de glucose

- 2 -

TTHHÈÈSSEE

En vue de l'obtention du

DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE

Délivré par l'Université Paul Sabatier Toulouse III

Discipline ou spécialité : Innovation Pharmacologique

JURY Professeur Pierre GOURDY - Président

Docteur Fabienne FOUFELLE - Rapporteur

Docteur Paul GRIMALDI - Rapporteur

Docteur Catherine POSTIC - Examinateur

Ecole doctorale Biologie Santé Biotechnologies Toulouse

Unité de recherche INSERM U858

Directeur(s) de Thèse : Dr.CASTAN-LAURELL Isabelle et Pr. VALET Philippe

Cédric DRAY

Rôle et Régulation de l'Apeline au cours de la Résistance à

l'Insuline associée à l’Obésité

Associée à l’obésité

- 3 -

Rôle et regulation de l’apeline au cours de la résistance à l’insuline

associée à l’obésité.

L'apeline est un peptide synthétisé retrouvé sous différentes formes de 36, 17 et

13 acides aminés. Les travaux réalisés au cours de ce doctorat ont permis de mettre en

évidence la régulation et le rôle de ce peptide au cours de l‟insulino-résistance.

Dans un premier temps, nous avons montré que le TNF , une cytokine d‟origine

inflammatoire impliquée dans les phénomènes de résistance à l‟insuline, augmentait

l‟expression et la sécrétion d‟apeline adipocytaire chez l‟homme et la souris. Une autre

étude nous a permis de montrer que l‟expression de l‟apeline et de son récepteur variait

au cours des différentes phases d‟installation du diabète de type II. Ainsi, chez la souris

et chez l‟homme, l‟expression de l‟apeline et d‟APJ au niveau du tissu adipeux est

sensible à l‟insuline au cours de l‟insulino-résistance mais cette sensibilité est perdue

au cours du diabète. Dans le muscle strié squelettique, cette régulation semble moins

claire.

Parallèlement à la régulation, des expériences réalisées ex vivo et in vivo chez la

souris ont mis en évidence que l'apeline augmentait de façon dose dépendante le

transport de glucose dans les muscle et le tissu adipeux. De plus, l'étude de la

signalisation induite par l'apeline dans le muscle soléaire isolé a montré une activation

de l'AMPK, de la eNOS et d‟Akt. Chez des souris obèses et insulino-résistantes, nous

avons pu montrer que l'apeline améliorait la tolérance au glucose (OGTT) et, comme

chez la souris saine, augmentait l'utilisation de glucose dans les muscles squelettiques

et le tissu adipeux.

Même si des travaux supplémentaires sont indispensables, l'apeline semble se

comporter comme une nouvelle hormone anti-diabétique.

- 4 -

Role and regulation of apelin during obesity –associated insulin-

resistance

Apeline is a peptide synthesized by adipocytes and present in plasma under

different forms such as 36, 17 and 13 aminoacids forms. During this doctoral, I have

studied the apelin regulation and role during insulin resistance and type II diabetes.

At first, we showed that TNF , an inflammatory cytokine involved in insulin

resistance, increased adipocyte apelin expression and secretion in mouse and human.

Another study allows us to show a wide-range expression of apelin and APJ during type

II diabetes development stages. In mouse and human, adipose tissue apelin and APJ

expression is insulin sensible during insulin resistance but fails to be sensible during

type II diabetes. In striated skeletal muscle, this kind of regulation is not clear and has to

be more studied.

At the same time, we also considered the metabolic role of apelin in mouse

model. Ex vivo and in vivo experiences realised in mouse highlighted that apelin

increased glucose uptake in muscle and adipose tissue. Furthermore, apelin-induced

signalling pathways studies in isolated soleus muscle showed AMPK, eNOS and Akt

activation. Interestingly, in high fat diet induced obese and insulin-resistant mice, we

showed that apelin effect was still effective to ameliorate glucose tolerance (OGTT) and,

as observed in healthy mouse, increased skeletal muscle and white adipose tissue

glucose utilization. Surprisingly, glucose utilization was also increased in hearts of

apelin-infused mice.

Even if supplemental data are necessary, apelin seems to behave as a new anti-

diabetic hormone and could be considered as a new potential target to fight metabolic

diseases.

- 5 -

PARTIE I : CONTROLE DU METABOLISME GLUCIDIQUE PAR L‟INSULINE

I. Les mécanismes “utilisateurs” de glucose …………………………p.11

1) Le transport de glucose …………………………………………………..p.12 a) SGLT1 b) GLUT

2) Utilisation et stockage du glucose ……………………………………..p.16 a) La glycolyse b) La voie des pentoses phosphate b) La glycogénogénèse c) La lipogénèse de novo

II. Les mécanismes “producteurs” de glucose ……………………...p.24

a) La glycogénolyse b) La néoglucogénèse

III. Les mécanismes moléculaires régulant le transport de glucose

1) Les voies insulino-dépendantes………………………………………..p.29 a) Le récepteur à l‟insuline1 b) Les insulin receptor substrat (IRS) c) Cascade de signalisation des PI3K d) Cascade de signalisation des MAPK

2) Les voies non insulino-dépendantes: l‟AMPK………………………...p.39 a) Généralités b) Structure et régulation c) Régulation du métabolisme énergétique d) L‟AMPK, médiateur des effets des médicaments anti-diabétique e) L‟AMPK hypothalamique et régulation de la prise alimentaire

3) Le transporteur de glucose GLUT4…………………………………….p.46 a) Régulation de l‟expression de glut4 b) Translocation de GLUT4 c) Activité intrinsèque d) Surexpression de glut4 e) Invalidation génique de glut4

- 6 -

PARTIE II : DE L‟OBESITE A LA RESISTANCE A L‟INSULINE

I. L’Obésité et le tissu adipeux (TA)

1) Définition / Mesure…………………………………………………….. 2) Epidémiologie………………………………………………………….. 3) Le tissu adipeux………………………………………………………...

a) Généralités b) Distribution anatomique du tissu adipeux c) Structure du tissu adipeux - Adipocyte - Fraction stroma-vasculaire

II. Le syndrome métabolique: focus sur la résistance à l’insuline

1) Définition ……………………………………………………………….. 2) Etiologie …………………………………………………………………

a) Etiologie b) Pathogénèse c) Mécanismes moléculaires de l‟insulino-résistance

3) Quantification de l‟insulino-résistance ………………………………

III. De l’obésité à la résistance à l’insuline

1) Modifications fonctionnelles du TA au cours de l‟obésité…………. a) Plasticité du tissu adipeux: avantage ou inconvenient? b) Inflammation du tissu adipeux c) Stress du réticulum endoplasmique d) Stress oxydant e) Flux lipidiques modifiés

2) Conséquences des modifications fonctionnelles du TA…………....

a) Distribution des depots adipeux: l‟hypothèse portale b) Accumulation ectopique de lipids dans les tissues non adipeux - Muscle squelettique - Foie - Coeur - Pancréas c) Les acides gras à l‟origine du phénomène de lipotoxicité d) Les adipokines - Généralités

p.51

p.52

p.53

p.60

p.61

p.69

p.75

p.81

- 7 -

- Les adipokines “délétères” pour la voie de signalisation de l‟insuline

- Les adipokines bénéfiques

PARTIE III : LE SYSTEME APELINE/APJ

I. Le récepteur APJ ………………………………………………………………

1) Découverte 2) Distribution tissulaire 3) Structure 4) Régulation

II. L’apeline …………………………………………………………………………..

1) Découverte 2) Structure 3) Distribution tissulaire

III. Interaction apeline/APJ ……………………………………………………

1) Caractéristiques de la liaison apeline/APJ 2) Fonctionnalité des l‟interaction apelin/APJ

IV. Rôle de l’apeline dans le système cardiovasculaire ……….

1) Tonus vasculaire 2) Système cardiaque 3) Apeline et régulation centrale du système cardiovasculaire 4) Apeline et physiopathologies cardiovasculaires 5) Apport des modèles de souris transgéniques

V. Rôle de l’apeline dans le système nerveux central ……………

1) Distribution du système apeline/APJ dans le cerveau 2) Apeline et regulation de l‟équilibre hydrique 3) Apeline et prise alimentaire

VI. Apeline et angiogénèse ……………………………………………………

1) Implication de l‟apeline dans l‟angiogénèse a) Le xénope b) Le poisson zèbre c) La souris

2) Rôle de l‟apeline sur le développement vasculaire

p.108

p.114

p.118

p.126

p.137

p.143

- 8 -

3) Système de regulation du complexe apeline/APJ au cours de l‟angiogénèse

4) Apeline et angiogénèse tumorale

VII. Apeline et tissu adipeux ………………………………………………………..

1) Régulation de l‟apeline adipocytaire

a) Hormonale b) Autres régulations

2) Apeline et troubles métaboliques 3) Implication de l‟apeline dans le métabolisme énergétique

PARTIE IV : OBJECTIFS ET TRAVAUX DE THESE

I. Objectifs ………………………………………………………………………………….

II. Etude du rôle métabolique de l’apeline …………………………………...

ARTICLE I: L’apeline augmente l’utilisation de glucose chez la souris normale et insulino-résistante ………………………………………

1) Introduction 2) Article 3) Discussion

III. Etude de la regulation de l’expression l’apeline et de son récepteur APJ au cours de l’insulino-resistance et du diabète de type II

ARTICLE II: Le TNF augmente l’expression et la sécrétion de l’apeline adipocytaire chez l’homme et la souris …………………..


ARTICLE III: Régulation de l’expression de l’apeline et d’APJ chez l’homme et la souris au cours du diabète de type II …………………….


p.151

p.159

p.161

p.162

p.181

p.192

- 9 -

PARTIE V : CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ………….

BIBLIOGRAPHIE ……………………………………………………………………………

p.218

p.224

- 10 -

Figures et Tables Fig. 1 : Le fonctionnement des transporteurs de glucose

Fig. 2 : Voie métabolique de la glycolyse

Fig. 3 : Voie métabolique de la glycogénogénèse

Fig. 4 : Mécanismes cellulaire de la lipogénèse de novo

Fig. 5 : Contrôle de la lipogénèse de novo par les facteurs de transcription SREBP et

ChREBP

Fig. 6 : Voie métabolique de la glycogènolyse

Fig. 7 : Voie métabolique de la néoglucogénèse

Fig. 8 : Structure du récepteur à l‟insuline

Fig. 9 : Cascade de signalisation de la PI3K

Fig. 10 : Voie de signalisation des MAPK

Fig. 11 : Rôles métaboliques et activation de l‟AMPK

Fig. 12 : Pathogénèse de l‟insulino-résistance

Fig. 13 : Schéma simplifié de l‟action des AG, du TNF et de l‟insuline sur la voie de

l‟insuline.

Fig. 14 : Expression du récepteur APJ

Fig. 15 : Séquence du récepteur APJ

Fig. 16 : Alignement des séquences de l‟apeline

Fig. 17 : Distribution tissulaire de l‟ARNm et du peptide de l‟apeline

Fig. 18 : Voies de signalisation de l‟apeline dans les cellules endothéliales entraînant la

vasodilatation.

Fig. 19 : Mécanismes cellulaires impliqués dans la contraction cardiaque induite par

l‟apeline.

Fig. 20 : Régulation de l‟équilibre hydrique par l‟apeline 17

Fig. 21 : Régulation de l‟expression de l‟apeline adipocytaire

Fig. 22 : L‟apeline stimule le transport de glucose dans le muscle squelettique

Table 1 . Distribution tissulaire et Km des principaux transporteurs de glucose

Table 2. Glycémies obtenues chez l‟homme au cours d‟une hyperglycémie provoquée

par voie orale.

Table 3. Agents ou facteurs pouvant réguler l‟expression d‟APJ

- 11 -

PARTIE I Contrôle du métabolisme glucidique

par l'insuline

L'organisme humain utilise en permanence des substrats énergétiques pour

maintenir ses fonctions vitales alors que la fourniture de ces substrats par l'alimentation

est périodique. La couverture des besoins énergétiques de l'homme est principalement

assurée par deux classes de nutriments: les lipides et les glucides. Cette énergie n'est

pas entièrement dépensée au moment de l'alimentation et est en partie stockée pour

être disponible en période interprandiale. Différents mécanismes sont donc mis en jeu

pour, d'une part métaboliser et oxyder, et d'autre part stocker les nutriments.

La glycémie de l'homme, qui est la quantité de glucose présente dans le sang,

doit être maintenue dans des limites assez strictes afin d'éviter les complications liées à

l'hypo- et à l'hyperglycémie. Pour cela, trois organes vont participer activement à la

régulation des taux plasmatiques de glucose: le foie, le muscle et le tissu adipeux blanc

(TA). Dans une moindre mesure, d'autres tissus vont passivement contribuer à

augmenter ou à diminuer la glycémie. C'est le cas du cerveau qui n'utilise comme

substrat que le glucose ou des reins qui sont capables de produire ce substrat

énergétique. Dans le foie, le muscle strié squelettique et le TA, les flux entrant et sortant

de glucose seront contrôlés par des régulations nerveuses et/ou hormonales. Dans les

prochains chapitres de ce manuscrit nous nous consacrerons essentiellement à l'étude

des régulations hormonales et plus précisément à l'action de l'insuline sur le contrôle du

métabolisme glucidique.

Les voies biochimiques permettant de réguler la glycémie peuvent être divisées

en trois grandes parties: le stockage, l'utilisation et la production de glucose.

Ainsi nous verrons par quels mécanismes le glucose est utilisé par les cellules

afin de produire de l'énergie (glycolyse) ou des molécules indispensables à la survie des

cellules (voie des pentoses phosphate). Nous détaillerons ensuite les processus

favorisant le stockage de glucose dans le muscle, le foie et le tissu adipeux blanc sous

l'influence de l'insuline (glycogénogénèse et lipogénèse de novo). Enfin nous

- 12 -

terminerons par la description des voies permettant la production endogène de glucose

(néoglucogénèse et glycogénolyse).

I. Les mécanismes "utilisateurs" de glucose

1) Le transport de glucose

Avant d'être utilisé, le glucose doit pénétrer dans les cellules. La bicouche lipidique des

membranes cellulaires étant imperméable à cette molécule hydrophile, son passage

vers l'intérieur de la cellule nécessite la présence de protéines de transport spécialisées

qui vont lui permettre de traverser la membrane plasmique. Les transporteurs d'hexoses

appartiennent à deux familles distinctes de protéines: les SGLT (sodium glucose co-

transporter) assurant un transport actif secondaire et les GLUT (glucose transporter)

assurant sa diffusion facilitée.

a) Les SGLT

Les SGLT co-transportent le glucose et le sodium, ce qui permet d'accumuler le glucose

dans la cellule contre un gradient de concentration. Ces transporteurs ne sont exprimés

que dans des structures cellulaires particulières: la membrane apicale des entérocytes

constituant le plateau strié de l'intestin grêle et la membrane apicale des cellules

épithéliales de la bordure en brosse du tubule proximal du rein (1, 2). De part leur

localisation, ils jouent un rôle majeur dans l'absorption intestinale et la réabsorption

tubulaire rénale du glucose.

b) Les GLUT

La famille des protéines de transport des hexoses par diffusion facilitée comporte

plusieurs isoformes dont les gènes ont été clonés chez l'homme (GLUT1 à GLUT12).

La diversité de la famille des GLUTs est importante afin de répondre aux besoins

spécifiques des différents tissus. Néanmoins, les GLUTs ont quasiment la même taille

(≈500 acides aminés) et une homologie de séquence variable (28% à 65%, surtout aux

- 13 -

domaines transmembranaires (1). Ils se présentent comme une protéine à douze

domaines transmembranaires aux extrémités N- et C-terminales intracellulaires. Entre le

sixième et septième domaine transmembranaire, on retrouve une grande boucle

hydrophile intracellulaire.

Le transfert des molécules de glucose se fait par un changement de conformation

du transporteur, exposant de façon alternative deux sites de liaison au glucose. Un

premier site fait face à l‟extérieur de la cellule (exofacial), et un second site fait plutôt

face à l‟intérieur de la cellule (endofacial). Lorsque le glucose se lie au site exofacial, le

transporteur change de conformation (voir figure). Des analyses par mutagenèse dirigée

de ces sites de liaison ont permis d‟identifier les résidus des domaines

transmembranaires qui composent distinctement le site exofacial et endofacial (4-6).

L'extrémité C-terminale est aussi importante puisque sa délétion bloque le transporteur

en conformation « face vers l‟intérieur », empêchant donc le transport (2).

Fig1. Schéma représentant la cinétique de transport du glucose par un transporteur GLUT.

GLUT1

Le gène de l'isoforme glut1 est exprimé dans pratiquement tous les tissus de

l'organisme. La protéine GLUT1 a été initialement mise en évidence dans les globules

rouges et le cerveau (cellules endothéliales des capillaires). Elle est également présente

dans certains tissus sensibles à l'insuline comme le muscle squelettique et le TA (3).

Cette isoforme est localisée essentiellement au niveau de la membrane plasmique des

cellules et en faible quantité dans une fraction microsomale intracellulaire. GLUT1, qui

présente une faible vitesse de transport du glucose (Km d'environ 2 à mM) est saturable

pour des glycémies physiologiques chez l'homme (5.5 mM). Ainsi cette isoforme assure

- 14 -

le transport basal de glucose dans la cellule et alimente le flux glycolytique nécessaire à

la survie des cellules.

GLUT2

Le gène de GLUT2 est exprimé dans le foie (membrane plasmique des hépatocytes), le

pancréas endocrine (membrane plasmique des cellules des îlots de Langherans),

dans l'intestin grêle (membrane basolatérale et apicale des entérocytes) et dans le rein

(4). C'est le transporteur qui présente la vitesse de transport la plus forte pour son

substrat (Km pour le glucose d'environ 15 à 20 mM). Le rôle de cette isoforme diffère

selon les tissus dans lesquels elle s'exprime. Dans l'hépatocyte comme dans la cellules

, l'isoforme GLUT2 agit comme un transporteur bidirectionnel (4, 5). Dans le foie, elle

est adaptée alternativement à la production ou à l'utilisation du glucose selon la situation

physiologique. Dans le pancréas, GLUT2 est le premier élément du système de

sensibilité du glucose de la cellule . Grâce à son Km élevé pour le glucose, GLUT2

permet au flux de glucose allant de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule d'être

proportionnel à l'élévation de la glycémie jusqu'à des valeurs élevées comme celles que

l'on peut rencontrer physiologiquement en période post-prandiale. Au cours de ces

périodes pendant lesquelles la glycémie peut être très élevée, GLUT2 est indispensable

au stockage hépatique du glucose comme nous le verrons au cours de l'étude de la

glycogénogénèse.

GLUT3

Le gène de l'isoforme GLUT3 a été cloné à partir d'ADN de muscle fœtal humain (6),

mais il n'est pratiquement plus exprimé dans ce tissu chez l'adulte. Sa répartition

tissulaire est ubiquiste chez l'homme alors que chez le rat, elle est plutôt restreinte au

cerveau où elle est majoritairement exprimée par les neurones. Il semblerait que dans

cet organe, il puisse exister une coopération entre GLUT1 et GLUT3 pour assurer le flux

de glucose vers les cellules (5).

- 15 -

GLUT4

Le gène de l'isoforme GLUT4 est exprimé presque exclusivement dans les tissus où le

transport de glucose est sensible à l'insuline (muscle strié squelettique, cœur, tissu

adipeux). Cependant, certains travaux ont mis en évidence que GLUT4 pouvait être

présent au niveau du tissu cérébral et qu'il n'était pas contrôlé par l'insuline (7). GLUT4

a une forte affinité pour le glucose, son Km pour cet hexose est d'environ 4-5 mM.

Comme nous allons le détailler plus loin, cette isoforme a la particularité d'être sensible

à l'insuline. Ainsi, en présence de l'hormone, la capacité des cellules à transporter le

glucose peut augmenter d'un facteur 15 à 20 grâce à la présence de GLUT4 à la

membrane plasmique (8).

GLUT5

Bien qu‟il soit aussi capable de transporter du glucose, GLUT5 est le transporteur

spécifique du fructose. Le gène de l'isoforme GLUT5 est exprimé de façon importante

dans l'intestin grêle (membrane apicale des entérocytes), les testicules et en quantité

moindre dans le rein, le muscle strié squelettique, le TA et les cellules nerveuses chez

l'homme (9). Le Km de GLUT5 pour le fructose est d'environ 6 mM. Cette isoforme

assure essentiellement le transport du fructose alimentaire dans les cellules épithéliales

de l'intestin grêle (4). Contrairement à l'isoforme GLUT4, l'insuline n'exerce aucun

contrôle sur GLUT5 (9).

D'autres protéines GLUT ont été découvertes. Ainsi, on dénombre aujourd'hui

pas moins de 12 isomères mais les formes de GLUT6 à GLUT12 n'ont été que très peu

étudiées et ne feront donc pas l'objet d'une description ici.

- 16 -

Table 1 : Distribution tissulaire et Km des principaux transporteurs de glucose.

Nom Distribution tissulaire Km

GLUT1 Ubiquiste 5-7 mM

GLUT2 Foie, rein, intestin, cellules

pancréatiques 7-20 mM

GLUT3 Cerveau 2 mM

GLUT4 Muscle squelettique, TA 5 mM

GLUT5 Jéjunum, muscle

squelettique, TA 5 mM pour le fructose

2) L'utilsation et le stockage du glucose

Après son entrée dans la cellule, le glucose sera phosphorylé par une

hexokinase donnant ainsi du glucose-6-phosphate. Cette molécule pourra alors suivre

quatre voies différentes en fonction de la demande énergétique des cellules: la

glycolyse, qui utilise le glucose circulant pour produire de l'énergie au cours de l'effort

(oxydation phosphorylantes), la voie des pentoses phosphate qui est source de

coenzymes réduits et à l'origine de la synthèse des nucléotides, la glycogénogénèse

qui permet le stockage de glucose dans le muscle et le foie sous forme de glycogène,

un polysaccharide de glucose et la lipogénèse de novo, capable de synthétiser des

acides gras (AG) à partir de glucose.

a) La glycolyse

La glycolyse (ou voie d'Embden-Meyerhof) est la voie du catabolisme oxydatif anaérobie

du glucose. Elle consiste en l'oxydation progressive d'une molécule de glucose à 6

- 17 -

carbones en deux molécules de pyruvate à 3 carbones. Grâce à cette voie, le glucose

est à la fois source d'énergie et précurseur de molécules d'intérêt biologique. En effet,

dans tous les tissus, la glycolyse à pour but de produire de l'énergie directement sous

forme d'ATP ou indirectement sous forme de NADH,H+ (qui permet ultérieurement de

produire de l'ATP au niveau de la chaîne respiratoire). La glycolyse est aussi précurseur

de molécules d'intérêt biologiques comme par exemple le glycérol-3-phosphate,

accepteur d'AG pour former les triglycérides (TG).

La glycolyse comporte dix étapes catalysées par dix enzymes cytosoliques. Cette

voie peut être divisée en trois séquences:

- Phosphorylation du glucose en fructose 1,6-bisphosphate

Cette séquence de trois réactions nécessite des ions Mg++ et de l'énergie qui est

apportée par l'hydrolyse de deux ATP en ADP. Elle consiste en la phosphorylation du

glucose en glucose-6-phosphate (G6P) qui permet de maintenir le glucose dans la

cellule. Dans la plupart des tissus, cette phosphorylation est réalisée par l'hexokinase

alors que dans le foie et le pancréas, la glucokinase, une hexokinase spécifique de ces

tissus accomplit cette fonction. L'étape suivante est l'isomérisation du G6P en fructose-

6-phosphate qui sera phosphorylé par la phosphofructo-kinase (PFK) en fructose 1,6-

bisphosphate.

- Clivage du fructose 1,6-bisphosphate en 2 trioses phosphate

L'aldolase va cliver le fructose 1,6-bisphosphate en glycéraldéhyde-3-phosphate (GA3P)

et en dihydroactéone phosphate (DHAP). Les trioses sont plus oxydables que les

hexoses, leur fonction réductrice (aldéhyde ou cétone) n'est pas masquée comme elle

l'est dans la structure cyclique des héxoses.

- L'oxydation d'un GA3P conduit au pyruvate et produit de l'énergie

La glycéraldéhyde-3-phosphate désyhdrogénase (GA3PDH) va oxyder le GA3P en 1,3-

bisphosphate-glycérate. Cette étape va permettre la réduction du NAD+ en NADH, H+

et la synthèse d'ATP. Il s'ensuivra alors une transformation du 3-phosphoglycérate en

phospo-énolpyruvate qui sous l'action de la pyruvate kinase (PK) permettra la synthèse

du pyruvate et d'une deuxième molécule d'ATP. L'oxydation d'une molécule de pyruvate

, via le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire, produira 12 ATP.

- 18 -

Fig. 2 : Voies métaboliques de la glycolyse. Le glucose entre dans la cellule par un transporteur puis il

est directement transformé en glucose-6-phosphate par une enzyme limitante qu‟est l‟hexokinase. Ce

glucose-6-phosphate va ensuite subir plusieurs transformations conduisant au pyruvate. Le pyruvate va

servir de substrat énergétique dans la cellule où, via son oxidation dans le cycle de Krebs, il pourra

donner différents métabolites énergétiques.

Fructose 1,6-bisphosphate

Fructose-6-Phosphate

Glucose-6-Phosphate

Glucose

Phosphofructokinase

Phosphoglucoisomérase

Héxokinase

Glucose

GLUT4

GA3P

1,3 bisphosphoglycérate

3 Phosphoglycérate

2 Phosphoglycérate

Phosphoénolpyruvate

Pyruvate

Aldolase

Triose phosphate

isomérase GA3P déshydrogénase

Phosphoglycérate kinase

Phosphoglycéromutase

Enolase

Pyruvate kinase

- 19 -

La glycolyse sera dépendante de la disponibilité cellulaire en glucose qui varie en

fonction de la glycémie et du transport de glucose à travers la membrane plasmique qui,

comme nous l'avons évoqué plus haut, a lieu par diffusion facilitée grâce aux

transporteurs spécifiques GLUT. Les trois réactions limitantes sont celles catalysées par

l'hexokinase, la PFK et la PK, trois enzymes soumises à la régulation allostérique ainsi

qu'au contrôle transcriptionnel effectué par l'insuline. En effet, dans le foie et le muscle,

l'hormone hypoglycémiante est capable d'induire la synthèse de ces trois enzymes

glycolytiques et ainsi favoriser l'utilisation de ce substrat.

b) La voie des pentoses phosphate

En dérivation sur la glycolyse, la voie des pentoses phosphate (encore appelée shunt

des pentoses ou des hexoses monophosphate, voie du 6-phosphogluconate ou de

Dickens-Horecker), a pour but de générer des coenzymes réduits (NADPH,H+)

nécessaires à des réactions de synthèses réductrices (synthèse des AG, du

cholesterol,…) ou à des réactions de réduction particulières. Cette voie sera aussi à

l'origine du ribose-5-phosphate indispensable à la synthèse des nucléotides puriques et

pyrimidiques.

La voie des pentoses phosphate est ubiquiste mais a lieu surtout dans le foie où

elle est plus active que celle de la glycolyse et dans le TA où la synthèse d'AG nécessite

une production accrue de NADPH,H+. Elle est également retrouvée dans d'autres tissus

tels que la glande mammaire au cours de la lactation ou au niveau des globules rouges.

Le substrat de la voie des pentoses phosphate est le G6P qui sera oxydé en 6-

phosphogluconate par la glucose-6-phosphate déshydrogénase. Le 6-

phosphogluconate sera à son tour oxydé et décarboxylé en ribulose-5-phosphate par la

6-phosphogluconate déshydrogénase. Enfin, le ribulose-5-phosphate est le substrat de

deux réactions réversibles qui vont produire du xylulose-5-phosphate (Xu5P) et du

ribose-5-phosphate (R5P) à l'origine des nucléotides puriques et pyrimidiques.

En fonction des besoins de la cellule en NADPH,H+ ou en Xu5P/R5P, on pourra

observer un "shunt" de la voie de la glycolyse vers celle des pentoses phosphate et vice

versa en cas de forte demande énergétique.

- 20 -

c) La glycogénogénèse

Polymère de glucose, le glycogène est un homopolysaccharide ramifié dont les unités

de glucose sont unies par des liaisons O-glycosidiques intra-chaîne ( 1-4) et

interchaînes ( 1-6). L'accumulation de glycogène dans le foie et les muscles est une

réponse physiologique à l'augmentation de l'apport de glucose faisant suite à un repas.

Le glycogène est donc la forme de stockage du glucose dans les cellules animales.

Fig. 3 Voies métaboliques de la glycogénogénèse. Le glucose entre dans la cellule puis il est

transformé en G6P par la glucokinase. La phosphoglucomutase va transformer le G6P en glucose-1-

phosphate qui sera greffé à un UDP afin de pouvoir transférer le glucose sur le glycogène déjà existant.

Après un repas, le glucose est absorbé par l'intestin puis il est dirigé vers le foie

par la veine porte. Les hépatocytes périportaux sont alors exposés de part leur situation

à un sang très riche en glucose. Le transfert du glucose dans les hépatocytes est réalisé

UDP-glucose

Glucose-1-phosphate

Glucose-6-Phosphate

Glucose

UDP-glucose Phosphorylase

Phosphoglucomutase

Glucokinase ou Héxokinase

Glucose

Glycogène (n+1 glucoses)

Glycogène (n glucoses)

UDP

GLUT4

Glycogène Synthase

UDP-glucose

Glucose-1-phosphate

Glucose-6-Phosphate

Glucose

UDP-glucose Phosphorylase

Phosphoglucomutase

Glucokinase ou Héxokinase

Glucose

Glycogène (n+1 glucoses)


UDP

GLUT4

Glycogène Synthase

- 21 -

par les transporteurs de glucose GLUT2, non insulino-dépendants. Compte tenu du Km

élevé de GLUT2 pour le glucose et de la différence de concentration de glucose qu'il

existe de part et d'autre de la membrane plasmique hépatocytaire, il se produira un

transfert élevé de glucose vers les hépatocytes. Dans la cellule, le glucose est

phosphorylé en glucose-6-phosphate par la glucokinase. La glucokinase hépatique a

deux caractéristiques qui la différencient des autres hexokinases. D'une part, elle

possède un Km élevé pour le glucose (12 mM) et d'autre part, elle n'est pas inhibée par

son produit: le G6P. De ce fait, le glucose extracellulaire et intracellulaire sont en quasi

équilibre même en cas d'hyperglycémie.

Dans le muscle, plusieurs études ont avancé que le contrôle principal de la

synthèse de glycogène s'exerçait au niveau du transport et de la phosphorylation du

glucose (10, 11). En effet, dans les cellules musculaires, une hexokinase (hexokinase II)

de bas Km (0.02 mM) phosphoryle le glucose en G6P et elle est inhibée par son produit

de réaction, le G6P. De plus, le transporteur de glucose insulino-dépendant GLUT4

possède un Km de 5 mM ne lui permettant pas de faire pénétrer des quantités

importantes de glucose au cours d'hyperglycémie post-prandiales. Ainsi, le glycogène

est en faible concentration dans le muscle (comparée au foie) mais compte tenu de la

proportion des muscles dans l‟organisme le glycogène musculaire représente deux tiers

du glycogène total.

Dans le foie ou les muscles, quatre réactions successives vont mener à la synthèse du

glycogène à partir du G6P.

-Le G6P est isomérisé en glucose-1-phosphate (G1P) par la

Phosphoglucomutase

-Le G1P est "activé" en UDP-glucose par l'UDP-glucose-phosphorylase en

présence d'UTP

-La glycogène synthase effectue des ajouts successifs d'unités UDP-glucose, par

des liaisons 1-4, sur une amorce de glycogène (oligosaccharide formé de 8 unités

glucose liés à une protéine, la glycogénine). L'activité de la glycogène synthase est

régulée par un système de phosphorylation/déphosporylation. Ainsi en période post

prandiale, la déphosphorylation de la glycogène synthase, catalysée par la protéine

phosphatase 1, est stimulée par l'insuline.

- 22 -

Inversement, en période de jeune, le glucagon et l'adrénaline, stimulateurs de l'adenylyl

cyclase dans le foie et les muscles, vont permettre d'activer la protéine kinase A qui à

son tour va phosphoryler et inhiber la glycogène synthase.

-L'enzyme de ramification intervient quand la chaîne linéaire compte une

vingtaine d'unités glucose. Elle transfère 5 à 8 unités glucose sur un glucose de la

chaîne en croissance, créant une ramification 1-6. Cette ramification permet à la

glycogène synthase de poursuivre son action.

d) La lipogénèse de novo

La capacité de stockage énergétique sous forme de glycogène étant limitée, les

glucides qui se trouvent en excès sont stockés sous forme lipidique dans le TA et le foie.

La lipogénèse de novo est la synthèse d'acide gras (AG) ou plus exactement

d'acyl-CoA, la forme intracellulaire activée des AG, à partir de carbones dérivés des

glucides et en particulier du glucose. La lipogénèse consiste à convertir un excès de

glucides alimentaires en lipides. Deux organes sont capables de moduler leur capacité

lipogénique en fonction des conditions nutritionnelles: le foie et le TA (12-14).

Fig. 4 Mécanismes

moléculaires impliqués dans

la lipognénèse de novo. Le

glucose est transformé en

pyruvate grâce à la glycolyse.

Le pyruvate sera alors

transformé en citrate à

l‟intérieur de la mitochondrie.

La lipogénèse permet la

synthèse d‟acide gras à chaîne

longue (AGCL) qui vont

constituer les triglycérides (TG)

intracellulaires.

- 23 -

Dans les deux tissus, le pyruvate produit à partir de la glycolyse est transformé

dans la mitochondrie en acétyl-CoA par la pyruvate déshydrogénase (PDH). L'acétyl-

CoA, après son retour dans le cytoplasme grâce à un système de "navette" (la

membrane mitochondriale est imperméable aux dérivés CoA), va être carboxylé par

l'acétyl-CoA carboxylase (ACC) en malonyl-CoA puis polymérisé pour former l'acyl-CoA

grâce à la synthase des acides gras (FAS pour Fatty Acid Synthase). Le palmitate est le

principal AG synthétisé par ce système.

La synthèse des AG est donc fonction de la disponibilité en substrats d'origine

glucidiques (qui via la glycolyse vont donner le pyruvate) et de l'activité de l'ACC qui

catalyse la réaction limitante. Comme pour la glycogénogénèse, l'insuline constitue un

régulateur majeur de la lipogénèse. Le premier niveau de régulation de l'insuline sur la

lipogénèse sera effectué via le transport de glucose insulino-sensible dans le tissu

adipeux. De plus, dans ce tissu mais aussi dans le foie, l'insuline régule l'activité de

l'ACC. Cette enzyme est déphosphorylée et activée par la protéine phosphatase-2A qui

est elle-même contrôlée par les taux d'insuline. Enfin, cette enzyme est aussi soumise à

la régulation allostérique émanant de ses produits.

A long terme, la principale régulation s'effectue au niveau transcriptionnel (15).

Ainsi, un facteur de transcription dépendant de l'insuline, SREBP-1c (Sterol Response

Element Binding Protein 1c), semble être au centre de la régulation des enzymes de la

lipogénèse telles que l'ACC et la FAS. Le rôle clé de SREBP-1c dans la lipogénèse de

novo a pu être démontré chez des souris surexprimant la forme active de ce facteur

dans le foie. Ces souris développent une stéatose hépatique massive due à l'activation

de l'expression des gènes lipogéniques (16, 17). Cependant, dans le foie des souris

invalidées pour SREBP-1c, bien que l'expression des gènes de la lipogénèse soit

diminuée de 50% (18), une activité lipogénique indépendante de SREBP-1c persiste en

réponse à l'alimentation, suggérant l'existence d'un second niveau de contrôle. La

découverte du facteur de transcription ChREBP (Carbohydrate responsive element

binding protein) par le groupe de Uyeda en 2001 a permis de mettre en évidence que la

lipogénèse de novo pouvait être également régulée par le glucose (19). Dentin et ses

collaborateurs ont pu confirmer le rôle de ChREBP dans la lipogénèse en inhibant

sélectivement l'expression de ce facteur de transcription dans des hépatocytes isolés

grâce à l'utilisation d'ARN interférent. Au cours de ces expériences, une forte

- 24 -

concentration de glucose n'est plus capable de stimuler l'expression des gènes

lipogéniques (ACC et FAS) et glycolitiques (PK) (20). Dans les adipocytes 3T3L1 en

culture, ChREBP est aussi capable d'augmenter la lipogénèse à partir de glucose grâce

à son action sur l'expression des gènes impliqués dans la génération de pyruvate et

ceux participant à la lipogénèse (21).

Fig.5 Contrôle de la lipogénèse de novo par les facteurs de transcription ChREBP et

SREBP (D’après Dentin et al., 2005). On remarque ici que SREBP et ChREBP sont deux facteurs qui

agissent en synergie pour contrôler l‟expression d‟enzymes glycolytiques ou lipogéniques. GK :

glucokinase ; G6P : glucose-6-phosphate ; L-PK : L-pyruvate kinase ; X5P : xyllulose-5-phosphate ; ACC :

acetyl-CoA carboxylase ; FAS : Fatty acyl trasnferase

II. Les mécanismes producteurs de glucose

Alors que tous les tissus et cellules de l'organisme sont capables d'utiliser le glucose,

seuls le foie, les reins et l'intestin sont capables de produire du glucose. Ceci est lié à

l'expression dans ces tissus d'une enzyme spécifique, la glucose-6-phosphatase, qui

permet l'hydrolyse du G6P en glucose. Le glucose ainsi produit peut alors être libéré

dans la circulation sanguine et dirigé vers d'autres tissus ou cellules dont l'activité

fonctionnelle est totalement (érythrocytes, rétine…) ou partiellement (cerveau)

dépendante du glucose. Une production normale de glucose est essentielle en période

- 25 -

interprandiale (jeûne nocturne) pour le maintien de la glycémie dans ses limites

physiologiques.

a) La Glycogénolyse

Nous venons de voir que seuls deux tissus sont capables de stocker le glucose sous

forme de glycogène: le foie et le muscle strié squelettique. Au cours du jeûne ou de

l'effort physique ces deux tissus ne vont pas utiliser le glycogène de la même façon. En

effet, du fait de la présence de la glucose-6-phosphatase dans le foie, ce tissu pourra

largement participer au contrôle de la glycémie (75% du glucose libéré dans la

circulation). Dans le muscle en revanche, le glucose-6-phosphate formé par la

glycogénolyse servira de substrat au muscle lui-même via la glycolyse.

La structure ramifiée du glycogène permet la libération rapide de molécules de

glucose-6-phosphate. Pour cela trois réactions sont nécessaires:

-La glycogène phosphorylase scinde les liaisons 1-4. Ainsi, elle libère

l'une après l'autres les unités glucose des extrémités des chaînes non réductrices, sous

forme de glucose-1-phosphate

-La phosphoglucomutase transforme le glucose-1-phosphate en G6P

-La glucose-6-phosphatase déphosphoryle le G6P qui ainsi peut sortir de

la cellule.

Une autre enzyme est également impliquée dans la glycogénolyse, l'amylo-1-

glucosidase, qui attaque les ponts de ramification et libère ainsi du glucose dans la

cellule qui pourra diffuser vers le compartiment sanguin.

La glycogénolyse et la glycogénogénèse ne doivent pas avoir lieu en même

temps. Cela est possible parce qu'elles empruntent des voies distinctes qui sont

régulées de façon différentes et coordonnées: selon les circonstances nutritionnelles et

métaboliques, quand une voie est accélérée, l'autre est freinée. La glycogénolyse est

contrôlée par la glycogène phosphorylase et la glycogénogénèse par la glycogène

synthase. Les deux voies sont alors soumises à une régulation réciproque:

-Les deux enzymes sont soumises à un contrôle allostérique, les mêmes

effecteurs ayant des effets contraires.

- 26 -

-Alors que l'insuline stimule l'activité de la glycogène synthase, l'absence

d'insuline et la présence de glucagon et d'adrénaline (jeûne ou exercice physique)

entraînent la phosphorylation et l'activation de la glycogène phosphorylase.

Au centre de la balance glycogénogénèse/glycogénolyse il y la protéine kinase A. Elle

participe tant à l'activation de la glycogène phosphorylase qu'à l'inactivation de la

glycogène synthase. D'autres mécanismes sont capables de contrôler la glycogénolyse.

De nombreux travaux se sont en particulier intéressés à la régulation de la production

hépatique de glucose. On sait ainsi que la quantité de glucose dans le milieu régule la

production de glucose d'hépatocytes en cultures. De plus, l'hormone de croissance, le

cortisol et les catécholamines stimulent aussi la production hépatique de glucose (22-

24).

Fig. 6 La glycogénolyse. Cette voie permet degrader les réserves de glycogène musculaire et hépatique

afin de fournir du glucose-6-phosphate comme substrat énergétique. Le glucose-6-phosphate sera

transformé en glucose par la glucose-6-phosphatase uniquement dans le foie.


Glycogène (n-1 glucoses)

Pi

Glucose-1-Phosphate

Glucose-6-Phosphate

Glucose

Glycogène

Phosphorylase

Phosphoglucomutase

Glucose-6-Phosphatase

Glucose


Glycogène (n-1 glucoses)

Pi

Glucose-1-Phosphate

Glucose-6-Phosphate

Glucose

Glycogène

Phosphorylase

Phosphoglucomutase

Glucose-6-Phosphatase

Glucose

Foie

Foie et

Muscles

- 27 -

b) La néoglucogénèse

La néoglucogénèse produit du glucose à partir de substrats non glucidiques. Ces

substrats, molécules à 3 carbones pour la majorité, sont produits par les tissus

périphériques, libérés dans le sang et captés par le foie.

-Le lactate représente 40 à 50% du flux néoglucogénique. Produit par le

métabolisme anaérobie surtout au niveau des muscles, il est oxydé en pyruvate.

-L'alanine représente 30 à 40% du flux. Libéré par la protéolyse musculaire,

l'alanine est transaminée en pyruvate. C'est l'acide aminé glucoformateur le plus

important.

-Le glycérol, libéré par la lipolyse adipocytaire, entre dans la néoglucogénèse au

niveau du triose-phosphate, le dihydroactéone phosphate.

De plus, les reins produisent du glucose à partir de la glutamine qu'ils utilisent pour leurs

besoins propres. Ce n'est qu'après plusieurs jours de jeûne que la néoglucogénèse

rénale prend de l'importance en libérant du glucose dans le sang.

Pour transformer deux molécules de pyruvate en une molécule de glucose, 12

réactions sont nécessaires: 8 sont communes avec celles de la glycolyse et 4 sont

catalysées par des enzymes irréversibles. La néoglucogénèse peut être divisée en 4

séquences qui ont lieu dans la mitochondrie, puis le cytosol et enfin dans le réticulum

endoplasmique de l'hépatocyte.

-Transformation du pyruvate en phosphoénolpyruvate:

Le pyruvate cytosolique est transporté dans la mitochondrie où il est carboxylé en

oxaloacétate par la pyruvate carboxylase mitochondriale. Cette enzyme est très active

dans le foie en période de jeûne. L'oxaloacétate doit être transporté dans le cytosol. Ne

possédant pas de transporteur, il franchit la membrane mitochondriale sous forme de

malate. Enfin, l'oxaloacétate est décarboxylé en phosphoénolpyruvate par la

phosphoénolcarboxykinase (PEPCK) cytosolique.

-Transformation du phosphoénolpyruvate en fructose 1,6-bisphosphate:

Cette étape utilise les enzymes réversibles de la glycolyse.

-Transformation du fructose 1,6-bisphosphate en G6P:

La fructose 1,6-bisphosphatase hydrolyse le fructose 1,6-bisphosphate en fructose-6-

phosphate. Celui-ci est isomérisé en glucose-6-phosphate.

- 28 -

-Transformation du G6P en glucose:

Comme nous l'avons déjà évoqué, la glucose-6-phophatase hydrolyse le G6P en

glucose uniquement dans les hépatocyte et les cellules rénales et intestinales.

AlanineLactate

Pyruvate


Fructose 1,6 bisphosphate

Glucose-6-Phosphate

Glucose

Enzymes de la glycolyse

Fructose 1,6 bisphosphatase

Glucose-6-phosphatase

Glucose

Oxaloacétate

Malate

Pyruvate

Glycérol

Dihydroacétone P

AlanineLactate

Pyruvate


Fructose 1,6 bisphosphate

Glucose-6-Phosphate

Glucose

Enzymes de la glycolyse

Fructose 1,6 bisphosphatase

Glucose-6-phosphatase

Glucose

Oxaloacétate

Malate

Pyruvate

Glycérol

Dihydroacétone P

Fig. 7 La Néoglucogénèse. En cas de besoins énergétiques, l‟organisme a la capacité de

synthétiser du glucose à partir de différents substrats comme le glycérol, le lactate et l‟alanine.

Comme, la glycolyse, la régulation de la néoglucogénèse est sous la dépendance

du rapport glucagon/insuline. Ainsi, en période post-prandiale, l'insuline, via la

stimulation de la protéine kinase B (que nous détaillerons plus loin), va activer l'AMPc-

phospodiestérase qui va hydrolyser l'AMPc et ainsi diminuer l'activité de la PKA. Cette

inhibition va entraîner une diminution de l'activité fructose 1,6-bisphosphatase ce qui

aura pour conséquence de ralentir la néoglucogénèse. A l'inverse, le glucagon et les

glucocorticoïdes stimulent la néoglucogénèse en agissant directement sur l'activité des

enzymes clés de cette voie ou indirectement en augmentant l'activité d'enzymes

- 29 -

responsables d'un apport de substrats pour la néoglucogénèse (acides aminés et

glycérol apportés par la protéolyse musculaire et la lipolyse adipocytaire).

III. Mécanismes moléculaires régulant le transport de glucose

Nous venons de voir que de nombreux processus impliqués dans le contrôle de

la glycémie impliquent une régulation du transport de glucose. Cette entrée de glucose à

longtemps été considérée comme uniquement contrôlée par l'insuline mais aujourd'hui

de nombreuses études montrent que de nouvelles voies émergent et avec elles de

nouvelles pistes possibles pour la régulation de la glycémie.

.

1) Les voies insulino-dépendantes

a) Le récepteur à l’insuline (RI)

Structure et fonction - Le gène du récepteur de l‟insuline est composé de 22 exons et

21 introns. La traduction génère le prorécepteur, qui sera par la suite scindé au niveau

d'un site de clivage (4 acides aminés : RKRR) en sous-unités α et β.

Fig. 8 Structure du récépteur à l’insuline

Un assemblage hétérotétramérique de deux sous-unités α et deux sous-unités β

(α2β2) par des ponts disulfures formera le récepteur de l‟insuline mature.

Le récepteur insulinique (RI) appartient à la superfamille des récepteurs à

tyrosine kinase (RTKs), ainsi dénommée parce que la partie intracellulaire du récepteur

comporte un domaine à activité enzymatique qui phosphoryle les tyrosines de divers

substrats intracellulaires. Il est important de noter qu‟à l‟état activé, tous les RTKs sont

des dimères et sont, en fait, activés par un mécanisme de dimérisation induit par le

Domaine de liaison

Signalisation

Domaine de liaison

Signalisation

- 30 -

ligand. La dimérisation rapproche les deux domaines tyrosine kinase, permettant la

phosphorylation d‟une kinase par l‟autre («transphosphorylation»), ce qui multiplie

l‟activité enzymatique par un facteur 30 et crée, en outre, des sites de liaison (tyrosines

phosphorylées) pour diverses molécules impliquées dans la signalisation.

A l‟état basal, la sous-unité du RI inhibe l‟activité kinase du récepteur. Cette

activité inhibitrice est mise en évidence par le retrait de cette partie extracellulaire par

digestion enzymatique ou par mutagénèse (25). La liaison de l‟insuline induit des

changements de conformation qui activent la kinase et induit une trans-phosphorylation

des sous-unités β. Cette autophosphorylation s‟effectue sur des résidus tyrosine

intracellulaires: la tyrosine 960 du domaine juxtamembranaire, les tyrosines 1316 et

1322 du domaine C-terminal et les tyrosines 1146, 1150 et 1151 du domaine de

régulation. Ces derniers sont particulièrement importants pour réguler le niveau

d‟activation de la kinase. En effet, la mutation d‟une, de deux ou de ces trois tyrosines

diminue progressivement l‟activité kinase induite par une stimulation par l‟insuline (26).

Bien que ces tyrosines peuvent aussi servir au recrutement de médiateurs de la

cascade de signalisation, ce rôle est généralement attribué à la tyrosine 960 du motif.

En effet, le motif NPXY 960 est un point d‟ancrage pour les médiateurs de la voie de

signalisation de l‟insuline qui possèdent un domaine PTB (PhophoTyrosin Binding). Pour

le prouver, deux études ont montré que la substitution de cette tyrosine par un autre

acide aminé affectait la transmission du signal sans toutefois modifier le niveau

d‟activation de la kinase, ce qui suggère bien une implication dans le recrutement des

médiateurs (27, 28). De plus, il a aussi été montré qu‟un des sites d‟autophosphorylation

(contenu dans un motif YXXM) du domaine C-terminal était reconnu par le domaine SH2

(Src-Homology-2) de certains partenaires (la sous-unité p85 de la PI3K s‟accrocherait

au récepteur activé via ce site) (29, 30), mais l‟interaction réelle in vivo est incertaine

(31). D‟un autre côté, la délétion de 82 acides aminés en C-terminal, dont les tyrosines

1316 et 1322, n‟a que peu d‟effet sur la propagation du signal aux médiateurs, mais

réduit considérablement le niveau d‟autophosphorylation (32), ce qui suggère que la

phosphorylation des tyrosines du domaine C-terminal est majoritairement impliquée

dans la régulation de l‟activité plutôt que dans le recrutement d‟effecteurs (33, 34).

- 31 -

Interaction de l’insuline avec son récépteur- Différentes approches expérimentales

ont été utilisées pour situer les surfaces impliquées dans la liaison de l‟insuline avec son

récepteur. Il apparaît que l‟insuline se comporte comme un ligand bivalent dont les deux

surfaces de liaison se lient à deux sites distincts sur les deux sous-unités α du récepteur

et, en les rapprochant, favorise l'interaction des deux domaines tyrosine kinase et leur

transphosphorylation (35, 36).

Internalisation, recyclage et dégradation des RI- Une fois que la cascade de

transduction de l‟insuline sera amorcée, le complexe récepteur/ligand va être séquestré

dans les vésicules intracellulaires de l‟appareil endosomal (37). Cette étape

d‟internalisation du complexe actif régule de plusieurs façons le signal insulinique à

transmettre (38).

-Arrêt du signal par la dégradation intracellulaire de l’insuline – Des pompes

à protons ATP-dépendantes acidifient l‟intérieur des endosomes, ce qui a pour premier

effet de dissocier le complexe récepteur/ligand. Ainsi, la diminution du pH favorise

l‟activité d‟une peptidase qui dégrade plus aisément l‟insuline à l‟approche du pH 5,0-5,5

(39).

-Régulation de la sensibilité à l’insuline par un contrôle du nombre de

récepteur à la surface – Alors que l‟insuline est dégradée, le récepteur libre sera dirigé

soit vers le compartiment lysosomal pour y être dégradé soit vers la membrane

plasmique pour permettre à un nouveau signal insulinique d‟être transmis (recyclage).

L‟exposition des cellules à une forte mais brève concentration d‟insuline induira une voie

d‟internalisation qui favorise le recyclage (40) alors que l‟exposition prolongée à

l‟insuline favorisera la dégradation du récepteur (41). L‟inhibition de l‟acidification des

endosomes aurait pour effet d‟inhiber la dissociation du complexe récepteur/insuline, et

par conséquent le recyclage du récepteur à la membrane (42). La diminution de la

signalisation observée dans de telles conditions suggère que l‟acidification et le

recyclage du récepteur ont des rôles importants dans la régulation de la signalisation de

l‟insuline (43).

- 32 -

b) Les Insulin Receptor Substrate (IRS)

Nous avons vu qu‟après la liaison de l‟insuline à son récepteur, ce dernier

s‟autophosphoryle sur de multiples sites contenant des résidus tyrosines (44). Ceci

conduit alors à l‟activation de la fonction kinase du RI qui va recruter puis phosphoryler

sur des résidus tyrosine des protéines de la famille des IRS.

A ce jour, il a pu être mis en évidence qu‟il existait quatre protéines IRS

différentes (IRS1-4) mais les formes les plus retrouvées sont les IRS1 et –2 (45). Les

IRS sont des protéines d‟ancrages (docking protein). Elles se positionnent au niveau de

la face cytoplasmique de la membrane plasmique par leur domaine PH (domaine

d‟homologie avec la pleckstrine) qui reconnaît des phospholipides membranaires. Elles

positionnent ainsi leur domaine PTB (Phosphotyrosin Binding), adjacent au domaine

PH, en face de la tyrosine 960 du RI et se fixent au récepteur. L‟extrémité carboxy-

terminale des IRS se trouve alors à proximité du domaine tyrosine kinase du récepteur.

Ceci permettra la phosphorylation de résidus tyrosines spécifiques sur les IRS. Une fois

qu‟elles sont phosphorylées, les protéines vont servir d‟intermédiaires entre le récepteur

à l‟insuline et les reste de la voie de signalisation (45). La région C-terminale de ces

protéines contient de nombreux de sites de phosphorylation. On y retrouve plus d‟une

vingtaine de résidus tyrosine potentiellement phosphorylés par le récepteur de l‟insuline

(46). Ces phosphorylations permettent le recrutement des molécules de signalisation

près du récepteur de l‟insuline activé via leurs domaines SH2 pour ainsi propager le

signal insulinique.

A l‟opposé, IRS-1 serait inhibé par la phosphorylation de certains résidus sérine

(46) et une boucle de rétroaction négative aurait à sa disposition plus de 70 résidus

sérine potentiels pour contrôler l‟ampleur du signal.

A partir de l‟activation des IRS par le récepteur à l‟insuline, deux voies principales vont

participer au transport de glucose. L‟une directement via une action sur la quantité de

transporteurs de glucose GLUT4 présents à la membrane plasmique, c‟est la voie de la

Phosphatidyl Inositol 3 Kinase (PI3K) ; l‟autre indirecte va agir sur la régulation de

l‟expression de gènes impliqués dans le métabolisme glucidique, c‟est la voie des

Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK).

- 33 -

c) La cascade de signalisation des PI3K

La PI3K, à l'origine du message- La PI3K catalyse la réaction de phosphorylation du

groupe 3‟-hydroxyl du phosphatidylinositol (PI) et de phosphoinositides. Les PI3K sont

donc des kinases « lipidiques » qui sont associées à IRS-1 et dont l‟activation va

entraîner, entre autre, le déclenchement de la voie permettant le transport de glucose

(47). Les PI3K possèdent une sous-unité catalytique de 110 kDa et une sous-unité

régulatrice de 85 kDa contenant deux domaines SH2. Il existe une multitude d‟isoformes

de sous-unités régulatrices et catalytiques et leurs associations entraînent un nombre

important de PI3K différentes.

Les domaines SH2 de la sous-unité p85 vont reconnaître les résidus tyrosine

phosphorylés des IRSs et se rendre au complexe récepteur/IRS, près de la membrane,

en transportant la sous-unité catalytique p110 (48). La liaison de p85 à p110 contrôle la

stabilité et l‟activité de p110 en exerçant sur elle une constante inhibition. Aini quand

p85 va se lier à IRS, elle sera phosphorylée sur le résidu tyrosine 688 par des kinases

de la famille Src (49) ce qui aura pour effet de suspendre cette inhibition (50, 51). La

protéine p110 se retrouve alors activée et près de la membrane (condition nécessaire à

l‟activation de l‟enzyme comme l‟a montré Egawa (52)), où elle peut phosphoryler des

phosphoinositol-4,5-biphosphate (PI4,5P2) pour générer des phosphoinositol

triphosphate (PIP3) qui sont des seconds messagers.

En réponse à une stimulation à l‟insuline, il se produit une accumulation de PIP3

à la membrane, jusqu‟à ce que les phosphatases PTEN (phosphatase and tensin

homolog deleted on chromosome ten), SHIP-2 (Src homology 2 domain containing

inositol 5‟ phosphatase-2) et SKIP (skeletal muscle and kidney-enriched inositol

phosphatase) (53) déphosphorylent les PIP3 pour donner du PIP2 (54).

Le PIP3 est un second messager activateur allostérique de la phosphoinositide-

dependant kinase 1 (PDK1). PDK1 est une sérine/thréonine kinase qui active les

protéines kinases B et C (PKB et PKC) via la phosphorylation de domaines présents sur

leur boucle d‟activation (55). Même si PDK1 est considérée comme une enzyme

limitante de la signalisation insulinique permettant le transport de glucose (56, 57),

l‟activation de cette protéine reste à démontrer in vivo puisque pour l‟instant toutes les

- 34 -

études concernant son implication dans la signalisation de l‟insuline ont été obtenues

sur des cellules en culture. L‟augmentation de l‟activité de la PDK1 médiée par l‟insuline

est semble-t-il associée à des phosphorylation sur des acides aminés sérine (58) et

tyrosine (59) même si Mora et ses collaborateurs ont pu montrer que la PDK1 pouvait

être constitutivement active (55).

En présence d‟inhibiteurs pharmacologiques de la PI3K (wortmannin et le

LY294002), la supression presque totale du transport de glucose induit par l‟insuline

dans les cellules musculaires ou adipeuses montre l‟importance de cette kinase dans le

transport de glucose insulinodépendant (60-62).

La PKB, un relais indispensable- Plusieurs études ont mis en évidence que la PKB se

trouvait en aval de la PI3K (63-65) et qu‟elle participait au transport de glucose médié

par l‟insuline (66-68). La protéine PKB est codée par le gène Akt (c‟est la raison pour

laquelle on peut retrouver la protéine sous le nom d‟Akt). Elle se compose d‟un domaine

régulateur présent à l‟extrémité NH2-terminale ainsi que d‟un domaine PH permettant

des interactions de type protéine-protéine (69). Plusieurs isoformes de la protéine PKB

ont à ce jour été mis en évidence mais les plus importantes (surtout dans le muscle)

sont la PKB codée par le gène Akt1 et la PKB codée par Akt2 (70). Les produits

issus de l‟activité de la PI3K (essentiellement les PIP3) vont permettre la translocation

de PKB à la membrane plasmique où elle sera activée par la PDK1 via la

phosphorylation de la thréonine 308 et de la serine 473 (71) et où elle pourra

s‟homodimériser pour être active (70). Récemment, un complexe enzymatique formé de

mTOR (mammalian target of rapamycin) et RICTOR (rapamycin insensitive companion

of mTOR) s‟est vu attribuer un rôle dans cette phosphorylation (72, 73).

Une fois activée, la PKB va phosphoryler d‟autres substrats comme par exemple

une protéine de 160 kDa récemment identifiée appelée AS 160 (pour Akt substrate)

(74). In vitro, cette protéine va directement réguler les flux entrant de glucose en

contrôlant la translocation à la membrane plasmique de transporteur de glucose GLUT4

de cellules adipeuses (75). AS160 est aussi exprimée dans le muscle de rat où elle est

phosphorylée en réponse à une stimulation par l‟insuline mais également en réponse à

la contraction musculaire (76).

En plus de son rôle dans le transport de glucose, la PKB est aussi impliquée

dans les effets de l‟insuline sur la synthèse de glycogène. En effet, dans le foie et le

- 35 -

muscle, la PKB va phosphoryler la glycogen synthase kinase 3 (GSK3) ce qui aura pour

conséquence d‟augmenter le stockage du glucose sous forme de glycogène dans ces

deux organes (77, 78). De plus elle est aussi capable d‟activer une phosphodiestérase

(PDE3) indispensable à l‟effet antilipolytique de l‟insuline dans l‟adipocyte (79).

En contrôlant l‟activité de certains facteurs de transcription, PKB régule aussi

l‟expression de gènes essentiels à l‟action de l‟insuline. FOXO-1 par exemple, promeut

la transcription des gènes de la gluconéogenèse dans le foie (80). PKB inhibe FOXO-1

en le phosphorylant sur sa sérine 256, ce qui le séquestre dans le cytoplasme et

prévient ainsi la transcription des gènes qui lui sont associés. La phosphorylation de

FOXO-1 par PKB réduit alors considérablement la gluconéogenèse et la production

hépatique de glucose. Dans les adipocytes, la voie insuline-PKB-FOXO-1 permettrait de

réguler la différenciation adipocytaire (81).

L‟inhibition de PKB par l‟expression d‟un dominant négatif ne bloque pas complètement

l‟effet de l‟insuline sur le transport du glucose. Ceci suggère l‟implication d‟une autre

voie de signalisation.

La PKC- L‟autre voie qui se trouve en aval de la PDK1 est celle de la PKC. Cette

protéine est un important régulateur de la croissance cellulaire, de la différenciation et

du métabolisme (82-84). La famille des PKC comprend 12 isotypes de sérine/thréonine

kinase distribuées ubiquitairement dans l‟organisme. Une classification en trois groupes

de ces PKC a pu être réalisée en fonction des propriétés enzymatiques des ces

protéines.

Il y a les PKC conventionnelles (PKCc) nommées PKC , et , les PKC

dites « nouvelles » (PKCn) appelées PKC , €, et et enfin les PKC atypique (PKCa)

comme la PKC et la PKC (85). Toutes ces PKC sont caractérisées par leur activation

lipidique mais les PKCc et les PKCn sont activées plus spécifiquement par les

diacyglycérides (DAG) (85). De plus, tous les isoformes sont dépendants de la présence

d‟une phosphatidyl serine (PS) à la face cytoplasmique de la membrane plasmique afin

de pouvoir s‟ancrer pour être activées par phosphorylation des résidus sérine/thréonine

par la PDK1 (55).

- 36 -

Les PKC peuvent réguler positivement ou négativement le signal insulinique. En effet,

les PKC et sont impliquées dans le transport de glucose musculaire médié par une

exposition aiguë des cellules à l‟insuline (86, 87) alors que les PKC et agissent

comme des régulateurs négatifs du signal en cas d‟exposition longue à l‟hormone (88).

De façon intéressante, il a pu être montré que la PKC était impliquée dans le transport

de glucose indépendamment d‟une stimulation par l‟insuline (89). En effet, nous verrons

dans les prochains chapitres que l‟AMP-activated protein kinase (AMPK) peut activer la

PKC et ainsi induire une augmentation du transport de glucose indépendamment de

l‟insuline (90).

Enfin, physiologiquement, certaines PKC conventionnelles ( et ) sont aussi

capables de se lier à IRS1 ou à RI afin de désensibiliser ces protéines via une

phosphorylation en sérine/thréonine avec pour conséquence, une suppression rapide du

signal insulinique (91, 92). Ce rétrocontrôle pourrait bien être un mécanisme impliqué

dans l‟insulino-résistance puisqu'il semblerait que chez le diabétique, l‟activation des

PKC ne soit plus régulée.

- 37 -

Fig. 9 Cascade de signalisation de l’insuline transitant par la PI3K et induisant une augmentation

du transport de glucose. La fixation de l‟insuline sur son recépteur va induire la phopsphorylation de ce

dernier sur des résidus tyrosine. Ceci va permettre à la protéine substrat du récepteur (IRS) d‟être activée

par phopshorylation sur une tyrosine. La protéine IRS phosphorylée va à son tour activer la

phosphoinositol-3-kinase (PI3K) en se liant sur sa sous unité p85. La conséquence de cette liaison sera

une levée de l‟inhibition de la sous-unité catalytique p110 qui transforme les phophoinositol-2-phosphate

(PIP2) membranaires en phopsphoinosotol-3-phosphate (PIP3) qui sont des second mesagers

intracellulaires. La liaison des PIP3 à la phosphoinositide dependant kinase 1 (PDK1) permet d‟activer les

protéines PKB/Akt et PKC responsables de la translocation des vésicules contenant Glut 4 à la membrane

plasmique.

- 38 -

d) La cascade de signalisation des MAPK

Les MAPK sont des protéines conservées au cours de l‟évolution et ubiquitaires

dans l‟organisme. Ce sont des sérine/thréonine kinases impliquées dans des processus

tels que la croissance cellulaire, la prolifération, la différenciation ou encore l‟apoptose.

Chez les mammifères, les cellules possèdent 3 voies MAPK différentes :

-la voie des Extracellular signal Regulated Kinase 1 et 2 (ERK1 et ERK2)

-la voie de la c-jun N-terminal kinase (JNK)

-la voie de la p38-MAPK

Fig. 10 Voie de signalisation des MAPK. En se fixant sur son récepteur l‟insuline va induire une série

d‟activation permettant à des protéines comme Erk, JNK et P38 d‟activer certains facteurs de

transcriptions qui réguleront l‟expression de gènes impliqués dans le métabolisme énergétique, la

croissance et la prolifération cellulaire.

- 39 -

La voie des MAPK pourra activer l‟expression de gènes via la phosphorylation de

facteurs de transcription et de kinases intermédiaires. Ainsi, les facteurs de transcription

pourront être activés par les trois voies MAPK ou par une seule. Par exemple, toutes

trois sont capables de phosphoryler Elk-1, un facteur de transcription impliqué dans la

prolifération des cellules (93, 94). Plus spécifiquement, p38-MAPK module l‟activité de

MEF2 (Myosin Enhncing Factor 2) et JNK phosphoryle c-jun, STAT3 (Signal Transducer

and Activator of Transcription 3) et le Nuclear Factor Activated T-cell (NFAT) (95).

STAT3 est impliqué dans la régulation de la gluconéogénèse hépatique alors que MEF2

et NFAT sont eux concernés par la différenciation musculaire (96). En contrôlant

l‟activité de ces différents facteurs de transcription et donc aussi l‟expression génique

que ces derniers régulent, l‟insuline pourra agir, via la voie des MAPK, sur l‟homéostasie

glucidique.

2) Le transport de glucose médié par les voies non insulino-dépendante: la

voie de l'AMPK

a) Généralités

Une protéine est apparue depuis quelques années comme un acteur clé de

l‟homéostasie énergétique insulino-indépendant, la protéine kinase activée par l‟AMP

(AMPK). L‟AMPK est très conservée au cours de l‟évolution. Ses homologues sont

SNF1 (Sucrose Non-Fermenting 1) chez la levure S. cerevisiae (97) et SnRK (SNF-1

Related Kinase) chez la plante (98). L‟AMPK est activée par différents stress induisant

une déplétion de la cellule en énergie et une augmentation du rapport AMP/ATP. C‟est

le cas par exemple de l‟hypoxie, des poisons métaboliques (inhibiteurs de la chaîne

respiratoire, de l‟ATP synthase mitochondriale, etc...), de l‟ischémie, de l‟exercice

physique ou encore d‟un déficit en glucose (99, 100). Certains agents pharmacologiques

(101, 102) ou encore certaines hormones comme l‟adiponectine et la leptine (103, 104)

activent l‟AMPK. La metformine, les thiazoledinediones (TZD) et le 5-aminoimidazole-4-

carboxamide-1-β-D-ribonucléoside (AICAR) sont des agents activateurs de l‟AMPK

(105-110) alors que le composé C ou l‟araA sont connus pour l‟inhiber (111). Une fois

activée, l‟AMPK modifie l‟activité et l‟expression de différentes protéines cibles afin de

- 40 -

rétablir l‟homéostasie énergétique cellulaire en activant les voies métaboliques

productrices d‟énergie et en inhibant les voies consommatrices. En plus de son rôle au

niveau cellulaire, des études récentes ont mis en évidence un rôle de l‟AMPK dans le

maintien de l‟homéostasie énergétique à l‟échelle de l‟organisme. En effet, en réponse à

des signaux hormonaux et nutritionnels, centraux et périphériques, l‟AMPK intervient

également dans la régulation de la prise alimentaire.

b) Structure et régulation

L‟AMPK est une sérine/thréonine kinase exprimée dans un grand nombre de

tissus. C‟est une protéine hétérotrimérique constituée d‟une sous-unité catalytique ( ) et

de deux sous-unités régulatrices (β et γ) (112). Différentes isoformes ont été mises en

évidence pour chacune de ces sous-unités, pouvant conduire à 12 possibilités

combinatoires. L‟association différentielle de ces isoformes confère à l'AMPK une

certaine spécificité tissulaire (les complexes composés de l‟isoforme γ3 sont exprimés

spécifiquement dans le muscle squelettique) et pourrait, au sein d‟un même tissu, se

traduire par des fonctionnalités différentes (113). L‟état d‟activation de l‟AMPK dépend

de la concentration intracellulaire en AMP. Cette dernière est étroitement liée à la

concentration d‟ATP et les deux varient en fonction de l‟état métabolique. Dans la

cellule, une déplétion en ATP s‟accompagne d‟une augmentation plus marquée de la

concentration en AMP. Ce système est très sensible puisqu‟une diminution de 10 % de

la concentration d‟ATP se traduit par une augmentation d‟environ 100 % de la

concentration d‟AMP. L‟AMP constitue ainsi un très bon indicateur des variations

énergétiques de la cellule.

L‟AMP est aussi capable d‟empêcher l‟interaction entre l‟AMPK et des protéines

phosphatases (PP2A et PP2C) qui vont déphosphoryler et inactiver l‟AMPK (114).

Enfin, l‟AMP active l‟AMPK de manière allostérique mais favorise également la

phosphorylation par une AMPK kinase (AMPKK) de la thréonine 172 située dans la

boucle d‟activation de la sous-unité catalytique de l‟AMPK.

Cette phosphorylation, indispensable à l‟activation de l‟AMPK, est catalysée par une

protéine serine/thréonine kinase récemment identifiée comme étant LKB1, un

suppresseur de tumeur (115, 116). LKB1 est associée à d‟autres protéines (MO25 et

- 41 -

STRAD) pour former un complexe actif (117). Dans le muscle squelettique, l‟invalidation

de LKB1 entraîne une perte de la stimulation de l‟AMPK obtenue avec l‟AICAR (118).

La phosphorylation et l‟activation de l‟AMPK a également été observée dans des

conditions n‟induisant pas de modifications du rapport AMP/ATP comme, par exemple,

lors de chocs osmotiques. Cette activation implique une autre AMPKK, la

Ca2+/calmoduline kinase kinase (CaMKK) qui phosphoryle également la sous-unité

catalytique sur la thréonine 172 (119-121).

Une troisième AMPK kinase a pu être identifiée. Il s‟agit de la Transforming

growth factor- activated kinase 1 (TAK1) qui est une sérine/thréonine kinase qui

s‟associe avec d‟autres protéines pour être active (les TABs pour TAK binding protein)

(122). Bien que tous les mécanismes ne soient pas totalement élucidés, il a été montré

que TAK1 est activée par différentes cytokines comme le TGF ou le TNF et plus

directement par des changements du ratio AMP/ATP (123).

c) Régulation du métabolisme énergétique

L‟AMPK joue un rôle important dans la régulation du métabolisme glucidique. En

effet, elle stimule le transport de glucose dans le muscle et dans l'adipocyte, en

induisant la translocation du transporteur GLUT4 à la membrane plasmique. Le

mécanisme par lequel l‟AMPK induit cette translocation est indépendant de l‟action de

l‟insuline et pourrait impliquer la synthase d'oxyde nitrique (NOS) (101, 105).

De la même manière que l‟exercice physique, l‟AMPK induit l‟expression de

protéines telles que GLUT4, l‟hexokinase II et des enzymes mitochondriales,

nécessaires à l‟utilisation des substrats glucidiques (124). L‟activation de l‟AMPK dans le

muscle pourrait donc avoir des effets bénéfiques chez les patients obèses, au même

titre que l‟exercice physique. Parallèlement à la translocation de GLUT4, dans le

muscle, l‟AMPK inhibe la glycogène synthase (99, 100) diminuant ainsi la synthèse de

glycogène et permettant à la cellule d‟orienter le glucose vers la production d‟énergie

(glycolyse). Dans le cœur, l‟AMPK stimule le transport de glucose, mais également la

glycolyse en phosphorylant et activant la 6-phosphofructokinase-2 (125, 126). Enfin

dans le foie, l‟AMPK inhibe l‟expression de la phosphoénolpyruvate carboxykinase et de

- 42 -

la glucose-6-phosphatase, deux enzymes clés de la néoglucogenèse (127).

L‟augmentation de la production hépatique de glucose étant une des conséquences

majeures de l‟insulino-résistance, l‟activation de l‟AMPK dans le foie pourrait donc

également avoir des effets bénéfiques chez les patients insulino-résistants (128).

Dans les cellules β pancréatiques, l‟AMPK pourrait réguler la production de

l‟insuline mais son mode d‟action n‟est pas encore établi et ses cibles n‟ont à ce jour pas

été identifiées avec précision. Cependant, une activation de l‟AMPK par l‟AICAR dans

les cellules β pancréatiques et sur des îlots pancréatiques de rat augmente la sécrétion

d'insuline (129).

L‟activation de l‟AMPK conduit à la phosphorylation ou à une modulation de l‟expression

d‟un nombre important de protéines cibles impliquées dans la régulation du métabolisme

gluco-lipidique (130). Elle joue aussi un rôle clé dans la régulation du métabolisme

lipidique à la fois en terme de synthèse et d‟utilisation des acides gras.

L‟activation de l‟AMPK inhibe la lipogenèse et la synthèse de cholestérol en

phosphorylant et en inhibant respectivement l‟acétyl-CoA carboxylase (ACC) (131) et la

3-hydroxy-3-méthylglutaryl- CoA réductase (132). A plus long terme, l‟AMPK inhibe la

lipogenèse dans le foie en diminuant l‟expression de gènes glycolytiques et

lipogéniques tels que la L-pyruvate kinase et la synthase des acides gras. Cet effet

inhibiteur à long terme s‟effectue via l‟inhibition de l‟expression et de l‟activité de deux

facteurs de transcription lipogéniques : ChREBP (133) et SREBP1c (102).

Un des effets majeurs de l‟AMPK dans la régulation du métabolisme lipidique et

qui pourrait jouer un rôle central dans le traitement de l‟obésité et de l‟insulinorésistance

est la stimulation de l‟oxydation des acides gras. En effet, comme nous le verrons dans

les prochains chapitres, l‟accumulation d‟acides gras dans des cellules non adipeuses

conduit à la production de dérivés métaboliques comme les acyl-CoA, le diacylglycérol

ou les céramides qui interfèrent avec la transmission du signal insulinique et induisent

une insulino-résistance. L‟inhibition de l‟ACC par l‟AMPK entraîne une diminution des

concentrations intracellulaires en malonyl-CoA, un intermédiaire de la voie lipogénique

mais également un puissant inhibiteur de la Carnitine Palmitoyl Transférase I (CPT1). La

CPT1 est l‟enzyme régulant l‟entrée des acyl-CoA à chaîne longue dans la

mitochondrie, étape limitante de la β-oxydation. En inhibant l‟ACC, l‟AMPK favorise donc

l‟entrée des acides gras dans la mitochondrie et leur oxydation. Les tissus non

lipogéniques expriment une seconde isoforme de l‟ACC (ACC2 ou ACCβ) codée par un

- 43 -

gène différent de l‟isoforme exprimée dans les tissus lipogéniques (ACC1 ou ACCα).

L‟ACC2, dans des tissus comme le muscle, agirait comme un régulateur de l‟oxydation

des acides gras via la synthèse de malonyl-CoA (134). Différentes études ont montré

que l‟AMPK était capable de phosphoryler et inhiber les deux isoformes de l‟ACC

(Hardie et al., 2003). L‟inhibition de l‟ACC par l‟AMPK pourrait donc être un moyen

efficace d‟améliorer l‟insulino-sensiblité des patients obèses et de diminuer

l‟accumulation ectopique de graisses. Il a de plus été montré que les complexes AMPK

contenant l‟isoforme γ3 (spécifiquement exprimée dans le muscle squelettique)

permettaient une oxydation préférentielle des acides gras. Une mutation spécifique de

cette sous-unité, augmentant l‟activité basale de l‟AMPK, protége le muscle de

l‟accumulation de triglycérides et de l‟insulino-résistance (130). Cela fait de cette

isoforme γ3 une cible intéressante pour prévenir l‟apparition de l‟insulino-résistance

musculaire.

Fig. 11 Rôles métaboliques et activation de l’AMPK.

L‟AMPK est un senseur métabolique. Différents stimulis sont à l‟origine de son activation comme

l‟hypoxie, l‟ischémie, l‟exercice physique ou un déficit en glucose. Des molécules endogènes (leptine,

adiponectine,…) ou exogènes (AICAR, Metformine,…) sont aussi capables de stimuler la

phosphorylation de cette protéine. L‟AMPK joue un rôle sur les phénomènes producteurs (Inhibition

de la néoglucogénèse) ou consommateurs (activation du transport de glucose et de la glycolyse) de

glucose.

- 44 -

L‟AMPK pourrait prévenir également l‟accumulation d‟acides gras dans les cellules non

adipeuses en diminuant les concentrations plasmatiques d‟acides gras libres. En effet, il

a été montré, dans le tissu adipeux blanc, que l‟activation de l‟AMPK inhibait la lipolyse

induite par les catécholamines exerçant ainsi un retro-contrôle négatif permettant de

limiter la libération des acides gras (135, 136). Dans l‟adipocyte, l‟AMPK agit en

phosphorylant et en inhibant la translocation de la LHS vers la gouttelette lipidique

(135).

d) L’AMPK, médiateur des effets métaboliques des médicaments anti-

diabétiques

Un des intérêts suscités par l‟AMPK en tant que cible dans le traitement du diabète et de

l‟obésité est venu du fait que deux classes d‟anti-diabétiques, les thiazolidinediones

(TZDs) et les biguanides exercent certains de leurs effets métaboliques en activant

l‟AMPK.

L‟administration de TZDs chez le rat insulino-résistant diminue l‟accumulation de

lipides dans la cellule β pancréatique et le cœur, et prévient le développement du

diabète et des cardiomyopathies chez ces animaux. Chez l‟homme, les TZDs améliorent

l‟insulino sensibilité (137) et diminuent l‟accumulation lipidique dans le foie (138). Les

effets bénéfiques des TZDs ont largement été attribués à leur action sur le facteur de

transcription PPARγ, permettant d‟induire la différenciation adipocytaire et donc de

stimuler la capacité du tissu adipeux à stocker les acides gras. Cependant, des effets à

court terme des TZDs, indépendants de la voie PPARγ et de modifications d‟expression

génique, ont été rapportés notamment dans le muscle squelettique de patients obèses

et diabétiques. Un traitement aigu par les TZDs de cellules musculaires de patients

diabétiques stimule le transport de glucose par un mécanisme indépendant de la voie de

signalisation insulinique (139).

La metformine appartient à la famille des biguanides, également utilisée dans le

traitement du diabète de type 2. Par ses effets hypoglycémiant et hypolipémiant, elle

permet chez les patients diabétiques de rétablir l‟homéostasie glucido-lipidique et

- 45 -

d‟améliorer leur sensibilité à l‟insuline. Dans le foie et le muscle de rat, la metformine

exerce certains de ses effets en activant l‟AMPK, ce qui conduit à l‟inhibition de la

néoglucogenèse, à la stimulation de l‟oxydation des acides gras dans le foie et à

l‟augmentation du transport de glucose dans le muscle (102). Une activation de l‟AMPK

a été observée dans le muscle de patients diabétiques traités à la metformine (140) et

une étude réalisée dans une lignée cellulaire hépatocytaire humaine rendue insulino-

résistante a montré que la metformine, en activant l‟AMPK, diminuait les concentrations

intracellulaires en acides gras (141).

Bien que l‟activation de l‟AMPK par les TZDs et les biguanides ne soit pas le seul

mécanisme impliqué, il semble qu‟elle joue un rôle important dans la médiation de leurs

effets sur la sensibilisation des tissus à l‟insuline. Le mécanisme par lequel ces deux

classes d‟anti-diabétiques activent l‟AMPK n‟est pas clairement établi, mais pourrait

impliquer une inhibition de la chaîne respiratoire induisant une augmentation du rapport

AMP/ATP (112).

e) AMPK hypothalamique et régulation de la prise alimentaire

L‟hypothalamus est la principale région du système nerveux central impliquée

dans la régulation de l‟homéostasie énergétique et de la prise alimentaire. L‟intégration

des signaux neuroendocrines et métaboliques par les neurones hypothalamiques

permet à l‟organisme de s‟adapter aux changements d‟apport et de dépense

énergétique.

Une balance énergétique négative (au cours du jeûne) induit au niveau de

l‟hypothalamus la mise en place de signaux conduisant à une stimulation de la prise

alimentaire.

Différentes études ont montré simultanément que l‟activation de l‟AMPK dans

l‟hypothalamus augmentait la prise alimentaire et le poids corporel chez le rongeur et

qu‟à l‟inverse, son inhibition diminuait la prise alimentaire et le poids des animaux (103,

142, 143). L‟activation de l‟AMPK induit une augmentation de l‟expression des peptides

oréxigènes et, à l‟inverse, l‟inhibition de l‟AMPK hypothalamique diminue leur

expression, conduisant à une inhibition de la prise alimentaire. Différents signaux

connus pour moduler la prise alimentaire induisent des variations d‟activité de l‟AMPK.

Le jeûne active l‟AMPK dans l‟hypothalamus alors que la réalimentation ainsi qu‟une

- 46 -

hyperglycémie ou une hyperinsulinémie inhibent son activité. Certains signaux

orexigènes (e.g. la ghréline, l‟AGRP et les endocannabinoïdes) activent l‟AMPK et des

signaux anorexigènes, tels que la leptine ou les agonistes des récepteurs de type 4 à la

mélanocortine (MC4R), inhibent l‟activité AMPK hypothalamique.

De manière intéressante, on observe une régulation différentielle de l‟activité AMPK

hypothalamique et périphérique en réponse à certains signaux physiologiques. C‟est le

cas de la leptine qui stimule l‟activité AMPK dans le muscle squelettique et qui, à

l‟inverse, l‟inhibe dans l‟hypothalamus. Il existe donc vraisemblablement différents

mécanismes de régulation, qui à l‟heure actuelle n‟ont pas encore été identifiés.

3) Le transporteur de glucose GLUT4

a) Régulation de l’expression de GLUT4

La quantité de GLUT4 à la surface d‟une cellule va contrôler l‟entrée de glucose

dans les tissus insulino-dépendants. Ainsi, le contrôle de son expression peut être

considéré comme un mécanisme important de la régulation de l‟homéostasie du

glucose.

En 1989, cinq groupes de recherche indépendants rapportent le clonage de

l‟ADN complémentaire de GLUT4 (1). La quantité de GLUT4 (ARNm) diminue dans le

tissu adipeux et les muscles glycolytiques lorsque l‟insulinémie est maintenue basse par

une période de jeûne ou un traitement à la streptozotocine qui va inhiber la production

d‟insuline (144). Afin de dissocier l'effet d'une diminution de l'insulinémie et celui d'une

augmentation de la glycémie, Burcelin et ses collaborateurs ont montré que la

normalisation de la glycémie par une infusion physiologique d‟insuline permettait de

récupérer une expression normale du transporteur dans le tissu adipeux ce qui suggère

que c‟est bien l‟insulinopénie, et non l‟hyperglycémie qui est responsable des effets

observés (145). Par contre, l‟utilisation de la phlorizine (analogue du glucose qui permet

l‟excrétion de glucose par le rein) qui conduit à une diminution de la glycémie a mené à

une conclusion inverse dans le muscle squelettique (146, 147). En accord avec ces

études, Klip et ses collaborateurs ont concluent que l‟hyperglycémie diminue

l‟expression de GLUT4 dans le muscle squelettique, mais pas dans le tissu adipeux

- 47 -

(148). Etrangement, il n‟y a pas d‟élément de réponse génique sensible au glucose

connu sur le gène de GLUT4, ni de GLUT1. Par contre, la génération de souris

transgéniques exprimant un gène rapporteur sous la gouverne de différents fragments

du promoteur de GLUT4 a permis de bien identifier une région sensible à l‟insuline

(149).

b) La translocation de GLUT4

Avant même d‟avoir identifié et cloné GLUT4, on savait que l‟insuline provoquait la

redistribution intracellulaire d‟un « système » de transport du glucose (150, 151). GLUT4

se démarque des autres GLUTs par cette particularité qu‟il a d‟être hautement régulé

par l‟insuline. Fortement et spécifiquement exprimé dans le muscle et le tissu adipeux, il

en fait les deux plus grands consommateurs de glucose post-prandial, au moment où

l‟insulinémie est la plus élevée. L‟insuline réussit à augmenter le transport du glucose

dans les cellules qui contiennent GLUT4 en augmentant l‟activité intrinsèque de ce

transporteur, mais surtout par l‟entremise de cette redistribution cellulaire vers la surface

membranaire qu‟on appelle la translocation. Contrairement à GLUT1 (65%

d‟homologie), GLUT4 est essentiellement intracellulaire à l‟état basal, dissimulé dans

des compartiments intracellulaires en attente du signal insulinique. Ce n‟est qu‟une fois

à la membrane qu‟il peut aider le glucose à la traverser.

En condition basale, GLUT4 circule lentement entre les membranes internes

(endosomes et appareil de Golgi) et la membrane plasmatique. Il se retrouve aussi dans

un compartiment plus statique, les vésicules d‟entreposage de GLUT4, qui peuvent se

mêler aux endosomes ou aller directement à la membrane plasmique lorsque l‟insuline

stimule le processus de translocation. La stimulation par l‟insuline, via les voies de

signalisation PI3K produit une augmentation de l‟exocytose de GLUT4 accompagné

d‟une réduction de son endocytose (152). Le résultat est une augmentation nette de la

quantité de transporteurs à la membrane cellulaire de deux à huit fois dans muscle

squelettique ou dans l'adipocyte (153).

Fusion des membranes- La translocation des vésicules enrichies en GLUT4 vers la

membrane plasmique n‟est efficace pour augmenter le transport du glucose que si elles

s‟attachent, s‟amarrent et fusionnent avec cette membrane. Les protéines qui

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permettent l‟interaction entre les membranes en jeu sont appelées les SNAREs (SNAP

receptors). On place d‟un côté les t-SNARES (présents sur la membrane cellulaire ( t

arget)), membres de la famille des syntaxines, et de l‟autre, les v-SNAREs (pour

vésicules), membres de la famille des VAMPs. Les cellules expriment un grand nombre

de SNAREs. Dans le cas de la translocation des vésicules enrichies en GLUT4 stimulée

par l‟insuline, la syntaxine-4 est le seul t-SNARE impliqué et VAMP2 (synaptobrevin 2)

est le principal v-SNARE. SNAP23 (SNAP25 dans les adipocytes), Munc18c349-351 et

Synip352 y sont des partenaires (154).

c) L’activité intrinsèque

Il est relativement fréquent de voir dans la littérature des exemples où l‟augmentation du

transport du glucose diffère de l‟augmentation de la quantité de GLUT4 à la membrane

cellulaire (153). L‟utilisation de myocytes L6-GLUT4myc a permis d‟observer un

décalage entre la translocation de GLUT4 et le transport du glucose, suggérant que la

translocation n‟est pas le seul mécanisme nécessaire à l‟augmentation du transport du

glucose. De plus, la translocation et le transport du glucose diffèrent aussi quant à leur

sensibilité à l‟inhibiteur de la PI3K, la wortmannin (155). Pour expliquer ces

discordances, plusieurs études soutiennent que l‟insuline a aussi la capacité

d‟augmenter l‟activité intrinsèque de GLUT4.

L‟insuline induit la phosphorylation et l‟activation de la p38 MAPK. L‟expression

d‟un mutant inactif ou l‟inhibition de cette kinase avec des inhibiteurs spécifiques

inhibent à plus de 60% le transport du glucose, sans toutefois affecter la translocation

(156, 157). Ces résultats supportent donc l‟idée d‟une régulation de l‟activité intrinsèque

du transporteur, où p38 MAPK aurait un rôle crucial. Cependant, le mécanisme par

lequel p38 MAPK régule l‟activité de GLUT4 n‟est pas encore connu (153).

d) Surexpression de GLUT4

La surexpression de GLUT4 dans le tissu adipeux de souris entraîne une augmentation

de l‟adiposité (stockage du glucose dans les adipocytes sous forme de TG) qui

provoque une amélioration de la tolérance au glucose et en une meilleure utilisation du

- 49 -

glucose stimulé par l‟insuline (10, 158-161). La surexpression de GLUT4 ciblée aux

muscles a aussi permis d‟améliorer la sensibilité à l‟insuline sans induire d‟obésité (162).

e) Invalidation génétique de GLUT4

Les souris invalidées pour GLUT4 sont environ 20% plus petites que leurs

semblables, elles ont une espérance de vie raccourcie, une forte réduction de la masse

adipeuse et un coeur plus gros exprimant davantage de GLUT1 (163). De façon

surprenante, elles ont une glycémie normale, et elles répondent normalement au test de

tolérance au glucose. On observe tout de même une augmentation de l‟insulinémie

postprandiale, et une certaine résistance à l‟insuline décelée par un test de tolérance à

l‟insuline. On pense que la compensation par d‟autres GLUTs ou une captation plus

grande du glucose par le foie (via GLUT2) expliquerait ce phénotype plus modéré qu‟on

l‟aurait prédit (163-165). Ce qui reste plus difficile à expliquer, c‟est le phénotype des

souris hétérozygotes qui semblent plus atteintes (166). En effet, elles sont

hyperinsulinémiques, hyperglycémiques et montrent des symptômes histopathologiques

d‟un diabète de type 2 au niveau du coeur et du foie. La restauration de GLUT4

uniquement dans le muscle (162) suffit à rééquilibrer le métabolisme du glucose, ce qui

appuie bien l‟importance de ce tissu dans le développement de la résistance à l‟insuline.

Les souris invalidées pour GLUT4 spécifiquement dans le muscle squelettique et

cardiaque (165) montrent aussi une augmentation de GLUT1 dans un coeur plus gros.

Par contre, contrairement aux souris complètement invalidées, le poids n‟est pas

affecté, ni la masse adipeuse et les souris ont une espérance de vie normale. Elles sont

hyperglycémiques et intolérantes au glucose tandis que certaines développent un

diabète. Le transport du glucose stimulé par l‟insuline est sévèrement réduit dans le

muscle, mais aussi dans le tissu adipeux. La suppression de la production hépatique de

glucose par l‟insuline est aussi affectée (167).

Enfin, l‟invalidation de GLUT4 limitée aux tissus adipeux, blanc et brun, n‟affecte

ni la masse adipeuse, ni la taille du coeur. Par contre, même si le tissu adipeux

représente normalement moins de 10% du transport du glucose de tout l‟organisme, ces

souris sont résistantes à l‟insuline, intolérantes au glucose et certaines développent un

- 50 -

diabète (168). Un clamp hyperinsulinémique euglycémique a montré une réduction de

50% du transport du glucose total. In vivo, le transport du glucose dans le tissu adipeux

est atténué, tout comme dans le muscle squelettique, ainsi que la suppression de la

production hépatique de glucose. Cependant, dans le muscle ex vivo, les niveaux de

transport du glucose redeviennent normaux, suggérant que l‟inhibition du transport du

glucose dans le muscle est secondaire à l‟environnement « in vivo ». Pourtant, les

facteurs habituellement sécrétés par le tissu adipeux pouvant modifier la sensibilité à

l'insuline, que sont les acides gras libres, la leptine, le TNF- (Tumor Necrosis Factor-

), la résistine et l‟adiponectine ont des niveaux sanguins tout à fait normaux (169, 170).

De plus, aucun dépôt inhabituel de TG dans le muscle ni le foie n‟a été observé.

- 51 -

PARTIE II De l'Obésité à la Résistance à

l'Insuline...

I. L’Obésité et le tissu adipeux

1) Définition et mesure de l'obésité

L'obésité est reconnue comme maladie chronique en 1997 par l'OMS. Cette

organisation définit « le surpoids et l'obésité comme une accumulation anormale ou

excessive de graisse corporelle qui peut nuire à la santé ». Cette prise de poids

indésirable résulte le plus souvent d‟un excès d‟apport et/ou d‟une diminution des

dépenses énergétiques (171).

Le principal indicateur de mesure utilisé est l'indice de masse corporelle (IMC).

Pour les adultes, l'indice de masse corporelle est égal à la masse (exprimée en

kilogrammes) divisée par le carré de la taille de la personne (en mètre) :

IMC =

* Un IMC entre 18,5 et 25 est considéré comme normal chez un adulte.

* Entre 25 à 30, on parle de surpoids (surcharge pondérale).

* Au-delà de 30, on parle d'obésité.

* De 35 à 40, on parle d'obésité sévère et, au-delà de 40, d'obésité morbide.

Les limites de ce type de mesure résident dans le fait que l'IMC se base

principalement sur une population de type européenne et surtout qu‟il ne tient pas

compte de la répartition des graisses dans l‟organisme qui, comme nous allons le voir

dans les prochains chapitres, peut être la cause de certaines pathologies associées à

l‟obésité.

On peut aussi déterminer l'adiposité d'un individu en mesurant simplement le tour

de taille ou en calculant le ratio tour de taille/tour de hanches (172-174). Ici aussi, la

Masse

Taille 2

- 52 -

mesure ne permet pas de caractériser avec précision la localisation des dépôts adipeux

mais renseigne plutôt sur un développement anormal du tissu adipeux.

Autre alternative à l‟IMC: l'indice de masse graisseuse, qui lui ne tient pas compte

de la taille et du poids mais simplement du taux de graisse et de muscle contenu dans le

corps de l'individu. Cette mesure fine de l‟obésité via la quantification des dépôts

adipeux peut se faire par tomodensitométrie (CT-scan) ou par imagerie à résonance

magnétique (IRM). Un taux normal de graisse se situe entre 17 et 22 %. Ces méthodes

non invasives, basées sur l‟utilisation des rayons X, permettent de localiser et de

quantifier précisément le tissu adipeux au sein de l‟organisme (175).

2) Epidémiologie

Au plan mondial, l’International Obesity Task Force estime à 1,1 milliard le

nombre d‟adultes en surpoids et à près de 312 millions le nombre d‟adultes obèses. En

Europe, depuis les années 80, la prévalence de l‟obésité a été multipliée par trois,

même dans les pays traditionnellement caractérisés par des taux peu élevés de

surcharge pondérale et d‟obésité. Selon un rapport récent de l‟OMS, l‟obésité en Europe

serait à l‟origine d‟un million de décès par an.

Si aucune mesure n‟est prise et si la prévalence de l‟obésité continue à progresser au

même rythme, on estime que l‟Europe comptera 150 millions d‟adultes (20% de la

population) et 15 millions d‟enfants et d‟adolescents obèses (10% de la population) d‟ici

2010.

3) Le tissu adipeux

a) Généralités

Il existe deux types de TA chez la plupart des mammifères (176): le tissu adipeux

blanc et le tissu adipeux brun. Le plus abondant chez l‟homme est le tissu adipeux blanc

(TA). Le TA blanc est le « lieu » de stockage de l‟énergie par excellence mais qu‟il est

depuis quelques années aussi considéré comme un organe endocrine à part entière

pouvant participer à la régulation de différents processus physiologique et pathologiques

(177).

- 53 -

Le tissu adipeux brun (TA brun) est peu présent chez l‟homme adulte alors qu‟il

est essentiel chez le rongeur. Le principal rôle de ce tissu est de maintenir une

température constante chez le petit animal grâce au phénomène de thermogénèse.

Jusqu'à récemment, il était admis que le TA brun humain était présent et actif

uniquement chez le nouveau-né. Cependant, des études de tomodensitométrie ont

permis d'identifier que ce tissu était aussi retrouvé chez certains adultes (10% de la

population) au niveau cervical, supraclaviculaire, paravertébral, médiastinal, para-

aortique et suprarénal. Cette nouvelle cartographie du TA brun a même permis

d'envisager un rôle de ce tissu dans la régulation de la balance énergétique (178). De

plus en plus d'intérêt est porté à ce tissu depuis que de nouvelles propriétés le

rapprochant du tissu musculaire ont été démontrées chez l'adulte. En effet, le TA brun

semble être assez proche du muscle squelettique: ces deux tissus utilisent la

phosphorylation oxydative pour consommer de l'énergie, ils possèdent de nombreuses

mitochondries et sont capables de faire la thermogénèse adaptative pour produire de la

chaleur. Récemment, une étude faite par Seale et ses collaborateurs (179) a montré

que le TA brun et le muscle possédaient une cellule progénitrice commune exprimant le

facteur de transcription Myf5 que l'on ne retrouve pas dans le TAB. Dans cette étude,

les auteurs montrent également que le régulateur transcriptionnel PRDM16 permet

d'orienter ce progéniteur commun vers un phénotype d'adipocyte brun alors que son

invalidation conduit à une augmentation de l'expression de gènes caractéristiques du

phénotype musculaire. Réciproquement, la surexpression de PRDM16 dans des

myoblastes en culture induit une adipogénèse (179). D'autres études sont actuellement

en cours pour mieux caractériser l'importance métabolique de ce tissu et déterminer

quels sont les différents acteurs impliqués dans la détermination phénotypique

conduisant à l'adipocyte brun.

b) Distribution anatomique des TA

Chez l‟homme normopondéral, le TA blanc est divisé en deux types de tissus possédant

des caractéristiques propres : le TA blanc sous cutané (TASC) et le tissu adipeux blanc

viscéral (TAV) .

- 54 -

Comme son nom l‟indique, le TASC est une couche de gras localisée entre les

muscles et la peau mais aussi entre les fascias musculaires. D‟un point de vue

anatomique, ce tissu représente 80% du TA de l‟organisme d‟un individu sain et il est

localisé au niveau du tronc, de la zone glutéo-fémorale, de la poitrine mais aussi au

niveau de la face.

Le TAV est un tissu profond qui va entourer les viscères. Ainsi, ce TA interne sera

surtout retrouvé au niveau péritonéal (ommental, mésentérique), retropéritonéal

(periaortique, perirénal,…) mais également intrapelvien (gonadique et urogenital). De

plus, comme décrit sur la figure 1, un deuxième type de TA -profond mais non-viscéral-

pourra être localisé au niveau péri- ou intra-musculaire ainsi qu‟au niveau du cœur. Ce

troisième type de dépôt adipeux a été peu étudié jusqu‟à présent mais de plus en plus

de travaux récents montrent aujourd‟hui l‟implication de ce TA dans la genèse de

certaines pathologies associées à l‟obésité.

Le TA de l‟homme sain ou obèse possède des caractéristiques propres à sa

localisation anatomique qui sont influencées par l‟age et le sexe de l‟individu. Le

dimorphisme sexuel observé lors de différentes études a permis d‟introduire les termes

de distribution androïde ou gynoïde de la masse grasse. Chez la femme possédant un

poids normal, le TASC est surtout localisé au niveau de la zone glutéo-fémorale ainsi

qu‟au niveau de la poitrine. Chez l‟homme normopondéral, les dépôts adipeux

superficiels se retrouvent au niveau de la nuque, d‟une zone allant des muscles

deltoïdes aux triceps ainsi qu‟au niveau de la région lombaire. En revanche, chez les

deux sexes (plus marqué chez les hommes), le TAV se retrouve surtout au niveau de

l‟omentum, du mésentère et de la zone rétropéritonéale.

Chez le rongeur, et plus précisément chez la souris qui est le modèle animal que

j‟ai utilisé au cours de ces travaux de thèse, le tissu adipeux blanc peut être également

divisé en sous-cutané et interne (ou viscéral). Le tissu adipeux sous cutané est surtout

localisé au niveau inguinal entre le péritoine et la peau ainsi qu‟au niveau des pattes

postérieures alors que le TA viscéral est essentiellement concentré autour des gonades

(TA périgonadique) et des reins (TA périrénal). (180).

- 55 -

c) Structure du TA

Le TA présente une grande hétérogénéité cellulaire. Les cellules de ce tissu

peuvent être séparées en deux grandes populations: les adipocytes matures et la

fraction non-adipocytaire ou fraction stroma-vasculaire (FSV).

L'adipocyte

L'adipocyte est la principale cellule qui compose le TA, elle est ronde,

volumineuse (diamètre allant d'une vingtaine de micromètres à plus d'une centaine pour

les plus grosses) et possède un cytoplasme réduit du fait de la présence de la vacuole

lipidique. Cette vacuole, qui occupe l'essentiel de la cellule, contient les réserves

énergétiques stockées sous formes de TG. Comme nous l'avons déjà vu, la lipogénèse

et la lipolyse sont les deux grands mécanismes permettant à l'adipocyte de stocker ou

de libérer le contenu énergétique de la vacuole.

La FSV contient des préadipocytes, des cellules endothéliales, des cellules

hématopoïétiques (macrophages, lymphocytes,…), des cellules précurseurs ainsi que

des cellules nerveuses. Martin Rodbell, en 1964, est le premier à proposer une méthode

permettant de séparer les adipocytes matures des cellules de la FSV basée sur une

digestion à la collagénase (181). Aujourd‟hui l‟approche utilisée pour définir les

différentes cellules composant le TA se base sur des analyses en cytométrie en flux

permettant de caractériser à l‟aide de marqueurs membranaires les populations

cellulaires de la FSV fraîchement isolée. Trois marqueurs principaux sont utilisés :

-CD34 ou Mucosialine est exprimé à la surface des cellules souches

hématopoïétiques, des cellules endothéliales progénitrices et des cellules endothéliales

des capillaires sanguins

-CD31 ou PECAM (platelet endothelial cell adhesion molecule) est fortement

exprimé à la surface des cellules endothéliales de tout type et de manière plus diffuse

sur les cellules de la lignée monocytaire et les plaquettes

-CD14 ou récepteur aux lipopolysaccharides (LPS) est exprimé à la surface des

cellules de la lignée monocytaire.

- 56 -

L‟utilisation combinée d‟anticorps dirigés contre ces trois marqueurs couplés à

des fluorochromes différents, permet, en combinaison avec les données obtenues sur la

taille et la granularité des cellules, d‟identifier au sein de la FSV, des populations

cellulaires distinctes. En parallèle, une approche originale d„immuno-sélection de ces

populations cellulaires en utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps

reconnaissant ces trois marqueurs de surface à été développée (182)

Ainsi on distingue :

- les cellules CD34+/CD31+ : cellules endothéliales capillaires

- les cellules CD14+/ CD31+ : macrophages

- les cellules CD34+/ CD31- : cellules progénitrices.

Le préadipocyte

L‟augmentation du nombre d‟adipocytes qui peut être observée au sein du TA est

due à la différenciation d‟une cellule présente dans la FSV et nommée préadipocyte .Le

pré-adipocyte est un type cellulaire relativement immature qui peut se différencier en

adipocyte. En 2005, Sengenes et ses collaborateurs ont mis en évidence que les

cellules CD34+/CD31- présentaient la capacité de se différencier en adipocytes

lorsqu‟elles sont cultivées en milieu adipogénique. Elles expriment alors des gènes

adipocytaires (LPL, LHS, aP2 et FAS) et développent progressivement les activités

métaboliques adipocytaires que sont la lipolyse et la lipogénèse (182). Cependant ces

cellules sont bipotentes car elles peuvent aussi se différencier en cellules endothéliales

lorsqu‟elles sont cultivées dans un milieu de diiférenciation approprié pour ce type

cellulaire.

Les cellules endothéliales

La microcirculation- Le rôle de l‟endothélium dans le développement du TA est

reconnu depuis longtemps. Cependant peu d‟études concernent cette composante du

TA par le fait que ce tissu est généralement considéré comme peu vascularisé. Cette

faible vascularisation apparente est en fait due à la taille élevée des adipocytes. En

effet, le jeûne chez l‟animal qui s‟accompagne d‟une diminution de la taille des

- 57 -

adipocytes, permet de mettre en évidence un réseau capillaire important autour de

chaque adipocyte. Ainsi quand on prend en compte le « volume maigre » de l‟adipocyte

et la surface capillaire, le réseau vasculaire dans le TA blanc est aussi élevé que celui

du muscle squelettique.

Rôle dans la formation du TA- Au niveau du développement du TA embryonnaire, les

analyses histologiques montrent une relation étroite entre le développement des

vaisseaux sanguins et celui des adipocytes (183). Récemment, les études réalisées par

Neels (184), utilisant l‟implantation sous-cutanée de cellules de la lignées

préadipocytaire 3T3F442A chez la souris, ont clairement associé l‟apparition des

marqueurs de l‟adipogénèse à ceux des marqueurs endothéliaux. Ces observations ont

été complétées par les travaux de Fukumura montrant que des préadipocytes

transfectés par une forme dominante négative de PPAR empêchant l‟adipogénèse,

inhibe l‟angiogénèse au site d‟implantation. En parallèle, l‟inhibition de l‟angiogénèse par

un anticorps neutralisant anti-VEGFR2 inhibe l‟adipogénèse (185).

En résumé, adipogénèse et angiogénèse sont deux phénomènes étroitement liés

et complémentaires au sein du TA. Dans ce sens, des études réalisées sur les lignées

murines de préadipocytes (3T3L1 et 3T3F442A) suggèrent que l‟hypoxie est un

inhibiteur puissant de l‟adipogénèse (186-188).

Rôle dans le développement du TA- Les analyses en cytométrie en flux montrent que

le pourcentage des cellules endothéliales des capillaires sanguins est proportionnel à

l‟augmentation du volume du TA (189). La dépendance du TA vis à vis de son réseau

vasculaire a été mise en évidence par des traitements de souris par des facteurs anti-

angiogéniques (190). L‟apoptose des cellules endothéliales induite par ces traitements

conduit à une prévention, mais également à une réversion, du développement du TA.

L‟endothélium joue donc un rôle déterminant dans la croissance, mais également dans

le maintient de la masse grasse.

Les cellules inflammatoires

La présence de cellules inflammatoires au sein de la FSV du TA humain est

reconnue depuis longtemps. Cependant, des observations récentes suggèrent une

- 58 -

implication de cette population dans la genèse de l‟état inflammatoire et des pathologies

associées à l‟obésité.

Deux populations cellulaires sont distinguables: les lymphocytes et les macrophages.

Les lymphocytes présents dans le TA sont de la famille des Natural Killer (NK).

Le rôle des lymphocytes du TA n‟est pas connu et est en cours de caractérisation.

Les macrophages sont des cellules résidentes dans la majorité des tissus de

l‟organisme. L‟origine des macrophages du TA n‟est pas clairement définie. De part les

similitudes d‟expression génique entre adipocyte et macrophage et l‟observation de

l‟activité de phagocytose que présentent les préadipocytes, il a été suggéré que les

macrophages puissent provenir de la différenciation de préadipocytes (191). Cependant,

il n‟a pu être mis en évidence de formation de colonies monocytaires à partir de

préadipocytes humains (182). Des expériences de transplantation de moelle osseuse

chez la souris démontrent que la majorité des macrophages du TA sont originaires de

cellules dérivant de la moelle osseuse et suggèrent donc que les macrophages du TA

sont originaires de l‟infiltration de monocytes sanguins circulants (192). Nous verrons

dans les prochains chapitres que le TA est un grand producteur de chimiokines (MCP-1

et IL8) qui pourraient participer à l‟attraction des monocytes circulants.

Les macrophages résidents dans les tissus peuvent être considérés comme les

« surveillants » de l‟intégrité tissulaire. Il s‟adaptent à leur micro-environnement en

acquérant des phénotypes et des fonctions spécifiques au tissu dans lequel ils résident

(193). En condition normale, la fonction majeure des macrophages résidents est

d‟éliminer le matériel étranger au tissu et les cellules apoptotiques, processus essentiel

dans le maintien de l‟homéostasie tissulaire. Le rôle des macrophages dans le TA n‟est

pas clairement établi mais des effets locaux et systémiques peuvent être envisagés. En

effet, les macrophages et leurs produits modulent la fonction de sécrétion, le

métabolisme lipidique et la différenciation adipocytaire (194)). Deux populations de

macrophages semblent co-exister dans le TA au cours du développement de l‟obésité.

Une première population appelée M1 présentant un phénotype « pro-inflammatoire » et

une deuxième population M2 présentant un phénotype « anti-inflammatoire » (195). Les

M1 pourraient jouer un rôle dans la mise en place de la résistance à l‟insuline associée

à l‟obésité via la sécrétion de certaines cytokines inflammatoires (195, 196).

- 59 -

A contrario les M2 joueraient un rôle bénéfique et permettraient, via l‟activation du

récepteur nucléaire PPAR de l‟adipocyte, de maintenir la sensibilité à l‟insuline du TA

(197). Le mécanisme expliquant la transition entre les populations M2 et M1 reste à

déterminer. Un travail récent montre que chez la souris, la mise en régime gras pourrait

favoriser l‟expansion de la population M1 (195).

Cependant, ce résultat obtenu chez la souris n‟est pas vérifié chez l‟homme

puisque Bourlier et ses collaborateurs ont pu montrer que le développement du TA

s‟accompagne d‟une augmentation du nombre de macrophages anti-inflammatoires. Les

auteurs expliquent ces différences par le fait que chez la souris, la mise en régime gras

sur une longue période entraîne le développement d‟une insulino-résistance du TA alors

que dans l‟étude de Bourlier, les sujets étudiés étaient des femmes en surpoids mais ne

présentant aucune défaut de sensibilité à l‟insuline. Il semblerait donc que la transition

macrophagique entre les population M2 et M1, observée chez la souris en régime gras,

soit plus directement causée par l‟insulino-résistance du TA et l‟impact du régime gras

plutôt que par l‟expansion du TA. Même si le rôle des macrophages du TA reste encore

flou, quelques pistes ont été évoquées concernant la capacité des sécrétions

macrophagiques à participer au développement du TA. Ainsi, les produits relargués par

le macrophage du TA participeraient à l‟angiogénèse du tissu ainsi qu‟a son expansion,

via la sécrétion de protéines responsables du remodelage de la matrice extra-cellulaire

(198). Cependant, même si de nombreuses études restent à mener pour comprendre

notamment la dynamique entre les populations M1 et M2, le rôle le plus couramment

décrit pour les macrophages du TA est celui d‟un médiateur de l‟inflammation entraînant

une perte de la sensibilité à l‟insuline du TA.

Les Cellules Nerveuses

Le TA est principalement innervé par des fibres ortho- et para-sympathiques

(199). Les fibres noradrénergiques sont étroitement associées au réseau vasculaire et

aux adipocytes. Le neurotransmetteur impliqué dans les messages nerveux du TA est la

noradrénaline, qui se lie aux différents sous-types de récepteurs adrénergiques

(récepteurs 1, 2, et 2 adrénergiques) régulant, en autres, la lipolyse. Ces fibres

- 60 -

nerveuses semblent aussi pouvoir moduler les processus de prolifération et de

différenciation des pré-adipocytes et ainsi réguler l‟évolution de la masse grasse (199,

200).

II. Le syndrome métabolique: focus sur la résistance à l'insuline

1) Définitions

Un ensemble d‟anomalies métaboliques incluant un défaut d'action de l‟insuline, une

glycémie élevée, une dyslipidémie ainsi que des complications cardio-vasculaires ont

tout d‟abord été définies par Reaven en 1988 sous le nom de syndrome métabolique

(SM) (201). Une définition du SM incluant aussi la présence d‟une obésité viscérale a

ensuite été développée par l‟Organisation Mondiale de la Santé dans les années 2000.

Plus récemment, l‟International Diabetes Association (IDA) à proposé de revoir cette

définition et l‟a modifié par une « triade » où l‟augmentation du périmètre abdominal

(supérieur à 94 cm pour les hommes et 80 cm pour les femmes) est un prérequis

associé à 2 facteurs parmi ceux-ci :

- Pression artérielle supérieure à 130/85 mmHg

- Une quantité de triglycérides supérieure à 150 mg/dl*

- Un taux de HDL-Cholestérol inférieur à 40 mg/dl pour les hommes

et 50 mg/dl pour les femmes.*

- Une glycémie supérieure à 5.5 mmol/L.*

*: valeurs à jeun

Quelle que soit la définition privilégiée, toutes s‟accordent à dire que le SM est

caractérisé par une obésité et une résistance à l„insuline (202). Après avoir définit la

physiopathologie de l'insulino-résistance, nous nous attacherons à décrire les liens qui

existent entre l'obésité et cette pathologie.

La résistance à l'insuline est un état pathologique dans lequel les tissus cibles de

l'insuline (foie, TA et muscle squelettique) ne répondent pas correctement à cett

hormone. On sera donc en présence d'une production hépatique de glucose non

contrôlée et d'une utilisation de glucose par les tissus périphériques altérée en réponse

à l'insuline.

- 61 -

2) Etiologie et pathogenèse

L‟insulino-résistance est l‟état qui précède le diabète de type II (DT2). Le DT2 est

l‟affection métabolique la plus répandue dans le monde. Sa prévalence s‟accroît de

manière exponentielle et, selon les prévisions de l‟OMS, plus de 300 millions d‟individus

seront diabétiques en 2025. Contrairement au diabète de type 1 (maladie génétique

auto-immune dirigée contre les cellules du pancréas), le DT2 est une maladie complexe

s‟inscrivant généralement dans le cadre plus large du syndrome métabolique. Son

étiologie est déterminée par l'interaction de facteurs génétiques et environnementaux.

a) Etiologie

Facteurs génétiques- La contribution génétique à l‟étiologie du diabète de type 2 est

très importante comme en témoigne le taux élevé (60-90%) de concordance chez les

jumeaux homozygotes et la prévalence familiale de cette maladie (203). On estime que

le risque de développer un diabète est d'environ 30 % si l'on a un parent diabétique et

approche les 70 % si les 2 parents sont diabétiques. Une histoire familiale de diabète

constitue donc un facteur de risque majeur de développer la maladie. Néanmoins, étant

donné la prévalence élevée du DT2 dans la population générale, il est fort probable que

les gènes de susceptibilité soient très nombreux, ce qui les rend difficiles à identifier. La

majorité des experts s‟accordent pour penser qu‟il s‟agit très vraisemblablement d‟une

affection polygénique (nécessitant la présence conjointe de plusieurs gènes anormaux

pour s‟exprimer) et multigénique (pouvant résulter de différentes combinaisons

d‟anomalies génétiques), ce qui cadre bien avec l‟hétérogénéité phénotypique de la

maladie. L'étude de la génétique du DT2 est particulièrement délicate en raison des

caractéristiques propres à cette affection. En effet, celle-ci apparaît à un âge tardif, elle

est souvent méconnue, son phénotype est mal défini et, enfin, elle est fortement

influencée par des facteurs environnementaux. L‟examen d'un grand nombre de gènes

candidats participant à la régulation de la sécrétion d'insuline (GLUT2, glucokinase...) ou

de son action (récepteur à l'insuline, GLUT4, IRS-1, glycogène synthase...) a conduit à

découvrir quelques formes de diabètes monogéniques (les MODYs), mais aucun gène

- 62 -

attendu intervenant de façon significative dans la forme commune de DT2 n‟a pu être

identifié par cette technique. Le screening du génome entier à la recherche de loci liés

au phénotype diabétique a permis de localiser plusieurs régions du génome présentant

une liaison probable avec le DT2. Dans ce type d‟étude, le problème est que

l‟association entre un locus donné et la susceptibilité au diabète varie d‟un groupe

ethnique à l‟autre. Jusqu‟à présent, le seul gène de susceptibilité pour le diabète de type

2 ayant été identifié par cette technique est celui codant pour la calpaine 10, une

protéase qui semble significativement associée au diabète dans plusieurs populations

(204), mais dont le rôle dans l‟homéostasie glycémique nécessite encore d‟être clarifié.

Facteurs environnementaux- L‟obésité, surtout quand la masse grasse est très

développée dans la région abdominale, est le principal et le plus puissant facteur

prédisposant au DT2 (205, 206). Près de 80 % des individus souffrant de diabète de

type II ont un excès pondéral et, dans la quasi totalité des populations, il existe une

relation étroite entre la prévalence du diabète et celle de l'obésité. La moitié des sujets

présentant une obésité morbide (indice de masse corporelle ou IMC > 40 kg/m2)

finissent par devenir diabétiques. Pourtant, seule une fraction des sujets obèses

finissent par devenir diabétiques car, dans la plupart des cas, le pancréas est capable

de faire face à cette sollicitation accrue par expansion de sa masse ß cellulaire et, peut-

être également, par augmentation de l‟expression d‟enzymes impliquées dans la

machinerie insulinosécrétoire du à une lipotoxicité moins imporatnte (1). L‟existence

d‟une telle adaptation pancréatique, évoquée dès 1981 par Bergman (207), a été

largement confirmée par des études ultérieures qui ont démontré la relation entre la

sensibilité à l‟insuline et la sécrétion précoce d‟insuline (208-210).

L‟analyse globale des résultats de la NHS ("Nuse Health Study") a abouti à la

conclusion que 90% des cas de diabète de type 2 pouvaient être attribués à des

facteurs environnementaux (principalement à l‟excès pondéral) (205, 206).

Interaction entre les facteurs génétiques et l’environnement- L'interaction entre

facteurs génétiques et environnementaux dans la genèse du DT2 est illustrée par

l'augmentation de la prévalence de la maladie dans certains groupes ethniques définis

- 63 -

suite à une modification de leur style de vie. C'est le cas, notamment, des indiens Pimas

chez lesquels la prévalence de l‟obésité et du DT2 est une des plus élevées au monde.

Ces indiens d'Arizona ont connu au début du siècle des périodes de famine ayant

décimé une grande partie de leur population. Les survivants vivent maintenant dans des

réserves où ils ont accès à une alimentation occidentale riche en calories. Selon la

théorie du «génotype économe», l'histoire de l'humanité, en général, et celle des indiens

Pimas en particulier, a conduit à la sélection naturelle de gènes favorables à la survie de

l'espèce dans des conditions de privation alimentaire qui ont prévalu pendant des

siècles. Les individus ayant survécu posséderaient des caractéristiques métaboliques

leur permettant de stocker l'énergie plus efficacement et, de ce fait, de mieux résister à

la famine. Malheureusement, ces mêmes gènes deviennent un handicap en période

d'abondance, favorisant les maladies de pléthore (211). Une des toutes premières

études épidémiologiques, réalisée chez les indiens Pimas, a montré que l‟incidence du

diabète augmentait avec le degré d‟obésité, en pente douce s‟ils étaient issus de

parents non diabétiques, mais de façon nettement plus abrupte si l‟un ou les deux

parents étaient diabétiques. Le fait d‟avoir hérité d‟une susceptibilité génétique multiplie

par 6 l‟incidence du diabète chez les individus dont l‟IMC dépasse 35 kg/m2, mais ne

l‟augmente pratiquement pas chez ceux qui arrivent à conserver un IMC < 20-25 kg/m2

(212). Les facteurs génétiques et environnementaux ne sont donc pas simplement

additifs, mais synergiques.

b) Pathogénèse de l’insulino-résistance

La grande majorité des patients diabétiques de type II présentent une résistance

plus ou moins sévère à l'action de l'insuline. Cette résistance s'exerce au niveau des 3

principaux tissus cibles de l‟hormone : le foie, le muscle squelettique et le tissu adipeux.

En pratique, elle se manifeste par une augmentation de la production hépatique de

glucose (principalement à partir de la néoglucogenèse), une diminution des capacités de

captation musculaire de glucose et une lipolyse exagérée avec élévation du taux

d'acides gras libres plasmatiques. Un grand nombre d‟anomalies biochimiques que nous

allons décrire, affectant différentes étapes de l‟action de l‟insuline, ont été démontrées

dans le DT2, tant in vivo qu‟in vitro, mais on s‟est progressivement rendu compte que,

dans la grande majorité des cas, il s‟agissait d‟anomalies acquises, secondaires aux

- 64 -

perturbations de l‟environnement métabolique et non primaires, causales de la maladie.

Au moyen de la spectroscopie RMN permettant d‟étudier les voies métaboliques in vivo,

l‟équipe de Shulman a élégamment démontré qu‟au niveau du muscle, le transport du

glucose vers l‟intérieur des cellules, c‟est à dire la toute première étape de l‟utilisation du

glucose, était déjà profondément diminuée chez des sujets avec une tolérance au

glucose normale nés de parents diabétiques de type 2 (213). La présence de cette

anomalie avant l‟apparition du diabète permettait donc de penser que le défaut de

transport était bien un déficit primaire. Rappelons cependant que la quantité de

protéines assurant le transport de glucose (GLUT4) est tout à fait normale chez les

patients diabétiques et leurs descendants (214). Plus loin nous verrons qu‟à l‟heure

actuelle, on pense plutôt que cette anomalie de transport serait secondaire au contenu

anormalement élevé en triglycérides intra-musculaires.

Cette anomalie du transport de glucose musculaire a été attribuée à une

dysfonction du métabolisme mitochondrial, via une oxydation incomplète des acides

gras, qui provoquerait une accumulation de métabolites néfastes pour la voie de

l'insuline dans les myocytes (215). Le même mécanisme est d‟ailleurs évoqué pour

expliquer l‟insulinorésistance du sujet âgé (216).

Plusieurs études ont démontré que 40 à 60 % de la sensibilité à l‟insuline étaient

génétiquement déterminés (217-219), tandis que le degré d‟obésité, le morphotype et

l‟aptitude physique rendent compte, pour leur part, d‟environ 35% de la variabilité

interindividuelle. Un point intéressant, confirmé par toutes les études de cohortes, est

que l‟obésité atténue cette variabilité de l‟action de l‟insuline et qu‟au delà d‟un IMC de

30-35 kg/m2, pratiquement tous les individus développent un certain degré

d‟insulinorésistance.

- 65 -

Fig. 12 Schéma simplifié de la pathogénèse de l’insulino-résistance.

L‟insulino-résistance se manifeste par une incapacité de l‟insuline à inhiber la production hépatique de

glucose par le foie (néoglucogénèse hépatique). Cette incapacité pourrait être provoquée par un afflux

d‟acides gras trop important provenant de l‟alimentation ou d‟une lipolyse accrue de la part du TA qui

présente aussi une perte progressve de l‟insulino-sensibilité. Parallèlement au développement de

l‟insulino-résistance hépatique, les muscles vont voir leur capacité à stocker, et donc à utiliser le glucose,

diminuer. L‟ensemble des ces évènements va conduire à une augmentation de la glycémie suivie d‟une

synthèse d‟insuline plus élevée qui va compenser l‟insulino-résistance dans les premiers stades de la

maladie. Progressivement, l‟hyperinsulinémie ne va plus contrecarrer l‟effet de l‟insulino-résistance, on

sera donc en présence d‟une hyperinsulinémie associée à une hyperglycémie caractéristique du diabète

de type 2.

Lorsque la résistance à l‟insuline s‟installe, le métabolisme du glucose est

fortement perturbé. Comme on le sait, le muscle capte près de 80% du glucose sanguin

post-prandial. Au cours de la résistance à l‟insuline, des défauts de signalisation mènent

à une réduction marquée du transport du glucose dans ce tissu (220) qui s‟explique par

- 66 -

une diminution de la translocation de GLUT4 (214, 221). Certaines études montrent

aussi une diminution de l‟expression de ce transporteur (214, 222), mais ce n'est pas

toujours le cas (223).

Les fonctions hépatiques sont aussi altérées. Par exemple, l‟augmentation de la

glycémie à jeun de patients diabétiques corrèle très bien avec une production hépatique

de glucose exagérée (220). La gluconéogenèse est responsable en grande partie de

cette augmentation, mais la glycogénolyse y contribue aussi (224). Enfin, le TA est de

plus en plus montré comme étant un tissu majeur impliqué dans les phénomènes

d'insulino-résistance. En effet, du fait de la résistance à l'insuline, le TA ne jouera plus

son rôle de "tampon" dans le contrôle le l'homéostasie énergétique et va même

participer à amplifier ce phénomène via la sécrétions de produits délétères pour la

sensibilité à l'insuline.

c) Mécanismes moléculaires de l'insulino-résistance

Les altérations possibles vont se situer à plusieurs niveaux de la voie de

signalisation de l'insuline. Du récepteur au contrôle transcriptionnel de certains gènes,

nous allons décrire ici les différentes altérations recensées dans la voie de signalisation

de l'hormone.

Contrôle négatif du signal- La fin du signal insulinique implique la dégradation de

l‟hormone après internalisation des complexes insuline-récepteurs dans les endosomes.

La majorité des récepteurs est recyclée au niveau de la membrane, tandis que d‟autres

sont dégradés. Dans des conditions physiologiques, les récepteurs nouvellement

synthétisés permettent de restaurer un nombre normal de récepteurs sur la cellule. En

présence d‟une hyperinsulinémie persistante, en revanche, les cycles

d‟internalisation/recyclage peuvent aboutir à une diminution du nombre de récepteurs à

la surface, processus de régulation négatif participant de façon secondaire à

l‟installation du phénotype de résistance à l‟insuline.

Les tyrosines phosphatases- La déphosphorylation des résidus tyrosine du récepteur

et des protéines IRS requiert des tyrosines phosphatases (PTPases) : les phosphatases

- 67 -

cytosoliques PTP1B et les membranaires LAR (Leukocyte common antigen-related

molecule) sont impliquées dans ces processus notamment PTP1B qui est présente sur

les récepteurs en cours d‟endocytose. Une augmentation de l‟activité PTPase dans les

muscles des patients diabétiques a été observée et participerait à la résistance de ces

tissus à l‟insuline. Des inhibiteurs de ces enzymes apparaissent ainsi constituer des

outils thérapeutiques prometteurs.

Deux équipes indépendantes ont presque simultanément invalidé PTP-1B chez la

souris (225). Chez ces animaux, la phosphorylation du récepteur en réponse à l'insuline

est prolongée et accentuée dans le muscle squelettique et le foie, mais pas dans le tissu

adipeux. Ceci entraîne une augmentation globale de la sensibilité à l'insuline et une

amélioration de la tolérance au glucose. Pour les souris nourries ad libitum,

l‟insulinémie, nécessaire pour maintenir un niveau de glucose semblable aux souris

contrôles, est réduite de moitié.

Le rôle des phosphorylations en sérine/thréonine- La phosphorylation des résidus

sérine ou thréonine semble jouer, vis-à vis du récepteur et des protéines IRS, un rôle

antagoniste de celui de la phosphorylation des résidus tyrosine intervient ainsi de façon

majeure dans les mécanismes de résistance à l'insuline. En situation physiologique,

cette phosphorylation des résidus sérine ou thréonine permettrait de mettre fin à

l‟activation du récepteur, son exacerbation en pathologie ayant en revanche un rôle

délétère induisant une résistance à l‟hormone.

Plusieurs études se sont intéressées à la phosphorylation sur serine/thréonine

des protéines IRS1 et 2 qui découplerait ces protéines du récepteur et arrêterait la

transduction du signal insuline. Selon le résidu sérine impliqué, la phosphorylation

provoque un changement de conformation, un encombrement allostérique ou une

relocalisation subcellulaire d‟IRS-1 qui résulte respectivement en une diminution de sa

phosphorylation par le récepteur de l‟insuline, en un recrutement déficient de la PI3K ou

en une augmentation de sa dégradation (226, 227).

De nombreux signaux sont capables d‟induire cette phosphorylation, tels le

diacylglycérol, les acyl-CoA, le glucose ou encore l'insuline (228, 229). Dans les

prochains chapitres nous verrons que des sécrétions adipocytaires comme les AGL, le

TNF ou d'autres cytokines inflammatoires comme l'interleukine 1 , sont fortement

impliquées dans ce type de phosphorylations inhibitrices du signal insulinique.

- 68 -

Parmi les enzymes capables de phosphoryler les IRS en serine/thréonine, on

trouve la PKC , la kinase IKK (inhibitor of nuclear factor k kinase), la MAP kinase et

la Jun kinase (JNK). Ainsi, en phosphorylant la sérine 307 de l‟IRS1 murin (sérine 312

chez l‟homme), la JNK empêche l‟interaction du domaine PTB de IRS1/2 avec la

tyrosine 960 phosphorylée du RI et induit un état de résistance à l‟insuline. Cette kinase

est activée par l‟insuline elle-même, ce qui pourrait expliquer l‟insulinorésistance

associée aux états d‟hyperinsulinisme (230), mais aussi par le TNF et les acides gras

libres sécrétés par le tissu adipeux (231, 232).

Fig. 13 Schéma simplifié de l’action des acides gras libres, du TNF et d’une

hyperinsulinémie sur la relation entre le récépteur à l’insuline et IRS. Les acides gras libres

vont pénetrer dans la cellule et induire l‟activation de la PKC qui va venir phosphoryler IRS sur sa

serine 307 et ainsi empécher l‟interaction IRS / recépteur à l‟insuline. De la même manière, le TNF

et l‟insuline vont aussi perturber cette interaction en agissant sur la protéine Junk (JNK).

La sous-unité P85 de la PI3K- L‟augmentation de l‟expression de la sous-unité p85

de type peut expliquer certains cas de résistance à l‟insuline (233), notamment celles

reliées à l‟obésité (234). L‟augmentation de l'expression de la p85 musculaire observée

dans de nombreux cas d'obésité, viendrait alors interférer entre le complexe p85/p110 et

ses effecteurs, de manière à inhiber la voie de signalisation de l'insuline (235).

- 69 -

La voie des ERK- Dans le muscle et le tissu adipeux isolés de patients atteints de DT2,

on a pu remarquer une activité sérine/thréonine kinase anormalement élevée de ERK

(236) et p38 MAPK (237). Il a été démontré que dans les adipocytes 3T3-L1, l‟activation

de ces deux kinases induisait une résistance à l‟insuline en interférant avec les fonctions

d‟IRS-1 (238).

La voie mTOR- Un régime riche en gras, utilisé pour induire l‟obésité et le diabète,

augmente de façon significative l‟activité de mTOR (ou S6K1) et la phosphorylation sur

sérine d‟IRS-1223 dans le muscle. Deux modèles de souris génétiquement obèses

montrent aussi cette augmentation de l‟activité mTOR (239). De plus, les souris

invalidées pour mTOR sont protégées contre cette résistance à l‟insuline induite par un

régime gras. Ces résultats suggèrent donc que mTOR/S6K1 est impliqué dans le

développement de la résistance à l‟insuline (240).

3) Quantification de l’insulino-résistance

Dans les premiers stades de la maladie, l'altération de la voie de signalisation de

l'insuline est à l'origine d'une augmentation de la glycémie. On parlera alors

d‟intolérance au glucose. Toutefois, au début de la maladie, le pancréas va pouvoir

normaliser la glycémie via une augmentation de la sécrétion d'insuline. Les patients

seront donc normoglycémiques et hyperinsulinémiques.

L'incapacité de l'insuline à produire son rôle d'hormone hypoglycémiante va alors

augmenter. Le pancréas va toujours tenter de compenser cette augmentation mais sans

succès. On parle alors de résistance à l'insuline ou de diabète de type II qui se

caractérise par une hyperglycémie associée à une hyperinsulinémie.

Enfin, le DT2 est également carcatérisé par une apoptose des cellules du

pancréas, trop sollicitées par l'augmentation dramatique des taux plasmatiques des

glucose. Ceci aura pour conséquence une diminution de l'insulinémie, on parle alors

d'insulinopénie.

- 70 -

L‟insulino-résistance peut se mesurer avec des outils simples s‟appuyant, comme on

vient de le voir, sur l‟incapacité de l‟insuline à assurer son rôle d‟hormone

hypoglycémiante.

Glycémie- La mesure de la glycémie est un test simple et fiable. Elle peut être pratiquée

à jeun, en période post-prandiale immédiate, ou après une charge en glucose (voir plus

loin). Chez l‟homme, on pratique cette mesure habituellement le matin à jeûn. Les

valeurs normales à jeun se situant entre 3.6 mmol/L et 6 mmol/L, une glycémie

supérieure à 7.0 mmol/L à deux reprises indique la présence d‟un diabète (241).

La glycémie post-prandiale varie en fonction de l‟âge, augmentant dès 40 ans. De

plus, la composition du repas influence la valeur du test puisqu'une faible teneur en

glucides peut diminuer une hyperglycémie. Par ailleurs, le résultat du test est influencé

par le moment de la journée durant lequel il est effectué. Ainsi, l‟hyperglycémie est plus

importante le matin après le petit déjeuner qu‟à d‟autres moments de la journée.

Finalement, il faut respecter un certain délai (1h30-2h) entre la prise alimentaire et le

prélèvement sanguin.

Les valeurs de la glycémie dépendent de plusieurs facteurs, notamment de la technique

d‟analyse, de l‟utilisation de sang complet (sang total) ou de plasma, de sang capillaire

ou veineux. En effet, sur du sang capillaire, on s‟attend à des valeurs légèrement

supérieures à celles du sang veineux total , de l‟ordre de 7 à 10% en post prandial, en

raison d‟une extraction du glucose par les tissus périphériques. Les valeurs glycémiques

plasmatiques sont quant à elles plus élevées que dans le sang veineux total, par effet

de dilution. Il faut savoir que l‟âge est lié à une augmentation progressive de la glycémie

(qu‟il faut donc considérer comme un phénomène physiologique).

Glucosurie- La mesure de la glycosurie n‟est plus utilisée en pratique clinique. En effet,

la précision de cette mesure est limitée par le fait que la glycosurie reflète la glycémie au

moment de la filtration de l‟urine, pas nécessairement celle qui est stockée dans la

vessie. De surcroît, dans certains cas (grossesse par exemple) le seuil de filtration du

glucose est diminué, ce qui peut aboutir à une glycosurie anormale en l‟absence

d‟hyperglycémie associée.

- 71 -

L’insuline- Chez l'homme, on dose l‟insuline par méthode radio-immunologique ou

ELISA, à jeun, sur du plasma ou du sérum. Les valeurs basales normales comprises

entre 10 et 20 mU/L, s‟élèvent jusqu‟à 50-130 mU/L une heure après une charge en

glucose (voir test de tolérance au glucose), et retourne à des valeurs inférieures à 30

mU/L deux heures après l‟ingestion de glucose. Cette mesure, combinée à celle de la

glycémie, va nous donner une idée de la capacité de l‟insuline à promouvoir l‟entrée de

glucose dans les tissus.

L’hémoglobine glyquée- La glycation est un processus physiologique post-

transcriptionnel qui entraîne la fixation de sucres sur certains sites des protéines. Cette

réaction qui est « mécanique » (c‟est à dire non enzymatique) et irréversible, et elle est

fonction du niveau glycémique et du temps d‟exposition des protéines au glucose.

L‟hémoglobine glyquée est la plus connue de ces protéines « cibles ». La forme

principale de glycohémoglobine est l‟hémoglobine A1c, dont la concentration en

situation physiologique se situe entre 4 et 6%. Ainsi, la demi-vie de l‟hémoglobine

glyquée se compare à celle des globules rouges qui est de 120 jours environ, et reflète

donc le contrôle glycémique des 8 à 12 dernières semaines. Cette fraction A1c de

l‟hémoglobine est anormalement élevée chez les patients diabétiques (242) avec

hyperglycémie chronique et est corrélée ainsi au contrôle métabolique. C‟est ainsi

qu‟une hémoglobine glyquée de 5 à 8% témoigne d‟un bon contrôle métabolique durant

les 2 à 3 derniers mois. Alors qu'une valeur supérieure à 8% doit laisser présager à une

exposition importante à de forts taux de glucose plasmatique.

L‟intérêt de ce test réside donc dans la surveillance thérapeutique rétrospective à

long terme du diabète. Toutefois, l‟absence de standardisation et les sensibilités

variables des différentes méthodes de dosages limitent l‟utilisation de routine de ces

tests comme paramètre diagnostique fiable du diabète.

Hyperglycémie provoquée par voie orale- Ce test consiste chez l‟adulte après un

jeûne de 12 heures à faire absorber 75 gr de glucose dans 300 ml d‟eau en moins de 5

minutes, au repos et au calme.

Après un prélèvement sanguin de base, on effectue des prélèvements sanguins

veineux répétés, à 30, 60, 90, 120 minutes après la surcharge en glucose. Il existe des

variantes de ce test, avec des périodes mesures plus courtes ou plus longues.

- 72 -

En fonction des différentes valeurs de glycémie obtenues (valeurs données et

correspondantes dans le tableau ci-dessous), on pourra alors classer les patients en

trois catégories: Normotolérants, Intolérants au glucose et diabétiques.

Table 2. Tableau des glycémies obtenues chez l’homme normal, intolérant au glucose ou

diabétique au cours d’une hyperglycémie provoquée par voie orale (75 gr de glucose dans 300 mL

d’eau).

Pathologie Glycémie à

jeun

Glycémie

2h Valeurs intermédiaires

Normal < 6.3 mmol/l et < 7.7 mmol/l et < 11 mmol/l

Intolérant au

glucose

6.3 à 7.7

mmol/l et

7.7 à 11

mmol/l et

1 ou plusieurs valeurs >

11 mmol/l

Diabète > 7.7 mmol/l et/ou > 11 mmol/l et/ou 1 ou plusieurs valeurs >

11 mmol/l

Il faut bien savoir que ce test apparaît inutile si la glycémie à jeun est déjà

pathologique. L‟interprétation du test d‟hyperglycémie par voie orale doit toujours être

prudente et tenir compte du contexte clinique (243).

Ce test peut être également réalisé chez le rongeur. Dans ce cas, il faut

administrer par gavage, une solution de glucose à une concentration de 3 gr de glucose

par kg de souris (3g/kg). Les valeurs renseignées pour l‟homme dans le tableau ci-

dessus sont approximativement les mêmes pour la souris.

Cependant, d'autres tests, ne tenant pas compte de l'effet incrétines, sont faisables chez

l'animal. Il s‟agit alors d‟administrer le glucose par voie intrapéritonéale (IPGTT) ou par

voie sanguine (IVGTT). Ces types d‟administration occultent totalement l‟effet des

incrétines (Glucagon like peptide GLP1 et Gastrointestinal peptide GIP) qui sont des

molécules sécrétées par l‟intestin suite à l'administration per os de glucose et qui vont

modifier la réponse insulinique à la charge de glucose. Grâce à ces deux types de tests

on peut donc avoir une idée assez précise de la capacité insulino-sécrétoire du

pancréas de l‟individu ou de l‟animal suite à une élévation artificielle de la glycémie.

Test de tolérance à l’insuline- Ce test consiste à suivre la glycémie après avoir injecté

(par voie intrapéritonéale ou intraveineuse) une solution d‟insuline (0.1U/kg de poids

- 73 -

corporel). Cette technique est surtout pratiquée chez l‟animal. Chez l‟homme, pour

s'affranchir des difficultés et des risques liés à l‟hypoglycémie, plusieurs aménagements

ont été proposés, définissant ainsi un test de tolérance à l'insuline modifié ou test court

à l'insuline. L'interprétation ne porte que sur les quinze premières minutes du test, avec

la détermination du rapport [(glycémie basale G0 - glycémie à 15 minutes G15)/G0],

normalement inférieur à 0,5 (Grulent et al. 1997) mais chez l'animal on peut suivre la

glycémie durant 120 ou 180 minutes.

Clamp hyperinsulinémique euglycémique- Cette technique développée par De

Fronzo en 1979 est actuellement celle qui est considérée comme faisant référence pour

déterminer la sensibilité à l‟insuline d‟un individu ou d„un animal (De Fronzo et al. 1979)

Une perfusion intraveineuse d'insuline à débit constant permet d'obtenir une

hyperinsulinémie stable tandis qu'une perfusion simultanée de glucose à débit variable

maintient la glycémie à son niveau basal de 5.5 mmol/L. Le débit de perfusion de

glucose est adapté en fonction de contrôles extemporanés de glycémie. Le protocole le

plus souvent utilisé fait appel à un débit d'insuline de 18 mU/kg/min pendant 180

minutes, de sorte que l'insulinémie s'élève à un plateau voisin de 100 mU/l. La

production hépatique de glucose est alors inhibée, le débit de glucose nécessaire pour

maintenir la glycémie constante correspond à la quantité de glucose utilisée par les

tissus périphériques. La sensibilité à l'insuline est donc appréciée par le débit de

perfusion de glucose à l'équilibre (GIR pour glucose infusion rate), exprimé en

mg/kg/min, que l'on va rapporter au niveau d'insulinémie atteint pour calculer le "turn

over" (TO).

La technique du clamp peut être couplée à celle de la dilution isotopique d'un

analogue non métabolisable du glucose marqué radioactivement ou détectable par

fluorescence (en général c'est le 2-déoxyglucose qui es utilisé), ainsi qu'aux dispositifs

de calorimétrie indirecte (application à l'étude de l'utilisation des substrats énergétiques :

oxydation lipidique, oxydation du glucose, stockage du glucose) (244). De plus,

l'utilisation de plusieurs paliers d'insulinémie croissante permet d'établir des courbes

doses-réponses et d'apprécier l'interaction insuline-récepteur. On peut ainsi réaliser une

analyse plus fine des états d'insulino-résistance, en orientant le diagnostic vers une

- 74 -

anomalie des récepteurs (effet maximal observé pour des niveaux d'insulinémie plus

élevés), un défaut post-récepteur (effet maximal diminué, quel que soit le niveau

d'insulinémie) ou une combinaison des deux (245). Le clamp euglycémique

hyperinsulinémique est une méthode fiable, sensible et reproductible.

D'autres types de clamps existent et renseignent sur des paramètres différents

(capacités sécrétoires du pancréas: clamp hyperglycémique, analyse de l'expression de

protéines ou de gènes en réponse à la variation exclusive du glucose ou de l'insuline

plasmatique, etc…).

L’indice HOMA-IR (Homeostasis Assessment Insulin Resistance)- Mise au point par

Matthews et ses collaborateurs en 1985, l‟HOMA-IR est essentiellement pratiqué chez

l‟homme (246). Cet indice est basé sur la glycémie et l‟insulinémie à jeun. Il consiste à

multiplier l‟insulinémie (en U/ml) par la glycémie (mM) et à diviser l‟ensemble par 22.5.

Ce facteur de division va servir à normaliser le résultat. En effet, pour un individu sain,

l‟insulinémie à jeun sera d‟environ 5 U/l alors que sa glycémie sera de 4.5 mmol/l. Le

produit de ces deux paramètres donne alors le facteur 22.5. En d‟autres termes, un

homme sain aura un index HOMA-IR de 1 et plus l‟indice sera élevé, plus l‟individu sera

insulino-résistant. L‟indice HOMA-IR est fréquemment utilisé pour détecter une anomalie

de sensibilité à l‟insuline ou un défaut de sécrétion de l‟hormone car il est fortement

corrélé aux résultats obtenus au cours d‟un clamp hyperinsulinémique euglycémique

sans toutefois être invasif pour l‟individu (246, 247). Les valeurs de référence utilisées

dans ce type d'index sont de 2 pour les sujets témoins, environ 5 pour les obèses et

peuvent atteindre 10 pour les patients diabétiques.

- 75 -

IV. De l'obésité à la résistance à l'insuline

La relation entre l'obésité et l'insulino-résistance peut s'expliquer par différents

mécanismes d'ordre inflammatoires, nerveux, endocrinien ou intracellulaire. Dans ce

chapitre sera développé le rôle joué par le tissu adipeux au travers de différents aspects

intracellulaires et des sécrétions adipocytaires (adipokines).

1) Modifications fonctionnelles du TA au cours de l'obésité

a) Plasticité de l’adipocyte: avantage ou inconvénient?

La forme sphérique caractéristique des adipocytes peut varier de façon

importante allant de 20 µm à 200 µm de diamètre (248). La plasticité du TA provient de

la grande capacité de stockage des adipocytes qui peuvent emmagasiner l‟énergie sous

forme de triglycérides dans une vacuole lipidique unique pouvant représenter 95% du

volume cytoplasmique. Cette vacuole contient un mélange de triglycerides (TG),

d‟acides gras (AG), de phospholipides et de cholesterols. Environ 95% des lipides

stockés sont représentés par les TG (constitués principalement par l'acide oléique et

palmitique) et par les diacyglycerols (DAG), les phospholipides (PL), les acides gras

non-estérifiés et le cholesterol (249, 250). Des études utilisant des traceurs isotopiques

ont pu montrer que les lipides étaient constamment mobilisés et renouvelés. Ainsi, la

« demi-vie » des lipides intracellulaires est d‟environ 8 jours chez les murins, ceci veut

dire que 10% des acides gras stockés dans le TA sont renouvelés chaque jour (251).

Comme évoqué plus haut, les adipocytes sont capables d‟augmenter considérablement

leur volume (plus de 1000 fois) afin d‟assurer ce rôle de «tampon» en cas de

déséquilibre de l‟homéostasie énergétique en faveur des apports. Dans ce cas, on parle

d‟hypertrophie adipocytaire. Depuis de nombreuses années, plusieurs théories ont mis

en avant le fait que cet accroissement du volume adipocytaire n‟était pas indéfini et

qu‟au cours de l‟obésité, l‟augmentation de la masse du TA pouvait résulter d‟une

hypertrophie adipocytaire suivie d‟une augmentation du nombre d‟adipocytes ou

hyperplasie (252, 253).

- 76 -

Cette théorie est aujourd‟hui remise en cause par une récente étude menée par

l‟équipe de P. Arner (254) au cours de laquelle les auteurs montrent que s‟il existe bien

une corrélation positive entre la taille des adipocytes (surtout sous-cutanées) et la prise

de poids, il n‟en est pas de même avec le nombre d‟adipocytes pour un même individu.

En effet, selon les auteurs, le nombre d‟adipocytes est constitué au cours de l‟enfance et

de l‟adolescence, puis il reste stable au cours de la vie adulte avec un renouvellement

adipocytaire d‟environ 10% par an. L‟originalité de cette étude réside dans le fait que les

auteurs s‟appuient sur l‟accumulation de carbone 14 présent dans l‟atmosphère pour

dater «l‟âge» des adipocytes au cours de la vie d‟un individu alors que les travaux

précédents ne comparaient que des individus sains et obèses à un instant déterminé.

Chez la souris, une étude concernant la plasticité du TA avait montré que

l‟expansion de ce tissu pouvait être corrélée à la mort cellulaire des adipocytes (255). En

effet, au cours de la mise en régime gras des animaux, Strissel et ses collaborateurs ont

pu observer une mort cellulaire importante des adipocytes permettant une hypertrophie

des adipocytes restants.

En conclusion, même si ces dernières découvertes semblent montrer que le rôle

de réservoir énergétique que joue le TA est surtout symbolisé par la capacité de ses

adipocytes à s‟hypertrophier; il semble de plus en plus intéressant de porter notre

attention sur les phases précoces du développement du TA chez l'enfant et l'adolescent.

En effet, si le nombre d‟adipocytes est «programmé» durant ces phases par des

facteurs génétiques et environnementaux, ces périodes de vie doivent être plus

étudiées. Ceci permettrait de mieux appréhender les déterminants qui induisent la

prolifération des adipocytes et pourquoi pas de développer de nouvelles stratégies de

lutte contre l‟obésité adulte.

b) Inflammation du tissu adipeux

C‟est en 1993 qu‟a été mis en évidence que l‟expression d'une cyotokine

inflammatoire, le Tumor Necrosis Factor (TNF ), était augmentée dans le TA de

souris obèses (256). Il a aussi été montré que l‟induction du transcrit de cette cytokine

inflammatoire provenait conjointement des adipocytes et des macrophages du TA (FSV)

(257). De plus, des expériences de coculture ont permis de mettre en évidence que

- 77 -

l‟adipocyte et le macrophage pouvaient interagir et promouvoir cette augmentation du

transcrit du TNF et d‟autres cytokines inflammatoires comme l‟interleukine-6 (IL-6)

(257).

Chez l‟obèse, ce fonctionnement paracrine prend toute son importance quand

plusieurs équipes observent que les macrophages peuvent constituer jusqu'à 60% des

cellules présentes dans la TA alors qu‟ils ne comptent que pour 5 à 10% dans le TA

d‟un homme sain (258-260). En effet, une corrélation positive entre le nombre de

macrophages infiltrés dans le TA ou la présence de marqueurs macrophagiques (F4/80)

dans ce tissu et le BMI ou la taille adipocytaire a plusieurs fois été retrouvée (260). De

plus, chez l‟homme, une diminution du poids corporel s‟accompagne d‟une diminution

de cette infiltration macrophagique du TA (260). Si l‟on ajoute à ces arguments le fait

que, chez la souris obèse, 1) les macrophages issus du TA présentent un pic

d‟expression de gènes impliqués dans l‟inflammation précédant de peu l‟apparition des

premiers symptômes de l‟insulino-résistance et que 2) l‟invalidation de la voie de

signalisation responsable de l‟inflammation dans les macrophages (NF- B) entraîne une

protection de l‟animal contre l‟insulino-résistance malgré la mise en régime gras, on peut

avancer que l‟infiltration macrophagique joue un rôle prépondérant au cours de

l‟installation de l‟insulino-résistance associée à l‟obésité (261). Cet état provoqué par

l'infiltration de macrophages dans le TA est aujourd'hui qualifiée «d‟inflammation de bas

niveau du TA »

Cependant, plusieurs points concernant l‟inflammation du TA restent débattus. En

effet, aucune certitude n‟est établie concernant l‟attraction des macrophages pour le TA

par rapport à d‟autres tissus au cours de l‟obésité. Est-ce que la réponse inflammatoire

initiale provient de l‟adipocyte et ensuite permet le recrutement et l‟infiltration des

macrophages dans le TA ou bien est-ce que, dans un premier temps, les macrophages

infiltrent le TA pour ensuite induire la réponse inflammatoire ?

En ce qui concerne le mécanisme de recrutement des macrophages dans le TA,

deux équipes ont simultanément montré en 2005, l‟implication du récepteur C-C

chemokine receptor 2 (CCR2) présent à la surface des macrophages, et de son ligand

CCL2 (C-C chemokine ligand 2) aussi appelé MCP-1 pour Monocyte Chemoattractant

Proteine-1 qui est exprimé par les cellules de la FSV (262, 263). En effet, l‟invalidation

de CCR2 ou de MCP-1 chez la souris entraîne une diminution de l‟infiltration

- 78 -

macrophagique dans le TA accompagné d‟une moindre inflammation du tissu et d‟une

insulino-sensitivité préservée malgré la mise en régime gras des animaux (264). De plus

chez l‟homme obèse, les taux plasmatiques de MCP-1 ainsi que son expression dans le

TA sont augmentés (265-267). Cependant, ces conclusions sont à considérer avec

précaution puisque deux équipes ont récemment montré que les souris MCP-1 -/- ne

présentaient pas de diminution de l‟infiltration macrophagique et ne montraient pas

d‟amélioration de l‟insulino-sensibilté au cours de la mise en régime gras des animaux

(268).

Néanmoins l‟ensemble des travaux concernant l‟inflammation montre que le rôle

des macrophages dans l‟installation de l‟insulino-résistance n‟est plus à démontrer

même si l‟effet strictement délétère des macrophages reste controversé. Comme nous

l'avons décrit précédemment, deux populations de macrophages (pro- et anti-

inflammatoires) semblent co-exister dans le TA au cours du développement de l‟obésité

(195). Les cellules pro-inflammatoires M1 pourraient alors jouer un rôle dans la mise en

place de la résistance à l‟insuline associée à l‟obésité via la sécrétion de certaines

cytokines inflammatoires. A contrario les M2 joueraient un rôle bénéfique et

permettraient, via le récepteur nucléaire PPAR de maintenir la sensibilité à l‟insuline du

TA.

c) Stress du Réticulum Endoplasmique

L‟étude de modèles animaux obèses et présentant des adipocytes

hypertrophiques a montré que l‟excès de nutriment pouvait provoquer un «stress» pour

l‟adipocyte et plus précisément pour son réticulum endoplasmique (RE), organelle

responsable de la synthèse des protéines, de la formation de gouttelettes lipidiques

ainsi que de la régulation du cholestérol au sein de l‟adipocyte (269, 270).

En situation normale, la traduction des ARNm en protéines se déroule dans le

RE, puis les protéines sont adressées à l‟appareil de Golgi qui va les « configurer » afin

qu‟elles remplissent au mieux leur rôle dans la cellule. Au cours de ce processus,

différents systèmes de contrôle vont permettre de maîtriser la synthèse protéique

(protéines chaperonnes, Unfolded Protein Response, …). Au cours de l‟obésité, il a pu

être observé que le stress du RE entraînait des perturbations dans le fonctionnement de

- 79 -

ces systèmes de contrôle conduisant à une synthèse protéique et lipidique anormale

(269-271).

d) Stress Oxydant

Parallèlement à ce stress du RE, l‟obésité s‟accompagne également d‟une

augmentation du stress oxydant au niveau des mitochondries (272). Les stress oxydant

peut être définit par un déséquilibre dû à une augmentation de la production d‟espèces

actives de l‟oxygène (EAO) et une diminution des systèmes anti-oxydant qui luttent

contre les effets délétères des radicaux libres et des peroxydes. L‟excès d‟AG produits

par la mitochondrie va entraîner un découplage de celle-ci qui va s‟accompagner d‟une

production accrue de radicaux libres oxygénés (273). En effet, Furukawa et ses

collaborateurs ont mis en évidence que les taux de malondialdehyde (MDA) et de

dienes conjugués (produits de la péroxydation lipidique) étaient significativement plus

élevés dans le TA d‟hommes obèses (274).

e) Flux lipidiques modifiés

Comme nous l'avons déjà évoqué, le rôle premier de l'adipocyte blanc est de

stocker l'énergie sous forme de TG puis de libérer ces substrats énergétiques en cas de

besoin de l'organisme. Cependant, au cours de l'obésité, cette gestion des flux

lipidiques peut être modifiée et conduire au développement de pathologies

métaboliques et cardiovasculaires. Dans ce sens, des études ont démontré qu‟au cours

des premières étapes de la prise de poids conduisant à l'obésité, l'adipocyte blanc va

voir son activité métabolique augmenter afin d'assurer son rôle de tampon de l'excès

énergétique. Les études menées par Bjorntorp et ses collaborateurs ont montré que des

adipocytes plus volumineux issus de TA viscéral d‟obèses sensibles à l'insuline

possédaient une incorporation de TG plus importante que les petits adipocytes (275).

Les mécanismes par lesquels ces adipocytes sont métaboliquement plus actifs ne sont

pas clairement définis. Néanmoins, il a été observé dans ces cellules une augmentation

significative de l‟expression (ARNm) et de l‟activité de certaines enzymes clés du

métabolisme lipidique comme la LHS, la lipoproteine lipase (LPL) et le transporteur de

- 80 -

glucose GLUT4 (276). Des expériences de microarray ont aussi confirmé que des gènes

nécessaires au métabolisme lipidique et à la différenciation adipocytaire étaient

surexprimés (277).

Cependant, l'adipocyte ne peut pas stocker à l'infini l'excès de substrat

énergétique de l'organisme. Peu d'études ont été faites concernant la phase de

transition qui va voir un adipocyte très actif devenir quasiment quiescent en terme

d'activité métabolique (278). Les hypothèses que l'on peut formuler aujourd'hui reposent

sur des travaux montrant que l'adipocyte sécrète des substances en fonction de la

quantité de lipides qu'il contient (279). Par exemple, la leptine (dont nous décrirons le

rôle plus loin) et d'autres adipokines sont sécrétées différentiellement selon la taille de la

vacuole lipidique (280-282). Ce contrôle précis apporte la preuve qu'il existe des

mécanismes intracellulaires de signalisation pouvant informer l'adipocyte sur le statut de

ses réserves intracytoplasmiques. Ce processus de détection des réserves lipidiques

est un élément clé et certaines données récentes de la littérature montrent que la

gouttelette lipidique pourrait être impliquée dans ce phénomène. Les études sur les

périlipines montrent qu'il existe un lien entre la concentration de ces protéines à la

surface de la gouttelette lipidique et la régulation de la production de sécrétions

adipocytaires. Ainsi, dans des adipocytes provenant de rongeurs ou d'individus obèses,

un déficit en périlipine a été rapporté et corrélé avec une augmentation de la lipolyse et

un dérèglement de la sécrétion de facteurs protéiques (adipokines) (283).

L'étirement mécanique des adipocytes en culture (3T3L1) diminue leur capacité

de différenciation via un mécanisme dépendant de PPAR (284). On peut alors

envisager que l'adipocyte s'hypertrophiant, des protéines situées à la surface de la

gouttelette lipidique ou à la surface de la membrane plasmique (caveolines) permettent

de mesurer une tension synonyme de remplissage maximal de l'adipocyte et ainsi

induire un signal d'arrêt du stockage lipidique.

Ainsi en période post-prandiale, le TA ne pouvant plus assurer son rôle de

tampon, les AG resteront plus longtemps dans la circulation et pourront alors cibler des

tissus comme le muscle squelettique, le foie ou le pancréas chez qui ils entraîneront une

résistance à l'insuline (cf. chapitre : les acides gras à l‟origine du phénomène de

lipotoxicité).

De plus il a également pu être montré chez l'homme et l'animal qu'une perfusion

d'AGL en quantité importante pouvait induire une résistance du TA. Ceci aura comme

- 81 -

effet une lipogénèse inhibée et une lipolyse augmentée: le TA va alors se mettre à

relarguer des AGL dans la circulation.

Nous sommes donc en présence, chez l‟obèse, d‟un double afflux d‟AGL: ceux

provenant de l‟alimentation et que le TA ne parviendra plus à stocker et ceux originaires

des adipocytes devenus lipomobilisateurs. On parle alors de lipotoxicité.

2) Conséquences des modifications fonctionnelles du TA

a) Distribution des dépôts adipeux: l’hypothèse portale

Nous avons vu qu‟au cours de l‟obésité, une distribution viscérale du TA est

corrélée avec le développement du syndrome métabolique. Plusieurs études ont émis

l‟hypothèse d‟une implication de la localisation anatomique des dépôts adipeux dans le

développement de maladies métaboliques. Lebovitz et ses collaborateurs ont pu

corréler le volume du TA viscéral à l‟insulino-résistance (de l'organisme) et certains ont

pu faire état d‟une amélioration de la sensibilité à l‟insuline en réponse à une perte de

poids significativement corrélée à la diminution du TA viscéral. L‟ensemble de ces

résultats montre donc que le TA viscéral est au centre des complications associées à

l‟obésité et plusieurs hypothèses ont émergées pour expliquer cette particularité. A la fin

des années 90, l‟équipe de P. Arner a pu montrer que la graisse viscérale était plus

résistante à l‟action de l‟insuline que la graisse sous-cutanée. Par conséquent la

production d‟AG à partir du TA viscéral est plus prononcée qu‟à partir d‟autres dépôts

adipeux. De plus, même s'il ne représente jamais plus de 20% du TA total, le TA

viscéral de part sa localisation et sa vascularisation lui donnant un accès direct à la

circulation portale, possède un rôle extrêmement important dans la genèse de

pathologies métaboliques. L‟hypothèse portale soutient que le flux important d‟AGL issu

du TA viscéral et qui arrive au foie par la veine porte induit un dérèglement du

métabolisme hépatique.

Au niveau du foie, l'accumulation de triglycérides provoque une insulino-

résistance comme elle le fait dans le muscle. L‟inhibition de l‟action de l‟insuline stimule

la néoglucogénèse hépatique et la sortie hépatique de glucose. De plus, les acides gras

fournissent également les cofacteurs nécessaires à la néoglucogénèse hépatique.

- 82 -

L‟accumulation de lipides hépatiques entraîne aussi une dyslipoprotéinémie

caractéristique du syndrome métabolique et du DT2 : hypertriglycéridémie, diminution

des HDL, accumulation de LDL petites et denses.

b) Accumulation ectopique de lipides dans les tissus non-adipeux.

L‟accumulation ectopique de lipides dans des tissus non-adipeux se produit via

une déficience dans la capacité à oxyder les AG. Les muscles, le foie, le pancréas et le

cœur sont les principaux organes affectés par ce phénomène

.

Muscle squelettique :

Différents travaux ont établi que la quantité de lipides intramusculaires (LIM) augmentait

considérablement au cours de deux situations totalement opposées: l'obésité et

l'exercice physique intense (285). Ces résultats surprenants confirment le rôle de

substrat énergétique joué par ces LIM. Ceci peut paraître paradoxal au regard des

résultats obtenus chez des sujets entraînés mais on sait aujourd‟hui qu‟une grande

disponibilité en AGL (observé au niveau plasmatique chez l‟obèse mais également chez

le sportif entraîné capable de lipomobiliser) peut induire une augmentation des LIM. De

plus, la perfusion d‟AGL chez des hommes sains augmente de façon significative les

LIM.

Comment alors concilier le fait que les sujets entraînés et les obèses possèdent

des taux de LIM élevés?

L‟explication réside dans la capacité du muscle à utiliser ces substrats.

L‟augmentation des LIM chez le sujet entraîné est une adaptation physiologique par

rapport à la demande musculaire et elle s‟accompagne d‟une capacité oxydative

augmentée. Chez l‟obèse, le stockage de lipides dans le muscle découle d‟un flux trop

important d‟AGL dans la circulation conjugué à une capacité oxydative diminuée. Ces

deux situations ont des conséquences opposées sur la sensibilité à l‟insuline du muscle.

Quand la capacité oxydative est importante, les concentrations en lipides intermédiaires

comme le diacyglycérol (DAG), les céramides ou l‟acyl-CoA sont faibles, alors qu‟en cas

de grande disponibilité en AGL accompagnée d‟une faible capacité oxydative leur

- 83 -

concentration augmente. Comme l‟insulino-résistance est corrélée à l‟accumulation de

ces intermédiaires, l‟ensemble de ces résultats montre clairement que chez l'individu ou

l'animal obèse, l‟accumulation ectopique de lipides au niveau musculaire participe

grandement à la réduction de l‟insulino-sensibilité de ce tissu.

Foie :

Comme déjà évoque plus haut, le foie est un organe essentiel dans le métabolisme

énergétique. Il synthétise le cholestérol et les TG et il produit et «recycle» les

lipoprotéines. Compte tenu de ce rôle dans le turn-over lipidique, il n‟est pas surprenant

que le foie présente des réserves lipidiques sous forme de TG. Cependant, chez

l‟homme sain, le contenu hépatique lipidique est faible puisqu‟il ne représente

qu‟environ 5% du poids total du foie. Chez l'individu obèse, cette limite de stockage est

dépassée et entraîne une stéatose hépatique. Les mécanismes qui sont responsables

de cette stéatose impliquent trois voies différentes d‟afflux d‟AGL au foie. La première,

comme nous l‟avons décrite, est due à la position du TA viscéral qui va libérer dans la

veine porte une grande quantité d‟AGL qui va parvenir directement au niveau du foie. La

seconde voie est celle de l‟alimentation. En effet, le foie se charge très vite en vacuoles

lipidiques en réponse à un régime riche en gras. Pour preuve, plusieurs études chez les

murins mais aussi chez l‟homme ont montré que deux semaines d‟alimentation riche en

lipides pouvaient induire une stéatose hépatique, ce phénomène étant également

rapidement reversé lors d‟une alimentation isocalorique. Enfin, le troisième type d‟apport

en AGL au foie est constitué par le foie lui-même. En effet, ce tissu étant capable de

lipogénèse de novo, le foie peut contribuer à hauteur de 25% environ à la synthèse de

TG hépatiques chez l‟obèse, ce qui représente 4 à 5 fois plus que chez un sujet sain

(286).

Le cœur :

Il y a de plus en plus d‟études montrant une accumulation ectopique de lipides dans le

cœur ce qui joue un rôle dans des cardiomyopathies ou des complications cardiaques.

Comme dans le muscle et dans le foie, un cœur surchargé en lipides peut devenir

insulino-résistant. Comme pour le muscle et le foie, les métabolites lipidiques sont très

toxiques pour le cœur puisqu‟il a pu être montré qu‟ils induisaient la mort cellulaire par

apoptose des cardiomyocytes. Une étude chez l‟homme a pu observer une

- 84 -

augmentation de la quantité de lipides intramyocardiques au cours de l‟obésité. Cette

accumulation de lipides est associée à un changement de profil d‟expression génique

observé dans des modèles animaux de stéatose et d‟insuffisance cardiaque. Chez le rat

obèse diabétique Zucker (mutation sur le récepteur à la leptine), les TG s‟accumulent

rapidement au niveau du cœur au fur et mesure que l‟obésité s‟installe. Cette

accumulation est suivie d‟une augmentation des céramides dans le cœur associée à

une apoptose plus importante. Ces changements sont accompagnés de pertes de

fonction entraînant un remodelage du ventricule gauche, une augmentation de la

pression dans ce ventricule et un rétrécissement de l‟épaisseur de la paroi septale.

Chez l‟homme, une alimentation riche en lipides pendant 48 heures induit une

accumulation de TG dans les cellules cardiaques. De plus, la présence de vésicules

lipidiques intramyocardiques est parfaitement corrélée avec les concentrations

plasmatiques d‟AGL, l‟IMC mais aussi avec la quantité de TA epicardique. L‟ensemble

de ces données montre que l‟accumulation de TG dans le cœur est du à une forte

exposition de l‟organe à des taux élevés d‟AGL, et ceci aura pour conséquence une

surcharge et une hypertrophie du ventricule gauche. Cependant des études

complémentaires sont nécessaires pour mieux appréhender les différents mécanismes

conduisant à l‟insuffisance cardiaque associée à l‟obésité.

Le pancréas :

Il a été suggéré que l‟accumulation ectopique de lipides au sein des cellules du

pancréas pouvait être responsable d‟une dérégulation de la sécrétion d‟insuline. Ainsi,

l‟exposition chronique (24 à 48 heures) d‟îlots isolés de Langherans à de fortes

concentrations d‟AGL induit des dommages irréversibles au niveau des cellules ,

responsables de la sécrétion d‟insuline. De façon intéressante, des études menées sur

le rat Zucker montrent une augmentation de l‟accumulation de TG dans les îlots juste

avant l‟apparition d‟un DT2 et coïncide parfaitement avec un changement

morphologique des îlots associé à une défaillance des cellules . Ces phénomènes sont

reversés lorsqu'une restriction énergétique est pratiquée aux animaux. De plus chez les

souris hétrozygotes pour le gène PPAR (PPAR +/-) nourries en régime gras, on

observe une forte accumulation de TG au niveau du pancréas associée à une sécrétion

- 85 -

d‟insuline perturbée. Un traitement de ces animaux à la pioglitazone, une agoniste

PPAR , diminue le contenu en TG du pancréas et simultanément restore une sécrétion

insulinique normale. Différents mécanismes ont été proposés pour expliquer l‟effet d‟une

exposition à long terme sur les cellules du pancréas. Il semblerait que les AGL

diminuent l‟expression du gène codant pour la préproinsuline mais modifient aussi celle

des protéines découplantes UCP2 (Uncoupling chain protein) qui seraient impliquées

dans la réponse du pancréas à une variation de la glycémie. En effet, les UCP2 sont

des protéines impliquées dans la production d‟ATP par la mitochondrie, or le pancréas

perçoit les variations de glycémie plasmatique grâce au ratio ATP/ADP modifié par le

glucose. Les AGL agissant sur l'expression des UCP2, vont modifier ce ratio et ainsi la

fonction insulino-sécrétoire du pancréas.

Les effets des AGL pourraient aussi être médiés par les acyl-CoA à longue

chaine puisque ces métabolites résultant d‟une mauvaise oxydation des AGL activent

les canaux K+ ATP-dépendant ce qui hyperpolarise la cellule rendant la dépolarisation

de cette cellule par le glucose plus difficile et entraînant un défaut dans la sécrétion

d‟insuline en réponse au glucose.

Enfin, parmi les effets délétères provoqués par les AGL, il a été montré qu‟une

apoptose des cellules pouvaient être observée suite à la génération de céramides

conséquente à l‟action de l‟acide palmitique. Au contraire, l‟acide oléique insaturé est lui

protecteur et anti-apoptotique.

c) Les acides gras à l'origine du phénomène de lipotoxicité

Les acides gras et le glucose constituent les principales sources d‟énergie

utilisées par le muscle squelettique. L‟hypothèse selon laquelle une importante

oxydation des AG inhiberait la glycolyse et l‟oxydation du glucose a d‟abord été formulée

par Randle en 1963 sous le terme de «cycle glucose-acide gras». Les travaux de

Randle ont pu mettre en évidence que lorsque l‟organisme était exposé à de fortes

concentrations de lipides (AG et cétones) comme c‟est le cas dans les situations

d'obésité, l‟oxydation des AG se faisait en priorité. Par conséquent, le métabolisme

glucidique était ralenti voir inhibé. Au niveau moléculaire, ces études ont montré que les

lipides pouvaient inhiber l‟activité de certaines enzymes impliquées dans le métabolisme

- 86 -

glucidique comme l‟hexokinase, la phosphofructokinase et la pyruvate déshydrogénase

mais pouvaient également induire l‟expression de différents isoformes des PKC (PKC ,

ou ) impliqués dans l‟insulino-résistance.

Physiologiquement, ces acides gras libres sont la principale source d‟énergie

chez les sujets à jeun. Avec l‟obésité, le flux circulant excède les besoins des différents

tissus. L‟importance du rôle des acides gras dans la résistance à l‟insuline explique en

grande partie la relation entre l‟obésité abdominale et le risque de diabète. Le TA

viscéral, plus résistant à l‟action de l‟insuline que le TA sous-cutané, produit d'avantage

d‟acides gras.

D'un point de vue moléculaire, il a été démontré que la résistance à l‟insuline

provoquée par les acides gras libres est associée à une augmentation de l‟activité de la

PKC-θ (287). La PKC-θ augmente la phosphorylation d‟IRS-1 sur ses sérines 307 et

1101 pour réduire son activation. Les souris invalidées pour PKC-θ sont protégées

contre les défauts de signalisation et de transport du glucose induit par une infusion de

lipides (288). C‟est JNK et IKK (inhibitor kappaB kinase) qui seraient à l‟origine de la

phosphorylation d‟IRS-1 en réponse à l‟activation de PKC-θ (289). Le salycilate, un

inhibiteur d‟IKK, bloque les effets négatifs d‟une infusion de lipides sur la signalisation de

l‟insuline. Des souris hétérozygotes invalidées pour IKK sont aussi protégées contre ces

effets (290). Par contre, l‟invalidation spécifiquement de cette protéine dans le muscle

squelettique n‟a pas empêché la phosphorylation inhibitrice d‟IRS-1 (291).

d) Les adipokines

Les sécrétions du TA ne se limitent pas aux AG. D'autres molécules, d'origine

peptidique ou protéique, seront produites et sécrétées par le TA. Il s'agit des adipokines.

Compte tenu de la place importante que peut prendre le TA chez l'obèse, une

production ou une sécrétion modifiée n'est pas sans conséquence sur les pathologies

associées à l'obésité comme l'insulino-résistance.

- 87 -

Généralités

C‟est au début des années 90 que le concept d‟adipokine apparaît grâce à la

découverte de la leptine par l‟équipe de Friedman (292). Cette découverte a

profondément modifié la vision du rôle du TA puisqu‟il est maintenant établi que via la

sécrétion de molécules biologiquement actives, le TA joue un rôle déterminant au sein

d‟un réseau complexe de communications entre organes (293, 294). Ainsi aujourd‟hui, la

dénomination « adipokine » recouvre plus de 50 facteurs différents. Un débat s‟est

d‟ailleurs installé sur l‟utilisation du terme « adipokine » pour des molécules qui n‟étaient

pas exclusivement synthétisées par l‟adipocyte. Malgré cette controverse sémantique,

nous qualifierons d‟adipokine toute production peptidique ou protéique importante

émanant de l‟adipocyte.

Dans ce chapitre, nous nous attacherons à répertorier les adipokines pouvant

agir (effet bénéfique ou délétère) sur la sensibilité à l'insuline et/ou l'homéostasie

glucidique. Pour chacune d'entre elles, nous établirons leur profil au cours de l'obésité

associé à l'insulinorésistance afin de déterminer lesquelles peuvent devenir des cibles

potentielles dans le traitement de ces pathologies.

Les adipokines délétères pour la voie de l'insuline

Le TNF (Tumor Necrosis Factor- ) est une cytokine initialement connue pour ses

importantes propriétés proinflammatoires, mais elle exerce aussi des effets sur le

métabolisme glucidique et lipidique (256). Cette cytokine est produite par un certain

nombre de types cellulaires dont les cellules lymphoïdes, les cellules musculaires et

adipeuses (295). Au sein du TA, la majorité des ARNm codant pour le TNF dérive des

cellules non adipeuses (cellules de la FSV) chez l‟homme (296) ; par contre chez le

rongeur, le TNF proviendrait essentiellement des adipocytes (256).

Le TNF joue un rôle important dans le développement de l‟insulinorésistance

liée à l‟obésité. Son premier lien à l‟obésité a été montré dans un modèle de souris

génétiquement obèses (db/db) où le tissu adipeux périgonadique présentait des

concentrations élevées de TNF . Il a été montré que le TNF provoquait une

- 88 -

augmentation du relargage des acides gras par les adipocytes, avec comme

conséquence une augmentation des taux d‟acides gras libres circulants et une

détérioration de la signalisation de l‟insuline (297). Plusieurs études montrent que le

TNF- inhibe la signalisation de l'insuline en phosphorylant IRS-1 sur son résidu sérine

307 (298). De ce fait, le TNF empêche l‟autophosphorylation du récepteur à l‟insuline

et diminue l‟activité tyrosine kinase en aval du récepteur (299). Ainsi, le TNF inhibe la

translocation de GLUT 4 et le captage de glucose dans le muscle en réduisant la

stimulation d‟IRS-1 et IRS-2 (300).

Le rôle du TNF dans l‟insulinorésistance liée à l‟obésité a aussi été montré a contrario

dans des modèles murins avec délétion du gène du TNF ou de ses récepteurs. Les

souris obèses (ob/ob) déficientes en TNF sont moins hyperglycémiques,

hyperinsulinémiques et intolérantes au glucose que des souris ob/ob possédant le gène

du TNF (301, 302). Chez les souris dont les récepteurs (p55 et p75) pour le TNF sont

invalidés, on ne note pas d‟altération du poids corporel sous régime classique ou riche

en graisses (303). Cependant, la délétion de ces deux récepteurs chez les souris ob/ob

entraîne une amélioration significative de la sensibilité à l‟insuline (304). La participation

du TA aux taux circulants de TNF n‟est pas encore clairement établie et il n‟est pas

exclu que le TNF agisse sur le tissu adipeux et sur les autres tissus cibles de l‟insuline,

essentiellement par voie autocrine ou paracrine. Par ses effets paracrines sur le tissu

adipeux, le TNF est capable de moduler l‟expression et la sécrétion d‟autres

adipokines (305), ce qui in fine va renforcer l‟insulinorésistance. Par exemple, le TNF

stimule la sécrétion d‟IL-6 et inhibe celle de l‟adiponectine (306, 307).

D‟abord décrit comme une cachectine, facteur induisant la cachexie malgré une

prise alimentaire normale, le TNF a été ensuite impliqué dans la régulation de la

masse adipeuse puisqu‟il limite l‟accumulation de triglycérides dans les adipocytes en

inhibant la LPL et en stimulant la lipolyse, ce qui se solde par une augmentation

d‟acides gras libres médiateurs d‟insulinorésistance (257, 308). De plus, il inhibe la

différenciation des préadipocytes humains (309) et induit l‟apoptose adipocytaire in vitro

(310). Ces données suggèrent que le TNF limiterait l‟expansion de la masse adipeuse

mais en contrepartie il induirait l‟insulinorésistance et des complications métaboliques

associées.

- 89 -

L’interleukine-6 (IL6) est une cytokine produite par de nombreuses cellules

(fibroblastes, cellules endothéliales, monocytes) et de nombreux tissus, dont le tissu

adipeux. Il est maintenant bien établi que la quantité d‟IL-6 produite par le TA est

augmentée en cas d‟obésité (311). Il a pu être estimé que 15 à 30 % des concentrations

circulantes d‟IL-6 pouvaient être attribués au TA.

L‟IL-6 pourrait être impliquée directement dans l‟insulinorésistance en

augmentant l‟expression de SOCS-3 et en diminuant la phosphorylation d‟IRS-1 et de

PKB/Akt (312, 313). Ainsi, dans les adipocytes 3T3-L1, l‟IL-6 induit une résistance

partielle à l‟action de l‟insuline sur le captage de glucose via un rétro-contrôle négatif de

la phosphorylation d‟IRS-1. Elle est aussi capable d‟agir négativement sur la

transcription des gènes codant pour IRS-1 et Glut 4 (314).

L‟IL-6 exerce d‟autres effets sur le tissu adipeux comme l‟inhibition de l‟activité de

la LPL et l‟induction de la lipolyse (315, 316) qui, via les AGL, pourrait contribuer à

l'installation ou au développement de l'insulino-résistance. Au cours de l'exercice

physique, il a été remarqué que les taux plasmatqiues d'IL-6 augmentaient (317). Cette

observation a permis de mettre en évidence un rôle bénéfique de l'IL-6 puisqu'elle

semble capable de stimuler l'activité de l'AMPK dans le muscle (317). Ainsi, il semblerait

que l'IL-6 possède deux types d'actions en fonction de la situation physiologique.

La résistine est une protéine de 12.5 kDa qui appartient à une famille de protéines

riches en résidus cystéines, responsables de sa dimérisation par des ponts dissulfures

(318). Les taux circulants de résistine sont augmentés chez des souris génétiquement

obèses (ob/ob et db/db) ou rendues obèses et résistantes à l‟insuline par un régime

riche en graisse (319). Chez les rongeurs, la principale source de résistine est d‟origine

adipocytaire (282). La résistine est également exprimée et produite dans le tractus

digestif, les glandes surrénales, le muscle squelettique (320), le cerveau (321) ainsi que

dans les îlots pancréatiques (322).

Chez l‟homme obèse, Kaser montre que la principale source de résistine

proviendrait des macrophages infiltrés dans le TA (323) alors que Pagano et ses

collaborateurs ont observé récemment que la résistine était aussi exprimée dans les

- 90 -

adipocytes humains avec une expression quatre fois plus élevée dans le TA viscéral

que sous-cutané (324).

La résistine joue un rôle physiologique dans le métabolisme glucidique, au niveau

du foie et du muscle squelettique, en atténuant l‟action de l‟insuline au sein de ces

tissus. L‟administration de résistine in vivo et la surexpression transgénique de résistine

induit une insulinorésistance secondaire à l‟augmentation de la production hépatique de

glucose (325, 326). De plus, chez des souris rendues obèses et résistantes à l‟insuline

par un régime riche en graisse, le traitement par un oligonucléotide résistine anti-sens

améliore la résistance hépatique à l‟insuline (327). Ces observations suggèrent des

propriétés diabétogéniques de la résistine chez le rongeur (d‟où son nom « résistine »

pour résistance à l‟action de l‟insuline).

La résistine diminue le captage des acides gras et leur métabolisme dans le

muscle squelettique, spécifiquement en diminuant l‟expression de l‟AMPK. Dès lors, il

est possible que la résistine induise une insulinorésistance hépatique en agissant

directement sur les hépatocytes ou en altérant la capacité du muscle squelettique à

contribuer à l‟homéostasie des acides gras. Elle provoque également une dyslipidémie

chez les souris via une augmentation de la sécrétion des lipoprotéines (328). In vitro, la

résistine diminue l‟action de l‟insuline dans les 3T3-L1 en inhibant certains facteurs de la

cascade de signalisation de l‟insuline, et plus spécifiquement en stimulant SOCS-3

(329).

La résistine est aussi considérée comme une molécule pro-inflammatoire. En

effet, plusieurs études ont mis en évidence une association entre la résistine et des

facteurs inflammatoires comme le TNF , l‟IL-6 et la protéine C-réactive (323, 330, 331).

Elle stimule la synthèse et la sécrétion de TNF et d‟IL-12 dans les macrophages via la

voie dépendante du NF-kB (332). Chez l‟homme, la littérature sur le rôle de la résistine

comme lien moléculaire entre obésité et insulinorésistance est assez partagée. Les

premiers résultats d‟études au sein de plusieurs populations ne vont pas dans le sens

d‟une contribution importante de la résistine au syndrome métabolique. Cependant,

Pagano a montré que les taux d‟ARNm de résistine dans le tissu adipeux sous-cutané

étaient élevés en rapport avec le degré d‟adiposité, suggérant un lien entre les taux

circulants de résistine et l‟obésité chez l‟homme.

- 91 -

MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) est une chemokine qui recrute des

monocytes aux sites d‟inflammation et qui est exprimée et sécrétée entre autres par le

tissu adipeux (333).

L‟augmentation de sécrétion de MCP-1 par le tissu adipeux de souris obèses

entraînerait, par voie paracrine, la sécrétion d‟une variété de cytokines et de

chemokines par les macrophages, responsable d‟une réponse inflammatoire locale et

d‟une modification de l‟expression de gènes adipocytaires, entraînant une

insulinorésistance systémique (334). Plus directement, MCP-1 diminue le captage de

glucose et la phosphorylation du récepteur à l‟insuline dans des adipocytes en culture

(333) mais le mécanisme reste inconnu.

La Retinol Binding Protein 4 (RBP4)- Au cours de l‟étude du phénotype de souris

invalidées pour le transporteur de glucose 4 (Glut4) spécifiquement dans l‟adipocyte,

l‟équipe de B. Kahn a pu observer une insulino-résistance du muscle et du foie (168).

Cette observation a conduit ce groupe à rechercher des sécrétions adipocytaires

dysrégulées et pouvant potentiellement médier cette perte de sensibilité de l‟insuline.

L‟expression adipocytaire et les taux plasmatiques de RBP4 sont plus que doublés chez

ces souris et cette augmentation est retrouvée chez différents modèles d'obésité murine

(db/db et régime hyperlipidique) (168, 335). RBP4 est une protéine de 21 kDa et sa

concentration plasmatique est de 30 à 40 µg/ml.

Son augmentation exogène (injection de RBP4 recombinante ou surexpression chez la

souris) provoque une insulinorésistance et une intolérance au glucose (335). Les souris

dont le gène codant pour RBP4 a été invalidé (rbp4-/-) présentent une sensibilité à

l‟insuline nettement améliorée par rapport aux animaux contrôles et les souris

hétérozygotes pour RBP4 (rbp4+/-) possèdent une sensibilité à l‟insuline intermédiaire

(335). Afin de déterminer l‟effet d‟une baisse de RBP4 indépendamment de l‟impact

d‟une manipulation génétique, les mêmes auteurs ont traité des souris avec du

fenretinide qui provoque l‟hyperexcretion rénale de RBP4 et par conséquent diminue les

taux plasmatiques de l‟adipokine. Chez des souris rendues obèses par un régime riche

en lipides, l‟administration de fenretinide ne modifie pas la prise alimentaire, le poids

corporel et le développement de l‟obésité par contre elle améliore nettement la

sensibilité à l‟insuline et la tolérance au glucose (335). Les mêmes résultats ont été

obtenus chez des souris génétiquement obèses (ob/ob) (335). Au niveau moléculaire,

- 92 -

RBP4 altère la voie de signalisation de l‟insuline dans le muscle en inhibant la

phosphorylation de IRS-1 et de la PI3K (Ost et al. 2007). Au niveau hépatique, les

mêmes expériences ont mis en évidence que RBP4 augmentait la production hépatique

de glucose via une action inhibitrice sur la synthèse de la PEPCK (335).

Chez l‟homme, les résultats sont moins clairs que ceux obtenus chez le rongeur.

Deux études cliniques ont montré des résultats contradictoires concernant les

corrélations entre les taux plasmatiques de RBP4 et l‟insulino-sensibilité. Dans une

première étude, les auteurs ont pu observer une corrélation positive entre les taux

plasmatiques de RBP4 et l‟insulino-resistance chez l‟obèse et le non-obèse (336). Ces

travaux montrent aussi que les taux plasmatiques de RBP4 sont étroitement associés à

certains marqueurs de l‟obésité comme l‟indice de masse corporelle, le ratio

taille/hanche ou encore les taux plasmatiques de triglycérides (336-338). A l‟inverse, les

travaux d‟autres équipes infirment ces résultats et montrent que, contrairement aux

résultats obtenus chez l‟animal, l‟expression de RBP4 dans le TA sous cutané ainsi que

les taux plasmatiques de RBP4 diminuent ou ne varient pas au cours de l‟obésité et/ou

de l‟insulinorésistance (339). A l‟heure actuelle, la pertinence de l‟étude de RBP4

comme cible potentielle pour lutter contre le diabète chez l‟homme est donc discutée.

La lipocaline 2 (Lcn2), aussi connue sous le nom de neutrophile gelatinase,

siderocaline ou 24p3- appartient à la même famille que RBP4. Les lipocalines sont des

petites protéines circulantes contenant une partie hydrophobe où un ligand peu venir se

fixer (340). Les ligands connus sont les stéroïdes, les phéromones et dans le cas de la

Lcn2 , les siderophores (341). Un sidérophore est un élément chimique secrété par les

micro-organismes et capable de chélater l'ion Fe3+. Au pH neutre, l'ion Fe3+ a une

solubilité faible, ce qui rend son utilisation par l'organisme impossible. Les sidérophores

solubilisent les ions fer en formant des complexes qui peuvent être utilisés par des

mécanismes de transport actif. La plupart des sidérophores sont des peptides non

ribosomaux. La Lcn2 est utilisée par le système immunitaire des mammifères pour

séquestrer les sidérophores et ainsi priver les bactéries de fer.

In vivo, il a d‟abord été montré que la Lcn2 était synthétisée par le TA (342-345),

puis quelque temps après, l‟adipocyte a pu être identifié comme étant la source

principale de Lcn2 (346). De plus, l‟expression élevée de Lcn2 dans l‟adipocyte de

http://fr.wikipedia.org/wiki/Micro-organisme

http://fr.wikipedia.org/wiki/Ch%C3%A9lation

http://fr.wikipedia.org/wiki/Ion

http://fr.wikipedia.org/wiki/Fer

http://fr.wikipedia.org/wiki/Potentiel_hydrog%C3%A8ne

http://fr.wikipedia.org/wiki/Solubilit%C3%A9

http://fr.wikipedia.org/wiki/Complexe_%28chimie%29

http://fr.wikipedia.org/wiki/Transport_actif

http://fr.wikipedia.org/wiki/Peptide

http://fr.wikipedia.org/wiki/Ribosome

- 93 -

l‟animal obèse et insulino-résistant pose les premières bases de la relation qu‟il peut

exister entre cette adipokine et l‟insulino-sensibilité. In vitro, l‟invalidation transitoire de la

Lcn2 montre une amélioration du transport de glucose médié par l'insuline (346).

D‟autres arguments vont dans le sens d'une contribution de cette adipokine à l'insulino-

résistance:

- la synthèse de Lcn2 est augmentée par des agents qui induisent

l‟insulino-résistance (dexaméthasone et TNF ) (346).

- une hyperglycémie prolongée est aussi cause d‟une expression de

Lcn2 accrue (344).

- les TZD réduisent l‟expression de la Lcn2 adipocytaire (347).

En ce qui concerne les mécanismes utilisés par la Lcn2 pour médier l‟insulino-

résistance, peu de choses ont été faites. Il semble cependant que le lien entre Lcn2 et

l‟ion fer puisse jouer un rôle au cours du diabète puisqu‟il a pu être montré que les

diabétiques avaient un taux de fer supérieur à la moyenne et que les patients atteints

d‟hémochromatose (maladie génétique où les patient présentent une hyperabsorption

du fer par l‟intestin) présentent également une résistance à l‟insuline (348, 349).

C1q/TNF-related protein (CTRP9)- est une glycoprotéine sécrétée quasiment

exclusivement par le TA (350, 351). Au sein de ce tissu, l‟équipe qui a découvert le

CTRP9 a aussi montré que l‟ARNm codant pour cette protéine était retrouvé en quantité

similaire dans les adipocytes et dans les cellules de la FSV. Comme pour d'autres

adipokines, les femelles possèdent un taux d'ARNm de CTRP9 supérieur à celui des

mâles. Au cours de l‟analyse de la séquence génétique codant pour CTRP9, les mêmes

auteurs ont observé que CTRP9 possédait une séquence comparable à celle de

l‟adiponectine (350, 351). Comme l‟adiponectine, CTRP9 possède une séquence signal,

un domaine N-terminal variable, un domaine collagène et un domaine C-terminal

globulaire. L'homologie avec l'adiponectine ne s'arrête pas là puisque CTRP9 est aussi

capable de s'associer en trimères, hexamères et formes de haut poids moléculaire. De

plus, lors de sa synthèse, CTRP9 s'associe aussi avec l'adiponectine dans le réticulum

endoplasmique et dans l'appareil de Golgi. Ces ressemblances avec l'adiponectine ont

naturellement conduit les investigateurs à étudier le rôle de cette nouvelle adipokine au

sein du métabolisme énergétique. Pour cela, ils ont surexprimé CTRP9 grâce à un

adénovirus chez la souris et ils ont pu observer une faible diminution de la glycémie des

- 94 -

animaux (350, 351). Dans des myotubes en culture, CTRP9 active spécifiquement des

voies impliquées dans le métabolisme glucidique comme l'AMPK, PKB ou encore la voie

des MAPK. Ces résultats montrent que CTRP9 semble impliqué dans la régulation de

l'homéostasie glucidique mais d'autres éléments doivent encore être apportés afin de

confirmer son rôle bénéfique ou délétère au cours de l'installation de l'obésité et de

l'insulino-résistance.

Les adipokines bénéfiques

La leptine- En 1959, Hervey réalise l‟expérience qui va changer la vision que l‟on avait

du TA (352). En effet, grâce au processus chirurgical de parabiose, il va montrer pour la

première fois le rôle endocrine que peut exercer le TA. Les expériences de parabioses

sont faites entre un rat rendu obèse par une lésion hypothalamique et un rat contrôle.

Suite à cette parabiose, le comportement du rat obèse n‟est pas modifié tandis que le

rat contrôle cesse de s‟alimenter. Harvey suggère alors l‟existence d‟un facteur de

satiété circulant dont la concentration chez le rat obèse devait être augmentée par

rapport au rat contrôle.

Les conclusions de Harvey sont ensuite soutenues par la découverte de souris

génétiquement obèses, la souris « obese »(ob/ob) et la souris « diabètique» (db/db),

caractérisées par une hyperphagie, une dépense énergétique réduite et une obésité

morbide. En 1973, la parabiose entre souris contrôle et souris ob/ob provoque une

réduction de la masse grasse des souris ob/ob mais n‟a pas d‟effet sur la souris témoin.

La parabiose entre les souris db/db et les souris contrôle n‟a pas d‟effet sur la souris

db/db mais induit une forte réduction de la prise alimentaire de la souris contrôle,

conduisant à sa mort. Les auteurs de ces travaux interprètent ces résultats de la

manière suivante : les souris ob/ob ne produisent pas le facteur de satiété tandis que les

souris db/db le produisent mais y sont insensibles. Il sera alors démontré que le gène ob

code pour la leptine alors le gène db code pour son récepteur. Suite à l‟obtention de la

séquence nucléotidique du gène ob, son analyse en fonction de critères de similitude ou

d‟homologie a permis l‟identification d‟une séquence caractéristique conduisant à

l‟identification de la leptine.

La leptine est une protéine de 16 kDa. Une partie importante de sa séquence

peptidique est conservée entre les différentes espèces étudiées (80% d‟homologie entre

- 95 -

homme, souris et rat) (353). L‟étude structurale de la leptine menée par Zhang et ses

collaborateurs (353) a montré que la leptine est constituée de 4 hélices anti-parallèles

connectées par deux longues boucles et une plus courte. Les résidus les plus conservés

sont importants pour le maintient de l‟intégrité structurale de la leptine ainsi que pour sa

fonction biologique et sont situés dans le cœur hydrophobe de la protéine.

La leptine est une hormone, circulant dans le plasma à une concentration

dépendante de la masse adipeuse et du statut énergétique de l‟individu. Dans ce sens,

les adipocytes du TA blanc ont longtemps été considérés comme les seules cellules

productrices de leptine. Cependant une synthèse ectopique de leptine a été mise en

évidence dans d‟autres tissus comme le muscle, le foie et l‟hypophyse (354-356). La

contribution de la synthèse ectopique de leptine dans la concentration plasmatique reste

sujette à controverse, et à ce jour les adipocytes restent considérés comme la principale

source de leptine.

Que ce soit chez l'homme ou chez l'animal, l‟obésité est associée à une élévation des

taux plasmatiques de leptine tandis que les états lipodystrophiques sont associés à une

réduction de ce taux (357). La nutrition exerce aussi un contrôle sur la production de

leptine. Ainsi, à la suite d‟un repas, le niveau plasmatique augmente chez les rongeurs

mais il semble inchangé chez l‟homme (358, 359). Chez l‟homme, il faut plusieurs jours

de régime hypercalorique pour voir les taux plasmatiques de leptine augmenter.

Cependant, un jeûne de 24 à 48h induit une forte baisse de la concentration

plasmatique de leptine chez les rongeurs et chez l'homme. Enfin, la sécrétion de leptine

semble également être corrélée à la composition et à l‟apport calorique des repas (360).

Cette régulation contrôlée par la nutrition est liée en partie à l‟insuline. Des études

réalisées in vitro montrent que l‟insuline stimule la synthèse et la sécrétion de leptine

dans une lignée d‟adipocytes de souris ainsi que dans les cultures primaires

d‟adipocytes humains isolés (361, 362). In vivo, l‟injection d‟insuline chez les rongeurs

entraîne également une augmentation de la concentration plasmatique de leptine. C‟est

également le cas chez l‟homme soumis à une perfusion d‟insuline (359).

Il existe d‟autres facteurs régulant la sécrétion de leptine. Parmi les facteurs qui

influencent positivement la sécrétion de leptine, on trouve le glucose, les

glucocorticoïdes (361), le TNF (363), les estrogènes (364), l‟interleukine-1 (365) ou

encore les endotoxines (307).

- 96 -

Par opposition, certains facteurs régulent négativement la production de leptine. C‟est le

cas pour l‟hormone de croissance (366), les TZD (367, 368)ou les acides gras libres

(369).

L‟équipe de Tepper a été la première à isoler et à cloner le récepteur de la leptine

(ObR) (370). Depuis, six isoformes ont pu être caractérisées et sont nommées de ObRa

à ObRf. Elles sont générées par épissage alternatif à partir du même ARNm. ObRa est

exprimée dans l‟ensemble des tissus périphériques étudiés (hypophyse, foie, muscle

squelettique et lisse, cœur, rein pancréas, os poumons, intestins, testicules, ovaire, rate,

glande medullosurrénale, tissu adipeux) suggérant une grande diversité dans les

fonctions de la leptine. Même si ObRa est la forme la plus exprimée au niveau

périphérique, l‟isoforme ObRb, exprimée au niveau central, semble être la plus

biologiquement important. C‟est elle qui est mutée chez la souris db/db (371, 372) et le

rat Zucker (373). Initialement, ObRb n‟avait été montrée qu‟au niveau central.

Cependant, quelques études montrent sa présence au niveau de la glande

médullosurrénale, du rein, du poumon, du muscle et du foie (374, 375).

Action métabolique centrale : La régulation de la balance énergétique s‟appuie

sur des signaux périphériques, nerveux, endocrines ou métaboliques intégrés au niveau

central permettant ainsi une réponse adaptative. Le système nerveux central (SNC)

régule la balance énergétique par 3 mécanismes:

-le comportement alimentaire (prise alimentaire, activité physique)

-le système nerveux autonome (dépense énergétique : métabolisme basal,

thermogénèse adaptative)

-le système neuro-endocrinien et la sécrétion d‟hormones (prise

alimentaire, métabolisme basal, thermogénèse adaptative)

L‟acteur principal du maintient de l‟homéostasie énergétique au niveau central est

l‟hypothalamus. Le système de régulation implique des circuits neuronaux complexes

entre les différents noyaux hypothalamiques, communicant par l‟intermédiaire de

neuropeptides. Ces derniers peuvent être classés en deux catégories : les

neuropeptides oréxigènes qui stimulent la prise alimentaire et inhibent les dépenses

énergétiques (neuropeptide anabolique) et les neuropeptides anorexigènes qui, à

- 97 -

l‟inverse, inhibent la prise alimentaire et stimulent les dépenses énergétiques

(neuropeptides cataboliques).

L‟injection au niveau central de leptine chez la souris induit une baisse de la prise

alimentaire ainsi qu‟une augmentation des dépenses énergétiques, ce qui se traduit par

une baisse des triglycérides et des acides gras plasmatiques (376). Pour que la leptine

synthétisée dans les adipocytes puisse agir au niveau du SNC, il faut que l‟hormone

puisse passer la barrière hémato-encéphalique (BHE). Pour cela, la leptine est

transportée par ObRa selon un processus actif, saturable et finement régulé. Ce

transport est d‟autant plus efficace que la concentration plasmatique en leptine est

élevée. Cependant, dans le cas de fortes concentrations de leptine caractéristiques de

l‟obésité, ce transport est altéré.

Dans le SNC, la cible principale de la leptine est le noyau arqué qui est constitué entre

autres de deux populations distinctes de neurones impliqués dans le contrôle de la

balance énergétique. Ainsi, la leptine inhibe l‟activité des neurones oréxigènes de

premier ordre NPY et AgRP et stimule l‟activité des neurones anorexigènes POMC et

CART.

Action métabolique périphérique : En plus de son effet central, la leptine peut

aussi agir au niveau périphérique principalement sur les tissus insulino-sensibles. La

leptine stimule la lipolyse d‟adipocytes de souris et cet effet n‟est pas retrouvé sur des

adipocytes de souris db/db (377). La leptine augmente l‟oxydation des AG et inhibe la

lipogénèse dans les tissus autres que le tissu adipeux. En effet, elle agit par

l‟intermédiaire de son récepteur ObRb qui est couplé au système Jak/Stat ou

directement sur la stimulation de l‟AMPK qui phosphoryle et inhibe l‟ACC (378). De plus

la leptine inhibe également l‟expression de SREBP-1c dans le foie, le pancréas et le TA

inhibant ainsi la lipogénèse dans ces tissus (379). Enfin l‟hormone est capable de

stimuler le transport de glucose dans le muscle grâce à l‟activation de l‟AMPK (378).

Comme nous l‟avons déjà évoqué, l‟obésité est caractérisée par des niveaux

plasmatiques de leptine élevés. A partir d‟une certaine concentration en leptine, cette

hormone n‟a plus d‟effet au niveau central et périphérique (380). Ce phénomène appelé

résistance à la leptine est caractéristique de l‟obésité. La cause et les mécanismes

- 98 -

d‟établissement de la résistance à la leptine sont encore mal connus et plusieurs

hypothèses sont envisagées pour expliquer ce processus :

-un défaut dans le transport de la leptine à travers la BHE

-une diminution de l‟expression de ObRb au niveau central et périphérique (381).

-un défaut dans les voies de signalisation activées en réponse à la leptine (notamment

une suractivation des protéines SOCS-3 et PTP1B responsables de la désensibilisation

du récépteur ObR) (382, 383).

Cette résistance à la leptine, qui semble être plutôt centrale, empêche toute possibilité

de traitement tant que les mécanismes responsables de cette désensibilisation n‟ont pas

été identifié.

L’adiponectine- Identifiée par plusieurs équipes, l'adiponectine est connue sous

différents noms en relation avec sa structure ou ses propriétés (384). Elle est appelée

ACRP30 (adipocyte complement-related protein of 30 kDa) ou adipoQ chez la souris et

GBP28 (gelatin-binding protein 28) ou APM1 (adipose most abundant gene transcript 1)

(385) chez l‟homme. Cette protéine de 247 acides aminés chez la souris et 244 chez

l‟homme est composée d'un peptide signal destiné à être clivé, d‟un domaine N-terminal

de type collagène et d‟un domaine C-terminal globulaire, avec une structure en triple

hélice. Son domaine globulaire présente des homologies de structure avec certaines

formes de collagène mais aussi avec la fraction C1q du complément et les cytokines de

la famille du TNF (384).

La protéine native s'assemble pour former des trimères qui s‟associent ensuite entre

eux via la formation des ponts dissulfures pour former des hexamères et des complexes

de haut poids moléculaire pouvant compter jusqu‟à 6 trimères. En plus de ces formes

multimériques, le groupe de Lodish a détecté dans le plasma humain une forme

globulaire issue d‟une protéolyse (386). Il existe un dimorphisme sexuel pour la

concentration plasmatique d‟adiponectine qui est plus élevée chez les femmes que chez

les hommes (387, 388). Des études réalisées sur les souris suggèrent que les

androgènes seraient à l‟origine d‟un abaissement de l‟adiponectinémie chez les mâles.

En effet, si l‟ovariectomie ne modifie pas la concentration d‟adiponectine, la castration

induit son augmentation. De même, un traitement à la testostérone provoque sa

diminution.

- 99 -

Deux récepteurs de l‟adiponectine ont été clonés (389). Ce sont des récepteurs à

7 domaines transmembranaires qui sont structurellement et fonctionnellement différents

des récepteurs couplés aux protéines G. AdipoR1 a une expression ubiquitaire, avec

une prédominance dans le muscle squelettique. Il possède une forte affinité pour la

forme globulaire de l‟adiponectine mais une affinité plus faible pour la forme totale.

AdipoR2 est préférentiellement exprimé dans le foie avec une affinité intermédiaire pour

les formes globulaire et totale. La suppression de l‟expression d‟AdipoR1 et d‟AdipoR2

s‟accompagne d‟une diminution des effets de l‟adiponectine sur l‟oxydation des acides

gras et l‟utilisation du glucose, ce qui confirme que ces récepteurs sont les médiateurs

de l‟action de l‟adiponectine. De nombreuses études sont actuellement en cours pour

essayer de mieux comprendre le rôle joué par ces récepteurs dans la transmission du

message adiponectine

L‟adiponectine est abondamment produite par le tissu adipeux blanc, ses

concentrations circulantes sont de l‟ordre de 5 à 30 mg/L, ce qui représente 0,01 % des

protéines plasmatiques totales. Le niveau d‟expression des ARNm est toutefois différent

selon la localisation du TA étudié puisqu‟il est 30% plus faible dans le tissu adipeux

viscéral que dans tissu adipeux sous-cutané abdominal, que les sujets soient minces ou

obèses (390).

Les concentrations circulantes d‟adiponectine sont diminuées chez les souris

obèses et diabétiques (391). Elles sont également fortement abaissées chez l‟homme

dans l‟obésité et le DT2 (392, 393). Il existe une corrélation inverse entre

l‟adiponectinémie et le degré d‟obésité et plus particulièrement avec la quantité de

graisse viscérale (394, 395). Les résultats des travaux concernant les effets d‟une

réduction pondérale sur les concentrations circulantes d‟adiponectine chez les sujets

obèses sont plus contradictoires. Les premières études ont montré qu‟une perte de

poids suivie d‟une période de stabilisation ou une restriction calorique de longue durée

s‟accompagnaient d‟une augmentation de l‟adiponectine plasmatique (396, 397). En

revanche d‟autres études n‟ont pas mis en évidence de variation d‟adiponectinémie lors

d‟une perte de poids de courte durée (398).

Enfin, une étude réalisée chez des sujets témoins minces a mis en évidence une

diminution des concentrations circulantes d‟adiponectine au cours d‟une restriction

calorique de 4 semaines (399). Des travaux réalisés chez les Indiens Pima ont montré

- 100 -

qu‟une baisse de l‟adiponectinémie précédait l‟apparition de l‟insulino-résistance et du

DT2 (400, 401).

Ce dernier résultat indique que les variations de l‟adiponectinémie ne seraient pas

seulement une conséquence de modifications liées aux situations pathologiques telles

que l‟obésité ou le DT2 mais pourraient également jouer un rôle causal.

Des études ont montré que l‟adiponectine recombinante injectée à des souris

résistantes à l‟insuline, obèses ou dépourvues de tissu adipeux, améliorait

considérablement les anomalies métaboliques de ces animaux (402, 403). Ceci se

traduit par une amélioration sensible de la résistance à l‟insuline associée à une

normalisation du profil lipidique et à une réduction de la stéatose musculaire et

hépatique. Ces effets semblent passer en partie par l‟activation de l‟AMPK (104), avec

pour conséquence, une augmentation de l‟utilisation du glucose et de l‟oxydation des

acides gras par le muscle et une réduction de la production hépatique de glucose. Les

effets de l‟adiponectine sur la sensibilité à l‟insuline pourraient aussi être en partie

indirects et faire intervenir des cytokines telles que le TNF . En effet, un traitement à

l‟adiponectine est capable d‟exercer une régulation négative sur le TNF et chez les

souris déficientes en adiponectine, l‟expression et la sécrétion de TNF sont

augmentées (404). Certaines molécules, participant à la résistance à l‟insuline, telles

que les glucocorticoïdes et les agonistes β-adrénergiques entraînent une diminution de

l‟expression de l‟adiponectine (306, 405).

L’adipsine/ASP (acylation-stimulating protein) - L‟adipocyte sécrète les facteurs C3,

B et D (adipsine) du système alterne du complément. L‟adipsine (ASP) qui est une

sérine protéase, clive le facteur B du complément quand celui-ci est complexé au

facteur C3. Le facteur C3a ainsi engendré se transforme, après attaque par une

carboxy-peptidase plasmatique, en ASP.

L‟ASP stimule la synthèse des triglycérides dans les adipocytes par deux

mécanismes. D‟une part, elle favorise l‟entrée de glucose dans l‟adipocyte via la

translocation des transporteurs de glucose (GLUT 1 et 4) des vésicules intracellulaires à

la membrane externe de la cellule. D‟autre part, elle augmente l‟activité de la

diacylglycérol transferase, enzyme impliquée dans la synthèse des triglycérides (406).

- 101 -

L'équipe de K. Cianflone a pu remarquer une augmentation de 85% des taux

plasmatiques d'adipsine chez la souris obèse (db/db) (407).

Dans le TA viscéral de sujets obèses, Saleh et ses collaborateurs ont observés

une diminution du nombre de sites de liaison pour l‟ASP ainsi qu‟une affinité plus faible

de ses récepteurs (408). Ces anomalies pourraient contribuer à un rendement plus

faible du stockage des triglycérides et à une augmentation du flux des acides gras libres

circulants et par là, favoriser les désordres métaboliques associés à l‟obésité viscérale

(408-410).

Chez les souris invalidées pour le gène codant pour l'adipsine (ADKO), il a pu

être observé un retard de la clairance des TG et des AGL après un repas ce qui

confirme le rôle de cette protéine dans le contrôle de l'homéostasie lipidique (407).

La Chemerine- La présence du récepteur orphelin ChemR23 sur des cellules

dendritiques immatures ou des macrophages a conduit Wittamer et ses collaborateurs

(411) à rechercher son ligand dans des fluides inflammatoires. Le fractionnement et la

purification d‟ascites (d‟origine ovarienne ou hépatique) et de fluides synoviaux ont été

testés sur des cellules CHO surexprimant le récepteur ChemR23 couplé à un rapporteur

fluorescent. Ainsi, après plusieurs étapes de purification, les auteurs ont pu montrer que

la chemerine était le ligand naturel de ChemR23. Il s‟agit d‟une protéine

chémoattractante synthétisée par plusieurs tissus et principalement par le foie, le rein et

le tissu adipeux blanc (412). Elle est sécrétée sous une forme immature de 18 kDa

(proChemerine) puis est ensuite clivée à son extrémité C-terminale par une protéase

extracellulaire en une forme biologiquement active de 16 kDa.

La chemerine est retrouvée dans le plasma à une concentration de 3.0 nM chez

l‟homme et 0.6 nM chez la souris (413). Le récepteur ChemR23 est présent sur de

nombreux tissus comme le cœur, le foie, le placenta et le TA blanc. Au sein du TA

blanc, Goralsky et ses collaborateurs (414) ont montré qu‟il n‟existait pas de différence

d‟expression de la chemerine et de son récepteur en fonction de la localisation du TA.

En revanche, au cours de la même étude, les auteurs ont mis en évidence que

l‟expression de la Chemerine et de ChemR23 était 2 fois plus importante dans

l‟adipocyte que dans les cellules non adipocytaire du TA (414).

La quantité importante de récepteurs ChemR23 au niveau adipocytaire a conduit

différentes équipes à s‟intéresser au rôle joué par le complexe Chemerine/ChemR23 au

- 102 -

niveau de la biologie de l‟adipocyte. Très récemment, 3 études différentes ont montré

que la Chemerine influençait l‟adipogénèse tant au niveau d‟une lignée adipocytaire

murine (3T3-L1) que dans l‟adipocyte isolé à partir d‟explants de TA humain (411, 413,

414). La chémerine agit également sur l'expression de certains gènes impliqués dans le

métabolisme lipidique et glucidique. Ainsi, in vitro, la chémérine augmente l'expression

adipocytaire de GLUT 4 ou de FAS (415)). Au cours d‟expériences d‟invalidation du

gène codant pour la chémérine ou pour son récepteur, il a été observé par différentes

approches une nette diminution de l‟adipogénèse (414). De même, au cours du

traitement des cellules 3T3-L1 par un agent prodifférenciant (troglitazone), l‟expression

du complexe chemerine/ChemR23 est significativement augmentée. Cet effet

proadipogénique est médié par l‟activation des MAPK ERK 1/2 connues pour être

impliquées dans ce type de processus (412).

Afin d‟envisager une possible implication de la chémérine dans le développement

de l‟obésité ou de ses pathologies associées, les équipes de Segal et de Sasaki ont

étudié l‟évolution de l‟expression adipocytaire du complexe chémérine/ChemR23 au

cours de l‟obésité. Chez des rats mis en régime gras, on retrouve une augmentation de

l‟expression de la chémérine ainsi que de son récepteur au niveau du tissu adipeux

entier mais également de l‟adipocyte isolé. De plus, chez ces animaux, les taux

plasmatiques de chémérine sont aussi augmentés (412, 413). Puisque la chémérine est

une cytokine qui recrute et active les cellules immunitaires, l‟hypothèse selon laquelle

elle pourrait jouer un rôle dans le développement de l‟inflammation du TA paraît assez

séduisante et mérite d‟être largement approfondie.

La Visfatine a été caractérisée récemment par une approche visant à étudier

différentiellement les gènes exprimés par le TA viscéral entre une situation contrôle et

obèse (416). Cette protéine se nomme aussi PBEF (pre-B cell colony-enhancing factor)

et est connue pour réguler la prolifération des lymphocytes B. Ce facteur peut être

synthétisé par la moelle osseuse, le foie ou les muscles squelettiques et le TA viscéral,

d‟où son nom (Visceral fat).

Chez la souris, l‟expression tissulaire de la visfatine comme ses taux

plasmatiques sont augmentés avec l‟obésité associée à une résistance à l‟insuline

(416).

- 103 -

Les effets de la visfatine sont de plus en plus controversés et certains résultats

concernant le métabolisme glucidique ont même été retirés de la littérature récemment

(416). A sa découverte, l‟équipe de Shimomura avait montré que la visfatine était

caractérisée par des effets insulino-mimétiques. Au cours de cette étude, les auteurs

avaient observé que cette adipokine était un puissant agent adipogénique via la

stimulation du transport de glucose et de la lipogenèse in vitro (416). En effet, elle

semble induire une augmentation du transport de glucose in vitro sur les pré-adipocytes

3T3L1 ou les myocytes L6 (416). L‟administration de visfatine à des souris diabétiques

paraît améliorer la sensibilité à l‟insuline. Cette hypothèse est confirmée par la présence

d‟une hyperglycémie « basale » chez les animaux hétérozygotes pour l‟invalidation de la

visfatine (416). Tout cela serait expliqué par le fait que la visfatine peut se lier sur les

récepteurs à l‟insuline, avec une affinité similaire à l‟insuline mais sur un site de liaison

différent (416). Chez l‟homme, des études ont montré que les taux de visfatine

plasmatique étaient augmentés au cours de l‟obésité et lors de l‟installation de

l‟insulinorésistance (417, 418). Cependant, une autre étude montre que les taux

plasmatiques de visfatine ne sont pas corrélés avec la quantité de TA viscéral et

n‟observe aucune différence d‟expression entre les dépôts adipeux sous-cutanés et

viscéraux (419). Même si plusieurs équipes ont montré un lien entre la visfatine et

l‟obésité, son rôle métabolique nécessite d‟être éclairci (420).

L’Omentine Antérieurement découverte dans l‟intestin et les tissus endothéliaux,

l‟Omentine possède différentes appellations comme l‟intelectine ou la lectine

endothéliale. En 2004, au cours d‟une étude visant à détecter de nouvelles adipokines

s‟exprimant différentiellement en fonction de la localisation du TA, Yang et al. ont pu

mettre en évidence chez l‟homme que l‟omentine était spécifiquement présente dans le

TA omental (421). Au sein de ce tissu, l‟ARN messager de l‟Omentine est exprimé

parallèlement par les cellules adipocytaires et non adipocytaires (421). Cette adipokine

de 313 acides aminés (33kDa) présente à son extrémité N-terminale une séquence

signal hydrophobe permettant sa sécrétion. Ainsi, elle est retrouvée dans le plasma à

une concentration comprise entre 100 ng/ml et 1 µg/ml avec des taux plus importants

chez la femme par rapport à ceux observés chez l‟homme (422). C‟est en 2006 que

l‟équipe de Gong montre que l‟Omentine potentialise de 50% l‟effet de l‟insuline sur le

transport de glucose d‟adipocytes humains isolés à partir de biopsies de TA sous-cutané

- 104 -

ou viscéral . Il est intéressant de noter que l‟Omentine n‟a aucun effet sur le transport de

glucose basal. Dès lors, les auteurs ont privilégié l‟étude d‟une voie de signalisation

commune à celle de l‟insuline et ils ont pu montrer qu‟ Akt était la principale cible de

l‟Omentine (421). Ces résultats ont conduit l‟équipe de McLenithan à étudier la

régulation de cette adipokine chez l‟homme au cours de l‟obésité et du diabète. Malgré

le faible nombre de cas dans cette étude, les auteurs ont pu mettre en évidence que

dans le TA viscéral, l‟expression d‟Omentine est significativement diminuée au cours du

développement de l‟obésité ainsi que lors de la perte de la sensibilité à l‟insuline

(corrélations négatives avec l‟indice de masse corporelle et l‟HOMA-IR) (422). Il

semblerait que chez l‟homme, contrairement aux modèles murins, l‟Omentine soit très

peu exprimée au niveau des dépôts adipeux alors que son ARN messager est présent

au niveau de l‟intestin (De Souza Batista et al., 2007). L‟ensemble de ces résultats

montre que l‟Omentine pourrait devenir une cible thérapeutique intéressante sous

réserve d‟identifier son récepteur afin de déterminer si d‟autres tissus insulinosensibles

(muscle, foie) peuvent être la cible de cette adipokine.

La vaspine a été caractérisée en 2005 par Hida et ses collaborateurs sur un modèle de

rat obèse et insulino-résistant (OLETF) comme étant une nouvelle adipokine ne

s‟exprimant exclusivement que dans le TA épidydimal, rétropéritonéal et mésentérique

(423). Cette adipokine, constituée de 412, 414 ou 415 acides aminés respectivement

chez le rat, la souris et l‟homme, appartient à la superfamille des inhibiteurs de serine

protéase (serpine). L‟étude de Hida révèle que les taux d‟ARNm de la vaspine dans le

TA sont dans un premier temps fortement corrélés avec l‟obésité et l‟insulinorésistance

puis, dans un deuxième temps, l‟expression de cette cytokine diminue parallèlement

avec l‟installation du diabète (424). Les taux plasmatiques de vaspine suivent un profil

identique.

Compte tenu de la forte corrélation qui existe entre l‟insulinorésistance et la

vaspine, les auteurs ont étudié un rôle potentiel de cette production adipocytaire dans le

métabolisme glucidique. L‟administration intrapéritonéale de vaspine humaine

recombinante à des souris rendues obèses et diabétiques (par un régime riche en gras

et en glucose) améliore significativement la tolérance au glucose et la sensibilité à

l‟insuline de ces animaux sans modifier les taux plasmatiques d‟insuline (423). De plus,

les auteurs ont pu observer que le traitement de ces souris par la vaspine permettait de

- 105 -

normaliser le profil d‟expression génique des TA mésentérique et sous-cutané des

souris diabétiques. En effet, l‟expression génique de marqueurs de l‟insulinorésistance

comme GLUT 4, la leptine, la résistine, l‟adiponectine ou encore le TNF montre une

réversion conduisant à des expressions comparables à celles des souris contrôles

(423). Suite à ces résultats, une étude s‟et attachée à caractériser le profil d‟expression

de la vaspine chez l‟homme. Il semblerait que l‟expression de cette adipokine soit

globalement associée à l‟obésité, l‟insulinorésistance et au métabolisme avec des

différences selon la localisation des TA (424). De façon intéressante, les taux

plasmatiques de vaspine sont deux fois plus élevés chez les femmes (1,3 µg/l) que chez

les hommes (0,6 µg/l) et sont corrélés négativement avec l'insulino-résistance (425,

426). Enfin, comme pour la Chémérine, il conviendrait de vérifier si son rôle observé

chez la souris est retrouvé chez l‟homme.

Le Fasting induced adipose factor (FIAF)-Le récepteur nucléaire PPAR régule la

différenciation adipocytaire et la sensibilité à l‟insuline des adipocytes en agissant sur

l‟expression de gènes cibles. En étudiant ces gènes, deux équipes ont mis en évidence

en 2000 qu‟il existait une nouvelle cible pour PPAR qu‟ils nommèrent le PGAR (PPAR

angiopoietin related) (427). Ce facteur est ensuite renommé ANGTL4 (angiopoietin-like

protein) ou FIAF (Fasting-induced adipose factor) car cette adipokine présente des

similarités structurales avec la famille des angiopoietines et que son expression dans le

TA et dans le sang est nettement augmentée par la mise à jeun (428). L‟étude plus

approfondie de la régulation de ce facteur montre que FIAF est majoritairement exprimé

par les tissus adipeux (blanc et brun) où il est régulé par des agonistes PPAR , et et

qu‟il est aussi retrouvé dans le foie où il est régulé positivement par PPAR . De plus,

l‟analyse du gène codant pour FIAF montre une région de réponse aux PPARs (PPRE)

au niveau de l‟intron 3 (429). D‟après ces résultats, plusieurs équipes ont mené des

travaux étudiant l‟implication de FIAF sur la sphère lipidique. En 2002, Yoshida et ses

collaborateurs montrent que l‟injection aiguë de FIAF à un modèle de souris obèses,

diabètiques et hypotriglycéridémiques (KK/San) entraîne une augmentation importante

des taux plasmatiques d‟acides gras libres et de triglycérides via une action inhibitrice

sur la LPL (430). Dans une étude plus complète, une équipe chinoise rapporte que FIAF

est une hormone impliquée dans la régulation de l‟homéostasie glucidique, du

- 106 -

métabolisme lipidique et de la sensibilité systémique à l‟insuline (431). En effet, en

surexprimant FIAF grâce à un adenovirus dans des modèles de souris normales et/ou

obèses diabétiques (db/db), les auteurs observent une diminution significative de la

glycémie sans modification de l‟insulinémie ainsi qu‟une nette amélioration de la

tolérance au glucose. La cible principale du FIAF semble être le foie puisque l‟adipokine

supprime la production hépatique de glucose basale et améliore la sensibilité à l‟insuline

de cultures primaires d‟hépatocytes (430). Les auteurs confirment que FIAF provoque

une hyperlipidémie et observent une accumulation importante de lipides dans le foie. La

démonstration de Ono (432) selon laquelle l‟activation d‟Akt dans le foie médie une

hypoglycémie associée à une hypertriglycéridémie et à une accumulation hépatique de

lipides permet de concilier l‟ensemble de ces résultats. Cependant, des études

permettant d‟identifier la voie de signalisation de FIAF sont indispensables pour

confirmer cette hypothèse. Chez l‟homme, un potentiel effet hypoglycémiant est soutenu

par le fait que les niveaux plasmatiques de FIAF sont inversement corrélés à ceux du

glucose sanguin. De plus, les taux plasmatiques de FIAF sont significativement

diminués chez les diabétiques de type II alors qu‟ils sont inchangés chez les obèses non

diabétiques (Xu et al., 2005). Enfin, il est important de noter que FIAF est retrouvé dans

le sérum humain et murin sous plusieurs formes: la forme native (20-35 kDa)

synthétisée et sécrétée essentiellement par le TA et des formes tronquées ou

glycosylées surtout produites par le foie. Des études supplémentaires sont nécessaires

afin de déterminer le rôle de ces différentes formes.

Cathepsine L- Les cathepsines sont des protéases à cystéine de la superfamille de la

papaïne qui comprend 11 isoformes à ce jour. La majorité des cathépsines est localisée

dans les endosomes ou les lysosomes, où elles participent à la dégradation

intracellulaire des protéines. Elles sont synthétisées sous forme de précurseurs inactifs

qui subissent une maturation protéolytique en milieu acide (433). De plus en plus de

travaux mettent en évidence une implication de ces cathepsines dans le métabolisme

mais elles semblent exercer un effet indirect en augmentant la capacité d'expansion du

TA (434). Cependant, la cathépsine L est la seule démontrant un rôle direct sur le

métabolisme glucidique. Ainsi, au cours de travaux réalisés in vitro analysant les

variations d‟expression génique existant au cours de la cinétique de différenciation de

pré-adipocytes humains, Yang et ses collaborateurs ont observé que les taux d‟ARNm

- 107 -

codant pour la cathepsine L étaient augmentés d‟un facteur 3 (435). Cette étude

rapporte aussi que la cathepsine L possède une expression adipocytaire augmentée

dans différents modèles d‟obésité et qu‟elle est impliquée dans l‟adipogénèse et la

tolérance au glucose.

Des tests fonctionnels ont été réalisés et les auteurs ont pu observer que le

traitement des cellules avec l‟inhibiteur de la cathepsine L augmentait le transport de

glucose stimulé par l‟insuline. Il semblerait que la cathepsine L soit impliquée dans la

dégradation du récepteur à l‟insuline et participe ainsi en partie à la régulation de

l‟insulino-sensibilité. Cette hypothèse est vérifiée grâce au modèle animal invalidé pour

la cathepsine L (catL-/-). En effet, ces souris présentent un poids corporel moins

important comparé aux animaux contrôles probablement dû à l‟effet adipogénique de la

cathepsine L (435) mais l‟invalidation de la cathepsine L provoque surtout une

diminution des taux plasmatiques de glucose et d‟insuline ainsi qu‟une amélioration de

la tolérance au glucose sans modifier la prise alimentaire. Des résultats identiques ont

pu également être observés lorsque ces animaux ont été nourris par un régime

hyperlipidique (435).

Chez l‟homme, il semblerait que les taux plasmatiques de cathepsine L soient

corrélés négativement avec l‟insulino-sensibilité (436). Cependant, de plus amples

études sont nécessaires afin de pouvoir envisager des perspectives thérapeutiques

ciblant la cathepsine L.

- 108 -

PARTIE III Le système Apeline/APJ

I. Le récepteur APJ

1) Découverte d'APJ

Différentes molécules bioactives comme les hormones, les neurotransmetteurs et

certaines chémokines transmettent leur signal cellulaire en se liant à des récepteurs à

sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG). Les récents

progrès dans l'analyse du génome ont conduit à la découverte de nouveaux gènes

codant pour des RCPG dont le ligand est inconnu. Ces récepteurs sont nommés

"récepteur orphelins" dans l'attente de la découverte de leur ligand endogène.

Le récepteur APJ (putative receptor protein related to AT1) appartient à la famille

des RCPG. Il a été identifié la première fois par O'Dowd et ses collaborateurs en 1993

(437) sur la bande q12 du chromosome 11 humain. Cette découverte a eu lieu alors que

les auteurs recherchaient des homologues du récepteur à la vassopressine dans le

cerveau humain. Le clonage de ce gène a été effectué par PCR (polymerase chain

reaction) avec un ensemble de primers générés sur la base de séquences conservées

des parties transmembranaires des RCPG. Le cDNA obtenu code pour une préprotéine

de 377 acides aminés. Elle possède une forte homologie de séquence avec le récepteur

de type 1 à l'angiotensine II (40 à 50 % d'identité dans les régions transmembranaires)

ce qui lui a valu l'autre nom de angiotensin-II receptor-like 1 (AGTRL1). Cependant,

l'angiotensine II ne se lie pas à APJ lorsqu'il est surexprimé dans des cellules

ovariennes de hamster chinois (CHO) (438) ou dans des fibroblastes (437).

Au cours de l'étude de l'embryogenèse chez la souris, Devic et ses collaborateurs

ont ensuite pu montrer une homologie de séquence en acides aminés (92%) entre le

récepteur msr/apj murin (qui a d'abord été mis en évidence chez le Xénope d'où le nom

de Xénop mesenchyme-associated serpentine receptor) et le récepteur APJ humain

cloné quelques années auparavant (92% d'homologie) (439, 440). En 2000 a eu lieu le

- 109 -

clonage du gène codant pour APJ chez le rat et nommé B78/apj (441, 442) qui possède

une homologie de séquence de 74% avec la forme humaine.

2) Distribution tissulaire d'APJ

Les premières études concernant la localisation anatomique d'APJ ont été

menées par O'Dowd qui grâce à des expériences de Northern blot, a pu retrouver la

présence du récepteur orphelin au niveau du cerveau humain et plus précisément dans

le striatum, l'hippocampe, le cervelet et le cortex. Matsumoto a confirmé ces résultats et

a montré plus spécifiquement qu'APJ était présent dans le corpus callosum, la corde

spinale et la medulla (443). Quelques années après, l'équipe de R. Doms a complété

ces études en rapportant une expression du récepteur principalement dans la corde

spinale, la medulla, les noyaux subthalamiques, la substance noire, l'amydale, le noyau

caudé, le corpus callosum et l'hippocampe. Les mêmes travaux ont aussi mis en

évidence qu'en périphérie, ce sont des tissus comme dans la rate, le thymus, les

ovaires, les testicules, l'intestin et le colon qui expriment le récepteur (444).

En 2000, par la technique de l'hybridation in situ effectuée chez le rat, il a pu être révélé

que le transcrit d'APJ était localisé dans les noyaux paraventriculaires (NPV) et supra-

optiques (NSO) de l'hypothalamus ainsi qu'au niveau du parenchyme pulmonaire, des

cellules glomérulées du cortex rénal, des corps lutéaux de l'ovaire et dans des zones

diffuses de l'hypophyse (442). La localisation précise d'APJ au niveau des noyaux des

neurones magnocellulaires des NPV et NSO (neurones qui contrôlent l'activité de l'axe

hypothalamo-hypophysaire) amène O'Caroll à supposer un rôle du récepteur dans des

processus neuroendocrines que nous détaillerons dans les prochains chapitres. Enfin,

une autre étude procédant à l'analyse de la distribution tissulaire de l'ARNm codant pour

APJ chez le rat par la technique de RT-PCR présentée dans la figure ci-contre (Figure

1C) montre que le récepteur est présent dans presque tous les tissus en quantité

variable (445).

On peut aussi remarquer (figure 12) une plus forte expression du récepteur APJ

dans les tissus issus de rats nouveau-nés. Ceci suggère que le récepteur puisse jouer

un rôle sur le développement embryonnaire sur lequel nous reviendrons plus tard dans

ce manuscrit. Par la suite d'autres localisations ont été observées pour APJ comme le

tractus digestif et les ostéoblastes (446, 447).

- 110 -

De plus, par homologie avec les récepteurs à l'angiotensine 2 et les récepteurs à

la bradykinine, un équipe de l'Université de Toronto travaillant sur des lignées de

cellules nerveuses a pu mettre en évidence qu'APJ était retrouvé au niveau nucléaire

dans différentes zones du cerveau humain (cervelet et NPV). En effet, en s'appuyant sur

des techniques d'immunocytochimie et de mutagénèse dirigée, les auteurs nous

apprennent qu'APJ présente une séquence signal d'adressage permettant au récepteur

de se retrouver au niveau du noyau. Cette étude montre aussi que ce phénomène de

localisation nucléaire est indépendant de la fixation d'un ligand sur APJ (448).

Fig. 14 Expression du récepteur APJ dans différents tissus chez l’homme (d’après

Tatemeoto et al. 1999)

3) Structure d'APJ

Comme nous l'avons déjà évoqué, APJ est un récepteur à 7 domaines

transmembranaires. Peu de choses ont été publiées sur les caractéristiques physiques

de ce récepteur. Cependant, lors de l'étude de la séquence en acides aminés, O'Dowd

observe la présence de sites de phopsphorylation de la protéine kinase AMPc

dépendante (PKA) ainsi que deux sites de palmitoylation et de glycosylation (ODowd et

al. 1993). Plus récemment, Alexanderov et ses collaborateurs ont mis en évidence la

présence de 4 acides aminés cystéines sur les boucles extracellulaires. Selon les

auteurs, la présence de ces résidus laisse pressentir plusieurs possibilités de ponts

- 111 -

dissulfures importants pour le repliement et la conformation tridimensionnelle de la

protéine (449). D'autres résidus cystéines présents au niveau de l'extrémité C-terminale

d'APJ confirment les sites potentiels de palmitoylation proposés par O'Dowd et

retrouvés chez d'autres RCPG.

Cette même étude montre que la stabilité du récepteur est dépendante du milieu.

La concentration en sels (essentiellement NaCl) ainsi que le pH ou la présence de

différents détergents ou petites molécules amphiphiles présents dans les tampons

commerciaux s'avèrent déterminants pour la stabilité d'APJ. En effet, plus la

concentration en NaCl (1 M) est élevée et plus le récepteur APJ semble stable. De

même, un pH faible favoriserait la stabilité du récepteur (perte de stabilité importante

entre pH 6 et pH 6.5). Enfin, alors que l'ajout de sucrose ou de galactose dans le milieu

ne semble pas avoir d'effet sur APJ, celui de citrate ou de l'urée diminue la stabilité du

récepteur. Ces considérations techniques seront à prendre en compte lors

d'expériences impliquant ce récepteur.

Fig.13 Séquence du recépteur APJ de l’homme et du rat (d’après Hosoya et al., 2000)

4) Régulation d'APJ

Plusieurs équipes, qui se sont intéressées aux effets biologiques transmis par APJ, ont

parallèlement étudié la régulation de ce récepteur. C'est le cas par exemple de O'Caroll

et de ses collaborateurs qui ont pu observer que des variations de l'osmolarité pouvaient

réguler l'expression d'APJ dans le NPV ainsi que dans le NSO de rat (450). En effet,

- 112 -

comme nous le reverrons plus en détails dans la partie traitant des effets d'APJ au

niveau du système nerveux central, une charge de sodium (présent dans l'eau de

boisson) ou un déprivation en eau de 48h pratiquée chez des rats entraîne une forte

augmentation (jusqu'8 fois) du niveau d'expression d'APJ au niveau du SNC. De plus,

les neurones parvocellulaires constituant le NPV présentent aussi une expression d'APJ

augmentée lorsque les rats étaient soumis à un stress (450). D'autres régulations ont

été démontrées comme par exemple l'effet positif d'une adrenalectomie chez le rat sur

l'expression d'APJ, signifiant que les glucocorticoïdes endogènes inhibent l'expression

du récepteur au niveau central (450). Très récemment, une étude menée chez le rat

rendu obèse par un régime riche en lipides, a pu mettre en évidence que ces animaux

présentaient une augmentation de l'expression d'APJ hyppothalamique. De plus, dans

cette même étude, les auteurs démontrent que l'apeline, injectée par voie intracérébro-

ventriculaire à ces animaux, entraîne une diminution de l'expression du récepteur (451).

Table 3. Tableau résumant les différents agents ou facteurs pouvant réguler positivement

ou négativement l’expression de l’ARNm ou de la protéine d’APJ

Agent ou facteur Effet Modèle Réference

Osmoticité + (ARNm) SNC rat O'Caroll et al, 2003

Stress +(ARNm) SNC rat O'Caroll et al, 2003

NO/L-Arginine +(ARNm et protéine) SNC rat Bai et al., 2007

Vasculogénèse +(protéine) Vaisseaux rétine

souris

Saint-Geniez et al.,

2003

Insuffisance

cardiaque +(ARNm et protéine) Coeur homme Chen et al., 2003

Insuffisance

cardiaque chronique -(ARNm)

Atrium et ventricule

humain Foldes et al., 2003

Diabète -(ARNm et protéine) Aortes de souris

db/db Zhong et al., 2007

Hypertension -(Protéine) Coeur et aorte de rat

hypertendus (SHR)

Zhong et al., 2005 et

2006

Ligand APJ - (Protéine) Rats obèses Clarke et al., 2008

- 113 -

L'ensemble des régulations observées pour APJ sont résumées dans le tableau

ci-contre (Table 3). Il est intéressant de remarquer que mise à part l'étude récente de

Bai et ses collaborateurs montrant que l'expression d'APJ est augmentée dans les

noyaux caudés de rats qui ont subi une injection intracérbroventriculaire de L-Arginine

(452), ou de celle de Clarke (451) concernant la régulation d'APJ par son ligand aucune

autre étude ne montre un effet direct d'un agent sur l'expression d'APJ.

L'expression du gène codant pour APJ est régulée par une séquence sans intron

située à l'extrémité 5' de la séquence d'APJ. Cette région possède une CAAT box et des

motifs AP-1, AP-2 et Sp1 qui participent à la régulation de l'expression d'APJ. Compte

tenu de ces information, O'Caroll et ses collaborateurs suggèrent que le promoteur du

gène codant pour le récepteur pourrait être sous le contrôle complexe de plusieurs

facteurs comme Sp1, C/EBP, les oestrogènes et les glucocorticoïdes. De plus, grâce à

des expériences conjuguant l'utilisation d'un gène rapporteur (luciférase) et de la

forskoline (provoque l'augmentation intracellulaire d'AMPc), ils montrent que

l'expression du gène pourrait être contrôlée négativement par l'AMPc (453). Nous

verrons par la suite que l'interaction entre APJ et de son ligand provoque une inhibition

de l'AMPc. Ceci laisse alors penser que le ligand peut entraîner une augmentation de

l'expression de son récepteur comme il pu déjà être décrit pour d'autres couples

ligand/récepteur.

Le dernier type de régulation n'est pas transcriptionnel mais post-traductionnel et

il nécessite la présence du ligand d'APJ. En effet, en 2003, l'équipe dirigée par R.J.

Pomerantz a pu mettre en évidence sur des cellules HEK 293 transfectées avec le

récepteur APJ couplé à l'EGFP ("enhance green fluorescence protein") que la fixation

du ligand sur son récepteur entraînait son internalisation. Cette internalisation est

dépendante de la concentration en ligand et elle est contrôlée par des mécanismes

impliquant la transferrine et la clathrine (454). La suppression, par mutagénèse dirigée,

d'une partie de l'extrémité C-terminale du récepteur indique que cette partie est

déterminante pour l'internalisation du récepteur (455) et pourrait donc servir de cible

pharmacologique pour maintenir APJ à la surface de la membrane plasmique.

- 114 -

II. L'Apeline

1) Découverte de l'apeline

En 1998, Tatemoto et ses collaborateurs identifient le ligand endogène du

récepteur orphelin APJ (438). Pour cela, ils s'appuient sur le fait que la liaison d'un

ligand sur son récepteur entraîne une excrétion de protons par les cellules. En effet,

l'induction d'une voie de signalisation cellulaire va conduire à des phénomènes

d'activation de la glycolyse, de la respiration mitochondriale ou encore à l'activation des

canaux calcium qui, in fine, aboutira à l'acidification du milieu. Les auteurs mesurent

donc l'efficacité de différents extraits tissulaires bovins et porcins à acidifier le milieu de

culture de cellules CHO transfectées avec le récepteur APJ. Ils observent que l'extrait

d'estomac bovin provoque la plus forte acidification et entreprennent alors la purification

du ligand d'APJ par utilisation successive de résines échangeuses de cations, de

centrifugations sur gradient linéaire puis de chromatographies en phase liquide (HPLC).

Un peptide est obtenu et nommé apeline pour "APJ endogenous ligand". A partir de la

séquence N-terminale de ce peptide, l'ADN complémentaire est synthétisé et des

recherches menées dans Genbank ont permis de montrer qu'il existait une séquence

codant pour une préproprotéine de 77 acides aminés chez l'homme, le rat et le bovin

(456). Cette préproapeline a été localisée dans le génome humain sur le chromosome

Xq25-26-1. L'homologie de séquence est de 82 % entre le rat et l'humain et de 77 %

entre le rat et le bovin.

2) Structure de l'apeline

L'analyse de la séquence de la préproapeline montre qu'il existe des sites riches en

acides aminés hydrophobes potentiellement impliqués dans un clivage de la

préproprotéine. Le premier site de clivage est localisé au niveau de l'acide aminé 22 et

entraîne la production d'un peptide de 55 acides aminés. Cette forme de 55 acides

aminés constitue la proapeline. Les 22 acides aminés positionnés à l'extrémité N-

terminale semblent constituer une séquence signal pour la sécrétion du peptide (457).

- 115 -

D'autres clivages ont lieu au niveau des sites hydrophobes (résidus arginine 46,

49, 59, 60, 63, 64, 66, 68 et lysine 72) amenant à retrouver l'apeline sous différentes

formes selon les tissus étudiés. Par exemple, Kawamata et ses collaborateurs montrent

qu'une forme longue de 36 acides aminés est plutôt retrouvée au niveau des poumons,

des testicules et de l'utérus alors que les formes de 36 et de 13 acides aminés sont

localisées au niveau de la glande mammaire du rat (458). Dans son étude originelle, en

se basant sur la séquence en acides aminés, Tatemoto avait déjà montré qu'il existait

plusieurs formes d'apeline. Il avait ainsi isolé ou synthétisé de l'apeline 36, de l'apeline

17 et de l'apeline 13 montrant une efficacité croissante de ces 3 peptides à acidifier le

milieu (438). De plus, il a également pu être montré qu'une forme d'apeline 13

pyroglutaminée à son extrémité N-terminale existait (le résidu Glutamine en position 65

se cyclise). Cette modification post-traductionnelle est retrouvée sur d'autres peptides et

permet de les stabiliser et de les protéger contre les dégradations par des peptidases

(199).

Au sein de ces différentes formes d'apeline, l'extrémité C-terminale est très

conservée. En effet, quelle que soit l'espèce étudiée, l'alignement des séquences

codant l'apeline (chez la souris, le rat, le bœuf et l'homme) a révélé une conservation

stricte des 17 derniers acides aminés carboxy-terminaux.

Récemment, une étude a montré que deux molécules de préproapeline pouvaient

s'associer et former des dimères. En effet, le traitement de lysats de tissu cardiaque de

souris par le DTT (dithiothreitol: composé qui détruit les ponts dissulfures) à permis

d'obtenir des bandes de 16 et 8 kDa (correspondant aux dimères et monomères

d'apeline) sur des immunoblots dirigés contre l'apeline, alors qu'une seule bande de 16

kDa (dimères) étaient présente avec les échantillons non traités. Ce résultat semble

assez surprenant puisqu'il n'existe pas de résidus cystéine au sein de 36 derniers

acides aminés de l'apeline. Ceci suggère donc que seules les formes intracellulaires

plus longues que l'apeline 36 (apeline 55 ou 77 par exemple) sont dimériques. Comme

déjà décrit pour d'autres protéines ou peptides, le rôle de cette dimérisation pourrait être

de protéger la preproapeline contre des protéases intracellulaires (459)

- 116 -

Fig 14. Alignement des séquences de l'apeline chez le boeuf, l'homme le rat et la souris (d'aprés

Llorens Cortes et al. 2001). On remarque, en rouge que les 17 derniers acides aminés situés à

l‟extrémité C-terminale sont conservés entre les 4 espèces étudiées.

3) Distribution tissulaire de l'apeline

Comme pour son récepteur, l'apeline est largement distribuée dans les différents tissus

de l'organisme. Au cours de la découverte de l'apeline, Tatemoto met en évidence que

le peptide est présent dans l'estomac et au niveau du SNC des bovins (438). En 1999,

une étude s'intéressant à la distribution tissulaire de l'apeline chez le rat et la souris

remarque que c'est au niveau de la glande mammaire de l'animal en période de

lactation que l'expression de l'apeline est la plus forte dans l'organisme (460). Cette

observation conduit les auteurs à rechercher la présence d'apeline dans le colostrum ou

le lait issu d'animaux (rat et bovin) avant et après des périodes de gestation. L'apeline

est présente dans le colostrum de ces animaux en grande quantité (90 pmol/ml) le jour

de la parturition puis chute les jours suivants (moins de 25 pmol/ml) (460). L'ensemble

de ces premières données concernant la localisation tissulaire de l'apeline va conduire à

étudier son rôle dans le système immunitaire. En effet, l'apeline présente dans le

colostrum ou le lait maternel pourrait intervenir dans la régulation du système

immunitaire du nouveau-né.

La première "cartographie" des tissus exprimant l'apeline est publiée en 2000 par

l'équipe dirigée par O'Dowd (456). Cette étude, pratiquée sur des tissus humains,

montre que l'apeline est fortement exprimée au niveau du cerveau et plus précisément

dans des zones telles que le noyau caudé, le thalamus, l'hypothalamus, l'hippocampe,

- 117 -

et le cortex frontal. Au niveau périphérique, la détection immunohistochimique de

l'apeline est visible dans les cellules des tubules collecteurs du rein, dans les

hépatocytes, dans les îlots pancréatiques, au niveau du placenta, et de certains type de

fibres musculaires. Une présence plus marquée est mise en évidence dans les

poumons et les bronches, au niveau de la rate ou du thymus, ainsi que les cellules

endothéliales constituant les vaisseaux sanguins du cœur et du rein (461, 462)

Chez le rat, on retrouve une expression de l'apeline au niveau du cortex frontal,

du striatum, du cervelet, de l'hippocampe et de l'hypophyse. Des images issues

d'expériences d'hybridation in situ confirment ce résultat et montrent la localisation

précise des neurones de rat exprimant l'apeline. Ainsi, on observe un marquage au

niveau du claustrum, du subiculum, des aires antérieures et postérieures du gyrus

cingulaire et des tubercules olfactifs. De plus, certains noyaux thalamiques et

hypothalamiques présentent un marquage assez dense. C'est le cas pour les noyaux

anterodorsaux, ventropostérieurs, ventromédian et centrolatéraux du thalamus et pour

les noyaux de l'aire supraoptique (NSO) et paraventriculaire (NPV) de l'hypothalamus.

Ces résultats concernant le transcrit de l'apeline sont retrouvés lors d'études

immunohistochimiques chez le rat où le peptide de l'apeline est localisé au niveau des

NPV et NSO mais aussi au niveau d'autres neurones comme ceux appartenant aux

noyau accessoire et suprachiasmatique (463). La localisation de l'apeline au niveau du

noyau accessoire est intéressante car ce noyau est connu comme pouvant sécréter

directement ces productions dans la circulation locale et ainsi atteindre les neurones

vassopressinergiques. Nous verrons que cette distribution anatomique prend toute son

importance lors de l'étude des rôles biologiques de l'apeline.

- 118 -

Fig. 17 Distribution tissulaire de l’ARNm et du peptide de l’apeline. A) L‟ARNm de l‟apeline est

distribué dans de nombreux tissu parmi lesquels le système nerveux central, le cœur le poumon, la

glande mammaire et le tissu adipeux. B) Le peptide de l‟apeline est surtout retrouvé dans les poumons et

dans la glande mammaire.

Au niveau périphérique, l'ARNm codant pour l'apeline est retrouvé au niveau du

rein, du cœur, des testicules et de l'intestin (458). Kawamata et ses collaborateurs

retrouvent ces résultats et mettent en évidence que d'autres tissus comme l'ovaire, le

poumon et le tissu adipeux expriment le messager de l'apeline. Cependant, au cours

d'expériences d'immunoréactivité dirigée contre l'apeline, on remarque que la détection

est surtout localisée au niveau des poumons et de la glande mammaire (458). Il

semblerait donc que la présence du transcrit ne témoigne pas exactement de la

présence du peptide. Par la suite plusieurs études s'intéressant aux rôles biologiques de

l'apeline ont pu localiser le peptide ou son ARNm dans d'autres tissus. Par exemple, on

sait que l'apeline est retrouvée au niveau du tractus gastrointestinal (446) avec une

expression plus importante au niveau du fundum et de l'iléon. Dans ces régions,

A

- 119 -

l'apeline est contenue dans les cellules endocrines et exocrines suggérant que l'apeline

puisse être excrétée par ces cellules dans la lumière intestinale (464).

III. Interaction apeline/APJ

1) Caractéristiques de la liaison apeline/APJ

Au cours d'expériences de liaison pharmacologique pratiquées sur des cellules CHO

transfectées par le récepteur APJ, l'équipe dirigée par M. Fujino montre que l'apeline 13

se lie à son récepteur avec une forte affinité (Kd entre 6.3 et 22.3 pM et Bmax entre 3.01

et 7.4 pmol/mg de protéine selon les études) (445, 458). Cette liaison est rapide et il

semblerait que l'apeline 13 se dissocie assez vite du récepteur ce qui n'est pas le cas de

l'apeline 36. En effet, si l'apeline 36 possède une affinité inférieure à son homologue de

13 acides aminés, elle se lie en revanche plus fortement au récepteur de sorte que lors

d'expériences de compétition la liaison apeline 36/APJ soit difficile à déplacer (445,

458). Sur d'autres types cellulaires exprimant de façon endogène APJ comme les

HEK293 (human embryonnic kidney), les expériences de binding ont montré que

l'apeline 13 pyroglutaminée possédait un seul site de liaison avec une haute affinité

(Kd= 2.7 nM et Bmax= 275 pmol/mg de protéine) (465, 466). Enfin, sur des tissus

humains ou murins isolés (cœur, poumon ou cerveau), l'apeline 13 se lie avec une

affinité du même ordre (moins de 1nM) et la quantification d'APJ sur ces tissus montre

un Bmax de 5 à 10 fmol/mg de protéine (Katugampola et al.,2001).

Compte tenu des nombreuses formes d'apeline qui sont retrouvées dans la

circulation, plusieurs équipes se sont attachées à déterminer quels acides aminés

étaient importants dans la liaison apeline/APJ. Pour cela l‟essentiel des travaux a

consisté à étudier les effets de différentes formes d‟apeline sur les effets décrits comme

l‟acidification du milieu, l‟inhibition de l‟AC ou encore la capacité de l‟apeline à induire

l‟internalisation du récepteur APJ.

Comme nous l‟avons vu plus haut, les premières expériences concernant la liaison

apeline/APJ montrent que les formes courtes d‟apeline ont une meilleure capacité à

- 120 -

inhiber l‟AC et ainsi à diminuer les taux d‟AMPc intracellulaires (445, 454). Les travaux

de De Mota effectués sur des cellules CHO exprimant le récepteur APJ de rat mettent

en évidence que l‟élongation de l‟apeline 17 par une tyrosine en N-terminal ou la

délétion des quatre premiers acides aminés (équivaut à obtenir l‟apeline 13) ne modifie

pas la capacité du peptide à inhiber la production d‟AMPc (441). En revanche, la

délétion des sept premiers acides aminés (équivaut à obtenir l‟apeline 10) ou la

substitution de la phénylalanine en position C-terminale par une alanine, abolit

totalement l‟activité du peptide (441).

Medhurst et ses collaborateurs montrent par des techniques d‟Alanine-scan

(remplacement d‟un acide aminé par une alanine) que les acides aminés en position N-

terminale sont plus importants que ceux positionnés à l‟extrémité C-terminale pour la

liaison à APJ. Cette observation est valable que l‟on étudie la liaison apeline/APJ ou sa

fonctionnalité (diminution d‟AMPc, augmentation Ca++ intracellulaire) (466). L'explication

de ce résultat semble résider dans le fait qu‟une région située dans la partie N-terminale

(motif « RPRL ») pourrait constituer une séquence de reconnaissance ligand/récepteur.

Cependant les mêmes expériences sont également réalisées par Fan et ses

collaborateurs mais les résultats ne sont pas en accord avec les conclusions de

Medhurst (465). En effet, lors de l‟Ala-scan, ces auteurs observent que la liaison

apeline/APJ peut également être affectée par le remplacement d‟acides aminés située à

l‟extrémité C-terminale (P12 et F13). Plus récemment, El Massari et ses collaborateurs

montrent que la délétion des acides aminés en position N-terminale et C-terminale ne

modifie que très peu l'affinité de l'apeline pour son récepteur. En revanche,

l'internalisation du récepteur est fortement diminuée lorsque les acides aminés en

position C-terminale sont absents (454).

Ces travaux vont démontrer tout leur intérêt lors de l'étude de la régulation de l'apeline.

En effet, une étude a montré en 2005 que le remplacement de la phénylalanine située

position C-terminale (dernier acide aminé) par une alanine antagonise l'effet de l'apeline

(rôle hypotenseur dans cette étude que nous aborderons dans les prochains chapitres)

(459). De plus, une enzyme impliquée dans la régulation de la synthèse de

l'angiotensine interviendrait aussi dans la régulation de l'activité de l'apeline. En effet,

l'ACE2 (Angiotensin converting enzyme 2) clive la phénylalanine en position C-terminale

et pourrait par ce mécanisme inactiver l'apeline (467). Ces hypothèses doivent être

- 121 -

approfondies car peu de choses sont à ce jour connues sur cette enzyme et sur l'activité

biologique de l'apeline dégradée par l'ACE2.

L'ensemble de ces travaux concernant la pharmacologie de l'interaction

apeline/APJ démontre que cette liaison est spécifique, réversible, saturable et que sur

certains tissus humains et murins il n'existe qu'un site de liaison à haute affinité pour

l'apeline.

2) Fonctionnalité de l'interaction apeline/APJ

Acidification du milieu- C'est au cours de la découverte de l'apeline que l'interaction

apeline/APJ est caractérisée pour la première fois. En effet, en 1998, Tatemoto et ses

collaborateurs montrent, sur des cellules CHO transfectées par le récepteur APJ, que la

liaison de l'apeline induit une augmentation de l'acidification extracellulaire. Au cours de

ces expériences, des expériences incrémentant les doses ont permis de mettre en

évidence que l'efficacité des différentes formes d'apeline à acidifier le milieu augmentait

avec le raccourcissement du peptide. Ainsi, l'apeline 13 (pyroglutaminée ou non) acidifie

le milieu extracellulaire avec une EC50 d'environ 0.3 nM alors que les formes de 17 et

36 acides aminés ont respectivement une EC50 de 2.5 et 20 nM (438). Ces conclusions

sont retrouvées par une autre équipe qui montre également que le peptide de 36 acides

aminés entraîne une acidification plus longue que les autres formes d'apeline (445).

Ceci est en accord avec les observations réalisées au cours des expériences

pharmacologiques de liaison de l'apeline sur APJ (445, 458).

Le mécanisme impliqué dans l'acidification du milieu par l'apeline semble être

dépendant de l'échangeur Na+/K+ puisque l'utilisation d'un inhibiteur spécifique (MIA) de

cet échangeur inhibe totalement l'acidification du milieu (445).

Inhibition de l'adenylylcyclase- Les précédentes études montraient qu'APJ était un

récepteur couplé aux protéines Gi/o dont on sait qu'ils agissent en diminuant les

concentrations intracellulaires d'AMPc. En l'absence d'outil pharmacologique (apeline

marquée, agoniste ou antagoniste) et afin de décrire l'interaction apeline/APJ, plusieurs

équipes ont étudié l'effet de l'apeline sur l'activité de l'adenylyl cyclase (AC), enzyme

responsable des taux d'AMPc intracellulaires. Sur les cellules CHO transfectées avec

- 122 -

APJ, l'apeline entraîne une inhibition totale de l'accumulation d'AMPc et ce quelle que

soit la forme d'apeline utilisée (468). Cependant, des différences d'efficacité ont pu être

observées puisque l'EC50 de l'apeline 13 pyroglutaminée est environ 4 fois plus faible

que celle de l'apeline 36. Comme pour l'affinité, la capacité des différents peptides à

promouvoir l'inhibition de la synthèse d'AMPc semble être inversement corrélée à la

taille des fragments d'apeline (441, 445). Ces résultats suggèrent qu'APJ est un

récepteur capable d'agir sur l'adenylyl cyclase en inhibant son activité. Cette hypothèse

est confirmée par la perte de l'effet de l'apeline lors du traitement des cellules avec un

inhibiteur spécifique des protéines Gi/0 (toxine pertussique) (445, 469). Pour appuyer le

couplage d'APJ avec Gi/0, Masri et ses collaborateurs montrent que l'interaction

apeline/APJ ne produit pas d'augmentation des niveaux intracellulaires d'inositol

phosphate synonyme de l'activation des protéines Gq (469). Cette même équipe

démontre également que sous l'influence de son ligand, APJ se lie aux sous-unités i1

ou i2 mais pas i3 (468). Ce résultat constitue une spécificité intrinsèque du récepteur

APJ dont il faudra tenir compte lors de l'étude de différents effets de l'apeline sur des

modèles cellulaires. En effet, le degré d'inhibition de l'adenylyl cyclase est plus important

dans les cellules n'exprimant qu'exclusivement i2 par rapport à celles exprimant i1,

alors qu'il est logiquement nul dans les cellules possédant la forme i3. De plus, il

semblerait que l'affinité de l'apeline pour APJ soit 5 fois plus importante lorsque le

récepteur est couplé à la forme i2 (468). Ces résultats ne montrent pas un couplage

préférentiel d'APJ avec une sous-unité de la protéine G mais souligne plutôt une plus

haute efficacité du couplage APJ/sous unité i2.

Internalisation du récepteur- Après la fixation de leur ligand, de nombreux récepteurs

sont internalisés afin de médier un effet cellulaire ou d'être simplement dégradés ou

recyclés. En 2000, l'équipe dirigée par C. Llorens-Cortes a pu mettre en évidence grâce

au marquage fluorescent d'APJ, que ce récepteur était internalisé dans des cellules

CHO transféctées lorsque l'apeline 17 était présente dans le milieu (441). Evans et ses

collaborateurs confirment ces conclusions et démontrent même que cette internalisation

est très rapide (50% des récepteurs internalisés en 10 min) et quasiment totale (90%

des récepteurs internalisés au bout d'une heure) (470). Il semblerait également que

l'internalisation soit inversement corrélée à la taille de l'apeline utilisée: plus l'apeline est

- 123 -

courte et plus l'internalisation est forte (454). En outre, il apparaît que l'internalisation est

dépendante de la clathrine (454) mais indépendante de la -arrestine (470). L'utilisation

de marqueurs des endosomes (EEA), des lysosomes (Cathepsine D) et des voies de

recyclage (Transferrine) montre que le récepteur est recyclé et pas dégradé lorsque les

cellules sont incubées avec de l'apeline 17. Enfin, après deux heures d'incubation, on

retrouve APJ dans de larges vésicules prés du noyau dans des compartiments de

recyclage périnucléaire (PNRC) (454) Ces phénomènes d'internalisation semblent être

fortement liés à certaines fonctionnalités du récepteur. En effet, El Massari et ses

collaborateurs affirment qu'au cours de leurs travaux visant à étudier en parallèle

l'internalisation d'APJ et l'effet cardiovasculaire de l'apeline, seules les formes capables

de produire l'internalisation ont un effet sur la sphère cardiovasculaire (454). Cependant,

sur des cellules en culture (HEK293) il semblerait que l‟internalisation ne soit pas

toujours accompagnée d‟une signalisation cellulaire (augmentation des taux

intracellulaires de Ca++). Ainsi, en fonction du modèle et de l'effet biologique étudié, il se

peut que l'internalisation d'APJ soit plus ou moins nécessaire pour médier une

signalisation cellulaire.

Voies de signalisation activées par le complexe apeline/APJ

La voie des Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)

Les travaux effectués sur les CHO transféctées par APJ ont permis d'étudier les voies

de signalisation activées par l'apeline dans ces cellules. Comme nous l'avons vu plus

haut, APJ est couplé à Gi/0. Ce couplage est aussi décrit comme pouvant activer la voie

de kinases nommées ERK (extracellular signal-regulated kinase) qui elles-même

appartiennent à la voie des MAPK. Plus en détail, Masri et ses collaborateurs ont

montré que l'apeline pouvait activer la phosphorylation de p42 et p44 qui sont des ERKs

impliquées dans la croissance cellulaire (469). Le blocage de la phosphorylation des

ERKs par la PTX suggère que cet effet est dû à l'activation d'une protéine G i ou G0 dans

les cellules CHO. Des expériences complémentaires ont permis de confirmer que l'effet

de l'apeline ne transitait pas par la sous-unité de la protéine G (469) et qu'il était

indépendant de l'activation de Ras (GTPase pourtant largement impliquée dans les

- 124 -

effets de croissance cellulaire). Bien que l'activation des MAPK via les protéines G soit

souvent dépendante des sous-unités de la protéine G il a pu être montré qu'une

forme mutante de la sous-unité i2 stimulait constitutivement les MAPK (471).

L'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique (GF109203X) démontre que la voie

d'activation des ERK transite nécessairement par la Protéine Kinase C (PKC). Nous

verrons dans les prochains chapitres que ces résultats permettent d'envisager un rôle

de l'apeline dans la prolifération de cellules endothéliales ou gastro-intestinales.

Activation de la P70S6 kinase

L'apeline est capable d'activer la P70S6 kinase (P70S6K ou S6K1) aussi bien dans les

cellules CHO transféctées avec APJ que dans les HUVEC (Human vascular embryonic

cell) exprimant le récepteur de façon endogène (472). La P70S6K est une kinase

capable d'intégrer de nombreux signaux grâce à la phosphorylation sélective de ses

différents résidus qui va entraîner des changements conformationnels successifs à

l'origine de l'activation de la kinase (473). Cette protéine joue un rôle dans le contrôle de

la synthèse protéique et dans la croissance et la prolifération cellulaire (474, 475).La

P70S6K est aussi présente au sein du système nerveux central (476) où il a récemment

été mis en évidence qu'elle pouvait avoir un rôle sur la balance énergétique en synergie

avec la protéine mTOR (477). La signalisation cellulaire étudiée sur les HUVEC a

permis de mettre en évidence que l'apeline provoquait la phosphorylation rapide (2

minutes) et longue (2 heures) de résidus clés tels que les thréonine 421 et 389 mais

aussi la sérine 424 (Masri et al., 2004). Dans cette étude, les auteurs démontrent, grâce

à l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques, que la phosphorylation de la thréonine en

position 389 est dépendante de l'activation d'Akt et de mTOR (voie de la Pi3K) alors que

celle des résidus 421 et 424 sont sous le contrôle de la voie des MAPK (PKC atypique

et ERK). La phosphorylation sur le site 389, un des sites permettant d'activer la fonction

kinase de la P70S6K, semble démontrer que l'apeline est capable d'activer la P70S6K.

Afin de confirmer ce résultat, il est nécessaire de vérifier que l'apeline permet la

phosphorylation du résidu T229 décrit comme étant le dernier résidus phosphorylé

permettant l'activation de la P70S6K (474).

Enfin, il est intéressant de remarquer qu'une telle régulation est observée lors de

l'étude de l'action du VEGF sur les HUVEC (Yu et al., 1999). Nous verrons plus loin que

- 125 -

ce mécanisme pourrait être en partie responsable de l'effet mitogènique et angiogénique

de l'apeline.

Autres cibles cellulaires du système apeline/APJ

Dans des cellules humaines de rein 293T exprimant APJ, Hashimoto et ses

collaborateurs ont pu confirmer que l'apeline induisait la phosphorylation d'Akt/PKB par

une voie dépendante de la protéine Gi et de la PI3K. Ils ont également pu montrer que

la protéine FAK (Focal Adhesion Kinase), responsable de l'adhésion focale et de la

motilité cellulaire était activée par phosphorylation au cours de ces expériences (478).

De la même manière, l'apeline est aussi capable d'activer Akt dans des ostéoblastes

humains (447).

Dans les prochains chapitres de ce manuscrit, nous verrons que l'apeline est

largement impliquée dans la régulation de l'activité cardio-vasculaire ce qui a amené

plusieurs équipes à étudier sa signalisation dans les cellules cardiaques et

endothéliales. Ainsi, dans les cellules musculaires lisses, l'apeline est capable d'activer

la phospholipase C (PLC), la protéine kinase C (PKC) et, par une action indirecte sur

des échangeurs Na+/H+ et Na+/Ca++, d'augmenter la concentration intracellulaire de

calcium. Ce même mécanisme pourrait également expliquer l'augmentation des taux

intracellulaires de Ca++ dans des neurones humains en culture (NT2.N) provoquée par

l'apeline (479). Par la suite, nous décrirons également l'effet de l'apeline sur le tonus

vasculaire et nous allons démontrer que la cible privilégiée de l'apeline dans les cellules

endothéliales est la synthase d'oxide nitrique ou eNOS.

IV. Rôle de l'apeline dans le système cardio-vasculaire

1) Le tonus vasculaire

C'est en 2000 que Lee et ses collaborateurs (Lee et al., 2000) décrivent pour la

première fois un effet de l'apeline sur le système vasculaire. L'injection de deux doses

différentes (3,3 et 6,6 µg/kg poids corporel) d'apeline 13 par voie intraveineuse (iv) à des

rats anesthésiés entraîne une diminution significative et immédiate des pressions

- 126 -

systoliques et diastoliques. Cet effet dure 3 à 4 minutes et il s'accompagne d'une légère

augmentation de la fréquence cardiaque.

Ce résultat est reproduit par deux équipes différentes en 2001 et 2004. En effet,

au cours d'une étude menée aussi sur le rat Wistar anesthésié, Tatemoto et ses

collaborateurs ont pu confirmer que l'injection iv d'apeline entraînait une diminution de la

pression artérielle moyenne (PAM) (480). Cette même étude montre également qu'il

existe une différence d'efficacité entre les formes d'apeline: l'apeline 12 ou 13 possédant

une meilleure capacité à diminuer la PAM que la forme de 36 acides amines (diminution

de la PAM de 26, 11 et 5 mmHg respectivement). En 2004, l'équipe dirigée par C.

Llorens-Cortes montre que l'apeline 17, comparée au fragment de 13 acides aminés,

possède une capacité plus élevée à induire une baisse de la PAM (-12.8 mmHg et -6

mmHg respectivement) (454).

Afin d'expliquer le mécanisme d'action de l'apeline, plusieurs équipes se sont

tournées vers le monoxyde d'azote (NO) puisqu'au niveau des cellules endothéliales,

l'apeline est capable de phosphoryler (sur le résidu serine 1176) et d'activer la Synthase

d'Oxyde Nitrique endothéliale (eNOS) entraînant une synthèse de NO quantitativement

importante. En effet, deux minutes après l'injection i.v d'apeline 13 (7,5 µg/kg), on

observe une augmentation des taux plasmatiques de nitrites oxydés (480, 481). Le NO

est un gaz synthétisé par la eNOS à partir de la L-arginine. Il va activer la guanylate

cyclase et ainsi provoquer la transformation de guanosine triphosphate (GTP) et

guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dont l'augmentation est responsable de la

modulation de l'activité de certaines protéines kinases. Ces enzymes, en favorisant la

sortie de potassium et de calcium hors de la cellule, provoquent une hyperpolarisation

avec pour conséquence une relaxation des fibres musculaires lisses des vaisseaux. A

l'échelle d'un vaisseau, le NO produit par les cellules endothéliales va diffuser jusqu'aux

cellules musculaires lisses composant la paroi vasculaire et provoquer leur relaxation.

L'ensemble de ces mécanismes conduira in fine à des phénomènes de vasodilatations

et de diminution de la pression artérielle.

Il apparaît cependant que le rôle de l'apeline sur les vaisseaux n'est pas

seulement dû aux récepteur APJ présents sur les cellules endothéliales. En effet,

comme nous l'avons déjà vu plus haut, APJ est aussi présent au niveau des cellules

musculaires lisses des certains vaisseaux. Des expériences faites sur des artères

humaines dénuées de cellules endothéliales montrent que l'apeline 13 possède un effet

- 127 -

direct sur les cellules musculaire lisses provoquant leur contraction et par conséquent

pouvant potentiellement médier une vasoconstriction (482). Dans un contexte

physiopathologique de dysfonction endothéliale, on peut aisément imaginer que

l'apeline puisse avoir un rôle de vasoconstricteur et participe indirectement à

l'installation de pathologies vasculaires. Plus récemment, des études réalisées sur des

cellules musculaires lisses de la paroi des vaisseaux montrent que l'apeline est aussi

responsable de la phosphorylation (en Thr 18 et Ser 19) des chaînes lourdes de

myosine, acteurs essentiels de la contraction des cellules musculaires lisses. Cette

activation est perdue lorsque les cellules musculaires lisses sont issues de souris

invalidées pour le récepteur APJ (483).

Même si la plupart des études ont montré un effet vasodilatateur de l'apeline,

certains travaux ont rapporté une augmentation de la PAM. En effet, Kagiyama et ses

collaborateurs ont mis en évidence qu'à très forte concentration (environ 200 µg/kg),

l'apeline 13 injectée en iv pouvait induire une constriction des vaisseaux responsable

d'une augmentation de la PAM. De plus, au cours de cette étude, les auteurs ont pu

observer une augmentation de la fréquence cardiaque (484). Enfin, une étude pratiquée

chez le mouton a révélé que l'apeline (20 µg/kg) pouvait avoir des effets biphasiques sur

la pression artérielle entraînant une diminution (-12 mmHg) suivie d'une augmentation

(+12 mmHg) de celle ci quelques minutes après l'injection (485). Même si ce type de

régulation semble être dû à une adaptation rapide de l'organisme, il apparaît que

l'apeline agit de façon différente sur le tonus vasculaire en fonction de la dose injectée

et de l'espèce étudiée.

Chez l'homme, les études relatives à l'apeline et à la physiologie vasculaire ont

essentiellement concerné les propriétés (localisation et liaison) du couple apeline/APJ.

En effet, en 2001, des études de binding pratiquées ex vivo ont mis en évidence que

l'apeline 13 se liait rapidement au niveau des artères coronaires, de l'aorte et de la veine

saphène (482). La présence du complexe apeline/APJ (détecté par immunohistochimie)

est très prononcée dans la plupart des vaisseaux qui entourent le cœur, le rein et les

poumons. Il est aussi retrouvé au niveau des cellules endothéliales des gros vaisseaux

(462) et colocalisé avec PECAM (CD31 ou platelet-endothelial cell adhesion molecule),

une protéine très présente dans les cellules endothéliales (486). En ce qui concerne les

- 128 -

effets physiologiques de l'apeline sur le système vasculaire humain, seules trois études

ont été jusque là publiées. Deux d'entre elles présentent des travaux réalisés sur des

artères ou des veines ex vivo (482, 487). Katugampola et ses collaborateurs ont montré

que l'apeline augmentait la constriction de la veine saphène dénuée de cellules

endothéliales alors que Salcedo à mis en évidence que l'apeline provoquait une

vasodilatation des artères hépatiques et mésentériques. De façon intéressante, cette

dernière étude montre que l'effet de l'apeline, au niveau des artères hépatiques,

uniquement, n'est pas totalement réprimé lors du blocage pharmacologique de la eNOS.

Ce résultat signifie que dans certains tissus, la vasodilatation médiée par l'apeline n'est

pas exclusivement transduite par la eNOS (487). On pourrait émettre l'hypothèse que

l'apeline puisse devenir une cible potentielle dans le traitement de pathologies

vasculaires spécifiques de certains tissus. L'étude de cette voie parallèle devra donc

être approfondie.

Dernièrement, des travaux ont pu mettre en évidence que l'effet vasodilatateur de

l'apeline était conservé chez l'homme. En effet, bien que l'injection d'apeline 13 ou 36

chez l'homme sain ne semble pas modifier le tonus veineux, les auteurs observent, suite

à l'injection, une vasodilatation artérielle dépendante du NO (488).

Fig. 18 Voies de signalisation de l’apeline dans les cellules les cellules endothéliales

permettant la vasodilatation. Au niveau des cellules endothéliales,l ‟apeline se fixe sur son récepteur

APJ qui va induire une cascade de signalisation impliquant la protéine kinase C (aPKC), la

- 129 -

phosphoinositol-3-phosphate kinase (PI3K) et Akt. Il s‟en suivra une phosphorylation activatrice de la

synthse d‟oxide nitrique endothéliale (eNOS) qui va permettre la libération de NO. Ce NO va pouvoir agir

sur les cellules musculaire lisses entourant les vaisseaux et permettre leur relaxation. Ce phénomène

induiration une dilatation à l‟échelle du vaisseaux.

2) Apeline et système cardiaque

Au cours des différentes études menées in vivo chez le rongeur pour établir le rôle de

l'apeline sur le tonus vasculaire, plusieurs observations ont rapporté des modifications

de la fonction cardiaque consécutives à l'administration du peptide. Cet autre effet de

l'apeline semble posséder deux origines:

Effet cardiaque indirect: effet chronotrope- En 2003, Cheng et ses collaborateurs ont

mis en évidence que l'injection d'apeline à de fortes concentrations (de 15 à 60 µg/kg)

incrémentait de façon dose dépendante la fréquence cardiaque (augmentation de 15 à

40 battements par minute) chez le rat éveillé (113). Avant ces travaux, la plupart des

études décrivant peu ou pas d'effet de l'apeline sur la sphère cardiaque avaient été

réalisées chez le rat anesthésié. Or il est maintenant bien décrit que certains

phénomènes physiologiques ne sont pas observables chez l'animal anesthésié. Dans

son étude, Cheng a pu montrer que l'augmentation de la contraction cardiaque était due

à la mise en place du baroreflexe faisant suite à l'hypotension. Le baroreflexe est un

mécanisme permettant à l'organisme de contrôler la pression artérielle. Des "capteurs

de pression" (barorécepteur) qui se trouvent au niveau des sinus carotidiens et de la

crosse aortique perçoivent les baisses de la pression sanguine et s'opposent à ces

modifications en agissant positivement sur la fréquence cardiaque via la modulation des

systèmes nerveux sympathique et parasympathique. Ainsi, au cours d'une hypotension

provoquée par une injection d'apeline, les barorécepteurs captent la baisse de tension

et s'y opposent en activant le système sympathique et en inhibant le système

parasympathique. La résultante de ces régulations est une augmentation de la

fréquence cardiaque. La démonstration de ces régulations est obtenue lorsque les rats

sont traités par de la mecamylamine, un antagoniste des récepteurs nicotiniques des

ganglions impliqués dans le relais de l'information vasculaire (113, 489). En effet, le

- 130 -

blocage de ces relais centraux inhibe totalement l'augmentation de la fréquence

cardiaque observée chez les animaux témoins en présence d'apeline. Ceci montre bien

que le baroreflexe est à l'origine de l'effet chronotrope observé au cours de

l'administration d'apeline.

Effet cardiaque direct: effet inotrope positif- Bien que les expériences de Cheng

décrites dans le paragraphe précédent plaident pour un lien indirect entre l'apeline et la

fonction cardiaque, la forte présence d'APJ au niveau du cœur (462) a conduit

différentes équipes a étudier le rôle direct du peptide sur cet organe. Pour cela, Szokodi

et ses collaborateurs ont travaillé sur des cœurs isolés et perfusés de rats. Ainsi, ces

auteurs ont pu mettre en évidence que l'apeline augmentait la tension cardiaque avec

une EC50 de 33 pM. Cet effet est rapide (2 min après l'ajout d'apeline) et comparable en

intensité à des inotropes positifs connus tels que l'endothéline ou l'adrenomedulline

mais en deçà de l'effet de l'isoproterenol (agoniste -adrénergique) (490).

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la contraction cardiaque ont aussi

été étudiés. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques a permis de mettre en évidence

que la Phospholipase C (PLC) et la protéine kinase C (PKC) étaient indispensables pour

médier l'effet inotrope positif de l'apeline. Par contre, contrairement à l'effet observé sur

le tonus vasculaire, le monoxyde d'azote (NO) ne semble pas jouer de rôle dans la

contraction cardiaque (490).

L'effet de l'apeline sur la contraction cardiaque semble en partie dûe à une

augmentation des taux intracellulaires de Ca++. En effet, l'inhibition des co-transporteurs

sodium/proton (NHE) et sodium/calcium (NCX) diminue de 50 à 60% la capacité de

l'apeline à stimuler la contraction cardiaque (Szokodi et al., 2002 et Farkasfavi et al.,

2007).

Chez l'homme, le complexe APJ/apeline est présent au niveau du myocarde et

de façon plus marquée au niveau de l'endocarde de l'oreillette droite (ARNm et

immunoréactivité). L'étude immunohistologique de prélèvements de cœurs montre que

l'apeline est présente au niveau des cellules endothéliales endocardiques tapissant

l'oreillette droite (colocalisation avec PECAM) mais peu ou pas détectable au niveau des

cardiomyocytes (462, 486). Aucune autre étude concernant un rôle putatif de l'apeline

dans la physiologie cardiaque humaine n'a à ce jour été publié. En effet, comme nous

- 131 -

allons le voir dans les prochains chapitres, l'essentiel des travaux effectués chez

l'homme concerne l'implication de l'apeline dans la pathologie cardiaque.

Fig. 19 Mécanismes cellulaires impliqués dans la contraction cardiaque induite par

l’apeline. En se fixant sur son récepteur, l‟apeline va permettre d‟activer la phopspholipase C (PLC) et la

protéine kinase C (PKC) dans les cardiomyocytes. Cette activation conduira à une entrée massive de

calcium à l‟intérieur de la cellule grâce aux échangeurs Na/H (NHE) et Na/Ca (NCX). L‟augmentation du

Ca intracellulaire va permettre la phosphorylation des chaînes lourdes de myosine et va ainsi provoquer la

contraction des cellules.

3) Apeline et régulation centrale du système cardiovasculaire

La forte présence d'APJ au niveau des centres cardiorespiratoires situés dans le

bulbe rachidien a conduit trois équipes différentes à étudier l'effet d'injections intra-

cérébroventriculaire (icv) d'apeline sur la fonction cardiaque. Seyedabadi et ses

collaborateurs ont tout d'abord mis en évidence qu'APJ était exprimé par les cellules du

noyau du tractus solitaire (NTS) et de l'aire médullaire rostrale ventrolatérale (RVLM),

deux centres impliqués dans la régulation centrale de l'activité cardiaque (491). Ils ont

ensuite démontré qu'une microinjection icv d'apeline 13 au niveau du RVLM ou du NTS

- 132 -

entraînait une faible augmentation de la pression artérielle. En 2005, ces résultats

concernant un effet central de l'apeline sur la sphère cardiaque sont reproduits par une

équipe japonaise (484). Dans cette étude, les auteurs observent que l'apeline injectée

en icv produit une augmentation de la pression artérielle mais également une

augmentation de la fréquence cardiaque plus importante que lors de l'administration

d'apeline par voie veineuse. De plus, l'apeline injectée directement au niveau central

produit une surexpression de c-fos, un marqueur d'activation neuronal, au niveau du

noyau paraventriculaire qui est impliqué dans la régulation des fluides de l'organisme

alors que l'injection systémique ne produit aucun effet sur l'expression de c-fos.

Cependant, compte tenu de la différence de concentration d'apeline utilisée lors des

expériences entre l'injection iv (de 90 à 225 µg/kg) et icv (de 22 à 90 µg/kg) et de

l'absence de dosage de l'apeline présente au niveau central, il est difficile de comparer

les effets produits par les deux voies d'administration.

4) L'apeline et la physiopathologie cardiovasculaire

a) Etudes descriptives

Les premières observations permettant de supposer un rôle de l'apeline dans la

physiopathologie cardiaque proviennent d'études menées sur des cellules en cultures.

En effet, l'étirement de myocytes issus de ventricules de nouveau-nés de rats entraîne

une diminution de l'expression du messager de l'apeline et d'APJ alors que ceux de

marqueurs de l'insuffisance cardiaque comme les peptides natriurétiques (ANP ou BNP)

sont augmentés. Ces premiers résultats permettent donc d'envisager une implication du

système apeline/APJ dans les pathologies cardiaques. Dans la même étude, les

résultats obtenus in vivo montrent une baisse de 33% de l'expression d'apeline dans le

ventricule gauche de rats hypertendus (rats SHR: spontaneous hypertensive rats) (490).

Ces résultats sont confirmés par l'étude de l'expression de l'ARNm et de la protéine de

l'apeline chez d'autres modèles de rats hypertendus (Rat Dahl-SS ou rats rendus

hypertendus par un traitement à l'isoprotérenol) (492, 493) ou encore chez la souris

(souris db/db hypertendue) (494). En revanche, il semblerait que dans les stades

précoces de l'insuffisance cardiaque ou encore au cours d'autres pathologies

- 133 -

cardiaques, l'expression du messager et de la protéine de l'apeline et d'APJ augmente

(492, 495). Ceci suggère que dans les modèles d'insuffisance cardiaque, le système

apeline/APJ pourrait retarder l'apparition de la maladie alors qu'au contraire, dans

d'autres pathologies cardiaques, le complexe apeline/APJ participerait secondairement

à l'installation de la pathologie. Des expériences complémentaires sont néanmoins

nécessaires pour montrer que cette surexpression myocardique dans les stades

précoces permet de retarder l'apparition d'insuffisance cardiaque plus sévère.

Chez l'homme, même si la plupart des protocoles cliniques étudient les variations

d'apeline plasmatique au cours d'une pathologie cardiovasculaire, deux études se sont

intéressées aux modifications d'expression de l'apeline et de son récepteur dans le

cœur. C'est ainsi qu'en 2003, Foldes et ses collaborateurs montrent que l'expression de

l'apeline et de son récepteur varient en fonction de la partie du cœur et de la pathologie

étudiée (496). En effet, dans le ventricule myocardique humain gauche, les auteurs

observent une nette augmentation de l'expression de l'apeline chez les patients atteints

de pathologies cardiaques coronariennes (PCC) ou de cardiomyopathie (5 et 3 fois

respectivement).

Au niveau de l'oreillette droite, l'expression de l'apeline est 200 fois plus

importante que dans le ventricule myocardique. Ce résultat semble cohérent avec

l'hypothèse avancée par certains groupes selon laquelle l'apeline atriale serait la

principale source d'apeline plasmatique. Cependant, à l'heure actuelle, aucun argument

direct n'est en faveur de cette hypothèse même si plusieurs travaux ont montré une

corrélation positive entre l'apeline atriale et plasmatique (496, 497). Ainsi, au cours de

pathologies cardiaques coronariennes, le marquage immunohistologique atrial d'apeline

diminue de 30%, l'expression d'APJ de 50% et l'apelinémie décroît de 89.8 à 71.6 pg/ml

(496). Cette diminution de l'apelinémie chez les patients atteints d'insuffisance

cardiaque est retrouvée par plusieurs groupes (341, 498, 499). De plus, des dosages

plasmatiques réalisés par l'équipe de T. Quertermous sur des patients insuffisants

cardiaques ont révélés qu'au cours de l'installation de la pathologie, les taux circulants

du peptide augmentait dans les premiers stades de la maladie puis diminuaient de

manière dramatique lors d'insuffisance cardiaque sévère (486). Comme chez le rat, les

auteurs interprètent l'élévation de l'apelinémie qui a lieu dans un premier temps comme

un effet cardioprotecteur du système apeline/APJ, puis la diminution de ces taux

- 134 -

plasmatiques d'apeline comme pouvant participer au développement de l'insuffisance

cardiaque.

Ces hypothèses sont étayées par l'augmentation de l'apelinémie observées au

cours de différentes interventions visant à améliorer la fonction cardiaque. Par exemple,

au cours de la pose d'un dispositif d'assistance du ventricule droit chez l'insuffisant

cardiaque, on observe une élévation d'un facteur 2.5 de l'apelinémie (486). De même,

neuf mois après une resynchronisation cardiaque (possible grâce à la pose d'un

pacemaker), on observe une élévation des taux d'apeline plasmatiques atteignant des

valeurs identiques à celles relevées chez l'homme sain (499).

b) Etudes fonctionnelles

A partir des différentes observations rapportées dans le chapitre précédent, il

semble clair que l'apeline pourrait être une cible dans le traitement des maladies

cardiovasculaires.

Plusieurs équipes ont mis en que l'apeline pourrait être une cible thérapeutique

d'intérêt dans le traitement des maladies cardiaques. Ainsi, chez le rat atteint d'infarctus

du myocarde et de cardiomyopathie provoqués par une ligation au niveau des artères

coronaires, deux équipes différentes ont pu montrer qu'une injection d'apeline (200 g/l)

entraînait une augmentation significative de la contraction cardiaque démontrée par une

amélioration de la Pmax, du rapport dP/dt et du volume d'éjection cardiaque (500, 501).

La voie de signalisation que l'apeline stimule chez le rat hypertendu afin d'augmenter la

contraction cardiaque semble être identique à celle observée chez le rat sain. En effet, il

a été montré ex vivo que l'apeline augmentait la contraction cardiaque en incrémentant

de 36% l'afflux intracellulaire de Ca2+ intracellulaire sur des cœurs issus de rats rendus

insuffisants cardiaques par une exposition de 16 semaines à l'hypoxie (chambre à

hypoxie) (502). Chez la souris db/db, qui présente une augmentation de la réponse à

l'angiotensine et une diminution à celle de l'acéthylcholine, l'apeline utilisée ex vivo sur

des anneaux d'aorte conserve ses propriétés vasodilatatrices alors que l'expression

d'APJ est diminuée au niveau de ces vaisseaux. De plus, l'étude mécanistique montre

que malgré la diminution de l'expression d'APJ dans ce tissu, l'apeline parvient tout de

même à phosphoryler Akt (Ser473) et eNOS (Ser1177) (494, 503).

- 135 -

De plus, chez des rats insuffisants cardiaques, une injection d'apeline diminue la

concentration de malondialdehyde (MDA) produite au niveau du cœur. Le MDA est un

produit délétère issu de la péroxydation lipidique qui pourrait intervenir dans la genèse

de la pathologie cardiaque (493).

Enfin, d'autres études ont permis de montrer des corrélations entre une

amélioration de la fonction cardiovasculaire et une augmentation indirecte (qui n'est pas

provoquée par une injection d'apeline) de l'apelinémie. C'est le cas pour le traitement de

rats spontanément hypertendus (SHR) avec une injection quotidienne d'acide rétinoïque

(10 mg/kg/jour) qui augmente l'expression du système apeline/APJ au niveau du cœur

et de l'aorte et améliore la pression artérielle moyenne (504). L'exercice physique est

également un stimulateur de l'expression de l'apeline et de son récepteur au niveau de

la sphère cardiovasculaire (505). Enfin, l'utilisation d'un inhibiteur de ACE1 (Angiotensin

converting enzyme 1) qui est impliquée dans la régulation des taux d'angiotensine II

entraîne une augmentation des taux d'apeline plasmatique et améliore la fonction

cardiaque (492). Ce résultat montre qu'il existe une étroite relation entre l'angiotensine II

et l'apeline. Récemment, une étude intéressante menée par Chun et ses collaborateurs

a montré que l'apeline s'opposait aux effets proathérogènes de l'angiotensine II dans un

modèle de souris invalidées pour le gène ApoE (impliqué dans le transport du

cholestérol) (506). Au cours de ces travaux, les auteurs observent que la co-infusion

d'apeline et d'angiotensine II diminue les lésions atherosclérotiques (formation

d'aneurysmes aortiques, épaississement néointimal....). Comme pour la vasodilatation,

ce mécanisme antiathérogène semble être médié par le NO puisque le prétraitement

des souris avec un inhibiteur de NOS abolit totalement les effets de l'apeline.

5) Apport des modèles de souris transgéniques

Finalement, l‟importance du système apeline/APJ dans la physiologie

cardiovasculaire a été étudiée au travers de modèles murins présentant une invalidation

du gène codant soit pour l‟apeline soit pour APJ. La première étude concernant les

souris invalidées pour APJ, montre que l‟effet hypotenseur de l‟apeline est supprimé

chez ces souris ainsi que la phosphorylation de la eNOS. Par contre, la PAM n‟est pas

différente des souris témoins mais les souris invalidées pour APJ ont une réponse à

- 136 -

l‟angiotensine II qui est augmentée (481). Les souris APJ-/- n‟ont pas de complications

cardiovasculaires ce qui sous-entend que le système apeline/APJ à lui seul ne joue pas

un rôle majoritaire dans ces phénomènes.

Comme nous l‟avons évoqué, les souris invalidées pour le gène de l‟apeline n‟ont

pas de phénotype marqué jusqu‟à l‟âge adulte puisque les souris ont une morphologie

et une fréquence cardiaque qui ne sont pas modifiées. De plus, elles ont un poids

corporel, une prise alimentaire et une prise hydrique comparable aux souris sauvages.

Par contre, avec l‟âge, ces souris développent progressivement une diminution de la

contractilité cardiaque et une augmentation du diamètre du ventricule gauche en fin de

systole toutes deux compensées par un traitement par voie veineuse d'apeline 13 (507).

Cette étude montre également que l‟apeline joue un rôle important après une surcharge

en pression puisque les souris invalidées pour l‟apeline développent une insuffisance

cardiaque sévère.

En conclusion, l'ensemble de ces résultats concernant le système apeline/APJ et

la sphère cardiovasculaire montre que l'apeline pourrait être un des acteurs les plus

influents sur la régulation cardiaque ou vasculaire. Les résultats obtenus chez l'homme

par Japp et ses collaborateurs sont encourageant et montrent que l'apeline exogène

produit, comme chez la souris, une vasodilatation. En effet, il apparaît nécessaire de

déterminer comment varient les concentrations d'apeline cardiaque et plasmatique au

cours de l'installation de différentes pathologies cardiovasculaires afin de savoir quelles

pathologies réellement cibler au cours d'un traitement à l'apeline.

V. Apeline et Système Nerveux Central

1)Distribution de l'apeline et de son récepteur dans le cerveau

Les techniques d'hybridation in situ ont permis d'observer que l'ARNm du récepteur APJ

était présent dans le cortex cérébral, l'hippocampe, les structures olfactives,

l'hypothalamus et l'hypophyse. Une expression très forte est détectée dans les noyaux

hypothalamiques comme le noyau paraventriculaire (NPV), le noyau supraotique (NSO)

- 137 -

et le noyau arqué ainsi que dans la glande pinéale et les lobes antérieur et

intermédiaires de l'hypophyse (437, 442, 443, 456, 508).

L'équipe dirigée par C. Llorens-Cortès a pu visualiser la présence de neurones

apelinergiques dans le système nerveux central du rat. Ceci a été possible grâce au

développement d'un anticorps polyclonal de haute affinité et séléctif pour la forme de 17

acides aminés de l'apeline (508, 509). Comme pour APJ, la présence de l'apeline est

très marquée dans les structures de l'hypothalamus et du bulbe rachidien impliquées

dans le contrôle de la prise hydrique et alimentaire comme le PVN, le NSO, le noyau

arqué, le noyau réticulé latéral et le noyau ambigu (510). Une immunoréactivité

importante des fibres et des terminaisons nerveuses est également observée dans la

couche interne de l'éminence médiane et dans l'hypophyse postérieure. Cette

observation suggère que les neurones apelinergiques du NPV et du NSO se projettent,

comme les neurones magnocellulaires vasopressinergiques et ocytocinergiques, dans

l'hypophyse postérieure. Cette hypothèse est confirmée par un double marquage

immunofluorescent montrant une colocalisation de l'apeline, de la vassopressine et de

l'ocytocine au niveau des neurones magnocellulaires hypothalamiques (463, 508, 511).

D'autres fibres apelinergiques ont également été visualisées au niveau de la lame

terminale et située le long du troisième ventricule. Cette région est elle aussi impliquée

elle aussi dans la régulation de la prise hydrique (512, 513).

Une telle localisation a mené différentes équipes à supposer un rôle du complexe

apeline/APJ dans la régulation de fonctions régulées par l'axe hypothalamo-

hypophysaire comme la prise hydrique, la prise alimentaire ou l'activité locomotrice.

2) L'apeline et la régulation de l'équilibre hydrique

Chez l'homme, plus de 60% du poids corporel est constitué par de l'eau stockée dans

les compartiments intra et extracellulaires. La perte d'eau entraîne l'activation de

signaux sensoriels (endocrines et neuronaux) qui vont renseigner le cerveau sur le

statut hydrominéral de l'organisme et ainsi permettre une réponse adaptée au maintient

de l'homéostasie hydrique (513).

Des études expérimentales ont mis en évidence que certaines structures du

cerveau étaient impliquées dans la régulation de la balance hydrique (noyau du tractus

- 138 -

solitaire, la medula ventrolatérale rostrale et caudale, le noyau parbrachial, la partie

anteroventrale du 3ème ventricule, l'hypothalamus, etc...). L'ensemble de ses structures

nerveuses va converger essentiellement vers deux centres hypothalamiques que sont le

noyau paraventriculaire (NPV) et le noyau supra-optique (NSO), essentiels, comme

nous l'avons déjà évoqué plus haut, dans le contrôle et la régulation de la balance

hydrominérale. Ainsi, lors d'une diminution de la volémie ou d'une perturbation de

l'osmolarité, l'information est transmise à l'hypothalamus qui va augmenter la production

de vasopressine ou medier la sensation de soif. La vasopressine ou hormone

antidiurétique (AVP pour arginine-vasopressine ou ADH pour antidiuretic hormone) est

une hormone synthétisée par le NPV et le NSO de l'hypothalamus et libérée par

l'hypophyse postérieure. Cette hormone va agir au niveau rénal où elle se lie sur ses

récepteurs V2 situés sur les cellules du tube collecteur. La liaison de l'AVP sur ses

récepteurs va induire une augmentation de la concentration intracellulaire d'AMPc qui va

entraîner une translocation d'aquaporine (canaux hydriques) initialement présents dans

des vésicules cytoplasmiques. Ceci aura pour conséquence une réabsorption de l'eau

vers l'interstitium rénal.

Compte tenu des résultats évoqués plus haut concernant la localisation de l'apeline et

d'APJ au niveau de l'axe hypothalamo-hypophysaire, plusieurs équipes se sont

intéressées au rôle que pouvait jouer le complexe apeline/APJ sur l'équilibre hydrique.

Des études de double marquage associant des techniques d'immunohistochimie et

d'hybridation in situ ont été menées et ont démontré que les récepteurs de la

vassopressine (V1a et V1b) étaient présents au niveau des cellules qui expriment aussi

APJ (509). La colocalisation vassopressine/apeline au niveau des neurones

magnocellulaires et l'association des deux récepteurs au niveau des mêmes cellules a

conduit l'équipe de C. Llorens-Cortès a étudier le rôle de l'apeline sur la libération de

vasopressine (509). Pour cela, les auteurs ont procédé à des injections icv d'apeline 13

pyroglutaminée à différentes doses (100 ng, 300 ng et 1 g) et ont pu observer que

seule l'injection d'1 g d'apeline provoquait une diminution (47%) des taux plasmatiques

de vasopressine chez la souris privée d'eau pendant 24 heures. De la même manière,

alors que la privation d'eau pendant 48 heures induit une augmentation dramatique des

- 139 -

concentrations d'AVP plasmatiques chez la souris (x4), l'injection icv d'apeline 17 (1 g)

permet de limiter cette augmentation.

Pour tenter de mieux appréhender les mécanismes permettant à l'apeline de

réguler la sécrétion d'AVP, De Mota et ses collaborateurs ont utilisé le modèle de la

ratte en lactation dans lequel on retrouve une hyperactivité de neurones

magnocellulaires vasopressinergiques destinée à conserver au mieux l'équilibre

hydrique de l'organisme afin d'obtenir une production optimale de lait. Chez ces

animaux, l'injection icv d'apeline 17 diminue l'activité électrique phasique des neurones

vasopressinergiques une heure après l'administration de 2 pmol du peptide (508). Cette

diminution s'accompagne d'une réduction de la sécrétion de vasopressine dans la

circulation sanguine qui a pour conséquence une diurèse aqueuse plus importante

(508). Plus récemment, Tobin et ses collaborateurs ont pu montrer que l'apeline 13

provoquait une augmentation des taux intracellulaires de Ca++ de neurones

vasopressinergiques et ocytocinergiques (514). Ces travaux ont également montré que

l'apeline 13 était responsable d'une augmentation de l'activité électrique des corps

neuronaux. Il semblerait que l'apeline entraîne une régulation différentielle entre les

corps cellulaires et les extrémités somato-dendritiques. En effet, la plupart des

mécanismes de sécrétions observés au niveau neuronal montrent qu'une augmentation

de l'activité électrique est synonyme d'une sécrétion plus importante. Cependant, dans

quelques situations, un phénomène de régulation différentielle peut donner lieu à une

augmentation de l'activité électrique dans le soma et à une diminution de l'activité

sécrétoire au niveau dendritique (515)comme observé par Tobin pour l'apeline.

On peut ainsi conclure de ces résultats que l'apeline pourrait être libérée au

niveau somatodendritique et exercer un effet inhibiteur direct sur l'activité phasique des

neurones vasopressinergiques et la libération systémique d'AVP.

Un autre argument en faveur d'une étroite interaction entre apeline et l'AVP dans

le contrôle de la balance hydrominérale est apporté par des expériences de privation

hydrique associée à des marquages immunohistochimiques d'AVP et de l'apeline (511).

Les résultats obtenus au cours de ces travaux confirment une présence de l'AVP et de

l'apeline au sein des mêmes cellules (certaines cellules sont AVP+ et apeline+ mais

toutes les apeline+ sont AVP+) mais montrent également qu'à l'intérieur de la cellule,

- 140 -

ces deux peptides ne sont pas colocalisés. En effet, l'apeline est localisée en clusters

autour du noyau alors que l'AVP est distribuée dans tout le cytoplasme. De plus, cette

étude nous apprend aussi que lorsque les animaux sont privés d'eau pendant 48h, une

nette augmentation du marquage de l'apeline (de 9 à 55 fois selon les territoires étudiés)

se produit au niveau du NSO. Selon les auteurs, cette augmentation, concomitante avec

une diminution des taux plasmatiques d'apeline est la résultante d'une diminution de la

sécrétion d'apeline par les neurones apelinergiques. Ainsi, le stress hydrique provoqué

au cours de ces expériences est responsable de la diminution de la sécrétion d'apeline

par les neurones magnocellulaires. Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués

dans cette régulation, les auteurs ont traité ces animaux avec un antagoniste des

récepteurs à l'AVP. Les résultats émanant des ces travaux montrent que ce traitement

diminue partiellement (50% environ) l'immunoréactivite de l'apeline dans le NPV. De

même, l'injection icv d'AVP augmente le marquage dirigé contre l'apeline dans ces

territoires (511). Enfin, dans une autre étude, la même équipe a pu constater une

augmentation de la diurèse en accord avec les modifications des taux plasmatiques

d'AVP observées lorsque l'apeline est administrée aux animaux (508).

Chez l'homme, des travaux consistant à augmenter l'osmolarité plasmatique et à

observer les variations de concentrations plasmatiques d'apeline et d'AVP ont mis en

avant qu'il existait une corrélation négative entre l'osmolarité plasmatique et l'apelinémie

alors que les taux d'AVP plasmatiques augmentaient (516).

L'ensemble de ces travaux met en évidence que lors d'un stress hydrique, la

privation d'eau entraîne une augmentation de la sécrétion d'AVP qui, par effet autocrine

ou paracrine, va provoquer une inhibition de la sécrétion d'apeline. L'apeline, par son

effet antagoniste à celui de l'AVP, semble être un nouveau peptide diurétique impliqué

dans la balance hydrominérale.

Chez l'homme, les résultats obtenus confirment ceux obtenus chez l'animal et

permettent d'envisager l'apeline comme cible pharmacologique dans le traitement de

patients présentant des troubles hydriques. En outre le ratio AVP/apeline semble être un

bon marqueur de l'état hydrominéral chez l'homme et pourrait être utilisé en

investigation clinique.

- 141 -

En 2001, Reaux et ses collaborateurs montrent, chez le rat privé d'eau pendant

24 heures, qu'une injection icv d'apeline 13 pyroglutaminée entraîne une nette

diminution de la prise hydrique (de 7.6 à 4.9 ml) (509). Cet effet est comparable aux

effets déjà observés pour des molécules impliquées dans le contrôle de la prise

hydrique comme les peptides natriurétiques (517). Pour appuyer ce résultat, des études

imunohistochimiques ont permis de caractériser des fibres et des terminaisons

apelinergiques au niveau des centres de la soif (Organe Vasculaire de la Lame

Terminale (OVLT) et Organe Subfornical (SFO)) (510). Cependant, d'autres études n'ont

pas retrouvé les mêmes résultats. En effet, les équipes dirigées par O'Dowd et par

Bloom (456, 518)) montrent que l'apeline provoque une augmentation de la prise

hydrique dépendante de la dose. D'autres travaux ne retrouvent aucun effet de l'apeline

lorsqu'elle est administrée au niveau central (Mitra et al., 2006). Les auteurs expliquent

ces désaccords par des différences dans le choix des animaux, dans leur statut

hydrique ou encore dans la précision de la zone du cerveau où l'injection d'apeline est

pratiquée.

Les résultats concernant la régulation de la sécrétion de vasopressine par

l'apeline sont reproduits par plusieurs équipes et vont dans le sens d'une diminution de

la prise hydrique et d'une augmentation de la diurèse. Cependant, il semble nécessaire

d'explorer l'effet de l'apeline sur la prise hydrique de plusieurs espèces animales

différentes ainsi que d'observer l'action du peptide en fonction de l'état d'hydratation de

l'animal.

- 142 -

Fig. 20 Régulation de l’équilibre hydrique par l’apeline 17. (D’après Llorens-Cortes et al.,

2005). L‟apeline et l‟AVP sont colocalisées au niveau de nombreux neurones. 1) L‟injection icv d‟apeline

va inhiber l‟activité éléctrique phasique des neurones AVP qui aura pour conséquence 2) une inhibition de

la sécrétion systémique d‟AVP. Cette diminution d‟AVP plasmatqiue va entraîner une augmentation de la

diurèse aqueuse.

3) Apeline et prise alimentaire

De part sa localisation au niveau de zones du cerveau décrites comme pouvant

contrôler la prise alimentaire (NSO et PVN), le rôle du complexe apeline/APJ a aussi été

exploré dans la prise alimentaire. Comme pour la prise hydrique, les travaux concernant

l'apeline et la prise alimentaire sont assez controversés. Ainsi, en 2002, Taheri et ses

collaborateur montrent que l'injection icv d'apeline 13 augmente la prise alimentaire

chez l'animal à jeun (518). Cet effet est dépendant de la dose d'apeline et se produit

entre 2 et 4 heures après l'administration du peptide. Plus récemment, une étude

comportementale sur l'effet d'une administration icv chronique d'apeline (1 g/jour pdt 10

- 143 -

jours) a montré qu'au bout de 4 jours de traitement, les animaux présentaient une

augmentation de 15% de leur prise alimentaire (519). Contrairement à ces études, trois

équipes différentes ont observé qu'une injection icv d'apeline provoquait une diminution

de la prise alimentaire (451, 520, 521). En effet, lors de l'administration icv d'apeline 13

chez le rat, une réduction d'environ 10% a pu être observée entre 2 et 4 heures après

l'administration du peptide (520). Sunter et ses collaborateurs ont pu montrer une

diminution plus importante de la prise alimentaire chez des rats nourris ou à jeun et cela

8 ou 24 heures après l'injection respectivement (464). Enfin, plus récemment, une étude

a démontré que l'apeline 13 diminuait la prise alimentaire des rats nourris en régime

normal mais n'avait plus d'influence chez des animaux mis en régime gras (451).

Pour expliquer l'absence d'effet sur la prise alimentaire de la leptine chez les

souris en régime gras, Munzberg émet deux hypothèses: i) soit il existe un défaut de

transport de la leptine à travers la barrière hématoencéphalique qui se produit chez

l'animal obèse ii) soit il existe un défaut de signalisation dans la cascade induite par la

leptine (522). Comme l'apeline est administrée par voie icv, la première hypothèse peut

être éliminée au profit d'une anomalie dans la cascade de transduction de l'apeline.

Dans ce sens, Clarke et ses collaborateurs ont d'ailleurs observé une diminution de

l'expression d'APJ au niveau central chez les rats en régime gras traités par de l'apeline

(451).

L'ensemble de ces travaux montre que l'apeline est bien impliquée dans la

régulation de la prise alimentaire comme pouvait le laisser supposer sa localisation dans

le PVN et le NSO. Cependant, trop de discordances existent à ce jour pour conclure sur

un effet positif ou négatif de l'apeline sur la prise alimentaire. D'autres expériences sont

nécessaires afin de préciser le rôle de l'apeline dans cette régulation et ainsi classer

l'apeline dans la liste des peptides oréxigènes ou anorexigènes.

VI. Apeline et Angiogènèse

Le rôle de l'apeline dans les phénomènes d'angiogénèse a été étudié sur trois

espèces différentes: le poisson zèbre, le xénope et la souris. Chez ces trois espèces,

nous allons voir que la localisation du complexe apeline/APJ a permis d'envisager un

- 144 -

rôle de l'apeline dans le développement vasculaire et cardiaque et que les propriétés

angiogéniques de l'apeline peuvent aussi être considérées comme une cible

thérapeutique lors de traitement anti-tumoraux.

1) Implication du système apeline/APJ dans l'angiogénèse

a) Le xénope

L'implication du complexe apeline/APJ dans les phénomènes d'angiogénèse est

suggérée dès 1999 par Devic et ses collaborateurs grâce à des expériences effectuées

chez le xénope (439). En effet, dans cette étude, les auteurs mettent en évidence par

hybridation in situ qu'APJ est fortement exprimé au niveau des cellules endothéliales

composant le cœur et les vaisseaux en formation chez l'embryon de xénope. Ces

travaux montrent également que l'expression d'APJ est détectée au cours des dernières

phases de la blastula et augmente significativement au cours de la gastrulation. Durant

le stade larvaire, le messager d'APJ est retrouvé au niveau du tube procardiaque et des

vaisseaux en formation où il est présent à la surface des cellules endothéliales (439).

Quelques années plus tard, les mêmes résultats sont retrouvés par une équipe

Japonaise qui montre aussi que la préproapeline est exprimée au niveau des mêmes

sites que le récepteur APJ (523). Cette co-expression est surtout observée au niveau

des veines cardinales postérieures, dans les veines rétiniennes et dans les vaisseaux

intersomitiques. Cette même étude va également mettre en avant le rôle angiogénique

de l'apeline. En effet, des techniques de surexpression ou d'invalidation de l'apeline et

de son récepteur montrent que ce complexe intervient dans la formation de nouveaux

vaisseaux (524). La surexpression d'apeline au stade 8 cellules influence la distribution

des précurseurs endothéliaux et hématopoïétiques ainsi que celle des cardiomyocytes

(523). Ceci signifie que chez le xénope, l'apeline pourrait être impliquée dans

phénomènes de migration cellulaire. L'invalidation de la traduction de l'apeline et de son

récepteur par des morpholinos (molécules spécifiques qui agissent sur l'épissage de la

protéine et empêchent ainsi sa synthèse) conduit à une diminution importante de la

différenciation des cellules endothéliales, cardiaques et hématopoïétiques à l'origine

d'une vasculogénèse imparfaite. De la même manière, Kallin et ses collaborateurs

révèle qu'une invalidation d'APJ entraîne une inhibition de la formation des vaisseaux

- 145 -

intersomitiques alors que la co-injection d'ARNm d'APJ dans ces cellules restaure le

développement de ces vaisseaux (525). En conclusion, ces résultats montrent que

l'apeline agit principalement sur l'angiogénèse précoce et qu'elle peut intervenir sur la

vasculogénèse du xénope.

b) Le poisson zèbre

Chez le poisson zèbre, APJ est retrouvé au cours de différentes phases de la vie fœtale.

Des expériences d'hybridation in situ ont permis à Tucker et à ses collaborateurs de

mettre en évidence qu'APJ était exprimé en quantité importante au niveau de structures

à l'origine des futurs vaisseaux avant les premières phases de la gastrulation (526, 527).

Comme pour le xénope, les cellules endothéliales composant des vaisseaux tels que

l'aorte dorsale, les veines cardinales et les vaisseaux intersomitiques présentent

précocement une forte expression d'APJ. Contrairement à ce que nous avions pu

observer dans la précédente espèce, l'apeline et son récepteur ne sont pas co-exprimés

au cours des première heures de vie chez le poisson zèbre. En effet, dans les premiers

stades qui suivent la fusion, l'apeline se trouve dans des territoires médians puis son

expression va évoluer vers les territoires cardiaques pour finalement se retrouver dans

les mêmes régions que son récepteur (526).

Dans une autre étude, Scott a observé que le récepteur à l'apeline était surtout

présent au niveau des précurseurs myocardiques et que son invalidation génétique

observée au cours de la mutation germinale grinch n'entraînait pas de modification du

réseau vasculaire mais plutôt une diminution du nombre de cardiomyocytes (528). En

effet, l'observation du poisson zèbre mutant grinch, révèle une inhibition du

développement du myocarde associée à une baisse du nombre de cellules progénitrices

myocardiques mais aucun défaut n'est constaté au cours du développement des

vaisseaux. L'explication d'un tel phénotype chez le mutant grinch résiderait dans le fait

que, chez le poisson zèbre, il existe deux types de récepteurs APJ: AGTLR1a et

AGTLR1b (Angiotensin like receptor). Une compensation se produirait entre les deux

types et la mutation de la forme AGTRL1b serait compensée par la forme AGTRL1a au

niveau des vaisseaux mais pas au niveau du cœur. Pour confirmer cette hypothèse de

redondance des récepteurs, les auteurs ont bloqué la traduction de l'ARNm de

AGTLR1a en protéine (morpholino) lors du stade unicellulaire chez le poisson zèbre

- 146 -

grinch. Cette double inhibition des isoformes du récepteur à l'apeline induit une absence

totale de formation de cœur (528). Il semble alors que chez le poisson zèbre, l'apeline et

son récepteur jouent un rôle subtil au début de la formation du cœur primitif en

contrôlant la migration des précurseurs myocardiques. Scott et ses collaborateurs ont

essayé de restaurer les anomalies cardiaques du poisson zèbre grinch en injectant des

doses importantes d'apeline au stade unicellulaire ou chez l'embryon.

La plupart des molécules impliquées dans le modelage cardiaque agissent

généralement sur la prolifération et l'apoptose des précurseurs cardiaques. Avec

l'apeline, nous sommes en présence d'un facteur original qui agit également sur la

migration de ces cellules. Ces résultats sont très intéressants bien qu'il soit nécessaire

de démontrer l'existence de ce phénomène chez d'autres espèces que celle du poisson

zèbre.

c) La souris

Chez ce modèle animal, l'expression de l'apeline et de son récepteur a été étudiée chez

l'embryon et sur la vasculogénèse de la rétine. Ainsi, plusieurs études ont pu montrer

que l'expression de l'apeline et d'APJ était détectée dans tous les territoires vasculaires

de l'embryon de souris comme les vaisseaux entourant l'œil, les bourgeons de pattes

ainsi qu'au niveau des vaisseaux intersomitiques (525). Cette expression augmente

durant les 15 premiers jours de vie puis diminue fortement (90%) au cours de la vie

adulte (529).

Les techniques d'hybridation in situ révèlent la présence précoce (dès le troisième jour

après la naissance) et centrifuge d'APJ et de la préproapeline au niveau du réseau

veineux rétinien (colocalisation avec EphB4, marqueur spécifique du réseau veineux)

qui est connu pour connaître une forte activité angiogénique après la naissance (530,

531).

Au cours du développement embryonnaire de la souris, APJ est retrouvé sur les cellules

endothéliales formant l'axe aorte-gonade-mesonephros au niveau duquel les

phénomènes d'angiogénèse sont très présents (532). Lorsque les cellules endothéliales

issues de cet axe sont cultivées en présence d'apeline, on remarque une augmentation

de leur prolifération d'un facteur 3 (532).

Enfin, ces études ont également montré que les animaux dont le gène codant pour

l'apeline a été invalidé possèdent un diamètre des vaisseaux intersomitiques plus petit

- 147 -

que les souris contrôle pendant l'embryogenèse mais aucune différence de diamètre

n'est observée à l'age adulte (532). De plus, chez ces animaux, la vascularisation de la

rétine est retardée dans le temps et on observe une réponse angiogénique au VEGF et

au FGF (deux facteurs pro-angiogéniques) plus faible au niveau des vaisseaux

rétiniens. Un traitement à l'apeline de ces souris restaure la réponse aux facteurs

angiogéniques suggérant que l'apeline et ces molécules proangiogéniques agissent en

synergie.

Compte tenu de l'ensemble de ces résultats plusieurs équipe ont suggéré que

l'apeline puisse agir de façon paracrine sur les cellules de la sphère cardiovasculaire et

ainsi induire leur prolifération, leur cohésion et leur migration afin de former de nouveaux

vaisseaux.

2) Rôle de l'apeline sur le développement vasculaire

En 2004, des travaux effectués in vitro sur une lignée de cellules rétiniennes (RF/6A)

montrent que l'apeline-13 augmente la prolifération et la migration de ces cellules (Kasai

et al., 2004). Ce résultat est retrouvé par d'autres équipes travaillant sur des cellules

endothéliales embryonnaires humaines (HUVEC) (472) ainsi que sur des membranes

chorioallantoïdes de poulets et sur une lignée de cellules endothéliales issues de la

microvasculature du cerveau de souris (bEnd.3) (472, 524). De plus, des expériences

pratiquées en Matrigel® démontrent que l'apeline possède des propriétés angiogéniques

comparables à celles du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). En effet, les

formes de 13 et de 36 acides aminés d'apeline entraînent la formation de tubes

vasculaires par les cellules de la lignée RF/6A dès 24 heures de traitement (529).

L'apeline est aussi capable d'augmenter le diamètre des tubes néoformés à partir de

cellules HUVEC (532). Cependant, d'autres travaux montrent que l'apeline semble

orienter les cellules endothéliales issues d'embryon de souris vers des structures en

feuillet plutôt qu'en tube. Les mécanismes impliqués dans ces phénomènes sont

dépendants de protéines d'adhésion: la claudine 5 et à une moindre mesure la VE-

cadhérine (532).

Comme nous l'avons déjà évoqué plus haut, l'étude de l'interaction apeline/APJ a

permis de montrer la stimulation de la voie des ERKs (extracellular regulated kinase).

Cette voie de signalisation est impliquée dans la prolifération cellulaire, mécanisme

- 148 -

indispensable lors de l'angiogénèse. En s'appuyant sur ces informations, Masri et ses

collaborateurs ont mis en évidence que l'apeline 13 activait la protéine p70S6 kinase sur

des cellules HUVEC et que cette activation était responsable d'une phosphorylation des

ERK et d'une augmentation de la prolifération des cellules matérialisée par une

augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée dans ces cellules (472). D'autres

expériences concernant la prolifération de cellules endothéliales ont par la suite posé la

question d'une participation du VEGF à l'effet angiogénique de l'apeline. Ainsi, Cox

affirmait en 2006 que l'effet de l'apeline était indépendant du VEGF ou du FGF. Pour

arriver à ces conclusions, il a montré que l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de la voie

de signalisation du VEGF ou du FGF ne modifiait pas l'incorporation de BrdU dans les

cellules endothéliales issues du réseau microvasculaire du cerveau de souris (524).

D'un autre côté, l'étude de Kasai a montré, grâce à l'apport des modèles transgéniques,

que l'apeline et les facteurs pro-angiogéniques tels que le VEGF et le FGF semblaient

agir en synergie. En effet, ces travaux indiquent que l'apeline seule n'a aucun effet sur

l'angiogénèse des vaisseaux de la rétine de souris invalidées pour l'apeline alors que

l'action angiogénique du VEGF ou du FGF est améliorée chez ces souris lors d'un

traitement à l'apeline (529). Au niveau moléculaire, les facteurs proangiogéniques

comme le VEGF et le FGF participent à l'angiogénèse via des voies de signalisation

telles que les MAPK et la PI3K. La liaison de l'apeline sur son récepteur active ces voies

de signalisation et pourrait participer à améliorer l'angiogénèse initiée par le VEGF ou le

FGF. Enfin, l'apeline est aussi capable de moduler la synthèse de monoxyde d'azote

(NO) via son action sur la eNOS. Il a pu être montré que des variations de concentration

du NO peuvent activer ou inhiber les phénomènes d'angiogénèse. Ainsi, Jones et ses

collaborateurs ont mis en évidence que de faibles concentrations de NO entraînaient

une stimulation de l'angiogénèse alors qu'à forte concentration elle l'inhibaient (533).

3) Régulation du complexe apeline/APJ au cours de l'angiogénèse

Les mécanismes moléculaires permettant de contrôler le système apeline/APJ au cours

de l'angiogénèse ont été très peu étudiés. On sait cependant que la quantité d'oxygène

perçue par les cellules entraîne le développement de neovaisseaux. Ainsi, lorsque

l'apport d'oxygène est trop faible (phénomène d'hypoxie), certaines molécules seront

sécrétées par les cellules afin de favoriser l'angiogénèse.

- 149 -

Récemment, plusieurs travaux ont mis en évidence que l'hypoxie était un

phénomène capable d'activer la synthèse d'apeline au niveau des adipocytes blancs en

culture (534), des cardiomyocytes (535) et des entérocytes (536).

Ces différents travaux soulignent que c'est par l'intermédiaire du facteur induit par

l'hypoxie (HIF), qui est un facteur de transcription hétérotrimérique sensible à l'oxygène,

que la synthèse d'apeline est augmentée dans ces trois types de cellules. A partir de

ces résultats, Eyries et ses collaborateurs ont envisagé un rôle de l'hypoxie et de HIF

dans l'augmentation de l'expression de l'apeline constatée au cours de l'angiogénèse.

Afin de vérifier cette hypothèse, les auteurs ont tout d'abord confirmé l'augmentation du

messager de l'apeline en réponse à l'hypoxie dans des cellules endothéliales humaines

en culture. Puis, ils ont montré l'importance de l'apeline dans les phénomènes

d'angiogénèse induits par l'hypoxie en constatant que l'invalidation de l'apeline ou de

son récepteur entraînait une inhibition de la prolifération des cellules endothéliales in

vitro mais aussi in vivo chez le xénope. Pour aller plus loin, ils ont ensuite procédé à des

expériences de transfection transitoire et d'immunoprécipitation de chromatine qui leur

ont permis de montrer la présence d'une zone de liaison de HIF sur le premier intron du

gène codant pour l'apeline dans des cellules endothéliales humaines en culture. Enfin,

l'invalidation de HIF par des techniques de si-RNA (small interferring RNA) entraîne une

perte de l'activation de la synthèse d'apeline en réponse à l'hypoxie (537) ce qui

confirme le rôle majeur de l'hypoxie dans la régulation de la synthèse d'apeline au cours

de l'angiogénèse.

Au cours de l'angiogénèse, les vaisseaux sanguins doivent être capables

d'adapter leur diamètre en fonction des besoins en oxygène et en nutriments de l'organe

ou des tissus irrigués. Cet ajustement du diamètre des vaisseaux est une étape

primordiale de l'angiogénèse qui semble être contrôlée, au moins en partie, par

l'angiopoïetine (Ang1) et son récepteur Tie2 (538, 539). Comme nous l'avons évoqué

plus haut, les modèles génétiques nous ont montré l'implication du système apeline/APJ

dans le contrôle du diamètre des vaisseaux. A partir de ces deux types de régulation,

Kidoya et ses collaborateurs ont tenté de savoir si le système Ang1/Tie 2 pouvait avoir

une influence sur le complexe apeline/APJ. Sur les cellules HUVEC, le traitement à

l'Ang1 augmente de façon dépendante du temps l'expression de l'ARNm et de la

protéine de l'apeline ainsi que sa sécrétion dans le milieu (532). Chez la souris

surexprimant l'Ang1 au niveau des kératinocytes, l'expression d'apeline dans les cellules

- 150 -

endothéliales dermique est significativement augmentée par rapport aux souris

contrôles (532).

4) L'apeline et l'angiogénèse tumorale

La tumorigénèse est un phénomène physiopathologique au cours duquel l'angiogénèse

est très importante. Deux équipes se sont intéressées au rôle joué par l'apeline au cours

de ces processus et ont pu montrer l'implication du peptide dans la croissance tumorale.

Ainsi, Kallin et ses collaborateurs ont mis en évidence que l'apeline et son récepteur,

indétectables au niveau des vaisseaux de cerveaux humains sains, possédaient une

expression nettement augmentée lors de l'étude de vaisseaux de cerveaux de patients

atteints de glioblastomes (tumeur du cerveau) (525). Au cours de la même année, Sorli

a également montré l'implication de l'apeline dans la tumorigénèse en greffant chez la

souris des cellules de tumeurs mammaires surexprimant le peptide (540). Cet effet n'est

pas lié à une augmentation de la prolifération des cellules surexprimant l'apeline

puisque ces cellules sont dépourvues du récepteur APJ et qu'elles ne prolifèrent pas in

vitro. Par contre, lorsqu'elles sont greffées chez la souris, ces cellules entraînent une

augmentation de la quantité de vaisseaux entourant la tumeur symbolisée par une

présence importante de cellules endothéliales CD31 positives (540).

Au sein du laboratoire, ces résultats concernant la tumorigénèse et l'angiogénèse

nous ont conduit à envisager un rôle de l'apeline dans le développement anormal du

tissu adipeux au cours de l'obésité. Cette hypothèse s'appuie sur le fait que de

nombreux spécialistes de l'obésité comparent le développement du TA à celui d'une

tumeur. Ainsi, chez la souris, O.Kunduzova a montré que la néoangiogénèse observée

autour d'un dépôt adipeux greffé était en partie dépendante de l'expression d'apeline.

Pour montrer cette relation, des injections de si-RNA dirigé contre l'apeline ont été

pratiquées dans les dépôts adipeux avant leur greffe. Cette invalidation a eut pour

conséquence de diminuer de moitié la vascularisation des greffons en comparaison des

dépôts adipeux non traités (541).

Ces résultats placent l'apeline comme une cible potentielle dans la lutte contre le

développement des tumeurs. L'élaboration d'antagonistes du récepteur APJ pourrait par

exemple permettre de maîtriser la croissance tumorale ou le développement du tissu

adipeux au cours de l'obésité en inhibant l'effet proangiogénique de l'apeline.

- 151 -

VII. Apeline et tissu adipeux

Dans les chapitres précédents, nous avons vu que plusieurs équipes avaient

détecté la présence de l'apeline et de son récepteur au niveau du tissu adipeux blanc de

souris. Or le TA est constitué de différents types cellulaires. Au laboratoire, J. Boucher a

pu montrer que l'apeline était exprimée et sécrétée par l'adipocyte blanc humain et

murin (542). Cette découverte a permis de considérer l'apeline comme une nouvelle

adipokine et a permis d'envisager un rôle de ce peptide au sein du métabolisme

énergétique. Au laboratoire, J. Boucher montre que l'apeline s'exprime de façon

identique dans les adipocytes et dans la FSV du TA humain et murin. Ces travaux

mettent également en avant que, dans la lignée adipocytaire 3T3F442A, l'expression de

l'apeline est augmentée parallèlement à la différenciation de ces cellules (542).

Cependant, une étude effectuée sur la lignée 3T3L1 montre une augmentation de

l'expression de l'apeline au cours des premiers jours de différenciation suivie d'une

diminution après 4 jours de différenciation (543). Ces résultats discordants pourraient

s'expliquer par le fait que la différenciation des cellules 3T3L1 nécessite un traitement

par des agents pharmacologiques (dexamethasone) pouvant induire une diminution de

l'expression de l'apeline.

1) Régulation de l'apeline adipocytaire

a) Régulations hormonales

L'insuline - Pour étudier la régulation de l'apeline adipocytaire, la première expérience

réalisée au laboratoire a été de mettre à jeun des animaux. Des expériences de mise à

jeun/réalimentation visant à faire varier physiologiquement l'insulinémie ont été faites au

laboratoire. Ainsi, en situation physiologique on peut observer chez l'animal

normopondéral, une variation de l'expression adipocytaire d'apeline parallèle à celle des

taux circulants d'insuline (542).

In vitro, l'effet direct de l'insuline sur l'expression d'apeline est démontré sur les

cellules 3T3F442A et 3T3L1 différenciées qui présentent un taux d'ARNm de l'apeline 3

- 152 -

à 4 fois plus important lorsqu'elles sont traitées 3, 6 ou 24 heures par de l'insuline (1 à

1000 nM) (542). Les mêmes résultats ont été retrouvés par d'autres équipes (534, 543,

544). Cette augmentation de l'expression adipocytaire de l'apeline s'accompagne d'une

augmentation d'un facteur 2 de la sécrétion du peptide par les cellules dans le milieu.

Sur ces mêmes cellules, l'utilisation d'inhibiteurs sélectifs a permis de démontrer que le

contrôle de l'expression de l'apeline par l'insuline était dépendant des voies des MAPK,

de la PI3K et de la PKC.

Glucocorticoïdes - Les patients présentant une obésité androïde semblent produire

plus de cortisol que ceux dont seul le TA sous-cutané se développe (545). Ceci peut

s'expliquer par le fait que les cellules de la FSV du TA viscéral peuvent générer du

cortisol à partir de cortisone alors que celles du TA sous-cutané n'en sont pas capables

(546).

Wei et ses collaborateurs ont mis en évidence qu'un traitement de 24 heures à la

dexamethasone diminuait l'expression adipocytaire de l'apeline de façon dépendante de

la dose (543). L'ensemble de ces résultats suggère qu'au cours de l'obésité viscérale,

les glucocorticoïdes, synthétisés par les cellules de la FSV du TA viscéral, puissent agir

de façon paracrine afin de diminuer l'expression adipocytaire de l'apeline. Afin de vérifier

cette hypothèse, il serait intéressant de savoir s'il existe une différence territoriale dans

la synthèse adipocytaire d'apeline entre le TA viscéral et sous-cutané d'individus

présentant une obésité androïde ou périphérique.

L'hormone de croissance (GH) - Un autre mode de régulation de l'expression de

l'apeline adipocytaire a été mis en évidence en 2007 par l'équipe de M. Fasshauer

(544). En effet, les travaux de cette équipe allemande montrent que l'hormone de

croissance (GH) augmente d'un facteur 3 à 4 l'expression et la sécrétion d'apeline par la

lignée adipocytaire 3T3L1. L'utilisation d'inhibiteurs sélectifs démontre que cette

régulation transite par la voie PI3K/Akt et qu'elle est dépendante de la protéine Jak

- 153 -

b) Autres régulations

Vitamine C - Une étude révèle qu'un traitement quotidien avec de fortes doses de

vitamine C (750 mg/kg de poids corporel) chez le rat rendu obèse par un régime

"cafétéria" entraîne une diminution de l'expression adipocytaire d'apeline à des valeurs

comparable à celle du rat normopondéral (547). Dans ces travaux, les auteurs indiquent

que l'insulinémie ne varie pas au cours du traitement et que la leptine possède le même

type de réponse à la vitamine C que l'apeline. Cependant, l'interprétation de ces

résultats doit rester prudente puisque les animaux traités à la vitamine C présentent

également une diminution de leur poids corporel. Compte tenu des résultats précédents,

cette variation du poids pourrait avoir un lien avec la diminution de l'expression de

l'apeline qui dans cette étude n'est pas due à une diminution de l'insulinémie. Des

travaux complémentaires concernant le lien entre adiposité et expression d'apeline dans

le TA devront être menés.

.

Deux facteurs de transcription ont été décrits comme étant impliqués dans la

régulation de l'expression adipocytaire de l'apeline: il s'agit de HIF (Hypoxia induced

factor) et de PGC1 (PPAR coactivator 1).

L'hypoxie - Comme nous l'avons déjà abordé au cours du chapitre précédent, l'hypoxie

est capable de réguler la production adipocytaire d'apeline (524, 534). Des travaux

réalisés sur la lignée 3T3L1 rapportent que l'hypoxie (1% O2) provoque une

augmentation de augmentation de l'expression de l'apeline de plus de 25 fois associé à

une sécrétion multipliée par 4 dans le milieu (534). Au niveau moléculaire, les auteurs

de cette étude ont suggéré que HIF pouvait participer à cette régulation. L'activation

pharmacologique de la synthèse de HIF et son invalidation génique ont confirmé cette

hypothèse. De façon originale, les auteurs ont aussi démontré que la régulation de

l'expression de l'apeline par l'insuline était dépendante de la présence de HIF (534). Au

laboratoire, les mêmes résultats ont été obtenus sur la lignée adipocytaire 3T3F442A

(541). L'ensemble de ces résultats, conjugués à ceux obtenus par O. Kunduzova

concernant le rôle de l'apeline sur l'angiogénèse du TA (541), suggèrent qu'au cours de

l'obésité, les taux importants d'insuline circulante puissent participer, via l'activation de

- 154 -

HIF et les propriétés proangiogéniques de l'apeline, au développement du TA. Ainsi,

l'apeline possèderait un rôle bénéfique en réponse à l'hypoxie.

PGC-1 - Une collaboration avec l'équipe de D. Langin a permis de démontrer que PGC1

augmentait l'expression (x3) et la sécrétion (x2) de l'apeline dans des adipocytes

humains et murins (548). Le laboratoire de D. Langin travaille sur la recherche de

facteurs adipocytaires régulés par la surexpression de PGC-1, un facteur de

transcription qui interagit avec des récepteurs nucléaires (PPAR ) afin d'activer

l'expression de gènes impliqués essentiellement dans le métabolisme énergétique

mitochondrial. Ce facteur est principalement exprimé dans des muscles squelettiques

oxydatifs et le tissu adipeux brun. Cependant, sa surexpression dans l'adipocyte blanc

montre qu'il est aussi capable de stimuler l'oxydation lipidique dans ces cellules (549).

L'apeline est la seule adipokine qui varie au cours de la surexpression de PGC-1.

Cette régulation a pu être démontrée de façon directe in vitro, via la surexpression de

PGC1 dans les adipocytes; et indirecte, in vivo, grâce à la mise au froid d'animaux

permettant d'augmenter en parallèle l'expression de PGC1 et d'apeline dans les

adipocytes du TA viscéral (548). D'autres investigations concernant la régulation de

l'expression de l'apeline par PGC-1 dans des tissus oxydatifs sont nécessaires. Il serait

également interressant d'étudier l'effet réciproque de l'apeline sur l'expression de PGC-1

et plus largement sur le métabolisme oxydatif

Fig. 21 Régulations de l’apeline

adipocytaire. L‟expression de l‟apeline

adipocytaire est contrôlée positivement

par l‟insuline, le TNF , l‟hormone de

croissace (GH) ou encore le facteur de

transcription PGC1 . De plus, certaines

situations comme l‟obésité ou l‟hypoxie

ont démontré une expression

augmentée de l‟apeline. Inversement la

restriction calorique et les

glucocorticoïdes induisent uen

diminution de l‟expression de l‟apeline.

- 155 -

2) Apeline et troubles métaboliques

L'ensemble des résultats que nous venons de décrire montre une relation forte

entre l'insuline plasmatique et l'apeline adipocytaire. L'obésité s'accompagnant d'une

augmentation de l'insulinémie, l'expression adipocytaire de l'apeline au cours de

l'obésité a été étudiée (542). Ainsi, dans différents modèles de souris obèses, il a pu

être montré que l'expression de l'apeline adipocytaire était augmentée uniquement dans

le s modèles présentant une hyperinsulinémie (542). Chez ces souris, l'augmentation de

l'expression de l'apeline adipocytaire s'accompagne d'une élévation de la concentration

plasmatique d'apeline d'un facteur 2 (0.75 ng/ml vs. 1.50 ng/ml). De plus, chez les souris

dont les cellules du pancréas ont été détruites par un traitement à la streptozotocine,

l'expression adipocytaire d'apeline est trois fois moins importante que chez les animaux

contrôles (542). Enfin, chez les souris db/db, qui possèdent une insulinémie et une

glycémie élevée, une corrélation positive a pu être établie entre les taux plasmatiques

d'insuline et l'expression du messager de l'apeline dans l'adipocyte alors qu'aucune

relation ne semble exister entre la glycémie et l'apeline adipocytaire (542). Une autre

étude révèle que, chez le rat, la mise en régime gras provoque une augmentation de

l'expression de l'apeline au niveau du TA sous-cutané alors qu'elle n'entraîne aucune

modification au sein du TA viscéral (547). Même si les résultats de ces deux études sont

difficilement comparables (expression de l'apeline dans l'adipocyte isolé pour Boucher et

dans le TA entier pour Garcia-Diaz), il semblerait tout de même que l'augmentation de

l'expression de l'apeline au cours de l'obésité soit spécifique de l'espèce et du type de

tissu adipeux. De plus, les travaux de Garcia-Diaz démontrent également que la

quantité d'ARNm codant pour l'apeline est 7 fois plus importante dans le TA viscéral que

dans le TA sous-cutané et que, contrairement à ce que qu'avait montré Boucher chez

l'homme, les cellules de la FSV expriment nettement plus d'apeline que les adipocytes

dans les deux types de TA ( + 88% pour le TAV SC et + 82% pour le TASC) (547).

Chez l'homme obèse une corrélation positive est observée lorsque l'on compare

les taux plasmatiques d'apeline et l'IMC. Cette relation entre l'apelinémie et le tissu

adipeux est encore plus présente chez des patients obèses dont le poids diminue après

une opération chirurgicale ou après un régime hypocalorique (550, 551). En effet, dans

deux études différentes, la perte de poids entraîne un retour des taux plasmatiques

d'apeline comparable au niveau observé chez le patient sain. De plus, lors du régime

- 156 -

hypocalorique, l'expression de l'apeline et de son récepteur adipocytaire suivent le

même profil que l'apelinémie.

Ce dernier résultat associé aux observations faites par Boucher et ses

collaborateurs, suggère que la production adipocytaire d'apeline pourrait largement

participer aux taux plasmatiques du peptide. Ainsi, cette large contribution de l'adipocyte

expliquerait les taux importants d'apeline plasmatique observés chez l'individu et la

souris obèse (542, 550, 551).

Les travaux de Tasci et ses collaborateurs ont mis en évidence, chez l'homme,

que les concentrations d'apeline plasmatiques étaient corrélées négativement avec les

quantités de LDL-cholestérol (Low Density Lipoprotein) circulantes (552, 553). De plus,

au cours de protocoles visant à diminuer les concentrations plasmatiques de LDL-

cholestérol, les concentrations plasmatiques d'apeline augmentent d'un facteur 4 (de 0.2

ng/ml à 0.8 ng/ml). Cette relation inverse entre l'apelinémie et le LDL-cholestérol, mise

en évidence chez des patients dyslipidémiques ne présentant pas d'obésité, n'est pas

dépendante de l'insuline (553). Cependant, une corrélation négative entre l'apelinémie

et l'indice HOMA existe ce qui suggère que l'apeline puisse jouer un rôle dans l'insulino-

sensibilité du métabolisme lipidique.

D'autres travaux ont pu montrer que l'apeline plasmatique augmentait

progressivement au cours de l'installation du diabète de type II (418). Ainsi, l'apelinémie

de patients intolérants au glucose est de 459+/-32 pg/ml (contre 389+/-17 pg/ml pour les

individus sains) et elle atteint 498+/-35 pg/ml chez les patients diabétiques. Toutefois,

des résultats différents ont été obtenus dernièrement puisqu'une autre étude a pu

montrer que des patients récemment diagnostiqués pour un diabète de type II et non

traités présentaient des taux plasmatiques d'apeline diminués (750 vs 440 pg/ml) (554).

Cette différence de résultat semble résider dans le fait que les patients de l'étude de Li

ont été diagnostiqués pour un diabète de type II plusieurs années avant l'étude et qu'ils

sont sous traitement antidiabétique alors que les patients de l'étude menée par Erdem

ont été récemment diagnostiqués et ne suivent aucun traitement. Ces différences

révèlent tout l'intérêt d'étudier les variations de concentrations plasmatiques d'apeline au

cours de l'installation du diabète de type II.

- 157 -

3) Implication de l'apeline dans le métabolisme énergétique

En 2005, une équipe suédoise a montré que la relation insuline/apeline était réciproque

(555). En effet, ces travaux démontrent que le récepteur APJ est présent au niveau du

pancréas et que l'injection de l'apeline 36 par voie veineuse (2nmol/kg) entraîne une

diminution de la sécrétion d'insuline au cours d'un test de tolérance au glucose chez des

souris normopondérales ou rendues obèses par un régime gras. Cette diminution

s'accompagne logiquement d'une augmentation des taux plasmatiques de glucose et au

cours de cette expérience alors qu'aucun effet n'est observée sur la glycémie lorsque

l'apeline est administrée seule (555). Afin de démontrer que cet effet était direct, les

auteurs ont observé les capacités de production d'insuline d'îlots isolés de pancréas de

souris avec ou sans apeline 36. Les résultats montrent qu'un traitement de 60 minutes

d'apeline 36 (1 M) diminue significativement la production d'insuline des îlots en

réponse à une concentration élevée de glucose (16.7 mM). Ce résultat suggère qu'en

cas d'hyperglycémie, l'apeline pourrait réguler la sécrétion d'insuline.

Plus récemment, Higuchi et ses collaborateurs ont étudié les effets du traitement

chronique à l'apeline sur le métabolisme énergétique et l'adiposité de souris (556).

L'injection quotidienne, par voie intra péritonéale, d'apeline 13 (0.1 mol/kg) pendant 14

jours provoque une perte de poids des animaux en régime standard caractérisée par

une diminution du poids des différents dépôts adipeux (viscéral, sous-cutané et

mésentérique) associée à une baisse du contenu en triglycérides des adipocytes et à

une réduction de la taille de ces cellules. Chez la souris rendue obèse par un régime

gras, on observe une tendance à la perte de poids et une réduction significative du

poids du tissu adipeux viscéral. Les investigations concernant le métabolisme

énergétique concernent uniquement les souris normopondérales. Les résultats obtenus

montrent que le traitement à l'apeline diminue l'insulinémie et la concentration en

triglycérides plasmatiques et améliore la tolérance au glucose. De plus l'injection

quotidienne d'apeline entraîne une baisse de la concentration plasmatique en leptine et

augmente l'adiponectinémie. Cet effet est peut être indirect car il peut être du à une

diminution de la masse grasse. Aucun effet n'est observé sur la glycémie et les taux

plasmatiques d'acides gras libres mais une augmentation de la température corporelle

associée à une consommation d'oxygène augmentée a pu être relevée chez les

- 158 -

animaux traités (556). Cette dernière donnée a conduit les auteurs à étudier les

mécanismes responsables de la dissipation d'énergie sous forme de chaleur. Ainsi,

l'apeline entraîne une augmentation de l'expression de l'ARNm codant pour les

protéines décloupantes UCP1 et UCP3 respectivement dans le tissu adipeux brun et

dans le muscle. Ces protéines sont à l'origine de la dissipation d'énergie sous forme de

chaleur au niveau mitochondrial. Le mécanisme proposé serait que l'apeline, en

induisant l'expression de ces protéines découplantes, permettrait d'utiliser les substrats

énergétiques en excès empêchant ainsi leur stockage. Le reflet de cette dissipation

d'énergie sera une accumulation moins importante de triglycéride dans les adipocytes

avec pour conséquence une diminution du poids des dépôts adipeux et du poids

corporel. De la même façon, l'apeline permettrait d'améliorer certains paramètres

plasmatiques métaboliques comme le taux de triglycérides et d'insuline aboutissant à

une meilleure tolérance au glucose.

- 159 -

PARTIE IV: Objectifs et travaux de thèse

I. Objectifs

Lorsque j'ai commencé ma thèse, aucun rôle n'avait été décrit pour l'apeline

adipocytaire. Sa présence dans le TA et ses modifications d'expression et de sécrétion

avec l'obésité laissait supposer qu'elle pouvait agir sur son développement ou bien sur

le métabolisme énergétique. De plus, la régulation adipocytaire de l'apeline avait été

bien établie mais il restait à comprendre si cette régulation était maintenue dans les

situations d'insulino-résistance et de diabète de type II.

C'est pourquoi mon sujet de thèse s'est articulé autour de 2 axes:

Etude du rôle métabolique de l'apeline

Etude de la régulation de l'expression de l'apeline et de son

récepteur APJ au cours de l'insulino-résistance et du diabète de

type II

- 160 -

II. Etude du rôle métabolique de l'apeline

ARTICLE I: L'apeline augmente l'utilisation de glucose chez la souris

normale et insulino-résistante

Comme nous l'avons évoqué dans l'introduction de ce manuscrit, plusieurs

études ont mis en évidence un lien entre l'apeline et le métabolisme énergétique. En

effet, les travaux montrant une implication du peptide sur la prise alimentaire

représentent une première avancée dans le domaine (521). Les études suivantes ont

mis en avant un lien réciproque entre l'apeline et l'insuline confirmant l'hypothèse selon

laquelle l'apeline possède un rôle dans le métabolisme énergétique (555, 556).

C'est à partir de l'ensemble de ces résultats que nous nous sommes posés la

question du rôle de l'apeline au sein du métabolisme glucidique chez la souris normale

et la souris obèse et insulino-résistante.

Pour répondre à cette question, nous avons injecté, par voie veineuse, la forme

de 13 acides aminés de l'apeline à des souris normopondérales au cours de différentes

expériences visant à étudier le métabolisme glucidique. Ainsi, nous avons pu montrer

que l'apeline (200pmol/kg) entraîne une diminution de 25 % de la glycémie de souris à

jeûn et qu'elle améliore nettement la tolérance au glucose au cours d'une hyperglycémie

provoquée par voie orale. De plus, une perfusion d'apeline (75 pmol/kg/min) provoque

une augmentation de l'utilisation de glucose au niveau de l'organisme entier en

conditions basales et hyperinsulinémiques. Au niveau tissulaire, ces expériences nous

ont permis d'avancer que les cibles de l'apeline étaient préférentiellement le muscle strié

squelettique oxydatif (muscle soleus) et les TA. Ces effets observés avec l'apeline sont

comparables à ceux décrits par Kamohara et ses collaborateurs avec la leptine (557).

Dans les muscles isolés, l'apeline induit un transport de glucose direct et comparable à

l'insuline mais en utilisant une voie de signalisation différente. Grâce à des approches

pharmacologiques et géniques complémentaires, nous avons pu montrer que la voie de

signalisation de l'apeline conduisant au transport de glucose dans le muscle était

dépendante de l'activation de l'AMPK, de la eNOS et d'Akt. De plus, l'apeline est

- 161 -

toujours capable de stimuler l'utilisation du glucose (muscle, tissu adipeux et cœur) et

d'améliorer la tolérance au glucose chez les souris rendues obèses et insulino-

résistante par un régime hyperlipidique.

- 162 -

ARTICLE I

L'apeline augmente l'utilisation de

glucose chez la souris normale et

insulino-résistante

Cédric Dray, Claude Knauf, Danièle Daviaud, Aurélie Waget, Jérémie Boucher, Marie Buléon,

Patrice Cani, Camille Attané, Charlotte Guigné, Christian Carpéné, Rémy Burcelin, Isabelle

Castan-Laurell et Philippe Valet.

1 INSERM, U858, F-31 432 Toulouse, France

2 Université de Toulouse; UPS; Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil (I2MR), IFR150,

F-31432 Toulouse cedex 4, France

Cell Metabolism 8, 437-445, November 5 2008

- 163 -

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- 172 -

Discussion ARTICLE I

Apeline et Glycémie

Contrairement à ce qu'avait montré Sörhede Winzell et ses collaborateurs, nous

observons que l'injection d'apeline diminue la glycémie et ne modifie pas la production

d'insuline (555). Il existe plusieurs considérations techniques qui peuvent expliquer ces

différences. L'apeline utilisée par l'équipe Suédoise est la forme de 36 acides aminés du

peptide alors que nous utilisons l'apeline 13 pyroglutaminée. Nous avons vu, dans

l'introduction de ce manuscrit, que toutes les formes d'apeline peuvent se lier et agir

différemment sur APJ en fonction du tissu. De plus les animaux utilisés dans notre étude

sont des males conscients alors que l'équipe de Bo Arhen utilise des femelles

anesthésiées. Le genre et l'anesthésie peuvent entraîner des différences déjà décrites

en terme de réponse métabolique (558). Enfin, le test de tolérance au glucose que nous

pratiquons tient compte des incrétines sécrétées par l'intestin (GIP et GLP-1) au cours

de la charge orale de glucose et impliquées dans la régulation de l'insulinémie (559). Ce

n'est pas le cas dans l'étude de Sörhede Winzell puisque l'augmentation de la glycémie

est provoquée par voie une injection intraveineuse de glucose.

Métabolisme glucidique, flux sanguin et apeline

Même si l'effet de l'apeline ne semble pas être médié par une variation de

l'insulinémie, d'autres voies indirectes peuvent être impliquées. C'est le cas notamment

de la vasodilatation. En effet, la dilatation des vaisseaux sanguins provoque un afflux de

sang aux organes qui a pour conséquence une augmentation de la clairance du glucose

plasmatique. Il a pu ainsi être démontré que certaines molécules vasodilatatrices

entraînaient une diminution de la glycémie. De plus, des études récentes ont pu mettre

en évidence que l'insuline provoquait aussi une dilatation des microvaisseaux et que

cette vasodilatation était responsable de 20 à 40% de son effet sur l'homéostasie

glucidique (560). Comme nous l'avons décrit précédemment, l'apeline est un puissant

vasodilatateur et son action métabolique pourrait être le résultat d'une vasodilatation

permettant d'augmenter l'échange de glucose entre la circulation sanguine et les tissus

cibles. Cependant, des expériences pratiquées chez la souris nous ont permis

- 173 -

d'observer qu'aux doses utilisées (200 pmol/kg), l'apeline ne modifiait pas la pression

artérielle moyenne ou la fréquence cardiaque alors qu'elle diminuait la glycémie.

Toutefois, des expériences complémentaires plus approfondies seraient nécessaires

afin de mieux définir l'impact de l'apeline sur la microcirculation. Comme l'insuline, il est

fort probable que l'effet de l'apeline sur la clairance plasmatique du glucose soit en

partie médié par une vasodilatation qu'il serait intéressant de quantifier.

L'apeline et le transport de glucose

Dans le but de savoir si l'effet de l'apeline que nous avions observé était direct ou

résultait d'un relais à l'échelle de l'organisme (SNC, autres médiateurs, …), nous avons

étudié ces effets in vitro. Malheureusement, aucune lignée cellulaire musculaire (C2C12

et L6) ou adipocytaire (3T3F442A et 3T3L1) n'exprime de façon endogène le récepteur

APJ. Nous avons donc réalisé toutes nos expériences sur des tissus isolés murins.

Nous avons pu montrer que l'apeline augmentait, de façon dépendante de la dose, le

transport de glucose dans le muscle soleus et dans le TA de souris (résultats

complémentaires). L'apeline utilisée à la plus forte concentration (1 M) stimule le

transport de glucose dans le muscle de manière comparable à celle de l'insuline (10

nM). De façon intéressante, lorsque les muscles sont coincubés en présence d'insuline

(10nM) et d'apeline (1 M), on observe une potentialisation du transport de glucose

médié par l'insuline seule. Cet effet additif de l'apeline suggère que les deux hormones

produisent leur effet par des voies de signalisation distinctes.

L'AMPK: cible de l'apeline

Nous avons montré que l'apeline stimule le transport de glucose en activant

l'AMPK. En effet, l'apeline induit une augmentation de la phosphorylation de la sous-

unité de l'AMPK (thréonine 172) dans le muscle aussi bien in vitro qu'in vivo. Sur des

muscles isolés, cette stimulation est dépendante de la dose d'apeline et débute 20

minutes après le début de l'incubation. In vivo, l'injection i.v d'apeline (200pmol/kg)

entraîne une phosphorylation de l'AMPK dans le muscle soleus 20 minutes après

l'injection du peptide. Afin de connaître l'influence de l'apeline sur l'activité enzymatique

de l'AMPK, nous avons évalué la phosphorylation de la protéine ACC (Acétyl CoA

Carboxylase) qui est directement en aval de l'AMPK. Ces expériences montrent une

- 174 -

phosphorylation parallèle à celle de l'AMPK confirmant une activation de ce senseur

métabolique par l'apeline. L'inhibition pharmacologique (composé C) et génétique

(souris AMPK-DN) de l'activité de l'AMPK nous a permis de montrer que cette protéine

était indispensable à l'effet de l'apeline sur le transport de glucose.

Depuis plusieurs années, un intérêt particulier est porté à l'égard de la protéine

AMPK qui est une cible potentielle dans la lutte contre l'insulino-résistance. Dans ce

sens, de nombreuses études s'attachent à découvrir des molécules endogènes ou

exogènes capables de stimuler et d'activer cette protéine. Ainsi, plusieurs adipokines

telles que la leptine et l'adiponectine induisent une augmentation du transport de

glucose et de l'oxydation des acides gras dans le muscle squelettique via la stimulation

de l'AMPK (103, 389, 402).

De nombreux travaux sont effectués pour synthétiser des molécules exogènes

capables de stimuler l'AMPK. Ainsi, le 5-Aminoimidazole-4-Carboxamide

Ribonucleoside (AICAR), qui est un analogue de l'AMP, modifie le ratio AMP/ATP au

sein de la cellule. Or, l'augmentation du ratio AMP/ATP permet d'activer l'AMPK (561).

En rapprochant ces deux informations, Bergeron et ses collaborateurs ont pu montrer

qu'une perfusion d'AICAR (10 mg/kg/min) chez le rat normopondéral induisait une

amélioration de l'homéostasie gluco-lipidique (562). Ces travaux ont également montré

que chez ces animaux, ainsi que chez des rats génétiquement obèses et insulino-

résistant, la perfusion d'AICAR stimulait le transport de glucose dans les muscles

squelettiques suggérant que l'AMPK reste active. D'autres molécules sont capables

d'augmenter l'activité de l'AMPK et ainsi d'agir sur le métabolisme énergétique. C'est le

cas des biguanides (metformine ou phenformine) et des thiazolindinediones

(rosiglitazone, pioglitazone et troglitazone) qui, par des mécanismes différents semblent

médier l'augmentation de la phosphorylation de l'AMPK et qui sont utilisés dans le

traitement du diabète. C'est aussi le cas pour des composés naturels issus de plantes

comme la berbérine, le resvératrol ou la quercétine (563) qui sont la cible de nouvelles

études sur leur rôle au sein du métabolisme énergétique.

Grâce à notre étude, l'apeline peut être considérée comme une nouvelle

adipokine capable d'agir sur le métabolisme glucidique en ciblant l'AMPK dans le

muscle.

Comme nous l'avons vu dans l'introduction, l'AMPK est aussi impliquée dans la

régulation de la synthèse d'insuline par les cellules du pancréas (129). A la vue de ces

- 175 -

nouvelles informations concernant l'apeline et l'AMPK il serait intéressant d'étudier

l'activité de la protéine au niveau des cellules pancréatiques afin de savoir si l'apeline

13 régule la fonction pancréatique. Ceci permettrait de mieux appréhender le rôle de

l'apeline 13 sur la sécrétion d'insuline.

La littérature montre que de nombreuses protéines sont en aval de l'AMPK

(Hardie et al., 2004). L'effet de l'apeline sur la eNOS vasculaire et la stimulation de cette

protéine par l'AMPK sont deux arguments bien décrits qui nous ont permis de penser

que cette protéine pouvait être ciblée par l'apeline dans le muscle. De plus, différentes

études ont pu montrer que la eNOS était capable d'induire l'augmentation de GLUT4 à

la membrane plasmique de cellules musculaires, adipocytaires ou cardiaques favorisant

le transport de glucose dans ces tissus (564, 565).

Dans notre étude, nous avons pu voir que l'AMPK, stimulée par l'apeline, était capable

de phosphoryler la eNOS. Nos travaux réalisés sur les animaux dont le gène codant

pour la eNOS a été invalidé démontrent que cette protéine est indispensable à l'action

de l'apeline sur le transport de glucose.

Apeline et voie de l'insuline

Nous avons également cherché à savoir si la voie de signalisation de l'apeline

dans le muscle n'était pas commune à celle de l'insuline. En effet, nous avons vu que

certains travaux avaient mis en avant une phosphorylation d'Akt par l'apeline dans les

cellules HUVEC (566). Dans notre étude, nous montrons pour la première fois que

l'apeline phosphoryle Akt dans le muscle et que le transport de glucose est totalement

inhibé lorsque l'apeline est coincubée avec un inhibiteur de la PI3K et par conséquent

d'Akt. Ceci signifie qu'Akt est également indispensable dans le transport de glucose

médié par l'apeline. Akt (PKB) est également capable d'activer la protéine AS160 qui est

en amont de l'AMPK. On pourrait alors penser que, dans le muscle, l'apeline active Akt

qui via la protéine AS160 phosphoryle l'AMPK dont l'activation va permettre de stimuler

la eNOS. Cependant, une troisième série d'expérience effectuée sur les animaux

AMPK-DN montre que l'AMPK est en amont de la eNOS et de Akt. Ceci suggère que

l'apeline favorise le transport de glucose dans le muscle via une activation de l'AMPK

qui va ensuite parallèlement activer la eNOS et Akt, chacune d'entre elles agissant pour

favorisant l'entrée de glucose dans la cellule.

- 176 -

Afin de compléter l'étude de la voie de signalisation de l'apeline, des expériences

démontrant la translocation du transporteur GLUT4 à la membrane plasmique des

cellules sous l'influence du peptide me semblent nécessaires.

L'ensemble de ces résultats a été obtenu dans le muscle mais il est fort probable que

les mêmes acteurs moléculaires soient mobilisés par l'apeline dans le TA. En effet,

l'adipocyte exprime le récepteur APJ ainsi que les protéines impliquées dans la

signalisation moléculaire du métabolisme glucidique que nous venons de décrire. En

revanche, il ne semble pas que l'apeline agisse sur le métabolisme hépatique. Le

récepteur APJ n'étant pas présent à la membrane des hépatocytes, un effet direct de

l'apeline est peu probable. Cette hypothèse est confirmée par l'absence d'effet de

l'apeline sur la production hépatique de glucose au cours de l'étude de l'utilisation de

glucose (expériences de "turn-over" de glucose).

Fig. 22 Apeline et transport de glucose. Nous avons pu montré que l‟apeline pouvait induire le transport

de glucose dans le muscle en phosphorylant l‟AMPK, la eNOS et Akt. Il est probalble que l‟AMPK

phosphorylée induise une activation de la eNOS qui est capable d‟augmenter la translocation de GLUT4 à

la membrane plasmique et donc d‟incrémenter le transportde glucose. De plus, une interconnexion avec

la voie de l‟insuline n‟est pas impossible comme l‟atteste la phosphoruylation de d‟AKT par l‟apeline dans

le muscle. Comme dans la voie de la PI3K, Akt/PKB est capable d‟augmenter la translocation de GLUT4 à

la membrane plasmique.

- 177 -

Apeline et Insulino-résistance

Compte tenu du rôle joué par l'apeline sur le métabolisme glucidique de la souris

normopondérale, nous avons voulu savoir si ces effets étaient conservés chez la souris

obèse et insulino-résistante.

Des expériences de test de tolérance au glucose et de clamp hyperinsulinémique

euglycémiques ont validé l'insulino-résistance de notre modèle animal. Lorsque l'apeline

est administrée à ces animaux, on remarque une nette amélioration de la tolérance au

glucose Chez l a souris obèse et insulino-résistante, l'apeline favorise de transport de

glucose dans des tissus tels que le muscle squelettique et le TA. L'ensemble de ces

résultats montre que l'apeline est toujours éfficace malgré l'insulino-résistance.

Même si d'autres expériences complémentaires sont nécessaires, il est probable

que la même voie de signalisation décrite chez la souris normopondérale soit

responsable de ce transport de glucose chez la souris insulino-résistante. En effet,

comme l'avait montré Zhang sur l'aorte isolée de souris db/db, même si le nombre de

récepteur à l'apeline est diminué, APJ est toujours actif chez l'animal diabétique au

niveau des cellules endothéliales. A la vue de ces résultats, il semble nécessaire de

quantifier l'expression du récepteur APJ au niveau du muscle et du TA de souris ou

d'individus diabétiques. Ainsi, si la quantité de récepteurs présents à la membrane des

cellules musculaires ou adipocytaire est diminuée au cours du diabète, il devient plus

intéressant d'établir une stratégie visant à augmenter l'expression d'APJ plutôt que

d'augmenter les taux plasmatiques d'apeline déjà élevés chez ces patients (567). Nous

avons montré au laboratoire qu'au cours de l'obésité, les taux plasmatiques d'apeline

sont augmentés (542, 568). Or, nous venons de décrire que l'apeline 13 synthétique,

injectée en aigu à des souris obèses et insulino-résistantes, conserve sa capacité à

améliorer la tolérance au glucose et la sensibilité à l'insuline. Les études effectuées

chez l'homme diabétique ont montré des discordances dans l'évolution des taux

plasmatiques d'apeline plasmatique. Ainsi, l'étude de Li montre une augmentation de

l'apelinémie au cours du diabète alors que celle de Erdem constate une diminution.

Compte tenu de ces différences, il est difficile de conclure à un rôle bénéfique ou

délétère de l'apeline au cours du diabète. C'est la raison pour laquelle, dans la troisième

partie de ces travaux de thèse, nous avons étudié les taux plasmatiques et l'expression

- 178 -

de l'apeline et de son récepteur dans deux tissus cibles, le muscle et le TA, au cours de

l'installation de l'insulino-résistance et du diabète associés à l'obésité.

L'apeline impliquée dans le métabolisme cardiaque?

De façon inattendue, les expériences de clamp hyperinsulinémique euglycémique

pratiquées chez la souris obèse et insulino-résistante révèlent que la perfusion d'apeline

augmente significativement le transport de glucose dans le cœur. Ce résultat est

d'autant plus surprenant que l'apeline ne stimule pas le transport de glucose dans le

cœur de souris normopondérales. En conditions physiologiques, le glucose n'est pas le

substrat préférentiel des cardiomyocytes mais il est indispensable. En effet, bien que les

AG constituent 70% des substrats énergétiques du cœur, un équilibre entre l'utilisation

du glucose et des AG est essentiel au bon fonctionnement de cet (569). Le transport de

glucose dans le cœur est dépendant des transporteurs GLUT1 et GLUT4 (570). GLUT1

va permettre le transport basal du glucose alors que GLUT4 se trouve au niveau de

vésicules intracellulaires dont la translocation à la membrane plasmique est dépendante

de l'insuline (571). L'insuline régule également le transport de glucose au niveau

cardiaque en agissant sur l'expression génique des transporteurs (572, 573). De façon

intéressante, des résultats obtenu en 2004 par l'équipe de LH Young montrent que le

traitement (30 à 60 minutes) de cœurs isolés de rats par de l'AICAR stimule le transport

de glucose dans les cardiomyocytes. Cette augmentation est provoquée par une

augmentation de l'activité de l'AMPK qui, via la eNOS, va entraîner la translocation de

GLUT4 au niveau de la membrane plasmique (574). Au cours du diabète de type II, la

sensibilité à l'insuline au niveau du cœur est diminuée et, par conséquent, le transport

de glucose est réduit. Ceci a pu être montré chez les souris db/db et ob/ob (575) alors

que chez l'homme les résultats sont plus nuancés (576). Toutefois, l'ensemble de ces

travaux et de nos résultats suggèrent que chez la souris normopondérale, le transport

de glucose est maximal au cours du clamp hyperinsulinémique euglycémie ce qui a pour

conséquence une absence d'effet de l'apeline. En revanche, chez la souris obèse et

insulino-résistante, le transport de glucose insulino-dépendant étant diminué, il est

possible d'observer l'effet de l'apeline dans le cœur. Ce résultat constitue une

perspective thérapeutique importante dans les pathologies cardiaques associées aux

maladies métaboliques. En effet, du fait de leur transport "passif" (la présence du

transporteur CD36 n'est pas régulé par une hormone) au niveau de la membrane

- 179 -

plasmique des cardiomyocytes, les AG vont être utilisés préférentiellement au glucose

au niveau de ces cellules (cycle de Randle) (569). Chez l'obèse, l'afflux important d'AG

va conduire à un déséquilibre dans l'utilisation des substrats à la base de phénomènes

délétères au niveau du cœur comme la génération de céramides responsables de

l'apoptose des cellules cardiaque ou bien d'une accumulation de glycogène dans ce

tissu à l'origine de cardiomyopathies (569). Il est donc nécessaire d'approfondir ces

résultats afin de définir le rôle exact de l'apeline sur le métabolisme cardiaque et son

implication dans les pathologies cardiovasculaires associées aux maladies

métaboliques.

Les effets que nous avons obtenus au cours ces travaux ne concernent que le

modèle murin. Les premiers résultats montrant l'efficacité de l'apeline chez l'homme sur

la vasodilation et l'implication du NO ont été publiés récemment par l'équipe de D.

Newby en Ecosse (488). Dans son étude, Japp montre que l'injection d'apeline 13 chez

l'humain entraîne les mêmes effets vasculaires que ceux décrits chez la souris. Une

collaboration avec cette équipe est en cours et devrait nous permettre de bénéficier des

échantillons des patients traités à l'apeline afin de pouvoir mesurer différents

paramètres plasmatiques comme la glycémie et l'insulinémie.

- 180 -

III. Etude de la régulation de l'expression de l'apeline et de son

récépteur APJ au cours de l'insulino-résistance et du diabète de type

II

Suite à la mise en évidence de la régulation adipocytaire de l'apeline par

l'insuline, s'est posée la question de son devenir au cours de l'insulino-résistance et du

dibète de type II.

Tout d'abord, nous nous sommes intéressés au TNF qui est une cytokine

inflammatoire dont l'expression dans le TA est augmentée avec l'insulino-résistance

(Article 2) puis nous avons entrepris une étude sur du long-terme afin de déterminer

l'expression de l'apeline et de son récepteur non seulement dans le TA mais aussi dans

le muscle et d'autres tissus (non présentés dans l'article) chez des souris soumises à un

régime hyperlipidique et des souris db/db de même age (Article 3). Ces souris ont été

suivies en terme de poids, glycémie et insulinémie, de tolérance au glucose et à

l'insuline.

En parallèle, grâce à une collaboration avec H. Vidal, nous avons pu étudier

l'expression d'apeline et d'APJ dans le TA et le muscle squelettique de sujets contrôles

et diabétiques (Article 3).

- 181 -

ARTICLE II: Le TNF augmente l'expression de l'apeline adipocytaire

Le TA est le siège d'une inflammation de bas niveau au cours de l'obésité. Cette

inflammation est décrite par une infiltration macrophagique des dépôts adipeux

accompagnée d'une augmentation de l'expression et de la sécrétion de cytokines

inflammatoires telles que l'IL6, MCP-1 ou le TNF par les cellules adipeuses et celles de

la FSV (195).

Des injections de TNF (2ng/souris) par voie intrapéritonéale ont été pratiquées

chez la souris puis nous avons étudié l'expression adipocytaire de l'apeline chez ces

animaux. Les résultats montrent que, 8 heures après l'injection, le TNF entraîne une

augmentation de l'expression de l'apeline d'un facteur 3 dans les adipocytes isolés.

Cette augmentation s'accompagne d'une concentration plasmatique d'apeline plus

élevée chez les souris traitées au TNF . Afin de déterminer si l'effet du TNF sur

l'expression d'apeline est direct, nous avons étudié, sur la lignée cellulaire 3T3F442A,

les conséquences d'un traitement aigu au TNF sur l'expression d'apeline. Les résultats

obtenus montrent que le traitement au TNF augmente l'expression et la sécrétion de

l'apeline dans ce modèle cellulaire. De plus, l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques

(LY294002, PD098059 GFX et SP600125) a mis en évidence que la régulation de

l'expression de l'apeline par le TNF était dépendante de la PI3K, de la Jun kinase et

des MAPK. En revanche, contrairement à ce qu'il avait été observé avec l'insuline, le

contrôle de l'expression de l'apeline par le TNF est indépendant de la PKC.

Compte tenu de ces résultats, nous avons voulu connaître la relevance

physiologique de cette régulation. Pour cela, nous avons quantifié l'expression

adipocytaire de l'apeline et du TNF chez des modèles murins d'obésité. Ainsi, chez

deux modèles murins d'obésité différents, l'expression de l'apeline adipocytaire

augmente proportionnellement à celle du TNF .

Chez l'homme, le même type de régulation semble exister. Lors de la culture d'explants

de TA sous cutanés, une augmentation spontanée de l'expression et de la sécrétion du

TNF a été décrite (180). Dans notre étude, cette augmentation est suivie d'une

élévation significative de l'expression de l'apeline. A contrario, lors de l'inhibition

pharmacologique de la sécrétion de TNF dans le milieu, une absence d'augmentation

du transcrit de l'apeline est observée. L'analyse d'échantillons provenant de TA humains

- 182 -

sous-cutanés ou viscéraux démontre une corrélation positive existe entre l'expression

adipocytaire d'apeline et celle du TNF . Cette corrélation est encore plus forte chez les

individus obèses.

- 183 -

ARTICLE II

Le TNF augmente l'expression de

l'apeline dans le tissu adipeux

humain et murin

Danièle Daviaud, Jérémie Boucher, Stéphane Gesta, Cédric Dray, Charlotte Guigné, Didier

Quillot, Ahmet Ayav, Olovier Ziegler, Christian Crapéné, Jean-Sébastien Saulnier Blache,

Phlippe Valet et Isabelle Castan-Laurell




Faseb Journal 20, E796-E802 (2006)

- 184 -

- 185 -

- 186 -

- 187 -

- 188 -

- 189 -

- 190 -

- 191 -

Discussion ARTICLE II

Cette étude a donc mis en évidence un nouveau facteur capable de réguler

l'expression de l'apeline dans le TA. Alors que le TNF possède une action inhibitrice

sur la voie de l'insuline, l'expression adipocytaire d'apeline est, de façon surprenante,

contrôlée positivement par le TNF . Ceci suggère qu'au cours du développement de

l'obésité conduisant à l'insulino-résistance, les taux élevés de TNF et d'insuline

pourraient agir de concert et ainsi maintenir une apelinémie élevée.

Cependant, différents travaux suggèrent aussi que l'inflammation du TA est

précoce et qu'elle a lieu avant l'installation de l'obésité. Il est alors possible d'imaginer

que le TNF , sécrété localement par le TA de l'individu en surpoids, puisse provoquer,

par action autocrine ou paracrine, une augmentation de l'expression et de la sécrétion

de l'apeline. Aux vues des propriétés angiogéniques de l'apeline dans le TA décrites par

O. Kunduzova (541) et des résultats que nous avons obtenus, on ne peut pas exclure

que le peptide, dont la production est alors stimulée par le TNF , possède un rôle dans

les phases précoces du développement du TA associé à l'obésité.

D'autres résultats, obtenus au laboratoire, démontrent que le lipopolysaccharide

(LPS) est aussi capable d'induire une augmentation de l'expression adipocytaire de

l'apeline in vivo et in vitro. Le LPS est une molécule étroitement impliquée dans

l'inflammation du TA au cours de l'obésité et à l'origine de dysfonctionnements

métaboliques. Il semble alors que la régulation de l'expression de l'apeline adipocytaire

ne soit pas spécifique à un agent inflammatoire en particulier mais plutôt à

l'inflammation elle-même. A partir de ces informations, il me semble nécessaire

d'approfondir les recherches afin de mieux appréhender l'implication de l'inflammation

sur l'expression adipocytaire de l'apeline et ses conséquences sur le TA.

Réciproquement, le rôle potentiel de l'apeline sur les phénomènes inflammatoires

observés au sein de ce tissu mérite d'être étudié.

- 192 -

ARTICLE III: Etude de la régulation de l'expression de l'apeline et de son

récepteur APJ au cours de l'insulino-résistance et du diabète de type II chez

l'homme et la souris.

L'insulino-résistance trouve son origine, à la fois, dans le dysfonctionnement de la

voie de l'insuline, mais également dans la modification du profil sécrétoire des

adipocytes. Ainsi, certaines adipokines, délétères pour la sensibilité à l'insuline ou la

tolérance au glucose, possèdent une expression ou une sécrétion augmentée (TNF ,

IL-6, résistine et RBP4), alors que d'autres, favorables au maintient d'un métabolisme

énergétique normal diminuent (adiponectine et omentine). Enfin, un troisième profil

d'expression existe: il s'agit d'adipokines qui voient leur expression augmenter avec

l'obésité et l'insulino-résistance alors qu'elles sont bénéfiques pour le métabolisme

énergétique (leptine et adipsine). Pour expliquer ceci, différents travaux ont montré que

des phénomènes de "résistance" pouvaient se mettre en place au cours de l'obésité et

de ses pathologies associées. Ainsi, l'adipsine voit le nombre de ses récepteurs

diminuer chez le rat obèse alors que la leptine possède une voie de signalisation altérée

du fait d'une leptinémie trop importante (359, 577).

A la vue de ces résultats, nous nous sommes interressés à la régulation de

l'apeline au cours de l'insulino-résistance et diu diabète de type II chez l'homme et la

souris.

- 193 -

ARTICLE III

Régulation de l'expression de

l'apeline et d'APJ chez l'homme et la

souris au cours de l'insulino-

résistance

Dray C 1,2

, Debard C3, Jager J

4, Disse E

5, Daviaud D

1,2, Martin GP

6, Guigné C

1,2, Bost F

4, Tanti

JF4, Laville M

5, Vidal H

3, Valet P

1,2 and Castan-Laurell I

1,2




3 INSERM Unité 870; INRA Unité 1235; INSA de Lyon; Université Lyon 1, Faculté de

médecine Lyon-Sud, F-69600, Oullins 4 Centre Méditéranéen de Médecine Moléculaire, INSERM U 895, Université de Nice Sophia-

Antipolis, F-06204 Nice, France

5 Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, Institut National de la Recherche Agronomique,

INRA UR66, Toulouse, France

Running title: apelin/APJ regulation in type 2 diabetes

Article en préparation

- 194 -

Human and mouse apelin and APJ regulation in adipose tissue and skeletal

muscle in type 2 diabetes

Dray C

1,2, Debard C

3, Jager J

4, Disse E

5, Daviaud D

1,2, Martin GP

6, Guigné C

1,2, Bost F

4, Tanti

JF4, Laville M

5, Vidal H

3, Valet P

1,2 and Castan-Laurell I

1,2




3 INSERM Unité 870; INRA Unité 1235; INSA de Lyon; Université Lyon 1, Faculté de

médecine Lyon-Sud, F-69600, Oullins

4 Centre Méditéranéen de Médecine Moléculaire, INSERM U 895, Université de Nice Sophia-

Antipolis, F-06204 Nice, France

5 Centre de Recherche en Nutrition Humaine Rhône-Alpes, Hospices Civils de Lyon, Hôpital

Lyon-Sud, F-69310 Pierre-Bénite

6 Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, Institut National de la Recherche Agronomique,

INRA UR66, Toulouse, France

Running title: apelin/APJ regulation in type 2 diabetes

Corresponding author:

Isabelle Castan-Laurell, I2MR, IFR 150, BP 84225, 31432 Toulouse cedex 4, France.

Email: [email protected] tel: (33) 5 61 32 56 35, fax: (33) 5 61 32 56 23

Key words: apelin, APJ, adipose tissue, skeletal muscle, insulin resistance,

diabetes

mailto:[email protected]

- 195 -

Abstract

Objective: Apelin, an adipocyte-secreted factor, is increased in adipose tissue (AT) with obesity

and up-regulated by insulin. The regulation of apelin and APJ (apelin receptor) expression in

skeletal muscle in relation with insulin resistance or type 2 diabetes is not known. Thus, we

compared apelin and APJ profile in AT and muscle in humans and mice and studied their

regulation by insulin.

Methods: Apelin and APJ expression were measured by real-time PCR in At and skeletal

muscle. We used C57Bl6/J mice fed either a chow- or a high-fat (HF) diet and db/db mice.

Insulin effect was measured during fasting/refeeding conditions in HF-fed mice. Control and

diabetic humans were subjected to an hyperinsulinemic-euglycemic clamp and biopsies of both

tissues were obtained before and after the clamp.

Results: Whereas apelin and APJ were significantly increased in AT of HF-fed mice, no

modifications were observed in muscle. In AT and muscle of db/db, apelin expression was

similar to control but APJ in muscle was decreased. Between control and diabetic subjects, there

was no significant difference in apelin and APJ expression in AT and muscle. Although insulin

regulates apelin and APJ expression in AT and muscle of control mice and humans, APJ

regulation was only observed in AT of HF-fed mice and in muscle of diabetic subjects.

Conclusion: Apelin and APJ expression are differently regulated between i) AT and muscle and

ii) insulin-resistant and diabetic states. APJ expression in muscle decreases with type 2 diabetes.

- 196 -

Introduction

Apelin is a circulating peptide produced and secreted by human and mouse adipocytes

(Boucher et al, 2005). Its plasma concentrations are increased in humans with morbide obesity

(Heinonen et al., 2005) and in hyperinsulinemic obese mice (Boucher et al., 2005). Our group

also demonstrated that adipose tissue apelin expression and production are strongly regulated by

insulin (Boucher et al 2005). Very recently we discovered that apelin is able to stimulate glucose

utilization in adipose tissue and skeletal muscles in mice with a normal weight but also in obese

and insulin-resistant mice (Dray et al 2008), supporting a potential physiological role of this

peptide in the regulation of glucose homeostasis. However, there are controversies in the

literature regarding the regulation of apelin in patients with altered glucose metabolism. Erdem et

al showed that plasma apelin levels were decreased in newly diagnosed type 2 diabetic subjects

compared to overweight patients (Erdem et al 2008) whereas, in another study, an increased level

of apelin has been observed in subjects with glucose intolerance and type 2 diabetes (Li et al.,

2006).

Apelin acts through the binding to a specific G protein-coupled receptor named APJ

(Tatemoto et al., 1998). Apelin and APJ mRNA are widely expressed in mammal tissues and are

associated with functional effects in both the central nervous system and peripheral tissues

(Carpéné et al., 2007). Apelin and APJ receptor are often co-localized in the same tissues and

display similar variations of expression. For example, coordinated down-regulation (Iwanaga et

al 2006) or increased expression (Alturi et al 2007) of apelin and APJ has been observed in

human or rodent heart with cardiac dysfunction. In obese subjects, we recently showed that the

expression of both apelin and APJ was increased in adipose tissue (Castan-laurell et al 2008).

So far, the regulation of APJ expression in skeletal muscle has not been yet studied.

Moreover, the impact of insulin-resistance and type 2 diabetes, on the expression of these new

actors of glucose metabolism, remains to be addressed. Therefore, in the present study, we

investigated the adipose tissue and skeletal muscle expression of apelin and APJ in mouse models

displaying different degrees of insulino-resistance and in human subjects with and without type 2

diabetes. Furthermore, we studied their regulation during hyperinsulinemic euglycemic clamp in

humans and during the fasting-refeeding transition in mice models. The data presented herein

showed that apelin and APJ expression are differently regulated according to the tissue in

situations of insulin-resistance and diabetes.

- 197 -

Materials and Methods

Animal studies

Housing and diets Animals were handled in accordance with the principles and guidelines

established by the National Institute of Medical Research (INSERM). C57Bl6/J wild type and

db/db mice were obtained from Charles River Laboratory (l’Arbresle, France). Mice were housed

conventionally in a constant temperature (20-22°C) and humidity (50-60%) animal room, with a

12/12h light/dark cycle (lights on at 8:00 am) and free access to food and water. The C57Bl6/J

mice were fed either a chow diet or a high-fat (HF) diet containing 20% protein, 35%

carbohydrate and 45% fat (Research Diet, NJ). HF-fed mice were followed at regular intervals

with measure of body weight and blood parameters (glucose, insulin) until they were obese and

insulin resistant (30 weeks-old in average). Db/db mice were fed a chow diet and killed at the

same age than the HF-fed mice.

Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) An intraperitoneal injection of glucose (1 g/kg of

body weight) was performed in 12-h-fasted mice. Blood was collected from the tip of the tail vein

and glucose levels were monitored with a glucometer (Roche Diagnostic, Rotkreuze,

Switzerland) at 0, 20, 40, 60, 90 and 120 min after glucose injection.

Intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) An intraperitoneal injection of human insulin (0,75

U/kg of body weight) was performed in 12-h-fasted mice. Blood was collected from the tip of the

tail vein and glucose levels were monitored with a glucometer (Roche Diagnostic, Rotkreuze,

Switzerland) at 0, 20, 40, 60, 90 and 120 min after insulin injection.

Nutritional regulation and tissue sampling Mice were fed, 24 hrs fasted or refed during 24h after

24 hrs fasting. Blood was collected through inferior cava vein on EDTA 0,1% for plasmatic

glucose, insulin and apelin determination (see below) and tissues were taken and immediately

frozen for RNA determination or for glucose transport in isolated adipocytes or skeletal muscle.

Plasma parameters Serum insulin and apelin concentrations were measured using an ultra-

sensitive mouse insulin ELISA (Mercodia, Uppsala, Sweden) and a non selective apelin-12 EIA

kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA) respectively. Leptin was measured with Milliplex

kit of mouse adipokine (Millipore, St Charles MO, USA)

- 198 -

Human study

Subjects. All participants gave their written consent after being informed of the nature, purpose,

and possible risks of the study. The experimental protocol was approved by the Ethical

Committees of the Hospices Civils de Lyon and performed according to the French legislation

(Huriet Law). Fourteen patients with type 2 diabetes participated to the study. None of the

healthy lean control subjects had impaired glucose tolerance or a familial or personal history of

diabetes, obesity, dyslipidemia, or hypertension. All type 2 diabetic patients (mean HbA1c = 8.9

± 0.5%) were treated only with oral antidiabetic agents (metformin and/or sylfonylurea). They

interrupted, under medical control, their usual treatment at least 5 days before the investigation.

The characteristics of the subjects are presented in Table 1.

Hyperinsulinemic clamp. All studies were performed after an overnight fast. To investigate

insulin action on glucose metabolism and on gene expression in peripheral tissues, the subjects

were submitted to a 3 hour euglycemic hyperinsulinemic clamp (insulin infusion rate of 2

mU.min-1.kg-1), as previously described in details (Laville et al 1996, Ducluzeau et al 2001).

Plasma metabolites and hormones concentrations were measured using enzymatic methods and

radioimmunoassays.

In vitro studies

Human preadipocyte culture Human preadipocytes (Biopredic, Rennes, France) were grown at

5% CO2 and 37°C in 12-wells collagen-coated plates in DMEM Ham’s F12 containing 15 mM

Hepes, 2 mM L-Glutamine, 5% fetal calf serum, 1% antimycotic solution, ECGS/H-2, hEGF-5,

and HC-500 from Supplement Pack Preadipocyte Growth Medium (Promocell). Differentiation

in adipocytes was induced after confluence by changing the medium for DMEM Ham’s F12 15

mM Hepes, 2 mM L-glutamine, 3% fetal calf serum, supplemented with biotin (33 µM), insulin

(100 nM), pantothenate (17 µM), isobutylmethylxanthine (0.2 mM), dexamethasone (1 µM),

rosiglitazone (10 µM). The medium was removed after 3 days and replaced with Ham’s F12

containing 15 mM Hepes, 2 mM L-glutamine, 10% FCS, supplemented with biotin (33 µM),

insulin (100 nM), pantothenate (17 µM) and dexamethasone (1 µM). Then, the cells were fed

every 2 days with the same medium. Human adipocytes were used 9 days after the beginning of

the differentiation protocol.

- 199 -

Glucose transport in mice adipocytes A sample of perigonadic adipose tissue was minced,

incubated while shaking in 5 ml of KR buffer (Gibco, Invitrogen, Paisley, UK) supplemented

with 1 mg/ml collagenase and 1% BSA and digested for 30 min at 37°C. After filtration, isolated

adipocytes were incubated in the presence or not of 100 nM insulin for 45 min at 37°C in a final

volume of 400 µl. Then, 2-deoxy-d-[3H]-glucose (D2-DG), was added at a final concentration of

0.1 mM for 10 min. Assays were stopped with 100 µl of 100 mM cytochalasin B and aliquots of

the cell suspension were centrifuged in microtubes containing di-isononyl phthalate (density

0.974 g/ml) to separate adipocytes from the buffer and count the intracellular [3H]2-DG.

Glucose Transport in mice skeletal muscle Soleus muscles were isolated and preincubated for 10

min in Krebs-Henseleit (KH) buffer, pH 7.4, containing bovine serum albumin (2 mg/ml), 2 mM

sodium pyruvate and 20 mM Hepes. Muscles were then incubated for 45 min in the absence or

the presence of insulin (100 nM). For glucose transport, muscles were transferred in another vial

containing KH medium supplemented with D-2DG (0,1 mM) and D-[3

H]-2-Deoxyglucose (0.4

µCi/ml) for 10 minutes. Muscles were then washed for 1 hr in ice-cold iso-osmotic NaCl solution

and dissolved in 1 M NaOH during 1 hour. D-[3H]-2DG 6-phosphate and D-[3H]-2DG were

differentially precipitated by the use of zinc sulfate (0.3M), baryum hydroxide (0.3M) and

perchloric acid solutions (6%). All the incubations were carried out at 37 C under a 95% 02 : 5%

CO2 athmosphere.

Apelin and AJP mRNA expression studies

Mice tissues Tissues from fed mice (adipose tissue, muscle) were crushed by using Precellys 24

automated biological sample lyser with CK-14 beads vials. Total RNAs (1 g) were isolated

from AT using RNeasy Lipid Tissue Kits (QIAGEN, France) and from muscle using RNA STAT

(AMS Technology, UK). Total RNAs were reverse transcribed using random hexamers and

Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, UK). Real time PCR was performed as

previously described (Boucher et al., 2005). Brefly, Real-time PCR was performed on 12,5 ng

cDNA with both sense and antisense oligonucleotides in a final volume of 20 µL using SYBR

Green qPCR Master Mix (Eurogentec, Seraing, Belgium). Fluorescence was monitored and

analyzed in a GeneAmp 7500 detection system instrument (Applied Biosystems, Warrington,

- 200 -

UK). In parallel, analysis of the 18S ribosomal RNA wad performed using the ribosomal RNA

control Taqman Assay Kit (Applied Biosystems) to normalize gene expression.

Human tissues Total RNA preparations form adipose tissue and skeletal muscle samples were

performed as described previously (Ducluzeau et al 2001, Debard et al 2004). The concentrations

of Apelin and APJ mRNAs were measured by reverse transcription followed by real-time PCR

using a Light-Cycler (Roche Diagnostics, Meylan, France). First-strand cDNAs were first

synthesized from 500 ng of total RNA in the presence of 100 units of Superscript II (Invitrogen,

Eragny, France) using both random hexamers and oligo (dT) primers (Promega, Charbonnières,

France). The real-time PCR was performed in a final volume of 20 µl containing 5 µl of a 60-fold

dilution of the RT reaction medium, 15 µl of reaction buffer from the FastStart DNA Master

SYBR Green kit (Roche Diagnostics) and 10.5 pmoles of the specific forward and reverse

primers. For quantification, a standard curve was systematically generated with 6 different

amounts of cDNA. Each assay was performed in duplicate and validation of the real time PCR

runs was assessed by evaluation of the melting temperature of the products and by the slope and

error obtained with the standard curve. Hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) mRNA

level was determined in each samples and was used as internal standard for normalization of

target mRNA expression.

Statistical Analysis

Data were analyzed under R 2.8.1 (www.r-project.org) and are presented as mean ± SEM.

Depending on the experimental design log-transformed data were analyzed by one- or two-way

analysis of variance followed by a student t-test with a pooled variance estimate to compare the

groups. Data from the hyperinsulinemic clamp study were analyzed by paired student t-test. A p-

value below 5% was considered significant.

http://www.r-project.org/

- 201 -

Results

Characteristics and metabolic parameters of the different mouse models

HF-fed and db/db mice compared to chow-fed mice at the same age were obese,

hyperinsulinemic and had higher levels of blood glucose (Fig 1). In the fed state, db/db mice had

dramatically higher blood glucose levels than HF-fed mice (6.01 ± 0.20 vs 2.12 ± 0.12 g/l

respectively). Fasted glucose levels were significantly higher in HF-fed mice, than in fasted

control mice but did not differ from refeeding and fed states (Fig 1B). In HF-fed mice, even

though insulinemia was decreased during fasting, the level was significantly higher than in fasted

control mice (Fig 1C). Db/db were more hyperinsulinemic than HF-fed mice (6.03 ± 1.16 vs 4.85

± 0.69 ng/ml respectively). Plasma leptin levels were increased in HF-fed mice and more

dramatically in db/db mice as expected (Fig 1D). Plasma apelin levels were also increased in HF-

fed mice as previously described as well as in db/db mice (Fig 1E). During GTT and ITT, HF-fed

mice presented a profile of glucose intolerance and a loss of insulin sensitivity that was less

pronounced than in db/db mice (Fig 1F and 1G). Moreover, HF-fed mice had significant impaired

glucose transport measured in vitro in isolated adipocytes and soleus muscle (Fig 1H and 1I).

This decrease was more pronounced in db/db mice. Thus HF-fed mice were clearly insulin-

resistant but less than db/db mice.

Apelin and APJ expression in AT and muscle in mice

In fed conditions, apelin but also APJ expression was increased in AT of HF-fed insulin-

resistant mice but not in AT of diabetic db/db mice compared to chow-fed mice (Fig 2). In

muscle, apelin expression was similar in control, HF-fed and decreased in diabetic mice. APJ

expression was decreased in muscle of insulin-resistant when compared to control mice. This

effect was more marked in diabetic mice (Fig 2).

During fasting/refeeding transition, apelin expression significantly increased in AT (2.8

fold) and in muscle (2.4 fold) of control mice. These effects were less pronounced in the tissues

of HF-fed mice (Fig. 3), but apelin expression increased in both tissues upon refeeding in this

model too. Regarding APJ, fasting and refeeding did not change its mRNA expression in skeletal

muscle, neither in control or in HF-fed mice. In adipose tissue APJ expression tended to be

increased upon refeeding in control mice (P= 0.09) and the effect was more significant in HF-fed

mice (P= 0.051) (Fig. 3).

- 202 -

Characteristics and metabolic parameters of the subjects.

The lean control subjects and the moderately obese type 2 diabetic patients who participated in

the study had classical metabolic characteristics (Table I). In the basal state, after an overnight

fasting, plasma concentrations of glucose, insulin, and triglycerides were higher in type 2 diabetic

patients than in control subjects. During the euglycemic hyperinsulinemic clamp, insulinemia was

maintained at similar supra-physiological concentration in both groups. Under such condition, the

stimulation by insulin of whole-body glucose utilization rate was profoundly reduced in type 2

diabetic patients, indicating a marked state of insulin-resistance. In addition, NEFA

concentrations during the clamp remained significantly higher in the type 2 diabetic patients

(Table I) indicating also lower insulin response in adipose tissue.

Apelin and APJ expression in AT and muscle in humans and regulation by insulin

In the basal state, apelin and APJ mRNA expressions were not significantly different between

control subjects and type 2 diabetic patients, both in adipose tissue and in skeletal muscle, even

though there were trends for an increased apelin expression in fat and for a decreased APJ

expression in muscle of the type 2 diabetic patients (Fig 4).

To assess the effect of insulin in vivo, tissue biopsies were taken before and at the end of the 3

hour hyperinsulinemic clamp. Hyperinsulinemia increased apelin and APJ expression in adipose

tissue of control subjects (Fig. 4). This effect of insulin on apelin and APJ mRNAs was

completely blunted in the AT of the type 2 diabetic patients. In skeletal muscle apelin appears to

be not affected by 3 hours of hyperinsulinemia, neither in control or in diabetic subjects. In

contrast APJ mRNA levels were increased during the clamp. Although the effect was modest, the

difference reached significance in the muscle of diabetic patients (Fig. 4).

To confirm the direct involvement of insulin in the observed regulation of apelin and APJ

expression in human adipose tissue, primary culture of human adipocytes were treated with

insulin in vitro. As shown if figure 5, insulin promoted a significant direct effect on apelin

expression as soon as 3h stimulation. This effect was more pronounced after 8h of treatment. APJ

expression was also increased by insulin after 3h.

- 203 -

Discussion

Insulin resistance in the major insulin-target tissues is widely recognized as a fundamental

defect that precedes the development of type 2 diabetes. As obesity is a major risk factor for

insulin resistance, adipose tissue-secreted factors (adipokines) play an important role in this

phenomenon. Adipokines have been shown to have either insulin-sensitizing effects or to be

implicated in the induction of insulin resistance (Catalan et al 2009). The regulation of apelin,

newly identified as an adipokine stimulating glucose uptake (Dray et al 2008), and of its receptor

APJ has thus been herein highlighted in AT and skeletal muscle during insulin-resistant and

diabetic states. We showed that apelin and APJ mRNA expression exhibit tissue-specific

regulation and are differently regulated between insulin-resistant and diabetic states.

Apelin and APJ expression profiles are different in AT and skeletal muscle during the

onset of type 2 diabetes. We observed that apelin expression in AT increase with insulin-

resistance before to be down-regulated in type 2 diabetes whereas, apelin expression in muscle of

control and insulin-resistant mice is similar. In diabetic mice, a decrease of apelin expression in

AT and muscle was observed compared to chow-fed mice. This suggests that in a less deleterious

state of insulin resistance (observed in HF-fed), apelin expression can be regulated specifically in

AT. However, during the fasting/refeeding transition where numerous parameters are modified, a

similar increase of apelin mRNA was observed in AT and muscle of refed HF-fed mice. One

candidate involved in the regulation of apelin could be insulin, as previously reported (Boucher

2005). However, this is consistent with the fact that insulin has not the same effect in adipose

tissue and skeletal muscle during insulin-resistance. This is supported by a recent study showing

that after 14-week of HFD in mice, adipose tissue compared to liver or muscle was more

sensitive in response to insulin regarding Akt phosphorylation (Kim et al, 2008). Moreover,

Sartipy et al (Sartipy et al, 2003) showed that in metabolically insulin-resistant adipocytes (3T3-

L1), different genes continued to respond to insulin suggesting that some signalling pathways

involved in gene transcription remain insulin sensitive (Samad et al 2000). All together, these

data suggest that insulin sensitivity of adipose tissue is preserved or higher when compared to

skeletal muscle in the model of HF-induced insulin resistance. The increased expression of apelin

in AT could contribute to the elevated plasma levels measured in HF-fed mice. In db/db mice

eventhough apelin expression is not increased in AT, the considerable amount of fat mass could

account for the high plasma apelin levels. Thus, plasma apelin levels are increased in both

insulin-resistant and diabetic states in mice. It could be hypothesized that the endogenous

circulating apelin in HF-fed mice helps to delay the onset of insulin resistance first in adipose

- 204 -

tissue as a primary target. In diabetic mice, the levels of apelin might be insufficient or inefficient

to counteract the insulin resistance. An other hypothesis could be the settlement of an apelin

resistance.

The difference between AT and muscle is even more pronounced regarding APJ

expression. In AT, APJ follows the same expression profile than apelin whereas, in muscle, APJ

mRNA levels decrease with insulin resistance and even more in type 2 diabetes. Thus, the level

of APJ expression in muscle, compared to apelin, is dependent of the degree of insulin resistance.

Down-regulation of APJ mRNA and protein levels has been described in aorta from diabetic

db/db mice (Zhong et al 2007). This study also showed that apelin treatment, despite a depressed

expression of APJ, reversed the altered aortic vascular responsiveness to angiotensin or

acethylcholine observed in db/db mice (Zhong et al 2007). We recently showed that in HF-fed

obese and insulin-resistant mice, exogenous apelin during an euglycemic-hyperinsulinemic clamp

increases glucose utilization in muscle (Dray et al 2008). Thus, the amount of APJ mRNA levels

in muscle of HF-fed mice and consequently the number of receptor is probably sufficient to

mediate apelin metabolic effects.

In humans, the literature reported essentially apelin and APJ regulation in the cardiac

muscle in different cardiovascular diseases (Chandrasekaran et al 2008) or in adipose tissue

during obesity or weight loss (Heinonen et al 2009, Castan-Laurell et al 2008). We reported here

for the first time apelin and APJ expression in parallel in skeletal muscle and AT of diabetic

subjects. There was a trend for a decreased APJ expression in muscle but not in AT of the

diabetic patients. Interestingly, insulin during the clamp is able to increase APJ expression in

muscle of control and diabetic subjects. Apelin expression in AT and muscle was not

significantly modified by insulin in diabetic subjects. Whether plasma apelin levels are increased

or decreased in patients with type 2 diabetes, is not clear due to the heterogeneity in the groups

studied and the type of control subjects chosen (Heinonen et al 2005, Li et al 2006, Tasci et al

2007, Erdem et al 2008). Nevertheless, plasma apelin levels seem to be influenced by the

different stages of the disease (obesity vs insulin resistance vs type 2 diabetes) and consequently

the positive association between apelin and insulin is not always found.

In conclusion, the down-regulation of APJ expression observed in skeletal muscle with

type 2 diabetes may have pathophysiological implications. There is a need in clinical and

specifically longitudinal studies to clarify the changes in expression of the apelin-APJ system in

order to establish whether modulation of the apelin-APJ system has therapeutic benefits in

patients with type 2 diabetes.

- 205 -

Acknowledgments

We gratefully acknowledge the animal facilities staff (service de Zootechnie) and the

phenotypage plateforme Anexplo of Toulouse from IFR150.

- 206 -

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- 209 -

- 210 -

- 211 -

- 212 -

- 213 -

- 214 -

Discussion ARTICLE III

Tous les gènes sensibles à l'insuline ne sont pas régulés de la même manière au

cours de l'insulino-résistance. Ainsi, Sartipy et ses collaborateurs ont pu monter sur les

cellules 3T3L1 qu'il existait deux types de gènes. Les gènes dont l'expression devient

résistante à l'insuline, c'est à dire qu'il ne sont plus régulés par l'insuline exogène et les

gènes qui, malgré l'insulino-résistance fonctionnelle métabolique, restent sensibles à

l'insuline (333). D'autres études ont par la suite pu montrer le même type de régulation

in vivo. En effet, chez l'obèse et le patient diabétique de type II, l'équipe de H. Vidal a

mis en évidence des différences de réponse à l'insuline de la part de gènes impliqués

dans le métabolisme énergétique (578).

Lors de ces travaux, nous avons pu observer une augmentation de l'expression

de l'apeline dans le TA de souris insulino-résistante comparble à celle observée par J.

boucher chez les souris obèses hyperinsulinémiques (542). Chez les souris diabétiques

de type II (souris db/db), l'expression de l'ARNm de l'apeline est diminuée jusqu'à

retrouver la même expression que chez les souris normopondérales. Cette observation

sur le TA viscéral entier est retrouvée sur les adipocytes isolés et les cellules de la FSV

issus du TA de ces animaux (données personnelles). Les concentrations plasmatiques

d'apeline ne suivent pas le même profil que l'expression du peptide dans le TA

puisqu'on remarque une augmentation progressive des taux sériques du peptide chez

les souris insulino-résistantes et les diabétiques. Ces résultats posent la question de la

participation du TA blanc au sein de l'apeline circulante. En effet, même si l'étude de

l'expression du messager n'est pas suffisante pour conclure, il semble néanmoins peu

probable que le TA soit la principale source d'apeline plasmatique chez la souris

diabétique. Des expériences complémentaires s'attachant à quantifier la synthèse et la

sécrétion de l'apeline au sein de ce tissu sont toutefois nécessaires. Dans ce sens,

l'élaboration de modèles murins dont le gène codant pour l'apeline a été spécifiquement

invalidé dans le TA est en cours.

Nous avons également conscience que l'utilisation de souris db/db peut constituer un

biais dans l'étude compte tenu des liens établis entre leptine et apeline par Higuchi

(556). En effet, un traitement chronique à l'apeline semble augmenter la concentration

plasmatique en leptine et on peut émettre l'hypothèse qu'en retour, la leptine soit

capable de modifier la sécrétion d'apeline. Dans cette boucle de régulation, la leptine

- 215 -

inhiberait la sécrétion d'apeline de sorte que chez la souris db/db (dépourvue de

récepteur à la leptine) l'absence de ce rétrocontrôle entraîne une augmentation de la

concentration plasmatique d'apeline. Nous avons déjà vu que la vasopressine, régulée

par l'apeline, était capable de modifier la sécrétion d'apeline au niveau des noyaux

supra-optiques (511). La leptine pourrait être un bon candidat pour jouer le même rôle

au niveau du TA.

Comparé au TA, l'absence de modification du profil d'expression de l'apeline

dans le muscle rectus femoris de souris en régime gras ou des souris db/db suggère

que la régulation observée dans le TA est spécifique de ce tissu.

Dans le but d'observer l'expression de l'apeline en réponse à des variations

plasmatiques d'insuline chez les souris insulino-résistantes, nous avons procédé à des

expériences de mise à jeun et réalimentation. L'augmentation de l'insulinémie entraîne

une augmentation de l'expression de l'apeline dans le TA des souris normopondérales

et des souris obèses et insulino-résistantes. Cette régulation, qui existe aussi dans les

muscles d'animaux sains, est perdue dans ceux des animaux en régime gras. Ces

résultats semblent confirmer la théorie selon laquelle les muscles deviennent plus

rapidement résistants à l'insuline que le TA. Ainsi, l'insuline parvient encore à réguler

l'expression adipocytaire d'apeline alors qu'elle n'est plus capable de le faire dans le

muscle.

L'insuline est un des systèmes permettant de réguler l'expression adipocytaire de

la leptine. Or, dans un contexte d'obésité et d'hyperinsulinémie, certains auteurs se sont

posés la question d'une régulation de la leptine au cours de l'insulino-résistance. Chez

la souris normopondérale, les résultats montrent qu'une mise à jeûn entraîne une

inhibition de l'expression de la leptine alors qu'une réalimentation provoque une

augmentation de l'expression de l'ARNm de la leptine. En revanche, chez la souris

obèse et insulino-résistante, cette régulation ne s'opère plus. Il semblerait donc qu'au

cours de l'insulino-résistance, l'insuline perde sa capacité à réguler l'expression de la

leptine.

Profil d'APJ au cours de l'installation du diabète

Ces travaux sont les premiers à étudier la régulation d'APJ dans le muscle stré

squelettique. Comme pour son ligand, l'expression d'APJ dans le TA est augmentée

- 216 -

chez les souris insulino-résistante diminuée et elle fortement diminuée chez les animaux

diabétiques. Ces résultats sont en accord avec ceux qui ont été obtenus au cours des

expériences de mise à jeun et de réalimentation puisque l'expression d'APJ dans le TA

est régulée positivement par l'insuline aussi bien chez les animaux normopondéraux

que chez souris insulino-résistantes.

Dans le muscle, l'expression d'APJ diminue parallèlement à la perte de sensibilité

à l'insuline des animaux. Or, au cours des expériences de variations physiologiques de

l'insulinémie, l'expression d'APJ musculaire ne semble pas contrôlée par l'insuline

soulignant une fois de plus le fait que l'insuline, au cours de l'insulino-résistance, agit

différemment entre le muscle et la TA.

En résumé, cette étude chez la souris nous a permis de mettre en évidence que:

-l'expression de l'apeline et d'APJ semblait être contrôlée par l'insuline au sein du

TA et ce malgré le développement d'une insulino-résistance fonctionnelle.

-l'expression de l'apeline dans le muscle est régulée par la mise à jeun et la

réalimentation mais cette régulation est perdue au cours de l'insulino-résistance.

Nous avons conscience que les expériences de mise à jeun et réalimentation

sont intéressantes d'un point de vue physiologique pour modifier l'insulinémie mais que

de nombreux autres paramètres varient aussi au cours de ce type d'expérience

(glycémie, triglycéridémie, leptinémie, adiponectinémie, acides gras plasmatiques…) et

rendent l'interprétation difficile. Afin de s'affranchir d'une variation de la glycémie, il

serait intéressant de pratiquer un clamp hyperinsulinémique euglycémique chez ces

différents groupes de souris et d'observer l'expression de l'apeline dans les différents

tissus.

Etude de l'expression du système apeline/APJ chez le diabétique de type II

Chez l'homme, c'est justement le clamp hyperinsulinémique euglycémique qui a

été choisi afin d'incrémenter pharmacologiquement l'insulinémie. Les résultats montrent

que l'insuline régule positivement l'expression de l'apeline et d'APJ dans le TA

d'individus sains alors que cette régulation est perdue chez le patient diabétique. Au

niveau musculaire, seule l'expression d'APJ est régulée par l'insuline.

- 217 -

Même si le nombre d'individus doit être augmenté dans chaque groupe, les

résultats obtenus au niveau du TA confirment le contrôle de l'insuline sur l'expression du

complexe apeline/APJ en situation physiologique et suggèrent que chez ces patients

diabétiques, ce tissu semble totalement insulino-résistant.

Ces travaux, qui corroborent les résultats obtenus par J. Boucher chez l'individu

sain, sont complétés par l'augmentation de l'expression de l'apeline lors du traitement

par l'insuline sur une lignée adipocytaire humaine.

L'ensemble des résultats exposés dans cette étude souligne la relation qu'il existe entre

apeline, insuline et diabète. La régulation de l'expression de l'apeline et de son

récepteur par l'insuline est complexe et elle semble dépendre du tissu et de la situation

physiologique.

- 218 -

Conclusion générale et perspectives

L'obésité est fréquemment associée à plusieurs pathologies regroupées sous le

terme de syndrôme X: insulino-résistance, hypertension, hyperlipidémie… L'insulino-

résistance est un état au cours duquel les tissus dépendants de l'insuline (foie, muscle

et TA) vont perdre progressivement leur sensibilité à l'insuline. La conséquence directe

d'un tel processus est une augmentation de la concentration plasmatique des substrats

énergétiques (lipides et glucides). Cette exposition permanente des organes à des taux

élevés de glucose et de lipides va entraîner des modifications biochimiques au niveau

de certaines cellules conduisant à aggraver le phénomène de résistance à l'insuline.

Une des phases les plus précoces de cette perte de sensibilité à l'insuline est

matérialisée par une diminution du transport de glucose dans les cellules insulino-

dépendantes. Ainsi, une élévation de la glycémie basale et post-prandiale pourra être

observée.

L'apeline est un peptide synthétisé sous la forme d'un prépropeptide de 77 acides

aminés dans différents tissus tels que le cœur, le muscle, les poumons ou encore le

système nerveux central. Les formes circulantes et biologiquement actives sont les

isotypes de 36, 17 et 13 acides aminés au sein desquelles les 13 derniers acides

aminés sont conservés entre les espèces. Comme l'apeline, son récepteur APJ a été

localisé dans de nombreux tissus. APJ est un récepteur à 7 domaines

transmembranaires couplé à une protéine de type Gi/o. Sa stimulation conduit à son

internalisation ainsi qu'à une diminution de la synthèse d'AMPc dans la cellule. In vitro, il

a été montré que la stimulation d'APJ provoquait une activation de la voie des MAPK

(ERK1 et ERK2) et de la PI3K (Akt), ainsi qu'une phosphorylation activatrice des

protéines P70S6K, FAK, PLC et PKC. Ces résultats ont suggéré une implication de

l'apeline dans la prolifération, la croissance et la migration cellulaire.

Son implication dans la régulation des fonctions cardiaques et vasculaires a pu

être démontrée depuis une dizaine d'années. Ainsi, l'apeline, en stimulant la NOS

endothéliale (eNOS), est un puissant vasodilatateur qui va agir par l'intermédiaire de la

synthèse de monoxyde d'azote. Dans le cœur, l'apeline est capable d'augmenter la

- 219 -

contraction cardiaque et sa concentration plasmatique est corrélée négativement au

développement de certaines pathologies cardiaques chez l'homme.

L'apeline et son récepteur sont aussi présents au niveau de certaines zones du

système nerveux central. Ainsi, l'équipe de C. Llorens-Cortés a mis en évidence que

l'apeline était impliquée dans la régulation des fluides corporels via son action sur la

synthèse de vasopressine. Bien que les résultats méritent d'être approfondis, l'autre rôle

central de l'apeline qui pu être montré concerne la prise alimentaire.

Chez la souris normopondérale et la souris rendue obèse et insulino-résistante

par un régime hyperlipidique, les résultats obtenus démontrent que l'apeline participe à

la régulation de l'homéostasie glucidique en agissant sur des tissus insulino-sensibles

tels que le muscle ou le TA. Le foie, qui est un tissu important dans le maintient de

l'homéostasie énergétique, ne semble pas être une cible de l'apeline. Vu l'absence de

récepteur APJ au niveau de cet organe, mais si un effet indirect est possible, ce résultat

semble cohérent. Cependant, de récents travaux ont montré que l'expression hépatique

du récepteur APJ pouvait être fortement augmentée (plus de 300 fois) au cours de

certaines pathologies comme la cirrhose hépatique (Principe et al., 2008). Ces

observations devraient nous amener à nous interroger l'effet de l'apeline sur le

métabolisme hépatique car au cours diabète de type II associé à l'obésité, des

phénomènes de stéatose hépatique ont été rapportés pouvant conduire vers une

cirrhose et une fibrose du foie (15). Ainsi, lors des stades avancés de la pathologie, APJ

pourrait être présent à la membrane plasmique des hépatocytes permettant ainsi à

l'apeline de jouer un rôle direct sur le foie. Enfin, Principe et ses collaborateurs montrent

que l'apeline est impliquée dans les processus de cirrhose et de fibrose hépatique

provoqués par un traitement au tétrachlorure de carbone (CCl4) (579). Il serait

intéressant d'étudier la participation du système apeline/APJ aux même phénomènes

observés au cours des pathologies associées à l'obésité (580).

Lors de l'étude concernant le rôle de l'apeline dans le métabolisme énergétique,

toutes les investigations ont été faites au niveau périphérique. Cependant, on ne peut

pas exclure que l'apeline puisse également médier son effet sur l'homéostasie

glucidique via une action centrale. En effet, la localisation des neurones exprimant le

récepteur APJ au niveau des noyaux arqués (NPV) et ventromédian de l'hypothalamus

- 220 -

suggère que l'apeline puisse jouer un rôle sur l'équilibre glucidique (581). L'apeline

pourrait agir comme la leptine, au niveau périphérique et central, pour réguler

l'homéostasie glucidique. En effet, plusieurs travaux ont permis de mettre en évidence

que la leptine inhibait l'activité de l'AMPK hypothalamique ce qui conduisait à une

augmentation de l'oxydation des acides gras par les tissus périphériques (581). Comme

nous l'avons vu dans l'introduction, cette meilleure oxydation des substrats lipidiques

pourra conduire à une augmentation de l'utilisation du glucose. Etant donné l'ensemble

de ces résultats, un axe de recherche est actuellement développé dans l'équipe pour

définir le rôle central de l'apeline sur l'homéostasie glucidique.

Des résultats récents mettant en évidence l'implication de la P70S6K dans le

contrôle central de la prise alimentaire et de l'homéostasie glucidique (477) pourraient

permettre de mieux appréhender le rôle central de l'apeline. En effet, Masri et ses

collaborateurs avaient montré que l'apeline provoquait une phosphorylation activatrice

de la P70S6K sur des cellules en culture (472) et nous venons de mettre en évidence

que l'apeline est capable de réguler l'activité de l'AMPK. Or, au niveau hypothalamique,

la leptine active la P70S6K et inhibe l'AMPK ce qui conduit à une diminution de la prise

alimentaire et régule le métabolisme énergétique en augmentant l'oxydation des AG

(103, 112, 477). On peut alors facilement imaginer que l'apeline possède le même mode

d'action et ainsi serait capable de diminuer la prise alimentaire comme l'avait évoqué

Sunter en 2003 (521).

L'apeline et la leptine ont beaucoup de points communs aussi bien sur le plan

fonctionnel qu'au niveau de leur régulation. Ces similitudes sont également retrouvées

sur le transport de intestinal de glucose et nous ont conduit a développer une

collaboration basée sur l'étude du rôle de l'apeline au niveau du transport de glucose

intestinal. Cette collaboration avec l'équipe de R. Ducroc à Paris a permis de montrer

que l'apeline pouvait phosphoryler l'AMPK au niveau des entérocytes de rats et de

souris conduisant à modifier le transport de glucose de la lumière intestinale vers la

circulation sanguine. Ainsi, l'apeline administrée per os aux souris juste avant une

charge orale de glucose améliore nettement la tolérance au glucose d'animaux sains ou

insulino-résistants. Ces travaux en cours constituent un nouveau domaine d'action de

l'apeline très prometteur et renforcer son rôle dans l'homéostasie glucidique.

- 221 -

Compte tenu de l'action pléïotropique de l'AMPK, les résultats que nous avons

obtenus ouvrent un champ d'investigation important pour les prochaines années. En

effet, si notre étude montre que l'apeline favorise le transport de glucose dans le muscle

via l'activation de l'AMPK, d'autres travaux doivent être entrepris afin d'établir le rôle de

l'apeline sur les autres effets métaboliques médiés par l'AMPK. Ainsi, les premières

expériences faites au laboratoire semblent indiquer que l'apeline participe également à

la régulation de l'homéostasie lipidique. La phosphorylation d'ACC par l'AMPK que nous

avons observée rend cette enzyme inactive. Par conséquent, l'ACC n'assure plus la

synthèse de malonyl-CoA, molécule précurseur des AG dans la cellule, ce qui va

entraîner une augmentation de l'oxydation des AG (acyl-CoA). Des expériences en

cours devraient nous permettre de savoir si l'apeline entraîne une augmentation de la -

oxydation des lipides dans le muscle strié squelettique et par conséquent permet de

lutter contre les phénomènes de lipotoxicité observée dans l'insulino-résistance.

A la vue des effets aigus de l'apeline que nous avons pu observer, un traitement

chronique devrait nous renseigner sur la capacité du peptide à améliorer ou à reverser

un phénotype d'insulino-résistance. Le traitement chronique à l'apeline pourrait aussi

agir sur l'expression de certains gènes diminuée au cours du diabète comme par

exemple GLUT4, HKII ou encore APJ dans le muscle. De la même façon, ce type de

traitement devrait préciser le rôle de l'apeline au niveau cardiaque. Puisque chez la

souris insulino-résistante, l'apeline améliore le transport de glucose dans le cœur, elle

pourrait ainsi restaurer l'équilibre entre l'utilisation des lipides et des glucides par cet

organe et limiter les cardiomyopathies observées chez les diabétiques de type II.

Cependant, ces perspectives soulèvent un point essentiel dans la compréhension

de l'implication de l'apeline au cours des maladies métaboliques. En effet, nous avons

vu que les taux plasmatiques d'apeline étaient augmentés chez l'animal obèse et

insulino-résistant. Chez l'homme les résultats sont plus contrastés mais semblent aller

dans le même sens.

Pourquoi l'injection d'apeline exogène entraîne-t-elle des effets sur le

métabolisme glucidique alors que l'apelinémie est élevée?

La première hypothèse à laquelle nous avons pensé était qu'il se créait une forme

de résistance à l'apeline. Comme la leptine ou l'insuline, il se pourrait que l'apeline ait

- 222 -

besoin d'augmenter sa concentration plasmatique pour produire son effet. Dans ce

sens, nous avons montré que l'expression d'APJ diminuait de façon dramatique dans le

muscle de souris diabétique. Cependant, Zhang et ses collaborateurs avaient montré

chez la souris db/db que, même si l'expression du récepteur diminuait dans les aortes

de ces animaux, l'apeline conservait la même efficacité pour induire une vasodilatation.

L'hypothèse d'une résistance à l'apeline semble donc peu probable.

En revanche, il existe un système capable de réguler de façon post-

traductionnelle l'apeline. Les enzymes ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme 2) sont

capables de dégrader l'apeline par son extrémité C-Terminale et par ce processus

semblent inactiver le peptide. Le dosage plasmatique de l'apeline qui est généralement

utilisé s'appuie sur l'identification des 12 derniers acides aminés. Ainsi, il est probable

que ce type de test ne puisse pas différencier les formes d'apeline 13 actives et celles

inactivées par l'ACE2. Ainsi, l'injection d'apeline exogène permettrait d'augmenter

significativement la quantité plasmatique d'apeline active et permettrait d'obtenir un effet

même chez la souris hyperapelinémique. Afin de vérifier ces hypothèses, il serait

nécessaire de doser par des méthodes de spectroscopie de masse les différentes

formes d'apeline présentes dans le plasma d'individus ou de souris insulino-résistants.

Si cette régulation est vérifiée, un blocage de l'activité ACE2 pourrait s'avérer

intéressant dans la lutte contre le diabète de type 2.

L'obésité est aussi caractérisée par une augmentation dramatique du

développement du TA. Ce processus est associé entre autres à des phénomènes

d'inflammation locales (infiltration macrophagique, synthèse de cytokines

inflammatoires,…) et à des dysrégulations des productions adipocytaires (AG et

adipokines). L'état inflammatoire du TA lors de l'obésité nous a amené à étudier l'effet

du TNF sur l'expression et la production de TNF . Nous avons pu mettre en évidence

que le TNF augmentait in vivo et in vitro l'expression et la sécrétion de l'apeline par

l'adipocyte humain et murin. Ces résultats impliquent que l'apeline adipocytaire puisse

jouer un rôle paracrine sur l'inflammation de bas niveau constatée dans le TA de

l'obèse. Certains travaux montrant une inflammation du TA avant l'installation de

l'obésité, on peut émettre l'hypothèse d'une participation de l'apeline dans ces

phénomènes inflammatoires. Ainsi, il serait intéressant d'étudier le rôle de l'apeline sur

- 223 -

l'inflammation du TA et son implication dans les dysrégulations de ce tissu observées au

cours de l'obésité.

L'apeline possède des propriétés angiogéniques qui pourraient être à l'origine du

développement du TA décrit au cours de l'obésité. En effet, des stratégies anti-

angiogéniques ont permis de montrer que l'angiogénèse était indispensable au

développement du TA au cours de l'obésité. Nos résultats rapportent que l'insuline et le

TNF augmentent l'expression et la sécrétion d'apeline par le TA. Or, au cours de

l'obésité conduisant vers l'insulino-résistance, il a été décrit une augmentation des taux

circulants d'insuline ainsi que de la concentration locale de TNF au niveau de TA. Ces

résultats vont dans le sens d'une forte concentration d'apeline sécrétée localement par

le TA qui par ses propriétés pro-angiogéniques pourrait participer au développement du

TA.

En prenant compte de l'ensemble de ces remarques, l'apeline doit être considérée

comme une cible thérapeutique importante dans la lutte contre le diabète de type II. La

compréhension du rôle de l'apeline au cours de l'insulino-résistance est néanmoins

nécessaire afin de savoir si cette adipokine située à l'interface de différentes pathologies

comme les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le diabète de type est

protectrice ou participe à la genèse de ces maladies. Ainsi, le développement

d'agonistes ou d'antagonistes de l'apeline pourrait s'avérer très intéressant pour lutter

contre ces pathologies associées à l'obésité.

- 224 -

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- 3 - Rôle et regulation de l’apeline au cours de la résistance à l’insuline associée à l’obésité. L'apeline est un peptide synthétisé retrouvé sous différentes formes de 36, 17 et 13 acides aminés. Les travaux réalisés au cours de ce doctorat ont permis de mettre en évidence la régulation et le rôle de ce peptide au cours de l‟insulino-résistance. Dans un premier temps, nous avons montré que le TNF, une cytokine d‟origine inflammatoire impliquée dans les phénomènes de résistance à l‟insuline, augmentait l‟expression et la sécrétion d‟apeline adipocytaire chez l‟homme et la souris. Une autre étude nous a permis de montrer que l‟expression de l‟apeline et de son récepteur variait au cours des différentes phases d‟installation du diabète de type II. Ainsi, chez la souris et chez l‟homme, l‟expression de l‟apeline et d‟APJ au niveau du tissu adipeux est sensible à l‟insuline au cours de l‟insulino-résistance mais cette sensibilité est perdue au cours du diabète. Dans le muscle strié squelettique, cette régulation semble moins claire. Parallèlement à la régulation, des expériences réalisées ex vivo et in vivo chez la souris ont mis en évidence que l'apeline augmentait de façon dose dépendante le transport de glucose dans les muscle et le tissu adipeux. De plus, l'étude de la signalisation induite par l'apeline dans le muscle soléaire isolé a montré une activation de l'AMPK, de la eNOS et d‟Akt. Chez des souris obèses et insulino-résistantes, nous avons pu montrer que l'apeline améliorait la tolérance au glucose (OGTT) et, comme chez la souris saine, augmentait l'utilisation de glucose dans les muscles squelettiques et le tissu adipeux. Même si des travaux supplémentaires sont indispensables, l'apeline semble se comporter comme une nouvelle hormone anti-diabétique.

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