UTILISATION DE COMPLEXES FORMÉS DE PECTINE ET D'ISOLAT … · 2018-04-14 · Les complexes non...

MARIE-CLAUDE GENTÈS

UTILISATION DE COMPLEXES FORMÉS DE PECTINE ET D'ISOLAT DE PROTÉINES SÉRIQUES

DANS LA FORMULATION DE YOGOURTS BRASSÉS

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en Sciences et technologie des aliments pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)

DÉPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION FACULTÉ DES SCIENCES DE L'AGRICULTURE ET DE L'ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2007 © Marie-Claude Gentès, 2007

ii

Résumé

Ce travail avait pour but d’améliorer les propriétés rhéologiques (fermeté, viscosité

apparente) et la synérèse de yogourts brassés en ajoutant des complexes composés d’isolat

de protéines sériques (IPL) et de pectine comme agent stabilisant. Les complexes ont été

stabilisés par l’application d’un traitement thermique afin de résister à une remontée de pH

à 7.0. Parmi les concentrations étudiées, 0.1% de complexes non chauffés a donné les

meilleures propriétés rhéologiques. Les complexes traités thermiquement n’ont pas permis

d’améliorer les caractéristiques du yogourt. Cet effet est possiblement relié à l’utilisation

combinée de pectine et d’IPL plutôt qu’à la complexation des biopolymères. Utiliser une

solution d’IPL et de pectine, non complexée, a donné des propriétés rhéologiques

supérieures aux complexes non chauffés. La variation du ratio caséines-protéines totales a

permis d’obtenir des résultats différents: les complexes non chauffés ont donné de

meilleures propriétés rhéologiques que la solution d’IPL et de pectine non complexée.

iii

Résumé long Le but de ce travail était d’améliorer les propriétés rhéologiques et la rétention du sérum du

yogourt brassé par l’ajout de complexes composés d’isolat de protéines sériques et de

pectine, utilisé comme agent stabilisant. L’hypothèse de cette étude était que les complexes,

ayant possiblement des propriétés fonctionnelles différentes des constituants seuls,

permettront de stabiliser les propriétés finales du yogourt brassé. Une étape préalable à

l’utilisation de complexes dans le yogourt brassé devait être effectuée : stabiliser les

complexes à une remontée de pH à 6.5-6.7. Un traitement thermique de 90°C/2minutes a

permis cette stabilisation.

Le taux d’incorporation des complexes a été déterminé. Une concentration de 0.1% en

équivalent pectine a permis d’améliorer les caractéristiques finales du yogourt additionné

de complexes non chauffés comparativement au yogourt additionné d’une pectine

commerciale. Les complexes traités thermiquement (stabilisé) n’étaient peu influencés par

la concentration utilisée. Cette observation suggère une sur-agrégation protéique empêchant

la formation d’un réseau caséique homogène ou la non-participation des complexes dans

l’élaboration de la structure de la matrice gélifiée. Les conclusions de cette section ont

suscité une interrogation soit que les résultats seraient dus à l’effet additif de la pectine et

l’isolat de protéines sériques sans formation préalable de complexes. Cette dernière a été

validée au troisième objectif. Une solution de pectine et d’isolat de protéines sériques non

complexée offrait de meilleures caractéristiques texturales que les complexes non chauffés.

Une différence de pH des laits de standardisation pourrait avoir modifié le processus de

gélification de la matrice. Finalement, le dernier objectif était de varier le ratio caséines-

protéines totales. Une augmentation de la quantité de caséines au détriment de la teneur en

protéines sérique a permis d’améliorer les propriétés rhéologiques. Une observation

intéressante a également été notée. Les complexes non chauffés ont présenté de meilleures

caractéristiques texturales que la solution de pectine et d’isolat de protéines sériques. Il

semble donc que la variation de caséines et de protéines du lactosérum influence

grandement la qualité finale des yogourts brassés.

iv

Abstract

The aim of this work was to improve the rheological properties and whey retention of

stirred yoghurts by the addition of whey protein isolate (WPI) and low methoxyl pectin

complexes as stabilizing agent. The developed complexes were stabilized to a pH

adjustment to 7.0 by the application of heat treatment. The level of incorporation to obtain

adequate finish characteristics was determined. The stabilized complexes (heat treated)

were unable to enhance the rheological properties of yoghurt despite of unheated

complexes did. This effect could be due to the addition of WPI and pectin without

complexe formation. Using a WPI and pectin solution without complexe formation led to

increase the rheological properties. Varying the casein to total protein ratios gave different

results: unheated complexes permitted to obtain greater rheological properties than WPI

and pectin solution without complexe formation.

v

Avant-Propos

Ce mémoire comporte 5 chapitres dont 4 sont présentés sous forme d'articles scientifiques.

Pour ces derniers, j’en suis l’auteure principale. J’ai planifié et réalisé la totalité des

expérimentations au Centre de Recherche et de Développement sur les Aliments

d’Agriculture et Agroalimentaire Canada (CRDA, AAC, Saint-Hyacinthe). J'ai entièrement

effectué l’analyse des résultats de recherche ainsi que la rédaction de ces articles. La

supervision de ce projet a été effectuée par la Dr. Sylvie Turgeon, directrice. Le co-

directeur de ces travaux a été le Dr. Daniel St-Gelais. Tous deux ont apporté leur soutien

scientifique et conseils selon leur expertise. La réalisation des travaux a été également

possible grâce au Conseil de Recherche en Science Naturelle et Génie (CRSNG) qui m’a

accordée une bourse d’études supérieures de maîtrise (ESM). Les partenaires financiers du

projet ont été le CRSNG ainsi que Parmalat Canada.

Le premier chapitre intitulé «Revue de littérature» est un document de référence théorique

sur la technologie de fabrication de yogourts (définition, influence sur le produit fini,

changements induits), les principaux défauts de qualité ainsi que les méthodes employées

pour prévenir les imperfections telles que la maîtrise du procédé de fabrication et l’ajout

d’agents stabilisants. La formation de complexes constitués de polysaccharide et de

protéine, leurs applications alimentaires et la justification d’utilisation à titre d’agents

stabilisants dans le yogourt y sont discutées. Finalement, l’hypothèse de recherche, le but,

l’objectif général et les objectifs spécifiques de l’étude, sont présentés.

Le second chapitre: «Stabilization of pectin-whey protein isolate complexes to an

increasing of pH to neutrality by using heat treatment» sera soumis sous peu. Cet article

vise à stabiliser les complexes formés d’isolat de protéines sériques et de pectine à une

remontée de pH à 7.0 suite à l’application d’un traitement thermique. Les résultats obtenus

ont permis de développer une méthode de validation de la stabilité, de déterminer le couple

temps-température requis pour la stabilisation, de stabiliser le complexe et d’en déterminer

la durée de conservation.

vi

Le troisième chapitre «Pectin-whey protein isolate complexes in stirred yoghurts : Impact

on the rheological properties and syneresis» fait l’objet d’une publication. Ce chapitre

porte sur l’application des complexes dans le yogourt et d’en déterminer le taux

d’incorporation. La texture de ces yogourts a été comparée à un yogourt additionné de

pectine commerciale. Cette étude a permis de connaître le comportement des complexes

dans le yogourt à diverses concentrations de même que la détermination du taux

d’incorporation donnant des propriétés rhéologiques maximales.

Le quatrième chapitre : «Effect of pectin and whey protein isolate with and without

complexe formation on the rheological properties of stirred yoghurts», se veut une étude

sur l’effet d’additionner une solution d’isolat de protéines sériques et de pectine sans

complexation. Les résultats de cet article ont permis de déterminer que la complexation

n’est pas requise pour améliorer les propriétés rhéologiques de yogourts.

Le cinquième chapitre «Impact of varying casein to total protein ratios on rheological

properties and syneresis of stirred yoghurts made with pectin-whey protein isolate

complexes» porte sur l’impact de la variation du ratio caséines-protéines totales sur les

propriétés rhéologiques des laits fermentés. L’effet de la variation de ce facteur a été étudié

sur deux types de formulations de yogourts brassés soit une additionnée d’une solution de

pectine et d’isolat de protéines sériques sans formation préalable de complexes et la

seconde additionnée de complexes non chauffés. Cette étude a permis de souligner

l’importance du contrôle du ratio caséines-protéines totales dans la formulation de yogourts

brassés additionnés de complexes.

Le présent travail se termine par une conclusion générale présentant l’ensemble des

résultats obtenus et de leur importance et pertinence dans le domaine des produits laitiers

fermentés. Finalement, la dernière section «Perspectives» présente les améliorations à

apporter pour des travaux futurs, de même que des pistes à étudier.

vii

Remerciements

Tout au long de mon projet de recherche, j'ai eu la chance de rencontrer des gens qui

m'ont touché et fait évoluer. Cette expérience a été bénéfique autant du côté personnel

que professionnel. Je veux donc remercier personnellement toute personne qui, en lisant

ces quelques lignes, se sentira concernée.

Pour le projet de recherche et le financement, je remercie madame Sylvie Turgeon et

monsieur Daniel St-Gelais. Un merci tout spécial, à vous deux, pour les judicieux conseils

ainsi que le temps et l'énergie que vous m’avez consacrés.

Je tiens également à remercier personnellement les assistantes de recherche de l’équipe du

chercheur Daniel St-Gelais : Sophie Turcot, Annie Caron, Caroline Lapointe et Sylvie

Haché pour leur aide et leur soutien en laboratoire. Merci à Martin Cauchon, stagiaire d'été,

avec qui j'ai fabriqué des tonnes et des tonnes de yogourts brassés.

Un remerciement particulier est adressé au Conseil de Recherche en Sciences naturelles et

en Génie du Canada (CRSNG) de m’avoir accordé une bourse d’études supérieures (ESM)

pour la totalité de mes études de maîtrise et pour la subvention de ce projet de recherche.

Je remercie le second partenaire financier : Parmalat Canada. Je veux également remercier

monsieur Daniel St-Gelais de m’avoir permis de bénéficier des installations de l’usine

pilote, de même que tous les appareils d’analyse et de dosage du Centre de recherche et de

développement sur les aliments (CRDA) d’Agriculture et agroalimentaire Canada.

Un merci tout spécial à mes parents, ma sœur et mon frère ! Merci de croire en moi, de

m’encourager et de me soutenir dans tout ce que j’entreprends!

N’oubliez pas de croire en vos rêves, même les plus fous !

viii

Ce mémoire est dédié à mes parents, Hélène et René.

Failure is success in progress (Unknown)

ix

Table des matières

Résumé long....................................................................................................................... iii Abstract .............................................................................................................................. iv Avant-Propos ...................................................................................................................... v Remerciements.................................................................................................................. vii Table des matières.............................................................................................................. ix Liste des figures ............................................................................................................... xiii Liste des tableaux.............................................................................................................. xv Liste des abréviations...................................................................................................... xvii Introduction......................................................................................................................... 2 Chapitre 1 : Revue de littérature ......................................................................................... 4

1.1 Définition du yogourt................................................................................................ 4 1.2 Procédé de fabrication du yogourt brassé ................................................................. 4

1.2.1 Le lait de transformation.................................................................................... 4 1.2.2. La pasteurisation et l’homogénéisation ............................................................ 5 1.2.3. L’inoculation et la coagulation ......................................................................... 6 1.2.4. Le conditionnement, entreposage et transport ................................................. 7

1.3. Principaux défauts résultant de la fabrication du yogourt ....................................... 8 1.3.1. Synérèse ............................................................................................................ 8 1.3.2. Les défauts de texture ....................................................................................... 9

1.4. Stabilisation du yogourt brassé .............................................................................. 10 1.4.1. Procédé de fabrication..................................................................................... 10 1.4.2. Addition de stabilisants................................................................................... 12

1.5. Complexe protéines/polysaccharides..................................................................... 13 1.5.1. Protéines de lactosérum .................................................................................. 13 1.5.2. Polysaccharides............................................................................................... 14 1.5.3. Formation des complexes ............................................................................... 15 1.5.4. Facteurs influençant la formation de complexes ............................................ 16 1.5.5. Applications alimentaires des complexes ....................................................... 17 1.5.6. Addition du complexe dans la formulation de yogourts brassés .................... 17

1.6. Hypothèse, But, Objectif général, Objectifs spécifiques ....................................... 19 1.6.1. Hypothèse ....................................................................................................... 19 1.6.2. But................................................................................................................... 19 1.6.3. Objectif général............................................................................................... 19 1.6.4. Objectifs spécifiques....................................................................................... 19

Chapter 2: Stabilization of pectin-whey protein isolate complexes to an increasing of pH to neutrality by using heat treatment................................................................................. 20

Résumé.......................................................................................................................... 21 Abstract ......................................................................................................................... 22 2.1. Introduction............................................................................................................ 23 2.2. Materials and methods ........................................................................................... 25

2.2.1 Materials .......................................................................................................... 25 2.2.2. Complexe formation ....................................................................................... 25 2.2.3. Stability test .................................................................................................... 26

x

2.2.4. Heat treatment................................................................................................. 27 2.2.5. Shelf-life ......................................................................................................... 28 2.2.6. Statistical methods .......................................................................................... 28

2.3. Results.................................................................................................................... 29 2.3.1. Effect of heat treatment................................................................................... 29 2.3.2. Shelf-life ......................................................................................................... 32

2.4. Discussion .............................................................................................................. 33 2.4.1. Effect of heat treatment................................................................................... 33 2.4.2. Shelf-life ......................................................................................................... 35

2.5. Conclusion ............................................................................................................. 36 Acknowledgements....................................................................................................... 36

Chapter 3: Pectin-whey protein isolate complexes in stirred yoghurts: Impact on rheological properties and syneresis ................................................................................. 43

Résumé.......................................................................................................................... 44 Abstract ......................................................................................................................... 45 3.1. Introduction............................................................................................................ 46 3.2. Materials and methods ........................................................................................... 48

3.2.1 Materials .......................................................................................................... 48 3.2.2. Complexe formation ....................................................................................... 48 3.2.3. Yoghurt milk preparation................................................................................ 49 3.2.4. Strains, cultures and medium culture.............................................................. 49 3.2.5. Yoghurt manufacture ...................................................................................... 50 3.2.6. Analytical methods ......................................................................................... 51 3.2.8. Rheological measurements and whey separation ........................................... 51 3.2.9. Microscopy ..................................................................................................... 52 3.2.10. Statistical methods ........................................................................................ 52

3.3. Results.................................................................................................................... 53 3.3.1. Yoghurt manufacture ...................................................................................... 53 3.3.2. Rheological properties, whey separation and microstructure ......................... 54

3.4. Discussion .............................................................................................................. 56 3.4.1. Yoghurt manufacture ...................................................................................... 56 3.4.2. Rheological properties, whey separation and microstructure ......................... 59


Chapter 4: Effect of pectin and whey protein isolate with and without complexe formation on the rheological properties of stirred yoghurts ............................................. 70

Résumé.......................................................................................................................... 71 Abstract ......................................................................................................................... 72 4.1. Introduction............................................................................................................ 73 4.2. Material and methods............................................................................................. 74

4.2.1 Materials .......................................................................................................... 74 4.2.2. Complexes formation...................................................................................... 74 4.2.3. Yoghurt milk preparation................................................................................ 75 4.2.4. Strains, cultures and medium culture.............................................................. 76

xi

4.2.5. Yoghurt manufacture ...................................................................................... 76 4.2.6. Analytical methods ......................................................................................... 77 4.2.8. Rheological measurements and whey separation ........................................... 78 4.2.9. Microscopy ..................................................................................................... 78 4.2.10. Statistical methods ........................................................................................ 79

4.3. Results.................................................................................................................... 79 4.3.1. Yoghurt manufacture ...................................................................................... 79 4.3.2. Rheological properties, whey separation and storage time............................. 79 4.3.3 Effects on microstructure................................................................................. 81

4.4. Discussion .............................................................................................................. 82 4.4.1. Yoghurt manufacture ...................................................................................... 82 4.4.2 Rheological properties, whey separation and microstructure .......................... 83


Chapter 5: Impact of varying casein to total protein ratios on rheological properties and syneresis of stirred yoghurts made with pectin-whey protein isolate complexes............. 93

Résumé.......................................................................................................................... 94 Abstract ......................................................................................................................... 95 5.1. Introduction............................................................................................................ 96 5.2. Material and methods............................................................................................. 98

5.2.1 Materials .......................................................................................................... 98 5.2.2. Complexe formation and whey protein isolate-pectin solution ...................... 98 5.2.3. Yoghurt milk preparation................................................................................ 99 5.2.4. Strains, cultures and medium culture.............................................................. 99 5.2.5. Yoghurt manufacture .................................................................................... 100 5.2.6. Analytical methods ....................................................................................... 100 5.2.7. Rheological measurements and whey separation ......................................... 101 5.2.9. Microscopy ................................................................................................... 101 5.2.10. Statistical methods ...................................................................................... 102

5.3. Results.................................................................................................................. 102 5.3.1. Rheological properties and whey separation ................................................ 102 5.3.2. Microstructure............................................................................................... 103

5.4. Discussion ............................................................................................................ 104 5.4.1. Yoghurt manufacture .................................................................................... 104 5.4.2. Rheological properties and whey separation ................................................ 104 5.4.3. Microstructure............................................................................................... 107

5.5. Conclusion ........................................................................................................... 108 Acknowledgements..................................................................................................... 108

Conclusion générale........................................................................................................ 114 Perspectives de recherche ............................................................................................... 117 Appendice A. Protocole de formation des complexes d’isolat de protéines sériques et de pectine ............................................................................................................................. 119 Appendice B. Protocole du test de stabilité .................................................................... 121

xii Appendice C. Étude préliminaire : Stabilisation des complexes à base d’isolat de protéines sériques et de pectine à pH 4.5 et 5.0 à une remontée de pH à 7.0 par l’application d’un traitement thermique de 90°C/2 min. ................................................ 124 C.1. Introduction ............................................................................................................. 124 C.2. Matériels et Méthodes ............................................................................................. 125

C.2.1 Matériels............................................................................................................ 125 C.2.2. Formation des complexes d’isolat de protéines sériques et de pectine ............ 125 C.2.3. Test de centrifugation : Dosage de la teneur en sucres totaux et en azote total des diverses phases............................................................................................................ 127 C.2.3. Analyse statistique............................................................................................ 128

C.3. Résultats et Discussion............................................................................................ 128 C.3.1. Complexes à pH 5.0 ......................................................................................... 128 C.3.2. Complexes à pH 4.5 ......................................................................................... 130

C.4. Conclusion............................................................................................................... 131 Appendice D. Calcul de l’apport des diverses matières premières en protéines sériques dans les yogourts brassés pour les diverses concentrations en équivalent pectine étudiées (voir « Chapter 3 »)......................................................................................................... 135 Bibliographie................................................................................................................... 138

xiii

Liste des figures

Figure 2.1: Schematic representation of phases in centrifuged complexes ..................... 27 Figure 2.2: Distribution of total nitrogen (%) in superior soluble phase (a), intermediate

soluble phase (b), inferior soluble phase (c) and insoluble phase (d) of centrifuged complexes and WPI or PEC solutions functions of pH and temperature of heat treatment. .................................................................................................................. 38

Figure 2.3: Distribution of total sugar (%) in superior soluble phase (a), intermediate

soluble phase (b), inferior soluble phase (c) and insoluble phase (d) of centrifuged complexes and WPI or PEC solutions functions of pH and temperature of heat treatment. .................................................................................................................. 39

Figure 3.1: Distribution of whey protein in stirred yoghurt made with UHC or HC (%)

functions of pectin concentration (%).Stabilizer contained WPI as protein source. 65 Figure 3.2: Hardness of stirred yoghurt after 4 (a) and 18 days (b) of storage at 4°C c)

Whey separation of stirred yoghurts. Measurements were made at 4 and 18 days after manufacture at 4°C functions of 0.05, 0.1 and 0.2% of pectin concentration.. 66

Figure 3.3: a) Apparent viscosity at a shear rate of 10 s-1 Hz b) Storage modulus (G’) at

a stress of 1 Pa, frequency of 0.1 Hz c) Loss modulus (G’’) at a stress of 1 Pa, frequency of 0.1Hz. Pectin concentration: 0.05, 0.1 and 0.2%. Measurements were made at 4 and 18 days after manufacture and stored at 4°C..................................... 67

Figure 3.4: Visual observation of the texture of stirred yoghurts made with 0.2% as

pectin equivalent for all stabilizers: a) UHC b) POC c) HC d) CP.......................... 68 Figure 3.5: Scanning electron micrographs of stirred yoghurts added with UHC (a), HC

(b), PC (c) and POC (d) at 0.1% as pectin equivalent. Microstructure was visualised at 5 K of magnification. ............................................................................................ 69

Figure 4.1: (a) The pH unit of various stirred yoghurts and (b) Developed acidity

expressed as percentage of lactic acid of various stirred yoghurts functions of storage time. .............................................................................................................. 88

Figure 4.2: (a) Hardness of stirred yoghurts functions of various stabilizers after 4 and 18

days of storage at 4°C (b) Apparent viscosity of stirred yoghurts functions of various stabilizers. Measurements were made after 4 and 18 days of manufacture at a shear rate of 10s-1 and a temperature of 4°C. .................................................................... 89

xiv Figure 4.3: Elastic modulus (G’) of stirred yoghurts functions of type of stabilizers and

storage time. Measurements were made 4 and 18 days after manufacture at a stress of 1 Pa, frequency of 0.1 Hz and a temperature of 4°C. ........................................... 90

Figure 4.4: Syneresis of stirred yoghurts functions as (a) stabilizers and (b) storage time.

Measurements were made at 4 and 18 days after manufacture at 4°C ..................... 91 Figure 4.5: Scanning electron micrographs of stirred yoghurts added with UHC (a), HC

(b), SWPIP (c) and PWPIP (d). Microstructure was visualised at 5 K of magnification. ........................................................................................................... 92

Figure 5.1: (a) Storage modulus (G’) and (b) Loss moduli (G’’) at frequency of 1 Hz

with a constant stress of 0.1 Pa functions of CN to TP ratios (55 and 70%) and storage time (4 and 18 days). Measurements were made at 4°C. ........................... 110

Figure 5.2: Hardness of stirred yoghurt functions of (a) CN to TP ratios and (b) time of

storage. Measurements were made at 4°C. ............................................................. 111 Figure 5.3: (a) Apparent viscosity at shear rate of 0.1s-1 Hz functions of CN to TP ratios

and (b) Whey separation functions of storage time. Measurements were made at 4°C. ......................................................................................................................... 112

Figure 5.4: Scanning electron micrographs of stirred yoghurts added with UHC at CN to

TP ratios of 55% (a) and 70% (b) and SWP with CN to TP ratios of 55% (c) and 70% (d). Microstructure was visualised at 5 K of magnification. .......................... 113

Figure B.1. : Représentation schématique, dans tube à centrifugation, des diverses phases

obtenues après centrifugation de la solution complexée......................................... 121

xv

Liste des tableaux Table 2.1: Weight proportion of superior soluble phase, intermediate soluble phase,

inferior soluble phase and insoluble phase of complexes at pH 4.5 (COMP) and WPI or pectin solutions without heat treatment (25°C/0 min) or heated at 73°/5 min, 85°/15 min and 90°/2 min. Adjustment at pH 7.0 was done after heat. ................... 37

Table 2.2: Total sugar to total nitrogen ratio in superior soluble phase, intermediate

soluble phase, inferior soluble phase and insoluble phase of centrifuged complexes at pH 4.5 without heat treatment (25°C/0 min) or heated at 73°/5 min, 85°/15 min or 90°/2 min. Adjustment at pH 7.0 was done after heat. ............................................. 40

Table 2.3: Evolution of aerobic bacterial population, pH and titratable acidity of various

complexes during the storage at 4°C ........................................................................ 41 Table 2.4: Total nitrogen to total sugar ratio of inferior soluble phase (INSP) and

insoluble phases (IP) of centrifuged complexes at pH 4.5 without heat treatment (UHC45) and with 0.01% (wt) sodium azide, heated at 90°C/2 min (HC45) and with pH adjustment at 7.0 after heat (AHC70) during 28 days of storage at 4°C. ........... 42

Table 3.1: Whey protein, casein, non-nitrogen protein and total protein contents in the

various ingredients .................................................................................................... 64 Table 3.2: Ingredient level (% w/w) of yoghurt milk preparation ................................... 64 Table 3.3: Composition (%) of stirred yoghurts .............................................................. 65 Table 4.1: Type of stabilizers studied in stirred yoghurt formulations and application of

heat treatment or not of milk prior formation of acidified network.......................... 87 Table 5.1: Proportion of raw materials in yoghurt composition of SWP and UHC ...... 109 Table 5.2: Theoretical and experimental casein to total protein ratio............................ 109 Tableau B.1. : Standards du mélange IPL/PEC............................................................. 123 Tableau C.1.1. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour la phase soluble supérieure ..................... 132 Tableau C.1.2. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour la phase soluble intermédiaire................. 132 Tableau C.1.3. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour la phase soluble inférieure ...................... 132

xvi Tableau C.1.4. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour le culot1 ................................................... 133 Tableau C.1.5. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour la phase soluble supérieure ..................... 133 Tableau C.1.6. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour la phase soluble intermédiaire................. 133 Tableau C.1.7. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour la phase soluble inférieure ...................... 134 Tableau C.1.8. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour le culot1 ................................................... 134 Tableau D.1. : Teneur en protéines sériques, caséines et azote non protéique de diverses

matières premières utilisées .................................................................................... 135 Tableau D.2. : Quantité moyenne de chacun des matières premières de toutes les

productions.............................................................................................................. 136 Tableau D.3. : Apport en protéines sériques des diverses matières premières.............. 137

xvii

Liste des abréviations

Chapitre 2: Superior soluble phase: SSP

Intermediate soluble phase: ISP

Inferior soluble phase: INSP

Insoluble phase: IP

Unheated complexes at pH 4.5: UHC45

Heated complexes at pH 4.5: HC45

Heated complexes at pH 4.5 and pH adjustment at 7.0 after heat treatment: AHC70

Chapitre 3: Unheated complexes: UHC

Heated complexes: HC

Commercial pectin: CP

Pectin used in complexe formation: POC

Chapitre 4: WPI-PEC without complexe formation in solution form: SWPIP

WPI-PEC without complexe formation in powder form: PWPIP

WPI in solution form: SWPI

WPI in powder form: PWPI

Unheated complexes at pH 4.5 and no heat treatment of standardised milk: UHCNY

Heated complexes at pH 4.5 and no heat treatment of standardised milk: HCNY

Chapitre 5: Unheated complexes: UHC

WPI-PEC solution without complexe formation: SWP

2

Introduction

Le marché canadien de fabrication de yogourts est florissant. La production est passée de

122 millions de kilogrammes en 1998-1999 à 190 millions de kilogrammes pour les années

2002-2003 (Statistiques Canada, 2004). Les vertus santé de ce produit, l’éventail de saveurs

ainsi que l’arrivée de yogourts enrichis en probiotiques et polyphénols, en polyphénols sont

en partie responsables de cette augmentation de la consommation. Néanmoins, les

principaux défauts de ce produit fermenté demeurent soit la fermeté inadéquate du gel, les

variations de viscosité et l’expulsion du lactosérum : la synérèse (Keogh et O’Kennedy,

1998; Lucey et Singh, 1998).

Afin de pallier à ces imperfections, plusieurs études ont porté sur l’optimisation du procédé

industriel. L’étape de la standardisation vise à augmenter la teneur en solides totaux et à

ajuster le ratio caséines/protéines sériques. Ces ajustements permettent de diminuer

l’aptitude du gel lactique à la synérèse et de contrer les variations de viscosité. Le

traitement thermique du lait est un des plus importants paramètres affectant la texture du

yogourt. Le taux de dénaturation des protéines de lactosérum semble le facteur dominant

qui a un impact sur les caractéristiques du gel formé et l’expulsion du lactosérum (Tamine

et Robinson, 1999). Le second paramètre influençant les caractéristiques désirées du

yogourt est la fermentation. La température et le temps d’incubation, le taux d’inoculation

ainsi que le ratio lactobacilles sur streptocoques sont des facteurs à considérer.

En industrie alimentaire, il est d’usage d'ajouter aux mélanges à yogourt des agents

stabilisants. Ces derniers ont pour but d’améliorer et de maintenir les caractéristiques

désirées du produit final telles qu’une certaine fermeté, viscosité ou consistance, une

texture adéquate et une sensation en bouche agréable. Les stabilisants généralement

employés sont la pectine, la gélatine, la carraghénane, le xanthane, les amidons modifiés

ainsi que la gomme de caroube (Sodini et al, 2004). Dépendant de leurs propriétés

fonctionnelles et leurs concentrations, ils peuvent gélifier ou accroître la viscosité du gel.

Par conséquent, ils contribuent à limiter la synérèse et à donner une texture lisse.

3

Un des critères importants pour l’utilisation d’agents stabilisants est son effet sur le goût et

l’arôme du produit final. Par exemple, la gélatine, un stabilisant d'origine animale (bovine

et porcine), est reconnu pour sa contribution exceptionnelle à la texture et la sensation en

bouche. En effet, sa température de fusion, proche de la température de la cavité buccale,

donne une perception en bouche similaire à la matière grasse (Salvador et Fiszman, 1998).

Son ajout n’apporte pas de saveur particulière au produit fini. Par contre, son emploi ne

convient pas à tous les consommateurs tels que certains végétariens ainsi que la

communauté juive. L’utilisation d’amidon peut conférer un goût de céréale au yogourt. De

plus, ces agents stabilisants sont souvent modifiés chimiquement afin de leur conférer des

propriétés fonctionnelles spécifiques. L’utilisation de tels ingrédients dits «chimiques»

inquiète de plus en plus les consommateurs. Pour les autres agents stabilisants, peu d’études

ont été réalisées afin de déterminer leur influence sur les caractéristiques du yogourt. Il

s’agit généralement d’informations connues par l'expérience acquise de la part des

industriels et des fournisseurs.

Une autre avenue pour la stabilisation des yogourts est l’ajout d’un complexe de protéines-

polysaccharides à la formulation alimentaire. Cette complexation de polymères pourrait

conférer des propriétés fonctionnelles différentes des biopolymères utilisés seuls. Lors d’un

abaissement du pH, les polymères de charges opposées s’associent en solution aqueuse

pour former un complexe. La littérature répertorie peu d’applications alimentaires sauf

l’emploi d’un complexe d’isolat de protéines de lactosérum-xanthane comme substituts de

matière grasse (Laneuville et al, 2000). Par ailleurs, les propriétés moussantes améliorées

d’un complexe d’isolat de protéines de lactosérum-gomme arabique ont justifié son

utilisation dans les sorbets glacés (Schmitt et al, 2005).

Le but de ce travail est de produire un yogourt brassé additionné d’un complexe d’isolat de

protéines de lactosérum-pectine afin de le stabiliser au niveau de la synérèse, la fermeté, la

viscosité apparente ainsi que les modules élastique et visqueux. Ce dernier a été développé

et caractérisé par l’équipe de Sylvie Turgeon, Ph.D.

4

Chapitre 1 : Revue de littérature

1.1 Définition du yogourt Selon la réglementation québécoise, le yogourt est défini comme «un produit laitier obtenu

par la fermentation du lait, du lait partiellement écrémé ou du lait écrémé, par les bactéries

lactiques Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus»

(MAPAQ, 2003).

1.2 Procédé de fabrication du yogourt brassé

1.2.1 Le lait de transformation Le lait de vache est un système complexe constitué d’eau, de lactose, de protéines, de

matière grasse, de minéraux et de vitamines (Amiot et al, 2002; Lamontagne, 2002). Lors

de la fabrication de yogourts, ces différents constituants ont un impact considérable sur la

qualité du produit fini (Sodini et al, 2004; Lamontagne, 2002; Tamine et Robinson, 1999).

La teneur en matière grasse a un effet sur l’onctuosité et la sensation de douceur en bouche.

Le lactose, substrat des bactéries lactiques lors de la fermentation, est essentiel à la

croissance bactérienne. Ce sucre simple est graduellement transformé en acide lactique et

autres composés volatils. Par conséquent, il influence la coagulation du caillé, l’aptitude du

gel à la synérèse et la flaveur caractéristique des yogourts. Les protéines du lait, ayant des

propriétés de liaison et de rétention d’eau, ont une influence sur la texture, la viscosité, la

consistance, l’élasticité et la fermeté du gel lactique. Les minéraux interviennent dans le

processus de coagulation comme stabilisateurs du caillé. Ces derniers influencent donc la

texture et la capacité de rétention d’eau du yogourt. L’eau, piégée dans les mailles de la

matrice gélifiée, est essentielle à la croissance des bactéries lactiques. Sa teneur et sa

biodisponibilité se répercutent sur la vitesse de fermentation, la durée de conservation ainsi

que sur la texture et l’aptitude à la synérèse du caillé acide.

5

Plusieurs facteurs influencent la composition du lait de vache soit la race de l’animal, le

cycle de lactation, l’alimentation ainsi que les facteurs climatiques (Amiot et al, 2002).

L’industrie alimentaire doit utiliser cette matière première variable pour la production d’un

produit fini aux qualités constantes. Afin de contrer cette variabilité, les constituants du lait

sont standardisés. Il existe plusieurs façons de standardiser le lait de transformation comme

l’addition de solides totaux, de solides non gras, de protéines, de sucres et/ou d’édulcorants,

de matières grasses et d’agents stabilisants (Lamontagne, 2002).

1.2.2. La pasteurisation et l’homogénéisation La pasteurisation vise à détruire les microorganismes pathogènes susceptibles de croître

dans le lait ainsi que l’inactivation des enzymes telles que la lipase. Cette étape influence la

texture, la coloration (réaction de Maillard) ainsi que le goût du produit fini (goût de cuit).

Du point de vue technologique, l’application d’un traitement thermique intense permet de

dénaturer graduellement les protéines du lactosérum. Le changement de conformation

induit permet l’exposition du groupement thiol libre de la β-lactoglobuline, protéine

majeure du lactosérum. La stabilisation du réseau caséique est réalisée grâce à l’association

de la κ-caséine avec la β-lactoglobuline via un pont disulfure (Sava et al, 2005). Ces

interactions covalentes protéines-caséines augmentent la consistance et la viscosité du lait.

Une dénaturation maximale de la β-lactoglobuline (> 99%) est recherchée pour l’obtention

d’un yogourt aux caractéristiques désirées. D’autres liaisons sont également engendrées

telles que les interactions entre l’α-lactalbumine et les caséines (Corredig et Dalgleish,

1999). Le traitement thermique résulte en un mélange mixte de protéines sériques solubles,

d’agrégats de protéines sériques et de micelles de caséines recouvertes de protéines sériques

(Vasbinder et de Kruif, 2003). Un apport intense de chaleur peut engendrer des

inconvénients tels qu’altérer la valeur nutritive du yogourt (perte de vitamines

thermosensibles). La fermeté, la viscosité et la synérèse sont également affectées dues à une

agrégation protéines sériques-caséines excessive (Shah, 2003; Lucey et al, 1998;

Dannenberg et Kessler, 1988a et b).

6

L’homogénéisation est un traitement physique permettant de réduire la taille des globules

de gras (Lamontagne, 2002). La séparation de la phase lipidique de la phase aqueuse,

causée par le phénomène de gravité durant la fermentation et l’entreposage du yogourt, est

ainsi diminuée, voire éliminée (Sodini et al, 2004; Tamine et Robinson, 1999). De plus,

cette diminution de diamètre facilite l’insertion des globules de gras dans les pores de la

matrice. Lors de l’étape d’homogénéisation, il y a incorporation des caséines dans la

membrane des globules de gras. La résultante est une augmentation du caractère hydrophile

de ces dernières. La capacité de rétention d’eau ainsi que la fermeté du coagulum sont

également améliorées (Mahaut et al, 2000; Tamine et Robinson, 1999).

1.2.3. L’inoculation et la coagulation Lors de la fermentation lactique, le lactose est principalement métabolisé en acide lactique

par les souches Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et Streptococcus thermophilus.

Ces bactéries thermophiles possèdent des températures optimales de croissance entre 37 à

46°C et 42 à 50°C, respectivement (Mahaut et al, 2000). Ces souches bactériennes agissent

en synergie. Ce sont les streptocoques qui amorcent la fermentation en procurant aux

lactobacilles les composantes requises à leur activité fermentaire telles que l’acide formique

et le gaz carbonique. Quant aux lactobacilles, ceux-ci hydrolysent partiellement les caséines

libérant ainsi de courts peptides et acides aminés qui favorisent la croissance des

streptocoques. Les ferments lactiques sont sensibles aux résidus de lavage, à la présence

d’antibiotiques ainsi qu’aux bactériophages (Clark and Plotka, 2004; Lamontagne, 2002;

Mahaut et al, 2000; Tamine et Robinson, 1999).

Durant la fermentation, l’abaissement graduel du pH engendre trois changements. Les

micelles de caséines, chargées négativement au pH du lait, se neutralisent progressivement.

À pH 4.6, point isoélectrique de ces protéines, la répulsion électrostatique minimale

provoque l’agglomération des micelles de caséines (Tamine et Robinson, 1999; Lucey,

2002; Spiegel et Kessler, 1997; van Vliet et al, 1991). Au pH normal du lait, les micelles

de caséines sont entourées de molécules d’eau permettant de les protéger et de les stabiliser.

La neutralisation de charges diminue le degré d’hydratation.

7

Les conditions acides déstabilisent l’équilibre salin du lait. Avant fermentation, les

minéraux, principalement composés de calcium et de phosphore, se présentent sous deux

formes en équilibre soit solubles et liées aux micelles de caséines via des ponts de

phosphate de calcium (Tamine et Robinson, 1999). En milieu acide, les minéraux sous

forme colloïdale sont peu à peu dissous dans la phase aqueuse. La baisse de répulsion

électrostatique des caséines, la déshydratation partielle ainsi que la dissolution des

minéraux sous forme colloïdale entraînent la désorganisation des sous-unités micellaires.

La résultante est la coagulation des protéines. La matrice formée consiste en un réseau de

caséines liées entre elles par des liaisons de faibles énergies : électrostatiques, hydrophobes

et van der Waals (Tamine et Robinson, 1999; van Vliet et al, 1991). L’enchevêtrement des

protéines laisse place à des interstices où le lactosérum est piégé (Lucey, 2002). Le caillé

déminéralisé ainsi formé est faible, difficilement manipulable, perméable et peu

contractile. La fermentation lactique est arrêtée lorsque le pH atteint 4,6 ou moins et que

l’acidité titratable est de plus de 70 °Dornic (Chandan et O’Rell, 2006; Mahaut et al, 2000).

Le respect du pH final est primordial puisque cette caractéristique influence les propriétés

sensorielles telles que l’acidité, la flaveur et la texture du produit fini (Sodini et al, 2004).

Une lente acidification conduit à la formation d’un gel lisse et homogène.

1.2.4. Le conditionnement, entreposage et transport Le conditionnement inclut les étapes de refroidissement, brassage, lissage et mise en pot

dans le cas de la production du yogourt brassé (Lamontagne, 2002; Mahaut et al, 2000). Le

rôle premier du refroidissement est d’arrêter la fermentation (Chandan et O’Rell, 2006;

Lamontagne, 2002). Les ferments lactiques étant des espèces thermophiles, leur activité

métabolique est ralentie au minimum à des températures de 10°C et moins. Dépendant de la

grosseur du contenant et de la viscosité du lait fermenté, cette étape peut durer quelques

heures. Il est donc d’usage de refroidir avant d’atteindre le pH et l’acidité titratable désirés.

Habituellement, le refroidissement se déroule en deux étapes (Tamine et Robinson, 1999).

D’ordre général, le lait fermeté est pré-refroidi autour de 20°C à l’étape du brassage.

Ensuite, les yogourts sont brassés, lissés et mis en pot pour être refroidis à la température

d’entreposage. Le brassage permet de briser le caillé et d’y réincorporer le lactosérum.

8

Le lissage consiste à faire passer le caillé brassé dans une pompe. Cette étape permet

d’obtenir une texture lisse. Les paramètres tels que la longueur du tuyau, le design, la

vitesse et la température sont tous des facteurs à contrôler (Lucey, 2004). Par la suite, les

fruits, les saveurs et/ou les agents colorants sont ajoutés. Les fruits sont incorporés sous les

formes suivantes : frais, en sirop, en purée, confits, cannés ou congelés. Les saveurs

peuvent être naturelles ou artificielles (synthétisées par voie chimique). Les colorants sont

additionnés pour rendre les produits plus attrayants. La mise en pot est la dernière étape

avant l’entreposage à 4°C. Le remplissage des contenants joue un rôle important dans le

procédé de fabrication. Il permet de livrer un produit sécuritaire en le protégeant contre des

agressions extérieures (poussières, lumière, microorganismes indésirables), facilite sa

manutention et véhicule l’image de marque de la compagnie (Tamine et Robinson, 1999).

De la fin de la fabrication au lieu de vente, les yogourts doivent être entreposés

adéquatement. La chaîne de froid doit être respectée afin d’éviter, principalement, la post-

acidification et la contamination microbienne. Le transport réfrigéré s’effectue

principalement par voie terrestre (camion de livraison).

1.3. Principaux défauts résultant de la fabrication du yogourt

1.3.1. Synérèse Contrairement au fromage, le lactosérum formé suite à la coagulation lactique n’est pas

expulsé du caillé. Par conséquent, la matrice doit posséder la caractéristique de retenir ce

liquide. L’expulsion du lactosérum à la surface des gels lactiques appelée synérèse est

indésirable (Lucey, 2001; Keogh et O’Kennedy, 1998; Lucey et Singh, 1998; van Vliet et

al, 1991). Une distinction existe entre la synérèse endogène ou spontanée due à la

contraction du gel en l’absence de force externe et la synérèse causée par l’application

d’une force extérieure comme le brassage et lissage du gel et le conditionnement (Lucey,

2002; Lucey et al, 1998; van Vliet et al, 1991). La première forme est reliée à l’instabilité

de la matrice résultant en une série de réarrangements dans le temps. Il est connu que

l’expulsion du lactosérum est favorisée si les liens entre les protéines sont brisés.

9

Deux mécanismes peuvent causer ce bris. La première est due à la relaxation des liaisons

intermoléculaires protéines-protéines induites par le mouvement thermal. La seconde est

provoquée suite à un stress interne dans la matrice. À cause du mouvement Brownien et de

la déformation des filaments ou des liaisons entre les protéines, le gel tend à se refermer sur

lui-même ayant pour effet de créer une pression endogène sur le lactosérum et possiblement

de la synérèse (van Vliet et al, 1991).

Ce défaut peut survenir suite à une contamination lactique importante dans la matière

première (Lamontagne, 2002). L’hydrolyse des protéines par les bactéries psychrotrophes

résulte en une perte de leur capacité de rétention d’eau. Une concentration insuffisante en

solides totaux ou une température de solubilisation inadéquate lors de la standardisation de

protéines peut également engendrer l’expulsion du lactosérum de la matrice (Krasaekoopt

et al, 2004; Sodini et al, 2004; Tamine et Robinson, 1999). L’utilisation inappropriée d’un

agent stabilisant et des fluctuations de température durant la fabrication et la conservation

sont également des facteurs influençant la séparation du lactosérum (Clark et Plotka, 2004).

Un traitement thermique trop intense de même qu’une homogénéisation inadéquate, une

acidification rapide ou une sur-acidification lors de la fermentation et du conditionnement

sont des étapes à contrôler afin d’éviter la synérèse.

1.3.2. Les défauts de texture Les défauts de texture sont un gel trop mou ou trop ferme, une faible onctuosité, une

sensation râpeuse ou sableuse en bouche (Clark et Plotka, 2004; Lamontagne, 2002). Une

fermeté excessive ressemblant à une texture de pouding peut être causée par un taux élevé

de solides totaux, une quantité abusive de stabilisants causant une sur-stabilisation caséique

ou une faible température de fermentation (Lucey et Singh, 1998). Un réseau de faible

structure est dû à une quantité insuffisante de solides totaux, un traitement thermique

incomplet, une faible acidité ou une température de fermentation trop élevée (Lucey et

Singh, 1998). Le manque d’onctuosité est fréquemment la résultante d’un yogourt réduit en

matière grasse. La sensation en bouche râpeuse ou sableuse est occasionnée par la présence

de larges agrégats de protéines de l’ordre de 1 à 5 mm (Lucey et Singh, 1998).

10

Une production excessive d’acide lactique, une température d’homogénéisation ou

d’incubation élevée, une utilisation abusive de ferments lactiques et une stabilisation

incorrecte du réseau sont aussi associées à ce type de défaut (Clark et Plotka, 2004).

1.4. Stabilisation du yogourt brassé

1.4.1. Procédé de fabrication La qualité primaire du lait ainsi que la nature et la concentration des constituants du lait

standardisé ont une influence sur les propriétés finales du yogourt. L’augmentation de la

teneur en solides totaux améliore la fermeté ainsi que la viscosité du yogourt (Krasaekoopt

et al, 2004; Sodini et al, 2004; Tamine et Robinson, 1999). Le ratio protéines sériques-

caséines doit également être judicieusement choisi (Sodini et al, 2004; Tamine et Robinson,

1999). En effet, les protéines sériques doivent être en quantité suffisante pour pouvoir jouer

leur rôle d’entourer les micelles de caséines durant la coagulation lactique. La teneur en

minéraux influence aussi les propriétés finales du yogourt. Au deçà d’une concentration

critique, les minéraux préviennent l’agrégation des micelles de caséines pouvant résulter

en une expulsion accrue de lactosérum et des fermetés et viscosités moindres (Schkoda et

al, 1997). L’enrichissement s’effectue par l’utilisation de poudre de lait écrémé, de

concentré de protéines de lactosérum ou de caséinate de sodium. L’emploi de concentré de

protéines de lactosérum améliore la capacité de rétention d’eau des protéines comparé à de

la poudre de lait écrémé (Aguilera et Kessler, 1989; Guirguis et al, 1984). Lors de la

standardisation, quatre paramètres doivent être considérés : la quantité à ajouter, la

température de mélange, le volume du mélange à agiter et la durée du brassage

(Lamontagne, 2002).

La maîtrise du procédé et des paramètres de fabrication du yogourt est un moyen d’éviter

les défauts reliés à la transformation. Plusieurs études ont porté sur les facteurs optimaux

de certaines étapes de préparation de ce produit telles que les temps et températures du

traitement thermique, les vitesses d’acidification et les températures et pressions

d’homogénéisation.

11

Plusieurs auteurs rapportent que le couple temps/température de pasteurisation ainsi que la

température d’incubation sont les éléments ayant le plus d’impact sur les qualités du

produit fini (Sodini et al, 2004; Won-Jae et Lucey, 2004; Lee et Lucey, 2003; Lucey et

Singh, 1998). Par exemple, la combinaison d’une température élevée de pasteurisation de

93°C et d’une basse température d’incubation de 34.3°C forme un caillé possédant

davantage de liaisons entre les caséines et les protéines sériques dénaturées comparé à

l’utilisation de températures élevées d’incubation, 40 et 45.7°C, et de basses températures

de pasteurisation, 72 et 82.5°C (Lee et Lucey, 2003). De plus, la matrice formée à partir

d’un lait traité thermiquement par ultra haute température (UHT) est de moindre fermeté

que les yogourts ayant subi un traitement de chaleur conventionnel (Krasaekoopt et al,

2004; Labropoulos et al, 1981). Par exemple, un yogourt conventionnel de 16% de solides

totaux possède un gel lactique plus ferme qu’un yogourt UHT à 20% de solides totaux

(Krasaekoopt et al, 2004). Conséquemment, le degré de dénaturation des protéines

sériques influence la force du caillé acide. Le degré d’interactions entre la β-lactoglobuline

et la κ-caséine dépend non seulement du couple temps-température de chauffage, mais

aussi de la concentration en protéines, du pH et de la présence de sels minéraux (Singh,

1995). Pour l’étape de refroidissement, la vitesse et la température à atteindre sont des

facteurs qui ont un impact sur la qualité du produit fini puisqu’elles influencent elles-

mêmes la croissance bactérienne ainsi que la post-acidification. Lors de la mise en pot, la

température du mélange influence les qualités technologiques du yogourt. Par exemple, un

remplissage en pot à 10°C donnera un yogourt avec un réseau caséique moins serré, une

tendance accrue à la synérèse et une faible sensation en bouche tandis qu’à 20°C, la

sensation en bouche est plus prononcée, la viscosité est plus élevée et la rétention du sérum

est accrue (Olsen, 2003). La durée et la température (bris de la chaîne de froid) lors de

l’entreposage et du transport sont également des paramètres influençant sur la production

d’un yogourt de qualité (Lucey, 2004). Les 48 premières heures d’entreposage sont

critiques afin d’obtenir la stabilité finale du yogourt. Durant cette période, des

réarrangements importants sont engendrés principalement dus à l’hydratation et ou la

stabilisation des micelles de caséines (Tamine et Robinson, 1999). Le transport réfrigéré est

nécessaire afin de livrer un produit de qualité. Les chocs doivent être réduits au minimum

afin d’éviter une perte de viscosité et une expulsion accrue du sérum.

12

1.4.2. Addition de stabilisants En industrie alimentaire, il est d’usage d’additionner des agents stabilisants à la formulation

des yogourts (Lamontagne, 2002; Tamine et Robinson, 1999; Keogh et O’Kennedy, 1998).

Le rôle principal de ces additifs alimentaires est d'obtenir un yogourt de bonne stabilité

avec la texture désirée (Tamine et Robinson, 1999). Dépendant de leurs propriétés

fonctionnelles et de leur concentration, ils peuvent gélifier ou simplement accroître la

viscosité du gel. Par conséquent, ils contribuent à limiter la synérèse et à donner une texture

lisse. Les agents stabilisants généralement employés sont la pectine, la gélatine, la

carraghénane, la gomme de xanthane, l’amidon et la gomme de caroube (Clark et Plotka,

2004; Sodini et al, 2004). Les plus utilisés, en Amérique du Nord, sont l’amidon et la

pectine. Ils peuvent être vendus séparément ou en mélange (synergie). Les fabricants

recommandent les quantités à employer. Un des critères pour choisir le stabilisant est son

effet sur le goût et l’arôme du yogourt. L’utilisation d’amidon confère au produit fini un

goût de céréale. La gélatine est reconnue pour sa contribution exceptionnelle à la texture et

la sensation en bouche et ce, à cause de sa température de fusion près de celle de la cavité

buccale donnant une perception en bouche similaire à la matière grasse (Salvador et

Fiszman, 1998). L’ajout de ce stabilisant d'origine animale n’apporte aucune saveur

particulière au produit fini. Cependant, son utilisation ne convient pas à tous les

consommateurs comme certains végétariens et la communauté juive. Un autre facteur

influençant l’emploi d’un type d’agents stabilisants dépend des propriétés finales désirées.

Par exemple, Hess et ses collaborateurs (1997) ont étudié la fermeté, la viscosité et la

résistance à la synérèse de yogourts produits avec trois mélanges commerciaux de

stabilisateurs. Le premier mélange composé de gélatine, carraghénane, gomme de caroube

et dextrose, additionné à raison 0.2% (p/p) dans la formulation alimentaire, a donné une

structure et une sensation en bouche désirables pour des yogourts à boire. Une autre poudre

contentant de la pectine et de l’amidon modifié, additionnée à 0.6% (p/p), a produit un

yogourt de meilleure fermeté que le premier mélange. Le dernier ingrédient composé

d’amidons modifiés et de gélatine, ajouté à 1% (p/p) dans le lait de transformation, a donné

un yogourt de grande fermeté comparable à celle de la crème anglaise. Ce dernier a

présenté le taux de synérèse le moins élevé. L’ajout de pectine ou d’alginate (0.2%)

augmente significativement la capacité de rétention d’eau du gel (Shukla et al, 1988).

13

De plus, les travaux de Keogh et O’Kennedy (1998) ont démontré qu’un mélange de

xanthane et de gomme de caroube (0.3%) augmente la capacité de rétention d’eau du caillé

lactique. Aucun effet n’est remarqué par l’emploi d’amidon de blé natif (0.6%). Malgré

l’ajout de stabilisants et/ou texturants et les nombreuses études scientifiques, les défauts de

texture demeurent. Une autre avenue est l’emploi d’un complexe de protéines-

polysaccharides, dans la formulation des yogourts brassés, pour stabiliser la viscosité

apparente, minimiser la synérèse et obtenir une fermeté désirée. Conséquemment, ce travail

portera sur l’application d’un système formé d’isolat protéines sériques et de pectine

développé et caractérisé par l’équipe de Sylvie Turgeon, professeure de l’Université Laval.

1.5. Complexe protéines/polysaccharides

1.5.1. Protéines de lactosérum Les protéines sériques sont principalement composées de la β-lactoglobuline, l’α-

lactalbumine et l’albumine de sérum bovin (Amiot et al, 2002). D’autres types de protéines

du sérum sont également retrouvés en petites quantités. Lorsqu’un traitement thermique est

appliqué, ces macromolécules possèdent la caractéristique de gélifier à chaud et à froid

dépendant de plusieurs facteurs externes et intrinsèques. Les pouvoirs d’émulsification et

de moussage sont également d’autres propriétés fonctionnelles de ces macromolécules

(Lorient et al, 1988).

La β-lactoglobuline semble être la macromolécule principale qui interagit avec les micelles

de caséines via des ponts disulfures lors de la formation du caillé (Sava et al, 2005). Cette

protéine majeure est constituée de 162 résidus d’acides aminés dont 5 sont des résidus de

cystéine (Sava et al, 2005, Amiot et al, 2002). Quatre de ces acides aminés forment des

ponts disulfures permettant de maintenir la structure tertiaire. Le cinquième possède un

groupement thiol libre. Par contre, ce dernier n’est pas disponible dans la forme native de

cette protéine (Walstra et al, 2006, Sava et al, 2005).

14

Il existe au moins cinq variants génétiques dont sont deux plus communs: A et B (Kinsella

et Whitehead, 1989). Ces derniers diffèrent principalement du point de vue conformation.

Gao, Ng-Kwai-Hang et Britten (2002) ont démontré que les variants génétiques (A, B, C et

un mélange des trois) avaient un effet sur les propriétés rhéologiques des gels induits par

traitement thermique (fermeté, synérèse, vitesse de relaxation). De plus, Bikker et ses

collaborateurs (2000) ont montré que l’emploi de variants génétiques (A, B and C), dans

des gels laitiers acidifiés préalablement traités thermiquement, donnait des résultats de

module de conservation significativement différents. Par exemple, un mélange des variants

B et C a donné une augmentation presque linéaire du module élastique, dans les gels laitiers

acidifiés, lorsque la concentration en protéines sériques était accrue. Cette variabilité a été

associée aux différents profils de gélification des variants génétiques de β-lactoglobuline.

Une autre étude a également démontré une croissance du module de conservation quand la

quantité de variants B et C est augmentée (Graveland-Bikker et Anema, 2003). L’α-

lactalbumine semble également jouer un rôle dans la composition de la matrice fermentée

(Corredig et Dalgleish, 1999 et 1996). Cette dernière est une métalloprotéine (Amiot et al,

2002). Elle est constituée de 123 résidus d’acides aminés et un cation calcium. Elle possède

aussi une partie hydrophobe qui semblerait être le site de fixation de la

galactosyltransférase : enzyme de la biosynthèse du lactose. Cette macromolécule possède

deux variants génétiques; le B étant le plus présent dans le lait. L’albumine de sérum bovin,

constituée de 582 résidus d’acides aminés, est associée au transport de molécules comme

les hormones et les acides gras insolubles.

1.5.2. Polysaccharides Les polysaccharides sont des macromolécules à haut poids moléculaire possédant plusieurs

zones hydrophiles grâce à des groupements hydroxyles présents sur la chaîne. Cette

caractéristique d’affinité pour les molécules hydrophiles comme l’eau explique leur

utilisation répandue dans les formulations alimentaires pour le contrôle de la viscosité et de

la texture (Tamine et Robinson, 1999; Colonna and Thibault, 1986). Les polysaccharides

sont chargés soit négativement, soit positivement ou sont neutres. Ces hydrocolloïdes sont

hautement hydrophiles et flexibles (Sanchez et Paquin, 1997).

15

Conséquemment, ces derniers possèdent une excellente capacité à lier l'eau. Ils ont

également la propriété de former des associations avec les protéines (Laneuville, 2004;

Turgeon et al, 2003; Kruif et Tuinier, 2001). Ces biopolymères peuvent être d’origine

végétale (gomme arabique, guar et caroube, pectine), animale (gélatine) et microbienne

(gomme de xanthane) (Tamine et Robinson, 1999; Colonna and Thibault, 1986). Ces

macromolécules peuvent également provenir des extraits d’algues tels que l’agar-agar, la

carraghénane et l’alginate.

1.5.3. Formation des complexes En milieu aqueux, les protéines et les polysaccharides chargés négativement peuvent se

combiner via des liaisons de faibles énergies selon des conditions spécifiques de pH et de

force ionique. Les propriétés fonctionnelles résultant de la formation de ces complexes

diffèrent de celles des biopolymères purs (Kruif et Tuinier, 2001; Tolstoguzov, 1997 et

1991; Samant et al, 1993). Lors de la mise en solution de ces deux constituants, deux

scénarios peuvent survenir soit que les biopolymères sont compatibles ou incompatibles.

L’incompatibilité thermodynamique ou séparation de phases ségrégative, est causée par des

forces répulsives; les deux molécules possèdent des charges de même signe. Dans ce cas, il

y a formation de deux phases où les protéines sont dans une phase et les polysaccharides se

retrouvent dans l’autre (Turgeon et al, 2003; Kruif et Tuinier, 2001). Dans le domaine

alimentaire, la séparation de phases ségrégative peut être mise à profit pour améliorer la

texture de produits extrudés, mais aussi pour induire la gélification d’une solution protéique

et ce, à une concentration inférieure à celle des protéines pures (Tolstoguzov, 1994 et

1991).

La compatibilité thermodynamique peut entraîner la formation de deux types de solution :

une homogène et stable (co-solubilité) et une autre présentant deux phases où les deux

biopolymères se retrouvent majoritairement dans une des phases : séparation de phases

associative (Turgeon et al, 2003; Kruif et Tuinier, 2001).

16

La première situation survient lorsque la concentration en soluté est très faible. La seconde

se produit seulement sous des conditions spécifiques. Par exemple, la co-solubilité peut

arriver lorsque le pH est entre le pI de la protéine et le pKa du polysaccharide et ce, à

faibles forces ioniques (moins de 0.2 à 0.3 M).

Dans le domaine alimentaire, les complexes en condition de compatibilité

thermodynamique (complexes électrostatiques) peuvent diminuer la sensibilité des

protéines aux ions de calcium et modifier la texture des aliments par gélification ou

texturisation de la protéine (Samant et al, 1993).

1.5.4. Facteurs influençant la formation de complexes La complexation électrostatique est influencée par des facteurs intrinsèques : charge et

densité de charge, conformation et poids moléculaire et des facteurs environnementaux :

ratio protéines-polysaccharides, concentration en solides totaux, force ionique, pH et

température (Turgeon et al, 2003; Laneuville et al, 2000). La charge et la distribution des

sites réactifs des deux biopolymères sont proportionnelles à la force de l’interaction

(Samant et al, 1993). Une densité de charge élevée entraîne une précipitation ou

gélification tandis qu’à faible valeur, la complexion électrostatique est supprimée.

Généralement, les complexes protéines-polysaccharides anioniques sont en conditions

solubles lorsque le pH de la solution est supérieur au point isoélectrique des protéines

(Dickinson, 1998, Samant et al, 1993). La conformation et le poids moléculaire peuvent

induire une séparation de phases. Par exemple, un polymère à haut poids moléculaire

conduit à une séparation de phases causée par un volume exclu élevé et des effets

d’encombrements stériques. Le ratio protéines-polysaccharides optimal pour la formation

de complexes varie selon le ratio de charges portées sur chacun des biopolymères. À teneur

élevée de solides totaux, la complexation électrostatique est supprimée. Par contre, à faibles

teneurs, le système devient co-soluble. À force ionique élevée, la complexation du mélange

est diminuée, voire inhibée (Tolstoguzov, 1986). Comme le pH influence le degré

d’ionisation et la charge nette des polymères, il s’agit d’un facteur d’importance.

17

Normalement, les complexes sont formés à température ambiante. Un traitement de chaleur

induit une dénaturation plus ou moins poussée de protéines dépendant du couple temps-

température utilisé. Lorsque dénaturée, la protéine expose de nouveaux sites libres

chargés. La résultante peut être la formation de complexes plus stables (Sanchez et Paquin,

1997; Samant et al, 1993). La dénaturation des protéines, avant formation des complexes,

contribue à la formation d’agrégats de trop grandes tailles (Sanchez et Paquin, 1997).

1.5.5. Applications alimentaires des complexes Plusieurs études ont porté sur la caractérisation des complexes protéines-polysaccharides

(Turgeon et al, 2003; Kruif et Tuinier, 2001; Laneuville et al, 2000; Tolstoguzov, 1997 et

1991; Samant et al, 1993). Jusqu’à présent, les applications alimentaires de ces complexes

sont peu nombreuses. Une application actuellement connue est l’utilisation d’un complexe

d’isolat de protéines de lactosérum-gomme de xanthane comme substitut de la matière

grasse (Laneuville, 2005). Les propriétés moussantes améliorées des complexes d’isolat de

protéines de lactosérum-gomme arabique ont justifié des applications dans les sorbets

glacés (Schmitt et al, 2005). L’emploi de complexes de protéines-polysaccharides n’a pas

encore été étudié dans des systèmes laitiers acides tels que les yogourts.

1.5.6. Addition du complexe dans la formulation de yogourts brassés L'addition des complexes, dans la formulation de yogourts brassés, pourrait s'effectuer à

deux étapes du procédé de fabrication soit au moment de la standardisation ou à une étape

intermédiaire entre le lissage et la mise en pot. Cette dernière option permettrait d’ajouter le

complexe comme une pâte de fruits. Au départ du projet, ces deux options ont été

considérées. La première alternative est à prioriser étant plus facile d'utilisation en

industrie laitière. Il suffirait simplement d'ajouter les complexes formés au lait de

standardisation. Cette option comporte cependant un obstacle majeur : l’interaction entre

les protéines et les polysaccharides est principalement de type électrostatique (Dickinson,

1998; Tolstoguzov, 1997 et 1986; Samant et al, 1993). Conséquemment, ce type de liaison

est largement dépendant de la force ionique et du pH.

18

Le lait de standardisation possède un pH d’environ 6.5-6.7 (Amiot et al, 2002). Dans ces

conditions, les complexes seraient dissociés. En effet, les complexes formés ne sont pas

stables au pH du lait, mais entre la plage de pH de 4,5 à 6,0. Cet effet empêche donc

l'emploi des complexes développés directement dans le lait au moment de la

standardisation. La seconde option est de les additionner entre les étapes de lissage et la

mise en pot telle qu'employée lors de l'ajout de pâte de fruits pour donner les saveurs aux

yogourts (Chandan et O’Rell, 2006; Tamine et Robinson, 1999). À ce stade, le yogourt a

atteint un pH de 4,4-4,6. Ainsi, les complexes pourraient être additionnés à ce stage sans

être défaits. Un des inconvénients majeurs est que les complexes sont formés en solution

aqueuse comportant moins de 3% de solides totaux. Conséquemment, une quantité

importante d'eau serait ajoutée au lait fermenté. Une alternative serait de concentrer la

solution complexée par ultrafiltration (UF). Une autre serait d'enrichir, au départ, le lait de

standardisation. Ainsi, la quantité d'eau ajoutée serait prise en compte et la teneur en

solides totaux désirée pourrait être obtenue. Par contre, cette option s'avère complexe

puisque l'on ne peut prévoir le comportement du yogourt à forte concentration en solides

totaux puis, ensuite l'effet de l'ajout d'eau sur les propriétés rhéologiques et l'aptitude à la

synérèse. Aussi, en ajoutant les complexes à cette étape, un traitement thermique de ceux-ci

serait requis afin d'assurer l'innocuité de ce dernier.

Dans l’optique que cette technologie serait employée par l’industrie, il est important de

considérer l’avenue impliquant le moins de modification possible au procédé.

Conséquemment, l’ajout des complexes au moment de la standardisation a été priorisée. Le

point de départ était de stabiliser les complexes face à une remontée de pH près de la

neutralité. La solution choisie a été l’application d’un traitement thermique au complexe

avant l’utilisation dans la formulation des yogourts brassés. Certains auteurs ont affirmé

que l’application d’un traitement de chaleur peut permettre une stabilité accrue (Sanchez et

Paquin, 1997; Samant et al, 1993; Tolstoguzov, 1986). Les effets de l’application d’un

traitement thermique sur la stabilité des complexes sont présentés au «Chapter 2».

19

1.6. Hypothèse, But, Objectif général, Objectifs spécifiques

1.6.1. Hypothèse L’addition de complexes formés de pectine et d’isolat de protéines sériques dans la

formulation de yogourts brassés permet d'améliorer et de stabiliser les propriétés

rhéologiques et de limiter la synérèse de ce produit.

1.6.2. But Le but de ce projet est de déterminer le mode d’emploi de complexes à base de pectine et

d’isolat de protéines sériques comme agents stabilisants dans les yogourts brassés et d’en

vérifier l’impact sur les propriétés rhéologiques et l’aptitude à la synérèse de ces derniers.

1.6.3. Objectif général Comparer les propriétés rhéologiques (viscosité apparente, fermeté) et l’aptitude à la

synérèse de yogourts brassés contenant des complexes d’isolat de protéines sériques-

pectine avec des yogourts brassés produits avec une pectine commerciale.

1.6.4. Objectifs spécifiques Objectif 1 : Stabiliser les complexes face à une remontée de pH près de la neutralité par

l'application d'un traitement thermique et d’en valider leur durée de conservation.

Objectif 2 : Déterminer le meilleur taux d’incorporation des complexes d’isolat de

protéines sériques-pectine dans les yogourts en fonction des concentrations étudiées.

Objectif 3 : Comparer les propriétés rhéologiques de yogourts additionnés de solutions

d’isolat de protéines sériques et de pectine non complexées aux yogourts ajoutés de

complexes non chauffés et valider l’impact du double traitement thermique subi par les

complexes sur les propriétés rhéologiques des yogourts.

Objectif 4 : Évaluer l’impact de la variation du ratio caséines-protéines totales sur les

propriétés rhéologiques de yogourts additionnés de complexes non chauffés comparés à une

solution pectine-isolat de protéines sériques non complexée.

20

Chapter 2: Stabilization of pectin-whey protein isolate complexes to an increasing of pH to neutrality by using

heat treatment

Marie-Claude Gentès1, Daniel St-Gelais2, Sylvie Turgeon1*

1STELA Dairy Research Centre and Institute of Nutraceuticals and Functional Foods

(INAF), Laval University, Quebec, Qc, Canada G1K 7P4

2Food Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 3600

Casavant Blvd. West, Saint-Hyacinthe, Qc, Canada, J2S 8E3

*Corresponding author. E-mail address: [email protected]. Tel: + 1 418 656

2131 ext.4970. Fax: +1 418 656-3353.

21

Résumé

Le but de ce travail était de déterminer le couple temps-température requis pour la

stabilisation de complexes formés de pectine faiblement méthylée et d’isolat de protéines

sériques (COMP) à pH 4.5 suite à une remontée de pH à 7.0 et d’évaluer leur durée de

conservation sur 28 jours à 4°C. Trois traitements thermiques ont été étudiés : 73°C/5

minutes, 85°C/15 minutes et 90°C/2 minutes. Un traitement thermique de 73°C/5 minutes

n’a pas permis de stabiliser les complexes; lorsque le pH est ajusté à 7.0, les complexes

sont défaits. Des traitements plus sévères (85°C et 90°C) sont adéquats pour stabiliser les

complexes. Le couple 90°C/2 minutes, pour stabiliser les complexes, a été employé pour

les sections suivantes. Les solutions de pectine seule traitées à tous les traitements de

chaleurs ainsi qu’ajustées à pH 4.5 ou 7.0 étaient stables : la majorité des sucres totaux se

retrouvait dans la phase supérieure soluble après centrifugation. Les solutions de protéines

sériques étaient influencées par le pH. En condition acide et lorsqu’un traitement thermique

a été appliqué, les protéines sériques étaient majoritairement insolubles. Lorsque

complexées, la solubilité des protéines sériques a été améliorée: la stabilité a été accrue à

des pH acides et des traitements de chaleur intenses. Le test de durée de conservation a

révélé que les COMP traités thermiquement pouvaient se conserver jusqu’à 28 jours sans

que leur stabilité et leur innocuité ne soient affectées tandis qu’en absence de traitement

thermique, la durée de conservation des COMP ne dépassait pas les 14 jours due à la

présence de contaminations microbiennes.

Mots-Clé : Complexes Pectine/IPL, Traitement thermique, Stabilité

22

Abstract

The goal of this study was to determine the time-temperature combination to ensure the

stability of low methoxy pectin-whey protein isolate complexes formed at pH 4.5 (COMP)

to pH adjustment at 7.0 and to evaluated their shelf-life on 28 days at 4°C. Three heat

treatments were performed: 73°C/5 minutes, 85°C/15 minutes and 90°C/2 minutes. At

73°C/5 minutes, adjustment at neutral pH led to dismantle complexes. Severest heating

conditions permitted to stabilize the COMP (85ºC and 90ºC). The treatment at 90°C was

used in the other sections. Treating or not pectin solutions (PEC) at the various heat

treatments and at pH 4.5 or 7.0 did not affect its solubility. Whey protein isolate (WPI)

solutions were influenced by pH and heat treatment. At acidic pH combined with heat

treatment, serum proteins precipitated. WPI bounded with pectin led to increase protein

solubility. The shelf-life test had revealed that heated COMP can be preserved up to 28

days without affecting stability and no undesirable bacterial grown was found while COMP

with no heating treatment had to be used before 14 days of storage because of microbial

spoilage.

Keywords: Pectin-WPI Complexes, Heat treatment, Stability

23

2.1. Introduction

In diluted solution, proteins may be attracted by polysaccharide to form electrostatic

complexes in a specific pH range and a specific protein-polysacharide ratio, too

(Tolstoguzov, 1997 and 1986; Samant and al, 1993). Soluble protein-polysaccharide

complexes generally occur when biopolymers carry same or opposite charges i.e. pH above

isoelectric point (IEP) of proteins (Dickinson, 1998; Samant and al, 1993). Insoluble

complexes can be formed below the IEP (Tolstoguzov, 1997 and 1986; Samant and al,

1993; Tolstoguzov, 1986). This attraction involves positive charges of local patches of

proteins (mainly -NH3+groups) interacting with carboxyl groups of anionic polysaccharides.

These macromolecules are linked together by electrostatic bounds. Subsequently, these

interactions are strongly affected by pH and ionic strength of solvent (Tolstoguzov, 1997

and 1986; Samant and al, 1993). The stability of complexes depends also largely on their

length, the nature of interactions and the numbers of interacting groups (Tolstoguzov,

1997). After complexe formation of biopolymers, increasing pH to neutrality contributes to

inhibit interactions and molecules remain separated. Other factors influence complexe

formation like protein-polysaccharide ratio, total solid concentration and temperature. In

this work, complexes were made from 2% of whey protein isolate and 0.5% of amidated

and low methoxy pectin previously developed by our team (Bertrand, 2007). Soluble whey

protein isolate-pectin complexes existed in the specific range of pH 5.0 to 6.0. Below IEP,

for instance pH 4.5, protein-polysaccharide complexes are usually equilibrium of soluble

and insoluble forms (Samant and al, 1993; Tolstoguzov, 1986).The interest of using

complexes in food system is that complexes of protein and polysaccharide can have new

functional properties as compared to individual macromolecules (Tolstoguzov, 1997;

Samant and al, 1993). As a result, protein-polysaccharide interactions could be used to

modify the rheological properties of food products. Some food applications are well known

like whey protein isolate and xanthan gum complexes as fat substitute (Laneuville, 2005).

24

Schmitt and co-workers (2005) have developed whey protein isolate and gum Arabic

complexes. The improvement of foaming property has justified their application in frozen

sorbet (Schmitt and al, 2005). On the other hand, yoghurt application has not been yet

studied.

Before investigating the behaviour of complexes in fermented milk, a prior step must be

done: to stabilize complexes towards neutral pH (pH 6.5-6.7: the usual pH of standardised

milk in yoghurt process). Then, stabilized complexes could be added at the standardisation

step. Heating complexes can positively affect its stability to higher ionic strength and larger

pH range by partial or complete unfolding of protein (Tolstoguzov, 1997 and 1991). During

unfolding process, protein structure will expose some charged groups which are free for

further reactions and lateral chain will remain more flexible. This improvement of

flexibility helps to maximise interactions (Samant and al, 1993). Also, number of linkages

like hydrogen and hydrophobic types will increase (Tolstoguzov, 1997). As described

before, the impact of heat treatment on the characteristics and stability of complexes has

not been studied. This information is essential for a better knowledge of heating process

induced in complexes and helping to predict the resulting physicochemical characteristics

of complexes after heat treatment. Preliminary work has demonstrated that heating

complexes formed at pH 5.0 led to the destruction of interactions between pectin and serum

proteins favouring protein-protein bounds because of their minimal charge and

subsequently, aggregation (Appendix C). Lowering pH to form complexes (i.e. below the

isoelectric point of whey proteins) could improve the solubility of whey proteins as their

total charges are positive and then, protein-polysaccharide interactions would be favoured

rather than protein-protein interactions when a heat treatment is applied. The aim of this

work was to stabilize complexes formed at pH 4.5 to neutral pH (approximate pH of milk)

by the heat treatment and also, to determine their shelf-life for further utilisation in yoghurt

formulation.

25

2.2. Materials and methods

2.2.1 Materials Low methoxy pectin (PEC) was given by CPKelco (Lille Skensved, Denmark).

Polysaccharide contained 30% of esterification and 19% of amidated groups and was

derived from citrus peel. Whey protein isolate (WPI) was provided by Davisco Foods

(Bipro, US, USA). Pectin powder contained 3 % of nitrogen (Kjeldahl method, AOAC,

2000).

2.2.2. Complexe formation Main solution of 1.5% of pectin powder dissolved in distilled water (w/w) using magnetic

agitation was prepared. To ensure complete dissolution, solution was heated at 85°C for 1

minute. Main solution of 16.0% of WPI in distilled was prepared. Solution was gently

mixed with magnetic agitation for two hours. Both mixtures were stored at 4°C overnight

with gentle magnetic agitation. Solutions were used at room temperature. Pectin solution

was adjusted at pH 5.5±0.05 with NaOH 0.5 and 0.1N (USP grade, VWR, Canada). NaOH

0.5N was used to increase pH at 5.0 and then, NaOH 0.1N was used to adjust pH at

5.5±0.05. WPI solution was adjusted to pH 6.5 with 10% (w/w) lactic acid (Food grade,

Fisher Scientific, Ottawa, Ontario). Mixtures were weighted and distilled water added to

reach final concentrations of 2% of WPI and 0.5% of pectin (ratio of 4:1). The mixed

solution was left two hours at room temperature with gentle magnetic agitation. Complexe

formation was done by slow acidification to pH 4.5 with 10% lactic acid. After two hours

of mixing, complexes were stored at 4°C or heat treated at the desirable time-temperature

combination in water bath, cooled and then, stored at 4ºC with magnetic stirrer.

26

2.2.3. Stability test The stability of complexes to an increasing of pH to neutrality was evaluated by the

stability test. This method was based on the distribution of whey proteins and pectin in

several phases obtained after centrifugation. To force phase separation, centrifugation at 42

700 x g (17 000 rpm) for 1h30 at 20-30°C was used (Beckmann J2-21, Rotor JA-18,

Beckman Coulter, California, USA). In conditions of complexe formation, four phases

were obtained from top to bottom of the tube: a superior soluble phase (SSP), an

intermediate soluble phase (ISP), an inferior soluble phase (INSP) and an insoluble phase

(IP) as presented in Figure 2.1. As complexes should be bigger than free WPI or pectin

(without electrostatic interactions), they should be found in the less soluble phases: INSP

and IP. Mixtures were centrifuged in 2 centrifuged tubes. Each corresponding phases were

mixed together to ensure a sufficient quantity for further quantification. After

centrifugation, phases were carefully separated with disposable pipette of 5mL and

weighted. Amount of complexes, in each phase, cannot be directly quantified. The

distribution of pectin expressed in total sugar and whey proteins as nitrogen content, in the

phases, was used to determine the presence or absence of complexes. For the quantification

of total nitrogen, Kjeldahl method was used (AOAC, 2000). Total sugar was determined

with the colorimetric Dubois method (Dubois et al, 1956) at 490 nm with a visible

spectrometer (EL-808, Bio-Tek Instruments Inc., Vermont, USA). Due to the presence of

lactose in WPI, 2% of whey proteins in complexes contributed to 0.016% of total sugar as

compared to 0.470% of total sugar in pectin at 0.5% in complexes. Consequently, to

consider the trace of lactose in WPI, a solution containing 0.5 % of pectin and 2 % of WPI

was used as standard in sugar content determination. Nitrogen was used instead of protein

(obtained from a conversion factor) because pectin contains nitrogen in its amidated

groups. At 0.5% of pectin in complexes, nitrogen corresponded to 0.015% comparatively to

0.2878% of nitrogen in 2% of whey proteins in complexes measured by Kjeldhal method.

Non-centrifuged solutions were also quantified. Insoluble phase was obtained by

difference. The stability was evaluated after examination of weight, distribution of total

sugar and total nitrogen and total sugar to total nitrogen ratio (TS to TN ratio) in each

phase. Theoretical TS to TN ratio of WPI (2%)-pectin (0.5%) complexes was 1.60 (0.486%

of total sugar and 0.303% of total nitrogen).

27

After heat treatment and pH adjustment at 7.0, INSP and IP of centrifuged complexes that

will contain its desirable TS to TN ratio will be considered as stable.

Figure 2.1: Schematic representation of phases in centrifuged complexes

2.2.4. Heat treatment Time-temperature pairs that can induce complexe stability against a pH at neutrality were

determined. The solutions and complexes used for this experiment were pectin solutions at

0.05% (PEC), WPI solutions at 0.2% (WPI) and WPI-pectin complexes (COMP). Three

heat treatments were tested: 73°C/5 min, 85°C/15 min and 90°C/2 min. The first

temperature was chosen because it represents a standard temperature of milk pasteurisation

and the unfolding process of whey proteins is reversible (Amiot and al, 2002). The second

one was used as an intermediate treatment. The last one was a heat treatment usually used

in yoghurt making (Tamine and Robinson, 1999). This severity permits to unfold

irreversibly whey proteins, as the heat process of 85°C/15 minutes does, too (Amiot and al,

2002). Heat treatments were performed in water bath. Temperature of water was adjusted at

3°C above the targeted one. For instance, to reach 90°C, temperature of water was adjusted

at 93°C. Generally, it took 5 minutes to reach the desired temperature. Hot mixtures were

cooled to 22-23°C by immersion in icy water (15 min). All solutions and complexes were

compared to test solutions and complexes without heat treatment i.e. made at room

temperature (25°C).

Intermediate soluble phase (ISP)

Inferior soluble phase (INSP)

Insoluble phase (IP)

Superior soluble phase (SSP)

28

2.2.5. Shelf-life Determination of the shelf-life on stability of complexes was done to facilitate its utilisation

at laboratory scale and for further use in food industry. Shelf-life was studied on 28 days at

4°C under a constant magnetic agitation. A novel batch of complexes was done. Four

mixtures were studied: complexes at pH 4.5 without heat treatment (UHC45), UHC45

added with 0.01 wt% sodium azide as preservative, heated complexes at 90°C/2min

(HC45) and complexes were adjusted at pH 7.0 after heat treatment (AHC70).

Measurements of stability, aerobic bacterial flora, titratable acidity and pH were done at

days 1, 7, 14, 21 and 28. Titratable acidity and pH were measured by official standard

methods (AOAC, 2000). Aerobic bacterial population was enumerated on Plate Count Agar

(Difco, Detroit, Mich, USA).

2.2.6. Statistical methods The effect of heat treatment and pH of various pure solutions and complexes on complexe

stability was analysed according to a factorial design (completely randomized design) by

analysis of variance. For the shelf-life, a split-plot factorial design was applied. Time factor

was the sub-plot. Significant differences were tested at P≤0.05. Statistical analysis was

carried out with the general linear models procedure of SAS (SAS, 1989).

29

2.3. Results

2.3.1. Effect of heat treatment Proportion of weight of each phase is given in Table 2.1. There is a significant interaction

between type of solutions (complexes, WPI or PEC solutions), time-temperature

combinations and pH. Complexes (COMP) at pH 4.5, without heat treatment (25°C/0min)

showed 4 phases. The SSP and ISP represented almost 68% of total weight. These phases

were colorless: ISP was a bit fuzzier than SSP. INSP was cloudy with a white color

whereas IP had white pigmentation and was found as semi-solid state. The proportions of

the latter phases were 20.33% and 12.05%, respectively. Bringing the pH to 7.0 led to a

limpid homogeneous phase (SSP) that represented 98.83% of weight. After heating at 73°C

for 5 minutes, the predominant part of biopolymers was found in the SSP. The IP

proportion was not different from COMP pH 4.5 at 25°C. Phase appearances were similar

to those at room temperature. The pH adjustment to 7.0 after heat treatment revealed 3

phases: SSP, ISP and IP representing 27.72%, 70.75% and 1.5% of weight, respectively.

With higher temperatures (85 and 90°C), 4 phases were noted. They had a similar aspect to

those for COMP pH 4.5 at 25°C. On the other hand, dissimilarities were remarked for

weight percentages. SSP proportions were higher with higher temperatures than 25°C and

ISP, INSP and IP were lower. Comparing COMP at 90°C to 85°C, SSP proportion was

larger at the expense of ISP, INSP and IP weight proportions. When pH was increased to

neutrality, COMP at 85°C resulted in 4 phases as at pH 4.5, except that proportions were

closer to COMP pH 4.5 at 25°C. At 90°C and at pH 7.0, SSP was clear and no ISP was

found. SSP and INSP were the major fractions. No phase separation was observed for WPI

or PEC solutions. For WPI, at room temperature and at pH 4.5, weight of SSP represented

98.79%. With the heat treatment, proportion of SSP decreased and the amount of IP

increased. This effect was more pronounced at 85 and 90°C. Proportions of SSP were not

modified for WPI solutions at pH 7.0. PEC solutions gave major SSP (>96%).

30

Distribution of total nitrogen in SSP, ISP, INSP and IP of WPI or PEC solutions and

complexes is presented in Figure 2.2. Missing columns mean a lack of this phase in

complexes and that there was no phase separation for WPI or PEC solutions. Proportion

was expressed in percentage of nitrogen found in each phase as a function of its weight

phase. The proportion of total nitrogen was significantly affected by the interaction

between by type of solutions, pH and heat treatment conditions (p≤0.05). In SSP, the same

amount of total nitrogen was observed for COMP at pH 4.5 at 25°C, 85°C and 90°C. At

73°C, a larger quantity of nitrogen was remarked as compared to other temperatures. At pH

7.0, in COMP at 25°C, more than 95% of nitrogen was found in SSP. For other heat

treatments, pH adjustment to 7.0 led to an increase of nitrogen in this phase as compared to

COMP at pH 4.5. An ISP phase was obtained only with complexes and contained

proportion of nitrogen smaller than 12%, except for COMP at pH 7.0 heated at 73°C which

contained more than 70% of nitrogen. Approximately 11% of nitrogen was observed in

unheated COMP at pH 4.5 and COMP at pH 7.0 after heating at 85°C. Only 3.6% of

nitrogen was in ISP for COMP at pH 4.5 heated at 85 and 90°C. Nitrogen in INSP varied

from 11 to 63%. Heat treatments at 85 and 90°C led to decrease the amounts of nitrogen

whereas adjustment of pH to 7.0 led to increase nitrogen. Insoluble phase of COMP at pH

4.5 contained 60% of nitrogen. A heat treatment at 73°C increased this value at 90% and

higher temperature had intermediate values. At pH 4.5, WPI at 25°C showed approximately

90% of total nitrogen in SSP. The pH adjustment at 7.0 led to a significant increase of

soluble nitrogen. Protein solubility was affected by the severity of heat treatment. When

solutions were heated at 85 and 90°C, more than 80% of total nitrogen was in IP either at

pH 4.5 or 7.0. Intermediate heating (73°C), 60% of nitrogen was soluble at pH 4.5.

Adjustment at pH 7.0 contributed to increase soluble nitrogen of 20% as compared to acidic

pH. Percentage of nitrogen in PEC was relatively minor compared to total nitrogen content

and represented only 5% (0.015g on 0.3028g). For all heating conditions and pH, nitrogen

of PEC was mainly found in the SSP (>90%), except at pH 4.5 combined with a

temperature of 90°C (80%). IP contained less than 10% of total nitrogen except for PEC

solution at pH 4.5 treated at 90°C/2 min (20%).

31

Distribution of total sugar in each phase is shown in Figure 2.3. The missing columns

represented a lack of phase in complexes and no phase separation for WPI or PEC

solutions. Type of solutions, pH and heat treatments influenced significantly total sugar

content (p≤0.05). In SSP of COMP pH 4.5 at 25°C, total sugar content was near than 20%.

Adjustment of pH at 7.0 led to a significant increase in total sugar (more than 90%). After

heat treatment of COMP at pH 4.5, total sugar increased (25-40%). Sugar content of COMP

treated at 73°C decreased at pH 7.0 while it increased at 85 and 90°C. Total sugar content,

in ISP, was influenced by the application of heat treatment i.e. amount of sugar diminished

as compared to unheated complexes. When pH was at 7.0 after 73°C/5 min, a large

proportion of sugar remained in ISP. In INSP, COMP pH 7.0 at 90°C had higher sugar

level than COMP pH 4.5 at room temperature and COMP pH 4.5 at 90°C. In IP, total sugar

decreased as the severity of time-temperature condition increased. Adjustment at pH 7.0,

for all complexes, led to a significant diminishing of total sugar in IP. Percentage of sugar

level in WPI was relatively minor as compared to total sugar and represented 3.4%

(0.1648g on 4.868g). In SSP, higher concentration was found when pH was at 7.0

compared to pH 4.5. A contrary profile was observed in IP. For PEC, no matter pH or heat

treatments, sugar level, in SSP, was more than 92%. IP contained less than 8% of total

sugar. The TS to TN ratio of complexes is shown in Table 2.2. This factor was significantly

affected by the interaction between pH and heat treatment. Theoretical ratio of unheated

complexes at pH 4.5 without centrifugation was 1.6 (0.486g TS and 0.303g TN). The TS to

TN ratio, in SSP and ISP, was between 31 and 35 when unheated complexes at pH 4.5 were

centrifuged. INSP and IP had ratios near to the targeted one (1.6). Complexes seemed to be

in the two bottom phases. As the severity of heat treatment increased, TS to TN ratio in

SSP increased, too. In INSP, TS to TN ratios were similar for a heat process at 85°C and

90°C but lower than the targeted value. Application of heat treatment for complexes at pH

4.5 tended to slightly decrease TS to TN ratios in IP as compared to unheated complexes at

pH 4.5, except for complexes heated at 73°C. When the pH of unheated complexes at pH

4.5 was adjusted to neutrality, SSP contained the initial ratio while in IP, TS to TN ratio

was increased. This observation indicated that interactions between WPI and pectin were

dissociated. A small amount of insoluble proteins was found in IP.

32

A similar profile was found for complexes at pH 4.5 heated at 73°C when pH was adjusted

at 7.0. The first phases, SSP and ISP, contained a ratio near to the targeted one. The TS to

TN ratios, in SSP and ISP, for complexes at pH 4.5 treated at 85°C and 90°C decreased as

compared to heated complexes at pH 4.5. In INSP, complexes at pH 7.0 heated at 90°C/2

min gave a ratio equivalent to the one at pH 4.5. In IP, TS to TN ratio was also not

significantly different from complexes at pH 4.5 with a treatment at 90°C/2 min.

2.3.2. Shelf-life Evolution of mesophilic aerobic flora, pH and titratable acidity in complexes (UHC45,

UHC45 + sodium azide, HC45 and AHC70) during storage of 28 days at 4°C is presented

in Table 2.4. Interaction between the type of complexes and time was significant for these

parameters. The total flora of UHC45 gradually increased during the ageing from 2.39 Log

CFU/mL to 6.35 Log CFU/mL. A bacterial growth was also found in AHC70 whereas in

UHC45 + sodium azide and in HC45, it was not observed. For AHC70, a bacterial growth

was observed after 21 days of storage. Adding chemical preservative (UHC45 + sodium

azide) or a heat process at 90°C for 2 minutes (HC45) was sufficient to control undesirable

population. An increase of pH was also observed in UHC45 during the storage.

Microbiological contamination can cause this change. For the other complexes, pH and

titratable acidity did not change in time. UHC45 and HC45 had the same titratable acidity

values and did not change in time. UHC45 + sodium azide had higher values than HC45

and UHC45 probably due to the addition of sodium azide. At pH 7.0, complexes (AHC70)

showed lower titratable acidity than others because its pH was adjusted at 7.0.

Ageing effect on complexe stability for all conditions is shown in Table 2.4. Only the TS to

TN ratios of INSP and IP are shown. Previous study has demonstrated that theses phases

were sufficient to determine complexe stability (section 2.4.1.). The stability of complexes

was not influenced by the time for all studied conditions. TS to TN ratios of UHC45 +

sodium azide and HC45 were similar whereas UHC45 had slightly higher ratios in INSP. In

IP, all conditions led to comparable TS to TN fractions, except for AHC70 where

increasing the pH to neutrality led to diminish TS to TN ratio.

33

2.4. Discussion

2.4.1. Effect of heat treatment To evaluate the stability of complexes when a heat treatment was applied, the stability test

was used. After centrifugation of complexes, four phases were found. As protein-

polysaccharide interactions (complexe) should lead to the formation of larger molecule, the

complexes should be found in the less soluble phases (INSP and IP). Some impurities and

denatured proteins can also be found in this latter phase. On the other hand, free pectin or

WPI that did not take part to complexe formation or came from dismantled complexes

should be found in more soluble phases (SSP and ISP). The analysis of nitrogen and total

sugar distribution and the calculation of TS to TN ratio in INSP and IP will allow studying

the complexe stability through the various conditions used. The comparison of theoretical

TS to TN ratio (1.6) of unheated complexes and without centrifugation with the various

INSP and IP of heated complexes obtained by centrifugation will be used to evaluate the

complexe stability.

Preliminary work has shown that a solution containing pectin and WPI at pH 7.0 (without

complexe formation) presented mainly one soluble phase containing more that 95% of total

sugar and nitrogen. In addition, the ratio was similar to the theoretical ratio. The presence

of one phase indicated that pectin and whey proteins are present but without attractive

electrostatic interactions. In complexe conditions (unheated COMP at pH 4.5), complexes

seemed to be in the less soluble parts: INSP and IP. This result is supported theoretically by

the fact that below isoelectric point of proteins, protein-polysaccharide complexes are in

soluble-insoluble forms (Tolstoguzov, 1997 and 1986). Interactions between pectin and

WPI existed between pH 4.5 to 6.0 (Girard and al, 2002). Consequently, at pH 7.0,

complexes should be dismantled as observed in this study: majority of total nitrogen and

sugar remained in one soluble phase. When complexes were heated at 73°C, some

interactions between serum proteins and pectin still remained as major part of total sugar

and nitrogen were found in IP. The TN to TS ratio was similar to the targeted one.

34

On the other hand, pH adjustment at neutrality showed another profile: total sugar and

nitrogen were remarked in the superior phases (SSP and ISP). The same results were

remarked when unheated complexes were adjusted at pH 7.0. This result could be likely

explained by the reversible denaturation of whey proteins at this temperature (Amiot and

al, 2002). Therefore, complexes were dismantled. Heating acidic complexes at 85°C/15

min showed that most of nitrogen and total sugar were found in less soluble part as INSP

and IP like unheated complexes at pH 4.5 indicated that complexes remained. Increasing

pH at 7.0 showed that a certain amount of total sugar migrated to soluble phases. On the

other hand, in INSP and IP, TN-TS ratios were comparable to unheated complexes at pH

4.5. Consequently, some pectin-serum protein interactions could have been broken. The

stability test cannot quantify the amount of complexes but the migration of total sugar and

nitrogen gave an indirect confirmation that complexes remained. Heating at 90°C/2 min

gave similar profile to those after heating at 85°C. In SSP and ISP, sugar was found in

larger quantity than unheated complexes at pH 4.5. A severe heat treatment at acidic pH

leads to unfold irreversibly serum proteins and can lead to whey protein aggregation

(Dumay, 1988). In the less soluble phases, total sugar and nitrogen content plus TS to TN

ratios demonstrated that a certain amount of complexes remained. When pH increased to

7.0, TS to TN ratios were near to the targeted ratio.

Solubility of whey proteins, in WPI, was affected by pH and heat treatment, in accordance

to literature (Walstra et al, 2006; Kinsella and Whitehead, 1989; Dumay, 1988). In general,

whey proteins are soluble over a large range of pH (Dumay, 1988). Above the isoelectric

point of proteins (typically pH 5.2-5.4 for serum proteins), macromolecules are soluble

(Walstra et al, 2006; Dumay, 1988) but, below and at the isoelectric point of proteins, these

macromolecules loose solubility. At room temperature, WPI at both pH 4.5 and 7.0 were

mainly soluble. The insoluble part was probably due to the presence of some insoluble

materials: denatured proteins or insoluble impurities in WPI powder. Heat treatment

unfolds reversibly (below 75°C) or irreversibly (up to 75°C) whey proteins and causes its

aggregation (Amiot and al, 2002; Dumay, 1988). Reversible unfolding was observed when

pH was adjusted at 7.0 for WPI treated at 73°C.

35

Irreversible denaturation was noted for WPI heated at 85 and 90°C at pH 4.5 and

adjustment at pH 7.0 did not to allow solubilisation of nitrogen.

The small amount of total sugar in WPI solutions can be due to the presence of trace of

lactose or other impurities in WPI powder (Bargeman, 2003). Generally, WPI solution at

neutral pH had higher concentration of total sugar as soluble form that could indicate that

impurities present in powder were more soluble at higher pH. Contrary to whey proteins in

WPI solutions, proteins involved in complexe formation did not precipitate after heat

treatment and at pH below the isoelectric point of whey proteins. Some authors have

reported that protein-polysaccharide complexe formation increases protein solubility and

subsequently, its solubility over larger pH range and against heat treatment (Tolstoguzov,

1997 and 1986; Samant and al, 1993). Generally, PEC was stable no matter the heating

conditions or pH. Effectively, weight proportion, total sugar and nitrogen content and TS to

TN ratios did not vary or slightly. These results were in concordance with literature

revealing that pectin is relatively stable to large range of pH and heating (Colonna and

Thibault, 1986).

2.4.2. Shelf-life In time, UHC45 retained its stability but its shelf-life was compromised due to the absence

of heat treatment. Addition of a chemical preservative to complexes did not influence the

stability of complexes as the TS to TN ratios in INSP and IP ratios were comparable to

those of UHC45. During the storage, the stability of HC45 and AHC70 remained, too.

Employing 90°C-2 minutes combination was sufficient to destroy aerobic bacteria as in

accordance to literature that this is a severe heat treatment (Chandan and O’Rell, 2006).

Heated complexes (HC45, AHC70) can then be used until 28 days of manufacture. In spite

of complexe stability, UHC45 must be conserved maximum 14 days due to microbiological

problem. Consequently, the absence of heating limited its shelf-life and also its utilisation

in time.

36

2.5. Conclusion

This study permitted to develop a mean to stabilize complexes against an increasing of pH

to neutrality using a heat treatment similar to the one use in yoghurt manufacture

(90°C/2min).

Studying solutions containing only one constituent of complexes i.e. mixtures with pectin

or whey protein isolate at the severest time-temperature combination confirmed that

proteins were least soluble against pH than pectin. In complexes, it was pectin that

migrated to more or less soluble phases depending on pH and heating treatment. This

information is important to know because it revealed that the behaviour of each biopolymer

in complexes depending on heating and pH conditions.

The shelf-life of heated complexes was at least of 28 days at 4°C. On the other hand,

unheated complexes cannot be used after 14 days of storage because of microbiological

contamination.

As complexes was stabilized and the shelf-life was determined, the future work will look

into the effect of using stabilized (heated) complexes as stabilizing agent on rheological

properties and whey separation of stirred yoghurts.

Acknowledgements

NSERC is acknowledged to provide me a NSERC Postgraduate Scholarships (PGS M).

NSERC and Parmalat Canada are acknowledged for their financial support.

37

Table 2.1: Weight proportion of superior soluble phase, intermediate soluble phase,

inferior soluble phase and insoluble phase of complexes at pH 4.5 (COMP) and WPI or

pectin solutions without heat treatment (25°C/0 min) or heated at 73°/5 min, 85°/15 min and

90°/2 min. Adjustment at pH 7.0 was done after heat.

Weight proportion (%) Type of solution

Heat treatment (°C/min) pH SSP ISP INSP IP

4.5 34.74I 32.74B 20.33B 12.05B 25/0

7 98.83A NPa NP 1.17G

4.5 88.44D NP NP 11.56B 73/5

7 27.72J 70.75A NP 1.52G

4.5 59.45F 22.27C 8.17C 10.11C 85/15

7 39.81H 22.03C 21.65B 16.51A

4.5 65.60E 14.08D 10.57C 9.75C

COMP

90/2

7 45.25G NP 51.98A 2.77F

4.5 98.79A NP NP 1.21G 25/0

7 97.24AB NP NP 2.75F

4.5 96.73AB NP NP 3.27F 73/5

7 97.27AB NP NP 2.73F

4.5 92.70C NP NP 7.30D 85/15

7 93.61BC NP NP 6.39E

4.5 92.91C NP NP 7.09DE

WPI

90/2

7 96.92AB NP NP 3.08F

4.5 98.91A NP NP 1.09G 25/0

7 96.72AB NP NP 3.28F 4.5 98.63A NP NP 1.37G 73/5

7 98.79A NP NP 1.20G 4.5 99.02A NP NP 0.98G 85/15

7 98.74A NP NP 1.26G 4.5 98.99A NP NP 1.01G

PEC

90/2

7 97.21AB NP NP 2.79F aNP: No phase was found for complexes and there is no phase separation for WPI or PEC solutions. A-J Means with the same superscript in the same column did not differ at α≤0.05.

38

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

pH 4 5 pH

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

H 4 5 H

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

pH 4,5 pH

25°C

COMP WP

Figure 2.2: Distributio

soluble phase (b), in

complexes and WPI or

Tot

al n

itrog

en (%

)

a ab abc

f

j jk

lmn T

otal

nitr

ogen

(%

) T

otal

nitr

ogen

(%)

Tot

al n

itrog

en (%

)

(a)

(b)

(c)

(d)

b

b

e de

lm

d cd de
de
7 0 pH

7 0 H

7,0 pH

I PEC

n of tota

ferior so

PEC solu

b

jk

mn

jk

g

bcd

4 5

4 5

4,5

73°

T

l nitro

luble

tions

g

klm

f

f

h

pH 7 0 pH 4 5 pH 7 0 pH 4 5 pH 7 0

H 7 0 H 4 5 H 7 0 H 4 5 H 7 0

pH 7,0 pH 4,5 pH 7,0 pH 4,5 pH 7,0

C 85°C 90°C

emperature (°C) and pH

gen (%) in superior soluble phase (a), intermediate

phase (c) and insoluble phase (d) of centrifuged

functions of pH and temperature of heat treatment.

jk kl

cd

i

e

f

mn

h

bc d

i

klm

n

k

a a

e d c

a

a

mn ijk ij i

mn n kl

mn

c b

c

39

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

H 4 5 H 7 0 H 4 5 H 7 0 H 4 5 H 7 0 H 4 5 H 7 0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

H 4 5 H 7 0 H 4 5 H 7 0 H 4 5 H 7 0 H 4 5 H 7 0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

pH 4,5 pH 7,0 pH 4,5 pH 7,0 pH 4,5 pH 7,0 p

25°C 73°C 85°C

Temperature (°C) and pH

COMP WPI PEC

Figure 2.3: Distribution of total sugar (%) in superior soluble ph

soluble phase (b), inferior soluble phase (c) and insoluble phas

complexes and WPI or PEC solutions functions of pH and temperature

a

a ab

d

n

b

l

e e f

h i

jk j

l lmno

lmno

lmno

d d

0

Tot

al su

gar

(%)

Tot

al su

gar

(%)

Tot

al su

gar

(%)

Tot

al su

gar

(%) c

b

jk

g

ab

lm

f

b

l m

ab

ijk

e

ab

k i

ab

ij h

a

c

a

d d

b

b b

d c

a

n lmno

g

mno

(c)

(d)

(a)

(b)

c

H 4,5 pH 7,0

90°C

ase (a), intermediate

e (d) of centrifuged

of heat treatment.

k lm

no

40

Table 2.2: Total sugar to total nitrogen ratio in superior soluble phase, intermediate soluble

phase, inferior soluble phase and insoluble phase of centrifuged complexes at pH 4.5

without heat treatment (25°C/0 min) or heated at 73°/5 min, 85°/15 min or 90°/2 min.

Adjustment at pH 7.0 was done after heat.

Total sugar to total nitrogen ratio Heat treatment of complexes

(°C/min) pH SSP ISP INSP IP 4.5 3.53D 3.12CD 2.06B 1.33C 25/0

7 1.62E NPa NP 4.08A 4.5 5.35C NP NP 1.21CD 73/5

7 1.87E 1.71D NP 1.73B 4.5 9.54A 5.27E 1.28C 0.95DE 85/15

7 4.36CD 3.67BC 2.39A 0.48F 4.5 10.7A 4.01B 1.28C 1.01DE 90/2

7 7.10B NP 1.34C 0.74EF aNP: No phase was found. A-F Means with the same superscript in the same column did not differ at α≤0.05.

41

Table 2.3: Evolution of aerobic bacterial population, pH and titratable acidity of various

complexes during the storage at 4°C

Complexe

Time (Day)

Aerobic bacterial population

(Log CFU/mL) pH

Titratable acidity

(°Dornic)

UHC45

1 7 14 21 28

2.39C

2.17C

3.62B

5.10AB

6.35A

4.58FG

4.55G

4.58FG

4.77B

5.05B

18.32CD

19.81C

19.33CD

15.68D

15.44D

UHC45 + 0.01% (wt)

sodium azide

1 7 14 21 28

1.16C

0.23G

0.00H

0.00H

0.60H

4.61DE

4.62DE

4.67C

4.61E

4.64D

24.72AB

23.96AB

23.13AB

22.75B

25.27A

HC45

1 7 14 21 28

0.71E

0.00H

0.23G

0.00H

0.00H

4.60FG

4.61F

4.60FG

4.57F

4.57FG

17.69CD

17.49D

17.89CD

17.03D

17.35D

AHC70

1 7 14 21 28

0.57F

0.33F

0.00H

1.07D

2.53C

6.94A

6.86A

6.75A

6.76A

6.72A

4.74E

5.21E

5.71E

5.85E

5.57E

A-H Means with the same superscript in the same column did not differ at α≤0.05.

42

Table 2.4: Total nitrogen to total sugar ratio of inferior soluble phase (INSP) and insoluble

phases (IP) of centrifuged complexes at pH 4.5 without heat treatment (UHC45) and with

0.01% (wt) sodium azide, heated at 90°C/2 min (HC45) and with pH adjustment at 7.0 after

heat (AHC70) during 28 days of storage at 4°C.

Total sugar to total nitrogen ratio Complexe

Time (Day) INSP IP

UHC45

1 7 14 21 28

1.57A

1.54A

1.51A

1.57A

1.52A

1.13A

1.35A

1.28A

1.02A

1.14A

UHC45 + 0.01% (wt)

sodium azide

1 7 14 21 28

1.44 B

1.23B

1.14B

1.26B

1.28B

1.14A

1.13A

1.10A

1.18A

1.17A

HC45

1 7 14 21 28

1.39B

1.29B

1.39B

1.27B

1.36B

0.82A

1.05A

0.97A

1.02A

0.91A

AHC70

1 7 14 21 28

NPa

0.15B

045B

0.61B

0.68B

0.41B

A-B Means with the same superscript in the same column did not differ at α≤0.05. aNP: No phase was found.

43

Chapter 3: Pectin-whey protein isolate complexes in stirred yoghurts: Impact on rheological properties and

syneresis

Marie-Claude Gentès1, Sylvie Turgeon1, Daniel St-Gelais2*





*Corresponding author. E-mail address: [email protected]. Tel: + 1 450 773 1105. Fax:

+1 450 773 8461.

mailto:[email protected]

44

Résumé

Une étude portant sur l'impact de l’utilisation de complexes formés d'isolat de protéines

sériques et de pectine, préalablement traités thermiquement (HC) ou non (UHC), sur les

propriétés rhéologiques et l'aptitude à la synérèse de yogourts brassés, a été effectuée. Le

témoin utilisé était une pectine commerciale (CP). À une concentration de 0.1% de pectine,

UHC a donné les meilleures valeurs de propriétés rhéologiques. Des résultats

intermédiaires ont été enregistrés pour les deux pectines seules soit CP et la pectine

employée dans la formation de complexe (POC). Lorsqu'un traitement thermique est

appliqué (HC), les propriétés rhéologiques sont de faibles valeurs et semblent être peu ou

pas influencées par la concentration en pectine. Ces résultats suggèrent une sur-agrégation

des protéines sériques, augmentant possiblement la taille des complexes, réduisant ainsi les

points de contact dans le réseau caséique. Une autre hypothèse serait que les HC agissent à

titre de particules inertes se retrouvant ainsi piégés dans les mailles de la matrice. À 0.2%

de pectine, les yogourts contenant HC, UHC et POC donnent des propriétés rhéologiques

de moindres valeurs et l’expulsion du sérum est accrue. Une variation, dans la source de la

β-lactoglobuline, pourrait être à l'origine de cette différence; provenant principalement de

concentré de protéines sériques à 0.05 et 0.1% et d'isolat de protéines sériques à 0.2%. Un

phénomène de séparation de phases dû à une utilisation abusive de pectine pourrait être en

cause. Les CP et POC ont donné des profils différents concernant leurs propriétés

rhéologiques en fonction des concentrations étudiées. Certains facteurs intrinsèques et

extrinsèques pourraient expliquer ces variations.

Mot-clé : Complexe d’isolat de protéines sériques-pectine; Propriétés rhéologiques;

Synérèse; Yogourt brassé.

45

Abstract

The impact of adding whey protein isolate-pectin complexes heated (HC) and not (UHC)

before addition in standardised milk compared to a commercial pectin on the rheological

properties and syneresis of stirred yoghurt was investigated. At 0.1%, UHC had the highest

values of whey retention and rheological properties. Commercial pectin (CP) and pectin

used in complexes formation (POC) presented intermediate results. HC presented the

lowest values and a small variation of rheological properties for all concentrations used was

also observed. Double heat treatment undergone by HC could lead to an extensive whey

protein aggregation causing a reduction of contact point of casein network or HC acted like

inert particles trapped in casein clusters. At 0.2%, all yogurts containing pectin used in

complexes (POC, HC and UHC) presented a reduction of rheological properties and a

greater wheying-off. This can be explained by the change of β-lactoglobulin source that

came from whey protein concentrate at 0.05 and 0.1% and from whey protein isolate for

0.2%. Depletion flocculation due to an extensive use of pectin can also explained these

results. CP and POC had different rheological properties functions of pectin concentration.

Intrinsic and extrinsic factors may explain these variations.

Keywords: Whey protein isolate-pectin complexes; Rheological properties; Syneresis;

Stirred yoghurt.

46

3.1. Introduction

Yoghurt is one of the most popular fermented milk. Healthy benefits can be a cause of

increased consumption. Unfortunately, defects resulting from production or/and

rearrangement of casein network during storage leading to whey expulsion, inadequate

matrix strength and variations of viscosity can occur (Tamine and Robinson, 1999; Keogh

and O’Kennedy, 1998; Lucey and Singh, 1998). To avoid these problems, stabilizers or/and

thickeners are usually added to formulation for their water binding capacity (Tamine and

Robinson, 1999). Pectin, gelatin, carrageenan, xanthan gum, modified starch and locust

bean gum are the more frequently used polysaccharides (Sodini and al, 2004). Many

workers have studied the impact of stabilizers on rheological properties and whey

expulsion of yoghurts (Everett and McLeod, 2005, Fiszman and Salvador, 1999; Keogh and

O’Kennedy, 1998; Shukla and al, 1988). Processing parameters can also cause defects.

Standardization (dry matter and casein-total protein ratio), heat treatment (time and

temperature) and fermentation (temperature, incubation time, lactobacilli-streptococci ratio,

quantity of starters) are the most important steps that influence properties of gel (Sodini and

al, 2004; Tamine and Robinson, 1999). Despite the use of stabilizers or/and optimization of

process, whey separation and rheological problems remain. A new way to stabilize stirred

yoghurts is to employ whey protein isolate-pectin complexes as stabilizers.

In diluted solution, at low ionic strength and at a specific range of pH, anionic

polysaccharide and protein can interact together (Tolstoguzov, 1997 and 1986). Interactions

are mainly driven by weak energy bounds like electrostatic and hydrophobic interactions.

Association of these two polymers may confer to complexes different functional properties

(Bertrand, 2007; Tolstoguzov, 1997 and 1986).

47

Properties of protein-polysaccharide complexes have been extensively studied (Laneuville,

2005; Turgeon et al, 2003; Kruif et Tuinier, 2001; Laneuville et al, 2000; Tolstoguzov,

1997; Samant et al, 1993; Tolstoguzov, 1991). Unfortunately, food applications are

relatively new. Whey protein isolate-xanthan gum complexes have been used for

replacement of fat (Laneuville, 2005). Due to their effect of enhancing protein foaming

ability, whey protein isolate-arabic gum complexes have been used to stabilize sorbet

(Schmitt and al, 2005). On the other hand, the use of protein-polysaccharide complexes to

stabilize whey separation and rheological properties of fermented milk like yoghurt has not

been already studied.

The aim of this work was to determine the effect of addition of pectin-whey protein isolate

complexes on the rheological properties, whey separation and microstructure of stirred

yoghurts as compared to commercial pectin.

48

3.2. Materials and methods

3.2.1 Materials Pectins were obtained from Cp Kelco (Lille Skensved, Denmark). The pectin used for

complexe formation, with 30 % of esterification and 19 % of amidated groups, was derived

from citrus peel (X-917-02). Commercial pectin, used as control, with 31 % of

esterification and 17 % of amidated groups was also extracted from citrus peel (LM-106

AS-YA). Whey protein isolate (WPI) used for complexe formation was purchased from

Davisco Foods (Bipro, US, USA). For yoghurt formulation, pasteurised skim milk and raw

cream at 42% of fat (Parmalat Canada, Quebec, Canada), whey protein concentrate

(CRIMO, Agropur, Quebec, Canada), skim milk powder (low heat, spray drying process,

CRIMO, Agropur, Quebec, Canada) and lactose (98% of sugar, Saputo, Quebec, Canada)

were used. Distribution of protein types in all ingredients is presented in Table 3.1. Each

ingredient contributed to total protein content of yoghurts.

3.2.2. Complexe formation A stock solution of pectin (1.5% (w/w)) was prepared in distilled water using magnetic

stirrer and was heated at 85°C/1 min. A stock solution of 16.0% (w/w)) of WPI in distilled

water was made and .was gently mixed for 2 hours. Both mixtures were stored at 4°C

overnight under magnetic stirring. Stock solutions were used A 25°C. Pectin solution was

adjusted at pH 5.5±0.05 with NaOH 0.5 N (up to pH 5.0) and 0.1 N (up to pH 5.5) (USP

grade, VWR, Canada). WPI solution was adjusted to pH 6.5 with lactic acid (10% (w/w),

Fisher Scientific, Ottawa, Ontario). Stock solutions were weighted (WPI (2.0%): pectin

(0.5%) and completed with distilled water to reach a final ratio of 4:1. Mixed solution was

left 2 hours at 25°C under magnetic stirrer. Complexe formation was done by decreasing

the pH at 4.5 with lactic acid (10%). After two hours of mixing, complexes were stored at

4°C (UHC: unheated complexes) or heat treated at 90°C/2 min in water bath (HC: heated

complexes). This treatment was used to ensure that complexes were stable at a pH near

neutrality; similar to the pH of standardised milk.

49

3.2.3. Yoghurt milk preparation Stirred yoghurts were made with four different stabilizers: Commercial Pectin (CP), Pectin

of Complexes (POC), Heated Complexes (HC) and Unheated Complexes (UHC). Three

concentrations of stabilizers were tested: 0.05, 0.1 and 0.2% as pectin equivalent (w/w).

Pectins were added in a powder form whereas complexes at pH 4.5 were put in

standardised milk in a solution form. Ingredient level of standardised milk is shown in

Table 3.2. Yoghurt formulations were standardised at 1.0 % of fat, 4.0 % of total protein,

16.5 % of dry matter and at constant casein to total protein ratio of 62%. After analysis,

composition of all stirred yoghurts respected the targeted composition (Table 3.3). Ash

content was not standardised. The pH of standardised milks was not adjusted and was

significantly affected by pectin concentrations and type of stabilizers. When UHC or HC

was added at the standardisation step, the pH dropped of 0.11 unit compared to milk with

CP or POC (pH 6.51 ±0.03). As pectin level increased, the pH changed also significantly.

For instance, at 0.05%, the pH of UHC, HC, CP and POC was 6.55 ±0.02 as compared to

pH 6.35 ±0.02 at 0.2%. These variations did not affect fermentation time and

microbiological population after fermentation (results presented in section 3.2.5.).

3.2.4. Strains, cultures and medium culture Commercial yoghurt cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii

ssp. bulgaricus freeze-dried was used (611DPL, Rhodia, Madison, WI, USA). Starters were

selected for their abilities to produce small amount of exopolysaccharides to avoid that

rheological properties were influenced by exopolysaccharide production. Stock culture was

prepared in reconstituted skim milk powder (12 % of dry matter (w/w)) and sterilized at

110°C/10 min. After cooling at 42-43°C, 1g/L of starters was directly mixed to milk.

Incubation was made at 42-43°C. Fermentation was stopped when pH reached 5.3-5.5 and

culture was stored at 4°C overnight. Medium cultures used for microbiological count were

M17 selective agar medium for streptococci and acidified Man Rogosa Sharp (MRS)

medium for lactobacilli (Difco, Detroit, Mich, USA). Microbiological population, in starter

culture, was Log 8.9 ± 0.05 (Error standard of the means) CFU/mL for streptococci and

Log 8.0 ± 0.07 CFU/mL for lactobacilli.

50

3.2.5. Yoghurt manufacture Yoghurts were made at laboratory scale. Recipes were prepared in 5L stainless tank. Each

recipe was left at 4°C overnight to allow a complete hydration. Standardised milks were

preheated at 55°C prior homogenisation by a single pass at 1000 PSI (EmulsiFlex C5,

Avestin Co., Ottawa, Ontario, Canada). Homogenised milks were heated at 90°C for 2

minutes in culture incubator; an automatic control water bath usually used for dairy

ferments preparation (Laboratorium Wiesby GmbH&Co, Niebüll/W., Germany). Then,

mixtures were cooled to incubation temperature (42-43°C). Inoculation was made at 3% of

main culture to obtain a decrease of about 1 Log for each population when it was added to

standardised milk. Finally, inoculated mixtures were rapidly stored in yoghurt incubator

(CS-20, Coldstream Drive, Jordan Valley, IL, USA) at 42±1°C and left until pH 4.6 was

reached. Microbiological population, at inoculation time, was Log 7.3 ± 0.03 CFU/mL for

streptococci and Log 6.5 ± 0.04 CFU/mL for lactobacilli. All yoghurts reached the targeted

pH value after 3 hours and 30 minutes. Cooled to 18-20°C, fermented milks were gently

stirred 10 times with stainless tool and then, were smoothed with screw pump (Allweiller

AG 0-100 L/h, Netzch, Germany). Stirred yoghurts were filled in 175 mL pot and stored at

4°C. Production was divided in two batches: one for rheological analysis and whey

separation at day 4 and the other, for investigation after 18 days of storage. Acidity of

yoghurts was developed in 18 days at 4°C. Directly after filling in pots, lactic acid

percentage was 0.91 to reach 1.06 at the end of storage. A decreasing of pH values was also

remarked. After filling in pots, yoghurts were at pH 4.4 and after 18 days of storage, pH

decreased to 4.1. Microbiological population did not evolved in time. During storage,

culture remained stable: Log 8.83 ± 0.020 CFU/mL for streptococci and Log 8.27 ± 0.022

CFU/mL for lactobacilli.

51

3.2.6. Analytical methods Composition of milk preparation and stirred yoghurt were determined in duplicate. Fat

content was measured out by the ether extraction (Mojonnier) procedure (AOAC, 2000).

Dry matter was determined by air-drying at 100°C for 3 hours and ash by heating samples

at 550°C during 16-18 hours in muffle furnace (AOAC, 2000). Total protein and non-

casein nitrogen were quantified using macro-Kjeldahl method (St-Gelais and al, 1998).

Non-casein nitrogen of milk preparation was obtained by casein precipitation at pH 4.6

with H2SO4 1N. Non-protein content was dosed by precipitation with 12 % of TCA (w/w),

the sample was filtered and then, the filtrate was analysed (St-Gelais and al, 1998). Casein

content and whey proteins were calculated by difference. A nitrogen conversion factor of

6.38 was used to calculate milk protein values. Casein and total protein contents of raw

creams and milks were performed by infrared analyser using Fourier transform infrared:

FT-120 (Foss North America, MN, USA).Whey protein content of these raw materials

were calculated with theoretical value of 20% of total protein (Amiot and al, 2002). Non-

protein nitrogen was calculated by difference. Contribution of raw materials to reach a

constant whey protein level to achieve the desirable casein to total protein ratio was

calculated as described in Appendix D. Titratable acidity and pH were measured by official

standard methods (AOAC, 2000).

3.2.8. Rheological measurements and whey separation Yoghurt hardness was quantified after 4 and 18 days by using a TA-XT2 texture analyser

(Texture Technologies Corp., Scarsdale, NY). Analyses were made 5 times for each type of

yoghurts at 4°C. The plunger used was cylindrical, with a flat base of 25 mm diameter,

moving at a speed of 1mm/s (Hess and al, 1997). Maximum peak force (N) at a

displacement of 10 mm was recorded as firmness (N/m2). The rheological properties of

yoghurts were made with a dynamic stress rheometer using a bob and a cup (Rheometric,

Model SR-2000, TA Instrument, New Caslte, DE, USA). All measurements were

performed at 4°C after 4 and 18 days of storage in duplicate. Samples were directly taken

from the pots with the stainless cylinder.

52

A steady stress sweep test with a shear stress of 1.0 to 1.00 Pa was used to calculate

apparent viscosity at a constant shear rate of 10s-1 (Everett and McLeod, 2005). Dynamic

stress sweep test was used to determine the region of linear viscoelasticity of yoghurt under

an oscillatory of 1Hz and at an increasing strain from 0.02 to 30 Pa (Everett and McLeod,

2005). Storage or elastic (G’) and loss or viscous (G’’) moduli were measured at 1 Pa, in

the linear region of viscoelasticity of each yoghurt, functions of frequency in range of 0.1 to

10 Hz. To transfer yoghurts in centrifuge tubes with minimal disruption of gel, a home

made stainless cylinder was used. Samples (25-27g) were centrifuged at 1900 X g for 20

minutes at 4°C (Keogh and O’Kennedy, 1998). The clear supernatant was poured off,

weighed and recorded as syneresis (%). Measurements were made in duplicate.

3.2.9. Microscopy Prior microscopic visualisation, stirred yoghurts, UHC, HC, CP and POC at 0.1%, were

lyophilised. Frozen samples (-20°C) were sliced in a section of 5 cm x 5 cm x 3 cm (length

x width x height) and placed in glass Petri dishes. Samples were left in freeze-dryer during

48 hours at -40°C (Dura-Stop UP, Tray Dryer FTS systems, USA, New-York). A scanning

electron microscopy (SEM) was used to visualise the microstructure of acid milk gels (S-

3000N, Hitachi, Japan). The samples were coated by gold (Marivac, Quebec, Canada)

using the sputtering method with sputter coater equipment (Marivac, Quebec, Canada)

before analysis.

3.2.10. Statistical methods Analysis of variance, according to a factorial design, was applied to determine the effect of

type of yoghurts on fermentation parameters and yoghurt composition. However, a split-

plot design was used for the evolution of microbiological population, physical properties

like pH and titratable acidity, whey separation and rheological properties during the

storage. Time factor was the sub-plot. Significant differences were tested at P≤0.05.

Statistical analysis was carried out with the general linear models procedure of SAS (SAS,

1989).

53

3.3. Results

3.3.1. Yoghurt manufacture Ingredient level of yoghurt milk preparation is presented in Table 3.2. It is important to

keep in mind that complexes are solutions containing approximately 3% of dry matter. For

UHC and HC, increasing the pectin concentration was correlated with the amount of

stabilizer added. For instance, at 0.2%, approximately 45% of standardised milk came from

UHC or HC solution as compared to 22.73% for 0.1% and 11.36% for 0.05%. The pH of

standardised milk was influenced by the main factors: type of stabilizer and pectin

concentration (data not shown). This effect was especially marked at 0.2 % of pectin

concentration and was due to the large amount of complexe solution added. To reach the

desired total protein and dry matter for stirred yoghurts with complexes at 0.2%, less whey

protein concentrate (WPC) (about 10%) and twice more skim milk powder (SMP) were

used as compared to 0.1%. As pectin stabilizers (CP and POC) were added in powder form,

SMP and WPC level did not vary with pectin concentrations. Adjustment of raw materials,

to reach a constant composition, had an impact on whey protein source in UHC and HC

stirred yoghurts. This effect is shown in Figure 3.1. For all pectin concentrations, 42-43 %

of whey proteins came from milk (natural milk and powder form). As pectin level was

increased and consequently the quantity of complexes, less milk was used to compensate

the higher water content added. The part left, representing about 56-57% of whey protein

content, was constituted by WPI and WPC. The whey protein source had remarkably

changed. At 0.05%, 42% came from WPC and the balance was obtained from WPI. When

0.1% of pectin equivalent was used, half protein came from WPC and the other from WPI.

At the highest pectin level, 55% of whey proteins on 56-57% were obtained by WPI.

54

Composition of stirred yoghurts is given at Table 3.3. There was no significant difference

between total protein, fat and dry matter contents for all stirred yoghurts at any pectin level.

Moreover, it was conform to the initial desired composition: 1.0 % of fat, 4.0 % of total

protein, and 16.5 % of dry matter. There was a significant difference between pectin

concentrations and type of stabilizer (main factors) for minerals content. For UHC and HC

at 0.2 % of pectin content, minerals dropped as compared to 0.05 and 0.1%. This was due

to the use of less WPC. This ingredient contains about 3 times more minerals than WPI

mainly due to making process (Chandan and O’Rell, 2006). POC and CP had the same ash

level at any pectin level.

3.3.2. Rheological properties, whey separation and microstructure Yoghurt hardness is shown in Figure 3.2. Strength of gel was significantly affected by

pectin level, type of stabilizer and storage time (triple interactions; p≤0.05). After 4 days at

4°C and at 0.05% of pectin concentration, there was a significant difference between UHC

and POC with 405 and 387 N/m2, respectively (Figure 3.2(a)). Weaker strength was

observed for CP. Lowest value was reached by HC: 318 N/m2. The same growing order

was found at 0.1%. The highest hardness, 509 N/m2, was obtained for UHC, POC had

intermediate values followed by CP and then, by HC. For these two concentrations, using

unheated complexes compared to other stabilizers seems to have beneficial effects on the

firmness of stirred yoghurts. When 0.2% was used, the profile changed. CP reached the

higher hardness at 419 N/m2 followed by POC, UHC and then, HC. From 0.05 to 0.1%,

hardness of matrix increased for all stirred yoghurt, except for HC where a slightly lower

value was obtained. Increasing pectin level to 0.2% as compared to 0.1% led to decrease

hardness for UHC and POC. This effect was more drastic for UHC. On the other hand,

hardness of CP and HC was enhanced. Compared to other stabilizers, strength of HC

matrix seems to be less affected independently pectin concentration. After 18 days of

storage, hardness of stirred yoghurts was significantly improved. Similar profiles, at day 4,

were noted, except for POC at 0.05%: hardness had a lower increase than other stabilizers.

Storage of 18 days allowed an enhancement of the strength of the matrix for all stirred

yoghurts. Expulsion of serum was also investigated (Figure 3.1(c)).

55

Whey separation was significantly affected by both pectin concentrations and type of

stabilizers (double interactions). This property did not vary during storage time. At the

lowest pectin level, more serum was retained by UHC, POC and CP. Higher whey

separation was found for HC, but was not significantly different from UHC. At 0.1%, whey

retention was enhanced when CP was used. HC had the higher wheying-off followed by

UHC and POC. At 0.2%, UHC and HC had poor serum retention property: almost 50% was

expulsed. Intermediate result was reached when POC was used. The best stabilizer for

whey retention was CP at 0.2%. From 0.05 to 0.1%, a slight increase of syneresis was

observed for UHC, HC and POC. From 0.1%, to 0.2% whey expulsion for stabilizer

containing pectin used in complexe formation (HC, UHC and POC) increased drastically,

but not for CP. With a growing pectin concentration, UHC, HC and POC had similar

profiles: tendency of higher separation of serum. The opposite behaviour of CP was, at

higher pectin concentration, more serum was held. Apparent viscosity and storage (G’) and

loss (G’’) moduli of stirred yoghurts are shown at Figure 3.3. Pectin concentration and

stabilizer’s type influenced significantly these rheological properties (double interactions).

At 0.05, UHC had the higher value of apparent viscosity. CP and POC had intermediary

results. HC and CP were not significantly different. When 0.1% of pectin concentration

was used, UHC had the higher apparent viscosity. Intermediate value was obtained by POC

followed by CP. The lowest result was reached by HC. At 0.2%, CP, POC and HC had the

higher apparent viscosity. A significant decrease was obtained for UHC. Similar profiles

were observed for G’ and G’’. At 0.05%, UHC had the higher value. POC and CP were not

significant different. HC had reached the lowest G’ and G’’. At the intermediate pectin

level, all stabilizers were significantly different: UHC>POC>CP>HC. When 0.2% was

used, for G’, UHC remained the stirred yoghurt with the superior value. POC and CP had

same behaviour. HC had the poorest elastic character. For G’’, UHC, POC and CP had the

similar values and HC obtained the lowest viscous character. As pectin concentration

augmented, HC and CP enhanced for these rheological properties studied. On the other

hand, apparent viscosity and storage and loss moduli of POC and UHC reached upper

values at 0.1% and decreased at 0.2%. Time (main factor) was significantly different for

apparent viscosity, G’ and G’’. During 4 to 18 days, values of apparent viscosity and

storage and loss moduli were enhanced of 5, 10 and 6.5%, respectively.

56

Texture of all stirred yoghurts were visualised by a sample physical observation. When 0.5

and 0.1% of pectin were added, all matrixes had smooth textures (pictures not shown). On

the other hand, adding UHC and POC at 0.2% of pectin concentration led to a grainy

texture (Figure 3.4 (a) and (b)). HC showed intermediate results: the texture was less

coarse. CP presented a shiny texture without any chalky effect.

Microscopic visualisation of acid gel at 0.1% pectin level is shown in Figure 3.5. Between

UHC and HC picture, the aggregates of UHC seemed to be denser. PC and POC seemed to

have almost the structure. Rob form represents lactobacilli and spherical form is

streptococci.

3.4. Discussion

3.4.1. Yoghurt manufacture Composition of standardised milk (fat, total protein, casein to whey protein ratio, dry

matter) and technological process (heat treatment, homogenisation, inoculation,

coagulation, cooling and storage) have a major effect on rheological properties and serum

separation of finish product (Sodini and al, 2004; Olsen, 2003; Tamine and Robinson,

1999; Keogh, and O’Kennedy, 1998; Lucey and Singh, 1998). Moreover, Singh (1995) has

been reported that the degree of interaction between β-lactoglobulin and κ-casein, essential

for yoghurt matrix formation, depends on time and temperature of heating, protein content,

pH and salts. In this study, stirred yoghurts had the same desirable composition, except for

minerals that were not standardised. Also, the pH of standardised milk varied with pectin

concentrations and type of stabilizers. In addition, a variation in whey protein source was

remarked between the recipes. On the other hand, there was no apparent change in dairy

acid gel process. Effectively, all productions were controlled (same parameters for heat

treatment, inoculation, fermentation and cooling) and had similar coagulation time,

temperature and time of cooling and pH, titratable acidity, microbiological population after

fermentation and during storage.

57

Varying the pH of skim milk between 6.0 and 7.0, before heating, influences the

mechanism of unfolding protein (Vasbinder and de Kruif, 2003). These authors have

developed a representative model of casein-whey protein interactions for this range of pH.

During a heat treatment at 80°C for 10 minutes at pH 6.9, only a small amount of whey

proteins was involved in the coating of casein micelles and the rest was large whey protein

aggregates. At intermediate pH (6.7 and 6.55), extensive whey proteins were interacting

with casein micelles while whey protein aggregates remain soluble. At lower pH as 6.45

and 6.35, the coating of casein micelles by whey protein aggregates was more

inhomogeneous. With skim milk at pH 6.35 and 6.55, the gelation behaviour was similar.

In accordance to this previous work, Corredig and Dalgleish (1999) have also found that

heating milk at a high pH of 6.8 resulted in more whey protein aggregates but at lower pH

like 6.2 and 5.8, the association of whey proteins with casein micelles is favoured. In this

study, pH of standardised milk was 6.55 for POC and CP and 6.35 for HC and HNC,

respectively. As describe above, there was no difference in fermentation time. Moreover,

microscopic visualisation of acid gel did not reveal any change in structure. Consequently,

the variation of pH seems not be involved in variation of rheological properties and

wheying-off.

Minerals play a major role in destabilization of casein micelles during the coagulation. In

milk, there is equilibrium between soluble calcium and phosphate ions and calcium-

phosphate bridges link up to casein micelles (Amiot and al, 2002). As pH decreases during

fermentation process, colloidal minerals are progressively dissolved in serum. This

imbalance is involved in the complex process of reducing electrostatic repulsion between

casein micelles. This is essential to form a three-dimensional network. Adding minerals can

prevent the casein micelles from aggregating by neutralising their superficial charge

(Schkoda and al, 1997). For instance, excessive salt content disturbs the self-attraction of

casein micelles during coagulation. As a result, the strength of acid gel is weaker or, in the

last case, matrix cannot be formed. In this work, as dissimilar salt content was relatively

minor, it seems to be not involved in change of rheological properties and syneresis. As

mentioned before, lower mineral level at the highest pectin concentration was due to the

greater quantity of WPI added.

58

Even though the protein content and casein to total protein ratio was standardised and

consequently whey protein level too, the origin of the latter macromolecule seems to have a

significant impact on rheological properties and whey separation. At the higher pectin

concentration, whey protein source was changed as compared to the others. In fact, specific

functional properties of proteins govern the performance of these macromolecules in food

systems (Kinsella and Whitehead, 1989). To provide a product with the desirable and final

quality attributes, the choice of proper protein types is essential.

Various intrinsic and extrinsic factors can affect the functional properties of whey proteins

(Kinsella and Whitehead, 1989). WPI had higher gelification properties (storage and loss

moduli, penetration measurement) than WPC (Lorenzen and Schrader, 2006). The purity of

WPI powder compared to WPC that contained more fat, lactose and salts can be a cause of

this improvement of quality. The extent of denaturation can also be different. WPC and

WPI used in this work came from different suppliers. Consequently, milk and also whey

proteins came likely from different origins. Milk composition is influenced by many factors

as animal race, lactation cycle, feeding and climatic parameters (Amiot and al, 2002).

Whey composition is affected by milk, type of cheese making, technological process

(Kinsella and Whitehead, 1989). As β-lactoglobulin is the major protein in whey, it seems

to be the main one involved in coagulation (Shah, 2003; Corredig and Dalgleish, 1999 and

1996). Its macromolecule exists in at least five different variants which two most

commons: A and B (Kinsella and Whitehead, 1989). Gao and co-workers (2002) have

demonstrated that genetic variants (A, B, C and a mix of three of them) influenced the

strength and syneresis of heat-induced gel. Moreover, Bikker and co-workers (2000) have

shown that employing genetic variants of β–lactoglobulin (A, B and C) in acid gels milk

prepared from heated skim milk gave different results of G’. For instance, a mixture of

variants B and C caused an almost linear increased of G’ of acid gels with whey protein

concentration. They have attributed these variations to the different aggregation behaviours

among β-lactoglobulin genetic variants. Further study has shown that G’ increased when

the amount of variants B and C was growing (Graveland-Bikker and Anema, 2003). These

authors had the same conclusion than the others. This variability could partly explain the

remarkable decrease of rheological properties between 0.1 and 0.2% for UHC and POC.

59

For HC, no or small change was observed in rheological properties independently the

pectin level used. Consequently, variation in whey protein source seemed not to be in

cause. Other causes will be explained in section 3.4.2.

Process and treatment conditions play also major roles in the functional properties of

proteins (Kinsella and Whitehead, 1989). WPC and WPI are not obtained from the same

technology. WPC is obtained from membrane process e.g. ultra-filtration and gel filtration

and WPI from diafiltration or ion-exchange resins (Kinsella and Whitehead, 1989). This

variability in making whey powder process results in different functional properties that

could be affected the rheological properties of yoghurt.

3.4.2. Rheological properties, whey separation and microstructure This present study showed that using pectin-WPI complexes heated or not prior addition to

standardised milk gave stirred yogurts with different properties. Heat treatment is an

important step in yoghurt making process (Sodini and al, 2004; Tamine and Robinson,

1999). To form acidified milk gel, an intense heat treatment is required to allow an

extensive and irreversible unfolding of whey proteins (Sodini and al, 2004; Shah, 2003).

Denaturation of more than 90% of β-lactoglobulin is preferable. This latter protein seems to

be the main involves in the matrix formation trough disulfides bridges with κ-casein (Shah,

2003; Corredig and Dalgleish, 1999 and 1996). In native state, β-lactoglobulin contains 5

cysteine residues of which one is a free thiol group that is masked in hydrophobic interior

of the protein (Kinsella and Whitehead, 1989). A severe heat treatment (higher than 75°C)

allows irreversible unfolding and then, the free thiol group is exposed (Amiot and al, 2002).

Covalent interaction with κ-casein, responsible the strength of matrix, is possible. Disulfide

bridges are important in the structure of casein network because of their stability to heating

and at a large scale of pH (Alting and al, 2000). These interactions influence rheological

properties and wheying-off of yoghurt (Sodini and al, 2004; Shah, 2003). Non-covalent

interchange reactions like electrostatic and hydrophobic linkages may also occurred (Sava

and al, 2005).

60

Many factors could be involved in the explanation of the difference between UHC and HC.

Double heat treatment for HC could have led to an extensive aggregation of whey proteins.

Contact point between casein network could have been reduced (Schorsch and al, 2001).

Microscopic visualisation of the casein matrix obtained with the various stabilizers at 0.1%

of pectin concentration was not allowed to show dissimilitude, except that HC seems to

have bigger aggregates. Due to the small variations of rheological properties of HC for all

concentrations used, it can be suggested that denatured whey proteins in complexes do not

participated to the casein network formation and are acting such as inert particles inside

matrix clusters. Disulfides bonds are stable to heat temperature and at large scale of pH

(Alting and al, 2000) and less influenced by their environment. Disulfide bounds already

involved in whey protein aggregates in complexes are not available to bridge caseins, when

complexes are added to standardised milk, and the resulting is a weaker gel and whey

syneresis.

Complexe formation between pectin and WPI (unheated) prior addition to standardised

milk seemed to have a beneficial effect on properties of stirred yoghurts. As explained

before, heat treatment of complexes was done to ensure its stability against an increasing of

pH near to neutrality (Chapter 2). Theoretically, unheated complexes, when added in

standardised milk, should be dismantled. As a result: WPI and hydrocolloid remained in

solution without interactions (Chapter 2). According to this, the positive effect remarked

on rheological properties could be caused by the addition of WPI and pectin without

complexe formation. Casein to total protein ratio was standardised. Consequently, whey

proteins concentration was the same for all stirred yogurts made with the various

stabilisers. Another hypothesis could be that complexes remained totally of partially in

standardised milk. Previous study have shown that the association of protein and anionic

polysaccharide to a new functional property as increasing the whey protein solubility at low

pH and against severe heat treatment of 90°C for 2 minutes (Chapter 2). Improvement of

water binding capacity was not proved (Bertrand, 2007). Variation of functional properties

of complexes as compared to the use of WPI and pectin without complexe formation could

be a cause of this phenomenon.

61

Low methoxy pectins are often used in stirred and set yogurt formulations because of their

properties to improve the strength of the acid gel and to prevent whey separation (Chandan

and O’Rell, 2006). Due to their abilities to interact with calcium ions, a flexible matrix can

be formed. Consequently, particle sizes are increasing and leading to an improvement of

viscosity and greater serum retention. Generally, only a small amount (0.07-0.15%) is

required to achieve these beneficial effects. Another author has reported that pectin level

can be used up to 0.2% (Olsen, 2003). This divergence can be explained by the structure-

function relationship of pectin (Olsen, 2003). The key of making yoghurt with desirable

quality is the selection of specific pectin structure and to consider its interaction with

proteins. In other words, the choice of the appropriate hydrocolloid in yoghurt should be

dominated by its viscosity building capacities and also by its protein protection abilities

(Olsen, 2003). This phenomenon was observable in that work. Despite a similar degree of

esterification and amidated groups, pectins (CP and POC) had a different behaviour. Stirred

yoghurt made with CP showed an improvement of hardness and whey separation with

growing pectin concentration while POC, not. This different behaviour could be explained

by various intrinsic and extrinsic factors like structure of backbone (Olsen, 2003;

Maroziene and Kruif, 2000), distribution of both amidated and methoxyl groups (Olsen,

2003), molecular weight and extraction processes (May, 2000). The optimal concentration

of pectin depends also largely on the formulation (type of ingredients) and processing

conditions. According to literature, pectin level should be limited to 0.2% (Chandan and

O’Rell, 2006; Olsen, 2003). Up to this concentration, rheological defects appear like

improper viscosity, less syneresis resistance and grainy of chalky texture. In this study, all

stirred yoghurts containing pectin used for complexes formation (POC, HNC and HC) have

shown this profile: significant drop of apparent viscosity, higher whey separation and a

coarse structure. These imperfections were less important when HC was used, except for

the serum retention. Some authors have observed similar results for stirred skim-milk

yoghurt containing pectin (degree of esterification: 17%) at 0.05 to 0.5% (Everett and

McLeod, 2005). When pectin concentration reached 0.2% and more, apparent viscosity and

dynamic modulus values have diminished. These authors have concluded that an improper

micellar aggregates caused by an over use of pectin was the reason (Everett and McLeod,

2005).The phenomenon was also observed by Matia-Merino and al (2004).

62

These authors have studied the effect of low-methoxy and aminated pectin (17% of

amidated group with a degree of esterification of 31%) on rheological properties of acid-

induced sodium caseinate 2% (w/w) gels. They have observed a decrease of elastic

modulus when up to 0.2% of pectin was used. Based on confocal microscopy, they find that

increasing pectin content prevented aggregation of caseinate particles. The formation of

clusters was prevented due to the presence of this hydrocolloid. Consequently, the strength

of network was negatively influenced and led to a modification of the microstructure. These

negative effects can likely be explained by phase separation (biphasic) due to depletion

flocculation caused by an overuse of pectin (Olsen, 2003; Maroziene and Kruif, 2000).

Beneficial effects of pectin in the stabilization of acidified milk is due to steric stabilization

of casein by a possible combination of electrostatic and hydrophobic interactions (Everett

and McLeod, 2005; Maroziene and Kruif, 2000). First of all, to ensure the desirable quality

of finish product, polysaccharide must absorb onto casein particles. Secondly, a full

coverage of micellar particles is required. When the quantity of polysaccharide is further

increased over the full coverage (critical point), the system casein-hydrocolloid leads to a

phase separation due to depletion flocculation (Maroziene and Kruif, 2000). In skim milk at

pH 5.3, steps following by casein-pectin system, as pectin concentration increases, are

stable-bridging flocculation (about half-saturation coverage), stable, depletion flocculation

and stable/gel.

Hardness, apparent viscosity and viscous and elastic moduli were improved during the

storage. On the other hand, whey separation had not changed. These results are in

accordance to literature which reports that the presence of stabilizers increases viscosity

and consistency of yoghurt during the storage (Tamine and Robinson, 1999). Some authors

have described the improvement of firmness and viscosity is due to slight over-acidification

of yoghurt during the storage (Martin and al, 1999; Martens, 1972).

63

3.5. Conclusion

This project has shown how to use pectin-whey protein isolate complexes as stabilizers in

stirred yoghurt formulation. Moreover, this work has highlighted that double heat

treatment of whey proteins, in case of heated complexes, did not lead to an improvement of

rheological properties and a reduction of syneresis. A surprising conclusion was raised: the

use of complexes without stabilization (unheated), before addition to standardised milk,

improved the rheological properties of stirred yoghurts as compared to heated complexes

(stabilized). To validate if unheated complexes (without stabilization) remained when they

were added to standardised milk, an extensive study will be done to compare unheated

complexes to solution of whey protein isolate and pectin without complexe formation in

stirred yoghurts.

In stirred yoghurts, stabilized complexes were not required to improve rheological

properties and serum retention. On the other hand, the addition of complexes has an impact

(positive or negative) on finish properties of fermented milk. Other food applications for

these complexes could be possible like cottage cheese. Whey protein source has also been

found to play an important role in the quality of finish product. Characterisation of whey

powder should be interesting to be done to support the suggest hypothesis. Structure-

function and concentration of hydrocolloid seemed to also affect the properties of stirred

yoghurts. A judicious choice of stabilizers is an important key to provide a final product

with desirable quality.

Acknowledgements NSERC is acknowledged to provide me a NSERC Postgraduate Scholarships (PGS M).

NSERC and Parmalat Canada are acknowledged for their financial support. Sophie Turcot

and Sylvie Haché are thankfully for their technical support. Given thanks is also for Martin

Cauchon. Without him, this study could not have been realized.

64

Table 3.1: Whey protein, casein, non-nitrogen protein and total protein contents in the

various ingredients

Constituent (%)a

Ingredientb WP Casein NNP T. protein WPI 89.00 NDc 2.00 91.00 WPC 32.00 ND 4.00 36.00 SMP 7.06 27.90 0.74 35.70 Raw creamd 0.36 1.40 0.04 1.80 Skim milkd 0.64 2.50 0.06 3.20

aWP, Whey protein, NNP, non-nitrogen protein, T. protein, total protein bWPI, Whey protein isolate, WPC, Whey protein concentrate, SMP, Skim milk powder cND: Not detected dValues of raw cream and skim milk were means of all milk and cream values used for each production.

Table 3.2: Ingredient level (% w/w) of yoghurt milk preparation

Type of yoghurta

UHC and HCb CP POC Pectin concentration (%)

Ingredientc 0.05 0.1 0.2 0.05 0.1 0.2 0.05 0.1 0.2 Skim milk 76.87 64.95 40.33 89.16 89.52 89.42 89.16 89.52 89.42 Cream 2.78 2.46 2.62 2.71 2.33 2.38 2.71 2.33 2.38 SMP 1.58 2.72 5.05 0.44 0.43 0.53 0.44 0.43 0.53 WPC 35 1.86 1.27 0.11 2.44 2.43 2.44 2.44 2.43 2.44 Stabilizer 11.36 22.73 45.45 0.0513 0.11 0.22 0.059 0.11 0.23 Lactose 5.54 5.87 6.42 5.20 5.18 5.00 5.20 5.177 5.00

a UHC, unheated complexes, HC, heated complexes, CP, commercial pectin, POC, pectin of complexes. bUHC and HC were combined because they had exactly the same recipe. The only different is that for HC,

complexes solution was heated before added to yoghurt milk preparation. cSMP: Skim milk powder, WPC 35: whey protein concentrate at 35 %.

65

Table 3.3: Composition (%) of stirred yoghurts

Type of stirred yoghurtb

UHC HC POC CP Concentration in pectin equivalent (%)

Constituent

0,5 0,1 0,2 0,5 0,1 0,2 0,5 0,1 0,2 0,5 0,1 0,2

ESMc

T. proteina 3,99A 3,96A 3,88A 4,03A 3,97A 4,05A 3,98A 4,01A 3,99A 4,06 3,92A 4,05A 0,044

Fat 0,96A 0,87A 0,90A 0,97A 0,92A 0,94A 1,00A 0,97A 0,92A 0,95A 0,94A 0,96A 0,033

Ash 0,80CD 0,81BCD 0,73E 0,81BCD 0,78D 0,75E 0,83AB 0,85A 0,82ABC 0,84AB 0,84A 0,84A 0,011

Dry matter 16,57A 16,57A 16,56A 16,76A 16,70A 16,66A 16,83A 16,68A 16,66A 16,73A 16,56A 16,66A 0,12 a T. Protein, Total protein bUHC, unheated complexes, HC, heated complexes, CP, commercial pectin, POC, pectin of complexes. c Error standard of the means A-E Means with the same superscript in the same line did not differ at α≤0.05.

05

1015202530354045505560

0,05 0,1 0,2

Pectin concentration (%)

Whe

y pr

otei

n di

strib

utio

n (%

)

Skim milk Raw cream SMP WPC WPI (Complexes)

Figure 3.1: Distribution of whey protein in stirred yoghurt made with UHC or HC (%)

functions of pectin concentration (%).Stabilizer contained WPI as protein source.

66

(a)

250,00

300,00350,00

400,00450,00

500,00

550,00600,00

650,00

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Har

dnes

s (N

/m2)

(b)

250,00

300,00

350,00

400,00

450,00

500,00

550,00

600,00

650,00

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Har

dnes

s (N

/m2)

(c)

1520253035

40455055

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25


Whe

y se

para

tion

(%)

UHC HC CP POC

Figure 3.2: Hardness of stirred yoghurt after 4 (a) and 18 days (b) of storage at 4°C c)

Whey separation of stirred yoghurts. Measurements were made at 4 and 18 days after

manufacture at 4°C functions of 0.05, 0.1 and 0.2% of pectin concentration.

ESM ± 7.36

ESM ± 7.36

ESM ± 2.99

After 18 days

After 4 days

67

(a)

2,40

2,70

3,00

3,30

3,60

3,90

4,20

4,50

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

App

aren

t vis

cosi

ty (P

a s)

(b)

020406080

100120140160180200

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Stor

age

mod

ulus

(Pa)

(c)

0102030405060708090

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25


Loss

mod

ulus

(Pa)

UHC HC CP POC

Figure 3.3: a) Apparent viscosity at a shear rate of 10 s-1 Hz b) Storage modulus (G’) at a

stress of 1 Pa, frequency of 0.1 Hz c) Loss modulus (G’’) at a stress of 1 Pa, frequency of

0.1Hz. Pectin concentration: 0.05, 0.1 and 0.2%. Measurements were made at 4 and 18

days after manufacture and stored at 4°C.

SEM ± 0.163

ESM ± 10.26

ESM ± 4.19

68

Figure 3.4: Visual observation of the texture of stirred yoghurts made with 0.2% as pectin

equivalent for all stabilizers: a) UHC b) POC c) HC d) CP.

a) b)

c) d)

69

Figure 3.5: Scanning electron micrographs of stirred yoghurts added with UHC (a), HC

(b), PC (c) and POC (d) at 0.1% as pectin equivalent. Microstructure was visualised at 5 K

of magnification.

10µm

(c) (d)

10µm

10µm 10µm

(a) (b)

70

Chapter 4: Effect of pectin and whey protein isolate with and without complexe formation on the rheological

properties of stirred yoghurts







+1 450 773 8461.


71

Résumé

Cette étude porte sur l'impact de l’ajout d’isolat de protéines sériques et de pectine non

complexés comparé à l’utilisation de complexes à base de protéines sériques et de pectine

sur les propriétés rhéologiques et l'aptitude à la synérèse de yogourts brassés. Autant en

solution (SWPIP) que sous forme de poudre (PWPIP), l’utilisation d’un isolat de protéines

sériques et de pectine sans interaction a donné les meilleurs résultats de viscosité apparente,

fermeté et module de conservation. Les complexes non traités thermiquement (UHC) de

même que la solution (SWPI) et la poudre (PWPI) d’isolat de protéines sériques ont donné

des valeurs intermédiaires. Le comportement différent de l’UHC comparé à SWPIP ou

PWPIP pourrait être attribuable à la différence de pH des laits de standardisations.

Lorsqu’un traitement thermique est appliqué aux complexes (HC), les caractéristiques

physiques du yogourt chutent drastiquement. Une sur-agrégation causant une diminution

des points de contact, dans la matrice gélifiée, peut être à l’origine de ces résultats. Les

yogourts n’ayant pas subi de traitement thermique, UHCNY et HCNY, ont donné des gels

expulsant une grande quantité de sérum et de piètres propriétés rhéologiques. En général,

l’entreposage de 18 jours à 4°C a été bénéfique pour la plupart des qualités du yogourt sauf

pour la synérèse.

Mot-clé : Isolat de protéines sériques; Pectine; Propriétés rhéologiques; Yogourt brassé.

72

Abstract

The impact of adding whey protein isolate and pectin without complexe formation

compared to whey protein isolate and pectin complexes on the rheological properties and

syneresis of stirred yoghurt was investigated. Employing whey protein isolate and pectin

without complexe formation either in powder of solution forms (SWPIP and PWPIP) had

given the greater values of storage modulus, firmness and apparent viscosity. Unheated

whey protein isolate-pectin complexes (UHC) and native whey protein isolate in solution or

powder had shown intermediate results. The difference between pH of standardised milk

could be likely responsible to this different behaviours for UHC compared to SWPIP and

PWPIP. When complexes were heated (HC), a drop of physical characteristics was

remarked. Double heat treatment of whey protein could probably have led to an over

aggregation of whey proteins resulting in diminution of contact point in network. Stirred

yoghurts without heat treatment had the poorest attributes: UHCNY and HCNY. In general,

storage time led to enhancing the rheological properties of stirred yoghurts, but no change

was remarked for syneresis.

Keywords: Whey protein isolate; Pectin; Rheological properties; Stirred yoghurt.

73

4.1. Introduction

In fermented milk industry, yoghurts are often produced with hydrocolloids like pectin,

carrageenan, starch and gelatin due to their abilities to bind free water and enhance its

texture. Composition of standardised milk (dry matter, protein source and level, whey

protein-casein ratio, fat and ash content) has also a significant influence on the thickness of

fermented milk (Sodini and al, 2004; Tamine and Robinson, 1999). Even though the use of

polysaccharides, major defects of yoghurt texture remains as improper firmness, variation

in viscosity and wheying-off (Lucey, 2001; Keogh et O’Kennedy, 1998).

A possible way to improve yoghurt qualities is the addition of whey protein isolate (WPI)-

low methoxy pectin complexes (Bertrand, 2007; Chapter 3). The interesting fact about

interaction between protein and polysaccharide is that functional properties can be different

from those of each of biopolymers or without complexe formation (Kruif and Tuinier,

2001; Samant and al, 1993; Tolstoguzov, 1997 and 1991). Previous work has reported that

using WPI-pectin complexes at a ratio of 4:1 and at pH 4.5 at a level of 0.1% pectin led to

an improvement of hardness, storage and loss moduli and apparent viscosity as compared

to commercial low methoxy pectin (Chapter 3). Theoretically, as interactions between

protein and polysaccharide are mainly driven by electrostatic linkages, an adjustment of pH

to neutrality should dissociate complexes. As the pH of standardised milk is about 6.5-6.7,

when complexes will be added, pectin and whey proteins should not be in complexe form.

Consequently, theoretically, the obtained results should be related to the addition of WPI

and pectin in solution form by themselves. To confirm or infirm this hypothesis, the present

work was done. The aim was to investigate the impact of WPI and pectin solutions without

complexe formation (no pH adjustment at 4.5) compared WPI-pectin complexes (pH

adjustment at 4.5) on the rheological properties (firmness, apparent viscosity, storage

modulus and whey separation during a storage of 18 days at 4°C. In Dairy industry, pectin

and WPI can be used in solution or powder form. The effect of using WPI and WPI-pectin

without complexe formation in solution or in powder form on rheological properties and

whey retention of yoghurt will be also studied.

74

4.2. Material and methods

4.2.1 Materials Low methoxy pectins were obtained from Cp Kelco (Lille Skensved, Denmark). Pectin

used for complexe formation, with 30 % of esterification and 19 % of amidated groups, was

derived from citrus peel (X-917-02). Whey protein isolate (WPI) used for complexe

formation was purchased from Davisco Foods (Bipro, US, USA). For the formulation of

stirred yoghurts, pasteurised skim milk and raw cream at 41% of fat (Parmalat Canada, St-

Hyacinthe, Quebec, Canada), whey protein concentrate (CRIMO, Agropur, Granby,

Quebec, Canada), skim milk powder (low heat, spray drying process, CRIMO, Agropur,

Granby, Quebec, Canada) and lactose (98% of sugar, Saputo, St-Hyacinthe, Quebec,

Canada) were used. Protein composition of each raw material is presented in Table 3.1

(Chapter 3). Each ingredient contributed to the total protein content of stirred yoghurts.

4.2.2. Complexes formation A main solution of 1.5% of pectin powder dissolved in distilled water (w/w) using

magnetic stirrer was made. Pectin solution was heated at 85°C for 1 minute to ensure

complete solubilisation. A main solution of 16.0% of WPI in distilled water was made. To

ensure adequate hydration, solution was gently mixed with magnetic stirrer for two hours.

Both solutions were stored at 4°C overnight with gentle magnetic stirrer. Main solutions

were used at room temperature. Pectin solution was adjusted at pH 5.0-5.5 with NaOH 0.5

and 0.1N (USP grade, VWR, Canada). The first NaOH concentration was used for

increasing at approximately pH 5.0. The 0.1N NaOH level was used to adjust at pH 5.5.

WPI solution was adjusted to pH 6.5 with lactic acid 10% (w/w) (Food grade, Fisher

Scientific, Ottawa, Ontario). Mains solutions were weighted (WPI (2.0%): pectin (0.5%)

and distilled water were added to reach final ratio of 4:1. The mixed solution was left two

hours at room temperature with gentle magnetic stirrer. Formation of complexes was done

by decreasing gradually the pH to a final pH of 4.5 with a lactic acid solution at 10%.

75

After two hours of mixing, complexes was stored at 4°C (unheated) or heat treated at 90°C

for 2 minutes in water bath. After heating process, solutions were rapidly cooled in icy

water and then, stored at 4°C until utilisation. Applying a heat process of 90°C for 2

minutes to complexes was to ensure their stability against an increasing of pH to 6.7-6.8

(milk). This impact of this treatment on WPI-pectin complexes was previously studied by

our team (Chapter 2).

4.2.3. Yoghurt milk preparation Eight types of stirred yoghurts were made with six stabilizers at a concentration of 0.1% as

pectin equivalent (Table 4.1). This pectin concentration was defined as the best level that

given the greater apparent viscosity and firmness (Chapter 3). Yoghurts were added with

unheated WPI-pectin complexes at pH 4.5 at a ratio of 4:1 (UHC) or heated at 90°C for 2

minutes (HC). To study the effect of heat treatment, these two stabilizers were used in

yoghurt formulation that has not received the usual heat treatment using during making

process called: UHCNY for UHC and HCNY for HC, respectively. In earlier study,

complexes that have received double heat treatment i.e. one for the stabilisation of

complexes and the second for the milk treatment prior inoculation showed poor rheological

properties (Chapter 3). Other texturing agents were a solution of native WPI-pectin at the

same ratio than complexes without pH adjustment (pH 6.3-6.4) i.e. without complexe

formation (SWPIP) and as powder form (PWPIP) at the same level that as solution form.

The last stabilizers were native WPI either as powder (PWPI) and solution forms (SWPI).

The quantity of WPI in SWPIP and PWPIP to add in yoghurt formulation was based on the

amount of whey proteins containing in complexes at 0.1% as pectin equivalent. This

consideration was to ensure a constant level of casein to total protein ratio. Yoghurt

formulation was standardised at 1.0% of fat, 4.0% of total protein, 17.0% of dry matter and

ratio casein to total protein of 0.65. Each recipe was left at 4°C overnight before used to

allow a complete hydration. The pH of standardised milks had not been adjusted and was

significantly affected by type of stabilizers. For UHC, HC, UHCNY and HCNY, a drop of

0.13 units was obtained compared to SWPI, SWPIP, PWPI and PWPIP (pH 6.55 ± 0.0304).

76

These variations did not affect fermentation time and microbiological populations at

inoculation time and after fermentation as will be described in section 4.2.5. After analysis,

composition of all stirred yoghurts respected the targeted proximate (data not shown).

4.2.4. Strains, cultures and medium culture Commercial yoghurt culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii

ssp. bulgaricus freeze-dried was used (611DPL, Rhodia, Madison, WI, USA). This bacteria

mix was specifically selected for its ability to produce small amount of exopolysaccharides

to avoid that difference in rheological properties was due to the production of bacterial

polysaccharides. Main culture was prepared with a reconstituted skim milk powder (12 %

dry matter) autoclaved at 110°C/10 minutes in autoclave glass jars. After cooling at 42-

43°C, 1g/L of freeze-drying ferments was directly mixed to the reconstituted milk.

Incubation was made at 42-43°C. Fermentation was stopped by storing the main culture at

4°C overnight when pH had reached 5.3-5.5. The medium cultures used for microbiological

count was M17 selective agar medium for streptococci and acidified Man Rogosa Sharp

(MRS) medium for lactobacilli (Difco, Detroit, Mich, USA). Microbiological population, in

starter culture, was Log 8.89 ± 0.102 CFU/mL for streptococci and Log 7.87 ± 0.116

CFU/mL for lactobacilli.

4.2.5. Yoghurt manufacture Yoghurt was made at laboratory scale. Recipes were prepared in 5L stainless tank. Each

recipe was left at 4°C overnight to allow complete hydration. Standardised milks were

preheated at 55°C prior homogenisation by a single pass at 1000 PSI (EmulsiFlex C5,

Avestin Co., Ottawa, Ontario, Canada). Homogenised milks were heated at 90°C for 2

minutes in culture incubator; an automatic control water bath usually used for dairy

ferments preparation (Laboratorium Wiesby GmbH&Co, Niebüll/W., Germany). Two

mixtures were not heat treated, those containing UHCNY and HCNY as stabilizing agents.

Then, mixtures were cooled to incubation temperature (42-43°C). Inoculation rate was 3%.

77

The streptococci and lactobacilli populations were Log 7.38 ± 0.053 CFU/mL and Log 6.41

± 0.045 CFU/mL, respectively. Inoculated milk blends were rapidly incubated in yoghurt

incubator (CS-20, Coldstream Drive, Jordan Valley, IL, USA) at 42±1°C and left until pH

4.6 was reached. Fermentation time was approximately 3 hours and 15 minutes for all

yoghurts. Cooled to 18-20°C, fermented milks were gently stirred 10 times with stainless

tool and then, were smoothed with screw pump (Allweiller AG 0-100 L/h, Netzch,

Germany). Stirred yoghurt were filled in 175 mL pot and stored at 4°C. Production was

divided in three batches: one for analysis at day 0 (time when stirred yoghurts had reached

4°C), day 4 and after 18 days. Microbiological population did not change in time. During

storage, culture remained stable: Log 8.9 ± 0.01 CFU/mL for streptococci and Log 8.2 ±

0.01 CFU/mL for lactobacilli.

4.2.6. Analytical methods Composition of standardised milk and stirred yoghurt were determined in duplicate. Fat





Non-casein nitrogen of milk preparation was obtained by casein precipitation at pH 4.6

with H2SO4 1N. Non-protein content was isolated by precipitation with 12 % of TCA

(w/w), the sample was filtered and then, the filtrate was analysed (St-Gelais and al, 1998).

Casein content and whey proteins were calculated by difference. A nitrogen conversion

factor of 6.38 was used to calculate milk protein content. Titratable acidity expressed as

percentage of acid lactic (0.01N NaOH) and pH were also measured on 10 g of sample

(AOAC, 2000).

78

4.2.8. Rheological measurements and whey separation Hardness was quantified at 0, 4 and 18 days by using a TA-XT2 texture analyser (Texture

Technologies Corp., Scarsdale, NY). Analyses were made 5 times for each yoghurt at 4°C.

The plunger was cylindrical, with a flat base of 25 mm diameter, moving at a speed of

1mm/s (Hess and al, 1997). Maximum peak force (N) at a displacement of 10 mm was

recorded as firmness (N/m2). Rheological properties were measured with a dynamic stress

rheometer using a bob and a cup (Rheometric, Model SR-2000, TA Instrument, New

Caslte, DE, USA). All measurements were performed at 4°C after 4 and 18 days of storage

in duplicate. Samples were directly taken from the pots with the stainless cylinder. A

steady stress sweep test with a shear stress of 1.0 to 1.00 Pa was used to calculate apparent

viscosity at a constant shear rate of 10s-1 (Everett and McLeod, 2005). Dynamic stress

sweep test was used to determine linear region of viscoelasticity of yoghurt under

oscillatory of 1Hz and at an increasing stress from 0.02 to 30 Pa (Everett and McLeod,

2005). Storage modulus (G’) was measured at 1 Pa, in the linear region of viscoelasticity of

yoghurt, functions of frequency: 0.1 to 10 Hz. Whey separation was measured by

centrifuge force. To transfer yoghurt in centrifuge tubes without minimal disruption of gel,

a home made stainless cylinder was used. Samples (25-27g) were centrifuged at 1900 X g

for 20 minutes at 4°C (Keogh and O’Kennedy, 1998). The clear supernatant was poured

off, weighed and recorded as syneresis (%). Measurements were made in duplicate.

4.2.9. Microscopy Prior microscopic visualisation, stirred yoghurts were lyophilised. Frozen samples (-20°C)

were sliced in a section of 5 cm x 5 cm x 3 cm (length x width x height) and placed in glass

Petri dishes. Samples were left in freeze-dryer during 48 hours at -40°C (Dura-Stop UP,

Tray Dryer FTS systems, USA, New-York). A scanning electron microscopy (SEM) was

used to visualise the microstructure of acid milk gels (S-3000N, Hitachi, Japan). The

samples were coated by gold (Marivac, Quebec, Canada) using the sputtering method with

sputter coater equipment (Marivac, Quebec, Canada) before analysis.

79

4.2.10. Statistical methods Analysis of variance, according to a factorial design, was applied to determine the effects of

type of yoghurt on fermentation parameters and yoghurt composition. However, a split-


like pH and titratable acidity, water holding capacity and rheological properties during the

storage. Time factor was the sub-plot. Significant differences were tested at P≤0.05.

Statistical analysis was carried out with the general linear models procedure of SAS (SAS,

1989).

4.3. Results

4.3.1. Yoghurt manufacture The evolution of pH and developed acidity of stirred yoghurts, during 18 days of storage at

4°C, is presented in Figure 4.1 (a) and (b). These factors were significantly affected by type

of stabilizers and also the ageing. At time 0 i.e. when fresh stirred yoghurts reached 4°C,

pH of fermented milk made without the usual heat treatment (UHCNY and HCNY) were

higher than the other yoghurts except for SWPIP and PWPIP yoghurts. During storage, pH

of stirred yoghurts decreased significantly, except for UHCNY and HCNY yoghurts which

decreased very slowly. Production of lactic acid increased significantly, in all yoghurts

during ageing, except for UHCNY and HCNY yoghurts. The development of lactic acid

was less pronounced in HC than in UHC, especially at day 4. For the solution and powder

forms of WPI and WPI-pectin, at day 0, values were similar whereas after 4 and 18 days,

SWPI showed lower lactic acid content than the other yoghurts.

4.3.2. Rheological properties, whey separation and storage time Hardness of stirred yoghurts is shown in Figure 4.2 (a). This rheological property was

affected by interacting factors: types of stabilizers and storage time. The higher values, at

days 4 and 18, were reached when stirred yoghurts were made with PWPIP and SWPIP.

80

When the pH of WPI-pectin solution was adjusted at 4.5 (UHC), hardness was lower at

both times compared to solution without pH adjustment (SWPIP). The application of heat

treatment to complexes (HC) led to a more dramatic diminution of hardness value. Using a

solution or a powder form of native WPI gave greater results that HC yoghurt. When

standardised milk was unheated prior fermentation, stirred yoghurts (UHCNY and HCNY)

gave the lowest values. A significant increase of hardness was observed for UHC, SWPIP,

PWPIP, SWPI and PWPI during the ageing.

Apparent viscosity was significantly influenced by double interacting factors: type of

stabilizers and ageing (Figure 4.2 (b)). Generally, profile of apparent viscosity in time and

for the various texturing agents was similar to those obtained for hardness. Stirred yoghurts

made with WPI-pectin without complexe formation either as solution or powder form

(SWPIP and PWPIP) had given the higher results of apparent viscosity. UHC gave

intermediate values compared to SWPIP and PWPIP. On the other hand, apparent viscosity

of UHC yoghurt was not significantly different from PWPI. In solution form, SWPI

fermented milk had slightly lower value than UHC and PWPI. Applying a heat treatment of

complexes (HC) was not beneficial on this rheological property. In addition, lack of usual

heat treatment of milk was not favourable to improved apparent viscosity. UHCNY and

HCNY yoghurts had the lowest values. During the storage, apparent viscosity was

enhanced apart from UHCNY and HCNY yoghurts.

Elastic behaviour (G’) of stirred yoghurts is presented in Figure 4.3. This property was

largely influenced by double interacting factors: type of stabilizers and storage time.

Highest G’ values were reached by WPI and pectin mixed together as either powder or

solution form (SWPIP and PWPIP). UHC yoghurt had a higher elastic modulus than SWPI

and PWPI yoghurts. The heat treatment of complexes (HC) did not enhance this rheological

property compared to UHC. Like hardness and apparent viscosity, the lowest values were

obtained when the standardised milk was not heat treated before fermentation (UHCNY

and HCNY). No change was noticed for all stabilizers during storage at 4°C, except for

PWPIP yoghurt. For this latter the elastic modulus increased significantly during storage.

81

Whey separation of stirred yoghurts is shown in Figure 4.4 (a) and (b). This property was

significantly affected by single factors: type of stabilizers and time. Stirred yoghurts

presenting the higher whey expulsion were HCNY and UHCNY. Intermediate results were

found for HC, UHC, PWPI and PWPIP yoghurts. Higher whey retention was observed for

yoghurt produced with SWPI and SWPIP. A significant reduction of syneresis of each type

of stirred yoghurts was remarked during the ageing (Figure 4.4 (b)).

4.3.3 Effects on microstructure Microstructure of UHC, HC, SWPIP and PWPIP yoghurts is presented in Figure 4.5.

SWPI, PWPI, UHCNY and HCNY yoghurts were not represented as they gave poorest

rheological properties compared to the others. Micrographs demonstrated similar curds: a

dense and extensively branched matrix, except that SPWIP and PWPIP seemed to be

denser. HC compared to UHC showed slightly larger protein aggregates.

82

4.4. Discussion

4.4.1. Yoghurt manufacture The main roles of heat treatment are the destruction of pathogens and other undesirable

microorganisms, inhibition of lipases, induction of factors that stimulate or inhibit the

starter cultures and change in physicochemical properties of constituents in milk (Chandan

and O’Rell, 2006; Tamine and Robinson, 1999). The latter effect can likely explain the

different behaviours of UHCNY and HCNY that did not receive the usual heat treatment in

yoghurt process as compared to others. Redistribution of calcium, phosphate and

magnesium between soluble and colloidal forms can lead to a reduction of pH (Tamine and

Robinson, 1999). Lactose, major nutriment for lactic acid bacteria to produce lactic acid, is

also affected by heat treatment; decomposition to form organic acids, furfural and

hydroxymethylfurfunal (Tamine and Robinson, 1999). The resultant is the reduction of pH,

production of formic acid, effect on the growing of bacteria and contribution to yoghurt

flavour (Chandan and O’Rell, 2006; Tamine and Robinson, 1999). Despite the fact that no

change in microbiological population was found either in making process and during

ageing for all types of yoghurts, variations of pH and development of lactic acid was

observed especially when standardised milk was unheated. In fact, pH is an important

factor that affecting the growing and production of metabolites by bacteria (Chandan and

O’Rell, 2006; Tamine and Robinson, 1999). As the making process was hardly controlled

(inoculation rate, time of fermentation, pH at the end of fermentation, time-temperature of

cooling), difference observed between the various stabilizers was not due to variation of

parameters during the formation of acidified milk.

83

4.4.2 Rheological properties, whey separation and microstructure Rheological properties were improved when SWPIP and PWPIP were added to yoghurt

formulation. Is has been reported that addition of whey proteins less than 1% led to an

enhancement of physical characteristics of yoghurts (Tamine and Robinson, 1999). Other

studies have also highlighted the beneficial effect of adding pectin at less than 0.2%

(Everett and McLoed, 2005; Lucey, 2004; Olsen, 2003). In this study, addition of WPI and

pectin without complexe formation seemed to have a beneficial effect on rheological

properties as compared to yoghurts made with WPI alone.

SWPIP and PWPIP have given similar behaviours for elastic modulus but for hardness and

apparent viscosity, SWPIP yoghurts have slightly lower values. Almost the same profile

was remarked for SWPI and PWPI. As a result, using solution or powder forms seemed to

not affect the finish quality of fermented milk. For SPWIP and PWPIP, no apparent change,

in microstructure, was observed. In literature, no study was done on that subject probably

because powder is most largely used and friendlier to use than solution forms for Dairy

industry.

UHC yoghurt gave similar rheological properties to addition of SWPI and PWPI. Expect

results would be that UHC had greater or comparable rheological properties to a solution or

a mixed powder of WPI and pectin without complexe formation. This difference could be

likely due to the difference between pH of standardised milk. Unfolding protein mechanism

of skim milk, before heating, is affected by variation of pH between 6.0 and 7.0 (Vasbinder

and de Kruif, 2003). These authors have developed a representative model of the

interactions between casein and whey proteins for this range of pH. For instance, at pH 6.9,

during a heat treatment (80°C for 10 minutes), only a small quantity of whey proteins was

involved in the coating of casein micelles. The major part was separated from casein

micelles network as large whey protein aggregates. At intermediate values such as pH 6.7

and 6.55, extensive whey proteins were interacting with casein micelles while whey protein

aggregates remained soluble. At lower pH: 6.45 and 6.35, the coating of casein micelles by

whey protein aggregates was more heterogeneous.

84

It was concluded that the amount of whey proteins in association to casein micelles and the

type of whey protein coating on casein micelles had a significant effect on the acid-induced

gel behaviour and consequently, on physical characteristics of acid milk gel. Corredig and

Dalgleish (1999) have also found that heating milk at pH 6.8 resulted in higher quantity of

whey protein aggregates but at lower pH: 6.2 and 5.8, the association whey proteins-casein

micelles enhanced. Amatayakul and co-workers (2006b) obtained lower firmness value in

set yoghurt when soluble denatured whey protein proportion decreased in heated milk.

Contrary to UHC and HC (yoghurts that received the usual heat treatment of milk),

rheological properties of UHCNY and HCNY yoghurts had similar behaviour. The lack of

difference between yoghurts with complexes heated and not can be due to the formation of

disturbed matrix resulting of the absence of usual heat treatment in yoghurt making.

Consequently, due to its inadequate network, the finish characteristic could not be

enhancing by the utilisation stabilizing agents.

Difference between UHC and HC yoghurts can be explained by many factors. Double heat

treatment for HC could have been led to an extensive aggregation of whey proteins.

Contact point between casein network could have been lower (Schorsch and al, 2001).

These results were in accordance to previous work: HC had lower rheological properties

(G’, G’’, apparent viscosity and firmness) than UHC (Chapter 3). Whey separation was

similar as obtained in this study. Visualisation of matrix adding with the various stabilizers

at 0.1% as pectin equivalent did not show dissimilitude. The difference observed between

UHCNY and HCNY yoghurts compared to others was attributable to the lack of usual heat

treatment of milk in making process. In fact, heating milk results in a modification of type

of acid gel (Lucey and al, 1999; Tamine and Robinson, 1999; Lucey and Singh, 1998;

Kessler and al, 1991). Kessler and co-workers (1991) have studied the formation acidified

gel of heated or not milk. Unheated milk resulted in the formation of aggregated casein

micelles. Native whey proteins may act like inert particles in matrix (Lucey and al, 1999).

Microstructure of unheated milk appears to be more disturbed and disordered clusters

compared to heated milk that is more homogenous and highly branched structure (Lucey

and Singh, 1998).

85

An extensive heat treatment contributes to unfolding whey proteins causing the possible

interactions between these proteins and κ-casein by the intermediate of disulfides bridges

(Shah, 2003; Corredig and Dalgleish, 1999 and 1996). The resultant is an increasing of

number and strength of bonds between macromolecules (Lucey and Singh, 1998). This

difference of microstructure affects negatively the rheological properties of yoghurts as

storage modulus (Lucey and al, 1999), firmness (Kessler, 1997) and syneresis (Lucey and

Singh, 1998; Kessler, 1997). Due to its adequate acid gel formation, yoghurts resulting

from heated milk prior inoculation had greater rheological properties and whey retention

(Lucey and Singh, 1998).

Hardness, apparent viscosity, elastic modulus and whey retention was improved during the

storage. These results are in accordance to literature which presence of stabilizers increases

viscosity and consistency of yoghurt during the storage (Tamine and Robinson, 1999).

Martens (1972) and Martin and al (1999) described the enhancing of firmness and

Postumus viscosity to slight over-acidification of fermented milk during the ageing. The

greater retention of serum in long-time storage i.e. 5 to 21 days can be due to the protein

hydration according to Afonso and Maia (1999).

86

4.5. Conclusion

Using whey protein isolate and pectin without complexe formation either as powder or

solution forms, in stirred yoghurts, led to an improvement of rheological properties as

compared to adding complexes. This result highlighted the beneficial effect of adding

pectin and whey protein isolate in adequate proportion. Solution and powder of native WPI

gave similar characteristics than complexes. The pH of standardised milk seemed also to

have major impact on the formation of network and also on the final physical

characteristics of stirred yoghurts. Double heat treatment of complexes (one for stabilizing

the complexes, the other for heating milk prior inoculation) resulted likely on diminishing

the contact point between casein micelles. Consequently, native whey proteins, in

standardised milk, are required to form a proper three-dimensional network in association

to casein micelles. On the other hand, the usual heat treatment in making process is

essential to form an adequate casein network. A further study will be done to improve the

rheological properties of stirred yoghurts made with unheated complexes by varying the

casein to total protein ratios.

Acknowledgements



and Sylvie Haché are thankfully for their technical support.

87

Table 4.1: Type of stabilizers studied in stirred yoghurt formulations and application of

heat treatment or not of milk prior formation of acidified network

Type of stabilizers

Heat treatment of milk (yoghurt)

Unheated whey protein isolate in powder form (PWPI)

Yes

Unheated whey protein isolate in solution (SWPI)

Yes

Unheated whey protein isolate and pectin in powder form (PWPIP)

Yes

Unheated whey protein isolate and pectin in solution form (SWPIP)

Yes

Unheated whey protein isolate-pectin complexes at pH 4.5 (UHC)

Yes

Unheated whey protein isolate-pectin complexes at pH 4.5 (UHCNY)

No (NY)

Heated whey protein isolate-pectin complexes at pH 4.5 (HC)

Yes

Heated whey protein isolate-pectin complexes at pH 4.5 (HCNY)

No (NY)

88

4,00

4,05

4,10

4,15

4,20

4,25

4,30

4,35

4,40

4,45

0 4 18

pH u

nit

0,500,550,600,650,700,750,800,850,900,951,001,051,101,15

0 4 18Time (Day)

Dev

elop

ed a

cidi

ty (

% la

ctic

aci

d)

UHC HC HCNY UHCNY PWPI PWPIP SWPI SWPIP

Figure 4.1: (a) The pH unit of various stirred yoghurts and (b) Developed acidity expressed

as percentage of lactic acid of various stirred yoghurts functions of storage time.

(a)

(b)

89

240290340

390440490540590

640690740

4 18

Har

dnes

s (N

/m2)

1,92,22,52,83,13,43,7

44,34,64,9

4 18Time (Day)

App

aren

t vis

cosi

ty (P

a X

s-1)


Figure 4.2: (a) Hardness of stirred yoghurts functions of various stabilizers after 4 and 18

days of storage at 4°C (b) Apparent viscosity of stirred yoghurts functions of various

stabilizers. Measurements were made after 4 and 18 days of manufacture at a shear rate of

10s-1 and a temperature of 4°C.

(b)

(a)

90

0

30

60

90

120

150

180

210

4 18Time (Day)

Elas

tic m

odul

us (P

a)


Figure 4.3: Elastic modulus (G’) of stirred yoghurts functions of type of stabilizers and

storage time. Measurements were made 4 and 18 days after manufacture at a stress of 1 Pa,

frequency of 0.1 Hz and a temperature of 4°C.

91

25

28

31

34

37

40

43

46

49

52

55

UHC HC HCNY UHCNY PWPI PWPIP SWPI SWPIPType of stabilisers

Syne

resi

s (%

)

30

31

32

33

34

35

36

4 18Time (Day)

Syne

resi

s (%

)

Figure 4.4: Syneresis of stirred yoghurts functions as (a) stabilizers and (b) storage time.

Measurements were made at 4 and 18 days after manufacture at 4°C

(b)

(a)

92

Figure 4.5: Scanning electro

(b), SWPIP (c) and PWPIP (d

(a) (b)

(c)
10µm
n micrographs of stirred yoghurts added

). Microstructure was visualised at 5 K of

(d)

10µm
10µm 10µm
with UHC (a), HC

magnification.

93

Chapter 5: Impact of varying casein to total protein ratios on rheological properties and syneresis of stirred

yoghurts made with pectin-whey protein isolate complexes.







+1 450 773 8461.


94

Résumé

Cette étude a porté sur l’impact de la variation du ratio caséines-protéines totales (55 et

70%) et de l’utilisation de deux types de texturant (complexes pectine-isolat de protéines

sériques à pH 4.5 (UHC) et une solution de pectine et d’isolat de protéines sériques (SWP))

à une concentration fixe de 0.1% en équivalent de pectine sur les modules de perte et de

conservation, la viscosité apparente, la fermeté et l’aptitude à la synérèse de yogourts

brassés. À une quantité fixe de protéines totales, une augmentation de la teneur en caséines

a permis d’améliorer les propriétés rhéologiques des yogourts. Par contre, la rétention du

sérum n’était pas influencée par la variation du ratio. Les meilleures propriétés

rhéologiques ont été atteintes par le UHC avec un ratio élevé en caséines (70%). Une

visualisation de la microstructure a également démontré que les caillés contenant UHC était

plus denses et les agrégats de tailles supérieures. Généralement, l’entreposage à 4°C

pendant 18 jours a permis d’améliorer la fermeté et les caractères visqueux et élastiques

des yogourts brassés tandis que la séparation du lactosérum est augmentée.

Mot-clé : Complexes d’isolat de protéines sériques-pectine; Ratio caséines-protéines

totales; Propriété rhéologiques; Yogourt brassé.

95

Abstract

This study investigated the impact of two casein to total protein ratios (55 and 70%) and

two texturing agent (whey protein isolate-pectin complexes at pH 4.5 (UHC) and whey

protein isolate-pectin solution (SWP)) at 0.1% as pectin equivalent on the elastic and

viscous moduli, apparent viscosity, firmness and whey expulsion of stirred yoghurts.

Higher casein content at constant total protein concentration allowed an improvement of

rheological properties. Syneresis was not affected by the various ratios. The better

rheological properties were reached at casein to total protein ratio of 70% when UHC was

used. Microstructure has shown that yoghurt added with UHC had larger and denser

aggregates than those with SWP. Generally, storage time led to an improvement of

hardness, elastic and viscous characters despite whey separation increased.

Keywords: Whey protein isolate-pectin complexes; Casein to total protein ratio;

Rheological properties; Stirred yoghurt.

96

5.1. Introduction

Yoghurt is one of the oldest and most popular fermented milk in the world. Since few

years, its consumption has increased in North-America. This interest could be attributed to

its healthy benefit as weight control, immunologic effects, prevention of diarrhoea,

probiotic carriers and reduction of maldigestion effects for lactose intolerant people

(McKinley, 2005). The arrival of a large range of flavours, a greater variety of yoghurts as

low or non-fat, low carbohydrate content, enrich with polyphenols or bifidobateria could be

also responsible for this growing market. On the other hand, major defects remains like

improper firmness, variation in viscosity and whey separation (Lucey, 2001; Keogh et

O’Kennedy, 1998; Lucey and Singh, 1998).

To improve the final quality of yoghurt, numerous ways are possible. The first one is to

fortify milk base with dried ingredients such as whey protein isolates and concentrates,

skim milk powder, caseinate powders to increase total solid content or/and protein

concentration at standardization step (Sodini and al, 2004; Tamine and Robinson, 1999).

The type of protein has also an important influence on the properties of yoghurt (Sodini and

al, 2004; Tamine and Robinson, 1999). In North America, adding stabilizers like pectin,

alginate, carrageenan, gelatin and starch are also common practise (Tamine and Robinson,

1999). The primary role of these hydrocolloids is to enhance and maintain the desirable

characteristics of fermented milk. The control of technological process as heat treatment,

homogenisation, both time and temperature of incubation and cooling, handling and storage

conditions are factors affecting the rheological properties and syneresis of yoghurts

(Tamine and Robinson, 1999). Previous work has shown that using whey protein isolate

(WPI) and low methoxy pectin complexes at pH 4.5 and at 0.1% of pectin equivalent as

texturing agent can improve apparent viscosity, firmness and storage and loss moduli of

stirred yoghurts as compared to commercial pectin (Chapter 3). Another study has shown

that WPI and low methoxy pectin complexes at pH 4.5 was not enough sufficient than WPI

and of low methoxy pectin solution without complexe formation to improve the rheological

properties of stirred yoghurt (Chapter 4).

97

To enhance the finish quality of stirred yoghurts enriched with WPI-pectin complexes,

many ways can be tried as varying the casein concentration and keep total protein at

constant level. As this protein participates to matrix formation, casein should be

standardised at adequate level. A precise value or a specific range cannot be clearly

quantified from literature data at this time. Many authors have studied the effect of varying

the amount of casein content at constant total protein (Guzman-Gonzalez and al, 1999;

Guinee and al, 1995; Kailasapathy and Supriadi, 1998; Guirguis and al, 1984). Interesting

fact: depending on composition of dry matter, total protein and fat adding more or less

casein content gave contradictory behaviour on rheological properties. The aim of this

study was to determine the impact of varying casein to total protein ratios of two different

texturing agents, WPI-pectin complexes and WPI-pectin solution without complexe

formation, on the microstructure, apparent viscosity, elastic and viscous moduli, firmness

and syneresis during storage of 18 days at 4°C.

98

5.2. Material and methods

5.2.1 Materials Pectins were given by Cp Kelco (Lille Skensved, Denmark). Polysaccharide used in

complexe formation, with 30 % of esterification and 19 % of amidated groups, was derived

from citrus peel (X-917-02). Whey protein isolate (WPI) used for complexe formation was

purchased from Davisco Foods (Bipro, US, USA). For yoghurt formulation, pasteurised

skim milk and raw cream at 40.4% of fat (Parmalat Canada, St-Hyacinthe, Quebec,

Canada), whey protein concentrate (CRIMO, Agropur, Granby, Quebec, Canada), skim

milk powder (low heat, CRIMO, Agropur, Granby, Quebec, Canada) and lactose (98% of

sugar Saputo, St-Hyacinthe, Quebec, Canada) were used.

5.2.2. Complexe formation and whey protein isolate-pectin solution Pectin powder was dissolved in distilled water (w/w) using magnetic stirrer to reach a final

concentration of 1.5% (main solution). Complete dissolution was ensuring by heating main

solution at 85°C for 1 minute. A main solution of 16.0% of whey protein isolate in distilled

was made. For adequate hydration, solution was gently mixed with magnetic stirrer for two

hours. Both mixtures were stored at 4°C overnight with gentle magnetic stirrer. Main

solutions were used at room temperature. Pectin solution was adjusted at pH 5.5 with

NaOH 0.5 and 0.1 N (USP grade, VWR, Canada). The first NaOH concentration was used

for increasing the value of pH at approximately 5.0. The 0.1 N NaOH level was used to

adjust the pH value from 5.0 to 5.5. Whey protein isolate solution was adjusted to pH value

to 6.5 with lactic acid 10% (w/w) (Food grade, Fisher Scientific, Ottawa, Ontario). Mains

solutions were weighted (WPI (2.0%): pectin (0.5%)) and distilled water were added to

reach final ratio of 4:1. The mixed solution was left two hours at room temperature with

gentle magnetic stirrer. Whey protein isolate-pectin solution was already done. For the

formation of complexes, the pH was gradually decreasing with lactic acid at 10% to reach a

final pH of 4.5. Mixtures were left at 4°C until utilisation.

99

5.2.3. Yoghurt milk preparation Two types of stirred yoghurts were made with stabilizers at 0.1% as pectin level: unheated

WPI-pectin complexes (UHC) and a solution of WPI-pectin without complexe formation

(SWP). Yoghurt formulations were standardised at 1.0 % of fat, 4.0 % of total protein, and

16.5 % of dry matter. Despite total protein was controlled, two various casein (CN) to total

protein (TP) ratios were studied: 55 and 70%. A CN to TP ratio of 55% was approximately

constituted of 50% of casein and 50% of whey proteins. The higher ratio contained a

greater concentration of casein. Each recipe was left at 4°C overnight to allow a complete

hydration. Relative proportion of raw materials in standardised milk is shown in Table 5.1.

As CN to TP ratio increased, more SMP was added than WPC35. The amount of other

ingredients did not vary. Composition of all stirred yoghurts respected the targeted

proximate (Table 5.2). The pH of all standardised milks was about 6.38 ±0.04.

5.2.4. Strains, cultures and medium culture Commercial yoghurt culture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii

ssp. bulgaricus freeze-dried was used (611DPL, Rhodia, Madison, WI, USA). This

bacterium mix was specifically selected for its ability to produce small amount of

exopolysaccharides (EPS) to avoid that difference of rheological properties between

yoghurts was due to EPS prduction. Main culture was prepared with a reconstituted skim

milk powder (12 % dry matter) autoclaved at 110°C/10 minutes in autoclave glass jars.

After cooling at 42-43°C, 1g/L of freeze-drying ferments was directly mixed to the

reconstituted milk to obtain a population of about Log 9 CFU/mL for streptococci and Log

8 CFU/mL for lactobacilli. Incubation was made at 42-43°C. Fermentation was stopped by

storing the main culture at 4°C overnight when pH had reached 5.3-5.5. The medium

cultures used for microbiological count was M17 selective agar medium for streptococci

and acidified Man Rogosa Sharp (MRS) medium for lactobacilli (Difco, Detroit, Mich,

USA). Microbiological population, in starter culture, was Log 8.8 ± 0.06 CFU/mL for

streptococci and Log 8.1 ± 0.2 CFU/mL for lactobacilli.

100

5.2.5. Yoghurt manufacture Yoghurts were made as describe as section 3.2.5 (Chapter 3). Microbiological population,

at inoculation time, was Log 7.3 ± 0.04 CFU/mL for streptococci and Log 6.5 ± 0.02

CFU/mL for lactobacilli. All yoghurts reached the targeted pH after 3 hours and 15

minutes. Cooled to 18-20°C, fermented milks were gently stirred 10 times with stainless

tool and then, were smoothed with screw pump (Allweiller AG 0-100 L/h, Netzch,

Germany). Stirred yoghurt were filled in 175 mL pot and stored at 4°C. Production was

divided in two batches: one for rheological analysis and whey separation at day 4 and the

other, for investigation after 18 days. Yoghurt’s acidity was developed in 18 days at 4°C.

Directly after filling in containers, lactic acid percentage was 0.87 ±0.01 to reach 0.98

±0.01 at the end of storage. A decreasing of pH values was also remarked. After filling in

pots, yoghurts were at pH 4.38 ±0.008 and after 18 days of storage, pH reached 4.13

±0.008. Microbiological population did not evaluated in time. During storage, culture

remained stable: Log 8.9 ± 0.02 CFU/mL for streptococci and Log 8.2 ± 0.01 CFU/mL for

lactobacilli.

5.2.6. Analytical methods Composition of standardised milks and stirred yoghurts were determined in duplicate. Fat





Total protein, non-casein nitrogen, non-protein nitrogen, caseins and whey proteins were

calculated as describe as section 3.2.6 (Chapter 3). Casein and total protein contents of raw

creams and milks were performed by infrared analyser using Fourier transform infrared:

FT-120 (Foss North America, MN, USA). Titratable acidity and pH were measured by

official standard methods (AOAC, 2000).

101

5.2.7. Rheological measurements and whey separation Hardness was quantified after 4 and 18 days by using a TA-TX2 texture analyser (Texture

Technologies Corp., Scarsdale, NY). Analyses were made 5 times for each type of yoghurt

at 4°C. The plunger used was cylindrical, with a flat base of 25 mm diameter, moving at a

speed of 1mm/s (Hess and al, 1997). Maximum peak force (N) at a displacement of 10 mm

was recorded as firmness (N/m2). The rheological properties of yoghurts were made with a

dynamic stress rheometer using a bob and a cup (Rheometric, Model SR-2000, TA

Instrument, New Caslte, DE, USA). All measurements were performed at 4°C after 4 and

18 days of storage in duplicate. Samples were directly taken from the pots with the stainless

cylinder. A steady stress sweep test with a shear stress of 1.0 to 1.00 Pa was used to

calculate apparent viscosity at a constant shear rate of 10s-1 (Everett and McLeod, 2005).

Dynamic stress sweep test was used to determine the region of linear viscoelasticity of

yoghurt under an oscillatory of 1Hz and at an increasing stress from 0.02 to 30 Pa (Everett

and McLeod, 2005). Storage (G’) and loss (G’’) moduli were measured at 1 Pa, in the

linear region of viscoelasticity of yoghurt, functions of frequency in range of 0.1 to 10 Hz.

To transfer yoghurt in centrifuge tubes without minimal disruption of gel, a home made

stainless cylinder was used. Samples (25-27g) were centrifuged at 1900 X g for 20 minutes

at 4°C (Keogh and O’Kennedy, 1998). The clear supernatant was poured off, weighed and

recorded as syneresis (%). Measurements were made in duplicate.

5.2.9. Microscopy Prior microscopic visualisations, yoghurts (1 day ageing) were lyophilised. Frozen samples

(-20°C) were sliced in a section of 5 cm x 5 cm x 3 cm (length x width x height) and placed

in glass Petri dishes. Samples were left in freeze-dryer during 48 hours at -40°C (Dura-Stop

UP, Tray Dryer FTS systems, USA, New-York). A scanning electron microscopy (SEM)

was used to examine the structure of the protein network in acid gels (S-3000N, Hitachi,

Japan). The samples were coated by gold using the sputtering method (Marivac, Quebec,

Canada) with sputter coater equipment (Marivac, Quebec, Canada) before analysis.

102

5.2.10. Statistical methods Analysis of variance, according to a factorial design, was applied to determine the effects of

type of yoghurt on fermentation parameters and yoghurt composition. However, a split-


like pH and titratable acidity, syneresis and rheological properties during the storage. Time

factor was the sub-plot. Significant differences were tested at P≤0.05. Statistical analysis

was carried out with the general linear models procedure of SAS (SAS, 1989).

5.3. Results

5.3.1. Rheological properties and whey separation The elastic (G’) and viscous behaviours (G’’) of stirred yoghurts with various CN to TP

ratios are presented in Figure 5.1 (a) and (b), respectively. CN to TP ratios, type of

stabilizers and ageing affected significantly these properties. UHC led to an improvement

of elastic and viscous characters compared to SWP, except for G’ for both ratios at day 4.

At CN to TP ratio of 55%, the values were almost the same but at 70%, storage modulus

(G’) of UHC tended to be higher, but not significant. During ageing, values of G’ and G’’

of yoghurts added with SWP did not change. Another scenario was observed for UHC:

after 18 days of storage, elastic and viscous characters increased significantly. Yoghurt

hardness is shown at Figure 5.2. Hardness was significantly affected by single factor: CN to

TP ratios (Figure 5.2 (a)) and double factors i.e. ageing and type of texturing agents (Figure

5.2 (b)). Increasing the casein level (55 to 70%) led to an improvement of hardness. The

strength of SWP gel was lower than the one of UHC. During the storage, hardness was

significantly improved. Apparent viscosity of stirred yoghurts is shown in Figure 5.3(a).

CN to TP ratios and type of texturing agents influenced significantly this rheological

property despite time was not significant. At a ratio of 55%, there was no significant

different between SWP and UHC. However, with a ratio of 70%, the UHC had significantly

higher value than SWP. Ageing had no effect on apparent viscosity.

103

Whey separation was significantly increased with storage time (Figure 5.3 (b)). This

characteristic had not affected by the CN to TP ratios and the type of texturing agents.

Consequently, results have not been presented.

5.3.2. Microstructure Microstructure of stirred yoghurts at CN to TP ratios of 55 and 70% and made with UHC or

SWP is shown at Figure 5.4. Compared to acidified gels added with SWP at the two ratios

(55 and 70%), stirred yoghurts with UHC showed larger and denser aggregates. The

clusters of SWP seemed also to be spacer out than UHC. The network of UHC, at both

ratios, seemed to be more homogenous than yoghurt added with SWP. Between the CN to

TP ratios of 55 and 70%, no apparent change was remarked when SWP was used. By

opposition, CN to TP ratio of 70% resulted in bigger aggregates than a CN to TP ratio of

55% for the UHC.

104

5.4. Discussion

5.4.1. Yoghurt manufacture Standardisation step is one of the most important factors to control. The composition of

yoghurt (fat, total protein, CN to TP ratio, dry matter, addition of texturing agents) has a

major impact in the resulting quality of yoghurt (Sodini and al, 2004; Olsen, 2003; Tamine

and Robinson, 1999; Keogh, and O’Kennedy, 1998; Lucey and Singh, 1998). In this work,

stirred yoghurts had the same composition, except for the casein content as casein to total

protein ratio varied. Supplementing the milk base with casein compared to whey proteins

seems to have an effect on rheological properties and syneresis that will be more

extensively explained in further sections. Technological process as heat treatment,

homogenisation, inoculation, coagulation, cooling and storage has also an important

influence on rheological properties and serum retention ability (Sodini and al, 2004;

Tamine and Robinson, 1999; Lucey and Singh, 1998). The technological process of stirred

yoghurts was also well controlled. As a result, the variation of elastic and viscous

behaviours, hardness, apparent viscosity and whey separation between type of stabilizers

and various CN to TP ratios was not due to the yoghurt preparation i.e. making process.

5.4.2. Rheological properties and whey separation SWP and UHC had dissimilar behaviours. SWP had lower G’, G’’, hardness and apparent

viscosity values than UHC, except at CN to TP ratio of 55% after 4 days of manufacture for

G’ and apparent viscosity. These observations were contradictory to those obtained at

previous chapter: UHC showed a texture similar to a solution containing pure WPI

(Chapter 4). The composition, the pectin concentration and the technological process were

identical to those used in that work. Only CN to TP ratio used was different (65%). The

results of this chapter suggested that the difference between yoghurts added with UHC or

SWP is due to the variation of CN to TP ratios. This work underlined that CN to TP ratios

have a major impact on final characteristics of yoghurts and slight variations are sufficient.

105

Theoretically and supported by previous studies, unheated complexes (UHC), when will be

add to standardised milk (pH 6.5-6.8), should be dismantled (Bertrand, 2007; Chapter 2).

As WPI-pectin complexes exist due to electrostatic interactions, high ionic strength and pH

up to 6.0 are sufficient to destroy the interactions between the two macromolecules

(Bertrand, 2007; Tolstoguzov, 1997 and 1986; Samant and al, 1993). As a result, UHC,

when added to standardised milk, should act as a solution containing WPI and pectin

without electrostatic interactions i.e. like SWP. The differences observed between results

could be related to the conditions used in the stability test. The latter was realized in the

natural environment of complexe formation (2.5% of dry matter and low ionic strength).

This medium did not reflect the reality of milk composition with relatively high ionic

strength, presence of salts, fat and casein (Amiot and al, 2002). Assuming the fact that

complexes remained partially in milk, its use led to general enhance of rheological

properties compared to a solution containing whey protein isolate and pectin (SWP).

Some authors had determined that complexe formation between protein and polysaccharide

can lead to new functional properties compared to the macromolecules without interactions

or alone (Laneuville, 2005; Schmitt and al, 2005; Samant and al, 1993). Our previous study

has also been shown that the association of protein and anionic polysaccharide led to

increase whey protein solubility against low pH and severe heat treatment (90°C/ 2

minutes) (Chapter 2). Possible different functional properties between UHC and SWP (not

studied) could be partly responsible for this phenomenon.

Using larger casein content led to an improvement of rheological properties. Similar results

for G’ were obtained by Allmere and co-workers (1999). The G’ was positively correlated

with an increasing of casein content with a total protein values range to 3.32 to 4.06 (R2 =

0.77, P ≤ 0.05). No significant difference was found between casein content and G’’. This

difference could be due to the technological process; they have used glucono-δ-lactone to

product the acid gel. The acidification with starter is generally slower than with glucono-δ-

lactone. The acidification rate, factor influencing the rheological properties and whey

retention of acid gels, is different from bacterial cultures (Lucey and Singh, 1998).

106

The improvement of firmness with growing casein content was also observed by

Amatayakul and co-workers (2006a and b). As casein fraction plays an essential role in

matrix formation (Tamine and Robinson, 1999; Lucey et al, 1998; Lucey and Singh, 1998),

enrich the milk base with casein to moderate concentration can be beneficial for the

rheological properties. For the apparent viscosity, in literature, this property was often

measured by Brookfield viscosimeter (Guzman-Gonzalez and al, 1999; Kailasapathy and

Supriadi, 1998; Guirguis and al, 1984) and fewer studies used rheometer (Guinee and al,

1995). Moreover, results differed largely and were often contradictory. Guinee and co-

workers (1995) have found that fortified stirred yoghurt (5% total protein, 2% fat) with

whey protein concentrate (WPC) at 45% gave an improvement of viscosity compared to

those enriched with WPC 35%. In addition, stirred yoghurts fortified with skim milk

powder (SMP) i.e. superior casein content liken to those with WPC35 had given higher

apparent viscosity. On the other hand, Guirguis and al (1984) found that replacing 57% of

SMP by WPC (whey proteins-casein ratio of 0.23 compared to 0.22 with SMP), yoghurt at

16% of dry matter had 2.5 times higher Brookfield viscosity.

A specific effect of storage on rheological properties was not yet established. This

information is often partial and is included in the study. According to literature, the

presence of hydrocolloids, in milk base, could lead to an improvement of

consistency/viscosity during the ageing (Tamine and Robinson, 1999). According to our

results, only hardness was markedly affected by ageing despite the other properties did not

vary. As pectin used in complexe formation was not designed for yoghurt making, this

could explain the lack of improvement of finish product in time. During the ageing, a

spontaneous syneresis i.e. without applying an external pressure can occur (Lucey, 2001).

CN to TP ratios did not affect the amount of wheying-off (data not shown). This result was

contradictory with other studies that decreasing of casein-whey protein ratio led to greater

serum retention (Amatayakul and al, 2006a and b; Puvanenthiran and al, 2002). The latter

authors suggested that reducing the casein to whey protein ratio led to increase the

compactness of yoghurt microstructure. The denser structure could be responsible to a

higher immobilization of the free serum.

107

Whey proteins are well known as excellent water binders of water (Kinsella and

Whitehead, 1989). Visualisation of stirred yogurts cannot permit to support the observation

of Amatayakul and al (2006a and b) concerning compactness of structure.

Extensive studies showed that enriched yoghurt with whey protein such WPC reduced the

syneresis (Sodini and al, 2004; Lucey and al, 1999; Modler and al, 1983). This result was

not observed, in this work, probably due to an insufficient difference of whey protein level

between the two CN to TP ratios. There is probably an optimal or ideal CN-TP ratio that

seemed to be 70% in that study. On the other hand, a precise value or a specific range of

this optimum cannot be clearly inferred from literature data. For instance, the impact of

whey protein to casein ratio on rheological properties is relatively complex due to the

interactions with total solid, protein content and the intensity of heat treatment (Sodini and

al, 2004). Moreover, our work highlighted the importance of the choice of the right casein

and total protein content for a specific making process.

5.4.3. Microstructure Microstructure of UHC showed larger and denser clusters than SWP. As specified

previously, it was possible that some complexes remained in standardised milk. Logically,

the pectin-whey protein isolate interactions should be bigger particles than whey proteins

and pectin alone. This reasoning could partly explain the difference between the size of

clusters. For UHC, increasing the CN to TP ratios seemed to raise the dimension and the

density of aggregates. Modler and Kalab (1983) found that yoghurts enriched with sodium

caseinate compared to yoghurts made with skim milk powder and milk protein concentrate

led to the formation of acid gels with larger aggregates and greater linkages between

micelles. Consequently, the type of ingredients added to standardise milk for constant

yoghurt’s formulation has an important influence on the size of aggregates of the network.

No apparent change in the structure of SWP was remarked. The initial smaller size of

macromolecules alone compared to complexes could be a cause of this result.

108

5.5. Conclusion

The reduction of casein to total protein ratio resulted in a decrease of elastic and viscous

moduli, firmness and apparent viscosity. This effect highlighted the importance of

standardization step, especially when proteins were added. Protein types (casein or whey

protein, a mixture of it) and casein to total protein ratio should be seriously considered.

The type of texturing agents had also an important impact on rheological properties and

consequently on the microstructure of acid gels. With this study, it was concluded that

whey protein isolate-pectin complexes can be used to modify the texture of food product as

fermented milk.

Acknowledgements



and Sylvie Haché are thankfully for their technical support.

109

Table 5.1: Proportion of raw materials in yoghurt composition of SWP and UHC

CN to TP ratio (X 100) 55 70

Ingredient Proportion (g/ 100g) Skim milk 65.12 65.01 Raw cream 2.29 2.44 SMP 1.28 3.89 WPC 35 2.54 0.00911 Stabilizer 22.73 22.73 Lactose 6.04 5.93 Total 100.00 100.00

Table 5.2: Theoretical and experimental casein to total protein ratio

Theoretical CN to TP (%)

Experimental CN to TP ratio (%)

ESM*

(%) 55 55.00b 0.3454 70 69.60a 0.3454

* Error standard of the means A-B Means with the same superscript in the same row did not differ at α≤0.05.

110

55Day 4

70 55 70Day

0

100

200

300

400

500

600

700

Sto

rage

mod

ulus

(Pa)

55Day 4

70 55 7Day

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Loss

mod

ulus

(Pa)

SWP UHC

Figure 5.1: (a) Storage modulus (G’) and (b) Loss mod

a constant stress of 0.1 Pa functions of CN to TP ratio

and 18 days). Measurements were made at 4°C.

a

b

(a)

(b)

cc

e

b
b b c c c
18

0 18

uli

s (5

a

b
c
de
d
(G’’) at frequency of 1 Hz with

5 and 70%) and storage time (4

111

400

450

500

550

600

650

700

750

55 70

Casein to total protein ratio

Hard

ness

(N/m

2)

480510540570600630660690720750780

4 18

Time (Day)

Hard

ness

(N/m

2)

SWP UHC

Figure 5.2: Hardness of stirred yoghurt functions of (a) CN to TP ratios and (b) time of

storage. Measurements were made at 4°C.

(b)

(a)

112

3,1

3,4

3,7

4,0

4,3

4,6

4,9

5,2

5,5

55 70

Casein to total protein ratio

Appa

rent

vis

cosi

ty (P

a s)

SWP UHC

28,0

29,0

30,0

31,0

32,0

33,0

34,0

4 18

Time (Day)

Whe

y se

para

tion

(%)

Figure 5.3: (a) Apparent viscosity at shear rate of 0.1s-1 Hz functions of CN to TP ratios

and (b) Whey separation functions of storage time. Measurements were made at 4°C.

(b)

(a)

113

Figure 5.4: Scanning electro

TP ratios of 55% (a) and 70%

Microstructure was visualised

(a) (b)

(c)
10µm
n micrographs of stirred yoghurts added

(b) and SWP with CN to TP ratios of 5

at 5 K of magnification.

(d)

10µm
10µm 10µm
with UHC at CN to

5% (c) and 70% (d).

114

Conclusion générale

L’hypothèse de cette recherche était que l’utilisation de complexes formés d’isolat de

protéines sériques et de pectine, dans la formulation de yogourts brassés, permettrait

d’améliorer et de stabiliser les propriétés rhéologiques ainsi que de limiter la synérèse. Afin

de valider cette hypothèse, le but suivant avait été fixé : déterminer les conditions

d’utilisation des complexes dans le yogourt et valider son effet sur la texture du produit

fini. Ce dernier a été atteint : le mode d’emploi des complexes comme agent stabilisant a

été déterminé ainsi que la validation de leur impact sur les propriétés rhéologiques (fermeté,

viscosité apparente, modules de conservation et de perte) et l’aptitude à la synérèse. Les

différents objectifs visés, divisés en chapitres, ont permis d’évaluer la question soulevée :

est-ce que l’utilisation de complexes améliore les caractéristiques finales du yogourt?

La première section a permis de stabiliser les complexes formés d’isolat de protéines

sériques et de pectine suite à un ajustement de pH à 7.0 par le biais d’un traitement

thermique. Le temps de conservation des complexes a également été déterminé. Pour

réaliser cet objectif, une méthode quantitative, basée sur les différentes solubilités des

constituants, a été développée. Les diverses phases résultant d’une centrifugation ont été

dosées pour leur contenu en sucres et en azote totaux. Parmi les traitements thermiques

étudiés, ceux qui permettent de dénaturer irréversiblement les protéines sériques étaient

suffisants pour stabiliser les complexes. Par contre, la sévérité de ces couples temps-

température a engendré le démantèlement d’une certaine quantité de complexes. De plus,

lorsque le pH a été ajusté à la neutralité, une quantité de complexes a semblé se dissocier.

Tel que mentionné précédemment, la quantification de complexes résiduels demeure

impossible par le test de stabilité. Cependant, il semble qu’une certaine concentration de

complexes demeure liée. Les connaissances acquises ont permis une meilleure

compréhension de l’impact du traitement de chaleur sur la constitution des complexes. Il a

été dégagé que les solutions de pectine seules sont stables peu importe le pH et le

traitement de chaleur employés tandis qu’une solution de protéines sériques seule est

largement affectée par le pH et le couple temps-température.

115

Lorsque liées à la pectine, la solubilité de ces dernières a été améliorée. Ces informations

sont utiles pour prédire les propriétés fonctionnelles des complexes suite au traitement

thermique et subséquemment, leur potentiel d’utilisation dans des systèmes alimentaires

précis. Suite à une étude sur la durée de conservation, il a été déterminé que les complexes

non chauffés ne peuvent se conserver plus 14 jours tandis que ceux traités thermiquement

peuvent être utilisés jusqu’à 28 jours. La durée de conservation limitée des complexes non

chauffés est principalement reliée à une contamination microbiologique plutôt qu’à un

problème de stabilité.

Dans le second chapitre, le taux d’incorporation des complexes a été étudié. Une des

conclusions est que tout comme les agents stabilisants, les complexes possèdent une

concentration limite d’incorporation. Dans les concentrations utilisées, 0.1% a donné des

caractéristiques texturales améliorées comparées aux autres teneurs (0.05 et 0.2%). En

utilisant un témoin: complexes non traités thermiquement, il a été possible de déterminer

que ce dernier donnait des propriétés rhéologiques améliorées comparés aux complexes

traités thermiquement et même, à une pectine commerciale. Peu importe la concentration

ajoutée, les caractéristiques texturales des complexes chauffés ont faiblement varié. Une

sur-agrégation protéique pourrait avoir eu lieu suite à l’application d’un second traitement

de chaleur ayant pour conséquence d’empêcher la formation homogène du réseau caséique

Comme les complexes ont un impact sur les qualités finales du yogourt, il serait intéressant

de valider leur effet dans des produits ne nécessitant pas de traitement de chaleur.

Suite aux résultats de la section précédente, une question fondamentale a été soulevée. Est-

ce l’effet additif de la pectine et de l’isolat de protéines sériques non complexés qui est

responsable de l’amélioration des propriétés rhéologiques des yogourts brassés ou ceci est

dû à l’existence de complexes, dans le lait de départ, même si ces derniers n’ont pas été

stabilisés (non chauffés) préalablement? L’impact d’un double traitement thermique subi

par les complexes chauffés sur les propriétés rhéologiques de yogourts brassés a également

été étudié.

116

L’utilisation d’un mélange contenant de la pectine et des protéines de lactosérum solubles

non complexé a donné des caractéristiques texturales supérieures aux complexes non

chauffés; la rétention du sérum n’étant toute fois pas affectée. D’ailleurs, les complexes non

chauffés ont donné des résultats similaires à une solution d’isolat de protéines sériques

seule. Une explication à la dissimilitude de propriétés entre les complexes et les mélanges

non complexés pourraient être due à la différence de pH de ces derniers. Étant à pH acide

pour le complexe et à pH près de 6.3-6.5 pour les mélanges non complexés, le pH du lait de

standardisation a été affecté. Ce facteur chimique influence la formation du réseau caséique

et donc, ont un effet sur les caractéristiques finales des produits fermentés. L’absence de

traitement thermique du lait de standardisation a largement influencé les caractéristiques

rhéologiques des yogourts. Par contre, aucun effet significatif sur les propriétés finales des

yogourts additionnés de complexes chauffés ou non n’a été détectable. L’impact du double

traitement thermique subi pas les complexes chauffés n’a pu être adéquatement évalué.

L’existence de complexes, dans le lait de départ, n’a pas pu être validée.

Comme la composition et les procédés de fabrication sont des facteurs influençant les

propriétés finales du yogourt, cette dernière section a été effectuée dans le but de valider

l’effet de la variation du ratio caséines-protéines totales sur les caractéristiques texturales de

ce produit fermenté. Une teneur accrue en caséines améliore la fermeté et la viscosité

apparente. Contrairement au chapitre précédent, l’emploi de complexes non chauffés a

donné des propriétés rhéologiques supérieures à une solution de pectine et d’isolat de

protéines sériques non complexées aux deux ratios étudiés. Le ratio caséines-protéines

totales utilisé à la section précédente était de valeur intermédiaire à ceux étudiés dans ce

présent chapitre. Conséquemment, le taux de caséines versus celui des protéines totales

semble un facteur déterminant dans la fabrication de yogourts aux caractéristiques désirés.

De plus, dépendant du type d’agents stabilisants, l’impact sur les propriétés rhéologiques

du yogourt brassé diffère. Selon les résultats de cette section, il semble que des complexes

même si non stabilisés (non chauffés) persistent dans le lait de départ ayant comme

conséquence de modifier plus positivement les propriétés finales des yogourts

comparativement à une solution d’isolat de protéines sériques et de pectine non complexée

aux ratios caséines-protéines totales étudiés.

117

Perspectives de recherche

Ce travail ouvre les portes à de nombreuses voies d’étude : autant sur le plan fondamental

qu’appliquée aux aliments. Premièrement, la section sur la stabilisation pourrait être

bonifiée afin de permettre une meilleure compréhension de l’impact d’un traitement

thermique sur la stabilité des complexes soit d’en évaluer la taille avant et après traitement

thermique. L’hypothèse de la sur-agrégation des protéines sériques des complexes chauffés

(stabilisés) expliquant leur piètre habileté à améliorer les caractéristiques finales du yogourt

aurait pu être validée par la microscopie à transmission électronique. Une étude de stabilité

dans un système modèle (perméat) aurait également pu être effectuée afin de simuler

l’environnement ionique et salin du lait sans les interactions possibles avec les protéines

laitières. Cette expérimentation aurait permis de mieux comprendre le comportement des

complexes traités thermiquement ou non dans le lait de standardisation lors de la

fabrication du yogourt. Aussi, effectuer un test de stabilité sur un complexe ayant subit un

deuxième traitement thermique aurait pu permettre une meilleure compréhension des

résultats obtenus au «Chapter 3». Le taux de dénaturation protéique aurait pu être dosé afin

de d’évaluer l’impact du traitement thermique sur les protéines sériques dans le complexe

et dans les solutions de biopolymères seuls.

Au «chapter 3», un témoin yogourt sans agents stabilisants aurait permis de faciliter

l’interprétation des résultats. L’effet de cloche obtenu lors de la détermination de la

concentration optimale n’a pas permis de déterminer la teneur en complexes optimale réelle

pour le procédé de fabrication de yogourt utilisé. Il serait intéressant de refaire une

expérimentation avec des teneurs en agents stabilisants entre 0.1 et 0.2%.

Dans le «Chapter 4», une étude du processus de gélification (profil de gélification et

détermination du point de gélification) aurait été utile afin de valider l’hypothèse soulevée :

un pH différent des laits de départ influence le mécanisme de formation du réseau caséique.

118

Une visualisation microscopique par microscopie confocale à balayage laser aurait pu être

effectuée afin de visualiser les diverses structures gélifiées étudiées. Ces éléments auraient

aussi été utiles pour comparer les différents complexes et solutions de biopolymères seuls

analysés au «Chapter 2».

Comme les résultats obtenus au «Chapter 5» se sont révélés différents de ceux du «Chapter

4» concernant les propriétés texturales des complexes non chauffés versus les solutions

d’IPL et de pectine non complexés, il serait intéressant de refaire l’expérimentation de la

variation des ratios caséines-protéines totales tout en incluant le ratio utilisé antérieurement

dans les sections précédentes soit de 62%.

Une étude extensive de l’impact de la variation de divers constituants (teneur en matière

grasse, en protéines totales, minéraux) ainsi que du procédé de fabrication (variation des

pressions d’homogénéisation, du couple temps-température de traitement thermique,

température de fermentation et de refroidissement) aurait pu être menée. En effet, tous ces

facteurs et la combinaison de ces derniers influencent considérablement les qualités finales

des produits laitiers fermentés.

L’étape d’addition des complexes dans le procédé de fabrication des yogourts brassés aurait

pu être modifiée. En concentrant les complexes par ultrafiltration, par exemple, ce mélange

aurait pu être ajouté à l’étape réservée à l’ajout des pâtes de fruits. En effet, comme le pH

des yogourts brassés à ce stade est près de pH 4.4-4.6, les complexes auraient été en

condition de complexation. Conséquemment, l’étape préliminaire de stabilisation des

complexes n’aurait pas été requise.

Finalement, l’utilisation de complexes stabilisés ne semble pas être adéquate dans des

produits alimentaires devant subir un traitement thermique comme le yogourt brassé. Par

contre, les complexes pourraient être bénéfiques pour modifier les propriétés d’aliments

prêt-à-manger. Une application alimentaire future pourrait aussi être dans le fromage

cottage où une sur-agrégation protéique est requise.

119

Appendice A. Protocole de formation des complexes d’isolat de protéines sériques et de pectine But : Fabriquer les complexes à 2,0 % de poudre d’isolat de protéines de lactosérum et de 0.5

% de poudre de pectine faiblement méthylée.

Matériel : Pectine (CpKelco, Danemark) Isolat de protéines de lactosérum (Davisco, USA) Acide lactique de grade alimentaire à 10 % Hydroxyde de sodium à 0.1 et 0.5N Eau distillée Bain marie à 90°C, Multiplaque agitatrice Chambre réfrigérée à 4°C, Thermomètre, Chronomètre PH-mètre, Tampon pH 4 et 7 Manipulations : Jour 1 : Formation des solutions mères de PEC et IPL Solution mère de PEC à 1.5 % (p/p) de poudre

Peser la quantité de pectine requise Dissoudre peu à peu la pectine dans l’eau déionisée sous une forte agitation magnétique

pour permettre une hydratation adéquate (Exemple de calcul 1.1) Faire un traitement thermique de 85°C pendant 1 minute sur une plaque chauffante afin

d’assurer une dissolution complète Laisser refroidir à la température de la pièce sous agitation magnétique (2h00) Laisser reposer toute la nuit à 4°C sous agitation magnétique

Exemple de calcul 1.1 Une solution de 1.5 % (p/p) de PEC pour un poids final de 150 g. 1.5 g 100 g X 150 g Où X donne 2.5 g de PEC dans 147.75 g d’eau distillée

120

Solution mère d’IPL à 16 % (p/p) de poudre Dissoudre peu à peu l’IPL dans l’eau avec une agitation magnétique suffisante pour

permettre une hydratation adéquate tout en évitant la formation de mousse : dénaturation des protéines

Laisser agiter lentement à la température de la pièce pendant 2 heures (éviter la formation de mousse dans la solution)

Laisser reposer toute la nuit à 4°C sous agitation magnétique Jour 2 : Formation des complexes PEC (0.5%)/IPL (2.0%) et application d’un traitement thermique aux complexes

Sortir les solutions mères de la chambre réfrigérée, laisser revenir à température de la pièce sous agitation magnétique (2h00)

Ajuster le pH de la PEC à 5.5 ± 0.05 avec du NaOH Ajuster le pH d’IPL à 6.5 ± 0.05 avec de l’acide lactique de grade alimentaire Peser les quantités (±0.01) de PEC, d’IPL et d’eau millipore pour former un complexe

de concentration désirée : 2.0 % IPL et 0.5 % PEC (Exemple de calcul 1.2) Ajuster au pH désiré ± 0.05 unité de pH avec de l’acide lactique à 10 % Laisser reposer sous agitation magnétique pendant 1 heure afin de stabiliser les

solutions Transférer les solutions dans des tubes de 40 mL en verre Faire le traitement thermique de 90°C pendant 2 minutes Laisser revenir à la température (1h) en refroidissant dans l’eau glacée Remonter le pH des solutions à pH 7.0 Laisser à 4°C sous agitation magnétique pendant toute la nuit

La dénaturation des protéines avant formation des complexes contribue à la formation d’agrégats de trop grandes tailles (Sanchez et Paquin, 1997).

La concentration d’IPL de 2.0 % a été choisie puisqu’une concentration supérieure en protéines sériques forme un gel lors de l’application du traitement thermique (Bertrand, 2007).

Exemple de calcul 1.2 Un complexe d’IPL/PEC (2.0/0.5) pour un poids total de 250 g

Pour la PEC

Solution mère de 1.5 % Facteur de dilution (F.D.) de 3 Complexe de 0.5 % 250 g / 3 (F.D.) = 83.30 g de pectine 1.5 %

Pour l’IPL

Solution mère de 16 % Facteur de dilution (F.D.) de 8 Complexe de 2.0 % 250 g / 8 (F.D.) = 31.25 g d’IPL 16 %

121

Appendice B. Protocole du test de stabilité But: Vérifier la stabilité des complexes pectine-isolat de protéines de lactosérum vis-à-vis une

remontée de pH à la neutralité.

Description de la méthode de validation de la stabilité: Cette méthode est basée sur les

différentes de solubilité des constituants. Suite à une centrifugation de 17 000 RPM pendant

1h30 à 20-30°C, diverses phases sont obtenues. Ces dernières sont isolées, puis dosées pour

finalement en faire un bilan protéique et en pectine.

Hypothèse : Après centrifugation trois phases distinctes et un culot ont été formées (voir

figure ci-dessous). La phase supérieure soluble est constituée principalement de pectine libre, la

seconde est de la pectine complexée, la troisième, phase peu soluble, est formée de pectine

complexée (en présence ou non de solution contenant des complexes insolubles) et le culot est

constitué de protéines sériques dénaturées.

Figur

obtenu

Phase 1 : Pectine libre

Phase 2 : Pectine complexée (Complexe soluble)

Ce dosage permettra de faire un bilan de la quantité de pectine dans les diverses phases. Il s’agit d’un moyen d’évaluer la stabilité des complexes.

e B.1. : Représentation schématique, dans tube à centrifugation, des diverses phases

es après centrifugation de la solution complexée.

Culot : Protéines de lactosérum dénaturées

Phase 3 : Pectine complexée (Complexe insoluble)

122

Problématique : Les protéines interfèrent dans la méthode de phénol-sulfurique (Dubois et al,

1956). Le dosage de la teneur en protéines serait une alternative. Par contre, la pectine contient

3.00% d’azote. L’alternative proposée est de doser la pectine en utilisant une courbe standard

de pectine/IPL au même ratio que le complexe soit 1:4, respectivement.

Matériel :

Pectine (Cp Kelco, Danemark), Isolat de protéines de lactosérum (Davisco, USA) Phénol redistillé ou 99+% de pureté (Laboratoire Mat, Canada), Acide sulfurique concentré Eau distillée, Balance à 4 chiffres, Vortex, Bain-marie, Hotte chimique, Gant résistant aux acides, Spectrophotomètre Visible EL-808 (Biotek Instruments, USA) Centrifugeuse Beckmann J2-21 (Rotor JA-18, Beckman Coulter, California, USA) Tube en verre jetable (16 X 125 mm), Micropipettes (100 µL, 1000 µL et 10000 µL) Tube à centrifuger transparent de 50 mL (Nalgène), Plaques à 96 puits Manipulations :

Élaboration du réactif

1. Ajouter 190 g d’eau déionisée à 10 g de phénol redistillé (5 %). La solution doit être conservée à l’abri de la lumière au frigo pour une longue conservation.

Élaboration de la courbe standard d’isolat de protéines de lactosérum et de pectine au ratio de 2.0/ 0.5, respectivement (973.6 à 4868 µg/mL)

1. Préparer une solution mère d’IPL à 16 % (p/p) 2. Laisser hydrater 2 heures à la température de la pièce sous agitation magnétique 3. Laisser la solution toute la nuit à 4°C sous agitation magnétique 4. Préparer une solution mère de pectine à 1.5 % 5. Faire un traitement thermique de 85°C pendant 1 minute 6. Laisser revenir la solution à la température de la pièce sous agitation magnétique 7. Laisser la solution toute la nuit à 4°C sous agitation magnétique 8. Ajuster le pH des solutions mères à 6.5 pour l’IPL et 5.5-6.0 pour la pectine 9. Mélanger les deux solutions à un ratio de d’un 2.0 % d’IPL et de 0.5 % de PEC 10. Laisser agiter la solution environ 30 minutes sous agitation magnétique (cette solution

peut se conserver 1 semaine à 4°C) 11. Faire une dilution de 10 fois (F.D. de 10) pour un volume total de 10 mL (1000 µL du

mélange dans 9000 mL d’eau dd) 12. Bien agiter au vortex avant utilisation 13. Faire les standards en triplicata (Tableau B.1.)

123

Tableau B.1. : Standards du mélange IPL/PEC

Numéro d’échantillon

Concentration (µg/mL)

Facteur de dilution

µL de solution mère

µL d’eau déionisée

Blanc - - 0 400 Std 1 973.6 5 80 320 Std 2 1497.2 2.5 160 240 Std 3 2920.8 1.67 240 160 Std 4 3894.4 1.25 320 80 Std 5 4868.0 1 400 0

Préparation des échantillons

1. Faire les dilutions des échantillons en triplicata (Tableau 2) 2. Bien agiter au vortex 3. Ajouter 400 µL de phénol 5 % dans chacun des tubes (sous la hotte) 4. Ajouter 2 mL d’acide sulfurique (Attention : l’acide doit être ajouté au centre du

tube et non sur les parois afin d’obtenir une bonne homogénéité de la réaction) 5. Attendre 10 minutes, puis agiter tous les tubes au vortex 6. Attendre 30 minutes 7. Bien agiter au vortex 8. Transférer 200 µL des solutions dans les puits de la mutiplaque 9. Lire l’absorbance à 490 nm pour les hexoses

Référence:

Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. and Smith, F., 1956, Colorimetric

method for determination of sugar and related substance, Analytical Chemistry, 28: 350-

356.

124

Appendice C. Étude préliminaire : Stabilisation des complexes à base d’isolat de protéines sériques et de pectine à pH 4.5 et 5.0 à une remontée de pH à 7.0 par l’application d’un traitement thermique de 90°C/2 min.

C.1. Introduction En milieu aqueux et selon des conditions spécifiques, les protéines chargées négativement

et les polysaccharides chargés positivement peuvent se combiner via des liaisons de faibles

énergies. Les propriétés fonctionnelles résultant de la formation de ces complexes sont

souvent différentes de celles des biopolymères purs (Kruif et Tuinier, 2001; Tolstoguzov,

1991). Les complexes électrostatiques sont influencés par plusieurs facteurs intrinsèques :

charge, conformation, poids moléculaire et environnementaux : ratio protéines-

polysaccharides, teneur en solides totaux, force ionique, pH, température (Turgeon et al,

2003; Laneuville et al, 2000). Ce type de complexation est réversible (Tolstoguzov, 1986

and 1997). Par exemple, une quantité élevée en solides totaux, une forte force ionique ou

un pH au dessus du point isoélectrique des protéines peut suffire à détruire les interactions

entre les macromolécules.

Dans le domaine alimentaire, les complexes électrostatiques peuvent diminuer la sensibilité

des protéines aux ions de calcium et de modifier la texture des aliments par gélification ou

texturisation de la protéine (Samant et al, 1993). Une application actuellement connue est

l’utilisation d’un complexe d’isolat de protéines de lactosérum-gomme de xanthane comme

substitut de la matière grasse (Laneuville, 2005). De plus, les propriétés moussantes

améliorées de complexes d’isolat de protéines de lactosérum-gomme arabique ont justifié

des applications dans les sorbets glacés (Schmitt et al, 2005). Cependant, l’emploi de

complexes de protéines-polysaccharides, dans des systèmes laitiers acides tels que les

yogourts, n’a pas encore été étudié.

125

Avant d’approfondir cette application, une problématique s’imposait: stabiliser les

complexes électrostatiques développés par notre équipe à une remontée de pH près de la

neutralité afin de les incorporer à l’étape de standardisation des laits dans la fabrication de

yogourts. L’hypothèse posée est que l’application d’un traitement thermique permettra la

stabilisation des complexes électrostatiques. Certains auteurs affirment que l’application

d’un traitement de chaleur pourrait permettre une stabilité accrue (Sanchez et Paquin, 1997;

Samant et al, 1993; Tolstoguzov, 1986). Normalement, les complexes sont formés à

température ambiante. Lors de l’application d’un traitement thermique, une dénaturation

plus ou moins poussée de protéines est induite dépendant du couple température-temps.

Lorsque dénaturée, cette macromolécule expose de nouveaux sites libres chargés. La

résultante est la formation de complexes plus stables, vue l’augmentation du nombre

d’interactions hydrophobes et liaisons hydrogènes (Tolstoguzov, 1997; Samant et al, 1993).

Le but de cette étude était de stabiliser des complexes d’isolat de protéines sériques et de

pectine à pH 4.5 et 5.0 suite à une remontée de pH près de la neutralité par l’application

d’un traitement thermique intense de 90°C pendant 2 minutes.

C.2. Matériels et Méthodes

C.2.1 Matériels La pectine faiblement méthylée ont été obtenue de chez Cp Kelco (Lille Skensved,

Denmark). Cette macromolécule possède un degré d’estérification de 30 % et d’amidation

de 19 % (X-917-02). Ce polysaccharide a été extrait de la pelure de citron. L’isolat de

protéines de lactosérum a été acheté de Davisco Foods (Bipro, US, USA).

C.2.2. Formation des complexes d’isolat de protéines sériques et de pectine Une solution mère de 1.5% (p/p) de pectine a été effectuée en dissolvant la poudre dans de

l’eau distillée à l’aide d’une agitation magnétique. Pour assurer une dissolution complète,

un traitement thermique 85°C pendant 1 minute a été réalisé. Une solution mère de 16%

(p/p) d’isolat de protéines sériques a été faite à partir de la poudre dissoute dans de l’eau.

126

Le mélange a été agité doucement, pendant 2 heures, à l’aide d’un agitateur magnétique

pour assurer la complète hydratation. Les deux mélanges ont été entreposés sous agitation

magnétique à 4°C toute la nuit. Avant la formation des complexes, les solutions mères sont

laissées à la température de la pièce afin d’équilibrer leur température. Une fois à une

température de 20-23°C, la solution de pectine a été ajustée entre pH 5.5-6.0 avec du NaOH

à 0.5 et 0.1 N (Grade USP, VWR, Canada). La première concentration a été utilisée pour

augmenter le pH à 5.0 et la seconde pour le pH de 5.0 à 5.5-6.0. La solution mère d’isolat

de protéines sériques a été ajustée à pH 6.5 avec de l’acide lactique à 10% (p/p) (Grade

alimentaire, Fisher Scientific, Ontario). Les solutions mères ont été pesés et l’eau distillée a

été additionnées pour atteindre un ratio final de 4: 1 (isolat de protéines sériques (2.0%):

pectine (0.5%)). Le mélange a été laissé pendant 2 deux à la température ambiante sous

douce agitation magnétique. La formation des complexes a été effectuée par descente

graduelle du pH avec de l’acide lactique à 10% à pH 5.0 ou 4.5. Les complexes développés

antérieurement sont solubles entre pH de 5.0 à 6.0 (Bertrand, 2007). La détermination des

deux pH a été effectuée, puisque sous le point isoélectrique (PI) des protéines sériques, ces

dernières agissent comme des polycations (Tolstoguzov, 1986). Un plus grand nombre

d’interactions avec le polysaccharide anionique sont formés que lorsque le pH est au dessus

du PI où ces dernières sont chargées négativement. Des interactions sont cependant

possibles puisque la pectine possède des groupements amidés. À pH 5.0, le complexe est

dit soluble tandis qu’à pH 4.5, il peut y avoir présence de complexes solubles et insolubles

(Tolstoguzov, 1986). L’étude des pH sur la stabilité a été effectuée indépendamment. Par la

suite, les complexes sont soit entreposés à 4°C (complexes non traités thermiquement :

CNTT) ou traité thermiquement à 90°C pendant 2 minutes dans un bain-marie (complexes

traités thermiquement : CTT). Ce couple temps-température a été choisi puisque ce dernier

sera employé lors du traitement thermique des laits standardisés dans la fabrication de

yogourts. Les solutions ayant subi un traitement thermique ont été rapidement mises dans

l’eau glacée pour accélérer le refroidissement. De retour à la température de la pièce, les

complexes chauffés ont été soit entreposés à 4°C ou le pH a été remonté à pH 7.0 avec du

NaOH 0.5N (complexes à pH 5.0 traité thermiquement puis pH monté à 7.0 : CTT à pH

7.0). Les mélanges ont été ensuite mis à 4°C.

127

C.2.3. Test de centrifugation : Dosage de la teneur en sucres totaux et en azote total des diverses phases Cette méthode est basée sur les différentes solubilités des biopolymères (Voir Appendice

B). La pectine libre devrait se trouver dans la phase soluble supérieure. Les complexes

d’isolat de protéines sériques solubles devraient se trouver dans la phase soluble

intermédiaire. Les complexes d’isolat de protéines sériques insolubles, seulement pour les

solutions complexées à pH 4.5, devraient se retrouver dans la phase insoluble : culot. Les

protéines de lactosérum libres et dénaturées devraient également être dans le culot. Afin de

forcer la séparation des différents constituants, une centrifugation de 17 000 RPM pendant

1h30 entre 20-30°C a été utilisée (Beckmann J2-21, Rotor JA-18, Beckman Coulter,

Californie, USA). Des échantillons en duplicata ont été centrifugés afin d’obtenir des

quantités suffisantes pour les dosages. Les phases ont été soigneusement séparées à l’aide

de pipette jetable en plastique de 5 mL. Après isolement, les teneurs en sucres et azotes

totaux de chacune des phases ont été quantifiées. Les solutions non centrifugées ont été

également dosées. La constitution des culots a été obtenue par différence. Pour la

quantification, la teneur en azote total a été effectuée par la méthode de Kjeldahl (AOAC,

2000). Ce facteur a été choisi en raison des interférences causées par la présence mineure

de groupement amidé sur la pectine. Concrètement, la pectine amidée apportait 0.015g

d’azote par 100g de complexes comparativement à 0.2878g pour les protéines sériques. La

teneur en sucres totaux a été dosée par la méthode de colorimétrie de Dubois (Dubois et al,

1956). Les échantillons traités ont été lus à 490 nm avec un spectrophotomètre dans le

visible (EL-808, Bio-tek Instruments Inc., Vermont, USA). Une solution étalon contenant

0.5% de pectine et de 2% d’isolat de protéines sériques sans ajustement de pH a été utilisée

comme standard afin de minimiser les interférences des protéines sériques dans ce dosage

colorimétrique. Les protéines du lactosérum donnaient une teneur en sucres totaux de

0.016g par 100g de complexes tandis que la pectine apportait 0.47g de sucres totaux. Afin

de valider la stabilité des complexes après traitement thermique et une remontée de pH à

7.0, le ratio sucres totaux-azotes totaux a été calculé. Le rapport désiré est de 1.6 (0.486g de

sucres totaux et de 0.3028g d’azote total).

128

C.2.3. Analyse statistique L’analyse de la variance a été effectuée selon un plan entièrement aléatoire afin de

déterminer la stabilité des complexes suite à un traitement thermique et une remontée de pH

à 7.0 par rapport à un CNTT. Les différences significatives ont été testées à P≤ 0.05.

L’analyse statistique a été effectuée avec la procédure du modèle linéaire général de SAS

(SAS, 1989).

C.3. Résultats et Discussion

C.3.1. Complexes à pH 5.0 La teneur en sucres totaux et azote de même que le ratio sucres totaux-azote total des

diverses phases solubles et insolubles (culot) sont représentées aux tableaux A.1.1. à A.1.4.

Le facteur principal : condition (CTT pH 5.0 ou pH 7.0 et CNTT pH 5.0) a été significatif.

Tel que mentionné précédemment, la méthode de validation de la stabilité des complexes

était basée sur les différentes propriétés de solubilité des biopolymères seuls et associés.

Les complexes non traités thermiquement (pH 5.0), lorsque centrifugés à haute vitesse,

demeuraient sous forme soluble (Tableaux A.1.1. à A1.4.). En effet, deux phases solubles,

représentant environ 98% du poids total, ont donné respectivement un ratio de 1.9 et 1.6.

De plus, peu de culot a été formé représentant que 1.13 g du poids total sur 100g de

complexes centrifugés (Tableau A.1.4.). Des impuretés provenant des poudres de pectine et

de l’isolat de protéines sériques peuvent être à l’origine de cette minime fraction insoluble.

Lorsque qu’un traitement thermique a été appliqué aux complexes (CTT), la phase soluble

supérieure (PSS) est demeurée du même ordre de grandeur que le CNTT. La teneur en

sucres totaux n’était pas significativement différente, mais la quantité d’azote a chuté

d’environ 7 fois. Conséquemment, un ratio 10 fois plus élevé a été noté. Un scénario

similaire, pour la teneur en azote, a été observé pour la phase soluble intermédiaire

(PSINT). La quantité de sucres totaux de même que le poids de la phase ont été réduit

significativement. Un ratio d’environ 10 fois plus élevé a été enregistré. Une phase soluble

inférieure (PSINF) de 9.88% du poids total relativement pauvre en sucres totaux et en azote

a été trouvée. La proportion de culot a aussi significativement grossie.

129

Une quantité importante d’azote a été dosée soit environ 70% de l’azote total s’y retrouvait.

Une teneur en sucres totaux plus élevée a été également enregistrée. Le rapport a chuté pour

atteindre 3.28. Considérant la richesse du culot en azote total et un ratio significativement

plus faible, force est d’admettre, que les complexes, durant le traitement thermique, ont été

défaits. Cet effet pourrait être attribuable au changement de comportement des protéines

sériques puisque la pectine semble relativement stable à une gamme de pH de 5.0 à 7.0

ainsi qu’à l’application d’un traitement thermique intense. Ce résultat pourrait être expliqué

par la sévérité du couple temps-température utilisée et le pH de la solution complexée. Un

traitement de chaleur de plus de 75°C est suffisant pour dénaturer les protéines sériques

(Amiot et al, 2002). De plus, le pH de la solution complexée est près du point isoélectrique

des protéines du lactosérum soit 5.1 (Amiot et al, 2002). À ce pH, la charge nette de ces

macromolécules est quasi nulle favorisant ainsi l’attraction des protéines sériques. La

résultante d’un traitement thermique intense jumelé à une absence ou présence minime de

charge a été une agrégation protéines-protéines au détriment des interactions entre la

pectine et des protéines du lactosérum qui permettent aux complexes d’exister. Lorsque le

pH a été remonté à 7.0 suite au traitement de chaleur, le profil du CTT à pH 7.0, a été

similaire à CTT à pH 5.0. La PSS est de moindre proportion, mais la quantité d’azote total

a demeuré. La teneur en sucres totaux a été aussi différente. Le rapport calculé n’était pas

significativement différent que pour CTT à pH 5.0. Dans la PSINT, une proportion de poids

a été non significativement différente du CNTT. Les teneurs en sucres totaux et azote total

ont augmenté. Par contre, le ratio est demeuré non significativement différent du CTT à pH

5.0. Après analyse du culot, le poids était similaire de même que la teneur en sucres totaux

au CTT à pH 5.0. La quantité d’azote total a cependant augmenté pour atteindre près de

86%. Le ratio n’était pas significativement différent de celui du CTT à pH 5.0. Les résultats

similaires au CTT à pH 5.0 ont pu démontrer qu’une augmentation de pH à la neutralité,

sur des complexes défaits n’a pas permis une re-solubilisation des protéines sériques

agrégées. En effet, le traitement de chaleur utilisé (>75°C, Amiot et al, 2002) a dénaturé de

façon irréversible les protéines de lactosérum les rendant insolubles lors de la centrifugation

même lorsque le pH a été remonté à la neutralité.

130

C.3.2. Complexes à pH 4.5 Le poids, la teneur en sucres totaux et en azote total ainsi que le ratio sucres totaux-azote

total des diverses phases solubles et insolubles sont représentés aux tableaux A.1.5 à A.1.8.

Le facteur principal, condition, s’est avéré significatif. Dans la PSS, seule la teneur en

sucres totaux était significativement différente. Le CNTT à pH 4.5 possédait une quantité

similaire au CTT à pH 4.5. De plus, le CTT à pH 4.5 avait une valeur similaire au CTT à

pH 7.0. Aucune différence significative n’a été décelée dans la PSINT. Dans la PSINF, les

proportions des poids divergeaient : le CTT à pH 7.0 était le plus gros suivi du CTT à pH

4.5 et du CNTT à pH 4.5. Pour les dosages des constituants et le ratio, aucune différence

significative n’a été enregistrée. Aussi, les rapports sucres totaux-azote total ressemblaient

à celui théorique. Toutes les conditions possédaient la même proportion de poids, de

teneurs en sucres et azote totaux ainsi qu’un ratio près de la valeur désirée. Pour le pH 4.5,

c’était la PSINF et le culot qui contenaient des rapports près de la valeur théorique. En

effet, à pH 4.5 sous le PI, il devrait y avoir présence de complexes insolubles et solubles

(Tolstoguzov, 1997 et 1986). Par conséquent, la PSINF ainsi que le culot devraient

théoriquement comporter les complexes. Les résultats obtenus semblent supporter la

littérature.

Pour ce qui est de la viabilité des complexes, après traitement thermique, il semble que ces

derniers demeurent liés. Certains auteurs affirment que l’application d’un traitement de

chaleur pourrait permettre une stabilité accrue (Tolstoguzov, 1997; Sanchez et Paquin,

1997; Samant et al, 1993; Tolstoguzov, 1986; Imeson et al, 1977). Normalement, les

complexes sont formés à température ambiante. Lors de l’application d’un traitement

thermique, une dénaturation plus ou moins poussée de protéines est induite dépendant du

couple température-temps. Lorsque dénaturée, cette macromolécule expose de nouveaux

sites libres chargés. La résultante est la formation de complexes plus stables (Sanchez et

Paquin, 1997; Samant et al, 1993). Par exemple, une étude a été menée sur des complexes

de myoglobine ou de la sérum albumine bovine avec des polysaccharides anioniques

(alginate et carboxylmethyl cellulose) ayant subi un traitement thermique. La dénaturation

des protéines complexées a donné des complexes stables à un pH de 6.0 (Imeson et al,

1977).

131

Ces auteurs croient que cette stabilité a été causée par une augmentation des interactions

protéines-protéines.L’emploi d’un pH des solutions complexées sous le PI des protéines

sériques pourrait également avoir contribué à la formation de complexes plus stables avant

traitement thermique (Tolstoguzov, 1997; Samant et al, 1993, Tolstoguzov, 1986). En effet,

sous le pI, les protéines possèdent une charge nette positive (Amiot et al, 2002) agissant

ainsi comme des polycations. Conséquemment, le nombre d’interactions entre le

polysaccharide anionique et la macromolécule chargée positivement devrait avoir été

augmenté. Les interactions protéines-protéines pouvant ainsi avoir été grandement

diminuées contrairement aux résultats obtenus lorsque le pH était au PI. D’ajout, la

remontée du pH de la solution complexée à 7.0, après avoir été chauffée, ne semble pas

avoir détruite les interactions protéines-polysaccharides. Conséquemment, les résultats de

ces travaux ont démontré que l’application d’un traitement thermique de 90°C pendant 2

minutes stabiliserait les complexes protéines sériques-pectine à une large gamme de pH soit

4.5 à 7.0.

C.4. Conclusion L’application d’un traitement de chaleur de 90°C pendant 2 minutes n’a pas permis de

stabiliser les complexes à pH 5.0 suite à une augmentation de pH, mais un pH sous le PI

des protéines sériques a permis une stabilisation. Ces derniers seraient ainsi prêts à être

employés dans la formulation des yogourts. Par contre, une étude approfondie sur l’impact

de couples temps-température plus ou moins sévères comparée au traitement appliqué

pourrait être une avenue intéressante à explorer. Afin de permettre une meilleure

compréhension des mécanismes impliqués dans la stabilisation des complexes, des

solutions de constituants purs et contenant les deux macromolécules sans complexation

subissant les mêmes conditions devraient être étudiées.

132

Tableau C.1.1. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote total

des divers complexes étudiés pour la phase soluble supérieure

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)

Teneur azote total

(g/100 g)

Teneur en sucres totaux

(g/100g)

Ratio sucres totaux/azote

total CNTT à pH 5.0 36.15a* 0.0974a 0.184a 1.9b

CTT à pH 5.0 45.04a 0.0133b 0.221a 16.7a

CTT à pH 7.0 22.99b 0.00822b 0.120b 15.0a

* Les données avec les mêmes lettres, dans la même colonne, n’étaient pas significativement différentes

(Lsmean, alpha de 0.05, 3 répétitions).


des divers complexes étudiés pour la phase soluble intermédiaire

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)

Teneur azote total

(g/100 g)


(g/100g)


total CNTT à pH 5.0 61.75a 0.191b 0.308b 1.6b

CTT à pH 5.0 36.74b 0.0115c 0.193c 16.7a

CTT à pH 7.0 68.12a 0.0228a 0.354a 15.7a




des divers complexes étudiés pour la phase soluble inférieure

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)

Teneur azote total

(g/100 g)


(g/100g)


total CNTT à pH 5.0 Aucune phase Aucune phase Aucune phase Aucune phase CTT à pH 5.0 9.88a 0.0589a 0.0530a 0.88a

CTT à pH 7.0 Aucune phase Aucune phase Aucune phase Aucune phase * Les données avec les mêmes lettres, dans la même colonne, n’étaient pas significativement différentes


133


des divers complexes étudiés pour le culot1

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)

Teneur azote total

(g/100 g)


(g/100g)


total CNTT à pH 5.0 1.13b 0.0106c 0.0467b 4.3a

CTT à pH 5.0 6.21a 0.215b 0.0684a 0.33b

CTT à pH 7.0 5.52a 0.259a 0.0765a 0.29b

1Les constituants du culot n’ont pas été dosés, mais ont été obtenus par différence. * Les données avec les mêmes lettres, dans la même colonne, n’étaient pas significativement différentes



des divers complexes étudiés pour la phase soluble supérieure

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)

Teneur azote total

(g/100 g)


(g/100g)


total CNTT à pH 4.5 31.84a* 0.83b 0.0024a 3.4a

CTT à pH 4.5 55.61a 1.53ab 0.0022a 6.1a

CTT à pH 7.0 52.85a 2.11a 0.0029a 6.6a



Tableau C.1.6. : Poids, teneur en sucres totaux et en azote et ratio sucres totaux/azote

total des divers complexes étudiés pour la phase soluble intermédiaire

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)

Teneur azote total

(g/100 g)


(g/100g)


total CNTT à pH 4.5 33.58a 0.94a 0.0030a 3.1a

CTT à pH 4.5 22.45a 0.94a 0.0029a 4.4a

CTT à pH 7.0 Aucune phase Aucune phase Aucune phase Aucune phase



134


des divers complexes étudiés pour la phase soluble inférieure

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)


(g/100g)

Teneur azote total

(g/100 g)


total CNTT à pH 4.5 22.47b** 1.18a 0.0076a 1.5a

CTT à pH 4.5 13.40c 1.09a 0.0076a 1.3a

CTT à pH 7.0 40.94a 1.40a 0.0087a 1.6a



**Significatif à 0.0550


des divers complexes étudiés pour le culot1

Échantillon

Poids phase*

(g/100 g)


(g/100g)

Teneur azote total

(g/100 g)


total CNTT à pH 4.5 11.17a 2.26a 0.017a 1.4a

CTT à pH 4.5 6.92a 2.40a 0.017a 1.2a

CTT à pH 7.0 5.43a 1.95a 0.018a 9.8a

1Les constituants du culot n’ont pas été dosés, mais ont été obtenus par différence. * Les données avec les mêmes lettres, dans la même colonne, n’étaient pas significativement différentes


135

Appendice D. Calcul de l’apport des diverses matières premières en protéines sériques dans les yogourts brassés pour les diverses concentrations en équivalent pectine étudiées (voir « Chapter 3 »)

a) Dosage de la teneur en protéine totale, azote non protéique et caséines

Premièrement, la teneur en protéines sériques (PS), en caséines et azote non protéiques

des matières premières ont été analysée par la méthode officielle Kjeldahl (St-Gelais et

al, 1998) (Tableau D.1.).

Tableau D.1. : Teneur en protéines sériques, caséines et azote non protéique de diverses

matières premières utilisées

Teneur (%)

Matière première

Protéines sériquesa Caséines

Azote non protéique

WPI (complexes)* 89.0 0 2.0 WPC35# 32.0 0 4.0 Poudre de lait écrémé 7.06 27.90 0.74 Crème crueb 0.36 1.40 0.04 Lait écréméb 0.64 2.40 0.06

*WPI : Isolat de protéines sériques #WPC35 : Concentré de protéines sériques à 35% aTeneur en protéines sériques obtenue par différence (Protéine total-caséines-azote non protéique). b Les teneurs en protéines totales et caséines ont été obtenues par une moyenne des valeurs dosées par FT-120. Les

teneurs en protéines sériques et azote non protéique ont été calculées par différence et basées sur des proportions

théoriques (Amiot et al, 2002).

b) Quantité moyenne de chacun des ingrédients de toutes les productions

Par la suite, la quantité de matières premières a été calculée dans chacune des recettes pour

toutes les productions (Tableau D.2.). Une moyenne des triplicatas des recettes a été

effectuée.

136

Tableau D.2. : Quantité moyenne de chacun des matières premières de toutes les

productions

Concentration en équivalent pectine (%) 0.05 0.1 0.2 Matière première

Quantité (g) Lait écrémé 3457.05 2922.18 1814.76 Crème crue 125.93 110.13 117.91 Poudre de lait écrémé 73.01 125.33 227.47 WPC 35 84.34 57.07 5.10 WPI (Complexes) 511.25 1022.81 2045.32 Lactose 249.32 262.48 288.99 Total 4500.90 4500.00 4499.55

c) Apport en protéines sériques des diverses matières premières

Le calcul de l’apport en protéines sériques des divers ingrédients s’effectue de la manière

suivante :

Teneur en protéines sériques de la matière première (Tableau D.1.) X Quantité utilisée

(Tableau D.2.); le tout étant divisé par la quantité totale de la recette soit 4 500 g.

Les résultats sont représentés au Tableau D.3. Pour le calcul du WPI dans les complexes,

les étapes suivantes ont été suivies :

1) Dans le complexe, l’isolat de protéines sériques est à 2%. Dans cette quantité, il y a

89% de protéines sériques (Tableau D.1.) ce qui équivaut à 1.78 % de protéines

sériques.

2) Par exemple, à une concentration de 0.05% de pectine, 511.36 g (Tableau D.2.) de

complexes est ajouté. La quantité totale de recette est de 4500 g. En multipliant la

teneur en protéines sériques du complexe (1.78%) par le facteur de dilution

(511.36g/4500g=0.1136) ont obtient la teneur en protéines sériques de l’isolat de

protéines sériques de 0.2023 g. Pour les concentrations de 0.1 et 0.2%, les teneurs

en protéines sériques sont 0.4045 et 0.8081 g, respectivement (Tableau D.3.).

137

Tableau D.3. : Apport en protéines sériques des diverses matières premières

Concentration (%) en équivalent pectine Matière première 0,05 0,1 0,2 Lait écrémé 0,4917 0,4156 0,2581 Crème 0,0101 0,0088 0,0094 PLÉ 0,1145 0,1966 0,3569 WPC35 0,5998 0,4058 0,0363 WPI (Complexes) 0,2023 0,4045 0,8091 Lactose 0 0 0 Total (PS) 1,4183 1,4314 1,4698 Grand total 3,9695 3,9865 4,0104

d) Proportion de protéines sériques aux concentrations étudiées

Comme le ratio protéines sériques-protéines totales a été standardisé, la teneur en protéines

sériques ne varie pas en fonction de la concentration. Pour toutes les quantités en équivalent

de pectine, la teneur en protéines sériques se situe à 1.42-1.47% (Tableau D.3.). Pour

calculer la proportion, la teneur en protéines sériques en gramme est divisée par la teneur

total en protéines sériques puis multipliée par 100. Les résultats se retrouvent sous forme

de figure à la section « Chapter 3 : Figure 3.1. »

138

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UTILISATION DE COMPLEXES FORMÉS DE PECTINE ET D'ISOLAT … · 2018-04-14 · Les complexes non...

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