VOIE RAS NORMALE &...

VOIE RAS NORMALE & PATHOLOGIQUE

Hélène CavéUF de Biochimie et Biologie Moléculaire

D’après Karnoub & Weinberg Nat Review Mol Cell Biol, 2008

LES ETAPES CLE DANS LA CONNAISSANCE DE RAS

RAS (Rat Sarcoma Virus) homologue cellulaire de l’oncogène viral

associé au sarcome de Harvey (HRAS) et Kirsten (KRAS)

CANCER MALADIES DU DEVELOPPEMENT

19811981 19821982 19831983 19891989 19921992 19941994 19971997 20052005 20062006

Identification des gènes humains HRAS et KRAS

Les tumeurs humaines contiennent des protéines

RAS mutées constitutivement actives

Identification de NRAS

RAS n’est pas capable de transformer seul des cellules primaires

RAS estisoprénylé

RAS active les MAPK

RAS active la voie PI3K et RalGDS

KRAS est indispensable àl’embryogenèse

RAS active la

voie PLCεεεε

Syndrome de Costello : mutations de HRAS

Syndrome de Noonan et CFC : mutations de

KRAS

NRAS, cloné à partir de lignées de neuroblastome

Cycle de RAS

RAS GTPRAS GDP

Pi

RAS

GTP

GDP

RAS EST UN COMMUTATEUR MOLECULAIRERAS : sous-famille des petites protéines G

Ny

Myc, …

Vetter, Science 2001

REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU COMMUTATEUR

Les changements de structure impliquent 2 segments : switch I et switch II

L’hydrolyse du phosphate modifie la conformation des 2 régions switch

Les régions switch sont impliquées dans les interactions en amont (GEF) et en aval (effecteurs, GAP)

ISOFORMES DE RAS

Schubbert et al., Nature Reviews Cancer 2007

3 gènes RAS codent 4 protéines de 21 kD à forte homologie

Région hypervariableRésidus spécifiant les modifications post- traductionnelles des protéines

Epissagealternatif

Domaine très conservé

UN RTK PEUT CONTENIR PLUSIEURS SITES DE LIAISONAUX SH2 ET ACTIVER PLUSIEURS EFFECTEURS

P

P

P

P

P

P

PDGFR

P

P

P

Domainecatalytique

Src kinase

GRB2

SHC

PI3K, Nck

Ras-GAP

PTP-iD, SHP-2

PLCγγγγ

Activation

PDGF : Platelet derived growth factor

ShcSosGrb2

RecepteurRecepteur

(RTK, gp130)(RTK, gp130)

PP

Cycle de RAS

Gab

RAS GTPRAS GDP

NF1

Pi

RAS

GTP

GDP

ACTIVATION/INACTIVATION DE RASFacteur

de croissance soluble

Guanine nucleotideExchange Factors (GEFs)

GTPase-activatingproteins (GAPs).

RAS : sous-famille des petites protéines G

NeurofibromineNeurofibromine

(NF1)(NF1)Ny

Myc, …

RAS INTERAGIT AVEC DE MULTIPLES EFFECTEURS

ShcSosGrb2

RecepteurRecepteur


PP

ELK

Ny

Myc, …

MAPK

MAPKKK

MAPKKRAF

MEK

ERK

Gab

RAS GTPRAS GDP

NF1

Pi

RAS

GTP

GDP

RAS ACTIVE LA VOIE DES MAPK/ERKFacteur


Protéine

P

Protéine

Cascade des MAPK


(NF1)(NF1)

ShcSosGrb2

RecepteurRecepteur


PP

ELK

Ny

Myc, …

RAF

MEK

ERK

Gab

RAS GTPRAS GDP

NF1

Pi

RAS

GTP

GDP

RAS ACTIVE LA VOIE DES MAPK/ERKFacteur


Protéine

P

Protéine


(NF1)(NF1)

� Voie complexe (familles de protéines)� Voie non linéaire (régulations fines)� Voie très régulée

ARAF, BRAF, CRAF

MEK1, MEK2

ERK1, ERK2

HRAS, NRAS, KRAS

ShcSosGrb2

RecepteurRecepteur


PP

Cycle de RAS

Gab

RAS GTPRAS GDP

Pi

RAS

GTP

GDP

ACTIVATION DE RASVoies relayant le signalFacteur


MAPK

PI3K

RALGDS

Organisation Organisation

du cytosquelettedu cytosquelette

TrafficTraffic

de vde véésiculessicules

SurvieSurvie

ProlifProliféérationration

Signal Signal CaCa++++PLCεεεε

TIAM1


(NF1)(NF1)


(NF1)(NF1)

Mutations activatrices

SosGrb2PP

RAS

GTP

GDP

RAS GTPRAS GDP

Pi

Cycle de RAS

X

RAS EST MUTE DANS 30% DES CANCERS HUMAINS

KRAS>NRAS>HRAS

codon 12 (G12)

codon 13 (G13)

codon 61 (Q61)

NEUROFIBROMATOSE DE TYPE 1 (NF1)

Autosomique dominante1/3500 naissances

Haploinsuffisance

�Difficultés d’apprentisage fréquentes� Anomalies du squelette� Nodules de Lish

Inactivation bi-allelique

� Prédisposition aux tumeurs malignes(neurofibrosarcome, astrocytome, phaeochromocytome et LMMJ)

RAS

GTP

GDP

RAS GTPRAS GDP

Pi

Cycle de RAS


(NF1)(NF1)

X

SYNDROME DE NOONANTransmission autosomique dominante

1/2000 naissances

� Retard de croissance (60-70%) (Taille adulte : M 162.5 cm - F 152.7 cm)

� Malformations cardiaques (66%)

� Retard psychomoteur de degré variable (30-50%)

� Dysmorphie caractéristique (100%)

� Prédisposition faible aux leucémies

� Prenatal : nuque épaisse, hygroma

SHP2 : Tyrosine phosphatase cytosoliquerégulée par les facteurs de croissance

Mutations de PTPN11 chez 40% des patients(Tartaglia et al., Nat Genet 2001)

Sténose de la valve pulmonaire

45%

Cœur normal

SYNDROME DE NOONAN

Anomalie cardiaques congénitales (75%)

Cardiomyopathie hypertrophique

10%

Le SN est la cause non-chomosomique la plus fréquente d’anomalie cardiaque congénitale

ShcSosGrb2

ReceptorReceptor


PP

ELK

Ny

Myc, …

MAPK

MAPKKK

MAPKKRAF

MEK

ERK

FONCTION DE SHP-2

SHP-2

[-]

[+]

SHP-2 nécessaire à l’activation complètede la cascade MAPK/ERK par RAS

Gab

RAS GTPRAS GDP

NF1

Pi

RAS

GTP

GDP

Phosphatase régulée par les facteurs de croissance

Facteur de croissance

soluble

Protéine

P

Protéine

Neel, Trends in Biochem sciences 2003

STRUCTURE DE SHP-2

Phosphorylation de tyrosines


REGULATION DE SHP-2

Inactive à l’état basal


Activation par fixation à des pY

Récepteur TK activé

REGULATION DE SHP-2

PTP

C-SH2 N-SH2

Mutations by exon (n=248)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

exons

mutations retrouvées précédentes séries

Mutations by functional domain

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

N-SH2 linker C-SH2/N-SH2

C-SH2 PTP queue COOH

Domains

mutations (Paris) LiteratureMUTATIONS (EXON)

MUTATIONS (DOMAINE FONCTIONNEL)

Robert Debré

Littérature

Mutations constitutionnelles

AA mutés : rouge/blancDomaine catalytique : rose

MUTATIONS DE PTPN11 (SHP-2)

Tartaglia & Gelb 2005

PTP

C-SH2 N-SH2

Keilhack, H. et al. J. Biol. Chem. 2005


AA mutés : rouge/vertDomaine catalytique : rose


Activité PTP +/- p-Tyr dérivé d’IRS-1 [p1172]

Tartaglia & Gelb 2005

Keilhack, H. et al. J. Biol. Chem. 2005

PTP

C-SH2 N-SH2


AA mutés : rouge/vertDomaine catalytique : rose


Activité PTP +/- p-Tyr dérivé d’IRS-1 [p1172]

Araki et al., Nat Med 2004

SOURIS KNOCK-IN POUR PTPN11 D61G

Une seule mutation gain de fonction de PTPN11 est suffisante pour induire un phénotype de syndrome de Noonan avec syndrome myéloprolifératif

SYNDROME DE NOONAN & SYNDROMES ASSOCIES

Syndrome Syndrome Syndromede Noonan cardio-facio-cutané de Costello

Troubles alimentaires (inconstants Modérés)

Retard statural

Cardiopathie (75%)- 45% sténose valve pulmonaire- 10% cardiomyopathie hypertrophique

Visage triangulaire

Peau normale ou sèche

Phanères normaux

Retard mental (15-35%, léger)

Troubles alimentaires (sévères)

Retard statural (78%)

Cardiopathie (75%)- 40% sténose valve pulmonaire- 40% cardiomyopathie hypertrophique

Visage large

Kératose folliculaire, ichtyose

Cheveux épars bouclés

Cils et sourcils rares ou absents

Retard mental (>90%)

Troubles alimentaires (très sévères)

Retard statural (96%)

Cardiopathie (63%)- 46% sténose valve pulmonaire- 45% cardiomyopathie hypertrophique- 30% arythmie

Traits épais

Papillome, plis profonds, peau lâche, hyperpigmentation Cheveux bouclés

Retard Mental 100%

Rhabdomyosarcome, cancer de la vessie (15%)

CBLCBL

P

P

P

P

P

P

ERK1 ERK2

Shc

Gab2

Grb2

RAFRAF--11

SOS1SOS1

SHP2SHP2

MEK1MEK1 MEK2MEK2

BRAFBRAF

SpredSpred--11

GDPGDP

NRASNRAS

GTPGTP

NRASNRAS

GDPGDP

KRASKRAS

GTPGTP

KRASKRAS

GDPGDP

HRASHRAS

GTPGTP

HRASHRAS

ARAF

Syndrome de Syndrome de LegiusLegiusSHOC2SHOC2

NSNS--likelike avec cheveux avec cheveux

anaganagèènes caducsnes caducs

E2

20092009

Prolifération cellulaireSurvie cellulaire

Syndrome de Noonan

Syndrome Syndrome

CardioCardio--FacioFacio--

CutanCutanéé

Syndrome Syndrome

de de CostelloCostello

NeurofibromineNeurofibromine NeurofibromatoseNeurofibromatose

NS-like avec multiples

lentigines (LEOPARD)

Aoki et al., Nature Genetics 2005

Syndrome de CostelloG12S (85%)G12A (10%)

HRAS EST MUTE CHEZ 85% DES PATIENTS ATTEINTS DU SYNDROME DE COSTELLO

Consequences des mutations:

Insensibilité euw protéines GAP � Activation consitutive

Modification d’affinité� déséquilibre en faveur de la forme -GTP

FREQUENCES DES MUTATIONS Pathologies définies sur des critères cliniques

Nava et al., 2007

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

SN CFC SC

PTPN11

SOS1

RAF1

HRAS

KRAS

BRAF

MEK1

MEK2

FREQUENCES DES MUTATIONS Pathologies re-définies sur des critères de génétique moléculaire

Risque de cancer

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

SN CFC SC

PTPN11

SOS1

RAF1

HRAS

KRAS

BRAF

MEK1

MEK2

TOTAL

A quoi sert le diagnostic génétique ?

Pour le patient atteint• Diagnostic clinique• Participation / organisation / supervision de la prise en

charge médicale et socio-éducative• Pronostic

Pour les grossesses futures• Fixer le risque de récurrence• Informer des possibilités et limites du diagnostic anténatal• Information génétique (« conseil génétique »)

Pour la famille• Dépistage des personnes à risque

THERAPEUTIQUES SPECIFIQUES

P

P

P

P

P

P

GDP

NRAS

GTP

NRAS

ERK1 ERK2

Shc

Gab2

Grb2

RAFRAF--11

SOS1SOS1

SHP2SHP2

GDPGDP

KRASKRAS

GTPGTP

KRASKRAS

MEK1MEK1 MEK2MEK2

BRAFBRAF

SpredSpred--11

Expression des gènesProgression du cycle cellulaireApoptose

GDP

HRAS

GTP

HRAS


ARAF

Risque de

cancer ?

ONCOGENES & GENES SUPPRESSEURS DE TUMEUR

P

P

P

P

P

P

GDP

NRAS

GTP

NRAS

ERK1 ERK2

Shc

Gab2

Grb2

RAFRAF--11

SOS1SOS1

SHP2SHP2

GDPGDP

KRASKRAS

GTPGTP

KRASKRAS

MEK1MEK1 MEK2MEK2

BRAFBRAF

SpredSpred--11

Expression des gènesProgression du cycle cellulaireApoptose

GDP

HRAS

GTP

HRAS


ARAF

RISQUE TUMORALsyndrome de Noonan

syndrome syndrome

CardioCardio--FacioFacio--

CutanCutanéé

Syndrome Syndrome

de de CostelloCostello

NeurofibromatoseNeurofibromatose

syndrome LEOPARD

Syndrome Syndrome NFNF--likelike

1-2%

1-2%

13%

?

?

L’EFFET SUPPRESSEUR DE TUMEUR DE RAS

D’après Karnoub & Weinberg Nat Review Mol Cell Biol, 2008

Pourquoi les mutations constitutionnelles de RAS n’induisent-elles pas plus de cancers?

La réponse normale d’une cellule « naïve » à l’activation exagérée de RAS est l’arrêt du cycle cellulaire et/ou la sénescence et pas la prolifération ou la transformation

Arrêt du cycle cellulaire / sénescence

RAS

RAFp38 PI3K

p53

p21WAF1p14ARFp16INK4A

Signal mitogène

David Kerr, Nature Reviews Cancer 2003 3, 615-622

LES MUTATIONS DE RAS PARTICIPENT A LA PROGRESSION TUMORALE

Normal Adénome précoce Adénome tardif Adénocarcinome

Apoptose

Adhésion

Angiogénèse

Facteurs de croissance

Signalisation

LES MUTATIONS SOMATIQUES ET CONSTITUTIONNELLES SONT DIFFERENTES

Schubbert et al., Nature Reviews Cancer 2007

Mutations constitutionelles(syndrome CFC )

Mutations somatiques

(Cancer : mélanome

cancer colo-rectal, du sein, et des poumons)

Exemple de BRAF

Données du « Catalogue of Somatic Mutations in Cancer » (COSMIC) of the Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK

RAS EST MUTE DANS 30% DES CANCERS HUMAINS

Tissus HRAS KRAS NRAS

Gros intestin 0% 32% 3%Intestin grèle 0% 20% 25%Hématopoïétique 0% 5% 12%Poumon 1% 17% 1%Tractus biliaire 0% 32% 1%Pancréas 0% 60% 2%Glande salivaire 16% 4% 0%Peau 5% 2% 19%Tractus urinaire 12% 4% 3%Sein 1% 5% 1%Ovaire 0% 15% 4%

MUTATIONS DE GENES DE LA VOIE RAS DANS LES TUMEURS

Roberts et Der, Oncogene 2007

sosGRB2

RAS

BRAF

MEK

ERK

EGFR

TGFαααα

EGFR : ErbB1 / HER1ErbB2 / HER2 / Neu

Surexpression d’EGFR• Cancer colorectal (27-77%)

• Cancer du pancréas (30-50%)• Cancer du poumon (40-80%)

Mutations de RAS• Cancer du pancréas (90%)

• Cancer de la thyroïde (60%)• Cancer du colon (50%)• Cancer du poumon (30%)

Mutations de BRAF• Mélanome (70%)

• Cancer de la thyroïde (50%)• Cancer du colon (10%)

Mutation d’EGFR• Glioblastome (30-50%)

• Cancer du poumon (10%)

MUTATIONS DE GENES DE LA VOIE RAS DANS LES TUMEURS

Roberts et Der, Oncogene 2007

Inhibiteurs de farnesyl transferaseBi-phosphonatesStatines

AZD6244ARRY142886UO126

SorafenibRaf265PLX4032

sosGRB2

RAS

BRAF

MEK

ERK

EGFR

TGFααααTrastuzumab(Herceptine™)Cetuximab(Erbitux™)

Inhibiteurs de TK

Erlotinib

Geftinib

CBLCBL

P

P

P

P

P

P

MPK

PI3K

AKT

mTOR

RHEB

TSC

S6K

IRS1

ERK1 ERK2

Shc

Gab2

Grb2

RAFRAF--11

SOS1SOS1

SHP2SHP2

MEK1MEK1 MEK2MEK2

BRAFBRAF

SpredSpred--11

Gene expressionCell cycle progressionCell death

NeurofibrominNeurofibromin

ARAF

SHOC2SHOC2

GDPGDP

NRASNRAS

GTPGTP

NRASNRAS

GDPGDP

KRASKRAS

GTPGTP

KRASKRAS

GDP

HRAS

GTP

HRAS

RASOPATHIESRASOPATHIES

RAPAMYCINE

STATINES

On commence par tester l’efficacité chez un animal

Il nous faut donc un animal malade… Qu’on va traiter pour voir si ça marche

Ca marche sur quoi?(à quelle dose, selon quel protocole?)Comment le prouver?

Il faut traiter combien de temps?Ca marche sur toutes les mutations?

Marin et al., J Clinical Invest 2010

Expression inductible de la mutation Y279C

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