Nouveautés en Génétique Moléculaire des Cancers
Pr JP Merlio Service de Biologie des Tumeurs et CRB Cancer CHU BORDEAUX
INSERM U1053 Université de Bordeaux
Réunion du Réseau de Cancérologie d’Aquitaine
[email protected] 28 Novembre 2015
Why? How? What?
Liens d’intérêts: rémunération personnelle = 0 Contrats Pfizer, Abbott, Roche, Boerhinger avec CHU de Bordeaux, Université ou ADERA
Plan
1. Rappel sur la génétique somatique des cancers
2. Le Séquençage Nouvelle Génération (NGS)
3. Cellules tumorales circulantes
4. ADN circulant - PCR digitale - NGS - Autres techniques
Mutation ponctuelle
Anomalie de nombre
1 chromosome Délétion Insertion Inversion Amplification
Plusieurs chr. Translocation Insertion
Cellule
Chromosome
ADN Double brin
Anomalie de structure
Anomalie de nombre
Macrolésions:
Microlésions
Anomalies épigénétiques - Méthylation - Acétylation des histones - …
Mutations oncogéniques somatiques ou acquises
Hardin J, Bertoni G, Kleinsmith LJ. Becker’s World of the Cell 8th edition. Pearson.
Protéine anormale (hyperactive)
Mutation ponctuelle
Protéine normale en excès
Amplification génique
Chromosome avec translocation
Protéine normale en excès
Néoprotéine chimérique
(hyperactive)
Translocation chromosomique
ou
ADN
Proto-oncogene
Les anomalies drivers ou pilotes de la tumeur sont des cibles phamarcologiques
Les analyses de génétique moléculaire somatique sont dans le continuum des analyses des pathologistes (microscopie) car elles se font sur le matériel tumoral
K sein/estomac : Her2 K colorectal : RAS Lymphomes, sarcomes et translocations … K poumon : EGFR, ALK… Mélanome : BRAF…
• Outils moléculaires utilisés: IHC (pathologistes): proteine FISH sur lames
Biologie moléculaire sur ADN, ARN: PCR, q-PCR, Séquençage, NGS Protéomique: à venir
Diagnostic Pronostic Traitement
La gestion d’un tissu inclus en paraffine 1-La qualité préanalytique (délai de fixation, durée)
2- Economie du matériel par pathologiste Demande d’analyse par le clinicien puis envoi par pathologiste
Recherche de mutations Recherche en IHC/FISH Sélection par un pathologiste de la zone tumorale (lame colorée) 3 ou 4 coupes au
microtome Exclusion des zones nécrosées ou non tumorale Estimation du pourcentage decellules tumorales (<5%= non réalisé <10% non contributif si wt)
Déparaffinage
Extraction
Punch de la zone Sélectionnée (macrodissection)
Lame colorée (HES)
Tissu inclus en paraffine
Coupe au microtome Sélections
Analyser un matériel assez riche en cellules tumorales
Macro-dissection
>75% <25%
Difficultés techniques
Hétérogénéité et évolution rapides des techniques ADN parfois dégradés par la fixation
Détermination du statut KRAS en pratique
Digestion tampon TNE + protéinase K
Incubation la nuit à 55°C
Lysat cellulaire
élution
Coupe Forage
ADN
J1
J2
Quantification des ADN
J-1 sélection cerclage
Extraction d’ADN à partir de tissus fixés
1ère étape : extraction de l’ADN
• À partir de quel matériel ? Congélation, blocs (coupes, punch) • Lyse des cellules et tissus
• Extraction par détergents
• Précipitation des protéines Précipitation de l’ADN
• Dissous dans un tampon
• Dosage UV
La réaction de PCR : que met-on dans la machine ?
L’ADN extrait (tumeur)
L’enzyme = ADN-polymérase A
T
C G
A A A
G
G C
C C
T T T
Des nucléotides Désoxy-ribo-nucléotides
Amorces spécifiques du gène à amplifier
1er cycle de PCR
N cycles de PCR → quantité ADN x eN
Dénaturation
Hybridation des amorces
Elongation : synthèse du brin complémentaire
Cycle 1 2 molécules Cycle 2
4 molécules Cycle 3 8 molécules
Cycle 4 : 16 …
Séquençage – EXEMPLE
KRAS, EGFR, CKIT, BRAF…
A G C
A G/C C
Sérine
Thréonine
C A T C A G C A A A G A C A A
C A T C A C C A A A G A C A A
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
100% NCI-H1975
EGFR exon 21 c.2573T>G
p.L858R
Réaction de séquence et d’analyse de l’ensemble des molécules
• La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR en point final
• Différence: amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel
• A chaque cycle d’amplification, la quantité d ’ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits
– Syber Green: intercalant – Sondes Taqman – FRET etc…
• Obtention d’une cinétique de la réaction • Quantification possible
qPCR : rappels
Seuil
Signal
Cycles 10 20 30 0
Bruit de fond
Phase exponentielle
Plateau Éch. 1 Éch. 2
PCR quantitative: Principe de la quantification
Cibles thérapeutiques dans le CBNPC
MSTO/IASCLC 2012 − D’après Kris M et al., Targeted therapies actualisé
1999
KRAS
Inconnu 75 %
2004
Inconnu 60 %
KRAS
EGFR
Inconnu 35 %
KRAS
EGFR
Sélumétinib Tramétinib ?
Géfitinib Erlotinib Afatinib Dacomitinib CO1686 ? Crizotinib
LDK378 CH5424802
ALK
PIK3CA MK2206 ? BKM120 ?
BRAF Vémurafénib ? GDC0879 ? Régorafénib ? Inhibiteurs de MEK ?
MET MetMAb ? ARQ197 ? HER2
Afatinib ? Dacomitinib ?
MEK Sélumétinib ?
ROS1 Crizotinib
RET Vandétanib ? L184 ? Sunitinib ?
Les stratégies moléculaires ciblées ont permis jusqu’à aujourd’hui de proposer une médecine personnalisée aux patients
Mais elles ont atteint leurs limites avec de petites quantités de tissu et un grand nombre de gènes à étudier
Nous savons que le nombre de biomarqueurs va continuer à augmenter +++
Les algorithmes d’analyses hierarchisées ne sont pas utilisés
Aujourd’hui: les techniques à haut débit
Principes généraux du NGS
• Le NGS ou séquençage nouvelle génération ADN : Whole Genome, Whole Exome ou ciblé ARN : RNAseq (transcriptome, transcrits de fusion, découverte de nouveaux transcrits…), smallRNAseq (transcriptome de microARN, découverte de petits ARN…)
Principes généraux du NGS
Stratégie de fabrication de la Librairie: 2 approches
Capture Amplicon
Amplicon
Pratique au Service de Biologie des Tumeurs
Stratégie:
• Panel de gènes custom • Construction de la librairie par ampliseq (amplicons) • Amplification par PCR en émulsion • Séquençage sur PGM IonTorrent
Du prélèvement au Compte-Rendu biologique
• Extraction de l’ADN (FFPE, congélation ou plasma)
• Analyse moléculaire par NGS: synthèse librairie, amplification clonale et séquençage
• Interprétation de l’analyse: Vérification des témoins, vérification de l’absence de contamination Analyse des ADN patient (+/- technique complémentaire)
• Réalisation du Compte-Rendu biologique
Gene exon c. p. Var.freq.PIK3CA 21 c.3140A>G p.(His1047Arg) 25EGFR 18 c.2155G>A p.(Gly719Ser) 16,65EGFR 19 c.2235_2249del p.(Glu746_Ala750del) 6EGFR 20 c.2369C>T p.(Thr790Met) 6EGFR 21 c.2573T>G p.(Leu858Arg) 6EGFR 21 c.2582T>A p.(Leu861Gln) 6BRAF 15 c.1799T>A p.(Val600Glu) 34KRAS 4 c.436G>A p.(Ala146Thr) 8KRAS 2 c.38G>A p.(Gly13Asp) 8KRAS 2 c.35G>A p.(Gly12Asp) 8
Compte-Rendu biologique Conclusion : Selon les recommandations en vigueur, seules les mutations pouvant avoir un impact thérapeutique sont mentionnées ci-dessous : Absence de détection de mutation des exons 11, 15 du gène BRAF, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Mise en évidence de la mutation c.2236_2250del; p.(Glu746_Ala750del) dans l'exon 19 du gène EGFR. Mutant sensible aux inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase. Mise en évidence de la mutation c.2369C>T; p.(Thr790Met) dans l'exon 20 du gène EGFR. Mutation liée, dans l'état actuel des connaissances, à la résistance aux inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase de l'EGFR. Absence de détection de mutation des exons 18, 21 du gène EGFR, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Absence de détection de mutation de l'exon 20 du gène ERBB2, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Absence de détection de mutation des exons 2, 3, 4 du gène KRAS, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Absence de détection de mutation des exons 10, 21 du gène PIK3CA, dans la limite du prélèvement analysés et des techniques utilisées. Les essais cliniques en cours sont consultables sur le site <http://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Essais-cliniques-et-therapies-ciblees>.
Pratique au Service de Biologie des Tumeurs
Liste des cibles actionnables tumeurs solides: selon recommandation INCA
Nouvelles techniques
Séquençage nouvelle génération (NGS)
Ciblées sur un panel de cibles « actionnables »
Fragments d’exons hotspot
Analyse par PCR en pont ou en émulsion
Semi globales : Exome sequencing: régions codantes
Génome entier
Avantage par le nombre de mutations simultanément étudiées
Avantage par sensibilité en théorie
NGS et PCR digitale
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAA
Réaction d’amplification et de séquence individuelles pour chaque molécule
Plan
1. Le Séquençage Nouvelle Génération (NGS)
2. Cellules tumorales circulantes
3. ADN circulant
4. PCR digitale
• Biopsie liquide Analyse pour les CTC: sang total
Analyse plasmatique, ADN tumoral circulant
Tumeur primitive ou métastase
Eviter le relargage d’ADN d’ADN normal par les cellules nucléées sanguines
Rappels - Généralités
Qu’est ce qu’une CTC? • Constitue le lien entre la tumeur primitive et la métastase • Transite par le sang (cancer du poumon) ou les vaisseaux lymphatiques (cancer
du sein) • +/- Potentiel invasif et de dissémination tissulaire • Rôle dans la récidive (cellules dormantes et phénomène de « tumor-self
seeding »)
Passage dans le sang des CTC: • Évènement probablement très précoce de la carcinogénèse • Passage trans-endothélial et dans la circulation sanguine facilité par le
phénomène de transition-épithélio-mésenchymateuse (TEM), • CTC présentes en très faible quantité dans le sang : évènements très rares (1 à
10 CTC par mL de sang) Nécessité d’un niveau de sensibilité élevé
Principes généraux pour la détection des CTC:
• Immunodétection : capture des CTC grâce à l’expression de certains Ag qui
ne sont pas présents sur les cellules sanguines CellSearch® basée sur l’enrichissement de cellules exprimant l’Ag EpCAM • Isolement des CTC par leur densité (> à celle des éléments figurés du sang) Méthode OncoQuick® • Isolement des CTC par leur taille et morphologie: Enrichissement direct en
cellules épithéliales par filtration Méthode ISET® (Isolation by Size of Epithelial Tumor cell), CTC sont plus grosses que les autres cellules du sang : 25-30 µm; puis coloration cytochimique pour analyse morphologique
(GR = 7 µm, Ly non activé = 9-10 µm, PNN non activé = 15-20 µm)
Méthode de détection des CTC
Hofman V et al, Anatomie et cytologie pathologiques, revue francophone des laboratoires 2013
Intérêt des CTC en cancérologie
Intérêt des CTC en cancérologie : • Diagnostic : diagnostic précoce, résidu tumoral microscopique • Pronostic : existe t-il une corrélation avec le risque métastatique et la survie ? • Prévention : détection dans des populations à risque (dépistage)
Caractérisations moléculaires des CTC : • Biopsie en « temps réel » • Théranostic : thérapeutique ciblée et détection de résistance au traitement • Compréhension des mécanismes tumoraux et recherche de nouvelles cibles
thérapeutiques (gènes) • Greffe de CTC pour évaluation préclinique (ex mélanome)
Libération d’ADN dans le sang
ADN provenant de la destruction des cellules normales circule librement dans le sang. Chez un patient ayant un cancer, on retrouve en plus de l’ADN provenant de la tumeur.
Taux d’ADN circulant : • Individus sains : dizaines de ng/ml • Si progression tumorale : centaines de ng/ml Corrélation entre le taux d’ADN circulant et la progression tumorale dans la plupart des cancers.
Crowley, E. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2013
Libération d’ADN dans le sang
Origine, plusieurs hypothèses : • Dégradation naturelle des cellules normales
ou tumorales • Apoptose ou nécrose des cellules de la
tumeur primitive • Relargage actif d’ADN par les cellules
tumorales ou leur passage dans le système vasculaire suivi d’une mort cellulaire
• Lyse des cellules cancéreuses en circulation dans le plasma ou micrométastases
Présence d’ADN tumoral circulant = conséquence d’une circulation des cellules tumorales dans un processus métastatique
Pourquoi détecter les altérations de la tumeur au niveau de l’ADN circulant ?
Recherche altération sans prélèvement tumoral • Prélèvement en suivi tissulaire non réalisable • Matériel épuisé • Mauvaise qualité ADN (métastases osseuses) • Prélèvements disponibles pauvres en cellules tumorales • Reflet global des différents sites métastatiques
Suivi efficacité traitement • Rémission moléculaire de la mutation EGFR cible (ex : disparition mutation activatrice
EGFR)
Détection rechute • Réapparition mutation cible • Apparition mutation résistance
Facteur pronostique ?
Gestion des échantillons
Centrifuger tube de sang <4h après le prélèvement Conservation du plasma entre -20°C à -80°C Conservation des ADN circulants extraits à -20°C Eviter les cycles de décongélation-recongélation répétés
Echantillons prélevés stables jusqu’à 10 jours à TA Pas de centri/congelation au niveau du site préleveur, mais coût
Tube EDTA
2x Tube CELL-FREE DNA BCT
2x
10 mL
Extraction et Amplification
• Extraction du plasma: • Kits d’extraction spécifiques:
ex. Extraction kit Qiagen QIAAMP circulating nucleic acid
• Analyse de l’échantillon : Technique suffisamment sensible!
Connecting system
Système d’aspiration: extraction sur colonne
Altérations génétiques détectables dans l’ADN tumoral libre circulant
• Libération de petits fragments d’ADN libre dans la circulation (par différents mécanismes) par les cellules tumorales
• Mutations ponctuelles (EGFR et KRAS) • Variation du nombre de copies,
amplifications (HER2 et MET) • Réarrangements chromosomiques
(EML4-ALK) • Profils de méthylation
Perspectives et Conclusion
Nouvelles perspectives en oncologie: • Classification morphologique et génétique somatique (ADN) de la tumeur
• Génomique: Exome, miROme, methylome
Apport de la biopsie liquide (CTC, ADN circulant): • Dépistage, diagnostic moléculaire sans tissu • « Monitoring » de la maladie et résistance • Evaluation / imagerie, marqueurs tumoraux, re-biopsie site progression
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