Vérification des performances d’une méthode : l’étude de la sensibilité aux antibiotiques...

ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 // 47

article reçu le 25 octobre 2013, accepté le 27 janvier 2014.

© 2014 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

RÉSUMÉ

La mesure de la sensibilité aux antibiotiques par la technique des E-test®

repose sur l’utilisation de bandelettes imprégnées d’un gradient exponentiel d’antibiotique. Il s’agit d’une technique qualitative avec une interpréta-tion en catégorie thérapeutique (sensible, intermédiaire, résistant). Elle permet la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique par diffusion en milieu gélosé. L’objectif de ce travail est de contribuer à répondre aux exigences de la norme ISO 15189 en termes de vérification des performances, d’harmonisation des pratiques professionnelles et d’évaluation des compétences. L’étude a été réalisée en mesurant 90 CMI avec 17 types de bandelettes E-test® différentes (15 antibiotiques bactéricides et 2 antibiotiques bactériostatiques), 7 souches ATCC, 5 échantillons de contrôles externes de qualité et 25 isolats cliniques. La mise en œuvre des tests est délicate en raison d’une part des recommandations des fournisseurs qui doivent impérativement être respectées et d’autre part des difficultés de lecture et d’interprétation des tests.

Concentration minimale inhibitrice – matériau de référence certifié – accréditation – contrôle qualité – gestion des risques.

Jean-Paul Kleina,*, Thomas Gorsya

Vérification des performances d’une méthode : l’étude de la sensibilité aux antibiotiques par la technique des E-test®

a Laboratoire Syndibio98, rue des Capucins55200 Commercy

* [email protected]

1. Introduction

La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) en gradient de concentrations permet une lecture de 30 concentrations d’antibiotiques. Cette analyse nécessite un strict respect des recommandations des fournisseurs en raison de l’interprétation et de la mise en œuvre déli-cate des tests (milieu de culture, densité de l’inoculum, atmosphère et durée d’incubation).Trois dispositifs sont actuellement sur le marché : E-test® (bioMérieux), MICE® (Oxoid) et les bandelettes CMI (Liofilchem). Le principe de la technique E-test® est basé sur la diffusion en milieu solide d’un gradient d’antibiotique pour mesurer la plus petite concentration d’antibiotique qui

SUMMARY

Verification assessment of MIC determination

by E-test®

Antimicrobial susceptibility testing by E-test® is based on strips coated with an exponential gradient of antibiotic. The E-test® method is a qualitative test method with an interpretation in therapeutic catego-ries (sensitive, intermediate, resistant). The E-test® susceptibility testing method is based on the diffusion of the antibiotic from a preformed antibiotic gradient from a strip. The aim of this work is to contribute to meet the requirements of the standard ISO 15189 in terms of performances’ check, harmonization of the professional practises and evaluation of the skills/ know-how. The study was realized by measuring 90 minimal inhibitory concentrations with 17 types of different E-test® strips (15 bactericidal and 2 bac-teriostatic antibiotics), 7 ATCC’ strains, 5 samples of external quality controls and 25 clinical isolates. The implementation of the tests is delicate on the one hand because of the supplier’s recommandations which must be necessarily respected and on the other hand the difficulties of reading and interpre-tation of the tests.

Minimal inhibitory concentration – certified reference material – accreditation –

quality control – risk management.

inhibe la croissance bactérienne. La technique de détermi-nation des CMI est automatisée sur trois types d’appareils : le Phoenix® (Becton Dickinson), le Microscan® Walkaway (Siemens) par lecture directe et le Vitek® 2 (bioMérieux) par calcul de la vitesse de croissance aux concentrations testées [1]. Les systèmes Vitek® ne rendent pas de CMI vraies dans la mesure où seules 3 ou 4 concentrations d’antibiotiques sont utilisées avec les différentes cartes.Il s’agit d’une méthode manuelle qualitative (échelle dis-continue de concentrations testées). Elle peut apparaître de prime abord quantitative car les résultats sont exprimés en mg/L, mais il faut rappeler que selon le SH GTA 04 [2], la distinction entre une méthode quantitative et qualitative s’exprime par « la mesure d’un signal continu quantifiable ». Le résultat est rendu en concentration mais interprété en S, I ou R, c’est pourquoi il ne s’agit pas d’une méthode quantitative vraie mais qualitative.

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La revue de la littérature a permis de recenser différents articles consacrés aux CMI [3-5]. Cependant, nous n’avons pas pu retrouver de publication traitant spécifiquement de la vérification/validation de méthode pour les CMI dans le sens de la norme NF EN ISO 15189 [6] et du document du Cofrac SH GTA 04 [1]. La raison est sans doute liée à la « jeunesse » de la démarche qualité nécessitant d’attester d’une compétence et d’une performance technique de haut niveau. Il est à noter que les articles anglo-saxons traitent principalement de comparaison entre différentes techniques de détermination des CMI (E-test® et la tech-nique de référence par dilution en milieu gélosé) [7, 8].L’objectif de cette étude est de vérifier et de confirmer les performances de la méthode de détermination des CMI afin de déclarer l’aptitude de la méthode mise en œuvre par rapport aux besoins des clients (patients et corps médical). Ceci consiste à pouvoir apporter la preuve que le labora-toire rend un résultat fiable et juste qui n’est pas opérateur dépendant. La maîtrise de cette méthode contribue aussi à caractériser les phénotypes de résistances des bactéries.

2. Pour quelles bactéries

faut-il déterminer la CMI ?

2.1. Les recommandations des référentielsLe CA-SFM [9] et la NABM [10] pointent différentes situa-tions pour lesquelles il est recommandé de déterminer une CMI.

Il est utile de rappeler que la NABM distingue deux cas pour la détermination des CMI : le cas général s‘applique aux infections systémiques

et comprend l’étude au minimum de deux antibiotiques, le cas de Streptococcus pneumoniae avec utili-

sation d’une gamme de concentration adaptée à la mise en évidence d’une diminution de sensibilité aux bêta-lactamines.NB : la NABM mentionne que la détermination de la CMI doit être effectuée en utilisant une gamme comportant au minimum une série de 10 concentrations.

2.2. Situations cliniques et état de l’artLes données de la littérature permettent de définir les situa-tions dans lesquelles les CMI sont à déterminer [11-20] : certaines circonstances cliniques telles que les bactéries isolées de liquides de ponction ou d’hémocultures, mais aussi les infections sévères (endocardites, ostéites,…). Le CA-SFM précise les circonstances microbiologiques (tableau I) [9].

3. Matériels et méthodes

3.1. Référentiels utilisésLes référentiels utilisés sont le SH GTA 04 [1], Rémic 2010 [21], l’ouvrage de Cornaglia et coll. [22], l’Eucast [23] et le CLSI [24].

Tableau I – Circonstances dans lesquelles la détermination des CMI est nécessaire (∅ : diamètre).

Circonstances CMI à déterminer

Entérobactéries

BLSE et C3G ou aztréonam (ATM) S C3G ou ATM

∅ ertapénème 10 μg < 28 mm ou I ou R Ertapénème

Utilisation de la colistine en traitement Colistine

Infections sévères Antibiotiques utilisés

Streptococcus pneumoniae

Infection sévère, échec clinique, diminution sensibilité aux β-lactamines (∅ oxacilline 5 μg < 26 mm)

Amoxicilline, céfotaxime, ceftriaxone

∅ norfloxacine 5 μg < 8 mm Ciprofloxacine

Streptococcus sp. Diminution sensibilité aux β-lactamines(∅ oxacilline 5 μg < 21 mm)

Amoxicilline, céfotaxime

Staphylococcus sp. et Enterococcus sp.

Suspicion de sensibilité diminuée aux glycopeptides : I ou R sur automate, ∅ d’un des glycopeptides < 17 mm,∅ vancomycine 30 μg - ∅ teicoplanine 30 μg ≥ 3 mm, colonies en zone d’inhibition des glycopeptides

Vancomycine, téicoplanine

∅ tigécycline 15 μg < 22 mm Tigécycline

Haemophilus influenzae

Sensibilité diminuée aux β-lactamines(∅ ampicilline 2 μg < 20 mm) et infection sévère ou échec thérapeutique

Amoxicilline ou autre β-lactamine utilisable

Sensibilité diminuée aux fluoroquinolones : ∅ acide nalidixique 30 μg < 21 mm

Ofloxacine, ciprofloxacine, lévofloxacine

Pseudomonas aeroginosaUtilisation de la colistine en traitement Colistine

Sensibilité diminuée aux carbapénèmes Imipénème, méropénème, doripénème

Neisseria meningitidisSensibilité diminuée à la pénicilline G/amoxicilline :∅ oxacilline 5 μg < 18 mm

Pénicilline G, amoxicilline

Neisseria gonorrhoeae

Systématique (pour déterminer la sensibilité diminuée aux pénicillines) Pénicilline G, ceftriaxone

Sensibilité diminuée aux fluoroquinolones : ∅ acide nalidixique 30 μg < 25 mm

Ciprofloxacine, ofloxacine



tests ATCC (American Type Culture Collection), des souches provenant des contrôles de qualité nationaux (CQN) et des évaluations externes de la qualité (EEQ). Souches ATCC : Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619), Staphylococ-cus aureus (ATCC 29213), Neisseria gonorrhoeae (ATCC 49226), Klebsiella pneumoniae BLSE (ATCC 700603), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Escherichia coli (ATCC 25922).

Souches CQN : Neisseria gonorrhoeae CQN 13BAC1 (souche 250), Haemophilus influenzae CQN 13BAC1 (souche 434), Enterococcus faecium CNQ 11BAC2 (souche 951)

Souches EEQ : Streptococcus pneumoniae (BP 2013 2A) et Moraxella catarrhalis (CQ BP 2013-3).

L’harmonisation des lectures inter-opérateur a été menée à partir d’isolats cliniques.Les milieux de culture ont été ensemencés par écouvil-lonnage avec une suspension équivalente au standard 0,5 Mc Farland. Les CMI ont été lues après 18 à 24 heures d’incubation à 35 ± 2 °C.Pour valider les protocoles techniques, il est nécessaire d’étudier des souches tests dont les fournisseurs indiquent les limites d’acceptabilité. Ces dernières ne doivent pas être confondues avec les concentrations critiques mentionnées par le CA-SFM. Le tableau III présente une comparaison entre les préconisations du fournisseur (bioMérieux) et les concentrations critiques du CA-SFM (2013) pour Pseudo-monas aeruginosa.

3.4. Principe de lectureLa lecture et l’interprétation des CMI doivent être effec-tuées par des opérateurs expérimentés, conformément aux recommandations des fournisseurs [25]. Des spécificités inhérentes à certaines souches bactériennes, au type de gélose utilisé ou à l’antibiotique testé doivent être prises en compte lors de l’interprétation [3] : pour l’effet tunnel (il faut ignorer la croissance le long de la bandelette qui n’a pas de signification clinique) et lire les points d’intersection à la bandelette ;

lorsque l’ellipse est asymétrique, il faut lire la valeur la plus haute et si il y a une différence de plus de 2 dilu-tions, refaire le test ;

si l’intersection entre la pousse et la bandelette se situe entre deux graduations, il faut rendre la CMI correspon-dant à la valeur haute ;

Classiquement, l’objectif de la vérification des méthodes est de prouver que les résultats d’analyse sont fiables et justes. Dans le cas d’une méthode qualitative en por-tée A (méthode adoptée par le laboratoire), le SH GTA 04 recommande de documenter par la bibliographie la sensibilité et la spécificité diagnostiques, d’étudier la contamination, et d’effectuer une comparaison des méthodes.Les caractéristiques de la méthode E-test® rendent difficile l’étude sur site de la sensibilité et de la spécificité dia-gnostiques : multiplicité des phénotypes de résistances en fonction de l’espèce bactérienne, importance du nombre de souches de référence nécessaires à l’évaluation, coût et impact chronophage sur le temps technicien.Pour évaluer la contamination, la robustesse et la stabilité, nous nous sommes basés sur les données bibliographiques disponibles [25, 26].

3.2. Milieux et réactifsLes bandelettes E-test® sont constituées d’une échelle de 30 graduations en mg/L avec 15 dilutions vraies (0,5 – 1 – 2 – 4 – 8…) et 15 demi dilutions (0,5 – 0,75 – 1,5 – 2 – 3 – 4 – 5 – 6 – 7 - 8…). Le gradient exponentiel est prédéfini.Nous avons testé un panel de 17 antibiotiques pour la véri-fication des performances, présentés dans le tableau II.Nous avons suivi les recommandations du CA-SFM [9] pour le choix des milieux de culture : gélose Mueller Hin-ton (MH), gélose au sang (COS) et gélose polyvitex (PVX).

3.3. Souches tests et isolats cliniques L’évaluation des performances a été réalisée avec

des matériaux référencés certifiés qui sont des souches

Tableau II – Gamme d’antibiotiques testés.

Antibiotiques CodeGammes de

concentrations

Antibiotiques bactéricides

Benzylpénicilline (pénicilline G) PG

0,002 à 32 mg/L

Céfotaxime CT

Ceftriaxone TX

Ciprofloxacine CI

Ertapénème ETP

Imipénème IP

Méropénème MP

Rifampicine RI

Amoxicilline AC

0,016 à 256 mg/L

Céfixime IX

Ceftazidime TZ

Daptomycine DPC

Téicoplanine TP

Vancomycine VA

Spectinomycine SC 0,064 à 1 024 mg/L

Antibiotiques bactériostatiques

Acide fusidique FU 0,016 à 256 mg/L

Linézolide LZ 0,016 à 256 mg/L

Tableau III – Limites d’acceptabilité

et concentrations critiques

pour Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa

(ATCC 27853)

Isolats cliniques

Pseudomonas aeruginosa

AntibiotiquesLimites

d’acceptabilité du contrôle (mg/L)

Concentrations critiques CA-SFM (mg/L)

Imipénème 1 – 4 ≤ 4 (S) > 8 (R)

Méropénème 0,25 – 1 ≤ 2 (S) > 8 (R)

Doripénème 0,064 – 0,25 ≤ 1 (S) > 4 (R)


documents du Cofrac SH FORM 43 (fiche type quantitatif) [27] et SH FORM 44 (fiche type qualitatif) [28].

4. Résultats

4.1. Évaluation et maîtrise

des facteurs d’incertitudeLa vérification de la méthode analytique E-test® est basée sur une analyse exhaustive des risques par l’identification de ceux-ci et la mise en place de facteurs de maîtrise per-tinents en termes d’efficience et de réalisation.La maîtrise des facteurs d’incertitude doit être pleinement démontrée et documentée : gestion des référentiels avec une actualisation constante, documentation concise et pratique pour les techniciens, formation du personnel technique en insistant tout particuliè-rement sur l’intérêt des formations internes courtes et ciblées, standardisation des lectures à l’ensemble des opérateurs, utilisation appropriée des souches tests en contrôle de qualité,

évaluation des connaissances par des questionnaires diffusés aux techniciens et aux biologistes.

L’évaluation et la maîtrise des facteurs d’incertitude sont présentées dans le tableau IV pour la phase d’ensemen-cement et dans le tableau V pour les phases de lecture et d’interprétation [29, 30].

pour les antibiotiques bactéricides (aminosides, bêta-lactamines, glycopeptides), il faut tenir compte des macrocolonies et des microcolonies et lire l’inhibition complète à 100 % ; pour les antibiotiques bactériostatiques (macrolides, acide fusidique, clindamycine, tigécycline), il faut lire à 80 % d’inhibition et à 90 % pour le linézolide ;

l’observation d’un décrochage ou « dip » dans la zone de lecture impose de lire la CMI en extrapolant la courbe de l’ellipse ;

l’existence d’une hémolyse sur gélose au sang ne doit pas interférer avec la lecture ;

la lecture des CMI des pneumocoques est délicate, il faut non seulement ignorer l’hémolyse mais aussi tenir compte du voile ainsi que des microcolonies ;

les colonies muqueuses de Pseudomonas aeruginosa peuvent présenter des difficultés de lecture (effet tun-nel, double ellipse) ;

certains antibiotiques diffusent mal en milieu gélosé : colistine, vancomycine. Le CA-SFM recommande notam-ment pour la colistine de recourir à une détermination en milieu liquide.

3.5. Identification des processusLes étapes clés de la vérification des méthodes concernent : l’identification des processus et sous-processus liés à l’activité analytique (figure 1), l’analyse des risques et l’évaluation des performances qui sont reprises dans les

Figure 1 – Identification des sous-processus liés à l’étude de la sensibilité aux antibiotiques par E-test®.



Tableau IV – Évaluation et maîtrise des facteurs d’incertitude (ensemencement et dépôt de bandelettes).

Facteur

d’incertitude

de mesure

Identification des risques Facteurs à maîtriser Facteurs de maîtrise

Milieu

Difficulté d’interprétation : croissance bactérienne hétérogène

Contamination des milieux de cultures

Travail sous PSMMaintenance annuelle du PSM

Bionettoyage des paillasses et contrôle de surface

Surveillance des conditions environnementales (température, hygrométrie)

Application des précautions standardsRésultats aux contrôles qualité

(souche ATCC, CQN, CIL)Audit des bonnes pratiques professionnelles

Non-respect des conditions de santé et de sécurité du personnel

du laboratoireProtection de l’opérateur

Méthode

Difficulté d’interprétation : croissance bactérienne hétérogène

Ensemencement des milieux de cultures manuel ou automatisé (technique par écouvillonnage)

Utilisation d’un ensemenceur Inoculator Retro C80™

Respect de la documentation interne, conforme aux référentiels Remic et CA-SFM

Résultats des contrôles qualité internes et externes (souche ATCC, CQN, CIL)

Fiches techniques du fournisseur (bioMérieux) disponibles au poste : site internet du fournisseur

Audits de la paillasse de bactériologie

Choix des milieux de culture

Croissance bactérienne inconstante : allongement des délais de rendu des résultats,

augmentation du risque patient

Préparation de l’inoculum : turbidité (Mc Farland)

Allongement des délais de rendu des résultats, augmentation du

risque patient

Choix des bandelettes d’antibiotique à tester

Rendu de résultats non-valides : mauvaise diffusion du gradient

d’antibiotique

Dépôt de la bandelette E-test® (disposition sur le milieu de culture,

élimination des poches d’air)

Matériel

Altération des milieux de culture Conservation des géloses

Conditions de conservations conformes aux recommandations du fournisseur

Test de fertilité (par les souches de contrôle)Métrologie des enceintes de stockage des réactifs : cartographie et système

de surveillance des températures

Rendu de résultats erronés : faux-négatif

Condition de conservation des réactifs (température, humidité)

Mauvais isolement des souches pathogènes

Contamination des milieux ensemencés par le matériel

d’ensemencement (oëse, pipette)

Rendu de résultats erronés : turbidité de la suspension bactérienne non-conforme

pour la réalisation des analyses

Densichek™ Plus

Étalonnage mensuel de l’appareil selon les recommandations du fournisseur

(bioMérieux)Résultats des contrôles qualité

(souche ATCC, CQN, CIL)

Main

d’œuvre

Rendu de résultats erronés : ensemencement non-conforme, dépôt de la bandelette incorrect

Compétence du personnel

Formation (interne et externe)-habilitation- évaluation

Respect des fiches d’instruction et notices du fournisseur (bioMérieux)

Résultats de contrôles qualité (souche ATCC, CQN, CIL)

Audits de la paillasse de bactériologie

Matière

Difficulté et/ou erreur dans l’interprétation des CMI

Contamination des milieux de culture

lors de l’ensemencement à J0Qualité de l’ensemencement

Respect de la documentation interne, conforme au référentiel Remic

Audits de la paillasse de bactériologie Compétence du personnel d’ensemencement

(automatisable)

Délais de rendu de résultats non-respectés, augmentation

des coûts d’analyse

L’opérateur doit pouvoir disposer après culture à J0 de matériel

biologique en quantité suffisante pour réaliser la détermination

de la CMI.

Respect des températures et des durées d’incubation définies dans la documentation

interne du laboratoire et en conformité avec le Remic


4.2. Évaluation des performances analytiquesLes tableaux VI et VII présentent les résultats de l’étude des performances analytiques pour les antibiotiques tes-tés en fonction des limites d’acceptabilité [26] pour les souches ATCC et les souches tests. Les CMI obtenues ont été lues par 4 opérateurs différents pour chaque souche testée, l’étendue des concentrations lues est précisée entre crochets pour chaque antibiotique testé.Le tableau VIII présente les lectures des CMI par différents opérateurs en fonction des souches bactériennes et des antibiotiques testés.

Points clés

La métrologie des enceintes thermiques, le contrôle de la gestion documentaire (interne et externe) ou encore une politique d’audit interne déployée sur l’ensemble des pro-cessus du laboratoire sont des thèmes récurrents dans la maîtrise des facteurs d’incertitude. Ces derniers vont se retrouver dans l’analyse des risques quel que soit le domaine d’activité concerné (bactériologie, hématologie, biochimie…). Il apparaît donc opportun de mettre en place un système efficace et transposable sur l’ensemble des activités du laboratoire.

Tableau V – Évaluation et maîtrise des facteurs d’incertitude (lecture des CMI et interprétation).

Facteur

d’incertitude

de mesure

Identification des risques Facteurs à maîtriser Facteurs de maîtrise

Milieu

Non respect des conditions de sécurité du personnel

du laboratoireContamination de l’opérateur

Travail sous PSMMaintenance annuelle SAV du PSM

Bionettoyage des paillassesSurveillance des conditions environnementales

(température, hygrométrie)Contrôle de surface

Application des précautions standardsAudit des bonnes pratiques professionnelles

Méthode Détermination de la CMI erronée

Lecture de la CMI par examen visuel

Fiche d’instruction conforme auxréférentiels Remic et CA-SFMRésultats aux contrôles qualité

(souche ATCC, CQN, CIL)Fiches fournisseur disponibles au poste

(site internet du fournisseur)Audits de la paillasse de bactériologie

Performances des bandelettes E-test®

Vérifications continues des méthodes manuelles, documents d’enregistrement

Matériel

Détermination de la CMI erronéeIntégrité du matériel de lecture :

loupe binoculaire

Entretien et suivi métrologique de l’oculaireRésultats de contrôles qualité

(souche ATCC, CQN, CIL)

Altération et/ou perte de stabilité des réactifs utilisés : rendu de résultats non-valides,

détermination de la CMI erronée

Condition de conservation des réactifs (bandelette E-test®) :

température, luminosité

Respect des recommandations de conservation des réactifs

Métrologie des réfrigérateurs : cartographie et système de surveillance des températures

Croissance inhibée des cultures microbiennes : faux-négatif

dans le rendu des résultats

Conditions d’incubation : température

Métrologie des incubateurs : cartographie et système de surveillance des températures

Main

d’œuvreDétermination de la CMI erronée Compétence du personnel

Formation (interne et externe) qualification-habilitation- évaluation

Respect des fiches d’instruction et notice fournisseur (notamment Guide de lecture E-test®)

Résultats aux contrôles qualité (souche ATCC, CQN, CIL)

Harmonisation des lectures inter-opérateursAudits de la paillasse de bactériologie

Matière

Difficulté et/ou erreur dans l’interprétation et

l’identification des isolats cliniques

Contamination des milieux de culture lors de l’ensemencement

à J +1Qualité de l’isolement/

ensemencement

Respect de la documentation interne, conforme au référentiel Remic

Audits de la paillasse de bactériologie Compétence du personnel d’ensemencement

Délais de rendu des résultats non-respectés, augmentation

des coûts d’analyse

L’opérateur doit pouvoir disposer après culture de matériel biologique

en quantité suffisante pour poursuivre les analyses

Respect des températures et des durées d’incubation définies dans la documentation

interne du laboratoire et en conformité avec le Remic



Tableau VI – Évaluation des performances analytiques des bandelettes E-test® avec différentes souches ATCC.

Souches ATCC

(n = 13 essais)

Antibiotiques testés

(n = 35 essais)

Limites

d’acceptabilité

souches tests (ATCC)

CMI obtenue

(mg/L)

Évaluation de

la conformité

Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)

05/04/13

Ertapénème 2 – 8 6 [6-8]

Conformes aux limites

d’acceptabilité définies

Méropénème 0,25 – 1 0,5 [0,38-0,5]


07/04/13

Ertapénème 2 – 8 6 [6-8]

Méropénème 0,25 - 1 0,38 [0,25-0,38]

Pseudomonas aeruginosa(ATCC 27853)11/07/2013

Méropénème 0,25 – 1 0,38 [0,38]

Imipénème 1-4 2 [2]

Streptococcus pneumoniae(ATCC 49619)

23/04/13

Amoxicilline 0,032 – 0,125 0,064 [0,064]

Céfotaxime 0,032 – 0,125 0,094 [0,094]

Ceftriaxone 0,032 – 0,125 0,064 [0,064]

Pénicilline G 0,25 – 1 0,25 [0,25]

Streptococcus pneumoniae(ATCC 49619)30/04/2013

Amoxicilline 0,032 – 0,125 0,047 [0,047]

Céfotaxime 0,032 – 0,125 0,064 [0,064]

Ceftriaxone 0,032 – 0,125 0,064 [0,064]

Pénicilline G 0,25 – 1 0,25 [0,25]

Staphylococcus aureus(ATCC 29213)10/04/2013

Céfixime – 32 8 [8]

Teicoplanine 0,25 – 1 1 [1]

Vancomycine 0,5 – 2 1,5 [1,5]

Rifampicine 0,004 – 0,016 0,008 [0,006-0,008]

Klebsiella pneumoniae(ATCC 700603)

29/05/2013

Imipénème - 0,25 [0,25]

Ceftriaxone - > 32

Escherichia coli(ATCC 25922)04/07/2013

Imipénème 0,064 – 0,25 0,19

Ertapénème 0,004 – 0,0016 0,006

Ceftriaxone 0,032 – 0,125 0,38

Enterococcus faecalis(ATCC 29212)21/08/2013

Vancomycine 1 – 4 4

Teicoplanine 0,125 – 0,5 0,25

Rifampicine 0,50 – 4 0,50


Daptomycine 0,25 – 1 0,25 [0,25]

Acide fusidique 0,064 – 0,25 0,125 [0,125]


Daptomycine 0,25 – 1 0,25 [0,25]

Acide fusidique 0,064 – 0,25 0,064 [0,064 -0,125]

Linézolide 1 – 4 3 [3]

Neisseria gonorrhoeae(ATCC 49226)02/10/2013

Spectinomycine 8 – 32 12 [8-12]

Céfotaxime 0,016 – 0,064 0,032 [0,023-0,032]

Escherichia coli(ATCC 25922)29/10/2013

Céfixime 0,25 – 1 0,25 [0,25]

Ceftazidime 0,064 – 0,5 0,25 [0,25]


puisque le résultat conduit à ne pas proposer un traite-ment efficace dont il aurait pu bénéficier, mais n’expose pas le patient à un échec thérapeutique.

Discordance très majeure : résultat trouvé sensible (S) alors que la souche est en réalité résistante (R). Ce type d’erreur expose le patient à un risque important d’échec thérapeutique.

Pour chaque antibiotique testé (souches ATCC, souches tests et isolats cliniques), la variation des résultats entre les différents opérateurs, évaluée selon la classification ci-dessus, est exprimée par le pourcentage de concor-dance inter-opérateur. Par exemple, un pourcentage de 100 % de concordance correspond à aucune variation ou discordance significative.Le tableau X montre une seule discordance mineure concernant l’imipénème pour une souche de Klebsiella pneumoniae OXA 48. Les bactéries multirésistantes pré-sentent souvent des microcolonies dans l’ellipse d’inhi-bition, compliquant la lecture.

5. Discussion

Le choix de définir la méthode de détermination des CMI en une technique quantitative (mg/L) ou en technique qualitative (S, I, R) peut se discuter avec l’utilisation des formulaires SH FORM 43 et 44. On rappellera que le SH GTA 04 distingue la méthode quantitative de la méthode qualitative sur le fait d’assimiler au type quantitatif des exa-mens « fournissant un résultat de type qualitatif, extrapolé à partir de la mesure d’un signal continu quantifiable ».

Le tableau des comparaisons (tableau IX) montre une concordance des résultats pour les antibiotiques testés par rapport aux limites d’acceptabilité définies pour les matériaux de référence certifiés (ATCC).Certaines différences sont cependant observables, amoxi-cilline pour Streptococcus pneumoniae, ceftriaxone et ertapénème pour Escherichia coli, rifampicine pour Staphylococcus aureus, avec les CMI rendues par le Vitek qui sont supérieures aux limites hautes d’acceptabilité. L’automate Vitek® 2 Compact indique une CMI ou extrapole les résultats donnés par rapport à la gamme de concen-trations testée. Il ne s’agit donc pas d’une vraie CMI. La NABM précise que la détermination de la CMI se fait en utilisant une gamme comportant au minimum une série de dix concentrations.

4.3. Bilan de l’évaluation des performancesL’évaluation des performances analytiques des bandelettes E-test®, réalisée avec les souches ATCC (tableau VI) et les souches tests (tableau VII), montre des résultats en conformité avec les limites définies.L’analyse des résultats inter-opérateur est présentée dans le tableau X. Elle est basée sur les recommandations du Quamic 2013 [31] qui classe les discordances observées en trois catégories distinctes. Discordance mineure : souche résistante ou sensible répondue à tort intermédiaire ou souche intermédiaire répondue à tort résistante ou sensible. Discordance majeure : résultat trouvé résistant (R) alors que la souche est en réalité sensible (S). Ce type de résultat correspond à une perte de chance pour le patient

Tableau VII – Évaluation des performances analytiques des bandelettes E-test® sur souche tests CQN et EEQ.

Souches tests

(n = 5)


(n = 15)

Limites

d’acceptabilité

souches tests (EEQ et CNQ)

CMI

obtenue

(mg/L)

Évaluation de

la conformité

Enterococcus faecium(CNQ 11-Bac2)

Teicoplanine 0,78 – 1 1 [1]

Conformes aux limites

d’acceptabilité définies

Vancomycine 8 - 16 12 [8-12]

Streptococcus pneumoniaeCQ BP 2013-2A

Amoxicilline 2 1,5 [1,5]

Céfotaxime 1 1 [1]

Pénicilline G 1,5 0,75 [0,75]

Neisseria gonorrhoeaeCQN 13BAC1(souche 250)

Céfixime 2 (R) 2 (R) [1,5-3]

Ciprofloxacine > 32 (R) > 32 (R) [> 32]

Ceftriaxone 1 (R) 1 (R) [1]

Pénicilline G 0,38 – 0,5 (I) 0,5 (I) [0,5]

Haemophilus influenzaeCQN 13BAC1(souche 434)

Céfotaxime 0,25 (R) 0,25 [0,25]

Ceftriaxone 0,125 (S) 0,019 [0,019]

Ciprofloxacine 0,008 (S) 0,016 [0,016]

Amoxicilline 4 (R) 1,5 [1,5]

Moraxella catarrhalisCQ BP 2013-3

Céfotaxime - 0,125 [0,125]

Ciprofloxacine - 0047 [0,0047]



Tableau VIII – Traçabilité et concordance des lectures de CMI en mg/L.

Souches issues

d’isolats cliniques

(n = 25 essais)


(n = 40 essais)

Concentrations critiques

CA-SFM 2013 (mg/L)CMI obtenues (mg/L)

S R Opérateur 1 Opérateur 2 Opérateur 3 Opérateur 4

Neisseria gonorrhoeae 1304609327

Ceftriaxone ≤ 0,12 0,016 (S) 0,023 (S) 0,016 (S) 0,016 (S)

Pénicilline G ≤ 0,06 > 1 0,38 (I) 0,5 (I) 0,5 (I) 0,38 (I)



Spectinomycine ≤ 64 > 64 6 (S) 6 (S) 8 (S) 6 (S)

Ciprofloxacine ≤ 0,03 > 0,06 0,5 (R) 0,75 (R) 0,5 (R) 0,5 (R)



Spectinomycine ≤ 64 > 64 16 (S) 16 (S) 24 (S) 16 (S)

Enterobacter cloacae 1304329081

Ertapénème ≤ 0,5 > 1 0,75 (I) 0,75 (I) 0,75 (I) 0,75 (I)

Méropénème ≤ 2 > 8 0,19 (S) 0,25 (S) 0,19 (S) 0,25 (S)


Ertapénème ≤ 0,5 > 1 2 (R) 3 (R) 2 (R) 2 (R)


Ertapénème ≤ 0,5 > 1 0,75 (I) 1 (I) 1 (I) 1 (I)


Ertapénème ≤ 0,5 > 1 1,5 (R) 2 (R) 1,5 (R) 2 (R)


Ertapénème ≤ 0,5 > 1 1 (I) 1 (I) 1 (I) 0,75 (I)


Ertapénème ≤ 0,5 > 1 6 (R) 4 (R) 6 (R) 4 (R)


Ertapénème ≤ 0,5 > 1 0,38 (S) 0,38 (S) 0,38 (S) 0,38 (S)

Streptococcus pyogenes 1304522025

Pénicilline G ≤ 0,25 > 2 0,008 (S) 0,006 (S) 0,012 (S) 0,008 (S)

Amoxicilline ≤ 0,5 > 2 0,016 (S) 0,016 (S) 0,016 (S) 0,023 (S)

Clostridium perfringens 1304416226

Pénicilline G ≤ 0,25 > 0,5 0,064 (S) 0,064 (S) 0,094(S) 0,064 (S)

Vancomycine 0,38 (S) 0,25 (S) 0,38(S) 0,38 (S)

Haemophilus influenzae 1304526012

Amoxicilline < 1 > 1 16 (R) 16 (R) 12 (R) 16 (R)

Céfotaxime ≤ 0,12 0,023 (S) 0,023 (S) 0,023 (S) 0,032 (S)

Pseudomonas aeruginosa 1303515157

Ertapénème Résistance naturelle > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R)

Méropénème ≤ 2 > 8 0,75 (S) 1 (S) 1 (S) 1 (S)


Imipénème ≤ 4 > 8 1,5 (S) 1 (S) 1 (S) 1,5 (S)


Méropénème ≤ 2 > 8 3 (I) 3 (I) 3 (I) 4 (I)


Imipénème ≤ 4 > 8 > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R)

Méropénème ≤ 2 > 8 > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R)


Imipénème ≤ 4 > 8 8 (I) 6 (I) 6 (I) 6 (I)Méropénème ≤ 2 > 8 16 (R) 16 (R) 16 (R) 12 (R)


Imipénème ≤ 4 > 8 1 (S) 1,5 (S) 1 (S) 1 (S)

Corynebacterium urealyticum Vancomycine ≤ 4 > 4 0,38 (S) 0,38 (S) 0,5 (S) 0,38 (S)

Escherichia coliCarbapénémase NDM-5

1310507105

Imipénème ≤ 2 > 8 > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R)

Méropénème ≤ 0,12 > 8 > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R)

Ertapénème ≤ 0,5 > 1 > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R) > 32 (R)

Klebsiella pneumoniae OXA 48 25-143

Imipénème ≤ 2 > 8 3 (I) 2 (S) 2 (S) 2 (S)

Méropénème ≤ 0,12 > 8 1 (I) 0,75 (I) 1 (I) 1 (I)

Ertapénème ≤ 0,5 > 1 4 (R) 4 (R) 6 (R) 4 (R)

Klebsiella pneumoniae 1310317116

Ertapénème ≤ 0,5 > 1 0,75 (I) 1 (I) 0,75 (I) 0,75 (I)

Klebsiella pneumoniae 1310814536

Ceftazidime ≤ 1 > 4 > 128 (R) > 128 (R) > 192 (R) > 128 (R)

Staphylococcus aureus 1310519045

Acide fusidique ≤ 1 > 1 0,016 (S) 0,016 (S) 0,023 (S) 0,016 (S)


Tableau IX – Comparaison entre les CMI obtenues par E-test® et par technique automatisée Vitek® 2 Compact.

Souches ATCC Antibiotiques testés

Limites

d’acceptabilité

souches tests (ATCC)

CMI

Obtenue par E-test®Vitek® 2 Compact


Méropénème 0,25 – 1 0,5 ≤ 0,25


Méropénème 0,25 – 1 0,38 ≤ 0,25


Méropénème 0,25 – 1 0,38 ≤ 0,25

Imipénème 1-4 2 2


Amoxicilline 0,032 – 0,125 0,064 ≤ 0,25

Céfotaxime 0,032 – 0,125 0,094 ≤ 0,12

Ceftriaxone 0,032 – 0,125 0,064 ≤ 0,12

Pénicilline G 0,25 – 1 0,25 1


Amoxicilline 0,032 – 0,125 0,047 ≤ 0,25

Céfotaxime 0,032 – 0,125 0,064 ≤ 0,12

Ceftriaxone 0,032 – 0,125 0,064 ≤ 0,12

Pénicilline G 0,25 – 1 0,25 1

Staphylococcus aureus(ATCC 29213)

Teicoplanine 0,25 – 1 1 ≤ 0,5

Vancomycine 0,5 – 2 1,5 ≤ 0,5

Rifampicine 0,004 – 0,016 0,008 ≤ 0,03

Escherichia coli(ATCC 25922)

Ertapénème 0,004 – 0,0016 0,006 ≤ 0,5

Ceftriaxone 0,032 – 0,125 0,38 ≤ 1

Enterococcus faecalis(ATCC 29212)

Vancomycine 1 – 4 4 2

Staphylococcus aureus(ATCC 29213)

Acide fusidique 0,064 – 0,25 0,125 [0,125] ≤ 0,5

Tableau X – Concordance des lectures visuelles inter-opérateur.

Antibiotiques

Nombre de

souches

testées

Pourcentage de

concordance inter-opérateur

(%)

Nombre de résultats de CMI présentant une variation significativeTotal

Discordance mineure Discordance majeure Discordance très majeure

Acide fusidique 3 100 0 0 0 0

Amoxicilline 6 100 0 0 0 0

Benzylpénicilline (pénicilline G)

7 100 0 0 0 0

Céfixime 3 100 0 0 0 0

Céfotaxime 7 100 0 0 0 0

Ceftazidime 2 100 0 0 0 0

Ceftriaxone 9 100 0 0 0 0

Ciprofloxacine 4 100 0 0 0 0

Daptomycine 2 100 0 0 0 0

Ertapénème 14 100 0 0 0 0

Imipénème 9 97,2 1 0 0 1

Linézolide 1 100 0 0 0 0

Méropénème 10 100 0 0 0 0

Rifampicine 2 100 0 0 0 0

Spectinomycine 3 100 0 0 0 0

Téicoplanine 3 100 0 0 0 0

Vancomycine 5 100 0 0 0 0

Total 1 0 0 1



des CMI par la méthode de diffusion permet donc de contrôler et de valider les résultats obtenus par les techniques d’antibiogrammes automatisées.La sensibilité de la méthode (capacité du test à classer S une souche S) et la spécificité diagnostique (capacité à ne pas classer une souche d’une autre catégorie dans une catégorie donnée) sont globalement bonnes et en accord avec d’autres publications [4]. Toutefois, nos résultats nous incitent à surveiller ces deux paramètres de perfor-mance au long cours en vérifiant un nombre de souches plus important.

Points clés

Le mode de lecture des E-test® est délicat et varie en fonction des souches et des antibiotiques testés. Il nécessite une bonne formation des opérateurs (phase d’apprentissage), car certains couples bactéries/antibiotiques présentent des pièges de lecture et d’interprétation (pneumocoques, bactéries multirésis-tantes). Les CMI des souches cliniques doivent être comparées aux concentrations critiques du CA-SFM, alors que les CMI des souches tests doivent être com-parées aux limites d’acceptabilité des fournisseurs. La détermination des CMI est un facteur clé pour assu-rer la sécurité des traitements des infections graves (méningites, bactériémies, endocardites, infections ostéo-articulaires, patients de réanimation) et pour adapter les posologies sur la base des propriétés PK /PD des antibiotiques.

6. Conclusion

La détermination des CMI est un point critique en bac-tériologie clinique car elle nécessite une bonne maîtrise de tous les facteurs d’influence, c’est-à-dire un strict respect des recommandations des fournisseurs, une rigueur d’exécution et d’interprétation, ainsi qu’un savoir-faire des opérateurs, notamment pour les antibiotiques bactéricides et les souches muqueuses ou porteuses de phénotype de résistance complexe.Cette vérification des performances, réalisée dans le cadre de l’accréditation, permet de conclure que la méthode analytique mise en œuvre est appropriée à l’utilisation des réactifs conformément à l’utilisation prévue des résultats d’examen pour les patients.Enfin, si la finalité de la CMI n’est pas de rechercher les BMR, la maîtrise de cette technique peut servir à confirmer un phénotype suspecté et de prendre dans les meilleurs délais les dispositions pour le signalement, l’isolement ou le traitement des patients.

RemerciementsLes auteurs remercient Luc Essemilaire (Condom), Jean-Michel Garnier (Reims), Patrice Laudat (Tours), Jean-Pierre Bouilloux (Rodez) pour leur aide et la lecture critique de cet article ainsi que le personnel du labo-ratoire de Commercy.

Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de

conflits d’intérêts en relation avec cet article.

Dans le cas des E-test®, la frontière est étroite entre le qualitatif et le quantitatif, car le gradient de concentra-tions des antibiotiques testés est continu, en revanche les graduations sur les bandelettes sont discontinues. Classiquement, cette méthode est qualitative même si cela prête à discussion. D’ailleurs, certaines notices concernant la technique de détermination de la CMI par bandelettes la définissent comme quantitative.En ce qui concerne la méthode qualitative, il serait oppor-tun que le document SH FORM 44 accorde une place plus significative à l’analyse des risques et à la vérification des facteurs de maîtrise mises en place. De la même façon, une identification claire des processus et sous-processus est essentielle pour cadrer le travail à mener, et les disposi-tions à prendre pour maîtriser les points critiques identifiés.La mesure des CMI est d’une grande actualité notam-ment dans le cadre des stratégies de lutte (alerte, suivi et investigation) contre les bactéries multirésistantes et les bactéries hautement résistantes émergentes (BHRe). Le LBM joue un rôle central dans le dépistage et le diagnostic microbiologique [11, 12, 32]. Lors de cette étude, nous avons pu mettre en évidence la sensibilité diminuée de plusieurs entérobactéries aux carbapénèmes (Klebsiella pneumoniae BLSE, OXA 48, Escherichia coli NDM - 5) avant de faire confirmer l’identification par le Centre national de référence des résistances bactériennes ou le CHU de Nancy. Lorsque les souches bactériennes cumulent plusieurs mécanismes de résistance, l’anti-biogramme automatisé montre ses limites, dans ces cas la méthode E-test® est aussi intéressante à utiliser.Les résultats obtenus lors de cette vérification des per-formances sont en accord avec les données du fournis-seur et les conclusions de travaux qui portaient sur un échantillon plus important de souches cliniques [4, 33]. Différentes équipes ont établi que le système E-test® est assez bien corrélé avec la méthode de référence par dilution en gélose [7, 8, 33]. Toutefois certains tra-vaux ont montré que les E-test® donnaient des valeurs de CMI plus importantes que la méthode de référence notamment dans le cas de la vancomycine pour le genre Streptococcus [8]. Notre étude ne montre pas de discor-dances pour les CMI obtenues pour les souches tests mais souligne l’importance de la standardisation des pratiques (ensemencement, lecture et interprétation). L’emploi systématique de la loupe binoculaire pour la lecture des CMI a permis d’optimiser et d’harmoniser la lecture et l’interprétation. De surcroît, l’utilisation d’un ensemenceur permet d’améliorer la standardisation de la technique des E-test®.Il faut cependant souligner que les effets d’inoculum pour les systèmes Vitek® sont connus et non décelables avec certitude. Ils sont susceptibles d’engendrer des « effets de bascules » de catégorisation clinique. C’est pourquoi, la détermination de la CMI permet d’affiner les résultats bruts d’antibiogramme. Au niveau des E-test® l’effet inoculum est faible et en tout cas visible à la lecture.En revanche, les données obtenues avec les E-test® montrent dans certains cas des discordances avec les CMI trouvées par le Vitek® 2 qui utilise des gammes de concentrations en antibiotiques beaucoup plus réduites de l’ordre de 3 ou 4 concentrations. La détermination


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