Post on 05-Jan-2017
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TTHHÈÈSSEE
En vue de l'obtention du
DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE
Délivré par l'Université Paul Sabatier Toulouse III
Discipline ou spécialité : Innovation Pharmacologique
JURY Professeur Pierre GOURDY - Président
Docteur Fabienne FOUFELLE - Rapporteur
Docteur Paul GRIMALDI - Rapporteur
Docteur Catherine POSTIC - Examinateur
Ecole doctorale Biologie Santé Biotechnologies Toulouse
Unité de recherche INSERM U858
Directeur(s) de Thèse : Dr.CASTAN-LAURELL Isabelle et Pr. VALET Philippe
Cédric DRAY
Rôle et Régulation de l'Apeline au cours de la Résistance à
l'Insuline associée à l’Obésité
Associée à l’obésité
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Rôle et regulation de l’apeline au cours de la résistance à l’insuline
associée à l’obésité.
L'apeline est un peptide synthétisé retrouvé sous différentes formes de 36, 17 et
13 acides aminés. Les travaux réalisés au cours de ce doctorat ont permis de mettre en
évidence la régulation et le rôle de ce peptide au cours de l‟insulino-résistance.
Dans un premier temps, nous avons montré que le TNF , une cytokine d‟origine
inflammatoire impliquée dans les phénomènes de résistance à l‟insuline, augmentait
l‟expression et la sécrétion d‟apeline adipocytaire chez l‟homme et la souris. Une autre
étude nous a permis de montrer que l‟expression de l‟apeline et de son récepteur variait
au cours des différentes phases d‟installation du diabète de type II. Ainsi, chez la souris
et chez l‟homme, l‟expression de l‟apeline et d‟APJ au niveau du tissu adipeux est
sensible à l‟insuline au cours de l‟insulino-résistance mais cette sensibilité est perdue
au cours du diabète. Dans le muscle strié squelettique, cette régulation semble moins
claire.
Parallèlement à la régulation, des expériences réalisées ex vivo et in vivo chez la
souris ont mis en évidence que l'apeline augmentait de façon dose dépendante le
transport de glucose dans les muscle et le tissu adipeux. De plus, l'étude de la
signalisation induite par l'apeline dans le muscle soléaire isolé a montré une activation
de l'AMPK, de la eNOS et d‟Akt. Chez des souris obèses et insulino-résistantes, nous
avons pu montrer que l'apeline améliorait la tolérance au glucose (OGTT) et, comme
chez la souris saine, augmentait l'utilisation de glucose dans les muscles squelettiques
et le tissu adipeux.
Même si des travaux supplémentaires sont indispensables, l'apeline semble se
comporter comme une nouvelle hormone anti-diabétique.
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Role and regulation of apelin during obesity –associated insulin-
resistance
Apeline is a peptide synthesized by adipocytes and present in plasma under
different forms such as 36, 17 and 13 aminoacids forms. During this doctoral, I have
studied the apelin regulation and role during insulin resistance and type II diabetes.
At first, we showed that TNF , an inflammatory cytokine involved in insulin
resistance, increased adipocyte apelin expression and secretion in mouse and human.
Another study allows us to show a wide-range expression of apelin and APJ during type
II diabetes development stages. In mouse and human, adipose tissue apelin and APJ
expression is insulin sensible during insulin resistance but fails to be sensible during
type II diabetes. In striated skeletal muscle, this kind of regulation is not clear and has to
be more studied.
At the same time, we also considered the metabolic role of apelin in mouse
model. Ex vivo and in vivo experiences realised in mouse highlighted that apelin
increased glucose uptake in muscle and adipose tissue. Furthermore, apelin-induced
signalling pathways studies in isolated soleus muscle showed AMPK, eNOS and Akt
activation. Interestingly, in high fat diet induced obese and insulin-resistant mice, we
showed that apelin effect was still effective to ameliorate glucose tolerance (OGTT) and,
as observed in healthy mouse, increased skeletal muscle and white adipose tissue
glucose utilization. Surprisingly, glucose utilization was also increased in hearts of
apelin-infused mice.
Even if supplemental data are necessary, apelin seems to behave as a new anti-
diabetic hormone and could be considered as a new potential target to fight metabolic
diseases.
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PARTIE I : CONTROLE DU METABOLISME GLUCIDIQUE PAR L‟INSULINE
I. Les mécanismes “utilisateurs” de glucose …………………………p.11
1) Le transport de glucose …………………………………………………..p.12 a) SGLT1 b) GLUT
2) Utilisation et stockage du glucose ……………………………………..p.16 a) La glycolyse b) La voie des pentoses phosphate b) La glycogénogénèse c) La lipogénèse de novo
II. Les mécanismes “producteurs” de glucose ……………………...p.24
a) La glycogénolyse b) La néoglucogénèse
III. Les mécanismes moléculaires régulant le transport de glucose
1) Les voies insulino-dépendantes………………………………………..p.29 a) Le récepteur à l‟insuline1 b) Les insulin receptor substrat (IRS) c) Cascade de signalisation des PI3K d) Cascade de signalisation des MAPK
2) Les voies non insulino-dépendantes: l‟AMPK………………………...p.39 a) Généralités b) Structure et régulation c) Régulation du métabolisme énergétique d) L‟AMPK, médiateur des effets des médicaments anti-diabétique e) L‟AMPK hypothalamique et régulation de la prise alimentaire
3) Le transporteur de glucose GLUT4…………………………………….p.46 a) Régulation de l‟expression de glut4 b) Translocation de GLUT4 c) Activité intrinsèque d) Surexpression de glut4 e) Invalidation génique de glut4
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PARTIE II : DE L‟OBESITE A LA RESISTANCE A L‟INSULINE
I. L’Obésité et le tissu adipeux (TA)
1) Définition / Mesure…………………………………………………….. 2) Epidémiologie………………………………………………………….. 3) Le tissu adipeux………………………………………………………...
a) Généralités b) Distribution anatomique du tissu adipeux c) Structure du tissu adipeux - Adipocyte - Fraction stroma-vasculaire
II. Le syndrome métabolique: focus sur la résistance à l’insuline
1) Définition ……………………………………………………………….. 2) Etiologie …………………………………………………………………
a) Etiologie b) Pathogénèse c) Mécanismes moléculaires de l‟insulino-résistance
3) Quantification de l‟insulino-résistance ………………………………
III. De l’obésité à la résistance à l’insuline
1) Modifications fonctionnelles du TA au cours de l‟obésité…………. a) Plasticité du tissu adipeux: avantage ou inconvenient? b) Inflammation du tissu adipeux c) Stress du réticulum endoplasmique d) Stress oxydant e) Flux lipidiques modifiés
2) Conséquences des modifications fonctionnelles du TA…………....
a) Distribution des depots adipeux: l‟hypothèse portale b) Accumulation ectopique de lipids dans les tissues non adipeux - Muscle squelettique - Foie - Coeur - Pancréas c) Les acides gras à l‟origine du phénomène de lipotoxicité d) Les adipokines - Généralités
p.51
p.52
p.53
p.60
p.61
p.69
p.75
p.81
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- Les adipokines “délétères” pour la voie de signalisation de l‟insuline
- Les adipokines bénéfiques
PARTIE III : LE SYSTEME APELINE/APJ
I. Le récepteur APJ ………………………………………………………………
1) Découverte 2) Distribution tissulaire 3) Structure 4) Régulation
II. L’apeline …………………………………………………………………………..
1) Découverte 2) Structure 3) Distribution tissulaire
III. Interaction apeline/APJ ……………………………………………………
1) Caractéristiques de la liaison apeline/APJ 2) Fonctionnalité des l‟interaction apelin/APJ
IV. Rôle de l’apeline dans le système cardiovasculaire ……….
1) Tonus vasculaire 2) Système cardiaque 3) Apeline et régulation centrale du système cardiovasculaire 4) Apeline et physiopathologies cardiovasculaires 5) Apport des modèles de souris transgéniques
V. Rôle de l’apeline dans le système nerveux central ……………
1) Distribution du système apeline/APJ dans le cerveau 2) Apeline et regulation de l‟équilibre hydrique 3) Apeline et prise alimentaire
VI. Apeline et angiogénèse ……………………………………………………
1) Implication de l‟apeline dans l‟angiogénèse a) Le xénope b) Le poisson zèbre c) La souris
2) Rôle de l‟apeline sur le développement vasculaire
p.108
p.114
p.118
p.126
p.137
p.143
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3) Système de regulation du complexe apeline/APJ au cours de l‟angiogénèse
4) Apeline et angiogénèse tumorale
VII. Apeline et tissu adipeux ………………………………………………………..
1) Régulation de l‟apeline adipocytaire
a) Hormonale b) Autres régulations
2) Apeline et troubles métaboliques 3) Implication de l‟apeline dans le métabolisme énergétique
PARTIE IV : OBJECTIFS ET TRAVAUX DE THESE
I. Objectifs ………………………………………………………………………………….
II. Etude du rôle métabolique de l’apeline …………………………………...
ARTICLE I: L’apeline augmente l’utilisation de glucose chez la souris normale et insulino-résistante ………………………………………
1) Introduction 2) Article 3) Discussion
III. Etude de la regulation de l’expression l’apeline et de son récepteur APJ au cours de l’insulino-resistance et du diabète de type II
ARTICLE II: Le TNF augmente l’expression et la sécrétion de l’apeline adipocytaire chez l’homme et la souris …………………..
1) Introduction 2) Article 3) Discussion
ARTICLE III: Régulation de l’expression de l’apeline et d’APJ chez l’homme et la souris au cours du diabète de type II …………………….
1) Introduction 2) Article 3) Discussion
p.151
p.159
p.161
p.162
p.181
p.192
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PARTIE V : CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ………….
BIBLIOGRAPHIE ……………………………………………………………………………
p.218
p.224
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Figures et Tables Fig. 1 : Le fonctionnement des transporteurs de glucose
Fig. 2 : Voie métabolique de la glycolyse
Fig. 3 : Voie métabolique de la glycogénogénèse
Fig. 4 : Mécanismes cellulaire de la lipogénèse de novo
Fig. 5 : Contrôle de la lipogénèse de novo par les facteurs de transcription SREBP et
ChREBP
Fig. 6 : Voie métabolique de la glycogènolyse
Fig. 7 : Voie métabolique de la néoglucogénèse
Fig. 8 : Structure du récepteur à l‟insuline
Fig. 9 : Cascade de signalisation de la PI3K
Fig. 10 : Voie de signalisation des MAPK
Fig. 11 : Rôles métaboliques et activation de l‟AMPK
Fig. 12 : Pathogénèse de l‟insulino-résistance
Fig. 13 : Schéma simplifié de l‟action des AG, du TNF et de l‟insuline sur la voie de
l‟insuline.
Fig. 14 : Expression du récepteur APJ
Fig. 15 : Séquence du récepteur APJ
Fig. 16 : Alignement des séquences de l‟apeline
Fig. 17 : Distribution tissulaire de l‟ARNm et du peptide de l‟apeline
Fig. 18 : Voies de signalisation de l‟apeline dans les cellules endothéliales entraînant la
vasodilatation.
Fig. 19 : Mécanismes cellulaires impliqués dans la contraction cardiaque induite par
l‟apeline.
Fig. 20 : Régulation de l‟équilibre hydrique par l‟apeline 17
Fig. 21 : Régulation de l‟expression de l‟apeline adipocytaire
Fig. 22 : L‟apeline stimule le transport de glucose dans le muscle squelettique
Table 1 . Distribution tissulaire et Km des principaux transporteurs de glucose
Table 2. Glycémies obtenues chez l‟homme au cours d‟une hyperglycémie provoquée
par voie orale.
Table 3. Agents ou facteurs pouvant réguler l‟expression d‟APJ
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PARTIE I Contrôle du métabolisme glucidique
par l'insuline
L'organisme humain utilise en permanence des substrats énergétiques pour
maintenir ses fonctions vitales alors que la fourniture de ces substrats par l'alimentation
est périodique. La couverture des besoins énergétiques de l'homme est principalement
assurée par deux classes de nutriments: les lipides et les glucides. Cette énergie n'est
pas entièrement dépensée au moment de l'alimentation et est en partie stockée pour
être disponible en période interprandiale. Différents mécanismes sont donc mis en jeu
pour, d'une part métaboliser et oxyder, et d'autre part stocker les nutriments.
La glycémie de l'homme, qui est la quantité de glucose présente dans le sang,
doit être maintenue dans des limites assez strictes afin d'éviter les complications liées à
l'hypo- et à l'hyperglycémie. Pour cela, trois organes vont participer activement à la
régulation des taux plasmatiques de glucose: le foie, le muscle et le tissu adipeux blanc
(TA). Dans une moindre mesure, d'autres tissus vont passivement contribuer à
augmenter ou à diminuer la glycémie. C'est le cas du cerveau qui n'utilise comme
substrat que le glucose ou des reins qui sont capables de produire ce substrat
énergétique. Dans le foie, le muscle strié squelettique et le TA, les flux entrant et sortant
de glucose seront contrôlés par des régulations nerveuses et/ou hormonales. Dans les
prochains chapitres de ce manuscrit nous nous consacrerons essentiellement à l'étude
des régulations hormonales et plus précisément à l'action de l'insuline sur le contrôle du
métabolisme glucidique.
Les voies biochimiques permettant de réguler la glycémie peuvent être divisées
en trois grandes parties: le stockage, l'utilisation et la production de glucose.
Ainsi nous verrons par quels mécanismes le glucose est utilisé par les cellules
afin de produire de l'énergie (glycolyse) ou des molécules indispensables à la survie des
cellules (voie des pentoses phosphate). Nous détaillerons ensuite les processus
favorisant le stockage de glucose dans le muscle, le foie et le tissu adipeux blanc sous
l'influence de l'insuline (glycogénogénèse et lipogénèse de novo). Enfin nous
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terminerons par la description des voies permettant la production endogène de glucose
(néoglucogénèse et glycogénolyse).
I. Les mécanismes "utilisateurs" de glucose
1) Le transport de glucose
Avant d'être utilisé, le glucose doit pénétrer dans les cellules. La bicouche lipidique des
membranes cellulaires étant imperméable à cette molécule hydrophile, son passage
vers l'intérieur de la cellule nécessite la présence de protéines de transport spécialisées
qui vont lui permettre de traverser la membrane plasmique. Les transporteurs d'hexoses
appartiennent à deux familles distinctes de protéines: les SGLT (sodium glucose co-
transporter) assurant un transport actif secondaire et les GLUT (glucose transporter)
assurant sa diffusion facilitée.
a) Les SGLT
Les SGLT co-transportent le glucose et le sodium, ce qui permet d'accumuler le glucose
dans la cellule contre un gradient de concentration. Ces transporteurs ne sont exprimés
que dans des structures cellulaires particulières: la membrane apicale des entérocytes
constituant le plateau strié de l'intestin grêle et la membrane apicale des cellules
épithéliales de la bordure en brosse du tubule proximal du rein (1, 2). De part leur
localisation, ils jouent un rôle majeur dans l'absorption intestinale et la réabsorption
tubulaire rénale du glucose.
b) Les GLUT
La famille des protéines de transport des hexoses par diffusion facilitée comporte
plusieurs isoformes dont les gènes ont été clonés chez l'homme (GLUT1 à GLUT12).
La diversité de la famille des GLUTs est importante afin de répondre aux besoins
spécifiques des différents tissus. Néanmoins, les GLUTs ont quasiment la même taille
(≈500 acides aminés) et une homologie de séquence variable (28% à 65%, surtout aux
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domaines transmembranaires (1). Ils se présentent comme une protéine à douze
domaines transmembranaires aux extrémités N- et C-terminales intracellulaires. Entre le
sixième et septième domaine transmembranaire, on retrouve une grande boucle
hydrophile intracellulaire.
Le transfert des molécules de glucose se fait par un changement de conformation
du transporteur, exposant de façon alternative deux sites de liaison au glucose. Un
premier site fait face à l‟extérieur de la cellule (exofacial), et un second site fait plutôt
face à l‟intérieur de la cellule (endofacial). Lorsque le glucose se lie au site exofacial, le
transporteur change de conformation (voir figure). Des analyses par mutagenèse dirigée
de ces sites de liaison ont permis d‟identifier les résidus des domaines
transmembranaires qui composent distinctement le site exofacial et endofacial (4-6).
L'extrémité C-terminale est aussi importante puisque sa délétion bloque le transporteur
en conformation « face vers l‟intérieur », empêchant donc le transport (2).
Fig1. Schéma représentant la cinétique de transport du glucose par un transporteur GLUT.
GLUT1
Le gène de l'isoforme glut1 est exprimé dans pratiquement tous les tissus de
l'organisme. La protéine GLUT1 a été initialement mise en évidence dans les globules
rouges et le cerveau (cellules endothéliales des capillaires). Elle est également présente
dans certains tissus sensibles à l'insuline comme le muscle squelettique et le TA (3).
Cette isoforme est localisée essentiellement au niveau de la membrane plasmique des
cellules et en faible quantité dans une fraction microsomale intracellulaire. GLUT1, qui
présente une faible vitesse de transport du glucose (Km d'environ 2 à mM) est saturable
pour des glycémies physiologiques chez l'homme (5.5 mM). Ainsi cette isoforme assure
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le transport basal de glucose dans la cellule et alimente le flux glycolytique nécessaire à
la survie des cellules.
GLUT2
Le gène de GLUT2 est exprimé dans le foie (membrane plasmique des hépatocytes), le
pancréas endocrine (membrane plasmique des cellules des îlots de Langherans),
dans l'intestin grêle (membrane basolatérale et apicale des entérocytes) et dans le rein
(4). C'est le transporteur qui présente la vitesse de transport la plus forte pour son
substrat (Km pour le glucose d'environ 15 à 20 mM). Le rôle de cette isoforme diffère
selon les tissus dans lesquels elle s'exprime. Dans l'hépatocyte comme dans la cellules
, l'isoforme GLUT2 agit comme un transporteur bidirectionnel (4, 5). Dans le foie, elle
est adaptée alternativement à la production ou à l'utilisation du glucose selon la situation
physiologique. Dans le pancréas, GLUT2 est le premier élément du système de
sensibilité du glucose de la cellule . Grâce à son Km élevé pour le glucose, GLUT2
permet au flux de glucose allant de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule d'être
proportionnel à l'élévation de la glycémie jusqu'à des valeurs élevées comme celles que
l'on peut rencontrer physiologiquement en période post-prandiale. Au cours de ces
périodes pendant lesquelles la glycémie peut être très élevée, GLUT2 est indispensable
au stockage hépatique du glucose comme nous le verrons au cours de l'étude de la
glycogénogénèse.
GLUT3
Le gène de l'isoforme GLUT3 a été cloné à partir d'ADN de muscle fœtal humain (6),
mais il n'est pratiquement plus exprimé dans ce tissu chez l'adulte. Sa répartition
tissulaire est ubiquiste chez l'homme alors que chez le rat, elle est plutôt restreinte au
cerveau où elle est majoritairement exprimée par les neurones. Il semblerait que dans
cet organe, il puisse exister une coopération entre GLUT1 et GLUT3 pour assurer le flux
de glucose vers les cellules (5).
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GLUT4
Le gène de l'isoforme GLUT4 est exprimé presque exclusivement dans les tissus où le
transport de glucose est sensible à l'insuline (muscle strié squelettique, cœur, tissu
adipeux). Cependant, certains travaux ont mis en évidence que GLUT4 pouvait être
présent au niveau du tissu cérébral et qu'il n'était pas contrôlé par l'insuline (7). GLUT4
a une forte affinité pour le glucose, son Km pour cet hexose est d'environ 4-5 mM.
Comme nous allons le détailler plus loin, cette isoforme a la particularité d'être sensible
à l'insuline. Ainsi, en présence de l'hormone, la capacité des cellules à transporter le
glucose peut augmenter d'un facteur 15 à 20 grâce à la présence de GLUT4 à la
membrane plasmique (8).
GLUT5
Bien qu‟il soit aussi capable de transporter du glucose, GLUT5 est le transporteur
spécifique du fructose. Le gène de l'isoforme GLUT5 est exprimé de façon importante
dans l'intestin grêle (membrane apicale des entérocytes), les testicules et en quantité
moindre dans le rein, le muscle strié squelettique, le TA et les cellules nerveuses chez
l'homme (9). Le Km de GLUT5 pour le fructose est d'environ 6 mM. Cette isoforme
assure essentiellement le transport du fructose alimentaire dans les cellules épithéliales
de l'intestin grêle (4). Contrairement à l'isoforme GLUT4, l'insuline n'exerce aucun
contrôle sur GLUT5 (9).
D'autres protéines GLUT ont été découvertes. Ainsi, on dénombre aujourd'hui
pas moins de 12 isomères mais les formes de GLUT6 à GLUT12 n'ont été que très peu
étudiées et ne feront donc pas l'objet d'une description ici.
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Table 1 : Distribution tissulaire et Km des principaux transporteurs de glucose.
Nom Distribution tissulaire Km
GLUT1 Ubiquiste 5-7 mM
GLUT2 Foie, rein, intestin, cellules
pancréatiques 7-20 mM
GLUT3 Cerveau 2 mM
GLUT4 Muscle squelettique, TA 5 mM
GLUT5 Jéjunum, muscle
squelettique, TA 5 mM pour le fructose
2) L'utilsation et le stockage du glucose
Après son entrée dans la cellule, le glucose sera phosphorylé par une
hexokinase donnant ainsi du glucose-6-phosphate. Cette molécule pourra alors suivre
quatre voies différentes en fonction de la demande énergétique des cellules: la
glycolyse, qui utilise le glucose circulant pour produire de l'énergie au cours de l'effort
(oxydation phosphorylantes), la voie des pentoses phosphate qui est source de
coenzymes réduits et à l'origine de la synthèse des nucléotides, la glycogénogénèse
qui permet le stockage de glucose dans le muscle et le foie sous forme de glycogène,
un polysaccharide de glucose et la lipogénèse de novo, capable de synthétiser des
acides gras (AG) à partir de glucose.
a) La glycolyse
La glycolyse (ou voie d'Embden-Meyerhof) est la voie du catabolisme oxydatif anaérobie
du glucose. Elle consiste en l'oxydation progressive d'une molécule de glucose à 6
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carbones en deux molécules de pyruvate à 3 carbones. Grâce à cette voie, le glucose
est à la fois source d'énergie et précurseur de molécules d'intérêt biologique. En effet,
dans tous les tissus, la glycolyse à pour but de produire de l'énergie directement sous
forme d'ATP ou indirectement sous forme de NADH,H+ (qui permet ultérieurement de
produire de l'ATP au niveau de la chaîne respiratoire). La glycolyse est aussi précurseur
de molécules d'intérêt biologiques comme par exemple le glycérol-3-phosphate,
accepteur d'AG pour former les triglycérides (TG).
La glycolyse comporte dix étapes catalysées par dix enzymes cytosoliques. Cette
voie peut être divisée en trois séquences:
- Phosphorylation du glucose en fructose 1,6-bisphosphate
Cette séquence de trois réactions nécessite des ions Mg++ et de l'énergie qui est
apportée par l'hydrolyse de deux ATP en ADP. Elle consiste en la phosphorylation du
glucose en glucose-6-phosphate (G6P) qui permet de maintenir le glucose dans la
cellule. Dans la plupart des tissus, cette phosphorylation est réalisée par l'hexokinase
alors que dans le foie et le pancréas, la glucokinase, une hexokinase spécifique de ces
tissus accomplit cette fonction. L'étape suivante est l'isomérisation du G6P en fructose-
6-phosphate qui sera phosphorylé par la phosphofructo-kinase (PFK) en fructose 1,6-
bisphosphate.
- Clivage du fructose 1,6-bisphosphate en 2 trioses phosphate
L'aldolase va cliver le fructose 1,6-bisphosphate en glycéraldéhyde-3-phosphate (GA3P)
et en dihydroactéone phosphate (DHAP). Les trioses sont plus oxydables que les
hexoses, leur fonction réductrice (aldéhyde ou cétone) n'est pas masquée comme elle
l'est dans la structure cyclique des héxoses.
- L'oxydation d'un GA3P conduit au pyruvate et produit de l'énergie
La glycéraldéhyde-3-phosphate désyhdrogénase (GA3PDH) va oxyder le GA3P en 1,3-
bisphosphate-glycérate. Cette étape va permettre la réduction du NAD+ en NADH, H+
et la synthèse d'ATP. Il s'ensuivra alors une transformation du 3-phosphoglycérate en
phospo-énolpyruvate qui sous l'action de la pyruvate kinase (PK) permettra la synthèse
du pyruvate et d'une deuxième molécule d'ATP. L'oxydation d'une molécule de pyruvate
, via le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire, produira 12 ATP.
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Fig. 2 : Voies métaboliques de la glycolyse. Le glucose entre dans la cellule par un transporteur puis il
est directement transformé en glucose-6-phosphate par une enzyme limitante qu‟est l‟hexokinase. Ce
glucose-6-phosphate va ensuite subir plusieurs transformations conduisant au pyruvate. Le pyruvate va
servir de substrat énergétique dans la cellule où, via son oxidation dans le cycle de Krebs, il pourra
donner différents métabolites énergétiques.
Fructose 1,6-bisphosphate
Fructose-6-Phosphate
Glucose-6-Phosphate
Glucose
Phosphofructokinase
Phosphoglucoisomérase
Héxokinase
Glucose
GLUT4
GA3P
1,3 bisphosphoglycérate
3 Phosphoglycérate
2 Phosphoglycérate
Phosphoénolpyruvate
Pyruvate
Aldolase
Triose phosphate
isomérase GA3P déshydrogénase
Phosphoglycérate kinase
Phosphoglycéromutase
Enolase
Pyruvate kinase
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La glycolyse sera dépendante de la disponibilité cellulaire en glucose qui varie en
fonction de la glycémie et du transport de glucose à travers la membrane plasmique qui,
comme nous l'avons évoqué plus haut, a lieu par diffusion facilitée grâce aux
transporteurs spécifiques GLUT. Les trois réactions limitantes sont celles catalysées par
l'hexokinase, la PFK et la PK, trois enzymes soumises à la régulation allostérique ainsi
qu'au contrôle transcriptionnel effectué par l'insuline. En effet, dans le foie et le muscle,
l'hormone hypoglycémiante est capable d'induire la synthèse de ces trois enzymes
glycolytiques et ainsi favoriser l'utilisation de ce substrat.
b) La voie des pentoses phosphate
En dérivation sur la glycolyse, la voie des pentoses phosphate (encore appelée shunt
des pentoses ou des hexoses monophosphate, voie du 6-phosphogluconate ou de
Dickens-Horecker), a pour but de générer des coenzymes réduits (NADPH,H+)
nécessaires à des réactions de synthèses réductrices (synthèse des AG, du
cholesterol,…) ou à des réactions de réduction particulières. Cette voie sera aussi à
l'origine du ribose-5-phosphate indispensable à la synthèse des nucléotides puriques et
pyrimidiques.
La voie des pentoses phosphate est ubiquiste mais a lieu surtout dans le foie où
elle est plus active que celle de la glycolyse et dans le TA où la synthèse d'AG nécessite
une production accrue de NADPH,H+. Elle est également retrouvée dans d'autres tissus
tels que la glande mammaire au cours de la lactation ou au niveau des globules rouges.
Le substrat de la voie des pentoses phosphate est le G6P qui sera oxydé en 6-
phosphogluconate par la glucose-6-phosphate déshydrogénase. Le 6-
phosphogluconate sera à son tour oxydé et décarboxylé en ribulose-5-phosphate par la
6-phosphogluconate déshydrogénase. Enfin, le ribulose-5-phosphate est le substrat de
deux réactions réversibles qui vont produire du xylulose-5-phosphate (Xu5P) et du
ribose-5-phosphate (R5P) à l'origine des nucléotides puriques et pyrimidiques.
En fonction des besoins de la cellule en NADPH,H+ ou en Xu5P/R5P, on pourra
observer un "shunt" de la voie de la glycolyse vers celle des pentoses phosphate et vice
versa en cas de forte demande énergétique.
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c) La glycogénogénèse
Polymère de glucose, le glycogène est un homopolysaccharide ramifié dont les unités
de glucose sont unies par des liaisons O-glycosidiques intra-chaîne ( 1-4) et
interchaînes ( 1-6). L'accumulation de glycogène dans le foie et les muscles est une
réponse physiologique à l'augmentation de l'apport de glucose faisant suite à un repas.
Le glycogène est donc la forme de stockage du glucose dans les cellules animales.
Fig. 3 Voies métaboliques de la glycogénogénèse. Le glucose entre dans la cellule puis il est
transformé en G6P par la glucokinase. La phosphoglucomutase va transformer le G6P en glucose-1-
phosphate qui sera greffé à un UDP afin de pouvoir transférer le glucose sur le glycogène déjà existant.
Après un repas, le glucose est absorbé par l'intestin puis il est dirigé vers le foie
par la veine porte. Les hépatocytes périportaux sont alors exposés de part leur situation
à un sang très riche en glucose. Le transfert du glucose dans les hépatocytes est réalisé
UDP-glucose
Glucose-1-phosphate
Glucose-6-Phosphate
Glucose
UDP-glucose Phosphorylase
Phosphoglucomutase
Glucokinase ou Héxokinase
Glucose
Glycogène (n+1 glucoses)
Glycogène (n glucoses)
UDP
GLUT4
Glycogène Synthase
UDP-glucose
Glucose-1-phosphate
Glucose-6-Phosphate
Glucose
UDP-glucose Phosphorylase
Phosphoglucomutase
Glucokinase ou Héxokinase
Glucose
Glycogène (n+1 glucoses)
Glycogène (n glucoses)
UDP
GLUT4
Glycogène Synthase
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par les transporteurs de glucose GLUT2, non insulino-dépendants. Compte tenu du Km
élevé de GLUT2 pour le glucose et de la différence de concentration de glucose qu'il
existe de part et d'autre de la membrane plasmique hépatocytaire, il se produira un
transfert élevé de glucose vers les hépatocytes. Dans la cellule, le glucose est
phosphorylé en glucose-6-phosphate par la glucokinase. La glucokinase hépatique a
deux caractéristiques qui la différencient des autres hexokinases. D'une part, elle
possède un Km élevé pour le glucose (12 mM) et d'autre part, elle n'est pas inhibée par
son produit: le G6P. De ce fait, le glucose extracellulaire et intracellulaire sont en quasi
équilibre même en cas d'hyperglycémie.
Dans le muscle, plusieurs études ont avancé que le contrôle principal de la
synthèse de glycogène s'exerçait au niveau du transport et de la phosphorylation du
glucose (10, 11). En effet, dans les cellules musculaires, une hexokinase (hexokinase II)
de bas Km (0.02 mM) phosphoryle le glucose en G6P et elle est inhibée par son produit
de réaction, le G6P. De plus, le transporteur de glucose insulino-dépendant GLUT4
possède un Km de 5 mM ne lui permettant pas de faire pénétrer des quantités
importantes de glucose au cours d'hyperglycémie post-prandiales. Ainsi, le glycogène
est en faible concentration dans le muscle (comparée au foie) mais compte tenu de la
proportion des muscles dans l‟organisme le glycogène musculaire représente deux tiers
du glycogène total.
Dans le foie ou les muscles, quatre réactions successives vont mener à la synthèse du
glycogène à partir du G6P.
-Le G6P est isomérisé en glucose-1-phosphate (G1P) par la
Phosphoglucomutase
-Le G1P est "activé" en UDP-glucose par l'UDP-glucose-phosphorylase en
présence d'UTP
-La glycogène synthase effectue des ajouts successifs d'unités UDP-glucose, par
des liaisons 1-4, sur une amorce de glycogène (oligosaccharide formé de 8 unités
glucose liés à une protéine, la glycogénine). L'activité de la glycogène synthase est
régulée par un système de phosphorylation/déphosporylation. Ainsi en période post
prandiale, la déphosphorylation de la glycogène synthase, catalysée par la protéine
phosphatase 1, est stimulée par l'insuline.
- 22 -
Inversement, en période de jeune, le glucagon et l'adrénaline, stimulateurs de l'adenylyl
cyclase dans le foie et les muscles, vont permettre d'activer la protéine kinase A qui à
son tour va phosphoryler et inhiber la glycogène synthase.
-L'enzyme de ramification intervient quand la chaîne linéaire compte une
vingtaine d'unités glucose. Elle transfère 5 à 8 unités glucose sur un glucose de la
chaîne en croissance, créant une ramification 1-6. Cette ramification permet à la
glycogène synthase de poursuivre son action.
d) La lipogénèse de novo
La capacité de stockage énergétique sous forme de glycogène étant limitée, les
glucides qui se trouvent en excès sont stockés sous forme lipidique dans le TA et le foie.
La lipogénèse de novo est la synthèse d'acide gras (AG) ou plus exactement
d'acyl-CoA, la forme intracellulaire activée des AG, à partir de carbones dérivés des
glucides et en particulier du glucose. La lipogénèse consiste à convertir un excès de
glucides alimentaires en lipides. Deux organes sont capables de moduler leur capacité
lipogénique en fonction des conditions nutritionnelles: le foie et le TA (12-14).
Fig. 4 Mécanismes
moléculaires impliqués dans
la lipognénèse de novo. Le
glucose est transformé en
pyruvate grâce à la glycolyse.
Le pyruvate sera alors
transformé en citrate à
l‟intérieur de la mitochondrie.
La lipogénèse permet la
synthèse d‟acide gras à chaîne
longue (AGCL) qui vont
constituer les triglycérides (TG)
intracellulaires.
- 23 -
Dans les deux tissus, le pyruvate produit à partir de la glycolyse est transformé
dans la mitochondrie en acétyl-CoA par la pyruvate déshydrogénase (PDH). L'acétyl-
CoA, après son retour dans le cytoplasme grâce à un système de "navette" (la
membrane mitochondriale est imperméable aux dérivés CoA), va être carboxylé par
l'acétyl-CoA carboxylase (ACC) en malonyl-CoA puis polymérisé pour former l'acyl-CoA
grâce à la synthase des acides gras (FAS pour Fatty Acid Synthase). Le palmitate est le
principal AG synthétisé par ce système.
La synthèse des AG est donc fonction de la disponibilité en substrats d'origine
glucidiques (qui via la glycolyse vont donner le pyruvate) et de l'activité de l'ACC qui
catalyse la réaction limitante. Comme pour la glycogénogénèse, l'insuline constitue un
régulateur majeur de la lipogénèse. Le premier niveau de régulation de l'insuline sur la
lipogénèse sera effectué via le transport de glucose insulino-sensible dans le tissu
adipeux. De plus, dans ce tissu mais aussi dans le foie, l'insuline régule l'activité de
l'ACC. Cette enzyme est déphosphorylée et activée par la protéine phosphatase-2A qui
est elle-même contrôlée par les taux d'insuline. Enfin, cette enzyme est aussi soumise à
la régulation allostérique émanant de ses produits.
A long terme, la principale régulation s'effectue au niveau transcriptionnel (15).
Ainsi, un facteur de transcription dépendant de l'insuline, SREBP-1c (Sterol Response
Element Binding Protein 1c), semble être au centre de la régulation des enzymes de la
lipogénèse telles que l'ACC et la FAS. Le rôle clé de SREBP-1c dans la lipogénèse de
novo a pu être démontré chez des souris surexprimant la forme active de ce facteur
dans le foie. Ces souris développent une stéatose hépatique massive due à l'activation
de l'expression des gènes lipogéniques (16, 17). Cependant, dans le foie des souris
invalidées pour SREBP-1c, bien que l'expression des gènes de la lipogénèse soit
diminuée de 50% (18), une activité lipogénique indépendante de SREBP-1c persiste en
réponse à l'alimentation, suggérant l'existence d'un second niveau de contrôle. La
découverte du facteur de transcription ChREBP (Carbohydrate responsive element
binding protein) par le groupe de Uyeda en 2001 a permis de mettre en évidence que la
lipogénèse de novo pouvait être également régulée par le glucose (19). Dentin et ses
collaborateurs ont pu confirmer le rôle de ChREBP dans la lipogénèse en inhibant
sélectivement l'expression de ce facteur de transcription dans des hépatocytes isolés
grâce à l'utilisation d'ARN interférent. Au cours de ces expériences, une forte
- 24 -
concentration de glucose n'est plus capable de stimuler l'expression des gènes
lipogéniques (ACC et FAS) et glycolitiques (PK) (20). Dans les adipocytes 3T3L1 en
culture, ChREBP est aussi capable d'augmenter la lipogénèse à partir de glucose grâce
à son action sur l'expression des gènes impliqués dans la génération de pyruvate et
ceux participant à la lipogénèse (21).
Fig.5 Contrôle de la lipogénèse de novo par les facteurs de transcription ChREBP et
SREBP (D’après Dentin et al., 2005). On remarque ici que SREBP et ChREBP sont deux facteurs qui
agissent en synergie pour contrôler l‟expression d‟enzymes glycolytiques ou lipogéniques. GK :
glucokinase ; G6P : glucose-6-phosphate ; L-PK : L-pyruvate kinase ; X5P : xyllulose-5-phosphate ; ACC :
acetyl-CoA carboxylase ; FAS : Fatty acyl trasnferase
II. Les mécanismes producteurs de glucose
Alors que tous les tissus et cellules de l'organisme sont capables d'utiliser le glucose,
seuls le foie, les reins et l'intestin sont capables de produire du glucose. Ceci est lié à
l'expression dans ces tissus d'une enzyme spécifique, la glucose-6-phosphatase, qui
permet l'hydrolyse du G6P en glucose. Le glucose ainsi produit peut alors être libéré
dans la circulation sanguine et dirigé vers d'autres tissus ou cellules dont l'activité
fonctionnelle est totalement (érythrocytes, rétine…) ou partiellement (cerveau)
dépendante du glucose. Une production normale de glucose est essentielle en période
- 25 -
interprandiale (jeûne nocturne) pour le maintien de la glycémie dans ses limites
physiologiques.
a) La Glycogénolyse
Nous venons de voir que seuls deux tissus sont capables de stocker le glucose sous
forme de glycogène: le foie et le muscle strié squelettique. Au cours du jeûne ou de
l'effort physique ces deux tissus ne vont pas utiliser le glycogène de la même façon. En
effet, du fait de la présence de la glucose-6-phosphatase dans le foie, ce tissu pourra
largement participer au contrôle de la glycémie (75% du glucose libéré dans la
circulation). Dans le muscle en revanche, le glucose-6-phosphate formé par la
glycogénolyse servira de substrat au muscle lui-même via la glycolyse.
La structure ramifiée du glycogène permet la libération rapide de molécules de
glucose-6-phosphate. Pour cela trois réactions sont nécessaires:
-La glycogène phosphorylase scinde les liaisons 1-4. Ainsi, elle libère
l'une après l'autres les unités glucose des extrémités des chaînes non réductrices, sous
forme de glucose-1-phosphate
-La phosphoglucomutase transforme le glucose-1-phosphate en G6P
-La glucose-6-phosphatase déphosphoryle le G6P qui ainsi peut sortir de
la cellule.
Une autre enzyme est également impliquée dans la glycogénolyse, l'amylo-1-
glucosidase, qui attaque les ponts de ramification et libère ainsi du glucose dans la
cellule qui pourra diffuser vers le compartiment sanguin.
La glycogénolyse et la glycogénogénèse ne doivent pas avoir lieu en même
temps. Cela est possible parce qu'elles empruntent des voies distinctes qui sont
régulées de façon différentes et coordonnées: selon les circonstances nutritionnelles et
métaboliques, quand une voie est accélérée, l'autre est freinée. La glycogénolyse est
contrôlée par la glycogène phosphorylase et la glycogénogénèse par la glycogène
synthase. Les deux voies sont alors soumises à une régulation réciproque:
-Les deux enzymes sont soumises à un contrôle allostérique, les mêmes
effecteurs ayant des effets contraires.
- 26 -
-Alors que l'insuline stimule l'activité de la glycogène synthase, l'absence
d'insuline et la présence de glucagon et d'adrénaline (jeûne ou exercice physique)
entraînent la phosphorylation et l'activation de la glycogène phosphorylase.
Au centre de la balance glycogénogénèse/glycogénolyse il y la protéine kinase A. Elle
participe tant à l'activation de la glycogène phosphorylase qu'à l'inactivation de la
glycogène synthase. D'autres mécanismes sont capables de contrôler la glycogénolyse.
De nombreux travaux se sont en particulier intéressés à la régulation de la production
hépatique de glucose. On sait ainsi que la quantité de glucose dans le milieu régule la
production de glucose d'hépatocytes en cultures. De plus, l'hormone de croissance, le
cortisol et les catécholamines stimulent aussi la production hépatique de glucose (22-
24).
Fig. 6 La glycogénolyse. Cette voie permet degrader les réserves de glycogène musculaire et hépatique
afin de fournir du glucose-6-phosphate comme substrat énergétique. Le glucose-6-phosphate sera
transformé en glucose par la glucose-6-phosphatase uniquement dans le foie.
Glycogène (n glucoses)
Glycogène (n-1 glucoses)
Pi
Glucose-1-Phosphate
Glucose-6-Phosphate
Glucose
Glycogène
Phosphorylase
Phosphoglucomutase
Glucose-6-Phosphatase
Glucose
Glycogène (n glucoses)
Glycogène (n-1 glucoses)
Pi
Glucose-1-Phosphate
Glucose-6-Phosphate
Glucose
Glycogène
Phosphorylase
Phosphoglucomutase
Glucose-6-Phosphatase
Glucose
Foie
Foie et
Muscles
- 27 -
b) La néoglucogénèse
La néoglucogénèse produit du glucose à partir de substrats non glucidiques. Ces
substrats, molécules à 3 carbones pour la majorité, sont produits par les tissus
périphériques, libérés dans le sang et captés par le foie.
-Le lactate représente 40 à 50% du flux néoglucogénique. Produit par le
métabolisme anaérobie surtout au niveau des muscles, il est oxydé en pyruvate.
-L'alanine représente 30 à 40% du flux. Libéré par la protéolyse musculaire,
l'alanine est transaminée en pyruvate. C'est l'acide aminé glucoformateur le plus
important.
-Le glycérol, libéré par la lipolyse adipocytaire, entre dans la néoglucogénèse au
niveau du triose-phosphate, le dihydroactéone phosphate.
De plus, les reins produisent du glucose à partir de la glutamine qu'ils utilisent pour leurs
besoins propres. Ce n'est qu'après plusieurs jours de jeûne que la néoglucogénèse
rénale prend de l'importance en libérant du glucose dans le sang.
Pour transformer deux molécules de pyruvate en une molécule de glucose, 12
réactions sont nécessaires: 8 sont communes avec celles de la glycolyse et 4 sont
catalysées par des enzymes irréversibles. La néoglucogénèse peut être divisée en 4
séquences qui ont lieu dans la mitochondrie, puis le cytosol et enfin dans le réticulum
endoplasmique de l'hépatocyte.
-Transformation du pyruvate en phosphoénolpyruvate:
Le pyruvate cytosolique est transporté dans la mitochondrie où il est carboxylé en
oxaloacétate par la pyruvate carboxylase mitochondriale. Cette enzyme est très active
dans le foie en période de jeûne. L'oxaloacétate doit être transporté dans le cytosol. Ne
possédant pas de transporteur, il franchit la membrane mitochondriale sous forme de
malate. Enfin, l'oxaloacétate est décarboxylé en phosphoénolpyruvate par la
phosphoénolcarboxykinase (PEPCK) cytosolique.
-Transformation du phosphoénolpyruvate en fructose 1,6-bisphosphate:
Cette étape utilise les enzymes réversibles de la glycolyse.
-Transformation du fructose 1,6-bisphosphate en G6P:
La fructose 1,6-bisphosphatase hydrolyse le fructose 1,6-bisphosphate en fructose-6-
phosphate. Celui-ci est isomérisé en glucose-6-phosphate.
- 28 -
-Transformation du G6P en glucose:
Comme nous l'avons déjà évoqué, la glucose-6-phophatase hydrolyse le G6P en
glucose uniquement dans les hépatocyte et les cellules rénales et intestinales.
AlanineLactate
Pyruvate
Phosphoénolpyruvate
Fructose 1,6 bisphosphate
Glucose-6-Phosphate
Glucose
Enzymes de la glycolyse
Fructose 1,6 bisphosphatase
Glucose-6-phosphatase
Glucose
Oxaloacétate
Malate
Pyruvate
Glycérol
Dihydroacétone P
AlanineLactate
Pyruvate
Phosphoénolpyruvate
Fructose 1,6 bisphosphate
Glucose-6-Phosphate
Glucose
Enzymes de la glycolyse
Fructose 1,6 bisphosphatase
Glucose-6-phosphatase
Glucose
Oxaloacétate
Malate
Pyruvate
Glycérol
Dihydroacétone P
Fig. 7 La Néoglucogénèse. En cas de besoins énergétiques, l‟organisme a la capacité de
synthétiser du glucose à partir de différents substrats comme le glycérol, le lactate et l‟alanine.
Comme, la glycolyse, la régulation de la néoglucogénèse est sous la dépendance
du rapport glucagon/insuline. Ainsi, en période post-prandiale, l'insuline, via la
stimulation de la protéine kinase B (que nous détaillerons plus loin), va activer l'AMPc-
phospodiestérase qui va hydrolyser l'AMPc et ainsi diminuer l'activité de la PKA. Cette
inhibition va entraîner une diminution de l'activité fructose 1,6-bisphosphatase ce qui
aura pour conséquence de ralentir la néoglucogénèse. A l'inverse, le glucagon et les
glucocorticoïdes stimulent la néoglucogénèse en agissant directement sur l'activité des
enzymes clés de cette voie ou indirectement en augmentant l'activité d'enzymes
- 29 -
responsables d'un apport de substrats pour la néoglucogénèse (acides aminés et
glycérol apportés par la protéolyse musculaire et la lipolyse adipocytaire).
III. Mécanismes moléculaires régulant le transport de glucose
Nous venons de voir que de nombreux processus impliqués dans le contrôle de
la glycémie impliquent une régulation du transport de glucose. Cette entrée de glucose à
longtemps été considérée comme uniquement contrôlée par l'insuline mais aujourd'hui
de nombreuses études montrent que de nouvelles voies émergent et avec elles de
nouvelles pistes possibles pour la régulation de la glycémie.
.
1) Les voies insulino-dépendantes
a) Le récepteur à l’insuline (RI)
Structure et fonction - Le gène du récepteur de l‟insuline est composé de 22 exons et
21 introns. La traduction génère le prorécepteur, qui sera par la suite scindé au niveau
d'un site de clivage (4 acides aminés : RKRR) en sous-unités α et β.
Fig. 8 Structure du récépteur à l’insuline
Un assemblage hétérotétramérique de deux sous-unités α et deux sous-unités β
(α2β2) par des ponts disulfures formera le récepteur de l‟insuline mature.
Le récepteur insulinique (RI) appartient à la superfamille des récepteurs à
tyrosine kinase (RTKs), ainsi dénommée parce que la partie intracellulaire du récepteur
comporte un domaine à activité enzymatique qui phosphoryle les tyrosines de divers
substrats intracellulaires. Il est important de noter qu‟à l‟état activé, tous les RTKs sont
des dimères et sont, en fait, activés par un mécanisme de dimérisation induit par le
Domaine de liaison
Signalisation
Domaine de liaison
Signalisation
- 30 -
ligand. La dimérisation rapproche les deux domaines tyrosine kinase, permettant la
phosphorylation d‟une kinase par l‟autre («transphosphorylation»), ce qui multiplie
l‟activité enzymatique par un facteur 30 et crée, en outre, des sites de liaison (tyrosines
phosphorylées) pour diverses molécules impliquées dans la signalisation.
A l‟état basal, la sous-unité du RI inhibe l‟activité kinase du récepteur. Cette
activité inhibitrice est mise en évidence par le retrait de cette partie extracellulaire par
digestion enzymatique ou par mutagénèse (25). La liaison de l‟insuline induit des
changements de conformation qui activent la kinase et induit une trans-phosphorylation
des sous-unités β. Cette autophosphorylation s‟effectue sur des résidus tyrosine
intracellulaires: la tyrosine 960 du domaine juxtamembranaire, les tyrosines 1316 et
1322 du domaine C-terminal et les tyrosines 1146, 1150 et 1151 du domaine de
régulation. Ces derniers sont particulièrement importants pour réguler le niveau
d‟activation de la kinase. En effet, la mutation d‟une, de deux ou de ces trois tyrosines
diminue progressivement l‟activité kinase induite par une stimulation par l‟insuline (26).
Bien que ces tyrosines peuvent aussi servir au recrutement de médiateurs de la
cascade de signalisation, ce rôle est généralement attribué à la tyrosine 960 du motif.
En effet, le motif NPXY 960 est un point d‟ancrage pour les médiateurs de la voie de
signalisation de l‟insuline qui possèdent un domaine PTB (PhophoTyrosin Binding). Pour
le prouver, deux études ont montré que la substitution de cette tyrosine par un autre
acide aminé affectait la transmission du signal sans toutefois modifier le niveau
d‟activation de la kinase, ce qui suggère bien une implication dans le recrutement des
médiateurs (27, 28). De plus, il a aussi été montré qu‟un des sites d‟autophosphorylation
(contenu dans un motif YXXM) du domaine C-terminal était reconnu par le domaine SH2
(Src-Homology-2) de certains partenaires (la sous-unité p85 de la PI3K s‟accrocherait
au récepteur activé via ce site) (29, 30), mais l‟interaction réelle in vivo est incertaine
(31). D‟un autre côté, la délétion de 82 acides aminés en C-terminal, dont les tyrosines
1316 et 1322, n‟a que peu d‟effet sur la propagation du signal aux médiateurs, mais
réduit considérablement le niveau d‟autophosphorylation (32), ce qui suggère que la
phosphorylation des tyrosines du domaine C-terminal est majoritairement impliquée
dans la régulation de l‟activité plutôt que dans le recrutement d‟effecteurs (33, 34).
- 31 -
Interaction de l’insuline avec son récépteur- Différentes approches expérimentales
ont été utilisées pour situer les surfaces impliquées dans la liaison de l‟insuline avec son
récepteur. Il apparaît que l‟insuline se comporte comme un ligand bivalent dont les deux
surfaces de liaison se lient à deux sites distincts sur les deux sous-unités α du récepteur
et, en les rapprochant, favorise l'interaction des deux domaines tyrosine kinase et leur
transphosphorylation (35, 36).
Internalisation, recyclage et dégradation des RI- Une fois que la cascade de
transduction de l‟insuline sera amorcée, le complexe récepteur/ligand va être séquestré
dans les vésicules intracellulaires de l‟appareil endosomal (37). Cette étape
d‟internalisation du complexe actif régule de plusieurs façons le signal insulinique à
transmettre (38).
-Arrêt du signal par la dégradation intracellulaire de l’insuline – Des pompes
à protons ATP-dépendantes acidifient l‟intérieur des endosomes, ce qui a pour premier
effet de dissocier le complexe récepteur/ligand. Ainsi, la diminution du pH favorise
l‟activité d‟une peptidase qui dégrade plus aisément l‟insuline à l‟approche du pH 5,0-5,5
(39).
-Régulation de la sensibilité à l’insuline par un contrôle du nombre de
récepteur à la surface – Alors que l‟insuline est dégradée, le récepteur libre sera dirigé
soit vers le compartiment lysosomal pour y être dégradé soit vers la membrane
plasmique pour permettre à un nouveau signal insulinique d‟être transmis (recyclage).
L‟exposition des cellules à une forte mais brève concentration d‟insuline induira une voie
d‟internalisation qui favorise le recyclage (40) alors que l‟exposition prolongée à
l‟insuline favorisera la dégradation du récepteur (41). L‟inhibition de l‟acidification des
endosomes aurait pour effet d‟inhiber la dissociation du complexe récepteur/insuline, et
par conséquent le recyclage du récepteur à la membrane (42). La diminution de la
signalisation observée dans de telles conditions suggère que l‟acidification et le
recyclage du récepteur ont des rôles importants dans la régulation de la signalisation de
l‟insuline (43).
- 32 -
b) Les Insulin Receptor Substrate (IRS)
Nous avons vu qu‟après la liaison de l‟insuline à son récepteur, ce dernier
s‟autophosphoryle sur de multiples sites contenant des résidus tyrosines (44). Ceci
conduit alors à l‟activation de la fonction kinase du RI qui va recruter puis phosphoryler
sur des résidus tyrosine des protéines de la famille des IRS.
A ce jour, il a pu être mis en évidence qu‟il existait quatre protéines IRS
différentes (IRS1-4) mais les formes les plus retrouvées sont les IRS1 et –2 (45). Les
IRS sont des protéines d‟ancrages (docking protein). Elles se positionnent au niveau de
la face cytoplasmique de la membrane plasmique par leur domaine PH (domaine
d‟homologie avec la pleckstrine) qui reconnaît des phospholipides membranaires. Elles
positionnent ainsi leur domaine PTB (Phosphotyrosin Binding), adjacent au domaine
PH, en face de la tyrosine 960 du RI et se fixent au récepteur. L‟extrémité carboxy-
terminale des IRS se trouve alors à proximité du domaine tyrosine kinase du récepteur.
Ceci permettra la phosphorylation de résidus tyrosines spécifiques sur les IRS. Une fois
qu‟elles sont phosphorylées, les protéines vont servir d‟intermédiaires entre le récepteur
à l‟insuline et les reste de la voie de signalisation (45). La région C-terminale de ces
protéines contient de nombreux de sites de phosphorylation. On y retrouve plus d‟une
vingtaine de résidus tyrosine potentiellement phosphorylés par le récepteur de l‟insuline
(46). Ces phosphorylations permettent le recrutement des molécules de signalisation
près du récepteur de l‟insuline activé via leurs domaines SH2 pour ainsi propager le
signal insulinique.
A l‟opposé, IRS-1 serait inhibé par la phosphorylation de certains résidus sérine
(46) et une boucle de rétroaction négative aurait à sa disposition plus de 70 résidus
sérine potentiels pour contrôler l‟ampleur du signal.
A partir de l‟activation des IRS par le récepteur à l‟insuline, deux voies principales vont
participer au transport de glucose. L‟une directement via une action sur la quantité de
transporteurs de glucose GLUT4 présents à la membrane plasmique, c‟est la voie de la
Phosphatidyl Inositol 3 Kinase (PI3K) ; l‟autre indirecte va agir sur la régulation de
l‟expression de gènes impliqués dans le métabolisme glucidique, c‟est la voie des
Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK).
- 33 -
c) La cascade de signalisation des PI3K
La PI3K, à l'origine du message- La PI3K catalyse la réaction de phosphorylation du
groupe 3‟-hydroxyl du phosphatidylinositol (PI) et de phosphoinositides. Les PI3K sont
donc des kinases « lipidiques » qui sont associées à IRS-1 et dont l‟activation va
entraîner, entre autre, le déclenchement de la voie permettant le transport de glucose
(47). Les PI3K possèdent une sous-unité catalytique de 110 kDa et une sous-unité
régulatrice de 85 kDa contenant deux domaines SH2. Il existe une multitude d‟isoformes
de sous-unités régulatrices et catalytiques et leurs associations entraînent un nombre
important de PI3K différentes.
Les domaines SH2 de la sous-unité p85 vont reconnaître les résidus tyrosine
phosphorylés des IRSs et se rendre au complexe récepteur/IRS, près de la membrane,
en transportant la sous-unité catalytique p110 (48). La liaison de p85 à p110 contrôle la
stabilité et l‟activité de p110 en exerçant sur elle une constante inhibition. Aini quand
p85 va se lier à IRS, elle sera phosphorylée sur le résidu tyrosine 688 par des kinases
de la famille Src (49) ce qui aura pour effet de suspendre cette inhibition (50, 51). La
protéine p110 se retrouve alors activée et près de la membrane (condition nécessaire à
l‟activation de l‟enzyme comme l‟a montré Egawa (52)), où elle peut phosphoryler des
phosphoinositol-4,5-biphosphate (PI4,5P2) pour générer des phosphoinositol
triphosphate (PIP3) qui sont des seconds messagers.
En réponse à une stimulation à l‟insuline, il se produit une accumulation de PIP3
à la membrane, jusqu‟à ce que les phosphatases PTEN (phosphatase and tensin
homolog deleted on chromosome ten), SHIP-2 (Src homology 2 domain containing
inositol 5‟ phosphatase-2) et SKIP (skeletal muscle and kidney-enriched inositol
phosphatase) (53) déphosphorylent les PIP3 pour donner du PIP2 (54).
Le PIP3 est un second messager activateur allostérique de la phosphoinositide-
dependant kinase 1 (PDK1). PDK1 est une sérine/thréonine kinase qui active les
protéines kinases B et C (PKB et PKC) via la phosphorylation de domaines présents sur
leur boucle d‟activation (55). Même si PDK1 est considérée comme une enzyme
limitante de la signalisation insulinique permettant le transport de glucose (56, 57),
l‟activation de cette protéine reste à démontrer in vivo puisque pour l‟instant toutes les
- 34 -
études concernant son implication dans la signalisation de l‟insuline ont été obtenues
sur des cellules en culture. L‟augmentation de l‟activité de la PDK1 médiée par l‟insuline
est semble-t-il associée à des phosphorylation sur des acides aminés sérine (58) et
tyrosine (59) même si Mora et ses collaborateurs ont pu montrer que la PDK1 pouvait
être constitutivement active (55).
En présence d‟inhibiteurs pharmacologiques de la PI3K (wortmannin et le
LY294002), la supression presque totale du transport de glucose induit par l‟insuline
dans les cellules musculaires ou adipeuses montre l‟importance de cette kinase dans le
transport de glucose insulinodépendant (60-62).
La PKB, un relais indispensable- Plusieurs études ont mis en évidence que la PKB se
trouvait en aval de la PI3K (63-65) et qu‟elle participait au transport de glucose médié
par l‟insuline (66-68). La protéine PKB est codée par le gène Akt (c‟est la raison pour
laquelle on peut retrouver la protéine sous le nom d‟Akt). Elle se compose d‟un domaine
régulateur présent à l‟extrémité NH2-terminale ainsi que d‟un domaine PH permettant
des interactions de type protéine-protéine (69). Plusieurs isoformes de la protéine PKB
ont à ce jour été mis en évidence mais les plus importantes (surtout dans le muscle)
sont la PKB codée par le gène Akt1 et la PKB codée par Akt2 (70). Les produits
issus de l‟activité de la PI3K (essentiellement les PIP3) vont permettre la translocation
de PKB à la membrane plasmique où elle sera activée par la PDK1 via la
phosphorylation de la thréonine 308 et de la serine 473 (71) et où elle pourra
s‟homodimériser pour être active (70). Récemment, un complexe enzymatique formé de
mTOR (mammalian target of rapamycin) et RICTOR (rapamycin insensitive companion
of mTOR) s‟est vu attribuer un rôle dans cette phosphorylation (72, 73).
Une fois activée, la PKB va phosphoryler d‟autres substrats comme par exemple
une protéine de 160 kDa récemment identifiée appelée AS 160 (pour Akt substrate)
(74). In vitro, cette protéine va directement réguler les flux entrant de glucose en
contrôlant la translocation à la membrane plasmique de transporteur de glucose GLUT4
de cellules adipeuses (75). AS160 est aussi exprimée dans le muscle de rat où elle est
phosphorylée en réponse à une stimulation par l‟insuline mais également en réponse à
la contraction musculaire (76).
En plus de son rôle dans le transport de glucose, la PKB est aussi impliquée
dans les effets de l‟insuline sur la synthèse de glycogène. En effet, dans le foie et le
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muscle, la PKB va phosphoryler la glycogen synthase kinase 3 (GSK3) ce qui aura pour
conséquence d‟augmenter le stockage du glucose sous forme de glycogène dans ces
deux organes (77, 78). De plus elle est aussi capable d‟activer une phosphodiestérase
(PDE3) indispensable à l‟effet antilipolytique de l‟insuline dans l‟adipocyte (79).
En contrôlant l‟activité de certains facteurs de transcription, PKB régule aussi
l‟expression de gènes essentiels à l‟action de l‟insuline. FOXO-1 par exemple, promeut
la transcription des gènes de la gluconéogenèse dans le foie (80). PKB inhibe FOXO-1
en le phosphorylant sur sa sérine 256, ce qui le séquestre dans le cytoplasme et
prévient ainsi la transcription des gènes qui lui sont associés. La phosphorylation de
FOXO-1 par PKB réduit alors considérablement la gluconéogenèse et la production
hépatique de glucose. Dans les adipocytes, la voie insuline-PKB-FOXO-1 permettrait de
réguler la différenciation adipocytaire (81).
L‟inhibition de PKB par l‟expression d‟un dominant négatif ne bloque pas complètement
l‟effet de l‟insuline sur le transport du glucose. Ceci suggère l‟implication d‟une autre
voie de signalisation.
La PKC- L‟autre voie qui se trouve en aval de la PDK1 est celle de la PKC. Cette
protéine est un important régulateur de la croissance cellulaire, de la différenciation et
du métabolisme (82-84). La famille des PKC comprend 12 isotypes de sérine/thréonine
kinase distribuées ubiquitairement dans l‟organisme. Une classification en trois groupes
de ces PKC a pu être réalisée en fonction des propriétés enzymatiques des ces
protéines.
Il y a les PKC conventionnelles (PKCc) nommées PKC , et , les PKC
dites « nouvelles » (PKCn) appelées PKC , €, et et enfin les PKC atypique (PKCa)
comme la PKC et la PKC (85). Toutes ces PKC sont caractérisées par leur activation
lipidique mais les PKCc et les PKCn sont activées plus spécifiquement par les
diacyglycérides (DAG) (85). De plus, tous les isoformes sont dépendants de la présence
d‟une phosphatidyl serine (PS) à la face cytoplasmique de la membrane plasmique afin
de pouvoir s‟ancrer pour être activées par phosphorylation des résidus sérine/thréonine
par la PDK1 (55).
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Les PKC peuvent réguler positivement ou négativement le signal insulinique. En effet,
les PKC et sont impliquées dans le transport de glucose musculaire médié par une
exposition aiguë des cellules à l‟insuline (86, 87) alors que les PKC et agissent
comme des régulateurs négatifs du signal en cas d‟exposition longue à l‟hormone (88).
De façon intéressante, il a pu être montré que la PKC était impliquée dans le transport
de glucose indépendamment d‟une stimulation par l‟insuline (89). En effet, nous verrons
dans les prochains chapitres que l‟AMP-activated protein kinase (AMPK) peut activer la
PKC et ainsi induire une augmentation du transport de glucose indépendamment de
l‟insuline (90).
Enfin, physiologiquement, certaines PKC conventionnelles ( et ) sont aussi
capables de se lier à IRS1 ou à RI afin de désensibiliser ces protéines via une
phosphorylation en sérine/thréonine avec pour conséquence, une suppression rapide du
signal insulinique (91, 92). Ce rétrocontrôle pourrait bien être un mécanisme impliqué
dans l‟insulino-résistance puisqu'il semblerait que chez le diabétique, l‟activation des
PKC ne soit plus régulée.
- 37 -
Fig. 9 Cascade de signalisation de l’insuline transitant par la PI3K et induisant une augmentation
du transport de glucose. La fixation de l‟insuline sur son recépteur va induire la phopsphorylation de ce
dernier sur des résidus tyrosine. Ceci va permettre à la protéine substrat du récepteur (IRS) d‟être activée
par phopshorylation sur une tyrosine. La protéine IRS phosphorylée va à son tour activer la
phosphoinositol-3-kinase (PI3K) en se liant sur sa sous unité p85. La conséquence de cette liaison sera
une levée de l‟inhibition de la sous-unité catalytique p110 qui transforme les phophoinositol-2-phosphate
(PIP2) membranaires en phopsphoinosotol-3-phosphate (PIP3) qui sont des second mesagers
intracellulaires. La liaison des PIP3 à la phosphoinositide dependant kinase 1 (PDK1) permet d‟activer les
protéines PKB/Akt et PKC responsables de la translocation des vésicules contenant Glut 4 à la membrane
plasmique.
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d) La cascade de signalisation des MAPK
Les MAPK sont des protéines conservées au cours de l‟évolution et ubiquitaires
dans l‟organisme. Ce sont des sérine/thréonine kinases impliquées dans des processus
tels que la croissance cellulaire, la prolifération, la différenciation ou encore l‟apoptose.
Chez les mammifères, les cellules possèdent 3 voies MAPK différentes :
-la voie des Extracellular signal Regulated Kinase 1 et 2 (ERK1 et ERK2)
-la voie de la c-jun N-terminal kinase (JNK)
-la voie de la p38-MAPK
Fig. 10 Voie de signalisation des MAPK. En se fixant sur son récepteur l‟insuline va induire une série
d‟activation permettant à des protéines comme Erk, JNK et P38 d‟activer certains facteurs de
transcriptions qui réguleront l‟expression de gènes impliqués dans le métabolisme énergétique, la
croissance et la prolifération cellulaire.
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La voie des MAPK pourra activer l‟expression de gènes via la phosphorylation de
facteurs de transcription et de kinases intermédiaires. Ainsi, les facteurs de transcription
pourront être activés par les trois voies MAPK ou par une seule. Par exemple, toutes
trois sont capables de phosphoryler Elk-1, un facteur de transcription impliqué dans la
prolifération des cellules (93, 94). Plus spécifiquement, p38-MAPK module l‟activité de
MEF2 (Myosin Enhncing Factor 2) et JNK phosphoryle c-jun, STAT3 (Signal Transducer
and Activator of Transcription 3) et le Nuclear Factor Activated T-cell (NFAT) (95).
STAT3 est impliqué dans la régulation de la gluconéogénèse hépatique alors que MEF2
et NFAT sont eux concernés par la différenciation musculaire (96). En contrôlant
l‟activité de ces différents facteurs de transcription et donc aussi l‟expression génique
que ces derniers régulent, l‟insuline pourra agir, via la voie des MAPK, sur l‟homéostasie
glucidique.
2) Le transport de glucose médié par les voies non insulino-dépendante: la
voie de l'AMPK
a) Généralités
Une protéine est apparue depuis quelques années comme un acteur clé de
l‟homéostasie énergétique insulino-indépendant, la protéine kinase activée par l‟AMP
(AMPK). L‟AMPK est très conservée au cours de l‟évolution. Ses homologues sont
SNF1 (Sucrose Non-Fermenting 1) chez la levure S. cerevisiae (97) et SnRK (SNF-1
Related Kinase) chez la plante (98). L‟AMPK est activée par différents stress induisant
une déplétion de la cellule en énergie et une augmentation du rapport AMP/ATP. C‟est
le cas par exemple de l‟hypoxie, des poisons métaboliques (inhibiteurs de la chaîne
respiratoire, de l‟ATP synthase mitochondriale, etc...), de l‟ischémie, de l‟exercice
physique ou encore d‟un déficit en glucose (99, 100). Certains agents pharmacologiques
(101, 102) ou encore certaines hormones comme l‟adiponectine et la leptine (103, 104)
activent l‟AMPK. La metformine, les thiazoledinediones (TZD) et le 5-aminoimidazole-4-
carboxamide-1-β-D-ribonucléoside (AICAR) sont des agents activateurs de l‟AMPK
(105-110) alors que le composé C ou l‟araA sont connus pour l‟inhiber (111). Une fois
activée, l‟AMPK modifie l‟activité et l‟expression de différentes protéines cibles afin de
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rétablir l‟homéostasie énergétique cellulaire en activant les voies métaboliques
productrices d‟énergie et en inhibant les voies consommatrices. En plus de son rôle au
niveau cellulaire, des études récentes ont mis en évidence un rôle de l‟AMPK dans le
maintien de l‟homéostasie énergétique à l‟échelle de l‟organisme. En effet, en réponse à
des signaux hormonaux et nutritionnels, centraux et périphériques, l‟AMPK intervient
également dans la régulation de la prise alimentaire.
b) Structure et régulation
L‟AMPK est une sérine/thréonine kinase exprimée dans un grand nombre de
tissus. C‟est une protéine hétérotrimérique constituée d‟une sous-unité catalytique ( ) et
de deux sous-unités régulatrices (β et γ) (112). Différentes isoformes ont été mises en
évidence pour chacune de ces sous-unités, pouvant conduire à 12 possibilités
combinatoires. L‟association différentielle de ces isoformes confère à l'AMPK une
certaine spécificité tissulaire (les complexes composés de l‟isoforme γ3 sont exprimés
spécifiquement dans le muscle squelettique) et pourrait, au sein d‟un même tissu, se
traduire par des fonctionnalités différentes (113). L‟état d‟activation de l‟AMPK dépend
de la concentration intracellulaire en AMP. Cette dernière est étroitement liée à la
concentration d‟ATP et les deux varient en fonction de l‟état métabolique. Dans la
cellule, une déplétion en ATP s‟accompagne d‟une augmentation plus marquée de la
concentration en AMP. Ce système est très sensible puisqu‟une diminution de 10 % de
la concentration d‟ATP se traduit par une augmentation d‟environ 100 % de la
concentration d‟AMP. L‟AMP constitue ainsi un très bon indicateur des variations
énergétiques de la cellule.
L‟AMP est aussi capable d‟empêcher l‟interaction entre l‟AMPK et des protéines
phosphatases (PP2A et PP2C) qui vont déphosphoryler et inactiver l‟AMPK (114).
Enfin, l‟AMP active l‟AMPK de manière allostérique mais favorise également la
phosphorylation par une AMPK kinase (AMPKK) de la thréonine 172 située dans la
boucle d‟activation de la sous-unité catalytique de l‟AMPK.
Cette phosphorylation, indispensable à l‟activation de l‟AMPK, est catalysée par une
protéine serine/thréonine kinase récemment identifiée comme étant LKB1, un
suppresseur de tumeur (115, 116). LKB1 est associée à d‟autres protéines (MO25 et
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STRAD) pour former un complexe actif (117). Dans le muscle squelettique, l‟invalidation
de LKB1 entraîne une perte de la stimulation de l‟AMPK obtenue avec l‟AICAR (118).
La phosphorylation et l‟activation de l‟AMPK a également été observée dans des
conditions n‟induisant pas de modifications du rapport AMP/ATP comme, par exemple,
lors de chocs osmotiques. Cette activation implique une autre AMPKK, la
Ca2+/calmoduline kinase kinase (CaMKK) qui phosphoryle également la sous-unité
catalytique sur la thréonine 172 (119-121).
Une troisième AMPK kinase a pu être identifiée. Il s‟agit de la Transforming
growth factor- activated kinase 1 (TAK1) qui est une sérine/thréonine kinase qui
s‟associe avec d‟autres protéines pour être active (les TABs pour TAK binding protein)
(122). Bien que tous les mécanismes ne soient pas totalement élucidés, il a été montré
que TAK1 est activée par différentes cytokines comme le TGF ou le TNF et plus
directement par des changements du ratio AMP/ATP (123).
c) Régulation du métabolisme énergétique
L‟AMPK joue un rôle important dans la régulation du métabolisme glucidique. En
effet, elle stimule le transport de glucose dans le muscle et dans l'adipocyte, en
induisant la translocation du transporteur GLUT4 à la membrane plasmique. Le
mécanisme par lequel l‟AMPK induit cette translocation est indépendant de l‟action de
l‟insuline et pourrait impliquer la synthase d'oxyde nitrique (NOS) (101, 105).
De la même manière que l‟exercice physique, l‟AMPK induit l‟expression de
protéines telles que GLUT4, l‟hexokinase II et des enzymes mitochondriales,
nécessaires à l‟utilisation des substrats glucidiques (124). L‟activation de l‟AMPK dans le
muscle pourrait donc avoir des effets bénéfiques chez les patients obèses, au même
titre que l‟exercice physique. Parallèlement à la translocation de GLUT4, dans le
muscle, l‟AMPK inhibe la glycogène synthase (99, 100) diminuant ainsi la synthèse de
glycogène et permettant à la cellule d‟orienter le glucose vers la production d‟énergie
(glycolyse). Dans le cœur, l‟AMPK stimule le transport de glucose, mais également la
glycolyse en phosphorylant et activant la 6-phosphofructokinase-2 (125, 126). Enfin
dans le foie, l‟AMPK inhibe l‟expression de la phosphoénolpyruvate carboxykinase et de
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la glucose-6-phosphatase, deux enzymes clés de la néoglucogenèse (127).
L‟augmentation de la production hépatique de glucose étant une des conséquences
majeures de l‟insulino-résistance, l‟activation de l‟AMPK dans le foie pourrait donc
également avoir des effets bénéfiques chez les patients insulino-résistants (128).
Dans les cellules β pancréatiques, l‟AMPK pourrait réguler la production de
l‟insuline mais son mode d‟action n‟est pas encore établi et ses cibles n‟ont à ce jour pas
été identifiées avec précision. Cependant, une activation de l‟AMPK par l‟AICAR dans
les cellules β pancréatiques et sur des îlots pancréatiques de rat augmente la sécrétion
d'insuline (129).
L‟activation de l‟AMPK conduit à la phosphorylation ou à une modulation de l‟expression
d‟un nombre important de protéines cibles impliquées dans la régulation du métabolisme
gluco-lipidique (130). Elle joue aussi un rôle clé dans la régulation du métabolisme
lipidique à la fois en terme de synthèse et d‟utilisation des acides gras.
L‟activation de l‟AMPK inhibe la lipogenèse et la synthèse de cholestérol en
phosphorylant et en inhibant respectivement l‟acétyl-CoA carboxylase (ACC) (131) et la
3-hydroxy-3-méthylglutaryl- CoA réductase (132). A plus long terme, l‟AMPK inhibe la
lipogenèse dans le foie en diminuant l‟expression de gènes glycolytiques et
lipogéniques tels que la L-pyruvate kinase et la synthase des acides gras. Cet effet
inhibiteur à long terme s‟effectue via l‟inhibition de l‟expression et de l‟activité de deux
facteurs de transcription lipogéniques : ChREBP (133) et SREBP1c (102).
Un des effets majeurs de l‟AMPK dans la régulation du métabolisme lipidique et
qui pourrait jouer un rôle central dans le traitement de l‟obésité et de l‟insulinorésistance
est la stimulation de l‟oxydation des acides gras. En effet, comme nous le verrons dans
les prochains chapitres, l‟accumulation d‟acides gras dans des cellules non adipeuses
conduit à la production de dérivés métaboliques comme les acyl-CoA, le diacylglycérol
ou les céramides qui interfèrent avec la transmission du signal insulinique et induisent
une insulino-résistance. L‟inhibition de l‟ACC par l‟AMPK entraîne une diminution des
concentrations intracellulaires en malonyl-CoA, un intermédiaire de la voie lipogénique
mais également un puissant inhibiteur de la Carnitine Palmitoyl Transférase I (CPT1). La
CPT1 est l‟enzyme régulant l‟entrée des acyl-CoA à chaîne longue dans la
mitochondrie, étape limitante de la β-oxydation. En inhibant l‟ACC, l‟AMPK favorise donc
l‟entrée des acides gras dans la mitochondrie et leur oxydation. Les tissus non
lipogéniques expriment une seconde isoforme de l‟ACC (ACC2 ou ACCβ) codée par un
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gène différent de l‟isoforme exprimée dans les tissus lipogéniques (ACC1 ou ACCα).
L‟ACC2, dans des tissus comme le muscle, agirait comme un régulateur de l‟oxydation
des acides gras via la synthèse de malonyl-CoA (134). Différentes études ont montré
que l‟AMPK était capable de phosphoryler et inhiber les deux isoformes de l‟ACC
(Hardie et al., 2003). L‟inhibition de l‟ACC par l‟AMPK pourrait donc être un moyen
efficace d‟améliorer l‟insulino-sensiblité des patients obèses et de diminuer
l‟accumulation ectopique de graisses. Il a de plus été montré que les complexes AMPK
contenant l‟isoforme γ3 (spécifiquement exprimée dans le muscle squelettique)
permettaient une oxydation préférentielle des acides gras. Une mutation spécifique de
cette sous-unité, augmentant l‟activité basale de l‟AMPK, protége le muscle de
l‟accumulation de triglycérides et de l‟insulino-résistance (130). Cela fait de cette
isoforme γ3 une cible intéressante pour prévenir l‟apparition de l‟insulino-résistance
musculaire.
Fig. 11 Rôles métaboliques et activation de l’AMPK.
L‟AMPK est un senseur métabolique. Différents stimulis sont à l‟origine de son activation comme
l‟hypoxie, l‟ischémie, l‟exercice physique ou un déficit en glucose. Des molécules endogènes (leptine,
adiponectine,…) ou exogènes (AICAR, Metformine,…) sont aussi capables de stimuler la
phosphorylation de cette protéine. L‟AMPK joue un rôle sur les phénomènes producteurs (Inhibition
de la néoglucogénèse) ou consommateurs (activation du transport de glucose et de la glycolyse) de
glucose.
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L‟AMPK pourrait prévenir également l‟accumulation d‟acides gras dans les cellules non
adipeuses en diminuant les concentrations plasmatiques d‟acides gras libres. En effet, il
a été montré, dans le tissu adipeux blanc, que l‟activation de l‟AMPK inhibait la lipolyse
induite par les catécholamines exerçant ainsi un retro-contrôle négatif permettant de
limiter la libération des acides gras (135, 136). Dans l‟adipocyte, l‟AMPK agit en
phosphorylant et en inhibant la translocation de la LHS vers la gouttelette lipidique
(135).
d) L’AMPK, médiateur des effets métaboliques des médicaments anti-
diabétiques
Un des intérêts suscités par l‟AMPK en tant que cible dans le traitement du diabète et de
l‟obésité est venu du fait que deux classes d‟anti-diabétiques, les thiazolidinediones
(TZDs) et les biguanides exercent certains de leurs effets métaboliques en activant
l‟AMPK.
L‟administration de TZDs chez le rat insulino-résistant diminue l‟accumulation de
lipides dans la cellule β pancréatique et le cœur, et prévient le développement du
diabète et des cardiomyopathies chez ces animaux. Chez l‟homme, les TZDs améliorent
l‟insulino sensibilité (137) et diminuent l‟accumulation lipidique dans le foie (138). Les
effets bénéfiques des TZDs ont largement été attribués à leur action sur le facteur de
transcription PPARγ, permettant d‟induire la différenciation adipocytaire et donc de
stimuler la capacité du tissu adipeux à stocker les acides gras. Cependant, des effets à
court terme des TZDs, indépendants de la voie PPARγ et de modifications d‟expression
génique, ont été rapportés notamment dans le muscle squelettique de patients obèses
et diabétiques. Un traitement aigu par les TZDs de cellules musculaires de patients
diabétiques stimule le transport de glucose par un mécanisme indépendant de la voie de
signalisation insulinique (139).
La metformine appartient à la famille des biguanides, également utilisée dans le
traitement du diabète de type 2. Par ses effets hypoglycémiant et hypolipémiant, elle
permet chez les patients diabétiques de rétablir l‟homéostasie glucido-lipidique et
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d‟améliorer leur sensibilité à l‟insuline. Dans le foie et le muscle de rat, la metformine
exerce certains de ses effets en activant l‟AMPK, ce qui conduit à l‟inhibition de la
néoglucogenèse, à la stimulation de l‟oxydation des acides gras dans le foie et à
l‟augmentation du transport de glucose dans le muscle (102). Une activation de l‟AMPK
a été observée dans le muscle de patients diabétiques traités à la metformine (140) et
une étude réalisée dans une lignée cellulaire hépatocytaire humaine rendue insulino-
résistante a montré que la metformine, en activant l‟AMPK, diminuait les concentrations
intracellulaires en acides gras (141).
Bien que l‟activation de l‟AMPK par les TZDs et les biguanides ne soit pas le seul
mécanisme impliqué, il semble qu‟elle joue un rôle important dans la médiation de leurs
effets sur la sensibilisation des tissus à l‟insuline. Le mécanisme par lequel ces deux
classes d‟anti-diabétiques activent l‟AMPK n‟est pas clairement établi, mais pourrait
impliquer une inhibition de la chaîne respiratoire induisant une augmentation du rapport
AMP/ATP (112).
e) AMPK hypothalamique et régulation de la prise alimentaire
L‟hypothalamus est la principale région du système nerveux central impliquée
dans la régulation de l‟homéostasie énergétique et de la prise alimentaire. L‟intégration
des signaux neuroendocrines et métaboliques par les neurones hypothalamiques
permet à l‟organisme de s‟adapter aux changements d‟apport et de dépense
énergétique.
Une balance énergétique négative (au cours du jeûne) induit au niveau de
l‟hypothalamus la mise en place de signaux conduisant à une stimulation de la prise
alimentaire.
Différentes études ont montré simultanément que l‟activation de l‟AMPK dans
l‟hypothalamus augmentait la prise alimentaire et le poids corporel chez le rongeur et
qu‟à l‟inverse, son inhibition diminuait la prise alimentaire et le poids des animaux (103,
142, 143). L‟activation de l‟AMPK induit une augmentation de l‟expression des peptides
oréxigènes et, à l‟inverse, l‟inhibition de l‟AMPK hypothalamique diminue leur
expression, conduisant à une inhibition de la prise alimentaire. Différents signaux
connus pour moduler la prise alimentaire induisent des variations d‟activité de l‟AMPK.
Le jeûne active l‟AMPK dans l‟hypothalamus alors que la réalimentation ainsi qu‟une
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hyperglycémie ou une hyperinsulinémie inhibent son activité. Certains signaux
orexigènes (e.g. la ghréline, l‟AGRP et les endocannabinoïdes) activent l‟AMPK et des
signaux anorexigènes, tels que la leptine ou les agonistes des récepteurs de type 4 à la
mélanocortine (MC4R), inhibent l‟activité AMPK hypothalamique.
De manière intéressante, on observe une régulation différentielle de l‟activité AMPK
hypothalamique et périphérique en réponse à certains signaux physiologiques. C‟est le
cas de la leptine qui stimule l‟activité AMPK dans le muscle squelettique et qui, à
l‟inverse, l‟inhibe dans l‟hypothalamus. Il existe donc vraisemblablement différents
mécanismes de régulation, qui à l‟heure actuelle n‟ont pas encore été identifiés.
3) Le transporteur de glucose GLUT4
a) Régulation de l’expression de GLUT4
La quantité de GLUT4 à la surface d‟une cellule va contrôler l‟entrée de glucose
dans les tissus insulino-dépendants. Ainsi, le contrôle de son expression peut être
considéré comme un mécanisme important de la régulation de l‟homéostasie du
glucose.
En 1989, cinq groupes de recherche indépendants rapportent le clonage de
l‟ADN complémentaire de GLUT4 (1). La quantité de GLUT4 (ARNm) diminue dans le
tissu adipeux et les muscles glycolytiques lorsque l‟insulinémie est maintenue basse par
une période de jeûne ou un traitement à la streptozotocine qui va inhiber la production
d‟insuline (144). Afin de dissocier l'effet d'une diminution de l'insulinémie et celui d'une
augmentation de la glycémie, Burcelin et ses collaborateurs ont montré que la
normalisation de la glycémie par une infusion physiologique d‟insuline permettait de
récupérer une expression normale du transporteur dans le tissu adipeux ce qui suggère
que c‟est bien l‟insulinopénie, et non l‟hyperglycémie qui est responsable des effets
observés (145). Par contre, l‟utilisation de la phlorizine (analogue du glucose qui permet
l‟excrétion de glucose par le rein) qui conduit à une diminution de la glycémie a mené à
une conclusion inverse dans le muscle squelettique (146, 147). En accord avec ces
études, Klip et ses collaborateurs ont concluent que l‟hyperglycémie diminue
l‟expression de GLUT4 dans le muscle squelettique, mais pas dans le tissu adipeux
- 47 -
(148). Etrangement, il n‟y a pas d‟élément de réponse génique sensible au glucose
connu sur le gène de GLUT4, ni de GLUT1. Par contre, la génération de souris
transgéniques exprimant un gène rapporteur sous la gouverne de différents fragments
du promoteur de GLUT4 a permis de bien identifier une région sensible à l‟insuline
(149).
b) La translocation de GLUT4
Avant même d‟avoir identifié et cloné GLUT4, on savait que l‟insuline provoquait la
redistribution intracellulaire d‟un « système » de transport du glucose (150, 151). GLUT4
se démarque des autres GLUTs par cette particularité qu‟il a d‟être hautement régulé
par l‟insuline. Fortement et spécifiquement exprimé dans le muscle et le tissu adipeux, il
en fait les deux plus grands consommateurs de glucose post-prandial, au moment où
l‟insulinémie est la plus élevée. L‟insuline réussit à augmenter le transport du glucose
dans les cellules qui contiennent GLUT4 en augmentant l‟activité intrinsèque de ce
transporteur, mais surtout par l‟entremise de cette redistribution cellulaire vers la surface
membranaire qu‟on appelle la translocation. Contrairement à GLUT1 (65%
d‟homologie), GLUT4 est essentiellement intracellulaire à l‟état basal, dissimulé dans
des compartiments intracellulaires en attente du signal insulinique. Ce n‟est qu‟une fois
à la membrane qu‟il peut aider le glucose à la traverser.
En condition basale, GLUT4 circule lentement entre les membranes internes
(endosomes et appareil de Golgi) et la membrane plasmatique. Il se retrouve aussi dans
un compartiment plus statique, les vésicules d‟entreposage de GLUT4, qui peuvent se
mêler aux endosomes ou aller directement à la membrane plasmique lorsque l‟insuline
stimule le processus de translocation. La stimulation par l‟insuline, via les voies de
signalisation PI3K produit une augmentation de l‟exocytose de GLUT4 accompagné
d‟une réduction de son endocytose (152). Le résultat est une augmentation nette de la
quantité de transporteurs à la membrane cellulaire de deux à huit fois dans muscle
squelettique ou dans l'adipocyte (153).
Fusion des membranes- La translocation des vésicules enrichies en GLUT4 vers la
membrane plasmique n‟est efficace pour augmenter le transport du glucose que si elles
s‟attachent, s‟amarrent et fusionnent avec cette membrane. Les protéines qui
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permettent l‟interaction entre les membranes en jeu sont appelées les SNAREs (SNAP
receptors). On place d‟un côté les t-SNARES (présents sur la membrane cellulaire ( t
arget)), membres de la famille des syntaxines, et de l‟autre, les v-SNAREs (pour
vésicules), membres de la famille des VAMPs. Les cellules expriment un grand nombre
de SNAREs. Dans le cas de la translocation des vésicules enrichies en GLUT4 stimulée
par l‟insuline, la syntaxine-4 est le seul t-SNARE impliqué et VAMP2 (synaptobrevin 2)
est le principal v-SNARE. SNAP23 (SNAP25 dans les adipocytes), Munc18c349-351 et
Synip352 y sont des partenaires (154).
c) L’activité intrinsèque
Il est relativement fréquent de voir dans la littérature des exemples où l‟augmentation du
transport du glucose diffère de l‟augmentation de la quantité de GLUT4 à la membrane
cellulaire (153). L‟utilisation de myocytes L6-GLUT4myc a permis d‟observer un
décalage entre la translocation de GLUT4 et le transport du glucose, suggérant que la
translocation n‟est pas le seul mécanisme nécessaire à l‟augmentation du transport du
glucose. De plus, la translocation et le transport du glucose diffèrent aussi quant à leur
sensibilité à l‟inhibiteur de la PI3K, la wortmannin (155). Pour expliquer ces
discordances, plusieurs études soutiennent que l‟insuline a aussi la capacité
d‟augmenter l‟activité intrinsèque de GLUT4.
L‟insuline induit la phosphorylation et l‟activation de la p38 MAPK. L‟expression
d‟un mutant inactif ou l‟inhibition de cette kinase avec des inhibiteurs spécifiques
inhibent à plus de 60% le transport du glucose, sans toutefois affecter la translocation
(156, 157). Ces résultats supportent donc l‟idée d‟une régulation de l‟activité intrinsèque
du transporteur, où p38 MAPK aurait un rôle crucial. Cependant, le mécanisme par
lequel p38 MAPK régule l‟activité de GLUT4 n‟est pas encore connu (153).
d) Surexpression de GLUT4
La surexpression de GLUT4 dans le tissu adipeux de souris entraîne une augmentation
de l‟adiposité (stockage du glucose dans les adipocytes sous forme de TG) qui
provoque une amélioration de la tolérance au glucose et en une meilleure utilisation du
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glucose stimulé par l‟insuline (10, 158-161). La surexpression de GLUT4 ciblée aux
muscles a aussi permis d‟améliorer la sensibilité à l‟insuline sans induire d‟obésité (162).
e) Invalidation génétique de GLUT4
Les souris invalidées pour GLUT4 sont environ 20% plus petites que leurs
semblables, elles ont une espérance de vie raccourcie, une forte réduction de la masse
adipeuse et un coeur plus gros exprimant davantage de GLUT1 (163). De façon
surprenante, elles ont une glycémie normale, et elles répondent normalement au test de
tolérance au glucose. On observe tout de même une augmentation de l‟insulinémie
postprandiale, et une certaine résistance à l‟insuline décelée par un test de tolérance à
l‟insuline. On pense que la compensation par d‟autres GLUTs ou une captation plus
grande du glucose par le foie (via GLUT2) expliquerait ce phénotype plus modéré qu‟on
l‟aurait prédit (163-165). Ce qui reste plus difficile à expliquer, c‟est le phénotype des
souris hétérozygotes qui semblent plus atteintes (166). En effet, elles sont
hyperinsulinémiques, hyperglycémiques et montrent des symptômes histopathologiques
d‟un diabète de type 2 au niveau du coeur et du foie. La restauration de GLUT4
uniquement dans le muscle (162) suffit à rééquilibrer le métabolisme du glucose, ce qui
appuie bien l‟importance de ce tissu dans le développement de la résistance à l‟insuline.
Les souris invalidées pour GLUT4 spécifiquement dans le muscle squelettique et
cardiaque (165) montrent aussi une augmentation de GLUT1 dans un coeur plus gros.
Par contre, contrairement aux souris complètement invalidées, le poids n‟est pas
affecté, ni la masse adipeuse et les souris ont une espérance de vie normale. Elles sont
hyperglycémiques et intolérantes au glucose tandis que certaines développent un
diabète. Le transport du glucose stimulé par l‟insuline est sévèrement réduit dans le
muscle, mais aussi dans le tissu adipeux. La suppression de la production hépatique de
glucose par l‟insuline est aussi affectée (167).
Enfin, l‟invalidation de GLUT4 limitée aux tissus adipeux, blanc et brun, n‟affecte
ni la masse adipeuse, ni la taille du coeur. Par contre, même si le tissu adipeux
représente normalement moins de 10% du transport du glucose de tout l‟organisme, ces
souris sont résistantes à l‟insuline, intolérantes au glucose et certaines développent un
- 50 -
diabète (168). Un clamp hyperinsulinémique euglycémique a montré une réduction de
50% du transport du glucose total. In vivo, le transport du glucose dans le tissu adipeux
est atténué, tout comme dans le muscle squelettique, ainsi que la suppression de la
production hépatique de glucose. Cependant, dans le muscle ex vivo, les niveaux de
transport du glucose redeviennent normaux, suggérant que l‟inhibition du transport du
glucose dans le muscle est secondaire à l‟environnement « in vivo ». Pourtant, les
facteurs habituellement sécrétés par le tissu adipeux pouvant modifier la sensibilité à
l'insuline, que sont les acides gras libres, la leptine, le TNF- (Tumor Necrosis Factor-
), la résistine et l‟adiponectine ont des niveaux sanguins tout à fait normaux (169, 170).
De plus, aucun dépôt inhabituel de TG dans le muscle ni le foie n‟a été observé.
- 51 -
PARTIE II De l'Obésité à la Résistance à
l'Insuline...
I. L’Obésité et le tissu adipeux
1) Définition et mesure de l'obésité
L'obésité est reconnue comme maladie chronique en 1997 par l'OMS. Cette
organisation définit « le surpoids et l'obésité comme une accumulation anormale ou
excessive de graisse corporelle qui peut nuire à la santé ». Cette prise de poids
indésirable résulte le plus souvent d‟un excès d‟apport et/ou d‟une diminution des
dépenses énergétiques (171).
Le principal indicateur de mesure utilisé est l'indice de masse corporelle (IMC).
Pour les adultes, l'indice de masse corporelle est égal à la masse (exprimée en
kilogrammes) divisée par le carré de la taille de la personne (en mètre) :
IMC =
* Un IMC entre 18,5 et 25 est considéré comme normal chez un adulte.
* Entre 25 à 30, on parle de surpoids (surcharge pondérale).
* Au-delà de 30, on parle d'obésité.
* De 35 à 40, on parle d'obésité sévère et, au-delà de 40, d'obésité morbide.
Les limites de ce type de mesure résident dans le fait que l'IMC se base
principalement sur une population de type européenne et surtout qu‟il ne tient pas
compte de la répartition des graisses dans l‟organisme qui, comme nous allons le voir
dans les prochains chapitres, peut être la cause de certaines pathologies associées à
l‟obésité.
On peut aussi déterminer l'adiposité d'un individu en mesurant simplement le tour
de taille ou en calculant le ratio tour de taille/tour de hanches (172-174). Ici aussi, la
Masse
Taille 2
- 52 -
mesure ne permet pas de caractériser avec précision la localisation des dépôts adipeux
mais renseigne plutôt sur un développement anormal du tissu adipeux.
Autre alternative à l‟IMC: l'indice de masse graisseuse, qui lui ne tient pas compte
de la taille et du poids mais simplement du taux de graisse et de muscle contenu dans le
corps de l'individu. Cette mesure fine de l‟obésité via la quantification des dépôts
adipeux peut se faire par tomodensitométrie (CT-scan) ou par imagerie à résonance
magnétique (IRM). Un taux normal de graisse se situe entre 17 et 22 %. Ces méthodes
non invasives, basées sur l‟utilisation des rayons X, permettent de localiser et de
quantifier précisément le tissu adipeux au sein de l‟organisme (175).
2) Epidémiologie
Au plan mondial, l’International Obesity Task Force estime à 1,1 milliard le
nombre d‟adultes en surpoids et à près de 312 millions le nombre d‟adultes obèses. En
Europe, depuis les années 80, la prévalence de l‟obésité a été multipliée par trois,
même dans les pays traditionnellement caractérisés par des taux peu élevés de
surcharge pondérale et d‟obésité. Selon un rapport récent de l‟OMS, l‟obésité en Europe
serait à l‟origine d‟un million de décès par an.
Si aucune mesure n‟est prise et si la prévalence de l‟obésité continue à progresser au
même rythme, on estime que l‟Europe comptera 150 millions d‟adultes (20% de la
population) et 15 millions d‟enfants et d‟adolescents obèses (10% de la population) d‟ici
2010.
3) Le tissu adipeux
a) Généralités
Il existe deux types de TA chez la plupart des mammifères (176): le tissu adipeux
blanc et le tissu adipeux brun. Le plus abondant chez l‟homme est le tissu adipeux blanc
(TA). Le TA blanc est le « lieu » de stockage de l‟énergie par excellence mais qu‟il est
depuis quelques années aussi considéré comme un organe endocrine à part entière
pouvant participer à la régulation de différents processus physiologique et pathologiques
(177).
- 53 -
Le tissu adipeux brun (TA brun) est peu présent chez l‟homme adulte alors qu‟il
est essentiel chez le rongeur. Le principal rôle de ce tissu est de maintenir une
température constante chez le petit animal grâce au phénomène de thermogénèse.
Jusqu'à récemment, il était admis que le TA brun humain était présent et actif
uniquement chez le nouveau-né. Cependant, des études de tomodensitométrie ont
permis d'identifier que ce tissu était aussi retrouvé chez certains adultes (10% de la
population) au niveau cervical, supraclaviculaire, paravertébral, médiastinal, para-
aortique et suprarénal. Cette nouvelle cartographie du TA brun a même permis
d'envisager un rôle de ce tissu dans la régulation de la balance énergétique (178). De
plus en plus d'intérêt est porté à ce tissu depuis que de nouvelles propriétés le
rapprochant du tissu musculaire ont été démontrées chez l'adulte. En effet, le TA brun
semble être assez proche du muscle squelettique: ces deux tissus utilisent la
phosphorylation oxydative pour consommer de l'énergie, ils possèdent de nombreuses
mitochondries et sont capables de faire la thermogénèse adaptative pour produire de la
chaleur. Récemment, une étude faite par Seale et ses collaborateurs (179) a montré
que le TA brun et le muscle possédaient une cellule progénitrice commune exprimant le
facteur de transcription Myf5 que l'on ne retrouve pas dans le TAB. Dans cette étude,
les auteurs montrent également que le régulateur transcriptionnel PRDM16 permet
d'orienter ce progéniteur commun vers un phénotype d'adipocyte brun alors que son
invalidation conduit à une augmentation de l'expression de gènes caractéristiques du
phénotype musculaire. Réciproquement, la surexpression de PRDM16 dans des
myoblastes en culture induit une adipogénèse (179). D'autres études sont actuellement
en cours pour mieux caractériser l'importance métabolique de ce tissu et déterminer
quels sont les différents acteurs impliqués dans la détermination phénotypique
conduisant à l'adipocyte brun.
b) Distribution anatomique des TA
Chez l‟homme normopondéral, le TA blanc est divisé en deux types de tissus possédant
des caractéristiques propres : le TA blanc sous cutané (TASC) et le tissu adipeux blanc
viscéral (TAV) .
- 54 -
Comme son nom l‟indique, le TASC est une couche de gras localisée entre les
muscles et la peau mais aussi entre les fascias musculaires. D‟un point de vue
anatomique, ce tissu représente 80% du TA de l‟organisme d‟un individu sain et il est
localisé au niveau du tronc, de la zone glutéo-fémorale, de la poitrine mais aussi au
niveau de la face.
Le TAV est un tissu profond qui va entourer les viscères. Ainsi, ce TA interne sera
surtout retrouvé au niveau péritonéal (ommental, mésentérique), retropéritonéal
(periaortique, perirénal,…) mais également intrapelvien (gonadique et urogenital). De
plus, comme décrit sur la figure 1, un deuxième type de TA -profond mais non-viscéral-
pourra être localisé au niveau péri- ou intra-musculaire ainsi qu‟au niveau du cœur. Ce
troisième type de dépôt adipeux a été peu étudié jusqu‟à présent mais de plus en plus
de travaux récents montrent aujourd‟hui l‟implication de ce TA dans la genèse de
certaines pathologies associées à l‟obésité.
Le TA de l‟homme sain ou obèse possède des caractéristiques propres à sa
localisation anatomique qui sont influencées par l‟age et le sexe de l‟individu. Le
dimorphisme sexuel observé lors de différentes études a permis d‟introduire les termes
de distribution androïde ou gynoïde de la masse grasse. Chez la femme possédant un
poids normal, le TASC est surtout localisé au niveau de la zone glutéo-fémorale ainsi
qu‟au niveau de la poitrine. Chez l‟homme normopondéral, les dépôts adipeux
superficiels se retrouvent au niveau de la nuque, d‟une zone allant des muscles
deltoïdes aux triceps ainsi qu‟au niveau de la région lombaire. En revanche, chez les
deux sexes (plus marqué chez les hommes), le TAV se retrouve surtout au niveau de
l‟omentum, du mésentère et de la zone rétropéritonéale.
Chez le rongeur, et plus précisément chez la souris qui est le modèle animal que
j‟ai utilisé au cours de ces travaux de thèse, le tissu adipeux blanc peut être également
divisé en sous-cutané et interne (ou viscéral). Le tissu adipeux sous cutané est surtout
localisé au niveau inguinal entre le péritoine et la peau ainsi qu‟au niveau des pattes
postérieures alors que le TA viscéral est essentiellement concentré autour des gonades
(TA périgonadique) et des reins (TA périrénal). (180).
- 55 -
c) Structure du TA
Le TA présente une grande hétérogénéité cellulaire. Les cellules de ce tissu
peuvent être séparées en deux grandes populations: les adipocytes matures et la
fraction non-adipocytaire ou fraction stroma-vasculaire (FSV).
L'adipocyte
L'adipocyte est la principale cellule qui compose le TA, elle est ronde,
volumineuse (diamètre allant d'une vingtaine de micromètres à plus d'une centaine pour
les plus grosses) et possède un cytoplasme réduit du fait de la présence de la vacuole
lipidique. Cette vacuole, qui occupe l'essentiel de la cellule, contient les réserves
énergétiques stockées sous formes de TG. Comme nous l'avons déjà vu, la lipogénèse
et la lipolyse sont les deux grands mécanismes permettant à l'adipocyte de stocker ou
de libérer le contenu énergétique de la vacuole.
La FSV contient des préadipocytes, des cellules endothéliales, des cellules
hématopoïétiques (macrophages, lymphocytes,…), des cellules précurseurs ainsi que
des cellules nerveuses. Martin Rodbell, en 1964, est le premier à proposer une méthode
permettant de séparer les adipocytes matures des cellules de la FSV basée sur une
digestion à la collagénase (181). Aujourd‟hui l‟approche utilisée pour définir les
différentes cellules composant le TA se base sur des analyses en cytométrie en flux
permettant de caractériser à l‟aide de marqueurs membranaires les populations
cellulaires de la FSV fraîchement isolée. Trois marqueurs principaux sont utilisés :
-CD34 ou Mucosialine est exprimé à la surface des cellules souches
hématopoïétiques, des cellules endothéliales progénitrices et des cellules endothéliales
des capillaires sanguins
-CD31 ou PECAM (platelet endothelial cell adhesion molecule) est fortement
exprimé à la surface des cellules endothéliales de tout type et de manière plus diffuse
sur les cellules de la lignée monocytaire et les plaquettes
-CD14 ou récepteur aux lipopolysaccharides (LPS) est exprimé à la surface des
cellules de la lignée monocytaire.
- 56 -
L‟utilisation combinée d‟anticorps dirigés contre ces trois marqueurs couplés à
des fluorochromes différents, permet, en combinaison avec les données obtenues sur la
taille et la granularité des cellules, d‟identifier au sein de la FSV, des populations
cellulaires distinctes. En parallèle, une approche originale d„immuno-sélection de ces
populations cellulaires en utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps
reconnaissant ces trois marqueurs de surface à été développée (182)
Ainsi on distingue :
- les cellules CD34+/CD31+ : cellules endothéliales capillaires
- les cellules CD14+/ CD31+ : macrophages
- les cellules CD34+/ CD31- : cellules progénitrices.
Le préadipocyte
L‟augmentation du nombre d‟adipocytes qui peut être observée au sein du TA est
due à la différenciation d‟une cellule présente dans la FSV et nommée préadipocyte .Le
pré-adipocyte est un type cellulaire relativement immature qui peut se différencier en
adipocyte. En 2005, Sengenes et ses collaborateurs ont mis en évidence que les
cellules CD34+/CD31- présentaient la capacité de se différencier en adipocytes
lorsqu‟elles sont cultivées en milieu adipogénique. Elles expriment alors des gènes
adipocytaires (LPL, LHS, aP2 et FAS) et développent progressivement les activités
métaboliques adipocytaires que sont la lipolyse et la lipogénèse (182). Cependant ces
cellules sont bipotentes car elles peuvent aussi se différencier en cellules endothéliales
lorsqu‟elles sont cultivées dans un milieu de diiférenciation approprié pour ce type
cellulaire.
Les cellules endothéliales
La microcirculation- Le rôle de l‟endothélium dans le développement du TA est
reconnu depuis longtemps. Cependant peu d‟études concernent cette composante du
TA par le fait que ce tissu est généralement considéré comme peu vascularisé. Cette
faible vascularisation apparente est en fait due à la taille élevée des adipocytes. En
effet, le jeûne chez l‟animal qui s‟accompagne d‟une diminution de la taille des
- 57 -
adipocytes, permet de mettre en évidence un réseau capillaire important autour de
chaque adipocyte. Ainsi quand on prend en compte le « volume maigre » de l‟adipocyte
et la surface capillaire, le réseau vasculaire dans le TA blanc est aussi élevé que celui
du muscle squelettique.
Rôle dans la formation du TA- Au niveau du développement du TA embryonnaire, les
analyses histologiques montrent une relation étroite entre le développement des
vaisseaux sanguins et celui des adipocytes (183). Récemment, les études réalisées par
Neels (184), utilisant l‟implantation sous-cutanée de cellules de la lignées
préadipocytaire 3T3F442A chez la souris, ont clairement associé l‟apparition des
marqueurs de l‟adipogénèse à ceux des marqueurs endothéliaux. Ces observations ont
été complétées par les travaux de Fukumura montrant que des préadipocytes
transfectés par une forme dominante négative de PPAR empêchant l‟adipogénèse,
inhibe l‟angiogénèse au site d‟implantation. En parallèle, l‟inhibition de l‟angiogénèse par
un anticorps neutralisant anti-VEGFR2 inhibe l‟adipogénèse (185).
En résumé, adipogénèse et angiogénèse sont deux phénomènes étroitement liés
et complémentaires au sein du TA. Dans ce sens, des études réalisées sur les lignées
murines de préadipocytes (3T3L1 et 3T3F442A) suggèrent que l‟hypoxie est un
inhibiteur puissant de l‟adipogénèse (186-188).
Rôle dans le développement du TA- Les analyses en cytométrie en flux montrent que
le pourcentage des cellules endothéliales des capillaires sanguins est proportionnel à
l‟augmentation du volume du TA (189). La dépendance du TA vis à vis de son réseau
vasculaire a été mise en évidence par des traitements de souris par des facteurs anti-
angiogéniques (190). L‟apoptose des cellules endothéliales induite par ces traitements
conduit à une prévention, mais également à une réversion, du développement du TA.
L‟endothélium joue donc un rôle déterminant dans la croissance, mais également dans
le maintient de la masse grasse.
Les cellules inflammatoires
La présence de cellules inflammatoires au sein de la FSV du TA humain est
reconnue depuis longtemps. Cependant, des observations récentes suggèrent une
- 58 -
implication de cette population dans la genèse de l‟état inflammatoire et des pathologies
associées à l‟obésité.
Deux populations cellulaires sont distinguables: les lymphocytes et les macrophages.
Les lymphocytes présents dans le TA sont de la famille des Natural Killer (NK).
Le rôle des lymphocytes du TA n‟est pas connu et est en cours de caractérisation.
Les macrophages sont des cellules résidentes dans la majorité des tissus de
l‟organisme. L‟origine des macrophages du TA n‟est pas clairement définie. De part les
similitudes d‟expression génique entre adipocyte et macrophage et l‟observation de
l‟activité de phagocytose que présentent les préadipocytes, il a été suggéré que les
macrophages puissent provenir de la différenciation de préadipocytes (191). Cependant,
il n‟a pu être mis en évidence de formation de colonies monocytaires à partir de
préadipocytes humains (182). Des expériences de transplantation de moelle osseuse
chez la souris démontrent que la majorité des macrophages du TA sont originaires de
cellules dérivant de la moelle osseuse et suggèrent donc que les macrophages du TA
sont originaires de l‟infiltration de monocytes sanguins circulants (192). Nous verrons
dans les prochains chapitres que le TA est un grand producteur de chimiokines (MCP-1
et IL8) qui pourraient participer à l‟attraction des monocytes circulants.
Les macrophages résidents dans les tissus peuvent être considérés comme les
« surveillants » de l‟intégrité tissulaire. Il s‟adaptent à leur micro-environnement en
acquérant des phénotypes et des fonctions spécifiques au tissu dans lequel ils résident
(193). En condition normale, la fonction majeure des macrophages résidents est
d‟éliminer le matériel étranger au tissu et les cellules apoptotiques, processus essentiel
dans le maintien de l‟homéostasie tissulaire. Le rôle des macrophages dans le TA n‟est
pas clairement établi mais des effets locaux et systémiques peuvent être envisagés. En
effet, les macrophages et leurs produits modulent la fonction de sécrétion, le
métabolisme lipidique et la différenciation adipocytaire (194)). Deux populations de
macrophages semblent co-exister dans le TA au cours du développement de l‟obésité.
Une première population appelée M1 présentant un phénotype « pro-inflammatoire » et
une deuxième population M2 présentant un phénotype « anti-inflammatoire » (195). Les
M1 pourraient jouer un rôle dans la mise en place de la résistance à l‟insuline associée
à l‟obésité via la sécrétion de certaines cytokines inflammatoires (195, 196).
- 59 -
A contrario les M2 joueraient un rôle bénéfique et permettraient, via l‟activation du
récepteur nucléaire PPAR de l‟adipocyte, de maintenir la sensibilité à l‟insuline du TA
(197). Le mécanisme expliquant la transition entre les populations M2 et M1 reste à
déterminer. Un travail récent montre que chez la souris, la mise en régime gras pourrait
favoriser l‟expansion de la population M1 (195).
Cependant, ce résultat obtenu chez la souris n‟est pas vérifié chez l‟homme
puisque Bourlier et ses collaborateurs ont pu montrer que le développement du TA
s‟accompagne d‟une augmentation du nombre de macrophages anti-inflammatoires. Les
auteurs expliquent ces différences par le fait que chez la souris, la mise en régime gras
sur une longue période entraîne le développement d‟une insulino-résistance du TA alors
que dans l‟étude de Bourlier, les sujets étudiés étaient des femmes en surpoids mais ne
présentant aucune défaut de sensibilité à l‟insuline. Il semblerait donc que la transition
macrophagique entre les population M2 et M1, observée chez la souris en régime gras,
soit plus directement causée par l‟insulino-résistance du TA et l‟impact du régime gras
plutôt que par l‟expansion du TA. Même si le rôle des macrophages du TA reste encore
flou, quelques pistes ont été évoquées concernant la capacité des sécrétions
macrophagiques à participer au développement du TA. Ainsi, les produits relargués par
le macrophage du TA participeraient à l‟angiogénèse du tissu ainsi qu‟a son expansion,
via la sécrétion de protéines responsables du remodelage de la matrice extra-cellulaire
(198). Cependant, même si de nombreuses études restent à mener pour comprendre
notamment la dynamique entre les populations M1 et M2, le rôle le plus couramment
décrit pour les macrophages du TA est celui d‟un médiateur de l‟inflammation entraînant
une perte de la sensibilité à l‟insuline du TA.
Les Cellules Nerveuses
Le TA est principalement innervé par des fibres ortho- et para-sympathiques
(199). Les fibres noradrénergiques sont étroitement associées au réseau vasculaire et
aux adipocytes. Le neurotransmetteur impliqué dans les messages nerveux du TA est la
noradrénaline, qui se lie aux différents sous-types de récepteurs adrénergiques
(récepteurs 1, 2, et 2 adrénergiques) régulant, en autres, la lipolyse. Ces fibres
- 60 -
nerveuses semblent aussi pouvoir moduler les processus de prolifération et de
différenciation des pré-adipocytes et ainsi réguler l‟évolution de la masse grasse (199,
200).
II. Le syndrome métabolique: focus sur la résistance à l'insuline
1) Définitions
Un ensemble d‟anomalies métaboliques incluant un défaut d'action de l‟insuline, une
glycémie élevée, une dyslipidémie ainsi que des complications cardio-vasculaires ont
tout d‟abord été définies par Reaven en 1988 sous le nom de syndrome métabolique
(SM) (201). Une définition du SM incluant aussi la présence d‟une obésité viscérale a
ensuite été développée par l‟Organisation Mondiale de la Santé dans les années 2000.
Plus récemment, l‟International Diabetes Association (IDA) à proposé de revoir cette
définition et l‟a modifié par une « triade » où l‟augmentation du périmètre abdominal
(supérieur à 94 cm pour les hommes et 80 cm pour les femmes) est un prérequis
associé à 2 facteurs parmi ceux-ci :
- Pression artérielle supérieure à 130/85 mmHg
- Une quantité de triglycérides supérieure à 150 mg/dl*
- Un taux de HDL-Cholestérol inférieur à 40 mg/dl pour les hommes
et 50 mg/dl pour les femmes.*
- Une glycémie supérieure à 5.5 mmol/L.*
*: valeurs à jeun
Quelle que soit la définition privilégiée, toutes s‟accordent à dire que le SM est
caractérisé par une obésité et une résistance à l„insuline (202). Après avoir définit la
physiopathologie de l'insulino-résistance, nous nous attacherons à décrire les liens qui
existent entre l'obésité et cette pathologie.
La résistance à l'insuline est un état pathologique dans lequel les tissus cibles de
l'insuline (foie, TA et muscle squelettique) ne répondent pas correctement à cett
hormone. On sera donc en présence d'une production hépatique de glucose non
contrôlée et d'une utilisation de glucose par les tissus périphériques altérée en réponse
à l'insuline.
- 61 -
2) Etiologie et pathogenèse
L‟insulino-résistance est l‟état qui précède le diabète de type II (DT2). Le DT2 est
l‟affection métabolique la plus répandue dans le monde. Sa prévalence s‟accroît de
manière exponentielle et, selon les prévisions de l‟OMS, plus de 300 millions d‟individus
seront diabétiques en 2025. Contrairement au diabète de type 1 (maladie génétique
auto-immune dirigée contre les cellules du pancréas), le DT2 est une maladie complexe
s‟inscrivant généralement dans le cadre plus large du syndrome métabolique. Son
étiologie est déterminée par l'interaction de facteurs génétiques et environnementaux.
a) Etiologie
Facteurs génétiques- La contribution génétique à l‟étiologie du diabète de type 2 est
très importante comme en témoigne le taux élevé (60-90%) de concordance chez les
jumeaux homozygotes et la prévalence familiale de cette maladie (203). On estime que
le risque de développer un diabète est d'environ 30 % si l'on a un parent diabétique et
approche les 70 % si les 2 parents sont diabétiques. Une histoire familiale de diabète
constitue donc un facteur de risque majeur de développer la maladie. Néanmoins, étant
donné la prévalence élevée du DT2 dans la population générale, il est fort probable que
les gènes de susceptibilité soient très nombreux, ce qui les rend difficiles à identifier. La
majorité des experts s‟accordent pour penser qu‟il s‟agit très vraisemblablement d‟une
affection polygénique (nécessitant la présence conjointe de plusieurs gènes anormaux
pour s‟exprimer) et multigénique (pouvant résulter de différentes combinaisons
d‟anomalies génétiques), ce qui cadre bien avec l‟hétérogénéité phénotypique de la
maladie. L'étude de la génétique du DT2 est particulièrement délicate en raison des
caractéristiques propres à cette affection. En effet, celle-ci apparaît à un âge tardif, elle
est souvent méconnue, son phénotype est mal défini et, enfin, elle est fortement
influencée par des facteurs environnementaux. L‟examen d'un grand nombre de gènes
candidats participant à la régulation de la sécrétion d'insuline (GLUT2, glucokinase...) ou
de son action (récepteur à l'insuline, GLUT4, IRS-1, glycogène synthase...) a conduit à
découvrir quelques formes de diabètes monogéniques (les MODYs), mais aucun gène
- 62 -
attendu intervenant de façon significative dans la forme commune de DT2 n‟a pu être
identifié par cette technique. Le screening du génome entier à la recherche de loci liés
au phénotype diabétique a permis de localiser plusieurs régions du génome présentant
une liaison probable avec le DT2. Dans ce type d‟étude, le problème est que
l‟association entre un locus donné et la susceptibilité au diabète varie d‟un groupe
ethnique à l‟autre. Jusqu‟à présent, le seul gène de susceptibilité pour le diabète de type
2 ayant été identifié par cette technique est celui codant pour la calpaine 10, une
protéase qui semble significativement associée au diabète dans plusieurs populations
(204), mais dont le rôle dans l‟homéostasie glycémique nécessite encore d‟être clarifié.
Facteurs environnementaux- L‟obésité, surtout quand la masse grasse est très
développée dans la région abdominale, est le principal et le plus puissant facteur
prédisposant au DT2 (205, 206). Près de 80 % des individus souffrant de diabète de
type II ont un excès pondéral et, dans la quasi totalité des populations, il existe une
relation étroite entre la prévalence du diabète et celle de l'obésité. La moitié des sujets
présentant une obésité morbide (indice de masse corporelle ou IMC > 40 kg/m2)
finissent par devenir diabétiques. Pourtant, seule une fraction des sujets obèses
finissent par devenir diabétiques car, dans la plupart des cas, le pancréas est capable
de faire face à cette sollicitation accrue par expansion de sa masse ß cellulaire et, peut-
être également, par augmentation de l‟expression d‟enzymes impliquées dans la
machinerie insulinosécrétoire du à une lipotoxicité moins imporatnte (1). L‟existence
d‟une telle adaptation pancréatique, évoquée dès 1981 par Bergman (207), a été
largement confirmée par des études ultérieures qui ont démontré la relation entre la
sensibilité à l‟insuline et la sécrétion précoce d‟insuline (208-210).
L‟analyse globale des résultats de la NHS ("Nuse Health Study") a abouti à la
conclusion que 90% des cas de diabète de type 2 pouvaient être attribués à des
facteurs environnementaux (principalement à l‟excès pondéral) (205, 206).
Interaction entre les facteurs génétiques et l’environnement- L'interaction entre
facteurs génétiques et environnementaux dans la genèse du DT2 est illustrée par
l'augmentation de la prévalence de la maladie dans certains groupes ethniques définis
- 63 -
suite à une modification de leur style de vie. C'est le cas, notamment, des indiens Pimas
chez lesquels la prévalence de l‟obésité et du DT2 est une des plus élevées au monde.
Ces indiens d'Arizona ont connu au début du siècle des périodes de famine ayant
décimé une grande partie de leur population. Les survivants vivent maintenant dans des
réserves où ils ont accès à une alimentation occidentale riche en calories. Selon la
théorie du «génotype économe», l'histoire de l'humanité, en général, et celle des indiens
Pimas en particulier, a conduit à la sélection naturelle de gènes favorables à la survie de
l'espèce dans des conditions de privation alimentaire qui ont prévalu pendant des
siècles. Les individus ayant survécu posséderaient des caractéristiques métaboliques
leur permettant de stocker l'énergie plus efficacement et, de ce fait, de mieux résister à
la famine. Malheureusement, ces mêmes gènes deviennent un handicap en période
d'abondance, favorisant les maladies de pléthore (211). Une des toutes premières
études épidémiologiques, réalisée chez les indiens Pimas, a montré que l‟incidence du
diabète augmentait avec le degré d‟obésité, en pente douce s‟ils étaient issus de
parents non diabétiques, mais de façon nettement plus abrupte si l‟un ou les deux
parents étaient diabétiques. Le fait d‟avoir hérité d‟une susceptibilité génétique multiplie
par 6 l‟incidence du diabète chez les individus dont l‟IMC dépasse 35 kg/m2, mais ne
l‟augmente pratiquement pas chez ceux qui arrivent à conserver un IMC < 20-25 kg/m2
(212). Les facteurs génétiques et environnementaux ne sont donc pas simplement
additifs, mais synergiques.
b) Pathogénèse de l’insulino-résistance
La grande majorité des patients diabétiques de type II présentent une résistance
plus ou moins sévère à l'action de l'insuline. Cette résistance s'exerce au niveau des 3
principaux tissus cibles de l‟hormone : le foie, le muscle squelettique et le tissu adipeux.
En pratique, elle se manifeste par une augmentation de la production hépatique de
glucose (principalement à partir de la néoglucogenèse), une diminution des capacités de
captation musculaire de glucose et une lipolyse exagérée avec élévation du taux
d'acides gras libres plasmatiques. Un grand nombre d‟anomalies biochimiques que nous
allons décrire, affectant différentes étapes de l‟action de l‟insuline, ont été démontrées
dans le DT2, tant in vivo qu‟in vitro, mais on s‟est progressivement rendu compte que,
dans la grande majorité des cas, il s‟agissait d‟anomalies acquises, secondaires aux
- 64 -
perturbations de l‟environnement métabolique et non primaires, causales de la maladie.
Au moyen de la spectroscopie RMN permettant d‟étudier les voies métaboliques in vivo,
l‟équipe de Shulman a élégamment démontré qu‟au niveau du muscle, le transport du
glucose vers l‟intérieur des cellules, c‟est à dire la toute première étape de l‟utilisation du
glucose, était déjà profondément diminuée chez des sujets avec une tolérance au
glucose normale nés de parents diabétiques de type 2 (213). La présence de cette
anomalie avant l‟apparition du diabète permettait donc de penser que le défaut de
transport était bien un déficit primaire. Rappelons cependant que la quantité de
protéines assurant le transport de glucose (GLUT4) est tout à fait normale chez les
patients diabétiques et leurs descendants (214). Plus loin nous verrons qu‟à l‟heure
actuelle, on pense plutôt que cette anomalie de transport serait secondaire au contenu
anormalement élevé en triglycérides intra-musculaires.
Cette anomalie du transport de glucose musculaire a été attribuée à une
dysfonction du métabolisme mitochondrial, via une oxydation incomplète des acides
gras, qui provoquerait une accumulation de métabolites néfastes pour la voie de
l'insuline dans les myocytes (215). Le même mécanisme est d‟ailleurs évoqué pour
expliquer l‟insulinorésistance du sujet âgé (216).
Plusieurs études ont démontré que 40 à 60 % de la sensibilité à l‟insuline étaient
génétiquement déterminés (217-219), tandis que le degré d‟obésité, le morphotype et
l‟aptitude physique rendent compte, pour leur part, d‟environ 35% de la variabilité
interindividuelle. Un point intéressant, confirmé par toutes les études de cohortes, est
que l‟obésité atténue cette variabilité de l‟action de l‟insuline et qu‟au delà d‟un IMC de
30-35 kg/m2, pratiquement tous les individus développent un certain degré
d‟insulinorésistance.
- 65 -
Fig. 12 Schéma simplifié de la pathogénèse de l’insulino-résistance.
L‟insulino-résistance se manifeste par une incapacité de l‟insuline à inhiber la production hépatique de
glucose par le foie (néoglucogénèse hépatique). Cette incapacité pourrait être provoquée par un afflux
d‟acides gras trop important provenant de l‟alimentation ou d‟une lipolyse accrue de la part du TA qui
présente aussi une perte progressve de l‟insulino-sensibilité. Parallèlement au développement de
l‟insulino-résistance hépatique, les muscles vont voir leur capacité à stocker, et donc à utiliser le glucose,
diminuer. L‟ensemble des ces évènements va conduire à une augmentation de la glycémie suivie d‟une
synthèse d‟insuline plus élevée qui va compenser l‟insulino-résistance dans les premiers stades de la
maladie. Progressivement, l‟hyperinsulinémie ne va plus contrecarrer l‟effet de l‟insulino-résistance, on
sera donc en présence d‟une hyperinsulinémie associée à une hyperglycémie caractéristique du diabète
de type 2.
Lorsque la résistance à l‟insuline s‟installe, le métabolisme du glucose est
fortement perturbé. Comme on le sait, le muscle capte près de 80% du glucose sanguin
post-prandial. Au cours de la résistance à l‟insuline, des défauts de signalisation mènent
à une réduction marquée du transport du glucose dans ce tissu (220) qui s‟explique par
- 66 -
une diminution de la translocation de GLUT4 (214, 221). Certaines études montrent
aussi une diminution de l‟expression de ce transporteur (214, 222), mais ce n'est pas
toujours le cas (223).
Les fonctions hépatiques sont aussi altérées. Par exemple, l‟augmentation de la
glycémie à jeun de patients diabétiques corrèle très bien avec une production hépatique
de glucose exagérée (220). La gluconéogenèse est responsable en grande partie de
cette augmentation, mais la glycogénolyse y contribue aussi (224). Enfin, le TA est de
plus en plus montré comme étant un tissu majeur impliqué dans les phénomènes
d'insulino-résistance. En effet, du fait de la résistance à l'insuline, le TA ne jouera plus
son rôle de "tampon" dans le contrôle le l'homéostasie énergétique et va même
participer à amplifier ce phénomène via la sécrétions de produits délétères pour la
sensibilité à l'insuline.
c) Mécanismes moléculaires de l'insulino-résistance
Les altérations possibles vont se situer à plusieurs niveaux de la voie de
signalisation de l'insuline. Du récepteur au contrôle transcriptionnel de certains gènes,
nous allons décrire ici les différentes altérations recensées dans la voie de signalisation
de l'hormone.
Contrôle négatif du signal- La fin du signal insulinique implique la dégradation de
l‟hormone après internalisation des complexes insuline-récepteurs dans les endosomes.
La majorité des récepteurs est recyclée au niveau de la membrane, tandis que d‟autres
sont dégradés. Dans des conditions physiologiques, les récepteurs nouvellement
synthétisés permettent de restaurer un nombre normal de récepteurs sur la cellule. En
présence d‟une hyperinsulinémie persistante, en revanche, les cycles
d‟internalisation/recyclage peuvent aboutir à une diminution du nombre de récepteurs à
la surface, processus de régulation négatif participant de façon secondaire à
l‟installation du phénotype de résistance à l‟insuline.
Les tyrosines phosphatases- La déphosphorylation des résidus tyrosine du récepteur
et des protéines IRS requiert des tyrosines phosphatases (PTPases) : les phosphatases
- 67 -
cytosoliques PTP1B et les membranaires LAR (Leukocyte common antigen-related
molecule) sont impliquées dans ces processus notamment PTP1B qui est présente sur
les récepteurs en cours d‟endocytose. Une augmentation de l‟activité PTPase dans les
muscles des patients diabétiques a été observée et participerait à la résistance de ces
tissus à l‟insuline. Des inhibiteurs de ces enzymes apparaissent ainsi constituer des
outils thérapeutiques prometteurs.
Deux équipes indépendantes ont presque simultanément invalidé PTP-1B chez la
souris (225). Chez ces animaux, la phosphorylation du récepteur en réponse à l'insuline
est prolongée et accentuée dans le muscle squelettique et le foie, mais pas dans le tissu
adipeux. Ceci entraîne une augmentation globale de la sensibilité à l'insuline et une
amélioration de la tolérance au glucose. Pour les souris nourries ad libitum,
l‟insulinémie, nécessaire pour maintenir un niveau de glucose semblable aux souris
contrôles, est réduite de moitié.
Le rôle des phosphorylations en sérine/thréonine- La phosphorylation des résidus
sérine ou thréonine semble jouer, vis-à vis du récepteur et des protéines IRS, un rôle
antagoniste de celui de la phosphorylation des résidus tyrosine intervient ainsi de façon
majeure dans les mécanismes de résistance à l'insuline. En situation physiologique,
cette phosphorylation des résidus sérine ou thréonine permettrait de mettre fin à
l‟activation du récepteur, son exacerbation en pathologie ayant en revanche un rôle
délétère induisant une résistance à l‟hormone.
Plusieurs études se sont intéressées à la phosphorylation sur serine/thréonine
des protéines IRS1 et 2 qui découplerait ces protéines du récepteur et arrêterait la
transduction du signal insuline. Selon le résidu sérine impliqué, la phosphorylation
provoque un changement de conformation, un encombrement allostérique ou une
relocalisation subcellulaire d‟IRS-1 qui résulte respectivement en une diminution de sa
phosphorylation par le récepteur de l‟insuline, en un recrutement déficient de la PI3K ou
en une augmentation de sa dégradation (226, 227).
De nombreux signaux sont capables d‟induire cette phosphorylation, tels le
diacylglycérol, les acyl-CoA, le glucose ou encore l'insuline (228, 229). Dans les
prochains chapitres nous verrons que des sécrétions adipocytaires comme les AGL, le
TNF ou d'autres cytokines inflammatoires comme l'interleukine 1 , sont fortement
impliquées dans ce type de phosphorylations inhibitrices du signal insulinique.
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Parmi les enzymes capables de phosphoryler les IRS en serine/thréonine, on
trouve la PKC , la kinase IKK (inhibitor of nuclear factor k kinase), la MAP kinase et
la Jun kinase (JNK). Ainsi, en phosphorylant la sérine 307 de l‟IRS1 murin (sérine 312
chez l‟homme), la JNK empêche l‟interaction du domaine PTB de IRS1/2 avec la
tyrosine 960 phosphorylée du RI et induit un état de résistance à l‟insuline. Cette kinase
est activée par l‟insuline elle-même, ce qui pourrait expliquer l‟insulinorésistance
associée aux états d‟hyperinsulinisme (230), mais aussi par le TNF et les acides gras
libres sécrétés par le tissu adipeux (231, 232).
Fig. 13 Schéma simplifié de l’action des acides gras libres, du TNF et d’une
hyperinsulinémie sur la relation entre le récépteur à l’insuline et IRS. Les acides gras libres
vont pénetrer dans la cellule et induire l‟activation de la PKC qui va venir phosphoryler IRS sur sa
serine 307 et ainsi empécher l‟interaction IRS / recépteur à l‟insuline. De la même manière, le TNF
et l‟insuline vont aussi perturber cette interaction en agissant sur la protéine Junk (JNK).
La sous-unité P85 de la PI3K- L‟augmentation de l‟expression de la sous-unité p85
de type peut expliquer certains cas de résistance à l‟insuline (233), notamment celles
reliées à l‟obésité (234). L‟augmentation de l'expression de la p85 musculaire observée
dans de nombreux cas d'obésité, viendrait alors interférer entre le complexe p85/p110 et
ses effecteurs, de manière à inhiber la voie de signalisation de l'insuline (235).
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La voie des ERK- Dans le muscle et le tissu adipeux isolés de patients atteints de DT2,
on a pu remarquer une activité sérine/thréonine kinase anormalement élevée de ERK
(236) et p38 MAPK (237). Il a été démontré que dans les adipocytes 3T3-L1, l‟activation
de ces deux kinases induisait une résistance à l‟insuline en interférant avec les fonctions
d‟IRS-1 (238).
La voie mTOR- Un régime riche en gras, utilisé pour induire l‟obésité et le diabète,
augmente de façon significative l‟activité de mTOR (ou S6K1) et la phosphorylation sur
sérine d‟IRS-1223 dans le muscle. Deux modèles de souris génétiquement obèses
montrent aussi cette augmentation de l‟activité mTOR (239). De plus, les souris
invalidées pour mTOR sont protégées contre cette résistance à l‟insuline induite par un
régime gras. Ces résultats suggèrent donc que mTOR/S6K1 est impliqué dans le
développement de la résistance à l‟insuline (240).
3) Quantification de l’insulino-résistance
Dans les premiers stades de la maladie, l'altération de la voie de signalisation de
l'insuline est à l'origine d'une augmentation de la glycémie. On parlera alors
d‟intolérance au glucose. Toutefois, au début de la maladie, le pancréas va pouvoir
normaliser la glycémie via une augmentation de la sécrétion d'insuline. Les patients
seront donc normoglycémiques et hyperinsulinémiques.
L'incapacité de l'insuline à produire son rôle d'hormone hypoglycémiante va alors
augmenter. Le pancréas va toujours tenter de compenser cette augmentation mais sans
succès. On parle alors de résistance à l'insuline ou de diabète de type II qui se
caractérise par une hyperglycémie associée à une hyperinsulinémie.
Enfin, le DT2 est également carcatérisé par une apoptose des cellules du
pancréas, trop sollicitées par l'augmentation dramatique des taux plasmatiques des
glucose. Ceci aura pour conséquence une diminution de l'insulinémie, on parle alors
d'insulinopénie.
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L‟insulino-résistance peut se mesurer avec des outils simples s‟appuyant, comme on
vient de le voir, sur l‟incapacité de l‟insuline à assurer son rôle d‟hormone
hypoglycémiante.
Glycémie- La mesure de la glycémie est un test simple et fiable. Elle peut être pratiquée
à jeun, en période post-prandiale immédiate, ou après une charge en glucose (voir plus
loin). Chez l‟homme, on pratique cette mesure habituellement le matin à jeûn. Les
valeurs normales à jeun se situant entre 3.6 mmol/L et 6 mmol/L, une glycémie
supérieure à 7.0 mmol/L à deux reprises indique la présence d‟un diabète (241).
La glycémie post-prandiale varie en fonction de l‟âge, augmentant dès 40 ans. De
plus, la composition du repas influence la valeur du test puisqu'une faible teneur en
glucides peut diminuer une hyperglycémie. Par ailleurs, le résultat du test est influencé
par le moment de la journée durant lequel il est effectué. Ainsi, l‟hyperglycémie est plus
importante le matin après le petit déjeuner qu‟à d‟autres moments de la journée.
Finalement, il faut respecter un certain délai (1h30-2h) entre la prise alimentaire et le
prélèvement sanguin.
Les valeurs de la glycémie dépendent de plusieurs facteurs, notamment de la technique
d‟analyse, de l‟utilisation de sang complet (sang total) ou de plasma, de sang capillaire
ou veineux. En effet, sur du sang capillaire, on s‟attend à des valeurs légèrement
supérieures à celles du sang veineux total , de l‟ordre de 7 à 10% en post prandial, en
raison d‟une extraction du glucose par les tissus périphériques. Les valeurs glycémiques
plasmatiques sont quant à elles plus élevées que dans le sang veineux total, par effet
de dilution. Il faut savoir que l‟âge est lié à une augmentation progressive de la glycémie
(qu‟il faut donc considérer comme un phénomène physiologique).
Glucosurie- La mesure de la glycosurie n‟est plus utilisée en pratique clinique. En effet,
la précision de cette mesure est limitée par le fait que la glycosurie reflète la glycémie au
moment de la filtration de l‟urine, pas nécessairement celle qui est stockée dans la
vessie. De surcroît, dans certains cas (grossesse par exemple) le seuil de filtration du
glucose est diminué, ce qui peut aboutir à une glycosurie anormale en l‟absence
d‟hyperglycémie associée.
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L’insuline- Chez l'homme, on dose l‟insuline par méthode radio-immunologique ou
ELISA, à jeun, sur du plasma ou du sérum. Les valeurs basales normales comprises
entre 10 et 20 mU/L, s‟élèvent jusqu‟à 50-130 mU/L une heure après une charge en
glucose (voir test de tolérance au glucose), et retourne à des valeurs inférieures à 30
mU/L deux heures après l‟ingestion de glucose. Cette mesure, combinée à celle de la
glycémie, va nous donner une idée de la capacité de l‟insuline à promouvoir l‟entrée de
glucose dans les tissus.
L’hémoglobine glyquée- La glycation est un processus physiologique post-
transcriptionnel qui entraîne la fixation de sucres sur certains sites des protéines. Cette
réaction qui est « mécanique » (c‟est à dire non enzymatique) et irréversible, et elle est
fonction du niveau glycémique et du temps d‟exposition des protéines au glucose.
L‟hémoglobine glyquée est la plus connue de ces protéines « cibles ». La forme
principale de glycohémoglobine est l‟hémoglobine A1c, dont la concentration en
situation physiologique se situe entre 4 et 6%. Ainsi, la demi-vie de l‟hémoglobine
glyquée se compare à celle des globules rouges qui est de 120 jours environ, et reflète
donc le contrôle glycémique des 8 à 12 dernières semaines. Cette fraction A1c de
l‟hémoglobine est anormalement élevée chez les patients diabétiques (242) avec
hyperglycémie chronique et est corrélée ainsi au contrôle métabolique. C‟est ainsi
qu‟une hémoglobine glyquée de 5 à 8% témoigne d‟un bon contrôle métabolique durant
les 2 à 3 derniers mois. Alors qu'une valeur supérieure à 8% doit laisser présager à une
exposition importante à de forts taux de glucose plasmatique.
L‟intérêt de ce test réside donc dans la surveillance thérapeutique rétrospective à
long terme du diabète. Toutefois, l‟absence de standardisation et les sensibilités
variables des différentes méthodes de dosages limitent l‟utilisation de routine de ces
tests comme paramètre diagnostique fiable du diabète.
Hyperglycémie provoquée par voie orale- Ce test consiste chez l‟adulte après un
jeûne de 12 heures à faire absorber 75 gr de glucose dans 300 ml d‟eau en moins de 5
minutes, au repos et au calme.
Après un prélèvement sanguin de base, on effectue des prélèvements sanguins
veineux répétés, à 30, 60, 90, 120 minutes après la surcharge en glucose. Il existe des
variantes de ce test, avec des périodes mesures plus courtes ou plus longues.
- 72 -
En fonction des différentes valeurs de glycémie obtenues (valeurs données et
correspondantes dans le tableau ci-dessous), on pourra alors classer les patients en
trois catégories: Normotolérants, Intolérants au glucose et diabétiques.
Table 2. Tableau des glycémies obtenues chez l’homme normal, intolérant au glucose ou
diabétique au cours d’une hyperglycémie provoquée par voie orale (75 gr de glucose dans 300 mL
d’eau).
Pathologie Glycémie à
jeun
Glycémie
2h Valeurs intermédiaires
Normal < 6.3 mmol/l et < 7.7 mmol/l et < 11 mmol/l
Intolérant au
glucose
6.3 à 7.7
mmol/l et
7.7 à 11
mmol/l et
1 ou plusieurs valeurs >
11 mmol/l
Diabète > 7.7 mmol/l et/ou > 11 mmol/l et/ou 1 ou plusieurs valeurs >
11 mmol/l
Il faut bien savoir que ce test apparaît inutile si la glycémie à jeun est déjà
pathologique. L‟interprétation du test d‟hyperglycémie par voie orale doit toujours être
prudente et tenir compte du contexte clinique (243).
Ce test peut être également réalisé chez le rongeur. Dans ce cas, il faut
administrer par gavage, une solution de glucose à une concentration de 3 gr de glucose
par kg de souris (3g/kg). Les valeurs renseignées pour l‟homme dans le tableau ci-
dessus sont approximativement les mêmes pour la souris.
Cependant, d'autres tests, ne tenant pas compte de l'effet incrétines, sont faisables chez
l'animal. Il s‟agit alors d‟administrer le glucose par voie intrapéritonéale (IPGTT) ou par
voie sanguine (IVGTT). Ces types d‟administration occultent totalement l‟effet des
incrétines (Glucagon like peptide GLP1 et Gastrointestinal peptide GIP) qui sont des
molécules sécrétées par l‟intestin suite à l'administration per os de glucose et qui vont
modifier la réponse insulinique à la charge de glucose. Grâce à ces deux types de tests
on peut donc avoir une idée assez précise de la capacité insulino-sécrétoire du
pancréas de l‟individu ou de l‟animal suite à une élévation artificielle de la glycémie.
Test de tolérance à l’insuline- Ce test consiste à suivre la glycémie après avoir injecté
(par voie intrapéritonéale ou intraveineuse) une solution d‟insuline (0.1U/kg de poids
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corporel). Cette technique est surtout pratiquée chez l‟animal. Chez l‟homme, pour
s'affranchir des difficultés et des risques liés à l‟hypoglycémie, plusieurs aménagements
ont été proposés, définissant ainsi un test de tolérance à l'insuline modifié ou test court
à l'insuline. L'interprétation ne porte que sur les quinze premières minutes du test, avec
la détermination du rapport [(glycémie basale G0 - glycémie à 15 minutes G15)/G0],
normalement inférieur à 0,5 (Grulent et al. 1997) mais chez l'animal on peut suivre la
glycémie durant 120 ou 180 minutes.
Clamp hyperinsulinémique euglycémique- Cette technique développée par De
Fronzo en 1979 est actuellement celle qui est considérée comme faisant référence pour
déterminer la sensibilité à l‟insuline d‟un individu ou d„un animal (De Fronzo et al. 1979)
Une perfusion intraveineuse d'insuline à débit constant permet d'obtenir une
hyperinsulinémie stable tandis qu'une perfusion simultanée de glucose à débit variable
maintient la glycémie à son niveau basal de 5.5 mmol/L. Le débit de perfusion de
glucose est adapté en fonction de contrôles extemporanés de glycémie. Le protocole le
plus souvent utilisé fait appel à un débit d'insuline de 18 mU/kg/min pendant 180
minutes, de sorte que l'insulinémie s'élève à un plateau voisin de 100 mU/l. La
production hépatique de glucose est alors inhibée, le débit de glucose nécessaire pour
maintenir la glycémie constante correspond à la quantité de glucose utilisée par les
tissus périphériques. La sensibilité à l'insuline est donc appréciée par le débit de
perfusion de glucose à l'équilibre (GIR pour glucose infusion rate), exprimé en
mg/kg/min, que l'on va rapporter au niveau d'insulinémie atteint pour calculer le "turn
over" (TO).
La technique du clamp peut être couplée à celle de la dilution isotopique d'un
analogue non métabolisable du glucose marqué radioactivement ou détectable par
fluorescence (en général c'est le 2-déoxyglucose qui es utilisé), ainsi qu'aux dispositifs
de calorimétrie indirecte (application à l'étude de l'utilisation des substrats énergétiques :
oxydation lipidique, oxydation du glucose, stockage du glucose) (244). De plus,
l'utilisation de plusieurs paliers d'insulinémie croissante permet d'établir des courbes
doses-réponses et d'apprécier l'interaction insuline-récepteur. On peut ainsi réaliser une
analyse plus fine des états d'insulino-résistance, en orientant le diagnostic vers une
- 74 -
anomalie des récepteurs (effet maximal observé pour des niveaux d'insulinémie plus
élevés), un défaut post-récepteur (effet maximal diminué, quel que soit le niveau
d'insulinémie) ou une combinaison des deux (245). Le clamp euglycémique
hyperinsulinémique est une méthode fiable, sensible et reproductible.
D'autres types de clamps existent et renseignent sur des paramètres différents
(capacités sécrétoires du pancréas: clamp hyperglycémique, analyse de l'expression de
protéines ou de gènes en réponse à la variation exclusive du glucose ou de l'insuline
plasmatique, etc…).
L’indice HOMA-IR (Homeostasis Assessment Insulin Resistance)- Mise au point par
Matthews et ses collaborateurs en 1985, l‟HOMA-IR est essentiellement pratiqué chez
l‟homme (246). Cet indice est basé sur la glycémie et l‟insulinémie à jeun. Il consiste à
multiplier l‟insulinémie (en U/ml) par la glycémie (mM) et à diviser l‟ensemble par 22.5.
Ce facteur de division va servir à normaliser le résultat. En effet, pour un individu sain,
l‟insulinémie à jeun sera d‟environ 5 U/l alors que sa glycémie sera de 4.5 mmol/l. Le
produit de ces deux paramètres donne alors le facteur 22.5. En d‟autres termes, un
homme sain aura un index HOMA-IR de 1 et plus l‟indice sera élevé, plus l‟individu sera
insulino-résistant. L‟indice HOMA-IR est fréquemment utilisé pour détecter une anomalie
de sensibilité à l‟insuline ou un défaut de sécrétion de l‟hormone car il est fortement
corrélé aux résultats obtenus au cours d‟un clamp hyperinsulinémique euglycémique
sans toutefois être invasif pour l‟individu (246, 247). Les valeurs de référence utilisées
dans ce type d'index sont de 2 pour les sujets témoins, environ 5 pour les obèses et
peuvent atteindre 10 pour les patients diabétiques.
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IV. De l'obésité à la résistance à l'insuline
La relation entre l'obésité et l'insulino-résistance peut s'expliquer par différents
mécanismes d'ordre inflammatoires, nerveux, endocrinien ou intracellulaire. Dans ce
chapitre sera développé le rôle joué par le tissu adipeux au travers de différents aspects
intracellulaires et des sécrétions adipocytaires (adipokines).
1) Modifications fonctionnelles du TA au cours de l'obésité
a) Plasticité de l’adipocyte: avantage ou inconvénient?
La forme sphérique caractéristique des adipocytes peut varier de façon
importante allant de 20 µm à 200 µm de diamètre (248). La plasticité du TA provient de
la grande capacité de stockage des adipocytes qui peuvent emmagasiner l‟énergie sous
forme de triglycérides dans une vacuole lipidique unique pouvant représenter 95% du
volume cytoplasmique. Cette vacuole contient un mélange de triglycerides (TG),
d‟acides gras (AG), de phospholipides et de cholesterols. Environ 95% des lipides
stockés sont représentés par les TG (constitués principalement par l'acide oléique et
palmitique) et par les diacyglycerols (DAG), les phospholipides (PL), les acides gras
non-estérifiés et le cholesterol (249, 250). Des études utilisant des traceurs isotopiques
ont pu montrer que les lipides étaient constamment mobilisés et renouvelés. Ainsi, la
« demi-vie » des lipides intracellulaires est d‟environ 8 jours chez les murins, ceci veut
dire que 10% des acides gras stockés dans le TA sont renouvelés chaque jour (251).
Comme évoqué plus haut, les adipocytes sont capables d‟augmenter considérablement
leur volume (plus de 1000 fois) afin d‟assurer ce rôle de «tampon» en cas de
déséquilibre de l‟homéostasie énergétique en faveur des apports. Dans ce cas, on parle
d‟hypertrophie adipocytaire. Depuis de nombreuses années, plusieurs théories ont mis
en avant le fait que cet accroissement du volume adipocytaire n‟était pas indéfini et
qu‟au cours de l‟obésité, l‟augmentation de la masse du TA pouvait résulter d‟une
hypertrophie adipocytaire suivie d‟une augmentation du nombre d‟adipocytes ou
hyperplasie (252, 253).
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Cette théorie est aujourd‟hui remise en cause par une récente étude menée par
l‟équipe de P. Arner (254) au cours de laquelle les auteurs montrent que s‟il existe bien
une corrélation positive entre la taille des adipocytes (surtout sous-cutanées) et la prise
de poids, il n‟en est pas de même avec le nombre d‟adipocytes pour un même individu.
En effet, selon les auteurs, le nombre d‟adipocytes est constitué au cours de l‟enfance et
de l‟adolescence, puis il reste stable au cours de la vie adulte avec un renouvellement
adipocytaire d‟environ 10% par an. L‟originalité de cette étude réside dans le fait que les
auteurs s‟appuient sur l‟accumulation de carbone 14 présent dans l‟atmosphère pour
dater «l‟âge» des adipocytes au cours de la vie d‟un individu alors que les travaux
précédents ne comparaient que des individus sains et obèses à un instant déterminé.
Chez la souris, une étude concernant la plasticité du TA avait montré que
l‟expansion de ce tissu pouvait être corrélée à la mort cellulaire des adipocytes (255). En
effet, au cours de la mise en régime gras des animaux, Strissel et ses collaborateurs ont
pu observer une mort cellulaire importante des adipocytes permettant une hypertrophie
des adipocytes restants.
En conclusion, même si ces dernières découvertes semblent montrer que le rôle
de réservoir énergétique que joue le TA est surtout symbolisé par la capacité de ses
adipocytes à s‟hypertrophier; il semble de plus en plus intéressant de porter notre
attention sur les phases précoces du développement du TA chez l'enfant et l'adolescent.
En effet, si le nombre d‟adipocytes est «programmé» durant ces phases par des
facteurs génétiques et environnementaux, ces périodes de vie doivent être plus
étudiées. Ceci permettrait de mieux appréhender les déterminants qui induisent la
prolifération des adipocytes et pourquoi pas de développer de nouvelles stratégies de
lutte contre l‟obésité adulte.
b) Inflammation du tissu adipeux
C‟est en 1993 qu‟a été mis en évidence que l‟expression d'une cyotokine
inflammatoire, le Tumor Necrosis Factor (TNF ), était augmentée dans le TA de
souris obèses (256). Il a aussi été montré que l‟induction du transcrit de cette cytokine
inflammatoire provenait conjointement des adipocytes et des macrophages du TA (FSV)
(257). De plus, des expériences de coculture ont permis de mettre en évidence que
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l‟adipocyte et le macrophage pouvaient interagir et promouvoir cette augmentation du
transcrit du TNF et d‟autres cytokines inflammatoires comme l‟interleukine-6 (IL-6)
(257).
Chez l‟obèse, ce fonctionnement paracrine prend toute son importance quand
plusieurs équipes observent que les macrophages peuvent constituer jusqu'à 60% des
cellules présentes dans la TA alors qu‟ils ne comptent que pour 5 à 10% dans le TA
d‟un homme sain (258-260). En effet, une corrélation positive entre le nombre de
macrophages infiltrés dans le TA ou la présence de marqueurs macrophagiques (F4/80)
dans ce tissu et le BMI ou la taille adipocytaire a plusieurs fois été retrouvée (260). De
plus, chez l‟homme, une diminution du poids corporel s‟accompagne d‟une diminution
de cette infiltration macrophagique du TA (260). Si l‟on ajoute à ces arguments le fait
que, chez la souris obèse, 1) les macrophages issus du TA présentent un pic
d‟expression de gènes impliqués dans l‟inflammation précédant de peu l‟apparition des
premiers symptômes de l‟insulino-résistance et que 2) l‟invalidation de la voie de
signalisation responsable de l‟inflammation dans les macrophages (NF- B) entraîne une
protection de l‟animal contre l‟insulino-résistance malgré la mise en régime gras, on peut
avancer que l‟infiltration macrophagique joue un rôle prépondérant au cours de
l‟installation de l‟insulino-résistance associée à l‟obésité (261). Cet état provoqué par
l'infiltration de macrophages dans le TA est aujourd'hui qualifiée «d‟inflammation de bas
niveau du TA »
Cependant, plusieurs points concernant l‟inflammation du TA restent débattus. En
effet, aucune certitude n‟est établie concernant l‟attraction des macrophages pour le TA
par rapport à d‟autres tissus au cours de l‟obésité. Est-ce que la réponse inflammatoire
initiale provient de l‟adipocyte et ensuite permet le recrutement et l‟infiltration des
macrophages dans le TA ou bien est-ce que, dans un premier temps, les macrophages
infiltrent le TA pour ensuite induire la réponse inflammatoire ?
En ce qui concerne le mécanisme de recrutement des macrophages dans le TA,
deux équipes ont simultanément montré en 2005, l‟implication du récepteur C-C
chemokine receptor 2 (CCR2) présent à la surface des macrophages, et de son ligand
CCL2 (C-C chemokine ligand 2) aussi appelé MCP-1 pour Monocyte Chemoattractant
Proteine-1 qui est exprimé par les cellules de la FSV (262, 263). En effet, l‟invalidation
de CCR2 ou de MCP-1 chez la souris entraîne une diminution de l‟infiltration
- 78 -
macrophagique dans le TA accompagné d‟une moindre inflammation du tissu et d‟une
insulino-sensitivité préservée malgré la mise en régime gras des animaux (264). De plus
chez l‟homme obèse, les taux plasmatiques de MCP-1 ainsi que son expression dans le
TA sont augmentés (265-267). Cependant, ces conclusions sont à considérer avec
précaution puisque deux équipes ont récemment montré que les souris MCP-1 -/- ne
présentaient pas de diminution de l‟infiltration macrophagique et ne montraient pas
d‟amélioration de l‟insulino-sensibilté au cours de la mise en régime gras des animaux
(268).
Néanmoins l‟ensemble des travaux concernant l‟inflammation montre que le rôle
des macrophages dans l‟installation de l‟insulino-résistance n‟est plus à démontrer
même si l‟effet strictement délétère des macrophages reste controversé. Comme nous
l'avons décrit précédemment, deux populations de macrophages (pro- et anti-
inflammatoires) semblent co-exister dans le TA au cours du développement de l‟obésité
(195). Les cellules pro-inflammatoires M1 pourraient alors jouer un rôle dans la mise en
place de la résistance à l‟insuline associée à l‟obésité via la sécrétion de certaines
cytokines inflammatoires. A contrario les M2 joueraient un rôle bénéfique et
permettraient, via le récepteur nucléaire PPAR de maintenir la sensibilité à l‟insuline du
TA.
c) Stress du Réticulum Endoplasmique
L‟étude de modèles animaux obèses et présentant des adipocytes
hypertrophiques a montré que l‟excès de nutriment pouvait provoquer un «stress» pour
l‟adipocyte et plus précisément pour son réticulum endoplasmique (RE), organelle
responsable de la synthèse des protéines, de la formation de gouttelettes lipidiques
ainsi que de la régulation du cholestérol au sein de l‟adipocyte (269, 270).
En situation normale, la traduction des ARNm en protéines se déroule dans le
RE, puis les protéines sont adressées à l‟appareil de Golgi qui va les « configurer » afin
qu‟elles remplissent au mieux leur rôle dans la cellule. Au cours de ce processus,
différents systèmes de contrôle vont permettre de maîtriser la synthèse protéique
(protéines chaperonnes, Unfolded Protein Response, …). Au cours de l‟obésité, il a pu
être observé que le stress du RE entraînait des perturbations dans le fonctionnement de
- 79 -
ces systèmes de contrôle conduisant à une synthèse protéique et lipidique anormale
(269-271).
d) Stress Oxydant
Parallèlement à ce stress du RE, l‟obésité s‟accompagne également d‟une
augmentation du stress oxydant au niveau des mitochondries (272). Les stress oxydant
peut être définit par un déséquilibre dû à une augmentation de la production d‟espèces
actives de l‟oxygène (EAO) et une diminution des systèmes anti-oxydant qui luttent
contre les effets délétères des radicaux libres et des peroxydes. L‟excès d‟AG produits
par la mitochondrie va entraîner un découplage de celle-ci qui va s‟accompagner d‟une
production accrue de radicaux libres oxygénés (273). En effet, Furukawa et ses
collaborateurs ont mis en évidence que les taux de malondialdehyde (MDA) et de
dienes conjugués (produits de la péroxydation lipidique) étaient significativement plus
élevés dans le TA d‟hommes obèses (274).
e) Flux lipidiques modifiés
Comme nous l'avons déjà évoqué, le rôle premier de l'adipocyte blanc est de
stocker l'énergie sous forme de TG puis de libérer ces substrats énergétiques en cas de
besoin de l'organisme. Cependant, au cours de l'obésité, cette gestion des flux
lipidiques peut être modifiée et conduire au développement de pathologies
métaboliques et cardiovasculaires. Dans ce sens, des études ont démontré qu‟au cours
des premières étapes de la prise de poids conduisant à l'obésité, l'adipocyte blanc va
voir son activité métabolique augmenter afin d'assurer son rôle de tampon de l'excès
énergétique. Les études menées par Bjorntorp et ses collaborateurs ont montré que des
adipocytes plus volumineux issus de TA viscéral d‟obèses sensibles à l'insuline
possédaient une incorporation de TG plus importante que les petits adipocytes (275).
Les mécanismes par lesquels ces adipocytes sont métaboliquement plus actifs ne sont
pas clairement définis. Néanmoins, il a été observé dans ces cellules une augmentation
significative de l‟expression (ARNm) et de l‟activité de certaines enzymes clés du
métabolisme lipidique comme la LHS, la lipoproteine lipase (LPL) et le transporteur de
- 80 -
glucose GLUT4 (276). Des expériences de microarray ont aussi confirmé que des gènes
nécessaires au métabolisme lipidique et à la différenciation adipocytaire étaient
surexprimés (277).
Cependant, l'adipocyte ne peut pas stocker à l'infini l'excès de substrat
énergétique de l'organisme. Peu d'études ont été faites concernant la phase de
transition qui va voir un adipocyte très actif devenir quasiment quiescent en terme
d'activité métabolique (278). Les hypothèses que l'on peut formuler aujourd'hui reposent
sur des travaux montrant que l'adipocyte sécrète des substances en fonction de la
quantité de lipides qu'il contient (279). Par exemple, la leptine (dont nous décrirons le
rôle plus loin) et d'autres adipokines sont sécrétées différentiellement selon la taille de la
vacuole lipidique (280-282). Ce contrôle précis apporte la preuve qu'il existe des
mécanismes intracellulaires de signalisation pouvant informer l'adipocyte sur le statut de
ses réserves intracytoplasmiques. Ce processus de détection des réserves lipidiques
est un élément clé et certaines données récentes de la littérature montrent que la
gouttelette lipidique pourrait être impliquée dans ce phénomène. Les études sur les
périlipines montrent qu'il existe un lien entre la concentration de ces protéines à la
surface de la gouttelette lipidique et la régulation de la production de sécrétions
adipocytaires. Ainsi, dans des adipocytes provenant de rongeurs ou d'individus obèses,
un déficit en périlipine a été rapporté et corrélé avec une augmentation de la lipolyse et
un dérèglement de la sécrétion de facteurs protéiques (adipokines) (283).
L'étirement mécanique des adipocytes en culture (3T3L1) diminue leur capacité
de différenciation via un mécanisme dépendant de PPAR (284). On peut alors
envisager que l'adipocyte s'hypertrophiant, des protéines situées à la surface de la
gouttelette lipidique ou à la surface de la membrane plasmique (caveolines) permettent
de mesurer une tension synonyme de remplissage maximal de l'adipocyte et ainsi
induire un signal d'arrêt du stockage lipidique.
Ainsi en période post-prandiale, le TA ne pouvant plus assurer son rôle de
tampon, les AG resteront plus longtemps dans la circulation et pourront alors cibler des
tissus comme le muscle squelettique, le foie ou le pancréas chez qui ils entraîneront une
résistance à l'insuline (cf. chapitre : les acides gras à l‟origine du phénomène de
lipotoxicité).
De plus il a également pu être montré chez l'homme et l'animal qu'une perfusion
d'AGL en quantité importante pouvait induire une résistance du TA. Ceci aura comme
- 81 -
effet une lipogénèse inhibée et une lipolyse augmentée: le TA va alors se mettre à
relarguer des AGL dans la circulation.
Nous sommes donc en présence, chez l‟obèse, d‟un double afflux d‟AGL: ceux
provenant de l‟alimentation et que le TA ne parviendra plus à stocker et ceux originaires
des adipocytes devenus lipomobilisateurs. On parle alors de lipotoxicité.
2) Conséquences des modifications fonctionnelles du TA
a) Distribution des dépôts adipeux: l’hypothèse portale
Nous avons vu qu‟au cours de l‟obésité, une distribution viscérale du TA est
corrélée avec le développement du syndrome métabolique. Plusieurs études ont émis
l‟hypothèse d‟une implication de la localisation anatomique des dépôts adipeux dans le
développement de maladies métaboliques. Lebovitz et ses collaborateurs ont pu
corréler le volume du TA viscéral à l‟insulino-résistance (de l'organisme) et certains ont
pu faire état d‟une amélioration de la sensibilité à l‟insuline en réponse à une perte de
poids significativement corrélée à la diminution du TA viscéral. L‟ensemble de ces
résultats montre donc que le TA viscéral est au centre des complications associées à
l‟obésité et plusieurs hypothèses ont émergées pour expliquer cette particularité. A la fin
des années 90, l‟équipe de P. Arner a pu montrer que la graisse viscérale était plus
résistante à l‟action de l‟insuline que la graisse sous-cutanée. Par conséquent la
production d‟AG à partir du TA viscéral est plus prononcée qu‟à partir d‟autres dépôts
adipeux. De plus, même s'il ne représente jamais plus de 20% du TA total, le TA
viscéral de part sa localisation et sa vascularisation lui donnant un accès direct à la
circulation portale, possède un rôle extrêmement important dans la genèse de
pathologies métaboliques. L‟hypothèse portale soutient que le flux important d‟AGL issu
du TA viscéral et qui arrive au foie par la veine porte induit un dérèglement du
métabolisme hépatique.
Au niveau du foie, l'accumulation de triglycérides provoque une insulino-
résistance comme elle le fait dans le muscle. L‟inhibition de l‟action de l‟insuline stimule
la néoglucogénèse hépatique et la sortie hépatique de glucose. De plus, les acides gras
fournissent également les cofacteurs nécessaires à la néoglucogénèse hépatique.
- 82 -
L‟accumulation de lipides hépatiques entraîne aussi une dyslipoprotéinémie
caractéristique du syndrome métabolique et du DT2 : hypertriglycéridémie, diminution
des HDL, accumulation de LDL petites et denses.
b) Accumulation ectopique de lipides dans les tissus non-adipeux.
L‟accumulation ectopique de lipides dans des tissus non-adipeux se produit via
une déficience dans la capacité à oxyder les AG. Les muscles, le foie, le pancréas et le
cœur sont les principaux organes affectés par ce phénomène
.
Muscle squelettique :
Différents travaux ont établi que la quantité de lipides intramusculaires (LIM) augmentait
considérablement au cours de deux situations totalement opposées: l'obésité et
l'exercice physique intense (285). Ces résultats surprenants confirment le rôle de
substrat énergétique joué par ces LIM. Ceci peut paraître paradoxal au regard des
résultats obtenus chez des sujets entraînés mais on sait aujourd‟hui qu‟une grande
disponibilité en AGL (observé au niveau plasmatique chez l‟obèse mais également chez
le sportif entraîné capable de lipomobiliser) peut induire une augmentation des LIM. De
plus, la perfusion d‟AGL chez des hommes sains augmente de façon significative les
LIM.
Comment alors concilier le fait que les sujets entraînés et les obèses possèdent
des taux de LIM élevés?
L‟explication réside dans la capacité du muscle à utiliser ces substrats.
L‟augmentation des LIM chez le sujet entraîné est une adaptation physiologique par
rapport à la demande musculaire et elle s‟accompagne d‟une capacité oxydative
augmentée. Chez l‟obèse, le stockage de lipides dans le muscle découle d‟un flux trop
important d‟AGL dans la circulation conjugué à une capacité oxydative diminuée. Ces
deux situations ont des conséquences opposées sur la sensibilité à l‟insuline du muscle.
Quand la capacité oxydative est importante, les concentrations en lipides intermédiaires
comme le diacyglycérol (DAG), les céramides ou l‟acyl-CoA sont faibles, alors qu‟en cas
de grande disponibilité en AGL accompagnée d‟une faible capacité oxydative leur
- 83 -
concentration augmente. Comme l‟insulino-résistance est corrélée à l‟accumulation de
ces intermédiaires, l‟ensemble de ces résultats montre clairement que chez l'individu ou
l'animal obèse, l‟accumulation ectopique de lipides au niveau musculaire participe
grandement à la réduction de l‟insulino-sensibilité de ce tissu.
Foie :
Comme déjà évoque plus haut, le foie est un organe essentiel dans le métabolisme
énergétique. Il synthétise le cholestérol et les TG et il produit et «recycle» les
lipoprotéines. Compte tenu de ce rôle dans le turn-over lipidique, il n‟est pas surprenant
que le foie présente des réserves lipidiques sous forme de TG. Cependant, chez
l‟homme sain, le contenu hépatique lipidique est faible puisqu‟il ne représente
qu‟environ 5% du poids total du foie. Chez l'individu obèse, cette limite de stockage est
dépassée et entraîne une stéatose hépatique. Les mécanismes qui sont responsables
de cette stéatose impliquent trois voies différentes d‟afflux d‟AGL au foie. La première,
comme nous l‟avons décrite, est due à la position du TA viscéral qui va libérer dans la
veine porte une grande quantité d‟AGL qui va parvenir directement au niveau du foie. La
seconde voie est celle de l‟alimentation. En effet, le foie se charge très vite en vacuoles
lipidiques en réponse à un régime riche en gras. Pour preuve, plusieurs études chez les
murins mais aussi chez l‟homme ont montré que deux semaines d‟alimentation riche en
lipides pouvaient induire une stéatose hépatique, ce phénomène étant également
rapidement reversé lors d‟une alimentation isocalorique. Enfin, le troisième type d‟apport
en AGL au foie est constitué par le foie lui-même. En effet, ce tissu étant capable de
lipogénèse de novo, le foie peut contribuer à hauteur de 25% environ à la synthèse de
TG hépatiques chez l‟obèse, ce qui représente 4 à 5 fois plus que chez un sujet sain
(286).
Le cœur :
Il y a de plus en plus d‟études montrant une accumulation ectopique de lipides dans le
cœur ce qui joue un rôle dans des cardiomyopathies ou des complications cardiaques.
Comme dans le muscle et dans le foie, un cœur surchargé en lipides peut devenir
insulino-résistant. Comme pour le muscle et le foie, les métabolites lipidiques sont très
toxiques pour le cœur puisqu‟il a pu être montré qu‟ils induisaient la mort cellulaire par
apoptose des cardiomyocytes. Une étude chez l‟homme a pu observer une
- 84 -
augmentation de la quantité de lipides intramyocardiques au cours de l‟obésité. Cette
accumulation de lipides est associée à un changement de profil d‟expression génique
observé dans des modèles animaux de stéatose et d‟insuffisance cardiaque. Chez le rat
obèse diabétique Zucker (mutation sur le récepteur à la leptine), les TG s‟accumulent
rapidement au niveau du cœur au fur et mesure que l‟obésité s‟installe. Cette
accumulation est suivie d‟une augmentation des céramides dans le cœur associée à
une apoptose plus importante. Ces changements sont accompagnés de pertes de
fonction entraînant un remodelage du ventricule gauche, une augmentation de la
pression dans ce ventricule et un rétrécissement de l‟épaisseur de la paroi septale.
Chez l‟homme, une alimentation riche en lipides pendant 48 heures induit une
accumulation de TG dans les cellules cardiaques. De plus, la présence de vésicules
lipidiques intramyocardiques est parfaitement corrélée avec les concentrations
plasmatiques d‟AGL, l‟IMC mais aussi avec la quantité de TA epicardique. L‟ensemble
de ces données montre que l‟accumulation de TG dans le cœur est du à une forte
exposition de l‟organe à des taux élevés d‟AGL, et ceci aura pour conséquence une
surcharge et une hypertrophie du ventricule gauche. Cependant des études
complémentaires sont nécessaires pour mieux appréhender les différents mécanismes
conduisant à l‟insuffisance cardiaque associée à l‟obésité.
Le pancréas :
Il a été suggéré que l‟accumulation ectopique de lipides au sein des cellules du
pancréas pouvait être responsable d‟une dérégulation de la sécrétion d‟insuline. Ainsi,
l‟exposition chronique (24 à 48 heures) d‟îlots isolés de Langherans à de fortes
concentrations d‟AGL induit des dommages irréversibles au niveau des cellules ,
responsables de la sécrétion d‟insuline. De façon intéressante, des études menées sur
le rat Zucker montrent une augmentation de l‟accumulation de TG dans les îlots juste
avant l‟apparition d‟un DT2 et coïncide parfaitement avec un changement
morphologique des îlots associé à une défaillance des cellules . Ces phénomènes sont
reversés lorsqu'une restriction énergétique est pratiquée aux animaux. De plus chez les
souris hétrozygotes pour le gène PPAR (PPAR +/-) nourries en régime gras, on
observe une forte accumulation de TG au niveau du pancréas associée à une sécrétion
- 85 -
d‟insuline perturbée. Un traitement de ces animaux à la pioglitazone, une agoniste
PPAR , diminue le contenu en TG du pancréas et simultanément restore une sécrétion
insulinique normale. Différents mécanismes ont été proposés pour expliquer l‟effet d‟une
exposition à long terme sur les cellules du pancréas. Il semblerait que les AGL
diminuent l‟expression du gène codant pour la préproinsuline mais modifient aussi celle
des protéines découplantes UCP2 (Uncoupling chain protein) qui seraient impliquées
dans la réponse du pancréas à une variation de la glycémie. En effet, les UCP2 sont
des protéines impliquées dans la production d‟ATP par la mitochondrie, or le pancréas
perçoit les variations de glycémie plasmatique grâce au ratio ATP/ADP modifié par le
glucose. Les AGL agissant sur l'expression des UCP2, vont modifier ce ratio et ainsi la
fonction insulino-sécrétoire du pancréas.
Les effets des AGL pourraient aussi être médiés par les acyl-CoA à longue
chaine puisque ces métabolites résultant d‟une mauvaise oxydation des AGL activent
les canaux K+ ATP-dépendant ce qui hyperpolarise la cellule rendant la dépolarisation
de cette cellule par le glucose plus difficile et entraînant un défaut dans la sécrétion
d‟insuline en réponse au glucose.
Enfin, parmi les effets délétères provoqués par les AGL, il a été montré qu‟une
apoptose des cellules pouvaient être observée suite à la génération de céramides
conséquente à l‟action de l‟acide palmitique. Au contraire, l‟acide oléique insaturé est lui
protecteur et anti-apoptotique.
c) Les acides gras à l'origine du phénomène de lipotoxicité
Les acides gras et le glucose constituent les principales sources d‟énergie
utilisées par le muscle squelettique. L‟hypothèse selon laquelle une importante
oxydation des AG inhiberait la glycolyse et l‟oxydation du glucose a d‟abord été formulée
par Randle en 1963 sous le terme de «cycle glucose-acide gras». Les travaux de
Randle ont pu mettre en évidence que lorsque l‟organisme était exposé à de fortes
concentrations de lipides (AG et cétones) comme c‟est le cas dans les situations
d'obésité, l‟oxydation des AG se faisait en priorité. Par conséquent, le métabolisme
glucidique était ralenti voir inhibé. Au niveau moléculaire, ces études ont montré que les
lipides pouvaient inhiber l‟activité de certaines enzymes impliquées dans le métabolisme
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glucidique comme l‟hexokinase, la phosphofructokinase et la pyruvate déshydrogénase
mais pouvaient également induire l‟expression de différents isoformes des PKC (PKC ,
ou ) impliqués dans l‟insulino-résistance.
Physiologiquement, ces acides gras libres sont la principale source d‟énergie
chez les sujets à jeun. Avec l‟obésité, le flux circulant excède les besoins des différents
tissus. L‟importance du rôle des acides gras dans la résistance à l‟insuline explique en
grande partie la relation entre l‟obésité abdominale et le risque de diabète. Le TA
viscéral, plus résistant à l‟action de l‟insuline que le TA sous-cutané, produit d'avantage
d‟acides gras.
D'un point de vue moléculaire, il a été démontré que la résistance à l‟insuline
provoquée par les acides gras libres est associée à une augmentation de l‟activité de la
PKC-θ (287). La PKC-θ augmente la phosphorylation d‟IRS-1 sur ses sérines 307 et
1101 pour réduire son activation. Les souris invalidées pour PKC-θ sont protégées
contre les défauts de signalisation et de transport du glucose induit par une infusion de
lipides (288). C‟est JNK et IKK (inhibitor kappaB kinase) qui seraient à l‟origine de la
phosphorylation d‟IRS-1 en réponse à l‟activation de PKC-θ (289). Le salycilate, un
inhibiteur d‟IKK, bloque les effets négatifs d‟une infusion de lipides sur la signalisation de
l‟insuline. Des souris hétérozygotes invalidées pour IKK sont aussi protégées contre ces
effets (290). Par contre, l‟invalidation spécifiquement de cette protéine dans le muscle
squelettique n‟a pas empêché la phosphorylation inhibitrice d‟IRS-1 (291).
d) Les adipokines
Les sécrétions du TA ne se limitent pas aux AG. D'autres molécules, d'origine
peptidique ou protéique, seront produites et sécrétées par le TA. Il s'agit des adipokines.
Compte tenu de la place importante que peut prendre le TA chez l'obèse, une
production ou une sécrétion modifiée n'est pas sans conséquence sur les pathologies
associées à l'obésité comme l'insulino-résistance.
- 87 -
Généralités
C‟est au début des années 90 que le concept d‟adipokine apparaît grâce à la
découverte de la leptine par l‟équipe de Friedman (292). Cette découverte a
profondément modifié la vision du rôle du TA puisqu‟il est maintenant établi que via la
sécrétion de molécules biologiquement actives, le TA joue un rôle déterminant au sein
d‟un réseau complexe de communications entre organes (293, 294). Ainsi aujourd‟hui, la
dénomination « adipokine » recouvre plus de 50 facteurs différents. Un débat s‟est
d‟ailleurs installé sur l‟utilisation du terme « adipokine » pour des molécules qui n‟étaient
pas exclusivement synthétisées par l‟adipocyte. Malgré cette controverse sémantique,
nous qualifierons d‟adipokine toute production peptidique ou protéique importante
émanant de l‟adipocyte.
Dans ce chapitre, nous nous attacherons à répertorier les adipokines pouvant
agir (effet bénéfique ou délétère) sur la sensibilité à l'insuline et/ou l'homéostasie
glucidique. Pour chacune d'entre elles, nous établirons leur profil au cours de l'obésité
associé à l'insulinorésistance afin de déterminer lesquelles peuvent devenir des cibles
potentielles dans le traitement de ces pathologies.
Les adipokines délétères pour la voie de l'insuline
Le TNF (Tumor Necrosis Factor- ) est une cytokine initialement connue pour ses
importantes propriétés proinflammatoires, mais elle exerce aussi des effets sur le
métabolisme glucidique et lipidique (256). Cette cytokine est produite par un certain
nombre de types cellulaires dont les cellules lymphoïdes, les cellules musculaires et
adipeuses (295). Au sein du TA, la majorité des ARNm codant pour le TNF dérive des
cellules non adipeuses (cellules de la FSV) chez l‟homme (296) ; par contre chez le
rongeur, le TNF proviendrait essentiellement des adipocytes (256).
Le TNF joue un rôle important dans le développement de l‟insulinorésistance
liée à l‟obésité. Son premier lien à l‟obésité a été montré dans un modèle de souris
génétiquement obèses (db/db) où le tissu adipeux périgonadique présentait des
concentrations élevées de TNF . Il a été montré que le TNF provoquait une
- 88 -
augmentation du relargage des acides gras par les adipocytes, avec comme
conséquence une augmentation des taux d‟acides gras libres circulants et une
détérioration de la signalisation de l‟insuline (297). Plusieurs études montrent que le
TNF- inhibe la signalisation de l'insuline en phosphorylant IRS-1 sur son résidu sérine
307 (298). De ce fait, le TNF empêche l‟autophosphorylation du récepteur à l‟insuline
et diminue l‟activité tyrosine kinase en aval du récepteur (299). Ainsi, le TNF inhibe la
translocation de GLUT 4 et le captage de glucose dans le muscle en réduisant la
stimulation d‟IRS-1 et IRS-2 (300).
Le rôle du TNF dans l‟insulinorésistance liée à l‟obésité a aussi été montré a contrario
dans des modèles murins avec délétion du gène du TNF ou de ses récepteurs. Les
souris obèses (ob/ob) déficientes en TNF sont moins hyperglycémiques,
hyperinsulinémiques et intolérantes au glucose que des souris ob/ob possédant le gène
du TNF (301, 302). Chez les souris dont les récepteurs (p55 et p75) pour le TNF sont
invalidés, on ne note pas d‟altération du poids corporel sous régime classique ou riche
en graisses (303). Cependant, la délétion de ces deux récepteurs chez les souris ob/ob
entraîne une amélioration significative de la sensibilité à l‟insuline (304). La participation
du TA aux taux circulants de TNF n‟est pas encore clairement établie et il n‟est pas
exclu que le TNF agisse sur le tissu adipeux et sur les autres tissus cibles de l‟insuline,
essentiellement par voie autocrine ou paracrine. Par ses effets paracrines sur le tissu
adipeux, le TNF est capable de moduler l‟expression et la sécrétion d‟autres
adipokines (305), ce qui in fine va renforcer l‟insulinorésistance. Par exemple, le TNF
stimule la sécrétion d‟IL-6 et inhibe celle de l‟adiponectine (306, 307).
D‟abord décrit comme une cachectine, facteur induisant la cachexie malgré une
prise alimentaire normale, le TNF a été ensuite impliqué dans la régulation de la
masse adipeuse puisqu‟il limite l‟accumulation de triglycérides dans les adipocytes en
inhibant la LPL et en stimulant la lipolyse, ce qui se solde par une augmentation
d‟acides gras libres médiateurs d‟insulinorésistance (257, 308). De plus, il inhibe la
différenciation des préadipocytes humains (309) et induit l‟apoptose adipocytaire in vitro
(310). Ces données suggèrent que le TNF limiterait l‟expansion de la masse adipeuse
mais en contrepartie il induirait l‟insulinorésistance et des complications métaboliques
associées.
- 89 -
L’interleukine-6 (IL6) est une cytokine produite par de nombreuses cellules
(fibroblastes, cellules endothéliales, monocytes) et de nombreux tissus, dont le tissu
adipeux. Il est maintenant bien établi que la quantité d‟IL-6 produite par le TA est
augmentée en cas d‟obésité (311). Il a pu être estimé que 15 à 30 % des concentrations
circulantes d‟IL-6 pouvaient être attribués au TA.
L‟IL-6 pourrait être impliquée directement dans l‟insulinorésistance en
augmentant l‟expression de SOCS-3 et en diminuant la phosphorylation d‟IRS-1 et de
PKB/Akt (312, 313). Ainsi, dans les adipocytes 3T3-L1, l‟IL-6 induit une résistance
partielle à l‟action de l‟insuline sur le captage de glucose via un rétro-contrôle négatif de
la phosphorylation d‟IRS-1. Elle est aussi capable d‟agir négativement sur la
transcription des gènes codant pour IRS-1 et Glut 4 (314).
L‟IL-6 exerce d‟autres effets sur le tissu adipeux comme l‟inhibition de l‟activité de
la LPL et l‟induction de la lipolyse (315, 316) qui, via les AGL, pourrait contribuer à
l'installation ou au développement de l'insulino-résistance. Au cours de l'exercice
physique, il a été remarqué que les taux plasmatqiues d'IL-6 augmentaient (317). Cette
observation a permis de mettre en évidence un rôle bénéfique de l'IL-6 puisqu'elle
semble capable de stimuler l'activité de l'AMPK dans le muscle (317). Ainsi, il semblerait
que l'IL-6 possède deux types d'actions en fonction de la situation physiologique.
La résistine est une protéine de 12.5 kDa qui appartient à une famille de protéines
riches en résidus cystéines, responsables de sa dimérisation par des ponts dissulfures
(318). Les taux circulants de résistine sont augmentés chez des souris génétiquement
obèses (ob/ob et db/db) ou rendues obèses et résistantes à l‟insuline par un régime
riche en graisse (319). Chez les rongeurs, la principale source de résistine est d‟origine
adipocytaire (282). La résistine est également exprimée et produite dans le tractus
digestif, les glandes surrénales, le muscle squelettique (320), le cerveau (321) ainsi que
dans les îlots pancréatiques (322).
Chez l‟homme obèse, Kaser montre que la principale source de résistine
proviendrait des macrophages infiltrés dans le TA (323) alors que Pagano et ses
collaborateurs ont observé récemment que la résistine était aussi exprimée dans les
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adipocytes humains avec une expression quatre fois plus élevée dans le TA viscéral
que sous-cutané (324).
La résistine joue un rôle physiologique dans le métabolisme glucidique, au niveau
du foie et du muscle squelettique, en atténuant l‟action de l‟insuline au sein de ces
tissus. L‟administration de résistine in vivo et la surexpression transgénique de résistine
induit une insulinorésistance secondaire à l‟augmentation de la production hépatique de
glucose (325, 326). De plus, chez des souris rendues obèses et résistantes à l‟insuline
par un régime riche en graisse, le traitement par un oligonucléotide résistine anti-sens
améliore la résistance hépatique à l‟insuline (327). Ces observations suggèrent des
propriétés diabétogéniques de la résistine chez le rongeur (d‟où son nom « résistine »
pour résistance à l‟action de l‟insuline).
La résistine diminue le captage des acides gras et leur métabolisme dans le
muscle squelettique, spécifiquement en diminuant l‟expression de l‟AMPK. Dès lors, il
est possible que la résistine induise une insulinorésistance hépatique en agissant
directement sur les hépatocytes ou en altérant la capacité du muscle squelettique à
contribuer à l‟homéostasie des acides gras. Elle provoque également une dyslipidémie
chez les souris via une augmentation de la sécrétion des lipoprotéines (328). In vitro, la
résistine diminue l‟action de l‟insuline dans les 3T3-L1 en inhibant certains facteurs de la
cascade de signalisation de l‟insuline, et plus spécifiquement en stimulant SOCS-3
(329).
La résistine est aussi considérée comme une molécule pro-inflammatoire. En
effet, plusieurs études ont mis en évidence une association entre la résistine et des
facteurs inflammatoires comme le TNF , l‟IL-6 et la protéine C-réactive (323, 330, 331).
Elle stimule la synthèse et la sécrétion de TNF et d‟IL-12 dans les macrophages via la
voie dépendante du NF-kB (332). Chez l‟homme, la littérature sur le rôle de la résistine
comme lien moléculaire entre obésité et insulinorésistance est assez partagée. Les
premiers résultats d‟études au sein de plusieurs populations ne vont pas dans le sens
d‟une contribution importante de la résistine au syndrome métabolique. Cependant,
Pagano a montré que les taux d‟ARNm de résistine dans le tissu adipeux sous-cutané
étaient élevés en rapport avec le degré d‟adiposité, suggérant un lien entre les taux
circulants de résistine et l‟obésité chez l‟homme.
- 91 -
MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) est une chemokine qui recrute des
monocytes aux sites d‟inflammation et qui est exprimée et sécrétée entre autres par le
tissu adipeux (333).
L‟augmentation de sécrétion de MCP-1 par le tissu adipeux de souris obèses
entraînerait, par voie paracrine, la sécrétion d‟une variété de cytokines et de
chemokines par les macrophages, responsable d‟une réponse inflammatoire locale et
d‟une modification de l‟expression de gènes adipocytaires, entraînant une
insulinorésistance systémique (334). Plus directement, MCP-1 diminue le captage de
glucose et la phosphorylation du récepteur à l‟insuline dans des adipocytes en culture
(333) mais le mécanisme reste inconnu.
La Retinol Binding Protein 4 (RBP4)- Au cours de l‟étude du phénotype de souris
invalidées pour le transporteur de glucose 4 (Glut4) spécifiquement dans l‟adipocyte,
l‟équipe de B. Kahn a pu observer une insulino-résistance du muscle et du foie (168).
Cette observation a conduit ce groupe à rechercher des sécrétions adipocytaires
dysrégulées et pouvant potentiellement médier cette perte de sensibilité de l‟insuline.
L‟expression adipocytaire et les taux plasmatiques de RBP4 sont plus que doublés chez
ces souris et cette augmentation est retrouvée chez différents modèles d'obésité murine
(db/db et régime hyperlipidique) (168, 335). RBP4 est une protéine de 21 kDa et sa
concentration plasmatique est de 30 à 40 µg/ml.
Son augmentation exogène (injection de RBP4 recombinante ou surexpression chez la
souris) provoque une insulinorésistance et une intolérance au glucose (335). Les souris
dont le gène codant pour RBP4 a été invalidé (rbp4-/-) présentent une sensibilité à
l‟insuline nettement améliorée par rapport aux animaux contrôles et les souris
hétérozygotes pour RBP4 (rbp4+/-) possèdent une sensibilité à l‟insuline intermédiaire
(335). Afin de déterminer l‟effet d‟une baisse de RBP4 indépendamment de l‟impact
d‟une manipulation génétique, les mêmes auteurs ont traité des souris avec du
fenretinide qui provoque l‟hyperexcretion rénale de RBP4 et par conséquent diminue les
taux plasmatiques de l‟adipokine. Chez des souris rendues obèses par un régime riche
en lipides, l‟administration de fenretinide ne modifie pas la prise alimentaire, le poids
corporel et le développement de l‟obésité par contre elle améliore nettement la
sensibilité à l‟insuline et la tolérance au glucose (335). Les mêmes résultats ont été
obtenus chez des souris génétiquement obèses (ob/ob) (335). Au niveau moléculaire,
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RBP4 altère la voie de signalisation de l‟insuline dans le muscle en inhibant la
phosphorylation de IRS-1 et de la PI3K (Ost et al. 2007). Au niveau hépatique, les
mêmes expériences ont mis en évidence que RBP4 augmentait la production hépatique
de glucose via une action inhibitrice sur la synthèse de la PEPCK (335).
Chez l‟homme, les résultats sont moins clairs que ceux obtenus chez le rongeur.
Deux études cliniques ont montré des résultats contradictoires concernant les
corrélations entre les taux plasmatiques de RBP4 et l‟insulino-sensibilité. Dans une
première étude, les auteurs ont pu observer une corrélation positive entre les taux
plasmatiques de RBP4 et l‟insulino-resistance chez l‟obèse et le non-obèse (336). Ces
travaux montrent aussi que les taux plasmatiques de RBP4 sont étroitement associés à
certains marqueurs de l‟obésité comme l‟indice de masse corporelle, le ratio
taille/hanche ou encore les taux plasmatiques de triglycérides (336-338). A l‟inverse, les
travaux d‟autres équipes infirment ces résultats et montrent que, contrairement aux
résultats obtenus chez l‟animal, l‟expression de RBP4 dans le TA sous cutané ainsi que
les taux plasmatiques de RBP4 diminuent ou ne varient pas au cours de l‟obésité et/ou
de l‟insulinorésistance (339). A l‟heure actuelle, la pertinence de l‟étude de RBP4
comme cible potentielle pour lutter contre le diabète chez l‟homme est donc discutée.
La lipocaline 2 (Lcn2), aussi connue sous le nom de neutrophile gelatinase,
siderocaline ou 24p3- appartient à la même famille que RBP4. Les lipocalines sont des
petites protéines circulantes contenant une partie hydrophobe où un ligand peu venir se
fixer (340). Les ligands connus sont les stéroïdes, les phéromones et dans le cas de la
Lcn2 , les siderophores (341). Un sidérophore est un élément chimique secrété par les
micro-organismes et capable de chélater l'ion Fe3+. Au pH neutre, l'ion Fe3+ a une
solubilité faible, ce qui rend son utilisation par l'organisme impossible. Les sidérophores
solubilisent les ions fer en formant des complexes qui peuvent être utilisés par des
mécanismes de transport actif. La plupart des sidérophores sont des peptides non
ribosomaux. La Lcn2 est utilisée par le système immunitaire des mammifères pour
séquestrer les sidérophores et ainsi priver les bactéries de fer.
In vivo, il a d‟abord été montré que la Lcn2 était synthétisée par le TA (342-345),
puis quelque temps après, l‟adipocyte a pu être identifié comme étant la source
principale de Lcn2 (346). De plus, l‟expression élevée de Lcn2 dans l‟adipocyte de
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l‟animal obèse et insulino-résistant pose les premières bases de la relation qu‟il peut
exister entre cette adipokine et l‟insulino-sensibilité. In vitro, l‟invalidation transitoire de la
Lcn2 montre une amélioration du transport de glucose médié par l'insuline (346).
D‟autres arguments vont dans le sens d'une contribution de cette adipokine à l'insulino-
résistance:
- la synthèse de Lcn2 est augmentée par des agents qui induisent
l‟insulino-résistance (dexaméthasone et TNF ) (346).
- une hyperglycémie prolongée est aussi cause d‟une expression de
Lcn2 accrue (344).
- les TZD réduisent l‟expression de la Lcn2 adipocytaire (347).
En ce qui concerne les mécanismes utilisés par la Lcn2 pour médier l‟insulino-
résistance, peu de choses ont été faites. Il semble cependant que le lien entre Lcn2 et
l‟ion fer puisse jouer un rôle au cours du diabète puisqu‟il a pu être montré que les
diabétiques avaient un taux de fer supérieur à la moyenne et que les patients atteints
d‟hémochromatose (maladie génétique où les patient présentent une hyperabsorption
du fer par l‟intestin) présentent également une résistance à l‟insuline (348, 349).
C1q/TNF-related protein (CTRP9)- est une glycoprotéine sécrétée quasiment
exclusivement par le TA (350, 351). Au sein de ce tissu, l‟équipe qui a découvert le
CTRP9 a aussi montré que l‟ARNm codant pour cette protéine était retrouvé en quantité
similaire dans les adipocytes et dans les cellules de la FSV. Comme pour d'autres
adipokines, les femelles possèdent un taux d'ARNm de CTRP9 supérieur à celui des
mâles. Au cours de l‟analyse de la séquence génétique codant pour CTRP9, les mêmes
auteurs ont observé que CTRP9 possédait une séquence comparable à celle de
l‟adiponectine (350, 351). Comme l‟adiponectine, CTRP9 possède une séquence signal,
un domaine N-terminal variable, un domaine collagène et un domaine C-terminal
globulaire. L'homologie avec l'adiponectine ne s'arrête pas là puisque CTRP9 est aussi
capable de s'associer en trimères, hexamères et formes de haut poids moléculaire. De
plus, lors de sa synthèse, CTRP9 s'associe aussi avec l'adiponectine dans le réticulum
endoplasmique et dans l'appareil de Golgi. Ces ressemblances avec l'adiponectine ont
naturellement conduit les investigateurs à étudier le rôle de cette nouvelle adipokine au
sein du métabolisme énergétique. Pour cela, ils ont surexprimé CTRP9 grâce à un
adénovirus chez la souris et ils ont pu observer une faible diminution de la glycémie des
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animaux (350, 351). Dans des myotubes en culture, CTRP9 active spécifiquement des
voies impliquées dans le métabolisme glucidique comme l'AMPK, PKB ou encore la voie
des MAPK. Ces résultats montrent que CTRP9 semble impliqué dans la régulation de
l'homéostasie glucidique mais d'autres éléments doivent encore être apportés afin de
confirmer son rôle bénéfique ou délétère au cours de l'installation de l'obésité et de
l'insulino-résistance.
Les adipokines bénéfiques
La leptine- En 1959, Hervey réalise l‟expérience qui va changer la vision que l‟on avait
du TA (352). En effet, grâce au processus chirurgical de parabiose, il va montrer pour la
première fois le rôle endocrine que peut exercer le TA. Les expériences de parabioses
sont faites entre un rat rendu obèse par une lésion hypothalamique et un rat contrôle.
Suite à cette parabiose, le comportement du rat obèse n‟est pas modifié tandis que le
rat contrôle cesse de s‟alimenter. Harvey suggère alors l‟existence d‟un facteur de
satiété circulant dont la concentration chez le rat obèse devait être augmentée par
rapport au rat contrôle.
Les conclusions de Harvey sont ensuite soutenues par la découverte de souris
génétiquement obèses, la souris « obese »(ob/ob) et la souris « diabètique» (db/db),
caractérisées par une hyperphagie, une dépense énergétique réduite et une obésité
morbide. En 1973, la parabiose entre souris contrôle et souris ob/ob provoque une
réduction de la masse grasse des souris ob/ob mais n‟a pas d‟effet sur la souris témoin.
La parabiose entre les souris db/db et les souris contrôle n‟a pas d‟effet sur la souris
db/db mais induit une forte réduction de la prise alimentaire de la souris contrôle,
conduisant à sa mort. Les auteurs de ces travaux interprètent ces résultats de la
manière suivante : les souris ob/ob ne produisent pas le facteur de satiété tandis que les
souris db/db le produisent mais y sont insensibles. Il sera alors démontré que le gène ob
code pour la leptine alors le gène db code pour son récepteur. Suite à l‟obtention de la
séquence nucléotidique du gène ob, son analyse en fonction de critères de similitude ou
d‟homologie a permis l‟identification d‟une séquence caractéristique conduisant à
l‟identification de la leptine.
La leptine est une protéine de 16 kDa. Une partie importante de sa séquence
peptidique est conservée entre les différentes espèces étudiées (80% d‟homologie entre
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homme, souris et rat) (353). L‟étude structurale de la leptine menée par Zhang et ses
collaborateurs (353) a montré que la leptine est constituée de 4 hélices anti-parallèles
connectées par deux longues boucles et une plus courte. Les résidus les plus conservés
sont importants pour le maintient de l‟intégrité structurale de la leptine ainsi que pour sa
fonction biologique et sont situés dans le cœur hydrophobe de la protéine.
La leptine est une hormone, circulant dans le plasma à une concentration
dépendante de la masse adipeuse et du statut énergétique de l‟individu. Dans ce sens,
les adipocytes du TA blanc ont longtemps été considérés comme les seules cellules
productrices de leptine. Cependant une synthèse ectopique de leptine a été mise en
évidence dans d‟autres tissus comme le muscle, le foie et l‟hypophyse (354-356). La
contribution de la synthèse ectopique de leptine dans la concentration plasmatique reste
sujette à controverse, et à ce jour les adipocytes restent considérés comme la principale
source de leptine.
Que ce soit chez l'homme ou chez l'animal, l‟obésité est associée à une élévation des
taux plasmatiques de leptine tandis que les états lipodystrophiques sont associés à une
réduction de ce taux (357). La nutrition exerce aussi un contrôle sur la production de
leptine. Ainsi, à la suite d‟un repas, le niveau plasmatique augmente chez les rongeurs
mais il semble inchangé chez l‟homme (358, 359). Chez l‟homme, il faut plusieurs jours
de régime hypercalorique pour voir les taux plasmatiques de leptine augmenter.
Cependant, un jeûne de 24 à 48h induit une forte baisse de la concentration
plasmatique de leptine chez les rongeurs et chez l'homme. Enfin, la sécrétion de leptine
semble également être corrélée à la composition et à l‟apport calorique des repas (360).
Cette régulation contrôlée par la nutrition est liée en partie à l‟insuline. Des études
réalisées in vitro montrent que l‟insuline stimule la synthèse et la sécrétion de leptine
dans une lignée d‟adipocytes de souris ainsi que dans les cultures primaires
d‟adipocytes humains isolés (361, 362). In vivo, l‟injection d‟insuline chez les rongeurs
entraîne également une augmentation de la concentration plasmatique de leptine. C‟est
également le cas chez l‟homme soumis à une perfusion d‟insuline (359).
Il existe d‟autres facteurs régulant la sécrétion de leptine. Parmi les facteurs qui
influencent positivement la sécrétion de leptine, on trouve le glucose, les
glucocorticoïdes (361), le TNF (363), les estrogènes (364), l‟interleukine-1 (365) ou
encore les endotoxines (307).
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Par opposition, certains facteurs régulent négativement la production de leptine. C‟est le
cas pour l‟hormone de croissance (366), les TZD (367, 368)ou les acides gras libres
(369).
L‟équipe de Tepper a été la première à isoler et à cloner le récepteur de la leptine
(ObR) (370). Depuis, six isoformes ont pu être caractérisées et sont nommées de ObRa
à ObRf. Elles sont générées par épissage alternatif à partir du même ARNm. ObRa est
exprimée dans l‟ensemble des tissus périphériques étudiés (hypophyse, foie, muscle
squelettique et lisse, cœur, rein pancréas, os poumons, intestins, testicules, ovaire, rate,
glande medullosurrénale, tissu adipeux) suggérant une grande diversité dans les
fonctions de la leptine. Même si ObRa est la forme la plus exprimée au niveau
périphérique, l‟isoforme ObRb, exprimée au niveau central, semble être la plus
biologiquement important. C‟est elle qui est mutée chez la souris db/db (371, 372) et le
rat Zucker (373). Initialement, ObRb n‟avait été montrée qu‟au niveau central.
Cependant, quelques études montrent sa présence au niveau de la glande
médullosurrénale, du rein, du poumon, du muscle et du foie (374, 375).
Action métabolique centrale : La régulation de la balance énergétique s‟appuie
sur des signaux périphériques, nerveux, endocrines ou métaboliques intégrés au niveau
central permettant ainsi une réponse adaptative. Le système nerveux central (SNC)
régule la balance énergétique par 3 mécanismes:
-le comportement alimentaire (prise alimentaire, activité physique)
-le système nerveux autonome (dépense énergétique : métabolisme basal,
thermogénèse adaptative)
-le système neuro-endocrinien et la sécrétion d‟hormones (prise
alimentaire, métabolisme basal, thermogénèse adaptative)
L‟acteur principal du maintient de l‟homéostasie énergétique au niveau central est
l‟hypothalamus. Le système de régulation implique des circuits neuronaux complexes
entre les différents noyaux hypothalamiques, communicant par l‟intermédiaire de
neuropeptides. Ces derniers peuvent être classés en deux catégories : les
neuropeptides oréxigènes qui stimulent la prise alimentaire et inhibent les dépenses
énergétiques (neuropeptide anabolique) et les neuropeptides anorexigènes qui, à
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l‟inverse, inhibent la prise alimentaire et stimulent les dépenses énergétiques
(neuropeptides cataboliques).
L‟injection au niveau central de leptine chez la souris induit une baisse de la prise
alimentaire ainsi qu‟une augmentation des dépenses énergétiques, ce qui se traduit par
une baisse des triglycérides et des acides gras plasmatiques (376). Pour que la leptine
synthétisée dans les adipocytes puisse agir au niveau du SNC, il faut que l‟hormone
puisse passer la barrière hémato-encéphalique (BHE). Pour cela, la leptine est
transportée par ObRa selon un processus actif, saturable et finement régulé. Ce
transport est d‟autant plus efficace que la concentration plasmatique en leptine est
élevée. Cependant, dans le cas de fortes concentrations de leptine caractéristiques de
l‟obésité, ce transport est altéré.
Dans le SNC, la cible principale de la leptine est le noyau arqué qui est constitué entre
autres de deux populations distinctes de neurones impliqués dans le contrôle de la
balance énergétique. Ainsi, la leptine inhibe l‟activité des neurones oréxigènes de
premier ordre NPY et AgRP et stimule l‟activité des neurones anorexigènes POMC et
CART.
Action métabolique périphérique : En plus de son effet central, la leptine peut
aussi agir au niveau périphérique principalement sur les tissus insulino-sensibles. La
leptine stimule la lipolyse d‟adipocytes de souris et cet effet n‟est pas retrouvé sur des
adipocytes de souris db/db (377). La leptine augmente l‟oxydation des AG et inhibe la
lipogénèse dans les tissus autres que le tissu adipeux. En effet, elle agit par
l‟intermédiaire de son récepteur ObRb qui est couplé au système Jak/Stat ou
directement sur la stimulation de l‟AMPK qui phosphoryle et inhibe l‟ACC (378). De plus
la leptine inhibe également l‟expression de SREBP-1c dans le foie, le pancréas et le TA
inhibant ainsi la lipogénèse dans ces tissus (379). Enfin l‟hormone est capable de
stimuler le transport de glucose dans le muscle grâce à l‟activation de l‟AMPK (378).
Comme nous l‟avons déjà évoqué, l‟obésité est caractérisée par des niveaux
plasmatiques de leptine élevés. A partir d‟une certaine concentration en leptine, cette
hormone n‟a plus d‟effet au niveau central et périphérique (380). Ce phénomène appelé
résistance à la leptine est caractéristique de l‟obésité. La cause et les mécanismes
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d‟établissement de la résistance à la leptine sont encore mal connus et plusieurs
hypothèses sont envisagées pour expliquer ce processus :
-un défaut dans le transport de la leptine à travers la BHE
-une diminution de l‟expression de ObRb au niveau central et périphérique (381).
-un défaut dans les voies de signalisation activées en réponse à la leptine (notamment
une suractivation des protéines SOCS-3 et PTP1B responsables de la désensibilisation
du récépteur ObR) (382, 383).
Cette résistance à la leptine, qui semble être plutôt centrale, empêche toute possibilité
de traitement tant que les mécanismes responsables de cette désensibilisation n‟ont pas
été identifié.
L’adiponectine- Identifiée par plusieurs équipes, l'adiponectine est connue sous
différents noms en relation avec sa structure ou ses propriétés (384). Elle est appelée
ACRP30 (adipocyte complement-related protein of 30 kDa) ou adipoQ chez la souris et
GBP28 (gelatin-binding protein 28) ou APM1 (adipose most abundant gene transcript 1)
(385) chez l‟homme. Cette protéine de 247 acides aminés chez la souris et 244 chez
l‟homme est composée d'un peptide signal destiné à être clivé, d‟un domaine N-terminal
de type collagène et d‟un domaine C-terminal globulaire, avec une structure en triple
hélice. Son domaine globulaire présente des homologies de structure avec certaines
formes de collagène mais aussi avec la fraction C1q du complément et les cytokines de
la famille du TNF (384).
La protéine native s'assemble pour former des trimères qui s‟associent ensuite entre
eux via la formation des ponts dissulfures pour former des hexamères et des complexes
de haut poids moléculaire pouvant compter jusqu‟à 6 trimères. En plus de ces formes
multimériques, le groupe de Lodish a détecté dans le plasma humain une forme
globulaire issue d‟une protéolyse (386). Il existe un dimorphisme sexuel pour la
concentration plasmatique d‟adiponectine qui est plus élevée chez les femmes que chez
les hommes (387, 388). Des études réalisées sur les souris suggèrent que les
androgènes seraient à l‟origine d‟un abaissement de l‟adiponectinémie chez les mâles.
En effet, si l‟ovariectomie ne modifie pas la concentration d‟adiponectine, la castration
induit son augmentation. De même, un traitement à la testostérone provoque sa
diminution.
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Deux récepteurs de l‟adiponectine ont été clonés (389). Ce sont des récepteurs à
7 domaines transmembranaires qui sont structurellement et fonctionnellement différents
des récepteurs couplés aux protéines G. AdipoR1 a une expression ubiquitaire, avec
une prédominance dans le muscle squelettique. Il possède une forte affinité pour la
forme globulaire de l‟adiponectine mais une affinité plus faible pour la forme totale.
AdipoR2 est préférentiellement exprimé dans le foie avec une affinité intermédiaire pour
les formes globulaire et totale. La suppression de l‟expression d‟AdipoR1 et d‟AdipoR2
s‟accompagne d‟une diminution des effets de l‟adiponectine sur l‟oxydation des acides
gras et l‟utilisation du glucose, ce qui confirme que ces récepteurs sont les médiateurs
de l‟action de l‟adiponectine. De nombreuses études sont actuellement en cours pour
essayer de mieux comprendre le rôle joué par ces récepteurs dans la transmission du
message adiponectine
L‟adiponectine est abondamment produite par le tissu adipeux blanc, ses
concentrations circulantes sont de l‟ordre de 5 à 30 mg/L, ce qui représente 0,01 % des
protéines plasmatiques totales. Le niveau d‟expression des ARNm est toutefois différent
selon la localisation du TA étudié puisqu‟il est 30% plus faible dans le tissu adipeux
viscéral que dans tissu adipeux sous-cutané abdominal, que les sujets soient minces ou
obèses (390).
Les concentrations circulantes d‟adiponectine sont diminuées chez les souris
obèses et diabétiques (391). Elles sont également fortement abaissées chez l‟homme
dans l‟obésité et le DT2 (392, 393). Il existe une corrélation inverse entre
l‟adiponectinémie et le degré d‟obésité et plus particulièrement avec la quantité de
graisse viscérale (394, 395). Les résultats des travaux concernant les effets d‟une
réduction pondérale sur les concentrations circulantes d‟adiponectine chez les sujets
obèses sont plus contradictoires. Les premières études ont montré qu‟une perte de
poids suivie d‟une période de stabilisation ou une restriction calorique de longue durée
s‟accompagnaient d‟une augmentation de l‟adiponectine plasmatique (396, 397). En
revanche d‟autres études n‟ont pas mis en évidence de variation d‟adiponectinémie lors
d‟une perte de poids de courte durée (398).
Enfin, une étude réalisée chez des sujets témoins minces a mis en évidence une
diminution des concentrations circulantes d‟adiponectine au cours d‟une restriction
calorique de 4 semaines (399). Des travaux réalisés chez les Indiens Pima ont montré
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qu‟une baisse de l‟adiponectinémie précédait l‟apparition de l‟insulino-résistance et du
DT2 (400, 401).
Ce dernier résultat indique que les variations de l‟adiponectinémie ne seraient pas
seulement une conséquence de modifications liées aux situations pathologiques telles
que l‟obésité ou le DT2 mais pourraient également jouer un rôle causal.
Des études ont montré que l‟adiponectine recombinante injectée à des souris
résistantes à l‟insuline, obèses ou dépourvues de tissu adipeux, améliorait
considérablement les anomalies métaboliques de ces animaux (402, 403). Ceci se
traduit par une amélioration sensible de la résistance à l‟insuline associée à une
normalisation du profil lipidique et à une réduction de la stéatose musculaire et
hépatique. Ces effets semblent passer en partie par l‟activation de l‟AMPK (104), avec
pour conséquence, une augmentation de l‟utilisation du glucose et de l‟oxydation des
acides gras par le muscle et une réduction de la production hépatique de glucose. Les
effets de l‟adiponectine sur la sensibilité à l‟insuline pourraient aussi être en partie
indirects et faire intervenir des cytokines telles que le TNF . En effet, un traitement à
l‟adiponectine est capable d‟exercer une régulation négative sur le TNF et chez les
souris déficientes en adiponectine, l‟expression et la sécrétion de TNF sont
augmentées (404). Certaines molécules, participant à la résistance à l‟insuline, telles
que les glucocorticoïdes et les agonistes β-adrénergiques entraînent une diminution de
l‟expression de l‟adiponectine (306, 405).
L’adipsine/ASP (acylation-stimulating protein) - L‟adipocyte sécrète les facteurs C3,
B et D (adipsine) du système alterne du complément. L‟adipsine (ASP) qui est une
sérine protéase, clive le facteur B du complément quand celui-ci est complexé au
facteur C3. Le facteur C3a ainsi engendré se transforme, après attaque par une
carboxy-peptidase plasmatique, en ASP.
L‟ASP stimule la synthèse des triglycérides dans les adipocytes par deux
mécanismes. D‟une part, elle favorise l‟entrée de glucose dans l‟adipocyte via la
translocation des transporteurs de glucose (GLUT 1 et 4) des vésicules intracellulaires à
la membrane externe de la cellule. D‟autre part, elle augmente l‟activité de la
diacylglycérol transferase, enzyme impliquée dans la synthèse des triglycérides (406).
- 101 -
L'équipe de K. Cianflone a pu remarquer une augmentation de 85% des taux
plasmatiques d'adipsine chez la souris obèse (db/db) (407).
Dans le TA viscéral de sujets obèses, Saleh et ses collaborateurs ont observés
une diminution du nombre de sites de liaison pour l‟ASP ainsi qu‟une affinité plus faible
de ses récepteurs (408). Ces anomalies pourraient contribuer à un rendement plus
faible du stockage des triglycérides et à une augmentation du flux des acides gras libres
circulants et par là, favoriser les désordres métaboliques associés à l‟obésité viscérale
(408-410).
Chez les souris invalidées pour le gène codant pour l'adipsine (ADKO), il a pu
être observé un retard de la clairance des TG et des AGL après un repas ce qui
confirme le rôle de cette protéine dans le contrôle de l'homéostasie lipidique (407).
La Chemerine- La présence du récepteur orphelin ChemR23 sur des cellules
dendritiques immatures ou des macrophages a conduit Wittamer et ses collaborateurs
(411) à rechercher son ligand dans des fluides inflammatoires. Le fractionnement et la
purification d‟ascites (d‟origine ovarienne ou hépatique) et de fluides synoviaux ont été
testés sur des cellules CHO surexprimant le récepteur ChemR23 couplé à un rapporteur
fluorescent. Ainsi, après plusieurs étapes de purification, les auteurs ont pu montrer que
la chemerine était le ligand naturel de ChemR23. Il s‟agit d‟une protéine
chémoattractante synthétisée par plusieurs tissus et principalement par le foie, le rein et
le tissu adipeux blanc (412). Elle est sécrétée sous une forme immature de 18 kDa
(proChemerine) puis est ensuite clivée à son extrémité C-terminale par une protéase
extracellulaire en une forme biologiquement active de 16 kDa.
La chemerine est retrouvée dans le plasma à une concentration de 3.0 nM chez
l‟homme et 0.6 nM chez la souris (413). Le récepteur ChemR23 est présent sur de
nombreux tissus comme le cœur, le foie, le placenta et le TA blanc. Au sein du TA
blanc, Goralsky et ses collaborateurs (414) ont montré qu‟il n‟existait pas de différence
d‟expression de la chemerine et de son récepteur en fonction de la localisation du TA.
En revanche, au cours de la même étude, les auteurs ont mis en évidence que
l‟expression de la Chemerine et de ChemR23 était 2 fois plus importante dans
l‟adipocyte que dans les cellules non adipocytaire du TA (414).
La quantité importante de récepteurs ChemR23 au niveau adipocytaire a conduit
différentes équipes à s‟intéresser au rôle joué par le complexe Chemerine/ChemR23 au
- 102 -
niveau de la biologie de l‟adipocyte. Très récemment, 3 études différentes ont montré
que la Chemerine influençait l‟adipogénèse tant au niveau d‟une lignée adipocytaire
murine (3T3-L1) que dans l‟adipocyte isolé à partir d‟explants de TA humain (411, 413,
414). La chémerine agit également sur l'expression de certains gènes impliqués dans le
métabolisme lipidique et glucidique. Ainsi, in vitro, la chémérine augmente l'expression
adipocytaire de GLUT 4 ou de FAS (415)). Au cours d‟expériences d‟invalidation du
gène codant pour la chémérine ou pour son récepteur, il a été observé par différentes
approches une nette diminution de l‟adipogénèse (414). De même, au cours du
traitement des cellules 3T3-L1 par un agent prodifférenciant (troglitazone), l‟expression
du complexe chemerine/ChemR23 est significativement augmentée. Cet effet
proadipogénique est médié par l‟activation des MAPK ERK 1/2 connues pour être
impliquées dans ce type de processus (412).
Afin d‟envisager une possible implication de la chémérine dans le développement
de l‟obésité ou de ses pathologies associées, les équipes de Segal et de Sasaki ont
étudié l‟évolution de l‟expression adipocytaire du complexe chémérine/ChemR23 au
cours de l‟obésité. Chez des rats mis en régime gras, on retrouve une augmentation de
l‟expression de la chémérine ainsi que de son récepteur au niveau du tissu adipeux
entier mais également de l‟adipocyte isolé. De plus, chez ces animaux, les taux
plasmatiques de chémérine sont aussi augmentés (412, 413). Puisque la chémérine est
une cytokine qui recrute et active les cellules immunitaires, l‟hypothèse selon laquelle
elle pourrait jouer un rôle dans le développement de l‟inflammation du TA paraît assez
séduisante et mérite d‟être largement approfondie.
La Visfatine a été caractérisée récemment par une approche visant à étudier
différentiellement les gènes exprimés par le TA viscéral entre une situation contrôle et
obèse (416). Cette protéine se nomme aussi PBEF (pre-B cell colony-enhancing factor)
et est connue pour réguler la prolifération des lymphocytes B. Ce facteur peut être
synthétisé par la moelle osseuse, le foie ou les muscles squelettiques et le TA viscéral,
d‟où son nom (Visceral fat).
Chez la souris, l‟expression tissulaire de la visfatine comme ses taux
plasmatiques sont augmentés avec l‟obésité associée à une résistance à l‟insuline
(416).
- 103 -
Les effets de la visfatine sont de plus en plus controversés et certains résultats
concernant le métabolisme glucidique ont même été retirés de la littérature récemment
(416). A sa découverte, l‟équipe de Shimomura avait montré que la visfatine était
caractérisée par des effets insulino-mimétiques. Au cours de cette étude, les auteurs
avaient observé que cette adipokine était un puissant agent adipogénique via la
stimulation du transport de glucose et de la lipogenèse in vitro (416). En effet, elle
semble induire une augmentation du transport de glucose in vitro sur les pré-adipocytes
3T3L1 ou les myocytes L6 (416). L‟administration de visfatine à des souris diabétiques
paraît améliorer la sensibilité à l‟insuline. Cette hypothèse est confirmée par la présence
d‟une hyperglycémie « basale » chez les animaux hétérozygotes pour l‟invalidation de la
visfatine (416). Tout cela serait expliqué par le fait que la visfatine peut se lier sur les
récepteurs à l‟insuline, avec une affinité similaire à l‟insuline mais sur un site de liaison
différent (416). Chez l‟homme, des études ont montré que les taux de visfatine
plasmatique étaient augmentés au cours de l‟obésité et lors de l‟installation de
l‟insulinorésistance (417, 418). Cependant, une autre étude montre que les taux
plasmatiques de visfatine ne sont pas corrélés avec la quantité de TA viscéral et
n‟observe aucune différence d‟expression entre les dépôts adipeux sous-cutanés et
viscéraux (419). Même si plusieurs équipes ont montré un lien entre la visfatine et
l‟obésité, son rôle métabolique nécessite d‟être éclairci (420).
L’Omentine Antérieurement découverte dans l‟intestin et les tissus endothéliaux,
l‟Omentine possède différentes appellations comme l‟intelectine ou la lectine
endothéliale. En 2004, au cours d‟une étude visant à détecter de nouvelles adipokines
s‟exprimant différentiellement en fonction de la localisation du TA, Yang et al. ont pu
mettre en évidence chez l‟homme que l‟omentine était spécifiquement présente dans le
TA omental (421). Au sein de ce tissu, l‟ARN messager de l‟Omentine est exprimé
parallèlement par les cellules adipocytaires et non adipocytaires (421). Cette adipokine
de 313 acides aminés (33kDa) présente à son extrémité N-terminale une séquence
signal hydrophobe permettant sa sécrétion. Ainsi, elle est retrouvée dans le plasma à
une concentration comprise entre 100 ng/ml et 1 µg/ml avec des taux plus importants
chez la femme par rapport à ceux observés chez l‟homme (422). C‟est en 2006 que
l‟équipe de Gong montre que l‟Omentine potentialise de 50% l‟effet de l‟insuline sur le
transport de glucose d‟adipocytes humains isolés à partir de biopsies de TA sous-cutané
- 104 -
ou viscéral . Il est intéressant de noter que l‟Omentine n‟a aucun effet sur le transport de
glucose basal. Dès lors, les auteurs ont privilégié l‟étude d‟une voie de signalisation
commune à celle de l‟insuline et ils ont pu montrer qu‟ Akt était la principale cible de
l‟Omentine (421). Ces résultats ont conduit l‟équipe de McLenithan à étudier la
régulation de cette adipokine chez l‟homme au cours de l‟obésité et du diabète. Malgré
le faible nombre de cas dans cette étude, les auteurs ont pu mettre en évidence que
dans le TA viscéral, l‟expression d‟Omentine est significativement diminuée au cours du
développement de l‟obésité ainsi que lors de la perte de la sensibilité à l‟insuline
(corrélations négatives avec l‟indice de masse corporelle et l‟HOMA-IR) (422). Il
semblerait que chez l‟homme, contrairement aux modèles murins, l‟Omentine soit très
peu exprimée au niveau des dépôts adipeux alors que son ARN messager est présent
au niveau de l‟intestin (De Souza Batista et al., 2007). L‟ensemble de ces résultats
montre que l‟Omentine pourrait devenir une cible thérapeutique intéressante sous
réserve d‟identifier son récepteur afin de déterminer si d‟autres tissus insulinosensibles
(muscle, foie) peuvent être la cible de cette adipokine.
La vaspine a été caractérisée en 2005 par Hida et ses collaborateurs sur un modèle de
rat obèse et insulino-résistant (OLETF) comme étant une nouvelle adipokine ne
s‟exprimant exclusivement que dans le TA épidydimal, rétropéritonéal et mésentérique
(423). Cette adipokine, constituée de 412, 414 ou 415 acides aminés respectivement
chez le rat, la souris et l‟homme, appartient à la superfamille des inhibiteurs de serine
protéase (serpine). L‟étude de Hida révèle que les taux d‟ARNm de la vaspine dans le
TA sont dans un premier temps fortement corrélés avec l‟obésité et l‟insulinorésistance
puis, dans un deuxième temps, l‟expression de cette cytokine diminue parallèlement
avec l‟installation du diabète (424). Les taux plasmatiques de vaspine suivent un profil
identique.
Compte tenu de la forte corrélation qui existe entre l‟insulinorésistance et la
vaspine, les auteurs ont étudié un rôle potentiel de cette production adipocytaire dans le
métabolisme glucidique. L‟administration intrapéritonéale de vaspine humaine
recombinante à des souris rendues obèses et diabétiques (par un régime riche en gras
et en glucose) améliore significativement la tolérance au glucose et la sensibilité à
l‟insuline de ces animaux sans modifier les taux plasmatiques d‟insuline (423). De plus,
les auteurs ont pu observer que le traitement de ces souris par la vaspine permettait de
- 105 -
normaliser le profil d‟expression génique des TA mésentérique et sous-cutané des
souris diabétiques. En effet, l‟expression génique de marqueurs de l‟insulinorésistance
comme GLUT 4, la leptine, la résistine, l‟adiponectine ou encore le TNF montre une
réversion conduisant à des expressions comparables à celles des souris contrôles
(423). Suite à ces résultats, une étude s‟et attachée à caractériser le profil d‟expression
de la vaspine chez l‟homme. Il semblerait que l‟expression de cette adipokine soit
globalement associée à l‟obésité, l‟insulinorésistance et au métabolisme avec des
différences selon la localisation des TA (424). De façon intéressante, les taux
plasmatiques de vaspine sont deux fois plus élevés chez les femmes (1,3 µg/l) que chez
les hommes (0,6 µg/l) et sont corrélés négativement avec l'insulino-résistance (425,
426). Enfin, comme pour la Chémérine, il conviendrait de vérifier si son rôle observé
chez la souris est retrouvé chez l‟homme.
Le Fasting induced adipose factor (FIAF)-Le récepteur nucléaire PPAR régule la
différenciation adipocytaire et la sensibilité à l‟insuline des adipocytes en agissant sur
l‟expression de gènes cibles. En étudiant ces gènes, deux équipes ont mis en évidence
en 2000 qu‟il existait une nouvelle cible pour PPAR qu‟ils nommèrent le PGAR (PPAR
angiopoietin related) (427). Ce facteur est ensuite renommé ANGTL4 (angiopoietin-like
protein) ou FIAF (Fasting-induced adipose factor) car cette adipokine présente des
similarités structurales avec la famille des angiopoietines et que son expression dans le
TA et dans le sang est nettement augmentée par la mise à jeun (428). L‟étude plus
approfondie de la régulation de ce facteur montre que FIAF est majoritairement exprimé
par les tissus adipeux (blanc et brun) où il est régulé par des agonistes PPAR , et et
qu‟il est aussi retrouvé dans le foie où il est régulé positivement par PPAR . De plus,
l‟analyse du gène codant pour FIAF montre une région de réponse aux PPARs (PPRE)
au niveau de l‟intron 3 (429). D‟après ces résultats, plusieurs équipes ont mené des
travaux étudiant l‟implication de FIAF sur la sphère lipidique. En 2002, Yoshida et ses
collaborateurs montrent que l‟injection aiguë de FIAF à un modèle de souris obèses,
diabètiques et hypotriglycéridémiques (KK/San) entraîne une augmentation importante
des taux plasmatiques d‟acides gras libres et de triglycérides via une action inhibitrice
sur la LPL (430). Dans une étude plus complète, une équipe chinoise rapporte que FIAF
est une hormone impliquée dans la régulation de l‟homéostasie glucidique, du
- 106 -
métabolisme lipidique et de la sensibilité systémique à l‟insuline (431). En effet, en
surexprimant FIAF grâce à un adenovirus dans des modèles de souris normales et/ou
obèses diabétiques (db/db), les auteurs observent une diminution significative de la
glycémie sans modification de l‟insulinémie ainsi qu‟une nette amélioration de la
tolérance au glucose. La cible principale du FIAF semble être le foie puisque l‟adipokine
supprime la production hépatique de glucose basale et améliore la sensibilité à l‟insuline
de cultures primaires d‟hépatocytes (430). Les auteurs confirment que FIAF provoque
une hyperlipidémie et observent une accumulation importante de lipides dans le foie. La
démonstration de Ono (432) selon laquelle l‟activation d‟Akt dans le foie médie une
hypoglycémie associée à une hypertriglycéridémie et à une accumulation hépatique de
lipides permet de concilier l‟ensemble de ces résultats. Cependant, des études
permettant d‟identifier la voie de signalisation de FIAF sont indispensables pour
confirmer cette hypothèse. Chez l‟homme, un potentiel effet hypoglycémiant est soutenu
par le fait que les niveaux plasmatiques de FIAF sont inversement corrélés à ceux du
glucose sanguin. De plus, les taux plasmatiques de FIAF sont significativement
diminués chez les diabétiques de type II alors qu‟ils sont inchangés chez les obèses non
diabétiques (Xu et al., 2005). Enfin, il est important de noter que FIAF est retrouvé dans
le sérum humain et murin sous plusieurs formes: la forme native (20-35 kDa)
synthétisée et sécrétée essentiellement par le TA et des formes tronquées ou
glycosylées surtout produites par le foie. Des études supplémentaires sont nécessaires
afin de déterminer le rôle de ces différentes formes.
Cathepsine L- Les cathepsines sont des protéases à cystéine de la superfamille de la
papaïne qui comprend 11 isoformes à ce jour. La majorité des cathépsines est localisée
dans les endosomes ou les lysosomes, où elles participent à la dégradation
intracellulaire des protéines. Elles sont synthétisées sous forme de précurseurs inactifs
qui subissent une maturation protéolytique en milieu acide (433). De plus en plus de
travaux mettent en évidence une implication de ces cathepsines dans le métabolisme
mais elles semblent exercer un effet indirect en augmentant la capacité d'expansion du
TA (434). Cependant, la cathépsine L est la seule démontrant un rôle direct sur le
métabolisme glucidique. Ainsi, au cours de travaux réalisés in vitro analysant les
variations d‟expression génique existant au cours de la cinétique de différenciation de
pré-adipocytes humains, Yang et ses collaborateurs ont observé que les taux d‟ARNm
- 107 -
codant pour la cathepsine L étaient augmentés d‟un facteur 3 (435). Cette étude
rapporte aussi que la cathepsine L possède une expression adipocytaire augmentée
dans différents modèles d‟obésité et qu‟elle est impliquée dans l‟adipogénèse et la
tolérance au glucose.
Des tests fonctionnels ont été réalisés et les auteurs ont pu observer que le
traitement des cellules avec l‟inhibiteur de la cathepsine L augmentait le transport de
glucose stimulé par l‟insuline. Il semblerait que la cathepsine L soit impliquée dans la
dégradation du récepteur à l‟insuline et participe ainsi en partie à la régulation de
l‟insulino-sensibilité. Cette hypothèse est vérifiée grâce au modèle animal invalidé pour
la cathepsine L (catL-/-). En effet, ces souris présentent un poids corporel moins
important comparé aux animaux contrôles probablement dû à l‟effet adipogénique de la
cathepsine L (435) mais l‟invalidation de la cathepsine L provoque surtout une
diminution des taux plasmatiques de glucose et d‟insuline ainsi qu‟une amélioration de
la tolérance au glucose sans modifier la prise alimentaire. Des résultats identiques ont
pu également être observés lorsque ces animaux ont été nourris par un régime
hyperlipidique (435).
Chez l‟homme, il semblerait que les taux plasmatiques de cathepsine L soient
corrélés négativement avec l‟insulino-sensibilité (436). Cependant, de plus amples
études sont nécessaires afin de pouvoir envisager des perspectives thérapeutiques
ciblant la cathepsine L.
- 108 -
PARTIE III Le système Apeline/APJ
I. Le récepteur APJ
1) Découverte d'APJ
Différentes molécules bioactives comme les hormones, les neurotransmetteurs et
certaines chémokines transmettent leur signal cellulaire en se liant à des récepteurs à
sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG). Les récents
progrès dans l'analyse du génome ont conduit à la découverte de nouveaux gènes
codant pour des RCPG dont le ligand est inconnu. Ces récepteurs sont nommés
"récepteur orphelins" dans l'attente de la découverte de leur ligand endogène.
Le récepteur APJ (putative receptor protein related to AT1) appartient à la famille
des RCPG. Il a été identifié la première fois par O'Dowd et ses collaborateurs en 1993
(437) sur la bande q12 du chromosome 11 humain. Cette découverte a eu lieu alors que
les auteurs recherchaient des homologues du récepteur à la vassopressine dans le
cerveau humain. Le clonage de ce gène a été effectué par PCR (polymerase chain
reaction) avec un ensemble de primers générés sur la base de séquences conservées
des parties transmembranaires des RCPG. Le cDNA obtenu code pour une préprotéine
de 377 acides aminés. Elle possède une forte homologie de séquence avec le récepteur
de type 1 à l'angiotensine II (40 à 50 % d'identité dans les régions transmembranaires)
ce qui lui a valu l'autre nom de angiotensin-II receptor-like 1 (AGTRL1). Cependant,
l'angiotensine II ne se lie pas à APJ lorsqu'il est surexprimé dans des cellules
ovariennes de hamster chinois (CHO) (438) ou dans des fibroblastes (437).
Au cours de l'étude de l'embryogenèse chez la souris, Devic et ses collaborateurs
ont ensuite pu montrer une homologie de séquence en acides aminés (92%) entre le
récepteur msr/apj murin (qui a d'abord été mis en évidence chez le Xénope d'où le nom
de Xénop mesenchyme-associated serpentine receptor) et le récepteur APJ humain
cloné quelques années auparavant (92% d'homologie) (439, 440). En 2000 a eu lieu le
- 109 -
clonage du gène codant pour APJ chez le rat et nommé B78/apj (441, 442) qui possède
une homologie de séquence de 74% avec la forme humaine.
2) Distribution tissulaire d'APJ
Les premières études concernant la localisation anatomique d'APJ ont été
menées par O'Dowd qui grâce à des expériences de Northern blot, a pu retrouver la
présence du récepteur orphelin au niveau du cerveau humain et plus précisément dans
le striatum, l'hippocampe, le cervelet et le cortex. Matsumoto a confirmé ces résultats et
a montré plus spécifiquement qu'APJ était présent dans le corpus callosum, la corde
spinale et la medulla (443). Quelques années après, l'équipe de R. Doms a complété
ces études en rapportant une expression du récepteur principalement dans la corde
spinale, la medulla, les noyaux subthalamiques, la substance noire, l'amydale, le noyau
caudé, le corpus callosum et l'hippocampe. Les mêmes travaux ont aussi mis en
évidence qu'en périphérie, ce sont des tissus comme dans la rate, le thymus, les
ovaires, les testicules, l'intestin et le colon qui expriment le récepteur (444).
En 2000, par la technique de l'hybridation in situ effectuée chez le rat, il a pu être révélé
que le transcrit d'APJ était localisé dans les noyaux paraventriculaires (NPV) et supra-
optiques (NSO) de l'hypothalamus ainsi qu'au niveau du parenchyme pulmonaire, des
cellules glomérulées du cortex rénal, des corps lutéaux de l'ovaire et dans des zones
diffuses de l'hypophyse (442). La localisation précise d'APJ au niveau des noyaux des
neurones magnocellulaires des NPV et NSO (neurones qui contrôlent l'activité de l'axe
hypothalamo-hypophysaire) amène O'Caroll à supposer un rôle du récepteur dans des
processus neuroendocrines que nous détaillerons dans les prochains chapitres. Enfin,
une autre étude procédant à l'analyse de la distribution tissulaire de l'ARNm codant pour
APJ chez le rat par la technique de RT-PCR présentée dans la figure ci-contre (Figure
1C) montre que le récepteur est présent dans presque tous les tissus en quantité
variable (445).
On peut aussi remarquer (figure 12) une plus forte expression du récepteur APJ
dans les tissus issus de rats nouveau-nés. Ceci suggère que le récepteur puisse jouer
un rôle sur le développement embryonnaire sur lequel nous reviendrons plus tard dans
ce manuscrit. Par la suite d'autres localisations ont été observées pour APJ comme le
tractus digestif et les ostéoblastes (446, 447).
- 110 -
De plus, par homologie avec les récepteurs à l'angiotensine 2 et les récepteurs à
la bradykinine, un équipe de l'Université de Toronto travaillant sur des lignées de
cellules nerveuses a pu mettre en évidence qu'APJ était retrouvé au niveau nucléaire
dans différentes zones du cerveau humain (cervelet et NPV). En effet, en s'appuyant sur
des techniques d'immunocytochimie et de mutagénèse dirigée, les auteurs nous
apprennent qu'APJ présente une séquence signal d'adressage permettant au récepteur
de se retrouver au niveau du noyau. Cette étude montre aussi que ce phénomène de
localisation nucléaire est indépendant de la fixation d'un ligand sur APJ (448).
Fig. 14 Expression du récepteur APJ dans différents tissus chez l’homme (d’après
Tatemeoto et al. 1999)
3) Structure d'APJ
Comme nous l'avons déjà évoqué, APJ est un récepteur à 7 domaines
transmembranaires. Peu de choses ont été publiées sur les caractéristiques physiques
de ce récepteur. Cependant, lors de l'étude de la séquence en acides aminés, O'Dowd
observe la présence de sites de phopsphorylation de la protéine kinase AMPc
dépendante (PKA) ainsi que deux sites de palmitoylation et de glycosylation (ODowd et
al. 1993). Plus récemment, Alexanderov et ses collaborateurs ont mis en évidence la
présence de 4 acides aminés cystéines sur les boucles extracellulaires. Selon les
auteurs, la présence de ces résidus laisse pressentir plusieurs possibilités de ponts
- 111 -
dissulfures importants pour le repliement et la conformation tridimensionnelle de la
protéine (449). D'autres résidus cystéines présents au niveau de l'extrémité C-terminale
d'APJ confirment les sites potentiels de palmitoylation proposés par O'Dowd et
retrouvés chez d'autres RCPG.
Cette même étude montre que la stabilité du récepteur est dépendante du milieu.
La concentration en sels (essentiellement NaCl) ainsi que le pH ou la présence de
différents détergents ou petites molécules amphiphiles présents dans les tampons
commerciaux s'avèrent déterminants pour la stabilité d'APJ. En effet, plus la
concentration en NaCl (1 M) est élevée et plus le récepteur APJ semble stable. De
même, un pH faible favoriserait la stabilité du récepteur (perte de stabilité importante
entre pH 6 et pH 6.5). Enfin, alors que l'ajout de sucrose ou de galactose dans le milieu
ne semble pas avoir d'effet sur APJ, celui de citrate ou de l'urée diminue la stabilité du
récepteur. Ces considérations techniques seront à prendre en compte lors
d'expériences impliquant ce récepteur.
Fig.13 Séquence du recépteur APJ de l’homme et du rat (d’après Hosoya et al., 2000)
4) Régulation d'APJ
Plusieurs équipes, qui se sont intéressées aux effets biologiques transmis par APJ, ont
parallèlement étudié la régulation de ce récepteur. C'est le cas par exemple de O'Caroll
et de ses collaborateurs qui ont pu observer que des variations de l'osmolarité pouvaient
réguler l'expression d'APJ dans le NPV ainsi que dans le NSO de rat (450). En effet,
- 112 -
comme nous le reverrons plus en détails dans la partie traitant des effets d'APJ au
niveau du système nerveux central, une charge de sodium (présent dans l'eau de
boisson) ou un déprivation en eau de 48h pratiquée chez des rats entraîne une forte
augmentation (jusqu'8 fois) du niveau d'expression d'APJ au niveau du SNC. De plus,
les neurones parvocellulaires constituant le NPV présentent aussi une expression d'APJ
augmentée lorsque les rats étaient soumis à un stress (450). D'autres régulations ont
été démontrées comme par exemple l'effet positif d'une adrenalectomie chez le rat sur
l'expression d'APJ, signifiant que les glucocorticoïdes endogènes inhibent l'expression
du récepteur au niveau central (450). Très récemment, une étude menée chez le rat
rendu obèse par un régime riche en lipides, a pu mettre en évidence que ces animaux
présentaient une augmentation de l'expression d'APJ hyppothalamique. De plus, dans
cette même étude, les auteurs démontrent que l'apeline, injectée par voie intracérébro-
ventriculaire à ces animaux, entraîne une diminution de l'expression du récepteur (451).
Table 3. Tableau résumant les différents agents ou facteurs pouvant réguler positivement
ou négativement l’expression de l’ARNm ou de la protéine d’APJ
Agent ou facteur Effet Modèle Réference
Osmoticité + (ARNm) SNC rat O'Caroll et al, 2003
Stress +(ARNm) SNC rat O'Caroll et al, 2003
NO/L-Arginine +(ARNm et protéine) SNC rat Bai et al., 2007
Vasculogénèse +(protéine) Vaisseaux rétine
souris
Saint-Geniez et al.,
2003
Insuffisance
cardiaque +(ARNm et protéine) Coeur homme Chen et al., 2003
Insuffisance
cardiaque chronique -(ARNm)
Atrium et ventricule
humain Foldes et al., 2003
Diabète -(ARNm et protéine) Aortes de souris
db/db Zhong et al., 2007
Hypertension -(Protéine) Coeur et aorte de rat
hypertendus (SHR)
Zhong et al., 2005 et
2006
Ligand APJ - (Protéine) Rats obèses Clarke et al., 2008
- 113 -
L'ensemble des régulations observées pour APJ sont résumées dans le tableau
ci-contre (Table 3). Il est intéressant de remarquer que mise à part l'étude récente de
Bai et ses collaborateurs montrant que l'expression d'APJ est augmentée dans les
noyaux caudés de rats qui ont subi une injection intracérbroventriculaire de L-Arginine
(452), ou de celle de Clarke (451) concernant la régulation d'APJ par son ligand aucune
autre étude ne montre un effet direct d'un agent sur l'expression d'APJ.
L'expression du gène codant pour APJ est régulée par une séquence sans intron
située à l'extrémité 5' de la séquence d'APJ. Cette région possède une CAAT box et des
motifs AP-1, AP-2 et Sp1 qui participent à la régulation de l'expression d'APJ. Compte
tenu de ces information, O'Caroll et ses collaborateurs suggèrent que le promoteur du
gène codant pour le récepteur pourrait être sous le contrôle complexe de plusieurs
facteurs comme Sp1, C/EBP, les oestrogènes et les glucocorticoïdes. De plus, grâce à
des expériences conjuguant l'utilisation d'un gène rapporteur (luciférase) et de la
forskoline (provoque l'augmentation intracellulaire d'AMPc), ils montrent que
l'expression du gène pourrait être contrôlée négativement par l'AMPc (453). Nous
verrons par la suite que l'interaction entre APJ et de son ligand provoque une inhibition
de l'AMPc. Ceci laisse alors penser que le ligand peut entraîner une augmentation de
l'expression de son récepteur comme il pu déjà être décrit pour d'autres couples
ligand/récepteur.
Le dernier type de régulation n'est pas transcriptionnel mais post-traductionnel et
il nécessite la présence du ligand d'APJ. En effet, en 2003, l'équipe dirigée par R.J.
Pomerantz a pu mettre en évidence sur des cellules HEK 293 transfectées avec le
récepteur APJ couplé à l'EGFP ("enhance green fluorescence protein") que la fixation
du ligand sur son récepteur entraînait son internalisation. Cette internalisation est
dépendante de la concentration en ligand et elle est contrôlée par des mécanismes
impliquant la transferrine et la clathrine (454). La suppression, par mutagénèse dirigée,
d'une partie de l'extrémité C-terminale du récepteur indique que cette partie est
déterminante pour l'internalisation du récepteur (455) et pourrait donc servir de cible
pharmacologique pour maintenir APJ à la surface de la membrane plasmique.
- 114 -
II. L'Apeline
1) Découverte de l'apeline
En 1998, Tatemoto et ses collaborateurs identifient le ligand endogène du
récepteur orphelin APJ (438). Pour cela, ils s'appuient sur le fait que la liaison d'un
ligand sur son récepteur entraîne une excrétion de protons par les cellules. En effet,
l'induction d'une voie de signalisation cellulaire va conduire à des phénomènes
d'activation de la glycolyse, de la respiration mitochondriale ou encore à l'activation des
canaux calcium qui, in fine, aboutira à l'acidification du milieu. Les auteurs mesurent
donc l'efficacité de différents extraits tissulaires bovins et porcins à acidifier le milieu de
culture de cellules CHO transfectées avec le récepteur APJ. Ils observent que l'extrait
d'estomac bovin provoque la plus forte acidification et entreprennent alors la purification
du ligand d'APJ par utilisation successive de résines échangeuses de cations, de
centrifugations sur gradient linéaire puis de chromatographies en phase liquide (HPLC).
Un peptide est obtenu et nommé apeline pour "APJ endogenous ligand". A partir de la
séquence N-terminale de ce peptide, l'ADN complémentaire est synthétisé et des
recherches menées dans Genbank ont permis de montrer qu'il existait une séquence
codant pour une préproprotéine de 77 acides aminés chez l'homme, le rat et le bovin
(456). Cette préproapeline a été localisée dans le génome humain sur le chromosome
Xq25-26-1. L'homologie de séquence est de 82 % entre le rat et l'humain et de 77 %
entre le rat et le bovin.
2) Structure de l'apeline
L'analyse de la séquence de la préproapeline montre qu'il existe des sites riches en
acides aminés hydrophobes potentiellement impliqués dans un clivage de la
préproprotéine. Le premier site de clivage est localisé au niveau de l'acide aminé 22 et
entraîne la production d'un peptide de 55 acides aminés. Cette forme de 55 acides
aminés constitue la proapeline. Les 22 acides aminés positionnés à l'extrémité N-
terminale semblent constituer une séquence signal pour la sécrétion du peptide (457).
- 115 -
D'autres clivages ont lieu au niveau des sites hydrophobes (résidus arginine 46,
49, 59, 60, 63, 64, 66, 68 et lysine 72) amenant à retrouver l'apeline sous différentes
formes selon les tissus étudiés. Par exemple, Kawamata et ses collaborateurs montrent
qu'une forme longue de 36 acides aminés est plutôt retrouvée au niveau des poumons,
des testicules et de l'utérus alors que les formes de 36 et de 13 acides aminés sont
localisées au niveau de la glande mammaire du rat (458). Dans son étude originelle, en
se basant sur la séquence en acides aminés, Tatemoto avait déjà montré qu'il existait
plusieurs formes d'apeline. Il avait ainsi isolé ou synthétisé de l'apeline 36, de l'apeline
17 et de l'apeline 13 montrant une efficacité croissante de ces 3 peptides à acidifier le
milieu (438). De plus, il a également pu être montré qu'une forme d'apeline 13
pyroglutaminée à son extrémité N-terminale existait (le résidu Glutamine en position 65
se cyclise). Cette modification post-traductionnelle est retrouvée sur d'autres peptides et
permet de les stabiliser et de les protéger contre les dégradations par des peptidases
(199).
Au sein de ces différentes formes d'apeline, l'extrémité C-terminale est très
conservée. En effet, quelle que soit l'espèce étudiée, l'alignement des séquences
codant l'apeline (chez la souris, le rat, le bœuf et l'homme) a révélé une conservation
stricte des 17 derniers acides aminés carboxy-terminaux.
Récemment, une étude a montré que deux molécules de préproapeline pouvaient
s'associer et former des dimères. En effet, le traitement de lysats de tissu cardiaque de
souris par le DTT (dithiothreitol: composé qui détruit les ponts dissulfures) à permis
d'obtenir des bandes de 16 et 8 kDa (correspondant aux dimères et monomères
d'apeline) sur des immunoblots dirigés contre l'apeline, alors qu'une seule bande de 16
kDa (dimères) étaient présente avec les échantillons non traités. Ce résultat semble
assez surprenant puisqu'il n'existe pas de résidus cystéine au sein de 36 derniers
acides aminés de l'apeline. Ceci suggère donc que seules les formes intracellulaires
plus longues que l'apeline 36 (apeline 55 ou 77 par exemple) sont dimériques. Comme
déjà décrit pour d'autres protéines ou peptides, le rôle de cette dimérisation pourrait être
de protéger la preproapeline contre des protéases intracellulaires (459)
- 116 -
Fig 14. Alignement des séquences de l'apeline chez le boeuf, l'homme le rat et la souris (d'aprés
Llorens Cortes et al. 2001). On remarque, en rouge que les 17 derniers acides aminés situés à
l‟extrémité C-terminale sont conservés entre les 4 espèces étudiées.
3) Distribution tissulaire de l'apeline
Comme pour son récepteur, l'apeline est largement distribuée dans les différents tissus
de l'organisme. Au cours de la découverte de l'apeline, Tatemoto met en évidence que
le peptide est présent dans l'estomac et au niveau du SNC des bovins (438). En 1999,
une étude s'intéressant à la distribution tissulaire de l'apeline chez le rat et la souris
remarque que c'est au niveau de la glande mammaire de l'animal en période de
lactation que l'expression de l'apeline est la plus forte dans l'organisme (460). Cette
observation conduit les auteurs à rechercher la présence d'apeline dans le colostrum ou
le lait issu d'animaux (rat et bovin) avant et après des périodes de gestation. L'apeline
est présente dans le colostrum de ces animaux en grande quantité (90 pmol/ml) le jour
de la parturition puis chute les jours suivants (moins de 25 pmol/ml) (460). L'ensemble
de ces premières données concernant la localisation tissulaire de l'apeline va conduire à
étudier son rôle dans le système immunitaire. En effet, l'apeline présente dans le
colostrum ou le lait maternel pourrait intervenir dans la régulation du système
immunitaire du nouveau-né.
La première "cartographie" des tissus exprimant l'apeline est publiée en 2000 par
l'équipe dirigée par O'Dowd (456). Cette étude, pratiquée sur des tissus humains,
montre que l'apeline est fortement exprimée au niveau du cerveau et plus précisément
dans des zones telles que le noyau caudé, le thalamus, l'hypothalamus, l'hippocampe,
- 117 -
et le cortex frontal. Au niveau périphérique, la détection immunohistochimique de
l'apeline est visible dans les cellules des tubules collecteurs du rein, dans les
hépatocytes, dans les îlots pancréatiques, au niveau du placenta, et de certains type de
fibres musculaires. Une présence plus marquée est mise en évidence dans les
poumons et les bronches, au niveau de la rate ou du thymus, ainsi que les cellules
endothéliales constituant les vaisseaux sanguins du cœur et du rein (461, 462)
Chez le rat, on retrouve une expression de l'apeline au niveau du cortex frontal,
du striatum, du cervelet, de l'hippocampe et de l'hypophyse. Des images issues
d'expériences d'hybridation in situ confirment ce résultat et montrent la localisation
précise des neurones de rat exprimant l'apeline. Ainsi, on observe un marquage au
niveau du claustrum, du subiculum, des aires antérieures et postérieures du gyrus
cingulaire et des tubercules olfactifs. De plus, certains noyaux thalamiques et
hypothalamiques présentent un marquage assez dense. C'est le cas pour les noyaux
anterodorsaux, ventropostérieurs, ventromédian et centrolatéraux du thalamus et pour
les noyaux de l'aire supraoptique (NSO) et paraventriculaire (NPV) de l'hypothalamus.
Ces résultats concernant le transcrit de l'apeline sont retrouvés lors d'études
immunohistochimiques chez le rat où le peptide de l'apeline est localisé au niveau des
NPV et NSO mais aussi au niveau d'autres neurones comme ceux appartenant aux
noyau accessoire et suprachiasmatique (463). La localisation de l'apeline au niveau du
noyau accessoire est intéressante car ce noyau est connu comme pouvant sécréter
directement ces productions dans la circulation locale et ainsi atteindre les neurones
vassopressinergiques. Nous verrons que cette distribution anatomique prend toute son
importance lors de l'étude des rôles biologiques de l'apeline.
- 118 -
Fig. 17 Distribution tissulaire de l’ARNm et du peptide de l’apeline. A) L‟ARNm de l‟apeline est
distribué dans de nombreux tissu parmi lesquels le système nerveux central, le cœur le poumon, la
glande mammaire et le tissu adipeux. B) Le peptide de l‟apeline est surtout retrouvé dans les poumons et
dans la glande mammaire.
Au niveau périphérique, l'ARNm codant pour l'apeline est retrouvé au niveau du
rein, du cœur, des testicules et de l'intestin (458). Kawamata et ses collaborateurs
retrouvent ces résultats et mettent en évidence que d'autres tissus comme l'ovaire, le
poumon et le tissu adipeux expriment le messager de l'apeline. Cependant, au cours
d'expériences d'immunoréactivité dirigée contre l'apeline, on remarque que la détection
est surtout localisée au niveau des poumons et de la glande mammaire (458). Il
semblerait donc que la présence du transcrit ne témoigne pas exactement de la
présence du peptide. Par la suite plusieurs études s'intéressant aux rôles biologiques de
l'apeline ont pu localiser le peptide ou son ARNm dans d'autres tissus. Par exemple, on
sait que l'apeline est retrouvée au niveau du tractus gastrointestinal (446) avec une
expression plus importante au niveau du fundum et de l'iléon. Dans ces régions,
A
- 119 -
l'apeline est contenue dans les cellules endocrines et exocrines suggérant que l'apeline
puisse être excrétée par ces cellules dans la lumière intestinale (464).
III. Interaction apeline/APJ
1) Caractéristiques de la liaison apeline/APJ
Au cours d'expériences de liaison pharmacologique pratiquées sur des cellules CHO
transfectées par le récepteur APJ, l'équipe dirigée par M. Fujino montre que l'apeline 13
se lie à son récepteur avec une forte affinité (Kd entre 6.3 et 22.3 pM et Bmax entre 3.01
et 7.4 pmol/mg de protéine selon les études) (445, 458). Cette liaison est rapide et il
semblerait que l'apeline 13 se dissocie assez vite du récepteur ce qui n'est pas le cas de
l'apeline 36. En effet, si l'apeline 36 possède une affinité inférieure à son homologue de
13 acides aminés, elle se lie en revanche plus fortement au récepteur de sorte que lors
d'expériences de compétition la liaison apeline 36/APJ soit difficile à déplacer (445,
458). Sur d'autres types cellulaires exprimant de façon endogène APJ comme les
HEK293 (human embryonnic kidney), les expériences de binding ont montré que
l'apeline 13 pyroglutaminée possédait un seul site de liaison avec une haute affinité
(Kd= 2.7 nM et Bmax= 275 pmol/mg de protéine) (465, 466). Enfin, sur des tissus
humains ou murins isolés (cœur, poumon ou cerveau), l'apeline 13 se lie avec une
affinité du même ordre (moins de 1nM) et la quantification d'APJ sur ces tissus montre
un Bmax de 5 à 10 fmol/mg de protéine (Katugampola et al.,2001).
Compte tenu des nombreuses formes d'apeline qui sont retrouvées dans la
circulation, plusieurs équipes se sont attachées à déterminer quels acides aminés
étaient importants dans la liaison apeline/APJ. Pour cela l‟essentiel des travaux a
consisté à étudier les effets de différentes formes d‟apeline sur les effets décrits comme
l‟acidification du milieu, l‟inhibition de l‟AC ou encore la capacité de l‟apeline à induire
l‟internalisation du récepteur APJ.
Comme nous l‟avons vu plus haut, les premières expériences concernant la liaison
apeline/APJ montrent que les formes courtes d‟apeline ont une meilleure capacité à
- 120 -
inhiber l‟AC et ainsi à diminuer les taux d‟AMPc intracellulaires (445, 454). Les travaux
de De Mota effectués sur des cellules CHO exprimant le récepteur APJ de rat mettent
en évidence que l‟élongation de l‟apeline 17 par une tyrosine en N-terminal ou la
délétion des quatre premiers acides aminés (équivaut à obtenir l‟apeline 13) ne modifie
pas la capacité du peptide à inhiber la production d‟AMPc (441). En revanche, la
délétion des sept premiers acides aminés (équivaut à obtenir l‟apeline 10) ou la
substitution de la phénylalanine en position C-terminale par une alanine, abolit
totalement l‟activité du peptide (441).
Medhurst et ses collaborateurs montrent par des techniques d‟Alanine-scan
(remplacement d‟un acide aminé par une alanine) que les acides aminés en position N-
terminale sont plus importants que ceux positionnés à l‟extrémité C-terminale pour la
liaison à APJ. Cette observation est valable que l‟on étudie la liaison apeline/APJ ou sa
fonctionnalité (diminution d‟AMPc, augmentation Ca++ intracellulaire) (466). L'explication
de ce résultat semble résider dans le fait qu‟une région située dans la partie N-terminale
(motif « RPRL ») pourrait constituer une séquence de reconnaissance ligand/récepteur.
Cependant les mêmes expériences sont également réalisées par Fan et ses
collaborateurs mais les résultats ne sont pas en accord avec les conclusions de
Medhurst (465). En effet, lors de l‟Ala-scan, ces auteurs observent que la liaison
apeline/APJ peut également être affectée par le remplacement d‟acides aminés située à
l‟extrémité C-terminale (P12 et F13). Plus récemment, El Massari et ses collaborateurs
montrent que la délétion des acides aminés en position N-terminale et C-terminale ne
modifie que très peu l'affinité de l'apeline pour son récepteur. En revanche,
l'internalisation du récepteur est fortement diminuée lorsque les acides aminés en
position C-terminale sont absents (454).
Ces travaux vont démontrer tout leur intérêt lors de l'étude de la régulation de l'apeline.
En effet, une étude a montré en 2005 que le remplacement de la phénylalanine située
position C-terminale (dernier acide aminé) par une alanine antagonise l'effet de l'apeline
(rôle hypotenseur dans cette étude que nous aborderons dans les prochains chapitres)
(459). De plus, une enzyme impliquée dans la régulation de la synthèse de
l'angiotensine interviendrait aussi dans la régulation de l'activité de l'apeline. En effet,
l'ACE2 (Angiotensin converting enzyme 2) clive la phénylalanine en position C-terminale
et pourrait par ce mécanisme inactiver l'apeline (467). Ces hypothèses doivent être
- 121 -
approfondies car peu de choses sont à ce jour connues sur cette enzyme et sur l'activité
biologique de l'apeline dégradée par l'ACE2.
L'ensemble de ces travaux concernant la pharmacologie de l'interaction
apeline/APJ démontre que cette liaison est spécifique, réversible, saturable et que sur
certains tissus humains et murins il n'existe qu'un site de liaison à haute affinité pour
l'apeline.
2) Fonctionnalité de l'interaction apeline/APJ
Acidification du milieu- C'est au cours de la découverte de l'apeline que l'interaction
apeline/APJ est caractérisée pour la première fois. En effet, en 1998, Tatemoto et ses
collaborateurs montrent, sur des cellules CHO transfectées par le récepteur APJ, que la
liaison de l'apeline induit une augmentation de l'acidification extracellulaire. Au cours de
ces expériences, des expériences incrémentant les doses ont permis de mettre en
évidence que l'efficacité des différentes formes d'apeline à acidifier le milieu augmentait
avec le raccourcissement du peptide. Ainsi, l'apeline 13 (pyroglutaminée ou non) acidifie
le milieu extracellulaire avec une EC50 d'environ 0.3 nM alors que les formes de 17 et
36 acides aminés ont respectivement une EC50 de 2.5 et 20 nM (438). Ces conclusions
sont retrouvées par une autre équipe qui montre également que le peptide de 36 acides
aminés entraîne une acidification plus longue que les autres formes d'apeline (445).
Ceci est en accord avec les observations réalisées au cours des expériences
pharmacologiques de liaison de l'apeline sur APJ (445, 458).
Le mécanisme impliqué dans l'acidification du milieu par l'apeline semble être
dépendant de l'échangeur Na+/K+ puisque l'utilisation d'un inhibiteur spécifique (MIA) de
cet échangeur inhibe totalement l'acidification du milieu (445).
Inhibition de l'adenylylcyclase- Les précédentes études montraient qu'APJ était un
récepteur couplé aux protéines Gi/o dont on sait qu'ils agissent en diminuant les
concentrations intracellulaires d'AMPc. En l'absence d'outil pharmacologique (apeline
marquée, agoniste ou antagoniste) et afin de décrire l'interaction apeline/APJ, plusieurs
équipes ont étudié l'effet de l'apeline sur l'activité de l'adenylyl cyclase (AC), enzyme
responsable des taux d'AMPc intracellulaires. Sur les cellules CHO transfectées avec
- 122 -
APJ, l'apeline entraîne une inhibition totale de l'accumulation d'AMPc et ce quelle que
soit la forme d'apeline utilisée (468). Cependant, des différences d'efficacité ont pu être
observées puisque l'EC50 de l'apeline 13 pyroglutaminée est environ 4 fois plus faible
que celle de l'apeline 36. Comme pour l'affinité, la capacité des différents peptides à
promouvoir l'inhibition de la synthèse d'AMPc semble être inversement corrélée à la
taille des fragments d'apeline (441, 445). Ces résultats suggèrent qu'APJ est un
récepteur capable d'agir sur l'adenylyl cyclase en inhibant son activité. Cette hypothèse
est confirmée par la perte de l'effet de l'apeline lors du traitement des cellules avec un
inhibiteur spécifique des protéines Gi/0 (toxine pertussique) (445, 469). Pour appuyer le
couplage d'APJ avec Gi/0, Masri et ses collaborateurs montrent que l'interaction
apeline/APJ ne produit pas d'augmentation des niveaux intracellulaires d'inositol
phosphate synonyme de l'activation des protéines Gq (469). Cette même équipe
démontre également que sous l'influence de son ligand, APJ se lie aux sous-unités i1
ou i2 mais pas i3 (468). Ce résultat constitue une spécificité intrinsèque du récepteur
APJ dont il faudra tenir compte lors de l'étude de différents effets de l'apeline sur des
modèles cellulaires. En effet, le degré d'inhibition de l'adenylyl cyclase est plus important
dans les cellules n'exprimant qu'exclusivement i2 par rapport à celles exprimant i1,
alors qu'il est logiquement nul dans les cellules possédant la forme i3. De plus, il
semblerait que l'affinité de l'apeline pour APJ soit 5 fois plus importante lorsque le
récepteur est couplé à la forme i2 (468). Ces résultats ne montrent pas un couplage
préférentiel d'APJ avec une sous-unité de la protéine G mais souligne plutôt une plus
haute efficacité du couplage APJ/sous unité i2.
Internalisation du récepteur- Après la fixation de leur ligand, de nombreux récepteurs
sont internalisés afin de médier un effet cellulaire ou d'être simplement dégradés ou
recyclés. En 2000, l'équipe dirigée par C. Llorens-Cortes a pu mettre en évidence grâce
au marquage fluorescent d'APJ, que ce récepteur était internalisé dans des cellules
CHO transféctées lorsque l'apeline 17 était présente dans le milieu (441). Evans et ses
collaborateurs confirment ces conclusions et démontrent même que cette internalisation
est très rapide (50% des récepteurs internalisés en 10 min) et quasiment totale (90%
des récepteurs internalisés au bout d'une heure) (470). Il semblerait également que
l'internalisation soit inversement corrélée à la taille de l'apeline utilisée: plus l'apeline est
- 123 -
courte et plus l'internalisation est forte (454). En outre, il apparaît que l'internalisation est
dépendante de la clathrine (454) mais indépendante de la -arrestine (470). L'utilisation
de marqueurs des endosomes (EEA), des lysosomes (Cathepsine D) et des voies de
recyclage (Transferrine) montre que le récepteur est recyclé et pas dégradé lorsque les
cellules sont incubées avec de l'apeline 17. Enfin, après deux heures d'incubation, on
retrouve APJ dans de larges vésicules prés du noyau dans des compartiments de
recyclage périnucléaire (PNRC) (454) Ces phénomènes d'internalisation semblent être
fortement liés à certaines fonctionnalités du récepteur. En effet, El Massari et ses
collaborateurs affirment qu'au cours de leurs travaux visant à étudier en parallèle
l'internalisation d'APJ et l'effet cardiovasculaire de l'apeline, seules les formes capables
de produire l'internalisation ont un effet sur la sphère cardiovasculaire (454). Cependant,
sur des cellules en culture (HEK293) il semblerait que l‟internalisation ne soit pas
toujours accompagnée d‟une signalisation cellulaire (augmentation des taux
intracellulaires de Ca++). Ainsi, en fonction du modèle et de l'effet biologique étudié, il se
peut que l'internalisation d'APJ soit plus ou moins nécessaire pour médier une
signalisation cellulaire.
Voies de signalisation activées par le complexe apeline/APJ
La voie des Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)
Les travaux effectués sur les CHO transféctées par APJ ont permis d'étudier les voies
de signalisation activées par l'apeline dans ces cellules. Comme nous l'avons vu plus
haut, APJ est couplé à Gi/0. Ce couplage est aussi décrit comme pouvant activer la voie
de kinases nommées ERK (extracellular signal-regulated kinase) qui elles-même
appartiennent à la voie des MAPK. Plus en détail, Masri et ses collaborateurs ont
montré que l'apeline pouvait activer la phosphorylation de p42 et p44 qui sont des ERKs
impliquées dans la croissance cellulaire (469). Le blocage de la phosphorylation des
ERKs par la PTX suggère que cet effet est dû à l'activation d'une protéine G i ou G0 dans
les cellules CHO. Des expériences complémentaires ont permis de confirmer que l'effet
de l'apeline ne transitait pas par la sous-unité de la protéine G (469) et qu'il était
indépendant de l'activation de Ras (GTPase pourtant largement impliquée dans les
- 124 -
effets de croissance cellulaire). Bien que l'activation des MAPK via les protéines G soit
souvent dépendante des sous-unités de la protéine G il a pu être montré qu'une
forme mutante de la sous-unité i2 stimulait constitutivement les MAPK (471).
L'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique (GF109203X) démontre que la voie
d'activation des ERK transite nécessairement par la Protéine Kinase C (PKC). Nous
verrons dans les prochains chapitres que ces résultats permettent d'envisager un rôle
de l'apeline dans la prolifération de cellules endothéliales ou gastro-intestinales.
Activation de la P70S6 kinase
L'apeline est capable d'activer la P70S6 kinase (P70S6K ou S6K1) aussi bien dans les
cellules CHO transféctées avec APJ que dans les HUVEC (Human vascular embryonic
cell) exprimant le récepteur de façon endogène (472). La P70S6K est une kinase
capable d'intégrer de nombreux signaux grâce à la phosphorylation sélective de ses
différents résidus qui va entraîner des changements conformationnels successifs à
l'origine de l'activation de la kinase (473). Cette protéine joue un rôle dans le contrôle de
la synthèse protéique et dans la croissance et la prolifération cellulaire (474, 475).La
P70S6K est aussi présente au sein du système nerveux central (476) où il a récemment
été mis en évidence qu'elle pouvait avoir un rôle sur la balance énergétique en synergie
avec la protéine mTOR (477). La signalisation cellulaire étudiée sur les HUVEC a
permis de mettre en évidence que l'apeline provoquait la phosphorylation rapide (2
minutes) et longue (2 heures) de résidus clés tels que les thréonine 421 et 389 mais
aussi la sérine 424 (Masri et al., 2004). Dans cette étude, les auteurs démontrent, grâce
à l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques, que la phosphorylation de la thréonine en
position 389 est dépendante de l'activation d'Akt et de mTOR (voie de la Pi3K) alors que
celle des résidus 421 et 424 sont sous le contrôle de la voie des MAPK (PKC atypique
et ERK). La phosphorylation sur le site 389, un des sites permettant d'activer la fonction
kinase de la P70S6K, semble démontrer que l'apeline est capable d'activer la P70S6K.
Afin de confirmer ce résultat, il est nécessaire de vérifier que l'apeline permet la
phosphorylation du résidu T229 décrit comme étant le dernier résidus phosphorylé
permettant l'activation de la P70S6K (474).
Enfin, il est intéressant de remarquer qu'une telle régulation est observée lors de
l'étude de l'action du VEGF sur les HUVEC (Yu et al., 1999). Nous verrons plus loin que
- 125 -
ce mécanisme pourrait être en partie responsable de l'effet mitogènique et angiogénique
de l'apeline.
Autres cibles cellulaires du système apeline/APJ
Dans des cellules humaines de rein 293T exprimant APJ, Hashimoto et ses
collaborateurs ont pu confirmer que l'apeline induisait la phosphorylation d'Akt/PKB par
une voie dépendante de la protéine Gi et de la PI3K. Ils ont également pu montrer que
la protéine FAK (Focal Adhesion Kinase), responsable de l'adhésion focale et de la
motilité cellulaire était activée par phosphorylation au cours de ces expériences (478).
De la même manière, l'apeline est aussi capable d'activer Akt dans des ostéoblastes
humains (447).
Dans les prochains chapitres de ce manuscrit, nous verrons que l'apeline est
largement impliquée dans la régulation de l'activité cardio-vasculaire ce qui a amené
plusieurs équipes à étudier sa signalisation dans les cellules cardiaques et
endothéliales. Ainsi, dans les cellules musculaires lisses, l'apeline est capable d'activer
la phospholipase C (PLC), la protéine kinase C (PKC) et, par une action indirecte sur
des échangeurs Na+/H+ et Na+/Ca++, d'augmenter la concentration intracellulaire de
calcium. Ce même mécanisme pourrait également expliquer l'augmentation des taux
intracellulaires de Ca++ dans des neurones humains en culture (NT2.N) provoquée par
l'apeline (479). Par la suite, nous décrirons également l'effet de l'apeline sur le tonus
vasculaire et nous allons démontrer que la cible privilégiée de l'apeline dans les cellules
endothéliales est la synthase d'oxide nitrique ou eNOS.
IV. Rôle de l'apeline dans le système cardio-vasculaire
1) Le tonus vasculaire
C'est en 2000 que Lee et ses collaborateurs (Lee et al., 2000) décrivent pour la
première fois un effet de l'apeline sur le système vasculaire. L'injection de deux doses
différentes (3,3 et 6,6 µg/kg poids corporel) d'apeline 13 par voie intraveineuse (iv) à des
rats anesthésiés entraîne une diminution significative et immédiate des pressions
- 126 -
systoliques et diastoliques. Cet effet dure 3 à 4 minutes et il s'accompagne d'une légère
augmentation de la fréquence cardiaque.
Ce résultat est reproduit par deux équipes différentes en 2001 et 2004. En effet,
au cours d'une étude menée aussi sur le rat Wistar anesthésié, Tatemoto et ses
collaborateurs ont pu confirmer que l'injection iv d'apeline entraînait une diminution de la
pression artérielle moyenne (PAM) (480). Cette même étude montre également qu'il
existe une différence d'efficacité entre les formes d'apeline: l'apeline 12 ou 13 possédant
une meilleure capacité à diminuer la PAM que la forme de 36 acides amines (diminution
de la PAM de 26, 11 et 5 mmHg respectivement). En 2004, l'équipe dirigée par C.
Llorens-Cortes montre que l'apeline 17, comparée au fragment de 13 acides aminés,
possède une capacité plus élevée à induire une baisse de la PAM (-12.8 mmHg et -6
mmHg respectivement) (454).
Afin d'expliquer le mécanisme d'action de l'apeline, plusieurs équipes se sont
tournées vers le monoxyde d'azote (NO) puisqu'au niveau des cellules endothéliales,
l'apeline est capable de phosphoryler (sur le résidu serine 1176) et d'activer la Synthase
d'Oxyde Nitrique endothéliale (eNOS) entraînant une synthèse de NO quantitativement
importante. En effet, deux minutes après l'injection i.v d'apeline 13 (7,5 µg/kg), on
observe une augmentation des taux plasmatiques de nitrites oxydés (480, 481). Le NO
est un gaz synthétisé par la eNOS à partir de la L-arginine. Il va activer la guanylate
cyclase et ainsi provoquer la transformation de guanosine triphosphate (GTP) et
guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dont l'augmentation est responsable de la
modulation de l'activité de certaines protéines kinases. Ces enzymes, en favorisant la
sortie de potassium et de calcium hors de la cellule, provoquent une hyperpolarisation
avec pour conséquence une relaxation des fibres musculaires lisses des vaisseaux. A
l'échelle d'un vaisseau, le NO produit par les cellules endothéliales va diffuser jusqu'aux
cellules musculaires lisses composant la paroi vasculaire et provoquer leur relaxation.
L'ensemble de ces mécanismes conduira in fine à des phénomènes de vasodilatations
et de diminution de la pression artérielle.
Il apparaît cependant que le rôle de l'apeline sur les vaisseaux n'est pas
seulement dû aux récepteur APJ présents sur les cellules endothéliales. En effet,
comme nous l'avons déjà vu plus haut, APJ est aussi présent au niveau des cellules
musculaires lisses des certains vaisseaux. Des expériences faites sur des artères
humaines dénuées de cellules endothéliales montrent que l'apeline 13 possède un effet
- 127 -
direct sur les cellules musculaire lisses provoquant leur contraction et par conséquent
pouvant potentiellement médier une vasoconstriction (482). Dans un contexte
physiopathologique de dysfonction endothéliale, on peut aisément imaginer que
l'apeline puisse avoir un rôle de vasoconstricteur et participe indirectement à
l'installation de pathologies vasculaires. Plus récemment, des études réalisées sur des
cellules musculaires lisses de la paroi des vaisseaux montrent que l'apeline est aussi
responsable de la phosphorylation (en Thr 18 et Ser 19) des chaînes lourdes de
myosine, acteurs essentiels de la contraction des cellules musculaires lisses. Cette
activation est perdue lorsque les cellules musculaires lisses sont issues de souris
invalidées pour le récepteur APJ (483).
Même si la plupart des études ont montré un effet vasodilatateur de l'apeline,
certains travaux ont rapporté une augmentation de la PAM. En effet, Kagiyama et ses
collaborateurs ont mis en évidence qu'à très forte concentration (environ 200 µg/kg),
l'apeline 13 injectée en iv pouvait induire une constriction des vaisseaux responsable
d'une augmentation de la PAM. De plus, au cours de cette étude, les auteurs ont pu
observer une augmentation de la fréquence cardiaque (484). Enfin, une étude pratiquée
chez le mouton a révélé que l'apeline (20 µg/kg) pouvait avoir des effets biphasiques sur
la pression artérielle entraînant une diminution (-12 mmHg) suivie d'une augmentation
(+12 mmHg) de celle ci quelques minutes après l'injection (485). Même si ce type de
régulation semble être dû à une adaptation rapide de l'organisme, il apparaît que
l'apeline agit de façon différente sur le tonus vasculaire en fonction de la dose injectée
et de l'espèce étudiée.
Chez l'homme, les études relatives à l'apeline et à la physiologie vasculaire ont
essentiellement concerné les propriétés (localisation et liaison) du couple apeline/APJ.
En effet, en 2001, des études de binding pratiquées ex vivo ont mis en évidence que
l'apeline 13 se liait rapidement au niveau des artères coronaires, de l'aorte et de la veine
saphène (482). La présence du complexe apeline/APJ (détecté par immunohistochimie)
est très prononcée dans la plupart des vaisseaux qui entourent le cœur, le rein et les
poumons. Il est aussi retrouvé au niveau des cellules endothéliales des gros vaisseaux
(462) et colocalisé avec PECAM (CD31 ou platelet-endothelial cell adhesion molecule),
une protéine très présente dans les cellules endothéliales (486). En ce qui concerne les
- 128 -
effets physiologiques de l'apeline sur le système vasculaire humain, seules trois études
ont été jusque là publiées. Deux d'entre elles présentent des travaux réalisés sur des
artères ou des veines ex vivo (482, 487). Katugampola et ses collaborateurs ont montré
que l'apeline augmentait la constriction de la veine saphène dénuée de cellules
endothéliales alors que Salcedo à mis en évidence que l'apeline provoquait une
vasodilatation des artères hépatiques et mésentériques. De façon intéressante, cette
dernière étude montre que l'effet de l'apeline, au niveau des artères hépatiques,
uniquement, n'est pas totalement réprimé lors du blocage pharmacologique de la eNOS.
Ce résultat signifie que dans certains tissus, la vasodilatation médiée par l'apeline n'est
pas exclusivement transduite par la eNOS (487). On pourrait émettre l'hypothèse que
l'apeline puisse devenir une cible potentielle dans le traitement de pathologies
vasculaires spécifiques de certains tissus. L'étude de cette voie parallèle devra donc
être approfondie.
Dernièrement, des travaux ont pu mettre en évidence que l'effet vasodilatateur de
l'apeline était conservé chez l'homme. En effet, bien que l'injection d'apeline 13 ou 36
chez l'homme sain ne semble pas modifier le tonus veineux, les auteurs observent, suite
à l'injection, une vasodilatation artérielle dépendante du NO (488).
Fig. 18 Voies de signalisation de l’apeline dans les cellules les cellules endothéliales
permettant la vasodilatation. Au niveau des cellules endothéliales,l ‟apeline se fixe sur son récepteur
APJ qui va induire une cascade de signalisation impliquant la protéine kinase C (aPKC), la
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phosphoinositol-3-phosphate kinase (PI3K) et Akt. Il s‟en suivra une phosphorylation activatrice de la
synthse d‟oxide nitrique endothéliale (eNOS) qui va permettre la libération de NO. Ce NO va pouvoir agir
sur les cellules musculaire lisses entourant les vaisseaux et permettre leur relaxation. Ce phénomène
induiration une dilatation à l‟échelle du vaisseaux.
2) Apeline et système cardiaque
Au cours des différentes études menées in vivo chez le rongeur pour établir le rôle de
l'apeline sur le tonus vasculaire, plusieurs observations ont rapporté des modifications
de la fonction cardiaque consécutives à l'administration du peptide. Cet autre effet de
l'apeline semble posséder deux origines:
Effet cardiaque indirect: effet chronotrope- En 2003, Cheng et ses collaborateurs ont
mis en évidence que l'injection d'apeline à de fortes concentrations (de 15 à 60 µg/kg)
incrémentait de façon dose dépendante la fréquence cardiaque (augmentation de 15 à
40 battements par minute) chez le rat éveillé (113). Avant ces travaux, la plupart des
études décrivant peu ou pas d'effet de l'apeline sur la sphère cardiaque avaient été
réalisées chez le rat anesthésié. Or il est maintenant bien décrit que certains
phénomènes physiologiques ne sont pas observables chez l'animal anesthésié. Dans
son étude, Cheng a pu montrer que l'augmentation de la contraction cardiaque était due
à la mise en place du baroreflexe faisant suite à l'hypotension. Le baroreflexe est un
mécanisme permettant à l'organisme de contrôler la pression artérielle. Des "capteurs
de pression" (barorécepteur) qui se trouvent au niveau des sinus carotidiens et de la
crosse aortique perçoivent les baisses de la pression sanguine et s'opposent à ces
modifications en agissant positivement sur la fréquence cardiaque via la modulation des
systèmes nerveux sympathique et parasympathique. Ainsi, au cours d'une hypotension
provoquée par une injection d'apeline, les barorécepteurs captent la baisse de tension
et s'y opposent en activant le système sympathique et en inhibant le système
parasympathique. La résultante de ces régulations est une augmentation de la
fréquence cardiaque. La démonstration de ces régulations est obtenue lorsque les rats
sont traités par de la mecamylamine, un antagoniste des récepteurs nicotiniques des
ganglions impliqués dans le relais de l'information vasculaire (113, 489). En effet, le
- 130 -
blocage de ces relais centraux inhibe totalement l'augmentation de la fréquence
cardiaque observée chez les animaux témoins en présence d'apeline. Ceci montre bien
que le baroreflexe est à l'origine de l'effet chronotrope observé au cours de
l'administration d'apeline.
Effet cardiaque direct: effet inotrope positif- Bien que les expériences de Cheng
décrites dans le paragraphe précédent plaident pour un lien indirect entre l'apeline et la
fonction cardiaque, la forte présence d'APJ au niveau du cœur (462) a conduit
différentes équipes a étudier le rôle direct du peptide sur cet organe. Pour cela, Szokodi
et ses collaborateurs ont travaillé sur des cœurs isolés et perfusés de rats. Ainsi, ces
auteurs ont pu mettre en évidence que l'apeline augmentait la tension cardiaque avec
une EC50 de 33 pM. Cet effet est rapide (2 min après l'ajout d'apeline) et comparable en
intensité à des inotropes positifs connus tels que l'endothéline ou l'adrenomedulline
mais en deçà de l'effet de l'isoproterenol (agoniste -adrénergique) (490).
Les mécanismes moléculaires impliqués dans la contraction cardiaque ont aussi
été étudiés. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques a permis de mettre en évidence
que la Phospholipase C (PLC) et la protéine kinase C (PKC) étaient indispensables pour
médier l'effet inotrope positif de l'apeline. Par contre, contrairement à l'effet observé sur
le tonus vasculaire, le monoxyde d'azote (NO) ne semble pas jouer de rôle dans la
contraction cardiaque (490).
L'effet de l'apeline sur la contraction cardiaque semble en partie dûe à une
augmentation des taux intracellulaires de Ca++. En effet, l'inhibition des co-transporteurs
sodium/proton (NHE) et sodium/calcium (NCX) diminue de 50 à 60% la capacité de
l'apeline à stimuler la contraction cardiaque (Szokodi et al., 2002 et Farkasfavi et al.,
2007).
Chez l'homme, le complexe APJ/apeline est présent au niveau du myocarde et
de façon plus marquée au niveau de l'endocarde de l'oreillette droite (ARNm et
immunoréactivité). L'étude immunohistologique de prélèvements de cœurs montre que
l'apeline est présente au niveau des cellules endothéliales endocardiques tapissant
l'oreillette droite (colocalisation avec PECAM) mais peu ou pas détectable au niveau des
cardiomyocytes (462, 486). Aucune autre étude concernant un rôle putatif de l'apeline
dans la physiologie cardiaque humaine n'a à ce jour été publié. En effet, comme nous
- 131 -
allons le voir dans les prochains chapitres, l'essentiel des travaux effectués chez
l'homme concerne l'implication de l'apeline dans la pathologie cardiaque.
Fig. 19 Mécanismes cellulaires impliqués dans la contraction cardiaque induite par
l’apeline. En se fixant sur son récepteur, l‟apeline va permettre d‟activer la phopspholipase C (PLC) et la
protéine kinase C (PKC) dans les cardiomyocytes. Cette activation conduira à une entrée massive de
calcium à l‟intérieur de la cellule grâce aux échangeurs Na/H (NHE) et Na/Ca (NCX). L‟augmentation du
Ca intracellulaire va permettre la phosphorylation des chaînes lourdes de myosine et va ainsi provoquer la
contraction des cellules.
3) Apeline et régulation centrale du système cardiovasculaire
La forte présence d'APJ au niveau des centres cardiorespiratoires situés dans le
bulbe rachidien a conduit trois équipes différentes à étudier l'effet d'injections intra-
cérébroventriculaire (icv) d'apeline sur la fonction cardiaque. Seyedabadi et ses
collaborateurs ont tout d'abord mis en évidence qu'APJ était exprimé par les cellules du
noyau du tractus solitaire (NTS) et de l'aire médullaire rostrale ventrolatérale (RVLM),
deux centres impliqués dans la régulation centrale de l'activité cardiaque (491). Ils ont
ensuite démontré qu'une microinjection icv d'apeline 13 au niveau du RVLM ou du NTS
- 132 -
entraînait une faible augmentation de la pression artérielle. En 2005, ces résultats
concernant un effet central de l'apeline sur la sphère cardiaque sont reproduits par une
équipe japonaise (484). Dans cette étude, les auteurs observent que l'apeline injectée
en icv produit une augmentation de la pression artérielle mais également une
augmentation de la fréquence cardiaque plus importante que lors de l'administration
d'apeline par voie veineuse. De plus, l'apeline injectée directement au niveau central
produit une surexpression de c-fos, un marqueur d'activation neuronal, au niveau du
noyau paraventriculaire qui est impliqué dans la régulation des fluides de l'organisme
alors que l'injection systémique ne produit aucun effet sur l'expression de c-fos.
Cependant, compte tenu de la différence de concentration d'apeline utilisée lors des
expériences entre l'injection iv (de 90 à 225 µg/kg) et icv (de 22 à 90 µg/kg) et de
l'absence de dosage de l'apeline présente au niveau central, il est difficile de comparer
les effets produits par les deux voies d'administration.
4) L'apeline et la physiopathologie cardiovasculaire
a) Etudes descriptives
Les premières observations permettant de supposer un rôle de l'apeline dans la
physiopathologie cardiaque proviennent d'études menées sur des cellules en cultures.
En effet, l'étirement de myocytes issus de ventricules de nouveau-nés de rats entraîne
une diminution de l'expression du messager de l'apeline et d'APJ alors que ceux de
marqueurs de l'insuffisance cardiaque comme les peptides natriurétiques (ANP ou BNP)
sont augmentés. Ces premiers résultats permettent donc d'envisager une implication du
système apeline/APJ dans les pathologies cardiaques. Dans la même étude, les
résultats obtenus in vivo montrent une baisse de 33% de l'expression d'apeline dans le
ventricule gauche de rats hypertendus (rats SHR: spontaneous hypertensive rats) (490).
Ces résultats sont confirmés par l'étude de l'expression de l'ARNm et de la protéine de
l'apeline chez d'autres modèles de rats hypertendus (Rat Dahl-SS ou rats rendus
hypertendus par un traitement à l'isoprotérenol) (492, 493) ou encore chez la souris
(souris db/db hypertendue) (494). En revanche, il semblerait que dans les stades
précoces de l'insuffisance cardiaque ou encore au cours d'autres pathologies
- 133 -
cardiaques, l'expression du messager et de la protéine de l'apeline et d'APJ augmente
(492, 495). Ceci suggère que dans les modèles d'insuffisance cardiaque, le système
apeline/APJ pourrait retarder l'apparition de la maladie alors qu'au contraire, dans
d'autres pathologies cardiaques, le complexe apeline/APJ participerait secondairement
à l'installation de la pathologie. Des expériences complémentaires sont néanmoins
nécessaires pour montrer que cette surexpression myocardique dans les stades
précoces permet de retarder l'apparition d'insuffisance cardiaque plus sévère.
Chez l'homme, même si la plupart des protocoles cliniques étudient les variations
d'apeline plasmatique au cours d'une pathologie cardiovasculaire, deux études se sont
intéressées aux modifications d'expression de l'apeline et de son récepteur dans le
cœur. C'est ainsi qu'en 2003, Foldes et ses collaborateurs montrent que l'expression de
l'apeline et de son récepteur varient en fonction de la partie du cœur et de la pathologie
étudiée (496). En effet, dans le ventricule myocardique humain gauche, les auteurs
observent une nette augmentation de l'expression de l'apeline chez les patients atteints
de pathologies cardiaques coronariennes (PCC) ou de cardiomyopathie (5 et 3 fois
respectivement).
Au niveau de l'oreillette droite, l'expression de l'apeline est 200 fois plus
importante que dans le ventricule myocardique. Ce résultat semble cohérent avec
l'hypothèse avancée par certains groupes selon laquelle l'apeline atriale serait la
principale source d'apeline plasmatique. Cependant, à l'heure actuelle, aucun argument
direct n'est en faveur de cette hypothèse même si plusieurs travaux ont montré une
corrélation positive entre l'apeline atriale et plasmatique (496, 497). Ainsi, au cours de
pathologies cardiaques coronariennes, le marquage immunohistologique atrial d'apeline
diminue de 30%, l'expression d'APJ de 50% et l'apelinémie décroît de 89.8 à 71.6 pg/ml
(496). Cette diminution de l'apelinémie chez les patients atteints d'insuffisance
cardiaque est retrouvée par plusieurs groupes (341, 498, 499). De plus, des dosages
plasmatiques réalisés par l'équipe de T. Quertermous sur des patients insuffisants
cardiaques ont révélés qu'au cours de l'installation de la pathologie, les taux circulants
du peptide augmentait dans les premiers stades de la maladie puis diminuaient de
manière dramatique lors d'insuffisance cardiaque sévère (486). Comme chez le rat, les
auteurs interprètent l'élévation de l'apelinémie qui a lieu dans un premier temps comme
un effet cardioprotecteur du système apeline/APJ, puis la diminution de ces taux
- 134 -
plasmatiques d'apeline comme pouvant participer au développement de l'insuffisance
cardiaque.
Ces hypothèses sont étayées par l'augmentation de l'apelinémie observées au
cours de différentes interventions visant à améliorer la fonction cardiaque. Par exemple,
au cours de la pose d'un dispositif d'assistance du ventricule droit chez l'insuffisant
cardiaque, on observe une élévation d'un facteur 2.5 de l'apelinémie (486). De même,
neuf mois après une resynchronisation cardiaque (possible grâce à la pose d'un
pacemaker), on observe une élévation des taux d'apeline plasmatiques atteignant des
valeurs identiques à celles relevées chez l'homme sain (499).
b) Etudes fonctionnelles
A partir des différentes observations rapportées dans le chapitre précédent, il
semble clair que l'apeline pourrait être une cible dans le traitement des maladies
cardiovasculaires.
Plusieurs équipes ont mis en que l'apeline pourrait être une cible thérapeutique
d'intérêt dans le traitement des maladies cardiaques. Ainsi, chez le rat atteint d'infarctus
du myocarde et de cardiomyopathie provoqués par une ligation au niveau des artères
coronaires, deux équipes différentes ont pu montrer qu'une injection d'apeline (200 g/l)
entraînait une augmentation significative de la contraction cardiaque démontrée par une
amélioration de la Pmax, du rapport dP/dt et du volume d'éjection cardiaque (500, 501).
La voie de signalisation que l'apeline stimule chez le rat hypertendu afin d'augmenter la
contraction cardiaque semble être identique à celle observée chez le rat sain. En effet, il
a été montré ex vivo que l'apeline augmentait la contraction cardiaque en incrémentant
de 36% l'afflux intracellulaire de Ca2+ intracellulaire sur des cœurs issus de rats rendus
insuffisants cardiaques par une exposition de 16 semaines à l'hypoxie (chambre à
hypoxie) (502). Chez la souris db/db, qui présente une augmentation de la réponse à
l'angiotensine et une diminution à celle de l'acéthylcholine, l'apeline utilisée ex vivo sur
des anneaux d'aorte conserve ses propriétés vasodilatatrices alors que l'expression
d'APJ est diminuée au niveau de ces vaisseaux. De plus, l'étude mécanistique montre
que malgré la diminution de l'expression d'APJ dans ce tissu, l'apeline parvient tout de
même à phosphoryler Akt (Ser473) et eNOS (Ser1177) (494, 503).
- 135 -
De plus, chez des rats insuffisants cardiaques, une injection d'apeline diminue la
concentration de malondialdehyde (MDA) produite au niveau du cœur. Le MDA est un
produit délétère issu de la péroxydation lipidique qui pourrait intervenir dans la genèse
de la pathologie cardiaque (493).
Enfin, d'autres études ont permis de montrer des corrélations entre une
amélioration de la fonction cardiovasculaire et une augmentation indirecte (qui n'est pas
provoquée par une injection d'apeline) de l'apelinémie. C'est le cas pour le traitement de
rats spontanément hypertendus (SHR) avec une injection quotidienne d'acide rétinoïque
(10 mg/kg/jour) qui augmente l'expression du système apeline/APJ au niveau du cœur
et de l'aorte et améliore la pression artérielle moyenne (504). L'exercice physique est
également un stimulateur de l'expression de l'apeline et de son récepteur au niveau de
la sphère cardiovasculaire (505). Enfin, l'utilisation d'un inhibiteur de ACE1 (Angiotensin
converting enzyme 1) qui est impliquée dans la régulation des taux d'angiotensine II
entraîne une augmentation des taux d'apeline plasmatique et améliore la fonction
cardiaque (492). Ce résultat montre qu'il existe une étroite relation entre l'angiotensine II
et l'apeline. Récemment, une étude intéressante menée par Chun et ses collaborateurs
a montré que l'apeline s'opposait aux effets proathérogènes de l'angiotensine II dans un
modèle de souris invalidées pour le gène ApoE (impliqué dans le transport du
cholestérol) (506). Au cours de ces travaux, les auteurs observent que la co-infusion
d'apeline et d'angiotensine II diminue les lésions atherosclérotiques (formation
d'aneurysmes aortiques, épaississement néointimal....). Comme pour la vasodilatation,
ce mécanisme antiathérogène semble être médié par le NO puisque le prétraitement
des souris avec un inhibiteur de NOS abolit totalement les effets de l'apeline.
5) Apport des modèles de souris transgéniques
Finalement, l‟importance du système apeline/APJ dans la physiologie
cardiovasculaire a été étudiée au travers de modèles murins présentant une invalidation
du gène codant soit pour l‟apeline soit pour APJ. La première étude concernant les
souris invalidées pour APJ, montre que l‟effet hypotenseur de l‟apeline est supprimé
chez ces souris ainsi que la phosphorylation de la eNOS. Par contre, la PAM n‟est pas
différente des souris témoins mais les souris invalidées pour APJ ont une réponse à
- 136 -
l‟angiotensine II qui est augmentée (481). Les souris APJ-/- n‟ont pas de complications
cardiovasculaires ce qui sous-entend que le système apeline/APJ à lui seul ne joue pas
un rôle majoritaire dans ces phénomènes.
Comme nous l‟avons évoqué, les souris invalidées pour le gène de l‟apeline n‟ont
pas de phénotype marqué jusqu‟à l‟âge adulte puisque les souris ont une morphologie
et une fréquence cardiaque qui ne sont pas modifiées. De plus, elles ont un poids
corporel, une prise alimentaire et une prise hydrique comparable aux souris sauvages.
Par contre, avec l‟âge, ces souris développent progressivement une diminution de la
contractilité cardiaque et une augmentation du diamètre du ventricule gauche en fin de
systole toutes deux compensées par un traitement par voie veineuse d'apeline 13 (507).
Cette étude montre également que l‟apeline joue un rôle important après une surcharge
en pression puisque les souris invalidées pour l‟apeline développent une insuffisance
cardiaque sévère.
En conclusion, l'ensemble de ces résultats concernant le système apeline/APJ et
la sphère cardiovasculaire montre que l'apeline pourrait être un des acteurs les plus
influents sur la régulation cardiaque ou vasculaire. Les résultats obtenus chez l'homme
par Japp et ses collaborateurs sont encourageant et montrent que l'apeline exogène
produit, comme chez la souris, une vasodilatation. En effet, il apparaît nécessaire de
déterminer comment varient les concentrations d'apeline cardiaque et plasmatique au
cours de l'installation de différentes pathologies cardiovasculaires afin de savoir quelles
pathologies réellement cibler au cours d'un traitement à l'apeline.
V. Apeline et Système Nerveux Central
1)Distribution de l'apeline et de son récepteur dans le cerveau
Les techniques d'hybridation in situ ont permis d'observer que l'ARNm du récepteur APJ
était présent dans le cortex cérébral, l'hippocampe, les structures olfactives,
l'hypothalamus et l'hypophyse. Une expression très forte est détectée dans les noyaux
hypothalamiques comme le noyau paraventriculaire (NPV), le noyau supraotique (NSO)
- 137 -
et le noyau arqué ainsi que dans la glande pinéale et les lobes antérieur et
intermédiaires de l'hypophyse (437, 442, 443, 456, 508).
L'équipe dirigée par C. Llorens-Cortès a pu visualiser la présence de neurones
apelinergiques dans le système nerveux central du rat. Ceci a été possible grâce au
développement d'un anticorps polyclonal de haute affinité et séléctif pour la forme de 17
acides aminés de l'apeline (508, 509). Comme pour APJ, la présence de l'apeline est
très marquée dans les structures de l'hypothalamus et du bulbe rachidien impliquées
dans le contrôle de la prise hydrique et alimentaire comme le PVN, le NSO, le noyau
arqué, le noyau réticulé latéral et le noyau ambigu (510). Une immunoréactivité
importante des fibres et des terminaisons nerveuses est également observée dans la
couche interne de l'éminence médiane et dans l'hypophyse postérieure. Cette
observation suggère que les neurones apelinergiques du NPV et du NSO se projettent,
comme les neurones magnocellulaires vasopressinergiques et ocytocinergiques, dans
l'hypophyse postérieure. Cette hypothèse est confirmée par un double marquage
immunofluorescent montrant une colocalisation de l'apeline, de la vassopressine et de
l'ocytocine au niveau des neurones magnocellulaires hypothalamiques (463, 508, 511).
D'autres fibres apelinergiques ont également été visualisées au niveau de la lame
terminale et située le long du troisième ventricule. Cette région est elle aussi impliquée
elle aussi dans la régulation de la prise hydrique (512, 513).
Une telle localisation a mené différentes équipes à supposer un rôle du complexe
apeline/APJ dans la régulation de fonctions régulées par l'axe hypothalamo-
hypophysaire comme la prise hydrique, la prise alimentaire ou l'activité locomotrice.
2) L'apeline et la régulation de l'équilibre hydrique
Chez l'homme, plus de 60% du poids corporel est constitué par de l'eau stockée dans
les compartiments intra et extracellulaires. La perte d'eau entraîne l'activation de
signaux sensoriels (endocrines et neuronaux) qui vont renseigner le cerveau sur le
statut hydrominéral de l'organisme et ainsi permettre une réponse adaptée au maintient
de l'homéostasie hydrique (513).
Des études expérimentales ont mis en évidence que certaines structures du
cerveau étaient impliquées dans la régulation de la balance hydrique (noyau du tractus
- 138 -
solitaire, la medula ventrolatérale rostrale et caudale, le noyau parbrachial, la partie
anteroventrale du 3ème ventricule, l'hypothalamus, etc...). L'ensemble de ses structures
nerveuses va converger essentiellement vers deux centres hypothalamiques que sont le
noyau paraventriculaire (NPV) et le noyau supra-optique (NSO), essentiels, comme
nous l'avons déjà évoqué plus haut, dans le contrôle et la régulation de la balance
hydrominérale. Ainsi, lors d'une diminution de la volémie ou d'une perturbation de
l'osmolarité, l'information est transmise à l'hypothalamus qui va augmenter la production
de vasopressine ou medier la sensation de soif. La vasopressine ou hormone
antidiurétique (AVP pour arginine-vasopressine ou ADH pour antidiuretic hormone) est
une hormone synthétisée par le NPV et le NSO de l'hypothalamus et libérée par
l'hypophyse postérieure. Cette hormone va agir au niveau rénal où elle se lie sur ses
récepteurs V2 situés sur les cellules du tube collecteur. La liaison de l'AVP sur ses
récepteurs va induire une augmentation de la concentration intracellulaire d'AMPc qui va
entraîner une translocation d'aquaporine (canaux hydriques) initialement présents dans
des vésicules cytoplasmiques. Ceci aura pour conséquence une réabsorption de l'eau
vers l'interstitium rénal.
Compte tenu des résultats évoqués plus haut concernant la localisation de l'apeline et
d'APJ au niveau de l'axe hypothalamo-hypophysaire, plusieurs équipes se sont
intéressées au rôle que pouvait jouer le complexe apeline/APJ sur l'équilibre hydrique.
Des études de double marquage associant des techniques d'immunohistochimie et
d'hybridation in situ ont été menées et ont démontré que les récepteurs de la
vassopressine (V1a et V1b) étaient présents au niveau des cellules qui expriment aussi
APJ (509). La colocalisation vassopressine/apeline au niveau des neurones
magnocellulaires et l'association des deux récepteurs au niveau des mêmes cellules a
conduit l'équipe de C. Llorens-Cortès a étudier le rôle de l'apeline sur la libération de
vasopressine (509). Pour cela, les auteurs ont procédé à des injections icv d'apeline 13
pyroglutaminée à différentes doses (100 ng, 300 ng et 1 g) et ont pu observer que
seule l'injection d'1 g d'apeline provoquait une diminution (47%) des taux plasmatiques
de vasopressine chez la souris privée d'eau pendant 24 heures. De la même manière,
alors que la privation d'eau pendant 48 heures induit une augmentation dramatique des
- 139 -
concentrations d'AVP plasmatiques chez la souris (x4), l'injection icv d'apeline 17 (1 g)
permet de limiter cette augmentation.
Pour tenter de mieux appréhender les mécanismes permettant à l'apeline de
réguler la sécrétion d'AVP, De Mota et ses collaborateurs ont utilisé le modèle de la
ratte en lactation dans lequel on retrouve une hyperactivité de neurones
magnocellulaires vasopressinergiques destinée à conserver au mieux l'équilibre
hydrique de l'organisme afin d'obtenir une production optimale de lait. Chez ces
animaux, l'injection icv d'apeline 17 diminue l'activité électrique phasique des neurones
vasopressinergiques une heure après l'administration de 2 pmol du peptide (508). Cette
diminution s'accompagne d'une réduction de la sécrétion de vasopressine dans la
circulation sanguine qui a pour conséquence une diurèse aqueuse plus importante
(508). Plus récemment, Tobin et ses collaborateurs ont pu montrer que l'apeline 13
provoquait une augmentation des taux intracellulaires de Ca++ de neurones
vasopressinergiques et ocytocinergiques (514). Ces travaux ont également montré que
l'apeline 13 était responsable d'une augmentation de l'activité électrique des corps
neuronaux. Il semblerait que l'apeline entraîne une régulation différentielle entre les
corps cellulaires et les extrémités somato-dendritiques. En effet, la plupart des
mécanismes de sécrétions observés au niveau neuronal montrent qu'une augmentation
de l'activité électrique est synonyme d'une sécrétion plus importante. Cependant, dans
quelques situations, un phénomène de régulation différentielle peut donner lieu à une
augmentation de l'activité électrique dans le soma et à une diminution de l'activité
sécrétoire au niveau dendritique (515)comme observé par Tobin pour l'apeline.
On peut ainsi conclure de ces résultats que l'apeline pourrait être libérée au
niveau somatodendritique et exercer un effet inhibiteur direct sur l'activité phasique des
neurones vasopressinergiques et la libération systémique d'AVP.
Un autre argument en faveur d'une étroite interaction entre apeline et l'AVP dans
le contrôle de la balance hydrominérale est apporté par des expériences de privation
hydrique associée à des marquages immunohistochimiques d'AVP et de l'apeline (511).
Les résultats obtenus au cours de ces travaux confirment une présence de l'AVP et de
l'apeline au sein des mêmes cellules (certaines cellules sont AVP+ et apeline+ mais
toutes les apeline+ sont AVP+) mais montrent également qu'à l'intérieur de la cellule,
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ces deux peptides ne sont pas colocalisés. En effet, l'apeline est localisée en clusters
autour du noyau alors que l'AVP est distribuée dans tout le cytoplasme. De plus, cette
étude nous apprend aussi que lorsque les animaux sont privés d'eau pendant 48h, une
nette augmentation du marquage de l'apeline (de 9 à 55 fois selon les territoires étudiés)
se produit au niveau du NSO. Selon les auteurs, cette augmentation, concomitante avec
une diminution des taux plasmatiques d'apeline est la résultante d'une diminution de la
sécrétion d'apeline par les neurones apelinergiques. Ainsi, le stress hydrique provoqué
au cours de ces expériences est responsable de la diminution de la sécrétion d'apeline
par les neurones magnocellulaires. Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués
dans cette régulation, les auteurs ont traité ces animaux avec un antagoniste des
récepteurs à l'AVP. Les résultats émanant des ces travaux montrent que ce traitement
diminue partiellement (50% environ) l'immunoréactivite de l'apeline dans le NPV. De
même, l'injection icv d'AVP augmente le marquage dirigé contre l'apeline dans ces
territoires (511). Enfin, dans une autre étude, la même équipe a pu constater une
augmentation de la diurèse en accord avec les modifications des taux plasmatiques
d'AVP observées lorsque l'apeline est administrée aux animaux (508).
Chez l'homme, des travaux consistant à augmenter l'osmolarité plasmatique et à
observer les variations de concentrations plasmatiques d'apeline et d'AVP ont mis en
avant qu'il existait une corrélation négative entre l'osmolarité plasmatique et l'apelinémie
alors que les taux d'AVP plasmatiques augmentaient (516).
L'ensemble de ces travaux met en évidence que lors d'un stress hydrique, la
privation d'eau entraîne une augmentation de la sécrétion d'AVP qui, par effet autocrine
ou paracrine, va provoquer une inhibition de la sécrétion d'apeline. L'apeline, par son
effet antagoniste à celui de l'AVP, semble être un nouveau peptide diurétique impliqué
dans la balance hydrominérale.
Chez l'homme, les résultats obtenus confirment ceux obtenus chez l'animal et
permettent d'envisager l'apeline comme cible pharmacologique dans le traitement de
patients présentant des troubles hydriques. En outre le ratio AVP/apeline semble être un
bon marqueur de l'état hydrominéral chez l'homme et pourrait être utilisé en
investigation clinique.
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En 2001, Reaux et ses collaborateurs montrent, chez le rat privé d'eau pendant
24 heures, qu'une injection icv d'apeline 13 pyroglutaminée entraîne une nette
diminution de la prise hydrique (de 7.6 à 4.9 ml) (509). Cet effet est comparable aux
effets déjà observés pour des molécules impliquées dans le contrôle de la prise
hydrique comme les peptides natriurétiques (517). Pour appuyer ce résultat, des études
imunohistochimiques ont permis de caractériser des fibres et des terminaisons
apelinergiques au niveau des centres de la soif (Organe Vasculaire de la Lame
Terminale (OVLT) et Organe Subfornical (SFO)) (510). Cependant, d'autres études n'ont
pas retrouvé les mêmes résultats. En effet, les équipes dirigées par O'Dowd et par
Bloom (456, 518)) montrent que l'apeline provoque une augmentation de la prise
hydrique dépendante de la dose. D'autres travaux ne retrouvent aucun effet de l'apeline
lorsqu'elle est administrée au niveau central (Mitra et al., 2006). Les auteurs expliquent
ces désaccords par des différences dans le choix des animaux, dans leur statut
hydrique ou encore dans la précision de la zone du cerveau où l'injection d'apeline est
pratiquée.
Les résultats concernant la régulation de la sécrétion de vasopressine par
l'apeline sont reproduits par plusieurs équipes et vont dans le sens d'une diminution de
la prise hydrique et d'une augmentation de la diurèse. Cependant, il semble nécessaire
d'explorer l'effet de l'apeline sur la prise hydrique de plusieurs espèces animales
différentes ainsi que d'observer l'action du peptide en fonction de l'état d'hydratation de
l'animal.
- 142 -
Fig. 20 Régulation de l’équilibre hydrique par l’apeline 17. (D’après Llorens-Cortes et al.,
2005). L‟apeline et l‟AVP sont colocalisées au niveau de nombreux neurones. 1) L‟injection icv d‟apeline
va inhiber l‟activité éléctrique phasique des neurones AVP qui aura pour conséquence 2) une inhibition de
la sécrétion systémique d‟AVP. Cette diminution d‟AVP plasmatqiue va entraîner une augmentation de la
diurèse aqueuse.
3) Apeline et prise alimentaire
De part sa localisation au niveau de zones du cerveau décrites comme pouvant
contrôler la prise alimentaire (NSO et PVN), le rôle du complexe apeline/APJ a aussi été
exploré dans la prise alimentaire. Comme pour la prise hydrique, les travaux concernant
l'apeline et la prise alimentaire sont assez controversés. Ainsi, en 2002, Taheri et ses
collaborateur montrent que l'injection icv d'apeline 13 augmente la prise alimentaire
chez l'animal à jeun (518). Cet effet est dépendant de la dose d'apeline et se produit
entre 2 et 4 heures après l'administration du peptide. Plus récemment, une étude
comportementale sur l'effet d'une administration icv chronique d'apeline (1 g/jour pdt 10
- 143 -
jours) a montré qu'au bout de 4 jours de traitement, les animaux présentaient une
augmentation de 15% de leur prise alimentaire (519). Contrairement à ces études, trois
équipes différentes ont observé qu'une injection icv d'apeline provoquait une diminution
de la prise alimentaire (451, 520, 521). En effet, lors de l'administration icv d'apeline 13
chez le rat, une réduction d'environ 10% a pu être observée entre 2 et 4 heures après
l'administration du peptide (520). Sunter et ses collaborateurs ont pu montrer une
diminution plus importante de la prise alimentaire chez des rats nourris ou à jeun et cela
8 ou 24 heures après l'injection respectivement (464). Enfin, plus récemment, une étude
a démontré que l'apeline 13 diminuait la prise alimentaire des rats nourris en régime
normal mais n'avait plus d'influence chez des animaux mis en régime gras (451).
Pour expliquer l'absence d'effet sur la prise alimentaire de la leptine chez les
souris en régime gras, Munzberg émet deux hypothèses: i) soit il existe un défaut de
transport de la leptine à travers la barrière hématoencéphalique qui se produit chez
l'animal obèse ii) soit il existe un défaut de signalisation dans la cascade induite par la
leptine (522). Comme l'apeline est administrée par voie icv, la première hypothèse peut
être éliminée au profit d'une anomalie dans la cascade de transduction de l'apeline.
Dans ce sens, Clarke et ses collaborateurs ont d'ailleurs observé une diminution de
l'expression d'APJ au niveau central chez les rats en régime gras traités par de l'apeline
(451).
L'ensemble de ces travaux montre que l'apeline est bien impliquée dans la
régulation de la prise alimentaire comme pouvait le laisser supposer sa localisation dans
le PVN et le NSO. Cependant, trop de discordances existent à ce jour pour conclure sur
un effet positif ou négatif de l'apeline sur la prise alimentaire. D'autres expériences sont
nécessaires afin de préciser le rôle de l'apeline dans cette régulation et ainsi classer
l'apeline dans la liste des peptides oréxigènes ou anorexigènes.
VI. Apeline et Angiogènèse
Le rôle de l'apeline dans les phénomènes d'angiogénèse a été étudié sur trois
espèces différentes: le poisson zèbre, le xénope et la souris. Chez ces trois espèces,
nous allons voir que la localisation du complexe apeline/APJ a permis d'envisager un
- 144 -
rôle de l'apeline dans le développement vasculaire et cardiaque et que les propriétés
angiogéniques de l'apeline peuvent aussi être considérées comme une cible
thérapeutique lors de traitement anti-tumoraux.
1) Implication du système apeline/APJ dans l'angiogénèse
a) Le xénope
L'implication du complexe apeline/APJ dans les phénomènes d'angiogénèse est
suggérée dès 1999 par Devic et ses collaborateurs grâce à des expériences effectuées
chez le xénope (439). En effet, dans cette étude, les auteurs mettent en évidence par
hybridation in situ qu'APJ est fortement exprimé au niveau des cellules endothéliales
composant le cœur et les vaisseaux en formation chez l'embryon de xénope. Ces
travaux montrent également que l'expression d'APJ est détectée au cours des dernières
phases de la blastula et augmente significativement au cours de la gastrulation. Durant
le stade larvaire, le messager d'APJ est retrouvé au niveau du tube procardiaque et des
vaisseaux en formation où il est présent à la surface des cellules endothéliales (439).
Quelques années plus tard, les mêmes résultats sont retrouvés par une équipe
Japonaise qui montre aussi que la préproapeline est exprimée au niveau des mêmes
sites que le récepteur APJ (523). Cette co-expression est surtout observée au niveau
des veines cardinales postérieures, dans les veines rétiniennes et dans les vaisseaux
intersomitiques. Cette même étude va également mettre en avant le rôle angiogénique
de l'apeline. En effet, des techniques de surexpression ou d'invalidation de l'apeline et
de son récepteur montrent que ce complexe intervient dans la formation de nouveaux
vaisseaux (524). La surexpression d'apeline au stade 8 cellules influence la distribution
des précurseurs endothéliaux et hématopoïétiques ainsi que celle des cardiomyocytes
(523). Ceci signifie que chez le xénope, l'apeline pourrait être impliquée dans
phénomènes de migration cellulaire. L'invalidation de la traduction de l'apeline et de son
récepteur par des morpholinos (molécules spécifiques qui agissent sur l'épissage de la
protéine et empêchent ainsi sa synthèse) conduit à une diminution importante de la
différenciation des cellules endothéliales, cardiaques et hématopoïétiques à l'origine
d'une vasculogénèse imparfaite. De la même manière, Kallin et ses collaborateurs
révèle qu'une invalidation d'APJ entraîne une inhibition de la formation des vaisseaux
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intersomitiques alors que la co-injection d'ARNm d'APJ dans ces cellules restaure le
développement de ces vaisseaux (525). En conclusion, ces résultats montrent que
l'apeline agit principalement sur l'angiogénèse précoce et qu'elle peut intervenir sur la
vasculogénèse du xénope.
b) Le poisson zèbre
Chez le poisson zèbre, APJ est retrouvé au cours de différentes phases de la vie fœtale.
Des expériences d'hybridation in situ ont permis à Tucker et à ses collaborateurs de
mettre en évidence qu'APJ était exprimé en quantité importante au niveau de structures
à l'origine des futurs vaisseaux avant les premières phases de la gastrulation (526, 527).
Comme pour le xénope, les cellules endothéliales composant des vaisseaux tels que
l'aorte dorsale, les veines cardinales et les vaisseaux intersomitiques présentent
précocement une forte expression d'APJ. Contrairement à ce que nous avions pu
observer dans la précédente espèce, l'apeline et son récepteur ne sont pas co-exprimés
au cours des première heures de vie chez le poisson zèbre. En effet, dans les premiers
stades qui suivent la fusion, l'apeline se trouve dans des territoires médians puis son
expression va évoluer vers les territoires cardiaques pour finalement se retrouver dans
les mêmes régions que son récepteur (526).
Dans une autre étude, Scott a observé que le récepteur à l'apeline était surtout
présent au niveau des précurseurs myocardiques et que son invalidation génétique
observée au cours de la mutation germinale grinch n'entraînait pas de modification du
réseau vasculaire mais plutôt une diminution du nombre de cardiomyocytes (528). En
effet, l'observation du poisson zèbre mutant grinch, révèle une inhibition du
développement du myocarde associée à une baisse du nombre de cellules progénitrices
myocardiques mais aucun défaut n'est constaté au cours du développement des
vaisseaux. L'explication d'un tel phénotype chez le mutant grinch résiderait dans le fait
que, chez le poisson zèbre, il existe deux types de récepteurs APJ: AGTLR1a et
AGTLR1b (Angiotensin like receptor). Une compensation se produirait entre les deux
types et la mutation de la forme AGTRL1b serait compensée par la forme AGTRL1a au
niveau des vaisseaux mais pas au niveau du cœur. Pour confirmer cette hypothèse de
redondance des récepteurs, les auteurs ont bloqué la traduction de l'ARNm de
AGTLR1a en protéine (morpholino) lors du stade unicellulaire chez le poisson zèbre
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grinch. Cette double inhibition des isoformes du récepteur à l'apeline induit une absence
totale de formation de cœur (528). Il semble alors que chez le poisson zèbre, l'apeline et
son récepteur jouent un rôle subtil au début de la formation du cœur primitif en
contrôlant la migration des précurseurs myocardiques. Scott et ses collaborateurs ont
essayé de restaurer les anomalies cardiaques du poisson zèbre grinch en injectant des
doses importantes d'apeline au stade unicellulaire ou chez l'embryon.
La plupart des molécules impliquées dans le modelage cardiaque agissent
généralement sur la prolifération et l'apoptose des précurseurs cardiaques. Avec
l'apeline, nous sommes en présence d'un facteur original qui agit également sur la
migration de ces cellules. Ces résultats sont très intéressants bien qu'il soit nécessaire
de démontrer l'existence de ce phénomène chez d'autres espèces que celle du poisson
zèbre.
c) La souris
Chez ce modèle animal, l'expression de l'apeline et de son récepteur a été étudiée chez
l'embryon et sur la vasculogénèse de la rétine. Ainsi, plusieurs études ont pu montrer
que l'expression de l'apeline et d'APJ était détectée dans tous les territoires vasculaires
de l'embryon de souris comme les vaisseaux entourant l'œil, les bourgeons de pattes
ainsi qu'au niveau des vaisseaux intersomitiques (525). Cette expression augmente
durant les 15 premiers jours de vie puis diminue fortement (90%) au cours de la vie
adulte (529).
Les techniques d'hybridation in situ révèlent la présence précoce (dès le troisième jour
après la naissance) et centrifuge d'APJ et de la préproapeline au niveau du réseau
veineux rétinien (colocalisation avec EphB4, marqueur spécifique du réseau veineux)
qui est connu pour connaître une forte activité angiogénique après la naissance (530,
531).
Au cours du développement embryonnaire de la souris, APJ est retrouvé sur les cellules
endothéliales formant l'axe aorte-gonade-mesonephros au niveau duquel les
phénomènes d'angiogénèse sont très présents (532). Lorsque les cellules endothéliales
issues de cet axe sont cultivées en présence d'apeline, on remarque une augmentation
de leur prolifération d'un facteur 3 (532).
Enfin, ces études ont également montré que les animaux dont le gène codant pour
l'apeline a été invalidé possèdent un diamètre des vaisseaux intersomitiques plus petit
- 147 -
que les souris contrôle pendant l'embryogenèse mais aucune différence de diamètre
n'est observée à l'age adulte (532). De plus, chez ces animaux, la vascularisation de la
rétine est retardée dans le temps et on observe une réponse angiogénique au VEGF et
au FGF (deux facteurs pro-angiogéniques) plus faible au niveau des vaisseaux
rétiniens. Un traitement à l'apeline de ces souris restaure la réponse aux facteurs
angiogéniques suggérant que l'apeline et ces molécules proangiogéniques agissent en
synergie.
Compte tenu de l'ensemble de ces résultats plusieurs équipe ont suggéré que
l'apeline puisse agir de façon paracrine sur les cellules de la sphère cardiovasculaire et
ainsi induire leur prolifération, leur cohésion et leur migration afin de former de nouveaux
vaisseaux.
2) Rôle de l'apeline sur le développement vasculaire
En 2004, des travaux effectués in vitro sur une lignée de cellules rétiniennes (RF/6A)
montrent que l'apeline-13 augmente la prolifération et la migration de ces cellules (Kasai
et al., 2004). Ce résultat est retrouvé par d'autres équipes travaillant sur des cellules
endothéliales embryonnaires humaines (HUVEC) (472) ainsi que sur des membranes
chorioallantoïdes de poulets et sur une lignée de cellules endothéliales issues de la
microvasculature du cerveau de souris (bEnd.3) (472, 524). De plus, des expériences
pratiquées en Matrigel® démontrent que l'apeline possède des propriétés angiogéniques
comparables à celles du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). En effet, les
formes de 13 et de 36 acides aminés d'apeline entraînent la formation de tubes
vasculaires par les cellules de la lignée RF/6A dès 24 heures de traitement (529).
L'apeline est aussi capable d'augmenter le diamètre des tubes néoformés à partir de
cellules HUVEC (532). Cependant, d'autres travaux montrent que l'apeline semble
orienter les cellules endothéliales issues d'embryon de souris vers des structures en
feuillet plutôt qu'en tube. Les mécanismes impliqués dans ces phénomènes sont
dépendants de protéines d'adhésion: la claudine 5 et à une moindre mesure la VE-
cadhérine (532).
Comme nous l'avons déjà évoqué plus haut, l'étude de l'interaction apeline/APJ a
permis de montrer la stimulation de la voie des ERKs (extracellular regulated kinase).
Cette voie de signalisation est impliquée dans la prolifération cellulaire, mécanisme
- 148 -
indispensable lors de l'angiogénèse. En s'appuyant sur ces informations, Masri et ses
collaborateurs ont mis en évidence que l'apeline 13 activait la protéine p70S6 kinase sur
des cellules HUVEC et que cette activation était responsable d'une phosphorylation des
ERK et d'une augmentation de la prolifération des cellules matérialisée par une
augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée dans ces cellules (472). D'autres
expériences concernant la prolifération de cellules endothéliales ont par la suite posé la
question d'une participation du VEGF à l'effet angiogénique de l'apeline. Ainsi, Cox
affirmait en 2006 que l'effet de l'apeline était indépendant du VEGF ou du FGF. Pour
arriver à ces conclusions, il a montré que l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de la voie
de signalisation du VEGF ou du FGF ne modifiait pas l'incorporation de BrdU dans les
cellules endothéliales issues du réseau microvasculaire du cerveau de souris (524).
D'un autre côté, l'étude de Kasai a montré, grâce à l'apport des modèles transgéniques,
que l'apeline et les facteurs pro-angiogéniques tels que le VEGF et le FGF semblaient
agir en synergie. En effet, ces travaux indiquent que l'apeline seule n'a aucun effet sur
l'angiogénèse des vaisseaux de la rétine de souris invalidées pour l'apeline alors que
l'action angiogénique du VEGF ou du FGF est améliorée chez ces souris lors d'un
traitement à l'apeline (529). Au niveau moléculaire, les facteurs proangiogéniques
comme le VEGF et le FGF participent à l'angiogénèse via des voies de signalisation
telles que les MAPK et la PI3K. La liaison de l'apeline sur son récepteur active ces voies
de signalisation et pourrait participer à améliorer l'angiogénèse initiée par le VEGF ou le
FGF. Enfin, l'apeline est aussi capable de moduler la synthèse de monoxyde d'azote
(NO) via son action sur la eNOS. Il a pu être montré que des variations de concentration
du NO peuvent activer ou inhiber les phénomènes d'angiogénèse. Ainsi, Jones et ses
collaborateurs ont mis en évidence que de faibles concentrations de NO entraînaient
une stimulation de l'angiogénèse alors qu'à forte concentration elle l'inhibaient (533).
3) Régulation du complexe apeline/APJ au cours de l'angiogénèse
Les mécanismes moléculaires permettant de contrôler le système apeline/APJ au cours
de l'angiogénèse ont été très peu étudiés. On sait cependant que la quantité d'oxygène
perçue par les cellules entraîne le développement de neovaisseaux. Ainsi, lorsque
l'apport d'oxygène est trop faible (phénomène d'hypoxie), certaines molécules seront
sécrétées par les cellules afin de favoriser l'angiogénèse.
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Récemment, plusieurs travaux ont mis en évidence que l'hypoxie était un
phénomène capable d'activer la synthèse d'apeline au niveau des adipocytes blancs en
culture (534), des cardiomyocytes (535) et des entérocytes (536).
Ces différents travaux soulignent que c'est par l'intermédiaire du facteur induit par
l'hypoxie (HIF), qui est un facteur de transcription hétérotrimérique sensible à l'oxygène,
que la synthèse d'apeline est augmentée dans ces trois types de cellules. A partir de
ces résultats, Eyries et ses collaborateurs ont envisagé un rôle de l'hypoxie et de HIF
dans l'augmentation de l'expression de l'apeline constatée au cours de l'angiogénèse.
Afin de vérifier cette hypothèse, les auteurs ont tout d'abord confirmé l'augmentation du
messager de l'apeline en réponse à l'hypoxie dans des cellules endothéliales humaines
en culture. Puis, ils ont montré l'importance de l'apeline dans les phénomènes
d'angiogénèse induits par l'hypoxie en constatant que l'invalidation de l'apeline ou de
son récepteur entraînait une inhibition de la prolifération des cellules endothéliales in
vitro mais aussi in vivo chez le xénope. Pour aller plus loin, ils ont ensuite procédé à des
expériences de transfection transitoire et d'immunoprécipitation de chromatine qui leur
ont permis de montrer la présence d'une zone de liaison de HIF sur le premier intron du
gène codant pour l'apeline dans des cellules endothéliales humaines en culture. Enfin,
l'invalidation de HIF par des techniques de si-RNA (small interferring RNA) entraîne une
perte de l'activation de la synthèse d'apeline en réponse à l'hypoxie (537) ce qui
confirme le rôle majeur de l'hypoxie dans la régulation de la synthèse d'apeline au cours
de l'angiogénèse.
Au cours de l'angiogénèse, les vaisseaux sanguins doivent être capables
d'adapter leur diamètre en fonction des besoins en oxygène et en nutriments de l'organe
ou des tissus irrigués. Cet ajustement du diamètre des vaisseaux est une étape
primordiale de l'angiogénèse qui semble être contrôlée, au moins en partie, par
l'angiopoïetine (Ang1) et son récepteur Tie2 (538, 539). Comme nous l'avons évoqué
plus haut, les modèles génétiques nous ont montré l'implication du système apeline/APJ
dans le contrôle du diamètre des vaisseaux. A partir de ces deux types de régulation,
Kidoya et ses collaborateurs ont tenté de savoir si le système Ang1/Tie 2 pouvait avoir
une influence sur le complexe apeline/APJ. Sur les cellules HUVEC, le traitement à
l'Ang1 augmente de façon dépendante du temps l'expression de l'ARNm et de la
protéine de l'apeline ainsi que sa sécrétion dans le milieu (532). Chez la souris
surexprimant l'Ang1 au niveau des kératinocytes, l'expression d'apeline dans les cellules
- 150 -
endothéliales dermique est significativement augmentée par rapport aux souris
contrôles (532).
4) L'apeline et l'angiogénèse tumorale
La tumorigénèse est un phénomène physiopathologique au cours duquel l'angiogénèse
est très importante. Deux équipes se sont intéressées au rôle joué par l'apeline au cours
de ces processus et ont pu montrer l'implication du peptide dans la croissance tumorale.
Ainsi, Kallin et ses collaborateurs ont mis en évidence que l'apeline et son récepteur,
indétectables au niveau des vaisseaux de cerveaux humains sains, possédaient une
expression nettement augmentée lors de l'étude de vaisseaux de cerveaux de patients
atteints de glioblastomes (tumeur du cerveau) (525). Au cours de la même année, Sorli
a également montré l'implication de l'apeline dans la tumorigénèse en greffant chez la
souris des cellules de tumeurs mammaires surexprimant le peptide (540). Cet effet n'est
pas lié à une augmentation de la prolifération des cellules surexprimant l'apeline
puisque ces cellules sont dépourvues du récepteur APJ et qu'elles ne prolifèrent pas in
vitro. Par contre, lorsqu'elles sont greffées chez la souris, ces cellules entraînent une
augmentation de la quantité de vaisseaux entourant la tumeur symbolisée par une
présence importante de cellules endothéliales CD31 positives (540).
Au sein du laboratoire, ces résultats concernant la tumorigénèse et l'angiogénèse
nous ont conduit à envisager un rôle de l'apeline dans le développement anormal du
tissu adipeux au cours de l'obésité. Cette hypothèse s'appuie sur le fait que de
nombreux spécialistes de l'obésité comparent le développement du TA à celui d'une
tumeur. Ainsi, chez la souris, O.Kunduzova a montré que la néoangiogénèse observée
autour d'un dépôt adipeux greffé était en partie dépendante de l'expression d'apeline.
Pour montrer cette relation, des injections de si-RNA dirigé contre l'apeline ont été
pratiquées dans les dépôts adipeux avant leur greffe. Cette invalidation a eut pour
conséquence de diminuer de moitié la vascularisation des greffons en comparaison des
dépôts adipeux non traités (541).
Ces résultats placent l'apeline comme une cible potentielle dans la lutte contre le
développement des tumeurs. L'élaboration d'antagonistes du récepteur APJ pourrait par
exemple permettre de maîtriser la croissance tumorale ou le développement du tissu
adipeux au cours de l'obésité en inhibant l'effet proangiogénique de l'apeline.
- 151 -
VII. Apeline et tissu adipeux
Dans les chapitres précédents, nous avons vu que plusieurs équipes avaient
détecté la présence de l'apeline et de son récepteur au niveau du tissu adipeux blanc de
souris. Or le TA est constitué de différents types cellulaires. Au laboratoire, J. Boucher a
pu montrer que l'apeline était exprimée et sécrétée par l'adipocyte blanc humain et
murin (542). Cette découverte a permis de considérer l'apeline comme une nouvelle
adipokine et a permis d'envisager un rôle de ce peptide au sein du métabolisme
énergétique. Au laboratoire, J. Boucher montre que l'apeline s'exprime de façon
identique dans les adipocytes et dans la FSV du TA humain et murin. Ces travaux
mettent également en avant que, dans la lignée adipocytaire 3T3F442A, l'expression de
l'apeline est augmentée parallèlement à la différenciation de ces cellules (542).
Cependant, une étude effectuée sur la lignée 3T3L1 montre une augmentation de
l'expression de l'apeline au cours des premiers jours de différenciation suivie d'une
diminution après 4 jours de différenciation (543). Ces résultats discordants pourraient
s'expliquer par le fait que la différenciation des cellules 3T3L1 nécessite un traitement
par des agents pharmacologiques (dexamethasone) pouvant induire une diminution de
l'expression de l'apeline.
1) Régulation de l'apeline adipocytaire
a) Régulations hormonales
L'insuline - Pour étudier la régulation de l'apeline adipocytaire, la première expérience
réalisée au laboratoire a été de mettre à jeun des animaux. Des expériences de mise à
jeun/réalimentation visant à faire varier physiologiquement l'insulinémie ont été faites au
laboratoire. Ainsi, en situation physiologique on peut observer chez l'animal
normopondéral, une variation de l'expression adipocytaire d'apeline parallèle à celle des
taux circulants d'insuline (542).
In vitro, l'effet direct de l'insuline sur l'expression d'apeline est démontré sur les
cellules 3T3F442A et 3T3L1 différenciées qui présentent un taux d'ARNm de l'apeline 3
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à 4 fois plus important lorsqu'elles sont traitées 3, 6 ou 24 heures par de l'insuline (1 à
1000 nM) (542). Les mêmes résultats ont été retrouvés par d'autres équipes (534, 543,
544). Cette augmentation de l'expression adipocytaire de l'apeline s'accompagne d'une
augmentation d'un facteur 2 de la sécrétion du peptide par les cellules dans le milieu.
Sur ces mêmes cellules, l'utilisation d'inhibiteurs sélectifs a permis de démontrer que le
contrôle de l'expression de l'apeline par l'insuline était dépendant des voies des MAPK,
de la PI3K et de la PKC.
Glucocorticoïdes - Les patients présentant une obésité androïde semblent produire
plus de cortisol que ceux dont seul le TA sous-cutané se développe (545). Ceci peut
s'expliquer par le fait que les cellules de la FSV du TA viscéral peuvent générer du
cortisol à partir de cortisone alors que celles du TA sous-cutané n'en sont pas capables
(546).
Wei et ses collaborateurs ont mis en évidence qu'un traitement de 24 heures à la
dexamethasone diminuait l'expression adipocytaire de l'apeline de façon dépendante de
la dose (543). L'ensemble de ces résultats suggère qu'au cours de l'obésité viscérale,
les glucocorticoïdes, synthétisés par les cellules de la FSV du TA viscéral, puissent agir
de façon paracrine afin de diminuer l'expression adipocytaire de l'apeline. Afin de vérifier
cette hypothèse, il serait intéressant de savoir s'il existe une différence territoriale dans
la synthèse adipocytaire d'apeline entre le TA viscéral et sous-cutané d'individus
présentant une obésité androïde ou périphérique.
L'hormone de croissance (GH) - Un autre mode de régulation de l'expression de
l'apeline adipocytaire a été mis en évidence en 2007 par l'équipe de M. Fasshauer
(544). En effet, les travaux de cette équipe allemande montrent que l'hormone de
croissance (GH) augmente d'un facteur 3 à 4 l'expression et la sécrétion d'apeline par la
lignée adipocytaire 3T3L1. L'utilisation d'inhibiteurs sélectifs démontre que cette
régulation transite par la voie PI3K/Akt et qu'elle est dépendante de la protéine Jak
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b) Autres régulations
Vitamine C - Une étude révèle qu'un traitement quotidien avec de fortes doses de
vitamine C (750 mg/kg de poids corporel) chez le rat rendu obèse par un régime
"cafétéria" entraîne une diminution de l'expression adipocytaire d'apeline à des valeurs
comparable à celle du rat normopondéral (547). Dans ces travaux, les auteurs indiquent
que l'insulinémie ne varie pas au cours du traitement et que la leptine possède le même
type de réponse à la vitamine C que l'apeline. Cependant, l'interprétation de ces
résultats doit rester prudente puisque les animaux traités à la vitamine C présentent
également une diminution de leur poids corporel. Compte tenu des résultats précédents,
cette variation du poids pourrait avoir un lien avec la diminution de l'expression de
l'apeline qui dans cette étude n'est pas due à une diminution de l'insulinémie. Des
travaux complémentaires concernant le lien entre adiposité et expression d'apeline dans
le TA devront être menés.
.
Deux facteurs de transcription ont été décrits comme étant impliqués dans la
régulation de l'expression adipocytaire de l'apeline: il s'agit de HIF (Hypoxia induced
factor) et de PGC1 (PPAR coactivator 1).
L'hypoxie - Comme nous l'avons déjà abordé au cours du chapitre précédent, l'hypoxie
est capable de réguler la production adipocytaire d'apeline (524, 534). Des travaux
réalisés sur la lignée 3T3L1 rapportent que l'hypoxie (1% O2) provoque une
augmentation de augmentation de l'expression de l'apeline de plus de 25 fois associé à
une sécrétion multipliée par 4 dans le milieu (534). Au niveau moléculaire, les auteurs
de cette étude ont suggéré que HIF pouvait participer à cette régulation. L'activation
pharmacologique de la synthèse de HIF et son invalidation génique ont confirmé cette
hypothèse. De façon originale, les auteurs ont aussi démontré que la régulation de
l'expression de l'apeline par l'insuline était dépendante de la présence de HIF (534). Au
laboratoire, les mêmes résultats ont été obtenus sur la lignée adipocytaire 3T3F442A
(541). L'ensemble de ces résultats, conjugués à ceux obtenus par O. Kunduzova
concernant le rôle de l'apeline sur l'angiogénèse du TA (541), suggèrent qu'au cours de
l'obésité, les taux importants d'insuline circulante puissent participer, via l'activation de
- 154 -
HIF et les propriétés proangiogéniques de l'apeline, au développement du TA. Ainsi,
l'apeline possèderait un rôle bénéfique en réponse à l'hypoxie.
PGC-1 - Une collaboration avec l'équipe de D. Langin a permis de démontrer que PGC1
augmentait l'expression (x3) et la sécrétion (x2) de l'apeline dans des adipocytes
humains et murins (548). Le laboratoire de D. Langin travaille sur la recherche de
facteurs adipocytaires régulés par la surexpression de PGC-1, un facteur de
transcription qui interagit avec des récepteurs nucléaires (PPAR ) afin d'activer
l'expression de gènes impliqués essentiellement dans le métabolisme énergétique
mitochondrial. Ce facteur est principalement exprimé dans des muscles squelettiques
oxydatifs et le tissu adipeux brun. Cependant, sa surexpression dans l'adipocyte blanc
montre qu'il est aussi capable de stimuler l'oxydation lipidique dans ces cellules (549).
L'apeline est la seule adipokine qui varie au cours de la surexpression de PGC-1.
Cette régulation a pu être démontrée de façon directe in vitro, via la surexpression de
PGC1 dans les adipocytes; et indirecte, in vivo, grâce à la mise au froid d'animaux
permettant d'augmenter en parallèle l'expression de PGC1 et d'apeline dans les
adipocytes du TA viscéral (548). D'autres investigations concernant la régulation de
l'expression de l'apeline par PGC-1 dans des tissus oxydatifs sont nécessaires. Il serait
également interressant d'étudier l'effet réciproque de l'apeline sur l'expression de PGC-1
et plus largement sur le métabolisme oxydatif
Fig. 21 Régulations de l’apeline
adipocytaire. L‟expression de l‟apeline
adipocytaire est contrôlée positivement
par l‟insuline, le TNF , l‟hormone de
croissace (GH) ou encore le facteur de
transcription PGC1 . De plus, certaines
situations comme l‟obésité ou l‟hypoxie
ont démontré une expression
augmentée de l‟apeline. Inversement la
restriction calorique et les
glucocorticoïdes induisent uen
diminution de l‟expression de l‟apeline.
- 155 -
2) Apeline et troubles métaboliques
L'ensemble des résultats que nous venons de décrire montre une relation forte
entre l'insuline plasmatique et l'apeline adipocytaire. L'obésité s'accompagnant d'une
augmentation de l'insulinémie, l'expression adipocytaire de l'apeline au cours de
l'obésité a été étudiée (542). Ainsi, dans différents modèles de souris obèses, il a pu
être montré que l'expression de l'apeline adipocytaire était augmentée uniquement dans
le s modèles présentant une hyperinsulinémie (542). Chez ces souris, l'augmentation de
l'expression de l'apeline adipocytaire s'accompagne d'une élévation de la concentration
plasmatique d'apeline d'un facteur 2 (0.75 ng/ml vs. 1.50 ng/ml). De plus, chez les souris
dont les cellules du pancréas ont été détruites par un traitement à la streptozotocine,
l'expression adipocytaire d'apeline est trois fois moins importante que chez les animaux
contrôles (542). Enfin, chez les souris db/db, qui possèdent une insulinémie et une
glycémie élevée, une corrélation positive a pu être établie entre les taux plasmatiques
d'insuline et l'expression du messager de l'apeline dans l'adipocyte alors qu'aucune
relation ne semble exister entre la glycémie et l'apeline adipocytaire (542). Une autre
étude révèle que, chez le rat, la mise en régime gras provoque une augmentation de
l'expression de l'apeline au niveau du TA sous-cutané alors qu'elle n'entraîne aucune
modification au sein du TA viscéral (547). Même si les résultats de ces deux études sont
difficilement comparables (expression de l'apeline dans l'adipocyte isolé pour Boucher et
dans le TA entier pour Garcia-Diaz), il semblerait tout de même que l'augmentation de
l'expression de l'apeline au cours de l'obésité soit spécifique de l'espèce et du type de
tissu adipeux. De plus, les travaux de Garcia-Diaz démontrent également que la
quantité d'ARNm codant pour l'apeline est 7 fois plus importante dans le TA viscéral que
dans le TA sous-cutané et que, contrairement à ce que qu'avait montré Boucher chez
l'homme, les cellules de la FSV expriment nettement plus d'apeline que les adipocytes
dans les deux types de TA ( + 88% pour le TAV SC et + 82% pour le TASC) (547).
Chez l'homme obèse une corrélation positive est observée lorsque l'on compare
les taux plasmatiques d'apeline et l'IMC. Cette relation entre l'apelinémie et le tissu
adipeux est encore plus présente chez des patients obèses dont le poids diminue après
une opération chirurgicale ou après un régime hypocalorique (550, 551). En effet, dans
deux études différentes, la perte de poids entraîne un retour des taux plasmatiques
d'apeline comparable au niveau observé chez le patient sain. De plus, lors du régime
- 156 -
hypocalorique, l'expression de l'apeline et de son récepteur adipocytaire suivent le
même profil que l'apelinémie.
Ce dernier résultat associé aux observations faites par Boucher et ses
collaborateurs, suggère que la production adipocytaire d'apeline pourrait largement
participer aux taux plasmatiques du peptide. Ainsi, cette large contribution de l'adipocyte
expliquerait les taux importants d'apeline plasmatique observés chez l'individu et la
souris obèse (542, 550, 551).
Les travaux de Tasci et ses collaborateurs ont mis en évidence, chez l'homme,
que les concentrations d'apeline plasmatiques étaient corrélées négativement avec les
quantités de LDL-cholestérol (Low Density Lipoprotein) circulantes (552, 553). De plus,
au cours de protocoles visant à diminuer les concentrations plasmatiques de LDL-
cholestérol, les concentrations plasmatiques d'apeline augmentent d'un facteur 4 (de 0.2
ng/ml à 0.8 ng/ml). Cette relation inverse entre l'apelinémie et le LDL-cholestérol, mise
en évidence chez des patients dyslipidémiques ne présentant pas d'obésité, n'est pas
dépendante de l'insuline (553). Cependant, une corrélation négative entre l'apelinémie
et l'indice HOMA existe ce qui suggère que l'apeline puisse jouer un rôle dans l'insulino-
sensibilité du métabolisme lipidique.
D'autres travaux ont pu montrer que l'apeline plasmatique augmentait
progressivement au cours de l'installation du diabète de type II (418). Ainsi, l'apelinémie
de patients intolérants au glucose est de 459+/-32 pg/ml (contre 389+/-17 pg/ml pour les
individus sains) et elle atteint 498+/-35 pg/ml chez les patients diabétiques. Toutefois,
des résultats différents ont été obtenus dernièrement puisqu'une autre étude a pu
montrer que des patients récemment diagnostiqués pour un diabète de type II et non
traités présentaient des taux plasmatiques d'apeline diminués (750 vs 440 pg/ml) (554).
Cette différence de résultat semble résider dans le fait que les patients de l'étude de Li
ont été diagnostiqués pour un diabète de type II plusieurs années avant l'étude et qu'ils
sont sous traitement antidiabétique alors que les patients de l'étude menée par Erdem
ont été récemment diagnostiqués et ne suivent aucun traitement. Ces différences
révèlent tout l'intérêt d'étudier les variations de concentrations plasmatiques d'apeline au
cours de l'installation du diabète de type II.
- 157 -
3) Implication de l'apeline dans le métabolisme énergétique
En 2005, une équipe suédoise a montré que la relation insuline/apeline était réciproque
(555). En effet, ces travaux démontrent que le récepteur APJ est présent au niveau du
pancréas et que l'injection de l'apeline 36 par voie veineuse (2nmol/kg) entraîne une
diminution de la sécrétion d'insuline au cours d'un test de tolérance au glucose chez des
souris normopondérales ou rendues obèses par un régime gras. Cette diminution
s'accompagne logiquement d'une augmentation des taux plasmatiques de glucose et au
cours de cette expérience alors qu'aucun effet n'est observée sur la glycémie lorsque
l'apeline est administrée seule (555). Afin de démontrer que cet effet était direct, les
auteurs ont observé les capacités de production d'insuline d'îlots isolés de pancréas de
souris avec ou sans apeline 36. Les résultats montrent qu'un traitement de 60 minutes
d'apeline 36 (1 M) diminue significativement la production d'insuline des îlots en
réponse à une concentration élevée de glucose (16.7 mM). Ce résultat suggère qu'en
cas d'hyperglycémie, l'apeline pourrait réguler la sécrétion d'insuline.
Plus récemment, Higuchi et ses collaborateurs ont étudié les effets du traitement
chronique à l'apeline sur le métabolisme énergétique et l'adiposité de souris (556).
L'injection quotidienne, par voie intra péritonéale, d'apeline 13 (0.1 mol/kg) pendant 14
jours provoque une perte de poids des animaux en régime standard caractérisée par
une diminution du poids des différents dépôts adipeux (viscéral, sous-cutané et
mésentérique) associée à une baisse du contenu en triglycérides des adipocytes et à
une réduction de la taille de ces cellules. Chez la souris rendue obèse par un régime
gras, on observe une tendance à la perte de poids et une réduction significative du
poids du tissu adipeux viscéral. Les investigations concernant le métabolisme
énergétique concernent uniquement les souris normopondérales. Les résultats obtenus
montrent que le traitement à l'apeline diminue l'insulinémie et la concentration en
triglycérides plasmatiques et améliore la tolérance au glucose. De plus l'injection
quotidienne d'apeline entraîne une baisse de la concentration plasmatique en leptine et
augmente l'adiponectinémie. Cet effet est peut être indirect car il peut être du à une
diminution de la masse grasse. Aucun effet n'est observé sur la glycémie et les taux
plasmatiques d'acides gras libres mais une augmentation de la température corporelle
associée à une consommation d'oxygène augmentée a pu être relevée chez les
- 158 -
animaux traités (556). Cette dernière donnée a conduit les auteurs à étudier les
mécanismes responsables de la dissipation d'énergie sous forme de chaleur. Ainsi,
l'apeline entraîne une augmentation de l'expression de l'ARNm codant pour les
protéines décloupantes UCP1 et UCP3 respectivement dans le tissu adipeux brun et
dans le muscle. Ces protéines sont à l'origine de la dissipation d'énergie sous forme de
chaleur au niveau mitochondrial. Le mécanisme proposé serait que l'apeline, en
induisant l'expression de ces protéines découplantes, permettrait d'utiliser les substrats
énergétiques en excès empêchant ainsi leur stockage. Le reflet de cette dissipation
d'énergie sera une accumulation moins importante de triglycéride dans les adipocytes
avec pour conséquence une diminution du poids des dépôts adipeux et du poids
corporel. De la même façon, l'apeline permettrait d'améliorer certains paramètres
plasmatiques métaboliques comme le taux de triglycérides et d'insuline aboutissant à
une meilleure tolérance au glucose.
- 159 -
PARTIE IV: Objectifs et travaux de thèse
I. Objectifs
Lorsque j'ai commencé ma thèse, aucun rôle n'avait été décrit pour l'apeline
adipocytaire. Sa présence dans le TA et ses modifications d'expression et de sécrétion
avec l'obésité laissait supposer qu'elle pouvait agir sur son développement ou bien sur
le métabolisme énergétique. De plus, la régulation adipocytaire de l'apeline avait été
bien établie mais il restait à comprendre si cette régulation était maintenue dans les
situations d'insulino-résistance et de diabète de type II.
C'est pourquoi mon sujet de thèse s'est articulé autour de 2 axes:
Etude du rôle métabolique de l'apeline
Etude de la régulation de l'expression de l'apeline et de son
récepteur APJ au cours de l'insulino-résistance et du diabète de
type II
- 160 -
II. Etude du rôle métabolique de l'apeline
ARTICLE I: L'apeline augmente l'utilisation de glucose chez la souris
normale et insulino-résistante
Comme nous l'avons évoqué dans l'introduction de ce manuscrit, plusieurs
études ont mis en évidence un lien entre l'apeline et le métabolisme énergétique. En
effet, les travaux montrant une implication du peptide sur la prise alimentaire
représentent une première avancée dans le domaine (521). Les études suivantes ont
mis en avant un lien réciproque entre l'apeline et l'insuline confirmant l'hypothèse selon
laquelle l'apeline possède un rôle dans le métabolisme énergétique (555, 556).
C'est à partir de l'ensemble de ces résultats que nous nous sommes posés la
question du rôle de l'apeline au sein du métabolisme glucidique chez la souris normale
et la souris obèse et insulino-résistante.
Pour répondre à cette question, nous avons injecté, par voie veineuse, la forme
de 13 acides aminés de l'apeline à des souris normopondérales au cours de différentes
expériences visant à étudier le métabolisme glucidique. Ainsi, nous avons pu montrer
que l'apeline (200pmol/kg) entraîne une diminution de 25 % de la glycémie de souris à
jeûn et qu'elle améliore nettement la tolérance au glucose au cours d'une hyperglycémie
provoquée par voie orale. De plus, une perfusion d'apeline (75 pmol/kg/min) provoque
une augmentation de l'utilisation de glucose au niveau de l'organisme entier en
conditions basales et hyperinsulinémiques. Au niveau tissulaire, ces expériences nous
ont permis d'avancer que les cibles de l'apeline étaient préférentiellement le muscle strié
squelettique oxydatif (muscle soleus) et les TA. Ces effets observés avec l'apeline sont
comparables à ceux décrits par Kamohara et ses collaborateurs avec la leptine (557).
Dans les muscles isolés, l'apeline induit un transport de glucose direct et comparable à
l'insuline mais en utilisant une voie de signalisation différente. Grâce à des approches
pharmacologiques et géniques complémentaires, nous avons pu montrer que la voie de
signalisation de l'apeline conduisant au transport de glucose dans le muscle était
dépendante de l'activation de l'AMPK, de la eNOS et d'Akt. De plus, l'apeline est
- 161 -
toujours capable de stimuler l'utilisation du glucose (muscle, tissu adipeux et cœur) et
d'améliorer la tolérance au glucose chez les souris rendues obèses et insulino-
résistante par un régime hyperlipidique.
- 162 -
ARTICLE I
L'apeline augmente l'utilisation de
glucose chez la souris normale et
insulino-résistante
Cédric Dray, Claude Knauf, Danièle Daviaud, Aurélie Waget, Jérémie Boucher, Marie Buléon,
Patrice Cani, Camille Attané, Charlotte Guigné, Christian Carpéné, Rémy Burcelin, Isabelle
Castan-Laurell et Philippe Valet.
1 INSERM, U858, F-31 432 Toulouse, France
2 Université de Toulouse; UPS; Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil (I2MR), IFR150,
F-31432 Toulouse cedex 4, France
Cell Metabolism 8, 437-445, November 5 2008
- 163 -
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- 165 -
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- 172 -
Discussion ARTICLE I
Apeline et Glycémie
Contrairement à ce qu'avait montré Sörhede Winzell et ses collaborateurs, nous
observons que l'injection d'apeline diminue la glycémie et ne modifie pas la production
d'insuline (555). Il existe plusieurs considérations techniques qui peuvent expliquer ces
différences. L'apeline utilisée par l'équipe Suédoise est la forme de 36 acides aminés du
peptide alors que nous utilisons l'apeline 13 pyroglutaminée. Nous avons vu, dans
l'introduction de ce manuscrit, que toutes les formes d'apeline peuvent se lier et agir
différemment sur APJ en fonction du tissu. De plus les animaux utilisés dans notre étude
sont des males conscients alors que l'équipe de Bo Arhen utilise des femelles
anesthésiées. Le genre et l'anesthésie peuvent entraîner des différences déjà décrites
en terme de réponse métabolique (558). Enfin, le test de tolérance au glucose que nous
pratiquons tient compte des incrétines sécrétées par l'intestin (GIP et GLP-1) au cours
de la charge orale de glucose et impliquées dans la régulation de l'insulinémie (559). Ce
n'est pas le cas dans l'étude de Sörhede Winzell puisque l'augmentation de la glycémie
est provoquée par voie une injection intraveineuse de glucose.
Métabolisme glucidique, flux sanguin et apeline
Même si l'effet de l'apeline ne semble pas être médié par une variation de
l'insulinémie, d'autres voies indirectes peuvent être impliquées. C'est le cas notamment
de la vasodilatation. En effet, la dilatation des vaisseaux sanguins provoque un afflux de
sang aux organes qui a pour conséquence une augmentation de la clairance du glucose
plasmatique. Il a pu ainsi être démontré que certaines molécules vasodilatatrices
entraînaient une diminution de la glycémie. De plus, des études récentes ont pu mettre
en évidence que l'insuline provoquait aussi une dilatation des microvaisseaux et que
cette vasodilatation était responsable de 20 à 40% de son effet sur l'homéostasie
glucidique (560). Comme nous l'avons décrit précédemment, l'apeline est un puissant
vasodilatateur et son action métabolique pourrait être le résultat d'une vasodilatation
permettant d'augmenter l'échange de glucose entre la circulation sanguine et les tissus
cibles. Cependant, des expériences pratiquées chez la souris nous ont permis
- 173 -
d'observer qu'aux doses utilisées (200 pmol/kg), l'apeline ne modifiait pas la pression
artérielle moyenne ou la fréquence cardiaque alors qu'elle diminuait la glycémie.
Toutefois, des expériences complémentaires plus approfondies seraient nécessaires
afin de mieux définir l'impact de l'apeline sur la microcirculation. Comme l'insuline, il est
fort probable que l'effet de l'apeline sur la clairance plasmatique du glucose soit en
partie médié par une vasodilatation qu'il serait intéressant de quantifier.
L'apeline et le transport de glucose
Dans le but de savoir si l'effet de l'apeline que nous avions observé était direct ou
résultait d'un relais à l'échelle de l'organisme (SNC, autres médiateurs, …), nous avons
étudié ces effets in vitro. Malheureusement, aucune lignée cellulaire musculaire (C2C12
et L6) ou adipocytaire (3T3F442A et 3T3L1) n'exprime de façon endogène le récepteur
APJ. Nous avons donc réalisé toutes nos expériences sur des tissus isolés murins.
Nous avons pu montrer que l'apeline augmentait, de façon dépendante de la dose, le
transport de glucose dans le muscle soleus et dans le TA de souris (résultats
complémentaires). L'apeline utilisée à la plus forte concentration (1 M) stimule le
transport de glucose dans le muscle de manière comparable à celle de l'insuline (10
nM). De façon intéressante, lorsque les muscles sont coincubés en présence d'insuline
(10nM) et d'apeline (1 M), on observe une potentialisation du transport de glucose
médié par l'insuline seule. Cet effet additif de l'apeline suggère que les deux hormones
produisent leur effet par des voies de signalisation distinctes.
L'AMPK: cible de l'apeline
Nous avons montré que l'apeline stimule le transport de glucose en activant
l'AMPK. En effet, l'apeline induit une augmentation de la phosphorylation de la sous-
unité de l'AMPK (thréonine 172) dans le muscle aussi bien in vitro qu'in vivo. Sur des
muscles isolés, cette stimulation est dépendante de la dose d'apeline et débute 20
minutes après le début de l'incubation. In vivo, l'injection i.v d'apeline (200pmol/kg)
entraîne une phosphorylation de l'AMPK dans le muscle soleus 20 minutes après
l'injection du peptide. Afin de connaître l'influence de l'apeline sur l'activité enzymatique
de l'AMPK, nous avons évalué la phosphorylation de la protéine ACC (Acétyl CoA
Carboxylase) qui est directement en aval de l'AMPK. Ces expériences montrent une
- 174 -
phosphorylation parallèle à celle de l'AMPK confirmant une activation de ce senseur
métabolique par l'apeline. L'inhibition pharmacologique (composé C) et génétique
(souris AMPK-DN) de l'activité de l'AMPK nous a permis de montrer que cette protéine
était indispensable à l'effet de l'apeline sur le transport de glucose.
Depuis plusieurs années, un intérêt particulier est porté à l'égard de la protéine
AMPK qui est une cible potentielle dans la lutte contre l'insulino-résistance. Dans ce
sens, de nombreuses études s'attachent à découvrir des molécules endogènes ou
exogènes capables de stimuler et d'activer cette protéine. Ainsi, plusieurs adipokines
telles que la leptine et l'adiponectine induisent une augmentation du transport de
glucose et de l'oxydation des acides gras dans le muscle squelettique via la stimulation
de l'AMPK (103, 389, 402).
De nombreux travaux sont effectués pour synthétiser des molécules exogènes
capables de stimuler l'AMPK. Ainsi, le 5-Aminoimidazole-4-Carboxamide
Ribonucleoside (AICAR), qui est un analogue de l'AMP, modifie le ratio AMP/ATP au
sein de la cellule. Or, l'augmentation du ratio AMP/ATP permet d'activer l'AMPK (561).
En rapprochant ces deux informations, Bergeron et ses collaborateurs ont pu montrer
qu'une perfusion d'AICAR (10 mg/kg/min) chez le rat normopondéral induisait une
amélioration de l'homéostasie gluco-lipidique (562). Ces travaux ont également montré
que chez ces animaux, ainsi que chez des rats génétiquement obèses et insulino-
résistant, la perfusion d'AICAR stimulait le transport de glucose dans les muscles
squelettiques suggérant que l'AMPK reste active. D'autres molécules sont capables
d'augmenter l'activité de l'AMPK et ainsi d'agir sur le métabolisme énergétique. C'est le
cas des biguanides (metformine ou phenformine) et des thiazolindinediones
(rosiglitazone, pioglitazone et troglitazone) qui, par des mécanismes différents semblent
médier l'augmentation de la phosphorylation de l'AMPK et qui sont utilisés dans le
traitement du diabète. C'est aussi le cas pour des composés naturels issus de plantes
comme la berbérine, le resvératrol ou la quercétine (563) qui sont la cible de nouvelles
études sur leur rôle au sein du métabolisme énergétique.
Grâce à notre étude, l'apeline peut être considérée comme une nouvelle
adipokine capable d'agir sur le métabolisme glucidique en ciblant l'AMPK dans le
muscle.
Comme nous l'avons vu dans l'introduction, l'AMPK est aussi impliquée dans la
régulation de la synthèse d'insuline par les cellules du pancréas (129). A la vue de ces
- 175 -
nouvelles informations concernant l'apeline et l'AMPK il serait intéressant d'étudier
l'activité de la protéine au niveau des cellules pancréatiques afin de savoir si l'apeline
13 régule la fonction pancréatique. Ceci permettrait de mieux appréhender le rôle de
l'apeline 13 sur la sécrétion d'insuline.
La littérature montre que de nombreuses protéines sont en aval de l'AMPK
(Hardie et al., 2004). L'effet de l'apeline sur la eNOS vasculaire et la stimulation de cette
protéine par l'AMPK sont deux arguments bien décrits qui nous ont permis de penser
que cette protéine pouvait être ciblée par l'apeline dans le muscle. De plus, différentes
études ont pu montrer que la eNOS était capable d'induire l'augmentation de GLUT4 à
la membrane plasmique de cellules musculaires, adipocytaires ou cardiaques favorisant
le transport de glucose dans ces tissus (564, 565).
Dans notre étude, nous avons pu voir que l'AMPK, stimulée par l'apeline, était capable
de phosphoryler la eNOS. Nos travaux réalisés sur les animaux dont le gène codant
pour la eNOS a été invalidé démontrent que cette protéine est indispensable à l'action
de l'apeline sur le transport de glucose.
Apeline et voie de l'insuline
Nous avons également cherché à savoir si la voie de signalisation de l'apeline
dans le muscle n'était pas commune à celle de l'insuline. En effet, nous avons vu que
certains travaux avaient mis en avant une phosphorylation d'Akt par l'apeline dans les
cellules HUVEC (566). Dans notre étude, nous montrons pour la première fois que
l'apeline phosphoryle Akt dans le muscle et que le transport de glucose est totalement
inhibé lorsque l'apeline est coincubée avec un inhibiteur de la PI3K et par conséquent
d'Akt. Ceci signifie qu'Akt est également indispensable dans le transport de glucose
médié par l'apeline. Akt (PKB) est également capable d'activer la protéine AS160 qui est
en amont de l'AMPK. On pourrait alors penser que, dans le muscle, l'apeline active Akt
qui via la protéine AS160 phosphoryle l'AMPK dont l'activation va permettre de stimuler
la eNOS. Cependant, une troisième série d'expérience effectuée sur les animaux
AMPK-DN montre que l'AMPK est en amont de la eNOS et de Akt. Ceci suggère que
l'apeline favorise le transport de glucose dans le muscle via une activation de l'AMPK
qui va ensuite parallèlement activer la eNOS et Akt, chacune d'entre elles agissant pour
favorisant l'entrée de glucose dans la cellule.
- 176 -
Afin de compléter l'étude de la voie de signalisation de l'apeline, des expériences
démontrant la translocation du transporteur GLUT4 à la membrane plasmique des
cellules sous l'influence du peptide me semblent nécessaires.
L'ensemble de ces résultats a été obtenu dans le muscle mais il est fort probable que
les mêmes acteurs moléculaires soient mobilisés par l'apeline dans le TA. En effet,
l'adipocyte exprime le récepteur APJ ainsi que les protéines impliquées dans la
signalisation moléculaire du métabolisme glucidique que nous venons de décrire. En
revanche, il ne semble pas que l'apeline agisse sur le métabolisme hépatique. Le
récepteur APJ n'étant pas présent à la membrane des hépatocytes, un effet direct de
l'apeline est peu probable. Cette hypothèse est confirmée par l'absence d'effet de
l'apeline sur la production hépatique de glucose au cours de l'étude de l'utilisation de
glucose (expériences de "turn-over" de glucose).
Fig. 22 Apeline et transport de glucose. Nous avons pu montré que l‟apeline pouvait induire le transport
de glucose dans le muscle en phosphorylant l‟AMPK, la eNOS et Akt. Il est probalble que l‟AMPK
phosphorylée induise une activation de la eNOS qui est capable d‟augmenter la translocation de GLUT4 à
la membrane plasmique et donc d‟incrémenter le transportde glucose. De plus, une interconnexion avec
la voie de l‟insuline n‟est pas impossible comme l‟atteste la phosphoruylation de d‟AKT par l‟apeline dans
le muscle. Comme dans la voie de la PI3K, Akt/PKB est capable d‟augmenter la translocation de GLUT4 à
la membrane plasmique.
- 177 -
Apeline et Insulino-résistance
Compte tenu du rôle joué par l'apeline sur le métabolisme glucidique de la souris
normopondérale, nous avons voulu savoir si ces effets étaient conservés chez la souris
obèse et insulino-résistante.
Des expériences de test de tolérance au glucose et de clamp hyperinsulinémique
euglycémiques ont validé l'insulino-résistance de notre modèle animal. Lorsque l'apeline
est administrée à ces animaux, on remarque une nette amélioration de la tolérance au
glucose Chez l a souris obèse et insulino-résistante, l'apeline favorise de transport de
glucose dans des tissus tels que le muscle squelettique et le TA. L'ensemble de ces
résultats montre que l'apeline est toujours éfficace malgré l'insulino-résistance.
Même si d'autres expériences complémentaires sont nécessaires, il est probable
que la même voie de signalisation décrite chez la souris normopondérale soit
responsable de ce transport de glucose chez la souris insulino-résistante. En effet,
comme l'avait montré Zhang sur l'aorte isolée de souris db/db, même si le nombre de
récepteur à l'apeline est diminué, APJ est toujours actif chez l'animal diabétique au
niveau des cellules endothéliales. A la vue de ces résultats, il semble nécessaire de
quantifier l'expression du récepteur APJ au niveau du muscle et du TA de souris ou
d'individus diabétiques. Ainsi, si la quantité de récepteurs présents à la membrane des
cellules musculaires ou adipocytaire est diminuée au cours du diabète, il devient plus
intéressant d'établir une stratégie visant à augmenter l'expression d'APJ plutôt que
d'augmenter les taux plasmatiques d'apeline déjà élevés chez ces patients (567). Nous
avons montré au laboratoire qu'au cours de l'obésité, les taux plasmatiques d'apeline
sont augmentés (542, 568). Or, nous venons de décrire que l'apeline 13 synthétique,
injectée en aigu à des souris obèses et insulino-résistantes, conserve sa capacité à
améliorer la tolérance au glucose et la sensibilité à l'insuline. Les études effectuées
chez l'homme diabétique ont montré des discordances dans l'évolution des taux
plasmatiques d'apeline plasmatique. Ainsi, l'étude de Li montre une augmentation de
l'apelinémie au cours du diabète alors que celle de Erdem constate une diminution.
Compte tenu de ces différences, il est difficile de conclure à un rôle bénéfique ou
délétère de l'apeline au cours du diabète. C'est la raison pour laquelle, dans la troisième
partie de ces travaux de thèse, nous avons étudié les taux plasmatiques et l'expression
- 178 -
de l'apeline et de son récepteur dans deux tissus cibles, le muscle et le TA, au cours de
l'installation de l'insulino-résistance et du diabète associés à l'obésité.
L'apeline impliquée dans le métabolisme cardiaque?
De façon inattendue, les expériences de clamp hyperinsulinémique euglycémique
pratiquées chez la souris obèse et insulino-résistante révèlent que la perfusion d'apeline
augmente significativement le transport de glucose dans le cœur. Ce résultat est
d'autant plus surprenant que l'apeline ne stimule pas le transport de glucose dans le
cœur de souris normopondérales. En conditions physiologiques, le glucose n'est pas le
substrat préférentiel des cardiomyocytes mais il est indispensable. En effet, bien que les
AG constituent 70% des substrats énergétiques du cœur, un équilibre entre l'utilisation
du glucose et des AG est essentiel au bon fonctionnement de cet (569). Le transport de
glucose dans le cœur est dépendant des transporteurs GLUT1 et GLUT4 (570). GLUT1
va permettre le transport basal du glucose alors que GLUT4 se trouve au niveau de
vésicules intracellulaires dont la translocation à la membrane plasmique est dépendante
de l'insuline (571). L'insuline régule également le transport de glucose au niveau
cardiaque en agissant sur l'expression génique des transporteurs (572, 573). De façon
intéressante, des résultats obtenu en 2004 par l'équipe de LH Young montrent que le
traitement (30 à 60 minutes) de cœurs isolés de rats par de l'AICAR stimule le transport
de glucose dans les cardiomyocytes. Cette augmentation est provoquée par une
augmentation de l'activité de l'AMPK qui, via la eNOS, va entraîner la translocation de
GLUT4 au niveau de la membrane plasmique (574). Au cours du diabète de type II, la
sensibilité à l'insuline au niveau du cœur est diminuée et, par conséquent, le transport
de glucose est réduit. Ceci a pu être montré chez les souris db/db et ob/ob (575) alors
que chez l'homme les résultats sont plus nuancés (576). Toutefois, l'ensemble de ces
travaux et de nos résultats suggèrent que chez la souris normopondérale, le transport
de glucose est maximal au cours du clamp hyperinsulinémique euglycémie ce qui a pour
conséquence une absence d'effet de l'apeline. En revanche, chez la souris obèse et
insulino-résistante, le transport de glucose insulino-dépendant étant diminué, il est
possible d'observer l'effet de l'apeline dans le cœur. Ce résultat constitue une
perspective thérapeutique importante dans les pathologies cardiaques associées aux
maladies métaboliques. En effet, du fait de leur transport "passif" (la présence du
transporteur CD36 n'est pas régulé par une hormone) au niveau de la membrane
- 179 -
plasmique des cardiomyocytes, les AG vont être utilisés préférentiellement au glucose
au niveau de ces cellules (cycle de Randle) (569). Chez l'obèse, l'afflux important d'AG
va conduire à un déséquilibre dans l'utilisation des substrats à la base de phénomènes
délétères au niveau du cœur comme la génération de céramides responsables de
l'apoptose des cellules cardiaque ou bien d'une accumulation de glycogène dans ce
tissu à l'origine de cardiomyopathies (569). Il est donc nécessaire d'approfondir ces
résultats afin de définir le rôle exact de l'apeline sur le métabolisme cardiaque et son
implication dans les pathologies cardiovasculaires associées aux maladies
métaboliques.
Les effets que nous avons obtenus au cours ces travaux ne concernent que le
modèle murin. Les premiers résultats montrant l'efficacité de l'apeline chez l'homme sur
la vasodilation et l'implication du NO ont été publiés récemment par l'équipe de D.
Newby en Ecosse (488). Dans son étude, Japp montre que l'injection d'apeline 13 chez
l'humain entraîne les mêmes effets vasculaires que ceux décrits chez la souris. Une
collaboration avec cette équipe est en cours et devrait nous permettre de bénéficier des
échantillons des patients traités à l'apeline afin de pouvoir mesurer différents
paramètres plasmatiques comme la glycémie et l'insulinémie.
- 180 -
III. Etude de la régulation de l'expression de l'apeline et de son
récépteur APJ au cours de l'insulino-résistance et du diabète de type
II
Suite à la mise en évidence de la régulation adipocytaire de l'apeline par
l'insuline, s'est posée la question de son devenir au cours de l'insulino-résistance et du
dibète de type II.
Tout d'abord, nous nous sommes intéressés au TNF qui est une cytokine
inflammatoire dont l'expression dans le TA est augmentée avec l'insulino-résistance
(Article 2) puis nous avons entrepris une étude sur du long-terme afin de déterminer
l'expression de l'apeline et de son récepteur non seulement dans le TA mais aussi dans
le muscle et d'autres tissus (non présentés dans l'article) chez des souris soumises à un
régime hyperlipidique et des souris db/db de même age (Article 3). Ces souris ont été
suivies en terme de poids, glycémie et insulinémie, de tolérance au glucose et à
l'insuline.
En parallèle, grâce à une collaboration avec H. Vidal, nous avons pu étudier
l'expression d'apeline et d'APJ dans le TA et le muscle squelettique de sujets contrôles
et diabétiques (Article 3).
- 181 -
ARTICLE II: Le TNF augmente l'expression de l'apeline adipocytaire
Le TA est le siège d'une inflammation de bas niveau au cours de l'obésité. Cette
inflammation est décrite par une infiltration macrophagique des dépôts adipeux
accompagnée d'une augmentation de l'expression et de la sécrétion de cytokines
inflammatoires telles que l'IL6, MCP-1 ou le TNF par les cellules adipeuses et celles de
la FSV (195).
Des injections de TNF (2ng/souris) par voie intrapéritonéale ont été pratiquées
chez la souris puis nous avons étudié l'expression adipocytaire de l'apeline chez ces
animaux. Les résultats montrent que, 8 heures après l'injection, le TNF entraîne une
augmentation de l'expression de l'apeline d'un facteur 3 dans les adipocytes isolés.
Cette augmentation s'accompagne d'une concentration plasmatique d'apeline plus
élevée chez les souris traitées au TNF . Afin de déterminer si l'effet du TNF sur
l'expression d'apeline est direct, nous avons étudié, sur la lignée cellulaire 3T3F442A,
les conséquences d'un traitement aigu au TNF sur l'expression d'apeline. Les résultats
obtenus montrent que le traitement au TNF augmente l'expression et la sécrétion de
l'apeline dans ce modèle cellulaire. De plus, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques
(LY294002, PD098059 GFX et SP600125) a mis en évidence que la régulation de
l'expression de l'apeline par le TNF était dépendante de la PI3K, de la Jun kinase et
des MAPK. En revanche, contrairement à ce qu'il avait été observé avec l'insuline, le
contrôle de l'expression de l'apeline par le TNF est indépendant de la PKC.
Compte tenu de ces résultats, nous avons voulu connaître la relevance
physiologique de cette régulation. Pour cela, nous avons quantifié l'expression
adipocytaire de l'apeline et du TNF chez des modèles murins d'obésité. Ainsi, chez
deux modèles murins d'obésité différents, l'expression de l'apeline adipocytaire
augmente proportionnellement à celle du TNF .
Chez l'homme, le même type de régulation semble exister. Lors de la culture d'explants
de TA sous cutanés, une augmentation spontanée de l'expression et de la sécrétion du
TNF a été décrite (180). Dans notre étude, cette augmentation est suivie d'une
élévation significative de l'expression de l'apeline. A contrario, lors de l'inhibition
pharmacologique de la sécrétion de TNF dans le milieu, une absence d'augmentation
du transcrit de l'apeline est observée. L'analyse d'échantillons provenant de TA humains
- 182 -
sous-cutanés ou viscéraux démontre une corrélation positive existe entre l'expression
adipocytaire d'apeline et celle du TNF . Cette corrélation est encore plus forte chez les
individus obèses.
- 183 -
ARTICLE II
Le TNF augmente l'expression de
l'apeline dans le tissu adipeux
humain et murin
Danièle Daviaud, Jérémie Boucher, Stéphane Gesta, Cédric Dray, Charlotte Guigné, Didier
Quillot, Ahmet Ayav, Olovier Ziegler, Christian Crapéné, Jean-Sébastien Saulnier Blache,
Phlippe Valet et Isabelle Castan-Laurell
1 INSERM, U858, F-31 432 Toulouse, France
2 Université de Toulouse; UPS; Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil (I2MR), IFR150,
F-31432 Toulouse cedex 4, France
Faseb Journal 20, E796-E802 (2006)
- 184 -
- 185 -
- 186 -
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- 188 -
- 189 -
- 190 -
- 191 -
Discussion ARTICLE II
Cette étude a donc mis en évidence un nouveau facteur capable de réguler
l'expression de l'apeline dans le TA. Alors que le TNF possède une action inhibitrice
sur la voie de l'insuline, l'expression adipocytaire d'apeline est, de façon surprenante,
contrôlée positivement par le TNF . Ceci suggère qu'au cours du développement de
l'obésité conduisant à l'insulino-résistance, les taux élevés de TNF et d'insuline
pourraient agir de concert et ainsi maintenir une apelinémie élevée.
Cependant, différents travaux suggèrent aussi que l'inflammation du TA est
précoce et qu'elle a lieu avant l'installation de l'obésité. Il est alors possible d'imaginer
que le TNF , sécrété localement par le TA de l'individu en surpoids, puisse provoquer,
par action autocrine ou paracrine, une augmentation de l'expression et de la sécrétion
de l'apeline. Aux vues des propriétés angiogéniques de l'apeline dans le TA décrites par
O. Kunduzova (541) et des résultats que nous avons obtenus, on ne peut pas exclure
que le peptide, dont la production est alors stimulée par le TNF , possède un rôle dans
les phases précoces du développement du TA associé à l'obésité.
D'autres résultats, obtenus au laboratoire, démontrent que le lipopolysaccharide
(LPS) est aussi capable d'induire une augmentation de l'expression adipocytaire de
l'apeline in vivo et in vitro. Le LPS est une molécule étroitement impliquée dans
l'inflammation du TA au cours de l'obésité et à l'origine de dysfonctionnements
métaboliques. Il semble alors que la régulation de l'expression de l'apeline adipocytaire
ne soit pas spécifique à un agent inflammatoire en particulier mais plutôt à
l'inflammation elle-même. A partir de ces informations, il me semble nécessaire
d'approfondir les recherches afin de mieux appréhender l'implication de l'inflammation
sur l'expression adipocytaire de l'apeline et ses conséquences sur le TA.
Réciproquement, le rôle potentiel de l'apeline sur les phénomènes inflammatoires
observés au sein de ce tissu mérite d'être étudié.
- 192 -
ARTICLE III: Etude de la régulation de l'expression de l'apeline et de son
récepteur APJ au cours de l'insulino-résistance et du diabète de type II chez
l'homme et la souris.
L'insulino-résistance trouve son origine, à la fois, dans le dysfonctionnement de la
voie de l'insuline, mais également dans la modification du profil sécrétoire des
adipocytes. Ainsi, certaines adipokines, délétères pour la sensibilité à l'insuline ou la
tolérance au glucose, possèdent une expression ou une sécrétion augmentée (TNF ,
IL-6, résistine et RBP4), alors que d'autres, favorables au maintient d'un métabolisme
énergétique normal diminuent (adiponectine et omentine). Enfin, un troisième profil
d'expression existe: il s'agit d'adipokines qui voient leur expression augmenter avec
l'obésité et l'insulino-résistance alors qu'elles sont bénéfiques pour le métabolisme
énergétique (leptine et adipsine). Pour expliquer ceci, différents travaux ont montré que
des phénomènes de "résistance" pouvaient se mettre en place au cours de l'obésité et
de ses pathologies associées. Ainsi, l'adipsine voit le nombre de ses récepteurs
diminuer chez le rat obèse alors que la leptine possède une voie de signalisation altérée
du fait d'une leptinémie trop importante (359, 577).
A la vue de ces résultats, nous nous sommes interressés à la régulation de
l'apeline au cours de l'insulino-résistance et diu diabète de type II chez l'homme et la
souris.
- 193 -
ARTICLE III
Régulation de l'expression de
l'apeline et d'APJ chez l'homme et la
souris au cours de l'insulino-
résistance
Dray C 1,2
, Debard C3, Jager J
4, Disse E
5, Daviaud D
1,2, Martin GP
6, Guigné C
1,2, Bost F
4, Tanti
JF4, Laville M
5, Vidal H
3, Valet P
1,2 and Castan-Laurell I
1,2
1 INSERM, U858, F-31 432 Toulouse, France
2 Université de Toulouse; UPS; Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil (I2MR), IFR150,
F-31432 Toulouse cedex 4, France
3 INSERM Unité 870; INRA Unité 1235; INSA de Lyon; Université Lyon 1, Faculté de
médecine Lyon-Sud, F-69600, Oullins 4 Centre Méditéranéen de Médecine Moléculaire, INSERM U 895, Université de Nice Sophia-
Antipolis, F-06204 Nice, France
5 Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, Institut National de la Recherche Agronomique,
INRA UR66, Toulouse, France
Running title: apelin/APJ regulation in type 2 diabetes
Article en préparation
- 194 -
Human and mouse apelin and APJ regulation in adipose tissue and skeletal
muscle in type 2 diabetes
Dray C
1,2, Debard C
3, Jager J
4, Disse E
5, Daviaud D
1,2, Martin GP
6, Guigné C
1,2, Bost F
4, Tanti
JF4, Laville M
5, Vidal H
3, Valet P
1,2 and Castan-Laurell I
1,2
1 INSERM, U858, F-31 432 Toulouse, France
2 Université de Toulouse; UPS; Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil (I2MR), IFR150,
F-31432 Toulouse cedex 4, France
3 INSERM Unité 870; INRA Unité 1235; INSA de Lyon; Université Lyon 1, Faculté de
médecine Lyon-Sud, F-69600, Oullins
4 Centre Méditéranéen de Médecine Moléculaire, INSERM U 895, Université de Nice Sophia-
Antipolis, F-06204 Nice, France
5 Centre de Recherche en Nutrition Humaine Rhône-Alpes, Hospices Civils de Lyon, Hôpital
Lyon-Sud, F-69310 Pierre-Bénite
6 Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, Institut National de la Recherche Agronomique,
INRA UR66, Toulouse, France
Running title: apelin/APJ regulation in type 2 diabetes
Corresponding author:
Isabelle Castan-Laurell, I2MR, IFR 150, BP 84225, 31432 Toulouse cedex 4, France.
Email: isabelle.castan@inserm.fr tel: (33) 5 61 32 56 35, fax: (33) 5 61 32 56 23
Key words: apelin, APJ, adipose tissue, skeletal muscle, insulin resistance,
diabetes
- 195 -
Abstract
Objective: Apelin, an adipocyte-secreted factor, is increased in adipose tissue (AT) with obesity
and up-regulated by insulin. The regulation of apelin and APJ (apelin receptor) expression in
skeletal muscle in relation with insulin resistance or type 2 diabetes is not known. Thus, we
compared apelin and APJ profile in AT and muscle in humans and mice and studied their
regulation by insulin.
Methods: Apelin and APJ expression were measured by real-time PCR in At and skeletal
muscle. We used C57Bl6/J mice fed either a chow- or a high-fat (HF) diet and db/db mice.
Insulin effect was measured during fasting/refeeding conditions in HF-fed mice. Control and
diabetic humans were subjected to an hyperinsulinemic-euglycemic clamp and biopsies of both
tissues were obtained before and after the clamp.
Results: Whereas apelin and APJ were significantly increased in AT of HF-fed mice, no
modifications were observed in muscle. In AT and muscle of db/db, apelin expression was
similar to control but APJ in muscle was decreased. Between control and diabetic subjects, there
was no significant difference in apelin and APJ expression in AT and muscle. Although insulin
regulates apelin and APJ expression in AT and muscle of control mice and humans, APJ
regulation was only observed in AT of HF-fed mice and in muscle of diabetic subjects.
Conclusion: Apelin and APJ expression are differently regulated between i) AT and muscle and
ii) insulin-resistant and diabetic states. APJ expression in muscle decreases with type 2 diabetes.
- 196 -
Introduction
Apelin is a circulating peptide produced and secreted by human and mouse adipocytes
(Boucher et al, 2005). Its plasma concentrations are increased in humans with morbide obesity
(Heinonen et al., 2005) and in hyperinsulinemic obese mice (Boucher et al., 2005). Our group
also demonstrated that adipose tissue apelin expression and production are strongly regulated by
insulin (Boucher et al 2005). Very recently we discovered that apelin is able to stimulate glucose
utilization in adipose tissue and skeletal muscles in mice with a normal weight but also in obese
and insulin-resistant mice (Dray et al 2008), supporting a potential physiological role of this
peptide in the regulation of glucose homeostasis. However, there are controversies in the
literature regarding the regulation of apelin in patients with altered glucose metabolism. Erdem et
al showed that plasma apelin levels were decreased in newly diagnosed type 2 diabetic subjects
compared to overweight patients (Erdem et al 2008) whereas, in another study, an increased level
of apelin has been observed in subjects with glucose intolerance and type 2 diabetes (Li et al.,
2006).
Apelin acts through the binding to a specific G protein-coupled receptor named APJ
(Tatemoto et al., 1998). Apelin and APJ mRNA are widely expressed in mammal tissues and are
associated with functional effects in both the central nervous system and peripheral tissues
(Carpéné et al., 2007). Apelin and APJ receptor are often co-localized in the same tissues and
display similar variations of expression. For example, coordinated down-regulation (Iwanaga et
al 2006) or increased expression (Alturi et al 2007) of apelin and APJ has been observed in
human or rodent heart with cardiac dysfunction. In obese subjects, we recently showed that the
expression of both apelin and APJ was increased in adipose tissue (Castan-laurell et al 2008).
So far, the regulation of APJ expression in skeletal muscle has not been yet studied.
Moreover, the impact of insulin-resistance and type 2 diabetes, on the expression of these new
actors of glucose metabolism, remains to be addressed. Therefore, in the present study, we
investigated the adipose tissue and skeletal muscle expression of apelin and APJ in mouse models
displaying different degrees of insulino-resistance and in human subjects with and without type 2
diabetes. Furthermore, we studied their regulation during hyperinsulinemic euglycemic clamp in
humans and during the fasting-refeeding transition in mice models. The data presented herein
showed that apelin and APJ expression are differently regulated according to the tissue in
situations of insulin-resistance and diabetes.
- 197 -
Materials and Methods
Animal studies
Housing and diets Animals were handled in accordance with the principles and guidelines
established by the National Institute of Medical Research (INSERM). C57Bl6/J wild type and
db/db mice were obtained from Charles River Laboratory (l’Arbresle, France). Mice were housed
conventionally in a constant temperature (20-22°C) and humidity (50-60%) animal room, with a
12/12h light/dark cycle (lights on at 8:00 am) and free access to food and water. The C57Bl6/J
mice were fed either a chow diet or a high-fat (HF) diet containing 20% protein, 35%
carbohydrate and 45% fat (Research Diet, NJ). HF-fed mice were followed at regular intervals
with measure of body weight and blood parameters (glucose, insulin) until they were obese and
insulin resistant (30 weeks-old in average). Db/db mice were fed a chow diet and killed at the
same age than the HF-fed mice.
Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) An intraperitoneal injection of glucose (1 g/kg of
body weight) was performed in 12-h-fasted mice. Blood was collected from the tip of the tail vein
and glucose levels were monitored with a glucometer (Roche Diagnostic, Rotkreuze,
Switzerland) at 0, 20, 40, 60, 90 and 120 min after glucose injection.
Intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) An intraperitoneal injection of human insulin (0,75
U/kg of body weight) was performed in 12-h-fasted mice. Blood was collected from the tip of the
tail vein and glucose levels were monitored with a glucometer (Roche Diagnostic, Rotkreuze,
Switzerland) at 0, 20, 40, 60, 90 and 120 min after insulin injection.
Nutritional regulation and tissue sampling Mice were fed, 24 hrs fasted or refed during 24h after
24 hrs fasting. Blood was collected through inferior cava vein on EDTA 0,1% for plasmatic
glucose, insulin and apelin determination (see below) and tissues were taken and immediately
frozen for RNA determination or for glucose transport in isolated adipocytes or skeletal muscle.
Plasma parameters Serum insulin and apelin concentrations were measured using an ultra-
sensitive mouse insulin ELISA (Mercodia, Uppsala, Sweden) and a non selective apelin-12 EIA
kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA) respectively. Leptin was measured with Milliplex
kit of mouse adipokine (Millipore, St Charles MO, USA)
- 198 -
Human study
Subjects. All participants gave their written consent after being informed of the nature, purpose,
and possible risks of the study. The experimental protocol was approved by the Ethical
Committees of the Hospices Civils de Lyon and performed according to the French legislation
(Huriet Law). Fourteen patients with type 2 diabetes participated to the study. None of the
healthy lean control subjects had impaired glucose tolerance or a familial or personal history of
diabetes, obesity, dyslipidemia, or hypertension. All type 2 diabetic patients (mean HbA1c = 8.9
± 0.5%) were treated only with oral antidiabetic agents (metformin and/or sylfonylurea). They
interrupted, under medical control, their usual treatment at least 5 days before the investigation.
The characteristics of the subjects are presented in Table 1.
Hyperinsulinemic clamp. All studies were performed after an overnight fast. To investigate
insulin action on glucose metabolism and on gene expression in peripheral tissues, the subjects
were submitted to a 3 hour euglycemic hyperinsulinemic clamp (insulin infusion rate of 2
mU.min-1.kg-1), as previously described in details (Laville et al 1996, Ducluzeau et al 2001).
Plasma metabolites and hormones concentrations were measured using enzymatic methods and
radioimmunoassays.
In vitro studies
Human preadipocyte culture Human preadipocytes (Biopredic, Rennes, France) were grown at
5% CO2 and 37°C in 12-wells collagen-coated plates in DMEM Ham’s F12 containing 15 mM
Hepes, 2 mM L-Glutamine, 5% fetal calf serum, 1% antimycotic solution, ECGS/H-2, hEGF-5,
and HC-500 from Supplement Pack Preadipocyte Growth Medium (Promocell). Differentiation
in adipocytes was induced after confluence by changing the medium for DMEM Ham’s F12 15
mM Hepes, 2 mM L-glutamine, 3% fetal calf serum, supplemented with biotin (33 µM), insulin
(100 nM), pantothenate (17 µM), isobutylmethylxanthine (0.2 mM), dexamethasone (1 µM),
rosiglitazone (10 µM). The medium was removed after 3 days and replaced with Ham’s F12
containing 15 mM Hepes, 2 mM L-glutamine, 10% FCS, supplemented with biotin (33 µM),
insulin (100 nM), pantothenate (17 µM) and dexamethasone (1 µM). Then, the cells were fed
every 2 days with the same medium. Human adipocytes were used 9 days after the beginning of
the differentiation protocol.
- 199 -
Glucose transport in mice adipocytes A sample of perigonadic adipose tissue was minced,
incubated while shaking in 5 ml of KR buffer (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK) supplemented
with 1 mg/ml collagenase and 1% BSA and digested for 30 min at 37°C. After filtration, isolated
adipocytes were incubated in the presence or not of 100 nM insulin for 45 min at 37°C in a final
volume of 400 µl. Then, 2-deoxy-d-[3H]-glucose (D2-DG), was added at a final concentration of
0.1 mM for 10 min. Assays were stopped with 100 µl of 100 mM cytochalasin B and aliquots of
the cell suspension were centrifuged in microtubes containing di-isononyl phthalate (density
0.974 g/ml) to separate adipocytes from the buffer and count the intracellular [3H]2-DG.
Glucose Transport in mice skeletal muscle Soleus muscles were isolated and preincubated for 10
min in Krebs-Henseleit (KH) buffer, pH 7.4, containing bovine serum albumin (2 mg/ml), 2 mM
sodium pyruvate and 20 mM Hepes. Muscles were then incubated for 45 min in the absence or
the presence of insulin (100 nM). For glucose transport, muscles were transferred in another vial
containing KH medium supplemented with D-2DG (0,1 mM) and D-[3
H]-2-Deoxyglucose (0.4
µCi/ml) for 10 minutes. Muscles were then washed for 1 hr in ice-cold iso-osmotic NaCl solution
and dissolved in 1 M NaOH during 1 hour. D-[3H]-2DG 6-phosphate and D-[3H]-2DG were
differentially precipitated by the use of zinc sulfate (0.3M), baryum hydroxide (0.3M) and
perchloric acid solutions (6%). All the incubations were carried out at 37 C under a 95% 02 : 5%
CO2 athmosphere.
Apelin and AJP mRNA expression studies
Mice tissues Tissues from fed mice (adipose tissue, muscle) were crushed by using Precellys 24
automated biological sample lyser with CK-14 beads vials. Total RNAs (1 g) were isolated
from AT using RNeasy Lipid Tissue Kits (QIAGEN, France) and from muscle using RNA STAT
(AMS Technology, UK). Total RNAs were reverse transcribed using random hexamers and
Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, UK). Real time PCR was performed as
previously described (Boucher et al., 2005). Brefly, Real-time PCR was performed on 12,5 ng
cDNA with both sense and antisense oligonucleotides in a final volume of 20 µL using SYBR
Green qPCR Master Mix (Eurogentec, Seraing, Belgium). Fluorescence was monitored and
analyzed in a GeneAmp 7500 detection system instrument (Applied Biosystems, Warrington,
- 200 -
UK). In parallel, analysis of the 18S ribosomal RNA wad performed using the ribosomal RNA
control Taqman Assay Kit (Applied Biosystems) to normalize gene expression.
Human tissues Total RNA preparations form adipose tissue and skeletal muscle samples were
performed as described previously (Ducluzeau et al 2001, Debard et al 2004). The concentrations
of Apelin and APJ mRNAs were measured by reverse transcription followed by real-time PCR
using a Light-Cycler (Roche Diagnostics, Meylan, France). First-strand cDNAs were first
synthesized from 500 ng of total RNA in the presence of 100 units of Superscript II (Invitrogen,
Eragny, France) using both random hexamers and oligo (dT) primers (Promega, Charbonnières,
France). The real-time PCR was performed in a final volume of 20 µl containing 5 µl of a 60-fold
dilution of the RT reaction medium, 15 µl of reaction buffer from the FastStart DNA Master
SYBR Green kit (Roche Diagnostics) and 10.5 pmoles of the specific forward and reverse
primers. For quantification, a standard curve was systematically generated with 6 different
amounts of cDNA. Each assay was performed in duplicate and validation of the real time PCR
runs was assessed by evaluation of the melting temperature of the products and by the slope and
error obtained with the standard curve. Hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) mRNA
level was determined in each samples and was used as internal standard for normalization of
target mRNA expression.
Statistical Analysis
Data were analyzed under R 2.8.1 (www.r-project.org) and are presented as mean ± SEM.
Depending on the experimental design log-transformed data were analyzed by one- or two-way
analysis of variance followed by a student t-test with a pooled variance estimate to compare the
groups. Data from the hyperinsulinemic clamp study were analyzed by paired student t-test. A p-
value below 5% was considered significant.
- 201 -
Results
Characteristics and metabolic parameters of the different mouse models
HF-fed and db/db mice compared to chow-fed mice at the same age were obese,
hyperinsulinemic and had higher levels of blood glucose (Fig 1). In the fed state, db/db mice had
dramatically higher blood glucose levels than HF-fed mice (6.01 ± 0.20 vs 2.12 ± 0.12 g/l
respectively). Fasted glucose levels were significantly higher in HF-fed mice, than in fasted
control mice but did not differ from refeeding and fed states (Fig 1B). In HF-fed mice, even
though insulinemia was decreased during fasting, the level was significantly higher than in fasted
control mice (Fig 1C). Db/db were more hyperinsulinemic than HF-fed mice (6.03 ± 1.16 vs 4.85
± 0.69 ng/ml respectively). Plasma leptin levels were increased in HF-fed mice and more
dramatically in db/db mice as expected (Fig 1D). Plasma apelin levels were also increased in HF-
fed mice as previously described as well as in db/db mice (Fig 1E). During GTT and ITT, HF-fed
mice presented a profile of glucose intolerance and a loss of insulin sensitivity that was less
pronounced than in db/db mice (Fig 1F and 1G). Moreover, HF-fed mice had significant impaired
glucose transport measured in vitro in isolated adipocytes and soleus muscle (Fig 1H and 1I).
This decrease was more pronounced in db/db mice. Thus HF-fed mice were clearly insulin-
resistant but less than db/db mice.
Apelin and APJ expression in AT and muscle in mice
In fed conditions, apelin but also APJ expression was increased in AT of HF-fed insulin-
resistant mice but not in AT of diabetic db/db mice compared to chow-fed mice (Fig 2). In
muscle, apelin expression was similar in control, HF-fed and decreased in diabetic mice. APJ
expression was decreased in muscle of insulin-resistant when compared to control mice. This
effect was more marked in diabetic mice (Fig 2).
During fasting/refeeding transition, apelin expression significantly increased in AT (2.8
fold) and in muscle (2.4 fold) of control mice. These effects were less pronounced in the tissues
of HF-fed mice (Fig. 3), but apelin expression increased in both tissues upon refeeding in this
model too. Regarding APJ, fasting and refeeding did not change its mRNA expression in skeletal
muscle, neither in control or in HF-fed mice. In adipose tissue APJ expression tended to be
increased upon refeeding in control mice (P= 0.09) and the effect was more significant in HF-fed
mice (P= 0.051) (Fig. 3).
- 202 -
Characteristics and metabolic parameters of the subjects.
The lean control subjects and the moderately obese type 2 diabetic patients who participated in
the study had classical metabolic characteristics (Table I). In the basal state, after an overnight
fasting, plasma concentrations of glucose, insulin, and triglycerides were higher in type 2 diabetic
patients than in control subjects. During the euglycemic hyperinsulinemic clamp, insulinemia was
maintained at similar supra-physiological concentration in both groups. Under such condition, the
stimulation by insulin of whole-body glucose utilization rate was profoundly reduced in type 2
diabetic patients, indicating a marked state of insulin-resistance. In addition, NEFA
concentrations during the clamp remained significantly higher in the type 2 diabetic patients
(Table I) indicating also lower insulin response in adipose tissue.
Apelin and APJ expression in AT and muscle in humans and regulation by insulin
In the basal state, apelin and APJ mRNA expressions were not significantly different between
control subjects and type 2 diabetic patients, both in adipose tissue and in skeletal muscle, even
though there were trends for an increased apelin expression in fat and for a decreased APJ
expression in muscle of the type 2 diabetic patients (Fig 4).
To assess the effect of insulin in vivo, tissue biopsies were taken before and at the end of the 3
hour hyperinsulinemic clamp. Hyperinsulinemia increased apelin and APJ expression in adipose
tissue of control subjects (Fig. 4). This effect of insulin on apelin and APJ mRNAs was
completely blunted in the AT of the type 2 diabetic patients. In skeletal muscle apelin appears to
be not affected by 3 hours of hyperinsulinemia, neither in control or in diabetic subjects. In
contrast APJ mRNA levels were increased during the clamp. Although the effect was modest, the
difference reached significance in the muscle of diabetic patients (Fig. 4).
To confirm the direct involvement of insulin in the observed regulation of apelin and APJ
expression in human adipose tissue, primary culture of human adipocytes were treated with
insulin in vitro. As shown if figure 5, insulin promoted a significant direct effect on apelin
expression as soon as 3h stimulation. This effect was more pronounced after 8h of treatment. APJ
expression was also increased by insulin after 3h.
- 203 -
Discussion
Insulin resistance in the major insulin-target tissues is widely recognized as a fundamental
defect that precedes the development of type 2 diabetes. As obesity is a major risk factor for
insulin resistance, adipose tissue-secreted factors (adipokines) play an important role in this
phenomenon. Adipokines have been shown to have either insulin-sensitizing effects or to be
implicated in the induction of insulin resistance (Catalan et al 2009). The regulation of apelin,
newly identified as an adipokine stimulating glucose uptake (Dray et al 2008), and of its receptor
APJ has thus been herein highlighted in AT and skeletal muscle during insulin-resistant and
diabetic states. We showed that apelin and APJ mRNA expression exhibit tissue-specific
regulation and are differently regulated between insulin-resistant and diabetic states.
Apelin and APJ expression profiles are different in AT and skeletal muscle during the
onset of type 2 diabetes. We observed that apelin expression in AT increase with insulin-
resistance before to be down-regulated in type 2 diabetes whereas, apelin expression in muscle of
control and insulin-resistant mice is similar. In diabetic mice, a decrease of apelin expression in
AT and muscle was observed compared to chow-fed mice. This suggests that in a less deleterious
state of insulin resistance (observed in HF-fed), apelin expression can be regulated specifically in
AT. However, during the fasting/refeeding transition where numerous parameters are modified, a
similar increase of apelin mRNA was observed in AT and muscle of refed HF-fed mice. One
candidate involved in the regulation of apelin could be insulin, as previously reported (Boucher
2005). However, this is consistent with the fact that insulin has not the same effect in adipose
tissue and skeletal muscle during insulin-resistance. This is supported by a recent study showing
that after 14-week of HFD in mice, adipose tissue compared to liver or muscle was more
sensitive in response to insulin regarding Akt phosphorylation (Kim et al, 2008). Moreover,
Sartipy et al (Sartipy et al, 2003) showed that in metabolically insulin-resistant adipocytes (3T3-
L1), different genes continued to respond to insulin suggesting that some signalling pathways
involved in gene transcription remain insulin sensitive (Samad et al 2000). All together, these
data suggest that insulin sensitivity of adipose tissue is preserved or higher when compared to
skeletal muscle in the model of HF-induced insulin resistance. The increased expression of apelin
in AT could contribute to the elevated plasma levels measured in HF-fed mice. In db/db mice
eventhough apelin expression is not increased in AT, the considerable amount of fat mass could
account for the high plasma apelin levels. Thus, plasma apelin levels are increased in both
insulin-resistant and diabetic states in mice. It could be hypothesized that the endogenous
circulating apelin in HF-fed mice helps to delay the onset of insulin resistance first in adipose
- 204 -
tissue as a primary target. In diabetic mice, the levels of apelin might be insufficient or inefficient
to counteract the insulin resistance. An other hypothesis could be the settlement of an apelin
resistance.
The difference between AT and muscle is even more pronounced regarding APJ
expression. In AT, APJ follows the same expression profile than apelin whereas, in muscle, APJ
mRNA levels decrease with insulin resistance and even more in type 2 diabetes. Thus, the level
of APJ expression in muscle, compared to apelin, is dependent of the degree of insulin resistance.
Down-regulation of APJ mRNA and protein levels has been described in aorta from diabetic
db/db mice (Zhong et al 2007). This study also showed that apelin treatment, despite a depressed
expression of APJ, reversed the altered aortic vascular responsiveness to angiotensin or
acethylcholine observed in db/db mice (Zhong et al 2007). We recently showed that in HF-fed
obese and insulin-resistant mice, exogenous apelin during an euglycemic-hyperinsulinemic clamp
increases glucose utilization in muscle (Dray et al 2008). Thus, the amount of APJ mRNA levels
in muscle of HF-fed mice and consequently the number of receptor is probably sufficient to
mediate apelin metabolic effects.
In humans, the literature reported essentially apelin and APJ regulation in the cardiac
muscle in different cardiovascular diseases (Chandrasekaran et al 2008) or in adipose tissue
during obesity or weight loss (Heinonen et al 2009, Castan-Laurell et al 2008). We reported here
for the first time apelin and APJ expression in parallel in skeletal muscle and AT of diabetic
subjects. There was a trend for a decreased APJ expression in muscle but not in AT of the
diabetic patients. Interestingly, insulin during the clamp is able to increase APJ expression in
muscle of control and diabetic subjects. Apelin expression in AT and muscle was not
significantly modified by insulin in diabetic subjects. Whether plasma apelin levels are increased
or decreased in patients with type 2 diabetes, is not clear due to the heterogeneity in the groups
studied and the type of control subjects chosen (Heinonen et al 2005, Li et al 2006, Tasci et al
2007, Erdem et al 2008). Nevertheless, plasma apelin levels seem to be influenced by the
different stages of the disease (obesity vs insulin resistance vs type 2 diabetes) and consequently
the positive association between apelin and insulin is not always found.
In conclusion, the down-regulation of APJ expression observed in skeletal muscle with
type 2 diabetes may have pathophysiological implications. There is a need in clinical and
specifically longitudinal studies to clarify the changes in expression of the apelin-APJ system in
order to establish whether modulation of the apelin-APJ system has therapeutic benefits in
patients with type 2 diabetes.
- 205 -
Acknowledgments
We gratefully acknowledge the animal facilities staff (service de Zootechnie) and the
phenotypage plateforme Anexplo of Toulouse from IFR150.
- 206 -
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- 209 -
- 210 -
- 211 -
- 212 -
- 213 -
- 214 -
Discussion ARTICLE III
Tous les gènes sensibles à l'insuline ne sont pas régulés de la même manière au
cours de l'insulino-résistance. Ainsi, Sartipy et ses collaborateurs ont pu monter sur les
cellules 3T3L1 qu'il existait deux types de gènes. Les gènes dont l'expression devient
résistante à l'insuline, c'est à dire qu'il ne sont plus régulés par l'insuline exogène et les
gènes qui, malgré l'insulino-résistance fonctionnelle métabolique, restent sensibles à
l'insuline (333). D'autres études ont par la suite pu montrer le même type de régulation
in vivo. En effet, chez l'obèse et le patient diabétique de type II, l'équipe de H. Vidal a
mis en évidence des différences de réponse à l'insuline de la part de gènes impliqués
dans le métabolisme énergétique (578).
Lors de ces travaux, nous avons pu observer une augmentation de l'expression
de l'apeline dans le TA de souris insulino-résistante comparble à celle observée par J.
boucher chez les souris obèses hyperinsulinémiques (542). Chez les souris diabétiques
de type II (souris db/db), l'expression de l'ARNm de l'apeline est diminuée jusqu'à
retrouver la même expression que chez les souris normopondérales. Cette observation
sur le TA viscéral entier est retrouvée sur les adipocytes isolés et les cellules de la FSV
issus du TA de ces animaux (données personnelles). Les concentrations plasmatiques
d'apeline ne suivent pas le même profil que l'expression du peptide dans le TA
puisqu'on remarque une augmentation progressive des taux sériques du peptide chez
les souris insulino-résistantes et les diabétiques. Ces résultats posent la question de la
participation du TA blanc au sein de l'apeline circulante. En effet, même si l'étude de
l'expression du messager n'est pas suffisante pour conclure, il semble néanmoins peu
probable que le TA soit la principale source d'apeline plasmatique chez la souris
diabétique. Des expériences complémentaires s'attachant à quantifier la synthèse et la
sécrétion de l'apeline au sein de ce tissu sont toutefois nécessaires. Dans ce sens,
l'élaboration de modèles murins dont le gène codant pour l'apeline a été spécifiquement
invalidé dans le TA est en cours.
Nous avons également conscience que l'utilisation de souris db/db peut constituer un
biais dans l'étude compte tenu des liens établis entre leptine et apeline par Higuchi
(556). En effet, un traitement chronique à l'apeline semble augmenter la concentration
plasmatique en leptine et on peut émettre l'hypothèse qu'en retour, la leptine soit
capable de modifier la sécrétion d'apeline. Dans cette boucle de régulation, la leptine
- 215 -
inhiberait la sécrétion d'apeline de sorte que chez la souris db/db (dépourvue de
récepteur à la leptine) l'absence de ce rétrocontrôle entraîne une augmentation de la
concentration plasmatique d'apeline. Nous avons déjà vu que la vasopressine, régulée
par l'apeline, était capable de modifier la sécrétion d'apeline au niveau des noyaux
supra-optiques (511). La leptine pourrait être un bon candidat pour jouer le même rôle
au niveau du TA.
Comparé au TA, l'absence de modification du profil d'expression de l'apeline
dans le muscle rectus femoris de souris en régime gras ou des souris db/db suggère
que la régulation observée dans le TA est spécifique de ce tissu.
Dans le but d'observer l'expression de l'apeline en réponse à des variations
plasmatiques d'insuline chez les souris insulino-résistantes, nous avons procédé à des
expériences de mise à jeun et réalimentation. L'augmentation de l'insulinémie entraîne
une augmentation de l'expression de l'apeline dans le TA des souris normopondérales
et des souris obèses et insulino-résistantes. Cette régulation, qui existe aussi dans les
muscles d'animaux sains, est perdue dans ceux des animaux en régime gras. Ces
résultats semblent confirmer la théorie selon laquelle les muscles deviennent plus
rapidement résistants à l'insuline que le TA. Ainsi, l'insuline parvient encore à réguler
l'expression adipocytaire d'apeline alors qu'elle n'est plus capable de le faire dans le
muscle.
L'insuline est un des systèmes permettant de réguler l'expression adipocytaire de
la leptine. Or, dans un contexte d'obésité et d'hyperinsulinémie, certains auteurs se sont
posés la question d'une régulation de la leptine au cours de l'insulino-résistance. Chez
la souris normopondérale, les résultats montrent qu'une mise à jeûn entraîne une
inhibition de l'expression de la leptine alors qu'une réalimentation provoque une
augmentation de l'expression de l'ARNm de la leptine. En revanche, chez la souris
obèse et insulino-résistante, cette régulation ne s'opère plus. Il semblerait donc qu'au
cours de l'insulino-résistance, l'insuline perde sa capacité à réguler l'expression de la
leptine.
Profil d'APJ au cours de l'installation du diabète
Ces travaux sont les premiers à étudier la régulation d'APJ dans le muscle stré
squelettique. Comme pour son ligand, l'expression d'APJ dans le TA est augmentée
- 216 -
chez les souris insulino-résistante diminuée et elle fortement diminuée chez les animaux
diabétiques. Ces résultats sont en accord avec ceux qui ont été obtenus au cours des
expériences de mise à jeun et de réalimentation puisque l'expression d'APJ dans le TA
est régulée positivement par l'insuline aussi bien chez les animaux normopondéraux
que chez souris insulino-résistantes.
Dans le muscle, l'expression d'APJ diminue parallèlement à la perte de sensibilité
à l'insuline des animaux. Or, au cours des expériences de variations physiologiques de
l'insulinémie, l'expression d'APJ musculaire ne semble pas contrôlée par l'insuline
soulignant une fois de plus le fait que l'insuline, au cours de l'insulino-résistance, agit
différemment entre le muscle et la TA.
En résumé, cette étude chez la souris nous a permis de mettre en évidence que:
-l'expression de l'apeline et d'APJ semblait être contrôlée par l'insuline au sein du
TA et ce malgré le développement d'une insulino-résistance fonctionnelle.
-l'expression de l'apeline dans le muscle est régulée par la mise à jeun et la
réalimentation mais cette régulation est perdue au cours de l'insulino-résistance.
Nous avons conscience que les expériences de mise à jeun et réalimentation
sont intéressantes d'un point de vue physiologique pour modifier l'insulinémie mais que
de nombreux autres paramètres varient aussi au cours de ce type d'expérience
(glycémie, triglycéridémie, leptinémie, adiponectinémie, acides gras plasmatiques…) et
rendent l'interprétation difficile. Afin de s'affranchir d'une variation de la glycémie, il
serait intéressant de pratiquer un clamp hyperinsulinémique euglycémique chez ces
différents groupes de souris et d'observer l'expression de l'apeline dans les différents
tissus.
Etude de l'expression du système apeline/APJ chez le diabétique de type II
Chez l'homme, c'est justement le clamp hyperinsulinémique euglycémique qui a
été choisi afin d'incrémenter pharmacologiquement l'insulinémie. Les résultats montrent
que l'insuline régule positivement l'expression de l'apeline et d'APJ dans le TA
d'individus sains alors que cette régulation est perdue chez le patient diabétique. Au
niveau musculaire, seule l'expression d'APJ est régulée par l'insuline.
- 217 -
Même si le nombre d'individus doit être augmenté dans chaque groupe, les
résultats obtenus au niveau du TA confirment le contrôle de l'insuline sur l'expression du
complexe apeline/APJ en situation physiologique et suggèrent que chez ces patients
diabétiques, ce tissu semble totalement insulino-résistant.
Ces travaux, qui corroborent les résultats obtenus par J. Boucher chez l'individu
sain, sont complétés par l'augmentation de l'expression de l'apeline lors du traitement
par l'insuline sur une lignée adipocytaire humaine.
L'ensemble des résultats exposés dans cette étude souligne la relation qu'il existe entre
apeline, insuline et diabète. La régulation de l'expression de l'apeline et de son
récepteur par l'insuline est complexe et elle semble dépendre du tissu et de la situation
physiologique.
- 218 -
Conclusion générale et perspectives
L'obésité est fréquemment associée à plusieurs pathologies regroupées sous le
terme de syndrôme X: insulino-résistance, hypertension, hyperlipidémie… L'insulino-
résistance est un état au cours duquel les tissus dépendants de l'insuline (foie, muscle
et TA) vont perdre progressivement leur sensibilité à l'insuline. La conséquence directe
d'un tel processus est une augmentation de la concentration plasmatique des substrats
énergétiques (lipides et glucides). Cette exposition permanente des organes à des taux
élevés de glucose et de lipides va entraîner des modifications biochimiques au niveau
de certaines cellules conduisant à aggraver le phénomène de résistance à l'insuline.
Une des phases les plus précoces de cette perte de sensibilité à l'insuline est
matérialisée par une diminution du transport de glucose dans les cellules insulino-
dépendantes. Ainsi, une élévation de la glycémie basale et post-prandiale pourra être
observée.
L'apeline est un peptide synthétisé sous la forme d'un prépropeptide de 77 acides
aminés dans différents tissus tels que le cœur, le muscle, les poumons ou encore le
système nerveux central. Les formes circulantes et biologiquement actives sont les
isotypes de 36, 17 et 13 acides aminés au sein desquelles les 13 derniers acides
aminés sont conservés entre les espèces. Comme l'apeline, son récepteur APJ a été
localisé dans de nombreux tissus. APJ est un récepteur à 7 domaines
transmembranaires couplé à une protéine de type Gi/o. Sa stimulation conduit à son
internalisation ainsi qu'à une diminution de la synthèse d'AMPc dans la cellule. In vitro, il
a été montré que la stimulation d'APJ provoquait une activation de la voie des MAPK
(ERK1 et ERK2) et de la PI3K (Akt), ainsi qu'une phosphorylation activatrice des
protéines P70S6K, FAK, PLC et PKC. Ces résultats ont suggéré une implication de
l'apeline dans la prolifération, la croissance et la migration cellulaire.
Son implication dans la régulation des fonctions cardiaques et vasculaires a pu
être démontrée depuis une dizaine d'années. Ainsi, l'apeline, en stimulant la NOS
endothéliale (eNOS), est un puissant vasodilatateur qui va agir par l'intermédiaire de la
synthèse de monoxyde d'azote. Dans le cœur, l'apeline est capable d'augmenter la
- 219 -
contraction cardiaque et sa concentration plasmatique est corrélée négativement au
développement de certaines pathologies cardiaques chez l'homme.
L'apeline et son récepteur sont aussi présents au niveau de certaines zones du
système nerveux central. Ainsi, l'équipe de C. Llorens-Cortés a mis en évidence que
l'apeline était impliquée dans la régulation des fluides corporels via son action sur la
synthèse de vasopressine. Bien que les résultats méritent d'être approfondis, l'autre rôle
central de l'apeline qui pu être montré concerne la prise alimentaire.
Chez la souris normopondérale et la souris rendue obèse et insulino-résistante
par un régime hyperlipidique, les résultats obtenus démontrent que l'apeline participe à
la régulation de l'homéostasie glucidique en agissant sur des tissus insulino-sensibles
tels que le muscle ou le TA. Le foie, qui est un tissu important dans le maintient de
l'homéostasie énergétique, ne semble pas être une cible de l'apeline. Vu l'absence de
récepteur APJ au niveau de cet organe, mais si un effet indirect est possible, ce résultat
semble cohérent. Cependant, de récents travaux ont montré que l'expression hépatique
du récepteur APJ pouvait être fortement augmentée (plus de 300 fois) au cours de
certaines pathologies comme la cirrhose hépatique (Principe et al., 2008). Ces
observations devraient nous amener à nous interroger l'effet de l'apeline sur le
métabolisme hépatique car au cours diabète de type II associé à l'obésité, des
phénomènes de stéatose hépatique ont été rapportés pouvant conduire vers une
cirrhose et une fibrose du foie (15). Ainsi, lors des stades avancés de la pathologie, APJ
pourrait être présent à la membrane plasmique des hépatocytes permettant ainsi à
l'apeline de jouer un rôle direct sur le foie. Enfin, Principe et ses collaborateurs montrent
que l'apeline est impliquée dans les processus de cirrhose et de fibrose hépatique
provoqués par un traitement au tétrachlorure de carbone (CCl4) (579). Il serait
intéressant d'étudier la participation du système apeline/APJ aux même phénomènes
observés au cours des pathologies associées à l'obésité (580).
Lors de l'étude concernant le rôle de l'apeline dans le métabolisme énergétique,
toutes les investigations ont été faites au niveau périphérique. Cependant, on ne peut
pas exclure que l'apeline puisse également médier son effet sur l'homéostasie
glucidique via une action centrale. En effet, la localisation des neurones exprimant le
récepteur APJ au niveau des noyaux arqués (NPV) et ventromédian de l'hypothalamus
- 220 -
suggère que l'apeline puisse jouer un rôle sur l'équilibre glucidique (581). L'apeline
pourrait agir comme la leptine, au niveau périphérique et central, pour réguler
l'homéostasie glucidique. En effet, plusieurs travaux ont permis de mettre en évidence
que la leptine inhibait l'activité de l'AMPK hypothalamique ce qui conduisait à une
augmentation de l'oxydation des acides gras par les tissus périphériques (581). Comme
nous l'avons vu dans l'introduction, cette meilleure oxydation des substrats lipidiques
pourra conduire à une augmentation de l'utilisation du glucose. Etant donné l'ensemble
de ces résultats, un axe de recherche est actuellement développé dans l'équipe pour
définir le rôle central de l'apeline sur l'homéostasie glucidique.
Des résultats récents mettant en évidence l'implication de la P70S6K dans le
contrôle central de la prise alimentaire et de l'homéostasie glucidique (477) pourraient
permettre de mieux appréhender le rôle central de l'apeline. En effet, Masri et ses
collaborateurs avaient montré que l'apeline provoquait une phosphorylation activatrice
de la P70S6K sur des cellules en culture (472) et nous venons de mettre en évidence
que l'apeline est capable de réguler l'activité de l'AMPK. Or, au niveau hypothalamique,
la leptine active la P70S6K et inhibe l'AMPK ce qui conduit à une diminution de la prise
alimentaire et régule le métabolisme énergétique en augmentant l'oxydation des AG
(103, 112, 477). On peut alors facilement imaginer que l'apeline possède le même mode
d'action et ainsi serait capable de diminuer la prise alimentaire comme l'avait évoqué
Sunter en 2003 (521).
L'apeline et la leptine ont beaucoup de points communs aussi bien sur le plan
fonctionnel qu'au niveau de leur régulation. Ces similitudes sont également retrouvées
sur le transport de intestinal de glucose et nous ont conduit a développer une
collaboration basée sur l'étude du rôle de l'apeline au niveau du transport de glucose
intestinal. Cette collaboration avec l'équipe de R. Ducroc à Paris a permis de montrer
que l'apeline pouvait phosphoryler l'AMPK au niveau des entérocytes de rats et de
souris conduisant à modifier le transport de glucose de la lumière intestinale vers la
circulation sanguine. Ainsi, l'apeline administrée per os aux souris juste avant une
charge orale de glucose améliore nettement la tolérance au glucose d'animaux sains ou
insulino-résistants. Ces travaux en cours constituent un nouveau domaine d'action de
l'apeline très prometteur et renforcer son rôle dans l'homéostasie glucidique.
- 221 -
Compte tenu de l'action pléïotropique de l'AMPK, les résultats que nous avons
obtenus ouvrent un champ d'investigation important pour les prochaines années. En
effet, si notre étude montre que l'apeline favorise le transport de glucose dans le muscle
via l'activation de l'AMPK, d'autres travaux doivent être entrepris afin d'établir le rôle de
l'apeline sur les autres effets métaboliques médiés par l'AMPK. Ainsi, les premières
expériences faites au laboratoire semblent indiquer que l'apeline participe également à
la régulation de l'homéostasie lipidique. La phosphorylation d'ACC par l'AMPK que nous
avons observée rend cette enzyme inactive. Par conséquent, l'ACC n'assure plus la
synthèse de malonyl-CoA, molécule précurseur des AG dans la cellule, ce qui va
entraîner une augmentation de l'oxydation des AG (acyl-CoA). Des expériences en
cours devraient nous permettre de savoir si l'apeline entraîne une augmentation de la -
oxydation des lipides dans le muscle strié squelettique et par conséquent permet de
lutter contre les phénomènes de lipotoxicité observée dans l'insulino-résistance.
A la vue des effets aigus de l'apeline que nous avons pu observer, un traitement
chronique devrait nous renseigner sur la capacité du peptide à améliorer ou à reverser
un phénotype d'insulino-résistance. Le traitement chronique à l'apeline pourrait aussi
agir sur l'expression de certains gènes diminuée au cours du diabète comme par
exemple GLUT4, HKII ou encore APJ dans le muscle. De la même façon, ce type de
traitement devrait préciser le rôle de l'apeline au niveau cardiaque. Puisque chez la
souris insulino-résistante, l'apeline améliore le transport de glucose dans le cœur, elle
pourrait ainsi restaurer l'équilibre entre l'utilisation des lipides et des glucides par cet
organe et limiter les cardiomyopathies observées chez les diabétiques de type II.
Cependant, ces perspectives soulèvent un point essentiel dans la compréhension
de l'implication de l'apeline au cours des maladies métaboliques. En effet, nous avons
vu que les taux plasmatiques d'apeline étaient augmentés chez l'animal obèse et
insulino-résistant. Chez l'homme les résultats sont plus contrastés mais semblent aller
dans le même sens.
Pourquoi l'injection d'apeline exogène entraîne-t-elle des effets sur le
métabolisme glucidique alors que l'apelinémie est élevée?
La première hypothèse à laquelle nous avons pensé était qu'il se créait une forme
de résistance à l'apeline. Comme la leptine ou l'insuline, il se pourrait que l'apeline ait
- 222 -
besoin d'augmenter sa concentration plasmatique pour produire son effet. Dans ce
sens, nous avons montré que l'expression d'APJ diminuait de façon dramatique dans le
muscle de souris diabétique. Cependant, Zhang et ses collaborateurs avaient montré
chez la souris db/db que, même si l'expression du récepteur diminuait dans les aortes
de ces animaux, l'apeline conservait la même efficacité pour induire une vasodilatation.
L'hypothèse d'une résistance à l'apeline semble donc peu probable.
En revanche, il existe un système capable de réguler de façon post-
traductionnelle l'apeline. Les enzymes ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme 2) sont
capables de dégrader l'apeline par son extrémité C-Terminale et par ce processus
semblent inactiver le peptide. Le dosage plasmatique de l'apeline qui est généralement
utilisé s'appuie sur l'identification des 12 derniers acides aminés. Ainsi, il est probable
que ce type de test ne puisse pas différencier les formes d'apeline 13 actives et celles
inactivées par l'ACE2. Ainsi, l'injection d'apeline exogène permettrait d'augmenter
significativement la quantité plasmatique d'apeline active et permettrait d'obtenir un effet
même chez la souris hyperapelinémique. Afin de vérifier ces hypothèses, il serait
nécessaire de doser par des méthodes de spectroscopie de masse les différentes
formes d'apeline présentes dans le plasma d'individus ou de souris insulino-résistants.
Si cette régulation est vérifiée, un blocage de l'activité ACE2 pourrait s'avérer
intéressant dans la lutte contre le diabète de type 2.
L'obésité est aussi caractérisée par une augmentation dramatique du
développement du TA. Ce processus est associé entre autres à des phénomènes
d'inflammation locales (infiltration macrophagique, synthèse de cytokines
inflammatoires,…) et à des dysrégulations des productions adipocytaires (AG et
adipokines). L'état inflammatoire du TA lors de l'obésité nous a amené à étudier l'effet
du TNF sur l'expression et la production de TNF . Nous avons pu mettre en évidence
que le TNF augmentait in vivo et in vitro l'expression et la sécrétion de l'apeline par
l'adipocyte humain et murin. Ces résultats impliquent que l'apeline adipocytaire puisse
jouer un rôle paracrine sur l'inflammation de bas niveau constatée dans le TA de
l'obèse. Certains travaux montrant une inflammation du TA avant l'installation de
l'obésité, on peut émettre l'hypothèse d'une participation de l'apeline dans ces
phénomènes inflammatoires. Ainsi, il serait intéressant d'étudier le rôle de l'apeline sur
- 223 -
l'inflammation du TA et son implication dans les dysrégulations de ce tissu observées au
cours de l'obésité.
L'apeline possède des propriétés angiogéniques qui pourraient être à l'origine du
développement du TA décrit au cours de l'obésité. En effet, des stratégies anti-
angiogéniques ont permis de montrer que l'angiogénèse était indispensable au
développement du TA au cours de l'obésité. Nos résultats rapportent que l'insuline et le
TNF augmentent l'expression et la sécrétion d'apeline par le TA. Or, au cours de
l'obésité conduisant vers l'insulino-résistance, il a été décrit une augmentation des taux
circulants d'insuline ainsi que de la concentration locale de TNF au niveau de TA. Ces
résultats vont dans le sens d'une forte concentration d'apeline sécrétée localement par
le TA qui par ses propriétés pro-angiogéniques pourrait participer au développement du
TA.
En prenant compte de l'ensemble de ces remarques, l'apeline doit être considérée
comme une cible thérapeutique importante dans la lutte contre le diabète de type II. La
compréhension du rôle de l'apeline au cours de l'insulino-résistance est néanmoins
nécessaire afin de savoir si cette adipokine située à l'interface de différentes pathologies
comme les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le diabète de type est
protectrice ou participe à la genèse de ces maladies. Ainsi, le développement
d'agonistes ou d'antagonistes de l'apeline pourrait s'avérer très intéressant pour lutter
contre ces pathologies associées à l'obésité.
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- 3 - Rôle et regulation de l’apeline au cours de la résistance à l’insuline associée à l’obésité. L'apeline est un peptide synthétisé retrouvé sous différentes formes de 36, 17 et 13 acides aminés. Les travaux réalisés au cours de ce doctorat ont permis de mettre en évidence la régulation et le rôle de ce peptide au cours de l‟insulino-résistance. Dans un premier temps, nous avons montré que le TNF, une cytokine d‟origine inflammatoire impliquée dans les phénomènes de résistance à l‟insuline, augmentait l‟expression et la sécrétion d‟apeline adipocytaire chez l‟homme et la souris. Une autre étude nous a permis de montrer que l‟expression de l‟apeline et de son récepteur variait au cours des différentes phases d‟installation du diabète de type II. Ainsi, chez la souris et chez l‟homme, l‟expression de l‟apeline et d‟APJ au niveau du tissu adipeux est sensible à l‟insuline au cours de l‟insulino-résistance mais cette sensibilité est perdue au cours du diabète. Dans le muscle strié squelettique, cette régulation semble moins claire. Parallèlement à la régulation, des expériences réalisées ex vivo et in vivo chez la souris ont mis en évidence que l'apeline augmentait de façon dose dépendante le transport de glucose dans les muscle et le tissu adipeux. De plus, l'étude de la signalisation induite par l'apeline dans le muscle soléaire isolé a montré une activation de l'AMPK, de la eNOS et d‟Akt. Chez des souris obèses et insulino-résistantes, nous avons pu montrer que l'apeline améliorait la tolérance au glucose (OGTT) et, comme chez la souris saine, augmentait l'utilisation de glucose dans les muscles squelettiques et le tissu adipeux. Même si des travaux supplémentaires sont indispensables, l'apeline semble se comporter comme une nouvelle hormone anti-diabétique.