Post on 19-Nov-2020
Centrifugeuse SPE en ligne Chromatographie Liquide Spectromètre de masse (6460 Agilent)
Développement d’une méthode analytique de dosage des triazolespar SPE en ligne LC-MS/MS dans le plasma d’une espèce commune
de la Région Nouvelle-Aquitaine ; le Merle Noir
Introduction Méthodologie
Développements analytiques : SPE en ligne LC-MS/MS
Perspectives
Echantillons à analyser
Échantillon PréparationConcentration
PurificationSéparation
chromatographique
Source d’ionisation
ESI +
Détecteur
Cellule de collision - q2
MS 2 - Q3MS 1 - Q1
Louise PROUTEAU 1,2, Frédéric ANGELIER 1, Olivier CHASTEL 1, Patrick PARDON 2, François BRISCHOUX 1, Christophe BARBRAUD 1, Herve LORMEE 3, Marie-Hélène DEVIER 2, Hélène BUDZINSKI 2
1 CEBC, UMR 7372, CNRS, 405 Route de La Canauderie, 79360 Villiers-en-Bois2 LPTC, UMR 5805, CNRS EPOC, 351 Cours de libération, 33405 Talence3 ONCFS, Unité Avifaune migratrice, Carrefour de la Canauderie, 79360 Villiers-en-Bois
Remerciements : Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet MULTISTRESS avec le soutien financier de la région Nouvelle-Aquitaine, de la structure EC2CO ainsi que du projetPhytoCOTE. Cette étude a été réalisée au sein du Laboratoire d'Excellence COTE (ANR-10-LABX-45).
Tableau des transitions de quantification des 19 triazoles, imidazoles et étalons internes (EI) :
Ordre
d’élutiontr (min) Molécules MS1 MS2 Frag (V) CE (V)
1 11,9 Imazalil (imidazole) 297,06 41,2 126 36
2 12,5 Flutriafol 302,11 69,9 116 24
3 3’ 13,8 et 14,1 Cyproconazole 292,1 70,2 136 16
4 13,9 Triadiméfon 294,1 69 119 16
5 13,9 Triadiménol 296,1 70,1 82 10
6 14,5 Tétraconazole 372 158,9 104 28
7 14,7 Époxiconazole 330,08 121 131 24
8 14,8 Penconazole 284,07 70,1 114 16
9 14,9 Tébuconazole d6 (EI) 314,19 72,1 131 16
10 14,9 Tébuconazole 308,2 70,1 124 25
11 14,9 Flusilazole 316,1 165 124 24
12 15,2 Fenbuconazole d5 (EI) 342,16 70 151 16
13 15,2 Fenbuconazole 337,1 70 119 16
14 15,3 Metconazole 320,16 70,1 136 28
15 15,4 Propiconazole d5 (EI) 347,11 159 136 28
16 15,4 Prothioconazole 344,04 189 109 20
17 15,4 Propiconazole 342,1 158,9 134 32
18 15,4 Prochloraze (imidazole) 376 307,9 87 4
19 16,2 Difénoconazole 406,1 250,9 141 24
25 µL plasma de poulet
Ajout des pesticides
ciblés
Précipitation des protéines avec
solvant organique
Centrifugation
Filtration à 0,22 µm
Ajout d’eau MQ
Injection 600 µL
Chargement au de la
cartouche SPE
Lavage pendant 2 minutes
Elution à contre sens (0,3 mL/min)
Voie A : eau MQ + 0,1 % acide formique + 5 mM acétate d’ammonium
Voie B : MeOH + 0,1 % acide formique
Passage au travers une pré-colonne C18 puis
colonne chromatographique
Prélèvement sanguin au niveau de la veine alaire sur un merle noir juvénile
Echantillons de plasma
Centrifugation
Problématique de l’analyse
• Matrice biologique,• Prise d’essai faible,• Limites de quantification (LQ) faibles,• Automatisation de l’analyse.
SPE en ligne LC-MS/MS
Contexte
• Espèce bio indicatrice du milieu concernée par ce développement : Merle noir (Terdus merula)
Analyse contaminants
organiques (EPOC-LPTC)
Analyse contaminants métalliques
(LIENSs)
• Projet MULTISTRESS pluridisciplinaire :
• Mesurer les niveaux et effets des pesticides organiques sur les espèces non-ciblées (amphibiens, reptiles, oiseaux) fortement exposées à l’état sauvage.
Objectifs
• Pesticides employés dans les zones viticoles,
• Famille des fongicides (la plus utilisée en France) dont les triazoles (1, 2, 4) et imidazoles qui sont en pleine expansion,
• Transfert de ces molécules au sein des réseaux trophiques,
• Perturbateurs endocriniens qui pourraient empêcher le bon développement des vertébrés.
Sites d’étude
Registre parcellaire 2016 - Géoportail
Aires normalisées par la concentration en propiconazole
pour deux solvants de précipitation des protéines :
Ecologie, Physiologie
(CEBC)
Sensibilité et LQ obtenues pour 3 colonnes chromatographiques
pour le propiconazole :
Plasma dopé (2 ng/g plasma soit 70 pg/g)900 µL injectés
MRM et sensibilité obtenus pour le propiconazole avec les
cartouches :
Eau MQ dopée (0,1 ng/g)450 µL injectés
Eau MQ dopée (0,01 ng/g)50 µL injectés en injection directe
Cartouche pré-colonne C18 (Agilent) (Apolaire)
Cartouche PLEXA (Agilent) Temps(min)
Intensité (103)
11,5 16,5
1
2
3
4
5
6
1
2
33’
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1516
17
18
19
Superposition des transitions de quantification (logiciel Qualitative MassHunter) :
Eau MQ dopée (30 pg/g)450 µL injectés
0
0
4
S/N = 550
S/N = 250
Temps(min)
Intensité (103)
15,2 16,2
Solvant méthanol
Solvant acétonitrile
0
5
10
15
20
25
30
35
40
x 1
00
00
Air
e /
C°
(g/n
g)
ColonneDimen-
sionsMarque S/N
LQ (pg
injectés)
Kinetex
C18
2,1 mm x
100 mm x
1,8 µm
Phenome-
nex1400 2,6
Poroshell
C18
2,1 mm x
100 mm x
2,7 µmAgilent 2400 1,5
Poroshell
Phényl-
hexyl
2,1 mm x
100 mm x
2,7 µmAgilent 3350 1,1
Conclusions
Développements analytiques à
poursuivre
LQ (pg/g plasma)
30 50
12 molécules
0
6molécules
1molécule
Métabolites des pesticides à prendre en
compte
Conclure sur l’exposition spatiale
et temporelle en pesticides
• Limites de quantification obtenuespour le plasma de poulet avec lespectromètre MS/MS 6490 (Agilent) :
2 sites témoinsForêt
Parc urbain
2 sites d’étudeVignobles
conventionnel et raisonné
La Rochelle
Niort
Saintes
Co-polymère : Divinyl benzène / styrène (apolaire) + une surface hydrophile (polaire)
Plasma dopé (1,5 ng/g plasma) - Sans la filtration à 0,22 µm - 600 µL injectés
• Plasma : une matrice exploitable :
Temps(min)
Intensité (104)
14,3 16,5
2
4
6
8
6
9
1012 15
19
Superposition des transitions de quantification
0
300
Merle noir mâle capturé le 20/06/2016 en zone vignoble - 600 µL injectés
Ordre
d’élutionMolécules
Concentration
estimée (ng/g
plasma)
6 Tétraconazole 5
9 Tébuconazole d6 (EI) 1
10 Tébuconazole 0,3
12 Fenbuconazole d5 (EI) 1
15 Propiconazole d5 (EI) 1
19 Difénoconazole 0,01
• Difénoconazole,• Fenbuconazole,• Metconazole,• Penconazole,• Propiconazole,• Tébuconazole,• Tétraconazole.
Molécules détectées dans certains échantillons
(à quantifier)