UNIVERSITE PARIS-XII

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THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XII Discipline : Sciences de la vie et de la santé

présentée et soutenue publiquement par

Christiane BERGMAN-COPIE

le 19 décembre 2003

Titre

IDENTIFICATION DES MARQUEURS MOLECULAIRES

SPECIFIQUES DES LYMPHOMES A GRANDES CELLULES B

PRIMITIFS DU MEDIASTIN

___________

Directeur de thèse

Docteur Karen Leroy

_________

JURY Madame le Professeur Florence Cymbalista Rapporteur

Madame le Professeur Nicole Brousse Examinateur

Monsieur le Professeur Georges Delsol Rapporteur

Monsieur le Docteur Fréderic Davi Examinateur

Monsieur le Professeur Jean-Pierre Farcet Président du Jury

2

à Xavier,

à mes enfants Alban, Alice et Thomas,

à mes parents,

3

Je remercie,

Monsieur le Professeur Jean-Pierre Farcet

qui me fait l’honneur de présider cette thèse,

Madame le Professeur Florence Cymbalista

Monsieur le Professeur Georges Delsol

qui me font l’honneur d’être rapporteurs de cette thèse,

Madame le Professeur Nicole Brousse

Monsieur le Docteur Frédéric Davi

qui me font l’honneur d’être examinateurs de cette thèse,

Veuillez trouver ici l’expression de ma plus sincère gratitude.

4

A Madame le Docteur Karen Leroy,

Ce travail est le fruit d’une longue collaboration. Il n’aurait pas été possible sans l’aide

constante que tu m’as apportée. J’ai apprécié ta rigueur et tes critiques constructives. Je te

remercie tout particulièrement pour avoir dirigé ce travail et pour ton amitié.

5

A Monsieur le Professeur Philippe Gaulard,

Tu m’as communiqué ta passion de l’hématopathologie. Le temps manque au quotidien

pour te dire combien j’apprécie la qualité de ton enseignement. Je te remercie pour m’avoir

fait confiance, pour avoir initié ce travail et pour ton soutien constant.

6

A Monsieur le Professeur Serge Zafrani,

Permettez-moi de vous remercier pour votre accueil dans votre service qui a permis la

réalisation de cette thèse.

7

A Monsieur Paul-Henri Roméo,

Mon séjour dans ton unité restera pour moi une expérience fondamentale dans ma

formation professionnelle et je t’en remercie.

8

Je tiens à remercier aussi tout particulièrement

Madame Marie-Laure Boulland pour sa collaboration efficace, son aide à la préparation de

ce manuscrit et son amitié,

Madame Anne Plonquet pour sa participation à ce travail,

Madame Flavia Castellano pour son aide et son amitié,

Mes collègues cliniciens, Madame le Professeur Corinne Haioun, Madame le Docteur

Marine Divine, Monsieur le Professeur Felix Reyes, et Monsieur le Docteur Karim

Belhadj, pour leur collaboration de tous les jours et leur amitié,

Monsieur le Professeur Möller, Monsieur le Professeur Martin Dyer, et Monsieur le

Docteur Miguel Alonso, pour nous avoir donné les outils indispensables à la réalisation de

cette étude,

Mes collègues de l’unité U474, Madame Marie-Antoinette Vinit, Madame Marie Cambot,

Madame Leïla Maouche-Chrétien, pour leur amitié et leur aide précieuse,

Madame Jeanine Marquet pour son aide en culture cellulaire,

Madame le Docteur Hélène Rouard pour ces conseils précieux qui m’ont fait gagner un

temps considérable,

Les techniciens du service d’Anatomie pathologique qui ont participé à ce travail et en

particulier Madame Catherine Dehoulle, Madame Yvette Geleyn et Madame Nathalie Le

Metayer,

Madame Nadine Martin pour ses conseils avisés,

Madame Marie-Pierre Bralet et Madame Homa Adle-Biassette pour leur amitié,

Tous les membres du service d’Anatomie pathologique de l’hôpital Henri Mondor.

9

TABLE DES MATIERES

I. INTRODUCTION 11

II. LES LYMPHOMES A GRANDES CELLULES B PRIMITIFS DU MEDIASTIN

19

I-1. Aspects cliniques 20

I-2. Aspects morphologiques 21

I-3. Caractéristiques immunohistochimiques des LBPM 22

I-4. Les LBPM et les gènes des immunoglobulines 26

I-5. Caractéristiques moléculaires des LBPM 27

I-6. Anomalies cytogénétiques des LBPM 30

I-7. LBPM et stade de différenciation 32

I-8. Les lignées dérivées des LBPM : Karpas 1106 et MedB-1 36

I-8.1. La lignée Karpas 1106 37

I-8.2. La lignée MedB-1 38

I-9. Traitement et pronostic des LBPM 43

III. LES LYMPHOCYTES B THYMIQUES 49

III-1. Arguments en faveur de l’origine B thymique des LBPM 50

III-2. Les lymphocytes B thymiques (LBt) chez l’homme 50

III-2. 1. Morphologie du thymus 50

III-2.2. Distribution et caractéristiques morphologiques des LBt 53

III-2.3. Immunophénotype des LBt 55

III-2.4. Caractéristiques génotypiques des LBt 59

III-2.5. Caractéristiques fonctionnelles 61

III-2.6. Conclusion 62

III-3. Les lymphocytes B thymiques chez la souris 63

III-3.1. Cinétique des thymocytes 63

III-3.2. Lymphopoïèse B intrathymique 64

III-3.3. Caractéristiques fonctionnelles des lymphocytes B thymiques 67

III-3.4. Fonction des lymphocytes B thymiques. 67

III-3.5. Conclusion 67

10

IV. ETUDE COMPARATIVE DES LBPM ET DES LGCB NON MEDIASTINAUX

PAR LES METHODES D’ANALYSE DIFFERENTIELLE 69

IV-1. Objectifs de l’étude. 70

IV-2. Principe des techniques 71

IV-2.1. Principe de la méthode du Differential Display Reverse Transcription 71

IV-2. 2. Principe de la méthode du Representational Difference Analysis 73

IV-3. Le gène MAL et les LBPM 77

IV-3.1. Article 1 77

IV-3.2. Article 2 83

IV-3.3. Le gène MAL 89

IV-3.3.1. Le gène MAL 89 a. Clonage de l'ADNc MAL b. Organisation génomique du gène MAL c. Protéine MAL dans les différentes espèces et protéines homologues IV-3.3.2. Expression de MAL dans les système nerveux central et 93 périphérique IV-3.3.3. Expression de MAL dans les cellules épithéliales 95 a. expression de MAL dans les cellules épithéliales de rein b. expression de MAL dans les autres tissus épithéliaux IV-3.3.4. Expression de MAL dans les lymphocytes 96 IV-3.3.5. Association de MAL avec les glycosphingolipides et implications 96 fonctionnelles IV-3.3.6. MAL et la pathologie tumorale 99 a. MAL et lymphomes T cutanés b. MAL et cancer de l'œsophage IV-3.3.7. Conclusion 100

IV-4. Mise en évidence d’une activation constitutive du gène FIG1 dans les LBPM :

Article 3 101

V. DISCUSSION, CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 109 VI. BIBLIOGRAPHIE 126

11

I. INTRODUCTION

12

Les lymphomes malins non Hodgkiniens (LNHs) désignent des proliférations

tumorales dérivées des lymphocytes B, T ou NK (Natural Killer), à différents stades de

différenciation ou d’activation. L’entité anatomo-clinique définie comme « lymphome

diffus à grandes cellules B » (LGCB) est une prolifération clonale de lymphocytes B

matures et constitue un ensemble de tumeurs très hétérogènes sur le plan morphologique,

biologique et clinique. Le LGCB est le lymphome le plus fréquent de l’adulte et représente

dans les pays occidentaux près de 30 à 40% des lymphomes non-Hodgkinien (LNHs) (1).

Ce sont des lymphomes agressifs dont l’âge moyen de survenue est de 60 ans, mais les

extrêmes sont larges et des LGCB peuvent s’observer chez l’enfant. Le plus souvent, la

présentation initiale de la maladie est ganglionnaire mais dans 40% des cas, la présentation

est extra-ganglionnaire, le tube digestif étant le plus fréquemment atteint. L’évolution

clinique est très variable d’un malade à l’autre, et seuls 30 à 40 % des patients sont mis en

rémission complète durable par une chimiothérapie à base d’anthracyclines (2).

Cette catégorie histologique des « lymphomes diffus à grandes cellules B » a été

introduite en 1995 dans la classification de la REAL (a Revised European-American

classification of Lymphoid neoplasms) (3) et maintenue dans la classification plus récente

de l’OMS (4). Sur le plan morphologique, le LGCB est caractérisé par une prolifération

diffuse de cellules lymphoïdes de grande taille, dont il existe plusieurs variantes

cytologiques appelées centroblastique, à noyau multilobé, immunoblastique, anaplasique

ou encore riche en histiocytes et lymphocytes T. Cette classification morphologique est

cependant peu reproductible entre hématopathologistes, et l’absence de corrélations avec

des critères immunophénotypiques ou génotypiques distincts, ont incité en 1994 les

hématopathologistes de la REAL à les regrouper dans une catégorie unique de

13

« lymphomes diffus à grandes cellules B », tout en étant conscients que cette catégorie

regroupait des entités différentes.

Sur le plan immunophénotypique, les cellules tumorales des LGCB expriment les

marqueurs B tels que le CD19, CD20, CD22 et CD79a et les immunoglobulines de surface

et/ou intracytoplasmiques de type IgM, IgG et plus rarement IgA. Une expression de CD5

et de CD10 est détectée respectivement dans 10% et 25-50% des cas (4). Une expression

de la protéine BCL2 est détectée dans 30-50% des cas. Un réarrangement clonal des gènes

des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines est détecté dans la majorité des cas.

L’anomalie moléculaire la plus fréquemment détectée dans les LGCB est le

réarrangement du gène LAZ3/BCL6, situé en 3q27, et qui est observé dans 30 à 40% des

LGCB (5). Le gène BCL6 code pour un facteur de transcription appartenant à une famille

de protéines à doigt de zinc (6). La protéine BCL6 est normalement exprimée par les

cellules B du centre germinatif des follicules lymphoïdes et dans une sous-population de

lymphocytes T CD4+ du centre germinatif et des zones interfolliculaires (7). Elle joue un

rôle majeur dans la formation du centre germinatif (8) et son extinction semble nécessaire

pour la différenciation des cellules du centre germinatif (centrocytes) en plasmocytes (9).

Indépendamment des translocations, il a été montré récemment que les mutations

somatiques des régions régulatrices pouvaient déréguler l’expression du gène BCL6 dans

les LGCB (10).

Un réarrangement de l’oncogène BCL2 en rapport avec une translocation t(14 ;18)

est observée dans près de 20% des LGCB (11). Le gène BCL2 code pour une protéine

inhibant l’apoptose (12). Des mutations du gène suppresseur de tumeur P53 sont observées

14

dans 20% des LGCB et un petit pourcentage de LGCB présente des réarrangements et/ou

des mutations du gène c-MYC (13,14).

Les LGCB constituent un groupe de lymphomes extrêmement hétérogènes tant sur

le plan morphologique, immunohistochimique et moléculaire que sur le plan de la

présentation clinique, et de la réponse aux traitement. Il est vite apparu essentiel de

développer des outils permettant d’identifier des paramètres morphologiques,

immunologiques et/ou génétiques qui pourraient définir des groupes cliniques homogènes

et permettre une thérapeutique plus ciblée.

Dix ans après le début de l’élaboration de la REAL, où en sommes-nous dans le

démembrement de ce vaste groupe de tumeurs? Sur le plan clinique, la prise en charge

thérapeutique repose toujours sur une stratification des patients en fonction de l’Index

Pronostic International (IPI) basé sur 5 facteurs de risque : l’âge, le taux de lactate

deshydrogénase, l’indice de performance, le stade Ann Arbor et le nombre de sites

extraganglionnaires atteints. Cet index est supposé refléter la croissance tumorale et le

potentiel invasif de la tumeur, la réponse de l’hôte et la capacité du patient à tolérer un

traitement intensif (15).

Plusieurs marqueurs moléculaires pronostic individuels ont été identifiés tels que

l’expression de la protéine BCL2 ou de la survivine, qui dans les 2 cas sont associés à un

pronostic défavorable (16,17). De façon similaire, la présence de mutations de P53 et/ou la

détection immunohistochimique de P53 sont corrélés à une diminution de la survie des

patients atteints de LGCB (13,18,19).

L’apport majeur de ces dernières années est le développement des puces à ADN

(micropuces), qui de par l’analyse simultanée de l’expression de milliers de gènes

permettent une étude des processus biologiques impliqués dans le développement des

15

LGCB. L’utilisation des microarrays a permis d’avancer considérablement à la fois dans la

compréhension des mécanismes physiopathologiques responsables de l’hétérogénéité

moléculaire des LGCB, mais aussi dans la prédiction de la réponse au traitement.

Alizadeh et al ont été les premiers à analyser le profil d’expression génique des

LGCB en utilisant des puces à ADNc (Lymphochip) (20). Cette Lymphochip a été

construite à partir de 17 856 séquences d’ADNc, dont 12069 sont issus d’une librairie

d’ADNc de cellules B du centre germinatif. Deux mille trois cents trente huit ADNc

supplémentaires sont issus de librairies dérivées de LGCB, de lymphome folliculaire, de

lymphome du manteau et de leucémie lymphoïde chronique B (LLC). Enfin, ont été ajoutés

des séquences d’ADNc correspondant à des gènes induits ou réprimés lors de l’activation

de lymphocytes B ou T par des mitogènes ou des cytokines, et un ensemble de 3186 ADNc

correspondant à des gènes jouant un rôle important dans la biologie du lymphocyte ou du

cancer. Les auteurs ont analysés le profil d’expression génique de 3 types de lymphomes :

les LGCB, le lymphome folliculaire et la LLC. Les micropuces ont été cohybridées avec les

ADNc obtenus à partir de l’ARNm des échantillons à analyser et un ADNc de référence

obtenu à partir d’un pool d’ARNm extraits de 9 lignées dérivées de lymphomes ou de

leucémies. Ils ont utilisés une technique d’analyse non supervisée visant à regrouper les

lymphomes selon la similarité de leur profil d’expression génique (clustering hierarchique).

Cette étude a permis d’individualiser au sein des LGCB 2 sous-types moléculaires distincts

reflétant différents stades de différenciation: les LGCB ayant un profil d’expression

génique comparable à celui des lymphocytes B du centre germinatif des follicules

lymphoïdes (Germinal Center B-like Diffuse Large B-cell lymphoma = GCBL type) et les

LGCB ayant un profil d’expression génique comparable à celui de lymphocytes B du sang

périphérique activés in vitro (Activated B-like DLBCL = ABL type). Les résultats de cette

16

première étude suggéraient que les lymphomes type GCBL présentaient une évolution

nettement plus favorable que les lymphomes type ABL (76% en vie à 5 ans dans le premier

groupe contre 16% dans le second groupe). Les mêmes auteurs ont montré par la suite que

les LGCB type GCBL présentaient les caractéristiques attendues de lymphomes dérivés des

cellules lymphoïdes du centre germinatif des follicules lymphoïdes, du fait de la présence

de mutations somatiques avec variation intraclonale des gènes codant pour les chaînes

lourdes des immunoglobulines (21), l’expression du CD10 par les cellules tumorales, et

une translocation t(14 ;18) retrouvée dans près de 35% des cas (22). Ces caractéristiques

sont absentes du groupe des lymphomes type ABL. Ainsi, ces travaux suggèrent que la

signature moléculaire GCBL ou ABL de la tumeur, qui reflète une origine cellulaire et des

mécanismes oncogéniques différents, constitue à elle seule un facteur prédictif de réponse

au traitement.

Plus récemment, les mêmes auteurs en collaboration avec le

« Lymphoma/Leukemia Molecular Profiling Project » (LMPP) ont étendu leur analyse à

une série de 240 patients atteints de LGCB (23). Cette étude a permis d’identifier un

troisième groupe « type 3 », présentant une signature transcriptionnelle intermédiaire, où

aucun des gènes caractéristiques des groupes GCBL et ABL ne sont surexprimés. La survie

globale après une chimiothérapie à base d’anthracyclines était significativement différente

entre ces 3 groupes, les GCBL ayant une survie globale à 5 ans de 60%, contre 39% dans le

groupe de type 3 et 35% dans le groupe ABL. Les gènes dont l’expression est corrélée à la

survie ont été regroupés en 4 types de signature transcriptionnelle. Les 3 premières

signatures sont caractéristiques respectivement des lymphocytes B du centre germinatif, du

complexe MHC II et du stroma du ganglion lymphatique, et sont associées à un bon

pronostic. La quatrième signature est associée à la prolifération cellulaire et représente un

17

facteur de mauvais pronostic. Enfin, un gène a été défini de façon isolée, il s’agit du gène

BMP6 appartenant à la famille du TGFβ, et qui n’appartient à aucune des signatures

précédemment définies et dont l’expression est associée à un mauvais pronostic. Au total,

cette étude permet de construire un modèle prédictif de la survie basé sur l’analyse de

l’expression de 17 gènes.

Ces études par puces à ADN ont permis d’identifier parmi les multiples EST

présentes sur la micropuce, un gène jusqu’alors inconnu appelé HGAL (Human Germinal

center-Associated Lymphoma) dont l’expression représente un facteur de bon pronostic

(24). Les patients dont la tumeur exprime des taux élevés de transcrits HGAL présentent

une meilleure survie à 5 ans que les patients dont la tumeur exprime des taux bas d’ARNm

HGAL (survie médiane à 5 ans de 67 mois et de 33 mois respectivement). Le gène HGAL

code pour une protéine cytoplasmique de 178 acides aminés qui contient un motif

« ITAM » (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif), motif habituellement

retrouvé dans la portion intracytoplasmique des récepteurs transmembranaires et jouant un

rôle dans la transduction du signal des lymphocytes B et T. HGAL est fortement exprimé

dans les lymphocytes du centre germinatif des follicules lymphoïdes et la rate, et dans les

lymphomes dérivant du centre germinatif, notamment les lymphomes folliculaires. Son

expression est spécifiquement induite par l’interleukine 4, et son rôle exact dans la

physiologie du centre germinatif reste à définir. Comme il a été montré pour BCL6 (25),

son expression mesurée par RT-PCR est un facteur prédictif de survie prolongée.

L’expression élevée conjuguée de BCL6 et HGAL constitue un facteur de bon pronostic

(24). .

18

M Shipp et al (26) ont utilisé des micropuces constituées d’oligonucléotides (puce

Affymetrix) et une analyse supervisée dans le but de définir plus spécifiquement un profil

d’expression génique prédictif d’une bonne ou d’une mauvaise réponse au traitement. En

analysant une série de 58 patients atteints d’un LGCB et traités par une chimiothérapie de

type CHOP (cyclophosphamide, doxorubicine, vincristine, et prednisone), M Shipp et al

ont identifié un ensemble de 13 gènes permettant d’identifier les patients présentant un bon

pronostic (survie globale à 5 ans de 70%) et les patients ayant un mauvais pronostic (survie

globale à 5 ans de 12%). Ces gènes sont impliqués dans la signalisation associée au

récepteur B pour l’antigène (BCR) (PKC-β1 et PKC γ, protein kinase C β et γ), la

régulation du taux d’AMPc (PDE4B, cyclic AMP specific phosphodiestérase) et de

l’apoptose (NOR1/MINOR, Mitogen-inducible nuclear orphan receptor ), et leur expression

est indépendante de l’origine centre germinatif ou post-centre germinatif de la tumeur.

Certains de ces gènes sont toutefois utilisés dans le modèle prédictif défini par Alizadeh et

al (Alizadeh AA & Eisen MB, Nature 2000).

Au total, il est certain que l’analyse des LGCB par micropuces va permettre dans

les années qui viennent, d’une part de mieux comprendre les processus oncogéniques

impliqués dans le développement de ces lymphomes, et d’autre part de définir des sous-

groupes de patients plus homogènes permettant d’adapter au mieux la thérapeutique et de

cibler des anomalies spécifiques.

19

II. LES LYMPHOMES A GRANDES CELLULES B

PRIMITIFS DU MEDIASTIN

20

Les lymphomes à grandes cellules B primitifs du médiastin (LBPM) constituent une

entité distincte au sein des LGCB. Il s’agit d’une entité rare qui représente 2,4% des

lymphomes non-Hogkiniens (27). En 1986, Möller et al soulignent les caractéristiques

particulières de ces lymphomes qui atteignent l’adulte jeune, à prédominance féminine, se

présentent sous la forme d’une masse médiastinale, et dont les cellules tumorales

n’expriment pas d’immunoglobulines de surface. Les auteurs suggèrent alors que ces

lymphomes représentent une nouvelle entité de lymphome B (28). De 1986 au début des

années 1990, de nombreuses études ont contribué à l’identification des LBPM et ont

permis de souligner leurs caractéristiques particulières (28-34) conduisant à leur

reconnaissance officielle en 1994 comme une sous entité distincte de LGCB dans la

classification de la REAL (3) puis dans la nouvelle classification de l’OMS (4).

I-1. Aspects cliniques

Les LBPM se distinguent des lymphomes à grandes cellules B non-médiastinaux

(LGCB-NM) par leurs caractéristiques cliniques, morphologiques et moléculaires. Les

LBPM touchent l’adulte jeune (âge moyen 37 ans) avec un sexe ratio M/F de 1:2. Les

circonstances de découverte sont le plus souvent un syndrome cave supérieur (30% des

cas), une toux, une dyspnée ou une douleur thoracique en rapport avec une masse

médiastinale proéminente (>10cm) (77% des cas). Un taux de LDH supérieur à une fois la

normale est observé dans 76% des cas, mais le taux de β2-microglobuline sérique est

rarement élevé. Le bilan d’extension montre le plus souvent une maladie localisée au

médiastin antérieur avec ou non extension au creux sus-claviculaire ou aux structures

21

adjacentes comme le poumon ou la plèvre. Les localisations secondaires sont rares et sont

essentiellement extra-ganglionnaires atteignant des sites inhabituels pour un LGCB, en

particulier les reins, les surrénales, la thyroïde ou le système nerveux central. L’atteinte de

la moelle hématopoïétique est rare et n’est observée que dans 2% des cas. La majorité des

cas sont de stade Ann Arbor IE ou IIE au moment du diagnostic (27,29,35,36).

I-2. Aspects morphologiques

A l’heure actuelle, le diagnostic de LBPM repose sur des critères cliniques,

morphologiques et immunohistochimiques, mais il n’existe pas de critères histologiques

formels permettant de distinguer les LBPM des LGCB avec envahissement ganglionnaire

médiastinal.

Les LBPM sont caractérisés par une prolifération diffuse de lymphocytes de grande

taille, particuliers du fait de la présence d’un cytoplasme clair abondant et d’une fibrose

interstitielle fréquemment associée. Cette fibrose peut dans certains cas être plus dense

réalisant d’épais septa fibreux isolant des nodules tumoraux pouvant faire évoquer un

lymphome Hodgkinien classique de type scléronodulaire (29,32). La présence de cellules

claires (40% des cas) et d’une sclérose marquée (30% des cas) ne semblent pas avoir

d’incidence pronostique (36,37). Il existe des variantes cytologiques, dont certaines dites

« pléomorphes » pouvant faire évoquer un sarcome, un carcinome anaplasique ou un

lymphome Hodgkinien riche en cellules tumorales (38), mais ces variantes cytologiques

restent exceptionnelles (9 cas décrits sur une série de 120 LBPM rassemblés sur une

période de 20 ans soit 7,5%). A l’examen histologique, des reliquats thymiques peuvent

être retrouvés au sein de la tumeur, parfois associés à des kystes thymiques bordés par un

épithélium malpighien infiltré de cellules néoplasiques (30,32). Dans une série de 15

22

LBPM strictement localisés au thymus, Davis et al décrivent 7 tumeurs qui présentaient un

aspect histologique particulier du fait de la présence d’une prolifération lymphomateuse

développée essentiellement aux dépens de la médullaire thymique, refoulant le cortex et

laissant subsister en périphérie d’importantes zones de cortex thymique sain résiduel (32).

Ces descriptions histologiques constituent un argument en faveur de l’origine B thymique

des LBPM.

Il faut cependant souligner l’hétérogénéité des séries de LBPM publiées dans ces

études et encore à l’heure actuelle. Les lymphomes B à grandes cellules dits « primitifs du

médiastin » sont définis par une masse tumorale médiastinale proéminente au diagnostic et

regroupent en fait des lymphomes développés aux dépens des ganglions du médiastin et

des lymphomes développés aux dépens du thymus, et qui répondent très

vraisemblablement à des mécanismes physiopathologiques différents. Ceci explique en

partie l’hétérogénéité des résultats concernant les études immunohistochimiques et

moléculaires de ces lymphomes.

I-3. Caractéristiques immunohistochimiques des LBPM

Les LBPM présentent des caractéristiques immunophénotypiques distinctes des

LGCB non-médiastinaux qui sont résumées dans le tableau I.

23

Tableau I : Caractéristiques immunohistochimiques des LBPM comparées aux

LGCB.

Marqueurs

LBPM LGCB Références

Antigène commun leucocytaire CD45

+

+

(4)

Lymphocytaires B CD20 CD79a

+ +

+ +

(4)

Immunoglobulines S/C Chaînes lourdes µ, γ, δ Chaînes légères κ, λ

- -

+ (50-75%)

+

(4)

Molécules d’histocompatibilité HLA I/II

-/+

+

(4)

Récepteur du complément et des immunoglobulines

CD21 CD23

-

70%

-

16%

(4) (39)

Activation lymphocytaire CD30

+ (60-86%)

+ (15-24%)

(37,40)

Associé à l’apoptose BCl2

+ (78%)

+ (47%)

(41,42)

Zone du Manteau CD5 IgD

- -

-/+ (10%)

-

(4)

Centre germinatif des FL CD10 BCL6

+ (21-35%)

+ (46-100%)

+ (25-30%) + (55-97%)

(43,44)

Plasmocytaire MUM1/IRF4

+ (75%)

+ (73%)

(43-45)

Facteurs de transcription B PAX-5 OCT-2 BOB-1 PU.1

+ + + +

+ + + +

(41)

Abréviations : FL, follicule lymphoïde ; Immunoglobulines S/C, immunoglobulines de surface et

intracytoplasmiques ;

24

Les cellules tumorales des LBPM expriment les marqueurs B habituels tels que le

CD20 et le CD79a (Annexe 1) mais ne présentent pas habituellement d’immunoglobulines

de surface ou intracytoplasmiques détectables (43,46,47).

Il est classiquement décrit dans la littérature que les cellules tumorales des LBPM

présentent des déficits variables d’expression des molécules d’histocompatibilité de type

HLA I et II (33,46,48). La revue de la littérature sur ce sujet montre cependant des résultats

discordants selon les études (31). Récemment, Pileri et al montraient une expression

intense et homogène de HLA DR par immunohistochimie dans 61 cas sur 76 (80%) LBPM

(43). Cette discordance avec les études réalisées dans les années 90 peut s’expliquer par

l’évolution des techniques immunohistochimiques et en particulier par l’apport des

techniques de démasquage antigénique qui rendent l’analyse de l’expression de certains

antigènes plus performantes.

Les cellules tumorales présentent des ressemblances phénotypiques avec les

lymphocytes B thymiques, et comme ceux-ci n’expriment pas le récepteur pour la fraction

C3d du complément (CD21). De même, les cellules tumorales des LBPM expriment

fréquemment la molécule CD23, comme cela a été décrit en 1989 par Möller et al (49) et

confirmé récemment dans une série de 24 LBPM dont 17 (70%) étaient CD23+ (50) alors

que dans le groupe de LGCB-NM contrôle, seuls 14 cas sur 100 étaient positifs.

L’expression peu fréquente du CD23 dans les LGCB a été rapportée depuis par d’autres

auteurs dans une série de 125 LGCB où une positivité du CD23 n’est retrouvée que dans

16% des cas (39). L’expression fréquente de CD23 apparaît donc comme une

caractéristique spécifique des LBPM.

La molécule CD23 est un récepteur de faible affinité pour la fraction Fc des IgE

(FcεR2) et possède une fonction proinflammatoire. CD23 est aussi une molécule

25

d’adhésion intercellulaire qui s’associe au CD21 pour réguler la synthèse des IgE mais

aussi potentiellement la survie des lymphocytes B dans le centre germinatif des follicules

lymphoïdes et la présentation d’antigènes solubles aux lymphocytes T par les lymphocytes

B (51). Il existe 2 isoformes de la molécule CD23, qui diffèrent dans leur protion

intracytoplasmique. La protéine CD23a présente une expression restreinte aux lymphocytes

B, alors que l’expression de CD23b est étendue aux cellules hématopoïétiques (52). CD23

est exprimée par les cellules B naïves, les monocytes et les cellules folliculaires

dendritiques. Chez la souris, CD23 constitue un marqueur « pré-centroblastique », exprimé

par les cellules B naïves de la couronne du manteau et par les lymphocytes B à la phase

précoce du centre germinatif des follicules lymphoïdes dans les ganglions lymphatiques

(53). Son expression est induite dans les lymphocytes B par divers stimuli comme l’IL-4,

l’IL-13, anti-µ et anti-CD40 (54,55).

L’expression de la molécule d’activation CD30 est retrouvée dans la majorité des

cas de LBPM étudiés, le pourcentage de cas positifs variant de 60% à 86% selon les études

(37,43,56). Bien que l’expression du CD30 soit le plus souvent faible et hétérogène au sein

d’une même tumeur, et limitée tout au plus à 10 à 50% des cellules tumorales, le phénotype

CD30+ des cellules tumorales peut dans certains cas poser un problème de diagnostic

différentiel entre LBPM et lymphome de Hodgkin.

Du fait de leur extension essentiellement locorégionale et de la topographie

particulière des localisations secondaires de ces lymphomes, Eichelmann et al ont analysé

le profil d’expression des molécules d’adhésion des cellules tumorales des LBPM. Les

LBPM sont caractérisés par l’expression de CD54 (ICAM-1) dans 90% des cas, une

expression variable de CD58 (LFA3) (48% des cas) et l’absence d’expression des chaînes

α1,2,3,4,5,6 de la famille des β1-intégrines (57). Les auteurs suggèrent que ce profil

26

d’expression est comparable à celui observé dans les lymphomes se présentant sous la

forme d’une forte masse tumorale localisée sans phase leucémique (58-60).

I-4. Les LBPM et les gènes des immunoglobulines

Un réarrangement clonal des gènes codant pour les chaînes lourdes des

immunoglobulines est habituellement observé dans les LBPM (43,61,62). Il existe peu

d’études sur l’analyse de l’expression des transcrits des immunoglobulines dans les LBPM.

Pileri et al ont analysés les échantillons tumoraux de 40 LBPM en hybridation in situ à

l’aide de sondes spécifiques des chaînes légères kappa et lambda, et aucun transcrit n’a pu

être détecté (43). En RT-PCR, Leithaüser et al détectent des transcrits des chaînes lourdes

des immunoglobulines dans 8/13 (61,5%) LBPM, correspondant à des transcrits Igγ (n=5),

Igα (n=2) ou Igε (n=2, dont 1 cas coexprimant Igγ et Igε), mais aucun transcrit Igδ ou Igµ

n’a été identifié (62). En immunohistochimie, les cellules tumorales des LBPM

n’expriment pas habituellement d’immunoglobulines de surface ou intracytoplasmiques

(43,46,47). Cette absence d’expression des immunoglobulines ne semble pas lié à un

défaut d’expression des facteurs de transcription des immunoglobulines comme le montre

la conservation de l’expression de Oct-2, BOB.1 et PU.1 dans les LBPM, ni à la présence

de mutations invalidantes (« crippling mutations ») comme cela a été décrit dans le

lymphome Hodgkinien (43,63,64). En effet, les réarrangements séquencés montrent le plus

souvent que les séquences VDJ présentent un taux élevé de mutations somatiques, sans

variation intraclonale, et qu’elles sont fonctionnelles (43,62).

27

I-5. Caractéristiques moléculaires des LBPM

Bien qu’appartenant au groupe des lymphomes à grandes cellules B, les LBPM ne

présentent pas les anomalies moléculaires habituellement décrites dans les LGCB. Les

anomalies moléculaires observées dans les LBPM sont présentées dans le tableau II.

Tableau II : Anomalies moléculaires des LBPM/LGCB

Anomalies moléculaires Références LBPM

LBPM Nbre de

cas

LBPM Nbre de cas

positifs

Total LGCB Références LGCB

Réarrangement de BCL2

*Scarpa et al,1991 §Tsang et al, 1996 #Scarpa et al, 1999 Capello et al, 2000 Palanisamy et al, 2002

6 16 32 10 11

0 0 0 0 0

0%

20-30%

(42)

Réarrangement de BCL6

§Tsang et al, 1996 #Scarpa et al, 1999 Capello et al, 2000

16 32 8

1 1 0

2/56 4%

30-40%

(5)

Mutations de BCL6 Capello et al, 2000 Pileri et al, 2003 Palanisamy et al, 2002

10 37 13

1 26 7

34/60 57%

50%

(65)

Altérations de c-MYC *Scarpa et al, 1991 §Tsang et al, 1996 #Scarpa et al, 1999 Palanisamy et al, 2002

6 16 32 11

3 (1 R, 2M) 3 (50)

8 (2R, 6M) 0 (R)

14/65 5% (R)

20% (M)

7% (R)

32% (M)

(66,67) (10)

Mutations de P53

§Tsang et al, 1996 #Scarpa et al,1999 Capello et al, 2000

16 31 10

3 4 3

10/57 17%

22%

(13)

Délétion/méthylation p16 INK4A(CDKN2A)

#Scarpa et al, 1999 27 4 15% 28% (68,69)

EBV *Scarpa et al, 1991 §Tsang et al, 1996 #Scarpa et al, 1999 Cazals-Hatem et al, 1996

6 16 32 41

0 0 3 2

5/95

5%

5-7%

(70)

Abréviations: R= rearrangement, M= mutations.

Les LBPM se distinguent essentiellement par l’absence de réarrangements des

gènes BCL2 et BCL6 couramment retrouvés dans les LGCB. Aucun des 75 LBPM étudiés

dans la littérature ne présente de réarrangements de BCL2, alors que ceux-ci sont observés

dans près de 20-30% des LGCB (42,65,71-73). Les réarrangements de BCL6 ne sont

décrits que dans 2 cas de LBPM sur les 56 cas étudiés dans la littérature, alors que cette

anomalie moléculaire est retrouvée dans 30-40% des LGCB (5,65,66,72,73).

Les autres anomalies oncogéniques, non spécifiques, sont observées dans les LBPM

à la même fréquence que dans les LGCB. Des altérations du gène c-MYC ont été retrouvées

dans 14 (21%) cas sur les 65 LBPM étudiés dans la littérature, consistant soit en des

réarrangements majeur de c-MYC (3 cas), soit en des mutations ou microdélétions au

niveau de l’extrémité 3’ de l’exon 1 (66,67). Des mutations de P53 ont été décrites dans un

petit nombre de cas (17%) (65,72,73). Scarpa et al ont recherché des altérations du gène

p16 INK4A (CDKN2A) (73). Des altérations ont été retrouvées dans 4 cas sur 27 analysés

(15%), consistant en des méthylations du promoteur (3 cas) ou une délétion homozygote

dans un cas. Ces altérations de p16 INK4A ont également été décrites dans les LNH agressifs

(68,69).

Plusieurs études ont recherché une association avec le virus Epstein Barr, par

Southern blot (71-73) ou par hybridation in situ (36). La présence du génome EBV n’est

retrouvée que dans un très faible pourcentage de cas (5 cas positifs sur 95 analysés= 5%),

comparable à celui observé dans les LGCB. Le virus EBV n’apparaît donc pas impliqué

dans le développement des LBPM.

30

I-6. Anomalies cytogénétiques des LBPM

Jusqu’à présent, aucune translocation chromosomique spécifique des LBPM n’a été

décrite. L’anomalie cytogénétique la plus fréquemment retrouvée, liée de façon récurrente

et spécifique au LBPM, consiste en un gain de matériel chromosomique au niveau du bras

court du chromosome 9. Ces gains, mis en évidence par des techniques d’hybridation

génomique comparative (CGH), ont été initialement décrits par Joos et al en 1996, puis

confirmés ultérieurement par le même groupe dans une série plus grande de 43 LBPM en

2001 (74,75). Des techniques d’hybridation fluorescente in situ sur noyaux interphasiques

(FISH) à l’aide de sondes ADN spécifiques, d’empreintes PCR (Arbitrarily Primed

Polymerase Chain Reaction) ou d’analyse de séquences microsatellites, montrent que ces

gains de matériel chromosomique 9p sont observés dans près de 75% des LBPM (75-77).

Comparativement, des gains de segments chromosomiques 9p ne sont décrits que de façon

exceptionnelle dans les LGCB-NM, puisque dans une série de 103 LGCB, seuls 4 cas (4%)

présentaient des gains du 9p, et 3 d’entre eux étaient d’origine primitive extraganglionnaire

(75).

De façon intéressante, le seul lymphome présentant des anomalies récurrentes du

chromosome 9 est le lymphome de Hodgkin classique, où des gains du chromosome 9p

sont retrouvés dans près de 25% des cas (78,79). La région amplifiée de façon commune

dans les LBPM et le lymphome de Hodgkin est restreinte au segment 9p23-24. A ce niveau

existent, entre autres, 1 gène candidat potentiellement intéressant : le gène JAK2 codant

pour une tyrosine kinase associée aux récepteurs de cytokines et responsable de l’activation

de facteurs de signalisation et de transcription de la famille STAT (Signal Transducer and

Activation of Transcription. Une amplification de JAK2 est observée par Southern blot

dans un cas de LBPM et dans la lignée MedB-1 dérivée d’un LBPM (78).

31

La deuxième région génomique présentant des aberrations récurrentes dans les

LBPM concerne le chromosome X, où les techniques de CGH, de FISH et d’empreinte

PCR, permettent de retrouver des gains de segments chromosomiques dans près de 87%

des cas (74,75). Ces anomalies touchent le segment du bras court Xp11.4-21 et le segment

du bras long Xq24-26. En revanche, cette anomalie apparaît moins spécifique des LBPM,

puisqu’elle est décrite dans près de 10% à 30% des lymphomes B (74,75,80). Il est

intéressant de noter qu’il existe une bonne corrélation entre les anomalies du X et du 9p

dans une même tumeur. Lorsqu’il existe une surreprésentation du X, des gains du 9p sont

souvent associés.

De façon concomitante, d’autres auteurs ont décrits des anomalies du chromosome

6p comme étant caractéristiques des LBPM (77). Cette étude réalisée par une analyse de

375 microsatellites couvrant les 22 autosomes retrouve des gains du 6p dans 5/5 cas de

LBPM, notamment au niveau de la région 6p21.3-p22.3. Ces gains du 6p avaient

également été observés par Scarpa et al, dans 4/6 cas de LBPM, analysés en utilisant une

technique d’empreinte PCR (76).

Les études en CGH réalisées par Bentz et al décrivent également des gains de

matériel chromosomique des chromosomes 12q et 2p dans un tiers des LBPM (75). Ces

amplifications du 2p13-p16 coïncident avec la localisation du proto-oncogène REL, qui

code pour un facteur de transcription de la famille NFkB. Une amplification de REL sans

réarrangement associé, a été rapportée dans 6 cas de LBPM analysés par Southern blot

(74,81).

32

Enfin, dans une étude comparative par CGH entre 40 LBPM et 91 LGCB,

Palanisamy et al retrouvent des gains du chromosome 19q et des pertes du chromosome 4

avec une fréquence statistiquement plus élevée dans les LBPM par rapport aux LGCB (81).

Au total, la signature « cytogénétique » des LBPM peut se résumer essentiellement

en des gains de segments chromosomiques au niveau des chromosomes 9p, Xq, 6p, 12q, 2p

et 19q. Ces gains chromosomiques sont associés à une amplification des gènes JAK2 et

REL, dont le rôle précis dans le développement des LBPM reste à définir.

I-7. LBPM et stade de différenciation

La définition du stade de différenciation B de la cellule tumorale des LBPM reste

très controversée. Différentes études visant à établir l’origine « centre-germinatif » ou

« post-centre germinatif » des LBPM sur la base de l’étude de l’expression de marqueurs

de différenciation ont donnés des résultats discordants. La première étude visant à

déterminer le stade de différenciation de la cellule précurseur des LBPM est l’étude publiée

par Möller en 1987 (46). Les auteurs ont analysés par immunohistochimie sur coupes

congelées le profil d’expression de marqueurs de différenciation des cellules tumorales

dans 8 LBPM. Le profil d’expression retrouvé était caractérisé par un déficit variable en

molécules d’histocompatibilité, un phénotype CD10-, CD19+, CD20+, CD21- et PC-1 +

(marqueur de différenciation plasmocytaire), et l’absence complète d’expression

d’immunoglobulines de surface ou intra cytoplasmiques. Ce phénotype étant similaire à

celui retrouvé à un stade terminal de différenciation lymphocytaire B, les auteurs

suggéraient que les LBPM représentaient une tumeur à un stade terminal de différenciation

ou « pré-plasmocytaire ».

33

En 1989, Möller et al publient une étude comparable, mais en utilisant cette fois-ci

un panel beaucoup plus large d’anticorps dirigés contre différents marqueurs de

différenciation. Les auteurs ont comparé le phénotype de 12 LBPM à celui des cellules B

monocytoïdes et centrofolliculaires normales (49). Les cellules B monocytoïdes sont des

cellules B réactionnelles observées dans la zone marginale des sinus sous-capsulaires et

intermédiaires des ganglions lymphatiques inflammatoires. Ces lymphocytes ont longtemps

été apparentés aux cellules B de la zone marginale du parenchyme splénique et considérées

comme des lymphocytes à un stade de différenciation post-centre germinatif (82-84). Elles

ont pour particularité morphologique de présenter un cytoplasme clair abondant et sont

parfois confondues avec des histiocytes. Une hyperplasie des cellules B monocytoïdes

intra- ou périsinusale ganglionnaire est observée dans les adénites réactionnelles, en

particulier dans les infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ou la

toxoplamose. Dans cette étude, les auteurs montraient que les LBPM présentent des

similitudes morphologiques (présence d’un cytoplasme clair) et immunohistochimiques

(absence d’expression de CD10 et CD21) avec les cellules B monocytoïdes des ganglions,

et suggéraient que les cellules tumorales des LBPM étaient probablement à un stade de

différenciation post-centre germinatif. Depuis, l’analyse du statut des gènes codant pour les

chaînes lourdes des immunoglobulines (IgVH) des cellules B monocytoïdes, ont montré que

la majorité (74%) d’entre elles sont des cellules B naïves dont les gènes IgVH sont

dépourvus de mutations somatiques, et que seule une minorité (25,6%) présentent des

mutations des gènes IgVH compatibles avec des cellules à un stade de différenciation « post

centre germinatif » (85).

En 2001, ces résultats sont remis en question par l’étude de de Leval et al basée sur

l’étude de l’expression de CD10 et BCL6 en immunohistochimie sur coupes en paraffine

(86). CD10 est une endopeptidase membranaire exprimée dans de nombreux tissus

34

humains, mais qui dans les tissus lymphoïdes présente une expression restreinte aux

cellules du centre germinatif des follicules lymphoïdes (44). BCL6 est une protéine à doigt

de zinc, qui agit comme un répresseur transcriptionnel et qui est normalement exprimée par

les cellules B du centre germinatif des follicules lymphoïdes et dans une sous-population

de lymphocytes T CD4+ du centre germinatif et des zones interfolliculaires (7).

L’expression de CD10 et de BCL6 est habituellement utilisée comme un marqueur de

l’origine centro-germinative d’une cellule lymphoïde. Dans l’étude de de Leval et al, 100%

(19/19) des cas expriment BCL6 et 35% (6/19) expriment CD10, de façon plus ou moins

homogène. Ce phénotype est en faveur de l’origine centrofolliculaire des LBPM et les

auteurs suggèrent que les LBPM pourraient dériver des follicules lymphoïdes thymiques

fréquemment observés chez les adultes jeunes en l’absence de toute maladie autoimmune

(87). Dans cette hypothèse, les LBPM seraient issus des follicules lymphoïdes situés dans

l’espace périvasculaire du thymus et donc de lymphocytes B du système immunitaire

périphérique (cf chapitre lymphocytes B thymiques).

D’autres auteurs ont par la suite analysé l’expression de BCL6 par les cellules

tumorales en immunohistochimie. Palanisamy et al observent une positivité des cellules

tumorales avec l’anticorps anti-BCL6 dans 19/24 (79%) cas de LBPM analysés (81). Pileri

et al ont étudié l’expression de BCL6, CD10, MUM1/IRF4 dans une grande série de

LBPM (43). MUM1/IRF4 est un facteur de transcription appartenant à la famille des

facteurs de régulation de l’interféron (IRF) (88) qui est exprimé à l’état normal par les

plasmocytes et une sous-population minoritaire de cellules du centre germinatif des

follicules lymphoïdes (89). Dans cette étude, une expression de BCL6 est observée dans

31/66 (47%), de CD10 dans 15/71 (21%) et de MUM1/IRF4 dans 46/61 (75%) des cas.

Ces résultats sont comparables à ceux observés pour les LGCB (Tableau II).

35

Ces résultats illustrent la difficulté à utiliser l’immunophénotype, l’expression de

marqueurs du centre germinatif des follicules lymphoïdes (CD10, BCL6) ou d’un marqueur

« post centre germinatif » (MUM1/IRF4), pour rattacher les LBPM à un stade de

différenciation, ce d’autant plus que l’expression de BCL6 peut être liée à une dérégulation

transcriptionnelle (90).

La présence de mutations du gène BCL6 dans une cellule lymphoïde B témoigne de

son passage à travers le centre germinatif d’un follicule lymphoïde, car dans les tissus

lymphoïdes normaux, ces mutations sont observées dans 30 à 50% des lymphocytes B du

centre germinatif et des lymphocytes B mémoires, mais sont absentes des cellules B à un

stade pré-centre germinatif (91). La présence de mutations de BCL6 est donc considérée

comme un marqueur moléculaire permettant de définir l’origine d’une prolifération

lymphoïde B. Dans les LBPM, les mutations de BCL6 sont observées dans un pourcentage

très variable de cas selon les études. Dans l’étude de Capello et al, la présence de mutations

de BCL6 n’est observée que dans 1/10 cas de LBPM, alors que près de 50% des LGCB

étudiés (115 cas au total) présentent des mutations de BCL6 (65). Palanisamy et al

rapportent des mutations de BCL6 dans 7/13 (53%) cas de LBPM alors que Pileri et al

observent des mutations de BCL6 dans la majorité des LBPM étudiés, soit 26 cas sur 37

(70%) (43,81).

Ces résultats suggèrent qu’une proportion importante des LBPM dérive de

lymphocytes B ayant transité par le centre germinatif des follicules lymphoïdes où ils ont

subi le processus de mutations somatiques et sont soit prêts à quitter le centre germinatif,

soit déjà à un stade « post-centre germinatif ». L’analyse du statut des gènes codant pour les

chaînes lourdes des immunoglobulines (IgVH) dans les LBPM est en faveur de cette

hypothèse. Les mutations somatiques des gènes IgVH sont acquises au cours du transit du

36

lymphocyte B dans le centre germinatif du follicule lymphoïde et sont observées dans les

cellules B du centre germinatif et les cellules B mémoires. Leur présence permet donc

d’orienter vers le stade de différenciation de la cellule B précurseur de la prolifération

tumorale. Küppers et al ont analysés 5 cas de LBPM, et retrouvent un taux de mutations

dans les gènes codant pour les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines de l’ordre

de 8-26% (92). Dans l’étude de Leithäuser et al, la fréquence des mutations somatiques des

gènes IgVH était élevée variant de 5,6% à 30,9% (62). Dans 12 cas, le réarrangement IgVH

correspondait à un réarrangement fonctionnel, avec un rapport R/S =1.4, équivalent à celui

observé dans les lymphocytes B mémoires et les plasmocytes. Aucune variation

intraclonale (« ongoing mutation ») n’était observée dans aucun de ces cas.

En conclusion, si ces études ne permettent pas d’établir précisément le stade de

différenciation du lymphocyte B précurseur des LBPM, elles favorisent toutefois l’origine

post-centre germinatif de ces lymphomes. Cette hypothèse est étayée par les récentes

études sur puces à ADN, qui montrent que la signature transcriptionnelle des LBPM est

distincte de celle des LGCB d’origine centro-germinative (93). Les LBPM n’en restent pas

moins distincts des LGCB de type ABC, et pourraient constituer un troisième sous-groupe

de lymphome diffus à grandes cellules B.

I-8. Les lignées dérivées des LBPM : Karpas 1106 et MedB-1

Deux lignées dérivées de lymphome B du médiastin sont décrites dans la littérature

et ont été utilisées dans les travaux de cette thèse : ce sont les lignées Karpas 1106 et

MedB-1.

37

I-8.1. La lignée Karpas 1106

La lignée Karpas 1106 est une lignée dérivée d’un lymphome « lymphoblastique

B » de localisation médiastinale chez une femme de 23 ans sans antécédents particuliers

(94). Une rémission complète de la maladie avait été initialement obtenue par

chimiothérapie conventionnelle (cyclophosphamide, hydroxydaunorubicin, vincristine et

prednisone), mais une rechute était observée à 1 an avec dissémination de la maladie.

Malgré plusieurs traitements, la patiente décédait 4 mois après, avec une atteinte du

système nerveux central, et des épanchements pleuraux bilatéraux et une ascite. La lignée

Karpas 1106 est dérivée des épanchements pleuraux et du liquide d’ascite, prélevés lors de

la rechute de la maladie. Les clones cellulaires issus de ces 2 localisations présentaient les

mêmes caractéristiques immunophénotypique et génotypique. L’absence de matériel

tumoral au diagnostic n’a pas permis de comparer les caractéristiques de la lignée Karpas

1106 à la tumeur primitive.

La lignée Karpas 1106 présente un phénotype CD19+, CD22+, CD5-, CD10-,

CD23-, Bcl2-, exprime les immunoglobulines de surface de type IgG/kappa. Dans une

publication ultérieure, cette lignée a été considérée comme étant dérivée d’un lymphome de

la zone marginale du fait de son immunophénotype CD5- CD10- CD23- (95).

En cytogénétique, le caryotype du clone majoritaire est le suivant :

49,X,del(2)(p11.2p13.3), der(3)t(2 ;3)(p13.3 ;p25.1), +i9(p), ins(12 ;?)(q13.1q13.3),

del(14)(q11.2q13.1), del(15)(q11.2q15.3), der(18) t(X ;13 ;18)(q28 ;q12.1 ;q21.3 ), -20,

del(20)(q13.1q13.3) x 2, der (X)(X ;13 ;18)(q28 ; q12.1 ;q21.3 ), +iX(p).

La lignée Karpas 1106 est particulière du fait de la présence d’une translocation

complexe impliquant les 3 segments chromosomiques 18q21.3-qter, Xqter-c-Xq28 et

13q12.1, les études par FISH montrant que le segment 18 est retenu entre les segments X et

38

13. Les chromosomes 14, 15 et 20 présentent une délétion partielle du bras long et il existe

une translocation t(2 ;3).

Au total, bien que cette lignée soit issue d’un lymphome B médiastinal, il persiste

une incertitude sur la classification histologique précise de la tumeur initiale, tantôt

étiquetée lymphome lymphoblastique B, tantôt supposée être un lymphome de la zone

marginale. Les caractéristiques immunophénotypiques n’apparaissent pas comme typiques

des LBPM telles que nous les avons présentées dans les paragraphes précédents (absence

d’expression du CD23). Toutefois, cette lignée présente des anomalies des chromosomes 9,

notamment un isochromosome 9p, et X comme il est décrit dans les LBPM, et elle est

considérée comme probablement dérivée d’un LBPM. Les données récentes sur l’analyse

du transcriptome dans les LBPM montrent que cette lignée exprime les gènes

caractéristiques des LBPM, et confirme cette hypothèse (Rosenwald A & Wright G, J EXp

Med 2003).

I-8.2. La lignée MedB-1

La lignée MedB-1 se distingue de la lignée Karpas 1106 du fait qu’elle dérive d’un

lymphome B à grandes cellules présentant toutes les caractéristiques des LBPM telles

qu’elles sont définies dans la classification de l’OMS.

Cette lignée a été établie par Möller et al, et dérive d’un LBPM chez un homme de

27 ans (96). Ce patient présentait une maladie médiastinale localisée et avait été traité par

radiochimiothérapie. Après une régression initiale de la maladie, la tumeur a continué à

progresser malgré la chimiothérapie, et une thoracotomie avec résection du poumon gauche

39

envahi a été rendue nécessaire. Le patient est cependant décédé peu de temps après, à 9

mois du diagnostic initial. La lignée est dérivée de la pièce de résection pulmonaire

La lignée MedB-1 présente des caractéristiques immunohistochimiques

comparables à celles de la tumeur primitive, qui sont résumées dans le tableau III :

40

Tableau III : Caractéristiques immunophénotypiques de la lignée MedB-1 comparée

à la tumeur primitive (96)

Antigène Tumeur primitive Étude immunohistochimique

MedB-1 Étude

immunocytochimique

MedB-1 Étude en cytométrie de

flux (pourcentage de cellules

positives) HLA-A,B,C - - -

ββββ2 m - - - HLA I chaîne αααα - - -

HLA-DR +>- +/- + 80.7% HLA-DP -/+ +/- + 90.9% HLA-DQ -/+ ->+ + 51.1%

IgM - - - IgD - - - IgG - ->+ + 9.4% IgA - - -

κκκκ - +>- - λλλλ - - -

CD10- - - - CD19 + + + 99.1% CD20 + ->+ + 22.1% CD21 - - - CD22 + + + 53.9% CD23 + + + 96.9% CD24 ->+ ->+ + 18.8% CD25 - - - CD27 - - - CD30 ->+ + + 96.9% CD37 + + + 95.7% CD38 - - + 7.8% CD39 + + + 95.6 CD40 + + + 99.5% CD54 + + + 99.2% CD74 +/- +>- - CD95 + + + 99.2%

Abréviations: -, absence d’antigène détectable; +, antigène détecté; +/-, quantité identique de

cellules positives et négatives ; +>-, davantage de cellules positives ; ->+, vice versa.

La lignée MedB-1 exprime les marqueurs B CD19 et CD22, ainsi que les antigènes

associés aux lymphocytes B tels que les CD37 et CD39. Comparativement à la tumeur

initiale, seul un petit pourcentage de cellules (22%) exprime le CD20 en surface. Comme il

41

est classiquement décrit dans les LBPM, la tumeur primitive n’exprime pas

d’immunoglobulines de surface, mais à la différence de la tumeur primitive, MedB-1

présente un très faible pourcentage (<10%) de cellules de phénotype IgG/κ détectables sur

cytocentrifugation. L’antigène CD10 n’est pas exprimé, et CD21 est également négatif. Les

marqueurs CD23, CD30, CD40 et CD95 sont exprimés. Il faut noter cependant, que

presque la majorité des cellules tumorales expriment le CD30, contrairement à la tumeur

primitive où seul un petit pourcentage de cellules est CD30+. La lignée MedB-1 est

dépourvue d’expression des molécules d’histocompatibilité de classe I HLA-A,B,C et de la

β2 microglobuline.

La recherche du génome de l’EBV par Southern blot est négative.

La lignée MedB-1 présente un réarrangement clonal des gènes des chaînes lourdes

des immunoglobulines identique à celui observé dans la tumeur primitive. L’analyse des

mutations montre un taux élevé de mutations somatiques comme il est rapporté dans la

plupart des LBPM. Contrairement à la tumeur primitive, un faible degré de variation

intraclonale est observé dans la lignée MedB-1 (62).

Une petite proportion (10%) des cellules de la lignée MedB-1 exprime les

immunoglobulines IgG/κ intracytoplasmiques. Des études fonctionnelles ont été réalisées

sur la lignée MedB-1 pour évaluer la synthèse d’imunoglobulines en réponse à des stimuli

tels que l’interleukine-4 (IL-4) ou la dexaméthasone. La stimulation par l’IL-4 induit une

baisse de la synthèse d’IgG, alors que la dexaméthasone induit une augmentation modérée.

Cette variation de synthèse d’IgG est restreinte aux cellules tumorales IgG/κ + (62). Les

auteurs suggèrent que l’absence d’expression des immunoglobulines habituellement

observée dans les cellules tumorales des LBPM pourrait être liée à une inhibition de

synthèse induite par des signaux extrinsèques tels que l’IL-4.

42

En cytogénétique, le caryotype de MedB-1 est le suivant : 47,XY,inv(X)(p22 ;q13),

+der(1)t(1 ;14)(q10,q10), +9, -14, -21, i(21q). Il n’existe pas de données sur le caryotype de

la tumeur initiale, mais l’étude en CGH de la tumeur primitive et de la lignée MedB-1

montre des résultats identiques. La lignée MedB-1 et la tumeur dont elle dérive montrent

des altérations des chromosomes 9p et Xq comme il est habituellement observé dans les

LBPM. Il existe un chromosome 9 surnuméraire et le chromosome X est le siège d’une

inversion impliquant les segments Xp22 et Xq13. D’autre part, des gains de matériel

chromosomique sont observés au niveau des chromosomes 1q et 21 (75). Comme nous

l’avons mentionné précédemment, une amplification du gène JAK2 (situé en 9p23) d’un

facteur 4 par rapport à de l’ADN normal est observée dans la lignée MedB-1 par Southern

blot (78).

La lignée MedB-1 possède des propriétés d’adhésion particulières : lorsque les

cellules tumorales sont déposées sur des coupes congelées de tissu amygdalien ou

ganglionnaire, l’adhérence des cellules est très faible. Au niveau de la muqueuse colique,

les cellules tumorales n’adhèrent pas du tout. En revanche, lorsque celles-ci sont déposées

sur des coupes de thymus, les cellules tumorales adhèrent entre elles formant de petites

grappes au niveau de la médullaire thymique. Il semble donc que les cellules tumorales

aient conservé malgré la culture in vitro des propriétés spécifiques d’adhésion de la tumeur

initiale (96).

43

I-9. Traitement et pronostic des LBPM

Le LBPM est une maladie rare, et aucune étude prospective permettant de comparer

différents régimes thérapeutiques n’a été réalisée à ce jour. Toutefois, des études

rétrospectives ont été publiées comparant les taux de réponse et la survie de patients

atteints de LBPM et de LGCB-NM et traités de façon identique. D’autres études ont été

réalisées permettant de définir des facteurs de risque susceptibles d’influencer la réponse

au traitement, la survie globale et la survie sans évènement. Les résultats des principales

études réalisées sur les LBPM sont présentés dans le tableau IV :

44

Tableau IV: Etudes cliniques concernant les LBPM. Revue de la littérature.

Références

N Traitement Administré

RT Taux de RP (%)

Taux de RC (%)

Evolution clinique

(97) 20 CHOP(4) ou variantes avec teniposide et vincristine (16)

oui 55 45 50% (2ans OS) 33% (7ans OS)

(98) 30 CHOP(14), MACOP-B ou VACOP-B (15)

oui (14)

ns 55 38% (3 ans OS)

(56) 18 F-MACHOP (11), MACOP-B (7)

non 61 33 61% (30 mois OS)

(36) 141 CT à base d’anthracycline non ns 79 66% (3 ans OS) (99) 106 CT à base de Doxorubicine oui

(77%) 42 23 52% (3 ans OS)

(100) 35 CT (CBV) et autogreffe non 29 23 - 1ère réponse : 83% (5ans PFS) - Maladie réfractaire : 58% (5ans PFS) - Rechute : 27% (5ans PFS)

(101) 43 CT à base de Doxorubicine/mitoxantrone

ns ns 63 46% (5 ans OS)

(102) 50 MACOP-B oui 0 86% 82% (8 ans PFS) (103) 27 CT à base de Doxorubicine

(23), CVP (4) oui (11)

15 55 59% (3 ans OS)

(104) 31 BEAC, BEAM, CBV, TBC + autogreffe

oui 15

ns ns 56% (5 ans OS)

Abréviations : N, nombre de patients ; ns, non spécifié ; CT, chimiothérapie ; RT, radiothérapie ; RP,

rémission partielle définie comme la réduction de plus de 50% de la maladie tumorale ; RC, rémission

complète définie comme la disparition des signes cliniques et radiologiques de la maladie ; OS, survie

globale ; PFS, survie sans progression ; CHOP, cyclophosphamide, doxorubicine, vincristine, et prednisone ;

MACOP-B, méthotrexate, doxorubicine, cyclophosphamide, vincristine, prednisone, bléomycine ; VACOP-

B, etoposide, doxorubicine, cyclophosphamide, vincristine, prednisone, bléomycine ; F-MACHOP,

vincristine, cyclophosphamide, 5-FU, ara-C, adriamycine et méthotrexate ; CBV, cyclophosphamide,

carmustine, etoposide ; CVP, cyclophosphamide, vincristine, prednisone ; BEAC, carmustine, etoposide,

cytarabine, cyclophosphamide ; BEAM, carmustine, etoposide, cytarabine, melphalan ; TBC, thiotepa,

busulfan, cyclophosphamide.

Les LBPM sont le plus souvent traités par une chimiothérapie comportant des

anthracyclines comme le sont habituellement les lymphomes B à grandes cellules. Deux

45

études rétrospectives comparant les LBPM et les LGCB-NM, réalisées dans le cadre de

protocoles thérapeutiques avec des cohortes de patients traités de façon identique ont été

publiées. La première est une étude franco-belge réalisée dans le cadre du GELA (Groupe

d’Etude des Lymphomes de l’Adulte), qui compare 141 patients atteints d’un LBPM à 916

patients atteints d’un LGCB-NM et traités de façon identique par un régime basé sur

l’utilisationdu régime ACVBP (CHOP renforcé en adriamycine et endoxan) (36). La

majorité des LBPM (74%) appartenaient au groupe présentant au moins un facteur

pronostic péjoratif, (indice de performance � 2; �2 sites extranodaux atteints ; masse

médiastinale � 10cm ; atteinte de la moelle hématopoïétique ou du SNC), et étaient, après

chimiothérapie d’induction, randomisés pour recevoir soit une consolidation avec

autogreffe de cellules souches soit une consolidation par chimiothérapie conventionnelle.

Aucune radiothérapie n’était délivrée. Une rémission complète était observée dans 79% des

patients atteints de LBPM contre 68% dans les LGCB-NM. Cette étude ne montrait pas de

différence significative entre les LBPM et les LGCB-NM en terme de survie sans

évènement (61% versus 64%) et survie à 3 ans (66% versus 62%).

La seconde étude rétrospective est une étude réalisée par le groupe du Nebraska

comparant l’évolution clinique de 43 patients atteints d’un LBPM à une cohorte de 352

patients atteints d’un LGCB-NM. Tous les patients étaient traités par une chimiothérapie

comportant une anthracycline ; aucune différence n’était observée entre les 2 groupes en

terme de survie globale et de survie sans évènement. Ainsi, considérant ces 2 études, les

LBPM semblent se comporter de la même façon que les LGCB-NM.

Le choix du régime de chimiothérapie optimum pour les patients atteints de LBPM

reste aujourd’hui controversé. Dans les études les plus anciennes, une chimiothérapie

conventionnelle de type CHOP était utilisée (97,98). Des études plus récentes suggèrent

46

que des régimes plus intensifs de type MACOP-B pourraient réduire les taux de récidive

dans les LBPM (99,103). Dans une série de 50 patients traités par MACOP-B suivie d’une

radiothérapie de consolidation, une rémission complète était obtenue dans 86% des cas et

la survie sans évènement à 3 ans était de 93% (102). Ces résultats exceptionnellement bons

pourraient avoir été influencés par un biais de sélection des patients et l’utilisation d’une

radiothérapie adjuvante. La supériorité de la chimiothérapie intensifiée par rapport au

CHOP reste encore à démontrer, notamment par des études prospectives.

La place de la radiothérapie comme thérapeutique adjuvante dans le traitement des

LBPM reste mal définie. La seule étude permettant de démontrer un bénéfice d’une

radiothérapie adjuvante est l’étude multicentrique réalisée par Zinzani et al dans laquelle

une grande proportion des patients continuait à avoir une prise de contraste à la

scintigraphie au gallium après traitement par MACOP-B (102). A l’issue d’un traitement

d’induction, une radiothérapie de 30 à 36 gray a permis de négativer cette prise de gallium

chez la plupart des patients, et peu d’entre eux ont rechuté. Des résultats comparables ont

été rapportés par Bieri et al (103). En revanche, dans l’étude de Cazals-Hatem et al, une

survie favorable était obtenue par chimiothérapie intensive d’induction suivie d’une

chimiothérapie de consolidation sans radiothérapie cmplémentaire. Dans l’étude de

Lazzarino et al, la radiothérapie était inefficace lorsque la tumeur était chimiorésistante

(99). Enfin, non seulement l’intérêt de la radiothérapie dans le traitement des LBPM reste à

évaluer, mais il convient de rappeler les risques à long terme de l’irradiation chez des

patients jeunes (cancer secondaire, toxicité myocardique…)..

Plusieurs études ont évalué l’intérêt d’une chimiothérapie intensive suivie d’une

autogreffe de cellules souches dans le traitement des patients atteints d’un LBPM. Du fait

47

du jeune âge des patients et d’un mode de dissémination de la maladie épargnant le plus

souvent la moelle hématopoïétique, les patients atteints de LBPM sont de bons candidats à

l’autogreffe. Dans une série de 35 LBPM, d’excellents résultats ont été obtenus non

seulement dans le groupe de patients (n=12) autogreffés en première réponse après

chimiothérapie d’induction (survie sans évènements à 5 ans de 83%), mais également pour

les 12 patients non répondeurs au traitement de première intention (survie sans évènements

à 5 ans de 58%) (91). Dans une étude rétrospective de tous les LGCB traités par autogreffe

dans le MD Anderson Cancer Center entre 1986 et 1995, la localisation médiastinale était

un facteur prédictif indépendant pour une meilleure survie globale et une meilleure survie

sans évènements (104). Sur la base de ces résultats, certains auteurs ont suggéré que

l’autogreffe puisse être proposée en consolidation d’une première réponse après

chimiothérapie chez les sujets à haut risque (100).

Plusieurs facteurs pronostiques ont été identifiés dans les études publiées. Le

facteur prédictif de survie le plus important est la réponse de la maladie à la chimiothérapie

de première intention. L’absence de réponse dans les premiers mois qui suivent la

chimiothérapie première est en effet un facteur extrêmement péjoratif.

Il est admis que la présence d’une masse résiduelle est associée à un risque élevé de

récidive de la maladie (97-99). D’où la nécessité d’évaluer précisément la masse

médiastinale résiduelle après chimiothérapie première, la scintigraphie au gallium étant à

l’heure actuelle supplantée par la tomographie à émission de positons (TEP) au 18-FDG.

La TEP présente l’intérêt théorique majeur de permettre de distinguer les masses

résiduelles lymphomateuses actives de celles fibreuses inactives.

Certains autres facteurs pronostiques péjoratifs ont été inconstamment retrouvés :

un mauvais indice de performance, une masse médiastinale volumineuse, un épanchement

péricardique ou pleural, un taux de LDH élevé. La stratification des patients selon l’IPI ne

48

montre pas de différences significatives en terme de réponse au traitement et de survie. Le

taux de β2 microglobuline ne présente que peu d’intérêt car il est rarement élevé dans les

LBPM. Enfin, les critères histologiques comme la présence d’une fibrose ou de cellules

claires ne sont pas corrélés à la survie.

Au total, il n’existe pas de recommandations thérapeutiques bien établies pour la

prise en charge des LBPM. L’attitude thérapeutique qui tend à être préconisée à l’heure

actuelle, par exemple au sein du GELA, est de traiter les patients appartenant au groupe

favorable défini sur la base de l’IPI (faible masse tumorale, bon indice de performance,

taux de LDH normal) par une polychimiothérapie comportant une anthracycline de type

ACVBP (doxorubicine, cyclophosphamide, vinblastine, bléomycine, prednisone), associée

ou non à l’utilisation du rituximab. Dans les formes sévères (mauvais indice de

performance, masse médiastinale volumineuse, LDH élevées), le traitement de première

ligne comportera une chimiothérapie d’induction associant l’ACVBP au rituximab qui, en

situation de bonne réponse, sera suivi d’une intensification thérapeutique comportant une

haute dose-intensité de chimiothérapie puis une autogreffe. Il est possible que dans

l’avenir, une évaluation de la réponse précoce au traitement par la TEP identifie plus tôt les

patients à haut risque de maladie réfractaire ou de rechute.

49

III. LES LYMPHOCYTES B THYMIQUES

50

III-1. Arguments en faveur de l’origine B thymique des LBPM

L’origine B thymique des LBPM a été suggérée pour la première fois par Isaacson

et al en 1986 (29) devant un cas de LBPM caractérisé sur le plan histologique par une

tumeur entourée de thymus sain résiduel. Ce type d’aspect histologique a été rapporté

depuis par d’autres auteurs (105). Isaacson a ensuite mis en évidence l’existence d’une

composante lymphoïde B au sein de la médullaire thymique, jusqu’alors méconnue, et

distincte des follicules lymphoïdes B observés dans les espaces périvasculaires thymiques

(106). Cette étude était basée sur l’analyse immunohistochimique de coupes de thymus de

fœtus de 15 à 40 semaines de gestation, de nouveaux nés et de patients âgés de 9 mois à 66

ans. Les lymphocytes B étaient mis en évidence essentiellement dans la médullaire

thymique autour des corpuscules de Hassal, et plus rarement dans le cortex, étaient de

grande taille, et présentaient un phénotype CD19+, CD20+, CD22+, CD21-, CD35-, IgM+,

IgD+ et une fraction d’entre eux exprimaient le CD23. Les auteurs suggéraient alors que

les LBPM pouvaient dériver de cette population particulière de lymphocytes B de la

médullaire thymique.

III-2. Les lymphocytes B thymiques (LBt) chez l’homme

III-2. 1. Morphologie du thymus

Le thymus est un organe lymphoïde primaire jouant un rôle central dans le

développement, la maturation et la sélection des lymphocytes T (107). Le thymus est

développé à partir de la troisième poche pharyngée, colonisée par les cellules précurseurs

hématopoïétiques à partir de 7-8 semaines de gestation. A 16-20 semaines, la

morphogenèse thymique est complète et la diversification du répertoire lymphocytaire T est

en cours. Au cours des 2ème et 3ème trimestres de grossesse, le thymus augmente

51

considérablement de taille et les lymphocytes T qui ont subi une maturation et une

sélection au sein du microenvironnement thymique, migrent vers les organes lymphoïdes

secondaires comme la rate, le tube digestif et les ganglions lymphatiques pour constituer le

pool des lymphocytes T périphériques (108).

Sur le plan morphologique, le thymus est un organe plurilobé constitué de 2

compartiments distincts (figure 1). Le premier compartiment est constitué du cortex et de la

médullaire thymique, caractérisés par une population très dense de thymocytes immatures

disposés dans une trame de cellules épithéliales thymiques, et constitue ce qu’on appelle

l’espace épithélial thymique (EET) où a lieu la thymopoïèse. La médulla se distingue du

cortex par une population moins dense de thymocytes et renferme des arrangements

concentriques de cellules épithéliales thymiques matures appelés corps de Hassal. La

maturation des lymphocytes T se fait du cortex vers la médulla et le contact direct entre les

lymphocytes T et les cellules épithéliales thymiques constitue la clé de la régulation de la

prolifération et de la différenciation des lymphocytes T et des cellules épithéliales

thymiques.

Le deuxième compartiment correspond à l’espace situé entre le l’EET et la capsule

thymique. Cet espace renferme des vaisseaux, et constitue l’espace périvasculaire (EPV).

L’EPV est séparé de l’EET par une membrane basale, mais ces 2 espaces sont très intriqués

entre eux, et des colorations spéciales comme la coloration de la réticuline qui marque la

membrane basale ou une analyse immunohistochimique à l’aide d’un anticorps anti-

cytokératine qui met en évidence le réseau de cellules épithéliales, sont nécessaires pour

distinguer ces 2 espaces sur des coupes thymiques.

52

Espace Epithélial Thymique (EET)

Espace Périvasculaire (EPV)

Vaisseaux

Corpuscule de Hassal

C

C

C

C

C

M

M

M M

M

Figure 1 : Représentation schématique du thymus d’un sujet adulte.

53

Contrairement à la souris, la taille et le volume du thymus restent constants tout au

long de la vie, mais la proportion de ces différents constituants varie avec l’âge. L’EET est

à sa taille maximum à l’âge d’un an, puis involue au cours du reste de la vie. Parallèlement,

la taille des corpuscules de Hassal diminue de 60% conjointement à la diminution de la

maturation et du fonctionnement des cellules épithéliales thymiques. L’EPV renferme

selon l’âge des quantités variables de lymphocytes, polynucléaires, mastocytes,

macrophages et adipocytes. A la naissance, l’EPV ne renferme pas de lymphocytes, mais

avec l’âge, la composante lymphoïde de l’EPV augmente et atteint sa capacité maximum

entre 10 et 50 ans puis involue, tandis que la composante adipeuse augmente jusqu’à

constituer 80% du volume thymique après l’âge de 50 ans.

La présence de follicules lymphoïdes réactionnels à centres clairs dans l’EPV à

l’état physiologique, en dehors de tout contexte de maladie auto-immune, est semble-t-il

assez fréquente, avec un pic observé au cours de la deuxième décade (87). L’origine

thymique ou périphérique des lymphocytes de l’EPV est discutée, mais l’hypothèse actuelle

est que ces lymphocytes constituent un compartiment du système immunitaire

périphérique, leur accès à l’EPV étant favorisée par la présence de veinules postcapillaires

observés dans l’EPV (109). Le thymus apparaît donc comme un organe lymphoïde

chimérique, constitué d’une part d’un compartiment lymphoïde « primaire », l’EET

renfermant les thymocytes, et d’autre part d’un compartiment lymphoïde « secondaire »

appartenant au système immunitaire périphérique et situé dans l’EPV.

III-2.2. Distribution et caractéristiques morphologiques des LBt

Si le thymus joue un rôle central dans la différenciation lymphoïde T, l’existence

d’une population de lymphocytes B dans le thymus est, depuis les travaux d’Isaacson, bien

54

reconnue. Les données de la littérature sur les LBt chez l’homme sont relativement

succinctes, probablement en raison de la difficulté à analyser cette population très

minoritaire du thymus. Les résultats des différentes études sont parfois différents selon

qu’elles ont été réalisées en immunohistochimie sur des coupes de thymus ou en cytométrie

de flux à partir de suspensions cellulaires thymiques.

Le nombre de LBt dans le thymus varie selon l’âge. En cytométrie de flux, le

pourcentage de cellules CD19+ représente chez le fœtus 0,1 à 0,5% des thymocytes (110).

Les LBt CD19+ CD20+ représentent 1,3% des thymocytes Avant l’âge de 10 ans et jusqu’à

2,6% des thymocytes après l’âge de 10 ans (111). L’étude de ces LBt sur des coupes de

thymus d’enfants en immunohistochimie à l’aide de l’anticorps anti-CD20, montre que ces

lymphocytes B sont essentiellement localisés au niveau de la médulla où ils pourraient

représenter jusqu’à 33% du nombre total de cellules de la médullaire thymique (112). Ce

pourcentage parait cependant très élevé compte tenu de notre propre expérience et des

études morphologiques et immunohistochimiques réalisées par d’autres auteurs.

Les LBt présentent des caractéristiques morphologiques et immunohistochimiques

distinctes selon qu’ils sont situés dans l’EET ou dans l’EPV. Les LBt de l’EET sont

localisés essentiellement dans la médulla et sont rares dans le cortex. Hoffmann et al

identifient 2 sous-populations de morphologie distincte : la première est constituée de

cellules lymphoïdes rondes, de petite taille, et représente moins de 1% des lymphocytes de

la médulla. La seconde, encore plus rare, correspond à une sous-population de cellules de

grande taille avec des prolongements dendritiques, formant des rosettes avec les

lymphocytes T et exprimant le CD23, encore appelée cellule « astéroïde » (113,114).

L’étude de cytocentrifugation de suspensions cellulaires thymiques, à l’aide d’un anticorps

anti-CD20 montre que ces cellules astéroïdes pourraient représenter jusqu’à 50% des LBt

55

(115). Ces 2 types de cellules sont détectables dans les thymus de fœtus, de jeunes enfants

et d’adulte. Cependant, chez le fœtus, les cellules astéroïdes sont localisées essentiellement

au niveau de la jonction corticomédullaire, alors que chez l’adulte, elles sont davantage

dispersées dans la médulla ou regroupées autour des corpuscules de Hassal. L’existence de

2 sous-populations distinctes sur le plan morphologique est cependant contestée par les

études réalisées en microscopie electronique sur des thymus d’enfants agés de 6 mois à 10

ans par Borneman et al (116). Pour ces auteurs, tous les lymphocytes B de la médullaire

thymique sont de morphologie « astéroïde » mais leur taille peut être extrêmement variable,

de petite à grande, et la forme « à petites cellules rondes » identifiée par Hofffmann ne

serait qu’une variante cytologique de la cellule astéroïde.

Les LBt des EPV sont rares ou absents chez l’enfant, et leur nombre augmente chez

le jeune adulte et l’adulte d’âge moyen en particulier entre 10 et 50 ans, où ils sont parfois

associés à des follicules lymphoïdes (111). La présence de veinules postcapillaires (« high

endothelial venules ») dans l’EPV suggère que ces lymphocytes B proviennent des

lymphocytes du sang circulant (109).

III-2.3. Immunophénotype des LBt

Les lymphocytes de la médullaire thymique se distinguent des lymphocytes B de

l’EPV, du centre germinatif et de la couronne du manteau des follicules lymphoïdes des

ganglions lymphatiques par leurs caractéristiques morphologiques mais aussi

immunohistochimiques (82,106,111,113,114). Celles-ci sont résumées dans le tableau V.

56

Tableau V : Immunophénotype des LBt de la médullaire thymique comparé à celui

des LBt des EPV, des LB de la couronne du manteau et du centre germinatif des

follicules lymphoïdes

Marqueurs LBt Medulla*

LBt Medulla§

LBt des EPV§

LB du centre

germinatif

LB de la

couronne du

manteau Lymphocytaires B

CD19

CD20

CD22

CD37

CD72

+/- fœtus

+

+

+

+

+

+

+

+/-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Zone du manteau

CD5

-

nd

nd

-

+

Récepteur du complément et des

immunoglobulines

CD21

CD35

CD23

-

-

+ LBt

astéroïde

-

+

nd

+

+

nd

-

+

-

+

+

+

Immunoglobulines de surface

IgM

IgG

IgD

IgA

+

-

+/-

+/-

+

-

+/-

+/-

nd

nd

nd

nd

+/-

nd

-

-

+

nd

+

-

Molécules de costimulation

CD40

CD80

+

+/-

nd

nd

nd

nd

+

+

+

-

Légendes : * la première colonne résume les caractéristiques immunophénotypiques des LBt de la

médulla publiées par Isaacson, Hoffmann et Fend et réalisées sur coupes de thymus congelées ; §

dans les colonnes 2 et 3 sont indiqués les résultats de l’étude immunophénotypique réalisée par

Flores et al réalisées sur des coupes de thymus fixés en formol et inclus en paraffine ; LB,

lymphocyte B ; LBt, lymphocyte B thymique ; +, positif ; -, négatif ; +/- :sous-population positive.

57

Les travaux publiés par Isaacson, Hoffmann et Fend, concernent des séries limitées

de thymus de fœtus, d’enfant et de jeunes adultes. Les études immunohistochimiques ont

été réalisées sur des coupes de thymus congelées et les résultats sont résumés dans la

colonne 1 (*). Selon les auteurs, les LBt de la médulla présentent un phénotype CD20+

CD21- CD37+ CD72+, expriment le CD23 au niveau de la sous-population de

morphologie astéroïde, et expriment des immunoglobulines de surface, en particulier l’IgM

et plus rarement les IgD et IgA, et sont CD5 négatives. L’expression du CD19 est absente

chez le fœtus et apparaît après la naissance.

Dans l’étude de Flores et al, la caractérisation immunohistochimique des LBt a été

réalisée sur des coupes de thymus adulte, fixés et inclus en paraffine. Les résultats sont

présentés dans les colonnes 2 et 3 (§). Selon Flores et al, les LBt de la médulla se

distinguent des LBt de l’EPV par leur phénotype CD21- CD72-, ce qui contredit les

données des auteurs précédents en ce qui concerne l’expression de CD72. Ces

contradictions peuvent être imputables à la technique utilisée, la première étant une étude

immunohistochimique sur coupes de thymus congelées, la seconde étant réalisée sur des

coupes en paraffine. Une autre explication est que la molécule CD72 est un antigène

d’activation lymphocytaire B dont l’expression au niveau des LBt de la médulla semble

plus fréquente chez le jeune enfant et décroît avec l’âge. L’étude de Flores et al ne

concerne que des thymus de sujets adulte, ce qui peut expliquer l’absence d’expression de

CD72 par les LBt (111).

L’étude de Flores et al est intéressante car elle émet l’hypothèse d’un trafic possible

entre les LBt de la médulla et les LBt de l’EPV. En effet, la frontière entre les

compartiments thymiques que constituent l’EET et l’EPV n’est pas si imperméable que

l’on pourrait le penser. Plusieurs auteurs décrivent l’existence de brèches ou de ruptures de

58

la membrane basale, en particulier au niveau de points de contact entre les follicules

lymphoïdes de l’EPV et la médulla adjacente (82,117). Le nombre de lymphocytes B de la

médulla est d’autant plus important qu’il existe de nombreux follicules lymphoïdes dans

l’EPV adjacent. L’étude de Flores et al montre qu’à proximité des follicules lymphoïdes de

l’EPV, les LBt de la médulla présentent un phénotype CD21+ CD72+ caractéristique des

LBt de l’EPV, suggérant que des LBt transitent entre ces 2 compartiments thymiques (111).

Il existe des contradictions dans la littérature concernant l’expression du CD2 par

les LBt. Une étude en cytométrie de flux réalisée à partir de suspensions cellulaires de

cellules thymiques déplétée en lymphocytes T CD3+ CD4+ CD8+ par billes magnétiques,

a montré que près de 50% (chez un fœtus de 18 semaines) à 75% (chez un nouveau né de

2mois) des LBt CD19+ coexpriment la molécule d’adhésion CD2, alors que moins de 5%

des lymphocytes B CD19+ de la rate ou de la moelle hématopoïétique d’un fœtus

coexpriment CD2 (110). Tonnelle et al retrouvent également une expression de CD2 dans

30% des LBt CD19+ en cytométrie de flux (118). En revanche, cette expression de CD2

par les LBt n’a pas été retrouvée dans l’étude de Howe et al, réalisée par

immunohistochimie en simple et double immunomarquage sur coupes de thymus congelées

provenant de fœtus, de nouveau-nés et d’enfants agés de 2 mois à 10 ans (115). De la

même façon, l’expression de CD5 est détectée en cytométrie de flux dans près de 50% à

70% des LBt mais reste non détectée en immunofluorescence sur coupes de thymus

congelées (110,118,119). Ces discordances peuvent s’expliquer par un défaut de sensibilité

des techniques immunohistochimiques, un biais dans les études en cytométrie de flux lié à

la formation de rosettes de lymphocytes B et de thymocytes ou à une adsorption

membranaire passive.

Howe et al ont étudié l’expression de la molécule CD40, appartenant à la famille du

Tumor Necrosis Factor, et de la molécule de costimulation CD80 par les LBt, en

59

immunohistochimie sur coupes de thymus congelées (115). La majorité des LBt expriment

le CD40 et seule une fraction des LBt expriment la molécule CD80. L’incubation de

suspensions cellulaires thymiques avec les anticorps anti-CD40 et anti-CD80 ne permet pas

de dissocier les rosettes, suggérant que d’autres molécules sont probablement impliquées

dans les interactions B-T, et que ces rosettes sont extrêmement stables. Punnonen et al

retrouvent également une expression de CD40 par les LBt CD19+ en cytométrie de flux

(110).

III-2.4. Caractéristiques génotypiques des LBt

Si ces études nous renseignent sur les aspects morphologiques et les antigènes de

surface exprimés par les LBt, il existe peu de données sur l’existence d’une ontogenèse B

intrathymique chez l’homme, ceci encore une fois étant lié à la difficulté d’analyse de cette

population lymphocytaire thymique très minoritaire. L’analyse du statut des gènes codant

pour les chaînes lourdes des immunoglobulines nous renseigne toutefois sur le stade de

différenciation et de maturation des LBt.

Dunn-Walters et al ont montré par des études de microdissection du cortex et de la

médullaire thymique, que la médulla renfermait des LBt présentant un réarrangement des

chaînes lourdes des immunoglobulines (120). Les auteurs ont ensuite extrait l’ADN de

coupes entières de 2 thymus d’enfants, amplifiés par PCR la région VDJ des gènes codant

pour les chaînes lourdes des immunoglobulines (IgVH), clonés et séquencés les produits de

PCR obtenus. Les 19 clones séquencés correspondaient à 11 séquences différentes et la

majorité d’entre elles (9/11) ne présentaient pas de mutations. Les auteurs concluent que la

médullaire thymique renferme une population hétérogène de LBt, la majorité d’entre eux

présentant des gènes IgVH non mutés, caractéristiques des cellules lymphoïdes B naïves, et

un plus faible pourcentage présentant des gènes IgVH mutés.

60

Ces résultats sont en désaccord avec l’étude de Tonnelle et al (118). Les auteurs ont

analysé 2 thymus d’enfants, et montré dans un premier temps que les LBt présentaient un

biais du répertoire des IgVH, avec une représentation prépondérante de la famille VH4,

contrairement aux lymphocytes B de l’amygdale ou de la moelle hématopoïétique où la

famille VH3 est prédominante. D’autre part, sur les 45 cDNA VH4DJ séquencés, 38

présentaient des mutations somatiques avec un rapport R/S (mutation de

remplacement/mutation silencieuse) élevé de 5.04.

Flores et al ont étudié le statut des gènes IgVH des LBt, en séparant les LBt de

l’EET des LBt de l’EPV (111). Ils ont étudiés d’une part un thymus d’enfant, dont l’EPV

est à cet âge dépourvu de LBt, et dont l’analyse du statut des gènes IgVH reflète celui des

LBt de la médulla. D’autre part, ils ont microdisséqués l’EPV d’un thymus d’adulte afin

d’obtenir le statut des gènes IgVH des LBt de l’EPV. Treize des 46 séquences VH obtenues

à partir des LBt de la médulla du thymus d’enfant étaient uniques, et 4 (31%) d’entre elles

présentaient des mutations somatiques et 2 séquences étaient apparentées. Dix des 65

séquences obtenues à partir des LBt de l’EPV étaient uniques, 5 (50%) étaient mutées et 2

séquences étaient apparentées. Les séquences apparentées retrouvées dans la médulla et

dans l’EPV suggèrent l’existence de mutations somatiques des gènes IgVH dans ces 2

compartiments thymiques. Dans l’EPV, la présence de follicules lymphoïdes à centre clair

permet d’expliquer la présence de mutations somatiques. Dans la médulla, les auteurs

suggèrent que la présence d’une variation intraclonale pourrait s’expliquer par la capacité

des LBt de la médulla à transiter entre l’EET et l’EPV.

Ces résultats indiquent que les LBt de la médulla et de l’EPV sont des lymphocytes

B matures, présentant des réarrangements des chaînes lourdes des immunoglobulines

fonctionnels, et que ces gènes ont été l’objet d’un processus de mutations somatiques dans

61

certaines cellules. Le faible nombre d’études réalisées ne permet pas de savoir s’il existe un

biais du répertoire ni de comprendre l’origine des mutations observées.

III-2.5. Caractéristiques fonctionnelles

Les rares études fonctionnelles ont été réalisées par Spencer et al (112). Dix pour

cent des LBt isolés à partir de suspensions cellulaires de thymus d’enfants présentent une

expression de l’antigène Ki67, qui marque les cellules en cycle. En culture, les LBt

deviennent quiescents assez rapidement et meurent après une période de 10 jours sauf s’ils

sont stimulés par des mitogènes. Les LBt répondent aux activateurs polyclonaux des

lymphocytes B tels que le Staphylococcus aureus Cowan I (SAC), le phorbol 12-myristate

13-acetate (PMA) et le « pokeweed mitogen » (PWM). Lorsqu’ils sont stimulés, les LBt

conservent leur morphologie « astéroïde » et leurs interactions avec les thymocytes avec

formation de rosettes. Dans une étude ultérieure, les auteurs ont montré la grande stabilité

des rosettes lorsque celles-ci sont soumises à différents traitements tels que l’EDTA, la

cytochalasin B, la colchicine, l’azide de sodium, la pronase, expliquant ainsi la grande

difficulté à obtenir des suspensions cellulaires pures de LBt (115). La stabilité de ces

rosettes peut aussi expliquer l’expression de CD2 et de CD5 par les LBt observée en

cytométrie de flux par Punnonen et al, alors qu’elle n’est pas observée en

immunohistochimie sur coupes de thymus congelées (110).

Les études réalisées in vitro par Punnonen et al montrent que les LBt obtenus à

partir de suspensions cellulaires thymiques de fœtus ou de nouveau nés sont des

lymphocytes B fonctionnellement matures, exprimant des IgM à leur surface, et capables

de se différencier en lymphocytes B sécrétant des immunoglobulines de type IgG et IgE

quand ils sont cultivés en présence d’IL-4 et d’un clone T CD4+ activé. Le taux

d’immunoglobulines produites est comparable à celui que l’on peut obtenir à partir de

62

lymphocytes B isolés d’une rate, du foie ou de la möelle de foetus cultivés dans les mêmes

conditions.

III-2.6. Conclusion

Les LBt sont répartis dans 2 compartiments distincts, l’espace épithélial thymique

et l’espace périvasculaire. L’analyse des gènes des immunoglobulines des LBt montre qu’il

existe dans ces 2 compartiments des LBt présentant des gènes IgVH non mutés,

caractéristiques des cellules lymphoïdes B naïves, et des LBt présentant un taux élevé de

mutations somatiques. Contrairement à la souris (cf infra), il n’existe pas chez l’homme de

données permettant d’étayer l’hypothèse d’une ontogénie B intrathymique, ou que ces LBt

possèdent une fonction particulière, notamment dans le processus de sélection négative des

lymphocytes T.

L’hypothèse que les LBPM dérivent des LBt de la médulla repose sur des

arguments anatomiques, morphologiques et immunohistochimiques. Certaines tumeurs

sont clairement développées à partir du thymus, avec dans certains cas un envahissement

tumoral restreint à la médullaire thymique, refoulant le cortex en périphérie. Les LBt de la

médulla présentent un profil immunohistochimique comparable à celui des cellules

tumorales des LBPM, notamment l’expression de la molécule CD23 et l’absence

d’expression de CD21. De Leval et al suggèrent cependant que les LBPM pourraient

dériver des follicules lymphoïdes observés dans l’EPV thymique (86). En effet, ces

follicules lymphoïdes sont particulièrement fréquents chez l’adulte jeune, à l’âge où l’on

observe les LBPM, et diminuent avec l’âge. Le fait qu’il existe probablement un trafic des

LBt entre les 2 compartiments thymiques pourrait étayer cette hypothèse. Néanmoins, les

études sur puces à ADN récemment publiées montrent que les LBPM présentent un profil

63

transcriptionnel distinct de celui des cellules B du centre germinatif, et ne favorisent donc

pas l’hypothèse que les LBPM dérivent des follicules lymphoïdes de l’EPV (93,121).

III-3. Les lymphocytes B thymiques chez la souris

Contrairement à l’homme, les données de la littérature sur les LBt chez la souris

sont relativement abondantes. Seules les données les plus importantes sont rapportées

ici.

III-3.1. Cinétique des thymocytes

Chez le foetus, la colonisation du thymus par des cellules précurseurs

hématopoïétiques, capable de se différencier en lymphocytes B et T débute à 12 jours de

vie foetale (122). Chez la souris adulte, le thymus est régulièrement ensemencé par des

cellules précurseurs hématopoïétiques, mais à un taux plus faible que chez le fœtus

(123). L’identité de ces cellules précurseurs n’est pas encore clairement définie, mais le

concept généralement admis est que les progéniteurs lymphoïdes thymiques dérivent des

"précurseurs lymphoïdes communs" (CLP) identifiés dans la moelle osseuse et qui

possèdent un potentiel de différenciation restreint aux lignées T, B et NK. Dans le

thymus de la souris adulte, le précurseur hématopoïétique le plus précoce qui peut être

retrouvé présente un phénotype CD4low CD44 high c-Kit+.

D'après les expériences de Akashi, le pool des thymocytes présente un

renouvellement tous les 6 jours (123). Seulement 1% des thymocytes émigrent chaque

jour, la grande majorité d'entre eux meurent par apoptose secondaire à une sélection

négative ou à un défaut de sélection positive. Ces cellules qui quittent quotidiennement

le thymus vers les organes lymphoïdes secondaires (OLS) sont appelées "émigrants

thymiques récents" (RTE). Leur cinétique d'apparition dans les OLS peut être analysée

après marquage in vivo des thymocytes par injection intra thymique de FITC. Ainsi, les

64

RTE de la rate et des ganglions évalués 24h après injection intra thymique de FITC sont

constitués de 95% de lymphocytes Tαβ CD4+CD8- ou CD4-CD8+ et de 5% de

lymphocytes double négatifs CD4-CD8-. Parmi ces derniers, il existe des lymphocytes T

CD3+TCRγδ+, des lymphocytes B matures B220+IgM+, IgD+, CD5-/+ (une minorité

d'entre eux expriment le CD5) et quelques lymphocytes T CD3+ TCR γδ-. Les auteurs

estiment que le thymus exporte chaque jour vers les OLS ~1,2 x 106 lymphocytes T αβ,

~3 x 104 lymphocytes T γδ et ~3 x 104 lymphocytes B matures B220+IgM+.

III-3.2. Lymphopoïèse B intrathymique

Les lymphocytes B intra thymiques sont-ils issus d'une lymphopoïèse B intra

thymique ou d'une recirculation de lymphocytes B périphériques dans le thymus?

L'injection intraveineuse de splénocytes de souris adultes (Ly5.1 x Ly.2)F1 à des souris

Ly5.1 permet d'évaluer le pourcentage de lymphocytes B matures issus du donneur dans

les organes lymphoïdes secondaires et le thymus des souris après injection. A 18 jours

post injection, ~5-7% des lymphocytes B des OLS (rate, ganglions) sont du donneur,

alors que seulement ~0,6% des lymphocytes B matures du thymus sont du donneur. Les

auteurs suggèrent que la majorité des lymphocytes B (~2 x 104) exportés chaque jour du

thymus vers les OLS se développent et se différencient donc dans le thymus, et seule

une minorité d'entre eux (~0.8 x 104) sont des lymphocytes B d'origine périphérique

ayant transité par le thymus (123). Ces résultats indiquent que le thymus, qui joue un

rôle majeur dans la différenciation T, pourrait contribuer également à la constitution

d'un pool de lymphocytes B circulants.

Le thymus adulte renferme des lymphocytes B thymiques B220+ qui

représentent environ 0,1 à 0,3% des thymocytes totaux. Parmi ceux-ci, il existe des

progéniteurs B et des LBt matures. Les progéniteurs B sont à différents stades de

65

maturation tels que l’on peut les observer dans la moelle hématopoïétique: des

lymphocytes pro-B B220+ CD43+ sIgM- et pré-B B220+ CD43- sIgM-. Ces précurseurs

expriment les marqueurs moléculaires associés au développement précoce des

lymphocytes B comme le facteur de transcription PAX-5 et les molécules VpreB et λ5

(123). L’analyse des gènes codant pour les chaînes lourdes des immunoglobulines

montre que ces progéniteurs présentent un réarrangement DJ/VDJ (124).

Les LBt matures sont essentiellement des LBt activés et expriment les marqueurs

tels que B220+, sIgM+, FcγR, CD44, (LFA)-1, HSA (« heat-stable antigen), CD40, les

molécules du complexe majeur d’histocompatibilté II. Environ 75% sont CD5+ et

expriment la molécule d’activation CD69. Malgré l’expression de CD5 en surface,

l’ARNm CD5 n’est pas retrouvé en RT-PCR, suggérant que cette expression puisse être

liée à un transfert passif à partir des lymphocytes T environnants. Les LBt présentent

également des taux élevés de molécule de co-activation B7-2 (125,126).

Une étude immunohistochimique à l’aide d’anticorps anti-B220 et anti-IgM

montre que les cellules B immatures B220+ IgM- sont distribuées du cortex jusqu'à la

jonction cortico-médullaire tandis que les cellules B matures IgM+ sont distribuées

préférentiellement à la jonction cortico-médullaire et dans la médulla (123). L’ensemble

de ces éléments suggère que le microenvironnement thymique est susceptible d’assurer

une maturation lymphoide B comme T, et que la maturation lymphoide B intrathymique

s’effectue parallèlement à la migration des lymphocytes B du cortex vers la médulla,

comme il est observé dans la lymphopoièse T.

Le thymus constitue un site majeur de différenciation lymphocytaire T. Le

microenvironnement thymique, caractérisé par les cellules épithéliales thymiques, les

cellules dendritiques issues de la moelle osseuse, les macrophages, les lymphocytes B et

66

le stroma, fournit les signaux nécessaires à la prolifération, la maturation et à la

sélection positive ou négative des lymphocytes T. L’interleukine 7 (IL7) est présente

dans le milieu thymique, où elle est sécrétée par les cellules épithéliales thymiques. Elle

joue un rôle important dans la prolifération, la survie et la différenciation des

thymocytes vers la lignée T. L’IL7 favorise la survie des thymocytes ayant subit une

sélection positive en augmentant l’expression de Bcl2. Il faut noter que cette cytokine

joue également un rôle important dans la maturation lymphoïde B du stade pro-B vers le

stade pré-B dans la moelle osseuse.

Les signaux délivrés par le micrenvironnement thymique conditionnent le

devenir des précurseurs thymiques. L’activation de la voie de signalisation Notch1 joue

un rôle crucial dans la différenciation des précurseurs vers la lignée lymphocytaire B ou

T. Notch1 est une protéine transmembranaire exprimée à la surface des CLP.

L’interaction de Notch1 avec un de ses ligands (Delta-1) exprimés par les cellules

stromales thymiques induit la différenciation des précurseurs vers la lignée T et bloque

le développement lymphocytaire B (127,128). Cependant, il semblerait que certains

précurseurs échappent à cette voie de régulation de la thymopoïèse et se développent en

lymphocytes pro-B B220+ CD43+ sIgM-. In vitro, certaines lignées dérivées du stroma

thymique sont capables d’induire une maturation des progéniteurs thymiques en LBt

matures (129,130). Paradoxalement, malgré la présence de progéniteurs B dans le

thymus et la présence d’IL7 qui stimule la prolifération des lymphocytes pro-B dans la

moelle, la lymphopoïèse B thymique apparaît extrêmement inefficace. Hashimoto et al

ont montré très récemment que la différenciation des progéniteurs B thymiques était

limitée à un stade de développement précoce par des facteurs solubles sécrétés par le

microenvironnement thymique diminuant la réponse des cellules B à l’IL7 (131). Ces

différents mécanismes régulateurs permettent de contrôler l’homéostasie des thymocytes

67

et d’inhiber l’expansion des précurseurs B qui pourrait se faire au détriment de la

lymphoïèse T.

III-3.3. Caractéristiques fonctionnelles des lymphocytes B thymiques

Sur le plan fonctionnel, les lymphocytes B thymiques CD5+ prolifèrent moins et

synthétisent beaucoup moins d'IgM et d'IgG que les lymphocytes B spléniques en

réponse aux stimuli tels que LPS ou la costimulation IL-4/anti µ (132,133).

Contrairement aux lymphocytes B spléniques, les LBt ne répondent pas à une

stimulation CD40L seule. L'addition d'interleukine 10 est nécessaire et a un effet

synergique sur la réponse proliférative des LBt (133). Les LBt représentent donc un

sous-type de lymphocytes B aux propriétés fonctionnelles distinctes des lymphocytes B

spléniques.

III-3.4. Fonction des lymphocytes B thymiques.

De nombreuses études suggèrent que les lymphocytes B thymiques contribuent

en tant que cellules présentatrices de l'antigène à la sélection négative des lymphocytes

T au cours de différenciation intrathymique (par délétion clonale ou anergie) et

contribuent donc à la tolérance du soi (126,132,134). D'autre part, il a été suggéré que

ces lymphocytes B qui se différencient dans le thymus pourraient avoir un répertoire

différent et qu’ils pourraient participer à la diversification du répertoire B périphérique.

III-3.5. Conclusion

Les expériences chez la souris montrent qu’il existe une lymphopoïèse B

intrathymique, mais que celle-ci est régulée négativement d’une part par la voie de

signalisation Notch1 et d’autre part par la synthèse de signaux inhibiteurs par le

68

microenvironnement thymique. Ces signaux permettent d’inhiber l’expansion B

intrathymique qui pourrait se faire au détriment de la lymphopoïèse T. Les LBt

présentent des propriétés fonctionnelles distinctes des lymphocytes B périphériques en

terme de réponse à des stimulis cytokiniques comme l’IL-10. Enfin, ils jouent

probablement un rôle dans la tolérance au soi.

69

IV. ETUDE COMPARATIVE DES LBPM ET DES LGCB

NON MEDIASTINAUX PAR LES METHODES D’ANALYSE

DIFFERENTIELLE

70

IV-1. Objectifs de l’étude.

Les LBPM constituent une entité distincte au sein des LGCB du fait de leurs

caractéristiques cliniques, morphologiques et immunohistochimiques. Les LBPM ne

présentent pas les anomalies moléculaires habituellement observées dans les LGCB

périphériques et aucun marqueur génétique spécifique de cette entité n’a été identifié à ce

jour.

Afin d’identifier des altérations moléculaires spécifiquement associées aux LBPM,

nous avons comparé les ARNm exprimés dans un groupe de LBPM aux ARNm exprimés

dans un groupe de LGCB périphériques. Nous avons pour cela utilisé des méthodes

d’analyse différentielle, la première étant la méthode du « Differential Display Reverse

Transcription » (DDRT) et la seconde la méthode du « Représentational Difference

Analysis » ( RDA). Les principes de ces 2 méthodes sont exposés dans les annexes 1 et 2.

Ces travaux ont fait l’objet de 3 publications : les 2 premières concernent

l’identification du gène MAL dans les LBPM puis son expression dans les tissus

lymphoïdes normaux et pathologiques. La 3ième publication concerne la mise en évidence

d’une activation constitutive du gène FIG1 (interleukin Four Induced Gene 1) dans les

LBPM.

71

IV-2. Principe des techniques

IV-2.1. Principe de la méthode du Differential Display Reverse Transcription

La méthode du « Differential Display Reverse Transcription » (DDRT) a été

initialement décrite par Liang et al, et permet de comparer les séquences exprimées dans

des cellules de même origine et d’identifier des transcrits différentiels (135). Cette

méthode, qui présente l’avantage de nécessiter peu de matériel initial, a été utilisée dans la

littérature pour identifier des séquences spécifiquement exprimées dans certains cancers,

notamment le cancer du sein (136,137), le cancer de la prostate (138), ou dans des

lymphomes (139,140).

Le principe du DDRT est le suivant : une cellule produit environ 15000 à 20000

ARNm différents. Si on utilise 12 oligonucléotides différents 5’ (T)nXY 3’ (ou X=A, C ou

G et Y=A,C,G ou T) pour réaliser la transcription inverse de ces ARN messagers, on

partitionne la population initiale en 12, et le produit de chaque transcription inverse

comportera ~ 1500 ADNc différents. Chacune de ces réactions de réverse transcription est

ensuite amplifiée par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec

l’oligonucléotide 5’ (T)nXY 3’ correspondant et un oligonucléotide de 10 bp.

L’amplification est faite en présence de dATP marqué au 33P et les produits d’amplification

sont déposés sur un gel de séquence, ce qui permet de les séparer en fonction de leur

longueur à un nucléotide près. Un gel permet de visualiser au maximum 150 fragments

d’ADNc, la population initiale d’ADNc (1500 ADNc par reverse transcription) peut donc

théoriquement être visualisée en réalisant 10 réactions de PCR différentes en utilisant 10

oligonucléotides de 10 bases pour chaque oligonucléotide (T)nXY (figure 2).

72

Y X TTTTTTTTTn

Figure 2 : Principe du Differential Display Reverse Transcription

Analyse sur gel de polyacrylamide

Cellules A

Purification du fragment Réamplification par PCR

Clonage Séquençage Expression

Y’X’AAAAAAA5’

Y’X’AAAAAAAAAn Y X TTTTTTTTTn

5’ 3’

Y X TTTTTTTTTn

3’

NNNNNNNNNN

Y X TTTTTTTTTn

NNNNNNNNNN

Cellules B

Transcription inverse

ARN totaux ou poly(A)+

Amplification par PCR Décamère arbitraire

et oligodTn ancré

73

IV-2. 2. Principe de la méthode du Representational Difference Analysis

La technique du « Representational Difference Analysis » (RDA) a été

développée par Lisitsyn et al et publiée dans Science en 1993 (141). Initialement,

cette technique a été mise au point pour l'analyse différentielle de l'ADN génomique.

Elle a été adaptée ensuite par Hubank et al à l’analyse différentielle des ARN sous la

forme d’ADNc complémentaires (142).

Le principe de la méthode est d’associer une première étape d’hybridation

soustractive entre la population d'ADNc cible (appelée aussi tester) et une population

d’ADNc de référence (appelée driver) présente en excès. La seconde étape est une

étape d’amplification par polymérisation en chaîne (PCR), où seules les séquences

différentielles présentes dans la population tester sont amplifiées. Cette étape permet

un enrichissement cinétique en séquences cibles. Plusieurs cycles d’hybridation-

amplification sont ainsi réalisés permettant d’obtenir un produit différentiel. A la fin

du 3ième cycle, on estime que les séquences cibles sont enrichies d’un facteur ~1010.

Les produits différentiels sont déposés sur gel, et les bandes différentielles peuvent

ensuite être clonées et analysées. Le principe de la méthode est présenté sur la figure

3.

74

Tester Driver ARNm

ADNc double brin

Digestion enzymatique

Ligation d’adaptateurs

Amplification par PCR

Representations

hybridation tester/driver

Amplification par PCR

exponentielle linéaire

Digestion de l’ADN simple brin Amplification par PCR

absente

Ligation d’adaptateurs sur la population tester

Changement d’adaptateurs

hybridation DP1/driver

Amplification par PCR

Clonage Séquençage Expression

Figure 3 : Principe du Representational Difference Analysis

Premier produit Différentiel DP1

Deuxième produit Différentiel DP2

75

Les ARN à analyser sont représentés sous la forme de courtes séquences

d’ADNc double brin, appelées représentations. Les représentations sont obtenues par

transcription inverse des ARN polyA en ADNc double brin. Les ADNc double brin

sont ensuite soumis à une digestion par une enzyme de restriction DpnII ayant un site

à 4 bases (GATC). La taille moyenne des fragments d’ADNc double brin obtenus

après digestion est de l’ordre de 256 pb, ce qui veut dire que la majorité des ADNc

contiennent au moins un fragment amplifiable, ce qui est suffisant pour mettre en

évidence et isoler un gène différentiel. Ces ADNc double brin clivés sont ensuite

ligués à des adaptateurs A, et ensuite amplifiés par polymérisation en chaîne (PCR).

Cette étape permet d’obtenir une quantité suffisante d’ADNc appelée représentation

pour réaliser les cycles successifs d’hybridation-soustraction et tester les séquences

différentielles obtenues.

Les adaptateurs A sont enlevés des représentations par digestion par DpnII et

seuls les ADNc tester sont ligués à de nouveaux adaptateurs B. Les représentations

tester et driver sont ensuite dénaturées et réhybridées en présence d’un excès de

driver avec un rapport tester/driver de 1/100 pour le premier cycle. Après

hybridation, seuls les ADNc double brin constitués uniquement d’ADNc tester donc

munis d’amorces aux extrémités 5’ vont pouvoir être amplifiés de manière

exponentielle par PCR. Les ADNc consitués d’un brin tester et d’un brin driver ne

pourront en revanche qu’être amplifiés de façon linéaire. Une digestion par une

desoxyribonucléase hydrolysant le simple brin permet d’éliminer cette amplification

linéaire. Le premier produit différentiel DP1 est ainsi obtenu. Un deuxième cycle

d’hybridation soustractive-amplification avec un rapport tester/driver de 1/800 est

réalisé avec de nouveaux adaptateurs de façon à enrichir le produit DPI en séquences

différentielles. Le produit différentiel DP2 peut être ensuite analysé ou être l’objet

76

d’un 3ème cycle. Les différents fragments d’ADNc contenus dans le produit DP2 sont

séparés par électrophorèse sur gel d’acrylamide et les bandes visualisées sont

extraites du gel. Les différents fragments DP2 sont ensuite sous-clonés dans un

plasmide.

Le caractère différentiel des séquences isolées doit être confirmé. Les inserts

(fragment DP2 inséré dans le plasmide) sont purifiés, marqués radioactivement et

hybridés aux représentations tester et driver transférés par Southern blot sur une

membrane de nylon. Le caractère différentiel confirmé, ces inserts sont séquencés et

identifiés par comparaison aux bases de données.

Les avantages du RDA par rapport au DDRT sont sa rapidité et le fait que les

séquences communes sont éliminées et seules sont conservées les séquences

différentielles. La sensibilité est plus grande et les faux positifs moins nombreux. Les

inconvénients du RDA sont sa grande sensibilité, la mise en évidence d’ARNs peu

exprimés ou d’ARNs liés à un épissage différentiel ou encore d’ARNs « privés »

(séquences VDJ des gènes des immunoglobulines). Par ailleurs, cette technique ne

permet pas de mettre en évidence des différences liées à des mutations ponctuelles,

ou à de très petites délétions ou insertions, ou encore des fragments ne possédant pas

de site de restriction pour l’enzyme utilisée.

77

IV-3. Le gène MAL et les LBPM

IV-3.1. Article 1

« The MAL gene is expressed in primary mediastinal large B-cell

lymphoma »

Christiane Copie-Bergman, Philippe Gaulard, Leïla Maouche-Chrétien, Josette Brière,

Corinne Haioun, Miguel A. Alonso, Paul-Henri Roméo et Karen Leroy.

Blood 94 :3567-3575, 1999.

78

But de l’étude

Le but de ce travail était d’identifier des séquences exprimées spécifiquement et de

manière récurrente dans les cellules tumorales des LBPM afin de mieux cerner cette entité

anatomo-clinique et d’apporter des éléments permettant de comprendre les mécanismes

moléculaires impliqués dans la transformation des lymphocytes B thymiques.

Matériel

Le matériel tumoral inclus en paraffine et congelé de 10 patients atteints de LBPM

et de 8 patients atteints d’un LGCB-NM a été récolté à partir des archives du département

de Pathologie de l’Hôpital Henri Mondor, Créteil et de l’Hôpital Laennec, Paris. Le

diagnostic de lymphome a été établi selon des critères cliniques, morphologiques et

immunohistochimiques, et les lymphomes ont été classés selon la classification de la

REAL (3).

Les lignées utilisées dans cette étude étaient une lignée T (Jurkat), des lignées B à

différents stades de différenciation : pro B (RS 4 :11), pré B (697), des lignées dérivées de

lymphome de Burkitt (Raji et Ramos), et une lignée B porteuse de la translocation t(14 ;18)

(RL). Une lignée d’origine épithéliale (Hela) et des lignées érythroleucémiques (K562 et

HEL) ont également été utilisées.

Méthodes

Méthode du Differential Display Reverse Transcription (DDRT)

Nous avons comparé les ARNm exprimés dans des LBPM aux ARNm exprimés

dans des LGCB non médiastinaux (LGCB-NM) par la méthode du DDRT (135) (Annexe

1). Nous avons extrait l’ARN de 3 LBPM et de 3 LGCB-NM à partir de tissu tumoral

congelé en réalisant une lyse tissulaire en présence de phénol et de thiocyanate de

79

guanidine, selon une technique décrite par Chomczynski et al (143) (technique TRIZOL).

Après enrichissement en ARN poly(A), une transcription inverse a été réalisée avec une

amorce oligonucléotidique T12GC. La population d’ADNc obtenue a ensuite été amplifiée

par PCR à l’aide de l’oligonucléotide T12GC et du décamère arbitraire OPA 18 (5’

AGGTGACCGT 3’), en présence de dATP [α-33P]. Les produits de PCR ont été ensuite

séparés sur un gel d’acrylamide. L’analyse comparative du gel a permis d’identifier des

bandes différentielles. L’une d’entre elles a été excisée du gel, l’ADNc a été extrait et

réamplifié avec le même couple d’amorces, puis cloné dans un plasmide Bluescript pour

être ensuite séquencé.

Analyse en Northern Blot

Les ARNs totaux ont été extrait du matériel tumoral congelé ou des lignées à l’aide du

réactif TRIZOL. Après dénaturation et migration sur gel, les ARNs ont été transférés sur

membrane de nylon et hybridés à l’aide d’une sonde marquée au α-32P. La sonde MAL

utilisée était obtenue par amplification par PCR d’un fragment d’ADNc (nucléotide 62 à

585). Une sonde spécifique du gène GAPDH était utilisée comme contrôle.

Analyse en RT-PCR

Une transcription inverse a été réalisée à partir d’1µg d’ARN total en présence

d’hexamères aléatoires. La réaction de PCR a été effectuée en biplex en présence

d’amorces spécifiques de l’ADNc MAL et d’amorces spécifiques de l’ADNc S14 (gène

ubiquitaire codant pour une protéine ribosomale). Les produits de PCR ont été déposés sur

gel d’agarose à 2% et analysés.

Extraction d’ADN et analyse en Southern Blot

L’ADN génomique de 6 LBPM et 3 LGCB-NM a été extrait par digestion à la protéinase

K, extraction au phénol-chloroforme et précipitation à l’éthanol. Après digestion par

l’enzyme de restriction EcoRI, les fragments d’ADN ont été séparés par électrophorèse sur

80

gel d’agarose 0,8% et transférés sur membrane de nylon. Celle-ci a ensuite été hybridée à

l’aide de 2 sondes MAL : la première correspondait à un fragment EcoRI-HindIII localisé à

3,5 kb en amont du premier exon MAL et permettait d’explorer la partie 5’ du gène. La

seconde sonde était obtenue par amplification par PCR d’un fragment d’ADNc MAL

couvrant les exons 2, 3 et 4, et explorant la partie 3’ du gène MAL.

Immunohistochimie

L’étude immunohistochimique des prélèvement tumoraux a été réalisée sur coupes en

paraffine en utilisant un anticorps monoclonal anti-MAL 6D9 dirigé contre les acides

aminés 114-123 de la protéine humaine MAL (MA Alonso, Madrid) et révélé par une

technique APAAP (144). Des coupes de rein inclus en paraffine étaient utilisées comme

contrôle.

Résultats

Par la technique du DDRT, nous avons mis en évidence une bande différentielle

présente dans les 3 LBPM et absente dans les 3 LGCB-NM testés. Cette bande a été

séquencée et correspondait à l’extrémité 3’ du transcrit du gène MAL, dont l’expression a

été initialement décrite comme étant associée à la maturation lymphocytaire T (145).

Pour confirmer que la bande différentielle observée en DDRT correspondait

véritablement à un transcrit différentiel, nous avons étudié l’expression du gène MAL dans

des échantillons de LBPM et LGCB-NM par Northern Blot. Cette étude montrait la

présence des transcrits MAL dans les 2 LBPM analysés, alors qu’ils étaient absents ou

exprimés très faiblement dans les 4 LGCB-NM analysés. L’étude des différentes lignées

par Northern blot, montrait l’absence du transcrit MAL dans les lignées B à différents

stades de maturation, dans les lignées érythroleucémiques et dans la lignée Hela. La lignée

81

T Jurkat exprimait le transcrit MAL comme il a été initialement décrit par Alonso et al et

servait de témoin positif (145).

Devant la difficulté à obtenir suffisamment de matériel congelé pour réaliser des

études en Northern blot, et pour pouvoir étendre l’analyse de l’expression de MAL à une

plus grande série de LBPM, nous avons étudié par RT-PCR 12 LBPM et 8 LGCB-NM.

Cette étude a permis de montrer l’amplification d’un fragment de 520 pb spécifique de

l’ADNc MAL dans 8 LBPM sur 12, faiblement représenté (2/8) ou indétectable (6/8) dans 8

LGCB-NM.

Ces 2 études par Northern blot et RT-PCR ont permis de confirmer l’expression

différentielle du gène MAL dans les LBPM par rapport aux LGCB-NM. L’expression du

gène MAL ayant été initialement décrite comme associée à la différenciation lymphocytaire

T, il était important de savoir si cette expression provenait des cellules tumorales B des

LBPM ou des lymphocytes T réactionnels présents au sein de la tumeur. L’étude de

l’expression de la protéine MAL par immunohistochimie permettait de détecter la protéine

MAL dans les cellules tumorales de 7/9 LBPM, avec un marquage de la membrane

plasmique et/ou de granulations intracytoplasmiques notamment dans la région de

l’appareil de Golgi. L’expression de MAL par de petits lymphocytes correspondant très

vraisemblablement à des lymphocytes T réactionnels, servait de témoin positif interne. En

revanche, aucun des 8 LGCB-NM analysés ne montrait d’expression de la protéine MAL

dans les cellules tumorales. L’étude en Southern blot ne montrait pas de réarrangement ou

d’amplification du gène MAL dans les 6 LBPM analysés.

82

Conclusion

Cette étude a permis de montrer une expression différentielle et récurrente des

transcrits MAL dans les LBPM comparativement aux LGCB-NM, confirmant ainsi

l’hypothèse que les LBPM constituent une entité distincte au sein des LGCB.

En outre, cette étude décrivait pour la première fois une expression du gène MAL

dans des cellules lymphoïde B, cette expression n’ayant été décrite jusqu’alors que dans la

lignée lymphocytaire T.

La protéine MAL est une protéine transmembranaire localisée dans les

microdomaines membranaires enrichis en glycolipides du réseau transgolgien et de la

membrane plasmique, et il a été suggéré qu’elle pourrait jouer un rôle dans la transduction

du signal dans les lymphocytes T (146). Son expression dans les cellules tumorales des

LBPM pourrait modifier les propriétés fonctionnelles de ces microdomaines membranaires

et altérer la croissance cellulaire ou les interactions cellule-cellule ou cellule-matrice.

83

IV-3.2. Article 2

« MAL expression in lymphoid cells: further evidence for MAL as a

distinct molecular marker of primary mediastinal large B-cell

lymphomas »

Christiane Copie-Bergman, Anne Plonquet, Miguel A. Alonso, Marie-Laure Boulland,

Jeanine Marquet, Marine Divine, Peter Möller, Karen Leroy, Philippe Gaulard.

Modern Pathology 15:1172-1180, 2002

84

But de l’étude

Dans l’étude précédente, nous avons mis en évidence une expression récurrente et

différentielle du gène MAL dans les LBPM comparativement aux LGCB-NM. L’ARNm

MAL a été identifié initialement comme étant associé à la différenciation lymphocytaire T

(145). Par la suite son expression a été mise en évidence dans les cellules synthétisant la

myéline chez le rat (147), dans des lignées épithéliales polarisées dérivées de rein de chien

(148) et de thyroïdes de rat (149). Le transcrit MAL code pour un protéolipide qui joue un

rôle dans la stabilisation des microdomaines membranaires, dans la machinerie de transport

vésiculaire intracellulaire et pourrait intervenir dans la transduction du signal (146,150-

152). Son expression n’avait jamais été décrite dans la lignée lymphoïde B, mais les

données de la littérature sur les modalités d’expression de ce gène dans les tissus

lymphoïdes sont assez pauvres.

Le but de cette étude était d’étendre l’analyse de l’expression de la protéine MAL à

des lymphocytes B et T normaux issus du sang circulant ou des tissus lymphoïdes

périphériques, à une série de 185 lymphomes représentant les principaux lymphomes B, T

et de Hodgkin cités dans la classification de l’OMS, et à la lignée MedB-1, en utilisant des

méthodes de cytométrie en flux et d’immunohistochimie.

Matériel et méthodes

Cytométrie en flux

Les études en cytométrie de flux ont été réalisées à partir de sang périphérique de 4

donneurs sains, de suspensions cellulaires de 2 amygdales et de 2 rates provenant de

patients splénectomisés pour purpura thrombopénique. Les anticorps suivants ont été

utilisés : CD3 (HIT3a), CD19 (HD237) couplés directement à la phycoérythrine, CD4 (53-

5 ;Tricolor), anti-MAL 6D9 (MA Alonso, Madrid). Des immunomarquages multiples ont

été réalisés MAL/CD19 et MAL/CD3/CD4, pour étudier l’expression de la protéine MAL

85

dans les sous- populations lymphoïdes B et T du sang périphérique, de l’amygdale et de la

rate.

Histologie et Immunohistochimie

Des tissus lymphoïdes normaux ont été analysés : 2 amygdales, 2 rates, 2 ganglions

réactionnels, et 2 thymus (un thymus néonatal et un thymus provenant d’un homme de 19

ans). Ces prélèvements tissulaires ont été fixés à l’aide du réactif de Bouin et ont été inclus

en paraffine. Un fragment de chaque prélèvement a été congelé à -80°C.

Cent quatre vingt cinq cas de lymphomes pour lesquels du matériel fixé et inclus en

paraffine était disponible ont été sélectionnés dans les archives département de Pathologie

de l’hôpital Henri Mondor. Les coupes tissulaires ont été colorées par la coloration de

l’hématéine éosine safran (HES) pour des études morphologiques, et tous ces cas ont été

analysés en immunohistochimie afin d’étudier les principaux marqueurs B et T. Tous les

lymphomes ont été classés selon les critères de la classification de l’OMS (4). Cette série

comportait : 33 LBPM, 33 LGCB-NM, 31 lymphomes de Hodgkin classique, 10

lymphomes de Hodgkin nodulaire à prédominance lymphocytaire et des lymphomes B et

T/NK. L’expression de la protéine MAL a été étudiée par une étude immunohistochimique

sur coupes en paraffine à l’aide de l’anticorps monoclonal anti-MAL 6D9, en utilisant

l’automate Ventana et son kit de détection. Au cours de cette étude, nous nous sommes

aperçus que l’intensité du marquage à l’aide de l’anticorps anti-MAL était très dépendante

du fixateur. La fixation au Bouin est la fixation qui préserve le mieux l’immunoréactivité

de la protéine MAL. En revanche, pour les prélèvements fixés au Formol ou à l’AFA

(Acide-Formol-Acétique), une étape de prétraitement permettant un démasquage

antigénique s’est avérée nécessaire. L’étude immunohistochimique a donc été réalisée dans

la majorité des cas selon 3 types de conditions : sans prétraitement, prétraitement des lames

86

en tampon citrate pH 6.7 au microonde, et prétraitement en tampon EDTA pH8.0 au

microonde.

Des lames de cytocentrifugation de la lignée MedB-1 ont également été étudiées par

immunocytochimie pour l’expression de la protéine MAL.

Enfin, des doubles immunomarquages à l’aide de l’anticorps anti-MAL et de

l’anticorps anti-CD79a ont été réalisées en immunofluorescence sur des coupes de thymus,

d’amygdale et de ganglions réactionnels fixés et inclus en paraffine. Des coupes congelées

d’un thymus ont également été étudiées.

Résultats

Cette étude montre que la protéine MAL est fortement exprimée dans les

thymocytes, dans une large proportion des lymphocytes T CD4+ du sang circulant, et dans

une proportion moindre des lymphocytes T CD8+ circulants. Dans le compartiment

lymphoïde B normal, l’expression de MAL est extrêmement restreinte, limitée à une sous-

population de lymphocytes B de la médullaire thymique, dont certains présentent une

morphologie astéroïde, et à quelques cellules d’aspect plasmocytaires présentes dans les

zones interfolliculaires de l’amygdale et des ganglions.

Dans les lymphomes B (n=110), l’expression de MAL dans les cellules

néoplasiques est observée dans 21/33 LBPM et dans 3/5 plasmocytome/myelome, mais

dans aucun autre lymphome B à l’exception d’1/33 LGCB-NM. La lignée MedB-1 exprime

également la protéine MAL. Parmi les lymphomes T, MAL est fortement exprimé dans les

lymphomes lymphoblastiques T (5 cas positifs sur 6), alors que la majorité des lymphomes

T périphériques « matures » sont négatifs (27/28), à l’exception d’un lymphome

anaplasique T.

Parmi les lymphomes de Hodgkin, 3 lymphomes de Hodgkin classiques de type

scléronodulaire et de localisation médiastinale montraient des cellules de Reed Sternberg

87

présentant une immunoréactivité, et tous les lymphomes de Hodgkin nodulaires à

prédominance lymphocytaire étaient négatifs.

Conclusion

Cette étude est la première analyse du profil d’expression de la protéine MAL dans

la lignée lymphoïde dans des conditions physiologiques. Elle confirme que l’expression de

la protéine MAL est essentiellement restreinte à la lignée lymphoïde T, avec une

expression fréquente dans les lymphocytes T CD4+ du sang circulant et que MAL n’est pas

habituellement exprimée dans la lignée lymphoïde B, en dehors d’une sous-population très

restreinte de lymphocytes B de la médullaire thymique et de quelques plasmocytes des

zones interfolliculaires.

L’expression de la protéine MAL dans une petite proportion de lymphocytes B de la

médullaire thymique conforte l’hypothèse que les LBPM dérivent de cette population

particulière de lymphocytes. On peut s’interroger sur le fait que seule une proportion de ces

lymphocytes expriment MAL. L’analyse des lymphocytes de la médullaire thymique

montre que ces lymphocytes sont hétérogènes sur le plan morphologique,

immunohistochimique et génotypique (cf chapitre lymphocytes B thymiques). D’autre part,

l’expression de MAL dans les myélomes et dans des plasmocytes suggère que cette

expression peut être en rapport avec un stade de différenciation très tardif. Ces données

permettent d’émettre l’hypothèse que les LBPM dérivent de lymphocytes B de la

médullaire thymique qui expriment MAL à un stade tardif de différenciation.

Concernant l’analyse des lymphomes, cette étude confirme les données de notre

première étude montrant une expression différentielle et récurrente de la protéine MAL

dans près de 2/3 des LBPM, alors que la très grande majorité des LGCB-NM sont négatifs.

88

D’autre part, la lignée Med-1 dérivée d’un LBPM exprime MAL en immunohistochimie.

L’expression de MAL apparaît donc comme un marqueur moléculaire distinct des LBPM.

Un autre résultat est particulièrement intéressant. Trois des lymphomes de Hodgkin

classiques (LHc) présentent des cellules tumorales de Reed Sternberg exprimant MAL. Le

LHc de présentation médiastinale, en particulier lorsqu’il s’agit d’une forme histologique

riche en cellules tumorales, ou exprimant le CD20, est le diagnostic différentiel le plus

fréquent des LBPM. L’analyse de l’expression de MAL peut être utile pour distinguer ces 2

entités, mais il faut garder à l’esprit que 10% des LHc sont susceptibles d’exprimer MAL.

D’autre part, l’expression commune de MAL dans ces 2 entités suggère que LHc et LBPM

pourraient avoir une origine commune et que certains cas de LHc pourraient avoir une

origine B thymique. Les études moléculaires et les résultats des analyses par micropuces

publiées récemment montrent que ces 2 entités présentent des altérations moléculaires

communes (93,121).

89

IV-3.3. Le gène MAL

Introduction

Le gène MAL a été identifié lors d’une analyse différentielle de lignées leucémiques

T à la recherche de transcrits associés aux stades intermédiaires et tardifs de la

différenciation T intrathymique (145). Par la suite, son expression a été observée dans les

cellules productrices de myéline chez le rat et dans des lignées épithéliales dérivées de rein

de chien et de thyroïde de rat (147-149). Ce gène code pour une protéine hydrophobe située

dans les microdomaines membranaires riches en glycosphingolipides (GEMs). Cette

protéine intervient dans la stabilisation des microdomaines membranaires, dans la

machinerie de transport intracellulaire et pourrait jouer un rôle dans la transduction du

signal (146,150-154).

IV-3.3.1. Le gène MAL

a. Clonage de l’ADNc MAL

L'ADNc MAL a été cloné dans quatre espèces de mammifères différentes, l'homme,

le chien, le rat et la souris. La structure génomique de MAL ainsi que son organisation en

introns et exons a été caractérisée chez l'homme et la souris.

L'ADNc humain MAL a été initialement isolé par Alonso et al en 1987 lors de la

recherche de gènes exprimés pendant l'ontogénie T intra-thymique (145). En utilisant une

technique d'hybridation soustractive pour comparer les transcrits exprimés dans la lignée

leucémique T CCRF HSB-2 (stade de différenciation I, marqueurs T restreints à CD10) à la

lignée MOLT-4 (stade de différenciation II, marqueurs T exprimés: CD5, CD4, CD1, CD8,

90

CD2), les auteurs ont isolé un ARNm dont l'expression était associée au stades

intermédiaires (stade II) et tardifs (stade III) de la différenciation T intra-thymique.

Tableau VI: Immunophénotype de surface de cellules T leucémiques (145)

Lignées T CD5 CD3 CD4 CD1 CD8 CD10 CD2 TCR α α α α TCR ββββ

MAL ARNm

Stade de differenciation

CCRF HSB-2 - - - - - + - - + - I CCRF CEM + - + - + + - - + - I/II MOLT-4 + - + + + + + - + + II HPB-ALL + + + + + + + + + + II/III Jurkat + + + - + + + + + + II/III abréviation : TCR, récepteur T pour l’antigène

Chez le rat, le gène rMAL a été identifié lors de la recherche de nouveaux gènes

spécifiquement exprimés par les oligodendrocytes en utilisant une technique de criblage

différentiel d’une banque d’ADNc établie à partir de cordons de moëlle épinière d’un rat de

16 jours (147). L’ARNm rMAL a été identifié parmi d’autres transcrits codant pour des

protéines de la myéline. Parallèlement, la protéine rMAL a été isolée dans la fraction

membranaire insoluble aux détergents des oligodendrocytes et a été appelée « myelin

vesicular protein 17 » (MVP17) (155).

L’homologue murin mMAL a été cloné chez la souris en criblant une banque

d’ADNc de cerveau de souris avec une sonde rMAL (156).

Chez le chien, le clonage de l’ADNc codant pour la protéine VP17 (vesicular

integral protein 17), impliquée dans le transport intracellulaire dans les cellules épithéliales

rénales Madin-Darby (Madin-Darby Canine Kidney cells ou MDCK), a montré que cette

protéine est homologue aux protéines MAL humaine et du rat (148).

Les ARNm MAL humain et canin présentent une taille de 1,1 Kb, alors que chez la

souris et le rat la taille de l’ARNm est de 2,2 Kb (tableau II). Ces différences sont liées à

des variations de longueur de la région 3' non-codante.

91

Tableau VII. Homologues du gène MAL dans différentes espèces

Nom Espèce Source/clonage ARNm (kB)

hMAL humain lignées T 1,1

rMAL (MVP17) rat oligodendrocytes 2,2

mMAL souris cerveau 2,3

cMAL (VIP17) canin cellules MDCK 1,1

b. Organisation génomique du gène MAL

Le gène humain MAL est situé sur le bras long du chromosome 2 dans la région

2cen-q13 (157). Il est constitué de 4 exons interrompus par 3 introns et s’étend sur 21Kb

d’ADN génomique. L’organisation du gène murin est similaire (156,158). Différents

ARNm MAL résultant d’un épissage alternatif ont été identifiés dans les lignées T (159).

c. Protéine MAL dans les différentes espèces et protéines homologues.

La protéine MAL humaine est une protéine de 153 acides aminés très hydrophobe,

de masse moléculaire 16,7 kDa. Les protéines MAL humaine, de rat, de souris et de chien

présentent une forte homologie (86-89 %) entre elles. Plusieurs ARNm codant pour des

protéines ayant des homologies significatives avec la protéine MAL ont été identifiés (160)

(Tableau III).

Les 4 protéines MAL, BENE, la plasmolipine et MAL2 font partie d’un groupe de

protéolipides qui possèdent d’après leur profil d’hydrophobicité 4 domaines

transmembranaires, et qui ont pour dénominateur commun une séquence en acides aminés

(Q/Y)GWVM(F/Y)V(S/A)(V/L) située à la jonction entre la première boucle

extracellulaire et le deuxième domaine transmembranaire. Le rôle de cette séquence, qui

est spécifique des protéines de la famille MAL, n’est pas déterminé. Ces 4 protéines MAL,

92

BENE, la plasmolipine et MAL2 sont solubles dans les solvants organiques et résident

dans les microdomaines membranaires enrichis en glycolipides.

Tableau VIII. Protéine MAL dans les différentes espèces et protéines homologues.

Nom Espèce Source/clonage Homologie avec

hMAL (aa)

hMAL humain lignées T 100%

rMAL (MVP17) rat oligodendrocytes 89%

cMAL (VIP17) canin cellules MDCK 88%

mMAL souris cerveau 86%

BENE humain ADN génomique 41%

hPlasmolipine humain nerf sciatique 29%

hMAL2 humain sein 36%

L’ARNm du gène BENE a été initialement cloné lors de la recherche de gènes

situés à proximité du locus de la chaîne kappa des immunoglobulines (161). Ce gène est

situé dans la région chromosomique 2q13. Contrairement à L’ARNm MAL, l’ARNm

BENE n’est pas exprimé dans le cerveau, ni dans le thymus et la rate, mais essentiellement

dans la prostate, le testicule, l’intestin, le cœur, et le poumon. Dans les lignées, son

expression est détectée dans la lignée PC3 dérivée d’un cancer de la prostate, dans la lignée

épithéliale rénale A498, dans la lignée HeLa dérivée d’un cancer du col utérin, et dans la

lignée endothéliale ECV304 (162). En revanche, il n’existe pas d’expression de BENE dans

les lignées T Jurkat et HPB-ALL, la lignée MDCK, et la lignée hépatique HepG-2. Ce gène

code pour un protéolipide de 153 acides aminés et d’un poids moléculaire de 17 kDa.

L’homologie en acides aminés avec la protéine MAL est de 41%. Il a été montré

récemment que cette protéine était localisée dans les GEMs de la lignée endothéliale

ECV304 et dans les cellules endothéliales humaines (162).

93

L’ARNm de la plasmolipine a été initialement isolé chez le rat (156,163). Chez

l’homme, le gène de la plasmolipine est situé dans la région chromosomique 16q13 (164).

La plasmolipine est un protéolipide qui fait partie de la famille des protéines de la myéline.

Chez le rat, elle est exprimée dans une sous-population de neurones du système nerveux

central, dans les oligodendrocytes, les cellules de Schwann, et dans les cellules épithéliales

des tubules rénaux (165). Comme MAL et BENE, cette protéine est retrouvée dans la

fraction membranaire insoluble aux détergents (166). L’homologie en acides aminés de la

plasmolipine humaine avec la protéine hMAL est de 29%. Récemment, chez l’homme, les

expériences de Western blot ont montré une expression de la plasmolipine dans le thymus,

le testicule, le poumon, et la thyroïde (164). Sa fonction exacte n’est pas encore clairement

établie.

Une nouvelle protéine appartenant à la famille des protéines MAL, appelée MAL2,

a été récemment identifiée (167). Chez l’homme, ce gène est situé dans la région

chromosomique 8q23. Les transcrits MAL2 sont exprimés dans le rein, le foie, le poumon

et le cerveau mais ne sont pas exprimés dans le thymus, la rate et les lymphocytes du sang

circulant. Dans les lignées, les transcrits MAL2 sont exprimés dans la lignée hépatocytaire

HepG2A et la lignée MCDK, mais à la différence de MAL, les transcrits MAL2 ne sont pas

exprimés dans les lignées leucémiques Jurkat et HPB-ALL. La protéine MAL2 présente

36% d’homologies en acides aminés avec la protéine MAL. Elle réside dans les GEMs des

cellules HepG2 et est impliquée dans les phénomènes de transcytose (168).

IV-3.3.2.Expression de MAL dans le système nerveux central et périphérique

Chez le rat, les transcrits rMAL sont détectés dans les oligodendrocytes du système

nerveux central et dans les cellules de Schwann du système nerveux périphérique

(147,169). Les expériences d’immunoblot de protéines de la myéline et

94

d’immunohistochimie sur coupes de tissus nerveux montrent que la protéine rMAL est un

composant de la myéline. La protéine rMAL appartient à la superfamille des protéines à 4

domaines hydrophobes, dont font partie les protéines de la myéline PMP-22 (peripheral

myelin protein 22) (170), PLP (brain myelin proteolipid) (171), la Connexine 32 (gap

junction protein) (172) et la plasmolipine (165).

L’étude de l’expression de rMAL lors du développement embryonnaire et postnatal

montre que dans le système nerveux central, cette expression apparaît lors de la phase

tardive de la myélinisation. En revanche, dans le système nerveux périphérique,

l’expression de rMAL est détectée de façon très précoce, avant le début de la myélinisation,

dans les cellules de Schwann immatures, suggérant un rôle possible de MAL dans le

processus de différenciation des cellules de Schwann et l’initiation de la myélinisation

(173). L’expression de la protéine MAL lors de la maturation des oligodendrocytes et de la

phase de myélinisation précoce chez le rat est modulée par l’hormone thyroïdienne (174).

La protéine rMAL pourrait jouer un rôle dans la formation de la myéline, et/ou par

analogie aux autres protéines de la myéline, participer à la formation de pores

transmembranaires permettant le transport de petites molécules (175).

Chez l’homme, le transcrit MAL est détecté dans le cerveau humain en Northern

blot. Contrairement au rat, les transcrits MAL sont fortement exprimés dans les neurones du

cortex cérébral mais pas dans la substance blanche en hybridation in situ. L’expression de

la protéine MAL est détectée en immunohistochimie dans les sections nerveuses (176).

L’expression de MAL est induite lors de la différenciation des cellules embryonnaires

carcinomateuses humaines NTERA2 vers la lignée neuronale sous l’action de l’acide

rétinoïque (177).

95

IV-3.3.3.Expression de MAL dans les cellules épithéliales

a. expression de MAL dans les cellules épithéliales du rein.

Chez le rat et la souris, les transcrits MAL sont faiblement exprimés dans le rein en

Northern blot (147,156).

Chez le chien, la protéine cMAL a été isolée à partir des complexes membranaires

insolubles aux détergents des cellules rénales MDCK (147,148).

Chez l’homme, les études immunohistochimiques réalisées à l’aide d’un anticorps

anti-MAL sur des coupes tissulaires de rein, montrent une expression de la protéine MAL à

l’apex des cellules épithéliales cuboïdales bordant les tubules proximaux et les tubes

collecteurs (176). L’expression de MAL est associée à la différenciation de l’urothélium in

vitro (178).

b. expression de MAL dans les autres tissus épithéliaux.

En dehors du rein, les transcrits et la protéine MAL sont détectés dans d’autres

tissus épithéliaux. Chez les rongeurs, la protéine MAL est détectée dans l’épithélium

gastrique et œsophagien, et dans la lignée épithéliale FRT dérivée de la thyroïde de rat

(149,179).

Chez l’homme, l’analyse de l’expression de MAL en immunohistochimie à l’aide

de l’anticorps anti-MAL sur coupes de tissus fixés et inclus en paraffine, montre que cette

expression est détectée dans presque tous les épithéliums de l’organisme à quelques

exceptions près, comme les tubules rénaux distaux et les épithéliums malpighiens

kératinisés (176). Cette expression est particulièrement nette dans les épithéliums dont les

cellules ont une fonction sécrétoire comme la thyroïde, les cellules pariétales des glandes

gastriques, ou les cellules des acini pancréatiques, où l’expression de MAL est détectée

96

sous la forme de granulations intracytoplasmiques qui prédominent dans la partie apicale

de la cellule épithéliale.

IV-3.3.4.Expression de MAL dans les lymphocytes

Chez l’homme, le gène MAL a été identifié initialement comme un gène associé

aux stades tardifs de la différenciation T (145). Les études en Northern blot montrent que

l'ARNm MAL est détecté dans les lignées T relativement matures comme MOLT-4, HPB-

ALL et Jurkat, mais est absent des lignées CCRF HSB-2 et CCRF CEM plus immatures.

Le transcrit MAL est également détecté dans les lymphocytes T du sang périphérique, dans

les thymocytes et dans des clones T matures CD4+ ou CD8+ (145,158,159). Nous avons

nous-même montré que la protéine MAL est exprimée dans les thymocytes, et par

cytométrie en flux que l’expression de MAL est essentiellement observée dans les

lymphocytes T CD4+ périphériques, et de façon moins importante dans les lymphocytes T

CD8+ périphériques.

Dans les tissus lymphoïdes, la protéine MAL n’est généralement pas exprimée dans

les territoires B, en dehors d’une sous-population très restreinte de lymphocytes B de la

médullaire thymique et de quelques plasmocytes des zones interfolliculaires (180). Dans

les lignées lymphoïdes B, la plupart des lignées B analysées n’expriment pas le transcrit

MAL, en dehors des 2 lignées B dérivées de LBPM, MedB-1 et Karpas 1106.

Chez le rat et la souris, l’expression de MAL dans les tissus lymphoïdes a été très

peu étudiée. Dans ces études, les transcrits MAL ne sont pas détectés dans le thymus

contrairement à l’homme (147,156).

97

IV-3.3.5.Association de MAL avec les glycosphingolipides et implications

fonctionnelles

La protéine MAL est un composant des GEMs de nombreux types cellulaires. Les

GEMs sont des microdomaines membranaires enrichis en cholestérol et en

glycosphingolipides, formant de véritables « plate-formes » mobiles par rapport aux

phospholipides que les Anglais nomment rafts. Ils sont abondants à la surface membranaire

mais sont également trouvés à l’intérieur du cytoplasme dans des compartiments

d’endocytose ou d’exocytose. Ce sont des structures dynamiques qui bougent latéralement

le long de la membrane plasmique mais qui naviguent aussi en permanence entre la

membrane et les compartiments intracellulaires comme l’appareil de Golgi. Les rafts

contiennent différents types de protéines : des protéines ancrées par un glycosyl-

phosphatidylinositol (GPI), des protéines transmembranaires et des tyrosines kinases de la

famille Src. Ces rafts jouent un rôle important dans le transport des protéines et des lipides

du compartiment intracellulaire à la surface plasmique. Ils constituent également de

véritables plates-formes où se rassemblent certaines protéines intervenant dans la

transmission du signal cellulaire et jouent à ce titre un rôle majeur dans la signalisation

(181).

Initialement identifiée dans les GEMs des cellules MDCK (148), la protéine MAL a

par la suite été identifiée dans les GEMs d’oligodendrocytes matures en culture (155). Dans

les lymphocytes T, MAL est observée dans les GEMs des cellules Jurkat et des

lymphocytes T périphériques (146,153). MAL est également un composant des GEMs de

cellules épithéliales polarisées de la thyroïde (149).

98

Quelles sont les implications fonctionnelles de la présence de MAL dans les

GEMs ?

Dans les cellules épithéliales polarisées, MAL joue un rôle important dans le

transport des molécules. Dans les cellules MDCK, les expériences en immunofluorescence

montrent que la protéine cMAL est localisée dans la région périnucléaire, correspondant à

l’appareil de Golgi, dans les vésicules intracytoplasmiques et à la surface de la membrane

plasmique (148). La déplétion de la protéine MAL endogène dans les cellules MDCK

réduit considérablement le transport de protéines à GPI et de l’hémaglutinine du virus

influenza à la surface de la membrane (151,152,154). MAL apparaît comme une molécule

itinérante qui réalise un cycle permanent entre le réseau transgolgien et la membrane

plasmique (182). L’expression ectopique de MAL dans des cellules d’insectes induit la

formation de vésicules différentes de celles induites par l’expression de la cavéoline 1

(150). L’ensemble de ces données suggère que MAL joue un rôle important dans

l’organisation et la stabilisation de ces microdomaines membranaires dans les cellules

épithéliales polarisées, et dans le transport des molécules de l’appareil de Golgi à la surface

apicale de la cellule.

Dans le système nerveux, MAL est un constituant de la myéline. Du fait de son

association aux glycosphingolipides, elle pourrait contribuer à la stabilisation de la gaine de

myéline.

MAL est également exprimée dans les rafts des lymphocytes T. Etant donné le rôle

de MAL dans les cellules épithéliales polarisées, il est tentant de penser que MAL est

impliqué dans le fonctionnement et l’organisation de ces microdomaines membranaires

dans les lymphocytes T. Les GEMs des lymphocytes T renferment des protéines à GPI

comme la molécule d’activation CD59, et des tyrosines kinases de la famille Src. Des

expériences de co-immunoprécipitation avec l’anticorps anti-MAL montrent que MAL est

99

associée avec CD59 ainsi qu’avec la tyrosine kinase lck dans les GEMs des cellules de la

lignée T HPB-ALL et les lymphocytes du sang périphérique. Il a été suggéré que la

protéine MAL pourrait servir de protéine de liaison entre les protéines à GPI situés à

l’extérieur de la membrane et les tyrosines kinases intracellulaires, et jouer ainsi un rôle

dans la transduction du signal dans les lymphocytes T (146).

IV-3.3.6. MAL et la pathologie tumorale

a. MAL et lymphomes T cutanés.

Le gène MAL a récemment été identifié comme un gène associé à la résistance des

lymphomes T cutanés au traitement par l’interféron-α (IFNα) (183). Les auteurs ont

comparé par des micropuces à ADNc une lignée dérivée d’un lymphome T cutané appelé

Mycosis fungoïde (MF) sensible à l’ IFNα, à la même lignée rendue résistante à l’IFNα. Le

gène MAL figure parmi les 39 gènes identifiés associés à la résistance à l’ IFNα. De plus,

l’analyse de l’expression de la protéine MAL dans les tumeurs de 20 patients atteints de

MF par immunohistochimie montre une corrélation significative entre l’expression de

MAL par les cellules tumorales et l’allongement du délai de réponse au traitement.

L’expression de MAL apparaît donc comme un facteur prédictif de mauvaise réponse à l’

IFNα dans le Mycosis Fungoïde.

b. MAL et cancer de l’œsophage.

Mimori et al ont montré que l’expression de MAL était réduite ou absente dans les

carcinomes oesophagiens comparativement à l’épithélium oesophagien normal (184).

L’expression de MAL induite par transfection dans une lignée épithéliale TE3 dérivée d’un

carcinome de l’œsophage réduit sa croissance, sa motilité, bloque les cellules à la phase

100

G1/S du cycle cellulaire et augmente l’apoptose. Dans ce système, MAL apparaît comme

ayant un rôle de gène suppresseur de tumeur.

IV-3.3.7. Conclusion

MAL est un protéolipide exprimé dans un spectre très large de tissus épithéliaux.

Les expériences in vitro réalisées sur la lignée épithéliale MDCK et la lignée épithéliale

FRT dérivée de la thyroïde de rat, ont permis d’avancer considérablement sur les fonctions

de cette protéine. Sa localisation dans les GEMs de différents types cellulaires, son rôle

dans l’induction de la vésiculation souligne son importance fonctionnelle dans le transport

de molécules de l’appareil de Golgi à la surface apicale de la cellule.

Le rôle exact de la protéine MAL dans les processus de signalisation intracellulaire

reste encore à définir. Les données sur la co-localisation de MAL avec des tyrosines

kinases et des protéines à GPI dans les GEMs des lymphocytes T suggèrent un rôle

possible de MAL dans la transduction du signal dans les lymphocytes T. Il est tentant de

penser qu’une modification de l’expression de MAL puisse induire une altération du

fonctionnement des rafts, et donc de la transduction du signal, et puisse entraîner une

dérégulation des mécanismes de contrôle de la croissance cellulaire.

101

IV-4. Mise en évidence d’une activation constitutive du gène FIG1 dans

les LBPM :

Article 3

« Interleukin 4-induced gene 1 is activated in primary mediastinal large

B-cell lymphoma »

Christiane Copie-Bergman, Marie-Laure Boulland, Catherine Dehoulle, Peter Möller, Jean-

Pierre Farcet, Martin J.S. Dyer, Corinne Haioun, Paul-Henri Roméo, Philippe Gaulard, and

Karen Leroy.

Blood 101:2756-2761, 2003.

102

But de l’étude

Le but de cette étude était de poursuivre la caractérisation moléculaire des LBPM et

d’identifier un profil d’expression génique spécifique de cette entité, ceci afin de mieux

comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de ces

lymphomes. Nous avons pour cela utilisé la technique de « Representational Difference

Analysis » (RDA) pour rechercher des transcrits différentiels entre les LBPM et LGCB-

NM (Annexe 2).

Matériel et méthodes

Matériel

Quarante cinq cas de lymphomes pour lesquels du matériel congelé et du matériel

fixé et inclus en paraffine ont été sélectionnés dans les archives du département de

Pathologie de l’hôpital Henri Mondor. Cette série comportait : 17 LBPM, 18 LGCB-NM, 2

leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B), 2 lymphomes dérivés des cellules du manteau,

2 lymphomes de Burkitt, 2 lymphomes folliculaires, 2 lymphomes de la zone marginale

ganglionnaires.

Des tissus lymphoïdes contrôles ont été analysés : une amygdale, 3 ganglions

lymphoïdes réactionnels, une rate et un thymus d’un fœtus de 40 semaines de gestation.

Les suspensions cellulaires B purifiées ont été obtenues par tri magnétique à partir

d’amygdales, et ont été activées pendant 6 jours en présence d’IL-4 et de cellules murines

transfectées avec un plasmide codant pour le ligand de CD40.

Les lignées B suivantes ont été utilisées : les lignées lymphoblastiques RS 4 :11,

Nalm6, Nalm16, et 697 ; la lignée Ramos dérivée d’un lymphome de Burkitt ; la lignée RL

porteuse de la translocation t(14 ;18) ; et 2 lignées dérivées de lymphome du médiastin,

Karpas 1106 et MedB-1. D’autres lignées hématopoïétiques (les lignées T Jurkat,

103

SUDHL1, Peer et DU528 et leucémiques erythro-mégacaryocytaire HEL) et non-

hématopoïétiques (la lignée hépatoblastique HepG2, la lignée dérivée d’un mélanome

MZ2, et la lignée épithéliale Hela) ont été étudiées.

Méthodes

Méthode du RDA

Le principe de la méthode est exposé dans l’annexe 2. Pour cette étude, nous avons extrait

l’ARN de 5 LBPM et de 5 LGCB-NM à partir de tissu tumoral congelé à l’aide du réactif

TRIZOL. Les ARN totaux (2µg) de 5 LBPM d’une part et de 5 LGCB-NM d’autre part ont

été mélangés pour préparer les ARN polyA+ des LBPM et des LGCB-NM par purification

sur billes d’oligodT (Dynal). Une transcription inverse de ces ARN polyA en ADNc double

brin a été réalisée, puis ceux-ci ont été digérés par l’enzyme de restriction DpnII. La

procédure de RDA a été ensuite conduite selon le protocole de référence (142) avec les 2

étapes d’hybridation soustractive et d’amplification sélective, les ADNc des LBPM

constituant la population tester et les ADNc des LGCB-NM constituant la population

driver.

Northern blot

L’ARN total a été extrait du matériel tumoral congelé ou des lignées à l’aide du réactif

TRIZOL. Après dénaturation et migration sur gel d’agarose, les ARN ont été transférés sur

membrane et hybridés à l’aide d’une sonde FIG1 marquée au α-32P. Une sonde spécifique

du gène β-actine était utilisée comme contrôle.

Séquençage

L’ADN des plasmides et des produits de polymérisation en chaîne (PCR) ont été séquencés

à l’aide du kit Applied Biosystem PRISM Dye-dideoxy terminator et Dye-Primer. Les

réactions de séquence ont été analysées sur séquenceur automatique ABI 377 (Applied

Biosystem).

104

RT-PCR quantitative

Les différents échantillons ont été analysés en transcription inverse-polymérisation en

chaine (RT-PCR) quantitative afin de définir un ratio entre la quantité de transcrit FIG1

rapporté à la quantité d’un transcrit de référence du gène S14 dans chaque échantillon.

Analyse statistique

Pour tester les différences entre le groupe de LBPM et le groupe des LGCB-NM, nous

avons comparé les ratio des ARNm FIG1/S14 à l’aide d’un test de Fisher et d’un test

Mann-Whitney U test.

Extraction d’ADN et analyse en Southern Blot

L’ADN génomique de 5 LBPM, de 5 LGCB-NM et des lignées MedB-1 et Ramos a été

extrait par digestion à la protéinase K, extraction au phénol-chloroforme et précipitation à

l’éthanol. Après digestion par l’enzyme de restriction EcoRI, les fragments d’ADN ont été

séparés par électrophorèse sur gel d’agarose 0,8%, transférés sur membrane N+. Celle-ci a

ensuite été hybridée à l’aide d’une sonde FIG1 correspondant aux nucléotides 444 à 852 de

l’ADNc FIG1, et s’hybridant avec les exons 5,6 et 7.

Résultats

L’analyse comparative par RDA des représentations des LBPM et des LGCB-NM, a

permis d’obtenir après 2 cycles d’hybridation soustractive-amplification un produit

différentiel DP2 contenant 14 fragments d’ADNc issus de 9 gènes différents et exprimés de

façon différentielle dans la représentation d’ADNc LBPM comparée à la représentation

LGCB-NM (Tableau IX).

105

Tableau IX : Fragments de RDA exprimés de façon différentielle dans la

représentation d’ADNc LBPM comparée à la représentation LGCB-NM

N° accession Genbank Identité

AF 293462 Interleukin-4-induced gene 1 (FIG1/IL4I1)

U42594 Fibronectin splice variant

U20285 G-protein pathway suppressor 1

Z11692 Elongation factor 2

AF 129085 Carboxy terminus of Hsp70-interacting protein

M14058 Complement C1r

NM004244 CD163 antigen

M61771 Immunoglobulin lambda light chain C-region

L00022 Immunoglobulin heavy chain epsilon 1C-region

Un des fragments isolé par cette technique s’est révélé être homologue au transcrit

du gène FIG1/IL4I1 (interleukin Four Induced Gene 1), qui est un gène de réponse précoce

à l’interleukine 4 (IL-4), initialement décrit chez la souris et plus récemment chez l’homme

(185-187).

Nous avons montré par Northern Blot que le transcrit FIG1 humain, d’environ 2000

nt, était fortement exprimé dans tous les LBPM (5/5), et peu ou pas exprimé dans les

LGCB-NM (0/5), utilisés pour construire les représentations.

Nous avons déterminé la séquence de l’ARNm FIG1 humain. La protéine de 567 aa

codée par cet ARNm possède un peptide signal, appartient à la famille des L amino-acide

oxydases (LAOs) et présente de fortes homologies avec 2 flavoprotéines capables d’induire

106

l’apoptose lorsqu’elles sont sécrétées : l’Apoxine I (protéine de venin de serpent), et une

amino-acide oxydase du réticulum endoplasmique de poisson (ERL-LAO) (188-190).

L’étude de l’expression du gène FIG1 par Northern Blot et RT-PCR quantitative

montre une expression essentiellement restreinte aux tissus lymphoïdes, avec une

expression faible à l’état basal dans le thymus, la rate, l’amygdale et les ganglions

lymphatiques et une forte induction dans les lymphocytes B normaux stimulés par l’IL-4 et

le ligand de CD40. Dans les lignées B testées, cette expression est restreinte aux lignées

Karpas 1106 et MedB-1 dérivées de LBPM. Dans les lymphomes, les LBPM présentent

une expression de FIG1 significativement plus élevée que dans les LGCB-NM, les

hémopathies lymphoïdes B à petites cellules testées, et les tissus lymphoïdes normaux.

L’étude en Southern Blot n’a pas permis de détecter de réarrangement ou d’amplification

génique du gène FIG1 dans les LBPM.

Conclusion

En utilisant la méthode du RDA (141) pour comparer les transcrits des LBPM et

des LGCB-NM puis les techniques de Northern blot et de RT-PCR, nous avons mis en

évidence une activation transcriptionnelle du gène FIG1 dans les LBPM. Le gène FIG1 a

été initialement identifié chez la souris puis chez l’homme, comme un gène de réponse

précoce des lymphocytes B à l’IL-4 (185,187). L’induction est obtenue dans les 2 heures

qui suivent l’incubation des lymphocytes B avec l’IL-4, mais n’est pas observée en

présence d’IL-2, d’IL-5 et d’IL-6 (186). Il a été montré que cette induction était dépendante

du facteur de signalisation et de transcription STAT6 (191).

En l’absence de réarrangement ou d’amplification génique de FIG1 détectable par

Southern blot, l’expression différentielle de FIG1 dans les LBPM pourrait être liée à

l’activation constitutive d’une voie de signalisation cytokinique, notamment celle de l’IL-4

107

ou encore de l’IL-13, ces 2 cytokines ayant une voie de signalisation commune (192).

L’analyse des échantillons de LBPM par RT-PCR quantitative n’a pas permis de détecter

une expression significative d’IL-4 ou d’IL-13, permettant d’exclure l’hypothèse d’une

boucle autocrine ou paracrine. L’activation de FIG1 pourrait être liée à un évènement

oncogénique, notamment l’amplification du gène JAK2 qui siège dans une région

chromosomique (9p23) fréquemment amplifiée dans les LBPM (74). Le gène JAK2 code

pour une kinase impliquée dans la voie de signalisation IL-4/IL-13 (193) et son rôle

éventuel dans l’activation transcriptionnelle de FIG1 est à explorer

L’expression du gène FIG1 est fortement induite dans les lymphocytes B activés in

vitro en présence d’IL-4 (185-187). Il est possible que son expression dans les LBPM

reflète simplement le stade de différenciation de la cellule B à l’origine de ces lymphomes.

Ceci favoriserait l’hypothèse que ces lymphomes appartiennent au groupe des LGCB de

type « ABL » (Activated B-like DLBCL), comme le suggère les études des gènes de

immunoglobulines dans les LBPM, qui montrent un taux élevé de mutations somatiques

sans variation intraclonale (62).

Le gène FIG1 code pour une protéine de 567 acides aminés qui présente un peptide

signal permettant soit la localisation membranaire, soit la sécrétion de la protéine. Cette

protéine contient plusieurs sites potentiels de N-glycosylation et de phosphorylation, ainsi

qu’un domaine de type L amino-acide oxydase (LAO). La protéine FIG1 humaine présente

une homologie de structure significative avec l’Apoxine I du venin de serpent et la L

amino-acide oxydase du réticulum endoplasmique de poisson (ERL-LAO) (33 et 41%

d’identité respectivement) (188-190). Les LAOs catalysent la déamination oxidative de L

amino-acides et induisent la production d’ammonium et de peroxide d’hydrogène (H2O2).

L’H2O2 induit l’apoptose et semble impliqué dans un spectre croissant de voies de

signalisation comme molécule de transduction du signal (194). D’autre part, certaines

108

LAOs ont été décrites comme étant impliquées dans les phénomènes d’adhésion cellulaire

(195). La fonction précise de la protéine FIG1 reste à déterminer, mais ces données

suggèrent que FIG1 pourrait présenter une activité LAO associée à des propriétés

proapoptotiques ou à d’autres fonctions émergeantes pour les ectoenzymes, comme la

signalisation ou l’adhésion.

Au total, nous avons mis en évidence une activation transcriptionnelle du gène

FIG1 dans les LBPM. Cette expression pourrait être le reflet d’une activation constitutive

des voies de signalisation dépendantes de l’IL-4/IL-13 dans les LBPM.

109

V. DISCUSSION, CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

110

Nous avons comparé dans cette étude le profil transcriptionnel de 2 groupes de

lymphomes, les lymphomes B à grandes cellules primitifs du médiastin et les lymphomes à

grandes cellules B périphériques. Le but de cette étude était d’identifier des marqueurs

moléculaires spécifiques des LBPM afin de permettre une meilleure identification de ces

lymphomes et de mieux comprendre les mécanismes oncogéniques impliqués dans le

développement des LBPM.

Nous avons identifié le gène MAL comme étant spécifiquement exprimé dans les

LBPM (180,196). L’expression de ce gène est détectée dans près de 70% des LBPM par

immunohistochimie à l’aide de l’anticorps anti-MAL et cette expression est reconnue

comme un marqueur moléculaire spécifique des LBPM dans la classification récente de

l’OMS (3,4). L’usage de l’anticorps anti-MAL en Anatomie pathologique constitue une

aide précieuse et contribuera certainement à mieux cerner cette entité très particulière de

lymphome. Le rôle précis de la protéine MAL dans la physiopathologie des LBPM reste

spéculatif. Cette protéine est impliquée dans l’organisation des GEMs de nombreux types

cellulaires et notamment des lymphocytes T et ceci nous amène à nous interroger sur le rôle

potentiel des GEMs dans le développement des lymphomes. Il s’agit d’un domaine encore

peu exploré, mais l’abondance des publications de ces 5 dernières années reflète l’intérêt

croissant que suscitent les GEMs dans de nombreux domaines, en particulier dans les

interactions cellules-cellules et l’activation lymphocytaire.

Le concept de plates-formes mobiles ou rafts a été introduit par Simons et Ikonen

en 1997 (181). Ce concept est basé sur le fait que la membrane plasmique d’une cellule

111

n’est pas homogène et qu’elle est constituée de microenvironnements lipidiques distincts.

Les rafts sont des microdomaines membranaires enrichis en glycosphingolipides et

cholestérol, appelés aussi GEMs (« glycosphingolipid enriched microdomains »). Ces

GEMs constituent des structures très organisées et mobiles par rapport aux phospholipides

de la membrane plasmique. Des protéines à GPI, des tyrosines kinases de la famille Src et

des protéines hétérotrimériques G sont présentes constitutivement ou recrutées après

activation de façon sélective dans les rafts où elles sont mises en contact avec leurs

protéines cibles et effectrices. Les GEMs sont impliqués dans de nombreux processus

cellulaires comme le trafic membranaire, la morphogenèse cellulaire et la signalisation. Ils

permettent la propagation transmembranaire de la majorité des signaux extracellulaires

médiés par des récepteurs. L’inclusion ou l’exclusion de certaines protéines des rafts

permet de réguler leur activité comme cela a été montré pour la tyrosine kinase p56lck et la

phosphatase CD45. La présence ou non de la phosphatase CD45 dans les rafts permet en

effet de réguler l’activité de la tyrosine kinase p56lck (197). Les rafts constituent ainsi de

véritables plates-formes de signalisation où se rassemblent les molécules intervenant dans

les différentes étapes de la transduction du signal.

Les rafts jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immune des

lymphocytes B et T. Ils interviennent dans la formation de la synapse immunologique entre

les lymphocytes T et les cellules présentatrices de l’antigène (APC) lors de la réponse

immune T (198-200). Suite à l’activation lymphocytaire T par la cellule APC, les rafts se

rassemblent et se réorganisent de façon à constituer une plate-forme où vont s’associer les

différentes molécules impliquées dans la signalisation T. Les molécules constitutivement

présentes dans ces rafts sont le corécepteur T CD4, la tyrosine kinase Lck, et les chaînes

CD3ζ, et l’adaptateur transmembranaire LAT (« Linker for Activation of T cells »). La

112

réorganisation des rafts après activation permet à la tyrosine kinase Lck de phosphoryler

les motifs ITAMs (Immunoreceptor Tyrosine based Activation Motif) des chaines

CD3ζ, où va venir se fixer la protéine ZAP70, qui va à son tour phosphoryler et activer la

phospholipase Cγ1 et la protéine LAT. Les protéines de costimulation comme CD28 jouent

en rôle majeur dans la réponse immune T en mobilisant les rafts vers la synapse

immunologique et en réorganisant le cytosquelette au site de contact entre le lymphocyte T

et la cellule APC.

Les rafts sont également impliqués dans l’intégrité et le fonctionnement des

uropodes des lymphocytes T (201). Sous certaines conditions, comme la ligation

d’anticorps à leur surface, l’exposition à des chemokines et à des médiateurs

proinflammatoires, les lymphocytes T deviennent des cellules polarisées. La cellule

présente alors un pôle frontal (« leading edge ») et une protrusion membranaire postérieure

appelée uropode. La formation de ces uropodes conditionne les propriétés migratrices et les

interactions cellules–cellules des lymphocytes T. Millan et al ont montré que, comme dans

les cellules épithéliales polarisées, les lymphocytes T utilisent les rafts comme système de

transport pour diriger spécifiquement certaines molécules comme les molécules d’adhésion

ICAM-3, CD43 et CD44 vers cette région membranaire polarisée. La rupture de l’intégrité

des rafts par des agents séquestrant le cholestérol induit la perte de la polarisation du

lymphocyte T et l’altération de ses capacités d’agrégation et d’interaction avec les autres

cellules, et de migration.

Les rafts sont impliqués dans les étapes précoces de la signalisation associées au

récepteur B pour l’antigène (BCR) et dans le ciblage de l’antigène vers les compartiments

intracellulaires où il va être dégradé en peptides et associé aux molécules du complexe

majeur d’histocompatibilité II (MHCII) (202). Après fixation de l’antigène au BCR, celui-

113

ci migre vers les rafts où il est mis en contact avec les différentes protéines qui vont

permettre d’initier la cascade de signalisation et la transcription des gènes associés à

l’activation lymphocytaire B. La tyrosine kinase Lyn qui réside dans les rafts va

phosphoryler les résidus tyrosine des motifs ITAM des chaînes Igα/Igβ associées au BCR

et va initier la transduction du signal. Le déplacement du BCR dans les rafts est influencé

par le stade de différenciation de la cellule (dans les cellules B immatures le BCR ne migre

pas dans les rafts), par la présence des corécepteurs comme le complexe CD19/CD21 qui

prolonge la présence du BCR dans les rafts, et par la présence d’agents pathogènes, qui

comme la protéine LMP2A du virus Epstein Barr (EBV) peuvent bloquer à la fois la

translocation du BCR dans les rafts et la signalisation du BCR (203).

Une étude récente sur le rôle du signalosome CD40 dans des lymphomes B

agressifs et les lignées lymphoïdes B qui en dérivent, illustre le rôle potentiel des rafts dans

le développement des lymphomes B (204). Une activation constitutive de la voie NF-kB

est observée dans des lignées dérivées de lymphomes B agressifs ainsi que dans les cellules

tumorales de patients atteints de lymphome B de haut grade. Dans ces cellules, l’activation

de la voie NFkB résulte de l’activation permanente de la voie de signalisation CD40-CD40

ligand (CD40L). CD40 est une protéine de 45 kDa appartenant à la famille des récepteurs

du TNF, qui est exprimée à la surface de tous les lymphocytes B matures et des cellules

tumorales qui en dérivent. L’activation de la voie de signalisation CD40 est liée à la

dérégulation de l’expression du gène CD154 codant pour le CD40L, entrainant une

production endogène ectopique de CD40L. Celui-ci vient se coupler au CD40 et entraine

une activation permanente du signalosome CD40. Le signalosome CD40 est un complexe

macromoléculaire ancré dans les rafts de la membrane cellulaire. Il résulte de l’assemblage

de CD40-CD40L avec les protéines de signalisation intracellulaires TRAF 2 et 6 (TNF

receptor-activating factor 2), et le complexe IKKα/β (I-kappa kinase complex). Dans une

114

cellule B normale, l’activation du CD40 et la réorganisation des rafts est induite par

l’interaction avec le CD40L exprimé à la surface du lymphocyte T. Dans les cellules

tumorales B coexprimant le récepteur et le ligand, les rafts sont réorganisés de façon

constitutive et le signalosome CD40 est constitutivement activé. L’activation de la voie

CD40 permet la translocation du facteur de transcription NF-kB vers le noyau et la

transcription de gènes impliqués dans le contrôle de la croissance et la survie cellulaire.

Dans cette étude, Pham et al ont montré que les différents composants du signalosome

CD40 étaient présents dans les rafts des cellules tumorales B où ils formaient un complexe

actif. Le traitement in vitro des cellules tumorales avec des anticorps anti-CD154 et anti-

CD40 entraine une altération du signalosome CD40, une diminution de la croissance

cellulaire, une augmentation de l’apoptose et une diminution de l’expression de NFkB dans

les cellules tumorales. Cette étude souligne le rôle des rafts dans l’oncogenèse B du fait de

leur action régulatrice de l’activité de certains complexes de signalisation.

De façon intéressante, l’efficacité de certains anticorps anti-CD20 utilisés dans le

traitement des lymphomes B est étroitement corrélée à leur capacité à redistribuer le

récepteur CD20 dans les rafts après ligation (205). Le CD20 est une protéine

transmembranaire non glycosylée exprimée par les lymphocytes B. Elle présente un court

domaine extramembranaire contre lequel sont dirigés les anticorps anti-CD20 utilisés en

thérapeutique. Le mode d’action de ces anticorps in vivo n’est pas clairement établi, mais

leur action toxique in vitro sur les cellules B implique une cytotoxicité médiée par le

complément (CDC) et par les anticorps (ADCC). Cragg et al ont montré récemment que

l’activation de la fraction lytique du complément induite par les anticorps anti-CD20 in

vitro était corrélée à leur capacité à transloquer le CD20 dans les rafts de la cellule

tumorale après ligation. Les anticorps anti-CD20 agissent également en modifiant la

115

stabilité et l’organisation des rafts, entrainant une perturbation des mécanismes de

signalisation cellulaire (206).

L’expression de la protéine MAL dans les rafts de nombreux types cellulaires

suggère que cette protéine puisse avoir une fonction régulatrice des rafts, par analogie avec

la cavéoline. La cavéoline est une protéine membranaire de 22kDa située dans des

microdomaines membranaires enrichis en cholestérol appelés cavéoles. Les cavéoles sont

des invaginations de la membrane plasmique qui existent dans la plupart des cellules, mais

qui sont absentes des lymphocytes. La membrane des cavéoles renferme de nombreuses

protéines à GPI rassemblées en complexes. La cavéoline est un substrat pour les tyrosines

kinases de la famille Src, et se complexe avec des protéines intégrées et des protéines à

GPI. Elle sert d’adaptateur et de vecteur d’information entre les protéines à GPI exposées à

la surface cellulaire et les protéines impliquées dans la signalisation intracytoplasmique, et

assure la régulation du fonctionnement des cavéoles (207).

Du fait de la coimmunoprécipitation de la protéine MAL avec la protéine à GPI

CD59 et avec les protéines kinases Src, Alonso et al ont suggéré que MAL pourrait jouer

dans les lymphocytes un rôle analogue à la cavéoline, comme adaptateur entre les protéines

à GPI et les Src kinases intracytoplasmiques, et avoir un rôle plus général de protéine

régulatrice des rafts dans les lymphocytes T. Si on suit cette hypothèse, on peut penser que

l’expression de la protéine MAL dans les rafts des cellules tumorales des LBPM peut avoir

pour conséquence une dérégulation de l’activité de certains complexes de signalisation et

intervenir dans le contrôle de la croissance cellulaire.

Le gène CAV1 codant pour la cavéoline est un gène suppresseur de tumeur situé sur

le chromosome 7q31, une région fréquemment délétée dans les tumeurs carcinomateuses

(208). L’expression de CAV1 est diminuée dans un grand nombre de lignées dérivées de

116

tumeurs carcinomateuses. La réexpression de la cavéoline 1 dans des lignées dérivées de

cancer mammaire réduit considérablement leur potentiel de croissance, suggérant que la

cavéoline 1 joue un rôle important dans la régulation de la croissance tumorale (209,210).

Sur le plan fonctionnel, la cavéoline 1 agit comme un régulateur négatif de la voie de

signalisation Ras-p42/44 MAP kinase, pouvant expliquer son activité suppresseur de

tumeur in vitro (211). D’autre part, il a été montré que la baisse d’expression de la

cavéoline 1 dans des lignées dérivées de cancer de la prostate permet de restaurer leur

sensibilité aux androgènes (212).

L’ensemble de ces données montre le rôle important de la cavéoline dans la

transmission du signal cellulaire et dans le contrôle de la croissance tumorale. La protéine

MAL et la cavéoline 1 résident dans des microdomaines différents, mais elles présentent de

grandes similitudes fonctionnelles. Comme la cavéoline 1, MAL est impliquée dans le

transport et le ciblage de certaines protéines à la membrane dans les cellules épithéliales

polarisées, et il a récemment été suggéré que le gène MAL pouvait avoir un rôle de gène

suppresseur de tumeur dans des lignées dérivées de carcinome oesophagien (184).

Si dans les modèles des lignées épithéliales, il existe de grandes similitudes

fonctionnelles entre la cavéoline 1 et la protéine MAL, aucun rapprochement ne peut être

établi entre ces 2 protéines dans les cellules lymphoïdes et les lignées hématopoïétiques,

celles-ci étant habituellement dépourvues de cavéolines et de cavéoles. Hatana et al ont

cependant montré que certaines lignées leucémiques T présentant un phénotype activé

pouvaient exprimer la cavéoline 1 (213). Compte tenu de l’expression de la cavéoline dans

ces leucémies, et de MAL dans les LBPM, myelomes et lymphomes lymphoblastiques T, il

ne semble pas que ces protéines exercent un effet suppresseur de tumeur dans la lignée

hématopoïetique. De plus, même si la cavéoline se comporte comme un gène suppresseur

de tumeur dans des lignées cellulaires épithéliales en culture, il semble que sa réactivation

117

aux stades tardifs de tumorigénèse in vivo favorise la survie cellulaire, les métastases et la

chimiorésistance (214).

On peut aussi émettre l’hypothèse que l’expression de MAL dans les cellules

tumorales des LBPM est liée au degré de différenciation de la cellule néoplasique. A

l’appui de cette hypothèse, il est intéressant de constater que MAL est exprimé dans une

sous-population très restreinte de lymphocytes B, notamment dans les plasmocytes et les

tumeurs qui en dérivent, les plasmocytomes. L’expression de MAL pourrait donc

témoigner d’un stade de différenciation tardif de la cellule B, post-centre germinatif,

comme le suggère les résultats de l’étude de Möller et al, qui montre que ces lymphomes

présentent des gènes d’immunoglobulines avec un taux élevé de mutations somatiques sans

variation intraclonale (62). Ceci pourrait également suggérer que la sous-population de LBt

de la médulla qui exprime physiologiquement MAL est à un stade tardif de différenciation.

Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons mis en évidence une activation

transcriptionnelle du gène FIG1 dans les LBPM (215). Le gène FIG1 a été identifié chez la

souris comme un gène de réponse précoce à l’IL-4. Nous avons montré que l’expression de

ce gène est fortement induite dans les lymphocytes B humains activés par l’IL-4 et le

ligand de CD40. La protéine FIG1 présente des homologies de structure avec certaines L

amino-acide oxydases ayant des propriétés proapoptotiques via la production d’H2O2. Le

rôle potentiel de FIG1 dans la synthèse d’H2O2 ou comme molécule d’adhésion, comme

cela a été décrit pour certaines LAOs, reste à explorer.

L’intérêt majeur de cette deuxième étude est qu’elle nous oriente vers les

mécanismes physiopathologiques susceptibles d’être impliqués dans les LBPM, et

notamment vers une activation de la voie de signalisation dépendante de l’IL-4/IL-13.

118

L’expression de FIG1 est induite par l’IL-4 dans les lymphocytes B et sa transcription est

dépendante du facteur de signalisation et de transcription STAT6. L’IL-4 et l’IL-13 ont en

commun certaines étapes de la signalisation intracellulaire (figure 4).

Figure 4 : Voies de signalisation Il4/IL13

Il existe 2 types de récepteurs à l’IL-4. Le premier est constitué d’une chaîne IL4R-

α et de la chaine commune γ, le second est constitué de la chaine IL4R-α associé à la

chaine IL13Rα1. L’IL-4 peut se fixer sur ces 2 types de récepteurs, alors que l’IL-13 ne se

fixe que sur le second. Après la liaison du ligand, activation des JAKs associées, et

phosphorylation des chaînes des récepteurs, STAT6 active la transcription d’un ensemble

IL4-Rα chaîne γ commune

JAK1 P

PPPP

P

P FFIIGG11

TTCNNNNGAA

IL4-Rα IL13-Rαααα1

JAK2221

TYK2

IL4

PPPP

IL13

STAT6

JAK3 P P

P

P

P

119

de gènes responsables des propriétés physiologiques communes de ces 2 cytokines, comme

la stimulation de la prolifération lymphocytaire B et le switch des immunoglobulines. Les

mécanismes responsables de l’activation de cette voie de signalisation dans les LBPM

restent à définir. L’hypothèse d’une boucle autocrine ou paracrine a pu être éliminée, du

fait de l’absence ou de la très faible expression des transcrits IL-4 ou IL-13 dans les

échantillons tumoraux de LBPM et dans les lignées MedB-1 et Karpas 1106. Une

surexpression du gène JAK2, situé dans une région chromosomique (9p23) fréquemment

amplifiée dans les LBPM, pourrait en partie expliquer l’activation de cette voie de

signalisation.

Les données récentes sur l’analyse du transcriptome dans les LBPM confirment

l’hypothèse d’une dérégulation de la voie de signalisation cytokinique IL-4/IL-13 dans les

LBPM (93,121). Savage et al ont comparé le profil transcriptionnel de 34 LBPM et 176

LGCB-NM en utilisant des puces Affymetrix. Cette étude montre que les LBPM possèdent

une signature transcriptionnelle bien distincte de celle des LGCB-NM, caractérisée

essentiellement par : (1) une baisse de l’expression de différents constituants de la voie de

signalisation associée au BCR (IgM, kinase BLK, SAB, BLNK, PKCβ1, NF-AT, AKT1,

CD22); (2) une activation de la voie cytokinique IL-4/IL-13, comme en témoigne

l’augmentation de l’expression des différents effecteurs de la voie de signalisation

cytokinique IL-13, notamment l’IL13Rα1, JAK2 et STAT1, et les gènes cibles de l’IL-4/IL-

13 que constituent FIG1/IL4I4 et NF-IL3 ; (3) une activation de la voie NFkB, confirmée

par la mise en évidence en immunohistochimie d’une expression nucléaire de la sous unité

c-REL du complexe NFkB dans les cellules tumorales. Cette activation pourrait être liée à

l’augmentation de l’expression des membres de la famille TNF qui interagissent avec la

protéine de signalisation intracellulaires TRAF1 (TNF receptor-activating factor 1), et

120

activent secondairement la voie NFkB. L’expression de TRAF1 est observée dans les

cellules tumorales des LBPM par immunohistochimie.

Les LBPM se distinguent également des LGCB-NM par l’augmentation de

l’expression de la molécule d’adhésion LFA3 (CD58) et des composants de la matrice

comme la fibronectine et la métalloprotéinase 14. Cette étude, ainsi que l’analyse du

transcriptome par L Staudt, confirme que les 2 gènes MAL et FIG1 identifiés dans notre

étude, appartiennent à la signature transcriptionnelle des LBPM.

Si ces 2 études confirment que les LBPM possèdent une signature transcriptionnelle

bien distincte des LGCB-NM, elles dévoilent un aspect majeur des LBPM, qui est leur

grande similitude avec le lymphome de Hodgkin classique (LHc). La signature

transcriptionnelle des LBPM avec la perte partielle de l’identité B, l’activation des voies de

signalisation IL-4/IL-13 et NFkB est tout à fait comparable à celle du LHc. Il est à noter

que les gènes MAL et FIG1 qui appartiennent à la signature transcriptionnelle des LBPM

sont fortement exprimés dans les lignées dérivées de LHc. Les transcrits MAL sont détectés

en RT-PCR dans des cellules de Reed Sternberg microdisséquées à partir d’un échantillon

tumoral de LHc, à un niveau comparable à celui observé dans la lignée de LHc L428 et la

lignée Karpas 1106 dérivée d’un LBPM (93). Ces données confortent notre étude qui

montrait que 10% des LHc présentent une expression de la protéine MAL dans les cellules

tumorales. Le LHc et les LBPM présentent des caractéristiques communes, qui avaient déjà

été soulignées dans la littérature. Sur le plan clinique, elles atteignent volontiers le sujet

jeune, sous la forme d’une volumineuse masse médiastinale et sont fréquemment associées

à une fibrose abondante. Le diagnostic différentiel entre ces 2 entités peut parfois être

difficile sur le plan histologique, en particulier dans les LHc riches en cellules tumorales

et/ou lorsque les cellules de Hodgkin expriment le CD20 comme c’est le cas dans un faible

121

pourçentage de cas. Ces cas frontières ont été étiquetés « gray zone » (216). En

immunohistochimie, il existe dans ces 2 types de prolifération B une perte d’expression du

BCR, imputable dans le LHc à une perte d’expression des facteurs de transcription BOB1

et Oct2, alors que l’expression de ces facteurs de transcription est conservée dans les

LBPM. Sur le plan cytogénétique, une amplification de la région chromosomique 2p est

rapportée dans environ 20% des LBPM et jusqu’à 50% des LHc, et des gains du 9p dans

75% des LBPM et 25% des LHc (78,217). Enfin, des tumeurs composites ont été décrites,

avec dans certains cas la mise en évidence d’une relation clonale entre les 2 composantes

de la tumeur (218,219). L’ensemble de ces données suggère que ces 2 lymphomes pourrait

dériver d’un précurseur commun, dont la croissance et la survie a pu être favorisée par une

activation constitutive de la voie NF-kB, mais pour lequel différentes altérations génétiques

ont pu induire des aspects morphologiques le plus souvent différents et une évolution

clinique distincte. L’hypothèse que ce précurseur commun puisse être le lymphocyte B de

la médullaire thymique a déjà été évoquée, étayée par le fait qu’un cas de LHc de

localisation thymique exprimait MAL dans les cellules tumorales dans notre étude. Une

autre hypothèse a récemment été évoquée par Marafioti et al (220). Les auteurs ont

identifié une nouvelle sous-population lymphocytaire B située dans les zones

interfolliculaires des organes lymphoïdes, présentant des prolongements dendritiques

semblables à ceux observés dans les lymphocytes B thymiques. Ces cellules sont

caractérisées par l’expression des marqueurs B CD20, CD75, CD79a, des facteurs de

transcription PAX-5, Oct-2, et BOB-1, l’absence d’expression de l’IgD, des marqueurs du

centre germinatif BCL6 et CD10, des marqueurs plasmocytaires p63 (VS38C) et CD38, et

par l’expression du facteur de transcrition MUM1 (IRF4). Elles présentent un index de

prolifération élevé et sont Bcl2 et CD30 négatives. Elles expriment CD40 mais pas les

marqueurs associés aux cellules folliculaires dendritiques CD80, CD86, CD208 et CD21.

122

L’analyse des gènes des immunoglobulines montre qu’elles présentent un taux de

mutations somatiques de l’ordre de 9% sans variation intraclonale détectable. De fait, ces

cellules présentent des caractéristiques morphologiques et immunohistochimiques

distinctes des lymphocytes du centre germinatif et des cellules B mémoires ou des

plasmocytes. Elles s’apparentent aux lymphocytes B de la médullaire thymique, qui

présentent comme elles des prolongements dendritiques avec des connexions étroites avec

les lymphocytes T et une absence d’expression du marqueur CD21. Les auteurs suggèrent

que cette population particulière de lymphocytes B, qui est différente des sous-populations

lymphocytaires B individualisées jusqu’à présent, pourrait être à l’origine de lymphomes,

notamment du LHc. L’origine précise de cette population très particulière de lymphocytes

B nécessite très certainement des investigations complémentaires.

En conclusion, les résultats de nos 2 études, confortées par les données récentes des

micropuces, confirment clairement que les LBPM constituent une entité très distincte au

sein des lymphomes à grandes cellules B, avec des caractéristiques cliniques,

morphologiques, immunohistochimiques et cytogénétiques propres. Les LBPM constituent

un groupe de tumeurs hétérogène au sein duquel il apparaît difficile de faire la distinction

entre les LBPM « vrais » (d’origine thymique) et les LGCB développés à partir des

ganglions médiastinaux sur les bases cliniques et morphologiques seules. L’identification

de la signature transcriptionnelle des LBPM permettra dans l’avenir de distinguer ces 2

entités.

Loin de conclure le chapitre des LBPM, l’analyse du transcriptome ouvre de

nouvelles perspectives en mettant en évidence d’une part l’activation de différentes voies

de signalisation dans les LBPM et d’autre part les corrélations étroites qui existent entre les

LBPM et le LHc. Le LHc n’a pas fini de nous révéler ses mystères. Cette maladie est la

123

première hémopathie identifiée sur le plan clinique par Sir Thomas Hodgkin en 1832, et

individualisée par la suite sur le plan morphologique par Mr Sternberg (1892) et Mrs Reed

(1902). Malgré son âge (un peu moins de 2 siècles !), cette maladie continue de faire parler

d’elle et de susciter de nombreux travaux de recherche. L’identification de la cellule

précurseur du LHc permettra sans doute de progresser dans la compréhension des

processus oncogéniques impliqués dans le développement des LBPM et du LHc.

Les perspectives de ce travail comportent plusieurs volets. Le premier va consister à

étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’activation de la voie de signalisation

dépendante de l’IL-4/IL-13 mise en évidence dans les LBPM. L’activation de cette voie de

signalisation est étayée par le fait qu’il existe une activation constitutive du facteur STAT6

dans les lignées Karpas 1106 et MedB-1, lignées dérivées de LBPM exprimant fortement

FIG1, et que la forme phosphorylée de la protéine STAT6 a pu être mise en évidence dans

les noyaux des cellules tumorales de LBPM par immunohistochimie (manuscrit soumis).

Une amplification du gène JAK2, situé dans une région chromosomique (9p23)

fréquemment amplifiée dans les LBPM, a été mise en évidence dans 2 LBPM sur 6 par

Southern blot, et les études en RT-PCR montrent une forte expression des transcrits JAK2

dans les LBPM comparativement aux LGCB-NM. Ces résultats sont cohérents avec les

analyses globales du transcriptome sur puces à ADN réalisées en collaboration avec

l’équipe de L Staudt et par celle de M Shipp (93,121). Le travail de notre équipe va

consister à essayer de comprendre le rôle et la fonction des différentes protéines impliquées

dans cette voie de signalisation : STAT6, kinases de la famille JAK (notamment JAK2),

chaînes des récepteurs IL-4/IL-13, phosphatases et autres régulateurs négatifs de cette voie

(protéines de la famille SOCS). Les lignées MedB-1 et Karpas 1106, ainsi que des lignées

dérivées de LGCB et de LHc seront utilisées.

124

Le deuxième volet va porter sur le rôle de la protéine FIG1 dans la fonction

lymphocytaire B normale et dans le développment des LBPM. L’expression du gène FIG1

dans les lymphocytes B activés par l’IL-4 suggère que FIG1 pourrait jouer un rôle dans la

différenciation lymphocytaire B. Il est donc important d’analyser l’expression de ce gène

en fonction du stade de différenciation des lymphocytes B. Nous seront aidés pour cela par

la synthèse d’un anticorps anti-FIG1 qui est actuellement en cours de réalisation, qui nous

permettra d’analyser ces sous-populations lymphocytaires B en cytométrie de flux, mais

également d’analyser le profil d’expression de la protéine FIG1 dans les tissus lymphoïdes

par immunohistochimie.

L’analyse de la structure/fonction de la protéine FIG1 consistera à établir la

localisation subcellulaire de cette protéine dans des cellules transfectées et des cellules B

normales, de déterminer si cette protéine possède effectivement une activité LAO et des

fonctions proapoptotiques via la synthèse d’H2O2, ou des propriétés d’adhésion comme

cela a été décrit pour certaines LAOs.

Le troisième volet va porter sur l’analyse et l’exploitation des résultats du travail

effectué en collaboration avec L Staudt sur l’analyse du transcriptome des LBPM. Ce

travail et celui de l’équipe de M Shipp, ont permis de révéler une signature

transcriptionnelle propre aux LBPM, très proche de celle du LHc. Celle-ci est caractérisée

non seulement par une activation des gènes impliqués dans la signalisation cytokinique IL-

4/IL-13 (effecteurs : IL-13 Rα1, JAK2 et gènes cibles : FIG1, CD23, NF-IL-3, TARC), mais

aussi dans la signalisation de l’interféron (STAT1, IP10/CXCR3 ligand…) ; dans la

signalisation associée aux protéines de la famille du Tumor Necrosis factor (CD30,

Fas/CD95, TRAF1, OX40ligand, BCMA, TNFRSF14…), de gènes codant pour des

molécules de costimulation de la famille B7 (Programmed Death Ligand-2, CD80 et

CD86), et de gènes codant pour des molécules d’adhésion (intégrine αM et αV, CD58), des

125

protéines de la matrice extra-cellulaire (Fibronectine, collagène, métalloprotéinases) et des

régulateurs des interactions cellules-stroma (FGFR1, PDGFRbeta).

L’analyse de ces différentes voies de signalisation pourra être effectuée sur les lignées

MedB-1 et Karpas 1106. D’autre part, la constitution de « tissus puces » actuellement en

cours dans notre laboratoire représente un outil précieux qui permettra d’analyser

l’expression de différentes protéines de la signalisation susceptibles d’être impliquées dans

le développement des LBPM.

L’ensemble de ce travail devrait contribuer dans l’avenir à mieux individualiser ce

lymphome au sein des LGCB, et à améliorer les critères diagnostiques et la prise en charge

thérapeutique des patients atteints de LBPM. L’apport des puces à ADN dans la

connaissance de cette maladie est considérable. Ces études ont permis d’identifier une

signature transcriptionnelle spécifique des LBPM à laquelle appartiennent les gènes MAL

et FIG1. L’exploitation de ces données devrait permettre de mieux connaître les

mécanismes oncogéniques impliqués dans le développement de ces lymphomes et de

définir peut-être dans un avenir proche une cible thérapeutique potentielle.

126

VI. BIBLIOGRAPHIE

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RESUME en français Les lymphomes à grandes cellules B primitifs du médiastin (LBPM) se distinguent des lymphomes à grandes cellules B (LGCB) périphériques par leurs caractéristiques cliniques (masse médiastinale), morphologiques (cellules à grand cytoplasme clair, fibrose) et immunohistochimiques (absence d’expression d’immunoglobulines). Afin d’identifier des anomalies moléculaires spécifiques des LBPM, nous avons comparé les transcrits exprimés dans les LBPM à ceux exprimés dans les LGCB non médiastinaux en utilisant la technique de « Differential Display Reverse Transcription » puis la technique de « Representational Difference Analysis ». Nous avons mis en évidence une expression récurrente et spécifique du gène MAL dans les LBPM. Ce gène code pour une protéine hydrophobe ancrée dans les microdomaines membranaires enrichis en glycolipides appelés rafts. MAL est exprimé dans la plupart des cellules du compartiment lymphocytaire T mais de façon très restreinte dans la lignée lymphocytaire B. Une population minoritaire de cellules B thymiques exprime MAL, population qui pourrait représenter la contrepartie normale des LBPM. Nous avons montré que le gène FIG1/IL4I1, gène induit par l’interleukine 4 est activé dans les LBPM. L’expression de ce gène pourrait être le reflet d’une activation constitutive de la voie de signalisation dépendante de l’interleukine 4/ interleukine 13 dans les LBPM. L’ensemble de ce travail a apporté un support biologique à cette entité particulière de lymphome et devrait contribuer à améliorer les critères diagnostiques et la prise en charge thérapeutique des patients atteints de LBPM. _______________________________________________________________________ TITRE en anglais: Identification of specific molecular markers of primary mediastinal large B-cell lymphomas. _________________________________________________________________________ RESUME en anglais:

Primary mediastinal large B-cell lymphomas (PMBLs) are recognized as a distinct lymphoma subtype among diffuse large B-cell lymphomas (DLBLs) in view of their clinical (prominent mediastinal mass), morphological (large cells with clear cytoplasm, fibrosis) and immunohistochemichal features (lack of immunoglobulin expression). In order to identify specific molecular alterations in PMBLs, we compared PMBLs to non-mediastinal DLBLs transcripts using « Differential Display Reverse Transcription » and « Representational Difference Analysis » methods. We demonstrated the recurrent and specific expression of the MAL gene in PMBLs. The MAL gene encodes an integral membrane protein located in glycolipid-enriched membrane microdomains, called lipid rafts. It is expressed essentially in the T-cell lineage, but rarely in the B-cell lineage. We evidenced its expression in a minor population of thymic medullary B cells, that is believed to represent the normal counterpart of PMBL. We demonstrated that the transcription of the interleukin 4-induced gene 1 (FIG1/IL4I1) is activated in PMBLs. FIG1 expression might reveal a constitutive activation of the interleukin 4/ interleukin 13 cytokine signalling pathway in PMBLs. In conclusion, this study lends biological support to the PMBLs lymphoma entity and will contribute to a better diagnosis and treatment of this peculiar type of lymphomas. _________________________________________________________________________ DISCIPLINE-SPECIALITE DOCTORALE : Sciences de la Vie et de la Santé MOTS CLES : Lymphomes B, médiastin, thymus, MAL, FIG1, analyse différentielle, Interleukine 4. INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE : EA 2348, Département de Pathologie, Hôpital Henri Mondor, 51 avenue du Maréchal de Lattre de Tassigny, 94010 Créteil.