cinétique enzymatiquecinétique enzymatique

--modèle de base de la cinétique enzymatique Michaelis –Mentenmodèle de base de la cinétique enzymatique Michaelis –Menten -détermination des constantes cinétiques -détermination des constantes cinétiques -Représentation hyperbolique (Michaelis-Menten )-Représentation hyperbolique (Michaelis-Menten )-Représentation de Lineweaver-Burk-Représentation de Lineweaver-Burk-Inhibitions des réactions enzymatiques-Inhibitions des réactions enzymatiques -Inhibition compétitive -Inhibition compétitive -IC -IC50 50 pour inhibition compétitivepour inhibition compétitive

-inhibition non compétitive-inhibition non compétitive -IC -IC50 50 pour inhibition non compétitive pour inhibition non compétitive

-inhibition in compétitive -inhibition in compétitive -IC -IC50 50 pour inhibition in compétitive pour inhibition in compétitive

- Graphiques de Dixon - Graphiques de Dixon

11 Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

22Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

à t=0, la concentration en substrat est désignée [S]0

à t=0, la concentration en produit est égale à 0

la concentration en enzyme est désignée [E]T et reste constante tout au long de la mesure

à t=0, la concentration du complexe enzyme-substrat, [ES], est égale à 0

E + S E + PES

Complexe enzyme-substrat

33 Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

état stationnaire

état post-stationnaire

3 états lors de la cinétique

état pré-stationnaire

Phases de la réaction

44Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Temps

Con

cen

trati

on

s

[S]

[P]

[E]libre

[ES]

état pré-stationnaire

état stationnaire

état post-stationnaire

E + S

E + PES

[S]

[P]

[E]libre

[ES]d[ES]

dt=0

Vi

Équation de Michaelis-Menten

55Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

66Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

E + S E + PESk1

k-1

k2

vi = k2 [ES]

La vitesse d’apparition du produit P (vitesse de la réaction catalysée par l’enzyme) dépend de k2 et de la concentration en ES.

La [ES] dépend de sa vitesse de formation et de sa vitesse de disparition.

vformation ES = k1 [E] [S]

vdisparition ES = k-1 [ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]

Équation de Michaelis-Menten

77Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI88

ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E + P

Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ]

Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ][ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"),

donc vd = vf

(k-1+ k2)·[ ES ] = k1·[ E ]·[ S ]

[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM

KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten)

Il faut maintenant connaitre la concentration de l'enzyme libre [ E ].[ E ] = [ E ]T - [ ES ]

où [ E ]T est la concentration totale d'enzyme, libre ou lié. On a donc:

Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI 99

[ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM - [ ES ]·[ S ] / KM

[ ES ] + [ ES ]·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM

[ ES ]·( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T·[ S ] / KM

[ ES ]·(KM + [ S ]) / KM = [ E ]T·[ S ] / KM

[ ES ]·(KM + [ S ]) = [ E ]T·[ S ]

[ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ])

On peut enfin introduire ce terme dans l'équation pour la vitesse initiale:

vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])

[ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM

L’équation de Michaelis-Menten

vi = Vmax [S]

[S]KM +

Vitesse initiale

1010Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])

vi = Vmax [S]

[S]KM +

Si vi = ½ Vmax½ Vmax = Vmax

[S]

[S]KM+

½ (KM + [S]) = [S]½ KM = [S] - ½ [S]

½ KM = ½ [S]

KM = [S]

KM est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme. Plus l’affinité est élevée, et moins il faudra de substrat pour que l’enzyme fonctionne.

Constante de Michaelis-Menten

KM est la concentration en substrat pour laquelle l’enzyme fonctionne à la moitié de sa vitesse maximale

1111Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

1212Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

k2 = kcat

kcat

KM

[E]T [S]vi =devient

Dans ces conditions [E]T [E]libre

kcat

KM

[E] [S]vi =

kcat

KM

est une constante de vitesse apparente d’ordre 2

vi = Vmax [S]

[S]KM +

In vivo, la [S] est rarement saturante. Le rapport [S]/KM est compris entre 0,01 et 1 de sorte qu’au maximum la moitié des sites actifs est occupée par le substrat.

Prenons une condition où KM >> [S] :

vi = Vmax [S]

[S]KM +

Vmax = k2 [E]T

1313Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Vmax [S]

[S]KM+

1 1

vi

=

Si on écrit l’équation en double inverse :

1

Vmax [S]

[S]KM +

vi

=

Représentations linéaires

Lineweaver - Burkvi = Vmax

[S]

[S]KM +

ou

1

Vmax [S]

1KM xvi

=1

+Vmax

1

kcat [E]T [S]

1KM xvi

=1

+kcat [E]T

En réarrangeant on obtient :

Or Vmax = k2 [E]T = kcat [E]T

[E]T

kA [S]

11x

vi

=1

+kcat

ou

1414Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

1515Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

kcat/KM est l’efficacité catalytique de l’enzyme. On l'appelle également kA.

Lorsqu’un enzyme peut utiliser plusieurs substrats, kcat/KM permet d’estimer quel sera le substrat le plus utilisé par la protéine.

k2 est appelée constante catalytique ou kcat . Elle est proportionnelle au nombre de réactions que peut effectuer une molécule d’enzyme par unité de temps ( le «turn-over number»).

Vmax = kcat [E]T

µmole de P. mL-1.sec-1

sec-1µmole de E . mL-1

1/Kcat : est la durée , en s de l’acte catalytique

Kcat : donne la mesure de l’efficacité de l’acte catalytique

1616Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Exemple :

On calcule la quantité de produit apparue dans le tube chaque minute :

2 mL x 30 µmoles/mL/min = 60 µmoles/min

Dans le tube il y a une concentration saturante en substrat donc l’enzyme fonctionne en Vmax.

Il y a donc 60 µmoles de produit fabriquées par min par les 10 nmoles d’enzyme présentes dans le tube.

Le turn-over number est donc de 6000 réactions/min ou 100 réactions/sec.Chaque molécule d’enzyme catalyse 100 réactions chaque seconde.

k2 ou kcat est égale à 100 sec-1.

60 µmoles/min / 10 nmoles d’enzyme = 6000 réactions/min

ou 100 réactions/sec

Constante catalytique

1717Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Unités de vitesse : système international

Exemple:vi = 600 µmoles de P / L / min vi = 600 U / L = 600 UIE / Lcorrespond à

dans le système international (S.I.), l'unité officielle est le katal (kat) : quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. Les biochimistes préfèrent utiliser les unités internationales (U.I. ou U.E.)

1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 μkat = 16,6 nkat1 U.I = 1 µmol.min-1 ( signifie à ) 16.67 nmol.s-1 =16.67 nkat

vi = 10 µmoles de P / L / sec vi = 10 µkat / Ldonc à

1818Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Certains inhibiteurs s'associent de manière réversible à l'enzyme en interagissant de manière non covalente. D'autres se fixent de manière Irréversible et sont souvent utilisés pour déterminer les groupes actifs du site catalytique. Enfin, selon le type d'inhibiteur, l'enzyme peut fixer : -le substrat ou l'inhibiteur : c'est la fixation exclusive avec formation de complexes binaires ES ou EI : Inhibiteurs compétitifs: fixation à la place du substrat

-le substrat et l'inhibiteur : c'est la fixation non-exclusive avec formation de complexes ternaires (ESI). Si ce complexe ternaire reste encore actif (moins que le complexe ES), l'inhibition est dite partielle et s'il est totalement inactif, l'inhibition est dite totale. Inhibiteurs non-compétitifs: fixation ailleurs qu’au site substrat

empêchant la catalyse d’avoir lieu

Mode d’action des inhibiteurs

1919Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Inhibiteur compétitif : (fixation exclusive) C'est un mécanisme où la fixation de l'inhibiteur empêche celle du substrat (et réciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont donc mutuellement exclusives. En effet, puisque la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont mutuellement exclusives, l'addition d'une très forte concentration de substrat déplace l'équilibre E + S <==> ES en faveur de ES et donc déplace l'équilibre EI <==> E + I en faveur de E.Un inhibiteur compétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme libre sa fixation et celle du substrat étant exclusives l'une de l'autre.

2020Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

1/KM

d’où [ ES ] =

k-1 + k2

k1 [E] [S]=

KM

[E] [S]

On admet que la [ EI ] est rapidement atteinte et que [ EI ]f = [ EI ]d

k3 [E] [I] = k-3 [ EI ]

Vi = k2 [ ES ]

La vitesse d’apparition du produit s’exprime :

En vitesse initiale, les vitesses de formation et de disparition de ES sont égales :

k1 [E] [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ]

2121Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

On sait que : [E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ]

On peut donc écrire :

[E]T = [E] + +

[E] [I] [E] [S]

Ki KM

[ EI ] =Ki

[E] [ I ]On a vu que :

2222Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

On définit Ki :comme la constante de dissociation du complexe

EI :

[ EI ] =Ki

[E] [ I ][E]T = [E] + +

[E] [I] [E] [S]

Ki KM

[E]T = [E] ( 1 + + )[I] [S]

Ki KM

[E]T = [E] ( )KM [I] Ki [S]

Ki x KM

KiKM + +

2323Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

On peut également l’écrire :

[E] =Ki x KM + KM[I] + Ki [S]

x [E]TKi x KM

La vitesse de la réaction est donnée par :

Vi = k2 [ES]

[E]T = [E] ( )KM [I] Ki [S]

Ki x KM

KiKM + +

2424Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Vi = k2

[E] [S]

KMSi on remplace [E] par sa valeur :

[E] =Ki x KM + KM [I] + Ki [S]

x [E]TKi x KM

On obtient donc :

vi = x [E]T [S]k2

x Ki(Ki

x KM + KM [I] + Ki [S])

2525Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

x

KM

KM

Comme Vmax = k2 [E]T

vi = Vmax

[S]

KM (1 + ) + [S]

Ki

[I]

Sans inhibiteur :

vi =x [E]T [S]k2 x Ki

Ki x KM + KM [I] + Ki [S]

Ki

2626Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Avec inhibiteur :

vi = Vmax [S]

[S]KM +

2727Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Inhibition compétitive

IK

IKm

][1.'Km

--1/Km

-1/K’m

2828Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

2929Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Inhibiteur non compétitif : (fixation non exclusive) Un inhibiteur non compétitif classique n'a aucune influence sur la fixation du substrat (et réciproquement) : les sites de fixation du substrat et de l'inhibiteur sont distincts. En conséquence, l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre E et au complexe ES ; de même, le substrat se fixe à l'enzyme libre E et au complexe EI. Les inhibiteurs non compétitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le substrat. Un inhibiteur non compétitif au sens large peut se fixer à la fois sur l'enzyme libre et sur le complexe E-S, avec des constantes d'équilibre différentes

3030Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

3131Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

3232Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Inhibition non compétitive :

1/Vmax

max'V

IK

IV

][1

max

1/V’max

3333Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Inhibiteur incompétitif : (fixation non exclusive) du terme anglo - saxon : "uncompetitive".Ce type d'inhibition est aussi appelé inhibition par blocage du complexe intermédiaire. Cette appellation décrit mieux le mécanisme : l'enzyme et le substrat forment d'abord le complexe enzyme substrat (le complexe intermédiaire), puis l'inhibiteur se fixe à ce complexe

3434Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

3535Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

3636Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

Inhibition incompétitive

3737Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

3838Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

3939Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

4040Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI

4141Pr M.SLIMANIPr M.SLIMANI