PHYTOREMEDIATION DES METAUX
Laurence MARQUES Université Montpellier 2
FLBI455
A- Les caractéristiques de la pollution métallique
B- Bases de la physiologie des métaux chez les plantes
C- La phytoremédiation
C1- la phytostabilisation
exemple du projet européen Difpolmine dans l’Aude
C2- la phytovolatilisation
C3- la phytodégradation
C4- la phytoextraction
les plantes hyperaccumulatrices de métaux
les limites
la recherche
D- Deux exemples approfondis de physiologie des métaux
D1- la tolérance à l’aluminium
D2- la tolérance au cadmium
LE STRESS METALLIQUE EST UN STRESS ABIOTIQUE
Heavy metals
UV
Laurence Marquès UM2
Contact cutané
Ingestion
directe
Alimentationanimale
Alimentation
végétale
Eau
Poisson
Ingestion/conta
ct cutané
Inhalaltion,
vapeur,
poussière
LA POLLUTION METALLIQUE DES SOLS EST UN
PROBLEME DE SANTE PUBLIQUE
Laurence Marquès UM2
POLLUTION INORGANIQUE :
engrais (nitrate, phosphate)
métaux (Cd, As, Hg, Pb, Ni, Zn)
et radioéléments
POLLUTION ORGANIQUE :
hydrocarbures
solvants chlorés
pesticides
composés nitrés
LES CONTAMINANTS MAJEURS DES SOLS
Nriagu, 1996, Science
1940
1910
Laurence Marquès UM2
3Cd
Autres
Solvants
Metaux
Hydrocarbures
Polluants dans les
nappes phréatiques
15,6
7,5
4Ni
5,4As
6Cu
6,6Cr
7,5Zn
9Pb
35,4
Répartition (%)
ORIGINE DE LA CONTAMINATION DIFFUSE DES SOLS ET DE
L’EAU EN FRANCE
Rapport de l'Académie des sciences n°42, Août 1998
http://www.senat.fr/rap/l00-261/l00-26182
Laurence Marquès UM2
LES METAUX ET LA BIOLOGIE
Cr, Al, As, Cd, Hg, Pb SONT NON-ESSENTIELS et TOXIQUES
Fe, Zn, Mg, Mn, Cu… sont ESSENTIELS mais peuvent devenir TOXIQUES lorsqu’ils
sont présents en excès
Relativement faible DISPONIBILITE des métaux du sol pour les plantes car les
ions (petites molécules chargées) ne peuvent pas traverser les membranes
biologiques par simple diffusion.
Laurence Marquès UM2
Exemple du fer
Excès Symptomes de « bronzing »
Carencesymptomes de chlorose
L’homéostasie des métaux doit être finement contrôlée pour éviter les effets
délétères.
Laurence Marquès UM2
NE MARCHE PAS ….
LA POLLUTION METALLIQUE EST UNE POLLUTION TERMINALE
DEUX SOLUTIONS POSSIBLES :
DILUTIONDILUTION
ou
CONCENTRATION et CONFINEMENTCONCENTRATION et CONFINEMENT
Laurence Marquès UM2
Pollution des sols par les métaux lourds
Pression forte sur
les végétauxProblèmes socio-
économiques Problème de santé
publiqueRéduction de
biodiversité
Sélection de végétaux
tolérants et/ou hyperaccumulateurs
Laurence Marquès UM2
Zn contamination Zn, Cd and Pb contamination
Ancien bassin de décantation à St Laurent-le-Minier (34)
Thlaspi caerulescens: petite brassicacée hyperaccumultrice de Zn et de Cd
Laurence Marquès UM2
LES IONS METALLIQUES DANS LES PLANTES
Redistribution/ Stockage
transporteurs transmembranaires: INFLUX
chélateurs
Translocation
transporteurs transmembranaires: EFFLUX
chélateurs
Absorption
--> transporteurs transmembranaires: INFLUX
Laurence Marquès UM2
Transporteurs de métaux identifiés chez les plantes
(Clemens S. (2001) Planta, 212:475-486)
famille CDF
famille ZIP
famille NRAMP
Antiport
cations/H+
ATPases
type-P
ATPases ABC
Influx : entrée dans le cytoplasme
Efflux : sortie du cytoplasme (vers l’apoplasme ou les compartiments intracellulaires)
Laurence Marquès UM2
Les chélateurs connus pour jouer un rôle dans la tolérance auxmétaux: détoxification et stockage
Acides organiques: citrate, malate, oxalate (Al, sève brute)
Acides aminés: histidine (Ni)
Nicotianamine (Ni)
Phytochelatines (Cd, vacuole)
Metallothionines (Zn, Cu, cytoplasme)
Laurence Marquès UM2
PHYTOREMEDIATION : « FROM GREEN TO CLEAN »
La remédiation physique et chimique des sols contaminés par les métaux lourds
est un procédé lourd et très chers ( plus de 1.5 M / ha).
Les racines explorent de grands
volumes de sols
Les plantes utilisent l’énergie
solaire pour pomper les métaux
Laurence Marquès UM2
PHYTODEGRADATIONPHYTODEGRADATION
PHYTOSTABILISATIONPHYTOSTABILISATION
PHYTOVOLATILISATIONPHYTOVOLATILISATION
PHYTOEXTRACTIONPHYTOEXTRACTION
SHOOTS
=
solar-driven pump
RHIZOSPHERE
(roots + microbes)
=
sensor + extractoruptake
. ..... .. ... .
...
. .
..... .
..
.
. .
.... ..
leaching
dust =air pollution herbivory = food chain entrance
ground water pollution
Pb
Pb
TNT
Zn
Zn
Zn
Se
Laurence Marquès UM2
PHYTOREMEDIATION :
un ensemble de technologies vertes et durables
PHYTOSTABILISATIONPHYTOSTABILISATION
SHOOTS
=
solar-driven pump
RHIZOSPHERE
(roots + microbes)
=
sensor + extractor
. ..... .. ... .
... .
..... .
..
.
.
. ..
leaching
dust =air pollution herbivory = food chain entrance
ground water pollution
Pb
Pb
TNT
PHYTOREMEDIATION :
un ensemble de technologies vertes et durables
Laurence Marquès UM2
OBJECTIF:OBJECTIF:
Utilisation des Utilisation des plantes plantes pour pour éviter éviter la la dispersion de la pollutiondispersion de la pollution
CARACTERISTIQUES:CARACTERISTIQUES:
Efficace Efficace pour pour prévenir prévenir le le lessivage vers lessivage vers les zones non les zones non polluéespolluées
Efficace contre lEfficace contre l’é’érosion éoliennerosion éolienne
Les Les espèces choisies doivent espèces choisies doivent posséder posséder un un système racinaire étendusystème racinaire étendu, , êtreêtre
tolérantes tolérantes aux aux métaux mais métaux mais non non accumulatricesaccumulatrices pour pour éviter léviter l’’entréeentrée
dans dans la la chaine alimentairechaine alimentaire
LIMITES:LIMITES:
La pollution La pollution est toujours présenteest toujours présente
Survie Survie des des plantesplantes
PHYTOSTABILISATION
Laurence Marquès UM2
Plantations de peupliers
IRD New Caledonia
Espèces endémiques
Réalisations
Laurence Marquès UM2
Le site de la Combe du Saut à Salsignes (Aude)
Ancienne mine d’or, ce site est fortement pollué par l’arsenic,
une pollution endémique fortement aggravée par l’exploitation
de la mine d’or
Usine metaleurope en 2002
2006Laurence Marquès UM2
Eau potable :
10 µg / l
0,01 ppm
Concentration dans les sols en surface Ruisellement à la Combe du Saut
Concentration dans les eaux de ruissellement
Laurence Marquès UM2
Le projet européen Difpolmine
Laurence Marquès UM2
Amendement = grenaille de fer Deux parcelles d’essai
avec sans
grenaille
Légumineuse et graminée utilisées pour le repeuplement
Laurence Marquès UM2
Vue aérienne dusite en 2006
Image numériquede la maquettedu projet
Laurence Marquès UM2
PHYTODEGRADATIONPHYTODEGRADATION
SHOOTS
=
solar-driven pump
RHIZOSPHERE
(roots + microbes)
=
sensor + extractor
. ..... .. ... .
...
. .
..... .
..
.
.
.... ..
leaching
dust =air pollution herbivory = food chain entrance
ground water pollution
TNT
Laurence Marquès UM2
PHYTOREMEDIATION :
un ensemble de technologies vertes et durables
PHYTODEGRADATION
AIM: Transform pollutants into non toxic products
CHARACTERISTICS:CHARACTERISTICS:
Phytodegradation is the technology of choice to remediate
organic pollutionorganic pollution
A cleaning up of the site is achieved
Both plant cells and rhizospheric microbes participate to the
degradation
LIMIT:LIMIT:
METALS CANNOT BE PHYTODEGRADATED
Laurence Marquès UM2
PHYTOVOLATILISATIONPHYTOVOLATILISATION
SHOOTS
=
solar-driven pump
RHIZOSPHERE
(roots + microbes)
=
sensor + extractor
. ..... .. ... .
...
. .
..... .
..
.
.
.... ..
leaching
dust =air pollution herbivory = food chain entrance
ground water pollution
Se
PHYTOVOLATILISATIONPHYTOVOLATILISATION Se
Laurence Marquès UM2
PHYTOREMEDIATION :
un ensemble de technologies vertes et durables
AIM: Dilute pollutant in the atmosphere
CHARACTERISTICS:CHARACTERISTICS:
Plants can naturally volatilize Se : DMSe is volatil
Microbes can naturally volatilize Se and Hg: Hg0 is volatil
Cleaning up of the site is achieved
LIMIT:LIMIT:
Se and Hg are the only metals that can be volatilized
PHYTOVOLATILIZATION
Laurence Marquès UM2
Exemple de la raffinerie de pétrole Chevron à Richmond (Californie)::
le marais phytovolatilise 89% du Se relargué par la raffinerie.
http://epics.ecn.purdue.edu
Construction de marais artificiels
Laurence Marquès UM2
Phytovolatilisation du sélénium
(Terry N, Plant Physiol., 1999, 119, 565)
Le Se est métabolisé par les enzymes de la voied’assimilation du sulfate.Il se forme de la SeMet qui peut être méthylée enDMSe VOLATIL.
Les marais sont des biotopes dans lesquels le Se estnaturellement fortement volatilisé
MODELE DE PRELEVEMENT ETMETABOLISATION DU Se
ROLE DES BACTERIES DANS L’ACCUMULATION DU Se PAR LES PLANTES
Axenic Plus bacteria
No Se
20 µM Se
Laurence Marquès UM2
PGM et nouveaux procédés de remédiation
Hg(II) toxique
merA protéine bactérienne
Hg0 VOLATILE et moins toxique
Problème de la dissémination des PGMs…
Laurence Marquès UM2
PHYTOEXTRACTIONPHYTOEXTRACTION
SHOOTS
=
solar-driven pump
RHIZOSPHERE
(roots + microbes)
=
sensor + extractoruptake
. ..... .. ... .
...
. .
..... .
..
.
. .
. ..
leaching
dust =air pollution herbivory = food chain entrance
ground water pollution
Zn
Zn
Zn
Laurence Marquès UM2
PHYTOREMEDIATION :
un ensemble de technologies vertes et durables
PHYTOEXTRACTION
CHARACTERISTICS:CHARACTERISTICS:
It does not transform the pollutant
Use in the case of terminal pollution as
metallic pollution
It needs TRANSLOCATIONTRANSLOCATION from root to
shoot what is a great limiting factor
AIM: AIM: ExtractionExtraction of the pollutant from the soil using the of the pollutant from the soil using the solar-drivensolar-driven
forceforce andand concentrationconcentration in aerial harvestable part of the plantin aerial harvestable part of the plant
Laurence Marquès UM2
Niemeyera (Sebertia) acuminata
20% de nickel en poids secs dans la sève !
LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE METAUX
« Le sève bleue »
Laurence Marquès UM2
Arabidopsis halleri : zone urbaine près de l’ancienne usine Metaleurope à
Auby (59), hyperaccumulateur de Zn et Cd
LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE METAUX
Laurence Marquès UM2
Ancien bassin de décantation à St Laurent-le-Minier (34)
Thlaspi caerulescens: petite brassicacée hyperaccumulatrice de Zn, de Ni et de Cd
LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE METAUX
Laurence Marquès UM2
LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE MÉTAUX
Accumulation dans les partiesaériennes : jusqu’à plusieurs % / gMS sans effet néfaste
Augmentation de la translocation
Augmentation de l’absorptionracinaire
Hyperaccumulation:
teneur foliaire > teneur racinaire
Laurence Marquès UM2
Whiting et al., New Phytol., 2000
Homogeneous Zn pollution No pollution Zn pollution
Exploration du sol par les racines
Thlaspi caerulescens
Laurence Marquès UM2
Différences de prélèvements racinaires entre
T. arvense et T. caerulescens
Complémentation fonctionnelle
du transport de zinc dans le
mutant de levure zrt1zrt2 (zhy3)
par TcZNT1.
Expression transcriptionnelle de ZNT1
Pence et al., 2000, PNAS, 97, 4956
Clonage d’un transporteur de zinc impliqué dans le
prélèvement accru de ce métal chez T. caerulescens
Répartition racine / parties aériennes des métaux
Thlaspi arvense
plante non hyperaccumulatrice
Thlaspi caerulescens
hyperaccumulateur de Ni
Teneur en Ni de plantes cultivées sur 10 µM NiSO4
ROOT
SHOOT
ROOT
SHOOT
5% 89%
Laurence Marquès UM2
Localisation subcellulaire du zinc chez TT. caerulescens
MEB après cryofixation et EDXMA
--> La localisation subcellulaire des métaux est très délicate car les
ions métalliques sont très mobiles dans les tissus.
L’hyperaccumulation est apparue à plusieurs reprises dansdifférentes familles botaniques
Laurence Marquès UM2
Baker and Brooks (1989) Biorecovery 1 81-126
LIMITE = LA NOTION DE BIOCONCENTRATION
Bioconcentration factor (BCF) = shoot [metal] / soil [metal]
Model calculation from McGrath and Zhao,Curr Opin Biotechnol, 2003
HYPERACCUMULATION ET BIOMASSE SONT TOUTES DEUX NECESSAIRES
Nombre de récoltes
requises pour diminuer de
moitié la concentration en
métal dans 20 cm de sol
Plant biomass (t.ha-1)
Laurence Marquès UM2
Hyperaccumulateurs
Non-accumulateurs
Zinc absorbé
(kg/ha)
Nombre de
récoltes
Nombre de récoltes pour passer de 444 à 300 mg zinc/kg sol (norme NF U 44-041)(Baker et al., 1995)
Thlaspi caerulescens
Arabidopsis halleri
Alyssum lesbiacum
Brassica napus
Raphanus sativus
30,1
10,3
3,9
0,5
0,2
37
96
832
2046
13
…
Laurence Marquès UM2
LE VERROU BIOLOGIQUE:
FORTE BIOMASSE
FAIBLE TRANSLOCATION
TRES FAIBLE BIOMASSE
FORTE TRANSLOCATION
Brassica napus : colza
Thlaspi caerulescens
Nombre de récoltes requises
pour diminuer la teneur du sol
de 444 à 300 mg Zn.kg-1
(norme NF U 44-041)
832 15
Laurence Marquès UM2
COMMENT OBTENIR DES PLANTES ADAPTEES ACOMMENT OBTENIR DES PLANTES ADAPTEES A
LA PHYTOEXTRACTION ?LA PHYTOEXTRACTION ?
- EXPLOITATION DE LA BIODIVERSITE
- GENETIQUE
- BIOTECHNOLOGIE: recherche fondamentale et PGM
Laurence Marquès UM2
Ma et al, Nature, 2001
EXPLOITATION DE LA BIODIVERSITE
Laurence Marquès UM2
GENETIQUE QUANTITATIVE
LD70,2
At4-GA281,0
ZnT
ol Q
TL3
Mt2b0,0
At5g0816013,1
AthCDPK935,8H937,7
AthDET150,0
MTP1-B53,6
AGG/CT-8062,6
RESULTS:RESULTS:
tolerance and hyperaccumulation are two
distinct genetic traits (McNair, 1999 )
QTL analyses; marker assisted selection
0
2
4
6
AIMAIM:: Identification and selection of metal Identification and selection of metal
tolerance and/or tolerance and/or hyperaccumulation hyperaccumulation traitstraits
A. halleri A. lyrata
P. Saumitou-Laprade, Lille
Laurence Marquès UM2
La surexpression de la nicotianamine synthase confère une forte
tolérance au Ni
Col
35S-TcNAS
Col
O ppm 70 ppm 700 ppm 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0 ppm 70 ppm 700 ppm N
i c
on
ten
t (m
g/g
DW
)
Col
35S-TcNAS Col
Pianelli et al., 2005, Transgenic Research.
BIOTECHNOLOGIE: utilisation de PGM
--> validation de cibles
Laurence Marquès UM2
SOLUTIONS FOR MULTI-METALLIC POLLUTION EXIST
Transgenic Indian mustards
overexpressing -ECS display
increased metal tolerance and
shoot accumulation for Cd, Cr,
Cu, Pb and Zn
Plants are grown on aged polluted soil containing
mixture of metals
APS = adenosine triphosphate sulfurylase
GS = glutathione synthase
-ECS = -glutamylcysteine synthase
Nature 395, 553 - 554 (1998)
Harvesting a crop of gold in plants
CHRISTOPHER W. N. ANDERSON*, ROBERT R. BROOKS*, ROBERT B. STEWART* &ROBYN SIMCOCK†
US PATENTSChaney, 1998, Method for phytomining of nickel, cobalt and other metals from soil, US Patent 5711784
La toxicité aluminiqueL’Al est le troisième élément le plus abondant sur terre. En solsacides la forme Al3+ très phytotoxique domine. Ces solsreprésentent 40% des terres arables (+ acidification suite àl’utilisation excessive d’engrais).
Au niveau cellulaire, des concentrations symplastiques del’ordre du nmol sont toxiques car Al3+ à une constanted’affinité pour l’ATP 107 fois plus importante que Mg2+.
La constante de stabilité des complexes Al3+ -acidesorganiques est encore plus forte que celle de l’ATP et permetdonc de chélater efficacement l’Al3+ .
Pour la racine en croissance la toxicité est très forte auniveau de l’apex racinaire.
•Réponse spécifique de Al.
*Le sarrasin résiste à l’aluminium
en protégeant l’apex racinaire par
sécrétion d’acide oxalique: ce
mécanisme est commun à toutes
les plantes résistantes à l’Al, seul le
type d’acide varie.
* Le sarrasin accumule de l’Al dans
ses parties aériennes. La forme
complexée avec l’acide oxalique est
une forme non toxique accumulée
dans les feuilles.
Nature (1997), 390, 569
Detoxifying aluminium with buckwheatMa et al.
Les différents acides organiques qui détoxifient l’Al
Coloration de l’Al dans les
apex racinaires
Modèle de sécrétion d’acides organiques par les racinesen réponse à l’Al
Prélèvement, transport et stockage de l’Al chez le sarrasin:différents ligands organiques interviennent
0 75 200 1000µM Al3+
(de la Fuente J. M. et al. (1997) Science 276: 1566-1568)
La résistance à l’aluminium est contrôlée parl’excrétion d’acide organique par l’apex racinaire
La surexpression de citrate synthase confère une résistance aluminique au tabac et à la papaye
con
trô
leC
Sb
Papaye transgénique et témoin cultivées sur
aluminium
Phytochelatin synthase (Grill, 1989): en présence de Cd, Ag, Bi, Pb, Zn, Cu, Hg, Au:
-Glutamylcystéine synthase
Glutamate + cystéine + ATP ---> -glutamylcystéine + ADP + Pi
Glutathion synthase
-glutamylcystéine + glycine + ATP ---> glutathion + ADP + Pi
La résistance au cadmium
Plant Physiol. (1992) 100, 100
Cadmium-sensitive Mutants of Arabidopsis thalianaHowden R and Cobbet S
- 15000 M2 (mutagénèse EMS) criblées pour la sensibilité au cadmium dans un test de croissanceracinaire.- 120 mutants isolés.- 2 mutants confirmés.- 1 seul locus cad1
•mutation récessive
•pas d’effet maternel
•ségrégation 3:1 : locus mendélien
unique
•le croisement entre les deux mutants
montre que les deux mutations sont
alléliques.
Plant Physiol. (1995) 107, 1067
A Cadmium-Sensitive, Glutathione-Deficient Mutant ofArabidopsis thalianaHowden R et al.
-20000 M2 (mutagénèse aux rayons X) criblées pour lasensibilité au Cd dans un test de brunissement racinaire
- 1 mutant identifié cad2
Glutathion -Cd +Cd
Wild type 231 154cad2-1 41 30cad1-1 225 567
Plant Physiol. (1995) 107, 1059
Cadmium-sensitive, cad1 Mutants of Arabidopsis thaliana ArePhytochelatin DeficientHowden R et al.
Total PCs
Cd (µM) Wild type cad2-1 cad1-1
0 5 1 5 30 150 16 37
Le locus CAD2 =la -Glutamylcystéine synthase
Strain Cystéine(nmol g-1 DW)
GC(nmol g-1
DW)
GSH
(µmol g-1DW)
GCS(nmol min-1 mg-1
protein)
WT 111 64 3 0,8
cad2 234 21 1,3 0,3
pBI-GSHA 122 160 5,5 1,8
pBI101 223 24 1,3 0,3
Cartographie RFLP du locus CAD2
Caractérisation biochimique des plantes
Plant J, 1998, 16, 73
Le locus CAD1 = la phytochelatin synthase
Cette enzyme avait été caractérisée biochimiquement en 1989mais pendant dix ans personne n’avait pu cloner le gènecorrespondant.
En 1999, trois équipes publient simultanément le clonage pardes approches toutes différentes
cartographie du locus CAD1 par RFLP
un gène inconnu identifié
le séquencage dans les différents mutants cad1 donne des
mutations ponctuelles
complémentation du mutant cad1-3 par le locus CAD
sauvage: ça marche!
expression dans E. coli donne une enzyme fonctionnelle
capable de synthétiser des PCs.
pas de régulation transcriptionnelle par le Cd
1- Equipe de Cobbett Plant Cell (1999) 11, 1153
2-Equipe de Schroeder EMBO J (1999), 18, 3325
transformation de S. cerevisiae par une banque de cDNA
de racines de blé et criblage pour la résistance au cadmium
accumulation de Cd2+ dans les levures transformées
purification de la protéine correspondante
la protéine correspondante à une activité catalytique
produisant des PC2 à partir de milieu contenant du Cd et du
GSH
3- Equipe de Ph. Rea PNAS (1999), 96, 7110
transformation du mutant de levure yap1 par une banque
cDNA d’A. thaliana, criblage sur des milieux toxiques en
Cd et retransformation dans le mutant ycf1 pour les
plasmides conférant tjrs une résistance au Cd
clonage d’un cDNA
purification de la protéine correspondante
démonstration de l’activité catalytique de l’enzyme:
production de PC à partir de GSH en présence de Cd
Mécanismes de détoxication du cadmium par les phytochélatines
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