DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

23
Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

description

DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE. Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris. Principe de la CGH array. Marquage des ADN. Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5 par un logiciel adapté. - PowerPoint PPT Presentation

Transcript of DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Page 1: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris

DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Page 2: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

ADNpatient *Cy3

ADNtémoin*Cy5

Cohybridation

Lavage

Lecture parscanner

Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5

par un logicieladapté

Marquagedes ADN

Principe de la CGH Principe de la CGH arrayarray

Puce 2500clones (BAC)

Page 3: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Wolf-Hirschhorn Cri du Chat

Williams-Beuren

Langer-Giedion

Prader-Willi / Angelman

Miller-Dieker

Smith-Magenis

DiGeorge

13

21

18

YX

Page 4: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Quelle technologie utilise Prenatal BoBs?

BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence.5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

Prenatal BoBs

ACs n ead

Page 5: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Random Primer SolutionBiotin-dNTP MixPolymeraseSample Diluent

Marquage de l’ADN à la Biotine

Biotine

J1

Page 6: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Purification de l’ADN

Kit de purification Purelink INVITROGEN Biotine

Colonne avec filtre

Page 7: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Hybridation de l’ADN sur les billes

Biotine

Sonde fixée sur les micro billes

Hybridation à 52°C à 1200 rpm16 à 20H

Dénaturation 5 mn à 85°C

Page 8: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Wash Buffer 1

Lavages

Elimination de l’ADN non hybridé

ADN marqué non-hybridé

Filtre 0,45 µm en µplaque

J2

Page 9: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Reporter ConcentrateReporter Diluent

Révélation du signal

Biotine

Streptavidine

Phycoérythrine

37°C 1200 rpm

Page 10: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Wash Buffer 2

Lavages

Filtre 0,45 µm en µplaque

Streptavidine non couplée

Page 11: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Lectures des billes

Lecture d’une plaque complète = 2h

Page 12: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Lectures des billes

Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur l’ADN

Le laser rouge identifie le signal de la bille

Page 13: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Profil féminin normal

Page 14: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Profil masculin anormal

Page 15: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Notre expérienceà Robert Debré

Page 16: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE
Page 17: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

Page 18: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Nos résultatsDe avril 2011 à juillet 2012

Page 19: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Intérêts

– Rendu de résultats rapide– Seulement ? ng d’ADN nécessaire soit 2mL

de LA ou 1 petite villosité– Comparaison avec des références mâles et

femelles– Jusqu’à 44 patients par plaque– Jusqu’à 100 sondes par puits dont 4 à 8

sondes par région étudiée– Screening plus large (dont contrôles sur

quelques autosomes)

Page 20: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Exemple d’une découverte d’une tétrasomie 12p chez un fœtus

Page 21: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Exemple d’une découverte d’une délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un

RCIU à 34SA

Page 22: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Inconvénients

– Non détection des translocations équilibrées ?– Difficulté d’interprétation des triploïdies– Technique très manuelle– Technique coûteuse ?– Certaines microdel étudiées inutiles ?

Page 23: DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

Exemple d’une triploïdie chez un fœtus