Post on 07-Aug-2020
.2 1/, 3 3 V ,
Université de Montréal
L’interleuldne-21 : un nouveau joueur dans l’homéostasie des
lymphocytes T mémoires CD81 et dans l’hématopoïèse
par
Eve-Line Allard
Département de microbiologie et immunologie
Faculté de médecine
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures
en vue de l’obtention du grade de maîtrise ès sciences (M.$c.)
en microbiologie et immunologie
Septembre 2005 /© Eve-Line Allard, 2005
/ r / —
Y
Université 11de Montréal
Direction des bibliothèques
AVIS
L’auteur a autorisé l’Université de Montréal à reproduire et diffuser, en totalitéou en partie, par quelque moyen que ce soit et sur quelque support que cesoit, et exclusivement à des fins non lucratives d’enseignement et derecherche, des copies de ce mémoire ou de cette thèse.
L’auteur et les coauteurs le cas échéant conservent la propriété du droitd’auteur et des droits moraux qui protègent ce document. Ni la thèse ou lemémoire, ni des extraits substantiels de ce document, ne doivent êtreimprimés ou autrement reproduits sans l’autorisation de l’auteur.
Afin de se conformer à la Loi canadienne sur la protection desrenseignements personnels, quelques formulaires secondaires, coordonnéesou signatures intégrées au texte ont pu être enlevés de ce document. Bienque cela ait pu affecter la pagination, il n’y a aucun contenu manquant.
NOTICE
The author of this thesis or dissertation has granted a nonexclusive licenseallowing Université de Montréal to reproduce and publish the document, inpart or in whole, and in any format, solely for noncommercial educational andresearch purposes.
The author and co-authors if applicable tetain copyright ownership and moralrights in this document. Neither the whole thesis or dissertation, norsubstantial extracts from it, may be printed or otherwise reproduced withoutthe author’s permission.
In compliance with the Canadian Privacy Act some supporting forms, contactinformation or signatures may have been removed from the document. Whilethis may affect the document page count, it does flot represent any loss ofcontent from the document.
Université de Montréal
faculté des études supérieures
Ce mémoire intitulé
L’interleukine-21 un nouveau joueur dans l’homéostasie des
lymphocytes T mémoires CD8 et dans l’hématopoïèse
présenté par:
Eve-Line Allard
a été évalué par un jury composé des personnes suivantes:
Idriss Djilali-Saiah
président-rapporteur
Nathalie Labrecque
Directeur de recherche
Jean-françois Gauchat
Membre du jury
111
RÉSUMÉ
Les cytokines sont des molécules importantes dans le développement, la survie et
l’activation des cellules composant le système immunitaire. Les cytokines de type I
de la famille Yc (interleukine-2 (IL-2), IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 et la récente 1L21)
orchestrent le développement, la différenciation et la survie des lymphocytes T.Compte tenu que le récepteur à l’IL-21 (IL-21R) est exprimé de façon constitutive
par les cellules T, que l’IL-21 est constitutivement produite dans les organes
lymphoïdes et permet la survie des cellules T, nous croyons qu’elle participe
activement dans l’homéostasie des lymphocytes T in vivo. Min de vérifier cette
hypothèse, nous avons créé un modèle de souris transgénique (Tg) surexprimant l’IL
21. De façon surprenante, les souris Tg ont une espérance de vie très limitée. En effet,
70% d’entre elles meurent au courant des trois semaines suivant la naissance (groupe
1) alors que les autres ont une survie maximale de 5 mois (groupe 2). Les souris IL-21 Tg appartenant au groupe 1 présentent un développement hématopoïétique altéré
caractérisé par une surreprésentation de cellules myéloïdes larges et immatures au
détriment des lignées lymphoïde et érythroïde. Nous avons déterminé que l’IL-21R
était exprimé par les progéniteurs communs lymphoïdes, ce qui suggère que l’IL-2 1
changerait le programme de différenciation des précurseurs lymphoïdes vers celui des
progéniteurs myéloïdes. Nous avons observé aussi le défaut hématologique chez les
souris Tg du groupe 2, mais celles-ci affichent en plus une accumulation de
lymphocytes T mémoires fonctionnels. Nous avons démontré que l’IL-21 induisait lasurvie des lymphocytes T CD$ mémoires in vitro. En conclusion, ces résultatsrévèlent une fonction inattendue de l’IL-21 dans la régulation de l’hématopoïèse ainsi
que dans la génération et/ou la survie des lymphocytes T mémoires.
Mots clés : interleukine-21, cytoldne, récepteur de cytokine, lymphocyte T mémoire,homéostasie, survie, hématopoïèse, progéniteurs, lignée de différenciation
iv
ABSTRACT
Cytokines are important molecules required in the development, survival and
activation of celis that are part of the immune and hematopoietic system. Yc cytokines
(interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 and the newly discovered IL-21)
belonging to the type I family orchestrate T lymphocyte development, differentiation
and survival. Since the IL-21 receptor (IL-21R) is constitutively expressed by T celis,and that IL-21 is constitutively produced by lymphoid organs and induces T
lymphocyte survival, we propose that IL-21 participates actively in T lymphocyte
homeostasis in vivo. In order to verify this hypothesis, we created a transgenic (Tg)mouse model over-expressing IL-21. Surprisingly, 1g mice have a decreasedsurvival. Indeed, 70% of them die over the three weeks following birth (group 1)while the others have a maximum life expectancy of 5 months (group 2). Group 1 IL-
21 1g mice show an altered hematopoietic development caracterized by an over
representation of large and immature myeloid celis at the expense of the lymphoid
and erythroid lineages. We demonstrated that IL-21R was expressed by common
lymphoid progenitors, which suggests that IL-21 may change lymphoid precursor
lineage commitment towards myeloid differentiation. We also see this hematological
defect in group 2 Tg mice in addition to a functional memory T ceil accumulation.
We demonstrated that IL-21 could induce CD8 memory T lymphocyte survival in
vitro. Finally, these results uncover an unexpected function of IL-21 in hematopoiesis
regulation as well as memory T ceil generation and/or survival.
Keywords: interleuldn-21, cytokine, cytokine receptor, memory T lymphocyte,
homeostasis, survival, hematopoiesis, progenitors, differentiation lineage
V
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ.ABSTRACT.ivTABLE DES MATIÈRES y
LISTE DES TABLEAUX ixLISTE DES FIGURES xLISTE DES ABRÉVIATIONS xiREMERCIEMENTS xiiiCHAPITRE 1. INTRODUCTION 1
1.1 INTRODUCTION 21.2 LES CYTOMNES 4
1.2.1 Cytokines de ctasse I et leur récepteur 5
1.2.1.1 Cytokines de la famille y 5
1.2.2 Signalisation des cytokines 6
1.2.2.1 Voie de signalisation Jak/STAT 61.3 RÉPONSE DES LYMPHOCYTES T 8
1.3.1 Dévetoppement des lymphocytes T et de leur diversité 81.3.2 Reconnaissance de l’antigène par les lymphocytes T 9
1.3.3 Prolifération clonale des lymphocytes T 10
1.3.4 Contraction et formation de la mémoire immunologique 11
1.3.5 Caractéristiques des lymphocytes T mémoires 111.3.5.1 Auto-renouvellement et sensibilité à 1’Ag 111.3.5.2 Phénotype des lymphocytes T mémoires 12
1.3.5.3 Sous-types de lymphocytes T mémoires 12
1.4 HOMÉOSTASIE DES LYMPHOCYTES T 13
1.4.1 Prolifération homéostatique 14
1.4.2 Rôle des cytokines Yc dans l’homéostasie des lymphocytes T 15
1.4.2.1 Homéostasie des lymphocytes T naïfs 15
1.4.2.2 Génération et homéostasie des lymphocytes T effecteurs 171.4.2.3 Développement des lymphocytes T mémoires 18
1.4.2.4 Homéostasie des lymphocytes T mémoires 18
vi
1.5 HÉMATOPOÏÈSE .19
1.5.1 Propriétés et identification des CSH et progéniteurs communs 20
1.5.2 Développement et identification des lymphocytes T et B 23
1.5.2.1 Développement des précurseurs T dans le thymus 241.5.2.2 Développement des progéniteurs B dans la MO 25
1.5.3 Développement de la lignée myéloïde et marqueurs 251.5.4 Régulation du choix de différenciation dans I’hématopoïèse 27
1.5.4.1 Rôle des cytokines dans le choix lymphoïde versus myéloïde 271.5.4.2 Rôle des facteurs de transcription dans le choix lymphoïde versus
myéloïde 2$
1.5.4.3 Rôle des cytokines dans le développement T et B 2$
1.5.4.4 Rôle des facteurs de transcription dans le développement T et B 29
1.5.4.5 Rôle des cytokines dans le choix myéloérythroïde 30
1.5.4.6 Rôle des facteurs de transcription dans le choix myéloérythroïde 31
1.5.4.7 Rôle des cytoldnes dans le choix granulocytes!monocytes 32
1.5.4.8 Rôle des facteurs de transcription dans le choix
granulocytes/monocytes 32
1.6 L’INTERLEUKINE-21 ET SON RÉCEPTEUR 33
1.6.1 Distribution tissulaire et cellulaire de l’IL-2111L-21R 34
1.6.2 Effets biologiques de l’interleukine-21 351.6.2.1 Effets de l’IL-21 sur les lymphocytes T 35
1.6.2.2 Effets de l’IL-21 sur les lymphocytes B 37
1.6.2.3 Effets de l’IL-21 sur les cellules NK et DC 40
1.6.2.4 Signalisation par le duo IL-21!IL-21R 41
1.6.2.5 Effets de l’IL-21 dans des modèles de tumeur et d’autoimmunité 42
1.6.2.6 Résumé des fonctions de l’IL-21 dans le système immunitaire 44
PROBLÉMATIQUE 46
CHAPITRE 2. MATÉRIEL ET MÉTHODES 48
2.1 MATÉRIEL ET MÉTHODES 49
2.1.1 Essai de survie des lymphocytes T in vitro (article Ostiguy et al., en
préparation pour Journal ofLeukocyte Biotogy) 49
vii
2.1.2 Analyse du phénotype des souris IL-21 1g (chapitre 4) 49
2.1.3 Reconstitution hématopoïétique à partir de la MO de souris IL-21 1g
50
2.1.4 Détection de l’IL-21R sur Les progéniteurs de la moelle osseuse 50
2.1.5 Détection de l’IL-21R sur les progéniteurs par RT-PCR 51
CHAPITRE 3. ARTICLE 53
AVANT-PROPOS 54
CHAPITRE 4. RÉSULTATS SUPPLÉMENTAIRES 82
4.1 PARTICIPATION À L’ARTICLE OSTIGUY ETAL. INTITULÉ « IL-21
PROMOTES T LYMPHOCYTE SURVIVAL » EN PRÉPARATION POUR
JOURNAL 0F LEUKOCYTE BIOLOGY 83
4.1.1 L’IL-21 induit la survie des lymphocytes T in vitro 83
4.2 PERTURBATION DE L’HÉMATOPOÏÈSE CHEZ LA SOURIS IL-21
Tg 85
4.2.1 Accumulation de cellules de la lignée myéloïde chez la souris IL-21 1g
85
4.2.2 Reconstitution hématopoïétique après la greffe de MO de souris IL-21
Tg 90
4.2.3 Détermination de l’expression de l’IL-21R par les progéniteurs
hématopoïétiques 92
CHAPITRE 5. DISCUSSION 96
5.1 ACCUMULATION DE LYMPHOCYTES T PRÉSENTANT UN
PHÉNOTYPE MÉMOIRE 98
5.1.1 Augmentation du nombre de cellules TE spécifiques à l’Ag 99
5.1.2 Disponibilité accrue de cytokines permet à ta niche des lymphocytes T
mémoires de s’élargir 100
5.1.3 Diminution de la sensibilité des cellules TE à 1’AICD 101
5.1.4 Augmentation du taux d’auto-renouvellement des lymphocytes
mémoires 102
5.1.5 Induction de l’expression Bd-6 chez les lymphocytes T CD8 103
5.1.6 Prolifération boméostatique chez la souris IL-21 Tg 106
viii
5.1.7 Effet de l’IL-21 sur l’expression de récepteurs importants dans la
survie des lymphocytes T naïfs et activés/mémoires 108
5.2 PHÉNOTYPE HÉMATOPOÏÉTIQUE CHEZ LA SOURIS IL-21 TG .. 110
5.2.1 Accumulation de cellules myéloïdes au détriment des lignées
érythroïdes et lymphoïdes 112
5.2.2 Expression de l’IL-21R sur les progéniteurs hématopoïétiques 114
5.2.2.1 Effet de l’IL-21 sur l’expression de l’IL-7R chez les CLP et
répercussion sur le développement des cellules B et T 114
5.2.2.2 Signalisation par l’IL-21R sur les CLP 115
5.2.2.3 Activation de facteurs de transcription et expression de récepteurs
aberrants par les CLP 117
5.3 CONCLUSION 120
RÉFÉRENCES 122
ix
LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Exemples de cytokines de classe I 4
Tableau II: Jak/STAT activés par les cytokines y 7
Tableau III : Marqueurs des cellules hématopoïétiques 21
Tableau IV : Marqueurs du développement thymique des lymphocytes 24
Tableau V: Signalisation Jak!STAT utilisée par l’IL-21 42
Tableau VI: Greffe de MO provenant de souris IL-21 Tg 91
X
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Orchestration de la réponse des lymphocytes T par les cytokines y 15
figure 2: Hématopoïèse murine et marqueurs phénotypiques 22
Figure 3: Développement de la lignée granulocytaire 25
Figure 4: Régulation transcriptionnelle de l’engagement vers la lignée lymphoïde... .30
Figure 5 : Régulation transcriptionnelle de L’engagement vers la lignée myéloïde 31
Figure 6: Résumé des fonctions de l’IL-21 dans le système immunitaire 44
Figure 7: L’IL-21 induit la survie des lymphocytes T naïfs et des cellules T CD8
activées/mémoires 84
figure 8: Histologie de la moelle osseuse et de la rate de souris IL-21 Tg colorée avec
hématoxyline-éosine $6
Figure 9 : Accumulation de cellules myéloïdes dans la MO et la rate des souris [L-21
1g $7
figure 10: Composition de la moelle osseuse et de la rate chez les deux groupes de
souris IL-21 1g 8$
Figure 11: Profil des progéniteurs myéloïdes dans la MO de souris IL-21 1g 90
Figure 12: La reconstitution hématopoïétique suite à une greffe de MO de souris IL-21
1g recrée le phénotype des souris IL-21 1g chez la souris receveuse 92
figure 13 : Expression du récepteur à l’IL-21 par les cellules myéloïdes matures et les
précurseurs de la MO 93
Figure 14: Expression du récepteur à l’1L-21 par les précurseurs hématopoïétiques par
RT-PCR 95
Figure 15: Modèles proposés afin d’expliquer l’accumulation de lymphocytes T ayant
un phénotype mémoire dans la souris IL-21 1g 105
Figure 16: Modèle hypothétique proposé sur l’effet de l’IL-21 chez les CLP dans la
souris IL-21 1g 11$
xi
LISTE DES ABRÉVIATIONS
a.a. : acide aminé
Ac: anticorps
Ag: antigène
AICD : mort cellulaire induite par l’activation
B6: souris C57BL/6
CLP: progéniteurs lymphoïdes communs
CMH: complexe majeur d’histocornpatibilité
CMP: progéniteurs myéloïdes communs
CPA: cellule présentatrice d’antigène
CSH: cellule souche hématopoïétique
CTL: lymphocyte T cytotoxique
DC: cellule dendritique
EAE: encéphalomyélite autoimmunitaire expérimentale
VU: facteur de transcription
GMP: précurseurs granulocytes/monocytes
IFN : interféron
1g: immunoglobuline
IL: interleukine
Lin : «lineage
LPS: lipopolysaccharide
LT-CSH: long-terme CSH
MEP: précurseurs mégakaryocytes!érythrocytes
Mk: mégakaryocytes
MO: moelle osseuse
mrIL-21: IL-21 recombinante murine
NK : « natural killer
OVA: ovalbumine
PBMC: cellules du sang périphérique
RCB: récepteur des cellules B
RCT: récepteur des cellules T
SCf: facteur des cellules souches
ST-CSH: court-terme CSH
TE: cellules T effectrice
Tg: transgénique
TK: cellule T helper
IM: cellule T mémoire
TMc: cellule T mémoire centrale
TME: cellule T mémoire effectrice
xii
xiii
REMERCIEMENTS
Je voudrais d’abord remercier ma directrice de recherche. Nathalie Labrecque.
pour mavoir épaulée et conseillée durant la réalisation de ce projet plus que
stimulant. J’ai beaucoup apprécié ta disponibilité, tes connaissances ainsi que tes
encouragements constants. Tu as su trouver les bons mots afin que je donne le
meilleur de moi-même durant ces deux années.
Un merci immense à mes collègues du laboratoire qui ont fait que je me suis
sentie rapidement chez moi : Marie-Pierre Hardy, Julie Rooney, Miriam Marquis,
Julie Leignadier et Julie Leboeuf. Votre énergie et votre bonne humeur m’ont permis
de compléter ce projet avec succès. Un merci spécial à Marie-Pierre et Julie R. qui
ont participé de bon coeur à mon projet lors de journées plus difficiles: je vous en
dois une!
Je tiens aussi à remercier les membres du jury qui évalueront ce mémoire.
Finalement, merci à ma famille et à mes amis qui mont toujours soutenue
dans mon parcours malgré les chemins tortueux que j’ai pris. Vous avez cru en moi et
en mes capacités de mener à bien ce projet. Grâce à vos encouragements sous toutes
formes, vous m’avez permis de focuser mes énergies sur mes études tout en me
distrayant par des activités qui m’ont redonné énergie et sourire.
CHAPITRE 1.
INTRODUCTION
2
1.1 INTRODUCTION
Le système immunitaire permet à un organisme vertébré de se défendre contre
des pathogènes de différentes natures (virus, bactéries, parasites, champignons) par
deux types de réponse : la réponse innée et la réponse acquise. Ces deux sortes
d’immunité sont dépendantes de plusieurs types cellulaires et de molécules sécrétées
par ceux-ci, les cytokines. La réponse innée est la première ligne de défense qui entre
en jeu lors d’une infection, grâce à l’action des macrophages/monocytes, des cellules
« natural killer» (NK) et des granulocytes (neutrophiles, éosinophiles, basophiles)
qui n’ont pas de spécificité propre au type d’organisme infectieux. Cette immunité
naturelle requière la présence de cytokines importantes dans le recrutement et
l’activation d’autres cellules immunitaires possédant les récepteurs correspondants.
Ces dernières, dont les interleukines (IL)- 1, IL-6, IL-12, TNf-Œ et les interférons
(IfN)-Œ et -f3 sont produites selon le type d’organisme à combattre. Dans le cas où
cette réponse n’est pas suffisante pour éliminer le pathogène, il y aura recrutement et
activation des cellules de l’immunité acquise. Cette réponse dépend des lymphocytes
T et B, et seuls certains lymphocytes, qui reconnaîtront le pathogène de façon unique,
seront amenés à proliférer et à se différencier afin de répondre à l’envahisseur. Une
fois de plus, une panoplie de cytokines permet la prolifération, l’activation et la
différenciation des lymphocytes T et B. Les lymphocytes T CD4 de type T helper
(TH)1 (inflammatoires) ainsi que les CDW1 cytotoxiques (CTL) permettront
l’élimination de l’agent infectieux de façon plus directe. Les premières activeront les
macrophages à fusionner leurs lysosomes avec leurs phagosomes, via la signalisation
par l’WN-y, alors que les deuxièmes provoqueront la cytolyse des cellules infectées
(pathogènes intracellulaires). Les lymphocytes CD4 TH2 (auxiliaires) entraîneront
l’activation des lymphocytes B (par la sécrétion d’IL-4). Ces derniers seront alors à
même de sécréter des anticorps (ou immunoglobulines (1g)) de différentes catégories
permettant d’effectuer une réponse humorale efficace, i.e. enrayer les pathogènes
présents dans le sérum (extracellulaires), suite à l’activation de la cascade du
complément.
3
La beauté du système immunitaire réside dans le développement de
différentes lignées immunes ayant chacune leurs fonctions spécifiques. Cependant,
ces cellules sont toutes issues de processus de différenciation ayant permis à des
cellules plus immatures de donner vie à la diversité des cellules présentes dans le
sang. Ces cellules progénitrices sont retrouvées dans la moelle osseuse (MO) chez les
mammifères et permettent, via différents stades de différenciation, de produire des
cellules de plus en plus engagées dans une lignée spécifique. Cet engagement
requière la présence de récepteurs spécifiques à certaines cytoldnes qui activeront une
cascade intracellulaire. Celle-ci induira l’activation de facteurs de transcription
nécessaires à la différenciation suivant une lignée spécifique. Cette suite
d’événements réduit par le fait même leur potentiel de donner naissance à des
précurseurs appartenant à une autre lignée cellulaire. Ce processus est
l’hématopoïèse, qui permettra la naissance des progéniteurs de la lignée lymphoYde
(lymphocytes B et T) ainsi que ceux des granulocytes, macrophages, mégakaryocytes
(Mk) et érythrocytes. Toutes les étapes de développement de ces derniers ainsi que
des lymphocytes B s’effectuent dans la MO alors que les précurseurs T émigreront
vers le thymus où ils poursuivront leur maturation.
Le mémoire présenté ici permettra une revue de la réponse immunitaire
effectuée par les lymphocytes T ainsi que de l’hématopoïèse comme processus
permettant le développement de toutes les cellules du sang. Il y sera question de
l’importance des cytokines dans l’homéostasie et les fonctions des lymphocytes T, en
plus de leur rôle dans la différenciation des précurseurs hématopoYétiques. De plus,
une place primordiale sera accordée à l’interleukine-21 et à son récepteur, sujets
principaux de cette étude.
4
1.2 LES CYTOMNES
Les cytokines sont des molécules solubles ayant divers effets sur plusieurs
types de cellules et tissus. Leurs rôles sont aussi variés, que ce soit la régulation des
activités fonctionnelles ou la communication entre les cellules, la promotion de la
survie, de la mort cellulaire ou la chémotaxie (chémokines). L’activité des cytokines
s’effectue par la liaison à leur récepteur, présent à la surface cellulaire d’un nombre
restreint ou répandu de cellules, puis à la transmission de signaux intracellulaires
générant une réponse. La nomenclature des cytokines change selon que ces dernières
soient classées par les cellules les produisant (interleukines (IL), lympholdnes,
monokines, interférons) ou par leur structure secondaire et tertiaire (cytokines à
chaîne longue ou courte). En général, les cytokines sont classées en deux familles,
soient les cytokines de classe I (famille de l’hématopoïétine) et de classe II (famille
IFN/IL-1O). Les cytokines de classe I se divisent en familles selon leur utilisation
d’une chaîne commune présente dans leurs récepteurs respectifs (Tableau I). Cette
classe de cytokines sera l’objet principal de ce mémoire, plus spécifiquement la
famille Yc, dont les membres sont d’une importance particulière dans l’orchestration
de la réponse immunitaire par les lymphocytes T ainsi que dans la régulation de leur
homéostasie.
TABLEAU L EXEMPLES DE CYTOKINES DE CLASSE IFamille IL-2Ry Famille IL-3R Famille IL-6R Famille à chaîne unique
(famille Yc1)
IL-2 IL-3 IL-6 ÉrythropoïétineIL-4 IL-5 IL-11 Hormone de croissanceIL-7 GM-CSF1 IL-12A ProlactineIL-9 G-CSF IL-123
IL-13 IL-23IL-15 Oncostatin MIL-2 1 LIf’TSLP1 Leptine
1Yc chaîne commune gamma; TSLP: lymphopoïétine stromale thymique; GM-CSF: facteur de
stimulation de colonies de granulocytes-macrophages; LIF: facteur inhibiteur de leucémie
5
1.2.1 Cytokines de classe I et leur récepteur
Les récepteurs de cytokines peuvent être catégorisés en deux classes selon des
motifs structuraux conservés présents dans leur domaine extracellulaire, plus
particulièrement le nombre et la distance séparant des résidus cystéine et proline 1,2
Les récepteurs appartenant à la classe I possèdent 4 résidus cystéines dans la portion
N-terminale, un motif WSxWS (selon la nomenclature en acides aminés (a.a.)) en C
terminal et sept feuillets 3 . De plus, leurs ligands partagent une structure
tridimensionnelle semblable comprenant quatre hélices a ainsi qu’une topologie haut-
haut-bas-bas 6 Comme mentionné précédemment, les cytokines/récepteurs de classe I
sont à nouveau divisés en familles selon la chaîne commune utilisée par le récepteur
(Tableau I). L’accent sera mis sur les cytokines de la famille Yc qui sont d’une
importance particulière dans le développement, l’homéostasie et les réponses
immunitaires engendrés par les lymphocytes T 7,8•
1.2.1.1 Cytokines de la famille Yc
La chaîne y commune (yc) est partagée par les récepteurs pour les cytokines
IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-21 et TSLP (Tableau I) 9,1O De plus, les
récepteurs à l’IL-2 et l’IL-15 ont aussi en commun la chaîne IL-2Rf3 qui permet la
transmission de signaux La preuve de l’importance des cytokines Yc réside dans le
phénotype observé chez des patients atteints d’une mutation dans le gène Yc résultant
en une immunodéficience combinée sévère reliée au chromosome X (XSCID) 12 Les
patients présentant cette maladie ont un développement très diminué des lymphocytes
T et les NK, des cellules appartenant à l’immunité innée, sont absentes. Le nombre de
cellules B est normal, quoique ceux-ci ne soient pas fonctionnels, provoquant une
hypogammaglobulinémie 1346 Le phénotype observé résulte soit de l’absence de
liaison entre les cytokines de la famille y et leur récepteur ou par une déficience dans
la transmission des signaux via le récepteur s’il y a liaison. La panoplie d’effets
résultant du manque de la chaîne y démontre que chacune des cytokines a un rôle
important dans le développement, la fonctionnalité et l’homéostasie des cellules
6
immunitaires, particulièrement au niveau des lymphocytes T 17• De plus, la correction
du phénotype des patients SCID par transfert de moelle osseuse révèle à quel point la
signalisation intracellulaire via la chaîne ‘(e chez les récepteurs de cytokines utilisant
cette chaîne est importante dans le développement d’un système immunitaire
compétent.
1.2.2 Signalisation des cytokines ‘(e
Lors de la liaison d’une cytokine de la famille Yc à son récepteur, il y a
transduction de signaux intracellulaires via la queue cytoplasmique de ce dernier. En
effet, des motifs conservés comme boxi et box 2 présents dans la queue sont
impliqués dans la transduction de signaux . Lors de l’oligomérisation du récepteur,
il y a activation de la cascade JakJSTAT (Janus tyrosine kinase/signaÏ de transduction
et d’activation de la transcription) 19 Cette voie permet la survie, le développement,
la prolifération et la différenciation des cellules cibles. Cette signalisation est donc
décrite en détails dans a section qui suit.
1.2.2.1 Voie de signalisation Jak/STAT
La voie de Jak/STAT est impliquée dans la transduction de signaux provenant
des récepteurs de cytokines de la famille y 20 Contrairement aux récepteurs
d’hormone de croissance, les récepteurs des cytokines n’ont pas d’activité catalytique
intrinsèque (tyrosine ou sérine/thréonine kinase). Afin de pallier à ce manque, ces
derniers sont associés avec une classe de kinases: les Jak. Ceux-ci sont au nombre de
quatre: Jakl, Jak2, Jak3 et Tyk2. Les Jaki, Jak2 et Tyk2 sont exprimés de façon
ubiquitaire alors que Jak3 est présent seulement chez les cellules hématopoïétiques21,22 Lorsqu’une cytokine se lie à son récepteur, l’oligomérisation de ce dernier active
par auto- ou trans-phophorylation la tyrosine kinase Jak qui lui est associée 20
Cependant, différentes cytokines vont activer différents Jak (Tableau II). Par
exemple, les cytokines appartenant à la famille y vont activer principalement Jak3,
associé à la chaîne y, ainsi que Jakl, présent sur la chaîne spécifique du récepteur
7
23,24 Il est intéressant de noter que des patients Jak3 présentent un phénotype SCID
clinique semblable à celui observé chez ceux ayant une mutation dans le gène de la
chaîne 25 Les Jak activés vont alors phosphoryler certains résidus tyrosine du
récepteur, résidus étant reconnu par les domaines SH2 contenus dans plusieurs types
de molécules de signalisation. En effet, ces sites d’ancrage permettent l’entrée en jeu
des STAT 20,26
TABLEAU IL JAK/STAT ACTIVÉS PAR LES CYTOKINES 1cCytokine y, Jak STAT
IL-2 Jaki, Jak2, Jak3 STAT5a, STAT5b, STAT3
IL-4 Jaki, Jak3 STAT6
IL-7 Jaki, Jak3 STAT5a, STAT5b, STAT3IL-15 Jakl, Jak3 STAT5a, STAT5b, STAT3
Adapté à partir de 20
La famille STAT contient des facteurs de transcription et compte sept
membres: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b et STAT6 26,27 Suite
à leur ancrage par leur domaine SH2 à la queue cytoplasmique du récepteur sur le
résidu tyrosine phosphorylé, les STAT deviennent eux-mêmes activés par
phosphorylation. Ils se détachent alors du récepteur, vont former un dimère avec un
autre STAT et peuvent transioquer au noyau afin d’activer la transcription de leurs
gènes cibles. Les cytokines de la famille sont reconnues pour recruter
principalement STAT5a!b et STAT3, sauf l’IL-4 qui active STAT6 (Tableau II).
Cette cascade a été décrite ici pour les cytokines y, mais ne s’y limite pas car
d’autres types de cytokines de type I utilisent aussi cette voie : le récepteur du GM
CSF utilise Jak2 et STAT5a!b, ceux de l’érythropoïétine et des hormones de
croissance recrutent Jak2, STAT5a/b et STAT3 (hormone de croissance seulement)27 La signalisation via la voie Jak/STAT permet donc aux cytokines d’induire la
survie, la prolifération ou le développement de leurs cellules cibles, processus
importants dans les réponses immunitaires.
$
1.3 RÉPONSE DES LYMPHOCYTES T
La réponse des cellules T inclut la reconnaissance d’un antigène (Ag) perçu
comme étant étranger au soi. Ce processus induit la prolifération et la différenciation
en cellules T effectrices (TE) qui possèdent un arsenal de fonctions leur permettant
d’éliminer le pathogène. Suite à cela, la très grande majorité des lymphocytes T
effecteurs mourront par apoptose 28, alors que le restant de la population se
différenciera en lymphocytes T mémoires (TM) 29 Les cellules TM ont la capacité de
survivre à long terme et surtout, advenant une seconde infection par le même
pathogène, de répondre de façon beaucoup plus rapide et efficace 30• Ces différentes
étapes seront détaillées afin de bien comprendre les conséquences possibles advenant
un défaut dans la génération, la survie, l’activation ou la différenciation des
lymphocytes T.
1.3.1 Développement des lymphocytes T et de leur diversité
Le développement des lymphocytes T s’effectue dans le thymus où les
progéniteurs T provenant de la MO passeront divers stades de maturation et de
sélection. Suite à ce processus, les lymphocytes T matures présentant un répertoire de
récepteurs varié seront moins enclins à réagir contre des Ag du soi, i.e. à causer de
l’auto-immunité. Ces cellules T matures pourront ensuite émigrer en périphérie afin
de surveiller l’organisme en attente d’une rencontre avec un Ag pour lequel elles sont
spécifiques.
Le thymus est l’organe où les lymphocytes T se développent et acquièrent la
possibilité d’exprimer un récepteur des cellules T (RCT). Celui-ci est composé de
deux chaînes, a et 3, qui contiennent chacune des régions constantes et variables. Les
loci des chaînes u et j3 sont multigéniques et contiennent une grande diversité de
segments correspondants aux régions variables (V, D et J pour la chaîne I, V et J
pour la chaîne u) ainsi qu’un ou plusieurs segments géniques codant pour la région
constante C. Le réarrangement de chacune de ces chaînes est possible grâce à l’action
9
de deux recombinases, RAG1 et RAG2, qui permettent la mise bout à bout d’une
copie de chacun des segments V, (D), J de façon aléatoire. De plus, l’action d’autres
enzymes provoque l’ajout au hasard de nucléotides aux extrémités à joindre avant
l’assemblage des segments entre eux. Ceci augmente d’autant plus la diversité des
chaînes et et t3 qui, lors de leur réunion, permettront d’augmenter le nombre de RCT
de spécificité différente à 1O’31
Le RCT est une protéine membranaire, mais ne possède pas de queue
cytoplasmique suffisamment longue pour initier une signalisation lors d’une
stimulation RCT-dépendante. U est donc associé à un complexe, le CD3, composé de
quatre chaînes (y, Ç, , i) permettant une signalisation intracellulaire. Celles-ci sont
groupées en trois dimères dont les longues queues cytoplasmiques contiennent un
motif commun ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Cette
séquence, présente en trois copies sur les chaînes Ç et en une copie sur les autres
chaînes, devient phosphorylée lors de l’activation du lymphocyte T par son RCT,
induisant une signalisation intracellulaire 32
1.3.2 Reconnaissance de l’antigène par les lymphocytes T
Un lymphocyte T naïf est une cellule qui n’a jamais rencontré un Ag pour
lequel son RCT est spécifique. Il patrouille l’organisme dans l’attente d’une rencontre
avec un pathogène dans les divers organes lymphoïdes. Ce processus est possible
grâce à l’expression de la L-sélectine CD62L et du récepteur de chémokine CCR7 sur
les lymphocytes T naïfs, laissez-passer pour l’entrée dans les organes lymphoïdes
La reconnaissance antigénique s’effectue dans ces sites où les cellules
dendritiques (DC), des cellules présentatrices d’antigènes professionnelles (CPA)
provenant de la périphérie, se trouvent. Les DC ayant migré de foyers où se trouve
l’infection présentent des fragments peptidiques d’Ag. Ces derniers seront couplés àdes molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) du soi, de classe I ouII. Le lymphocyte T naïf spécifique reconnaît grâce à son RCT le complexe CMH du
soi chargé d’un peptide antigénique. Le CMH de classe I, présent sur la presque
10
totalité des cellules de l’organisme, présentera un peptide dérivé de protéines
cytosoliques endogènes, qu’elles soient de nature étrangère ou du soi. Au contraire, le
CMH de classe II, exprimé par les CPA comme les lymphocytes B, les macrophages
ou les DC, sera couplé à un peptide provenant de vésicules intracellulaires (Ag
externe). Tout dépendant de la nature du lymphocyte T en question (CD4 ou CD$),
le contact RCT-complexe peptide/CMH s’accomplira via le CMH de classe I, pour
les cellules T CD8, ou par le CMH de classe II, pour les lymphocytes T CD4 35,36•
1.3.3 Prolifération clonale des lymphocytes T
Suite à la reconnaissance d’un Ag par un lymphocytes T naïf ce dernier seraamené à proliférer afin d’augmenter le nombre de cellules T spécifiques à l’Ag et à se
différencier en lymphocytes T effecteurs (TE). Cependant, un signal d’activation via
le RCT n’est pas suffisant afin d’initier ces deux processus. Un second signal, un co
stimulateur, est requis de la part des CPA afin d’activer les lymphocytes T naïfs et
provient des molécules CD8O et CD$6 (B7.1 et B7.2) qui lient le CD28 présent sur la
cellule T ‘. La présence des deux signaux, l’un par le RCT, le second via le CD28,
induit l’activation des lymphocytes T et leur prolifération, augmentant de 1000 fois le
nombre de cellules T spécifiques à l’Ag 38,39 Dépendamment de l’environnement
dans lequel la reconnaissance antigénique s’effectue (en termes de cytokines), les
cellules T CD4 présenteront un phénotype ‘H’ (inflammatoire) ou TH2 (auxiliaire)
selon qu’il y a abondance d’IL-12 ou d’IL-4, respectivement Les lymphocytes T
CD$ deviendront cytotoxiques, fonctions comprenant la sécrétion de perforine, de
granzyme ou la ligation du récepteur de mort cellulaire Fas 41 Ces différents types de
lymphocytes T effecteurs permettent donc l’élimination de l’agent infectieux. Dans le
cas où la maturation d’une CPA n’est pas complète, celle-ci sera dans l’incapacité de
fournir le second signal de co-stimulation aux lymphocytes T naïfs. L’absence de ce
signal résulte en l’anergie du lymphocyte T.
11
1.3.4 Contraction et formation de la mémoire immunologique
Deux modèles expliquant la formation de la mémoire immunologique ont été
élaborés. Le premier propose que les lymphocytes T naïfs, après leur activation, vont
s’engagér dans deux voies distinctes de différenciation. La première voie amène la
production de lymphocytes TE alors que la deuxième induit la formation de
lymphocytes T mémoires (TM)42,43 Le second modèle suggère une différenciation
linéaire, où les lymphocytes T naïfs activés deviennent TE. puis une partie d’entre eux
deviennent TM Ce modèle démontre les évidences les plus convaincantes et nous
adhérons à ce dernier pour expliquer la formation de la mémoire immunologique.
Suite à l’élimination du pathogène, la majeure partie (90%) des lymphocytes
TE ayant passé par la phase d’expansion meurt par apoptose induite par la liaison de
leur récepteur fas 39,50 Cette phase de contraction est importante puisque l’organisme
ne requière plus la présence d’un aussi grand nombre de cellules TE. De plus, celles-ci
pourraient s’avérer néfastes puisqu’elles produisent des cytokines inflammatoires. De
même, elles sont des compétitrices pour les autres lymphocytes T en ce qui a trait aux
ressources disponibles (cytokines, espace). La population restante (10%) se
différenciera en lymphocytes TM afin d’assurer une protection à long terme contre
une éventuelle réinfection par le même pathogène.
1.3.5 Caractéristiques des lymphocytes T mémoires
1.3.5.1 Auto-renouvellement et sensibilité à 1’ Ag
Les cellules TM confèrent une immunité protectrice dans le cas où un même
pathogène infecterait l’organisme. Elles répondent beaucoup plus rapidement à l’Ag
et présentent donc une expansion en quelques heures seulement 51,52 De plus, elles
réagissent à des concentrations moins élevées d’Ag que leurs consoeurs naïves,
impliquant qu’elles sont plus sensibles Le nombre de cellules TM spécifiques à un
Ag donné est aussi plus élevé que chez les naïves Contrairement aux
12
lymphocytes T naïfs, les cellules TM ont un taux basal d’auto-renouvellement plus
rapide, augmentant leur longévité, qui ne requière pas la présence d’Ag 56-58rn LeS
lymphocytes T mémoires peuvent donc survivre pendant plusieurs années.
1.3.5.2 Phénotype des lymphocytes T mémoires
Plusieurs marqueurs permettent de différencier les cellules T naïves des
mémoires. D’abord, les cellules ‘M expriment fortement le CD44 (que nous
appellerons CD44”), alors que les lymphocytes T naïfs sont négatifs pour cette
molécule (CD44’°). Les différents isoformes de CD45R (A, B et O chez l’humain, B
chez la souris) identifient les cellules T naïves ou mémoires selon leur expression
différentielle sur ces groupes 590 En effet, les cellules CD4 ‘M de la souris
diminuent l’expression de CD45RB alors que celle-ci est très intense sur les
lymphocytes T naïfs 61
Enfin, les lymphocytes T CD8 mémoires sont identifiables grâce à deux
marqueurs stables le Ly6C et l’IL-2Rf3 (CD122). Les rôles in vivo de Ly6C ne sont
pas connus, quoique des résultats in vitro démontrent que ce dernier semble être un
accessoire dans la fonction cytolytique des cellules T CD8 62 De plus, l’expression
de Ly6C est en corrélation avec la production d’IfN-y par les CD8 TM63 L’IL-2Rf3
est une composante qui est partagée entre les récepteurs pour l’IL-2 et l’IL-l5 64•
Compte tenu que l’IL-l5 est connue pour induire la survie des lymphocytes CD$
TM, ce marqueur doit avoir une signification importante.
1.3.5.3 Sous-types de lymphocytes T mémoires
Les cellules T mémoires peuvent être divisées en deux sous-groupes selon
leur localisation et les cytokines qu’elles produisent. En effet, l’expression de
certaines molécules de surface permet à l’un des sous-groupes de patrouiller les tissus
non-lymphoïdes et les muqueuses, donc de se présenter au site même d’une infection.
Ceci permet l’initiation d’une réponse immunitaire rapide précédant l’émigration des
13
DC vers les organes lymphoïdes secondaires afin d’activer des lymphocytes T naïfs.Les sous-groupes se distinguent par l’expression de CCR7, un récepteur pour leschémokines CCL19 et CCL21, et par le CD62L. Les cellules TM centrales (TMc)expriment le CCR7 ainsi que le CD62L et se localisent principalement dans les
ganglions lymphatiques. Elles produisent peu d’IfN-y et d’IL-4 et ne contiennent pas
de perforine. Leur présence dans les ganglions leur permet de se diviser rapidement etde migrer aux sites d’infection advenant l’entrée d’un pathogène. Les lymphocytes
TM effecteurs (TME) quant à eux sont négatifs pour CCR7 et CD62L, sont retrouvés
dans les sites tertiaires (tissus périphériques) et contiennent de l’IFN-y et de la
perforine 65-67 Ces cellules sont prêtes à réagir sur le champ lors d’une ré-infection.Ces deux types de cellules T mémoires sont donc des gardiens de notre systèmeimmunitaire et constamment sur le qui-vive afin de répondre rapidement à uneinvasion par l’ennemi.
1.4 HOMÉOSTASIE DES LYMPHOCYTES T
L’homéostasie est définie comme étant les différents types de réponses
utilisées par les lymphocytes T afin de restaurer l’équilibre entre leurs diverses
populations, celles-ci occupant chacune une niche spécifique 68 L’homéostasie des
lymphocytes T met en jeu une balance entre le nombre de cellules T naïves,
effectrices (si une réponse immunitaire a été générée) et mémoires. De plus, les
mécanismes homéostatiques doivent tenir compte de l’export de nouveaux
lymphocytes T provenant du thymus, tout ceci dans un espace où les ressources sont
limitées. Dans un organisme à l’état stable, l’homéostasie des lymphocytes T
implique la co-existence de cellules T naïves et mémoires, qui sont régulées de façon
indépendante puisqu’appartenant à deux niches différentes 69 L’homéostasie des
lymphocytes T nécessite donc un équilibre adéquat entre leur développement, leur
mort et leur prolifération 70, mécanisme très complexe régulé par une panoplie demolécules, dont les cytokines.
14
1.4.1 Prolifération homéostatique
L’un des mécanismes homéostatiques le plus drastique dans l’occupation de
l’espace alloué aux lymphocytes T est sans contredit la prolifération homéostatique.
Ce processus est observé lorsque le nombre de cellules T est réduit sous un certain
seuil, provoquant la prolifération des lymphocytes T résiduels aussi bien naïfs que
mémoires. En effet, le transfert de lymphocytes T naïfs ou mémoires dans un hôte
irradié, donc lymphopénique, amène ces derniers à proliférer même si l’Ag pour
lequel leur RCT est spécifique est absent 71,72• Ceci est possible car l’expansion est
régie par les complexes peptide du soi : CMH du soi ayant servi à la maturation des
cellules T lors de leur développement dans le thymus. De plus, les cytokines IL-7 et
IL-15 participent à ce processus chez les lymphocytes T CD$ leurs consoeurs
CD4 requièrent l’IL-7 75,76 Il semblerait que les cellules T CD$ prolifèrent plus
rapidement que les CD4 et puissent participer à cette expansion en dehors des
organes lymphoïdes secondaires 72,77,78 Les lymphocytes T CD$, contrairement aux
CD4, n’ont pas besoin de CPA professionnelles pour leur prolifération
homéostatique D’un autre côté, ce ne sont pas toutes les cellules T qui répondent à
une lymphopénie par la prolifération. Certaines d’entre elles sont réfractaires à
l’expansion.
De façon intéressante, la prolifération homéostatique est accompagnée d’un
changement dans le phénotype des cellules T naïves, celles-ci arborant alors les
molécules caractéristiques des lymphocytes TM. Plusieurs groupes ont démontré que
la prolifération homéostatique des lymphocytes T naïfs résulte en une augmentation
de l’expression de CD44 et de l’IL-2R3 (surtout chez les cellules T CD$j ainsi que
la diminution de l’expression de CD45RB (chez les CD4). Cependant, les marqueurs
d’activation retrouvés chez la population effectrice sont absents des lymphocytes T
ayant participé à une prolifération homéostatique 72,80-84 Ces cellules T ayant un
phénotype mémoire en possèdent aussi les fonctions effectrices dont la production
d’IFN-’’ et la cytolyse 80-85 La prolifération homéostatique est donc un événement
générant des lymphocytes T mémoires stables, mais qui ne remplit pas la niche
15
occupée par les cellules T naïves puisque ces dernières deviennent mémoires.
Cependant, les nouveaux émigrants thymiques parviendront à combler l’espace
réservé aux lymphocytes T naïfs. S’ensuivront alors les mécanismes homéostatiques
normaux qui seront décrits dans la section suivante. Les cytokines de la famille Yc
(IL-2, IL-7 et IL-15 surtout) sont d’importance particulière dans ces processus.
1.4.2 Rôle des cytokines Yc dans l’homéostasie des lymphocytes T
figure I. Orchestration de ta réponse des lymphocytes Tpar les cytokines yImportance des cytokines Yc, particulièrement l’IL-2, l’IL-7 et l’IL-15, dans la réponse immunitairegénérée par les lymphocytes T. L’IL-7 est cruciale pour la survie des cellules T naïves. Lors d’uneréponse antigénique, l’IL-2 et l’IL-15 permettront la prolifération des lymphocytes T spécifiques àl’Ag et leur différenciation en TE. Lors de l’élimination du pathogène, les TE mourront par apoptoseet l’IL-7 mduira la différenciation des cellules restantes en TNI. La survie de celles-ci est dépendantede l’IL-7 pour les CD4 et de l’IL-15 pour les CD$.
1.4.2.1 Homéostasie des lymphocytes T naïfs
Les émigrants thymiques ainsi que les cellules T naïves sont d’importance
capitale dans la génération d’un répertoire clonai varié. En effet, cette diversité des
RCT assure la capacité du système immunitaire à faire face à de nouvelles infections.
Jour 7
PROUFÉRATION ETDIFFÉRENCIATION
IL-2 et IL-15
+
Jour O
DIFFÉRENCIATION ENTr.i
Cellules T
CONTRACTION(mort de 95-99% des Tt)
IL-2
ellules T naïves
SURVIEIL-7
..000
oCellules T mémoires
SURVIEIL-15 (CD8ÏIL-7 (CD4j
16
Cependant, afin de laisser place aux émigrants thymiques récents (106) 86 uneproportion (5%) des cellules T naïves (20 X 106) doit mourir chaque jour 87 Les
lymphocytes T naïfs sont métaboliquement quiescents (moins de 20% d’entre eux sedivisent sur une période de 5 semaines) 56 et ont une durée de vie prolongée (demi-vieentre 116 et 365 jours dans le sang chez l’humain) 88,89•
Cependant, les lymphocytes T naïfs requièrent des signaux de survie afin
d’être maintenus dans le réservoir de cellules en re-circulation. Le premier estl’interaction de leur RCT avec des peptides du soi couplés au CMH présentés par des
APC 72,90-97• Ce phénomène a été démontré autant chez les cellules T naïves CD4que CD8. En effet, le transfert de celles-ci dans un hôte déficient en CMH de classe I
ou II, selon que l’étude porte sur les cellules T CD$ ou CD4, cause leur pertegraduelle (demi-vie de 3 à 4 semaines). Selon Seddon et al., la survie des cellules Tnaïves induite par son RCT serait dépendante d’une signalisation nécessitant l’actionde kinases de la famille Src, comme lck et fyn .
Le second signal de survie pour les lymphocytes T naïfs est transmis par l’IL
7 (Figure 1). Celle-ci permet le maintien de la taille cellulaire des lymphocytes Tainsi que de leurs fonctions métaboliques, i.e. le métabolisme du glucose Eneffet, des cellules T naïves transférées dans un hôte déficient en IL-7 mourront defaçon très rapide 74,75,100• De plus, l’IL-7 et l’IL-15 ont été démontrées commeinduisant la survie des lymphocytes T naïfs CD$ in vitro par la régulation del’expression de membres de la famille Bd-2, molécules anti- et pro-apoptotique 1o1
103 L’IL-4, l’IL-6 et l’IL-21 permettent aussi la survie des lymphocytes T naïfs in
vitro 104-107 mais seule l’IL-7 a été identifiée comme étant essentielle in vivo 74,100,108
L’importance de l’IL-7 et de l’IL-l5 est aussi observée lors de la proliférationhoméostatique afin de remplir le réservoir périphérique en lymphocytes T (voirsection 1.4.1).
17
1.4.2.2 Génération et homéostasie des lymphocytes T effecteurs
Afin d’être en mesure de répondre à tout antigène étranger, le système
immunitaire doit être doté d’une très grande population de lymphocytes T présentant
un répertoire de RCT diversifié. Par conséquent, très peu de clones de cellules T sont
spécifiques à un envahisseur particulier (environ 1000). Cependant, par exemple lors
d’une infection virale, ceux-ci vont proliférer de façon massive. En conséquence,
c’est parfois 50% des cellules T CD8 qui seront spécifiques à l’Ag, cette population
représentant un nombre de lymphocytes T huit fois supérieurs à celui retrouvé chez
un hôte non-infecté 109rn Ces cellules T spécifiques vont ensuite se différencier en
lymphocytes TE qui ont les capacités nécessaires afin d’enrayer l’infection. A ce jour,
seules l’IL-2 et 1’IL-15 sont connues pour induire la prolifération et la différenciation
des cellules T naïves in vitro 45,110,111 (Figure 1). En effet, les lymphocytes T
provenant d’une souris déficiente en IL-2 prolifère de façon moindre que ceux
provenant d’une souris contrôle après stimulation optimale du RCT 112 De plus, la
différenciation des cellules T CD8 en CTL est favorisée par l’IL-2 In vivo,
l’absence d’IL-2, d’IL- 15, de leur récepteur respectif (IL-2Ra, IL-l5Ra) ou de leur
chafne partagée (IL-2R13) ne modifie pas la réponse proliférative des cellules T suite à
la rencontre avec un virus 113-116 Il est donc probable que d’autres cytokines puissent
jouer un rôle dans la prolifération des lymphocytes T. De plus, l’IL-2 est produite
seulement par les lymphocytes T activés, alors que les sources d’IL-15 sont
nombreuses, incluant les monocytes/macrophages, cellules dendritiques (DC),
kératinocytes et les cellules épithéliales 117120 Cependant, l’absence d’IL-2 ou de son
récepteur conduit à une lymphadénopathie et une splénomégalie (donc élargissement
des organes lymphoïdes secondaires, suite à une accumulation de lymphocytes T)
conjointement avec le développement d’autoimmunité 112,114,121 Ce fait amène une
caractéristique importante de la réponse immunitaire des cellules TE suite à
l’élimination du pathogène. En effet, 1’IL-2, malgré son effet positif sur la
prolifération, a aussi comme effet négatif d’induire la mort cellulaire induite par
l’activation (AICD) 122-124 11 est connu que l’IL-2 diminue l’expression de la chaîne
‘(e, cette dernière étant importante dans la transduction des signaux de survie par les
18
cytokines appartenant à cette famille comme mentionné plus haut 123• Suite à
l’élimination du pathogène, la très grande majorité des TE vont mourir par apoptose
afin de rétablir l’homéostasie lymphocytaire 28 et éliminer les dégâts que pourrait
causer cette population devenue inutile après la disparition du pathogène. Ce retour à
l’équilibre est aussi dépendant de la diminution des interactions RCT-CMH 126 de
cytokines inhibitrices 127,128 et de facteurs pro- et anti-apoptotiques 129•
1.4.2.3 Développement des lymphocytes T mémoires
Suite à l’élimination de la très grande majorité des cellules TE, la
population lymphocytaire restante se différenciera en lymphocytes ‘M29,45,130 il est
clair que la fréquence des cellules T mémoires spécifiques pour un Ag corrèle avec le
niveau de prolifération clonale atteint lors de la réponse immunitaire Les cytokines
y trouvent encore leur importance dans la génération des cellules TM. Par exemple,
un niveau plus élevé d’IL-4, IL-7 ou IL-15 (par injection ou dans un modèle
transgénique) peut augmenter les nombres de lymphocytes TM spécifiques à un Ag131-133 La formation des cellules T mémoires CD8 et CD4 est induite par l’IL-774,134-136 mais leur survie dépend de différents facteurs.
1.4.2.4 Homéostasie des lymphocytes T mémoires
Contrairement aux cellules T naïves, les lymphocytes TM ne requièrent pas
d’interaction avec le CMH pour survivre 48,137 Le réservoir des cellules T mémoires
se maintient grâce à l’auto-renouvellement de ces dernières, mais certaines d’entre
elles peuvent être remplacées par des cellules ‘M d’une autre spécificité antigénique138 Comme mentionné précédemment, la conservation des cellules TM est essentielle
afin de protéger l’organisme contre les ré-infections en générant une réponse plus
rapide et efficace. La survie des cellules ‘M est dépendante de deux cytokines
primordiales: l’IL-7 et FIL- 15 (figure 1). Les lymphocytes TNI CD8 requièrent 1’ IL
15 et, à un moindre niveau, l’IL-7 73,74,101,115,139-141 En effet, en temps normal, des
souris déficientes en IL-15 ou IL-l5Ra ont un nombre très réduit de cellules TM
19
CD$ 110,142, alors qu’une surexpression d’IL-7 malgré l’absence d’IL-15 permet leursurvie 143 L’IL-15 semble être une cytokine unique dû au fait qu’elle peut être
présentée en « trans» par la chaîne IL-l5Ru. Cette théorie propose que des cellules
exprimant l’IL-l5Ra présenteraient l’IL-15 à d’autres types cellulaires, comme les
lymphocytes T CD8, porteurs du complexe IL-2Rf3/y ‘. La chaîne u ne serait doncpas requise chez les cellules à qui serait présentée l’IL-15 145,146 Enfin, les TM CD4sont plutôt dépendants de l’IL-7 pour leur conservation 135,147 et de récentes évidencesdémontrent un rôle du RCT dans leur auto-renouvellement 147 Ce résultat expliquepourquoi aucune cytokine n’a jamais été reconnue comme étant essentielle aurenouvellement des lymphocytes CD4 TM 141
1.5 HÉMATOPOÏÈSE
Tout comme l’homéostasie des lymphocytes T, l’hématopoïèse est régulée parles cytokines. Ce deuxième processus requière en effet l’action de cytokines afin deréguler le développement et la survie des cellules au niveau de la moelle osseuse(MO). Celle-ci est en effet le site où se produit l’hématopoïèse, un processuspermettant la génération de toutes les lignées présentes dans le sang à partir d’unepopulation autorenouvelable et très immature, les cellules souches hématopoîétiques(CSH) 148 Ces dernières doivent remplacer environ 2.4 X 108 érythrocytes et 4 X 106
cellules périphériques non lymphoïdes du sang à tous les jours chez une souris adulte‘49.Des anomalies présentes lors du développement normal des cellules du sangpeuvent conduire à des désordres hématologiques comme les différents types deleucémie. Des mécanismes fortement régulés induisant la génération des lignéesmyéloïdes (donnant naissance aux monocytes/macrophages, granulocytes,érythrocytes et Mk) et lymphoïdes (développant les lymphocytes B, T, NK et les DC)sont sous l’action de cytokines, de signaux extracellulaires et de facteurs detranscription sur les progéniteurs, induisant le développement d’une lignée auxdépens d’une autre 150 Dans ce mémoire, l’hématopoïèse sera racontée sous la formedes principales étapes du développement des lignées de la MO, à partir des CSHjusqu’aux cellules B, monocytes, granulocytes et érythrocytes. Il y sera fait mention
20
de l’action des cytokines résultant en l’activation de facteurs de transcriptionimportants dans la différenciation et le développement des lignées hématopoïétiques.De plus, les marqueurs identifiant les différents progéniteurs seront décrits.
1.5.1 Propriétés et identification des CSH et progéniteurs communs
Les CSH possèdent trois propriétés qui les caractérisent: elles ne forment que0.05% des cellules de la MO, elles ont une capacité d’auto-renouvellement quipermet de maintenir le réservoir de CSH et elles donnent naissance à toutes leslignées du sang (pluripotentes) 151-153 Ces cellules se divisent de façon asynchrone,i.e. que la plupart (75%) d’entre elles ne sont pas en cycle cellulaire à chaque instant.Cependant, 99% des CSH se diviseront au moins une fois sur une période de 57 jours154 L’identification de gènes permettant aux CSH de se maintenir ou de s’expandreex vivo ou in vitro est un des objectifs premiers en hématologie ou oncologie. Eneffet, la pluripotence de ces cellules en fait des cibles parfaites pour reconstituer laMO d’un patient souffrant d’immunodéficience ou de leucémie. De plus, lesmécanismes intracellulaires permettant leur auto-renouvellement indéfini peuventnous aider à comprendre et identifier les molécules responsables de l’expansion detumeurs dont les cellules se divisent éternellement.
Les CSH peuvent être séparées en trois groupes suivant un ordre caractérisépar une perte progressive de la capacité de s’auto-renouveller. Un sous-groupe estcapable de s’auto-renouveller indéfiniment (long-terme (LT)-C$H)), le sous-groupecourt-terme (ST-CSH) se maintient pour huit semaines, alors que les progéniteursmultipotents (MPP) ne peuvent se regénérer 155,156 Ces derniers sont alorsresponsables de la première « décision» concernant la restriction du choix dedifférenciation vers la lignée myéloïde versus lymphoïde. Les MPP donnentnaissance soit aux progéniteurs lymphoïdes communs (CLP) 157 ou aux progéniteursmyéloïdes communs (CMP) 158 Les CMP se développent ensuite en précurseursgranulocytes/monocytes (GMP) ou en précurseurs mégakaryocytes/érythrocytes(MEP) . L’identification de ces différents progéniteurs selon certains marqueurs est
21
d’une importance capitale dans l’étude de la différenciation hématopoïétique. Les
cellules matures expriment des marqueurs caractéristiques à leur lignée (ou
« lineage »), i.e. CD3 Four les lymphocytes T, CD11b pour les cellules myéloïdes,
B220 pour les lymphocytes B et TerÏl9 pour les érythrocytes. L’ensemble de ces
marqueurs est appelé «lineage », terme désignant les cellules hématopoïétiques
matures. Les CSH n’exprimant pas ce marqueur sont Lin. Cette caractéristique nous
permet donc de les isoler parmi toutes les cellules composant la MO 159 Les autres
marqueurs utilisés sont c-Kit, Sca-1, CD34, F1k2, IL-7R et CD32/CD16 (fc1RII/III)
(Tableau III) 137,158 Par exemple, en plus d’être Lin, les CSH présentent un
phénotype Thyb0Sca1+cKit4iL7W ou LinCD34Thy chez la souris et l’humain
respectivement 152,154,160
TABLEAU III. MARQUEURS DES CELLULES HÉMATOPOÏÉTIQUESMarqueurs Fonctions
Lin Cocktail d’Ac spécifiques pour des marqueurs présents sur lescellules hématopoïétiques matures. Les CSH sont négatives.
Récepteur tyrosine kinase pour SCF1 exprimé sur lesc-Kit progéniteurs très immatures.
Protéine ancrée au phosphatidylinositol exprimée par les CSHSca-1 (Ly-6A!E) et les cellules T.
Glycoprotéine exprimée par certaines cellulesCD34 hématopoïétiques, adhésion cellulaire. Les CSH peuvent être
CD34 ou CD34.
Récepteur tyrosine kinase exprimé par les MPP, lymphocytesf1k2 B primitifs et progéniteurs myélomonocytiques 161
Récepteur à l’IL-7 exprimé par les CLP et nécessaire auIL-7R développement des lymphocytes T et B 157,162,163
Récepteurs pour la portion fc des IgG, servent dansCD32/CD16 l’identification des progéniteurs CMP, GMP et MEP 158
‘SCf: facteur des cellules souches. Adapté de Orkin, 2000.
Lors de l’identification des CLP, Kondo et al. ont utilisé la présence de l’IL
7R sur les lymphocytes matures, non sur les cellules myéloïdes, afin d’isoler cette
22
+•- •lo bpopulation caracterisee par les marqueurs IL-7R Lin c-Kit Sca-1 (Figure 2). Les
CLP, qui composent 0.02% de la MO, possèdent une capacité de reconstitution de la
MO in vivo qui est restreinte aux lymphocytes T, B et NK 157,164 En effet, aucun
granulocyte ou monocyte ne s’est développé à partir de ces progéniteurs 157 De plus,
malgré la culture de ces précurseurs dans un milieu de méthylcellulose conditionné
pour la croissance de colonies myéloïdes, aucune colonie de cette nature n’a été
observée. De façon intéressante, les récepteurs au GM-C$F et au M-CSf. ces
cytokines étant importantes dans le développement de la lignée myéloïde, sont
présents sur les CSH, mais absents chez les CLP, ce qui suggère que la diminution de
l’expression de ces récepteurs est l’un des événements initiaux induisant la
différenciation vers la lignée lymphoïde 165
figure 2. Hématopoïèse murine et marqueurs phénotypiques. Les trois stades CSH (LT-CSH,ST-CSH et MPP) sont caractérisés par une perte graduelle du potentiel d’auto-renouvellement,Les MPP se divisent ensuite en CLP ou CMP, ces derniers donnant naissance aux GMP et MEP.Les marqueurs utilisés pour différencier ces progéniteurs sont indiqués. Adapté de Kondo et al.,2003.
LT-CSHLinSca-1 c-KitlL-7R
ST-CSHLinSca-1 c-KitIL-7Rflk2
c:D MPP- + .+Lin Sca-1 c-Kit IL-7R
CLPLinSca-1o/
CMP
(DLinSca-1 cKithulL7RCD34CD32/CD1 610
oPro-T
/ oGMP
LinSca-1 cKithhlL7RCD34CD32/CD1 6
MEPLinSca-1 cKithhI L-7RCD34CD32/CD1 610
23
Les CLP ayant été isolés, il devait bien exister un progéniteur équivalent pour
la lignée myéloïde 166,167 Les CMP ont été identifiés en étudiant la portion IL-7W des
précurseurs Lin. Des études préliminaires avaient démontré la formation de colonies
myéloérythroïdes in vitro dans la fraction LinIL-7Wc-Kit. Compte tenu que les CSH
sont LinIL-7Wc-KitSca-i, celles-ci ont été éliminées en excluant la portion Sca-1.
La population restante, LinIL-7Wc-KitSca-f, a été divisée en trois populations
selon l’expression de CD34 et CD32/CD16 (FcRII/III), ce dernier étant un marqueur
des cellules myélomonocytiques 168. 10 CD34fcRII/III’°, 2° CD34FC1RII/111b0 and30 CD34FcRII/III 158 Leur potentiel de différenciation a été analysé in vitro sur
méthylcellulose et in vivo lors de transfert de MO. Les CMP (CD34FcRII/III’°), qui
composent 0.2% de la MO, donnent naissance à des monocytes, granulocytes,
érythrocytes et mégakaryocytes (Mks), alors que les GMP (CD34FcRII/IIÏ) et les
MEP (CD34TcRII[III’°) produisent des granulocytes/monocytes et Mks/érythrocytes
respectivement (Figure 2) 158 L’isolation de tous ces progéniteurs de stade de
différenciation plus ou moins avancé permet d’étudier de façon précise l’effet de
cytokines exogènes, l’expression différentielle de gènes régulateurs importants et de
récepteurs exprimés de façon ectopiques sur la différenciation de ces progéniteurs.
1.5.2 Développement et identification des lymphocytes T et B
Le développement des lymphocytes B s’effectue dans la MO, contrairement à
celui des cellules T qui se poursuivra dans le thymus. Les signaux entraînant une CLP
à s’engager dans la voie des lymphocytes T ou B sont encore obscurs et seront
discutés dans la section des cytokines et facteurs de transcription dans l’hématopoïèse
(sections 1.5.4.3 et 1.5.4.4). Les étapes générales du développement des lymphocytes
T et B ainsi que les marqueurs permettant d’identifier chaque stade de maturation
sont décrits ci-dessous.
24
1.5.2.1 Développement des précurseurs T dans le thymus
Les progéniteurs thymiques les plus immatures en provenance de la MO ont
été désignés comme étant CD4’°CDYCDWCD44CD25CD117. Ces cellules
appartiennent à la lignée lymphoïde, mais ne génèrent pas uniquement des
lymphocytes T (le potentiel s’étend aux DC et cellules B) 169,170 Lorsqu’elles
colonisent le thymus, ces cellules sont appelées «double-négatives» (DN), car elles
n’expriment pas le CD4 ou le CD$. Le stade DN est séparé en quatre populations
selon l’expression de CD44, CD25 et c-Kit 171174 (Tableau IV). Les DN1 sont
CD4425c-Kit, les DN2 CD4425c-Kit, les DN3 CD4425c-Kit’° et les DN4
deviennent CD4425c-Kit. C’est durant les stades DN3 et DN4 que les thymocytes
ayant correctement réarrangé la chaîne f3 de leur RCT (voir section 1.3.1) vont
exprimer pour la première fois un pre-RCT. Ils pourront ensuite devenir «double-
positifs» (DP), i.e. qu’ils commenceront à exprimer les co-récepteurs CD4 et CD8.
Durant ce stade, la chaîne a du RCT va se réarranger, formant un récepteur complet.
Le choix des thymocytes DP de devenir «simple-positif» (SP) CD4 ou CD$ dépend
ensuite du type de CMH avec lequel le RCT peut entrer en interaction: les
lymphocytes T CD8 interagissent avec le CMH de classe I alors que les CD4
utilisent le CMH de classe II. Les lymphocytes T seront alors prêts à émigrer en
périphérie.
TABLEAU IV. MARQUEURS DU DÉVELOPPEMENT THYMIQUE DESLYMPHOCYTES
Marqueurs DN1 DN2 ‘ DN3 DN4 DP SP4 SP8
CD44 ÷ + - - - - -
CD25 - + + - - - -
c-Kit + + faible - - - -
CD4 - - - - + + -
CD8 - - - - + - +
25
1.5.2.2 Développement des progéniteurs B dans la MO
Les différents stades de maturation des lymphocytes B sont identifiés en
fractions de A à C selon la notation de Hardy L’engagement dans la lignée B peut
être observé par l’expression de B220 et l’absence de CD19 (fraction A) 176178 La
molécule CD19 sera ensuite induite, stade appelé pro-B-tôt (ou fraction 3) 175,176,179
Suite au réarrangement de la chaîne lourde du récepteur des cellules B (RCB) au
stade pro-B-tardif (fraction C), la protéine Igi sera exprimée en surface. Ce pré-RCB
est un point de contrôle essentiel lors de la transition du stade pro-B à pre-B. En effet,
la signalisation provenant du pré-RCB induit l’expansion cellulaire et la
différenciation en pre-B, étape où le réarrangement de la chaîne légère du RCB
s’effectuera 180 Si ce dernier est productif, des cellules B immatures IgM émigreront
dans les organes lymphoïdes secondaires.
1.5.3 Développement de la lignée myéloïde et marqueurs
Les granulocytes et monocytes proviennent du même progéniteur (GMP),
alors que les érythrocytes sont générés à partir des MEP. Le développement de la
lignée myéloïde s’effectue dans la MO. La maturation des neutrophiles débute au
stade myéloblaste puis promyélocyte, où les granules primaires sont visibles, pour
continuer au stade myélocyte où les granules secondaires se forment, finissant par les
métamyélocytes, bands et neutrophiles matures contenant les granules tertiaires
(figure 3). Les monocytes se développent à partir de monoblaste - promonocyte -
monocyte. Les marqueurs importants utilisés pour les monocytes et granulocytes sont
[ 1’ ,‘ ,Myéloblaste Promyélocyte Myélocyte Stab Neutrophile segmenté
figure 3. Développement de la lignée granulocytaire. Les neutrophiles, basophiles et éosinophulesont les mêmes étapes de maturation. Les granules primaires apparaissent lors du stadepromyélocyte, les secondaires se présentent à l’étape myélocyte alors que les tertiaires sont visiblesdans te neutrophile segmenté.
26
CD11b, CD11c et Gr-1. Le CD11b est plus fortement exprimé sur les monocytes et
les granulocytes, malgré sa présence sur d’autres cellules non myéloïdes. Chez les
granulocytes, il commence à être exprimé au stade myélocyte et accroît en intensité
avec la maturation 181-183 Le CD11c est exprimé tôt dans la différenciation des
monocytes, avant l’apparition de CD 11h, alors qu’il est exprimé au stade myélocyte
chez les granulocytes 183,184 Finalement, l’expression de Gr-1 chez ces derniers
augmente avec la maturation, alors que la présence de Gr-1 est transitoire chez les
monocytes. Les cellules CD11bGr-1’ sont des neutrophiles en différenciation
terminale alors que les CD11bGr-1’° contiennent des cellules myéloïdes immatures
et des myélocytes 185
Les marqueurs pour les cellules érythroïdes sont peu nombreux et
comprennent les molécules CD71 et Ter-119 186,187 Le CD71 est un récepteur de
transferrine non-spécifique aux cellules érythroïdes dont l’expression diminue avec la
maturation des érythrocytes et qui est donc absent des érythrocytes matures 188• Le
Ter-119 est une molécule de surface spécifiquement détectée sur les érythroblastes,
stade plus précoce dans l’érythropoïèse 189 Le choix alternatif à l’érythropoïèse est le
développement de mégakaryocytes (Mks), cellules donnant naissance aux plaquettes
sanguines. Les Mks immatures et matures expriment le CD41 190,191 aussi connu sous
le nom de glycoprotéine IIb, une intégrine. Chez l’humain, les Mks expriment
fortement le CD41 et le CD9 192
L’utilisation des marqueurs mentionnés précédemment pour les différentes
lignées et les nombreux stades de maturation nous permet d’étudier les populations
présentes dans la MO de souris afin de détecter toute anomalie du développement. De
plus, il nous est alors possible d’étudier l’effet de cytokines sur chaque population
ainsi que d’identifier les molécules intracellulaires activées (facteurs de transcription)
entraînant les cellules hématopoïétiques vers une liguée de différenciation aux dépens
d’une autre.
27
1.5.4 Régulation du choix de différenciation dans l’hématopoïèse
Les cytokines ont une panoplie d’effets sur l’homéostasie des différentes
populations T, mais il ne faut pas négliger leur apport au développement des
différentes populations présentes dans la MO. Ces cytokines vont se lier à des
récepteurs permettant la survie et/ou la différenciation des divers progéniteurs. De
plus, des facteurs de transcription (VI’) exprimés de façon différentielle vont
permettre à une cellule de déterminer son choix de destinée (« celi fate
determination »).
1.5.4.1 Rôle des cytokines dans le choix lymphoïde versus myéloïde
L’ action des cytokines dans la différenciation des CSH vers les CLP ou les
CMP n’est pas définie 193,194 Il est connu que les cytokines peuvent jouer des rôles
importants dans le maintien du réservoir de CSH 195,196W Un concept expliquant le
dilemme des CSH dans leur maintien versus leur différenciation en précurseurs moins
immatures a émergé. Le maintien du nombre de CSH serait dépendant d’un niveau
élevé de cytokines. La diminution de la concentration en cytokines augmenterait les
chances que la CSH entre en différenciation 196 Par exemple, la culture de CSH
humaines ayant un fort potentiel d’auto-renouvellement (LT-CSH) avec une grande
quantité de cytokines (Ht3-L, SCF et megakaryocyte growth and development factor
(MGDF) à 250 ng/mL) leur permet de proliférer. Par contre, la concentration de ces
cytokines requise afin d’amplifier ces LT-C$H donnant naissance aux progéniteurs
moins immatures est beaucoup moindre (50 ng/mL) 197 Cependant, malgré l’effet
dose-dépendant de certaines cytokines sur le potentiel de différenciation des CSH, il
semblerait que l’engagement dans la lignée myéloïde ou lymphoïde soit de nature
stochastique, donc indépendant de cytokines. Le rôle des facteurs de transcription
(VI’) dans le choix de développement lymphoïde versus myéloïde sera donc initié ici.
Évidemment, il se pourrait que de nouvelles études permettent la formation d’un lien
entre la signalisation des cytokines via leur récepteur et l’activation de ces FT chez
les CSH, identifiant les facteurs responsables du choix de différenciation.
28
1.5.4.2 Rôle des facteurs de transcription dans le choix lymphoïde versus myéloïde
Le facteur primordial dans le choix de l’engagement vers la lignée lymphoïde
ou myéloïde est le FT PU.1 (Spi-1) (Figures 4 et 5). PU.] est exprimé dans les CSH,
MPP et toutes les cellules en différenciation sauf les érythroblastes, Mks et
lymphocytes 158,198,199 L’effet de PU. 1 dans le choix de différenciation vers la
lignée lymphoïde versus myéloïde semble être dose-dépendant puisqu’une
reconstitution rétrovirale conduisant à une expression moindre de PU.1 induit le
développement B chez les progéniteurs PU.1, alors qu’une expression importante de
PU.1 amène une différenciation en macrophages en culture in vitro 200 Ceci explique
pourquoi les souris déficientes en PU.1, mourant à la naissance, ne présentent aucune
cellule lymphoïde ou myéloïde, alors que les érythrocytes et Mks se développent de
façon normale dans le foie foetal 201-203 Par ailleurs, PU.1 n’est pas essentiel à la
génération de précurseurs granulocytiques, mais est requis pour leur différenciation204 De façon très intéressante, les progéniteurs PU.1 ne répondent pas in vitro aux
cytokines de la lignée myéloïde M-CSF, GM-CSF et G-CSF ainsi qu’à la cytokine
lymphoïde IL-7 en raison de l’absence ou de l’expression réduite de leurs récepteurs
correspondants. En effet, PU.1 a été démontré comme régulant directement la
transcription de l’IL-7Ra et plusieurs sites de liaison pour PU.1 ont été identifiés
dans les promoteurs des gènes de récepteurs myéloïdes 204,205 Ces résultats
confirment donc le rôle dose-dépendant de PU.1, une faible expression de ce dernier
induisant l’expression de l’IL-7Ra, alors qu’une forte expression induit celle des
récepteurs myéloïdes.
1.5.4.3 Rôle des cytokines dans le développement T et B
Remarquablement, le nombre de CLP est normal chez une souris déficiente en
chaîne 206 Ceci implique que les cytokines appartenant à la famille ne sont pas
essentielles à la survie des CLP. Cependant, lorsque le choix de différenciation est
effectué vers les lymphocytes T ou B, il apparaît que l’IL-7 et son récepteur sont
critiques dans la suite des étapes de maturation.
29
Au niveau des progéniteurs T ayant colonisé le thymus, il a été démontré queces thymocytes, s’ils sont déficients en IL-7Ra ou IL-7, présentent une altérationdans leur capacité de prolifération 162,163 De plus, la survie des DN1, DN2 et DN3 estsévèrement affectée en l’absence d’IL-7 207 Ceci résulte en une cellularité thymiquediminuée de 20 fois chez les souris déficientes en IL-7. Le phénotype est encore plussévère chez les mutants IL-7Ra’, causé par le partage de l’IL-7Ra avec le récepteurd’une autre cytokine importante (thymic stromal lymphopoietin) dans ledéveloppement d’un second type de lymphocytes T 162,208,209 L’IL-7 est aussi crucialedans le développement des lymphocytes B. En effet, les CLP déficients en IL-7Ro.ont une capacité très réduite de se différencier vers le stade le plus immature dudéveloppement B (pro-B-tôt) 206,210 D’autres exemples font mention de l’action decytokines dans le choix de lignée de différenciation. Deux groupes ont démontré quel’expression ectopique de l’IL-2R3 ou GM-CSFR humain sur les CLP induit cesderniers à se différencier en cellules myéloïdes lors d’une stimulation avec l’IL-2 oule GM-CSF humain, respectivement 165,211 Compte tenu que le GM-CSFR estexprimé sur les CSH et non sur les CLP, et que les progéniteurs myéloïdesl’expriment (voir section 1.5.4.5), ceci suggère que la diminution de l’expression deGM-CSFR est l’un des premiers événements dictant l’engagement dans la voielymphoïde 165
1.5.4.4 Rôle des facteurs de transcription dans le développement T et B
Les molécules Notch sont des récepteurs exprimés par tous les précurseurshématopoïétiques dont les ligands sont présents sur le stroma des organes lymphoïdesprimaires ainsi que sur «autres cellules hématopoïétiques 212 Les Notch semblentdes candidats importants dans les choix de différenciation proposé aux CL?,particulièrement Notchi. En effet, Notchi induit les CLP à se différencier enthymocytes en plus de son rôle dans la maturation des thymocytes vers leslymphocytes T (Figure 4). De plus, la signalisation via Notchi inhibe la productionde cellules B dans le thymus 213,214 D’un autre côté, la présence d’une formeconstitutivement active de Notchi dans la MO bloque le développement B à un
30
niveau très immature et induit la génération de cellules T immatures 214 Chez les
lymphocytes B, l’IL-7, en plus d’être un facteur de survie et d’expansion pour les
cellules pro-B, induit la différenciation des lymphocytes B à partir des CLP. En effet,
la signalisation par l’IL-7 module l’expression de EBF, un FT spécifiquement présent
durant le développement B (figure 4) 162,163,206,215-219 Le fT PU.1 est aussi reconnu
pour activer la transcription de EBF22°
ØÇSFR1frN
_
PU.1, EBF
figure 4. Régulation transcriptionnelle de l’engagement vers la lignéelymphoïde. L’importance du facteur de transcription PU.1 aiisi quel’expression de l’IL-7R et la diminution du GM-CSFR sont démontrées dans lechoix de la lignée lymphoïde. Adapté de Zhu et Emerson, 2002.
1.5.4.5 Rôle des cytokines dans le choix myéloérythroïde
Le facteur de croissance myéloïde GM-CSf stimule la survie, la prolifération
et la différenciation des GMP et des progéniteurs granulocytiques et monocytiques221 De plus, malgré le rôle certain du G-CSf chez les granulocytes, il semblerait que
l’absence de G-CSfR sur les CMP cause la diminution des progéniteurs autant GMP
que MEP 222 Ceci démontre que l’action du G-CSf n’est pas limitée aux progéniteurs
granulocytiques. Dans un autre ordre d’idées, la cytokine la plus importante dans la
régulation de l’érythropoïèse est l’érythropoïétine et son récepteur, exprimé par les
progéniteurs érythroïdes, est essentiel dans le développement et la maturation des
érythrocytes 223
31
1.5.4.6 Rôle des facteurs de transcription dans le choix myéloérythroïde
Comme mentionné précédemment, l’engagement dans la voie myéloïde
s’effectue par l’expression forte de PU. 1. Une dualité existe dans l’engagement vers
les différentes lignées myéloïdes (figure 5). En effet, les fT PU. 1 et GATA- 1 sont
requis dans le choix myéloïde, mais ces deux molécules sont des antagonistes: l’une
inhibe l’expression de l’autre 224,225 GAlA-1 est requis pour la différenciation en
MEP (et induit l’expression du récepteur à l’érythropoïétine 226) alors que PU. 1
génère les GMP. Leur expression diminue lors de la maturation de la lignée
granulocytique/monocytique ou mégakaryocytique/érythrocytique respectivement. En
effet, l’expression ectopique de PU. 1 dans la lignée K562, cellules leucémiques
érythroïdes/mégakaryocytiques, redirige la différenciation en granulocytes/monocytes
plutôt que Mks. Au contraire, la sur-expression de GAlA-1 dans les progéniteurs
granulocytiques 32D change le programme de développement vers la
mégakaryopoïèse 227 Ces données indiquent donc que le ratio GATA-1/PU.1 dans les
CMP dirige le choix de différenciation vers les MEP ou les GMP 224.225,228
monocyteIcs__._v
P
neutrophil
Pu.1 &
GATA1#CEBP, GATA-1 (o
eosinopliil
GATA-1!FOG’GATA-l
erytiirocyte
GATA
megakaryocyto
figure 5. Régulation transcriptionnelle de l’engagement vers ta lignée myéloïde. Les CMP sedifférencient soit en GMP ou en MEP. L’expression simultanée de PU.l et GATA-1 induit ladifférenciation des CSH vers les CM?, où l’expression dominante de PU.1 amènera le stade GMP,alors qu’un ratio en faveur de GATA-1 engagera la lignée érythroïde. Tiré de Zhu et Emerson,2002.
I
32
1.5.4.7 Rôle des cytokines dans le choix gianulocytes/monocytes
Lorsque les précurseurs sont au stade GMP, de nouveaux facteurs s’ajoutent à
ceux déjà présentés (figure 5). Le maintien de l’expression des récepteurs de
cytokines myéloïdes pour ce choix de lignée ne semble pas essentiel, puisque le
nombre de colonies granulocytes/macrophages développées in vitro à partir de MO
de souris G-CSF’ ou G-CSFW est modestement réduit. Ceci suggère que des
signaux par le G-CSfR ne sont pas requis pour l’engagement dans la lignée myéloïde229,230 Cependant, ces souris souffrent de neutropénie, causée par l’absence designalisation par le G-C$F. Par contre, il semblerait que l’IL-6 et le GM-CSf
pourraient compenser pour la perte de signal via le G-CSFR, permettant laneutropoïèse 231,232 11 va sans dire que le G-CSf stimule la survie, la prolifération et
la maturation des progéniteurs granulocytiques 233 De plus, celui-ci semble induire
l’engagement des GMP dans la voie des granulocytes aux dépens des monocytes
grâce à l’induction de C/EBPa 234•
Au niveau des monocytes, le M-CSf stimule la survie, la prolifération et la
maturation des précurseurs monocytaires via son récepteur (M-CSFR) 235
1.5.4.8 Rôle des facteurs de transcription dans le choix granulocytes!monocytes
L’expression préférentielle de C/EBPa ainsi que sa nécessité dans la lignée
granulocytaire semblent influencer le choix de différenciation des GMP en faveur des
granulocytes, cette lignée étant absente chez les souris déficientes en C/EBPŒ
contrairement aux monocytes 236,237 En combinaison avec PU.1, ces deux facteurs
permettent la différenciation terminale des granulocytes (figure 5) 238,239
Concernant la différenciation en monocytes, il est acquis que celle-ci dépend
de l’expression de PU.l, puisque ce dernier régule l’expression spécifique du M
CSFR sur les monocytes 240 De plus, la lignée monocytaire est absente chez les
souris Fu1 202 Le VU ICSBP est essentiel au développement monocytaire (Figure
33
5). Ce facteur induit l’expression de M-CSfR tout en inhibant celle de C/EBPa et GCSFR et n’affecte pas PU. 1 ni le GM-CSFR 241 Pour les progéniteurs myéloïdes, ilest surprenant de constater que l’addition in vitro d’IL-7 accroît de façon synergiquela formation de colonies myéloîdes à partir de progéniteurs LinSca-1 lorsquecombinée avec le GM-CSF ou le M-CSF 242 Le même phénomène se produit lorsqueÏ’IL-4 est ajoutée à l’IL-6 243 De plus, in vivo, l’administration d’IL-7 recombinanteaugmente le nombre de cellules immatures de la lignée myéloïde 244 Ceci suggèreque certaines cytokines de la famille ‘lc pourraient dicter le choix de différenciation encombinaison avec d’autres facteurs de croissance ou cytokines.
1.6 L’INTERLEUMNE-21 ET SON RÉCEPTEUR
L’interleukine-21 et son récepteur sont parmi les membres les plus récemmentdécouverts appartenant à la classe des cytokines de type I 245,246 L’IL-21R humain aété cloné grâce à son homologie de structure avec les autres cytokines appartenant àcette classe. En effet, l’IL-21R contient une séquence signal putative, un domainetransmembranaire, deux paires de résidus cystéine conservés et un motif WSxWS,classiques chez les membres de la classe des cytokines de type 1 5,246,247 De plus, ledomaine intracellulaire contient les motifs box 1 et box 2, nécessaires à latransduction de signaux 245,24$ Les plus proches homologues de l’IL-21R au niveau
de la séquence en a.a. sont l’IL-2R et l’IL-4Rcc 245,246 L’IL-21R possède unhomologue murin et tous deux Sont identiques à 72% au niveau de la séquencenucléique et à 62% au niveau des a.a. 246 finalement, l’IL-21R fait partie de lafamille des cytokines Yc, puisqu’il est composé d’une chaîne a et de la chaîne
commune y et que cette dernière est essentielle à la transduction de signaux suivant laliaison de son ligand 249,250
Son ligand, l’IL-21, une protéine de 15 kDa, a été identifié par clonagefonctionnel. Les homologues humains et murins partagent 57% d’identité. L’IL-21
possède 131 a.a., un domaine de quatre hélices ct, typique chez les cytokines de type
I, et présente une séquence en a.a très homologue à celle des cytokines IL-2, IL-4 et
34
IL-15. LUes cytokines IL-21 et IL-15 sont pourvues de deux paires de résidus cystéineen positions identiques, faisant de l’IL-15 son plus proche parent au niveau de leurstructure 245
1.6.1 Distribution tissulaire et cellulaire de l’IL-21/IL-21R
Au niveau des tissus, la présence du messager de 1’IL-21R a été détectée chezl’humain et chez la souris dans les organes lymphoïdes secondaires tels que la rate etles ganglions ainsi que dans le thymus, les amygdales, poumons et intestins 245,246,251
Cependant, l’expression est élevée au niveau des organes lymphoïdes. L’IL-21R a étédétecté en premier sur les lymphocytes B et les cellules NK 245 ainsi que sur lescellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) activés, les thymocytes et leslymphocytes T activés 245,246 Par la suite, notre laboratoire et d’autres ont démontrél’expression de l’IL-21R sur les lymphocytes T naïfs 107,252,253 et les DC 254,255 Il est ànoter que l’expression de l’IL-2lR augmente chez les PBMC et les lymphocytes B etT suivant une activation phytohemagglutinine-L- ou RCT-dépendante,respectivement 107,245,246,256 Dans la MO, tous les stades de développement deslymphocytes B sauf les pro-B manifestent la présence de l’IL-21R à la surfacecellulaire 107,253 Cependant, aucune étude n’a été effectuée sur les autres types deprécurseurs (granulocytes, monocytes, érytbrocytes, Mks). Le messager de l’IL-21R aaussi été détecté chez des lignées cellulaires B, T, NK activées et chez les HL-60(promyéloblastique; lignée de leucémie myéloïde aigus) 245,246,257
Contrairement à son récepteur dont l’expression est très fréquente dans lescompartiments lymphocytaires, la production du messager de l’IL-2l est restreinteaux cellules T CD4 activées et aux cellules stromales des organes lymphoïdes 107,245
En effet, le messager de l’IL-21 était présent dans les ganglions de souris Rag’ quisont dépourvues de tout lymphocyte T. De plus, l’expression de l’IL-21 était plusforte dans la fraction des ganglions enrichie en cellules stromales (gp38) 107
sous-type de cellules T CD4 produisant l’IL-21 (TH1 ou TH2) est encore controversé.Une équipe a démontré l’expression de l’IL-21 chez les cellules T TH1 humaines 25$
35
alors qu’une autre la détecte chez les lymphocytes T TH2 murines 259,260 L’équipe deMehta et al. a établi que ce phénomène était régulé par deux facteurs de transcription:T-bet et NFATc2 260 En effet, NFATc2 induit la transcription de l’IL-21 chez lescellules CD4 TH2 alors que T-bet inhibe la capacité de NfATc2 de se lier aupromoteur de l’IL-21 chez les ‘H’
260 Le spectre d’expression de l’IL-21R s’étenddonc sur les lymphocytes B, T, NK et DC, alors que la production d’IL-21 est limitéeaux cellules CD4 ‘H2 et cellules stromales des organes lymphoïdes.
1.6.2 Effets biologiques de I’ interleukine-2 1
Compte tenu de la variété de cellules exprimant le récepteur à l’IL-21, leseffets biologiques de 1’IL-21 ont été étudiés pour chacun des types cellulaires. Ladiversité des effets de l’IL-21 ne dépend pas seulement du type cellulaire, mais ausside l’étape de différenciation ou du statut d’activation de chacun 261 Chez un modèlemurin déficient en IL-21R, tous les compartiments immunitaires étaient présents etplus ou moins normaux 10$ Cependant, le taux des IgG était très diminué alors queles IgE étaient fortement augmentées dans le sérum, donnant un aperçu du rôle del’IL-21 dans la production d’Ig. La régulation du système immunitaire par l’IL-21semble donc subtile et complexe.
1.6.2.1 Effets de l’IL-21 sur les lymphocytes T
La découverte d’une nouvelle cytokine requière des essais in vitro afind’étudier ses rôles biologiques. L’IL-2l a été démontrée comme augmentant laprolifération de thymocytes et lymphocytes T matures CD4 et CD$ humains etmurins via une stimulation du RCT (par un anticorps (Ac) anti-CD3) 108,245 De plus,l’expansion in vitro de lymphocytes CD8 ‘E spécifiques au virus CMV est stimuléepar l’addition d’IL-21, suggérant un rôle important dans un contexte d’infection 262
Cependant, l’IL-21 endogène n’est pas essentiel à une prolifération RCT-dépendantepuisque les cellules T provenant d’une souris IL-21W’ prolifèrent normalement 108
Par contre, le pourcentage de cellules T spécifiques à un Ag donné, le pourcentage de
36
leurs CTLs capables de produire de l’IfN-y et leur activité cytolytique sont diminuéscomparativement à ceux provenant d’une souris contrôle 106 Notre laboratoire a aussidémontré que l’IL-21 entraînait la survie des cellules T naïves CD4 et, plusparticulièrement, des CD8 naïves 106,107 Cet effet de survie est initié grâce aumaintien du niveau de Bd-2 et à l’activation de la voie phosphatidylinositol 3-kinase(P13-K) 107 deux facteurs importants dans la survie cellulaire 263 En absence destimulation anti-CD3 et contrairement à d’autres membres de la famille Yc commel’IL-2, l’IL-7 ou l’IL-15 humaines, Ï’IL-21 ne peut induire la prolifération deslymphocytes T 245252 Néanmoins, L’IL-21 agit en synergie avec celles-ci pouraméliorer l’expansion cellulaire 106,245
Concernant les cellules TM, deux groupes ont obtenu des résultats opposés.Selon Kasaian et al., l’IL-21 bloquerait l’expansion de la population activée/mémoireCD44’’CD8 induite par l’IL-15, en plus de diminuer l’expression de l’IL-2Ra(CD25) et celle de l’IL-2R3 (CD122) 10$ L’IL-2l inhiberait donc l’expansion de lapopulation CD$ mémoire indépendante du RCT. Au contraire, l’IL-21 augmenteraitle nombre de cellules T CD441CD8 en combinaison avec l’IL-15 106 Aives et aL ontconfirmé que l’IL-21 promouvait l’expansion des PBMC CD8 humains ainsi quecelle des cellules T CD$ naïves humaines induites par l’IL-15 252 Compte tenu quel’équipe de Kasaian et al. a utilisé des cellules transfectées produisant l’IL-21, il estdifficile de comparer leurs résultats avec ceux de Zeng et al., qui ont testé l’IL-21 à100 ngfmL.
Les fonctions effectrices des CTLs et des cellules T CD4 « helper» sontimportantes afin d’enrayer l’infection. La cytolyse et la production d’IfN-’y par lesCD8 cytotoxiques et les CD4 TH1 permettent d’activer les cellules de la réponseinnée (phagocytose par exemple) et de détruire les cellules infectées afin d’éliminer lepathogène. L’IL-21 a été décrit comrrie induisant la production d’IFN-y et lesfonctions effectrices des CTLS 10$,262,264,265 Au niveau des cellules T CD4, l’IL-2 1n’affecte pas la production d’IFN-y par des TH’ préalablement formés in vitro 259
Cependant, l’ajout d’IL-21 durant la formation des TH1 amène une production
37
diminuée d’IfN-y par les CD4 TH’• L’IL-21 a donc un rôle important à jouer dans
l’activation des fonctions effectrices des lymphocytes T.
En résumé, l’IL-2l contribue à la survie des lymphocytes T naïfs. De plus,
elle augmente la prolifération de ces derniers lors d’une stimulation dépendante du
RCT. L’IL-21 induit l’expansion des lymphocytes T CD$ naïfs ou activés en
combinaison avec l’IL-15 ou I’IL-7 in vitro. L’alliance de l’IL-21 et de l’IL-15
augmente aussi les fonctions cytolytiques ainsi que la proportion de lymphocytes T
CD$ spécifiques à l’Ag présent lors des réponses immunitaires. finalement, pour les
cellules T CD4, l’addition d’IL-21 durant le développement de cellules TH1 diminue
la capacité de celles-ci à produire de l’IfN-y.
1.6.2.2 Effets de l’IL-21 suries lymphocytes B
Lors des premières analyses des effets de l’IL-21 sur les cellules B, il a été
démontré que l’IL-21 les stimulait de façon différentielle dépendamment de l’agent
utilisé pour leur activation. En effet, l’IL-21 inhibe la prolifération des cellules B
humaines et murines soutenue par un anti-IgM et l’IL-4 245,266 Elle co-stimule
l’expansion induite par un anti-CD4O chez les lymphocytes B humains 245 Au
contraire, cet effet est absent chez les lymphocytes B murins 266 L’IL-21 semble
donc inhiber les effets de l’IL-4 lors de l’activation des cellules B.
La fonction effectrice principale des lymphocytes B est la production d’Ac ou
immunoglobulines (1g) de différents isotypes. La souris déficiente en IL-21R possède
un compartiment B qui semble normal. Cependant, elle présente une augmentation de
la concentration en IgE (3X) et une réduction de la quantité d’IgGl (3X) et d’IgG2
(2X) dans le sérum comparativement aux souris contrôles 108,267 Le potentiel rôle de
1’IL-21 sur la commutation isotypique des cellules B, absent chez la souris IL-2 1R,
a été vérifié grâce à des protocoles d’immunisation avec ovalbumine ou Toxoplasma
gondii. Ces types d’infection génèrent une réponse qui implique une augmentation
dans la production d’IgG et ne requière pas d’IgE (pour T. gondii). Lors de
38
l’immunisation des souris IL-21R’, les niveaux d’IgGl totaux et d’IgG2b et gG3spécifiques à l’Ag étaient beaucoup moindres que chez la souris sauvage. De plus,l’absence de réponse IgE contre T. gondii chez la souris normale était contrebalancéepar un niveau vingt à vingt-cinq fois plus élevé d’IgE chez la souris IL-21R 267
surreprésentation d’IgE a été expliquée par l’action de l’IL-4, puisqu’une sourisdoublement déficiente pour l’IL-4 et l’IL-21R montrait une absence d’IgE, tout enayant un niveau très bas d’IgGl. Ceci implique donc que l’IL-21 et l’IL-4réguleraient la commutation isotypique chez les lymphocytes B. Ceci est importantcompte tenu que les différents types d’Ig sont utiles contre certains pathogènes denatures différentes. L’absence d’un type d’Ig peut empêcher la réponse immunitairede s’ effectuer correctement.
In vitro, I’IL-2l en combinaison avec l’IL-4 et un Ac anti-CD4O augmententla production d’IgGl murin 267 d’IgGl, d’IgG3 et d’1g04 humains 268 Ceci estexpliqué par l’action inhibitrice de l’IL-21 sur la transcription du gène CE induite parl’IL-4 qui permet la production d’IgE par les lymphocytes B 269 Un défaut designalisation dans ces deux cytokines (comme noté chez la souris IL-4’IL-21R oùtous les isotypes 1g sont diminués sauf les IgM) pourrait conduire à l’anomalie descellules B observée dans le syndrome XSCID 267 Une souris surexprimant l’IL-21 defaçon ubiquitaire contient des niveaux d’IgG, particulièrement d’IgGl, beaucoup plusélevés dans le sérum, confirmant le rôle de l’IL-21 dans la production d’IgGl 270
En plus d’influencer la commutation isotypique, l’IL-2l peut provoquerl’apoptose des cellules B naïves et activées murines in vitro 253,266 Cet effet est causépar une diminution de l’expression des facteurs anti-apoptotiques Bcl-xL et Bd-2,tant au niveau transcriptionnel que traductionnel. Chez les cellules B activées, l’IL-21induit leur apoptose tout en augmentant leur entrée dans le cycle cellulaire,permettant au nombre de cellules B de rester constant. Les lymphocytes B prolifèrentdonc grâce à l’IL-21 tout en entrant en apoptose, expliquant pourquoi il était penséque l’IL-21 n’avait pas d’effet sur les cellules B de souris stimulées avec un Ac antiCD4O 266 Afin d’expliquer la pertinence de ce double rôle de l’IL-21 chez les
39
lymphocytes B, une pré-culture de ces derniers avec un anti-CD4O pour une courtepériode (6h) a été effectuée avant l’ajout de l’IL-21. Cette expérience a démontré quela pré-culture avec l’anti-CD4O protégeait les cellules B de l’apoptose induite parl’IL-21 en augmentant l’expression de Bcl-xL. Cette suite d’événements rappelle sansdoute une réponse immunitaire in vivo où le lymphocyte CD4 TH2 liera le CD4Oprésent sur la cellule B afin de s’activer mutuellement, permettant alors à la cellule TCD4 de produire de l’IL-21 et à la cellule B protégée de l’apoptose de produire des1g 261 Ces résultats sont contraires aux effets de 1’IL-21 observés chez leslymphocytes T. En effet, l’IL-21 induit la survie des cellules T naïves tout enaugmentant leur prolifération si une stimulation dépendante du RCT est présente.
D’un autre côté, l’IL-21 semble avoir des effets sur le développement deslymphocytes B in vivo. Un modèle murin de surexpression de l’IL-21 humain oùcelui-ci est transcrit de façon ubiquitaire (promoteur de CMH de classe I) démontreun maintien du nombre de cellules B matures et une forte augmentation de lapopulation immature ainsi que des cellules plasmatiques 270 Le rôle de l’IL-2 1 dansla différenciation terminale des lymphocytes B est consolidé par le fait qu’il induitl’expression de Blimp-l et Bel-6, des facteurs de transcription importants dans ladifférenciation des cellules plasmatiques et dans la formation des centres germinatifs,respectivement 270
Finalement, l’IL-21 possède un rôle important dans la commutationisotypique des lymphocytes B pour la production d’IgG. De plus, l’IL-21 induitl’apoptose des cellules B naïves et, plus particulièrement, celle des cellules activéesvia un anti-IgM ou le LPS. Au contraire, le contact de cellules B avec un anti-CD4Oprotège celles-ci de l’apoptose, confirmant que l’IL-21 induit la perte de lymphocytesB activés sans un signal de la part des cellules T.
40
1.6.2.3 Effets de l’IL-21 sur les cellules NK et DC
L’effet de l’IL-15 sur les fonctions et la viabilité des cellules NK est essentielà la présence de celles-ci. Lors de la découverte de l’IL-21 et de sa forte homologieavec l’IL-15, les cellules NK furent les premières cibles cellulaires à être étudiées.Leur développement dans la MO a été d’abord étudié. Des cellules soucheshématopoïétiques humaines ont été cultivées en présence d’IL-15, F1t3 ligand et IL-21, ce qui a permis le développement de cellules NK matures 245rn À ce moment, oncroyait donc que l’IL-21 était un facteur important dans la génération de cellules NKmatures de la MO. Pourtant, la souris IL-21R possède un développement normal descellules NK, renversant cette hypothèse.
Le modèle murin déficient en IL-21R a aussi démontré que les cellules NKmatures sont présentes en nombre normal et possèdent des fonctions cytolytiquesefficaces. De plus, elles répondent très bien à des signaux activateurs (poly I :C ouIL-15) 108 Cependant, les effets de l’IL-21 varient selon l’espèce étudiée. Chez lesNK humains matures, 1’ IL-21 favorise la production d’ IfN-’ en synergie avec 1’ IL-15et l’IL-l$ et augmente leur activité cytolytique de la même façon que pour leslymphocytes T CTL 245,271 Toutefois, l’IL-2l inhibe la prolifération des cellules NKnaïves murines induite par l’IL-15 ou l’IL-2. De plus, elle ne favorise les fonctionseffectrices en combinaison avec l’IL-12 ou l’IL-15 que lorsque les NK ont été pré-activés in vitro ou in vivo W8 Il faut savoir que l’IL- 15 est un facteur essentiel dans ledéveloppement, la survie et les fonctions effectrices des cellules NK 272 L’IL-21semble donc induire la maturation terminale des cellules NK afin de stimuler leursfonctions effectrices 273 De façon intéressante, la stimulation des fonctions effectriceschez les cellules NK activées vient de pair avec une diminution de leur survie induitepar l’IL-l5, phénomène expliqué par Kasaian et al. comme un mécanisme ayant pourbut de diminuer la participation du système inné lorsque le système adaptatif estimplanté L’IL-21 agit donc, chez les cellules NK, comme un antagoniste deseffets induits par 1’ IL-15 dans un contexte murin.
41
Le rôle de 1’IL-2l dans le développement et les fonctions des DC, les cellulesprésentatrices d’Ag par excellence, a été étudié. La génération de ces dernières invitro en combinaison avec l’IL-21 a démontré une inhibition de la maturation des DC.Ceci a été observé par la diminution de l’expression du CMII de classe II ainsi quel’inhibition de l’expression de CCR7 (permettant la migration des DC matures auxganglions). De plus, les DC développées avec l’IL-21 présentaient une augmentationde l’endocytose. Tous ces phénotypes sont caractéristiques de DC immatures 254rn Desessais de prolifération des lymphocytes T en présence de DC développées enprésence d’IL-21 et chargées avec le peptide de l’ovalbumine ont démontré unecapacité moindre de ces DC à induire la prolifération des cellules T. De plus, laprésence d’IL-21 lors de la stimulation de DC matures par le lipopolysaccharide(LPS) inhibe l’activation de celles-ci et leur production de cytokines pro-inflammatoires 254 Ce phénomène pourrait permettre l’anergie de lymphocytes Tpuisque les signaux de co-stimulation sont absents ou alors générer des lymphocytesT régulateurs 261 Cependant, dans un contexte réel, la génération de DC s’effectuedans la MO, où l’expression de l’IL-21 n’a pas été démontrée. Les DC devraient doncse développer normalement puis se localiser à l’extérieur des organes lymphoïdessecondaires dans l’attente d’Ag. Ce n’est que lors d’une rencontre avec un Agétranger que la DC migrera aux ganglions ou à la rate, et ce processus implique lamaturation de la DC. Puisque l’IL-2l est surtout produite par les lymphocytes TCD4 activés, la DC ne devrait entrer en contact avec l’IL-21 qu’au moment d’entrerdans les organes lymphoïdes secondaires, moment où elle présente déjà un phénotypemature.
1.6.2.4 Signalisation par le duo IL-21/IL-21R
Les sections précédentes ont décrit les effets de l’IL-21 sur différents typescellulaires. Cependant, les rôles présentés sont le résultat d’une transduction designaux intracellulaires par l’IL-2lR et la chaîne y via le système Jak!STATmentionné dans la section 1.2.2.1 (Tableau V). Les Jaki et Jak3 sont utilisés danstous les types cellulaires étudiés.
42
Type de cellules Jak STATLeucémie de lymphocytes T Jak1246’249, Jak3249 STAT1, STAT5, STAT3249
(lignée humaine)
Lymphocytes T CD4 primaires N.D.1 STAT1, STAT3 274
(humains)
Cellules B primaires (murines) Jaki, Jak3 °STAT5 °
Cellules NK (humaine) N.D. STAT1, STAT3, STAT4 271
1 non disponible
STAT1 et STAT3 sont aussi recrutés chez les lymphocytes T et les cellules NK.Cependant, les lymphocytes B semblent préférer STAT5.
1.6.2.5 Effets de l’IL-21 dans des modèles de tumeur et d’autoimmunité
finalement, l’augmentation des fonctions effectrices et cytolytiques deslymphocytes TE CD8 et NK par l’IL-21 trouve son utilité dans le traitement detumeurs. Par exemple, des cellules de carcinome de côlon transfectées avec le gèned’IL-21 murin sont rejetées lorsqu’injectées dans un hôte syngénique. De plus, cessouris développent une immunité protectrice contre cette tumeur lors d’injectionsultérieures 275rn Dans un second modèle où les souris sont injectées avec un plasmidecodant pour l’IL-21 et/ou l’IL-15 puis des cellules de lymphomes, il a été démontréque le mélange des deux cytokines permet la régression complète des foyersmétastatiques dans le foie chez 80% des souris inoculées. Chez les souris ayant latumeur métastatique établie, le rejet du lymphome métastatique survient chez 40%des souris injectées avec les plasmides codant pour l’IL-21 et l’IL-l5 276 Ce genre deréponse immunitaire induit par l’IL-21 a aussi été étudié dans un modèled’adénocarcinome mammaire 264 de thymome 277 et de mélanome ou fibrosarcome265 Dans chacun des cas analysés, une population spécifique de CTL s’estdéveloppée, cellules dont les propriétés effectrices (cytolyse, production d’IfN-y,
perforine) sont augmentées. Ces résultats démontrent que l’IL-21 pourrait être unagent anti-tumeur à potentiel thérapeutique.
TABLEAU V. SIGNALISATION JAK!STAT UTILISÉE PAR L’IL-21
43
L’IL-21 a aussi été démontré comme ayant un effet dans le développement de
cellules autoimmunitaires. Une étude dans la souris NOD, modèle de diabète de type
I, a révélé qu’un pourcentage plus important de cellules T exprimait l’IL-21R
comparativement à un contrôle congénique NOD contenant une région protectrice
provenant d’une souris C57BL/6 (B6) (Idd3) 278 Cependant, nous avons démontré
que l’IL-21R était exprimé de façon constitutive par les lymphocytes T naïfs et
activés 107 Ceci suggère soit que les lymphocytes T de la souris NOD n’expriment
pas tous FIL-21R, soit que la méthode de détection de l’IL-21R par ce groupe n’est
pas très efficace. Il est connu que l’IL-21R est exprimé plus fortement sur les
lymphocytes T activés que sur les naïves. Il serait donc possible que l’IL-21R détecté
chez la souris congénique contrôle provienne des lymphocytes T activés.
L’accumulation de cellules T exprimant l’IL-21R chez la souris NOD serait donc le
résultat d’une augmentation de la proportion de lymphocytes T activés. Ceci serait
logique compte tenu que la souris NOD est un modèle d’autoimmunité causée par les
lymphocytes T activés. Ceci expliquerait pourquoi ce ne sont pas tous les
lymphocytes T qui expriment I’IL-21R dans le modèle NOD si la méthode de
détection n’est pas assez sensible. De plus, les auteurs mentionnent que les niveaux
d’IL-21 produits par l’ensemble des lymphocytes T retrouvés dans les souris NOD
sont beaucoup plus élevés. Cependant, compte tenu que 1’IL-2l est connu pour être
produit par les cellules T CD4 activées ainsi que les cellules stromales des organes
lymphoïdes, il serait logique que l’augmentation d’IL-21 provienne du fait que la
majorité des CD4 de la souris NOD sont activés. La comparaison entre le niveau
d’IL-21 dans la souris NOD et la souris congénique devrait donc se faire sur la base
des CD4CD44” seulement.
Une autre étude a analysé l’effet de l’administration d’IL-21 à une souris
avant l’induction de l’encéphalomyélite autoimmunitaire expérimentale (EAE). Dans
ce modèle, une protéine du système nerveux central (SNC) est injectée et créé une
réponse immunitaire qui conduit les lymphocytes T spécifiques à pénétrer dans le
SNC, induisant la maladie 279 Les données démontrent que l’administration d’IL-21
avant l’induction de l’EAE augmente la sévérité des symptômes. Cet effet n’est pas
44
observé lorsque l’IL-21 est injecté après le développement de l’EAE. Ces résultats
confirment l’effet de l’IL-21 sur le développement d’une immunité dont les fonctions
effectrices sont plus efficaces 10&262,264,265• En effet, la réponse contre l’Ag dans ce
modèle est induite par les lymphocytes T activés ainsi que par les cellules NK. La
production d’IFN-y par les lymphocytes T et les cellules NK est augmentée chez les
souris traitées à l’IL-21 avant l’induction de la EAE. De plus, le retrait des cellules
NK avant l’injection d’IL-21 annihile les effets de cette dernière, puisque les souris
déficientes en NK montrent une sévérité d’EAE égale à celle des souris contrôles 279
1.6.2.6 Résumé des fonctions de l’IL-21 dans le système immunitaire
IL-21
tL-2
TFNg
Permutation de
+ co-stimulation anti-CD4O classe lgG1 andlgG3
t Fonctions effectrices (j)NK + activation 4 Viabilité
IL-15 Survie
IL-21
figure 6. Résumé des fonctions de t’IL-21 dans te système immunitaire. L’IL-2 I estconnue pour entraîner la survie des lymphocytes T naïfs (I), stimuler les fonctionseffectrices des cellules CD$ cytotoxiques (2) et augmenter la prolifération induite parun signal RCT-dépendant (3). Chez les lymphocytes B, l’IL-2 1 stimule la prolifération(4) et active la commutation isotypique vers la production d’IgG (5). finalement, lescellules NK activées vont présenter des fonctions effectrices augmentées (6) tout envoyant leur survie diminuée par t’IL-21 (7). En effet, l’IL-2 I inhibe l’effet de survie del’IL-15 sur les cellules NK.
45
L’IL-21 présente plusieurs fonctions dans le système immunitaire qui varientselon le type cellulaire répondant à l’IL-21 ainsi que le statut d’activation de lacellule. Sur les lymphocytes T naïfs, l’IL-21 induit la survie et augmente laprolifération suite à une stimulation dépendante du RCT. De plus, l’IL-21 stimule lesfonctions effectrices des cellules CTL dont la production d’IfN-y et la cytolyse. Les
lymphocytes B vont proliférer suite à leur activation via un anti-CD4O encombinaison avec l’IL-21. Chez les souris, cette prolifération est accompagnée d’uneentrée en apoptose des cellules B. L’IL-21 assure la commutation isotypique vers laproduction d’IgG1 et IgG3. Finalement, chez les cellules NK, l’IL-21 augmente lesfonctions effectrices de celles-ci tout en diminuant l’effet de survie induit par l’IL-15sur cette population.
46
PROBLÉMATIQUE
Les cytokines de classe I de la famille Yc jouent des rôles très importants dans
le développement des lymphocytes T, la régulation de leur homéostasie et de leur
réponse. L’IL-7 est essentielle à la survie des lymphocytes T naïfs in vitro et in vivo.
L’IL-2 et l’IL-l 5 induisent la prolifération et la différenciation des cellules T naïves
en effecteurs. Lors de l’élimination du pathogène, l’IL-2 agit comme un antagoniste à
la survie de la majorité des TE en favorisant leur apoptose afin de retrouver un
équilibre dans le pooi de cellules T en périphérie. La génération des cellules TM
CD4 et CD8 s’effectue grâce à la présence de l’IL-7 qui induit la survie et la
différenciation des lymphocytes TE restants. La population TM CD8 est dépendante
de l’IL-15 pour son auto-renouvellement alors que les cellules T CD4 requièrent
l’IL-7. Au moment où cette étude a été entreprise, aucune cytokine n’était connue
pour la génération et la survie des lymphocytes T CD4 mémoires. La découverte de
l’IL-21 et de son récepteur, un nouveau duo appartenant à la famille Yc, était donc très
excitante du point de vue de l’homéostasie des lymphocytes T et, peut-être, d’un rôle
chez les TM CD4. L’IL-21 partage beaucoup d’homologie avec l’IL-15, 1’IL-4 et
l’IL-2, alors que son récepteur est semblable à l’IL-2Rf3 et à l’IL-4Ra. De plus, il a
été démontré que l’IL-21 co-stimule la prolifération des cellules T RCT-dépendante
et favorise la survie des lymphocytes T naïfs en culture 107,108,245 Compte tenu que
nous avons démontré précédemment que l’IL-21 était produite de façon constitutive
par les cellules stromales des organes lymphoïdes et que son récepteur était aussi
exprimé de façon constitutive, nous avons postulé que l’IL-21 est un facteur de survie
des lymphocytes T naïfs et jouerait donc un rôle dans leur homéostasie in vivo. Pour
répondre à cette hypothèse, nous avons créé un modèle murin surexprimant l’IL-21
murin de façon ubiquitaire. En effet, l’ADNc de l’IL-21 murin a été placé sous le
contrôle du promoteur de CMH de classe I, exprimé dans toutes les cellules, et de la
séquence amplificatrice 1g. Ce promoteur est connu comme étant un promoteur fort
dans les cellules T, B et NK, permettant une expression du transgène dans tous les
compartiments lymphoïdes 280 De plus, plusieurs équipes ont utilisé ce promoteur
afin d’étudier les effets d’une cytokine de façon générale dans l’organisme 270,281
47
L’objectif principal de cette étude était de caractériser les effets de la surexpressionde l’IL-21 dans le modèle de souris IL-2 1 transgénique (Tg). Des objectifssecondaires se sont ensuite ajoutés
• analyser l’effet de l’IL-21 sur l’homéostasie deslymphocytes T
• étudier le rôle de l’IL-21 dans l’hématopoïèse
En effet, un groupe de souris IL-21 Tg présente une accumulation de cellules Tprésentant un phénotype mémoire. De plus, un deuxième groupe meurt de façonprécoce de ce qui semble être un défaut dans I’hématopoïèse caractérisé dans lamoelle osseuse par l’accumulation de cellules myéloïdes aux dépens des lignéesérythroïdes et lymphoïdes. Nous avons donc investigué l’effet inattendu de l’IL-21dans l’hématopoïèse. Nous avons étudié l’expression de l’IL-2lR par les différentespopulations de progéniteurs de la moelle osseuse. De plus, nous avons tenté dedéterminer si le phénotype de la MO IL-21 Tg était transmissible dans une sourisreceveuse irradiée.
CHAPITRE 2.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
49
2.1 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Le matériel et les méthodes utilisés dans la majeure partie de l’étude présentée
dans ce mémoire sont décrits dans l’article qui suit cette section (Chapitre 3).
Cependant, la méthodologie utilisée concernant des travaux additionnels qui ne font
pas partie de l’article présenté ici, mais détaillés à la suite de ce dernier, sera décrite.
2.1.1 Essai de survie des lymphocytes T in vitro (article Ostiguy et al., en
préparation pour Journal ofLeukocyte Biology)
2 X 106 cellules de ganglions ont été cultivées sans stimulation dans du RPMI
1640 complet (supplémenté avec 10% sérum de bovin foetal, lmM sodium pyruvate,
0.1 mM acides aminés non-essentiels, 10 mM Hepes, 10 tM f3-mercaptoéthanol et de
la pénicilline-streptomycine) durant 72 heures en présence d’IL-21 recombinante
murine (mrIL-21) (25 ng/mL) (R&D Systems, Minneapolis, MN), de rIL-7 murine
(10 ng/mL) (Medicorp, Montreal, Qc, Canada) ou sans cytokine. Suite à l’incubation,
les cellules ont été récupérées et marquées à l’aide d’Ac anti-CD4, anti-CD8 et anti
CD44. Le 7-Amino-actinomycin D (7-AAD) (BD Pharmingen, Mississauga, ON,
Canada), un composé s’intercalant dans les acides nucléiques des cellules
apoptotiques ou nécrotiques, a été utilisé afin de mesurer la viabilité des lymphocytes
par cytométrie en flux. Dans certaines expériences, différentes populations de
lymphocytes ont été triées pour l’expression de la molécule CD44 (CD4+CD44b0,
CD4CD44’, CD8+CD44b0. ou CD8CD44). Ces sous-populations cellulaires ont
ensuite été cultivées dans les conditions et marquées avec les Ac et le 7-AAD décrites
ci-dessus.
2.1.2 Analyse du phénotype des souris IL-21 Tg (chapitre 4)
Les Ac suivants ont été utilisés: anti-CD11b (M1/70.15, Cedarlane, Hornby,
ON, Canada), anti-Grl (RB6-$C5, Caltag, Burlingame, CA), anti-Terll9 (Terll9,
Cedarlane), anti-B220 (RA3-6B2, Caltag) et anti-IgM (Caltag). Les Ac CD11b et Gr
50
1 détectent les monocytes et granulocytes, l’Ac Gr-1 étant plus spécifique aux
granulocytes, mais exprimé de façon transitoire chez les monocytes en
différenciation. L’Ac anti-Terli 9 détecte les cellules érythroïdes alors que les Ac
anti-B220 et —IgM identifient les lymphocytes B. Les cellules ont été analysées sur un
fACSCalibur en utilisant le logiciel CellQuest (Becton Dicldnson) ou WinMDI
(Scripps Clinic, La Jolla, CA).
2.1.3 Reconstitution hématopoïétique à partir de la MO de souris IL-21 1g
La MO d’une souris IL-21 Tg ou contrôle (née de la même portée et de même
sexe) a été prélevée et ses lymphocytes T ont été lysés à l’aide de 1’Ac anti-Thyl et
du complément de lapin (Cedarlane). La suspension cellulaire a ensuite été ajustée à 4
X 106 cellules/rnL afin d’injecter par voie intraveineuse un volume de 500 iL (2 X106 cellules) dans une souris receveuse syngénique B6C3F1 irradiée à 1200 rad. Les
souris transférées avec la MO Tg ou contrôle ont ensuite été injectées une fois par
jour pendant 5 jours avec une solution RPMI : eau stérile (1:1) afin d’éviter la
déshydratation. De plus, un traitement aux antibiotiques, Aposulfatrim (2.1% v/v), a
été administré durant 3 semaines dans l’eau. Les souris ayant reçu une greffe de MO
ont été analysées lorsqu’elles ont montré des signes de faiblesse, d’apathie ou
d’inconfort (position recroquevillée). La MO, la rate et les ganglions ont été prélevés
et marqués avec les Ac mentionnés dans la section 2.1.2 ainsi que dans l’article.
2.1.4 Détection de 1’IL-21R sur les progéniteurs de la moelle osseuse
La MO de quatre ou cinq souris B6 a été prélevée dans du RPMI 1640 ou du
PBS 1X!2% sérum de bovinl2 mM EDTA (lorsqu’il y avait déplétion des cellules
matures). Le marquage de surface comprenait: anti-Lin-bio (BD Pharmingen) (anti
CD3, -CDÏ lb, -Gr-l, -Terl 19 et —B220), anti-IL-7Ra-PE (pour les CLP) ou —bio
(pour les cellules myéloïdes) (A7R34, eBioscience), anti-c-Kit-APC (2B8, BD
Pharmingen), anti-Sca-1-PE-Cy5 (D7, eBiosciences). La streptavidine-APC-Cy7 a
été utilisée afin de détecter les Ac biotinylés. Les progéniteurs lymphoïdes (CLP) ont
51
été identifiés selon leur phénotype LiniL-7Rc-Kit’°Sca-1’° alors que les précurseurs
myéloïdes (CMP, GMP et MEP) sont présents dans la population LiniL-7Wc-
Kit’’Sca-r. Dans certaines expériences, la suspension cellulaire de MO a été enrichie
en progéniteurs grâce à une trousse EasySep® en suivant les instructions du
manufacturier (Stemcell Technologies, Vancouver, CB, Canada). Brièvement, la
suspension cellulaire (1 X 108 cellules!mL) a été incubée avec un mélange d’Ac (anti-
Lin) couplés à la biotine. Le mélange anti-Lin comprend des Ac dirigés contre CD5
(identifie les lymphocytes T et un sous-type de cellules B, les B-1), CDI1b, Gr-1, 7-4
(détecte les neutrophiles), Terll9, B220, et permet de marquer les cellules matures.
Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS 1X/2% sérum de bovin/2 mM EDTA,
puis marquées avec un complexe tétramérique d’Ac qui reconnaît la biotine et le
dextran fourni dans la trousse. Les microbilles magnétiques en dextran sont alors
ajoutées et la sélection magnétique permet de récupérer la suspension enrichie en
progéniteurs. L’IL-21R a été détecté sur ces différents progéniteurs suite à un
marquage avec la protéine de fusion IL-2 1fe ou IgG humain (contrôle négatif). L’IL
21Fc contient l’ADNc de I’IL-21 murine suivie de la portion Fc de l’IgG humaine 1o7
La détection de l’IL-21Fc s’effectue à l’aide d’un Ac anti-IgG (Fc spécifique) humain
couplé à l’Alexa f1uor488 (détecté en FL1) (Caltag).
2.1.5 Détection de I’IL-21R sur les progéniteurs par RT-PCR
La MO de souris B6 a préalablement été enrichie ou non en progéniteurs
grâce au kit EasySep® tel que décrit dans la section 2.1.4. Les Ac biotinylés (anti-
Lin) ont été révélés avec la streptavidine-APC-Cy7. Vingt milles progéniteurs
lymphoïdes (CLP) ou myéloïdes (CMP, GMP et MEP) ont été triés directement dans
I mL de TRizol en utilisant le fACSVantage SE. L’ARN a été extrait selon les
instructions du manufacturier (Invitrogen). L’ADNc a été synthétisé par transcription
inverse en utilisant des oligonucléotides synthétiques oligo(dT) (Invitrogen) et la
transcriptase inverse Superscript (Invitrogen). La réaction de PCR a été réalisée en
utilisant des amorces spécifiques pour l’IL-2lR murin (amorce 5’ : 5’-GCC TTA
CTC CTG CTG ATT C-3’ et amorce 3’ $ 5’-CTG AGT CCC AGG AGA TAT C-3’)
52
ou pour le contrôle interne HPRT (amorce 5’: 5’-GTA ATG ATC AGT CAA CGG
GGG AC-3’ et amorce 3’: 5’-CCA GCA AGC TTG CAA CCT TAÀ CCA-3’).
L’amplification par PCR a été effectuée dans du tampon Taq iX, 1.5 mM MgC12,
0.075 mM dNTPs, 10 pmole de chaque amorce et 0.5 U d’ADN polymérase Taq. Le
produit PCR a été obtenu suite à 35 répétitions du cycle: 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec;
et 72°C, 30sec.
CHAPITRE 3.
ARTICLE
54
AVANT-PROPOS
Quatre personnes ont participé aux travaux présentés dans l’article faisant
l’objet de ce chapitre. La forte majorité des travaux, analyses et la totalité des figuresont été effectuées par l’auteur de ce mémoire, soit Eve-Line Allard. Dario Lehoux acréé le transgène utilisé dans la génération des souris IL-21 1g et exécuté lesphénotypages sur les premières souris. Julie Rooney, en sa qualité d’assistante derecherche du laboratoire, a contribué à la réalisation de certaines expériences sur latotalité des souris IL-21 1g. En tant que chercheur principal du laboratoire, le Dr
Nathalie Labrecque a élaboré le projet de recherche présenté dans ce mémoire et a
grandement participé à la planification des expériences avec le premier auteur de
l’article.
55
OVEREXPRESSION 0F INTERLEUMN(IL)-21 PROMOTES MASSIVE
CD$ MEMORY T CELL ACCUMULATION
Eve-Line AlIard,1’2 Julie Rooney,’ Dario Lehoux,1 and Nathalie Labrecque’”3
‘Guy-Bernier Research Center, Maisonneuve-Rosemont Hospital, 2Department of
Microbiology and Immunology and 3Department of Medicine, University of
Montreal, Montreal, QC, Canada, HiT 2M4
Running titie: IL-21 regulates CD8 memory T ceil homeostasis
*Abbreviations used in this paper: Yc, common gamma chain; B6, C57BL/6; SPF,
specific pathogen free; CFSE, carboxylfluorescein succinyl ester; Tg, transgenic;
O/N, overnight; LN, lymph node: PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate.
Address correspondence to: Nathalie Labrecque
Guy-Bernier Research Center,
Maisonneuve-Rosemont Hospital,
5415 boul. de l’Assomption,
Montreal, QC, Canada HiT 2M4
Phone:(514) 252-3552
Fax: (514 252-3569
E-mail address:
56
Abstract
We previously demonstrated that IL-21 could mediate the survival of naîve T
lymphocytes (CD4 and CD8) as weIl as CD$ memory T celis in vitro which led us
to investigate the biological activity of IL-21 in vivo. Interestingly, our resuits have
shown that overexpression of IL-21 in transgenic mice drives the accumulation of
both CD4 and, more conspicuously, CD8 memory-like T celis. This accumulation
of memory phenotype T ceils was accompanied by a simultaneous reduction in naïve
T ceil numbers. The memory T ceils found in IL-21 Tg mice possessed the functional
characteristics of conventional memory T ceils. They were functional given their
ability to rapidly produce IfN-y upon phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)
ionomycin stimulation and to proliferate following stimulation via their TCR. In an
attempt to understand why only memory T lymphocytes accumulate in IL-2 1 Tg
mice, we have evaluated the possible influences of IL-21 on cytokine receptor
expression. We have shown that IL-21 inhibits IL-7R expression on naïve CD4 and
CD8 T ceils in vitro. This might explain why naïve T ce!! numbers declined in IL-21
Tg mice due to a lack of IL-7 survival signals. On the other hand, IL-7R expression
was not affected by IL-21 in CD4 memory T cells, allowing IL-7 dependent survival
of CD4 memory T ceils in IL-21 Tg mice. Although IL-21 also decreased IL-7R
expression in CD8 memory T ceils, this had no impact in their survival since they
are not dependant on IL-7 for their maintenance in the T ce!! pooi. Moreover, CD$
memory T celi are receptive to IL-21 survival signals thus allowing their
accumulation in IL-21 Tg mice. This study identifies IL-21 as an unexpected player
in T ce!! homeostasis and in the regulation of T ceil responses to y cytokines.
INTRODUCTION
The co-existence of naïve, effector and memory T lymphocytes in an immune system
made of a fixed number of ceils with different rotes and finite life spans requires
independent homeostatic regulation of the different T celi pools (1-4). This is
necessary to keep an optimal immune system ail life long; an individual should be
able to respond to new pathogens and to recurrent infectious agents at any time.
Members of the common gamma chain (y) cytokine family and 1CR signais play
57
important and distinct roles in the homeostasis of the different T celi pools. The
maintenance of the naïve CD4 and CD$ T lymphocyte pooi is mainly regulated
through TCR interaction with self-MHC molecules (5-12) and IL-7 signais (5, 13-
15). Unlike naïve T lymphocytes, memory CD4 and CD8 T ceil survival is
independent of TCR-MHC interactions (16-18) but requires cytokine signals. The
survival of CD4 and CD8 memory T celis is regulated by different cytokines. It has
been shown that CD8 memory T celis require IL-15 for their long-term maintenance
(19-23) whule memory CD4 T lymphocytes are dependent on IL-7 for their survival
in the T ceil pool (24, 25). Although naïve and memory T lymphocytes occupy
independent homeostatic niches (3, 26), it is intriguing that CD4 memory T celis
need IL-7 like the CD4 and CD8 naïve T celi pool. This raises the possibility that
other homeostatic signal(s), such as other Yc cytokine, allow(s) for the independent
non-competitive maintenance of naïve and CD4 memory T lymphocytes. In this
context, the recent identification of IL-21 and IL-21R, which are members of the Yc
cytokine/receptor family, is of particular interest.
IL-21 and its receptor (IL-21R) are the most recent Yc cytokine/receptor pair
identified (27, 28). IL-21R associates with y which is required for signal transduction
following ligand binding (29, 30). IL-21 has pleitropic effects on B lymphocytes, T
ceils, dendritic ceils, and NK celis (reviewed in (31)), but the only prominent
phenotype identified to date in the IL-21 or IL-21R-deficient murine model is an
increase in IgE production by B lymphocytes whule IgGi production is decreased (32,
33).
IL-21 was originally found to be produced by activated CD4 T lymphocytes
(27), but recent evidences revealed a Th2 subset-specific expression (34). Moreover,
we have recently identified that stromal ceils might produce a constitutive source of
IL-21 in the immune system (35). In T lymphocytes, IL-21 was shown to co
stimulate anti-CD3-induced proliferation in addition to increasing IFN-y production
and effector ceil functions in CILS (27, 32, 36). IL-21 was also found to synergize
with IL-15 and, to a lower extent, with IL-7, in regulating the function and expansion
of naïve and memory-phenotype CD$ lymphocytes (37). Moreover, we recently
58
described resuits demonstrating a foie for IL-21 in mediating the survival of naïve
CD4, CD8, and, to a iesser extent, of CD$ memory T ceils in vitro (35).
Since we previously demonstrated that IL-21 could mediate the survivai of
naïve T lymphocytes (CD4 and CD8) as well as CD8 memory T ceils in vitro, we
decided to investigate its biological activity in vivo by overexpressing IL-21 in
transgenic mice. Interestingly, our resuits show that overexpression of IL-2 1 in
transgenic (Tg) mice drives the accumulation of both CD4 and, more conspicuously,
CD$ memory-like T ceils. This accumulation of memory phenotype T celis is
accompanied by a simultaneous reduction in naïve T ceil numbers. The memory T
ceils found in IL-21 Tg mice possess the functionai characteristics of conventional
memory T celis. They are functional given their ability to rapidly produce IfN-y upon
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-ionomycin stimulation and to proliferate
foliowing stimulation via their TCR. In an attempt to understand why only memory T
lymphocytes accumulate in IL-21 mice, we have evaiuated the possible influences of
IL-21 on the celi surface expression of cytokine receptors. We have shown that IL-21
inhibits IL-7R expression on naïve CD4 and CD8 T celis in vitro. This might
explain why naïve T ceil numbers declined in IL-21 Tg mice due to a iack of IL-7
survivai signais. On the other hand, IL-7R expression was flot affected by IL-21 in
CD4 memory T ceils, allowing IL-7 dependent survival of CD4 memory T celis in
IL-21 Tg mice. Although, IL-21 also decreased IL-7R expression in CD8 memory T
celis, this had no impact in their survival since they were flot dependant on IL-7 for
their maintenance in the T celi pool. Moreover, CD8 memory T ceil are receptive to
IL-21 survival signais (35) thus allowing their accumulation in IL-21 Tg mice. This
study identifies IL-2 1 as an unexpected player in T celi homeostasis and in the
reguiation of T ceil responses to c cytokines.
RESULTS AN1 DISCUSSION
Generation and characterization of IL-21 Tg mîce
Our recently obtained data have demonstrated a role for IL-21 in promoting survival
of naïve CD4 and CD8 as well as activated/memory CD$ T celis in vitro (35).
Moreover, we have shown that IL-21 is constitutively produced by lymphoid organ
59
stromal ceils and that IL-21R is constitutively expressed by T celis (35). This led us
to hypothesize that overproduction of IL-21 in transgenic mice might enlarge the
naïve T ceil pool by promoting naïve T ceil survival. To test this possibility, we
overexpressed IL-21 in mice using a transgene (Fig. lA) in which IL-21 expression is
driven by the MHC class I promoter and 1g enhancer (38). Unexpectedly, IL-21 Tg
mice had a drastically shortened life span (Fig. 1 B). Moreover, ail transgenic mice
were smaller in size and weight (usually 50% of wt negative littermate, data flot
shown). Unfortunately, the impaired survival of IL-21 Tg mice prevented breeding
and backcrossing to C57BL/6 (B6) mice. To study the effects of IL-21
overexpression, we generated 31 independent IL-21 Tg founders. Importantly,
histological analysis of ail organs in IL-21 Tg mice showed no gross abnormalities
(data flot shown). Moreover, we neyer detected any leukocytic infiltrations nor
tumour development in IL-21 Tg mice (data not shown). Further analysis of IL-21 Tg
mice revealed that their death occurred due to a defect in hematopoiesis, which led to
the accumulation of myeloid ceils and severely reduced erythropoiesis (È.-L. Allard
and N. Labrecque, manuscript in preparation). Based on their survival, IL-21 Tg mice
could be divided into two groups of mice. The group 1 contains mice (-7O%) whose
life span spreads the first three weeks following birth, whule group 2 represents the
remaining mice. Only analyses of the T ceil phenotype in IL-21 Tg mice from group
2 are presented here since very young mice (group 1) had very few T celis.
Characterïzation of T ceils from IL-21 Tg mice
To evaluate the effect of IL-21 overexpression in mice, we analyzed the cellular
composition of secondary lymphoid organs in wt and IL-21 Tg mice. Fig. 2 A shows
that mature T and B ceils were present in the lymph noUes (LNs) and spleen of IL-2 1
Tg mice. The proportion (Fig. 2A) and number (Fig. 3A and C) of the different B celi
populations were flot affected by IL-21 overexpression. However, the distribution and
numbers of T ceil subsets were affected in both the spleen and LNs of IL-2 1 Tg mice
(Fig. 2 A and Fig. 3 A, C). We aiways observed a decrease in the percentage and
numbers of CD4 T ceils in secondary lymphoid organs of IL-21 Tg mice when
compared with their negative littermates (Fig. 2 A and fig. 3 A, C). Moreover, CD8
60
T lymphocytes were increased in proportion and in numbers in IL-21 1g mice (Fig. 2
A and Fig. 3 A, C). The decreased representation of CD4 T ceils and the
simultaneous increase in CD8 T cells led to a reduction in the CD4/CD8 ratio in IL-
21 Tg mice. Importantly, IL-21 overexpression had only littie impact on the absolute
cell numbers that were recovered from LNs and spleen (Fig. 3 C). This is strike
contrast to what is observed when the prosuwival cytokine, IL-7, is overexpressed in
vivo (39).
b understand why CD8 I celis accumulate, we further evaluated the
composition of the T celi pool in the secondary lymphoid organs of IL-21 1g mice.
We stained T lymphocytes with mAbs directed against markers specific for naïve,
activated and memory T ceil subsets. Most of their spleen and lymph node (LN) T
cells had a naïve phenotype (CD4410 and CD62L’’). Unexpectedly, most of the IL-21
1g CD4 and CD8 T ceils were bearing hallmarks of a memory phenotype (CD44
and CD621J0) compared to their wt littermates (Fig. 2 B,C). We further confirmed
their memory phenotype by staining IL-21 1g T lymphocytes with markers known to
be specific for memory T ceils. Remarkably, the majority of CD8 I cells (53-88%)
in IL-21 1g mice possessed a memory phenotype as illustrated by their high level of
expression of CD44, Ly6C (Fig. 2 B,C) and CD122 (data flot shown). Similarly, a
high proportion (35-54%) of CD4 T ceils had a memory phenotype as shown by
their high level of CD44 and low level of CD45RB expression, albeit to a lesser
extent then their CD8 I ceil counterpart. The expression of activation markers such
as CD25 and CD69 was similar in IL-21 Tg and wt mice (data flot shown). The
accumulation of memory CD4 and CD$ T lymphocytes was even more impressive
in absolute ceil numbers (Fig. 3 A, B). The increased number of CD8 memory
phenotype T lymphocytes explains the decreased CD4/CD8 ratio in IL-21 1g mice
(Fig. 2 A,B and Fig. 3 A,B). Moreover, the reduced numbers of CD4 T cells mainly
accounted for a loss in naïve CD4 T ceils (—5-fold reduction) (Fig. 3A,B).
To determine whether the enlargement in the memory T ceil pooi in IL-21 1g
mice arose due to clonal or oligoclonal expansion of T celis, we analyzed I ceil 1CR
Vf3 repertoire in IL-21 1g mice using a panel of different anti-TCR V3 Abs. As
61
shown in Fig. 2D, no skewing in TCR V3 usage was observed in IL-21 Tg mice
when compared to wt mice (negative littermates).
These resuits suggested that IL-21 promoted the survival of memory T ceils
which leU to their accumulation, mostly of CD8, at the expense of naïve T ceils.
These resuits seem to confirm ouï previous data indicating a role for IL-21 in
promoting survival of memory phenotype CD8 T ceils while they are in conflict with
ouï observations that IL-21 promotes naïve T celi survival (35). Moreover, the
accumulation of memory phenotype T celis that we observed in IL-21 Tg mice was
similar to the one observed by Kieper et al. when they overexpressed IL-7, except for
the maintenance of a normal reservoir of naïve T celis in IL-7 Tg mice (39). The
experiments described below evaluated the functionality of memory-phenotype T
lymphocytes and suggest a possible mechanism for memory T ceil accumulation and
naïve T cell loss in IL-21 Tg mice.
Functionality of IL-21 1g memory phenotype T celis
We evaluated the functional capacity of IL-21 Tg memory T ceils based on two
characteristics. First, upon an in vitro 4-hour restimulation with PMA-ionomycin,
memory T celis will produce IFN-y while naïve T lymphocytes wiil flot be able to
secrete WN-y in such a short period of time (40, 41). Second, memory T ceils will
undergo quicker mitogen-induced proliferation and will respond to lower dose of Ag
or mitogen than naïve T ceils (42-44). As shown in Fig. 4 A, IL-21 Tg and wt CD4
memory T celis (CD44 and CD45RBI0) produced IFN-y in similar proportion, 44%
and 38% respectively, after 4h of stimulation with PMA and ionomycin. The levels of
production as evaiuated with the mean fluorescence intensity (MFI)) were
comparable in IL-21 Tg and wt memory CD4 T celis (124 versus 195). Strikingly,
the proportion of CD8 memory T lymphocytes (CD44’ and Ly6dhi) synthesizing
IFN-y was much higher in IL-21 Tg (91%) than in wt (70%) mice (Fig. 4A).
Moreover, the level of IFN-y production was also higher in IL-21 Tg (MFI of 427)
than in wt (MFI of 240) memory CD8 T lymphocytes. Furthermore, the comparison
of IFN-y production by ail CD8 T ceils in IL-21 Tg and wt mice confirmed the
memory phenotype seen in IL-21 Tg mice. As shown in Fig. 4A, 78% of Tg CD8 T
62
ceils produced IFN-7, while only 33% of CD8 T ceils did in littermates. Ihe higher
level of IFN-y produced by IL-21 1g CD8 memory T ceils compared to those from
wt mice may have arisen from the known ability of IL-21 to increase effector
functions in I celis (27, 32, 36, 37).
We then monitored the proliferative capacity of 1g CD44hi T ceils to different
concentrations of anti-CD3 Abs (0.03 to 3 tg/mL) after 72h of stimulation using
CFSE labelled 1 celis. IL-21 Tg CD44’ CD4 1 ceils initiated proliferation at 0.1
ig/mL of anti-CD3 Abs as did their wt counterparts (Fig. 4B). At higher
concentration of anti-CD3 Abs, we saw the appearance of a population of I ceils
refractory to proliferation only in IL-21 1g mice. Further studies are required to
understand why some CD44’ CD4 1 celis do flot proliferate following anti-TCR
stimulation. On the other hand, CD44’ CD8 T celis from IL-21 1g mice showed
massive and more extensive proliferation (Fig. 4B) at the lowest anti-CD3 Abs
concentration used (0.03 ig/mL) when compared to wt CD44hi CD$ I celis. As
shown in Fig. 4B, only 35% of IL-21 1g CD44hi CD8 I ceils did not proliferate
compared to 81% in wt mice.
Until now, we demonstrated that overexpression of IL-21 resulted in the
acquisition of a memory phenotype for most of the Tg CD8 and about a third of 1g
CD4 T celis. These IL-21 1g memory I ceils were shown to have enhanced
functional capacities in terms of IFN-y production following PMA-ionomycin
stimulation and were able of ICR-dependent proliferation. However, we were
puzzled with the fact that we previously described IL-21 as mediating the survival of
naïve T cells in vitro (35), but these were remarkably reduced in cdl number and
proportion in IL-21 1g mice. Moreover, we also have previously demonstrated that,
in vitro, IL-21 alone did not promote the conversion of naïve T ceils (CD4410)
towards an activated/memory (CD44) phenotype. Since IL-15 1g mice show
increased numbers of Ag-specific CD$ 1m in vivo (45-47) and IL-21 is known to
synergize with IL-15 in the expansion of CD8 T celis (37), it might be that
overexpression of IL-21, together with the in vivo available IL-15, drives naïve CD8
I celis into homeostatic proliferation which leads to the acquisition of memory CD8
T ceil phenotype (48). However, this did not explain the disappearance of naïve CD4
63
lymphocytes, which are flot responsive to IL-15 signais. A possible explanation was
that IL-21 regulated cell surface expression of cytokine receptors involved in the
regulation of T celi survival and homeostasis. A similar situation was recently
observed by Park et al. who have shown that members of the Yc cytokine family
downregulate celi surface expression of the IL-7R (49).
Suppression of IL-21R, IL-7RŒ and IL-2Rf3 expression by IL-21 in vitro
To try to understand the potential outcomes IL-21 had in vivo on T celi homeostasis,
we determined the effect of IL-21 on IL-21R, IL-7RŒ and IL-2R3 (CD122)
expression by T ceils after 48h of in vitro exposure to the cytokine. In our analysis of
cytokine receptor expression, we separated T celis based on their expression of CD4,
CD8 and CD44 to discriminate effects on naïve versus activated/memory T
lymphocytes. In contradiction to another report which showed the opposite (on
human naïve CD8 T ceils) (50), in our hands, IL-21 exposure of resting T ceils lcd to
the downregulation of its own receptor expression on ail T celi subsets analyzed
(Fig. 5). This was an interesting observation since Yc cytokines are known to usually
upregulate their own receptor expression (51, 52), the only exception being IL-7 (49).
Very interestingiy, IL-7 was reported to inhibit IL-7R expression in vitro and in vivo,
thus allowing more naïve T celis to receive survival signais through the Iimited
amounts of IL-7 (49). It is tempting to speculate that IL-21 down-regulates its own
receptor expression for the same reason as IL-7. This reinforced a possible roie for
IL-21 in T ceil survival and homeostasis.
The recent observation that the other prosurvival Yc cytokines (IL-2, IL-4, 1L6
and IL-15) reduced IL-7R expression on resting T cells (49) ieads us to evaluate if the
newest Yc cytokine, IL-21, also influences IL-7R expression. A possible influence of
IL-21 on IL-7R expression in T lymphocytes of IL-21 Tg mice might explain the
reduced number of naïve T ceiis observed in our IL-21 Tg mice. Thus, we evaluated
the expression of the IL-7R on T cells after an in vitro exposure of 48h to IL-21. As
other y cytokines, IL-21 reduced IL-7R expression on both CD4 and CD8 naïve
(CD4410) T celis (Fig. 5). This may have huge impact on the in vivo survival of naïve
T ceils in our IL-21 Tg mice since IL-7 is critical for their survival and maintenance
64
in the T ceil pool (13, 15). However, this suggested that IL-21 signais can flot replace
IL-7 effect in promoting naïve T ceil survival in our IL-21 1g mice. This was
intriguing since both IL-7 and IL-21 promoted I ce!! survival by inducing the
expression of the anti-apoptotic molecule Bd-2 and by activating the
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway (35, 53, 54). Nevertheless, we cannot
exciude a simple toxic effect of massive amounts of IL-21 causing death of naïve I
celis in our 1g mode!, a!though it is difficult to understand how this effect would only
occur in naïve I lymphocytes.
We further evaluated if in vitro IL-21 exposure influenced IL-7R expression
by activated/memory (CD44h) T celis (Fig. 5). Indeed, IL-7R expression was reduced
on CD44ht CD8 I cells, but maintained on CD44 CD4 T lymphocytes (Fig. 5).
CD8 memory T ceils are independent of IL-7 for their maintenance (13), so reduced
expression of IL-7R should not affect their survival in IL-21 1g mice. A different
picture emerged for CD44hi CD4 T ceils. As shown in Fig. 5, in vitro, IL-21 had no
effect on IL-7R expression by CD44’ CD4 I lymphocytes. Very interestingly, the
CD4 memory I ceil pooi was enlarged in IL-21 1g mice despite our observations
that IL-21 was flot able to promote memory phenotype CD4 I ceil survival. Ihe lack
of effect of IL-21 on IL-7R expression on CD44 CD4 T cei!s might allow for their
efficient maintenance in vivo in IL-21 1g mice. Furthermore, their increase in
number observed in IL-21 1g mice might have resulted from the enhanced
avaiiability of IL-7 due to reduced consumption of IL-7 by naïve T celis that lost IL
7R in IL-21 1g mice.
Finally, we looked at the effect of IL-21 exposure on the expression of the IL
2R (CD122) chain by resting T ceils. The IL-2RF3 chain is used by both the IL-2R
and IL-15R and is mostly expressed by CD44hi CD$ I ceils. In opposition to Mves
et al. (50), but in agreement with Kasaian et al. (32), IL-2R expression was
decreased but not completely abrogated on activated/memory CD8 T ce!!s fol!owing
culture with IL-21. Ihis was unexpected given the CD8 memory phenotype seen in
IL-21 1g mice and the importance of IL-15 in promoting survival of these celis. One
way to reconcile these data is the fact that both IL-15 and IL-21 have survival effects
on CD8 memory I celi population (19-23, 35), and that high levels of IL-2RE3
65
expression are flot needed for IL-15-induced CD$ memory T celi proliferation or
survival (23). Moreover, it was shown that a population of IL-15-independent CD8
memory T ceils with a CD44CD122b0 phenotype was stili present in IL45 or IL
15R mice (20, 55). The survival and/or proliferation of these celis may be
dependent on IL-21, explaining their presence in IL-15’ and IL-15R mice.
In conclusion, IL-21 Tg mice revealed a new role for IL-21 in promoting
memory T ce!! accumulation. Moreover, IL-21 overexpression leU to an imbalance in
normal T celi homeostasis by affecting expression of cytokine receptors participating
in the regu!ation of the different T cel! pool maintenance. These new functions of IL-
21 will have to be considered before manipulating IL-21 levels in patients to treat
cancer or autoimmune disease.
66
MATERIAL AND METHODS
Mice and generation of IL-21 1g mice. C57BL/6 (B6) mice were obtained from
Charles River (USA) or bred at the Guy-Bernier Research Center under SPF
conditions. b generate IL-21 1g mice, the ftll-length murine IL-21 cDNA vas
amplified by PCR and subcloned into the pHSE vector, which contains the H2kb
promoter, the 1g enhancer and the human j3-globin spiicing and polyadenylation
sequences (3$). 1g mice were generated by microinjection of the transgene into
(B6XC3H)F1 eggs using standard procedure. IL-21 1g mice were genotyped by
southern blot using a probe derived from the IL-21 cDNA. Mice were used according
to the protocols approved at the Guy-Bernier Research Center.
fIow cytometry. The following Abs were used: anti-CD4 (L3/T4, Cedarlane), anti
CD$ (53-6.7, BD Biosciences; CT-CD$a, Cedarlane), anti-CD44 (1M7, BD
Biosciences), anti-CD62L (MEL-14, Caltag), anti-Ly6C (AL-21, BD Biosciences),
anti-CD122 (5H4 or TM-1, BD Biosciences), anti-CD45RB (16A, BD Biosciences),
anti-B220 (RA3-6B2, Caltag), anti-IgM (Caltag), anti-IL-7RŒ (A7R34, eBioscience),
and anti-TCR V13 screening panel (BD Biosciences). Ceil stainings were performed
on ice in fACSwash (DMEM without phenol red supplemented with 3% heat
inactivated horse serum, 0.03M Hepes and 0.1% NaN3) and analyzed on a
fACSCalibur using CellQuest software (Becton Dickinson) or WinMDI software
(from Joseph Trotter, Scripps Clinic, La bila, CA).
IL-21R expression was detected as previously described (35). Briefly, celis
were incubated with 50 ng of IL-2lFc fusion protein or human IgG followed by
biotinylated-goat F(ab’)2 anti-human IgG (Fc specific) (Caltag) and SA-PerCP
(Caltag).
Detection of ex vivo IFN-y production. Spienocytes (106 cells/mL) were stimulated
with PMA (50 ng/mL, Sigma-Mdrich) and ionomycin (500 ng/mL, Sigma-Aldrich)
in complete RPMI medium supplemented with 10% FBS (Invitrogen) for 4h at 37°C.
10 j.tg of brefeldin A (Sigma-Alrich) per mL of celis was added to the culture for the
last 2h. Celis were fixed in 2% formaldehyde in PBS 1.2X for 20 min at room
67
temperature. 106 celis were stained with anti-IFN-y (clone XMG1.2, Caltag) Abs
diluted in 0.5% saponin (Sigma-Aldrich) for 30 min at room temperature. Celis were
washed twice before ceil surface staining with anti-CD4, anti-CD8, anti-CD45RB and
anti-Ly6C Abs.
Anti-CD3 stimulation. Spienocytes (107/mL in PBS) were labelled with 0.5 jiM
CFSE (Molecular probes, Eugene, OR) for 10 min at 37°C and then washed 3 time in
RPMI supplemented with 10% FBS. 2 X 106 CFSE labelled ceils were stimulated in
24-well plates coated with different concentrations (0 to 3 ig/mL) of anti-CD3 Abs
(145-2C11, Cedarlane). After 72h, ceils were hawested and stained with anti-CD4,
anti-CD$ and anti—CD44 Abs before FACS analysis.
Effect of IL-21 on Yc cytokine receptor expression. B6 LN ceils (2 X 106 cells/mL)
were cultured for 48h in RPMI complete medium containing murine rIL-21 (25
ng/mL) (R&D Systems) or murine rIL-7 (10 ng/mL) (Medicorp). Ceils were
harvested and then stained with either anti-IL-7Ra or anti-IL-2Rr3 mAbs or IL-21Fc
fusion protein in combination with anti-CD4, anti-CD8, anti-CD44 Abs followed by
FACS analysis.
68
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank Sebastien Harton and Éric Milot for the production of IL-21 Tg
mice. We acimowiedge Caroline Meunier for help with histological analysis of Il-21
Tg mice. We are grateful to Claude Perreault and Rafick-Pierre Sékaly for critical
reading of the manuscript.
This work was supported by a pilot project grant no NIP-67713 from the
Canadian Institutes of Health and Research (CIHR) and by grant from Valorisation
Recherche Québec to N. Labrecque. The Guy-Bernier Research Center FACS facility
is supported by a multi-user maintenance grant (no MME-67439) from the CIHR. N.
Labrecque is supported by a CIHR new investigator salary award. È. -L. Allard
received a studentship from University of Montreal.
The authors have no conflicting financial interests.
69
REFERENCES
1. Jameson, S.C. 2002. Maintaining the norm: T-cell homeostasis. Nat Rev Immunol
2:547-556.
2. Tanchot, C., and B. Rocha. 1997. Peripheral selection of T celi repertoires: the role
of continuous thymus output. JExp Med 186:1099-1106.
3. Tanchot, C., and B. Rocha. 1995. The peripheral T celi repertoire: independent
homeostatic regulation of virgin and activated CD8+ T celi pools. Eur J Immunot
25:2127-2136.
4. Tanchot, C., and B. Rocha. 199$. The organization of mature T-cell pools. Imnzztnot
Today 19:575-579.
5. Boursalian, T.E., and K. Bottomly. 1999. Survival of naive CD4 T ceils: roles of
restricting versus selecting MHC class II and cytokine milieu. Jlmmunot 162:3795-
3801.
6. Tanchot, C., F.A. Lemonnier, B. Perarnau, A.A. Freitas, and B. Rocha. 1997.
Differential requirements for survival and proliferation of CD8 naive or memory T
celis. Science 276:2057-2062.
7. Takeda, S., H.R. Rodewald, H. Arakawa, H. Bluethmann, and T. Shimizu. 1996.
MHC class II molecules are flot required for survival of newly generated CD4+ T
celis, but affect their long-term life span. Imrnunity 5:217-228.
8. Rooke, R., C. Waltzinger, C. Benoist, and D. Maths. 1997. Targeted
complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant
adenovinises. Immunity 7:123-134.
9. Kirberg, J., A. Berns, and H. von Boehmer. 1997. Peripheral T cell survival requires
continual ligation of the T ceil receptor to major histocompatibility complex-encoded
molecules. JExp Med 186:1269-1275.
10. Nesic, D., and S. Vukmanovic. 1998. MHC class lis required for peripheral
accumulation of CD8+ thymic emigrants. Jlmmunot 160:3705-3712.
11. Brocker, T. 1997. Survival of mature CD4 T lymphocytes is dependent on major
histocompatibility complex class II-expressing dendritic celis. J Exp Med 186:1223-
1232.
12. Witherden, D., N. van Oers, C. Waltzinger, A. Weiss, C. Benoist, and D. Maths.
2000. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival
signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J Exp
Med 191:355-364.
70
13. Schiuns, K.S., W.C. Kieper, S.C. Jameson, and L Lefrancois. 2000. Interleukin-7
mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T celis in vivo. Nat Immunol
1:426-432.
14. Vivien, L., C. Benoist, and D. Maths. 2001. T lymphocytes need IL-7 but flot IL-4 or
IL-6 to survive in vivo. Intlmmunol 13:763-768.
15. Tan, J.T., E. Dudi, E. LeRoy, R. Murray, J. Sprent, K.I. Weinberg, and C.D. Surh.
2001. IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival of naive T ceils. Froc
NatlAcadSci USA 98:8732-8737.
16. Garcia, S., J. DiSanto, and B. Stockinger. 1999. Foflowing the development of a CD4
T ceil response in vivo: from activation to memory formation. Irnmunily 11:163-171.
17. Swain, S.L., H. Hu, and G. Huston. 1999. Class Il-independent generation of CD4
memory T celis from effectors. Science 286:1381-1383.
18. Murali-Krishna, K., L.L. Leu, S. Sambhara, f. Lemonnier, J. Altman, and R. Ahmed.
1999. Persistence of memory CD8 T ceils in MHC class 1-deficient mice. Science
286:1377-1381.
19. Zhang, X., S. Sun, I. Hwang, D.f. Tough, and J. Sprent. 1998. Potent and selective
stimulation of memory-phenotype CD8+ T ceils in vivo by IL-15. Immunity 8:591-
599.
20. Lodolce, J.P., D.L. Boone, S. Chai, R.E. Swain, T. Dassopoulos, S. Trettin, and A.
Ma. 1998. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte
homing and proliferation. Immunity 9:669-676.
21. Ku, C.C., M. Murakami, A. Sakamoto, J. Kappler, and P. Marrack. 2000. Control of
homeostasis of CD8+ memory T ceils by opposing cytokines. Science 288:675-678.
22. Kennedy, M.K., M. Glaccum, S.N. Brown, E.A. Butz, J.L. Viney, M. Embers, N.
Matsuki, K. Charrier, L. Sedger, C.R. Willis, K. Brasel, P.J. Morrissey, K. Stocking,
J.C. Schuli, S. Joyce, and J.J. Peschon. 2000. Reversible defects in natural killer and
memory CD8 T cell lineages in interleukin 15-deficient mice. J Exp Med 191:77 1-
780.
23. Berard, M., K. Brandt, S. Bulfone-Paus, and D.F. Tough. 2003. IL-15 promotes the
survival of naive and memory phenotype CD8+ T ceils. J Immunol 170:5018-5026.
24. Kondrack, R.M., J. Harbertson, J.T. Tan, M.E. McBreen, C.D. Surh, and L.M.
Bradley. 2003. Interleukin 7 regulates the survival and generation of memory CD4
celis. J Exp Med 198:1797-1806.
71
25. Seddon, B., P. Tomiinson, and R. Zamoyska. 2003. Interleukin 7 and T celi receptorsignais regulate homeostasis of CD4 memory ceils. Natlmmunol 4:680-686.
26. Freitas, A.A., and B. Rocha. 2000. Population biology of lymphocytes: the flight for
survival.Annu Revlmmunol 18:83-111.
27. Parrish-Novak, J., S.R. Dillon, A. Nelson, A. Hammond, C. Sprecher, J.A. Gross, J.
Johnston, K. Madden, W. Xu, J. West, S. Schrader, S. Burkhead, M. Heipel, C.
Brandt, J.L. Kuijper, J. Kramer, D. Conklin, S.R. Presnell, J. Berry, F. Shiota, S.
Bort, K. Hambly, S. Mudri, C. Clegg, M. Moore, f.J. Grant, C. Lofton-Day, T.
Gilbert, F. Rayond, A. Ching, L. Yao, D. Smith, P. Webster, T. Whitmore, M.
Maurer, K. Kaushansky, R.D. HoIly, and D. Foster. 2000. Interleukin 21 and itsreceptor are involved in NK celi expansion and regulation of lymphocyte function.Nature 408:57-63.
28. Ozaki, K., K. Kikly, D. Michalovicli, P.R. Young, and W.J. Leonard. 2000. Cloning
of a type cytokine receptor most related to the IL-2 receptor beta chain. Proc Nati
AcadSci USA 97:11439-11444.
29. Asao, H., C. Okuyama, S. Kumaki, N. Ishii, S. Tsuchiya, D. Foster, and K.
Sugamura. 2001. Cutting edge: the common gamma-chain is an indispensable
subunit of the IL-21 receptor complex. Jlmmunol 167:1-5.
30. Habib, T., S. Senadheera, K. Weinberg, and K. Kaushansky. 2002. The common
gamma chain (gamma c) is a required signaling component of the IL-21 receptor and
supports IL-21-induced ceil proliferation via JAK3. Biochernistry 41:8725-8731.
31. Leonard, W.J., and R. Spolski. 2005. Interleukin-21: a modulator oflymphoid
proliferation, apoptosis and differentiation. Nat Rev Immunot 5:688-698.
32. Kasaian, M.T., M.J. Whitters, L.L. Carter, L.D. Lowe, J.M. Jussif, B. Deng, K.A.
Johnson, J.S. Witek, M. Senices, R.F. Konz, A.L. Wurster, D.D. Donaldson, M.
Collins, D.A. Young, and M.J. Grusby. 2002. IL-21 limits NK ceil responses and
promotes antigen-specific T celi activation: a mediator of the transition from innate
to adaptive immunity. Imrnunity 16:559-569.
33. Ozaki, K., R. Spolski, C.G. Feng, C.F. Qi, J. Cheng, A. Sher, H.C. Morse, 3rd, C.
Liu, P.L. Schwartzberg, and W.J. Leonard. 2002. A critical role for IL-21 in
regulating immunoglobulin production. Science 298:1630-1634.
34. Wurster, A.L., V.L. Rodgers, A.R. Satoskar, M.J. Whitters, D.A. Young, M. Collins,
and M.J. Grusby. 2002. Interleukin 21 is a T helper (Th) celI 2 cytokine that
72
specificaily inhibits the differentiation of naive Th ceils into interferon gamma
producing Thi celis. J Exp Med 196:969-977.
35. Ostiguy, V., E.-L. Mlard, and N. Labrecque. 2005. IL-21 promotes T lymphocytesurvival. J Leukoc Biol In preparation.
36. Ma, H.L., M.J. Whitters, R.F. Konz, M. Senices, D.A. Young, M.J. Grusby, M.
Coliins, and K. Dunussi-Joannopoulos. 2003. IL-21 activates both innate and
adaptive immunity to generate potent antitumor responses that require perforin but
are independent of IfN-gamma. J bnmunol 17 1:608-615.
37. Zeng, R, R. Spoiski, S.E. Finkelstein, S. Oh, P.E. Kovanen, C.S. Hinrichs, C.A.
Pise-Masison, M.F. Radonovich, J.N. Brady, N.P. Restifo, J.A. Berzofsky, and W.J.Leonard. 2005. Synergy of IL-21 and IL-15 in regulating CD8+ T ccli expansion andfunction. JExp Mcd 201:139-148.
38. Pircher, H., T.W. Mak, R. Lang, W. Balihausen, E. Ruedi, H. Hengartner, R.M.
Zinkernagel, and K. Burki. 1989. T ceil tolerance to Misa encoded antigens in T celireceptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embof 8:719-727.
39. Kieper, W.C., 1.1. Tan, B. Bondi-Boyd, L. Gapin, J. Sprent, R. Ceredig, and C.D.Surh. 2002. Overexpression of interleukin (IL)-7 leads to IL-15-independent
generation of memory phenotype CD8+ T ceÏls.JExp Mcd 195:1533-1539.40. Cho, B.K., C. Wang, S. Sugawa, H.N. Eisen, and J. Chen. 1999. Functionai
differences between memory and naive CD8 T ceils. Froc NattAcad Sci USA96:2976-2981.
41. Bachmann, M.F., M. Barner, A. Viola, and M. Kopf. 1999. Distinct kinetics of
cytokine production and cytoiysis in effector and memory T celis after viral
infection. Eur J Immunot 29:29 1-299.
42. Byrne, J.A., J.L. Butler, and M.D. Cooper. 1988. Differential activation requirements
for virgin and memory T ceils. J Immunol 141:3249-3257.
43. Bruno, L., J. Kirberg, and H. von Boehmer. 1995. On the ceilular basis ofimmunological T ccli memory. Imrnunity 2:37-43.
44. Rogers, P.R., C. Dubey, and S.L. Swain. 2000. Qualitative changes accompanymemory T celi generation: faster, more effective responses at lower doses of antigen.Jlmmunol 164:2338-2346.
45. Marks-Konczalik, J., S. Dubois, J.M. Losi, H. Sabzevari, N. Yamada, L.Feigenbaum, T.A. Waldmann, and Y. Tagaya. 2000. IL-2-induced activation-induced
73
ceil death is inhibited in IL-15 transgenic mice. Froc NatlAcad Sci USA 97:11445-11450.
46. Fehniger, T.A., K. Suzuki, A. Ponnappan, J.B. VanDeusen, M.A. Cooper, S.M.Florea, A.G. Freud, M.L. Robinson, J. Durbin, and M.A. Caligiuri. 2001. Fatalleukemia in interleukin 15 transgenic mice follows early expansions in natural idilerand memory phenotype CD8+ T ceils. J Exp Med 193:219-23 1.
47. Nishimura, H., T. Yajima, Y. Naild, H. Tsunobuchi, M. Umemura, K. Itano, T.Matsuguchi, M. Suzuki, P.S. Ohashi, and Y. Yoshikai. 2000. Differential roles of
interleukin 15 mRNA isoforms generated by alternative splicing in immuneresponses in vivo. JExp Med 191:157-170.
48. Surh, C.D., and J. Sprent. 2000. Homeostatic T ceil proliferation: how far cari T celisbe activated to seif-iigands? J Exp Med 192:F9-F14.
49. Park, J.H., Q. Yu, B. Erman, 1.5. Appelbaum, D. Montoya-Durango, H.L. Grimes,and A. Singer. 2004. Suppression of IL7Ralpha Transcription by IL-7 and Other
Prosuwival Cytokines; A Novel Mechanism for Maximizing IL-7-Dependent T Ccli
Survival. Immunity 21:289-302.
50. Mves, N.L., F.A. Arosa, and R.A. van Lier. 2005. IL-21 sustains CD2$ expressionon IL-15-activated human naive CD8+ T ceils. Jlmmunol 175:755-762.
51. Depper, J.M., W.J. Leonard, C. Drogula, M. Kronke, T.A. Waldmann, and W.C.Greene. 1985. Interleukin 2 (IL-2) augments transcription of the IL-2 receptor gene.Froc NatlAcad Sci USA 82:4230-4234.
52. Ohara, J., and W.E. Paul. 1988. Up-reguiation of interieukin 4/B-ceil stimulatory
factor 1 receptor expression. Froc NattAcad Sci USA 85:8221-$225.
53. von Freeden-Jeffry, U., N. Solvason, M. Howard, and R. Murray. 1997. The earliest
T lineage-committed ceiis depend on IL-7 for Bd-2 expression and normal ccli cycleprogression. Immunity 7:147-154.
54. Pallard, C., A.P. Stegmann, T. van Kieffens, F. Smart, A. Venkitaraman, and H.Spits. 1999. Distinct roles of the phosphatidylinositol 3-kinase and STAT5 pathwaysin IL-7-mediated development of human thymocyte precursors. Imrnunity 10:525-
535.
55. Judge, A.D., X. Zhang, H. Fujii, C.D. Surh, and J. Sprent. 2002. Interleukin 15controls both proliferation and survival of a subset of memory-phenotype CD8(+) Tcelis. J Exp Med 196:935-946.
74
FIGURE LEGENI)S
Figure 1. Impaired survival of IL-21 transgenic mïce. (A) Structure of the IL-21
transgene. The murine IL-21 cDNA (450 ph) was subcloned into the pHSE vector
containing the H2Kb promoter, 1g enhancer and the human j3-globin spiicing and
polyadenylation sequences. X, XhoI; S, Sali; B, BamHI; E, EcoRL (B) Suwival
curve of IL-21 1g mice. The survival rate of 31 individual founders is shown over
time.
Figure 2. IL-21 overexpression Ieads to the accumulation of memory phenotype
T cefis. (A) Lymphocyte subsets distribution in the spleen and LN of the IL-21 Tg
mice and their negative littermates. CD4/CD8 (left dot plots) and B220/IgM (right
dot plots) profiles from wt and IL-21 tg mice from the LN (top panels) or spleen
(bottom panels). LN and spleen ceil suspensions were stained with mAbs directed
against CD4, CD8, B220 and IgM. The percentage of CD4, CD8, B220IgM,
B220igM and B220’’IgM celis is shown on each dot plot. (B) Phenotype of IL-2 1
Tg CD4 T lymphocytes. CD44/CD62L (left dot plots) and CD44/CD45RB (right dot
plots) profiles gated on CD4 T ceils from LN (top panels) and spleen (bottom
panels) of wt and IL-21 Tg mice. LN and spleen ceil suspensions were stained with
anti-CD4, anti-CD44 and anti-CD45RB Abs. (C) Memory phenotype of IL-21 Tg
CD8 T celis. CD44/CD62L (left dot plots) and CD44/Ly6C (right dot plots) profiles
gated on CD8 T celis from LN (top panels) and spleen (bottom panels) of wt and IL-
21 Tg mice. LN celis and spienocytes were stained with anti-CD8, anti-CD62L, anti
CD44 and anti-Ly6C. (D) T celi repertoire of IL-21 1g mice. 1CR Vf3 use by CD4
(white bars) and CD8 (black bars) I lymphocytes from IL-21 1g and wt mice. LN
ceils were stained with anti-CD4, anti-CD$, anti-CD3 and a panel of anti-ICR Vf
Abs. The FACS analyses from panel A to C are representative of 8 independent IL-
21 Tg founders while the data from panel C is from 2 different founders. The wt mice
used in all experiments were negative littermates.
75
Figure 3. Analysis of lymphoid cellularity in IL-21 Tg and control mice. (A)Cellular composition of the lymph nodes from IL-21 Tg and control mice. The
analyses were done on pooled axiliary, inguinal and mesenteric lympli nodes. (B)Spienic cellularity in IL-21 Tg mice. (C) Total ceil number of secondary lymphoid
organs and spienic B ceil numbers recovered from IL-21 Tg mice. Absolute numbersof total organ and different lymphocyte subsets are shown. Mean +1- SEM isrepresented. IL-21 Tg mice (white squares), negative littermates (black squares). Tm,memory T ceils.
Figure 4. Functionat capacity of IL-21 Tg memory phenotype CD4 and CD8 T
lymphocytes (A) Rapid IFN-y production by IL-21 Tg memory phenotype T ceils.Splenocytes were stimulated with PMA (50 ng/mL) and ionomycin (500 ng/mL) for
4h. Brefeldin A (10 jig/mL) was added during the last 2h of culture. Ceils were then
fixed in formaldehyde followed by staining with anti-IFN-y, anti-CD4, anti-CD8,
anti-CD44 and anti-CD45RB Abs. Fluorescence histograms show IFN-y production
gated on CD4 (left histograms) or CD8 (right histograms) T ceils from wt (top
panels) and IL-21 Tg (bottom panels) mice. The thin une represents IFN-y production
by total CD4+ or CD$+ T celis while the bold une shows IFN-y production by
memory CD8 (Ly6Chi) or CD4 (CD45RBb0) T lymphocytes. The dotted linestands for isotype control staining. The percentage of memory T lymphocytes (bold)
and total lymphocytes (normal) producing IfN-y are indicated on the histogram. Wtmice correspond to IL-21 1g negative littermates. (B) Normal proliferation ofmemory phenotype T celis from IL-21 1g mice following anti-CD3 stimulation. IL-21 1g and wt (negative littermates) spienocytes were labeled with CFSE and in vitro
stimulated with different concentrations of anti-CD3 Ab (0.03 to 3 ig/mL). 72 h later,ceils were stained with anti-CD4, anti-CD8 and anti-CD44 Abs followed by FACSanalysis. CFSE profiles gated on CD4CD44” (left histograms) or CD$CD44 (righthistograms) T celis from wt or IL-21 1g mice are shown for the different anti-CD3Ab concentrations. Thin une, CFSE profiles obtained after anti-CD3 stimulation;dotted line, CFSE fluorescence by unstimulated ceils.
76
Figure 5. IL-21 regulates Yc cytokine receptor expression on T lymphocytes invitro. B6 LN celis (1 X 106 /mL) were cultured either with rIL-21 (25 ng’mL), rIL-7(10 ng/mL) or medium alone for 48 h. Celis were then harvested and stained to detectIL-21R, IL-7Ra and IL-2Rj3 expression by the different T ce!! subsets. rnAbs wereused to detect IL-7Ra and IL-2R13 expression while an IL-21fc fusion protein wasused to detect IL-21R expression. The expression profiles of the different y cytokinereceptors after culture with cytokines are compared to fresh!y harvested LN ceils.Bold !ine, culture with rIL-21; thin une, culture with rIL-7; dotted une, ex vivo;dashed fine, isotype (note that the staining for the different isotypes overlaid).
77
A
B
X (1) 5 (2000) B (2450) E (3350) E (4050) X (5650)
* /
___
ATG TGAH2Kb promoter IL-21 3-gIobin 1g enhanoer
(spiicing and poiyadenyiation)
(t>
U)
Figure Ï
—•— L-21 Tg
—O— negatPe ittermates
Age (days)
Prop
ortio
nof
V[3
Tce
Ns
(%)
F’)
F’)
O(F
iO
(Fi
O01
II
II
J
:1 B’
Ci)
r-g
z(D (D D
CD -o (D (D D
r zC/
)-D w (D D
r z
o c) n) q o
-n CD -‘ (D
=
OC1
9
w G) n) q o
V32
Vf33
V4
V13
5.1/
5.2
V6
V7
VpB
.1/6
.2
V8.
3
V139
V1O
b
V31
1
V12
V13
V14
Vpl
7a
V132
V33
V4
Vp5
.1/5
.2
V6
V7
V8.
1/8.
2
V8.
3
V39
Vpl
Ob
vp11
V12
VJ3
13
Vp1
4V
j317
a
I
F’)
F’)
19
(1o +
o +
I.’IA
A
Ç) (b
H F’)
-‘
---J-
— ——
--3
4
00
Cei
lnum
ber
-‘
F%)
C34
xx
xX
oo
oo
Sple
enl-I
-l—D
-HLN
IHD
HSp
leen
Sce
lls
D
-n (D O)
w
Cei
lnu
mbe
rC
eil
num
ber
o
F0(J
.01
xxx
xx
oco
O
CD
4
CD
8,H
as
CD
4Tm
(n-
bir
xx
XX
oq
c
CD
4H
J-I
h—S—
-1
F1C
Dj
h*-l—
—D
—-1
LJcD
4Tm
1atN
CD
BT
mi—
0—
iC
D8T
m--
-U--
i
DD
wo
pP
-— Ç cE1
‘—
--—
-K
IE
VE
NT
SE
VE
NT
S
1F
EVENTS
EV
EN
TS
r.)—
H CD
81
ACD4tD44b0 CD4+CD44hi CD8CD44’° CD8CD44’
Figure 5
IL-7Ra
IL-2R3
CHAPITRE 4.
RÉSULTATS SUPPLÉMENTAIRES
$3
4.1 PARTICIPATION À L’ARTICLE OSTIGUY ET AL. INTITULÉ «IL-21PROMOTES T LYMPHOCYTE SURVIVAL> EN PRÉPARATION POURJOURNAL 0F LEUKOCYTE BIOLOGY
Ma contribution a consisté à évaluer l’effet de l’IL-21 sur les différents sous-types de lymphocytes T, basé sur leur expression de la molécule CD44, i.e.d’analyser le rôle de l’IL-2l sur la viabilité des lymphocytes naïfs (CD4410) versus
activés/mémoires (CD44). Ce résultat est présenté dans ce mémoire puisqu’ilcontribue à l’interprétation des résultats obtenus avec la souris IL-2 1 1g.
4.1.1 L’IL-21 induit la survie des lymphocytes T in vitro
Notre laboratoire a démontré que l’IL-21 favorisait la survie des lymphocytesT en culture 107 Cependant, nous voulions étudier l’effet de l’IL-21 sur la viabilitédes lymphocytes T CD4 et CD8 selon leur expression de CD44 afin de déterminersi la survie observée était applicable à toutes les sous-populations de lymphocytes T.Nous avons donc comparé la survie induite par l’IL-21 sur les cellules T naïves(CD44b0) versus activées/mémoires (CD44’”). Comme prévu, 1’IL-2 1 induit lasurvie des cellules T CD4 et CD8 naïves (58% ± 1.3% et 50% ± 6.7%respectivement) comparativement au milieu seul (27% ± 4.8% et 18% ± 2.2%respectivement) (Figure 7A). De façon très intéressante, nous pouvons aussi constaterun effet sur la population CD8 activée/mémoire (22% ± 2.1%) qui est absent chezleur vis-à-vis CD4 (22% ± 11%) par rapport au contrôle sans cytokine (6% ± 1.4%et 29% ± 5.3% respectivement). Deux scénarios peuvent expliquer la raison de cetteaugmentation de viabilité chez les lymphocytes CD8 activés/mémoires.Premièrement, l’IL-21 pourrait avoir un effet positif direct sur la survie de cettepopulation. Deuxièmement, I’IL-21 pourrait induire l’expression à la hausse de CD44sur les cellules T CD8 naïves, expliquant l’augmentation de la population delymphocytes T Puisque nous avons démontré que l’IL-2 1 favorise lasurvie des cellules T naïves, il est possible que les lymphocytes CD$ naïfs aient reçuun signal de survie de l’IL-21 et aient été induits à se différencier. Afin de vérifier
84
100100
44high____
8080
60
____
DCD440 (4Q •CD85
>
2020
Milieu tIC-21 rIL-7B
100
I
_______
H EÏ D cD4
Milieu rlL-7
C
CD44
Figure 7. L ‘iL-21 induit la survie des lymphocytes T naïfs et des cellules T CD8activéesimémoires. (A) Viabilité des cellules CD4+ et CD8+ en fonction de l’expression de CD44en présence ou absence de rIL-21 ou rIL-7. Une suspension cellulaire de ganglions lymphatiques desouris B6 a été cultivée in vitro pour 72h sans stimulation en présence ou absence de rIL-21 (25ng/mL) ou rIL-7 (10 ng/mL). Le pourcentage de viabilité a été obtenu suite à un marquage au 7-AAD en combinaison avec des Ac dirigés contre CD4, CD8 et CD44. (B) Viabilité des cellules TCD4+ et CD8+ triées en fonction de leur expression de CD44. Une suspension cellulaire deganglions a été triée selon les phénotypes suivants: CD4+CD44l0w, CD4CD44’, CD8+CD44I0wCD$CD44’’ et cultivés in vitro pour 72h tel que décrit en A. Le pourcentage de viabilité etl’expression de CD44 ont été analysés suite à un marquage au 7-AAD en combinaison avec un Acanti-CD44. (C) L’IL-21 n’induit pas la différenciation des lymphocytes T naïfs. L’expression deCD44 est démontrée avant le tri (trait fin), après le tri (trait pointillé) et après culture de 72h avec lerIL-21 (trait gras). Données représentant trois expériences indépendantes. Les statistiques ont étéobtenues en utilisant un test T de Student bilatéral où *= p <0.05, **
p <0.01, = p <0.005,= p <0.0005 and = p <0.00005.
cette hypothèse, nous avons trié des cellules CD4 et CD$ selon leur expression deCD44 et les avons cultivées avec rIL-21 (25 ng/mL) pour 72h. Ces cellules ont été
Milieu rlL-21 rIL-7
I I
Milieu tIC-21 rIL-7
CD4j
ri L-21
marquées avec le 7-AÀD et un Ac anti-CD44 afin de vérifier si son expression
85
augmentait suite à la culture avec l’IL-21. Tel qu’illustré dans la figure 7B, nous
avons pu constater que l’IL-21 avait un effet direct sur la survie des lymphocytes T
naïfs sans toutefois activer ces derniers (figure 7C). De plus, l’IL-21 semble avoir un
effet direct sur la survie des lymphocytes CD$ activés/mémoires, mais cet effet est
absent sur la population CD4 activée/mémoire. La survie observée chez les
lymphocytes T CD8 activés/mémoires est donc le résultat de la culture avec l’IL-21
et non de la différenciation des cellules naïves vers un phénotype mémoire.
4.2 PERTURBATION DE L’HÉMATOPOÏÈSE CHEZ LA SOURIS IL-21 TG
L’article présenté au chapitre 3 de ce mémoire décrit l’accumulation de
lymphocytes T mémoires chez la souris IL-21 Tg (voir chapitre 3). Cependant, la
surexpression de l’IL-21 provoque aussi un deuxième effet chez la souris Tg qui
altère le développement hématopoïétique. Ce processus altéré chez la souris IL-21 Tg
conduit à la mort de celle-ci. Nous avons mentionné dans l’article qu’environ 70%
des souris IL-21 1g mourraient durant les 3 premières suivant la naissance. Nous
avons appelé celles-ci groupe 1. Les cellules de ces souris IL-21 1g ne présentent pas
le phénotype mémoire, mais ont un développement hématopoïétique changé. Les
souris IL-21 Tg du groupe 2, englobant les autres souris, ont aussi un défaut
hématopoïétique en plus de développer une accumulation de lymphocytes T
mémoires. Les résultats qui seront présentés vont dépeindre le phénotype
hématopoïétique observé dans le modèle murin afin d’apporter des réponses
préliminaires pour expliquer la nature de ce phénomène.
4.2.1 Accumulation de cellules de la lignée myéloïde chez la souris IL-21 Tg
La mort des souris IL-21 1g du groupe 1 nous a amené à investiguer le
développement hématopoïétique chez la souris IL-21 Tg puisqu’en histologie, tous
les autres organes étaient normaux. L’ analyse de coupe histologique de la MO montre
$6
une hypercellularité dans celle-ci (Figure sA). De plus, on observe une accumulation
importante de neutrophiles dans la rate (Figure $3). Ces observations nous ont
amenés à caractériser les populations cellulaires présentes dans la MO et la rate par
cytoméffie en flux.
A
Moelle osseuse(1OX)
B
Rate (25X)
figure 8. Histologie de la moelle osseuse et de ta rate de souris IL-21 Tgcolorée avec hématoxytine-éosiite. L’os du bras (A) et la rate (B) ont étéprélevés dans le formol, puis fixés sur paraffine. Les coupes ont ensuite étécolorées avec l’hématoxyline-éosine. Nous remarquons la présence de nombreuxneutrophiles dans la MO IL-21 Tg ainsi que dans la rate.
L’analyse du profil FSC/SSC de la MO démontre une accumulation massive de
cellules myéloïdes immatures (fSC’SSC) chez la souris IL-21 Tg (figure 9). Cette
augmentation du nombre de cellules myéloïdes immatures est accompagnée de la
diminution des cellules lymphoïdes (fSCI0SSCI0) (figure 9). Ceci a été confirmé par
l’absence de lymphopoïèse B dans la MO de la souris IL-21 Tg, caractérisée par la
disparition de la population B22OEIgM chez les groupes 1 et 2 de souris IL-21 Tg
(souris contrôle : 3.7 X 106 vs souris IL-21 Tg: 1.5 X i0 pour le groupe 1, 5.1 X 106
vs 4.7 X l0 pour le groupe 2) (Figures 9 et 10). Le phénotype myéloïde chez les
souris des groupes I et 2 a été confirmé par l’observation d’une accumulation de
cellules myéloïdes CD1 1bGr-l, et ce, en terme de pourcentage
Rate
Contrôte
IL-21 tg
Figure 9. Accumulation de cellules myéloïdes dans la MO et la rate des souris IL-21 Tg.Analyses en cytométrie en flux de la taille cellulaire et des populations, de cellules myéloïdes,érythroïdes et lymphoïdes présentes dans la rate et la MG des souris IL-21 1g et contrôles. Lescellules ont été marquées avec des Ac anti-CD11b, anti-Gri, anti-Terll9, anti-B220 et anti-IgM.Les profils lymphoïdes et érythroïdes de la MG et de la rate proviennent de souris IL-21 Tg dugroupe 2. Les profils myéloïdes de la MO et de la rate représentent les souris du groupe 1. Leprofil représentatif d’une souris sur im groupe de 7 (groupe 1) ou 6 (groupe 2) est montré.
(Figure 10, Figure 9 et résultat non montré). Nous pouvons aussi remarquer que lapopulation CD11bGr-1mt chez la souris IL-21 Tg du groupe 2 semble plus marquéeque chez la souris contrôle, ce qui n’est pas le cas chez les souris du groupe 1 (Figure10). Gr-1 et CD11b étant des marqueurs pour la différenciation terminale desgranulocytes et monocytes, ceci suggère un blocage partiel dans la maturation de ces
87
Groupe 2 Groupe 1 Groupe 2Cellules B Érythroïdes
MO
•ll - -,
Contrôle
:
IL-21 tg
FSC •.>
derniers. De plus, la MO IL-21. Tg (groupe 2) semble éprouver un défaut
$8
d’érytbropoïèse selon le marquage Teri 19, démontrant la presque absence
d’érythrocytes. Ce phénomène intriguant nous a poussés à étudier la rate afin devérifier si le même phénotype y apparaissait.
MO
(nwzwoww1
.0Eoz
= z =wO O
Rate
Figure 10. Composition cellulaire de la moelle osseuse et de ta rate chez tes deux groupes desouris IL-21 Tg. Le nombre total de cellules ainsi que la composition cellulaire de la moelleosseuse et de la rate sont illustrés pour les souris des groupes 1 et 2. Les cellules CD11bGr-1incluent toute la population monocyte/granulocyte. Souris IL-21 Tg, groupe 1, n = 6, groupe 2,n = 6 contrôles, n = 12. Carrés noirs: souris non-Tg sacrifiées au même âge que les souris Tg;carrés blancs : souris IL-21 Tg
Nous observons aussi chez la rate des souris IL-21 1g une populationreprésentant des cellules myéloïdes (FSC’SSC”) (Figure 9). La rate IL-21 1g
(nwz
7.5Xo• 5X107
7.5 X iC
Groupe 1 Groupe 2
2 X 1
2 .5X
w
+
w(n.0
o
D. O.zz00— I_
+ *0 0cl cIc..l c.’1
0.0.
00— h
D) D)+ *
D) D)* +00c.J CJC1 C’1
4
2
Groupe 1 Groupe 2
2 X 1
I
ow wD. 0.z zO Oh. hO) D)w w._ -(u tu
+
0+.01
+O)111.wI-
7.5X106 1.2X108
i 8X107
X106 4X107
w w w w0.0. 00z z z z00 00h h- h- h
D)D)
+ +4- 400 00c’J (‘1 C%JC’4ÇJ olc’J
contient des progéniteurs B (B22OIgM) de façon surprenante chez le groupe 2 tout
$9
en ayant une déficience en lymphocytes B matures (B220igMj (Figures 9 et 10). Le
groupe 1 de souris IL-21 1g ne diffère pas des contrôles concernant le développement
des progéniteurs B dans la rate. Cependant, le développement semble bloqué à ce
stade puisqu’il y a absence de lymphocytes B matures (Figure 10). Comme nous
pouvons le constater, il y a présence d’une accumulation de cellules myéloïdes dans
la rate des souris IL-21 Tg des groupes 1 et 2 (Figure 9, résultat non montré, Figure
10). On retrouve aussi la population CD11bGr-1’t chez la souris Tg du groupe 2
alors que les souris du groupe 1 sont normales (Figure 10). Contrairement à ce qui a
été vu dans la MO IL-21 Tg, la rate semble présenter une augmentation de
l’érythropoïèse (souris IL-21 Tg du groupe 2), ce qui pourrait suggérer qu’un
mécanisme compensatoire a été mis en place dans la rate de la souris 1g afin de
répondre aux besoins de l’organisme en érythrocytes (Figures 9 et 10). La perte de
cellules érythroïdes est aussi identifiable à l’oeil nu sur les os provenant de la souris
IL-21 Tg: la moelle en est incolore. Ces résultats suggèrent un défaut dans
l’hématopoïèse qui induirait le développement de la lignée myéloïde au détriment des
lignées lymphoïdes et érythroïdes chez les souris IL-21 Tg. De plus, le thymus de ces
souris est atrophié et montre une forte diminution dans la population DP (résultat non
montré).
Afin d’essayer de comprendre pourquoi il y a une accumulation de
granulocytes dans la MO des souris IL-21 1g (groupes 1 et 2), nous avons évalué si le
nombre de progéniteurs myéloïdes était augmenté chez la souris IL-21 Tg (Figure
11). Selon les nombres cellulaires, il y a une diminution de 3X des progéniteurs
myéloïdes chez la souris IL-21 1g du groupe 1 (4.6 X i0 vs 1.6 X 10). Les CSH
sont 1.6X moins nombreuses que chez la souris contrôle (6.4 X vs 3.9 X 10g)
(Figure 11). Il y a aussi une perte des progéniteurs myéloïdes chez les souris IL-2 1 1g
du groupe 2 (1.2 X 106 vs 3.3 X 10f). Cependant, ces souris démontrent une nette
augmentation chez les CSH (4.5 X 10 vs 8.4 X 10).
90
Contrôle
IL-21 Tg
figure 11. Profit des progéniteurs myétoïdes dans la MO de souris IL—21 Tg. La MO de souris IL-21 Tg et contrôles a été marquée avec desAc anti-Lin, anti-IL-7Rcx, anti-cKit et anti-Sca- 1. La populationimmature et large (FSC) négative pour Lin et l’IL-7Ra a été séparéeselon l’expression de cKit et Sca-l. Les CSH sont cKitSca-l alorsque les précurseurs myéloïdes (CMP, GMP et MEP) sont c-Kit’Sca- I -.
Une souris du groupe I est présentée. Groupe I, n = 1, groupe 2, n = I.
4.2.2 Reconstitution hématopoïétique après la greffe de MO de souris IL-21 Tg
Nous avons mentionné dans l’article inclus dans ce mémoire (chapitre 3) la
durée de vie restreinte des souris IL-21 Tg. Afin de déterminer si la cause de la
mortalité était reliée au défaut hématopoïétique observé chez la souris IL-21 Tg. nous
avons effectué des expériences de greffe de la MO chez des souris receveuses après
irradiation létale (1200 rads) (Tableau VI). De façon intéressante, toutes les souris
transférées avec de la MO provenant de souris IL-21 Tg (sauf 2 provenant de la greffe
2) sont décédées plus ou moins 25 jours après le transfert alors que les souris ayant
reçu de la MO contrôle se portaient très bien (> 90 jours). Nous avons analysé le
phénotype des souris irradiées et reconstituées avec la MO Tg comparativement à
celui de la souris Tg donneuse et d’un contrôle (Figure 12). À noter, la souris contrôle
utilisée est une souris sauvage, et non une receveuse de MO normale, ce contrôle
n’ayant pas été fait lors de la première greffe. De plus, les souris ayant reçu la greffe
de MO IL-21 Tg à la troisième expérience sont mortes durant la nuit, nous empêchant
de faire toutes les analyses. Après analyse d’une souris receveuse de MO Tg de la
greffe 1, nous remarquons que son profil FSC/SSC est très semblable à celui de la
souris IL-21 Tg donneuse (Figure 12). De plus, nous observons une accumulation de
91
cellules myéloïdes (CD11bGr-1) chez la souris receveuse de MO de la souris IL-21Tg. Le développement des lymphocytes B semble aussi absent compte tenu de laperte de la population des progéniteurs B (B220IgM), phénotype similaire à celuiobservé chez les souris IL-21 Tg. L’érythropoïèse est aussi diminuée chez la sourisreceveuse, car on retrouve environ 20% de cellules Terll9 dans une MO contrôle.Ces résultats démontrent que le défaut hématopoïétique est responsable de la viabilitéréduite des souris IL-21 Tg, sûrement via une réduction dans l’érythropoïèse causantune anémie, puisque la majorité de l’espace est occupé par des cellules de la lignéemyéloïde.
Pour les souris receveuses de la greffe 2 (Tableau VI), nous avons attendu queles souris receveuses de MO provenant de souris IL-21 Tg aient des signes defaiblesse, symptômes utilisés pour décider quand euthanasier une souris IL-21 Tg.Ces souris sont restées en santé pendant au moins 3 mois. Nous avons décidé de leseuthanasier afin de voir si un phénotype hématopoïétique se développait. Nous avonsobservé que leur MO présentait un profil identique à celui retrouvé chez la souriscontrôle (résultat non montré). La souris IL-21 Tg ayant servi de donneur de MOn’avait pas un phénotype complet. La MO ne présentait pas une accumulation decellules myéloïdes et l’érythropoïèse était normale. Seul le développement deslymphocytes B était altéré (absence de progéniteurs B).
Tableau VI. Greffes de MO provenant de souris IL-21 Tg.Greffe et âge des souris Âge des souris Taux de
survie wtIL-21 Tg receveuses à leur mort IL-21 TgGreffe 1 (144 jours) Entre 25 et 30 jours 0/4 4/4Greffe 2 (35 jours) >100 jours 2/2 2/2Greffe 3 (62 jours) 25 jours 0/4 4/4
92
figure 12. La reconstitution hématopoïétique suite à une greffe de MOde souris IL-21 Tg recréé te phénotype des souris IL-21 Tg chez tasouris receveuse. La MO de souris IL-21 Tg ou contrôle a été transféréedans des hâtes irradiés de façon létale (1200 rad). Les souris ayant reçula MO Tg sont décédées au jour 25 post-transfert. Les résultats desmarquages de la MO avec des Ac anti-CD11b, anti-Gri, anti-B220, antiIgM et Teri 19 sont montrés. Malheureusement, le marquage Terl 19 n’apas été effectué sur la souris IL-21 Tg et son contrôle durant cetteexpérience.
4.2.3 Détermination de l’expression de I’IL-21R par les progéniteurs
hématopoïétique s
Compte tenu du phénotype hématopoïétique observé chez les souris IL-21 Tg
et prenant en considération que l’expression de l’IL-21R n’a jamais été caractérisée
chez les précurseurs de la MO, nous avons voulu étudier quelle(s) population(s) de la
MO expriment le récepteur à l’IL-21. Les expériences ont été conduites dans la
logique où l’accumulation de cellules myéloïdes doit résulter d’un effet de l’IL-21 sur
la survie et/ou la prolifération de l’un ou plusieurs des stades de maturation présents
CD11b
Terll9
93
ACellules myéloïdes
mawres
IL-21R
—: IL-21FcrIL-21 + IL-21Fc
B
C
+
FSC
Progéniteursmyéloïdes
—: IL-2lFc— rIL-21 + IL-21 Fc
IgG humain
—: IL-21R—: rIL-21
lgG humain
D—; IL-21R—: CCL-19fc
: IgG humain
figttre 13. Expression de t’IL-21R par tes cellules myéloïdesmatures et tes précurseurs hématopoïétiques de la MO. Nous avonsétudié l’expression de l’IL-21R en cytométrie en flux par les cellulesmyéloïdes matures (A), les progéniteurs myéloïdes (B), lesprécurseurs lymphoïdes sans enrichissement en progéniteurs (C) ouavec enrichissement (déplétion des cellules matures Lin parséparation magnétique) (D) provenant de souris B6. Les progéniteursmyéloïdes (CMP, GMP et MEP) ont été identifiés par les régions 1(LiniL7RcCfSCh1) et 2 (c-Kit hlSca.1) Les CLP proviennent desrégions 3 (LiniL-7RŒ) et 4 (cKitb0Sca1t0). L’IL-21R a été détectéavec une protéine de fusion IL-2lFc humain révélée avec un anti-humain IgG Fc spécifique. Dans le panneau D, la protéine de fusionCCL19-fc (chémokine se liant au CCR7, absent dans la MO) a étéutilisée comme second contrôle isotypique. n 5 pour les progéniteursmyéloïdes, n 1 pour CLP sans déplétion, n 2 pour CLP avecdéplétion.
94
dans cette lignée de différenciation. L’accumulation de cellules myéloïdesCD11bGr-1 dans la MO IL-21 Tg nous a amené à vérifier l’expression de Ï’IL-21Rsur la population myéloïde mature provenant de souris B6 (Figure 13A). Min des’assurer de la spécificité de notre protéine de fusion (IL-21Fc) pour l’IL-21R, nousavons effectué un essai de compétition avec le rIL-21. Ce dernier devrait bloquer lesrécepteurs à FIL-21, empêchant l’IL-21fc de s’y fixer, nous donnant donc uncontrôle négatif pour l’expression de l’IL-21R. La figure 13A illustre l’absence del’expression d’IL-21R sur les cellules myéloïdes, suggérant que l’accumulation decelles-ci ne résulte pas d’un effet de prolifération direct sur cette population. Parcontre, il était possible que l’accumulation de cellules myéloïdes provienne d’un effetsur les progéniteurs donnant naissance aux cellules de la lignée myéloïde (CMP etleurs descendants). Nous avons donc évalué par cytométrie en flux l’expression del’IL-21R sur les progéniteurs myéloïdes (LinIL7Rc(cKithiScafl. La figure 13Bmontre l’absence d’expression de l’IL-21R sur les progéniteurs myéloïdes.
L’absence d’expression du récepteur à l’IL-21 sur les cellules de la lignéemyéloïde nous a amené à émettre une autre hypothèse. Il a été démontré quel’expression ectopique de certains récepteurs de cytokine en combinaison avec leurligand permettait de reprogrammer le développement des progéniteurs lymphoïdesvers la lignée myéloïde 165,211 Nous avons donc émis l’hypothèse que lasurexpression d’IL-21 pouvait convertir la différenciation des CLP vers la lignéemyéloïde, si ceux-ci expriment l’IL-21R. Nous avons donc évalué l’expression del’IL-21R sur les CLP, ces derniers étant LinIL7Rci1cKitb0Sca1b0. Cette expérience
a été effectuée avec une suspension cellulaire de MO enrichie (les cellules maturesont été enlevées par sélection magnétique) ou non en progéniteurs (Figure 13C et D).Lors de l’expérience sur la MO complète, nous avons détecté un faible niveaud’expression de l’IL-21 R sur les CLP (Figure 13C). De façon étrange, nous avonsperdu ce signal lorsque nous avons enrichi la MO en précurseurs grâce à unedéplétion des cellules Lin. Ceci est peut-être dû à l’augmentation du bruit de fonddans les marquages (comparer les figures 13C et D). D’autres expériences demarquages devront être effectuées. Afin d’essayer de réconcilier les résultats
95
contradictoires concernant l’expression de l’IL-21R, nous avons évalué l’expressiondu messager de l’IL-21R. Les précurseurs lymphoïdes et myéloïdes ont été triés etanalysés pour la présence de l’ARNm de l’IL-21R par transcription inverse et PCR(Figure 14).
A B
Q o. Contrôles-J
IL-21R
HPRT
figure 14. Évaluation de l’expression du récepteur à t’IL-21 par tes précurseurshématopoïétiques. La MO de quatre souris B6 a été prélevée et enrichie en précurseurshématopoïétiques grâce à une déplétion des cellules matures Lin. (A) Stratégie utilisée pourtrier les CLP et les progéniteurs myéloïdes. Pour les CL?, nous avons trié les cellules c-Kitlo etSca1I0 (région 3) provenant de la fenêttre 1 (région 1, LiniL-7RŒ) tandis que les progéniteursmyéloïdes (incluant les CMP, GMP et MEP) ont été triés en utilisant tes régions 2 (LiniL-7Rcc) et 4 (c-Kit et Sca-l.). Les cellules (20000) ont été triées directement en TRIzol afind’extraire l’ARN. (B) Expression de l’ARNm de l’IL-21R par les CLP. Une RT-PCR a étéeffectuée avec des oligonuctéotides spécifiques pour l’IL-21R. HPRT a été utilisé commecontrôle interne alors que des cellules de ganglions et un contrôle eau ont servi de contrôlepositif et négatif, respectivement.
Nous pouvons voir de façon très claire le messager de l’IL-21R chez les CLP.Cependant, il est moins abondant que dans les cellules totales provenant de ganglions.Ceci suggère que la densité de l’IL-21R sur les CLP est très réduite. Confirmant lesrésultats obtenus par cytométrie en flux, on note l’absence d’IL-21R dans lapopulation myéloïde. Ces résultats suggèrent que l’IL-2l, lorsqu’en grandesquantités, pourrait agir sur les CLP qui expriment l’IL-21R et, par un mécanismeinconnu, induire l’accumulation de cellules myéloïdes au détriment des celluleslymphoïdes.
CHAPITRE 5.
DISCUSSION
97
De nombreuses cytokines de type I appartenant à la famille Yc régulent
différents aspects de la réponse immunitaire. Leurs rôles variés incluent la survie des
lymphocytes, que ces derniers soient naïfs ou mémoires, leur prolifération et
différenciation ainsi que leur apoptose. Considérant l’importance considérable de ces
cytokines Yc dans la réponse des cellules T in vivo et le fait que l’IL-21, le plus récent
membre de la famille Yc, induit la survie des lymphocytes T in vitro, nous avons émis
l’hypothèse suivante la surexpression de l’IL-21 in vivo permettra la survie des
cellules T. Ainsi, nous nous attendons à ce que l’IL-21 participe à l’homéostasie des
lymphocytes T en induisant leur génération et/ou leur survie. Afin de vérifier cette
hypothèse, nous avons généré un modèle murin surexprimant l’IL-21 sous le contrôle
du promoteur de CMH de classe I ainsi que d’une séquence amplificatrice des 1g. Le
résultat le plus surprenant est que les souris IL-21 Tg ont une espérance de vie très
limitée. De plus, les souris IL-21 Tg se divisent en deux groupes: le premier groupe a
une espérance de survie d’un maximum de 3 semaines et présente un défaut
hématopoïétique caractérisé par l’accumulation de cellules de la lignée myéloïde aux
dépens des lignées érythroïdes et lymphoïdes au niveau de la MO. Min de déterminer
sur quelle(s) population(s) de précurseurs hématopoïétiques ou de cellules matures
agissait l’IL-21, nous avons vérifié la(les)quelle(s) de ces populations exprimai(en)t
l’IL-21R. Nous démontrons que ce récepteur est exprimé par les CLP et absent sur les
cellules myéloïdes, progénitrices ou matures. Le deuxième groupe de souris IL-21 Tg
englobe toutes les autres souris (survie > 3 semaines) qui démontrent une
accumulation de cellules TM. Nous avons par ailleurs confirmé que l’IL-21 permettait
la survie de lymphocytes CD8 activés/mémoires in vitro, effet absent chez la
population homologue CD4. Nos résultats suggèrent que l’IL-21 participerait
activement à la génération et/ou la survie des lymphocytes T ayant un phénotype
mémoire. De plus, nous révélons un rôle inattendu de l’IL-21 dans la régulation de
l’hématopoïèse. Les sections suivantes ont pour but de discuter les hypothèses
conduisant à la compréhension du phénotype mémoire et hématopoïétique observé
chez la souris IL-21 Tg.
98
5.1 ACCUMULATION DE LYMPHOCYTES T PR1SENTANT UN
PHÉNOTYPE MÉMOIRE
La forte représentativité de lymphocytes T exprimant un phénotype mémoire
est observée surtout chez les souris dont la longévité dépasse 20 jours. En effet, chez
les souris plus jeunes, la proportion occupée par les cellules T dans la rate et les
ganglions est très faible (entre 1% et 5%), donc aucun phénotype n’est visible, Nous
avons démontré que ces cellules ont les capacités fonctionnelles typiques des
lymphocytes T mémoires en termes de production d’IfN-y suite à une courte
stimulation via le RCT et de prolifération suite à un stimulus mitogénique. De plus,
nous avons vérifié que le répertoire des lymphocytes T était oligoclonal afin
d’éliminér la possibilité que l’accumulation de cellules mémoires ne soit le fruit de la
prolifération excessive d’un ou de quelques clones spécifiques. Cependant, comment
expliquer cette accumulation de lymphocytes T mémoires aux dépens des cellules T
naïves, alors que l’IL-21 est connue pour induire la survie de ces dernières 10$?
Plusieurs hypothèses ont été développées et sont décrites dans les sous-sections
suivantes. Nous discuterons des possibilités suivantes:
• augmentation du nombre de cellules TE spécifiques à l’Ag
• disponibilité accrue de cytokines permet à la niche des
lymphocytes T mémoires de s’élargir
• diminution de la sensibilité des TE à l’AICD
• augmentation du taux d’auto-renouvellement des lymphocytes
T mémoires
• induction de Bd-6 chez les lymphocytes T CD$
• prolifération homéostatique des lymphocytes T
• effet de l’IL-21 sur l’expression de récepteurs importants dans
la survie des lymphocytes T naïfs et activés/mémoires
99
5.1.1 Augmentation du nombre de cellules TE spécifiques à 1’Ag
Le groupe de Zeng et al. a observé que l’IL-21 et l’IL-15 agissaient de façon
synergique dans l’expansion des lymphocytes CD8 activés/mémoires in vitro 106
Lors de la rencontre avec un pathogène, l’IL-21 pourrait permettre la génération
accrue de lymphocytes TE et/ou induire leur survie (Figure 15A). En effet, il a déjà
été démontré que l’IL-21 induisait un plus grand nombre de cellules T1 spécifiques à
un Ag donné in vitro 106 et in vivo 262 De plus, nous savons que le nombre de cellules
TM dépend du nombre de T1 qui ont été générés lors de la réponse immunitaire La
quantité élevée de cellules T mémoires pourrait donc provenir de la différenciation
des cellules T effectrices présentes de façon plus importante chez la souris IL-21 Tg,
en accord avec le modèle linéaire de différenciation des cellules T mémoires 4448rn Il
se pourrait que la rencontre d’Ag environnementaux chez la souris IL-21 Tg génère
les lymphocytes TM observés. Nous pourrions tester cette hypothèse en immunisant
une souris IL-21 Tg avec un virus. Au pic de la réponse, il serait possible d’identifier
les lymphocytes T spécifiques à l’un des peptides codés par le virus grâce à
l’utilisation de tétramères (tétramère de molécules de CMII couplées au peptide codé
par le virus). Nous pourrions comparer la proportion occupée par les cellules T
spécifiques chez la souris IL-21 1g versus un contrôle C57BL/6. D’autres souris
immunisées avec le virus seraient utilisées pour observer le développement de
cellules T mémoires spécifiques à ce virus. Nous pourrions alors comparer si la
génération de TM spécifiques au virus chez la souris IL-21 Tg est plus élevée que
chez le contrôle.
Cependant, ceci n’explique pas pourquoi les cellules T mémoires débordent
de leur niche et occupent la majorité de l’espace attribué aux lymphocytes T naïfs.
Ceci sera discuté dans la section suivante.
100
5.1.2 Disponibilité accrue de cytokines permet à la niche des lymphocytes T
mémoires de s’élargir
L’IL-7 et l’IL-15 sont importantes dans la survie des lymphocytes T naïfs et
mémoires ainsi que dans l’auto-renouvellement des cellules CD$ TM (pour l’IL-15).
Notre laboratoire a démontré que l’IL-21 induisait aussi la survie des lymphocytes T
naïfs ainsi que celle des cellules CD$ TM. Les modèles murins 1g pour ces cytokines
doivent donc comporter certaines similitudes. La souris IL-7 Tg démontre un
accroissement dans le nombre de lymphocytes T et B de 10-20 fois dans les organes
lymphoïdes secondaires 143 Cette augmentation au niveau des cellules T est plus
prononcée chez les CD$ que chez les CD4 et la majorité (55-70%) des cellules
CD8 arborent un phénotype mémoire. Ces cellules TM sont fonctionnelles et
semblent résulter d’une prolifération homéostatique en réponse aux peptides du soi.
Chez la souris IL-15 1g ou injectée avec l’IL-15, il y a aussi présence d’une
expansion préférentielle des lymphocytes CD$ qui possèdent un phénotype mémoire64,281-283 De plus, l’immunisation des souris IL-15 Tg avec un virus amène la
génération d’un nombre supérieur de lymphocytes T CD$ mémoires 132,283 Les
lymphocytes T de la souris IL-15 1g produisent de plus grandes quantités d’ IFN-y.
Fait intéressant, il y a diminution de l’apoptose chez les cellules T IL-15 1g induite
par l’AICD in vitro 282 L’ajout d’un Ac dirigé contre l’IL-15 restaure la sensibilité
des lymphocytes T à l’AICD. Ceci est en accord avec le rôle positif connu de l’IL-lS
sur l’auto-renouvellement et la survie des lymphocytes CD8 TM73,101•
Les phénotypes mentionnés précédemment ressemblent beaucoup à ce qui est
observé chez la souris IL-21 1g concernant l’accumulation de lymphocytes T ayant
un phénotype mémoire ainsi que les propriétés de ceux-ci. Normalement, la
génération de nouvelles cellules T mémoires devrait remplacer certains clones déjà
présents dans le réservoir mémoire, gardant le nombre de lymphocytes TM stable 138
Par contre, dans les deux modèles 1g décrits plus haut, une accumulation de cellules
TM a été observée. L’IL-7 et l’IL-15 régulent la survie et l’auto-renouvellement des
lof
lymphocytes ‘M CD4 et CD8, respectivement, et leur surexpression permet
l’accumulation de cellules T mémoires CD8. Nous pourrions émettre l’hypothèse
que la disponibilité accrue de ces cytokines permet à la niche des lymphocytes TM de
s’agrandir, entraînant une croissance dans le nombre de cellules T mémoires. Compte
tenu que la souris IL-21 1g contient aussi un nombre élevé de lymphocytes TM CD8
et que nous démontrons que l’IL-21 induit leur survie 107 il serait possible alors que
la niche des cellules T mémoires soit élargie chez la souris IL-21 Tg. En effet, les
lymphocytes CD8 TM pourraient utiliser l’IL-7, l’IL-15 ou l’IL-21, cette dernière
étant la plus abondante dans la souris IL-21 Tg.
5.1.3 Diminution de la sensibilité des cellules TE à I’MCD
Nous avons démontré que l’IL-21 permet la survie des lymphocytes CD8 TM,
mais ceci ne pourrait pas expliquer le nombre très important de ces cellules chez la
souris IL-21 Tg. En effet, l’IL-21 induirait la survie des cellules T mémoires
présentes dans l’organisme, ce qui correspond à un certain pourcentage du nombre
total de lymphocytes T. Cependant, chez la souris IL-21 1g, la très grande majorité
des lymphocytes T CD8 et une partie des CD4 présentent un phénotype mémoire,
ce qui indique qu’un mécanisme autre que la survie doit entrer en action afin
d’augmenter le réservoir de lymphocytes T mémoires.
Une autre hypothèse expliquant l’accumulation de cellules T mémoires se
base sur la démonstration que la culture de cellules T CD3 avec l’IL-21 diminue
l’expression de CD25 (chaîne Œ du récepteur à l’IL-2) et CD122 (chaîne 13 des
récepteurs à l’IL-2 et à l’IL-15) induite par l’IL-15 in vitro 10$ Nous pourrions
imaginer un scénario où, suite à l’élimination du pathogène, l’action de l’IL-21 aurait
diminué l’expression de l’IL-2RŒ et l’IL-2R13. Lors de la phase de contraction induite
par l’IL-2, les cellules ‘E seraient donc moins sensibles à l’action de celle-ci. Puisque
l’IL-2 induit normalement la mort par apoptose des cellules ‘E suite à l’élimination
du pathogène, cette situation se produirait de façon moindre dans la souris 1g IL-21,
conséquence de la diminution de l’expression de l’IL-2R. Ceci amènerait donc un
102
plus grand nombre de cellules TE à survivre durant la phase de contraction, donc uneaugmentation parallèle du nombre de lymphocytes TM (Figure 15B). Il serait possiblede vérifier cette hypothèse en immunisant une souris IL-21W’ 108 avec un virus. Ladétection des lymphocytes T spécifiques s’effectuerait grâce à un tétramère contenantl’un des peptides encodés par le virus. En connaissant la cinétique de la réponseimmunitaire au virus utilisé, il serait possible de vérifier, par marquage à l’annexineV, la proportion de lymphocytes T spécifiques au peptide qui sont en apoptose. Sil’IL-21 diminue vraiment la sensibilité des cellules TE à l’AICD, nous devrionsobserver un nombre plus important de cellules apoptotiques dans la souris IL-21W’que dans la souris normale.
D’un autre côté, il serait possible que l’absence de signalisation via l’IL-21Rne provoquerait pas plus d’apoptose des cellules ‘E que chez la souris contrôle si1’IL-21 ne fait qu’empêcher la mort des cellules TE. Nous pourrions donc effectuercette expérience chez les souris IL-21 Tg qui devraient présenter moins de cellules TE
annexine V par rapport à la souris contrôle. Un travail récent en faveur de cettehypothèse démontre que le transfert de lymphocytes T naïfs spécifiques à un peptideexprimé par une tumeur suivi d’injections d’IL-21 abolit la phase de contraction etpermet la génération et le maintien d’une population T mémoire spécifique à longterme 277 De plus, les lymphocytes T CD4 de la souris IL-15 Tg ont été démontréscomme étant résistants à I’AICD, phénomène qui pourrait se produire aussi chez lasouris IL-21 282
5.1.4 Augmentation du taux d’auto-renouvellement des lymphocytes mémoires
Un autre mécanisme par lequel l’IL-21 pourrait augmenter le réservoir deslymphocytes TM serait d’augmenter le taux d’auto-renouvellement de ces derniers(normalement, la demi-vie des TM humains se situe entre 22 et 79 jours 89) (Figure
15C). Une façon simple de vérifier cette possibilité serait d’étudier l’incorporation debromodeoxyuridine (BrdU) chez une souris IL-21 Tg. Cet analogue de bases’incorpore dans l’ADN lors de la prolifération cellulaire et peut être détecté à l’aide
103
d’un Ac nti-BrdU. Cette expérience pourrait aussi être effectuée chez une sourisnormale à qui on aurait injecté du rIL-21. L’objectif serait de voir si l’incorporationde BrdU est présente chez une plus grande proportion de lymphocytes TMcomparativement à une souris contrôle non-Tg ou injectée avec du PBS. Finalement,il est connu que l’IL-15 participe activement au maintien des lymphocytes CD8 TM
in vivo en agissant sur l’auto-renouvellement de ces derniers 115,140 De plus, la culturede cellules triées marquées au CFSE en combinaison avec l’IL-15 etl’IL-21 entraîne une division plus rapide des cellules (majorité de celles-ci sont CFSEnégatives) qu’avec l’IL-15 ou 1’IL-21 seule après une même période de temps 106rn
L’IL-21 seule ne semble donc pas promouvoir la division des lymphocytes CD8 TM
in vitro. Afin de vérifier in vivo si l’auto-renouvellement accru potentiel chez lasouris IL-21 Tg résulterait de l’action de l’IL-21 seule ou nécessiterait l’effetconcomitant de l’IL-15 in vivo, nous pourrions effectuer les essais d’incorporation deBrdU chez une souris IL-15’ à qui nous aurions injecté de l’IL-21 ou la croiser avecune souris IL-21 1g. Cette même expérience pourrait être conduite chez une souris
IL-15R&.
5.1.5 Inductïon de l’expression Bd-6 chez les lymphocytes T CD8
L’accumulation de lymphocytes T CD8 mémoires chez la souris IL-21 Tg
pourrait aussi être provoquée par l’induction de l’expression d’un facteur de
transcription contrôlant le développement et/ou le maintien des lymphocytes CD$
TM suite à la signalisation via le récepteur de l’IL-21. Jusqu’à maintenant, le seul FT
connu pour influencer le développement et l’auto-renouvellement des cellules T
CD8 mémoires est le répresseur transcriptionnel Bd-6 2$4,285 Le groupe de Ichii etal. a démontré que Bd-6 était important dans la génération et le maintien delymphocytes T CD8 mémoires 284 surtout au niveau des cellules CD8 TMC puisque
la proportion occupée par ces dernières dans la rate corrèle avec l’expression de Bd-6chez les cellules T 285 Bd-6 est un répresseur transcriptionnel exprimé de façonubiquitaire, mais est prédominant dans les centres germinatifs des cellules B 286-288rn
Afin de démontrer le rôle de Bd-6 chez les lymphocytes CD8 mémoires, Ichii et al.
104
ont utilisé un modèle murin déficient pour l’expression de Bel-6 (Bcl-6j
comparativement à un modèle Tg (tck-Bc16, où le promoteur lck conduit l’expression
de Bel-6 dans les lymphocytes T 289) et à une souris sauvage 284 Après immunisation
avec un peptide, les lymphocytes T mémoires de la souris Bel-6’ ont disparu de
façon rapide (4 semaines) alors que ceux de la souris sauvage se maintenaient. Chez
la souris Tg Bel-6, une augmentation du nombre de cellules CD$ TM spécifiques
était évidente 284 D’autre part, un essai d’incorporation de BrdU par les lymphocytes
CD8 ‘M de la souris 1g Bel-6 a démontré que trois fois plus de cellules étaient en
cycle cellulaire comparativement à une souris sauvage 265 Ces résultats soutiennent
donc un rôle très important pour Bel-6 dans la génération, le maintien et la
prolifération des lymphocytes T CD8 mémoires et expliquent pourquoi nous nous
attardons plus à ce FT. De plus, il a été démontré que l’IL-21 induisait l’expression
du messager de Bel-6 chez les lymphocytes B 270 On pourrait penser que la
signalisation du complexe IL-21/IL-21R entraîne aussi la transcription de Bel-6 dans
les cellules T CD8 (Figure 15D). Vu sous cet angle, la présence d’un Ag chez la
souris IL-21 1g entraînerait une réponse immunitaire, puis une phase de contraction
où les cellules TE meurent par apoptose. La présence d’IL-21 en grande quantité
permettrait d’induire l’expression de Bel-6 chez une grande partie des cellules
effectrices, conduisant à la génération d’un nombre plus élevé de I. De plus, Bel-6
étant toujours activé par l’IL-21, son expression constante permettrait le maintien et
la prolifération des cellules CD8 mémoires générées, similaire à ce qui est observé
chez la souris 1g lck-Bc16. D’un autre côté, il serait possible qu’une réponse
antigénique ne soit pas nécessaire dans l’induction de l’expression de Bel-6 chez les
lymphocytes T CD8. La signalisation constitutive de l’IL-21R par son ligand dans
un contexte sans infection chez la souris IL-21 Tg pourrait induire l’expression de
Bel-6 chez les cellules T CD$, les entraînant à se différencier en cellules T
mémoires. Des résultats en faveur de cette hypothèse démontrent que STAT5 régule
l’expression de Bel-6 chez les lymphocytes B humains 290 L’IL-21 a été démontrée
comme recrutant STAT5 chez une lignée de cellules T leucémiques humaines 249
Ceci pourrait être testé en cultivant des lymphocytes T CD$ naïfs avec de l’IL-21
105
B ContractionIL-2
1L-2
Ag + IL-21
Cellules T mémoires
C
___ ___
IL-21
Cellules T mémoires Cellules T mémoires
F
_
Cellule T naiveILL 1
Cellule T nawe
IL-7Ru lL-7Ra
dtdCellule CD4 TM
IL-2 1 Cellule CD4 ‘M
lL-2R13 IL-7Ru IL-2R13
Cellule CD8 TMIL-2 1 Cellule CD8 TM
figure 15. Modèles proposés afin d’expliquer l’accumulation de lymphocytes T ayant unphénotype mémoire dans ta souris IL-21 Tg. L’accumulation de cellules mémoires, plusparticulièrement des CD$ TM, peut être le résultat de plusieurs mécanismes impliquant l’IL-21.(A) L’IL-2 1 a été démontré comme co-stimulant la prolifération de cellules TE spécifiques à un Agdonné. (B) L’expression de l’IL-2RŒ et IL-2Rf3 est diminuée par l’IL-2 I sur les lymphocytes T.Cela pourrait causer une insensibilité à l’AICD lors de la phase de contraction. L’IL-2 1 pourraitaussi directement induire la survie des TE. (C) L’IL-2 1 induit la survie des CD$ TM in vitro, maispourrait induire leur auto-renouvellement seul ou en combinaison avec l’IL- 15. (D) L’IL-2 1 induitBel-6 chez les lymphocytes B. Il serait possible qu’il en soit de même chez les cellules T CD$. (E)L’accumulation de lymphocytes ayant un phénotype mémoire est peut-être le résultat d’uneprolifération homéostatique des cellules T naïves lorsqu’elles arrivent en périphérie. (F) La pertedes cellules naïves peut être expliquée par la diminution de l’expression de l’IL-7Ra induite parl’IL-21, causant la mort de celles-ci. Les lymphocytes CD4 et CD$ TM survivent grâce aumaintien du récepteur à Ï’IL-7 ou via l’IL-15, respectivement.
A Ag
Cellules T effectrices
Cellules T effectrices
D
E
L-21
o)eCellule T effectrice Cellule T mémoire
IL-7Ra
Cellules T mémoires
106
afin d’observer s’il y a induction de l’expression de Bel-6 ainsi qu’en vérifiant
l’expression de Bel-6 chez la souris IL-21 Tg.
5.1.6 Prolifération homéostatique chez la souris IL-21 Tg
Les hypothèses précédentes expliquent les différentes possibilités causant
l’accumulation de lymphocytes T mémoires dans la souris IL-21 Tg. Cependant, il est
à noter que non seulement la proportion de cellules mémoires augmente, mais qu’elle
prend presque toute la place dans les organes lymphoïdes secondaires. En effet, le
nombre de lymphocytes T mémoires équivaut presque à celui du nombre total de
lymphocytes T dans les ganglions et la rate. Le phénotype remarqué chez la souris
IL-21 Tg n’est donc pas dû seulement à une accumulation de cellules mémoires, mais
aussi à la disparition des cellules naïves. Un phénomène pouvant expliquer à la fois la
perte de cellules T naïves et l’accumulation de lymphocytes TM est la prolifération
homéostatique. Ce mécanisme opère lorsque l’espace en périphérie alloué aux
lymphocytes T n’est pas plein, comme chez la souris lymphopénique Rag’. En
situation de lymphopénie, les lymphocytes T prolifèrent de façon à remplir l’espace
disponible. Pendant ce processus de prolifération homéostatique, les lymphocytes T
naifs acquièrent un phénotype de cellules T mémoires fonctionnelles et ce, en
absence d’Ag 71,72
Cette différenciation des cellules T naives en mémoires pourrait donc
expliquer l’accumulation de lymphocytes T mémoires dans la souris IL-21 Tg. Des
évidences du groupe de King et al. démontrent que l’IL-21 pourrait être une molécule
favorisant la prolifération homéostatique in vivo (Figure 15E) 273 Ceci est basé sur
l’observation que la souris NOD (modèle de diabète autoimmun) est lymphopénique
et que le gène de l’IL-21 est présent dans le locus de susceptibilité au diabète de type
I Idd3. De plus, les niveaux du messager de l’IL-21 dans les lymphocytes T
provenant de la souris NOD sont 4 à 7 fois plus élevés que chez la souris contrôle
contenant le locus Idd3 protecteur d’une souris 36. Une plus grande proportion des
cellules T activées/mémoires exprimant l’IL-21R dans la souris NOD prolifèrent, ce
107
qui suggère que la signalisation de 1’IL-21 via son récepteur induit les lymphocytes I
à proliférer. Ceci induirait donc la prolifération homéostatique. Cependant, quelques
évidences vont à l’encontre de cette hypothèse. Premièrement, nous avons effectué
une expérience qui reproduit la prolifération homéostatique in vitro. En effet, la
culture de DC avec des lymphocytes T marqués au CFSE permet de recréer
l’expansion homéostatique en combinaison avec l’IL-7. En cultivant les cellules T
avec I’IL-21, nous avons remarqué l’absence de prolifération homéostatique in vitro
comparativement à l’IL-7 (résultat non montré). Deuxièmement, la prolifération
homéostatique ne rétablit pas le nombre de cellules retrouvé dans les organes
lymphoides secondaires des souris normales 85,291-294 Au contraire, notre souris IL-
21 1g démontre une cellularité dans la rate et les ganglions lymphatiques équivalente
à celle des souris non-1g. Aucune indication ne nous permet de penser que la souris
IL-21 1g a été ou est lymphopénique. Nous pourrions évaluer si la lymphopénie est
présente chez la souris IL-21 Tg en lui transférant des lymphocytes I préalablement
marqués au CFSE ayant un RCT 1g, de façon à pouvoir les reconnaître. Nous
pourrions comparer la prolifération des cellules T transférées observée chez la souris
IL-21 1g avec celle obtenue chez une souris non-1g. Cependant, les souris IL-7 1g
présentent une accumulation de lymphocytes T et pourtant, l’accumulation de
lymphocytes I CD8 ayant un phénotype mémoire est due à la prolifération
homéostatique 143 En effet, il a été démontré que l’abondance d’IL-7 amplifiait la
reconnaissance de complexes CMH: peptide du soi par les cellules T naïves. Ces
démonstrations suggèrent que la reconnaissance d’un complexe CMH: peptide du soi
par le RCT d’une cellule T naïve en présence d’IL-7 permet la survie de la cellule. En
cas d’abondance d’IL-7, le contact du RC1 est augmenté, entraînant les cellules 1
naïves à proliférer et se différencier en cellules I mémoires Ii se pourrait que
I’IL-21 fasse de même, ce qui confinnerait l’hypothèse de la prolifération
homéostatique.
108
5.1.7 Effet de I’IL-21 sur l’expression de récepteurs importants dans la surviedes lymphocytes T naïfs et activés/mémoires
La cytokine essentielle à la survie des lymphocytes T naïfs CD4 et CD8 estl’IL-7. De plus, l’IL-7 est perçue comme étant le joueur limitant dans l’espacepériphérique accordé aux cellules T, puisque ces dernières doivent rivaliser entre ellesafin de recevoir un signal de survie 68,295 D’autre part, le groupe de Park et al. adémontré que l’IL-7 ainsi que d’autres membres de la famille des cytokines Yc (l’IL
21 n’a pas été étudié) inhibaient l’expression de l’IL-7Ra au niveau transcriptionnel296 Notre laboratoire a démontré que l’IL-21 était aussi une cytokine pro-survie pourles lymphocytes T naïfs 107 De façon intéressante, les cytokines ayant le plus d’effetsur l’expression de l’IL-7RŒ sont celles sécrétées lors d’une réponse immunitaire (IL2, IL-4, IL-6 et IL-15), donc plutôt absentes à l’état basal. Dans un organisme normalen absence d’infection, l’IL-21 ne serait produite que par les cellules stromales desorganes lymphoïdes secondaires. Cependant, dans la souris IL-21 Tg, elle estfortement présente peu importe la présence d’une infection ou non grâce aupromoteur du CMH de classe I. Nous avons démontré que l’IL-21 inhibait
l’expression de l’IL-7RŒ sur les cellules T naïves. Ceci pourrait expliquer la perte deces dernières dans la souris IL-21 Tg, vue leur grande dépendance vis-à-vis cettecytokine pour leur survie. En effet, l’effet de survie via l’IL-7 passe parl’augmentation de Bel-2, un facteur pro-survie, ainsi que par l’activation de la voieP13-K. L’IL-21 quant à elle maintien l’expression de Bel-2 et induit la cascade P13-K.La différence dans l’induction de la survie entre l’IL-7 et l’IL-21 réside donc dansleur action sur le niveau d’expression de Bel-2: la première induit Bd-2, la secondemaintien Bel-2. Puisque l’IL-21 est présente en plus grande quantité chez la sourisIL-21 Tg que l’IL-7, les cellules T ont donc plus de chance de recevoir un signal parl’IL-21, ce qui induit leur survie et inhibe l’expression de l’IL-7RcL. Il se pourraitqu’à plus long terme, l’effet de survie de l’IL-21 sur les lymphocytes T naïfs ait unimpact moindre que celui normalement généré par l’IL-7, causant la disparition descellules T naïves. De plus, l’IL-21 ayant été démontré comme inhibant la présence de
son propre récepteur, les cellules naïves n’exprimeraient ni l’IL-21R, ni l’IL-7Ra, ce
109
qui pourrait diriger les lymphocytes naïfs vers leur mort cellulaire (Figure 15F).Cependant, il nous reste à prouver que l’expression des récepteurs à l’IL-7 et à l’IL
21 est diminuée chez les lymphocytes T naïfs de la souris IL-21 Tg par cytométrie enflux et/ou RT-PCR semi-quantitatif.
Dans un autre ordre d’idée, la survie des lymphocytes T mémoires CD4 et
CD8 dépend de l’IL-15, pour les CD8, et de l’IL-7, pour les CD4 et CD8. De
façon intéressante, le récepteur à l’IL-7 est maintenu sur les CD4 TM et diminué sur
les cellules CD8 ‘M lors de la culture in vitro avec l’IL-21. Ces deux populations
peuvent survivre in vivo chez la souris IL-21 Tg, les cellules CD4 ‘M utilisant l’IL-7
et les CD8 dépendant surtout de l’IL-15 (Figure 15F). Cependant, l’expression de
l’IL-2Rf3 était réduite chez ces derniers. Ceci était inattendu compte tenu de
l’accumulation de lymphocytes T CD8 présentant un phénotype mémoire ainsi que
de l’importance de l’1L45 dans leur survie. Par contre, il a été démontré que
l’expression de l’IL-2R n’avait pas à être forte afin que l’IL-15 puisse induire la
survie de sa population cible 101 De plus, il existe une population de cellules CD8
TM qui est indépendante de l’IL-lS et porte un phénotype 297
Cette population est présente chez les souris IL-15 et IL-15W’. Il se pourrait donc
que l’IL-21 induise la prolifération et/ou la survie de ce groupe qui composerait la
majeure partie des lymphocytes T CD8 mémoires de la souris IL-21 Tg, ceci reste à
vérifier.
Finalement, le groupe de Kamimura et al. a soulevé un point intéressant
lorsqu’ils ont démontré qu’une troisième cytokine de la famille Yc pouvait utiliser
1’IL-2Rf3 afin d’induire l’expansion des cellules 298 Brièvement, ils
ont montré que ces lymphocytes se divisaient de façon normale dans une souris
déficiente en IL-15 à qui on avait injecté un Ac anti-IL-2. Par contre, cet auto
renouvellement était complètement aboli lors de l’ajout d’un Ac anti-IL-2R3,
impliquant qu’une troisième cytokine pouvait signaler via l’IL-2R13 et induire la
prolifération de CD8 ‘M. L’IL-21R étant connu pour partager beaucoup
d’homologie avec l’IL-2R3 (29% d’identité, 46% de similarité), l’IL-21 serait un bon
110
candidat conmie troisième cytokine utilisant l’IL-2R. Ceci pourrait même expliquer
pourquoi 1’IL-21 diminue l’expression de 1’IL-2R13 sur les cellules CD$ TM si ellel’utilise dans sa signalisation. Afin de vérifier cette hypothèse, nous pouffions utiliserles souris IL-15 et les injecter avec un Ac anti-IL-2 ainsi qu’un anti-IL-21. Il seraitpossible alors d’étudier l’auto-renouvellement des lymphocytes T CD8 TM chez lasouris IL-15 où l’IL-2 et l’IL-2l ne sont plus disponibles en présence ou non d’un
Ac anti-IL-2RÇ3. Si l’IL-21 est la 3 cytokine utilisant l’IL-2R3, il devrait y avoir
absence de division des cellules T CD8 chez les souris injectées avec I’Ac anti-IL-21
avec ou sans l’anti-IL-2R3.
Toutes les hypothèses décrites précédemment pourraient expliquer la cause del’accumulation de lymphocytes T ayant un phénotype mémoire chez la souris IL-21Tg. Cependant, certaines sont favorisées à nos yeux. Nous croyons que l’IL-21, parson abondance, augmente l’espace alloué à la niche des cellules T mémoires. Commeles lymphocytes TM dépendent de I’IL-7 et de l’IL-15 (pour les cellules T CD4 etCD8 respectivement), la présence de l’IL-21 permet aux lymphocytes CD8 TM deprendre plus de place, car ils ne dépendent plus seulement de l’IL-lS. Il serait trèspossible que l’IL-21, en plus de son rôle de survie chez les lymphocytes CD$mémoires, induise aussi l’auto-renouvellement de ces derniers. La perte concomitantedes cellules T naïves serait la conséquence de l’inhibition de l’expression durécepteur de l’IL-7 par l’IL-21 et/ou l’induction de l’expression de Bd-6 chez celles-ci. L’explication du phénotype mémoire observé chez la souris IL-21 Tg représentedonc un défi stimulant.
5.2 PHÉNOTYPE HÉMATOPOÏÉTIQUE CHEZ LA SOURIS IL-21 TG
Lors de la caractérisation du modèle murin surexprimant l’IL-21, nous avonsobservé la présence de deux phénotypes distincts chez les souris IL-21 Tg. Lepremier groupe avait une durée de vie ne dépassant pas 3 semaines alors que dans le2e groupe, la survie était supérieure à 3 semaines. La différence expliquant pourquoinous obtenons deux groupes de souris réside peut-être dans le site d’intégration du
111
transgène. En effet, chaque souris IL-2lTg pourrait présenter un site d’insertion du
transgène différent. Les séquences amplificatrices, inhibitrices ou promotrices se
trouvant dans les environs de l’insertion pourraient moduler l’expression
transgénique. De plus, il se pourrait que le transgène abolisse l’expression d’un autre
gène important, conduisant au phénomène hématopoïétique que nous avons observé.
Il serait donc intéressant de comparer la concentration en IL-21 du sérum des souris
IL-21 1g versus leur durée de vie afin de voir si une corrélation existe entre
l’espérance de vie de la souris IL-21 Tg et son niveau d’IL-21 sérique. Pour résumer,
le groupe 1 de souris IL-21 1g présente un défaut de lymphopoïèse dans la MO
puisqu’il y a absence de précurseurs B (B220igM) et cellules B matures
(B22OIgM). Les pro-B sont normaux dans la rate, mais on y note l’absence de
cellules B matures. Malheureusement, l’érythropoïèse n’a pas encore été analysée
chez ce groupe de souris IL-21 1g. L’absence de lymphopoïèse est aussi observée
dans la MO chez le groupe 2 de souris IL-21 1g. Il y a perte des précurseurs B et
moins de cellules B matures. Au niveau de la rate, nous voyons un nombre supérieur
de progéniteurs B et une diminution de cellules B matures. Les souris du groupe 2
possèdent une érythropoïèse réduite dans la MO qui semble compensée par une
accumulation d’érythrocytes dans la rate. Chez les deux groupes de souris IL-21 1g,
nous avons remarqué l’accumulation de cellules de la lignée myéloïde (CD11bGr-
1) dans la MO, cette sur-représentation étant massive dans la rate. La souris IL-21
1g présente un défaut hématopoïétique qui pourrait expliquer leur viabilité réduite.
Ainsi, nous avons procédé à une greffe de MO chez des souris syngéniques irradiées.
Lors de l’analyse de la souris receveuse, i.e. aux environs du jour 25 post-greffe où
elle montrait des signes de grande faiblesse, nous avons remarqué la présence de ce
même phénotype hématopoïétique. Ceci suggère donc que l’IL-21 régule
l’hématopoïèse et, lorsque présente en grandes quantités, cause la mortalité chez les
souris IL-2 1 1g due à un défaut dans le développement des progéniteurs
hématopoïétiques.
Les sous-sections suivantes présentent les différentes hypothèses afin
d’expliquer le rôle de l’IL-21 dans la régulation de l’hématopoïèse
112
5.2.1 Accumulation de cellules myéloïdes au détriment des ]ignées érythroïdes et
lymphoïdes
Comme nous avons observé une accumulation de cellules myéloïdes dans la
MO et la rate de la souris IL-21 1g, nous suggérons que l’IL-21 inhibe la
lymphopoïèse et l’érythropoïèse au profit de la myélopoïèse chez la souris IL-2 1 Tg.
L’absence de pro-, pre- et cellules immatures B dans la MO des souris IL-21 Tg
pourrait être causée par un effet toxique de I’IL-21 sur cette population. En effet, il
n’a pas été démontré que l’IL-21 était une cytokine produite de façon endogène par la
MO dans une souris sauvage. La forte présence d’IL-21 dans la MO de la souris IL-
21 Tg pourrait avoir comme conséquence la mort par apoptose de la lignée
lymphoïde B. Des évidences suggèrent que l’IL-21 induit l’apoptose chez les cellules
B naïves et activées de la rate tout en les stimulant à proliférer 253,266 Cependant, les
effets sur les cellules B de la MO ne sont pas connus. Nous pourrions étudier l’effet
de l’IL-21 sur la lignée lymphoïde B (pro-, pre-B, B immatures et matures) de la MO
par injection de rIL-21 à des souris sauvages ou tout simplement en cultivant des
lymphocytes B avec de l’IL-2l. En utilisant le marquage à l’annexine V, il serait
possible d’observer s’il y a apoptose chez les différents stades de maturation B causée
par l’IL-21 à différents temps.
La colonisation de la rate par les progéniteurs B dans la souris IL-21 Tg est
peut-être un mécanisme compensatoire ayant pour but d’améliorer l’homéostasie des
lymphocytes B en périphérie. Quoique surprenant, la présence de progéniteurs B dans
la rate IL-21 Tg a déjà été illustrée chez une souris surexprimant l’IL-7 sous le
contrôle du promoteur de CMH de classe 299,300 Cependant, l’IL-7 est connue pour
réguler le développement des lymphocytes B, ce qui n’est pas le cas de l’IL-21.
Toutefois, l’IL-21R est exprimé par les cellules B pendant leur développement, ce qui
pourrait suggérer un rôle de l’IL-21 dans le développement des lymphocytes B 107,253
De plus, un autre groupe a démontré la présence de cellules B immatures dans la rate
113
chez une souris IL-21 Tg 270 À la différence de notre souris, la souris IL-21 Tg
construite par ce groupe surexprime l’IL-21 humain.
La présence plus élevée d’érythrocytes dans la rate IL-21 Tg servirait aussi à
combler le manque laissé par leur absence dans la MO. En effet, des travaux
précédents suggèrent qu’une anémie causée par le manque d’érytbrocytes amène
l’hypoxie dans les tissus, induisant l’expression d’érythropoïétine (Epo) par les reins.
L’augmentation de la concentration sérique en Epo entraînerait les cellules de la MO
à migrer vers la rate où elles se différencient et prolifèrent 301,302 D’ailleurs, la rate
supporte très bien l’érythropoïèse 303• Il serait envisageable de prolonger la survie des
souris IL-21 1g en leur injectant de 1’EPO, ce qui inhiberait l’anémie présente et
pourrait prolonger la survie de celles-ci.
Afin de confirmer que 1’IL-2l inhibe la lymphopoïèse et l’érythropoïèse au
profit de la myélopoïèse chez la souris IL-21 Tg, nous pourrions cultiver les cellules
de la MO et/ou de la rate de celles-ci dans un milieu supportant le développement de
colonies pre-B (rIL-7), érythroïdes (SCF, érythropoïétine), ou myéloïdes (IL-3, IL-6,
SCF). En phénotypant et comptant le nombre de colonies obtenues dans chacun des
milieux, il nous serait possible de déterminer l’activité progénitrice des cellules de la
MO et ou/de la rate provenant de souris IL-21 1g pour chaque lignée. Min de vérifier
l’effet direct de l’IL-21 in vitro sur le développement de ces différents types de
colonies, il serait très intéressant de cultiver des cellules de MO ou de rate prélevées
d’une souris normale B6 dans les milieux mentionnés précédemment. L’ajout de rIL
21 à ces milieux pourrait nous donner une indication sur le rôle de l’IL-21 dans le
développement des différentes lignées. Cependant, cet effet de l’IL-21 sur les cellules
précurseurs doit passer par la signalisation via son récepteur, 1’IL-21R. Nous avons
donc caractérisé l’expression de l’IL-21R sur les différents types de progéniteurs de
la MO chez une souris normale.
114
5.2.2 Expression de 1’IL-21R sur les progéniteurs hématopoïétiques
Puisque la souris IL-2 1 Tg présente une sur-représentation de cellules
myéloïdes dans la MO et une diminution concomitante des lymphocytes B et des
érytbrocytes, nous pensons que l’IL-21R doit être exprimé par les cellules myéloïdes.
L’accumulation de cellules myéloïdes serait donc expliquée par une prolifération des
cellules myéloïdes immatures et/ou matures. Afin d’expliquer comment l’IL-21 cause
les défauts hématopoïétiques, nous avons tenter de détecter laIles population(s)
hématopoïétique(s) exprimant l’IL-21R chez une souris sauvage. Compte tenu de
l’accumulation de cellules myéloïdes chez la souris IL-21 1g, nous pensions trouver
l’expression de l’IL-21R sur les cellules myéloïdes matures, ce qui aurait suggérer un
rôle de l’IL-21 dans la survie et/ou la prolifération de celles-ci. Puisque tel n’était pas
le cas, nous nous sommes tournés vers les progéniteurs myéloïdes, mais l’IL-21R
brillait toujours par son absence. En dernier recours, nous avons analysé les CLP de
la souris sauvage. Nous avons été surpris de constater l’expression de l’IL-21R sur les
CLP par RT-PCR, car ce résultat implique dès lors que l’IL-21 agit directement sur
les CLP. Dans les sections suivantes, nous proposons certains mécanismes par
lesquels l’IL-21 pourrait agir sur les CLP.
5.2.2.1 Effet de l’IL-21 sur l’expression de 1’IL-7R chez les CLP et répercussion sur
le développement des cellules B et T
Nous avons démontré que l’IL-21 diminuait l’expression de I’IL-7RŒ sur les
lymphocytes T naïfs ainsi que sur les cellules T CD$ activées/mémoires. Si l’IL-21
cause aussi la diminution de l’IL-7R sur les CLP, ceci peut avoir des conséquences
importantes au niveau du développement des stades de différenciation subséquents.
L’expression de l’IL-7Ra par les CLP est essentielle pour le développement des
lignées lymphoïdes B et T, car l’IL-7 induit la différenciation des CLP vers les
lymphocytes B et permet aux progéniteurs T arrivés dans le thymus de proliférer aux
stades DN et de survivre via l’induction de Bd-2 162,163,206,215,216,218,304 La forte
présence d’IL-21 pourrait donc causer une diminution dans la différenciation des
115
CLP vers les lymphocytes B, expliquant leur absence dans la MO de la souris IL-211g. Par le fait même, la survie des progéniteurs T et leur développement pourraientaussi être altérés, ces derniers ne recevant plus de signaux de survie et deprolifération via l’IL-7RŒ. Il est à noter que le thymus des souris IL-21 1g montreune forte diminution du nombre de thymocytes DP, ce qui pourrait être causé parl’absence de prolifération chez les stades DN due à la perte de l’expression de l’IL7Ra.
Cependant, la diminution de l’expression de l’IL-7RŒ par l’IL-21 ne pourraitaffecter directement la survie des CLP. En effet, la signalisation via ce récepteur n’estpas essentielle dans le maintien d’un nombre normal de CL?, comme constaté chezune souris déficiente en IL-7Ru 62,206• L’absence de l’IL-7RŒ sur les CLP joueraitdonc un rôle négatif dans la différenciation des CLP vers les lymphocytes B et Tplutôt que dans la survie des CLP. Il serait intéressant de cultiver des CLP de sourissauvage sur un milieu permettant le développement de colonies B et d’y ajouter del’IL-21. Ceci pourrait récapituler l’effet de l’IL-21 sur le développement de ces deux
populations afin de vérifier si celui-ci est inhibé.
Évidemment, il serait intéressant de confirmer la baisse de l’expression du
récepteur à l’IL-7 sur les CLP de la souris IL-21 1g. Par contre, nous prévoyons
quelques difficultés à identifier ces derniers, compte tenu que la reconnaissance des
CLP est basée sur l’expression de l’IL-7RŒ. Il nous faudrait aussi confirmer que l’IL
21 diminue l’expression de l’IL-7RŒ chez les CLP. Il faudrait pour cela trier des CLP
qui seraient ensuite cultivés in vitro en présence ou absence de rIL-21. Par cytométrie
en flux ou RT-PCR, nous pourrions détecter si l’IL-2l diminue l’expression de l’IL
7RŒ sur les CLP.
5.2.2.2 Signalisation par l’IL-21R sur les CLP
Nous avons observé une accumulation de cellules myéloïdes chez la souris
IL-21 Tg alors que l’IL-21R est exprimé par les CLP. Ceci implique que la
116
signalisation via l’IL-21R provoquerait un changement de différenciation des CLPvers la lignée myéloïde. Nous nous devons de noter que l’expression de l’IL-21R surles CLP est très faible comparativement à celle observée sur les lymphocytesmatures. Ceci soulève la question suivante: Est-ce que le niveau d’expression del’IL-21R est proportionnel au besoin de la cellule de recevoir un signal de FIL-21?En effet, pour l’IL-7, des cellules T cultivées en son absence augmentent l’expressionde l’IL-7RŒ alors que la présence d’IL-7 la diminue 296 Nous savons que l’IL-21Rest exprimé fortement sur les lymphocytes T et B activés. Ces derniers requièrent dessignaux via l’IL-21R afin d’induire la production d’IgG et l’apoptose chez les cellulesB, ainsi que la prolifération chez les lymphocytes T et B. Ces exemples démontrent àquel point une forte expression de l’IL-21R permet à ces types cellulaires de répondreà une infection. Cependant, la production d’IL-21 dans la MO n’a pas été démontrée.Sa forte présence dans la souris IL-2 1 1g pourrait donc conduire à une signalisationintracellulaire chez les CLP de la souris IL-21 1g qui est normalement absente chezles CLP d’une souris sauvage.
L’action de l’IL-21 dans le changement de lignée de différenciation pourrait
donc se présenter sous forme d’expression de récepteurs normalement absents chez
les CLP ou par l’activation et/ou l’inhibition de FT importants dans le développement
myéloïde et lymphoïde. Des évidences en faveur de cette hypothèse ont été obtenues
par deux groupes de recherche 165,211 La transfection de CLP avec le gène pour leGM-CSFR ou l’IL-2R a permis aux CLP d’exprimer de façon ectopique ces
récepteurs qui ne sont pas présents normalement chez cette population. La culture deces CLP transfectées avec l’IL-2 ou le GM-CSF a entraîné celles-ci à se différenciervers la lignée myéloïde, démontrant que l’action de cytokines peut changer le
programme de différenciation d’une lignée de développement vers une autre 165211
Dans le cas de la souris IL-21 Tg, l’activation constitutive d’un FT comme PU.l dans
les CLP par l’IL-21 pourrait inhiber l’expression de l’IL-7RŒ et activer la
transcription des gènes codant pour les récepteurs de cytokines myéloïdes. Cesdernières pourraient alors transmettre des signaux à une cellule auparavant dédiée à la
lignée lymphoïde. Il nous serait possible d’examiner l’expression de récepteurs
117
normalement absents sur les CLP (GM-CSFR, G-C$FR) cultivés ou non avec l’IL-21
afin de comprendre si le changement dans la lignée de différenciation est dû à l’action
de cytokines myéloïdes via leurs récepteurs. De plus, nous pourrions vérifier
l’activation ou l’inhibition de FT importants dans le développement myéloïde ou
lymphoïde en cultivant les CLP avec l’IL-21. L’expression de gènes cibles (comme
PU.1, IL-7RŒ, EBF, GATA-Ï) chez les CLP traités ou non avec l’IL-21 serait ensuite
analysée.
D’un autre côté, l’IL-21 pourrait simplement mener à l’apoptose des CLP,
laissant toute la place aux cellules myéloïdes. Il serait possible que l’IL-21 induise la
mort des CLP comme elle le fait chez les lymphocytes B 253,266 Ceci pourrait être
étudié en cultivant les CLP avec l’IL-2Ï et observer si elles subissent l’apoptose en
les marquant à l’annexine V.
5.2.2.3 Activation de Vf et expression de récepteurs aberrants par les CLP
L’expression de l’IL-7RŒ représente le changement initial dans la
différenciation des CSH vers les CLP, car ce récepteur est absent des CSH 157 De
plus, la diminution de l’expression de GM-CSFR serait aussi importante dans
l’engagement vers la lignée lymphoïde, puisque l’expression ectopique de ce
récepteur chez les CLP entraîne ces derniers à se développer dans la lignée myéloïde
in vitro 165 De façon intéressante, l’expression de l’IL-7RŒ et du GM-CSfR est
contrôlée par le Vi’ Pu.i 205,305,306 Une forte expression de PU.1 active la
transcription du GM-CSFR, alors qu’une faible expression de PU.1 induit
l’expression de l’IL-7RŒ. De plus, l’engagement des CSH vers les CLP ou les CMP
est dépendant de la concentration en PU.1. Une quantité plus élevée de PU.1 dirige
les cellules vers le développement myéloïde plutôt que lymphoïde 200 Nous
proposons deux mécanismes expliquant le phénotype myéloïde observé dans la MO
de la souris IL-21 Tg (figure 16). Premièrement, l’IL-21, en se liant à l’IL-21R,
pourrait inhiber l’expression de 1’IL-7Ra, qui ne pourrait signaler via le fi EBF 219rn
Ce dernier serait incapable d’activer la transcription de Pax5 307, qui normalement est
11$
IL-2 1
un antagoniste de PU.i 308rn Ce dernier serait alors présent en grandes quantités
puisqu’il se transcrit par lui-même 309, favorisant la différenciation de ce qui était
auparavant une cellule CLP vers la lignée myéloïde. De plus, PU. 1 est reconnu pour
moduler à la hausse l’expression des récepteurs des cytokines myéloïdes (GM-CSf,
M-CSF, G-C$f). L’expression de ces derniers favoriserait la maturation le long des
stades myéloïdes, inhibant toute différenciation lymphoïde au profit des CMP. Le
deuxième mécanisme impliquerait l’activation directe de PU.l comme cible de la
signalisation via l’IL-21R, le reste de la cascade étant identique à ce qui a été décrit
ci-haut. Ceci aurait deux conséquences: une haute teneur en PU. 1 dirige la
différenciation des précurseurs vers la lignée myéloïde. L’expression des gènes
relatifs au développement de la lignée B serait donc très diminuée. De plus, dès le
choix myéloïde engagé, le ratio PU. 1 !GATA- I serait en faveur de PU. 1. Ces deux fT
Pu.1
CLP
/fU1. 1
t@IL-ŒH
Pç
/ri
Lymphocytes B’
L Monocytes Granulocytes
figure 16. Modèle hypothétique proposé sur l’effet de l’IL-21 chez tes CLP dans ta souris IL-21 Tg. Nous avons démontré que les CLP expriment le récepteur à l’IL-2 1. Afin d’expliquerl’absence de développement B et l’accumulation de cellules myéloïdes, nous suggérons deuxmécanismes. Le premier tire partie des observations que l’IL-21 inhibe l’expression de l’IL-7RŒsur les lymphocytes T naïfs périphériques. S’il en est de même sur les CLP, la perte de l’IL-7Raentraînera un arrêt du développement B. De plus, le FT PU.1 pourrait s’accumuler puisqu’il n’estpas modulé par Pax5 et s’autoactive. L’abondance de PU.l empêchera GATA-l de diriger lesCMP vers les MEP, donc la différenciation s’effectuera plutôt du côté des GMP. Ceux-ci peuventensuite devenir granulocytes ou monocytes matures selon l’expression de C/EBPa.
119
étant des antagonistes et GAlA-1 entraînant la différenciation vers les MEP, les
précurseurs seraient dirigés vers les GMP. Il serait donc intéressant d’étudier
l’expression de PU.1 dans les cellules totales provenant de la MO de souris IL-21 1g
afin de vérifier si la signalisation par 1’IL-21R n’induirait pas ce FT, provoquant ainsi
son augmentation.
Évidemment, l’analyse du transcrit de GAlA-1 dans la MO de la souris IL-21
1g permettrait de confirmer cette hypothèse. Ceci expliquerait l’absence de cellules
érythroïdes. Ensuite, nous pourrions analyser l’expression de C/EBPŒ, le joueur
permettant le développement des granulocytes aux dépens des monocytes, puisqu’il
inactive PU•1 ‘°. La suite d’expériences décrites dans cette section nous permettrait
de comprendre comment l’IL-21 agit sur les populations hématopoïétiques,
conduisant à l’accumulation de cellules de la lignée myéloïde. Ceci serait un nouvel
exemple de l’action d’une cytokine dans la détermination du choix de lignée de
différenciation.
120
5.3 CONCLUSION
Cette étude a permis de caractériser le rôle de l’IL-21 in vivo dans
l’homéostasie des lymphocytes T. Nous avons été surpris de constater que malgré des
résultats in vitro démontrant que l’IL-21 était un facteur de survie chez les
lymphocytes T naïfs, le phénotype observé chez la souris IL-21 1g consistait en
l’accumulation de lymphocytes TM. En effet, ceux-ci présentent les caractéristiques
fonctionnelles des cellules T mémoires dont la production d’IFN-y et la prolifération
suite à une stimulation. Ces résultats amèneront une meilleure compréhension des
mécanismes régulant l’homéostasie des lymphocytes T. De plus, l’effet de l’IL-21 sur
l’expansion de cellules T spécifiques à un Ag pourrait être utilisé lors de
l’administration de vaccins thérapeutiques. L’ajout de l’IL-21 au vaccin thérapeutique
permettrait une meilleure réponse immunitaire afin d’enrayer une maladie ou une
tumeur. Le rôle de l’IL-21 dans la génération et/ou la survie des lymphocytes T
mémoires peut s’avérer important au niveau de la vaccination préventive. En effet, le
succès de la vaccination préventive réside dans la génération d’une population
mémoire efficace et stable à travers le temps. L’IL-21 pourrait aider, via la génération
de lymphocytes T mémoires, à développer une meilleure protection contre les
infections chez des sujets à risque.
Étonnamment, la souris IL-21 1g démontre une viabilité diminuée qui serait la
conséquence d’un défaut hématopoïétique. Les analyses effectuées sur la MO et la
rate ont permis de découvrir une accumulation de cellules myéfoïdes. De plus, la MO
est dépourvue de lymphocytes B et d’érythrocytes. Ceci suggère donc un rôle
inattendu pour l’IL-21 dans la détermination du choix de différenciation des
progéniteurs hématopoïétiques, choix biaisé vers la lignée myéloïde. Cette découverte
permettra une meilleure compréhension des mécanismes régulant le choix de
différenciation des progéniteurs de la MO. En outre, il pourrait être utile d’étudier
l’effet de l’IL-21 chez des patients souffrant d’un manque en cellules du système inné
(granulocytes, monocytes). Finalement, la compréhension du phénotype de la souris
121
IL-2 1 1g devrait nous donner des indices concernant le développement de syndromes
myéloprolifératifs, par exemple les leucémies myéloïdes chroniques.
122
RÉFÉRENCES
1. Bazan, J.F. Haemopoietic receptors and helical cytokines. Immunol Today 11,350-4 (1990).
2. Thoreau, E., Petridou, B., Kelly, P.A., Djiane, J. & Mornon, J.P. Structuralsymmetry of the extracellular domain of the cytokine/growthhormone/prolactin receptor family and interferon receptors revealed byhydrophobic cluster analysis. FEBS Lett 282, 26-3 1 (1991).
3. Bazan, J.F. A novel family of growth factor receptors: a common bindingdomain in the growth hormone, prolactin, erythropoietin and IL-6 receptors,and the p75 IL-2 receptor beta-chain. Biochem Biophys Res Commun 164,788-95 (1989).
4. Idzerda, R.L. et al. Human interleukin 4 receptor confers biologicalresponsiveness and defines a novel receptor superfamily. J Exp Med 171, 861-73 (1990).
5. Bazan, J.F. Structural design and molecular evolution of a cytokine receptorsuperfamily. Froc NattAcad Sci USA 87, 6934-8 (1990).
6. Wlodawer, A., Pavlovsky, A. & Gustchina, A. Hematopoietic cytokines:similarities and differences in the structures, with implications for receptorbinding. Protein Sci 2, 1373-82 (1993).
7. He, Y.W. & Malek, T.R. The structure and ftnction of gamma c-dependentcytokines and receptors: regulation of T lymphocyte development andhomeostasis. Crit Rev Immunol 18, 503-24 (1998).
8. Nelson, B.H. & Willerford, D.M. Biology of the interleukin-2 receptor. AdvImmunol 70, 1-81 (1998).
9. Sugamura, K. et al. The common gamma-chain for multiple cytokinereceptors. Adv Immunol 59, 225-77 (1995).
10. Leonard, W.J., Shores, E.W. & Love, P.E. Role of the common cytokinereceptor gamma chain in cytokine signaling and lymphoid development.ImmunolRev 148, 97-114 (1995).
11. Grabstein, K.H. et al. Cloning of a T ceil growth factor that interacts with thebeta chain of the interleukin-2 receptor. Science 264, 965-8 (1994).
12. Noguchi, M. et al. Interleukin-2 receptor gamma chain mutation resuits in Xlinked severe combined immunodeficiency in humans. Ceil 73, 147-57(1993).
13. Leonard, W.J., Noguchi, M., Russeil, S.M. & McBride, O.W. The molecularbasis of X-Iinked severe combined immunodeficiency: the role of theinterleukin-2 receptor gamma chain as a common gamma chain, gamma c.ImmunolRev 138, 61-86 (1994).
14. Sugamura, K. et al. The interleukin-2 receptor gamma chain: its role in themultiple cytokine receptor complexes and T celi development in XSCID.Annu Rev Immunol 14, 179-205 (1996).
15. Conley, M.E. et al. Nonrandom X chromosome inactivation in B ceils fromcarriers of X chromosome-linked severe combined immunodeficiency. FrocNatÏAcad$ci USA 85, 3090-4 (1988).
123
16. Wengler, G.S., Allen, R.C., Parolini, O., Smith, H. & Conley, M.E.Nonrandom X chromosome inactivation in natural killer celis from obligatecarriers of X-linked severe combined immunodeficiency. J Immunol 150,700-4 (1993).
17. Leonard, W.J. Cytokines and immunodeficiency diseases. Nat Rev Immunot 1,200-8 (2001).
18. Tanner, J.W., Chen, W., Young, R.L., Longmore, G.D. & Shaw, A.S. Theconserved box 1 motif of cytokine receptors is required for association withJAK kinases. JBi0Ï Chem 270, 6523-30 (1995).
19. Vosshenrich, C.A. & Di Santo, J.P. Interleukin signaling. Curr Biot 12, R760-3 (2002).
20. Rane, S.G. & Reddy, E.P. Janus kinases: components of multiple signalingpathways. Oncogene 19, 5662-79 (2000).
21. Johnston, J.A. et al. Phosphorylation and activation of the Jak-3 Janus kinasein response to interleukin-2. Nature 370, 15 1-3 (1994).
22. Witthuhn, B.A. et al. Involvement of the Jak-3 Janus kinase in signalling byinterleukins 2 and 4 in lymphoid and myeloid ceils. Nature 370, 153-7 (1994).
23. Russeli, S.M. et al. Interaction of IL-2R beta and gamma c chains with Jakiand Jak3: implications for XSCID and XCID. Science 266, 1042-5 (1994).
24. Miyazaki, T. et al. Functional activation of Jaki and Jak3 by selectiveassociation with IL-2 receptor subunits. Science 266, 1045-7 (1994).
25. O’Shea, J.J. et al. Jak3 and the pathogenesis of severe combinedimmunodeficiency. Mot Immunol 41, 727-37 (2004).
26. Darneli, J.E., Jr. STATs and gene regulation. Science 277, 1630-5 (1997).27. Leonard, W.J. & OShea, J.J. Jaks and STATs: biological implications. Annu
Rev Immunot 16, 293-322 (1998).28. Badovinac, V.P., Porter, B.B. & Harty, J.L Programmed contraction of
CD$(+) T celis after infection. Nat Immunot 3, 619-26 (2002).29. Kaech, S.M., Wherry, E.J. & Ahmed, R. Effector and memory 1-ceil
differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol 2,251-62 (2002).
30. Ahmed, R. & Gray, D. Immunological memory and protective immunity:understanding their relation. Science 272, 54-60 (1996).
31. Janeway, C.A. Chap.7: The development and survival of lymphocytes. inImmunobiology : the immune system in health and diseuse, Vol. 5th edition(ed. Congress, L.o.) (Garland Publishing, New York, 2001).
32. Paul, W. Chapter 8: T-cell antigen receptors. in fundamental immunology(eU. L.W., W.) (Phuladelphia, 2003).
33. Arbones, M.L. et al. Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migrationare impaired in L-selectin-deficient mice. Immunity 1, 247-60 (1994).
34. Forster, R. et al. CCR7 coordinates the primary immune response byestablishing ftnctional microenvironments in secondary Iymphoid organs.Ceil 99, 23-33 (1999).
35. Salter, R.D. et al. A binding site for the T-cell co-receptor CD$ on the alpha 3domain of HLA-A2. Nature 345, 41-6 (1990).
36. Doyle, C. & Strominger, J.L. Interaction between CD4 and class II MHCmolecules mediates celi adhesion. Nature 330, 256-9 (1987).
124
37. Banchereau, J. et al. Immunobiology of dendritic ceils. Annu Rev Immunol 18,767-$11 (2000).
3$. Blattman, J.N. et al. Estimating the precursor frequency of naive antigenspecific CD8 T celis. J Exp Med 195, 657-64 (2002).
39. Murali-Krishna, K. et aï. Counting antigen-specific CD8 T ceils: areevaluation of bystander activation during viral infection. Imrnunity 8, 177-87 (199$).
40. Mosmann, T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Giediin, M.A. & Coffman,R.L. Two types of murine helper T ceil clone. I. Definition according toprofiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 136, 234$-57 (1986).
41. Kagi, D. et al. Fas and perforin patbways as major mechanisms of T ceilmediated cytotoxicity. Science 265, 528-30 (1994).
42. Liu, Y., Wenger, R.H., Zhao, M. & Nielsen, P.J. Distinct costimulatorymolecules are required for the induction of effector and memory cytotoxic Tlymphocytes. J Exp Med 185, 251-62 (1997).
43. Manjunath, N. et al. Effector differentiation is flot prerequisite for generationof memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest 108, $71-8 (2001).
44. Hu, H. et al. CD4(+) T celi effectors can become memory celis with higliefficiency and without further division. Nat Immunol 2, 705-10 (2001).
45. Kaech, S.M. & Ahmed, R. Memory CD8+ T celi differentiation: initialantigen encounter triggers a developmental program in naive ceils. NatImmunol 2, 415-22 (2001).
46. Kaech, S.M., Hemby, S., Kersh, E. & Ahmed, R. Molecular and functionalprofiling of memory CD8 T ceil differentiation. Celt 111, 837-5 1 (2002).
47. Opferman, J.T., Ober, B.T. & Ashton-Rickardt, P.G. Linear differentiation ofcytotoxic effectors into memory T lymphocytes. Science 283, 1745-8 (1999).
4$. Swain, S.L., Hu, H. & Huston, G. Class Il-independent generation of CD4memory T ceils from effectors. Science 286, 1381-3 (1999).
49. van Stipdonk, M.J., Lemmens, E.E. & Schoenberger, S.P. Naive CTLs requirea single brief period of antigenic stimulation for clonai expansion anddifferentiation. Nat Immunol 2, 423-9 (2001).
50. Krammer, P.H. CD95’s deadly mission in the immune system. Nature 407,789-95 (2000).
51. Cho, B.K., Wang, C., Sugawa, S., Eisen, H.N. & Chen, J. Functionaldifferences between memory and naive CD8 T celis. Froc NatlAcad Sci USA 96, 2976-8 1 (1999).
52. Iezzi, G., Scheidegger, D. & Lanzavecchia, A. Migration and function ofantigen-primed nonpolarized T lymphocytes in vivo. JExp Med 193, 987-93(2001).
53. Rogers, P.R., Dubey, C. & Swain, S.L. Qualitative changes accompanymemory T celi generation: faster, more effective responses at lower doses ofantigen. J Immunol 164, 233 8-46 (2000).
54. Hou, S., Hyland, L., Ryan, K.W., Portner, A. & Doherty, P.C. Virus-specificCD8÷ T-cell memory determined by clonai burst size. Nature 369, 652-4(1994).
125
55. Busch, D.H., Pilip, I.M., Vijh, S. & Pamer, E.G. Coordinate regulation ofcomplex T ce!! populations responding to bacteria! infection. Immunity 8,353-62 (1998).
56. Tough, D.F. & Sprent, J. Turnover of naive- and memory-phenotype T ce!ls. JExp Mcd 179, 1127-35 (1994).
57. Bnino, L., von Boehmer, H. & Kirberg, J. Ce!! division in the compartment ofnaive and memory T lymphocytes. Eurlimmunol 26, 3179-84 (1996).
58. Zimmerman, C., Brduscha-Riem, K., Blaser, C., Zinkernagel, R.M. & Pircher,H. Visualization, characterization, and turnover of CD8+ memory T ceils invirus-infected hosts. J Exp Mcd 183, 1367-75 (1996).
59. Thomas, M.L. The leukocyte common antigen family. Annu Rev Immunol 7,339-69 (1989).
60. Bever!ey, P.C., Merkenschlager, M. & Terry, L. Phenotypic diversity of theCD45 antigen and its re!ationship to function. Immunot Suppi 1, 3-5 (1988).
61. Boursalian, I.E. & Bottomly, K. Stability of naive and memory phenotypeson resting CD4 T ce!ls in vivo. Jlmmunot 162, 9-16 (1999).
62. Johnson, R., Lancki, D.W. & Fitch, F.W. Accessory molecu!es involved inantigen-mediated cytolysis and lymphokine production by cytotoxic Tlymphocyte subsets. I. Identification of functions for the T ce!! surfacemolecules Ly-6C and Thy-1. Jlmmunol 151, 2986-99 (1993).
63. Wa!unas, T.L., Bruce, D.S., Dustin, L., Loh, D.Y. & Bluestone, J.A. Ly-6C isa marker of memory CD8+ T ceils. J Immunol 155, 1873-83 (1995).
64. Zhang, X., Sun, S., Hwang, I., Tough, D.F. & Sprent, J. Potent and se!ectivestimulation of memory-phenotype CD8÷ I celis in vivo by IL-15. Imrnttnity 8,591-9 (1998).
65. Sallusto, f., Lenig, D., Forster, R., Lipp, M. & Lanzavecchia, A. Iwo subsetsof memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effectorftnctions. Nature 401, 708-12 (1999).
66. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A.L. & Lefrancois, L. Preferentiallocalization of effector memory ce!ls in non!ymphoid tissue. Science 291,2413-7 (2001).
67. Reinhardt, R.L., Khoruts, A., Merica, R., Zell, T. & Jenkins, M.K. Visualizingthe generation of memory CD4 T cells in the whole body. Nature 410, 101-5(2001).
68. Stockinger, B., Barthlott, I. & Kassiotis, G. The concept of space andcompetition in immune regulation. Inzmunotogy 111, 241-7 (2004).
69. Tanchot, C. & Rocha, B. The organization of mature T-ce!l pools. ImmunolToday 19, 575-9 (1998).
70. Marrack, P. et al. Homeostasis of alpha beta TCR+ T ce!!s. Nat Immunol 1,107-11 (2000).
71. Viret, C., Wong, F.S. & Janeway, C.A., Jr. Designing and maintaining themature TCR repertoire: the continuum of self-peptide:self-MHC comp!exrecognition. Immunity 10, 559-68 (1999).
72. Ernst, B., Lee, D.S., Chang, J.M., Sprent, J. & Surh, C.D. The peptide ligandsmediating positive selection in the thymus control T cell survival andhomeostatic proliferation in the periphery. Immunity 11, 173-$1 (1999).
126
73. Ku, C.C., Murakami, M., Sakamoto, A., Kappler, J. & Marrack, P. Control ofhomeostasis of CD$+ memory T ceils by opposing cytokines. Science 288,675-8 (2000).
74. Schiuns, K.S., Kieper, W.C., Jameson, S.C. & Lefrancois, L. Interleukin-7mediates the homeostasis of naive and memory CD$ T celis in vivo. NatImmunol 1, 426-32 (2000).
75. Tan, J.T. et al. IL-7 is critical for homeostatic proliferation and survival ofnaive T ceils. Froc NatÏ Acad Sci USA 9$, $732-7 (2001).
76. Fry, T.J. & Mackali, C.L. Interleukin-7: master regulator of peripheral T-cellhomeostasis? Trends Immuizot 22, 564-71 (2001).
77. Dai, Z. & Lakkis, F.G. Cutting edge: Secondary lymphoid organs are essentialfor maintaining the CD4, but flot CD$, naive T ceil pool. J Immunol 167,6711-5 (2001).
7$. Bender, J., Mitcheli, T., Kappler, J. & Marrack, P. CD4+ T ceil division inirradiated mice requires peptides distinct from those responsible for thymicselection. J Exp Med 190, 367-74 (1999).
79. Jameson, S.C. Maintaining the norm: T-cell homeostasis. NatRevimmunol 2,547-56 (2002).
$0. Oehen, S. & Brduscha-Riem, K. Naive cytotoxic T lymphocytesspontaneously acquire effector function in lymphocytopenic recipients: Apitfall for T ceil memory studies? Fur Jlnimunol 29, 608-14 (1999).
$1. Goldrath, A.W. & Bevan, M.J. Low-affinity ligands for the TCR driveproliferation of mature CD8+ T ceils in lymphopenic hosts. Imrnunity 11, 183-90 (1999).
82. Kieper, W.C. & Jameson, S.C. Homeostatic expansion and phenotypicconversion of naive T celis in response to self peptide/MHC ligands. FrocNailAcadSci USA 96, 13306-11 (1999).
$3. Murali-Krishna, K. & Ahmed, R. Cutting edge: naive T ceils masquerading asmemory celis. J Immunol 165, 1733-7 (2000).
84. Cho, B.K., Rao, V.P., Ge, Q., Eisen, H.N. & Chen, J. Homeostasis-stimulatedproliferation drives naive T celis to differentiate directly into memory T celis.JExpMed 192, 549-56 (2000).
85. Goldrath, A.W., Bogatzki, L.Y. & Bevan, M.J. Naive T ceils transientlyacquire a memory-like phenotype during homeostasis-driven proliferation. JExp Med 192, 557-64 (2000).
$6. Scollay, R.G., Butcher, E.C. & Weissman, Ii. Thymus celi migration.Quantitative aspects of cellular traffic from the thymus to the periphery inmice. Fur Jlmmunol 10, 210-8 (1980).
87. Tanchot, C., Rosado, M.M., Agenes, F., Freitas, A.A. & Rocha, B.Lymphocyte homeostasis. Semin Immunol 9, 33 1-7 (1997).
$8. Sprent, J. & Tough, D.F. Lymphocyte life-span and memory. Science 265,1395-400 (1994).
89. McCune, J.M. et al. Factors influencing T-cell turnover in HIV-1-seropositivepatients. J Clin Invest 105, Ri-8 (2000).
90. Takeda, S., Rodewald, H.R., Arakawa, H., Bluethmann, H. & Shimizu, T.MHC class II molecules are flot required for survival of newly generatedCD4+ T celis, but affect their long-term life span. Inzmunity 5, 217-28 (1996).
127
91. Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C. & Mathis, D. Targetedcomplementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery ofrecombinant adenoviruses. Irnmunity 7, 123-34 (1997).
92. Tanchot, C., Lemonnier, F.A., Perarnau, B., Freitas, A.A. & Rocha, B.Differential requirements for survival and proliferation of CD8 naive ormemory T celis. Science 276, 2057-62 (1997).
93. Kirberg, J., Berns, A. & von Boehmer, H. Peripheral T celi survival requirescontinuai ligation of the T celi receptor to major histocompatibility complexencoded molecules. J Exp Med 186, 1269-75 (1997).
94. Labrecque, N. et al. How much TCR does a T celi need? Imrnunity 15, 71-82(2001).
95. Boursalian, T.E. & Bottomly, K. Survival of naive CD4 T celis: roles ofrestricting versus selecting MHC class II and cytokine milieu. J Immunol 162,3795-801 (1999).
96. Clarke, S.R. & Rudensky, A.Y. Survivai and homeostatic proliferation ofnaive peripherai CD4+ T celis in the absence of self peptide:MHC complexes.Jlmmunot 165, 2458-64 (2000).
97. Witherden, D. et al. Tetracycline-controliable selection of CD4(+) T celis:haif-life and survival signais in the absence of major histocompatibilitycomplex class II molecules. J Exp Med 191, 355-64 (2000).
9$. Seddon, B. & Zamoyska, R. TCR signais mediated by Src family kinases areessential for the survival of naive T cells. J Immunot 169, 2997-3005 (2002).
99. Rathmell, J.C., Farkash, E.A., Gao, W. & Thompson, C.B. IL-7 enhances thesurvival and maintains the size of naive T cells. J Immunol 167, 6869-76(2001).
100. Vivien, L., Benoist, C. & Mathis, D. T lymphocytes need IL-7 but flot IL-4 orIL-6 to survive in vivo. Int Immunol 13, 763-8 (2001).
101. Berard, M., Brandt, K., Buifone-Paus, S. & Tough, D.F. IL-15 promotes thesurvival of naive and memory phenotype CD8+ T ceils. J Immunol 170, 50 18-26 (2003).
102. Khaled, A.R., Kim, K., Hofmeister, R., Muegge, K. & Durum, S.K.Withdrawal of IL-7 induces Bax translocation from cytosol to mitochondriathrough a rise in intracellular pH. Froc NattAcad Sci USA 96, 14476-8 1(1999).
103. von Freeden-Jeffry, U., Solvason, N., Howard, M. & Murray, R. The earliestT lineage-committed ceils depend on IL-7 for Bd-2 expression and normalceil cycle progression. Immun ity 7, 147-54 (1997).
104. Vella, A., Teague, T.K., Ihie, J., Kappler, J. & Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T ceils: stat6 is probably not requiredfor the effect of IL-4. J Exp Med 186, 325-30 (1997).
105. Teague, T.K., Marrack, P., Kappler, J.W. & Vella, A.T. IL-6 rescues restingmouse T ceils from apoptosis.Jlmmunol 158, 5791-6 (1997).
106. Zeng, R. et al. Synergy of IL-21 and IL-15 in regulating CD8+ T celiexpansion and fiinction. J Exp Med 201, 139-48 (2005).
107. Ostiguy, V., Allard, E-L, Labrecque, N. IL-21 promotes T lymphocytesurvival. Journal ofLeukocyte BioÏogy En préparation.
128
108. Kasaian, M.T. et al. IL-21 limits NK ceil responses and promotes antigenspecific T celi activation: a mediator of the transition from innate to adaptiveimmunity. Immunity 16, 559-69 (2002).
109. Butz, E.A. & Bevan, MJ. Massive expansion of antigen-specific CD8+ Tcelis during an acute virus infection. Immunity 8, 167-75 (1998).
110. Lodolce, J.P. et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis bysupporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity 9, 669-76 (1998).
111. Fehniger, T.A. & Caligiuri, M.A. Interleukin 15: biology and relevance tohuman disease. Blood 97, 14-32 (2001).
112. Schorle, H., Holtschke, T., Hunig, T., Schimpi, A. & Horak, I. Developmentand function of T celis in mice rendered interleukin-2 deficient by genetargeting. Nature 352, 621-4 (1991).
113. Blattman, J.N. et al. Therapeutic use of IL-2 to enhance antiviral T-cellresponses in vivo. Nat lied 9, 540-7 (2003).
114. Kundig, T.M. et al. Immune responses in interleukin-2-deficient mice. Science262, 1059-61 (1993).
115. Becker, T.C. et al. Interleukin 15 is required for proliferative renewal of virusspecific memory CD8 T celis. J Exp Med 195, 1541-8 (2002).
116. Teague, R.M., Tempero, R.M., Thomas, S., Murali-Krishna, K. & Nelson,B.H. Proliferation and differentiation of CD8+ T ceils in the absence of IL-2/15 receptor beta-chain expression or STAT5 activation. J Immunol 173,3 131-9 (2004).
117. Carson, W.E. et al. Endogenous production of interleukin 15 by activatedhuman monocytes is critical for optimal production of interferon-gamma bynatural killer celis in vitro. J Clin Invest 96, 2578-82 (1995).
118. Jonuleit, H. et al. Induction of IL-15 messenger RNA and protein in humanblood-derived dendritic ceils: a role for IL-15 in attraction of T cells. JImmunol 158, 2610-5 (1997).
119. Blauveit, A. et al. Interleuldn-15 mRNA is expressed by human keratinocytesLangerhans celis, and blood-derived dendritic celis and is downregulated byultraviolet B radiation. J Invest Dermatol 106, 1047-52 (1996).
120. Weiler, M. et al. Interleukin-15, a leukocyte activator and growth factor, isproduced by cortical tubular epithelial cells.JAm Soc Nephrol 9, 1194-201(1998).
121. Sadlack, B. et al. Ulcerative colitis-like disease in mice with a disruptedinterleukin-2 gene. Celi 75, 253-6 1 (1993).
122. Lenardo, M.J. Interleukin-2 programs mouse alpha beta T lymphocytes forapoptosis. Nature 353, 858-6 1 (1991).
123. Van Parijs, L. et al. Uncoupling IL-2 signais that regulate T celi proliferation,survival, and Fas-mediated activation-induced cell death. Immunity 11, 281-8(1999).
124. Refaeli, Y., Van Parijs, L., London, C.A., Tschopp, J. & Abbas, A.K.Biochemical mechanisms of IL-2-regulated Fas-mediated T celi apoptosis.Immunity 8, 615-23 (1998).
125. Li, X.C. et al. IL-15 and IL-2: a matter of life and death for T cells in vivo.NatMed7, 114-8 (2001).
129
126. Kedi, R.M., Kappler, I.W. & Marrack, P. Epitope dominance, competitionand T ceil affinity maturation. Curr Opin Immunol 15, 120-7 (2003).
127. Letterio, J.J. & Roberts, A.B. Regulation of immune responses by TGF-beta.Annu Rev Immunol 16, 137-6 1 (1998).
128. Moore, K.W., de Waal Malefyt, R., Coffman, R.L. & O’Garra, A. Interleukin10 and the interleukin-lO receptor. Annu Rev Immunol 19, 683-765 (2001).
129. Moreno, M.B., Memon, S.A. & Zacharchuk, C.M. Apoptosis signalingpathways in normal T ceils: differential activity of Bd-2 and IL-ibetaconverting enzyme family protease inhibitors on glucocorticoid- and Fasmediated cytotoxicity. J Immunol 157, 3845-9 (1996).
130. Sprent, J. & Surh, C.D. Generation and maintenance of memory T celis. CurrOpin Immunol 13, 248-54 (2001).
131. Vella, A.T., Dow, S., Potter, T.A., Kappler, J. & Marrack, P. Cytokineinduced survival of activated T celis in vitro and in vivo. Froc Natt Acad SciUSA 95, 3810-5 (1998).
132. Yajima, T. et al. Overexpression of IL-15 in vivo increases antigen-drivenmemory CD8+ T celis following a microbe exposure. J Immunol 168, 1198-203 (2002).
133. Khan, I.A. & Casciotti, L IL-15 prolongs the duration of CD8+ T celimediated immunity in mice infected with a vaccine strain of Toxoplasmagondii. J Immunol 163, 4503-9 (1999).
134. Prlic, M., Lefrancois, L. & Jameson, S.C. Multiple choices: regulation ofmemory CD8 T celi generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL15. JExp Med 195, F49-52 (2002).
135. Kondrack, R.M. et al. Interleukin 7 regulates the survival and generation ofmemory CD4 ceils. J Exp Med 198, 1797-806 (2003).
136. Li, J., Huston, G. & Swain, S.L. IL-7 promotes the transition of CD4 effectorsto persistent memory celis. JExp Med 198, 1807-15 (2003).
137. Murali-Krishna, K. et al. Persistence of memory CD8 T celis in MHC class Ideficient mice. Science 286, 1377-81 (1999).
138. Selin, L.K., Vergilis, K., Welsh, R.M. & Nahili, S.R. Reduction of otherwiseremarkably stable virus-specific cytotoxic T lymphocyte memory byheterologous viral infections. J Exp Med 183, 2489-99 (1996).
139. Schluns, K.S., Williams, K., Ma, A., Zheng, X.X. & Lefrancois, L. Cuttingedge: requirement for IL-15 in the generation of primary and memoryantigen-specific CD8 T ceils. J Immunol 168, 4827-3 1 (2002).
140. Goldrath, A.W. et al. Cytoldne requirements for acute and Basal homeostaticproliferation of naive and memory CD$+ T celis. JExp Med 195, 15 15-22(2002).
141. Tan, J.T. et al. Interleuldn (IL)-15 and IL-7 jointly regulate homeostaticproliferation of memory phenotype CD8+ ceils but are flot required formemory phenotype CD4+ cells.JExpMed 195, 1523-32 (2002).
142. Kennedy, M.K. et al. Reversible defects in natural killer and memory CD8 Tceli lineages in interleukin 15-deficient mice. JExp Med 191, 771-80 (2000).
143. Kieper, W.C. et al. Overexpression of interleukin (IL)-7 leads to IL-15-independent generation of memory phenotype CD8÷ T celis. J Exp Med 195,1533-9 (2002).
130
144. Dubois, S., Mariner, J., Waldmann, T.A. & Tagaya, Y. IL-l5Ralpha recyclesand presents IL-15 In trans to neighboring ceils. Irnmunity 17, 537-47 (2002).
145. Burkett, P.R. et al. IL-15R alpha expression on CD$÷ T ceils is dispensablefor T celi memory. Froc NatÏAcad Sci USA 100, 4724-9 (2003).
146. Schluns, K.S., Klonowski, K.D. & Lefrancois, L. Transregulation of memoryCD8 T-cell proliferation by IL-l5Ralpha+ bone marrow-derived celis. Blood103, 988-94 (2004).
147. Seddon, B., Tomiinson, P. & Zamoyska, R. Interleukin 7 and T ceil receptorsignals regulate homeostasis of CD4 memory cells. Nat Immunol 4, 680-6(2003).
148. Evans, T. Developmental biology of hematopoiesis. Hematol Oncol ClinNorthAm 11, 1115-47 (1997).
149. Metcalf, D. The Molecular Control ofBlood Ceils, (Harvard Univ. Press,Cambridge, MA, 1988).
150. Zhu, J. & Emerson, S.G. Hematopoietic cytokines, transcription factors andlineage commitment. Oncogene 21, 3295-313 (2002).
151. Tiil, i.E. & Mc, C.E. A direct measurement of the radiation sensitivity ofnormal mouse bone marrow celis. Radiat Res 14, 213-22 (1961).
152. Spangrude, G.J., Heimfeld, S. & Weissman, I.L. Purification andcharacterization of mouse hematopoietic stem celis. Science 241, 5$-62(1988).
153. Orkin, S.H. Diversification of haematopoietic stem celis to specific lineages.NatRev Genet 1, 57-64 (2000).
154. Cheshier, S.H., Morrison, 5.1., Liao, X. & Weissman, I.L. In vivoproliferation and ceil cycle kinetics of long-term seif-renewing hematopoieticstem cells.ProcNattAcadSci USA 96, 3120-5 (1999).
155. Morrison, S.J. & Weissman, I.L. The long-term repopulating subset ofhematopoietic stem ceils is deterministic and isolatable by phenotype.Immunity 1, 661-73 (1994).
156. Morrison, S.J., Wandycz, A.M., Hemmati, H.D., Wright, D.E. & Weissman,I.L. Identification of a lineage of multipotent hematopoietic progenitors.Developnzent 124, 1929-39 (1997).
157. Kondo, M., Weissman, I.L. & Akashi, K. Identification of clonogeniccommon lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Ceil 91, 661-72(1997).
158. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T. & Weissman, IL. A clonogeniccommon myeloid progenitor that gives rise to ah myeloid lineages. Nature404, 193-7 (2000).
159. Rosmarin, A.G., Yang, Z. & Resendes, K.K. Transcriptional regulation inmyelopoiesis: Hematopoietic fate choice, myeloid differentiation, andleukemogenesis. Exp Hernatol 33, 13 1-43 (2005).
160. Baum, C.M., Weissman, I.L., Tsukamoto, A.S., Bucide, A.M. & Peault, B.Isolation of a candidate human hematopoietic stem-celi population. Froc NatÏAcadSci USA 89, 2804-8 (1992).
161. Hunte, B.E., Hudak, S., Campbell, D., Xu, Y. & Rennick, D. flk2/flt3 ligandis a potent cofactor for the growth of primitive B celi progenitors. J Immunot156, 489-96 (1996).
131
162. Peschon, J.J. et al. Early lymphocyte expansion is severely impaired ininterleukin 7 receptor-deficient mice. JExp Med 180, 1955-60 (1994).
163. von Freeden-Jeffry, U. et al. Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deletedmice identifies IL-7 as a nonredundant cytokine. J Exp Med 181, 15 19-26(1995).
164. Galy, A., Travis, M., Cen, D. & Chen, B. Human T, B, natural killer, anddendritic celis arise from a common bone marrow progenitor ceil subset.Irnmtcnity 3, 459-73 (1995).
165. Kondo, M. et al. Ceil-fate conversion of lymphoid-committed progenitors byinstructive actions of cytokines. Nature 407, 383-6 (2000).
166. Traver, D. et al. Fetal liver myelopoiesis occurs through distinct,prospectively isolatable progenitor subsets. BÏood 98, 627-35 (2001).
167. Manz, M.G., Miyamoto, T., Akashi, K. & Weissman, I.L Prospectiveisolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Froc NatlAcadSci USA 99, 11872-7 (2002).
168. Lacaud, G., Carisson, L. & Keller, G. Identification of a fetal hematopoieticprecursor with B ccli, T celi, and macrophage potential. Irnrnunity 9, 827-38(1998).
169. Wu, L., Antica, M., Johnson, G.R., Scollay, R. & Shortman, K.Developmental potential of the earliest precursor celis from the aduit mousethymus. JExp Med 174, 1617-27 (1991).
170. Ardavin, C., Wu, L., Li, C.L. & Shortman, K. Thymic dendritic ceils and Tceils develop simuitaneously in the thymus from a common precursorpopulation. Nature 362, 761-3 (1993).
171. Godfrey, D.I., Kennedy, J., Suda, T. & Zlotnik, A. A developmental pathwayinvolving four phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-negative aduit mouse thymocytes defined by CD44 and CD25expression. J Immunol 150, 4244-52 (1993).
172. Lesley, J., Schulte, R., Trotter, J. & Hyman, R. Qualitative and quantitativeheterogeneity in Pgp-1 expression among murine thymocytes. Celi Immunol112, 40-54 (1988).
173. Pearse, M. et al. A murine early thymocyte developmental sequence is markedby transient expression of the interÏeukin 2 receptor. Froc Nati Acad Sci U SA86, 1614-8 (1989).
174. Petrie, H.T., Hugo, P., Scollay, R. & Shortman, K. Lineage relationships anddevelopmental kinetics of immature thymocytes: CD3, CD4, and CD8acquisition in vivo and in vitro. J Exp Med 172, 15 83-8 (1990).
175. Hardy, RR., Carmack, C.E., Shinton, S.A., Kemp, J.D. & Hayakawa, K.Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B celi stages in normalmouse bone marrow. JExp Med 173, 1213-25 (1991).
176. Li, Y.S., Wasserman, R., Hayakawa, K. & Hardy, R.R. Identification oftheearliest B lineage stage in mouse bone marrow. Immunity 5, 527-35 (1996).
177. Ogawa, M., ten Boekel, E. & Melchers, F. Identification of CD19(-)B220(+)c-Kit(+)Flt3/FIk-2(+)cells as early B lymphoid precursors beforepre-B-I ceils in juvenile mouse bone marrow. Int Immunot 12, 313-24 (2000).
132
17$. Tudor, K.S., Payne, KJ., Yamashita, Y. & Kincade, P.W. Functional
assessment of precursors from murine bone marrow suggests a sequence of
early B lineage differentiation events. Immunity 12, 335-45 (2000).179. Li, Y.S., Hayakawa, K. & Hardy, R.R. The regulated expression of B lineage
associated genes during B celi differentiation in bone marrow and fetal Ïiver. J
Exp Med 178, 95 1-60 (1993).180. Meffre, E., Casellas, R. & Nussenzweig, M.C. Antibody regulation of B celi
development. Nat Immunol 1, 379-85 (2000).181. Terstappen, L.W., Hollander, Z., Meiners, H. & Loken, M.R. Quantitative
comparison of myeloid antigens on five lineages of mature peripheral blood
celis. JLeukoc Biol 48, 138-48 (1990).182. Terstappen, L.W., Safford, M. & Loken, M.R. FIow cytometric analysis of
human bone marrow. III. Neutrophil maturation. Leukemia 4, 657-63 (1990).
183. Kansas, G.S., Muirhead, M.J. & Dailey, M.O. Expression of the CD11/CD18,leukocyte adhesion molecule 1, and CD44 adhesion molecules during normal
myeloid and erythroid differentiation in humans. Blood 76, 2483-92 (1990).
184. Arnaout, M.A. Structure and function of the leukocyte adhesion molecules
CD11ICD1$. BÏood 75, 1037-50 (1990).185. Hestdal, K. et al. Characterization and regulation of RB6-8C5 antigen
expression on murine bone marrow celis. J Immunol 147, 22-8 (1991).
186. Lesley, J., Hyman, R., Schulte, R. & Trotter, J. Expression of transferrin
receptor on murine hematopoietic progenitors. Celi Irnnzunot 83, 14-25
(1984).187. Ikuta, K. et al. A developmental switch in thymie lymphocyte maturation
potential occurs at the level of hematopoietic stem celis. CeIt 62, 863-74
(1990).188. Lok, C.N. & Ponka, P. Identification of an erythroid active element in the
transferrin receptor gene. J Biol Chem 275, 24185-90 (2000).
189. Kina, T. et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule
associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of
murine erythroid lineage. Br J Haematot 109, 280-7 (2000).190. Berridge, M.V., Ralph, 5.1. & Tan, A.S. Celi-lineage antigens of the stem
cell-megakaryocyte-platelet lineage are associated with the platelet IIb-IIIa
glycoprotein complex. Btood 66, 76-85 (1985).191. Prandini, M.H., Uzan, G., Martin, F., Thevenon, D. & Marguerie, G.
Characterization of a specific erythromegakaryocytic enhancer within the
glycoprotein IIb promoter. f Biot Chem 267, 10370-4 (1992).
192. Clay, D. et al. CD9 and megakaryocyte differentiation. Blood 97, 1982-9
(2001).193. Metcalf, D. Lineage commitment and maturation in hematopoietic ceils: the
case for extrinsic regulation. BÏood 92, 345-7; discussion 352 (1998).
194. Enver, T., Heyworth, C.M. & Dexter, T.M. Do stem ceils play dice? Blood
92, 348-51; discussion 352 (1998).195. Maguer-Satta, V., Oostendorp, R., Reid, D. & Eaves, C.J. Evidence that
ceramide mediates the ability of tumor necrosis factor to modulate primitive
human hematopoietic ceil fates. BÏood 96, 4118-23 (2000).
133
196. Zandstra, P.W., Conneally, E., Petzer, A.L., Piret, J.M. & Eaves, C.J.Cytokine manipulation of primitive human hematopoietic ceil seif-renewal.Froc NattAcad Sci USA 94, 4698-703 (1997).
197. Ramsfjell, V. et al. Distinct requirements for optimal growth and In vitroexpansion of human CD34(+)CD38(-) bone marrow long-term cultureinitiating celis (LTC-IC), extended LTC-IC, and murine in vivo long-termreconstituting stem celis. Blood 94, 4093-102 (1999).
198. Hromas, R. et al. Hematopoietic lineage- and stage-restricted expression ofthe ETS oncogene family member PU.1. Blood 82, 2998-3004 (1993).
199. Anderson, M.K., Hernandez-Hoyos, G., Diamond, R.A. & Rothenberg, E.V.Precise developmental regulation of Ets family transcription factors duringspecification and commitment to the T celi lineage. Development 126, 3131-48 (1999).
200. DeKoter, R.P. & Singh, H. Regulation of B lymphocyte and macrophagedevelopment by graded expression of PU.1. Science 288, 1439-41 (2000).
201. Scott, E.W., Simon, M.C., Anastasi, J. & Singh, H. Requirement oftranscription factor PU.1 in the deveÏopment of multiple hematopoieticlineages. Science 265, 1573-7 (1994).
202. McKercher, S.R. et ai. Targeted disruption of the PU.1 gene resuits inmultiple hematopoietic abnormalities. Embo J 15, 5647-58 (1996).
203. Scott, E.W. et al. PU.1 functions in a celi-autonomous manner to control thedifferentiation of multipotential lymphoid-myeloid progenitors. Imrnunity 6,437-47 (1997).
204. DeKoter, R.P., Walsh, J.C. & Singh, H. PU.1 regulates both cytokinedependent proliferation and differentiation of granuiocyte/macrophageprogenitors. Embo J 17, 4456-68 (199$).
205. DeKoter, R.P., Lee, H.J. & Singh, H. PU.1 regulates expression of theinterleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Iminunity 16, 297-309 (2002).
206. Miller, J.P. et al. The earliest step in B lineage differentiation from commoniymphoid progenitors is critically dependent upon interleukin 7. J Exp Med196, 705-11 (2002).
207. Kim, K., Lee, C.K., Sayers, T.J., Muegge, K. & Durum, S.K. The trophicaction of IL-7 on pro-T ceils: inhibition of apoptosis of pro-Ti, -T2, and -T3ceils correlates with Bd-2 and Bax levels and is independent of Fas and p53pathways. J Immunol 160, 5735-41 (1998).
20$. He, Y.W. & Malek, T.R. Interleukin-7 receptor alpha is essentiai for thedevelopment of gamma delta + T ceils, but flot natural killer ceils. J Exp Med184, 289-93 (1996).
209. Levin, S.D. et al. Thymic stromal lymphopoietin: a cytokine that promotes thedevelopment of IgM+ B celis in vitro and signais via a novel mechanism. JImmunol 162, 677-$3 (1999).
210. Grabstein, K.H. et al. Inhibition of murine B and T lymphopoiesis in vivo byan anti-interleukin 7 monoclonal antibody. J Exp Med 178, 257-64 (1993).
211. Iwasaki-Arai, J., Iwasaki, H., Miyamoto, T., Watanabe, S. & Akashi, K.Enforced granulocyte/macrophage colony-stimulating factor signals do notsupport lymphopoiesis, but instmct lymphoid to myelomonocytic lineageconversion. J Exp Med 197, 13 11-22 (2003).
134
212. Radtke, F., Wilson, A., Mancini, S.J. & MacDonald, H.R. Notch regulation oflymphocyte development and function. Nat Immunol 5, 247-53 (2004).
213. Radtke, F. et aï. Deficient T ceÏi fate specification in mice with an inducedinactivation of Notchi. Immunity 10, 547-58 (1999).
214. Pui, J.C. et al. Notchl expression in early lymphopoiesis influences B versusT lineage determination. Immunity 11, 299-308 (1999).
215. Carvaiho, T.L, Mota-Santos, T., Cumano, A., Demengeot, J. & Vieira, P.Arrested B lymphopoiesis and persistence of activated B celis in aduitinterleukin 7(-/)- mice.JExpMed 194, 1141-50 (2001).
216. Corcoran, A.E. et ai. The interleukin-7 receptor alpha chain transmits distinctsignais for proliferation and differentiation during B iymphopoiesis. Embo J15, 1924-32 (1996).
217. Bussiinger, M. Transcriptional control of early B ceil development. Annu RevImmunol 22, 55-79 (2004).
218. Dias, S., Silva, H., Jr., Cumano, A. & Vieira, P. Interleukin-7 is necessary tomaintain the B ceil potential in common lymphoid progenitors. J Exp Med201, 971-9 (2005).
219. Kikuchi, K., Lai, A.Y., Hsu, C.L. & Kondo, M. IL-7 receptor signaling isnecessary for stage transition in aduit B celi development through upregulation of EBF. J Exp Med 201, 1197-203 (2005).
220. Kee, B.L & Murre, C. Induction of early B ceil factor (EBF) and multiple Blineage genes by the basic helix-loop-helix transcription factor E12. JExpMed 188, 699-713 (1998).
221. Metcalf, D. The molecular biology and functions of the granulocytemacrophage colony-stimulating factors. Blood 67, 257-67 (1986).
222. Richards, M.K., Liu, F., Iwasaki, H., Akashi, K. & Link, D.C. Pivotai role ofgranulocyte coiony-stimulating factor in the development of progenitors in thecommon myeloid pathway. Blood 102, 3562-8 (2003).
223. Socolovsky, M., Lodish, H.F. & Daley, G.Q. Control of hematopoieticdifferentiation: lack of specificity in signaling by cytokine receptors. FrocNatlAcadSci USA 95, 6573-5 (1998).
224. Rekhtman, N., Radparvar, F., Evans, T. & Skoultchi, A.I. Direct interaction ofhematopoietic transcription factors PU.1 and GATA-1: functional antagonismin erythroid celis. Genes Dey 13, 1398-411 (1999).
225. Zhang, P. et al. PU.1 inhibits GATA-1 function and erythroid differentiationby blocking GATA-1 DNA binding. Blood 96, 2641-8 (2000).
226. Zon, L.I., Youssoufian, H., Mather, C., Lodish, H.F. & Orkin, S.H. Activationof the erythropoietin receptor promoter by transcription factor GATA-1. FrocNatlAcadSci USA 88, 10638-41 (1991).
227. Matsumura, I. et al. Biologic significance of GATA-1 activities in Rasmediated megakaryocytic differentiation of hematopoietic ceil unes. Blood96, 2440-50 (2000).
22$. Zhang, P. et al. Negative cross-talk between hematopoietic regulators: GATAproteins repress PU.1. Froc NattAcad Sci USA 96, 8705-10 (1999).
229. Lieschke, G.J. et al. Mice lacking granulocyte coiony-stimulating factor havechronic neutropenia, granulocyte and macrophage progenitor ceil deficiency,and impaired neutrophil mobilization. Blood 84, 1737-46 (1994).
135
230. Liu, F., Wu, H.Y., Wesselschmidt, R., Kornaga, T. & Link, D.C. Impairedproduction and increased apoptosis of neutrophils in granulocyte colonystimulating factor receptor-deficient mice. Immunity 5, 491-501 (1996).
231. Liu, F., Poursine-Laurent, J. & Link, D.C. The granulocyte colony-stimulatingfactor receptor is required for the mobilization of murine hematopoieticprogenitors into peripheral blood by cyclophosphamide or interleukin-8 butflot fit-3 ligand. Btood 90, 2522-8 (1997).
232. Seymour, J.F. et al. Mice lacking both granulocyte colony-stimulating factor(CSF) and granulocyte-macrophage CSF have impaired reproductive capacity,perturbed neonatal granulopoiesis, lung disease, amyloidosis, and reducedlong-term survival. Btood 90, 3037-49 (1997).
233. Ohara, A. et al. Effect of recombinant human granulocyte colony-stimulatingfactor on hemopoietic ceils in serum-free culture. Exp Hematol 15, 695-9(1987).
234. Dahi, R. et al. Regulation of macrophage and neutrophil ceil fates by thePU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. NatImmunol 4, 1029-36 (2003).
235. Stanley, E.R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. MethodsEnzymol 116, 564-87 (1985).
236. Zhang, D.E. et al. Absence of granuiocyte colony-stimulating factor signalingand neutrophil development in CCAAT enhancer binding protein alphadeficient mice. Froc NatÏAcad Sci USA 94, 569-74 (1997).
237. Radomska, H.S. et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha is a regulatoryswitch sufficient for induction of granulocytic development from bipotentia!myeloid progenitors. Mol CeliBiol 18, 4301-14 (1998).
238. Anderson, K.L., Smith, K.A., Pio, F., Torbett, B.E. & Maki, R.A. Neutrophilsdeficient in PU.1 do flot terminally differentiate or become functionalÏycompetent. Blood 92, 1576-85 (1998).
239. Wang, X., Scott, E., Sawyers, C.L. & Friedman, A.D. C/EBPalpha bypassesgranulocyte coiony-stimulating factor signais to rapidly induce PU.1 geneexpression, stimulate granulocytic differentiation, and limit proliferation in32D cl3 myelobiasts. Blood 94, 560-7 1 (1999).
240. Zhang, D.E., Hetherington, C.J., Chen, H.M. & Tenen, D.G. The macrophagetranscription factor PU.1 directs tissue-specific expression of the macrophagecolony-stimuiating factor receptor. Mol CetÏBiol 14, 373-81 (1994).
241. Tamura, T., Nagamura-Inoue, T., Shmeltzer, Z., Kuwata, T. & Ozato, K.ICSBP directs bipotentiai myeioid progenitor celis to differentiate into maturemacrophages. Immunity 13, 155-65 (2000).
242. Jacobsen, F.W., Veiby, O.P., Skjonsberg, C. & Jacobsen, S.E. Nove! roie ofinterleukin 7 in mye!opoiesis: stimulation of primitive murine hematopoieticprogenitor ceils. JExp Med 178, 1777-82 (1993).
243. Rennick, D. et al. Interleukin-6 interacts with interleukin-4 and otherhematopoietic growth factors to selectiveiy enhance the growth ofmegakaryocytic, erythroid, myeloid, and multipotential progenitor celis.Blood 73, 1828-35 (1989).
136
244. Faltynek, C.R. et al. Administration of human recombinant IL-7 to normaland irradiated mice increases the numbers of lymphocytes and some immaturecelis of the myeloid lineage. Jlmmunot 149, 1276-82 (1992).
245. Parrish-Novak, J. et al. Interleukin 21 and its receptor are involved in NK celiexpansion and regulation of lymphocyte ftnction. Nature 408, 57-63 (2000).
246. Ozaki, K., Kikly, K., Michalovich, D., Young, P.R. & Leonard, W.J. Cloningof a type I cytokine receptor most related to the IL-2 receptor beta chain. FrocNatlAcadSci USA 97, 11439-44 (2000).
247. Cosman, D. The hematopoietin receptor superfamily. Cytokine 5, 95-106(1993).
248. Murakami, M. et al. Critical cytoplasmic region of the interleukin 6 signaitransducer gpl3O is conserved in the cytokine receptor family. Proc NatlAcadSci USA 88, 11349-53 (1991).
249. Asao, H. et ai. Cutting edge: the common gamma-chain is an indispensablesubunit of the IL-21 receptor complex. Jlmmunol 167, 1-5 (2001).
250. Habib, T., Senadheera, S., Weinberg, K. & Kaushansky, K. The comrnongamma chain (gamma c) is a required signaling component of the IL-21receptor and supports IL-21-induced celi proliferation via JAK3. Biochemistry41, 8725-31 (2002).
251. Parrish-Novak, J., Foster, D.C., Holly, R.D. & Ciegg, C.H. Interleukin-21 andthe IL-21 receptor: novel effectors of NK and T celi responses. JLeukoc Biot72, 85 6-63 (2002).
252. Alves, N.L., Arosa, F.A. & van Lier, R.A. IL-21 Sustains CD28 Expressionon IL-15-Activated Human Naive CD$+ T Ceils. J Immunol 175, 755-62(2005).
253. Jin, H., Carrio, R., Yu, A. & Malek, T.R. Distinct activation signais determinewhether IL-21 induces B celi costimulation, growth arrest, or Bim-dependentapoptosis. J Immunol 173, 657-65 (2004).
254. Brandt, K., Bulfone-Paus, S., foster, D.C. & Ruckert, R. Interleukin-21inhibits dendritic celi activation and maturation. Bïood 102, 4090-8 (2003).
255. Brandt, K. et al. Interleukin-21 inhibits dendritic cell-mediated T celiactivation and induction of contact hypersensitivity in vivo. J Invest Dermatol121, 1379-82 (2003).
256. Colins, M., Whitters, M.J. & Young, D.A. IL-21 and IL-21 receptor: a newcytokine pathway modulates innate and adaptive immunity. Immunol Res 28,13 1-40 (2003).
257. Pelletier, M., Bouchard, A. & Girard, D. In vivo and in vitro roles of IL-21 ininflammation. J Immttnol 173, 7521-30 (2004).
258. Chtanova, T. et ai. T foilicular helper ceils express a distinctive transcriptionaiprofile, reflecting their role as non-Thl/Th2 effector celis that provide help forB ceils. J Immunol 173, 68-78 (2004).
259. Wurster, A.L. et al. Interleuldn 21 is a T helper (Th) celi 2 cytokine thatspecifically inhibits the differentiation of naive Th celis into interferongamma-producing Thi ceils. J Exp Med 196, 969-77 (2002).
260. Mehta, D.S., Wurster, A.L., Weinmann, A.S. & Grusby, M.J. NfATc2 and Tbet contribute to T-helper-celi-subset-specific regulation of IL-21 expression.Froc NatlAcad Sci USA 102, 2016-21 (2005).
137
261. Mehta, D.S., Wurster, A.L & Grusby, M.J. Biology of IL-21 and the IL-21receptor. Immunol Rev 202, 84-95 (2004).
262. van Leeuwen, E.M. et al. Proliferation requirements of cytomegalovirusspecific, effector-type human CD8÷ T celis. J Immunol 169, 5838-43 (2002).
263. Khaled, A.R. & Durum, S.K. Lymphocide: cytokines and the control oflymphoid homeostasis. Nat Rev Imniunol 2, 817-30 (2002).
264. Di Carlo, E. et al. IL-21 induces tumor rejection by specific CTL and IFNgamma-dependent CXC chemokines in syngeneic mice. J Inimunol 172,1540-7 (2004).
265. Ma, Hi. et ai. IL-21 activates both innate and adaptive immunity to generatepotent antitumor responses that require perforin but are independent of IfNgamma. Jlmmunol 171, 608-15 (2003).
266. Mehta, D.S. et al. IL-21 induces the apoptosis of resting and activated primaryB cells.Jlmrnunot 170, 4111-8 (2003).
267. Ozaki, K. et al. A critical foie for IL-21 in regulating immunoglobulinproduction. Science 298, 1630-4 (2002).
26$. Pene, J. et al. Cutting edge: IL-21 is a switch factor for the production of IgGiand IgG3 by human B celis. Jlmmunol 172, 5154-7 (2004).
269. Suto, A. et al. Interleukin 21 prevents antigen-induced IgE production byinhibiting germ une C(epsiion) transcription of IL-4-stimulated B celis. Blood100, 4565-73 (2002).
270. Ozaki, K. et al. Regulation of B ceil differentiation and plasma ceil generationby IL-21, a nove! inducer of Blimp-1 and Bd-6. J Immunol 173, 5361-71(2004).
271. Strengeil, M. et al. IL-21 in synergy with IL-15 or IL-18 enhances IFNgamma production in human NK and T celis. J Imrnttnol 170, 5464-9 (2003).
272. Carson, W.E. et ai. A potentiai role for interleukin-15 in the regulation ofhuman natural killer ceil survival. J Clin Invest 99, 937-43 (1997).
273. Brady, J., Hayakawa, Y., Smyth, M.J. & Nutt, S.L. IL-21 induces thefunctionai maturation of murine NK celis. J Immunol 172, 2048-58 (2004).
274. Bennett, F. et al. Program death-1 engagement upon TCR activation basdistinct effects on costimulation and cytokine-driven proliferation: attenuationof ICOS, IL-4, and IL-21, but flot CD28, IL-7, and IL-15 responses. JImmunol 170, 7 11-8 (2003).
275. Ugai, S. et al. Expression of the interleukin-21 gene in murine coloncarcinoma celis generates systemic immunity in the inoculated hosts. CancerGene Ther 10, 187-92 (2003).
276. Kishida, T. et ai. Interleukin (IL)-21 and IL-15 genetic transfer synergisticallyaugments therapeutic antitumor immunity and promotes regression ofmetastatic lymphoma. Mot Ther 8, 552-8 (2003).
277. Moroz, A. et al. IL-21 enhances and sustains CD$+ T ceil responses toachieve durable tumor immunity: comparative evaluation of IL-2, IL-15, andIL-21. Jlmmunot 173, 900-9 (2004).
27$. King, C., hic, A., Koelsch, K. & Sarvetnick, N. Homeostatic expansion of Tceils during immune insufficiency generates autoimmunity. Celi 117, 265-77(2004).
138
279. Voilmer, T.L. et al. Differential effects of IL-21 during initiation andprogression of autoimmunity against neuroantigen. J Immunol 174, 2696-701(2005).
280. Pircher, H. et al. T ceil tolerance to Misa encoded antigens in T celi receptorV beta 8.1 chain transgenic mice. Embo f8, 719-27 (1989).
281. Nishimura, H. et al. Differentiai roies of interleukin 15 mRNA isoformsgenerated by alternative spiicing in immune responses in vivo. J Exp Med191, 157-70 (2000).
282. Marks-Konczalik, J. et al. IL-2-induced activation-induced celi death isinhibited in IL-15 transgenic mice. Froc NatlAcad Sci USA 97, 11445-50(2000).
283. Umemura, M., Nishimura, H., Hirose, K., Matsuguchi, T. & Yoshikai, Y.Overexpression of IL-15 in vivo enhances protection against Mycobacteriumbovis bacillus Calmette-Guerin infection via augmentation of NK and Tcytotoxic 1 responses. Jlmmunol 167, 946-56 (2001).
284. Ichui, H. et al. Role for Bd-6 in the generation and maintenance of memoryCD8+ T celis. Nat Immunol 3, 558-63 (2002).
285. Ichii, H., Sakamoto, A., Kuroda, Y. & Tokuhisa, T. Bcl6 acts as an amplifierfor the generation and proliferative capacity of central memory CD8+ T celis.Jlmmunol 173, 883-91 (2004).
286. Ailman, D. et al. BCL-6 expression during B-ceil activation. Blood 87, 5257-68 (1996).
287. fukuda, T. et al. The murine BCL6 gene is induced in activated lymphocytesas an immediate early gene. Oncogene 11, 1657-63 (1995).
288. Cattoretti, G. et al. BCL-6 protein is expressed in germinal-center B celis.Blood 86, 45-53 (1995).
289. Chaffin, K.E. et al. Dissection of thymocyte signaling pathways by in vivoexpression of pertussis toxin ADP-ribosyitransferase. Embo J 9, 3821-9(1990).
290. Scheeren, F.A. et al. STAT5 regulates the seif-renewal capacity anddifferentiation of human memory B ceils and controls Bd-6 expression. NatImmunol 6, 303-13 (2005).
291. Tanchot, C. et al. Conversion of naive T celis to a memory-like phenotype inlymphopenic hosts is not reiated to a homeostatic mechanism that fiils theperipheral naive T cefi pool. J Immunot 168, 5042-6 (2002).
292. Mackail, C.L., Granger, L., Sheard, M.A., Cepeda, R. & Gress, R.E. T-ceilregeneration after bone marrow transplantation: differential CD45 isoformexpression on thymic-derived versus thymic-independent progeny. Blood $2,2585-94 (1993).
293. Tanchot, C. & Rocha, B. The peripheral T ceil repertoire: independenthomeostatic regulation of virgin and activated CD8+ T celi pools. Eur JImmunol 25, 2127-36 (1995).
294. Mackali, C.L., Hakim, f.T. & Gress, R.E. Restoration of T-cell homeostasisafter T-celi depletion. Semin Immunol 9, 339-46 (1997).
295. Seddon, B. & Zamoyska, R. TCR and IL-7 receptor signais can operateindependently or synergize to promote lymphopenia-induced expansion ofnaive T celis. J Immunol 169, 3752-9 (2002).
139
296. Park, J.H. et al. Suppression of IL7Ralpha transcription by IL-7 and otherprosurvival cytokines: a novel mechanism for maximizing IL-7-dependent Tceli survival. Inzmunity 21, 289-302 (2004).
297. Judge, A.D., Zhang, X., Fujii, H., Surh, C.D. & Sprent, J. Interleukin 15controls both proliferation and survival of a subset of memory-phenotypeCD8(+) T celis. JExp Med 196, 935-46 (2002).
298. Kamimura, D. et al. Evidence of a novel IL-2115R beta-targeted cytokineinvolved in homeostatic proliferation of memory CD8+ T ceils. J Immunot173, 6041-9 (2004).
299. Mertsching, E., Grawunder, U., Meyer, V., Rolink, T. & Ceredig, R.Phenotypic and functional analysis of B lymphopoiesis in interleukin-7-transgenic mice: expansion of pro/pre-B ceil number and persistence of Blymphocyte development in lymph nodes and spleen. Eur J Immunot 26, 28-33 (1996).
300. Valenzona, H.O., Pointer, R., Ceredig, R. & Osmond, D.G. PrelymphomatousB ceil hyperpiasia in the bone marrow of interleukin-7 transgenic mice:precursor B celi dynamics, microenvironmental organization and osteolysis.Exp Hematol 24, 1521-9 (1996).
301. Hara, H. & Ogawa, M. Erthropoietic precursors in mice withphenylhydrazine-induced anemia. Am J Hematot 1, 453-8 (1976).
302. Broudy, V.C., Lin, N.L., Priestley, G.V., Nocka, K. & Wolf, N.S. Interactionof stem ceil factor and its receptor c-kit mediates lodgment and acuteexpansion of hematopoietic ceils in the murine spleen. Blood $8, 75-8 1(1996).
303. Obinata, M. & Yanai, N. Cellular and molecular regulation of anerythropoietic inductive microenvironment (EIM). Celi Struct funct 24, 17 1-9(1999).
304. Akashi, K., Kondo, M., von Freeden-Jeffry, U., Murray, R. & Weissman, I.L.Bd-2 rescues T lymphopoiesis in interleukin-7 receptor-deficient mice. Ceti89, 1033-41 (1997).
305. van Dijk, T.B. et al. Cloning and characterization of the human interleukin-3(IL-3)/IL-5/ granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor betacgene: regulation by Ets family members. Blood 92, 3636-46 (1998).
306. Akagawa, E., Muto, A., Arai, K. & Watanabe, S. Analysis of the 5’ promotersfor human IL-3 and GM-CSf receptor alpha genes. Biochem Biophys ResCommun 300, 600-8 (2003).
307. O’Riordan, M. & Grosschedl, R. Coordinate regulation of B celidifferentiation by the transcription factors EBF and E2A. Immunity 11, 21-3 1(1999).
308. Maitra, S. & Atchison, M. BSAP can repress enhancer activity by targetingPU.1 function. Mol CetiBiol 20, 1911-22 (2000).
309. Chen, H. et al. PU.; (Spi-1) autoregulates its expression in myeloid ceils.Oncogene 11, 1549-60 (1995).
310. Reddy, V.A. et al. Granulocyte inducer C/EBPalpha inactivates the myeloidmaster regulator PU.1: possible role in lineage commitment decisions. Blood100, 483-90 (2002).
DD
D