Centrifugeuse SPE en ligne Chromatographie Liquide Spectromètre de masse (6460 Agilent)

Développement d’une méthode analytique de dosage des triazolespar SPE en ligne LC-MS/MS dans le plasma d’une espèce commune

de la Région Nouvelle-Aquitaine ; le Merle Noir

Introduction Méthodologie

Développements analytiques : SPE en ligne LC-MS/MS

Perspectives

Echantillons à analyser

Échantillon PréparationConcentration

PurificationSéparation

chromatographique

Source d’ionisation

ESI +

Détecteur

Cellule de collision - q2

MS 2 - Q3MS 1 - Q1

Louise PROUTEAU 1,2, Frédéric ANGELIER 1, Olivier CHASTEL 1, Patrick PARDON 2, François BRISCHOUX 1, Christophe BARBRAUD 1, Herve LORMEE 3, Marie-Hélène DEVIER 2, Hélène BUDZINSKI 2

1 CEBC, UMR 7372, CNRS, 405 Route de La Canauderie, 79360 Villiers-en-Bois2 LPTC, UMR 5805, CNRS EPOC, 351 Cours de libération, 33405 Talence3 ONCFS, Unité Avifaune migratrice, Carrefour de la Canauderie, 79360 Villiers-en-Bois

Remerciements : Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet MULTISTRESS avec le soutien financier de la région Nouvelle-Aquitaine, de la structure EC2CO ainsi que du projetPhytoCOTE. Cette étude a été réalisée au sein du Laboratoire d'Excellence COTE (ANR-10-LABX-45).

Tableau des transitions de quantification des 19 triazoles, imidazoles et étalons internes (EI) :

Ordre

d’élutiontr (min) Molécules MS1 MS2 Frag (V) CE (V)

1 11,9 Imazalil (imidazole) 297,06 41,2 126 36

2 12,5 Flutriafol 302,11 69,9 116 24

3 3’ 13,8 et 14,1 Cyproconazole 292,1 70,2 136 16

4 13,9 Triadiméfon 294,1 69 119 16

5 13,9 Triadiménol 296,1 70,1 82 10

6 14,5 Tétraconazole 372 158,9 104 28

7 14,7 Époxiconazole 330,08 121 131 24

8 14,8 Penconazole 284,07 70,1 114 16

9 14,9 Tébuconazole d6 (EI) 314,19 72,1 131 16

10 14,9 Tébuconazole 308,2 70,1 124 25

11 14,9 Flusilazole 316,1 165 124 24

12 15,2 Fenbuconazole d5 (EI) 342,16 70 151 16

13 15,2 Fenbuconazole 337,1 70 119 16

14 15,3 Metconazole 320,16 70,1 136 28

15 15,4 Propiconazole d5 (EI) 347,11 159 136 28

16 15,4 Prothioconazole 344,04 189 109 20

17 15,4 Propiconazole 342,1 158,9 134 32

18 15,4 Prochloraze (imidazole) 376 307,9 87 4

19 16,2 Difénoconazole 406,1 250,9 141 24

25 µL plasma de poulet

Ajout des pesticides

ciblés

Précipitation des protéines avec

solvant organique

Centrifugation

Filtration à 0,22 µm

Ajout d’eau MQ

Injection 600 µL

Chargement au de la

cartouche SPE

Lavage pendant 2 minutes

Elution à contre sens (0,3 mL/min)

Voie A : eau MQ + 0,1 % acide formique + 5 mM acétate d’ammonium

Voie B : MeOH + 0,1 % acide formique

Passage au travers une pré-colonne C18 puis

colonne chromatographique

Prélèvement sanguin au niveau de la veine alaire sur un merle noir juvénile

Echantillons de plasma

Centrifugation

Problématique de l’analyse

• Matrice biologique,• Prise d’essai faible,• Limites de quantification (LQ) faibles,• Automatisation de l’analyse.

SPE en ligne LC-MS/MS

Contexte

• Espèce bio indicatrice du milieu concernée par ce développement : Merle noir (Terdus merula)

Analyse contaminants

organiques (EPOC-LPTC)

Analyse contaminants métalliques

(LIENSs)

• Projet MULTISTRESS pluridisciplinaire :

• Mesurer les niveaux et effets des pesticides organiques sur les espèces non-ciblées (amphibiens, reptiles, oiseaux) fortement exposées à l’état sauvage.

Objectifs

• Pesticides employés dans les zones viticoles,

• Famille des fongicides (la plus utilisée en France) dont les triazoles (1, 2, 4) et imidazoles qui sont en pleine expansion,

• Transfert de ces molécules au sein des réseaux trophiques,

• Perturbateurs endocriniens qui pourraient empêcher le bon développement des vertébrés.

Sites d’étude

Registre parcellaire 2016 - Géoportail

Aires normalisées par la concentration en propiconazole

pour deux solvants de précipitation des protéines :

Ecologie, Physiologie

(CEBC)

Sensibilité et LQ obtenues pour 3 colonnes chromatographiques

pour le propiconazole :

Plasma dopé (2 ng/g plasma soit 70 pg/g)900 µL injectés

MRM et sensibilité obtenus pour le propiconazole avec les

cartouches :

Eau MQ dopée (0,1 ng/g)450 µL injectés

Eau MQ dopée (0,01 ng/g)50 µL injectés en injection directe

Cartouche pré-colonne C18 (Agilent) (Apolaire)

Cartouche PLEXA (Agilent) Temps(min)

Intensité (103)

11,5 16,5

1

2

3

4

5

6

1

2

33’

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

1516

17

18

19

Superposition des transitions de quantification (logiciel Qualitative MassHunter) :

Eau MQ dopée (30 pg/g)450 µL injectés

0

0

4

S/N = 550

S/N = 250

Temps(min)

Intensité (103)

15,2 16,2

Solvant méthanol

Solvant acétonitrile

0

5

10

15

20

25

30

35

40

x 1

00

00

Air

e /

C°

(g/n

g)

ColonneDimen-

sionsMarque S/N

LQ (pg

injectés)

Kinetex

C18

2,1 mm x

100 mm x

1,8 µm

Phenome-

nex1400 2,6

Poroshell

C18

2,1 mm x

100 mm x

2,7 µmAgilent 2400 1,5

Poroshell

Phényl-

hexyl

2,1 mm x

100 mm x

2,7 µmAgilent 3350 1,1

Conclusions

Développements analytiques à

poursuivre

LQ (pg/g plasma)

30 50

12 molécules

0

6molécules

1molécule

Métabolites des pesticides à prendre en

compte

Conclure sur l’exposition spatiale

et temporelle en pesticides

• Limites de quantification obtenuespour le plasma de poulet avec lespectromètre MS/MS 6490 (Agilent) :

2 sites témoinsForêt

Parc urbain

2 sites d’étudeVignobles

conventionnel et raisonné

La Rochelle

Niort

Saintes

Co-polymère : Divinyl benzène / styrène (apolaire) + une surface hydrophile (polaire)

Plasma dopé (1,5 ng/g plasma) - Sans la filtration à 0,22 µm - 600 µL injectés

• Plasma : une matrice exploitable :

Temps(min)

Intensité (104)

14,3 16,5

2

4

6

8

6

9

1012 15

19

Superposition des transitions de quantification

0

300

Merle noir mâle capturé le 20/06/2016 en zone vignoble - 600 µL injectés

Ordre

d’élutionMolécules

Concentration

estimée (ng/g

plasma)

6 Tétraconazole 5

9 Tébuconazole d6 (EI) 1

10 Tébuconazole 0,3

12 Fenbuconazole d5 (EI) 1

15 Propiconazole d5 (EI) 1

19 Difénoconazole 0,01

• Difénoconazole,• Fenbuconazole,• Metconazole,• Penconazole,• Propiconazole,• Tébuconazole,• Tétraconazole.

Molécules détectées dans certains échantillons

(à quantifier)