UNIVERSITE PARIS 12 – VAL DE MARNE THESEdoxa.u-pec.fr/theses/th2008PEST0074.pdf · Microbial...

UNIVERSITE PARIS 12 – VAL DE MARNE

THESE

présentée pour obtenir le grade de

DOCTEUR de l’Université Paris 12 – Val de Marne

Spécialité : Sciences de l’Univers et de l’Environnement

par

Catherine GOUNOU

MOBILITE DES ELEMENTS TRACES METALLIQUES DANS LES SEDIMENTS : COUPLAGE ET COMPARAISON DES APPROCHES

CHIMIQUE ET MICROBIOLOGIQUE Soutenue le 09 juillet 2008 devant le jury : M. Daniel THEVENOT Président du jury M. Jacques BERTHELIN Rapporteur M. Philippe CAMBIER Rapporteur M. Philippe BATAILLARD Examinateur Mme Tatiana VALLAEYS Examinatrice M. Jean-Marie MOUCHEL Directeur de thèse M. Noureddine BOUSSERRHINE Directeur de thèse

Remerciements

2

Remerciements

Au terme de cette thèse, effectuée conjointement au CEREVE et à l’UMR 137 IRD-BIOSOL

(équipe Biologie des Sols et des Eaux) de l’Université Paris12-Val de Marne, je souhaite

remercier un grand nombre de personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à son

aboutissement.

En premier lieu, mes remerciements s’adressent aux personnes qui ont accepté de juger ces

recherches : Daniel Thévenot, Professeur Emérite du CEREVE qui m’a fait l’honneur de

présider le jury ; Philippe Cambier et Jacques Berthelin, directeurs de recherche,

respectivement à l’INRA de Versailles et au LIMOS-CNRS de Nancy qui se sont intéressés à

ce travail en tant que rapporteurs ainsi que Philippe Bataillard, chargé de recherche au BRGM

d’Orléans et Madame Tatiana Vallaeys, chargée de recherche à l’INRA de Jouy pour avoir

accepté d’endosser le rôle d’examinateur.

J’exprime ensuite toute ma reconnaissance à Jean-Marie Mouchel, Professeur au laboratoire

Sysiphe, de l’Université Pierre et Marie Curie, qui a pris le temps de diriger ce travail. Je lui

sais gré de ses conseils précieux, notamment pour l’interprétation des résultats et la rédaction

de ce mémoire.

J‘adresse également ma gratitude à Noureddine Bousserrhine, maître de conférences à l’UMR

BIOSOL (équipe Biologie des Sols et des Eaux), qui a co-encadré ma thèse durant ces 4

années. Grâce à lui, la découverte du monde mystérieux de la microbiologie et de la biologie

moléculaire fut passionnante. En outre, j’ai pris conscience de l’interaction entre la géochimie

et la microbiologie. Je le remercie également pour avoir pris le temps de me conseiller dans la

mise en œuvre des expériences, l’interprétation et la rédaction des résultats microbiologiques.

Un grand merci à Gilles Varrault, maître de conférences au CEREVE, qui m’a également

aidée pour l’interprétation des résultats des analyses de métaux et la relecture de mon

mémoire. Je lui suis reconnaissante d’avoir mis à ma disposition l’ICP-AES et d’avoir investi

dans un pH-stat pour mener à bien mes expérimentations.

Certains résultats n’auraient pu être obtenus sans la collaboration de Sophie Ayrault du

Laboratoire des Sciences du Climat et de l’Environnement pour l’analyse des métaux par ICP-

MS ni celle de Marie-Claude Millot et Mohamed Guerrouache de l’équipe des Systèmes

Remerciements

3

Polymères Complexes pour leur aide scientifique et technique dans la séparation des acides

organiques par HPLC. Qu’ils trouvent ici mes très grands remerciements.

Merci à Catherine Lorgeoux et Mohamed Saad, ingénieurs au CEREVE pour leur aide

respective dans l’analyse par chromatographie ionique et du carbone organique dissous.

Cette thèse n’aurait pu avoir lieu sans l’obtention des matières premières : les sédiments ! Je

remercie donc le Service Navigable de la Seine pour nous avoir autorisés à effectuer les

prélèvements dans la Seine et la Marne et avoir mis à notre disposition son personnel très

sympathique et ses remarquables embarcations…dont une a malencontreusement coulé lors

de l’une de nos campagnes de prélèvements, conséquence d’un feu de moteur ! Les

prélèvements sont parfois source de prise de risques !

Je remercie tout le personnel des laboratoires du CEREVE et du LBSE, en particulier :

- Evelyne Garnier-Zarli, Professeur et Directrice du LBSE pour m’avoir accueillie au sein de

son laboratoire,

- Maman Catherine Martin, secrétaire très dévouée du LBSE pour m’avoir soutenue durant

toute ma thèse et en particulier lors de la rédaction et …

- mes «compagnonnes» de route, Jennifer Harris et Marieke Demoucron, doctorantes, avec

qui j’ai partagé ces 4 années de thèse au quotidien, pour leur bonne humeur et leur soutien

moral.

Enfin, je remercie mes parents qui m’ont toujours encouragée, tout particulièrement dans les

moments difficiles.

Résumé

4

Résumé Les activités anthropiques entraînent une contamination des sédiments de rivière en de nombreux polluants et en particulier en éléments traces métalliques (ETM). Si la majorité des ETM se retrouvent piégés dans les sédiments, ceux-ci peuvent être remobilisés et passer en solution dans certaines conditions physico-chimiques et sous l’action des microorganismes autochtones. Les métaux relargués peuvent alors constituer un danger potentiel pour les organismes vivants dans les sédiments et dans la colonne d'eau. Dans le cas des sols, l’impact de l’activité microbienne autochtone sur la mobilité des ETM a souvent été rapporté. Cependant une telle activité de solubilisation n’a été que rarement étudiée dans le cas des sédiments. Une telle connaissance est pourtant importante pour la prédiction du comportement des métaux contenus dans les sédiments et la gestion de ces derniers, notamment lors de leur stockage suite aux opérations de dragage. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de comprendre et d’évaluer l’importance de certains des processus microbiens et chimiques de mobilité des ETM dans les sédiments en conditions anaérobies. La première phase de notre étude qui a consisté à incuber des sédiments de Seine et de Marne en milieu anaérobie dopé en glucose avait pour objectif d’étudier la corrélation entre le métabolisme microbien et le comportement des métaux en solution et dans les sédiments. Dans ces conditions opératoires, une forte solubilisation du fer et du manganèse (sous forme réduite) associée à une solubilisation de métaux traces (Co, Cu, Ni) a été mise en évidence, ce qui a laissé supposer l’intervention de bactéries ferri-réductrices dans les phénomènes observés. Une activité fermentaire importante a été observée et caractérisée par la production d’acides organiques majoritaires tels que les acides acétique et butyrique. Un tel résultat souligne l’importance des bactéries fermentatrices dans les phénomènes de dissolution observés. La deuxième étape de ce travail a consisté à confirmer l’importance de l’activité ferri-réductrice et à en identifier les acteurs principaux. Les analyses moléculaires menées ont montré que les bactéries ferri-réductrices majoritairement identifiées, appartiennent aux espèces Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa. L’utilisation d’un modèle géochimique nous a permis de montrer que les voies métaboliques supportant la réduction du fer et la mobilité des métaux étaient les fermentations butyrique et acétique. La troisième étape a consisté à comparer les impacts directs (réduction enzymatique) et indirects (propriétés des acides organiques produits) de Paenibacillus polymyxa et Clostridium butyricum sur la mobilité du fer, du manganèse et des autres métaux. Une telle étude a montré que les acides organiques produits (acétique, lactique, succinique, propionique et butyrique) ont un très faible impact sur la solubilisation aux pH rencontrés dans les sédiments et que la réduction enzymatique microbienne est le principal mécanisme de dissolution des éléments métalliques en milieu anaérobie.

Mots-clés : éléments traces métalliques, sédiments, bactéries ferri-réductrices, fermentation

Abstract

5

Abstract Antropic activities lead to the metallic contamination of river sediments. Most of trace metals are sorbed on sediments but a part of them can be released into aquatic environment when environmental conditions are modified. This is often due by the autochthonous microbial activity. Microbial activites and their consequences on the mobility of metals have been widely studied in soils. Metals are released through direct or indirect microbial mechanisms. Such studies in the case of sediments are very seldom. However, it can be usefull to understand the microbial mechanisms of metal release in sediments, and particularly for a good management of dredged sediments. In this environmental framework, the aim of this research work was to understand and to evaluate the role of the microbial and chemical mechanisms in the release of metals from river sediments in anaerobic conditions. Firstly, sediments from the Marne and Seine rivers were incubated in anaerobic conditions. A high solubilisation of iron and manganese occurred associated to the solubilisation of trace metals (Co, Cu, Ni, Pb). Meanwhile, organic acids were produced and the medium was acidified. Thus fermentation was supposed to be the main process of microbial metabolism. Furthermore these observations led us to suppose the presence of iron-reducing bacteria.

In a second step, the extent of the iron-reducing activity was studied. The main iron-reducing bacteria identified in the Marne sediments belonged to the species Clostridium butyricum and Paenibacillus polymyxa. The use of a geochemical model revealed that fermentation and reduction of iron(III) were the main metabolic pathways. Finally direct (enzymatic reduction) and indirect (complexation with organic acids, acidification) impacts of iron-reducing bacteria on the release of metals were compared. Acidification and organic acids had a weak impact on metal solubility in the range of studied pH (between 6,5 and 5). Enzymatic reduction is the main mechanisms of metal release in anaerobic conditions. Indeed the metallic concentrations can be 40 times higher in the presence of iron-reducing bacteria. Key-words: trace metals, sediments, iron-reducing bacteria, fermentation

Table des matières

6

Table des matières

Remerciements..................................................................................................... 2

Résumé ................................................................................................................. 4

Abstract ................................................................................................................ 5

Table des matières ............................................................................................... 6

Liste des figures ................................................................................................. 13

Liste des tableaux .............................................................................................. 16

Introduction générale........................................................................................ 20

Partie 1 : Synthèse bibliographique................................................................. 23

I. Les éléments traces métalliques dans l’environnement.......................... 24

I.1. Définition des éléments traces métalliques........................................................... 24

I.1.1. Classification et propriétés physico-chimiques des ETM ................................ 24

I.1.2. Toxicité............................................................................................................. 27

I.2. Origine des éléments traces métalliques dans l’environnement aquatique ...... 29

I.2.1. Origine naturelle............................................................................................... 29

I.2.2. Origine anthropique.......................................................................................... 31

I.3. Cycle des éléments traces métalliques dans l’environnement aquatique.......... 34

I.4. Cas du bassin versant de la Seine ......................................................................... 37

I.4.1. Présentation du bassin versant de la Seine ....................................................... 37

I.4.2. Contribution des différents compartiments à la pollution métallique du bassin

versant .......................................................................................................................... 38

I.4.3. Zones contaminées en ETM dans le bassin versant de la Seine....................... 41

II. Les éléments traces métalliques dans les sédiments................................ 42

II.1. Formation des sédiments ....................................................................................... 42

II.1.1. Origine des particules sédimentaires................................................................ 42

II.1.2. Sédimentation, diagénèse des sédiments et rôle dans la mobilité des ETM et

éléments majeurs .............................................................................................................. 43

II.2. Propriétés physico-chimiques des sédiments ....................................................... 48

II.2.1. Granulométrie des sédiments ........................................................................... 48

II.2.2. Composition minéralogique des sédiments...................................................... 48

Table des matières

7

II.3. Interaction entre éléments traces métalliques et composants des sédiments : cas

des oxydes de fer................................................................................................................. 51

II.3.1. Mécanismes d’immobilisation des ETM sur les oxydes de fer........................ 51

II.3.2. Mobilité des ETM associés aux oxydes de fer ................................................. 54

II.3.3. Importance de l’étude des oxydes de fer et des ETM associés d’un point de vue

environnemental ............................................................................................................... 57

III. Rôle des microorganismes dans la mobilité des ETM ............................ 57

III.1. Oxydation des sulfures métalliques .................................................................. 59

III.1.1. Microorganismes impliqués ............................................................................. 59

III.1.2. Mécanismes de lixiviation................................................................................ 59

III.1.3. Importance du contact bactérie-minéral dans le phénomène de biolixiviation 61

III.1.4. Paramètres influençant la lixiviation des sulfures de métaux .......................... 62

III.1.5. Conséquences de l’oxydation des sulfures sur l’environnement ..................... 63

III.2. Réduction des oxydes de Fe (III)....................................................................... 64

III.2.1. Réduction du fer et fermentation...................................................................... 65

III.2.2. Réduction couplée à l’oxydation des acides organiques et composés organiques

aromatiques ...................................................................................................................... 66

III.2.3. Réduction du fer et oxydation du soufre .......................................................... 67

III.2.4. Réduction du fer et oxydation de l’hydrogène ................................................. 68

III.2.5. Importance du contact entre bactéries et oxydes de fer lors de la réduction.... 68

III.2.6. Facteurs influençant la réduction des oxydes de Fe(III) .................................. 70

III.2.7. Conséquences de la réduction des oxydes de Fe sur la mobilité des ETM dans

les sols .......................................................................................................................... 73

III.3. Immobilisation des éléments traces métalliques par les microorganismes... 73

III.3.1. La biosorption .................................................................................................. 73

III.3.2. Précipitation par réduction du soufre et des composés soufrés oxydés ........... 75

IV. Méthodes d’évaluation de la biodisponibilité, mobilité, et spéciation des

ETM dans les sédiments ................................................................................... 76

IV.1. Les extractions simples ...................................................................................... 77

IV.2. Les extractions séquentielles ............................................................................. 78

Partie 2 : Mobilité des éléments traces métalliques et activité microbienne

autochtone : importance des bactéries ferri-réductrices............................... 83

Table des matières

8

Chapitre 1 : Interactions éléments traces métalliques et activité

microbienne autochtone.................................................................................... 84

I. Introduction ................................................................................................ 85

II. Matériel et méthodes .................................................................................. 86

II.1. Sites d’étude et description des lieux de prélèvement......................................... 86

II.2. Matériel utilisé et stockage des échantillons ........................................................ 89

II.2.1. Dispositif expérimental .................................................................................... 89

II.2.2. Caractérisation physico-chimique des sédiments............................................. 91

II.2.3. Suivi du métabolisme microbien...................................................................... 92

II.3. Mobilité des éléments traces métalliques ............................................................. 95

II.3.1. Principe des techniques de spectroscopie utilisées .......................................... 96

II.3.2. Analyse des éléments métalliques totaux......................................................... 96

II.3.3. Analyse des ETM dissous ................................................................................ 97

II.3.4. Répartition des éléments métalliques dans les différentes fractions du sédiment

.......................................................................................................................... 98

III. Résultats et discussion.............................................................................. 100

IV. Conclusions et perspectives ..................................................................... 127

Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes :

importance des bactéries ferri-réductrices ................................................... 129

I. Introduction .............................................................................................. 130

II. Matériel et méthodes ................................................................................ 131

II.1. Incubation des sédiments et suivi du métabolisme microbien ......................... 131

II.1.1. Incubation des sédiments ............................................................................... 131

II.1.2. Suivi du métabolisme microbien.................................................................... 131

II.2. Caractérisation génétique des communautés microbienne .............................. 133

II.2.1. Principe........................................................................................................... 133

II.2.2. Méthode.......................................................................................................... 133

II.3. Isolement et identification des bactéries ferri-réductrices ............................... 135

II.3.1. Milieu de culture ............................................................................................ 135

II.3.2. Ensemencement et incubation des bactéries .................................................. 136

II.3.3. Vérification de l’activité réductrice de fer des colonies................................. 136

Table des matières

9

II.3.4. Identification des bactéries ferri-réductrices .................................................. 136

II.3.5. Purification de l’ADN .................................................................................... 137

II.3.6. Séquençage de l’ADN et identification des bactéries .................................... 137


III.1. Evolution de la densité microbienne au cours de l’incubation..................... 140

III.2. Evolution de la capacité métabolique ............................................................. 141

III.3. Evolution de la diversité microbienne ............................................................ 145

III.4. Importance du fer dans la décomposition de la matière organique dans les

sédiments ........................................................................................................................... 148

III.4.1. Sulfato-réduction............................................................................................ 148

III.4.2. Réduction du fer ............................................................................................. 149

III.5. Estimation des populations microbiennes majoritaires................................ 150

III.6. Identification des bactéries ferri-réductrices................................................. 154


Partie 2 : Comparaison des mécanismes microbiologiques et chimiques

dans la mobilité des éléments traces métalliques ......................................... 158

Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des éléments

traces métalliques ............................................................................................ 159

I. Introduction .............................................................................................. 160


II.1. Caractéristiques des sédiments étudiés .............................................................. 161

II.2. Incubation des sédiments..................................................................................... 161

II.2.1. Stérilisation des sédiments ............................................................................. 161

II.2.2. Préparation de l’inoculum et ensemencement de Paenibacillus polymyxa.... 162

II.2.3. Incubation....................................................................................................... 162

II.3. Suivi de la croissance microbienne ..................................................................... 162

II.4. Suivi de la mobilité des éléments métalliques .................................................... 163


III.1. Métabolisme de Paenibacillus polymyxa......................................................... 165

III.2. Mobilité des éléments métalliques au cours de l’incubation ........................ 168

III.2.1. Eléments métalliques dissous......................................................................... 168

Table des matières

10

III.2.2. Attaque des différentes fractions du sédiment ............................................... 172

III.2.3. Provenance des éléments métalliques solubilisés .......................................... 174


Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la

mobilité des éléments traces métalliques....................................................... 196

I. Introduction .............................................................................................. 197


II.1. Choix des acides organiques................................................................................ 198

II.2. Dispositif expérimental ........................................................................................ 199

II.3. Modélisation.......................................................................................................... 200


III.1. Rôle du pH dans la dissolution des ETM ....................................................... 201

III.2. Rôle des acides organiques dans la dissolution des éléments métalliques... 202

III.2.1. Approche globale ........................................................................................... 202

III.2.2. Etude quantitative........................................................................................... 206

III.3. Bilan : Comparaison de l’effet du pH, des acides organiques et de l’activité

réductrice de Paenibacillus polymyxa. ............................................................................ 217

III.3.1. Eléments du groupe 1 (Fe, Mn, Sr) ................................................................ 218

III.3.2. Eléments du groupe 2 (Co, Ni, Pb) ................................................................ 218

III.3.3. Eléments du groupe 3 (Cd, Ag)...................................................................... 219


Conclusions générales et perspectives ........................................................... 221

Bibliographie.................................................................................................... 226

Annexes............................................................................................................. 254

Annexe 1 : Caractéristiques analytiques de la mesure du CO2 .................. 255

Annexe 2 : Caractéristiques analytiques du dosage du glucose par

spectrophotométrie UV (avec le kit D-Glucose, Roche) .............................. 258

Annexe 3 : Caractéristiques analytiques de la séparation et de la

quantification des acides organiques par HPLC.......................................... 259

Table des matières

11

Annexe 4 : Exemples de gammes d’étalonnage du carbone organique

dissous 264

Annexe 5 : Caractéristiques analytiques des mesures de métaux en ICP-

AES et ICP-MS................................................................................................ 266

Annexe 6 : Exemple de gamme d’étalonnage du Fe(II)............................... 267

Annexe 7 : Spéciation des métaux dans les sédiments ................................. 268

Mise en place et vérification du protocole..................................................... 268

I. Introduction .............................................................................................. 269

II. Matériels et méthodes............................................................................... 270

II.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique .......................................... 270

II.1.1. Dopage des acides humiques.......................................................................... 270

II.1.2. Dissolution des acides humiques par l’hydroxyde de sodium ....................... 271

II.1.3. Dissolution des acides humiques par le pyrophosphate de sodium ............... 271

II.2. Dissolution des métaux liés aux sulfures ............................................................ 272

II.2.1. Hydroxyde de sodium puis acide nitrique...................................................... 272

II.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique ............................................... 272


III.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique (acides humiques dopés) ..

............................................................................................................................ 273

III.1.1. Par l’hydroxyde de sodium ............................................................................ 273

III.1.2. Par le pyrophosphate de sodium..................................................................... 273

III.2. Dissolution des sulfures de métaux ................................................................. 274

III.2.1. Par l’hydroxyde de sodium puis par l’acide nitrique ..................................... 274

III.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique ................................................ 275

IV. L’acétate d’ammonium, solubilisant d’une partie des métaux liés aux

acides humiques ?............................................................................................ 277

IV.1. Matériel et méthodes........................................................................................ 278

IV.1.1. Dopage des acides humiques.......................................................................... 278

IV.1.2. Dissolution par l’acétate d’ammonium .......................................................... 278

IV.2. Résultats ............................................................................................................ 278

IV.2.1. Cadmium ........................................................................................................ 278

Table des matières

12

IV.2.2. Fer................................................................................................................... 278

IV.2.3. Plomb ............................................................................................................. 278

IV.2.4. Zinc................................................................................................................. 279

IV.2.5. Conclusions .................................................................................................... 279

V. Conclusion ................................................................................................. 279

Bibliographie.................................................................................................... 280

Annexe 8 : Description des plaques biolog (familles et composés) ............. 282

Annexe 9 : Validation de l’analyse des sulfates ............................................ 284

Annexe 10 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le calcul des

indices de saturation des minéraux métallo-carbonatés.............................. 286

Annexe 11 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le calcul des

indices de saturation des sulfures métalliques.............................................. 287

Annexe 12 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées pour la

modélisation de la spéciation des métaux en fonction du pH et des acides

organiques ........................................................................................................ 288

Annexe 13 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées pour la

modélisation de la spéciation des métaux à pH 6 avec mélange des acides

organiques ........................................................................................................ 292

Liste des figures

13

Liste des figures

Figure 1 : Classification périodique des éléments.................................................................... 26

Figure 2 : Schématisation du cycle hydrologique des métaux traces en milieu aqueux (d’après

Salomons et Förstner, 1984)..................................................................................................... 35

Figure 3 : Carte du bassin versant de la Seine (Piren-Seine) ................................................... 37

Figure 4: Profils de As, Cd, Co, Cu, Ni, Pb, Zn, Mn, Fe, SO42-, ΣH2S et pH dans l’eau

interstitielle dans les sédiments du Lac Chevreuil (Huerta-Diaz et al., 1998) (○), (∆) et (□)

représentent 3 profils différents. La flèche indique les limites de détections analytiques. ...... 46

Figure 5 : Schématisation de la complexation externe et interne à la sphère d’hydratation

(Sposito, 1989) ......................................................................................................................... 53

Figure 6 : Interactions microorganismes-métaux (d’après Ledin, 2000) ................................. 58

Figure 7 : Mécanismes de solubilisation des sulfures de métaux acido-solubles par attaque

chimique et microbiologique (Schippers et Sand, 1999) ......................................................... 60

Figure 8 : Mécanisme de dissolution des sulfures de métaux acido-insolubles par attaque

chimique et microbiologique (Schippers et Sand, 1999) ......................................................... 61

Figure 9 : Réduction dissimilatrice des oxydes de fer et fermentation (Lovley, 1991) ........... 65

Figure 10 : Réduction du Fe(III) via les acides humiques ....................................................... 69

Figure 11 : Mécanisme de réduction des oxydes de Fe(III) via les sidérophores .................... 70

Figure 12 : Concentration de Fe réduit par Vibrio en fonction de la température (d’après Jones

et al, 1984)................................................................................................................................ 71

Figure 13 : Populations bactériennes impliquées dans la réduction du soufre et ses formes

oxydées (d’après Boust et al, 1999) ......................................................................................... 75

Figure 14 : Carte du bassin versant de la Seine en amont et en aval de l’agglomération

parisienne ................................................................................................................................. 86

Figure 15 : Carte du site de Méry-sur-Marne (a) et détails du lieu de prélèvement (b)........... 87

Figure 16 : Carte du site d’Andrésy (a) et détails du lieu de prélèvement (b) ......................... 88

Figure 17 : Incubation en batch des sédiments ........................................................................ 90

Figure 18 : Evolution de la densité microbienne au cours des incubations des sédiments de

Marne et de Seine avec 0,5 % de glucose .............................................................................. 140

Figure 19 : Evolution de la dégradation des sources de carbones dans les sédiments de la

Marne (a) et de la Seine (b) .................................................................................................... 142

Figure 20 : Evolution de la concentration en glucose et acides organiques dans les incubations

des sédiments de la Marne et de la Seine (0,5 % de glucose) ................................................ 143

Liste des figures

14

Figure 21 : Evolution des profils DGGE au cours de l’incubation (en semaine) des sédiments

de Marne (a) et de Seine (b) ................................................................................................... 147

Figure 22 : Evolution des sulfates dans les incubations de la Marne (a) et de la Seine (b) ... 149

Figure 23 : Evolution des teneurs en Fe désorbé (µg.g-1 sédiments secs) dans les sédiments de

la Seine et de la Marne ........................................................................................................... 150

Figure 24 : Consommation de glucose et production d’acides organiques au cours de

l’incubation de P.polymyxa (barres d’erreur = écart-types des 3 réplicats) ........................... 165

Figure 25 : Evolution du pH au cours de l’incubation en présence de P. polymyxa (barres

d’erreur = écart-types des 3 réplicats) .................................................................................... 167

Figure 26 : Dissolution du Fe, Mn et Sr au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres


Figure 27 : Dissolution du Co, Cr, Ni et Pb au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres


Figure 28 : Dissolution de l’Ag, Cd et Cu au cours de l’incubation avec P. polyxmyxa (barres


Figure 29 : Teneurs en Mn en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes

phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................................... 176

Figure 30 : Teneurs en Sr en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes

phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................................... 177

Figure 31 : Teneurs en Co en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les

différentes phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................. 178

Figure 32 : Teneurs en Ni en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les


Figure 33 : Teneurs en Pb en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les


Figure 34 : Teneurs en Cr en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les


Figure 35 : Evolution du taux de dissolution des fractions du sédiment au cours de

l’incubation............................................................................................................................. 186

Figure 36 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates+oxydes

de Mn, oxydes de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de

l’incubation............................................................................................................................. 187

Liste des figures

15

Figure 37 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates, oxydes de

Mn + oxydes de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de

l’incubation............................................................................................................................. 188

Figure 38 : Dispositif expérimental du pH-stat (vue d’ensemble) ......................................... 200

Figure 39 : Evolution de la concentration en métaux dissous en fonction du pH en absence de

P. polymyxa ............................................................................................................................ 201

Figure 40 : Concentrations en métaux dissous en présence des acides lactique, acétique,

succinique et de la bactérie P.polymyxa en fonction du pH................................................... 205

Figure 41 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’acétate (400 mg.l-1)en

fonction du pH........................................................................................................................ 207

Figure 42 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au lactate (700 mg.l-1) en

fonction du pH........................................................................................................................ 208

Figure 43 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au succinate (480 mg.l-1)

en fonction du pH................................................................................................................... 209

Figure 44 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au propionate (100 mg.l-

1) en fonction du pH ............................................................................................................... 211

Figure 45 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liée au butyrate (1 g.l-1) en

fonction du pH........................................................................................................................ 212

Figure 46 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’oxalate (1 g.l-1) en

fonction du pH........................................................................................................................ 213

Figure 47 : Concentration maximale de CO2 (vpm) mesurée dans le flux d’azote en fonction

de la masse de CO2 injectée (mg)........................................................................................... 257

Figure 48 : Gammes étalons de chaque acide organique étudié ............................................ 262

Liste des tableaux

16

Liste des tableaux

Tableau 1 : Teneurs du fonds géochimique des éléments majeurs et des éléments traces dans

la croûte terrestre (Baize, 1997) ............................................................................................... 30

Tableau 2 : Emissions totales moyennes des ETM (tonnes.an-1) dans l’atmosphère en France

métropolitaine en 1990 et 2006 ainsi qu’en Europe (2005) (CITEPA, 2007; Mathias, 2007) 31

Tableau 3 : Quantités de minerais de métaux extraits en 1998 au Canada (kt), (Statistiques

Canada, 1998)........................................................................................................................... 33

Tableau 4 : Emission atmosphérique dans le bassin versant de la Seine jusqu’à l’entrée de

l’estuaire, Poses (64700 km²) par catégorie de source (an 2000) ; 1. Emission atmosphérique

annuelle (t.an-1) (CITEPA, 2007) 2. Importance relative des sources majeures d’émission : ‘-

‘<1% ; 1%≤*<10% ; 10%≤**<20% ; ***≥20%...................................................................... 38

Tableau 5 : Teneurs de fond moyennes en ETM dans les sédiments du bassin de la Seine

(µg.g-1) (Meybeck et al, 1998) ................................................................................................. 39

Tableau 6 : Apports de métaux dans les zones cultivées du bassin de la Seine (t.an-1)

(Thevenot et al, 2007) .............................................................................................................. 40

Tableau 7 : Stocks d’ETM dans le bassin urbain de Paris et sa banlieue (t.an-1) (Thévenot et

al, 2007) ................................................................................................................................... 40

Tableau 8 : Rétention des ETM (t.an-1) dans le système aquatique par le stockage des

particules dans le bassin versant de la Seine (Thévenot et al, 2007) ....................................... 41

Tableau 9 : Ordre d’apparition des réactions de réduction couplées à l’oxydation de la matière

organique (Reeburgh, 1983)..................................................................................................... 43

Tableau 10 : Exemples de microorganismes fermenteurs et réduisant le fer(III) en présence de

différentes sources de carbone donneuses d’électrons (Bousserrhine, 1995) .......................... 66

Tableau 11 : Pourcentage de fer réduit par les bactéries ferri-réductrices en fonction de la

surface de goethite (d’après Roden et Zachara (1996)) ........................................................... 71

Tableau 12 : Pourcentage de réduction du Fe(III) en fonction du pourcentage de substitution

de l’Al sur une goethite par Clostridium butyricum (Dominik et al, 2002)............................. 72

Tableau 13 : Pourcentage de fer et d’ETM solubilisé par Clostridium butyricum en fonction

de l’ETM de substitution sur une goethite (Bousserrhine et al, 1999a)................................... 72

Tableau 14 : Facteurs à l’origine de la mobilité des métaux traces dans les différents minéraux

du sédiment (d’après Pickering, 1986)..................................................................................... 78

Tableau 15 : Procédures d’extraction séquentielle généralement employées dans la littérature

.................................................................................................................................................. 80

Liste des tableaux

17

Tableau 16 : Exemple de répartition des ETM et éléments majeurs dans différents de

sédiments (%) par la méthode d’extraction séquentielle de Tessier ....................................... 81

Tableau 17 : Paramètres physico-chimiques analysés pour la caractérisation des sédiments . 91

Tableau 18 : Conditions de minéralisation des sédiments ....................................................... 97

Tableau 19 : Caractéristiques des amorces utilisées au cours de la caractérisation génétique de

la communauté microbienne totale et de l’identification des bactéries ferri-réductrices....... 135

Tableau 20 : Capacité des microorganismes des sédiments de la Marne et de la Seine à

dégrader le glucose et les acides organiques au cours du temps............................................ 143

Tableau 21 : Concentrations en glucose, sulfates, fer dissous, acide butyrique et acétique (en

mg.l-1) utilisées pour modéliser l’importance des communautés microbiennes .................... 151

Tableau 22 : Estimation de la biomasse des différentes communautés microbiennes

fonctionnelles dans les sédiments de la Marne et de la Seine................................................ 152

Tableau 23 : Caractéristiques physico-chimiques des sédiments de Marne (mai 2006)........ 161

Tableau 24 : Teneurs en métaux totaux (µg.g-1 de sédiments secs) dans les sédiments de la

Marne ..................................................................................................................................... 161

Tableau 25 : Résumé des différentes étapes de l’extraction séquentielle (oxydes de Fe

amorphes/cristallins) .............................................................................................................. 164

Tableau 26 : Masse de C produite (mg) ou disparue pendant l’incubation de P. polymyxa .. 166

Tableau 27 : Comparaison des bilans en carbone obtenus après consommation du glucose par

P. polymyxa ............................................................................................................................ 166

Tableau 28 : Calcul des indice de saturation des minéraux métallo-carbonatés à pH 6 par

Visual Minteq......................................................................................................................... 171

Tableau 29 : Teneurs des éléments métalliques dans les différentes fractions du sédiment

avant incubation (µg.g-1 de sédiments secs)........................................................................... 173

Tableau 30 : Phases majoritaires et pourcentage de phase attaquée des différents éléments

métalliques au cours de l’incubation (estimation qualitative)................................................ 182

Tableau 31 : Poids attribué à chaque élément métallique dans le calcul des pourcentages de

chaque fraction attaquée......................................................................................................... 183

Tableau 32 : Poids attribué à chacune des mesures observées au cours de l’incubation ....... 184

Tableau 33 : Taux de dissolution (valeurs minimales et maximales) des différentes phases au

4ème jour et en fin d’incubation obtenus pour les différents modèles..................................... 189

Tableau 34 : Quantités d’éléments métalliques désorbés calculées par les différents modèles et

observées ................................................................................................................................ 190

Liste des tableaux

18

Tableau 35 : Indices de saturation des sulfures métalliques à pH 6 calculé par Visual Minteq

................................................................................................................................................ 192

Tableau 36 : Acides organiques étudiés et produits au cours des essais à partir de 5 g.l-1 de

glucose.................................................................................................................................... 198

Tableau 37 : Pourcentage des formes complexées aux acides entre pH 5 et 6,5 ................... 214

Tableau 38 : Comparaison des teneurs totales théoriques et expérimentales extraites en

métaux à pH 6 en présence d’acides organiques (µg.l-1)........................................................ 215

Tableau 39 : Estimation par Visual Minteq de la distribution (%) des espèces métalliques à pH

6 dans les incubations réalisées avec P.polymyxa.................................................................. 217

Tableau 40 : Part (%) de l’activité réductrice de P.polymyxa, du pH 6 et des acides

organiques dans la solubilisation des éléments métalliques................................................... 217

Tableau 41 : Masse de CO2 injecté (mg) en tenant compte de la diminution de pression en

CO2 dans le flacon due aux prélèvements successifs pour l’injection ................................... 256

Tableau 42 : Concentration maximale de CO2 (vpm) dans le flux d’azote determinée par le

spectrophotomètre Béryl 100 Cosma ..................................................................................... 256

Tableau 43 : Pression partielle de CO2 (Pa) dans le flacon au cours des prélèvements

successifs ................................................................................................................................ 256

Tableau 44 : Facteurs de dilution obtenus en calculant le rapport concentration de CO2 lue sur

le spectrophotomètre (Béryl Cosma 100) sur la concentration de CO2 dans le flacon (vpm) 257

Tableau 45 : Répétabilité de la mesure de l’acide lactique (20 mg.l-1) .................................. 259

Tableau 46 : Domaine de linéarité (mg.l-1) des acides organiques étudiés ............................ 263

Tableau 47 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-AES...................................... 266

Tableau 48 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-MS........................................ 266

Tableau 49 : Protocole d’extraction séquentielle permettant de distinguer les métaux liés à la

matière organique de ceux liés aux sulfures (Campanella et al, 1995).................................. 269

Tableau 50 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par l’hydroxyde

de sodium ............................................................................................................................... 273

Tableau 51 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par le

pyrophosphate de sodium....................................................................................................... 273

Tableau 52 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et

HNO3 (50ml) .......................................................................................................................... 274

Tableau 53 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et

HNO3 (200ml) ........................................................................................................................ 275

Liste des tableaux

19

Tableau 54 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au

pyrophosphate de sodium et HNO3 (50 ml) ........................................................................... 276

Tableau 55 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au

pyrophosphate de sodium et au HNO3 (200 ml) .................................................................... 276

Introduction générale

20


L’accroissement des activités anthropiques a entraîné une contamination des sédiments de

rivière en de nombreux polluants et en particulier en éléments traces métalliques (ETM). A la

suite de leurs émissions, la majorité des ETM se trouve sous forme particulaire. Ces particules

sont transportées par ruissellement et se retrouvent en milieu fluvial où elles sédimentent. Si

la plupart des ETM se retrouve piégée dans les sédiments, une partie est susceptible d’être

solubilisée vers la colonne d’eau suite aux modifications des conditions physico-chimiques du

milieu. Par exemple lors des opérations de dragage, une importante solubilisation des ETM

peut survenir suite à l’aération des sédiments. Les ETM ainsi solubilisés peuvent interagir

avec la chaîne alimentaire et présenter un danger potentiel de toxicité pour les organismes

vivants et pour l’Homme.

Plusieurs auteurs ont souligné le lien étroit entre les modifications physico-chimiques du

milieu et l’activité microbienne autochtone. Dans le cas des sols, la mobilité des ETM a

souvent été associée à l’activité des microorganismes aérobies ou anaérobies. Ainsi, en milieu

aérobie, certaines bactéries autotrophes oxydent les sulfures de fer entraînant la production

d’acide sulfurique (Sand et al., 1992; Dopson et Lindström, 1999; Fowler et al., 1999;

Rohwerder et al., 2003). Cette baisse du pH provoque la dissolution d’autres sulfures

métalliques libérant ainsi les ETM en solution. Certains métabolites microbiens, tels que les

acides oxalique ou citrique produits par des microorganismes hétérotrophes ont également

étaient décrits comme étant cause de mobilité, via des phénomènes de complexation, de

certains ETM liés à des minéraux, autres que les oxydes de fer, et réactifs à des modifications

de pH telles que les fractions échangeables ou carbonates (Burckhard et al., 1995; Jones, 1998;

Wasay, 1998; Glover et al., 2002; Araujo do Nascimento, 2006).

En condition anaérobie, la dissolution des oxydes de fer par réduction bactérienne est un

mécanisme très connu et est très largement décrit (Munch et Ottow, 1980; Lovley, 1991;

Bousserrhine, 1995; Roden, 2006). Cette réduction entraîne non seulement la solubilisation du

fer mais celle des ETM qui y sont souvent associés (adsorbés ou en substitution) (Francis et

Dodge, 1988, 1990; Berthelin et al., 1995; Bousserrhine et al., 1999b). Les rares études

portant sur les facteurs limitant cette réduction ont montré la nécessité d’un contact direct

entre les oxydes de fer et les microorganismes (Munch et Ottow, 1983; Rajot, 1992;

Bousserrhine, 1995). De ce fait, la dissolution des ETM adsorbés sur les oxydes de fer ne


21

paraît pas directement liée à des facteurs physico-chimiques du milieu tels que l’acidification

ni à la complexation des ETM par les métabolites microbiens libérés dans le milieu.

Si la solubilisation des ETM dans les sols par l’activité des microorganismes a été largement

étudiée, rares sont les travaux qui se sont intéressés en détail à ces phénomènes dans les

sédiments. La majeure partie des études portant sur les sédiments s’attache uniquement à

quantifier les teneurs métalliques totales ou les teneurs contenues dans certaines fractions

(Biksham et al., 1991; Hirner, 1992; BradleyMoran et Woods, 1997; Tack et Verloo, 1999;

Yu et al., 2001; El Bilali et al., 2002; Akcay et al., 2003; Gismera et al., 2004; Hlavay et al.,

2004). Or, cette approche quantitative ne met pas l’accent sur le rôle des microorganismes

dans les phénomènes de solubilisation et par conséquent ne reflète pas réellement le rôle des

microorganismes dans les distributions observées. La compréhension de ces phénomènes de

solubilisation est pourtant nécessaire pour la gestion environnementale des sédiments dragués

et leur stockage en particulier. De plus, il n’est pas certain que les rares modèles diagénétiques,

qui ont cherché à introduire les ETM, mais dont le moteur est une activité hétérotrophe non

spécifique, permettent d’atteindre suffisamment de détails.

Dans ce contexte, les objectifs de ce travail ont donc été

- d’évaluer l’effet des microorganismes autochtones sur la mobilité des ETM dans deux

sédiments différents par leur nature et leur composition chimique (Marne et Seine),

- de caractériser les microorganismes impliqués dans la dissolution des ETM et le type de

métabolisme mis en œuvre et

- d’évaluer la part de la dissolution métallique liée à un contact direct entre sédiments et

microorganismes, de celle due à l’acidification du milieu et à la complexation par les

métabolites produits par les microorganismes.

Ce mémoire débute par une revue bibliographique visant à décrire les interactions entre

métaux et microorganismes. On y trouvera un volet consacré à l’origine des ETM dans les

sédiments ainsi qu’une description des différentes fractions du sédiment porteuses de ces

ETM, leur mode de fixation et les conditions physico-chimiques entraînant leur mobilité.

Cette synthèse bibliographique présente également les différents modes de solubilisation et

d’immobilisation des ETM par les microorganismes. Une attention toute particulière a été

portée sur les interactions oxydes de fer – bactéries ferri-réductrices. En effet, ce genre

d’interactions occupe probablement une place centrale dans des environnements anaérobies


22

similaires à ceux de nos sédiments. L’objectif sous-jacent de cette synthèse bibliographique

est également de montrer que les tests de lixiviation et autres extractions séquentielles,

permettant respectivement d’accéder à la fraction disponible et aux fractions contenues dans

les divers compartiments des sédiments, ne reflètent pas la réalité des échanges qui peuvent

s’effectuer au sein d’un sédiment puisqu’elles ne tiennent pas véritablement compte de

l’activité des microorganismes.

La 1ere partie est consacrée à une description des phénomènes de solubilisation des ETM

observés lors de l’incubation des sédiments de Marne et de Seine en lien avec le métabolisme

des microorganismes autochtones. Ce chapitre est divisé en deux chapitres, le 1er, sous forme

d’article, présente le devenir des ETM au cours d’une incubation en émettant des hypothèses

quant au métabolisme mis en place par les bactéries et son lien avec la mobilité des ETM. Le

2ème chapitre a pour objectif de confirmer les hypothèses émises quant au métabolisme

microbien et à mettre en évidence l’importance des bactéries ferri-réductrices dans nos

sédiments. L’identification des espèces bactériennes majoritaires responsables des

phénomènes observés y est également abordée en utilisant des techniques de biologie

moléculaire.

La 2ème partie est consacrée à l’étude de l’effet d’une culture pure de Paenibacillus polymyxa,

bactérie ferri-réductrice isolée de nos sédiments, sur la mobilité des ETM et l’importance du

contact bactéries-sédiments dans cette solubilisation. Le 1er chapitre est consacré à l’effet de

cette bactérie sur la mobilité des ETM sur un sédiment stérile. La dissolution des ETM, les

acides organiques produits et l’acidification du milieu ont été suivis au cours de l’incubation.

Le 2ème chapitre estime les parts d’ ETM dissous via les mécanismes de complexation et

d’acidification comparées à celle de la réduction enzymatique par P.polymyxa.

Enfin, ce mémoire se termine par une conclusion générale reprenant les principaux résultats

obtenus au cours de ce travail ainsi qu’une partie perspectives quant à ses applications

scientifiques et techniques.

Partie 1: Synthèse bibliographique

23

Partie 1 : Synthèse bibliographique


24

I. Les éléments traces métalliques dans l’environnement

I.1. Définition des éléments traces métalliques

Le terme de métaux lourds est souvent employé pour désigner les métaux et métalloïdes

associés à une contamination et un potentiel toxique et écotoxique. Cependant, ce terme est

utilisé sans fondement scientifique ni juridique. Il n’a jamais été défini par un organisme tel

que l’IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) (Duffus, 2001). En

général, sont appelés métaux lourds les éléments ayant une densité supérieure à 5 g.cm-3 et

précipitant avec les sulfures. Or, certains métaux toxiques ne sont pas particulièrement lourds

(ex : le zinc) alors que certains éléments toxiques ne sont pas tous des métaux (ex : l’arsenic).

Ainsi, pour toutes ces raisons, il est préférable d’utiliser le terme d’éléments traces

métalliques (ETM) plutôt que métaux lourds.

Conventionnellement, en sciences du sol, les éléments traces métalliques sont les 68 éléments

minéraux constituants de la croûte terrestre, dont le pourcentage massique est inférieur à

0,1% (Baize, 1997).

I.1.1. Classification et propriétés physico-chimiques des ETM

Dans la classification des éléments dite de Mendeleïev (figure 1), tous les éléments des blocs

s (sauf l’hydrogène et l’hélium), d et f sont des métaux ainsi que sept des éléments du bloc p.

De nombreux métaux possèdent deux propriétés chimiques caractéristiques (Shriver et Atkins,

2001) :

- la formation d’oxydes et d’hydroxydes basiques lorsque le métal est au degré

d’oxydation I et II et

- la formation de cations simples (hydratés) en solution aqueuse acide.

Ces deux propriétés sont donc importantes pour connaître les formes sous lesquelles les ETM

seront présents dans les sédiments et dans les sols (ex : formation d’oxydes, de sulfures

métalliques…).

Les métaux du bloc s regroupent les métaux alcalins et les alcalino-terreux. On les rencontre

particulièrement dans les minéraux et les eaux naturelles, notamment le Ca, Na et Mg (Shriver

et Atkins, 2001).

A l’état naturel, les éléments à gauche du groupe 6 se trouvent principalement sous forme

d’oxydes métalliques ou de cations métalliques associés à des oxyanions (exemples : chromite

FeCr2O4, hématite Fe2O3 et pyrulosite MnO2). A la droite du fer, le cobalt, cuivre et nickel se


25

trouvent à l’état naturel essentiellement sous forme de sulfures et d’arséniures. Le zinc est

l’élément le plus abondant du groupe 12 ; Cd et Hg sont beaucoup moins abondants. Les

sulfures sont les principaux minerais du groupe, le zinc et le cadmium y sont souvent associés

(Shriver et Atkins, 2001).

Les éléments métalliques du bloc p (métaux pauvres et métalloïdes) ont une abondance très

variable dans la croûte terrestre. Ainsi l’aluminium est l’élément le plus abondant. On le

retrouve principalement dans les argiles et les aluminosilicates. Le thorium et le bismuth sont

les moins abondants (Shriver et Atkins, 2001).


26

Bloc s Bloc d Bloc f Bloc pBloc s Bloc d Bloc f Bloc p

Figure 1 : Classification périodique des éléments


27

Les hommes ont largement utilisé les éléments traces métalliques pour développer leur

industrie. Or, les ETM présents dans l’environnement sont potentiellement biodisponibles

pour les êtres vivants. Si certains ETM sont essentiels pour leur développement, d’autres

présentent une certaine toxicité, notamment en fonction de leur forme chimique et ceci à partir

d’une certaine dose. C’est pourquoi il est nécessaire de s’intéresser au devenir des éléments

métalliques dans l’environnement.

I.1.2. Toxicité

Suivant leur nécessité pour les organismes vivants, les ETM peuvent être classés en deux

groupes : les éléments essentiels ou oligo-éléments et les éléments non nécessaires (Bliefert et

Perraud, 2001). De plus, un élément peut être essentiel pour un type d’organisme et non

nécessaire pour un autre.

Les organismes vivants présentent des besoins en éléments essentiels en concentrations bien

définies. Une carence peut entraîner l’inhibition d’une fonction de l’organisme alors qu’un

excès est à l’origine d’une toxicité.

La majeure partie des études portant sur la toxicité des ETM dans les sédiments, les rivières et

les sols concerne leurs effets sur les micro-organismes et/ou l’adaptation de ces derniers à leur

présence (Hassen et al., 1998; Bruins et al., 2000; Konstantinidis et al., 2003). Dans les sols,

l’effet toxique des ETM est principalement étudié sur les nématodes. Des concentrations

importantes en Cr et Se (> 90 mg.kg-1 de sol) entraînent une baisse significative de la diversité

de la communauté (Nagy et al., 2004). De même, le Co, Ni et Zn présentent des effets sur la

communauté à partir d’une teneur de 1600 mg.kg-1 de sol. Les nématodes semblent être

cependant plus sensibles au Cd puisqu’une diminution de la diversité est observée à partir de

160 mg.kg-1 de sol (Korthals et al., 1996). Dans les rivières, la toxicité des ETM a été

largement étudiée sur la moule Dreissena polymorpha, particulièrement sensible aux

contaminations métalliques (Naimo, 1995; Gundacker, 1999; Camusso et al., 2001). En effet,

celle-ci en filtrant l’eau pour se nourrir des microorganismes ingère également des ETM

dissous et associés aux matières en suspension. Les moules d’eau douce peuvent donc

accumuler de fortes teneurs en ETM qui engendreront des problèmes au niveau de leur

croissance, de l’efficacité de filtration, de l’activité enzymatique et du comportement (Naimo,

1995). Les conséquences métaboliques, notamment sur leur capacité de filtration apparaissent

à des concentrations de l’ordre de 10 ng.l-1 de Hg, 15 ng.l-1 de Cu, 100 ng.l-1 de Cd, 200 ng.l-1

de Zn et 400 ng.l-1 de Pb (Mouabad et Pihan, 1993). Chez l’Homme, l’accumulation d’ETM

dans l’organisme peut conduire à des dysfonctionnements du système rénal (Pb, Cd, Cr),


28

neurologique (Pb, As, Cd, Mn) ou hépatique (Cd) et provoquer des cancers (Goyer et

Clarkson, 2001).

L’accumulation des ETM dans les tissus vivants provient de leur forte capacité à former les

liaisons avec les ligands cellulaires (Bliefert et Perraud, 2001). De la nature et de la force de

ces liaisons découlent le degré de toxicité. Ainsi, plus ces liaisons sont ioniques, plus le métal

sera électronégatif, plus la liaison sera forte et donc la toxicité importante. Les cations

métalliques peuvent aussi former des liaisons de coordination c’est-à-dire de complexation

avec différents ligands cellulaires contenant des groupes –OH, -NH2, -SH et les peptides. Plus

le complexe cation métallique-ligand cellulaire sera stable et plus la toxicité sera importante

(Bliefert et Perraud, 2001) . Certains cations métalliques, tels que Hg2+, Cd2+ ou Pb2+ peuvent

induire une toxicité dans les cellules animales en perturbant l’action d’enzymes protectrices

impliquées dans l’élimination des radicaux libres. Or ces derniers sont particulièrement

toxiques car ils entraînent l’oxydation des lipides membranaires donc une destruction

membranaire.

La toxicité aiguë d’un ETM pour un organisme dépend de plusieurs facteurs (Bliefert et

Perraud, 2001):

- sa forme (spéciation),

- la façon dont il est absorbé (ingestion, inhalation…),

- le type d’organisme dans lequel il se trouve (plantes, animaux…),

- l’âge de l’organisme et son état de développement,

- son accumulation à certains endroits de l’organisme.

La toxicité des ETM dépend de plusieurs paramètres environnementaux modifiant leur

spéciation en solution. Parmi ces paramètres, on peut citer notamment le pH dont une

augmentation entraîne la précipitation des cations métalliques sous forme d’hydroxydes ou

d’oxydes de métaux insolubles. Il en résulte une diminution de la toxicité car les précipités

formés sont généralement moins disponibles et moins toxiques que les cations métalliques

libres.

La valeur du potentiel d’oxydo-réduction peut également affecter la toxicité des ETM en

favorisant la prédominance de leurs formes oxydées ou réduites. Il en est ainsi du chrome et

de sa forme Cr(VI) dont la toxicité est beaucoup plus importante que la forme réduite Cr(III).


29

I.2. Origine des éléments traces métalliques dans

l’environnement aquatique

Dans l’environnement aquatique, les ETM sont d’origine naturelle et anthropique. A partir de

leurs points d’émission, les ETM vont emprunter différentes voies de dispersion pour se

retrouver dans le milieu aquatique. Les cheminements pris par les ETM dépendent de leur

mode d’introduction (rejets directs dans les rivières, dans l’atmosphère ou sur le sol) ainsi que

de leur forme physique (solide, liquide ou gazeuse) (Foster et Charlesworth, 1996).

L’atmosphère constitue un milieu clé pour le transfert des polluants métalliques vers le milieu

aquatique. Ainsi, à l’échelle globale de la Terre, cette voie fournit plus de 70% du plomb et du

vanadium total, environ 30 % de mercure total et 20% de cadmium total au milieu aquatique.

Dans les régions rurales et reculées, l’atmosphère fournit la majeure partie des stocks d’ETM

dans le milieu aquatique.

I.2.1. Origine naturelle

I.2.1.1. Sols

Les ETM sont présents de façon naturelle dans les sols et constituent ainsi le fonds

géochimique. Les teneurs en ETM du fonds géochimique dépendent à la fois des teneurs

présentes dans les roches mères et des processus intervenus lors de la formation du sol et qui

ont pu lessiver ou concentrer les éléments (Robert, 1996). Les éléments traces ne représentent

que 0,6% des éléments totaux alors que les 12 éléments majeurs interviennent pour 99,4%

(tableau 1, (Baize, 1997)). Les métaux les plus abondants dans la croûte terrestre sont

l’aluminium et le fer. Ce dernier, en particulier, intervient dans de nombreux processus

biologiques notamment dans les processus énergétiques microbiens et ceci dans les

environnements aérobies et anaérobies (Lovley, 1991).


30

Tableau 1 : Teneurs du fonds géochimique des éléments majeurs et des éléments traces dans la croûte

terrestre (Baize, 1997)

Eléments majeurs (%) Oxygène 46,6 Potassium 2,50 Silicium 27,7 Magnésium 2,00 Aluminium 8,1 Titane 0,44 Fer 5,0 Hydrogène 0,14 Calcium 3,63 Phosphore 0,11 Sodium 2,80 Manganèse 0,10

Eléments traces (mg.kg-1) Fluor 700 Cobalt 23 Chlore 200 Plomb 15 Chrome 200 Bore 3 Vanadium 110 Molybdène 1 Nickel 80 Iode 0,3 Zinc 65 Cadmium 0,2 Azote 46 Sélénium 0,09 Cuivre 45

Les processus d’érosion des sols contribuent à la dispersion des ETM et éléments majeurs

dans le système aquatique (Martin et Meybeck, 1979). Ainsi, l’érosion chimique des sols

participe à l’enrichissement en Al, Fe et Ti des matières en suspension dans les rivières car

d’autres éléments sont plus facilement dissous. A l’inverse, les matières en suspension sont

faiblement enrichies en Na, Ca, Mg et Sr car ces éléments se trouvent principalement sous

forme dissoute. Aucun enrichissement par rapport à l’Al n’a été observé dans les matières en

suspension pour les terres rares, Co, Cr, Cs, Fe, Mn, Rb, Si, Th, Ti, U et V. A l’inverse, des

apports en Br, Sb, Pb, Cu, Mo et Zn, ainsi qu’en Ni et P ont été observés dans les matières en

suspension. L’érosion des sols peut donc contribuer à un enrichissement en ETM et éléments

majeurs dans le milieu aquatique sous forme dissoute ou particulaire.

I.2.1.2. Sources naturelles contribuant à l’émission d’ETM dans

l’atmosphère

Ainsi que nous l’avons vu, l’atmosphère est un élément clé dans la dispersion des ETM par

leurs retombées sur les continents et leurs entrées dans les systèmes fluviaux. Les principales

sources naturelles d’ETM dans l’atmosphère sont les poussières terrigènes, les volcans, les

aérosols marins et les feux de forêts (Nriagu, 1989). Les éruptions volcaniques libèrent, en

moyenne par an et dans le monde, entre 18800 et 27000 T de Cu, entre 3200 et 4200 T de Pb

et 1000 T de Hg dans l’atmosphère (Bliefert et Perraud, 2001). En 1989, les sources

naturelles ne représentaient qu’entre 30 et 50 % des émissions globales d’ETM

atmosphériques (Nriagu, 1989). En effet, les principales sources d’ETM dans l’atmosphère


31

sont d’origine anthropique et sont émises par les pays développés et en voie

d’industrialisation comme nous allons le voir dans le paragraphe suivant.

I.2.2. Origine anthropique

I.2.2.1. L’atmosphère : vecteur des sources anthropiques d’ETM

Des études portant sur la contamination des ETM dans les milieux polaires ont montré que

ceux-ci étaient principalement émis par les pays industrialisés. Ainsi la pollution métallique

dans l’Arctique est issue des émissions anthropiques de l’Eurasie en hiver et de l’Europe en

été. A l’échelle du globe, l’origine des ETM est donc fluctuante en fonction des saisons

(Pacyna, 1995). Dans l’Antarctique, l’analyse de la glace a montré que les teneurs en V, Cr,

Mn, Cu, Zn, Co, Ag, Cd, Ba, Pb, Bi et U étaient inférieures à 3.10-15 g.g-1 entre 1834 et 1990

(Planchon et al., 2002). Si des éléments comme le Mn, Co, Ba, V et Cd présentent peu de

fluctuations temporelles, une augmentation des teneurs en Cr, Cu, Zn, Ag, Pb, Bi et U est

apparue au cours du temps et particulièrement dans les dernières années. L’origine de cette

augmentation est liée au développement des activités anthropiques en Amérique du Sud,

Afrique du Sud et en Australie (extraction des mines et fonderies au Chili, Pérou, Zaïre et

Zambie).

Les émissions atmosphériques totales des ETM en France métropolitaine entre 1990 et 2006

et en Europe sont présentées dans le tableau 2.

Tableau 2 : Emissions totales moyennes des ETM (tonnes.an-1) dans l’atmosphère en France

métropolitaine en 1990 et 2006 ainsi qu’en Europe (2005) (CITEPA, 2007; Mathias, 2007)

Emissions totales moyenne en France (tonnes.an-1)

Emissions moyennes en Europe (tonnes.an-1) (d’après l’EMEP)

Année 1990 2006 2005 As 16,4 10,5 7,6 Cd 18,8 4,6 7,6 Cr 391 40 16 Hg 27 7,9 3,4 Ni 316 162 62 Pb 4283 128 90 Zn 1895 261 274

Si, dans la plupart des cas, les rejets d’ETM en France sont supérieurs à la moyenne

européenne, on constate une diminution très importante depuis 1990. Si les industries

manufacturières restent les principales émettrices d’ETM en particulier pour l’As, le Cd, le

Cr, le Hg, le Pb et le Zn, la diminution observée est essentiellement due aux progrès des


32

techniques de transformation des métaux ainsi qu’à la mise en place de dépoussiéreurs plus

efficaces (CITEPA, 2007). Les émissions de Hg dues à l’incinération des ordures

ménagères ont également diminué grâce à l’amélioration du traitement des fumées. Le plomb

était émis à 97 % par le trafic routier dans les années 1990 et a progressivement diminué pour

devenir quasiment nul après l’interdiction de distribution des essences plombées en 2000.

Actuellement, les émissions de Pb proviennent à 62 % de l’industrie manufacturière (CITEPA,

2007). Le Ni est principalement émis lors de la production d’énergie, en particulier lors des

opérations de raffinage du pétrole et de production d’électricité (CITEPA, 2007).

L’émission de Cu n’a pratiquement pas varié depuis 1990 avec environ 170 T rejetées par an.

Le Cu provient majoritairement du transport routier (54 % en 2005) et dans une moindre

mesure du transport ferroviaire (34 % en 2005) et est émis lors de l’usure des plaquettes de

frein et des caténaires (CITEPA, 2007).

La majorité des ETM parvient dans l’atmosphère sous forme particulaire ou aérosols dont la

taille est comprise entre 0.05 et 100µm de diamètre (Spokes et Jickells, 2006). Les plus fines

particules s’agglomèrent en particules plus grosses sous l’agitation atmosphérique puis

sédimentent (Spokes et Jickells, 2006). Ces aérosols représentent une source importante

d’ETM pour les milieux dans lesquels ils se déposent. Cependant une partie des éléments

métalliques atmosphériques est solubilisée dans l’eau de pluie. Cette solubilisation est

généralement supérieure à 80% pour le Na, Cl, K, Ca, Se et Br, entre 50 et 80 % pour le Mg,

V, Cr, Mn, As, Co, Ni, Cu, Cd, Sb et Pb et moins de 25 % pour l’Al, Sc et Fe (Cawse, 1980).

Cette relative solubilité des ETM dans l’atmosphère dépend de leur spéciation. Une étude

réalisée sur les particules fines atmosphériques (<100µm) (Fernandez Espinosa et al., 2002)

a montré que près de 40 % du Ni, 35 % du Co, 32 % du Mn et 50 % du V étaient adsorbés sur

la fraction soluble et échangeable et donc facilement solubilisés dans l’eau de pluie. A

l’inverse, 54 % du fer se trouvait dans la fraction résiduelle. Par conséquent, la spéciation des

éléments métalliques atmosphériques présente des implications significatives pour leur

transfert et leur devenir dans les différents compartiments de l’environnement.

I.2.2.2. Les rejets urbains

Une part importante des ETM d’origine anthropique provient des systèmes hydrologiques

urbains. Les eaux pluviales ruissellent sur les chaussées et les toitures et contribuent

également à la pollution due aux réseaux d’assainissement unitaires. De ces trois sources

urbaines, les ruissellements de chaussées sont généralement les plus contaminés en ETM


33

(Förster, 1993). Certaines parties des véhicules (freins, pneus) sont constituées de Cu, Pb, Zn,

Cr, Ni ou Cd et l’usure de ces pièces entraîne la libération de ces éléments sur la chaussée

(Legret et Pagotto, 1999 ; Sorme et Lagerkvist, 2002). A Paris, dans le bassin versant du

Marais, les ruissellements de toitures représentent 63 % du volume total d’eau qui ruisselle

dans ce bassin versant, générant plus de 85 % de Cd, Pb, Zn et 66 % du Cu trouvés dans le

réseau d’assainissement par temps de pluie (Garnaud, 1999). Le lessivage des structures en

béton est à l’origine des ETM suivants, en concentrations détectables dans les ruissellements :

As, Be, Cd, Cr, Hg, Ni, Pb, Sb, Se et Th (Hillier et al., 1999).

Dans de nombreux environnements urbains, des quantités significatives d’ETM sont associées

aux effluents domestiques et industriels et boues de stations d’épuration (STEP). Une

étude réalisée par Imhoff et al. (1981) a montré que les stations d’épuration le long de la Ruhr

recevaient 31 % de métaux issus des effluents domestiques et 69 % issus des effluents

industriels. Cependant, la charge relative émise dépendait de l’ETM avec 90% de Cr, 65% de

Ni et 50 % de Cu émis par l’industrie. En France, la part de métaux contenue dans les rejets

de STEP urbaines et industrielles est constituée à 79 % de Zn, 14 % de Cu, 2 % de Ni, Pb et 1

% de Cr (Barré et al., 2008).

I.2.2.3. Les activités minières

La pollution en ETM due aux activités minières remonte à 7000 avant JC, date des premières

exploitations humaines de métaux avec la fusion du cuivre (Renfrew et Bahn, 1991). Le

développement de la métallurgie a ensuite conduit à une augmentation de l’impact

environnemental de l’extraction des métaux. Avec la révolution industrielle, en particulier

depuis le début du 20ème siècle, l’exploitation des mines métallifères a augmenté d’une façon

considérable en vue de leur transformation en produits manufacturés (Nriagu, 1990). Le

tableau 3 donne un exemple de quantités de minerais extraits de mines métalliques au Canada

en 1998 (Statistiques Canada 1998) : Tableau 3 : Quantités de minerais de métaux extraits en 1998 au Canada (kt), (Statistiques Canada, 1998)

Minerais kilotonnes extraits Fer 96743 Or / argent 36454 Plomb / zinc 8484 Nickel/cuivre 15041 Cuivre/Zinc 87654 Autres minerais 15518


34

Les activités minières entraînent des conséquences majeures pour l’environnement (Ceto et

Mahmud, 2000) comme :

- une acidification des eaux de ruissellement due aux sulfures métalliques via la

production d’acide sulfurique en présence d’oxygène,

- une pollution métallique des eaux de surface et souterraines ainsi que des sédiments,

- l’émission des métaux sous forme particulaire dans l’atmosphère et

- une pollution au cyanure, utilisé notamment pour améliorer l’extraction de l’or une.

Qu’ils soient d’origine naturelle ou anthropique, les ETM empruntent donc différentes voies

dont la principale est la voie atmosphérique pour se retrouver dans le milieu aquatique, dans

lequel ils vont effectuer un cycle.

I.3. Cycle des éléments traces métalliques dans l’environnement

aquatique

Dans l’environnement aquatique, il existe quatre réservoirs d’ETM qui interagissent (figure

2) : les matières en suspension (MES), la colonne d’eau elle-même, les sédiments et les eaux

interstitielles (Salomons et Förstner, 1984). De très nombreux mécanismes

(adsorption/désorption, (co)-précipitation/dissolution…) interviennent entre les MES et les

ETM dissous en solution (1). Les échanges entre MES et sédiments interviennent lors des

processus de sédimentation et érosion/resuspension (2). Puis des échanges de métaux se

produisent entre les différentes fractions du sédiment et les eaux interstitielles (3) qui se

retrouveront à nouveau dans les eaux de surface (4) à travers des mécanismes de diffusion par

exemple.


35

Matières en suspension

Eaux de surface

Eaux interstitielles

Eaux souterraines

Sols

VégétationHomme

Sédiments

Biota

Milieu aqueux Milieu terrestre

1

2

3

4

Figure 2 : Schématisation du cycle hydrologique des métaux traces en milieu aqueux (d’après Salomons et

Förstner, 1984)

Les échanges entre sédiment et eau sont particulièrement importants. Concrètement, les ETM

des sédiments et des eaux interstitielles peuvent se retrouver en solution sous forme

particulaire ou dissoute lors des opérations de dragage qui entraînent un brassage des

sédiments et modifient les paramètres physico-chimiques du milieu dont les conditions

d’oxydo-réduction et le pH (Eggleton et Thomas, 2004). Lors des crues, les sédiments sont

remis en suspension, ce qui entraîne une mobilité des ETM qui se retrouvent soit sous forme

particulaire (2) soit sous forme dissoute dans les eaux de surface car provenant des eaux

interstitielles (4). A l’inverse, lors des périodes d’étiage, les particules en suspension

sédimentent et les ETM se retrouvent piégés dans les sédiments (2) (Meybeck et al., 1999;

Sherrell et Ross, 1999; Birch et al., 2001). Cependant, la régulation des ETM dissous par le

régime hydrique est plus complexe car des phénomènes d’oxydo-réduction s’ajoutent aux

phénomènes purement physiques. Dans la Seine et la Marne, il a été montré que les

concentrations en Li, B, Rb, Sr et Ba étaient corrélées au régime hydrique et qu’elles étaient

plus fortes en période de crue (Elbaz-Poulichet et al., 2006). Cependant, les concentrations en

Mn, Cu, Mo, Cd et Pb n’étaient pas corrélées au type de régime hydrique. Ainsi les

concentrations en Mn, Cu et Cd dissous augmentaient rapidement en été alors que la

concentration en Mo diminuait. Ces variations ont été attribuées aux processus d’oxydo-


36

réduction. La concentration en oxygène dissous diminuant en été, le milieu devient alors plus

réducteur ce qui entraîne un relargage du Mn, Cu, Cd et Pb alors que le Mo est immobilisé.

Les ETM présents dans ces quatre compartiments sont constamment en interaction avec le

biota présent dans le milieu aquatique. En extrayant de l’eau et des sédiments des nutriments

indispensables à leur croissance, les organismes vivants ingèrent les ETM potentiellement

toxiques qui y sont associés. Afin de contrer cette toxicité, ces organismes mettent en place un

mécanisme de détoxification différent selon que les cellules adoptent une stratégie de

régulation ou d’accumulation (Phillips et Rainbow, 1989). La régulation intracellulaire totale

du métal empêche son entrée dans la cellule ou en accélère sa sortie et l’ETM sera donc rejeté

dans le milieu aquatique. Au contraire, l’accumulation se traduit par une séquestration du

métal dans le milieu intracellulaire et est rendu non disponible par la synthèse de ligands et

donc par la formation de complexes « métal-ligand ». Ces organismes accumulateurs

contribuent donc à une diminution des ETM dissous.

Les surfaces biologiques sont les substrats les plus importants pour le piégeage des métaux

dans certains milieux aquatiques, tels que les lacs, et les concentrations en ETM dissous

peuvent parfois être contrôlées par l’adsorption à la surface cellulaire (Adriano (2001) selon

Newman et McKintosch (1991)). Lorsque ces organismes périssent, leur décomposition

pourra de nouveau rendre les ETM biodisponibles ou bien ceux-ci seront piégés dans les

sédiments ou adsorbés sur les matières en suspension.

De même que les remises en suspension et le piégeage des ETM dans les sédiments peuvent

être contrôlés par le régime hydrique et donc par les variations saisonnières, ces dernières

contrôlent également la rétention ou le relargage des ETM par l’activité biologique. En été,

l’activité biologique étant plus importante, la rétention des ETM sera plus importante qu’en

hiver lors de la décomposition de la matière organique qui pourra entraîner une solubilisation

des ETM. Par exemple, il a été montré que la répartition du Mn, Cu, Zn, Cd et Pb dans le

Rhin était corrélée à l’activité du phytoplancton (Admiraal et al., 1995). Le Mn apparaît sous

forme particulaire lors du bloom algal alors que le manganèse dissous est plus important en

période de faible activité du phytoplancton.

Ainsi, la régulation des ETM dans le milieu aquatique est très complexe et dépend à la fois de

paramètres chimiques, physiques et biologiques, le tout fluctuant en fonction des saisons.


37

C’est pourquoi il est intéressant d’étudier les paramètres chimiques et biologiques régissant

les ETM afin d’en comprendre le devenir, en particulier au niveau des sédiments, et sous

l’activité des microorganismes.

I.4. Cas du bassin versant de la Seine

Notre thématique de recherche s’intéressant aux sédiments du bassin versant de la Seine, il

nous est apparu indispensable d’une part de présenter ce bassin versant et d’autre part de

distinguer les différentes sources d’émission d’ETM afin de situer et justifier le choix des

sites de prélèvement par rapport à leur niveau de contamination.

I.4.1. Présentation du bassin versant de la Seine

Le bassin versant de la Seine, d’une superficie de 75 000 km², est caractérisé par une forte

densité de population (environ 215 habitants au km²). La plus forte concentration de

population se situe au niveau de Paris et sa banlieue (2740 km² pour 9,47 millions d’habitants)

dans une zone allant de la Seine et Marne à la confluence de la Seine et de l’Oise (figure 3)

SeineOise

MarneSeine

Oise

Marne

Figure 3 : Carte du bassin versant de la Seine (Piren-Seine)


38

Le bassin de la Seine regroupe 25% de la production agricole française, 25-30% de la

production industrielle française, 23% de la population française mais transporte moins de

10% de l’eau et des sédiments (Thevenot et al., 2007). 98% des eaux usées produites dans

Paris et sa banlieue sont collectées et traitées par quatre stations d’épuration : Seine-Amont,

Seine-Aval, Seine-Centre et Marne-Aval (SIAAP, 2007)

Par conséquent, de par sa densité de population et de ses nombreuses activités agricoles et

industrielles, le bassin versant de la Seine présente des stocks de métaux importants dans

divers compartiments, tels que les sols, les structures urbaines et industrielles, les sols

industriels pollués, les décharges et les sédiments.

I.4.2. Contribution des différents compartiments à la pollution

métallique du bassin versant

I.4.2.1. Rejets atmosphériques

Les ETM atmosphériques sont émis par des industries, des transformations énergétiques

(usines d’incinération d’ordures ménagères, combustion du charbon…) ainsi que par les

transports. Ces émissions représentent entre 6 et 16% des émissions totales en France. Dans le

bassin de la Seine, le Cr, Cu, Ni, Pb et Zn sont les ETM les plus fortement émis (tableau 4,

d’après Thévenot et al., 2007). Les activités industrielles de transformation énergétique et

manufacturières sont les principales émettrices d’ETM dans l’atmosphère du bassin. Tableau 4 : Emission atmosphérique dans le bassin versant de la Seine jusqu’à l’entrée de l’estuaire, Poses

(64700 km²) par catégorie de source (an 2000) ; 1. Emission atmosphérique annuelle (t.an-1) (CITEPA,

2007) 2. Importance relative des sources majeures d’émission : ‘-‘<1% ; 1%≤*<10% ; 10%≤**<20% ;

***≥20%

As Cd Cr Cu Hg Ni Pb Zn 1. Emission à l’intérieur du bassin 2,4 1,5 16 29 1,6 34 35 140

2. Importance relative des émissions

Transformation énergétique *** *** * * *** *** *** ***

Industries de manufacture *** *** *** * ** ** *** ***

Résidentiel tertiaire * * * * * ** * * Agriculture - - - - - - - - Transport routier - - - *** - - * - Autre transport - - - ** - - ** -


39

I.4.2.2. Erosion naturelle des sols

Les fonds géochimiques des sédiments de la Seine ainsi que dans l’ensemble du bassin

versant ont été déterminés sur la base d’échantillons historiques (à Paris Bercy et à l’estuaire)

et de petits bassins forestiers vierges de toute activité anthropique (Meybeck et al., 1998;

Thévenot et al., 2002). Les résultats moyens obtenus sont présentés dans le tableau 5.

L’aluminium et le fer sont les éléments ayant les plus fortes teneurs. Ceci concorde avec le

fait que ce sont les éléments majeurs dans la croûte terrestre (tableau 1). Le strontium est

également un élément présent en forte teneur. Les teneurs en Co, Ni, Pb et Zn se situent dans

la moyenne des teneurs habituellement mesurées dans les roches sédimentaires (Baize, 1997). Tableau 5 : Teneurs de fond moyennes en ETM dans les sédiments du bassin de la Seine (µg.g-1) (Meybeck

et al, 1998)

Al Ag As Ba Be Cd Co Cr Cu

33 000 2,7 6,5 ± 0,8

210 ± 50

1,3 ± 0,2

0,25 ± 0,05

7 ± 1

40 ± 5

15 ± 5

Fe Hg La Li Na Ni P Pb Sb

15 000 0,03 ± 0,0015

20 ± 2

38 ± 4

17000 ± 300

16 ± 2

750 ± 100

23 ± 3

0,5 ± 0,1

Sr V Zn 220 ± 30

40 ± 5

60 ± 10

I.4.2.3. Activités agricoles

L’agriculture impacte à plus ou moins long terme sur la pollution métallique. Cet impact est

dû :

- aux ETM présents dans les compléments alimentaires, dans les engrais (sources de Cd,

par exemple) et dans les produits phytosanitaires,

- aux retombées atmosphériques,

- à l’utilisation des boues de station d’épuration comme engrais.

Les apports en ETM par les zones agricoles dans le bassin de la Seine liés à la fertilisation

sont beaucoup plus faibles que les dépôts atmosphériques pour le Cu, Ni, Pb et Zn (Thevenot

et al., 2007). A l’inverse, les apports de Cd et Cr, liés à la fertilisation, sont plus importants

que les retombées atmosphériques (tableau 6). De même, les apports en Cd, Cr et Ni sont plus

importants avec la fertilisation qu’avec la réutilisation des boues de station d’épuration, à

l’échelle du bassin.


40

Tableau 6 : Apports de métaux dans les zones cultivées du bassin de la Seine (t.an-1) (Thevenot et al, 2007)

Cd Cr Cu Ni Pb Zn Engrais contenant du P 5,76 28,8 7,2 7,2 1,44 28,8 Epandage des boues de station d’épuration 0,35 5,1 31 2 15 83

Dépôts atmosphériques 1,66 5,22 166 23,9 108 583

I.4.2.4. Activités de Paris et son agglomération

Les rejets métalliques issus des activités de Paris et son agglomération et contribuant à la

pollution du bassin versant ont été étudiés dans le cadre du programme OPUR (Gromaire-

Mertz, 1998; Garnaud, 1999; Chebbo et al., 2001; Gromaire et al., 2001; Gromaire et al.,

2002; Rocher, 2003). De nombreuses sources ont été identifiées telles que les émissions

atmosphériques, le trafic routier, les retombées atmosphériques, le ruissellement des toitures

et des rues, les eaux usées domestiques, les eaux usées industrielles rejetées directement dans

le milieu naturel ou connectées au réseau d’assainissement ainsi que les ETM provenant du

dessablement du réseau d’assainissement. Les stocks métalliques issus de ces différentes

sources ont été estimés et sont présentés dans le tableau 7. Le zinc est l’élément le plus

fortement émis. On remarque également que le cuivre est le plus fortement émis par le trop

plein du réseau d’assainissement. La collecte des effluents est effectuée par la station

d’épuration d’Achères qui reçoit chaque jour 27,5 m3.s-1 d’effluents (SIAAP, 2007).

L’efficacité d’abattement de la pollution métallique en sortie de STEP est de 76% pour le Cu,

70% pour le Zn et 49 % pour le Cu (Thévenot et al, 2007). L’efficacité d’abattement du Cd

est difficile à estimer en raison des faibles concentrations et des limites de détection des

appareils de mesure. Les éléments métalliques émis par les activités urbaines et non abattus

par les STEP vont contribuer à l’augmentation des teneurs en ETM dans le milieu fluvial que

ce soit sous forme dissoute ou particulaire.

Tableau 7 : Stocks d’ETM dans le bassin urbain de Paris et sa banlieue (t.an-1) (Thévenot et al, 2007)

Cd Cu Pb Zn Eaux usées domestiques 0,42 111 17 229 Ruissellement urbain 0,19 26 84 470 Eaux industrielles connectées au réseau d’assainissement 0,005 1,2 0,3 10 Eaux industrielles rejetées directement en rivière 0,011 3 0,8 23 Trop plein du réseau d’assainissement 0,051 606 6,6 52 Sédiments du réseau d’assainissement 0,13 18 42 110 Boues de station d’épuration 0,76 68 32,4 180 Eaux traitées en station d’épuration 2,07 26 25,5 90


41

I.4.2.5. Rétention des ETM particulaires dans le système

aquatique

Arrivés dans les rivières, les ETM associés aux particules en suspension peuvent se déposer

dans le lit de la rivière, dans les sites naturels en cas d’inondation (laisses de crues) ou bien

dans des ouvrages de stockage. Les particules sédimentées sont aussi draguées puis stockées

ou épandues sur des zones spécifiques.

La qualité des sédiments est contrôlée tous les 3 ans avant dragage par le Service de la

Navigation de la Seine. Entre 60 000 et 180 000 tonnes de sédiments ont été draguées par an

sur les 15 dernières années. 70% des sédiments dragués sont ensuite stockés sous une couche

d’eau, selon les pratiques actuelles (Carpentier et al., 2002a, 2002b). Ce stockage de

sédiments constitue donc une réserve potentielle d’ETM susceptibles d’être relargués dans le

milieu environnant en fonction des conditions physico-chimiques de stockage et de l’activité

biologique.

Le tableau 8 synthétise la rétention des ETM associés aux particules dans le système

aquatique (Thévenot et al., 2007). Les laisses de crue et les sédiments dragués constituent les

réservoirs les plus importants d’ETM.

Tableau 8 : Rétention des ETM (t.an-1) dans le système aquatique par le stockage des particules dans le

bassin versant de la Seine (Thévenot et al, 2007)

Cd Cr Cu Hg Pb Zn Rétention dans les réservoirs 0,012 2,34 1,17 0,005 0,63 0,68 Laisses de crues 0,026 3,18 1,70 0,013 1,25 2,5 Dragage 0,170 4,7 3,05 0,040 4,30 14

La rétention totale des sédiments dans le bassin de la Seine est estimée à 200 000 tonnes par

an, ce qui correspond en moyenne au quart de la quantité de sédiments exportée vers

l’estuaire (700 000 t.an-1).

I.4.3. Zones contaminées en ETM dans le bassin versant de la Seine

Les sources de pollutions métalliques dans le bassin de la Seine sont multiples et contribuent à

un stockage d’ETM dans divers compartiments, notamment les sédiments. Une distribution

géographique de la pollution métallique a été établie sur la base d’un indicateur de pollution

métallique conçu par Meybeck et al. (2004). Cet indicateur est basé sur les teneurs en Cd, Cu,

Hg, Pb et Zn dans les échantillons particulaires et normalisé par rapport aux teneurs de fonds

géochimiques.


42

L’indice varie de 1 (bruit de fond géochimique) à 40 (contamination forte) à travers

l’ensemble du bassin mais des valeurs supérieures à 100 (contamination extrême) ont été

observées dans des affluents de l’Eure. Des corrélations entre les indices de contamination et

les ETM ont montré que les activités anthropiques avaient un fort impact sur les

concentrations en Ag, Sb et P, un impact marginal sur les concentrations en Ba, Ni et Cr et un

très faible impact sur les concentrations en Li, Be, V, Co ainsi qu’en éléments majeurs.

Dans le bassin supérieur de la Seine, on observe une évolution marquée de l’impact

anthropique de l’amont vers l’aval. En aval de la confluence de la Marne et de la Seine, juste

avant l’entrée dans Paris, la contamination diminue suite à un effet de dilution spatiale. En

entrant dans le grand Paris, la contamination métallique augmente suite aux rejets urbains de

temps de pluie dans la Seine et aux affluents contaminés péri-urbains. En traversant Paris,

l’indice augmente en raison des rejets du réseau unitaire. En aval de Paris, les indices de

contamination sont plus complexes à expliquer, particulièrement dans et autour de la zone de

confluence avec l’Oise. Ceci est dû non seulement à l’arrivée de l’Oise mais également aux

rejets de la station d’épuration de Seine-Aval (Achères) dont les masses d’eau se mélangent

plus ou moins rapidement avec la Seine. Plus en aval, les masses d’eau de la Seine, de l’Oise

et des rejets de la station d’épuration Seine-Aval sont progressivement mélangées, ce qui se

traduit par une diminution de la contamination métallique.

Comme nous l’avons vu précédemment, le comportement des ETM et éléments majeurs dans

le milieu aquatique fluctue au cours du temps. Il en est donc de même dans le bassin versant

de la Seine, selon les périodes d’étiage ou de crues, par exemple ainsi qu’en fonction de

l’activité du phytoplancton. Les concentrations et teneurs en ETM et éléments majeurs dans le

bassin versant de la Seine sont donc en perpétuel changement, c’est pourquoi il est intéressant

d’étudier leur devenir.

II. Les éléments traces métalliques dans les sédiments

II.1. Formation des sédiments

II.1.1. Origine des particules sédimentaires

Les particules solides constituant les sédiments ont trois origines (Chamley, 2000) :

- terrigène lorsque les particules proviennent de l’érosion des continents,

- allochimique lorsque les particules proviennent du bassin sédimentaire lui-même ou


43

- orthochimique qui correspond aux précipités chimiques dans le bassin sédimentaire ou

à l’intérieur du sédiment durant la diagénèse.

Les particules d’origine terrigène sont issues de l’altération superficielle des roches selon des

mécanismes physique (érosion éolienne et variations de température), chimique (hydrolyse,

acidification et salinité) et biologique (activité des microorganismes).

II.1.2. Sédimentation, diagénèse des sédiments et rôle dans la mobilité

des ETM et éléments majeurs

Les sédiments de rivière résultent d’une accumulation de particules en suspension au fond des

cours d’eau, appelée sédimentation. La sédimentation dépend de trois grands types de

paramètres intimement liés : les paramètres hydrodynamiques (débit de la rivière, direction du

courant, forme et profondeur des cours d’eau), physiques (taille des particules) et chimiques

(conditions de pH et d’oxydo-réduction) (Cojan et Renard, 1997).

La diagénèse, qui regroupe l’ensemble des réactions chimiques qui se déroulent dans les

sédiments après le dépôt des matières en suspension mais aussi pendant leur sédimentation,

joue un rôle important sur le comportement des ETM et éléments majeurs (Salomons et

Förstner, 1984). La variation des concentrations de nombreuses substances dans l’eau

interstitielle avec la profondeur reflète ces réactions diagénétiques. Ces réactions sont

d’origines abiotique et biologique. La plupart des réactions biologiques est due à une

décomposition de la matière organique par les microorganismes. Pour oxyder la matière

organique, les bactéries utilisent les accepteurs d’électrons présents, en suivant une hiérarchie

qui dépend de l’apport énergétique fournit par la réduction de chaque oxydant (tableau 9).

Dans les sédiments de la Seine, à l’aval d’Achères, la méthanisation est un processus majeur

lors de la dégradation de la matière organique en période d’étiage. Le CH4 est supérieur à 80

% des gaz totaux émis à l’interface eau-sédiment (Garban et al., 1995).

Tableau 9 : Ordre d’apparition des réactions de réduction couplées à l’oxydation de la matière organique

(Reeburgh, 1983)

Réaction de réduction Eh (mV) Energie fournie (kJ.mol-1 de CH2O dégradé)

Réduction de O2 O2 → H2O 720-740 -475 Dénitrification NO3

- → N2 710 -448 Réduction du Mn Mn(IV) → Mn(II) 460 -349 Réduction du Fe Fe(III) → Fe(II) 60 -114 Réduction des sulfates SO4

2- → HS- -200 -77 Méthanogénèse CH2O → CO2, CH4 -250 -58


44

La réduction des oxydes de manganèse et de fer après disparition de l’oxygène et

dénitrification peut entraîner la dissolution des ETM adsorbés sur ces oxydes (Salomons et

Förstner, 1984). Le sulfure d’hydrogène résultant de la réduction des sulfates peut réagir avec

les minéraux contenant du fer pour former des sulfures de fer. Le fer libéré peut ensuite réagir

avec les sulfures pour former des sulfures de fer.

Les sédiments sont donc un compartiment très réactif du milieu aquatique. Cette forte

réactivité tient d'une part au fait qu'ils contiennent toute une plage de compartiments de

conditions d’oxydo-réduction différentes, et que de la matière particulaire et dissoute peut être

transportée dans ces différents compartiments.

On représente souvent les profils de teneurs dans les sédiments selon une échelle où le zéro

est placé au niveau de l'interface avec l'eau surnageante (exemple de profils figure 4). Par

rapport à l'interface, chaque couche de sédiment paraît s'enfoncer progressivement vers le bas.

En réalité, c'est l'interface qui progresse vers le haut et les couches peuvent être en réalité

immobiles. Selon cette vision, les couches de sédiment ne passeraient pas d'un milieu

d’oxydo-réduction à un autre mais évolueraient isolément vers des conditions d’oxydo-

réduction de plus en plus réductrices en fonction de l'activité biologique, hétérotrophe

essentiellement, à l’œuvre au sein de la couche.

En réalité, même dans un milieu très calme, il existe des processus de transfert de particules

ou d'espèces dissoutes entre les couches. La diffusion moléculaire est effective pour les

composés dissous dès lors que les taux de sédimentation sont suffisamment faibles. Rares sont

les milieux où la vitesse de sédimentation est supérieure à 1 cm par an, et l'application des

coefficients de diffusion moléculaires, même quelque peu corrigés pour tenir compte de la

tortuosité (Boudreau, 1996), montre que la diffusion moléculaire est capable de faire migrer

significativement les composés dissous à ces échelles d'espace et de temps (avec un

coefficient de diffusion de 10-10 m2.s-1, le temps caractéristique pour la diffusion sur 1 cm est

de t=L2/D=0.01*0.01/10-10 = 106 secondes = 100 jours). La compaction progressive du

sédiment provoque aussi une remontée de l'eau interstitielle vers l'interface avec l'eau

surnageante. Mais c'est sans doute la bioturbation, qui, dans de très nombreux milieux calmes,

est le facteur principal du mélange entre les couches successives de sédiments. Les modèles

biogéochimiques qui simulent la distribution et les flux d'éléments au sein des sédiments

prennent en compte effectivement ces phénomènes de diffusions (Soetaert et al., 1996; Wang

et Van Cappellen, 1996; Hunter et al., 1998; Boudreau, 1999; Millward et Liu, 2003;


45

Meysman et al., 2005). De fait, si l’on admet, comme c'est généralement le cas, que le milieu

est de plus en plus réducteur avec la profondeur dans le sédiment, des espèces dissoutes

générées dans les compartiments les plus réduits du sédiment peuvent effectivement remonter

vers des secteurs moins réduits, et les composés voire les particules subissent des cycles

d’oxydo-réduction et non pas seulement des successions d’oxydo-réduction.

L'observation des profils de concentrations dans l'eau interstitielle doit nous éclairer sur ces

migrations. Des techniques développées récemment, technique de diffusion sur gel (DGT) ou

technique d'équilibre de diffusion (DET) permettent d'accéder, au prix d'un temps de contact

plus long, à des profils plus précis et sans doute plus fiables que les méthodes d'extraction

(délicates) d'eau interstitielle sous atmosphère inerte après tranchage des sédiments (Gao et al.,

2006). Ces techniques permettent des mettre en évidence des gradients de concentration des

éléments actifs sensibles aux variations d’oxydo-réduction (Fe, Mn, S) et des gradients de

métaux traces. On observe très souvent un pic de concentration qui engendre naturellement

des phénomènes de diffusion à la fois vers le haut et vers le bas. Le pic est généré par la

libération de métaux initialement liés aux particules (liées à des oxydes ayant été réduits,

voire de la matière organique) (Zhang et al., 1995; Huerta-Diaz et al., 1998). La diffusion

vers le bas est liée à la formation de sulfures qui fixent le fer et les métaux traces sous forme

particulaire, et induisent donc un déficit de concentration. Le déficit de concentration vers le

haut est soit simplement lié à des concentrations moindres de métaux dissous dans l'eau

surnageante soit à une réoxydation dans le sédiment des métaux (Fe) réduits. La re-

précipitation peut avoir lieu dans les couches d’eau profondes des lacs par exemple et non pas

dans le sédiment.

La figure 4 donne un exemple de profils d’ETM dans les eaux interstitielles de sédiments

d’eau douce d’un lac acide. On note une forte augmentation de fer dissous sous l’interface

eau-sédiment dans le lac Chevreuil. Elle témoigne de la dissolution des oxydes de fer et de la

diffusion des ions Fe(II) libérés vers la surface. Les sulfates sont fortement réduits, selon une

dynamique opposée à celle des ions Fe(II). Des sulfures apparaissent à la même profondeur

mais le pic présente une molarité très inférieure aux teneurs en sulfates. Puis les sulfures

dissous disparaissent de nouveau en profondeur, ce qui témoigne de la formation de sulfures

insolubles et implique la disparition d’une partie des ions Fe(II) avec la profondeur. Le

manganèse ne présente pas le même type de profil, ce qui suggère de très faibles interactions

avec les sulfures.


46

Figure 4: Profils de As, Cd, Co, Cu, Ni, Pb, Zn, Mn, Fe, SO42-, ΣH2S et pH dans l’eau interstitielle dans les

sédiments du Lac Chevreuil (Huerta-Diaz et al., 1998) (○), (∆) et (□) représentent 3 profils différents. La

flèche indique les limites de détections analytiques.


47

Dans un milieu beaucoup plus énergétique, tel qu'une rivière, de nombreux processus

mécaniques sont susceptibles d'accélérer les cycles d’oxydo-réduction successifs auxquels

sont soumis les particules et les éléments qu'elles contiennent. Les cycles

déposition/resuspension ou exondations multiples peuvent être générés à des échelles de

temps très variables par les successions de crues et d'étiages, qui provoquent à la fois des

variations de niveau d'eau et de vitesse de l'eau, le passage des bateaux, très influents en

étiage dans la partie naviguée de la Seine (Martin, 2001) voire encore les dragages. Pour

autant qu'ils ne soient pas trop rapides pour que des conditions successives réduites et

oxydantes puissent s'établir, ces mécanismes forcent des séquences d’oxydo-réduction au

cours desquelles les ETM pourraient osciller entre des fractions sulfures ou oxydes (Fe et Mn)

(Mucci et al., 2003 ; Van Cappellen et Wang, 1996). En particulier, dans les estuaires et plus

encore dans les marais salins, la salinité joue un rôle très important dans la diagénèse précoce

des sédiments. Ainsi, ce type de sédiments contient plus de phases de fer réactif que les

sédiments marins (Kostka et Luther, 1995). Le cycle rédox du fer est très rapide et complet :

la forme oxydée est très rapidement transformée en forme réduite sous forme de pyrite due à

la présence de sulfates en fortes concentrations. Le cycle rédox est contrôlé à la fois par la

réduction des sulfates et l’oxydation du sédiment qui dépendent à la fois du cycle annuel

(luminosité, température) mais aussi d’effets épisodiques tels que les marées (Kostka et

Luther, 1995). Une étude comparative entre la composition de sédiments fluviaux et marins

en estuaire (estuaire de la Scheldt, sud-ouest des Pays-Bas) réalisée sur la fraction vaseuse

(<63 µm) a montré une variation de la teneur en As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb et Zn (Verlaan,

2000). Les variations constatées s’expliquent par :

- l’apport de particules fluviales dans la zone de mélange,

- la précipitation chimique du Ni sur les oxydes de manganèse insolubles dans la zone

de transition entre la zone supérieure de l’estuaire anoxique et la zone inférieure

oxique et

- la formation de sulfures de Cd, Cu, Hg et Zn insolubles dans la zone supérieure

anoxique de l’estuaire et une mobilisation du Cd, Cu, Hg et Zn dans la zone oxique

inférieure de l’estuaire.

Ainsi les sédiments contribuent à une régulation des ETM et éléments majeurs selon des

processus complexes faisant intervenir activité chimique, physique et biologique et ceci en

lien étroit avec les propriétés physico-chimique des sédiments.


48

II.2. Propriétés physico-chimiques des sédiments

II.2.1. Granulométrie des sédiments

Les sédiments sont habituellement décomposés en deux principales fractions, la fraction

grossière et la fraction fine.

La fraction grossière présente une granulométrie supérieure à 50 µm et est divisée en sous-

fractions (Norme Afnor, NF X 31-107) :

- > 2 mm : débris végétaux ou agrégats

- entre 2 mm et 200 µm : sables grossiers

- entre 200 et 50 µm : sables fins et limons

La fraction fine présente une granulométrie inférieure à 50 µm se divise également en sous-

fractions suivantes :

- entre 50 et 20 µm : limons grossiers

- entre 20 et 2 µm : limons fins

- < 2 µm : colloïdes ou argiles

La connaissance de la granulométrie est particulièrement importante car les fractions fines et

en particulier les argiles assurent la cohésion des sédiments en raison de leurs propriétés

électriques et leur structure en feuillets. Les ETM se trouvent préférentiellement adsorbés sur

les fractions fines, car celles-ci présentent de très grandes surfaces spécifiques comportant de

nombreux sites d’adsorption. Les fractions fines peuvent être constituées de composés actifs

pour les ETM tels que les hydroxydes ou les matières organiques. Ainsi, dans les sédiments

de la Seine, Carpentier et al. (2002b) ont montré que le Cr, le Fe, l’Al, le Mn et le Ni étaient

majoritairement présents sur les fractions fines.

II.2.2. Composition minéralogique des sédiments

Les minéraux, de par leurs propriétés physico-chimiques, sont capables de réagir avec les

ETM présents dans le milieu environnant. En fonction de la répartition des ETM au sein d’un

sédiment, ils seront faiblement ou fortement adsorbés donc plus ou moins mobilisables en

fonction des conditions chimiques du milieu.

II.2.2.1. Les minéraux primaires et secondaires

- Les silicates primaires

Les silicates primaires proviennent de la destruction physique de la roche mère. On les trouve

principalement dans le sable et les limons fins ainsi que dans les argiles.


49

La structure des silicates primaires est basée sur des tétraèdres de silice SiO44- qui peuvent se

trouver soit sous forme d’unité isolée soit liés entre eux par leurs sommets de façon à former

des chaînes simples ou doubles, des couches ou des réseaux tridimensionnels (Sposito, 1989).

Des substitutions isomorphiques de Si par Al, Al par Fe(III) et Mg par Fe ou Al se produisent

simultanément aux substitutions de nombreux éléments traces.

L’attaque chimique des silicates primaires contribue à la libération d’espèces majeures telles

que le Na+, Mg2+, K+, Ca2+, Mn2+ et Fe2+. Les cations métalliques Co2+, Cu2+et Zn2+ se

trouvant dans les silicates primaires à l’état de traces sont libérés par érosion (Sposito, 1989).

- Les argiles

Les argiles sont des silicates d’alumine de formule générale (n SiO2Al2O3, mH2O). La

structure cristalline des argiles est disposée en feuillets constitués d’un empilement de

couches tétraédriques de SiO2 et de couches octaédriques de Al2O3.

La substitution des ions Si4+ par les ions Al3+ au sein des feuillets est une propriété

fondamentale des argiles permettant d’expliquer leur affinité pour les éléments traces

métalliques. Par cette substitution, les argiles sont chargées négativement. Cependant, il existe

aussi d’autres charges négatives à la surface des feuillets dues par exemple à des fonctions

hydroxyles. Ces charges sont capables de former des liaisons avec les éléments métalliques

cationiques.

- Les oxydes et hydroxydes

De part leur grande abondance dans la lithosphère et leur faible solubilité aux pH des sols,

l’aluminium, le fer et le manganèse constituent la plupart des oxydes, oxyhydroxydes et

hydroxydes (Sposito, 1989).

Les oxydes de fer se présentent sous forme d’oxydes, d’hydroxydes et d’oxy-hydroxydes et

leur structure est composée de Fe, O et/ou OH. Les hydroxydes de fer possèdent des

groupements hydroxyles –OH sur leur surface, ce qui leur confère des propriétés acido-

basiques. Ils seront donc très fortement impliqués dans les mécanismes d’adsorption des

cations métalliques en solution. Le fer peut se trouver sous forme divalente (ex : FeO,

Fe(OH)2) mais également être sous forme trivalente (Fe2O3) (Cornell et Schwertmann, 2003).

Les composés ferriques les plus communément rencontrés dans les systèmes

environnementaux sont (Cornell et Schwertmann, 2003) :


50

- la goethite (α-FeOOH), qui est la forme hydroxyde la plus stable

thermodynamiquement à température ambiante,

- la ferrhydrite (5Fe2O3, 9H2O) qui est un oxyde de fer amorphe très répandu dans les

environnements de surface et

- l’hématite (α-Fe2O3) qui est une forme cristalline très répandue dans les sols et les

roches et est extrêmement stable d’un point de vue thermodynamique.

De par leurs propriétés, les oxydes de fer présentent de nombreuses interactions avec les ETM

qui seront détaillées dans le paragraphe II.3 de ce chapitre.

- Les carbonates

Enfin les sédiments sont composés de carbonates qui interagissent avec les ETM et

contribuent à leur solubilité en cas de modification des conditions physico-chimiques. Par

exemple, une acidification du milieu entraînera la dissolution des carbonates mobilisant en

solution les ETM y étant coprécipités comme le Mn, Fe, Co ou Cd (Sposito, 1989).

II.2.2.2. La matière organique

La matière organique est constituée de biomolécules telles que les acides organiques, les

amines ou les polysaccharides produits par les microorganismes ainsi que les substances

humiques. Toutes ces molécules présentent certaines caractéristiques qui seront déterminantes

pour leur interaction avec les ETM (Sposito, 1989) telles que l’existence d’une grande variété

de groupements fonctionnels réactifs (carboxyliques, carbonyles, amines, phénoliques,

alcooliques…) et un caractère anionique sur le réseau macromoléculaire ayant des effets sur la

réactivité des groupes fonctionnels.

L’adsorption des cations à la surface des minéraux et matières organiques est contrôlée par les

charges de surface qui dépendent du pH (Park, 1965). Le point de charge nulle permet de

caractériser la capacité d’adsorption des ETM sur la surface en fonction du pH. Il s’agit de la

valeur de pH pour laquelle le nombre de charges protoniques de surface positives et négatives

se compense. Les ions s’adsorbant sur une charge opposée à la leur, l’adsorption ne devient

significative qu’à un pH voisin ou supérieur au pH de point de charge nulle. Cependant, les

interactions entre ETM et groupes minéralogiques sont beaucoup plus complexes et ne se

limitent pas à des phénomènes d’adsorption. En effet, les ETM peuvent également être co-


51

précipités à la surface des minéraux ou bien des substitutions de cations dans les réseaux

cristallins peuvent se produire, comme nous allons le voir dans le cas des oxydes de fer.

II.3. Interaction entre éléments traces métalliques et composants

des sédiments : cas des oxydes de fer

Nous avons choisi de traiter les interactions entre ETM et sédiments en nous intéressant plus

particulièrement aux oxydes de fer. Comme nous l’avons vu précédemment, les réactions

biotiques et abiotiques contribuant à la diagénèse précoce des sédiments sont très importantes

dans la régulation des métaux traces. En particulier des concentrations importantes d’ETM

s’accumulent à l’interface d’oxydo-réduction lors de la formation diagénétique des

oxyhydroxydes de Fe et Mn (Douglas et Adeney, 2000). Il est probable que ceux-ci se

forment par nucléation et via l’activité microbienne. La géochimie des ETM sur les oxydes de

fer dépend des apports en ETM en provenance des sédiments et/ou de la colonne d’eau et des

modifications physico-chimiques du fond et des eaux interstitielles. Les oxydes de fer peuvent

donc constituer un puits pour les ETM mais peuvent aussi être solubilisés par différents

mécanismes physico-chimiques et microbiologiques, notamment en milieu anaérobie, où les

conditions sont réductrices (cas des sédiments).

II.3.1. Mécanismes d’immobilisation des ETM sur les oxydes de fer

Les oxydes de fer servent de réservoirs aux ETM. Le phénomène chimique principal mis en

jeu est la co-précipitation qui est la précipitation simultanée d’un élément chimique avec

d’autres éléments (Sposito, 1989). Les trois types de co-précipitation sont l’inclusion ou

substitution isomorphique, l’adsorption spécifique et la formation de solution solide. Dans

notre étude, nous ne nous intéresserons qu’aux deux premiers mécanismes. Ainsi, le réseau

cristallin des oxydes de fer se compose majoritairement d’atomes d’oxygène et de fer.

Cependant, les atomes de fer peuvent se substituer avec d’autres cations métalliques présents

dans le milieu environnant.

II.3.1.1. Substitution cationique

La probabilité de substitution cationique du fer dépend du rayon du cation métallique et de sa

valence (Cornell et Schwertmann, 2003). Un cation de valence +III est l’espèce la plus

probable pour se substituer au Fe(III). Le cas de substitution des oxydes de fer amorphes est le

plus fréquemment rencontré dans le milieu naturel. Par conséquent, les oxydes de fer agissent

comme des pièges pour les métaux de valence +III et plus rarement +II et +IV.


52

La goethite alumineuse est le meilleur exemple de substitution isomorphe par l’aluminium. En

effet, l’Al(III) peut remplacer jusqu’à 1/3 du Fe(III) total présent dans la goethite (Cornell et

Schwertmann, 2003). Le pH et la température jouent un rôle important dans cette substitution.

Le pH modifie la spéciation de l’Al en solution. A pH acide, la forme Al3+ est majoritaire ce

qui facilite la substitution. Une augmentation de température entraîne une diminution de

l’incorporation de l’Al, probablement suite à une augmentation de la vitesse de croissance du

cristal. La substitution présente des conséquences sur la solubilisation de la goethite. En

fonction du métal incorporé, la dissolution de la goethite substituée diminue dans l’ordre

suivant :

Mn-goethite > goethite pure > V-goethite > Al-goethite > Cr-goethite

La substitution de la goethite par l’aluminium est fréquemment rencontrée dans les sols

tropicaux (Cornell et Schwertmann, 2003). A l’inverse, bien que les rayons ioniques du Fe(III)

et du Mn(III) soient proches, la substitution par le Mn(III) est très limitée car celui-ci présente

une sphère de coordination tétragonale distordue sur un site octaédrique (effet Jahn-Teller).

Bien que les métaux puissent être incorporés dans le réseau cristallin des oxydes de fer, les

cations métalliques peuvent également être piégés sur les oxydes de fer par adsorption.

II.3.1.2. Adsorption spécifique des cations métalliques

L’adsorption spécifique joue un rôle particulièrement important dans le processus

d’interaction entre les ETM et les sédiments. Il s’agit d’une accumulation nette de matière

(ETM) à l’interface d’une phase solide (sédiment) et d’une solution aqueuse (colonne d’eau).

Elle diffère de la précipitation par le fait qu’elle n’aboutit pas au développement d’une

structure moléculaire tridimensionnelle. L’adsorption spécifique d’ETM sur les sédiments fait

intervenir deux processus (figure 5) :

La complexation externe à la sphère d’hydratation : elle correspond à une adsorption physique

mettant en jeu une déformation des orbitales électroniques du ligand et du métal de part et

d’autre de la sphère d’hydratation, de type dipôle-dipôle. Ce mécanisme est instantané et

réversible. Les cations adsorbés sont facilement échangeables (Sposito, 1989).

La complexation interne à la sphère d’hydratation : elle correspond à une adsorption mettant

en jeu des liaisons covalentes donc de plus forte énergie. Aucune molécule d’eau n’est

interposée entre le cation métallique et les groupes fonctionnels de l’adsorbant. Le complexe


53

formé est assez stable et les cations fortement liés à l’adsorbant. La désorption est par

conséquent moins facile car elle requiert une plus grande énergie pour rompre les liaisons

(Sposito, 1989).

Figure 5 : Schématisation de la complexation externe et interne à la sphère d’hydratation (Sposito, 1989)

Dans le cas des oxydes de fer, il s’agit d’un phénomène d’interaction des espèces adsorbées

avec les groupes hydroxyles présents à la surface des hydroxydes de fer –OH. L’oxygène peut

interagir avec les protons des acides alors que les cations métalliques agissent comme des

acides de Lewis et échangent l’hydrogène du groupement –OH avec d’autres ligands pour

former des complexes de surface (Cornell et Schwertmann, 2003) :

≡FeOH + Mz+ FeOM(z-1)+ + H+

et ≡Fe(OH)2 + Mz+ (FeO)2M(z-2)+ + 2H+

L’adsorption cationique entraîne une libération de protons et donc une acidification du milieu.

Certains paramètres tels que la force ionique de la solution et la température ont une influence

sur la capacité d’adsorption des oxydes de fer. Selon l’électrolyte, l’adsorption sera renforcée

ou supprimée. Par exemple, Crisenti et Sverjensky (1999) ont observé une augmentation de

l’adsorption des cations avec une solution de NaClO4 alors qu’une concentration forte en

NaCl entraîne une diminution de l’adsorption. Une température élevée augmente l’adsorption

des cations sur les oxydes de fer (Cornell et Schwertmann, 2003 d’après Machesky, 1985).

Suivant le type d’oxyde, la force d’adsorption des ETM est différente. Ainsi sur la goethite, le

cuivre est le métal le plus fortement adsorbé suivi par le Pb, Zn, Cd, Co, Ni et Mn alors que


54

sur l’hématite, les forces d’adsorption du Cu et du Pb sont inversées (McKenzie, 1980; Gerth

et Brümmer, 1983). Quant à la ferrihydrite, la force d’adsorption des ETM sur la ferrihydrite

suit l’ordre suivant : Pb>Cu>Cd>Zn>Ni>Ca (Dzombak et Morel, 1990).

En cas de faibles concentrations en cations et d’un nombre limité de sites disponibles sur les

oxydes, une compétition entre cations se produit (Benjamin et Leckie, 1981). Ainsi, le Zn

supprime toute adsorption du Cu sur la ferrihydrite.

L’adsorption spécifique des cations sur les oxydes de fer est un phénomène. La durée

d’adsorption du Ni, Zn et Cd varie de 2 h à 42 jours (Brümmer et al., 1988). En effet, il existe

des processus rapides et d’autres plus lents, relevant plus de la diffusion, de la réorganisation

des atomes en surface et dans le réseau du solide.

La réversibilité de l’adsorption spécifique dépend du type de complexe de surface formé ainsi

que de l’ETM adsorbé. S’il s’agit d’un complexe de surface interne, la désorption sera

beaucoup plus difficile (Quirk et Posner, 1975). Dans ce cas, les ETM se sont rapidement

adsorbés en surface puis par un mécanisme de diffusion lente se sont adsorbés sur les sites

internes.

Malgré une force d’adsorption plus élevée que pour les autres ETM, le plomb peut être

complètement désorbé de la goethite (Padmanabham, 1983) alors que la désorption du Cu, Zn,

Cd, Ni et Co suit une courbe d’hystérésis (Padmanabham, 1983; Brümmer et al., 1988;

Barrow et al., 1993).

II.3.2. Mobilité des ETM associés aux oxydes de fer

La dissolution des oxydes de fer dépend de différents paramètres tels que la température du

système, les propriétés acido-basiques et d’oxydo-réduction du milieu ainsi que des propriétés

intrinsèques aux oxydes (Cornell et Schwertmann, 2003).

La dissolution des oxydes de fer se produit selon différents mécanismes que sont la

protonation, la complexation et la réduction.

II.3.2.1. Protonation

Le mécanisme détaillé de la dissolution des oxydes de fer par protonation a été proposé par

Stumm et Furrer (1987). Il s’agit d’une adsorption de protons sur les groupements hydroxyles


55

à la surface des oxydes. L’adsorption du proton affaiblit la liaison Fe-O conduisant à la

libération du fer en solution. L’équation de dissolution par protonation est la suivante :

FeOOH + nH+ → [Fe(OH)(3-n)]aqn+ + (n-1) H2O

II.3.2.2. Complexation

Lors de la dissolution des oxydes par complexation, les ligands organiques s’adsorbent à la

surface de l’oxyde, ce qui affaiblit la liaison Fe-O et provoque la libération du complexe

ligand-Fe(III) en solution (Stumm et Furrer, 1987) :

≡Fe(III)-OH + L- + H+ → ≡Fe(III)-L + H2O → Fe(III)-Laq + H2O

Ainsi, l’oxalate permet de dissoudre la goethite, l’hématite et la ferrihydrite dans une gamme

de pH comprise entre 3 et 5 alors qu’en l’absence du ligand, la dissolution se produit à pH nul

(Stumm et al., 1985)

Les protons facilitent la dissolution des groupements OH par protonation, affaiblissant ainsi la

liaison Fe-O et dans une moindre mesure augmentent la charge négative à la surface de

l’oxyde facilitant l’adsorption du ligand. Si le pH diminue, la protonation des ligands en

solution augmente, ce qui diminue l’adsorption du ligand et donc la formation du complexe

Fe(III)-Laq. Ainsi, le taux de dissolution des oxydes de fer par complexation diminue. Par

conséquent, la désorption par complexation en présence de ligands organiques est maximale à

un pH donné. Par exemple, la dissolution de l’hématite par l’acide citrique est maximale entre

pH 4 et 5 alors que la dissolution de la goethite par l’acide oxalique est maximale à pH 2,6

(Cornell et Schindler, 1987).

II.3.2.3. Réduction

La dissolution des oxydes de fer par réduction est le mécanisme le plus important dans le

milieu naturel. La réduction du Fe(III) en Fe(II) déstabilise la sphère de coordination du fer

par perte de charge et parce que la taille du Fe(II) est plus grande que celle du Fe(III) (0,078

vs 0,064 nm) (Cornell et Schwertmann, 2003). Le Fe(II) est donc libéré en solution.

La dissolution des oxydes de fer par réduction augmente lorsque l’activité des électrons

augmente c’est-à-dire lorsque le potentiel d’oxydo-réduction du milieu diminue. La réduction

peut se faire par des réactifs chimiques réducteurs synthétiques ou naturels tels que le

dithionite ou l’hydroquinone (voir Cornell et Schwertmann (2003) pour une revue complète


56

des différents réducteurs chimiques utilisés) mais également par photochimie et surtout par

voie bactérienne.

La réduction par photochimie est initiée lors de l’apport d’énergie par transfert de charge dans

les groupes Fe(III)-OH de surface. Des ligands, tels que l’oxalate ou le citrate, impliqués dans

la dissolution par complexation peuvent, après avoir été activés photochimiquement, réduire

les oxydes de fer dissous. Un exemple de réduction par photochimie est la formation d’ions

Fe2+ dans les eaux de surface comme étant le résultat d’alternance jour-nuit avec une

augmentation diurne de la concentration en Fe2+ (McKnight et al., 1988).

La réduction biologique des oxydes de fer fait intervenir des microorganismes ferri-réducteurs

vivant en milieu anaérobie (Lovley, 1991). Les oxydes de fer servent d’accepteurs terminaux

dans leur chaîne respiratoire. Tous ces mécanismes ainsi que les principaux microorganismes

impliqués seront détaillés dans le paragraphe III.

II.3.2.4. Comparaison de l’efficacité des mécanismes de

dissolution

Banwart et al. (1989) ont montré qu’à pH 3, le taux de dissolution de l’hématite était plus

important par réduction que par complexation et enfin par protonation (un facteur de 350

entre la réduction et la protonation). De même, le taux de dissolution de la goethite par

réduction microbienne était 400 fois plus important que par protonation.

A pH neutre, la dissolution par protonation était extrêmement lente alors que la réduction en

particulier en présence de ligands complexants était beaucoup plus efficace.

La réduction est donc le mécanisme majeur de dissolution des oxydes de fer et du transport du

fer dans les écosystèmes.

Cependant, la substitution métallique peut avoir une influence sur les mécanismes de

solubilité des oxydes de fer. Ainsi, les effets de substitution sur la dissolution de la goethite

sont plus importants pour des températures comprises entre 20 et 50°C. L’aluminium n’a pas

de conséquence sur la dissolution photochimique de la goethite dans l’oxalate à pH 2,6

(Cornell et Schindler, 1987) alors que l’on observe une diminution de la dissolution de la

goethite et de l’hématite de synthèse substituées en Al dans un mélange réducteur composé de

dithionite/citrate/bicarbonate (Torrent et al., 1987). Le Cr(III) stabilise la goethite et la

préserve d’une dissolution par protonation alors que celle-ci est favorisée lors d’une

substitution par le Mn, Al, Ni et Co (Lim-Nunez et Gilkes, 1987; Schwertmann, 1991)


57

II.3.3. Importance de l’étude des oxydes de fer et des ETM associés

d’un point de vue environnemental

Comme nous venons de le voir, de nombreux ETM sont associés aux oxydes de fer et cela

peut avoir des conséquences sur leur mobilité. La coprécipitation ou l’adsorption des ETM

participent à la dépollution des ETM dans l’environnement. Ainsi un cas de dépollution

naturelle en As par les oxydes de fer a été rencontré dans un récif corallien de

Papouasie Nouvelle-Guinée. En atteignant les eaux de surface aérobies, les fluides

hydrothermaux riches en As et Fe dissous se déchargent de leurs teneurs en As car celui-ci est

quasiment complètement adsorbé et/ou coprécipité sur la ferrihydrite. Le piégeage de

l’arsenic permet donc de préserver le biotope d’une contamination en arsenic (Pichler et

Veizer, 1999). De plus, les oxydes de fer contribuent par des réactions d’oxydo-réduction à la

détoxification des ETM. C’est le cas de la réduction du Cr(VI) en Cr(III), qui a lieu dans les

sols et les sédiments en condition anoxique (Wehrli et al., 1989). Dans ce processus, le Fe(II)

agit comme un donneur d’électrons et entraîne la formation d’un oxyde de fer selon la

réaction :

2 CrO42- + 6 Fe2+ + 4 H2O → 2Cr3+ + 6 FeOOH + 2 H+

Cependant, les oxydes de fer peuvent être à l’origine de pollution métallique en particulier

sous l’action des microorganismes. Ainsi dans les sols ferralitiques de Nouvelle-Calédonie, la

réduction bactérienne du fer entraîne la mobilité du Co et du Ni coprécipités sur les oxydes de

fer et manganèse (Quantin et al., 2001).

L’action des microorganismes va donc avoir un impact très important sur la solubilisation des

métaux ainsi que leur piégeage.

III. Rôle des microorganismes dans la mobilité des ETM

Depuis que la vie est apparue sur Terre, il y a environ 3,5 milliards d’années, les bactéries et

les champignons ont progressivement conquis les enveloppes superficielles (eaux, sédiments,

sols...) et interviennent dans les processus d’altération. Ces micro-organismes obtiennent

l’énergie nécessaire à leur croissance et à leur multiplication dans des réactions

d’oxydoréduction impliquant des substances soit organiques (on parle alors de bactéries et de

champignons chimio-organotrophes), soit minérales (il s’agit alors de bactéries chimio-

lithotrophes). Simultanément, ces micro-organismes produisent et excrètent des métabolites

qui peuvent avoir des propriétés oxydantes, réductrices, alcalines, acides ou complexantes,

tant vis-à-vis des minéraux solides que des éléments libérés en solution. Enfin, que ceci soit


58

ou non justifié par leurs besoins nutritionnels, ils peuvent absorber dans leurs cellules ou fixer

sur leurs constituants cellulaires (par exemple leurs parois) des éléments métalliques et agir

alors comme de véritables pièges à éléments minéraux (Berthelin, 1988; Berthelin et al.,

1995).

L’ensemble de ces phénomènes est résumé dans la figure 6 (d’après Ledin, 2000). Les micro-

organismes liés au soufre et au fer jouent un rôle particulièrement important sur le devenir des

ETM.

Figure 6 : Interactions microorganismes-métaux (d’après Ledin, 2000)

Une mobilisation des ETM par les microorganismes peut être due à une oxydation du soufre

conduisant à une acidification du milieu et donc à une dissolution des ETM par baisse du pH.

La réduction des oxydes de fer entraîne la dissolution des ETM y étant adsorbés.

A l’inverse, l’immobilisation des ETM peut être due à une réduction des sulfates en sulfures

qui se complexent avec les cations métalliques pour précipiter sous forme de sulfures

métalliques. D’autres bactéries, en oxydant le Fe(II) en Fe(III) vont conduire à la formation

d’oxydes de fer sur lesquels les ETM peuvent s’adsorber. Nous détaillerons certains de ces

mécanismes dans la suite de ce chapitre.


59

III.1. Oxydation des sulfures métalliques

L’oxydation biologique des sulfures métalliques est un phénomène largement rapporté dans la

littérature. Elle est rencontrée dans les mines et les sédiments en conditions aérobies et est

réalisée par des microorganismes autotrophes afin d’obtenir l’énergie nécessaire à leur

croissance.

III.1.1. Microorganismes impliqués

Les micro-organismes oxydant les sulfures de métaux les plus fréquemment étudiés (Suzuki,

2001; Baker et Banfield, 2003) sont les suivants :

-Thiobacillus ferrooxidans qui oxyde les composés soufrés réduits en sulfates et les ions Fe(II)

en Fe(III),

- Thiobacillus thiooxidans qui oxyde uniquement les composés soufrés réduits et

- Leptospirilum ferroxidans qui oxyde uniquement les ions Fe(II).

Il s’agit de bactéries de type Gram négatif. Le pH optimal de croissance de ces bactéries et en

particulier de Thiobacillus ferrooxidans est de 2 mais elles sont capables de pousser dans une

gamme de pH plus large et comprise entre 1.5 et 6 (Leduc et Ferroni, 1994).

III.1.2. Mécanismes de lixiviation

Suivant le type de sulfures métalliques, les mécanismes de lixiviation diffèrent. En raison de

la nature de la liaison entre le S et l’atome métallique, les sulfures de métaux seront attaqués

par oxydation ou par protonation (Crundwell, 1988). Les bandes de valence du FeS2, MoS2 et

WS2 étant uniquement issues des liaisons chimiques entre les atomes métalliques, celles-ci ne

contribuent pas à la liaison chimique entre le métal et le soufre dans le cristal. La liaison M-S

est uniquement ionique (Welz et Rosenburg, 1987). Par conséquent, ces sulfures sont

uniquement altérables par oxydation, par exemple par les ions Fe3+. A l’inverse, les sulfures

métalliques, tels que ZnS, PbS, MnS2 ou CuFeS2, ont des bandes de valence auxquelles les

orbitales des métaux et du soufre contribuent. Par conséquent, ces sulfures métalliques sont

acido-solubles (Crundwell, 1988; Schippers et Sand, 1999).

III.1.2.1. Lixiviation des sulfures de métaux acido-solubles

La lixiviation des sulfures de métaux est un processus chimique dans lequel les ions ferriques

et les protons interviennent. Le rôle des micro-organismes est de produire les composés

chimiques et de créer les espaces dans lesquels les réactions de lixiviation peuvent se produire

(Rawlings, 2005).


60

La lixiviation des sulfures de métaux acido-solubles, encore appelée mécanisme polysulfure,

est réalisée par l’intermédiaire de l’attaque combinée des ions ferriques et des protons avec le

soufre élémentaire comme principal composé intermédiaire (figure 7).

MS

M2+ + Sn2-

S8

SO42-

H+

Attaque par acidification

Fe2+

Fe3+

Attaque par oxydation

2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2OTf, Lf MS + Fe3+ + 2H+ M2+ + H2S.+ + Fe2+

0,5H2S + Fe3+ 0,125S8 + Fe2+ + H+

0,125S8 + 1,5O2 + H2O SO42- + 2H+

MS

M2+ + Sn2-

S8

SO42-

H+

Attaque par acidification

Fe2+

Fe3+


Fe2+

Fe3+

Fe2+

Fe3+


2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2OTf, Lf MS + Fe3+ + 2H+ M2+ + H2S.+ + Fe2+MS + Fe3+ + 2H+ M2+ + H2S.+ + Fe2+

0,5H2S + Fe3+ 0,125S8 + Fe2+ + H+0,5H2S + Fe3+ 0,125S8 + Fe2+ + H+

0,125S8 + 1,5O2 + H2O SO42- + 2H+

Figure 7 : Mécanismes de solubilisation des sulfures de métaux acido-solubles par attaque chimique et

microbiologique (Schippers et Sand, 1999)

En milieu acide et oxygéné, Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirilum ferrooxidans

oxydent le Fe(II) en Fe(III) (Schippers et Sand, 1999) selon la réaction suivante :

2 Fe2+ + 2H+ + ½ O2 → 2Fe3+ + H2O

Le Fe(III) produit attaque le sulfure de métal selon la réaction suivante :

MS + Fe3+ + 2H+ → M2+ + H2S.+ + Fe2+

puis par une suite de réactions conduire à la formation de soufre élémentaire (figure 7). Le

soufre élémentaire est relativement stable mais peut être oxydé en sulfate par des bactéries

sulfato-oxydantes telles que Acidithiobacillus thiooxidans ou Acidithiobacillus caldus selon la

réaction :

0,125 S8 + 1,5 O2 + H2O → SO42- + 2H+

L’acide sulfurique produit entraîne alors la solubilisation directe des sulfures de métaux.

Le rôle des micro-organismes dans la solubilisation des sulfures métalliques est donc de

produire de l’acide sulfurique pour une attaque par protonation et de conserver le fer à l’état

ferrique pour une attaque oxydante du minéral.


61

III.1.2.2. Sulfures de métaux acido-insolubles

Les sulfures de métaux acido-insolubles sont attaqués uniquement par voie biologique

(Schippers et Sand, 1999) selon un mécanisme communément appelé mécanisme thiosulfate

(figure 8). Dans ce mécanisme, la solubilisation est réalisée par oxydation des sulfures de

métaux par le fer ferrique produit comme précédemment par les micro-organismes. L’attaque

conduit à la formation de thiosulfate comme produit intermédiaire principal et à la formation

d’acide sulfurique comme produit final. Cependant, contrairement au mécanisme précédent, la

production de H+, ne participe pas à l’attaque chimique des sulfures de métaux pour les

raisons évoquées précédemment.

Fe2+

Fe3+

Tf, Lf

MS

M2+ + S2O32-

SO42- + H+

FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+

S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4

2- + 8Fe2+ + 10H+

2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O

Tf : Thiobacillus ferroxidans

Lf : Leptospirillum ferroxidans

Fe2+

Fe3+

Tf, LfFe2+

Fe3+

Tf, Lf

MS

M2+ + S2O32-

SO42- + H+

FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+

S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4

2- + 8Fe2+ + 10H+

2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O



MS

M2+ + S2O32-

SO42- + H+

FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+

S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4

2- + 8Fe2+ + 10H+S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4

2- + 8Fe2+ + 10H+

2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O



Figure 8 : Mécanisme de dissolution des sulfures de métaux acido-insolubles par attaque chimique et

microbiologique (Schippers et Sand, 1999)

III.1.3. Importance du contact bactérie-minéral dans le phénomène de

biolixiviation

Les bactéries sulfo- et ferro-oxydantes sont présentes en suspension et à la surface des

sulfures. Bien que le contact minéral-bactérie ne soit pas nécessaire à l’oxydation des sulfures

et en particulier de la pyrite, celui-ci accélère de façon très significative le processus

d’oxydation (Dziurla, 1995). Le type de contact entre les bactéries sulfo-oxydantes et les

sulfures de métaux est un contact indirect, les bactéries étant liées aux sulfures de métaux par

des substances polymériques extracellulaires (Dziurla, 1995).

Ohmura et al (1993) ont montré que lors de l’oxydation de la pyrite par A. ferrooxidans, la

bactérie était distribuée en monocouche à la surface du minéral. Une meilleure adhérence du


62

complexe bactérie-substances polymériques extracellulaires est rapportée lorsque la densité

cellulaire est faible. Par ailleurs, d’autres résultats suggèrent que l’interaction entre A.

ferrooxidans et la pyrite serait contrôlée par l’affinité des cellules pour le Fe3+ ou le Fe2+

présents sur la surface du minéral (Dziurla, 1995). Cette affinité pourrait être due à une ou

plusieurs protéines membranaires intervenant dans le mécanisme d’adhésion.

III.1.4. Paramètres influençant la lixiviation des sulfures de métaux

III.1.4.1. Type de micro-organismes

Le type de micro-organismes et leurs relations déterminent le rendement de dissolution des

sulfures de métaux. Ainsi, en ce qui concerne la dissolution de la pyrite, il a été observé que

le consortium Leptospirillum sp, Acidithiobacillus caldus et Ferroplasma sp entraînait une

plus grande dissolution de la pyrite que lorsque Leptospirillum sp était seule ou en présence

de A. caldus (Okibe et Johnson, 2004).

De même, la présence simultanée d’ A. caldus et Sulfobacillus thermosulfidooxidans dissout

99,9 % du Fe de l’arsenopyrite, alors que seulement 36% du Fe est dissous en présence de S.

thermosulfidooxidans (Dopson et Lindström, 1999). Cependant, en présence d’A. caldus, la

quantité de S0 n’augmente pas de façon significative. Selon ces derniers auteurs, l’addition de

A. caldus modifie l’efficacité de lixiviation de l’arsenopyrite selon trois mécanismes :

1) l’oxydation du soufre augmente le taux de lixiviation de l’arsenopyrite en éliminant la

couche de soufre à la surface du minéral, rendant accessible le Fe à l’attaque biologique,

nécessitant un contact entre minéral et bactéries,

2) production de métabolites organiques tels que des cétoacides qui stimulent la croissance

microbienne autotrophe et mixotrophe,

3) production d’agents de surface actifs dans la solubilisation du S0. En effet, il a été

également observé qu’ A. caldus produisait de tels agents de surface favorisant la dissolution

du S0 (Dopson et Lindström, 1999).

III.1.4.2. Paramètres physico-chimiques

En milieu naturel, les variations saisonnières et en particulier la température influencent

significativement la composition de la communauté bactérienne. Ainsi, l’étude des

communautés microbiennes dans des eaux de drainage extrêmement acides d’une mine par

Edwards et al. (1999) a montré qu’au mois de janvier 95 % des bactéries n’étaient pas des

archéobactéries alors qu’en juillet-août 50 % de la population microbienne était composé

d’archéobactéries. Par ailleurs, A. ferrooxidans est la plus abondante lorsque le pH est de 2,5


63

et la température de 20°C alors que l’inverse est observé à pH 0,5. L. ferrooxidans est la plus

abondante lorsque le pH est compris entre 0 et 3 et la température entre 20 et 50°C.

III.1.5. Conséquences de l’oxydation des sulfures sur l’environnement

L’oxydation des sulfures peut avoir un impact négatif pour l’environnement. En effet, les

activités minières intensives représentent un danger potentiel pour le milieu naturel. Comme

nous venons de le décrire, l’activité de ces bactéries entraîne une acidification du milieu. En

fonction de la composition des minerais et en particulier des ETM qui les composent, ceux-ci

vont se retrouver en fortes concentrations dans les eaux de surface et souterraines.

Cependant cette capacité de lixiviation peut être utilisée à des fins de dépollution. En effet,

cette capacité a été appliquée dans le domaine environnemental et en particulier dans la

remédiation des sites miniers, le traitement des déchets industriels, la dépollution des boues de

station d’épuration et pour la bioremédiation des sols et sédiments contaminés en ETM

(Bosecker, 2001).

Dans ces configurations, les conditions de lixiviation (croissance des microorganismes

notamment) sont optimisées de manière à prévenir tout risque de contamination du milieu

environnant. Récupération des métaux dissous par lixiviation et remédiation des sites pollués

sont alors réalisées simultanément (Bosecker, 1997).

Dans le cas des résidus minéraux industriels (cendres d’incinération, cendres volantes…), la

plupart des méthodes conventionnelles de bioremédiation peuvent échouer car les ETM sont

généralement présents sous forme d’oxydes plutôt que de sulfures. Or, ces oxydes de métaux

peuvent être détruits par l’acide sulfurique produit par T. thiooxidans. Si, dans la plupart des

cas, un traitement chimique par attaque acide s’avère beaucoup plus facile, l’utilisation de

telles bactéries présente l’avantage d’un coût économique moindre et d’une source continuelle

d’acide sulfurique. Par ailleurs, durant la production d’acide par T. thiooxidans, le pH diminue

graduellement. Ainsi, les métaux passent en solution à différentes vitesses en fonction de leur

solubilité, ce qui permet de les séparer (Brombacher et al., 1998).

Les boues de station d’épuration ont longtemps été épandues sur les terres cultivées comme

engrais. Or ces boues contiennent de fortes teneurs en métaux. L’utilisation de bactéries sulfo-

oxydantes du genre Thiobacillus entraîne l’acidification des boues à pH 2. Cette diminution

de pH a permis de solubiliser les métaux et de rendre leurs teneurs compatibles avec les

normes recommandées appliquées en agriculture (Blais et al., 1992).

De la même manière, les sédiments de dragage des cours d’eau qui peuvent être épandus

contiennent des quantités non négligeables de métaux. Or l’aération de ces sédiments entraîne


64

leur acidification et donc la mobilité des métaux. Des techniques de remédiation consistent à

accélérer la lixiviation naturelle en activant les Thiobacillus naturellement présents dans les

sédiments. Ainsi il a été possible de solubiliser en deux jours, en réacteurs, entre 47 et 80 %

de Cu, 81-89 % de Mn et 42-60% de Ni (Couillard et Chartier, 1991).

Concernant la remédiation des sols pollués, des souches de T. ferrooxidans ont permis

d’extraire en totalité le Cd, Co, Cu et Ni et en présence de T.thiooxidans plus de 80% de Cd,

Co, Cu et Zn ont été extraits (Gomez et Bosecker, 1999).

Ainsi la lixiviation des ETM par les microorganismes autotrophes peut être utilisée dans un

but environnemental et participer à la dépollution des matrices solides contaminées en ETM.

III.2. Réduction des oxydes de Fe (III)

Le fer joue un rôle vital chez tous les organismes vivants et en particulier au niveau de leur

métabolisme cellulaire. En effet, le fer intervient dans le transport, le stockage et l’activation

de l’oxygène moléculaire, la réduction des ribonucléotides et le diazote, l’activation et la

décomposition des péroxydes et le transport d’électrons via une grande variété de

transporteurs d’électrons (Pierre et al., 2002).

En milieu aérobie, ainsi que nous l’avons décrit précédemment, certaines bactéries sont

capables d’oxyder le fer(II) pour tirer leur énergie. En milieu anaérobie, le fer est un élément

important dans la respiration des microorganismes qui l’utilisent comme accepteur terminal

d’électrons dans leur chaîne respiratoire à la place de l’oxygène (Luu et Ramsay, 2003).

Cette propriété du fer à être utilisé soit comme accepteur soit comme source d’électrons

provient de la valeur du potentiel d’oxydo-réduction du couple Fe2+/Fe3+ (+700mV).

Cependant, le fer est un élément dont la solubilité est très faible et par conséquent peu

disponible. C’est pourquoi, les mécanismes de mobilisation du fer par les microorganismes

ont été particulièrement étudiés tant d’un point de vue métabolique qu’au niveau des

conséquences biogéochimiques et en particulier de la genèse des sols (Cornell et

Schwertmann, 2003).

La réduction bactérienne des oxydes de fer est un mécanisme fréquemment rencontré dans les

sols et sédiments en conditions anaérobies.

Dans la majorité des cas, il s’agit d’une réduction enzymatique dissimilatrice du Fe(III). Les

bactéries ferri-réductrices utilisent le Fe(III) comme accepteur terminal d’électron dans leur


65

chaîne respiratoire en milieu anaérobie à la place de l’oxygène (Lovley, 1991). Le Fe(III) est

donc réduit en Fe(II). La réduction dissimilatrice, où de grandes quantités de Fe(II)

s’accumulent à l’extérieur des bactéries, se différencie de la réduction assimilatrice au cours

de laquelle de faibles quantités de Fe(II) sont produites et assimilées par les bactéries.

III.2.1. Réduction du fer et fermentation

Les premiers microorganismes ayant été décrits pour leur capacité à réduire le Fe(III)

possédaient un métabolisme de type fermentaire (figure 9). Il s’agissait de souches de

Clostridium sporogenes et de Paenibacillus polymyxa cultivées sur un milieu contenant du

glucose comme source de carbone (Starkey et Halvorson, 1927; Roberts, 1947).

Cependant, lors de ce processus, le fer n’est pas un accepteur majoritaire d’électrons. En effet,

moins de 5% d’équivalents réducteurs sont transférés vers le fer (Lovley, 1991 ; Bousserrhine

et al., 1999a). Le fer apparaît donc être un puits minoritaire d’électrons pour le métabolisme

fermentaire. Chez Paenibacillus polymyxa, la plupart des équivalents d’électrons, initialement

présents dans le glucose, se retrouve dans l’éthanol, le 2,3-butylène glycol, les acides lactique

et formique (Roberts, 1947).

Les calculs thermodynamiques montrent que la stratégie métabolique d’utiliser le Fe(III),

même en étant un puits mineur d’électrons, peut fournir aux bactéries fermentatrices une

énergie plus importante que la fermentation seule (Lovley, 1991).

Figure 9 : Réduction dissimilatrice des oxydes de fer et fermentation (Lovley, 1991)


66

Par ailleurs, la réduction des oxydes de Fe(III) peut s’avérer plus efficace en présence d’un

consortium de micro-organismes. Ainsi, la réduction d’oxyde de Fe(III) faiblement cristallisé

et en présence de glucose, nécessite la présence simultanée d’Escherichia coli et de

Geobacter metallireducens (GS-15). En effet, la présence d’E. coli seule, entraîne la

fermentation du glucose mais ne réduit pas le Fe(III) car E. coli ne possède pas les enzymes

spécifiques. Si G. metallireducens est seulement présente, celle-ci ne pourra pas métaboliser

le glucose. Aussi, est-il nécessaire qu’E.coli métabolise le glucose en éthanol pour que celui-

ci soit utilisé par G. metallireducens pour réduire le Fe(III). Cette réduction du Fe(III) en Fe(II)

est réalisée par contact direct entre G. metallireducens et l’oxyde de Fe(III) car l’enzyme

responsable de la réduction est située sur la membrane de la bactérie (Lovley, 1991)

D’autres bactéries comme Clostridium butyricum utilisent aussi le mécanisme de fermentation

pour réduire les oxydes de Fe(III) en Fe(II) (tableau 10). Les produits majoritaires de

fermentation obtenus sont alors de l’acétate, le butyrate, le dioxyde de carbone et de

l’hydrogène. Ces bactéries du genre Clostridium ont été décrites dans des sols hydromorphes

en milieu anaérobie (Munch et Ottow, 1983; Bousserrhine, 1995; Bousserrhine et al., 1999a,

1999b; Dominik et al., 2002).

Tableau 10 : Exemples de microorganismes fermenteurs et réduisant le fer(III) en présence de différentes

sources de carbone donneuses d’électrons (Bousserrhine, 1995)

Microorganismes Donneurs d’électrons Formes de fer Aerobacter sp glucose Oxyhydroxyde de fer ferrique

amorphe (OHFA) Bacillus cereus Glucose-asparatine Hématite Bacillus circulans Sucrose

Glucose-asparatine OHFA hématite

Bacillus polymyxa Glucose Glucose Sucrose

OHFA Hématite OHFA

Bacillus subtilis glucose Hématite Bacteroides hypermegas Glucose-tryptone Chlorure ferrique Clostridium butyricum glucose Hématite Clostridium sporogenes Glucose, peptone OHFA Echerichia coli Glucose, peptone,

Glucose-asparagine OHFA hématite

Pseudomonas aeruginosa Glucose-asparagine hématite Vibrio sp Glucose Chlorure ferrique

III.2.2. Réduction couplée à l’oxydation des acides organiques et

composés organiques aromatiques


67

Bien que peu de microorganismes capables de tirer leur énergie de produits de fermentation

avec réduction du Fe(III) aient été isolés, ceux-ci sont probablement largement répandus dans

l’environnement (Lovley, 1991). Les bactéries oxydant l’acide acétique et réduisant le fer ont

été identifiées dans de nombreux types de sédiments (Lovley et Phillips, 1986). Ainsi, la

bactérie GS-15 a été décrite comme étant capable d’oxyder totalement l’acide acétique en

dioxyde de carbone en réduisant simultanément le Fe(III) en Fe(II) selon l’équation (Lovley et

Phillips, 1988) :

Acetate- + 8Fe(III) + 4H2O→ 2HCO3- + 8Fe(II) + 9H+

D’autres bactéries, telle que Shewanella putrefaciens sont également capables d’oxyder

l’acide formique en dioxyde de carbone avec réduction du fer(III) (Lovley et Phillips, 1989) :

Formate- + 2Fe(III) + H2O → HCO3- + 2Fe(II) + 2H+

Cependant cette bactérie oxyde de façon incomplète le lactate et le pyruvate tout en réduisant

le Fe(III) :

Lactate- + 4Fe(III) + 2H2O → acetate- + HCO3- + 4Fe(II) + 5H+

Pyruvate- + 2Fe(III) + 2H2O → acetate- + HCO3- + 2Fe(II) + 3H+

Outre les acides organiques, les composés aromatiques sont également oxydés par les

bactéries (Lovley, 1991). Ceci d’autant plus que ces molécules composent majoritairement la

matière organique naturelle, notamment dans les sédiments et contribuent à la pollution

anthropique (cas du toluène et du phénol).

Certaines bactéries sont donc capables d’oxyder ces composés aromatiques en réduisant le

Fe(III). Ainsi la bactérie GS-15 peut complètement oxyder le benzoate, le toluène, le phénol

et le p-crésol en dioxyde de carbone en réduisant simultanément le Fe(III) (Lovley et

Lonergan, 1990). Ce type de bactéries pourrait donc être utilisé pour la dépollution de

composés organiques en milieu anaérobie, par exemple.

III.2.3. Réduction du fer et oxydation du soufre

La réduction du fer par les bactéries utilisant le soufre élémentaire comme donneur d’électron

a été décrite par Brock et Gustafson (1976) chez les bactéries Thiobacillus thiooxidans,

Thiobacillus ferrooxidans et Sulfolobus acidocaldarius selon la réaction :


68

S° + 6Fe(III) + 4H2O → HSO4- + 6Fe(II) + 7H+

Seule T. ferrooxidans peut tirer son énergie de cette oxydation du sulfure avec réduction du

Fe(III). Ces bactéries sont rencontrées en milieu aérobie mais ne nécessitent pas la présence

de matières organiques puisque ce sont des bactéries chimiolithotrophes.

III.2.4. Réduction du fer et oxydation de l’hydrogène

Les microorganismes vivant dans les sédiments peuvent coupler l’oxydation de l’hydrogène à

la réduction du fer. Par exemple, des souches du genre Pseudomonas (Balashova et Zavarzin,

1980) et de l’espèce Shewanella putrefaciens (Lovley et Phillips, 1989) sont capables

d’oxyder l’hydrogène avec le fer(III) comme unique accepteur d’électrons selon la réaction :

H2 + 2Fe(III) → 2H+ + 2Fe(II)

En milieu acide, Acidophilum cryptum utilise l’hydrogène pour réduire les oxydes de Fe(III)

amorphes contenus dans les sédiments lacustres (pH 3,2).

III.2.5. Importance du contact entre bactéries et oxydes de fer lors de la

réduction

Les oxydes de fer étant pratiquement insolubles dans l’eau à pH neutre, un contact direct entre

bactéries et oxydes de fer est nécessaire. Des études ont montré que la réduction des oxydes

de fer par les produits du métabolisme des bactéries ferri-réductrices était quasiment nulle.

Les produits exocellulaires ne contribuent donc pas à la réduction des oxydes de fer de façon

significative (Munch et Ottow, 1983; Rajot, 1992).

Cependant dans certaines conditions, notamment lorsque les oxydes de fer sont peu

accessibles et en milieu aérobie, la réduction du Fe(III) peut s’effectuer après complexation

avec les acides humiques et les sidérophores (Lovley et al., 1998, Hersman et al, 1995).

Les acides humiques jouent le rôle d’intermédiaires lors des transferts d’électrons entre les

mécanismes réducteurs de Fe(III) et les oxydes de Fe(III) insolubles (Lovley et al., 1998). Le

relargage du Fe(III) par les acides humiques est un mécanisme abiotique (figure 10).


69

e -

Fe(III)

Acétate

CO2

Fe2+

Acides humiquesoxydés

Acides humiquesréduits

Bactérie

e -

Fe(III)

Acétate

CO2

Fe2+

Acides humiquesoxydés

Acides humiquesréduits

Bactérie

Figure 10 : Réduction du Fe(III) via les acides humiques

Les sidérophores ont un rôle différent. Produits en condition nutritionnelle déficitaire en fer,

ce sont des molécules de faibles poids moléculaires utilisées comme chélatants du Fe et

sécrétées par les bactéries et les champignons lorsque la cinétique de dissolution du fer est

lente, notamment en milieu neutre ou basique et aérobie. Environ 500 sidérophores sont

connus. Les ligands sont hexadentates mais aussi tridentates. La stabilité du complexe Fe-

sidérophore est exceptionnelle avec une constante de stabilité supérieure à 1030 (Hersman et

al., 1995; Neilands, 1995; Kalinowski et al., 2000; Boukhalfa et Crumbliss, 2002; Kraemer,

2004)

Après production et relargage du sidérophore par les bactéries, celui-ci se lie à l’oxyde de

Fe(III) pour former un complexe sidérophore-Fe(III) qui diffuse ensuite à travers la

membrane bactérienne (figure 11).


70

OO

OO

OOORelargage du

sidérophore

BactérieEx : Pseudomonas

Oxyde de Fe(III)

Reconnaissance du Fe(III)

par le sidérophore

Fe

O

OO

O

OO

Formation du complexesidérophore-Fe

Diffusion du complexeà travers la membrane cellulaire

En milieu aérobie

OO

OO

OOORelargage du

sidérophore

OO

OO

OOO

OO

OO

OOORelargage du

sidérophore

BactérieEx : Pseudomonas

Oxyde de Fe(III)

Reconnaissance du Fe(III)

par le sidérophore

Fe

O

OO

O

OO

Formation du complexesidérophore-FeFe

O

OO

O

OOFe

O

OO

O

OO

Formation du complexesidérophore-Fe



En milieu aérobie

Figure 11 : Mécanisme de réduction des oxydes de Fe(III) via les sidérophores

Lorsque le complexe Fe(III)-sidérophore se trouve à l’intérieur de la bactérie, le fer est réduit

en Fe(II)-sidérophore puis il y a séparation du Fe2+ et du sidérophore. Ce dernier est soit

détruit soit recyclé et est expulsé hors de la cellule.

III.2.6. Facteurs influençant la réduction des oxydes de Fe(III)

L’importance de la réduction enzymatique des oxydes de fer (III) dépend de nombreux

paramètres intrinsèques aux oxydes de fer.

III.2.6.1. Le type et la surface des oxydes de Fe(III)

Les oxydes amorphes ou faiblement cristallisés sont plus facilement réductibles (Hansel et al.,

2004). Ainsi le rendement de réduction du Fe(III) par Shewanella putrefaciens est de 25%

pour la ferrihydrite, 4,6% pour la goethite et 1,4 % pour l’hématite. Ceci tient au fait que les

formes amorphes sont thermodynamiquement moins stables que les formes cristallisées.

Par ailleurs, plus la surface de l’oxyde est importante et plus la réduction du Fe(III) le sera

également (Bousserrhine, 1995; Roden et Zachara, 1996; Dominik et al., 2002). Les

pourcentages de réduction du Fe(III) par Shewanella alga en fonction de la surface de la

goethite sont présentés dans le tableau 11.


71

Tableau 11 : Pourcentage de fer réduit par les bactéries ferri-réductrices en fonction de la surface de

goethite (d’après Roden et Zachara (1996))

Surface (m2.g-1) Pourcentage de Fe(III) réduit 153,3 12,6±0,3 55,2 2,7±0,1 31 1,5±0,2

III.2.6.2. Les paramètres physico-chimiques

La présence d’oxygène est un facteur inhibiteur de la réduction de la goethite ainsi que l’a

montré (Bousserrhine, 1995) lors de ses études portant sur les paramètres influençant la

réduction des oxydes de fer par Clostridium butyricum.

La température est également un facteur important car la réduction des oxydes de Fe(III) ne

sera optimale que dans une gamme de température donnée (Jones et al., 1984). Ceci est dû au

fait que la température accélère le métabolisme carboné et donc la vitesse de production des

électrons utilisés pour la réduction. Par exemple, l’oxydation du malate avec réduction du

Fe(III) (1 mmol.l-1) par Vibrio ne sera optimale qu’entre 10-15 °C et 35 °C (figure 12).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

10 15 20 25 30 35 40

Température (°C)

Fe2+

(µm

ol.L

-1)

Figure 12 : Concentration de Fe réduit par Vibrio en fonction de la température (d’après Jones et al, 1984)

La nature du substrat carboné joue un rôle non négligeable sur le rendement de la réduction

des oxydes de Fe(III). Vibrio est capable de réduire le Fe(III) en utilisant du malate et du

glucose mais n’utilisera pas le lactate (Jones et al., 1984). De même, le rendement de

réduction des oxydes de Fe(III) par A. cryptum sera de 93 % avec de l’hydrogène comme

donneur d’électrons et seulement de 21 % avec de la cellobiose (Bousserrhine, 1995). Par

ailleurs, A. cryptum n’oxydera pas le lactate, le formate, le pyruvate, l’acétate ou le benzoate

pour réduire le Fe(III).


72

Enfin, selon la composition du milieu de culture, la réduction dissimilatrice sera différente. La

réduction de la goethite par C. butyricum sera deux fois plus faible dans un milieu riche en

nutriments que dans un milieu eau distillée + glucose à cause de la présence du carbonate de

calcium qui tamponne le milieu (Bousserrhine, 1995). Cette modification du pH modifie le

métabolisme carboné et par conséquent, la production d’électrons produits.

III.2.6.3. La présence de métaux substitués

Dans le milieu naturel, les oxydes de Fe sont associés à d’autres éléments traces métalliques.

Ces ETM exercent une influence sur le rendement de réduction des oxydes de Fe(III)

adsorbés ou en substitution.

Ainsi, plus une goethite sera substituée en aluminium et plus le rendement de réduction sera

faible (Dominik et al., 2002). En effet, l’aluminium bloque l’accès aux sites, en précipitant à

la surface des oxydes de fer. Or, ces sites sont nécessaires à Clostridium butyricum pour

réduire le Fe(III) en Fe (II) (tableau 12). Tableau 12 : Pourcentage de réduction du Fe(III) en fonction du pourcentage de substitution de l’Al sur

une goethite par Clostridium butyricum (Dominik et al, 2002)

Pourcentage de substitution Pourcentage de réduction du Fe(III) 0 >90 5 45 33 15

D’autres auteurs ont montré qu’un hydroxyde de Fe présentant des substitutions en Ni

conduira à une inhibition de la réduction du Fe(III) par Shewanella putrefaciens par un

mécanisme chimique non défini (Fredrickson et al., 2001; Zachara et al., 2001).

Dans le même cadre, des études menées par Bousserrhine et al ont montré que la nature de

l’élément en substitution influençait le rendement de la réductibilité bactérienne des oxydes

de fer (Bousserrhine, 1995; Bousserrhine et al., 1999a, 1999b) (tableau 13).

Tableau 13 : Pourcentage de fer et d’ETM solubilisé par Clostridium butyricum en fonction de l’ETM de

substitution sur une goethite (Bousserrhine et al, 1999a)

ETM substitué (5%) Pourcentage de fer solubilisé Pourcentage d’ETM solubilisé Co > 90 Mn > 90 Cr 60 8 Al 36 18


73

III.2.7. Conséquences de la réduction des oxydes de Fe sur la mobilité

des ETM dans les sols

Dans la nature, de nombreux ETM sont adsorbés ou substitués dans les oxydes de fer. La

réduction des oxydes de fer par les microorganismes peut donc conduire à un relargage des

ETM adsorbés dans l’eau interstitielle des sédiments et des sols en milieu anaérobie (Lovley

et Coates, 1997; Ponthieu et al., 2006). Cette désorption entraîne donc un risque potentiel

pour l’écosystème aquatique. Ainsi que nous venons de le voir précédemment, des ETM

coprécipités sur une goethite artificielle ont été désorbés lors de la réduction du Fe(III) par

Clostridium sp. (Francis et Dodge, 1990; Bousserrhine et al., 1999a, 1999b). Dans des sols en

milieu anaérobie, la réduction de goethite riche en Ni en Co par Shewanella putrefaciens

provoque la dissolution de ces ETM (Zachara et al., 2001). Dans des sols ferralitiques

hydromorphes, l’activité des bactéries ferri-réductrices autochtones a entraîné la mobilité du

cobalt et du cuivre (Quantin et al., 2001).

Bien que les microorganismes soient à l’origine de la mobilisation des ETM dans les sols,

d’autres microorganismes pourront entraîner leur immobilisation dans certaines conditions

physico-chimiques. C’est pourquoi il est nécessaire de s’intéresser à ces phénomènes dans

cette revue bibliographique car de telles conditions physico-chimiques peuvent se manifester

dans les sédiments et permettre de comprendre la mobilité et la redistribution des ETM. Par

ailleurs, l’immobilisation des ETM par les microorganismes peut constituer un bon outil de

dépollution des eaux de surface et souterraine.

III.3. Immobilisation des éléments traces métalliques par les

microorganismes

Les microorganismes peuvent être à l’origine d’une immobilisation des ETM par des

mécanismes de biosorption et par la réduction des sulfures.

III.3.1. La biosorption

La biosorption est la rétention des éléments métalliques organiques et inorganiques solubles

ou insolubles à la surface des cellules bactériennes par des mécanismes physico-chimiques

tels que l’adsorption (Gadd, 2001). La biosorption peut conduire à la formation de minéraux

stables par nucléation ou à une accumulation à l’intérieur des microorganismes par divers

systèmes de transports internes (assimilation active).


74

III.3.1.1. Adsorption à la surface des cellules microbiennes

L’accumulation passive ou adsorption des métaux traces à la surface des cellules bactériennes

dépend des propriétés de surface des cellules telles que les charges électriques et l’orientation

des groupes fonctionnels liant le métal ainsi que de la spéciation du métal en phase aqueuse

(Ledin, 2000). Les groupes fonctionnels ayant le plus de pouvoir ligand sont les groupes

carboxyliques, aminés et phosphorylés. L’accumulation dépend également de l’âge des

cellules et si celles-ci sont vivantes ou mortes. Ainsi, des cellules d’un jour de Thiotrix

accumulent beaucoup moins de Ni ou Zn que les mêmes cellules âgées de 2-5 jours

(Shuttleworth et Unz, 1993). La capacité de biosorption des cellules mortes peut être

supérieure, égale ou inférieure à celle de cellules vivantes (Ledin, 2000).

Par ailleurs, les paramètres physico-chimiques environnementaux ont une influence sur la

rétention des métaux traces par les cellules bactériennes. Ainsi, lorsque le pH du milieu

augmente, les sites fonctionnels à la surface des cellules se déprotonent ce qui rend possible

leur liaison avec les cations métalliques. A des pH plus élevés, les métaux ont tendance à se

désorber car les microorganismes produisent des métabolites solubles qui pourront se lier aux

métaux et ainsi entrer en concurrence avec les sites fonctionnels de surface cellulaire. De plus,

à pH élevé, des complexes métalliques anioniques ou neutres se forment et par conséquent ont

moins d’affinité pour les sites de surface que les cations libres (Ledin, 2000). L’influence des

conditions d’oxydo-réduction sur la rétention des métaux traces à la surface des bactéries a été

très peu étudiée. Cependant, il a été montré que l’état d’oxydation du Fe influence de façon

significative sa tendance à se lier aux polymères bactériens anioniques tels que les capsules

(McLean et al., 1992).

III.3.1.2. Formation de minéraux

Les sites d’adsorption des métaux traces à la surface de la paroi cellulaire bactérienne peuvent

servir de site de nucléation pour la formation de minéraux. Ainsi, chez Bacillus subtilis, le

développement de phases minérales silicates a été observé à la surface de la bactérie et a servi

d’interface pour la sorption des métaux (Beveridge et Murray, 1980). Des minéraux de fer

peuvent également être formés par les microorganismes (Konhauser et al., 1993). Les liaisons

Fe-bactéries servent en effet de sites de nucléation pour la formation et la croissance de

phases minérales présentant un large spectre de morphologie allant de structures amorphes

telles que des gels aux structures cristallisées en fonction du degré d’hydratation. Les métaux

liés aux oxyhydroxydes et silicates formés sur les parois bactériennes sont très difficiles à


75

désorber et résistent aux attaques à l’EDTA et autres ligands organiques (Urrutia et Beveridge,

1993, 1995)

III.3.2. Précipitation par réduction du soufre et des composés soufrés

oxydés

Nous avons vu précédemment qu’en milieu anaérobie, les bactéries ferri-réductrices étaient à

l’origine de la réduction des oxydes de fer. Le fer(II) solubilisé peut repréciter en raison de

l’activité des bactéries sulfato-réductrices présentes dans le milieu.

III.3.2.1. Bactéries sulfato-réductrices

La réduction du soufre et des composés soufrés oxydés fait intervenir des bactéries anaérobies

sulfato-réductrices (figure 13).

La réduction des sulfates et autres formes oxydées du soufre peut s’effectuer de deux

manières :

- la réduction assimilatrice qui produit des ions sulfures, nécessaires aux synthèses

cellulaires et

- la réduction dissimilatrice dans laquelle le composé soufré oxydé sert uniquement

d’accepteur terminal d’électron dans la production d’ATP en anaérobiose. Le sulfure

d’hydrogène dégagé correspond au produit terminal de la respiration des sulfates.

Bactéries réductrices du

soufre :

DesulforomonasDesulfovibrioPyrodictiumArchaebacteria…

SO42- SO3

2-

SO2, HSO3-

S° S2O32-

HS-, S2-

Bactéries sulfato-réductrices

DesulfovibrioDesulfobulbusDesulfobacterDesulfococcusDesulfosarcinaDesulfonema

DesulfoarculusDesulfotomaculumArchaebacteria…

Enzyme : sulfite réductase

dissimilatrice

Bactéries réductrices du

soufre :

DesulforomonasDesulfovibrioPyrodictiumArchaebacteria…

SO42- SO3

2-

SO2, HSO3-

S° S2O32-

HS-, S2-

Bactéries sulfato-réductrices

DesulfovibrioDesulfobulbusDesulfobacterDesulfococcusDesulfosarcinaDesulfonema

DesulfoarculusDesulfotomaculumArchaebacteria…

Enzyme : sulfite réductase

dissimilatrice

Figure 13 : Populations bactériennes impliquées dans la réduction du soufre et ses formes oxydées

(d’après Boust et al, 1999)


76

III.3.2.2. Conséquence sur l’immobilisation des ETM

Les sulfures produits sont connus pour être des phases d’adsorption pour les ETM (Boust et

al., 1999). Les sulfures de fer apparaissent lorsque leur produit de solubilité est atteint c’est-à-

dire lorsque les concentrations en sulfures dissous (HS-) issus de l’activité des bactéries

sulfato-réductrices et celles en fer dissous ne sont plus compatibles avec le maintien de ces

espèces à l’état dissous. Le fer réduit en solution provient de la réduction des oxydes de fer

par les bactéries ferri-réductrices.

Le monosulfure de fer (FeS ou greigite) précipite sous forme d’enduits mal cristallisés et très

dispersés qui peuvent ensuite évolués vers des formes plus résistantes et mieux cristallisées de

type pyrite (FeS2). Les sulfures ainsi formés peuvent conduire à l’apparition de sulfures

polymétalliques par substitution des sulfures de métaux moins solubles que le sulfure hôte. Le

cadmium peut ainsi s’échanger avec le fer déjà précipité sous forme de sulfures :

FeS(s) → Fe2+ + S2-

Cd2+ + FeS(s) → Cd2+ + Fe2+ + S2-

Cd2+ + FeS(s) → CdS(s) + Fe2+

De la même façon, le cuivre dont le sulfure est plus insoluble que celui du cadmium peut par

substitution conduire à l’apparition de sulfure de cuivre :

Cu2+ + CdS(s) → CuS(s) + Cd2+

Il a été montré en laboratoire (Boust et al., 1999) qu’après trois jours d’incubation de

sédiments en milieu anoxique, de fortes proportions de cobalt, zinc, cadmium, manganèse et

antimoine étaient associés aux sulfures.

IV. Méthodes d’évaluation de la biodisponibilité, mobilité, et

spéciation des ETM dans les sédiments

Afin d’évaluer le devenir des ETM dans les sols et sédiments, diverses méthodes d’extraction

chimique ont été mises en place. L’extraction chimique est la mise en solution aqueuse d’une

fraction d’un ou de plusieurs éléments présents dans la phase solide du sol. Deux types de

méthodes sont utilisés : l’extraction simple et l’extraction séquentielle (Lebourg et al., 1996).

Les méthodes d’extraction permettent de déterminer l’extractibilité, la biodisponibilité, la

mobilité et la spéciation des ETM. L’extractibilité est la capacité des ETM à passer en


77

solution et dépend de la solution extractante (nature et concentration), des conditions

opératoires (rapport sol/solution, durée et mode d’agitation,…) mais aussi de la matrice

étudiée et de l’état de l’élément dans le sol (Lebourg et al., 1996). Dans le cas des sols, la

biodisponibilité est la potentialité d’un ETM à être absorbé par une plante. La mobilité est

définie par la capacité d’un élément à migrer d’un point à un autre, à passer d’une forme

chimique à une autre ou à changer de phase (passage de la phase solide à la phase liquide)

(Juste, 1988). Ainsi, on distingue une fraction dite mobile (à court terme) et une seconde

fraction dite mobilisable (à long terme). La spéciation est la caractérisation de la répartition

d’un élément dans les différents compartiments du sol ou de l’état chimique dans lequel il se

trouve dans ces différents compartiments (ionique, complexé…).

IV.1. Les extractions simples

Quatre types de solution d’extraction sont utilisés pour les extractions simples : les acides

dilués, les complexants organiques, les solutions salines et l’eau déionisée (Beckett, 1989).

Les quantités totales d’ETM sont estimées en utilisant des acides forts concentrés.

L’évaluation de la fraction disponible peut être réalisée à l’aide d’acides dilués comme l’acide

acétique (0,1 mol.l-1), chlorhydrique (0,1 mol.l-1) ou un mélange d’acides. Cependant,

l’utilisation des acides dilués est trop agressive et peu discriminante vis-à-vis des différentes

formes sous lesquelles se trouvent les ETM. Les complexants organiques sont utilisés pour

quantifier les ETM échangeables, ceux complexés par la matière organique ainsi que ceux

fixés sur les hydroxydes du sol (hydroxydes de Fe, de Mn et d’Al). L’EDTA (Acide éthylène

diaminotétraacétique) et le DTPA (acide diéthylène triaminepentaacétique) sont les réactifs

les plus utilisés pour évaluer la biodisponibilité du Cd, Zn, Ni, Cu et Pb (Shuman, 1988). Le

DTPA possède un pouvoir d’extraction plus faible que celui de l’EDTA mais plus fort que

celui des solutions salines.

L’eau déionisée a été utilisée pour simuler la mobilité des ETM dans les conditions naturelles

par l’eau du sol. L’extraction du Cd, Cu, Zn, Pb et Ni par l’eau déionisée est sensée donner

une bonne évaluation des risques de transfert de ces ETM dans les sols pollués (Lebourg et al.,

1996). Cependant cette technique présente de nombreux problèmes analytiques tels que de

faibles concentrations dissoutes, ce qui nécessite le recours à des appareils de mesures ayant

de très faibles limites de détection. De plus, l’extraction à l’eau ne permet pas une bonne

floculation de la suspension, ce qui perturbe le dosage. L’extraction à l’eau est donc plus

adaptée dans le cas de matrices fortement polluées. Les extractions par des solutions salines


78

regroupent les solutions de sels divers : CaCl2, NaNO3, NH4NO3, etc. La concentration de ces

sels varie généralement de 0,01 à 1 mol.l-1. La solubilisation se fait essentiellement par

échange cationique. Cependant, les effets d’une contamination en Pb, Cr et Ni sont rarement

évalués avec les solutions salines. La variabilité des conditions expérimentales ne permet pas

de définir clairement les domaines d’application des trois réactifs les plus couramment utilisés

et cités précédemment.

De plus, tous ces tests sont réalisés sur des durées très courtes avec une très petite quantité

d’échantillons. Il est donc difficile d’extrapoler les résultats sur des durées très longues.

IV.2. Les extractions séquentielles

Les méthodes d’extraction séquentielle ont été développées afin de déterminer la répartition

géochimique des ETM dans les sols et les sédiments en fonction des propriétés oxydantes,

réductrices, acido-solubles et échangeables des différentes phases. Les différentes fractions

sur lesquelles se trouvent les ETM, leurs mécanismes d’immobilisation dans les différents

minéraux du sédiment ainsi que les facteurs entraînant leur relargage sont résumés dans le

tableau 14 (d’après Pickering, 1986). Tableau 14 : Facteurs à l’origine de la mobilité des métaux traces dans les différents minéraux du

sédiment (d’après Pickering, 1986)

Phase des sédiments fixant les ETM

Mécanismes d’immobilisation Facteurs de relargage

Minéraux primaires Réseau cristallin - Métaux liés en position inerte

Destruction complète du réseau

Carbonates Physiquement sorbés Coprécipitation

Diminution du pH Modification de la pression de CO2

Matières organiques (substances humiques, résidus organiques)

Physiquement sorbés, complexes métalliques, chimiquement sorbés (échanges de H+ dans les groupements –COOH, -OH)

Dépend du pH Destruction du groupe organique

Hydroxydes et oxydes de Fe et Mn

Hydroxydes de métaux co-précipités Sorption physique Sorption chimique (échange d’H+)

Dissolution partielle dans l’acide ; Réduction du fer et du manganèse Photochimie

Sulfures Co-précipitation Oxydation du soufre Acides fulviques et organiques Sels métalliques solubles Variation de pH

Destruction de la matière organique

C’est pourquoi ces méthodes sont basées sur l’utilisation successive de réactifs ayant des

propriétés chimiques différentes afin de dissoudre successivement les diverses phases

minérales et organiques du sédiment et de libérer les ETM associés. Différentes fractions ont

ainsi été définies en fonction de leurs propriétés physico-chimiques : échangeable, acido-

soluble, réductible, oxydable et résiduelle.


79

La fraction échangeable représente l’ensemble des ETM facilement désorbés par un sel neutre

entraînant une modification de la composition du milieu. Les sels fréquemment employés sont

l’acétate d’ammonium, de sodium et le chlorure de magnésium. En général, la fraction

échangeable est faible dans les sols et les sédiments. La fraction acido-soluble correspond aux

ETM liés aux carbonates et est donc sensible aux variations de pH. L’accès aux ETM liés à

cette fraction est réalisé en utilisant un tampon acétate d’ammonium/acide acétique à pH 5.

La fraction réductible correspond aux ETM liés aux oxydes de fer et de manganèse,

thermodynamiquement instables en conditions réductrices. Ces oxydes peuvent être détruits

en partie en modifiant les conditions de pH et de potentiel d’oxydo-réduction du milieu. Ainsi

le réactif le plus couramment employé est le chlorhydrate d’hydroxylamine en milieu acide

(NH2OH, HCl). La fraction oxydable représente les ETM liés aux matières organiques

(micro-organismes vivants, matières organiques dégradées…) et sulfures. Le peroxyde

d’hydrogène (H2O2), oxydant très fort, est généralement utilisé pour quantifier les ETM liés à

cette fraction. Enfin la fraction résiduelle inclut tous les ETM ayant résisté aux étapes

d’extraction précédente. Elle est constituée des ETM piégés dans la matrice cristalline

argileuse et dans les minéraux à réseau cristallin stable. Par conséquent, les ETM se trouvant

dans cette fraction ont une faible réactivité et sont difficilement relargués dans les conditions

rencontrées dans le milieu naturel. En général, les ETM de la fraction résiduelle sont

quantifiés par fusion alcaline ou à l’aide d’un mélange d’acides forts, tels que l’acide

fluorhydrique, nitrique et chlorhydrique.

Les différents schémas d’extraction séquentielle généralement utilisés dans la littérature sont

présentés dans le tableau 15.


80

Tableau 15 : Procédures d’extraction séquentielle généralement employées dans la littérature

(Tessier et al., 1979) (Kersten et Förstner, 1986) (Hirner et al., 1990) B K O Q XY

Echangeable Carbonates Oxydes de Fe/Mn Organique Résiduelle

D K M V Q Z

Echangeable Carbonates Oxydes de Mn Oxydes de Fe amorphes Sulfures + organiques Résiduelle

A D G H L X LYZ

Solubles à l’eau Echangeables Organique (échangeable avec solvants) Organique (acides humiques et fulviques) Minérale facilement soluble Minérale difficilement soluble Organique insoluble

(Sposito et al., 1982) (Shuman et Hargrove, 1985) (Zeien et Brümmer, 1989) E I R Z

Echangeable Composés sorbés Organique Carbonates et sulfures

F J N T U LXZ

Echangeable Organique Oxydes de Mn Oxydes de Fe amorphes Oxydes de Fe cristallisés Résiduelle

C D N S T U XYZ

Echangeable et facilement soluble Carbonates Oxydes de Mn Organique Oxydes de Fe amorphes Oxydes de Fe cristallisés Résiduelle

(Ure et al, 1993) – Méthode BCR P M Q (sans HNO3)

Echangeable/Carbonates Oxyhydroxydes de Fe/Mn Sulfures+organiques

A : eau, B : MgCl2, C : NH4NO3, D : NH4OAc, E : KNO3, F: Mg(NO3)2, G : benzène/méthanol, H: benzène/méthanol/KOH, I : NaOH, J : NaOCl, K : NaOAc/HOAc, L : HCl, M : NH2OH. HCl/ HNO3, N: NH2OH.HCl+NH4OAc, O : NH2OH.HCl/HOAc, Q : H2O2/HNO3/NH4OAc R : EDTA, S : NH4-EDTA, T: (NH4)2C2O4, U: acide ascorbique/tampon oxalate, V: tampon oxalate, X : HF, Y : HClO4, Z : HNO3, P : CH3COOH

La diversité des méthodes d’extraction séquentielle tant au niveau de la définition des

différentes fractions que de la nature des réactifs employés reflète la complexité de la

répartition des ETM dans les sols et sédiments et montre également que ces différentes

méthodes ont toujours été source de controverses. En effet, de nombreux reproches ont été

faits à l’encontre de ces méthodes notamment au niveau de leur sélectivité et des phénomènes

de réadsorption des ions métalliques sur le sédiment au fur et à mesure des étapes d’extraction

(Pickering, 1986; Hirner, 1992; Xiao-Quan et Bin, 1993; Bermond, 2001; Billon et al., 2001;

Li et al., 2001). De plus, les résultats obtenus entre les différentes méthodes utilisées sont

difficilement comparables. C’est pourquoi une méthode d’harmonisation au niveau européen

(méthode BCR) a été proposée pour permettre de réaliser des comparaisons dans la

distribution des ETM entre les sédiments et sols étudiés (Ure et al., 1993). Cette méthode

d’extraction ne comporte que 3 étapes caractérisant les ETM liés aux fractions

échangeable/acido-soluble, réductible et oxydable. Cependant cette méthode d’extraction a

également été améliorée et modifiée à de nombreuses reprises car elle présente également des

problèmes de reproductibilité et de réadsorption (Quevauviller et al., 1993; Mossop et

Davidson, 2003; Fernández et al., 2004; Bacon et al., 2005; Ciceri et al., 2008).


81

Quelques exemples de résultats obtenus par extraction séquentielle réalisée avec la méthode

classique de Tessier (1979) sont présentés dans le tableau 16. Les sédiments étudiés

proviennent de rivières du Canada, de Turquie, d’Inde et de Lettonie. Tableau 16 : Exemple de répartition des ETM et éléments majeurs dans différents de sédiments (%) par

la méthode d’extraction séquentielle de Tessier

Echangeable Carbonatée Réductible Oxydable Résiduelle Cu 1-5 11-21 6-40 10-31 25-44 Cd 5-40 18-30 5-22 3-28 20-27 Pb 1-40 5-15 10-30 2-23 42-43 Zn 0-5 10-13 25-30 4-20 45-57 Co 1-7 2-12 13-42 21-29 21-45 Cr 1 1 53 18 25 Fe <1 0.05-2 12-23 2-20 56-83 Mn 0.5-13 12-13 14-52 1-5 28-57 Ni 1-4 4-12 11-30 5-30 41-64

D’après Tessier et al., 1979; Klavins et al., 2000; Akcay et al., 2003; Jain, 2004

De plus, l’échantillonnage, le stockage et la préparation des sédiments avant l’extraction

séquentielle requièrent de nombreuses précautions. En effet, le broyage et le séchage peuvent

modifier la répartition des ETM sur les différentes phases porteuses, en particulier pour les

échantillons en anaérobie (Herr et Gray, 1997; Stephens et al., 2001). Par exemple, le passage

en milieu aérobie lors du prélèvement peut entraîner une oxydation des sulfures en sulfates,

sous-estimant la fraction oxydable.

Une étude a comparé différentes méthodes de stockage de sols couramment utilisées :

humidification, séchage puis ré-humidification, conservation au frais (4°C pendant 15 jours)

et congélation (-20°C pendant 15 jours) (Perez et al., 2004). Les résultats ont montré une

modification importante de la répartition des ETM, en particulier lorsque les échantillons de

sol sont séchés puis réhumidifiés. Seuls les échantillons gardés au frais à 4°C pendant 15 jours

ont donné des résultats similaires à ceux obtenus immédiatement après prélèvement.

Une des méthodes employées lorsque des études de spéciation sont réalisées sur des carottes

de sédiment est la congélation. Or, l’analyse des ETM par extraction séquentielle de carottes

de sédiments congelées a montré que ce type de stockage ne préservait pas la répartition des

métaux dans les différentes phases du sédiment (Hjorth, 2004). Les zones anaérobies sont les

plus sensibles à la congélation, en particulier les métaux liés aux sulfures. De plus, le fer

associé aux carbonates montre une certaine tendance à s’oxyder durant le processus de

congélation. Afin de contrer l’effet de l’oxygène sur la modification de la répartition des ETM

dans les sédiments anoxiques lors de leurs prélèvements, une méthode de prélèvement inerte a

été proposée (Einax et Nischwitz, 2001). Elle consiste à transférer immédiatement les


82

sédiments dans un récipient contenant de l’argon. Cette méthode semble efficace et montre

que les conditions anoxiques doivent être préservées pour éviter de modifier la répartition du

Cd, Zn, Pb, Mn et Fe mais qu’elle ne semble pas utile pour le Co, Ni, Cu et Cr car ces

éléments sont généralement situés sur des phases non sensibles à l’oxygène.

Après avoir rappelé l’origine des ETM dans les hydrosystèmes et en particulier dans le bassin

de la Seine, nous avons focalisé notre analyse sur les interactions liquide/solide qui contrôlent,

pour une large part, à la fois le transit des ETM dans l’hydrosystème et la biodisponibilité des

contaminants.

Au sein des sédiments, différentes fractions sont potentiellement actives, car susceptibles de

transformations majeures au cours des processus diagénétiques. Il s’agit des oxydes de fer et

de manganèse, des sulfures et de la matière organique. Les oxydes de fer et de manganèse

sont solubilisés en conditions réductrices et formés en conditions oxydantes, alors que les

sulfures sont solubilisés en conditions oxydantes et formés en conditions réductrices. La

matière organique est la source d’énergie pour la réduction dans les processus diagénétiques.

De nombreux auteurs se sont ainsi intéressés à la mise au point de méthodes d’extractions

chimiques destinées à évaluer les quantités d’ETM associées à ces différentes fractions.

Cependant, aucune méthode n’est spécifique d’une fraction. Les différentes combinaisons

d’extractants mettent en œuvre des mécanismes de solubilisation (échange d’ions,

acidification, réduction, oxydation,…) plus ou moins intenses. De plus, il est aussi difficile,

par exemple, de distinguer matières organiques et sulfures car ces deux fractions sont

solubilisées par voie oxydative alors que leurs devenirs sont complètement différents dans

l’environnement. Une des principales questions reste donc la représentativité

environnementale de ces méthodes. En effet, comme nous l’avons largement discuté dans

cette analyse bibliographique, les mécanismes de la mobilisation ou fixation des ETM sur

différentes fractions sont essentiellement d’origine microbiologique. Aussi la question

suivante demeure-elle relativement irrésolue : l’action des populations de microorganismes

réputées solubiliser telle ou telle fraction solubilise-t-elle effectivement d’une part, la fraction

telle que les méthodes d’extraction séquentielle l’identifie et d’autre part, solubilise-t-elle les

ETM associés ? Sur la base de cette question générale, nous nous intéresserons dans la suite à

la solubilisation des oxydes ferriques dans des sédiments du bassin de la Seine.

Partie 2 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone

83

Partie 2 : Mobilité des éléments traces métalliques et activité

microbienne autochtone : importance des bactéries ferri-

réductrices

Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone

84

Chapitre 1 : Interactions éléments traces métalliques et activité

microbienne autochtone


Introduction

85

I. Introduction

Les éléments traces métalliques sont répartis dans les sols et sédiments au sein des différentes

fractions minérales et organiques. Cette répartition dépend des conditions physico-chimiques

du milieu telles que les conditions d’oxydo-réduction et de pH. En fonction de ces conditions

environnementales, les ETM sont soit libérés soit immobilisés. Par exemple, une acidification

du milieu entraîne la dissolution des carbonates conduisant à une mobilité des ETM y étant

fixés. Dans des conditions réductrices, les sulfates transformés en sulfures s’associent aux

ETM pour former des sulfures métalliques qui précipitent.

Or, ces modifications des conditions d’oxydo-réduction et de pH sont principalement liées à

l’activité microbienne autochtone. Dans les sols, de nombreuses études ont montré qu’en

milieu anaérobie, les bactéries ferri-réductrices étaient à l’origine de la mobilisation des ETM

lors de la réduction dissimilatrice des oxydes de fer (phase porteuse d’ETM), qu’elles utilisent

comme accepteur terminal d’électrons dans leur métabolisme énergétique. En milieu aérobie,

des bactéries oxydant les sulfures sont à l’origine d’une très forte acidification du milieu

entraînant une mobilité importante des ETM.

Si la mobilité des ETM due à l’activité microbienne autochtone a été largement étudiée dans

les sols, peu d’études se sont intéressées aux interactions ETM-activité microbienne

autochtone dans les sédiments. Il est cependant essentiel de comprendre ces phénomènes de

relargage des ETM dans les sédiments qui peuvent avoir un impact environnemental

important notamment en termes de contamination métallique des nappes phréatiques et des

milieux aquatiques de surface. Cette connaissance est également indispensable pour la gestion

des sédiments. Dans le cas particulier de la gestion des sédiments de dragage, il est important

de connaître les conditions dans lesquelles les ETM seront susceptibles d’être relargués de

façon à stocker ces sédiments de manière raisonnée.

L’objectif de ce 1er chapitre est donc d’étudier par une approche générale la mobilité des ETM

dans des sédiments de Marne et de Seine et de mettre en relation cette mobilité avec l’activité

des microorganismes autochtones.


Matériel et méthodes

86

II. Matériel et méthodes

II.1. Sites d’étude et description des lieux de prélèvement

Les sédiments étudiés sont issus de la Marne et de la Seine et plus précisément de Méry-sur-

Marne et d’Andrésy (figure 14). Les études de pollution en ETM dans le bassin versant

supérieur de la Seine ont montré une évolution marquée de l’impact anthropique de l’amont

vers l’aval (Meybeck et al., 2004). En amont de Paris, la pollution métallique est beaucoup

plus faible qu’en aval. L’augmentation en concentrations métalliques au fur et à mesure que la

Seine traverse Paris est due aux rejets urbains de temps de pluie dans la Seine et aux affluents

contaminés péri-urbains, aux rejets du réseau unitaire et industriels. En aval de Paris, les

indices de contamination sont beaucoup plus complexes, notamment autour de la confluence

avec l’Oise. Cette complexité provient d’un mélange de masses d’eau à la confluence mais

également des rejets de la station d’épuration de Seine-Aval (Achères). Par conséquent, on

peut s’attendre à avoir des teneurs en ETM plus fortes à Andrésy qu’à Méry-sur-Marne. Nous

avons donc choisi deux sédiments contaminés différemment en ETM de façon à vérifier si les

mécanismes de mobilité de métaux et les activités microbiennes étaient similaires ou non

selon le type de sédiments (très anthropisés à Andrésy et beaucoup moins à Méry).

Andrésy

Méry-sur-Marne

Andrésy

Méry-sur-Marne

Figure 14 : Carte du bassin versant de la Seine en amont et en aval de l’agglomération parisienne

Sur les deux sites, les prélèvements ont été effectués à l’amont du barrage-écluse comme

indiqué sur les figures 15 et 16.



87

Site de prélèvementSite de prélèvement

(a)

Ecluse et barrage

Point de prélèvement

Ecluse et barrageEcluse et barrage

Point de prélèvementPoint de prélèvement

(b) Figure 15 : Carte du site de Méry-sur-Marne (a) et détails du lieu de prélèvement (b)



88

Stationd’épuration

Seine-Aval(Achères)

Site de prélèvement

Confluence de la Seineet de l’Oise

Stationd’épuration

Seine-Aval(Achères)

Site de prélèvement

Confluence de la Seineet de l’Oise

(a)


Barrage

Ecluse


Barrage

Ecluse

(b)

Figure 16 : Carte du site d’Andrésy (a) et détails du lieu de prélèvement (b)



89

II.2. Matériel utilisé et stockage des échantillons

Au cours des campagnes d’échantillonnage, réalisées en novembre 2005 et mai 2006, les

sédiments ont été prélevés à l’aide d’une benne Eckman. L’utilisation de ce type de benne

permet d’échantillonner presque tous les types de sédiments et de récolter les sédiments

jusqu’à 30 cm de profondeur. Par ailleurs, il assure une bonne protection contre le risque de

lessivage s’il n’est pas remonté trop rapidement. Cependant, ce type de benne peut perturber

l’intégrité du sédiment lors du prélèvement et une contamination possible en éléments

métalliques en fonction du matériau de la benne. C’est pourquoi nous avons choisi une benne

en acier inoxydable, minimisant les risques de corrosion.

Les sédiments collectés ont été conservés sous une couche d’eau du site dans des flacons en

plastique (préalablement rincés à l’acide nitrique ultrapur dilué (65%, Normapur)), afin de

préserver les conditions anaérobies, caractéristiques du sédiment.

Pour toutes les expériences d’incubation menées, les sédiments n’ont été ni séchés ni broyés.

En effet, le séchage et le broyage peuvent d’une part influer sur la population microbienne

autochtone et d’autre part modifier l’état d’oxydation et la spéciation des métaux présents ou

de leurs phases porteuses (Herr et Gray, 1997; Stephens et al., 2001). Cependant, comme nous

le verrons par la suite, ce choix technique a généré des problèmes d’hétérogénéité des sous-

échantillons.

II.2.1. Dispositif expérimental

Les incubations de sédiments ont été conduites en batch (figure 17). Il s’agit d’un système en

milieu clos dans lequel l’incubation débute avec une quantité connue de substrat que les

microorganismes vont utiliser en continu pour leur croissance. Des flacons sérum de 250 ml

contenant 150 ml de milieu de culture ont été stérilisés par autoclave. Les incubations

commencent lors de l’introduction de 20 g de sédiments humides. Les poids secs des

sédiments de Marne et de Seine ont été déterminés par ailleurs. Les sédiments de la Marne et

de la Seine contiennent respectivement en moyenne 50 % et 30 % d’humidité. Tous les

résultats analytiques ont été ramenés en masse sèche pour les calculs.

Le rapport masse de sédiments/volume de solution = 10 environ a été choisi car il s’agit du

rapport qui est utilisé dans les tests de lixiviation (Paschke et al., 1999; Cappuyns et al., 2004;



90

Cappuyns et Swennen, 2005) destinés à estimer la quantité de métaux biodisponibles dans les

sols et sédiments. Toutes les manipulations ont été réalisées sous hotte à flux laminaire afin de

ne pas contaminer en microorganismes les sédiments et les flacons.

Figure 17 : Incubation en batch des sédiments

Les conditions anaérobies ont été créées dans les cultures par un dégazage sous flux d’azote.

Les flacons ont ensuite été placés à l’obscurité dans une étuve à 28 ± 2°C pendant 10 jours au

minimum et 1 mois au maximum et sans agitation. Nous avons choisi de ne pas agiter les

flacons afin de récréer les conditions naturelles de l’interface eau-sédiment en milieu calme et

donc caractéristiques d’un milieu anaérobie. En effet, l’agitation en milieu naturel conduit à

une réoxygénation de l’interface eau-sédiment et par conséquent au passage d’un milieu

anaérobie à un milieu aérobie. Ceci entraîne donc des modifications très importantes aux

niveaux chimique et biologique comme la réoxydation des sulfures et donc une acidification

du milieu avec la formation d’acide sulfurique et le développement de bactéries aérobie

strictes (s et al., 1998; Brune et al., 2000; Caille et al., 2003; Eggleton et Thomas, 2004;

Shipley et al., 2004; Cappuyns et Swennen, 2005).

Afin, d’une part, de stimuler la croissance bactérienne pour accélérer les processus microbiens

et d’autre part, d’apprécier l’impact de l’intensité de l’activité microbienne sur les vitesses de

réaction de solubilisation des métaux, trois milieux de culture contenant des concentrations

croissantes en glucose ont été testés :



91

- milieu 1 : eau distillée + 0,15 g.l-1 de levure + 0,05 % de glucose



L’extrait de levure (Difco Laboratories) est utilisé comme source d’azote alors que le glucose

est une source de carbone.

Par ailleurs, les sédiments de la Marne et de la Seine ont été incubés et étudiés en triplicat

pour chaque milieu de culture. Chaque semaine, des triplicats de flacons ont été sacrifiés afin

de réaliser les analyses chimiques et biologiques sur les sédiments.

Afin de contrôler toute éventuelle contamination en ETM des microcosmes, des blancs ont été

réalisés dans les mêmes conditions mais sans ajout de sédiments.

II.2.2. Caractérisation physico-chimique des sédiments

Les sédiments ont été caractérisés avant incubation à l’INRA d’Arras (tableau 17) :

Tableau 17 : Paramètres physico-chimiques analysés pour la caractérisation des sédiments

Paramètres Méthode Physique Granulométrie NF X 31-107 Argile (< 2 µm) Limons fins (2/20 µm) Limons grossiers (20/50 µm) Sable fin (50/200 µm) Sable grossier (200/2000 µm) Chimique pH de l’eau NF ISO 10390 Carbone organique (g.kg-1) C/N Matière organique (g.kg-1)

NF ISO 10694 NF ISO 13878

Capacité d’échange cationique (cmol+.kg-1)

NF X 31-130

Pour l’analyse granulométrique, la détermination des fractions les plus fines (< 50 µm)

s'effectue au moyen de 3 prélèvements successifs (à la pipette dite de Robinson) dans une

suspension de sol en cours de sédimentation. La fraction des sables fins est séparée par

passage sur tamis de 50 µm et sous courant d'eau de la suspension après prélèvements des

fractions fines. Prélèvements et tamisage sont réalisés après destruction de la matière

organique par l'eau oxygénée (H2O2) sur une prise d'essai d'environ 10 g. La dispersion finale

est réalisée par un court passage aux ultrasons après addition de dispersant [(NaPO3)6 +

Na2CO3] et après avoir au préalable séparé les sables grossiers (> 0,200 mm) par tamisage.



92

L’analyse du pH est réalisée après mise en suspension de l'échantillon du sédiment séché à

l'air dans l'eau dans un rapport 1/5 (v/v).

La méthode de l’analyse du carbone organique repose sur la transformation en dioxyde de

carbone de la totalité du carbone présent dans l'échantillon. La réaction s'effectue en portant

ce dernier à environ 1000°C en présence d'oxygène. Après séparation chromatographique, la

quantité de gaz carbonique formée est quantifiée au moyen d'un catharomètre (conductibilité

thermique). La teneur en azote (organique et minéral) de l'échantillon est déterminée en le

chauffant à environ 1000°C en présence d'oxygène. Les produits de combustion ou

décomposition sont réduits à l'état d'azote moléculaire (N2). Les quantités de N2 formées sont

quantifiées, après séparation chromatographique, au moyen d'un catharomètre.

Enfin, la CEC a été déterminée selon la méthode de Metson qui comprend trois étapes.

L'échantillon est d'abord saturé en ions ammonium (NH4+ ) par percolations successives d'une

solution d'acétate d'ammonium (CH3CO2NH4) à 1 mol.l-1. Le pouvoir tampon de cette

dernière permet de ramener le pH du milieu aux environs de 7, ce qui constitue une des

caractéristiques essentielles de la méthode. Après avoir éliminé l'excès d'ions ammonium par

percolations d'alcool éthylique, on procède ensuite à leur échange par une solution de chlorure

de sodium à 1 mol.l-1. Les ions ammonium déplacés sont dosés par spectrocolorimétrie sur la

solution précédente, une fois filtrée.

II.2.3. Suivi du métabolisme microbien

L’activité des microorganismes a été suivie pendant toute la durée des incubations.

Tout d’abord, la croissance bactérienne a été étudiée en dosant le CO2 produit et en

dénombrant les bactéries anaérobies au cours de l’incubation.

Parallèlement la consommation du glucose et la production d’acides organiques ont été

suivies afin de caractériser les processus fermentaires des microorganismes autochtones. Le

carbone organique dissous ainsi que la variation du pH ont également été analysés.

II.2.3.1. Activité globale et minéralisation du carbone

Le CO2 produit par les microorganismes anaérobies a été suivi régulièrement au cours de

l’incubation par prélèvement d’1 ml de l’atmosphère des microcosmes à l’aide de seringues

stériles (TERUMO) équipées d’aiguilles stériles à travers les septums hermétiques des flacons

sérum, préalablement nettoyés à l’éthanol pour éviter toute contamination. Les flacons n’ont

donc pas été ouverts. La teneur en CO2 a été déterminée par spectrométrie infra-rouge



93

(BERYL 100 COSMA). Les caractéristiques analytiques de l’appareil et des mesures ainsi

que la procédure d’étalonnage sont regroupées en annexe 1.

II.2.3.2. Evolution de la densité des microorganismes anaérobies

dans les microcosmes au cours de l’’incubation

Chaque semaine, des suspensions-mères de sédiments ont été préparées à partir de chaque

microcosme sacrifié (2g de sédiment humide dans un 10 ml d’eau physiologique (NaCl,

10 g.l-1) puis une série de dilution a été réalisée à partir de ces suspensions-mères. L’eau

physiologique est utilisée afin de ne pas créer un déséquilibre osmotique entre la

concentration en minéraux dans les cellules microbiennes et la solution de culture. Le

déséquilibre pourrait, en effet, créer une augmentation de la pression osmotique des cellules

microbiennes et les faire éclater. 1 ml de chaque dilution est ensemencé en profondeur dans

un milieu de culture coulé en boîte de Pétri. Le milieu de culture est un milieu PCA (Plate

Count Agar) contenant les composants suivants : hydrolysat pancréatique de caséine 5 g.l-1,

extrait de levure 2,5 g.l-1, glucose 1 g.l-1, agar 15 g.l-1. L’incubation des boîtes de Pétri est

réalisée à 30°C, en condition anaérobie. Pour réaliser l’anaérobiose, les boîtes de Pétri sont

placées dans une jarre avec un sachet GENbox anaer permettant d’obtenir une concentration

en O2 < 0,1% après 2,5 h et une concentration en CO2 > 16% après 24 h. Les colonies sont

dénombrées après 48 h puis 72 h puis le nombre de colonies est rapporté en unité CFU par

gramme de sédiments secs. Il est à noter que seul 1 % de la totalité des bactéries présentes

dans le milieu est cultivable.

II.2.3.3. Dosage du glucose

Le glucose a été dosé par réaction enzymatique (Kit D-Glucose, Roche) dont le principe est le

suivant :

En présence de l’enzyme hexokinase et d’ATP, le D-glucose est phosphorylé en D-glucose-6-

phosphate (G-6-P) avec formation simultanée d’ADP. En présence de l’enzyme glucose-6-

phosphate déshydrogénase (G-P-DH), le G-6-P est oxydé par le NADP en D-gluconate-6-

phosphate avec formation de NADPH.

La quantité de NADPH formée dans la réaction est proportionnelle à la quantité de D-glucose

présente dans l’échantillon. L’absorbance est mesurée en spectrophotométrie UV à une

longueur d’onde de 340 nm. Les caractéristiques analytiques de la mesure sont données en

annexe 2.



94

II.2.3.4. Dosage des acides organiques

La recherche d’acides organiques produits par les microorganismes a été réalisée par

chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur 1 ml de milieu de culture (les

échantillons sont conservés par congélation avant analyse). Ce dosage a pour objectif la mise

en évidence d’un métabolisme fermentaire souvent mis en place par les microorganismes en

conditions anaérobies.

Les acides formique, pyruvique, lactique, acétique, succinique, propionique et butyrique ont

été analysés. Après optimisation de la méthode de séparation en se basant sur la méthode

employée par Tormo et Izco (2004). Les acides ont été séparés sur une colonne en phase

inverse (Atlantis T3 5 µm, 4,6*250 mm) selon les conditions suivantes données en annexe 3.

II.2.3.5. Dosage du carbone organique dissous

Le carbone organique dissous a été dosé suivant le protocole du laboratoire du CEREVE.

Tout le matériel utilisé est préalablement grillé à 500°C afin d’éliminer toute trace de carbone

organique. A 38 ml d’échantillon filtré sous vide, 2 ml d’acide orthophosphorique concentré

(85 % Normapur, analytical reagent) sont ajoutés afin de stopper toute activité biologique.

L’échantillon est ensuite conservé en chambre froide à 4 °C jusqu’à analyse.

L’analyse du COD se fait de façon indirecte, par mesure du CO2 libéré après une oxydation

chimique du carbone organique présent dans l’échantillon par ajout de persulfate de sodium à

chaud (90°C). Le CO2 produit est ensuite analysé par spectrométrie infra-rouge (1010 OI-

ANALYTICAL). La masse de CO2 résultante est proportionnelle à la masse de COD dans

l’échantillon. Un exemple de gamme est donné en annexe 4.

II.2.3.6. Suivi du pH

Afin de suivre l’évolution de l’acidité du milieu, le pH a été mesuré régulièrement à l’aide

d’une électrode combinée (Metrohm) au cours de l’incubation dans 20 ml de solution prélevée

à l’aide d’aiguilles et de seringues stériles et après filtration de la solution à travers un filtre en

acétate de cellulose (0,45 µm de diamètre de pore). L’électrode est calibrée avant chaque

analyse à l’aide de solutions tampons à pH 7 et 4 (pH cal, Schott Geräte)



95

II.2.3.7. Détermination du carbone minéralisé

Le carbone inorganique produit au cours de l’incubation a été déterminé à partir de la

concentration en CO2 mesurée dans l’atmosphère du flacon et du pH mesuré en solution à

partir de la théorie thermodynamique. Les réactions, qui se produisent, lorsque le dioxyde de

carbone est dissous dans l’eau, peuvent être représentées par les équilibres suivants :

CO2(g) ⇔ CO2(aq) (1)

CO2(aq) + H2O ⇔ H2CO3 (2)

H2CO3 ⇔ H+ + HCO3- (3)

HCO3- ⇔ H+ + CO3

2- (4)

Cependant, il est difficile de distinguer par des moyens analytiques CO2(aq) et H2CO3. C’est

pourquoi l’on préfère confondre les deux espèces et exprimer leurs concentrations comme la

concentration probable de l’espèce CO2* (Lewis et Randall, 1961).

Les réactions 1, 2 et 3 sont donc redéfinies en espèces probables selon les équations-bilans

suivantes :

CO2(g) ⇔ CO2*

(aq) (5)

CO2*

(aq) ⇔ H+ + HCO3- (6)

Les relations d’équilibre entre les concentrations des différentes espèces peuvent alors s’écrire

comme suit :

K0 = [CO2*] / PCO2 (7)

K1 = ([H+].[HCO3-]) / [CO2

*] (8)

K2 = ([H+].[ CO32-]) / [HCO3

-] (9)

avec K0 = 2.99.106 Pa.mol-1.l pour le CO2 à 25°C, K1 = 10-6.3 et K2 = 10-10.3 à 25°C. Etant

données les valeurs de pH mesurées au cours de l’incubation, nous ne tiendrons compte que

des équations 7 et 8 pour calculer le CO2 dissous total.

II.3. Mobilité des éléments traces métalliques

Les éléments métalliques totaux, dissous ainsi que dans les différentes fractions du sédiment

ont été suivis au cours de l’incubation.



96

L’analyse des éléments métalliques a été réalisée par spectroscopie d’émission atomique et de

masse couplée à un plasma à couplage inductif (ICP-AES et ICP-MS).Des précisions sur les

performances des deux méthodes sont données en annexe 5.

II.3.1. Principe des techniques de spectroscopie utilisées

II.3.1.1. ICP-AES

L’ICP-AES est une méthode d’analyse spectroscopique basée sur l’utilisation d’un plasma

d’argon. Il s’agit d’un mélange gazeux conducteur contenant des concentrations relativement

élevées d’ions argon et d’électrons qui constituent les espèces conductrices. Le plasma

d’argon atteint des températures comprises entre 6000 et 8000 K. A ces températures, les

éléments sont excités. Cet état excité n’étant pas stable, les éléments se désexcitent en

émettant des photons dont la longueur d’onde est caractéristique de chacun des éléments

analysés.

Les avantages de l’ICP-AES sont que les limites de détection sont très faibles, de l’ordre du

µg.l-1, et que tous les éléments sont mesurés simultanément. De plus, la torche à plasma étant

axiale dans l’appareil utilisé, elle permet d’effectuer les mesures sur toute la longueur de la

flamme, conduisant ainsi à une sensibilité maximale.

II.3.1.2. ICP-MS

La spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif est une technique reposant sur la

séparation, l’identification et la quantification des éléments contenus dans un échantillon en

fonction de leur masse. Elle est basée sur une torche à plasma générant des ions, comme en

ICP-AES. A la différence de cette dernière technique, les ions sont séparés par spectromètre

de masse quadripolaire en fonction de leur masse et de leur charge. L’ICP-MS présente une

excellente sensibilité permettant de détecter des éléments présents au niveau du ppt et de

nombreux éléments en trace au niveau du ppb.

II.3.2. Analyse des éléments métalliques totaux

L’analyse des métaux traces et majeurs totaux a été réalisée suivant le protocole de

minéralisation de Bettinelli et al. (2000).



97

250 mg d’échantillon humide sont pesés précisément dans les bombes de minéralisation et 2

ml d’HF (40 %, Normatom), 2 ml d’HNO3 (65 %, Normatom) et 6 ml d’HCl (30 %,

Normatom) sont ajoutés. Le mélange est laissé au repos toute la nuit.

Puis la minéralisation par micro-ondes (MLS 1200, Milestone) a lieu selon les conditions

suivantes (tableau 18) :

Tableau 18 : Conditions de minéralisation des sédiments

Etape 1 2 3 4 5 Puissance (W) 250 400 600 0 300 Durée (min) 8 4 6 2 3

Après refroidissement, 2 ml d’acide borique saturé sont ajoutés pour précipiter les ions

fluorures. Les bombes sont ensuite fermées puis placées dans le four micro-ondes et chauffées

à nouveau pendant 3 min à 300 W.

Les liqueurs obtenues sont transvasées dans des fioles de 50 ml et complétées à 50 ml avec de

l’eau MilliQ avant d’être analysées.

II.3.3. Analyse des ETM dissous

Des aliquotes de milieu de culture (20 ml) sont prélevés régulièrement au cours de

l’incubation. Après filtration immédiate sur filtre en acétate de cellulose (0.45 µm de diamètre

de pores), préalablement rincés à l’acide nitrique (2% Normapur) puis à l’eau ultrapure

(MilliQ, Millipore) et acidification, les échantillons sont analysés.

Les éléments traces dont les concentrations étaient fréquemment inférieures à la limite de

détection de l’ICP-AES, le Cd, Co, Cr, Cu, Ni, Pb et Zn ont donc été analysés en ICP-MS

équipé d’une cellule à collision pour réduire les interférences isobariques (Xseries CCT,

Thermo Electron). Les courbes de calibration ont été obtenues en analysant les solutions (2, 5,

10, 20 µg.l-1) préparées à partir de la solution multi-élémentaire PlasmaCal 4 (100 mg.l-1, SCP

Science). Rh, In et Re ont été utilisés comme standards internes aux concentrations

respectives de 10, 1 et 1 µg.l-1 à partir d’une solution mono-élémentaire (1000 mg.l-1, SCP

Science).

De plus, le fer(II) a été analysé par colorimétrie immédiatement après échantillonnage. 1 mL

d’échantillon est addition à 1 mL de phénantroline (0,5 %). Après agitation, le mélange doit

reposer pendant 30 min à température ambiante avant lecture au spectrophotomètre à 490 nm.

La coloration rouge développée est très stable. La concentration en Fe(II) est obtenue à partir



98

d’une gamme étalon réalisée dans les mêmes conditions avec une solution de chlorure de fer

(annexe 6).

II.3.4. Répartition des éléments métalliques dans les différentes

fractions du sédiment

Les éléments métalliques sont répartis sur les différents minéraux constituant les sédiments

tels que les carbonates, les oxydes de fer et manganèse, les silicates ainsi que sur les matières

organiques. Les conditions physico-chimiques du milieu et en particulier le pH et les

conditions redox sont à l’origine de cette répartition. Des modifications de ces conditions,

notamment sous l’influence des microorganismes en milieu anaérobie peuvent entraîner une

dissolution des carbonates par acidification, une réduction des oxydes de fer et manganèse et

la précipitation des métaux sous forme de sulfures insolubles en conditions fortement

réductrices. C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés à la répartition des éléments

métalliques au sein du sédiment avant et après incubation.

De nombreux protocoles d’extractions séquentielles ont été proposés, la plupart basée sur

celui de Tessier (1979). Bien que ces extractions soient toujours soumises à de nombreuses

controverses (notamment à cause des phénomènes de réadsorption, par exemple), nous avons

néanmoins décidé d’employer un protocole d’extraction. De plus, la plupart des protocoles ne

permettent pas de distinguer les métaux liés aux sulfures de ceux liés à la matière organique.

Or, sulfures et MO font partie des "phases" actives, c'est à dire très évolutives dans les

processus biogéochimiques et diagénétiques. Le problème est moins critique pour les oxydes

de Fe et/ou Mn car leur devenir biogéochimique est assez proche, même si le Mn est plus

réactif que le Fe, ce qui n'est pas du tout le cas des matières organiques ou des sulfures.

Le protocole adopté pour cette spéciation est celui préconisé par Campanella et al. (1995) qui

permet de distinguer les métaux liés à la matière organique de ceux liés aux sulfures et que

nous avons vérifié et légèrement modifié (annexe 7). En particulier, nous avons éliminé

l’attaque qui consistait à séparer les métaux liés aux humines des acides humiques. En effet, le

but de notre extraction séquentielle est de distinguer les métaux liés aux matières organiques

de ceux liés aux sulfures. Il ne nous est donc pas nécessaire de distinguer les différents types

de matières organiques. Afin de préserver les conditions anaérobies et donc éviter tout risque

d’oxydation des sulfures, les spéciations ont été réalisées sous flux d’azote dans une boîte à

gants et tous les réactifs utilisés ont été dégazés. La spéciation a été réalisée sur les sédiments

avant, après 1 semaine et 4 semaines d’incubation.



99

Les différentes étapes de ce protocole sont les suivantes :

Etape 1 : Métaux échangeables et liés aux carbonates. 90 ml d’acétate d’ammonium (1M)

ajusté à pH 5 avec de l’acide acétique pur sont ajoutés à 9 g de sédiment humide. Après 24 h

d’agitation à 130 tr.min-1, le mélange est centrifugé à 4200 tr.min-1 pendant 15 min (Jouan,

GR412). Le surnageant est récupéré et acidifié à pH 1 avec de l’acide nitrique ultrapur avant

dosage des métaux par ICP-AES. Le pH a été vérifié au bout de 24 h et est resté stable.

Etape 2 : Métaux liés aux oxydes de Fe et de Mn. 90 ml de 1:1 (v:v) chlorure

d’hydroxylammonium (1 M) : acide acétique (25 %) sont ajoutés au culot de l’étape

précédente. La suite du protocole concernant le surnageant est la même que précédemment.

Etape 3 : Métaux liés aux matières organiques. 50 ml de NaOH (0,5 M) sont ajoutés au culot.

La suite du protocole concernant le surnageant est la même que précédemment.

Etape 4 : Métaux liés aux sulfures. 50 ml de HNO3 (8 M) sont ajoutés au culot. Le mélange

est chauffé à 85 °C pendant 3 h avec agitation manuelle de temps en temps. Puis la suite du

protocole concernant le surnageant est la même que précédemment.


Résultats et discussion

100

III. Résultats et discussion

Les résultats et discussion de ce 1er chapitre sont présentés sous la forme d’un article soumis à

la revue « Water, Air and Soil Pollution ».

101

Title : Influence of microbial activity on the release of heavy metals in anaerobic river

sediments

C. Gounou*1,2, N. Bousserrhine2, G. Varrault1, J.-M. Mouchel3

1*Université Paris-Est, Cereve, UMR-MA102 - AgroParisTech, 61 Avenue du Général de

Gaulle, 94010 Créteil Cedex, France, tel : 33 145 176 563, fax : 33 145 171 999,

[email protected], [email protected]

²LBSE, Université Paris 12-Val de Marne, 61 avenue du Général de Gaulle, 94010 Créteil

Cedex, France, [email protected] 3 UMR 7619 Sisyphe, Université Pierre et Marie Curie, 75252 Paris Cedex 05, France :

[email protected]

102

Abstract

The impact of the autochthonous microbial activity on the release of metals in river sediments

has been studied. Sediments were incubated in anaerobic conditions and enriched in glucose

to stimulate microbial metabolism. Glucose was fermented and organic acids were produced.

If no obvious correlation between the acidification of the medium and the release of metals

was observed, a more significant correlation was observed between microbial activity and the

release of metals (r²=0.9). In particular, a strong activity of the iron-reducing bacteria took

place leading to the solubilisation of co-precipitated metals on iron-oxides. The presence of

the iron-reducing bacterium Clostridium butyricum, known for its iron-reducing activity was

supposed since a high concentration of butyrate was produced and it was probably implied in

the dissolution of metals.

Key-words : trace metals, microorganisms, river sediments, fermentation, iron-reducing

bacteria

1.Introduction

Anthropic activities lead to the metallic pollution of environment and particulary of river

sediments. Metals carried on suspended matter can settle and remain trapped in sediments,

which have been considered as potential chemical time bombs (Cappuyns 2006).

Indeed particle bound metals can be mobilized by changing physico-chemical conditions such

as the acidification of the medium or a change in the redox conditions (Calamano 1993; Chen

2001 ; Chuan 1996; Sims 1978). If physico-chemical parameters can roughly explain the

overall solubilization patterns of trace metals and their repartition in the different fractions of

sediments, the autochthonous microbial activities play a major role on the fate of metals in

aquatic systems in soils and sediments (Berthelin 1995 ; Kurek 2002 ; Bosecker 1997 ; Ledin

2000; Huang 2005; Gadd 2004). They can provoke a severe acidification of the medium

during sulphide oxidation (Gomez 1999; Lombardi 2001; Ryu 2003) or reduce iron and

manganese oxides (Lovley 1991). Conversely, other organisms can also promote the

oxidation of Fe and Mn oxides. If such phenomena have been described in soils, studies in

sediments are very seldom and particularly in strictly anaerobic conditions (Regnell and

Tunlid 1891; Charlatchka and Cambier 2000). However it is necessary to understand the

microbial activity in anoxic sediments since the potential release of metals, in particularly in

freshwater, may contaminate the neighbouring groudwater masses, for example in the case of

storage of dredged sediments in wet ponds (Carpentier et al 2002a 2002b).

103

The aim of this work was to study the fate of particle bound metals in sediments in response

to an increase of the heterotrophic microbial activity. Fluvial sediments were sampled and

incubated in anaerobic conditions. The release of metals and its distibution patterns in the

sediments as well as microbial metabolism were monitored during the incubation period.

2 Materials and Methods

2.1 Sampling

The first twenty centimetres of sediments were collected in the Marne River (Méry-sur-Marne)

and in the Seine River (Andrésy) in November 2005 with an Eckman grab. These sites were

chosen because of their position regarding the Paris conurbation which is considered as a

major source of contamination, Méry is located upstream of Paris while Andrésy is

downstream and deeply affected by the city. Once collected, sediment samples were

transferred into a 10 L plastic bottle previously washed with nitric acid (5 %, Normatom) to

avoid any metallic contamination. Sediments were kept moist under a Marne or Seine water

layer and were not crushed nor dried to preserve anaerobic conditions and thus preserve their

main characteristics. Given the mass of the sediment block, it is expected that sampling did

not significantly modified the bulk particulate speciation of metals, while the dissolved

speciation in interstitial water was certainly modified.

2.2 Experimental Design

Sediment incubations were carried out in anaerobic conditions in autoclaved serum flasks

(250 ml) sealed with a Teflon faced silicone septum and caped with aluminium seals. The

incubation started when 20 g (wet weight) were added to the 150 ml sterilized culture medium

containing 0.5 % of glucose (C source) and 0.15 g.l-1 of yeast extract (N source). This culture

medium was used to stimulate bacterial growth, accelerate potential the evolution of

sediments and study the impact of the microbial activity on the release of metals. The

anaerobic conditions were created by degassing the system with nitrogen. Incubations were

conducted in the dark at 28 ± 2 °C for 4 weeks without shaking to avoid resuspension of

sediments and consequently to only consider diffusion of metals during the incubation and

simulate diffusion of metals in calm and anaerobic areas. Blanks incubations were realised in

the same experimental conditions without any sediment addition.

Incubations of sediments and blanks were realised in triplicate and all manipulations were

done under a sterilised hood to avoid any microbial contamination. The dry weight of

sediments was determined: the moisture content in sediment samples was 50 % for the Marne

104

and 30 % for the Seine samples. All results are given against dry weight. All microbial and

chemical parameters were sampled and measured under inert atmosphere

2.3 Microbial metabolism

CO2 production was quantified with an infrared spectrophotometer (Beryl 100 Cosma). pH

was measured in the culture medium sampled with a sterile syringe through the septum to

keep anaerobic conditions and filtered through a 0.45 µm (pore diameter) cellulose acetate

filter (Sartorius). The total inorganic C was computed from the gaseous CO2 measurements,

and H2CO3 and HCO3- concentrations determined from the Henry’s law (KH = 2.99*106

Pa.L.mol-1) and the CO32-/HCO3

-/H2CO3 equilibrium (K1=10-6.3, K2=10-10..3). All constants are

given for 28 °C. Glucose was measured enzymatically in 1 ml of the culture medium using a

commercial kit (Kit D-Glucose, Roche). Pyruvate, formate, acetate, lactate, priopionate and

butyrate, which are the main organic acids produced during the glucose fermentation (Lovley

1988) were analysed in 1 ml of medium solution by HPLC according to Tormo and Izco

(2004). Briefly, the separation of organic acids was realised by HPLC with a reversed phase

column (Atlantis T3 5 µm, 4,6*250 mm) and a gradient of KH2PO4 (20 mM) and acetonitrile.

Organic acids were detected on-line by a UV spectrophotometer at 210 nm (UVD340S,

Gynkotek).

2.4 Metals in solution and in sediments.

Total metals in sediments were quantified before incubation by microwave mineralization

according to the method of Bettinelli et al (2000). Briefly it consisted in a mineralization with

a mix of 6 ml of HCl (30 %, Normatom), 3 ml of HNO3 (65 %, Normatom) and 2 ml HF (40

%, Normatom) for 250 mg of dry sediments. Furthermore the total contents of Fe and Al in

sediments before incubation were quantified according to the method NF EN ISO 11885

(INRA, Arras, France), which is based on a total extraction with fluorhydric acid only on 250

mg of sediment sample sieved to 250 µm.

Dissolved metals were analysed in 20 ml of the growing medium after filtration (0.45 µm

acid-washed membrane filter). Sequential extraction of metals was realised according to the

method of Campanella et al (1995) that we slightly modified to separate organic matter bound

metals and sulphide-bound metals. The step allowing to separate organic matter, exchanging

for acid-base effect, to humic compounds was removed since we are only interested in the

metals linked to the totality of organic matter. In order to keep anaerobic conditions and avoid

105

sulphide oxidation, the whole sequential extraction was realised under N2 atmosphere in a

glove box and reagents were degassed with nitrogen. The different steps of the sequential

extraction were the following:

Exchangeable and carbonate fraction: 90 ml of ammonium acetate (1 M) adjusted to pH 5

with acetic acid were added to 9 g of moist sediments. After shaking at 130 rpm for 24 h, the

mixture was centrifuged at 2400 g for 15 min. The pH value was checked at the end of the

extraction step and the supernatant was recovered.

Fe and Mn oxides fraction: 90 ml of hydroxylammonium chloride (1M, Normapur)/ acetic

acid (25 %, Normapur) 1:1 (v:v) were added to the sediment residue. The pH was 3.2. Then

the treatment was the same as the previous step.

Organic matter fraction: 50 ml of NaOH (0.5 M) were added to the sediment residue and the

treatment was the same as the previous step.

Sulphide fraction: 50 ml of HNO3 (8 M, Normatom) were added to the sediment residue and

the treatment was the same as the previous stage. Nevertheless, concerning this step, results

obtained must be interpreted very carefully because the residual fraction starts to be attacked.

All recovered supernatants were acidified at pH 1 with nitric acid (65 %, Normatom) and kept

at 4 °C before analysis. Analyses of metals were performed by using ICP-OES (Vista MPX,

Varian). 11 elements were analysed: Ag, Al, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Pb, Mn, Ni, and Zn.

Standards were prepared from an ICM 240 (Promochem) solution. The analytical quality was

controlled against reference solutions SPS-WW1 and SPS-SW1 (table 1). Although we are

well aware that sequential extractions are not perfectly specific of the fractions of particles

they are intended to destroy, we shall use the name of the fractions to refer to the extraction

steps, as a commonly done practice (Tessier et al. 1979; Quevauviller et al. 1993; Rauret 1998;

Dold 2003).

3 Results and Discussion

3.1. Characterisation of sediments

Physical and chemical characteristics of the sediments are given in the table 2 (Inra, Arras,

France). Both sediments are very different in their composition, the Seine sediment was much

coarser than the Marne sediments.

3.1.1. Total metal contents

106

The total metal contents in Marne and Seine sediments were analysed before incubation (table

3) according to the Bettinelli et al. (2002) method. Some differences between both sediments

in their metallic contents are noticed. The Marne sediments contained higher loads of Al, Fe

and Mn than the coarser Seine sediments. As far as trace metals are concerned, the Marne

sediments have higher contents of Cr, Ni and Zn than the Seine sediments. However higher

contents of Pb were found in the Seine sediments than in the Marne sediments. The higher Al

content in the Marne sediments could be explained by a higher clay fraction (440 g.kg-1) than

the Seine sediments (28 g.kg-1). However this result must be taken cautiously since the total

metals were analysed on the whole sediment whereas granulometry was analysed on particles

lower than 250 µm. Previous studies (Carpentier et al. 2002b) realised on dredged sediments

of the Seine showed good correlations between the percentage of fine particules and Cr, Fe,

Al, Mn and Ni. As a consequence, the higher loads of Al, Fe, Mn, Cr and Ni found in the

Marne sediments can be explained by the higher fractions of clays in these sediments.

Conversely, the concentrations in Ag, Cd, Cu, Pb and Zn measured in the coarser Seine

sediment, although similar to the concentrations obtained in the Marne sediment indicate a

much higher contamination status downstream of Paris, as expected (Thévenot, 2007).

3.1.2. Sequential extraction

It was performed on both sediments before incubation. Since no specific attack of the residual

fraction was attempted, metal contents in this fraction were estimated by difference. A

pseudo-residual fraction was calculated as the difference between total content

(HCl+HNO3+HF and microwave extraction) and the sum of the contents of the other fractions.

For the Marne sediments, results show that Co belonged mainly to the

exchangeable/carbonates fraction and Fe and Mn oxides fraction, Cu to the organic matter and

sulphide fractions (table 4a). Iron was mainly contained in the Fe/Mn oxides and sulphides.

Ni was mainly bound to the sulphide fractions and Mn mainly belonged to the exchangeable

and carbonates fraction. As the pH of the sediment was 8.1 and the redox potential was about

-0.2V, the Eh-pH stability diagram of Mn confirms that Mn was mainly under carbonate form.

In the much coarser Seine sediments, the distribution of metals showed some noticeable

differences (table 4b). A significant difference regards to the percentage of Fe in the

exchangeable+carbonate fraction which was much higher in Seine sediments (up to 28 %).

The percentage of Co and Ni in the organic fraction was 4 times higher the in Seine sediments,

107

up to about 20 %, while the same percentage decreased by more than a factor 2 for Cu, down

to 20 % also. The fractionation of Mn was about the same in both samples.

3.2. Microbial metabolism

3.2.1 Fermentation process

Rates of carbon mineralization were high during the first four days for both sediment samples

before a plateau occurred (Fig. 1). No latency period was observed at the beginning of the

experiment meaning a good physiological state of microorganisms and a good adaptation to

the experimental conditions. Quantities of inorganic carbon produced were quite similar for

both sediments and reach a maximum of 137 mg for the Marne and 175 mg for the Seine

sediment samples. Glucose was totally degraded after 4 days of incubation in both sediment

samples and several organic acids were detected: acetate, lactate, propionate and butyrate. In

the Marne sediments, butyrate and acetate were the major organic acids produced after 4 days

of incubation up to 23 and 130 mg-C at the end of the incubation, while the initially produced

lactate disappeared after 4 days. In the Seine sediments, the organic acid production pattern

was different. No lactate was detected. Only a small amount of propionate was produced (0.2

mg-C). The maximum of acetate was observed during the first stage of the incubation (13 mg-

C) followed by a plateau at about 3.5 mg-C after 3 days. Butyrate increased during the first

four days to attain a maximum value of 90 mg-C. The production of such organic acids

indicates that fermentation metabolism occurred (Charlatchka and Cambier 2000).

Furthermore Dassonville et al (2004) also demonstrated that in soils enriched with glucose in

anaerobic conditions, the microbial metabolism of glucose led to the initial formation of CO2

and acetate, while smaller quantities of lactate and propionate were accumulated.

The decrease of acetate in the experiments with Seine sediments could be due to a

consumption of acetate by autochthonous microorganisms (Lovley and Philipps 1988). In the

Marne and Seine sediment samples, after 10 days of incubation, about 75 % of the organic

carbon introduced as glucose was transformed into organic acids and mineralized carbon. The

organic carbon not determined can be due to the production of other metabolites such as

alcohols, amino-acids and other polysaccharides not analysed and to the increase of the

biomass. Indeed microorganisms increased from about 7.2x105 to 3.5x108 CFU.g-1 of dry

sediments in the Marne flasks and from 106 to 1.1x108 CFU.g-1 of dry sediments in the Seine

flasks after 1 day of incubation and which was the maximum. If it is assumed that the average

dry weight per bacterium is 2.7 x 10-13 g (Reynolds and Pepper 2000), the estimated biomass

108

in the Marne sediments is 0.9 mg and 0.42 mg in the Seine sediments after 1 day of

incubation.

To conclude, the organic acid production patterns in our incubations indicated that

microorganisms had a fermentative metabolism rather than an anaerobic respiration since

glucose was mainly transformed into carbon dioxide, organic acids and probably alcohols.

3.2.2 Acidification of the medium

For the Marne sediments, a strong acidification of the aqueous medium was observed during

the first four days of incubation from 8.2 to 5.8 (Fig. 2). Then after the day #7, the pH slightly

decreased until 5.5 and stabilized until the end of the incubation. For the Seine flasks, a

stronger acidification was noticed during the first two days from 7.7 to 5.1. Then pH

increased until the day #4 and remained constant at 5.4 until the end of the experiment.

This decrease can be attributed to the secretion of protons, amino-acids or organic acids.

Indeed the most thermodynamically favoured fermentation glucose reactions are the

following (Lovley and Philipps 1988) :

C6H12O6 + H2O → CH3COO- + CH3CH2COO- + HCO3- + H2 + 3H+ (1)

C6H12O6 + 2.6H2O → 0.6CH3COO- + 0.7CH3CH2CH2COO- + 2HCO3- + 2.6H2 + 3.3H+ (2)

Assuming that reactions 1 and 2 mainly occurred in our sediments and using the maximum

quantities of propionate and butyrate produced, it can be estimated that 13 mmol H+ in 150 ml

of solution was produced. This was calculated by considering the maximal quantity (mmole)

of each organic acid produced in 150 ml of solution: 2 mmol of butyrate, 1 mmol of acetate

and 0.2 mmol of propionate. Acetate was not considered in the equilibrium 2 to calculate the

total of the protons produced. As 4 mmol of glucose were introduced in 150 ml of solution at

the beginning of the incubation, 12 mmol of H+ were expected to be produced theoretically

and 13 mmol were really produced. As a consequence a part of the acidification of the

medium is due to the production of organic acids. A similar acidification from 7.5 to 5.5 was

found in anaerobic sediments incubated with 20 g.l-1 of glucose (Dassonville et al. 2004).

3.3 Metals in solution and sediments and their relationship with the microbial metabolism

3.3.1 Dissolved Fe and Mn

For the Marne sediments, high dissolution of Fe and Mn during the first five days of

incubation occurred followed by a plateau (Fig. 3). Maximum contents were 1600 and 110

µg.g-1 respectively. Same trends were observed for the dissolution of Fe and Mn in the Seine

109

sediments but dissolved amounts were lower than for the Marne sediments with about 600

and 20 µg.g-1 for Fe and Mn, respectively (Fig. 3). The dissolution of Fe and Mn was

maximum during the first days of the experiments and synchronous with the higher decrease

of pH. Several processes may be involved in the general positive relationship between

lowering of pH and metal release, which has been widely demonstrated for various substrates

(Sims and Patrick 1978; Calamano et al. 1993; Chuan et al. 1996; Stumm and Morgan 1996;

Chen and Lin 2001; Gundersen and Steinnes 2003; Qureshi et al. 2003; Yang et al. 2006).

However, no strict correlation between pH and Fe and Mn release was observed in our

sediments since after the strong pH decrease during the first day, pH started in slowly increase

while metals were still released in the supernatant. It is likely that slow kinetics at interfaces

slowly buffer the strong pH decrease due to -dissolved- glucose degradation, while additional

slow kinetics also at interface induce a slow release of metals. Accordingly, a reverse

relationship (dissolved metals increase with an increasing pH) was found for the final part of

the experiment. Same trends as our results are observed in a previous study, in which an

increase of the leached metals were observed in soils with a decrease of the pH but both

parameters were not obviously correlated (Linde et al. 2007). In their study, the only

relationship with R2 values above 0.2 was found for Cu and Cr concentration versus pH.

Much better correlations were obtained between C mineralization and the release of Fe and

Mn (R²>0.80) for both sediments. In particular, it can be noticed that dissolved iron attained a

plateau when glucose was completely consumed (Figs 1 and 3). Other experiments realised

with only 0.1 % of glucose instead of 0.5 % in the same incubation conditions (not presented

here) revealed a relationship between the percentage of glucose and the concentration of iron

dissolved. With 0.5 % of glucose, about 5 % and 10 % of the total iron was leached in the

Marne and Seine sediments, respectively while only about four times less of the total iron was

leached with 0.1 % of glucose in both sediments. The same plateau of iron concentration was

observed after the consumption of all glucose.

As better correlations were found between the Fe and Mn release with C mineralization, the

presence of iron and manganese reducing bacteria was supposed. Indeed some fermentative

bacteria are known to oxidise organic matter by reducing iron and manganese oxides at the

same time to use them as final electron acceptor (Lovley, 1991). The production of butyric

acid is characteristic of the microorganism Clostridium butyricum, known for its iron-

reducing activity (Lovley, 1991). Furthermore thermodynamic calculations suggest that the

metabolic strategy of using Fe(III) as a minor electron sink provide a slightly greater energy

110

yield than fermentation alone (Lovley, 1991). The percentage of the electrons produced by

fermentation and used for the iron reduction was calculated (table 5) at the end of the

incubation by assuming that all the dissolved iron was iron (II) and following the fermentation

equilibriums (Jones and Wood 1986) from the concentration of organic acids at the end of the

incubation:

Glucose → 2 propionate + 4e- (3)

Glucose → 2 lactate + 4e- (4)

Glucose → 1 butyrate + 4e- (5)

Glucose → 2 acetate + 8e- (6)

Fe3+ + e-→ Fe2+ (7)

The total amount of electrons produced (mmoles) was compared to the total amount of

electrons used to reduce iron (III) into iron (II). 2.39 and 5.42 % of electrons were used to

reduce iron-oxides, in the Marne and Seine, respectively. Identically low percentages are used

for the reduction of iron oxides such as goethite, usually lower than 6 % (Lovley 1991).

Under the assumption that all the dissolved iron was produced by the reductive dissimilatory

activity of iron-reducing bacteria on the Fe oxides measured by the sequential extraction

procedure, bacteria would have been able to reduce 60 % and 46 % of iron-oxides in Marne

and Seine sediments.

3.3.2. Other dissolved metals

As far as other metals are concerned (Co, Cu and Ni), their dissolution profiles were similar to

the Fe and Mn dissolution profiles for both sediments (Fig. 4). A high rate of dissolution was

observed for all metals during the first five days followed by a plateau. Maximum dissolution

contents were 1 and 0.7 µg.g-1 for Co/Ni and Cu respectively for the Marne sediments and 0.4;

0.2 and 0.1 µg.g-1 for Cu, Ni and Co, respectively, in the Seine sediments. The dissolved

contents of the other metals were very low and did not increase during the incubation (such

for Cd, Cr and Pb). As for Fe and Mn, no correlation was found between their release and the

decrease of pH whereas good correlations were found between the contents of dissolved

metals and carbon mineralization (R² between 0.62 and 0.93). Furthermore, the similarity of

dissolution profiles between Fe and Co, Cu, Mn and Ni, in the Seine and Marne sediments

suggests that these metals have been released from the iron oxides. The ratios of dissolved

metal/dissolved iron during the incubation were compared to the ratios of metal/iron in the

111

different fractions of the sediments measured by sequential extraction before the incubation

(Fig. 5). These ratios must also be compared to the exchangeable/carbonate fraction because

the acidification due to fermentation may also have released a fraction of the trace metals that

have been released by this extraction step. In the Marne sediments (Fig. 5a), it appeared that

the dissolution of Cu was close to the dissolution of Cu coming from the Fe/Mn oxide fraction.

The same behaviour was observed for Co and Ni. For Mn, it was close to the dissolution of

Mn coming from exchangeable/carbonate and Mn/Fe oxides fractions. The same results were

obtained for the Seine sediments (Fig. 5b). Such correlations have been observed in pore-

water sediments: dissolved Ni and Cu increased in the zone of Fe and Mn reduction

(Leermarkers et al. 2005).

As a consequence, metals adsorbed or co-precipitated on iron-oxides were released during

their reduction as it has been observed in previous studies (Francis and Dodge 1990;

Bousserrhine et al. 1999a,b; Quantin et al. 2001). In further studies, it will be interesting to

characterize the iron-reducing bacteria in our sediments and their relative contribution to the

dissolution of metals.

The aim of this paper was to study the activity of heterotrophic bacteria on the release of

metals in anaerobic sediments. Despite some different physico-chemical properties between

sediments, similar trends were observed. The organic matter was fermented and CO2 and

organic acids were produced. Meanwhile, the release of Co, Cu, Fe, Mn and Ni occurred. A

strong correlation was noticed between the dissolution of Fe and the other metals. This fact let

to think that Co, Cu, Mn and Ni were leached from iron-oxides by iron-reducing bacteria.

This was emphasized by the results of sequential extraction that showed a correlation between

dissolved metals and metals dissolved coming from the iron oxides. Furthermore the presence

of iron-reducing bacteria was highlighted by the analysis of organic acids and particularly a

high concentration of butyrate (1 g.l-1), which is usually produced by the iron-reducing

bacterium, Clostridium butyricum. In further studies, it would be interesting to analyse more

precisely the evolution of the microorganisms during the incubation and identify the

microorganisms and particularly, the iron-reducing bacteria.

In a more general view, this study shows that autochthonous microorganisms can also be used

as a biological method to estimate metals linked to the different fractions of sediments and

particularly to the iron-oxides thanks to the use of iron-reducing bacteria. This method can be

used alternatively to the usual chemical extraction scheme, which’s cons are well known, such

as readsorption on other mineral fractions of soils and sediments.

112

Acknowledgements

The authors are grateful to Research Ministry and the University Paris Est for their financial

and technical support and also to the Service of the Navigation of Seine for their authorization

and technical support for the sediment sampling.

References

Berthelin, J., Munier-Lamy, C. & Leyval, C. (1995). Effect of microorganisms on mobility of

heavy metals in soils. Environmental impact of soil component interactions. London, Lewis

Publishers. II.

Bettinelli, M., Beone, G. M., Spezia, S. & Baffi, C. (2000) Determination of heavy metals in

soils and sediments by microwave-assisted digestion and inductively coupled plasma optical

emission spectrometry analysis. Analytica Chimica Acta; 424, 289-296.

Bosecker, K. (1997) Bioleching : metal solubilization by microorganisms. FEMS

Microbiology Reviews; 20, 591-604.

Bousserrhine, N., Gasser, U. G., Jeanroy, E. & Berthelin, J. (1999a). Comparison between

bacterial and chemical dissolution of Al-substituted goethite. Incidence on mobilization of

iron. Effect of mineral-organic-microorganism interactions on soil and freshwater

environments. J. Berthelin, P. M. Huang, J.-M. BollagetF. Andreux, Kluwer Academic /

Plenum Publishers.

Bousserrhine, N., Gasser, U. G., Jeanroy, E. & Berthelin, J. (1999b). "Bacterial and chemical

reductive dissolution of Mn-, Co-, Cr-, and Al- substituted goethites." Geomicrobiology

Journal, 16(3), 245-258.

Calmano, W., Hong, J. & Förstner, U. (1993) Binding and mobilization of heavy metals in

contaminated sediments affected by pH and redox potential. Water Science and Technology,

28

113

Campanella, L., D'Orazio, D., Petronio, B. M. & Pietrantonio, E. (1995) Proposal for a metal

speciation study in sediments. Analytica Chimica Acta, 309, 387-393.

Cappuyns, V., Swennen, R. & Devivier, A. (2006) Dredged River Sediments: Potential

Chemical Time Bombs ? a Case Study. Water, Air, & Soil Pollution, 171, 49-66.

Carpentier, S., Moilleron, R., Beltran, C., Herve, D. & Thevenot, D. (2002a) Quality of

dredged material in the River Seine basin (France). I. Physico-chemical properties. The

Science of The Total Environment, 295, 101-113.

Carpentier, S., Moilleron, R., Beltran, C., Herve, D. & Thevenot, D. (2002b) Quality of

dredged material in the river Seine basin (France). II. Micropollutants. The Science of The

Total Environment, 299, 57-72.

Charlatchka, R. & Cambier, P. (2000) Influence of Reducing Conditions on Solubility of

Trace Metals in Contaminated Soils. Water, Air, & Soil Pollution, 118, 143-168.

Chen, S.-Y. & Lin, J.-G. (2001) Bioleaching of heavy metals from sediments : significance of

pH. Chemosphere, 44,1093-1102.

Chuan, M. C., Shu, G. Y. & Liu, J. C. (1996) Solubility of heavy metals in a contaminated

soil: Effects of redox potential and pH. Water, Air, & Soil Pollution, 90, 543-556.

Dassonville, F., Godon, J. J., Renault, P., Richaume, A. & Cambier, P. (2004) Microbial

dynamics in an anaerobic soil slurry amended with glucose, and their dependence on

geochemical processes. Soil Biology and Biochemistry, 36, 1417-1430.

Dold, B. (2003) Speciation of the most soluble phases in a sequential extraction procedure

adapted for geochemical studies of copper sulfide mine waste. Journal of Geochemical

Exploration, 80, 55-68.

Francis, A. J. & Dodge, C. J. (1990). "Anaerobic microbial remobilization of toxic metals

coprecipitated with iron oxide." Environmental Science and Technology, 24(3), 373-378.

114

Gadd, G. M. (2004) Microbial influence on metal mobility and application for bioremediation.

Geoderma, 122, 109-119.

Gomez, C. & Bosecker, K. (1999) Leaching Heavy Metals from Contaminated Soil by Using

Thiobacillus ferrooxidans or Thiobacillus thiooxidans. Geomicrobiology Journal, 16, 233 -

244.

Gundersen, P. & Steinnes, E. (2003) Influence of pH and TOC concentration on Cu, Zn, Cd,

and Al speciation in rivers. Water Research, 37, 307-318.

Huang, P.-M., Wang, M.-K. & Chiu, C.-Y. (2005) Soil mineral-organic matter-microbe

interactions: Impacts on biogeochemical processes and biodiversity in soils. Pedobiologia, 49,

609-635.

Jones, D. T. & Woods, D. R. (1986) Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiological

reviews, 50, 484-524.

Kurek, E. (2002). Microbial mobilization of metals from soil minerals under aerobic

conditions. Interactions between Soil Particles and Microorganisms. Impact on the Terrestrial

Ecosystem. Huang, P. M., Bollag, J.-M.etSenesi, N. Wiley, Chicheste, IUPAC Series on

Analytical and Physical Chemistry of Environmental systems. 8, 189-225.

Ledin, M. (2000) Accumulation of microorganisms-processes and importance for soil systems.

Earth-Science Reviews, 51, 1-31.

Leermakers, M., Gao, Y., Gabelle, C., Lojen, S., Ouddane, B., Wartel, M. & Baeyens, W.

(2005) Determination of High Resolution Pore Water Profiles of Trace Metals in Sediments

of the Rupel River (Belgium) using Det (Diffusive Equilibrium in Thin Films) and DGT

(Diffusive Gradients in Thin Films) Techniques. Water, Air, & Soil Pollution, 166, 265-286.

Linde, M., Öborn, I. & Gustafsson, J. P. (2007). Effects of changed soil conditions on the

mobility of trace metals in moderately contaminated urban soils. Water, Air and Soil

Pollution, 183, 69-83.

115

Lombardi, A. T. & Garcia, J., Oswaldo. (2002) Biological leaching of Mn, Al, Zn, Cu and Ti

in an anaerobic sewage sludge effectuated by Thiobacillus ferrooxidans and its effect on metal

partitioning. Water Research, 36, 3193-3202.

Lovley, D. R. (1991) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. Microbiological reviews,

55, 259-287.

Lovley, D. R. & Phillips, E. J. P. (1988) Novel mode of microbial energy metabolism :

organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied

and Environmental Microbiology, 54, 1472-1480.

Quantin, C., Becquer, T., Rouiller, J. H. & Berthelin, J. (2001). Oxide weathering and trace

metal release by bacterial reduction in a New Caledonia Ferralsol. Biogeochemistry, 53(3),

323-340.

Quevauviller, P., Ure, A., Muntau, H. & Griepink, B. (1993) Improvement of analytical

measurements within the BCR-programme : single and sequential extraction procedures

applied to soil and sediment analysis. International Journal of Environmental and Analytical

Chemistry, 5, 129-134.

Qureshi, S., Richards, B. K., Hay, A. G., Tsai, C. C., McBride, M. B., Baveye, P. & Steenhuis,

T. S. (2003) Effect of microbial activity on trace element release from sewage sludge.

Environmental Science & Technology; 37, 3361-3366.

Rauret, G. (1998) Extraction procedures for the determination of heavy metals in

contaminated soil and sediment. Talanta, 46, 449-455.

Regnell, O. & Tunlid, A. (1991) Laboratory study of chemical speciation of mercury in lake

sediment and water under aerobic and anaerobic conditions. Applied and Environmental

Microbiology; 57, 789-795.

Reynolds, K. A. & Pepper, I. L. (2000). Microorganisms in the environment. Environmental

microbiology. Maier, R. M., Pepper, I. L.& Gerba, C. P. San Diego, Academic Press: 19-27.

116

Ryu, H. W., Moon, H. S., Lee, E. Y., Cho, K. S. & Choi, H. (2003) Leaching characteristics

of heavy metals from sewage sludge by Acidithiobacillus thiooxidans MET. Journal of

Environmental Quality, 32, 751-759.

Sims, J. L. & Patrick, W. H. (1978) The distribution of micronutrient cations in soil under

conditions of varying redox potential and pH. Soil Science Society of America Journal, 42,

258-262.

Stumm, W. & Morgan, J. J. (1996). Aquatic chemistry : chemical equilibria and rates in

natural waters, Wiley interscience.

Tessier, A., Campbell, P. G. S. & Bisson, M. (1979) Sequential extraction procedure for the

speciation of particulate trace metals. Analytical Chemistry; 51, 844-851.

Tormo, M. A & Izco, J. M. (2004). Alternative reversed-phase high-performance liquid

chromatography method to analyse organic acids in dairy products. Journal of

Chromatography A, 1033(2), 305-310.

Thevenot, D. R., Moilleron, R., Lestel, L., Gromaire, M.-C., Rocher, V., Cambier, P., Bonte,

P., Colin, J.-L., de Ponteves, C. & Meybeck, M. (2007) Critical budget of metal sources and

pathways in the Seine River basin (1994-2003) for Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb and Zn. Science of

The Total Environment

Human activity and material fluxes in a regional river basin: the Seine River watershed -

Seine Special Issue; 375, 180-203.

Yang, J. Y., Yang, X. E., He, Z. L., Li, T. Q., Shentu, J. L. & Stoffella, P. J. (2006) Effects of

pH, organic acids, and inorganic ions on lead dissolution from soils. Environmental Pollution,

143, 9-15.

117

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12

Time (days)

C (m

g)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Cglu

cose

(mg)

LactateAcetatePropionateButyrateMineralized CCorg acid + C mineralizedGlucose

a) Marne

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12

Time (days)

C (m

g)

0

50

100

150

200

250

300

350

400C

gluc

ose

(mg)

AcetatePropionateButyrateMineralized CCorg acid + C mineralizedGlucose

b) Seine

Fig. 1. : Evolution of organic and inorganic carbon during the incubation (error bars : standard

deviation between triplicates)

118

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time (days)

pH

Marne Seine

Fig. 2. : Evolution of pH in the growing medium during the incubation

119

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Time (days)

Diss

olve

d M

n (µ

g.g

-1 o

f dry

sed

imen

ts)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Diss

olve

d Fe

(µg.

g-1

of d

ry s

edim

ents

)

Mn-Marne Mn-Seine Fe-Marne Fe-Seine

Fig. 3 : Evolution of the content of dissolved Fe and Mn during the incubation

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Time (days)

Diss

olve

d m

etal

s (µ

g.g

-1 o

f dry

sed

imen

ts)

Co-Marne Cu-Marne Ni-Marne Co-Seine Cu-Seine Ni-Seine

Fig. 4 : Evolution of the content of dissolved Co, Cu and Ni during the incubation

120

y = 0.0004x - 0.0344R2 = 0.9244

0

1

2

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Dissolved Fe (µg.g-1)

Dis

solv

ed C

o (µ

g.g

-1)

dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides

a) Co

y = 0.0005x - 0.0646R2 = 0.9079

0

5

10

15

20

25

0 500 1000 1500 2000 2500 3000


Dis

solv

ed C

u (µ

g.g

-1)


b) Cu

121

y = 0.0681x + 1.5881R2 = 0.9171

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000


Dis

solv

ed M

n (µ

g.g

-1)


c) Mn

y = 0.0006x + 0.0112R2 = 0.8926

0

2

4

6

8

10

12

0 500 1000 1500 2000 2500 3000


Dis

solv

ed N

i (µg

.g-1

)


d) Ni

A- Marne

122

y = 0.0001x + 0.008R2 = 0.975

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 200 400 600 800 1000 1200 1400


Dis

solv

ed C

o (µ

g.g

-1)


a) Co

y = 0.0005x + 0.0736R2 = 0.8702

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 200 400 600 800 1000 1200 1400


Diss

olve

d C

u (µ

g.g

-1)


b) Cu

123

y = 0.0313x - 0.2676R2 = 0.9734

0

20

40

60

80

100

120

0 200 400 600 800 1000 1200 1400


Dis

solv

ed M

n (µ

g.g

-1)


c) Mn

y = 0.0002x + 0.0321R2 = 0.9037

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

0 200 400 600 800 1000 1200 1400


Dis

solv

ed N

i (µg

.g-1

)


d) Ni

B-Seine

Fig. 5 : Correlation between dissolved metals and dissolved Fe for the dissolved metals

during incubation and in the different fractions of the sediment

124

TABLE 1 : Mean values (µg.l-1) of control solutions analysed by ICP-AES (experimental and

theorical values)

Parameters Marne Seine Method Physical Size fractions (g.kg-1) NF X 31-107 Clay (<2 µm) 440 28 Fine silt (2/20 µm) 346 4 Coarse silt (20/50 µm) 153 2 Fine sand (50/200 µm) 32 9 Coarse sand (200/2000 µm) 29 957 Chemical pH water 8.1 7.8 NF ISO 10390 Organic carbon (g.kg-1) 23 26.9 C/N 9.6 47.6 Organic matter (g.kg-1) 39.7 51.2


CEC (cmol+.kg-1) 15.8 1.42 NF X 31-130 TABLE 2 : Physical and chemical characteristics of sediments (fractions < 250 mm)

SW1 Mean Theorical values WW1 Mean Theorical values Al 50±3 50± 1 Co 59.7±3.5 60.0± 0.3 Cu 21±1 20± 1 Cu 416±6 400± 2 Cr 2.36±0.07 2.00± 0.02 Cr 210±3 200± 1 Cd 0.58±0.13 0.50± 0.01 Cd 21.0±1.4 20.0± 0.1 Co 2.00±0.00 2.00± 0.02 Fe 1000±6 1000± 5 Fe 21±2 20± 1 Mn 419±9 400± 2 Mn 10.2±0.5 10.0± 0.1 Pb 103.5±4.9 100.0± 0.5 Ni 9.0±0.0 10.0± 0.1 Zn 608.5±12.0 600± 6 Pb 6.7±0.3 5.0± 0.1 Zn 23±4 20± 1

125

1

Samples Ag Al Cd Co Cr Cu Fe Mn Ni Pb Zn Mean content 0.35 6370 0.38 6 24 22 11800 203 12 16 65 Marne sediments Standard deviation 0.04 1500 0.03 1 2 1 900 5 1 1 3 Mean content 0.31 11600 0.5 2 9.4 21 3900 114 4 41 46 Seine sediments Standard deviation 0.02 2616 0.1 1 1.8 7 454 24 1 19 5

Background of the Seine watershed (Thévenot et al. 2007)

Mean content 2.7 33000 0.25 7 40 15 15000 16 23 60

TABLE 3 : Total content of metals (µg.g-1 of dry sediments) before incubation. Standard deviation represents deviation between triplicates. 2

3

4

5

126

Content (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 1.5 2.4 57 312 2.9 Fe/Mn oxides 1.5 2.9 2837 128 3.0 Organic matter 0.17 19 33 0.35 0.74 Sulphides 0 14 1427 63 9.8 Sum of the fractions 3.17 38.3 4354 503.35 16.44 Pseudo-residual 2.83 - 7446 - - Standard deviation (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 0.1 0.2 9 9 0.1 Fe/Mn oxides 0.1 0.1 70 13 0.2 Organic matter 0.03 1 2 0.05 0.06 Sulphides 0 0 143 5 0.6

a) Marne

Content (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 0.19 2.4 584 101 0.74 Fe/Mn oxides 0.25 2.9 1298 59 0.60 Organic matter 0.11 3.3 9.5 0.06 0.17 Sulphides - 9.3 203 17 1.7 Sum of the fractions 0.55 17.9 2094.5 177.06 3.21 Pseudo-residual 1.45 3.1 1806 - 0.79 Standard deviation (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 0.03 0.2 98 6 0.06 Fe/Mn oxides 0.02 0.02 93 6 0.01 Organic matter 0.06 1.3 3.6 0.01 0.08 Sulphides - 1.9 5 1 0.07

b) Seine

TABLE 4 : Content of metals in the different fractions of the sediment before incubation (%

recovered represents the ratio of the sum of each fractions out of the total metals)

Marne Seine Fe2+ (mmol) 0.29 1.72 Acetate (mmol) 0.95 0.15 Byturate (mmol) 2.02 1.66 Propionate (mmol) 0.22 0.005 Electron production (meq e-) 12 7 Percentage of electrons implicated in the Fe(III) reduction 2.39 5.42

TABLE 5 : Metabolism of microorganisms and its implication in the reduction of iron oxides


Conclusions et perspectives

127

IV. Conclusions et perspectives

L’objectif de ce premier chapitre était d’étudier la mobilité des éléments traces métalliques et

éléments majeurs dans les sédiments de la Seine et de la Marne sous l’activité des

microorganismes autochtones en milieu anaérobie. Bien que les sédiments étudiés aient des

propriétés physico-chimiques différentes, les résultats obtenus sont similaires tant du point de

vue microbiologique que de la mobilité métallique.

La croissance microbienne se manifeste par une consommation rapide du glucose, durant les 4

premiers jours d’incubation, accompagnée d’un dégagement de dioxyde de carbone et d’une

production d’acides organiques. Aussi, les bactéries semblent-elles mettre en place un

processus de fermentation. Nous avons pu observer une acidification du milieu de culture

passant d’un pH 7,5 à un pH 5.

Parallèlement à l’activité microbienne, nous avons observé une forte dissolution des ETM et

éléments majeurs, en particulier du Co, Cu, Fe, Mn et Ni. Il semble que cette dissolution ne

soit pas corrélée à l’acidification du milieu mais plutôt liée à l’activité microbienne. En effet,

nous avons constaté une corrélation entre la cinétique de solubilisation des ETM et éléments

majeurs et la croissance microbienne, en particulier la production de CO2 et la consommation

du glucose.

Par ailleurs, une forte corrélation entre la dissolution du fer d’une part, et celle du Co, Cu, Mn

et Ni d’autre part, est à souligner.

La présence de bactéries fermentaires avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer est donc

fortement suspectée. En effet, celles-ci, en réduisant les oxydes de fer pourraient être à

l’origine de la désorption des ETM y étant adsorbés. Ceci est d’ailleurs renforcé par les

analyses d’extractions séquentielles qui révèlent que les ETM dissous proviennent de la

fraction réductible c’est-à-dire des oxydes de manganèse et des oxydes de fer. De plus, la

forte production d’acide butyrique au cours de l’incubation nous laisse penser qu’une des

bactéries ferri-réductrices présentes dans le milieu pourrait être Clostridium butyricum. En

effet, cette bactérie est connue pour son activité fermentaire et sa capacité à réduire les oxydes

de fer (Bousserrhine, 1995, 1999a, 1999b).



128

Il s’agit donc maintenant d’approfondir le métabolisme mis en place par les microorganismes,

de savoir si les communautés microbiennes sont modifiées au cours de l’incubation et de

mettre en évidence et d’identifier les bactéries ferri-réductrices présentent dans les sédiments.

Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-

réductrices

129

Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des

microorganismes : importance des bactéries ferri-réductrices


réductrices

Introduction

130

I. Introduction

Dans le premier chapitre dédié à l’étude de la mobilité des éléments traces métalliques et

éléments majeurs dans les sédiments de la Marne et de la Seine en relation avec l’activité de

microorganismes autochtones, les résultats ont montré que, malgré des propriétés physico-

chimiques différentes des sédiments étudiés, les mêmes tendances ont été observés concernant

le métabolisme microbien et le devenir des éléments métalliques.

La matière organique ajoutée (glucose) a été dégradée très rapidement par un processus

fermentaire conduisant à la production d’acides organiques et de dioxyde de carbone.

Simultanément, une acidification du milieu s’est produite. Parallèlement à ce métabolisme

microbien, nous avons observé une dissolution du Fe, Mn, Co, Cu, et Ni. Par ailleurs, il a été

constaté que la dissolution réductrice du fer était corrélée à celle de certains ETM. Nous

avons donc supposé que ces ETM étaient associés aux oxydes de fer, cette hypothèse étant

renforcée par les résultats obtenus lors de l’extraction séquentielle. Nous en avons donc déduit

que, dans les conditions opératoires, les bactéries mettaient en place un métabolisme de type

fermentaire avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer. La présence d’acide butyrique

dans les incubations nous a laissé supposer que des bactéries de l’espèce Clostridium

butyricum, bactérie anaérobie tellurique connue pour son métabolisme fermentaire et sa

capacité à réduire les oxydes de fer (Bousserrhine, 1995, 1999a,b), étaient présentes et

jouaient un rôle prépondérant dans les sédiments étudiés.

Aussi, nous sommes-nous attachés, dans ce volet, à étudier le métabolisme mis en place

parallèlement à la réduction bactérienne du fer et à en identifier les acteurs ainsi qu’à en

suivre leur dynamique. L’importance d’autres activités microbiennes susceptibles de nous

renseigner davantage sur le devenir des éléments métalliques a également été abordée. Il

s’agira essentiellement des activités concernant les sulfates.


réductrices


131


II.1. Incubation des sédiments et suivi du métabolisme microbien

II.1.1. Incubation des sédiments

Les sédiments de la Marne et de la Seine, issus de la campagne de prélèvement de novembre

2005, ont été mis à incuber en batch pendant un mois dans les mêmes conditions que celles

mises en place dans les expérimentations du chapitre 1.

Nous avons choisi de travailler avec 0,5 % de glucose dans ce volet puisque c’est à cette

concentration que les résultats les plus représentatifs et significatifs ont été observés. En fait,

les résultats présentés dans cette partie ont été obtenus lors des incubations effectuées

précédemment (cf. chapitre1).

II.1.2. Suivi du métabolisme microbien

L’activité des microorganismes a été suivie pendant toute la durée des incubations.

La densité microbienne anaérobie a été étudiée pendant la durée de l’incubation selon le

protocole décrit dans le chapitre 1.

II.1.2.1. Suivi de la diversité fonctionnelle ou capacité

métabolique des microorganismes

Le suivi de la diversité fonctionnelle permet de constater d’éventuelles modifications dans la

structure de la communauté microbienne au cours de l’incubation. Celle-ci a été suivie chaque

semaine en utilisant la technique Biolog mise au point par Garland et Mills (Garland et Mills,

1991) (Microplaques AN, Biolog, AES laboratories). Il s’agit d’une plaque de 96 puits

contenant chacun une source de carbone différente et un réactif, le tétrazolium. Les sources de

carbone sont regroupées par famille : amines, polysaccharides, hydrates de carbone, acides

organiques, acides aminés et divers (annexe 8). L’oxydation des sources de carbone par les

microorganismes entraîne la réduction du tétrazolium qui prend alors une coloration violette

et dont l’intensité est mesurée au spectrophotomètre (Opsys MR, Dynex Technologies) à une

longueur d’onde de 590 nm. 100 µl de suspension du sédiment à analyser a été inoculé dans

chacun des puits puis la plaque a été mise à incuber dans un bocal « Le Parfait » fermé

hermétiquement et contenant un sachet GENbox anaer (Biomérieux) permettant de réaliser

l’anaérobiose. Après 48 h puis 72 h d’incubation à 30 °C, la plaque est analysée au lecteur de


réductrices


132

plaques. Entre les deux mesures, un sachet GENbox anaer est replacé dans le bocal afin de

recréer les conditions anaérobies pour la suite de l’expérimentation. L’effet de l’oxygénation

pendant la lecture de la plaque est considéré comme négligeable. Chaque puit fournit donc

une réponse oui/non selon que le composé qu’il contient est significativement dégradé ou non

dans les conditions d’incubation choisies. Les résultats seront interprétés en les examinant par

famille et en comptant le pourcentage de composés (ou puits) donnant une réponse positive

pour chaque famille.

II.1.2.2. Mesure du potentiel d’oxydo-réduction

Le potentiel d’oxydo-réduction a été mesuré, au cours de l’incubation, à l’aide d’une électrode

de platine (Metrohm) immédiatement après prélèvement de l’échantillon et filtration à 0,45

µm.

II.1.2.3. Dosage des sulfates

Afin de mettre en évidence d’éventuelles réactions de sulfato-réduction, souvent rapportées au

cours de transformation microbienne en conditions anaérobies, les ions sulfates ont été dosés

par chromatographie ionique (C1 Metrosep Anion Dual 1 + précolonne, Metrohm).

Le principe de la chromatographie ionique repose sur l’interaction électrostatique entre la

résine de la colonne et les ions à séparer. La résine est chargée soit positivement pour séparer

les anions soit négativement pour séparer les cations. En fonction de la force de l’interaction

électrostatique entre la résine et les ions, la séparation se fera plus ou moins facilement.

Dans notre cas, l’éluant est un mélange de carbonate de sodium (2,5 mM, Normapur,

Analytical Grade) et d’hydrogénocarbonate de sodium (2,4 mM, Merck). Le débit est de 0,5

ml.min-1 et le volume d’échantillon injecté est 20 µL. La gamme étalon est préparée à partir

d’une solution standard multiéléments (Fluka multielement IC standard solution II). 10 ml de

milieu de culture ont été prélevés à différents temps et filtrés à 0,47 mm avant analyse.

Les caractéristiques analytiques sont indiquées en annexe 9.


réductrices


133

II.2. Caractérisation génétique des communautés microbienne

II.2.1. Principe

Depuis Torsvik (1980) qui a extrait directement les acides nucléiques à partir d’échantillons

de sol, de nombreuses méthodes ont été développées pour analyser la diversité génétique du

monde microbien en tenant compte de la fraction non cultivable représentant 90 % du

peuplement microbien d’un sol. Parmi ces méthodes, la DGGE (Electrophorèse en Gradient

de Gel Dénaturant) permet d’obtenir une image instantanée de cette diversité (Muyzer et al.,

1993). Cette technique consiste à séparer des fragments d’ADN dont la taille est identique

mais dont la séquence est différente selon le principe suivant :

1) On amplifie, sur un échantillon d'ADN extrait du milieu naturel, le gène rrn ou codant

pour l’ARN ribosomal 16S. Celui-ci est présent chez les bactéries et les archéobactéries. Il se

compose de régions variables, caractéristiques de chaque espèce, encadrées de régions

conservées utilisées en tant qu’amorces (Lane et al, 1974, Woese, 1970).

2) Le mélange des produits de la réaction de PCR est mis à migrer sur un gel présentant un

gradient vertical de produits dénaturants constitués d’acrylamide et d’urée (Muyser et al,

1993).

3) En fonction de leurs séquences et en particulier du pourcentage de bases GC, les

fragments amplifiés vont migrer plus ou moins loin sur le gel et on obtiendra in fine une

image de la « diversité » de la communauté microbienne.

II.2.2. Méthode

II.2.2.1. Extraction de l’ADN.

L’ADN a tout d’abord été extrait sur 0.25 g de sédiments (masse sèche) à l’aide d’un kit

d’extraction (PowersoilTM, MO BIO Laboratories, Ozyme, France). Il s’agit dans un premier

temps de lyser les cellules microbiennes. Le tube initial dans lequel est introduit le sédiment

contient un tampon permettant la dispersion des particules de sédiments tout en protégeant les

acides nucléiques de toute dégradation. L’ajout d’un réactif, dont le but est de lyser

complètement les cellules, permet de casser les acides gras et les lipides associés à la

membrane de nombreux organismes. Les cellules sont lysées par combinaison d’agents

chimiques et par agitation mécanique. Les étapes suivantes consistent à éliminer, par

précipitation à froid (4°C) et centrifugation, les matières organiques et inorganiques afin

d’augmenter la pureté de l’ADN. L’étape suivante consiste à purifier l’ADN. Pour ce faire,


réductrices


134

l’ADN est fixé sur une micro-colonne de silice (du kit PowersoilTM, MO BIO Laboratories,

Ozyme, France) à l’aide d’une forte concentration de solution saline. Les impuretés restantes

sont donc éliminées par filtration à travers le gel de la colonne filtrante mais fixatrice d’ADN.

L’ADN fixé est purifié à l’aide de la solution d’éthanol (70 %) qui permet d’éliminer à l’aide

d’une étape de filtration-centrifugation, tous les résidus de sels, acides humiques et autres

contaminants tout en maintenant l’ADN fixé sur la colonne. Une seconde étape de filtration-

centrifugation permet d’éliminer l’éthanol résiduel. La dernière étape consiste à récupérer

l’ADN en le désorbant de la colonne de silice à l’aide d’une solution tampon d’élution

(Tampon Tris 10 mM, pH 8).

II.2.2.2. Amplification PCR (Polymerase Chain Reaction)

Afin d’amplifier une séquence partielle de l’ARNr 16S, les amorces 518r et 338f ont été

utilisées (tableau 19). Une PCR a été réalisée sur 2 µL d’ADN dans 23 µL de mélange

contenant les amorces 518r (0,4 pmol.µl-1) et 338f (0,4 pmol.µl-1), la Taq Polymerase (Master

Mix, 1 pmol.µl-1) et de l’eau stérile. La PCR a été effectuée selon les conditions suivantes

(PTC-200 Peltier Thermal Cycler (Biorad)) : dénaturation à 94 °C pendant 5 min

(dénaturation initiale); 31 fois le cycle suivant : 94 °C pendant 30 s (dénaturation), 60 °C

pendant 1 min (hybridation), 72 °C pendant 3 min (élongation) et enfin 72 °C pendant 15 min.

La quantité d’ADN amplifié a été estimée par migration électrophorèse sur gel d’agarose (1 %)

dans un bain de solution tampon TAE (dilué 50 fois et composée de 40 mM de Tris, 20 mM

d’acide acétique, 1 mM d’EDTA, pH 8,3, Biorad) (200 V) en utilisant un marqueur de taille

moléculaire (multiple de 200 paires de bases (pb) de 200 à 10000 pb) (SmartLadder,

Eurogentec). La migration de l’ADN est visualisée en ajoutant 3 µL de bleu de bromothymol

dans chaque échantillon d’ADN.


réductrices


135

Tableau 19 : Caractéristiques des amorces utilisées au cours de la caractérisation génétique de la

communauté microbienne totale et de l’identification des bactéries ferri-réductrices

Amorces Séquences 5’→ 3’ Position Région de l’ARNr 16S

Référence

338f (F)+

518r (R)

ACTCCTACGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTG

338-355

518-534

V3

Muyser et al , 1993

27f AGAGTTTGATGATGGCTCAG 27- Lane, 1991 1100r GGGTTGCGCTCGTTG 1110 Lane, 1991 705r CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTC 705 + : GC clamp (CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG) attaché

en 5’ de l’amorce

II.2.2.3. Analyse DGGE

Les brins d’ADN amplifié par PCR ont été séparés par électrophorèse (150 V pendant 10 min

puis 20 V pendant 6 h) sur un gel d’acrylamide avec un gradient linéaire de dénaturation de

40 à 60 % en utilisant le Bio-Rad D-CodeTM System chauffé à 60 °C. Après migration, le gel

est plongé dans un bain de bromure d’éthidium pendant 15 min puis rincé à l’eau pendant 10

min. Les bandes d’ADN sont ensuite visualisées sous ultraviolet avec le lecteur de gel Geldoc

2000 (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) puis analysées avec le logiciel Quantity One

(Bio-Rad, Marnes la Coquette, France).

II.3. Isolement et identification des bactéries ferri-réductrices

II.3.1. Milieu de culture

L’isolement des bactéries ferri-réductrices a été réalisé sur un milieu gélifié de Bromfield

modifié (Bousserrhine, 1995) dont la composition est la suivante (pour 1 litre) :

- KH2PO4 : 0,5 g

- MgSO4, 7H2O : 0,5 g

- (NH4)2SO4 : 1 g

- Extrait de levure : 0,15 g

- Fe2O3H2O : 0,5 g

- Glucose : 10 g

- CaCO3 : 3 g

- Agar : 15 g


réductrices


136

Ce milieu permet de cultiver les bactéries anaérobies et de mettre en évidence celles qui sont

ferri-réductrices. Le milieu est ensuite réparti dans des flacons puis autoclavé à 120 °C

pendant 20 min. Après refroidissement à 45 °C, le milieu est coulé en boîtes de Pétri.

II.3.2. Ensemencement et incubation des bactéries

Chaque semaine, 2 g de sédiments humides sont dilués dans 10 ml d’eau physiologique

(10 g.l-1 NaCl) et une série de dilution adéquate est réalisée. 100 µl de chaque dilution est

étalée sur des boîtes de Pétri de milieu Bromfield solide. Les boîtes sont ensuite mises à

incuber à 28 °C dans des bocaux «Le Parfait » fermées hermétiquement où l’anaérobiose a

été réalisée.

Les colonies ayant poussé sont dans un premier temps repiquées et purifiées une à une sur du

milieu Bromfield solide. Dans un second temps, elles sont ensemencées dans du milieu

Bromfield liquide afin de vérifier leur activité ferri-réductrice.

II.3.3. Vérification de l’activité réductrice de fer des colonies

Les colonies sont repiquées individuellement dans des tubes stériles contenant du milieu

Bromfield liquide, dont la composition est identique à celle du milieu solide en absence

d’agar et de carbonate de calcium. Les tubes sont dégazés sous azote et mis à incuber à 28 °C

pendant 48 h.

L’apparition de fer II, dosé par spectrophotométrie, permet de prouver qu’une colonie est

effectivement issue d’une bactérie ferri-réductrice.

II.3.4. Identification des bactéries ferri-réductrices

II.3.4.1. Extraction d’ADN

Les souches purifiées issues des boîtes de Pétri sont remises en culture dans un milieu nutritif

LB (10 g.l-1 de tryptone, 5 g.l-1 d’extrait de levure, 5 g.l-1 de NaCl, pH 7) afin d’obtenir un

culot bactérien suffisant pour l’extraction d’ADN.

Après centrifugation pour récupérer le culot bactérien, l’ADN est extrait à l’aide du kit

DNeasy® Tissue Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Après extraction, l’ADN est quantifié

par spectrophotométrie UV à 260 nm (ND-1000 spectrophotometer, Nanodrop,

ThermoScientific) afin de vérifier que la quantité d’ADN est suffisante pour les étapes

suivantes.


réductrices


137

II.3.4.2. Amplification de l’ADN

L’ADN extrait est ensuite amplifié en utilisant les amorces 27f et 1100r (tableau 19) de

façon à obtenir environ 1000 paires de bases sur l’ARNr 16S. La PCR est réalisée sur un

volume final de 40 µl contenant 20 µl de Taq Polymérase (Master Mix, 1 pmol.µl-1), 1,6 µl

d’amorce 27f (10 pmol.µl-1) et 1,6 µl d’amorce 1100r (10 pmol.µl-1). La quantité de volume

d’ADN est ajoutée de telle façon à obtenir une concentration finale en ADN de 10 ng.µl-1. De

l’eau stérile purifiée est également ajoutée pour compléter le volume à 40 µl.

Les étapes d’amplification sont les suivantes : dénaturation initiale à 96 °C pendant 5 min et

44 fois le cycle suivant : 96 °C pendant 30 s (dénaturation), 56 °C pendant 30 s (hybridation),

72 °C pendant 1 min 30 s (élongation) puis après le dernier cycle, 72 °C pendant 5 min.

II.3.5. Purification de l’ADN

Après amplification, les brins d’ADN migrent sur un gel d’agarose (1 %) de la façon suivante :

3 µl de bleu de bromothymol (servant à visualiser à la migration de l’ADN) est ajouté à 40 µl

d’ADN amplifié. La migration est réalisée dans du TAE (dilué 50 fois et composée de 40 mM

de Tris, 20 mM d’acide acétique, 1 mM d’EDTA, pH 8,3, Biorad) pendant 40 min à 120V.

Le gel est ensuite plongé dans un bain de bromure d’éthidium pendant 15 min puis rincé à

l’eau ultrapure pendant 10 min avant d’être visualisé sous UV.

Les bandes d’ADN sont alors découpées et purifiées à l’aide du kit de purification DNA and

Gel Band purification kit (GE Healthcare). Ce kit permet d’éliminer, en suivant les

instructions du fournisseur, l’agarose et autres impuretés provenant de la migration par

électrophorèse.

II.3.6. Séquençage de l’ADN et identification des bactéries

II.3.6.1. Principe du séquençage d’ADN

Le séquençage d’ADN consiste à déterminer l’ordre des nucléotides d’un fragment d’ADN

donné. Il est réalisé par la méthode dérivée de celle de Sanger et al (1977) qui est une

méthode par synthèse enzymatique sélective (Brevet ABI). Le principe consiste à initier la

polymérisation de l’ADN à l’aide d’une amorce complémentaire à une partie du fragment.

L’élongation de l’amorce est réalisée par la polymérase Taq. Les quatre

désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), marqués par des composés fluorescant

à des longueurs d’onde différentes, sont ajoutés, ainsi qu’en faible concentration, l’un des

quatre didésoxynucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Ces didésoxynucléotides


réductrices


138

jouent le rôle de terminateurs d’élongation : une fois incorporés dans le nouveau brin

synthétisé, ils empêchent la poursuite de l’élongation. On obtient donc des chaînes de

longueurs différentes. La détection des fragments se fait en utilisant un traceur fluorescent

attaché soit à l’oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide. Une fois la réaction de

séquence terminée, les fragments de différentes tailles sont séparés par électrophorèse

capillaire puis le séquenceur détecte la fluorescence aux différentes longueurs d’ondes

d’émission repérant ainsi les fragments d'ADN et leur taille précise. Le séquenceur permet de

lire les quatre nucléotides en même temps.

II.3.6.2. Méthode de séquençage

- Réactions de séquences

Les réactions de séquence sont réalisées sur les fragments d’ADN purifiés et quantifiés au

nanodrop. La concentration en ADN doit être suffisante pour obtenir une concentration finale

de 5 ng.µl-1 après ajout des réactifs permettant de réaliser les réactions de séquence. Les

réactions de séquence sont effectuées avec le kit BigDye Terminator v1.1. Cycle sequencing

kit (AppliedBiosystems) dans un volume final contenant 4 µL de SRR (réactif contenant

l’enzyme, les dNTP et les ddNTP), 2 µL de TP5x (tampon) et 0,32 µL d’amorce 27f, 1100r

ou 705r (tableau 19) à 10 pmol.l-1. Le volume d’ADN est ajouté de telle façon à avoir une

concentration de 5 ng.µl-1. De l’eau purifiée stérile est ajoutée éventuellement pour compléter

le volume final à 20 µl.

Les étapes des réactions de séquence sont les suivantes : dénaturation initiale à 96 °C pendant

1 min puis 24 fois le cycle suivant : 96 °C pendant 10 s (dénaturation), 50 °C pendant 5 s

(hybridation) et 60 °C pendant 4 min (élongation).

- Purification

Les fragments d’ADN sont ensuite purifiés de la façon suivante afin d’éliminer les

didésoxynucléotides marqués non incorporés :

L’ADN est précipité dans un mélange contenant 50 µl d’éthanol absolu et 2 µl d’acétate de

sodium (3 M) pendant 45 min puis centrifugé pendant 20 min à la vitesse maximale afin

d’obtenir un culot d’ADN. Le surnageant est soigneusement pipeté puis 150 µl d’éthanol

(70 %) est ajouté pour purifier l’ADN. Après centrifugation à vitesse maximale pendant 5 min,

le surnageant est éliminé et les tubes mis à sécher à l’obscurité pour éviter toute dégradation

de l’ADN par les UV.


réductrices


139

- Dénaturation

20 µl de formamide est ensuite ajouté à l’ADN afin d’être dénaturé à 96 °C pendant 2 min et

avant passage au séquenceur.

- Séquençage et identification des bactéries

Le séquençage est réalisé sur un séquenceur capillaire (310 Genetic Analyser, Applied

Biosystems) dont le principe est le suivant : les brins d’ADN sont séparés dans le capillaire

contenant un électrolyte. La migration des fragments d’ADN se met en place grâce à

l’application d’un champ électrique et les fragments sont séparés en fonction de leur charge

ionique. Les fragments séparés sont ensuite détectés par spectrométrie UV. Les résultats sont

obtenus grâce au logiciel DNA Sequencing Analysis Software, version 3.7. Les séquences

obtenues pour chaque amorce sont alors assemblées afin d’obtenir la séquence complète grâce

aux logiciels Chromas et Seaview. La séquence complète est alignée avec les bases de

séquences RDP (Ribosomal Database Project, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) afin de

rechercher le microorganisme présentant la séquence la plus proche et donc l’identité la plus

probable de l’espèce en présence.


réductrices


140


III.1. Evolution de la densité microbienne au cours de l’incubation

Dans les sédiments de la Marne, le pic de densité microbienne a été atteint après 24 h

d’incubation avec 3,5.108 CFU.g-1 de sédiments secs puis la densité a diminué pour se

stabiliser autour 106 CFU.g-1 de sédiments secs après 3 semaines d’incubation (figure 18a).

Dans les sédiments de la Seine, la densité microbienne a atteint également un pic après 24 h

d’incubation à 108 CFU.g-1 de sédiments secs. Contrairement à l’évolution de densité dans les

sédiments de la Marne, la densité microbienne a diminué le 3ème jour mais a ré-augmenté

après le 5ème jour pour atteindre de nouveau la valeur maximale (figure 18b).

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

1,E+08

1,E+09

0 1 3 5 7 14 21 28

Temps (jours)

CFU

.g-1

séd

imen

ts s

ecs

a) Marne

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

1,E+08

1,E+09

0 1 3 5 7 14 21 28

Temps (jours)

CFU

.g-1

séd

imen

ts s

ecs

b) Seine

Figure 18 : Evolution de la densité microbienne au cours des incubations des sédiments de Marne et de

Seine avec 0,5 % de glucose

La densité s’est ensuite stabilisée la 1ère et 2ème semaine pour finalement décroître à 8.105

CFU.g-1 de sédiments secs en fin d’incubation. Bien que les sédiments étudiés aient une

structure et des propriétés physico-chimiques différentes, l’évolution de la densité

microbienne suit globalement le même profil dans les deux incubations. Le pic observé après

24 h d’incubation montre que les communautés microbiennes se sont rapidement adaptées aux


réductrices


141

conditions de culture et leur croissance a été dopée par la présence de glucose qui est une

source de carbone facilement accessible et dégradable.

III.2. Evolution de la capacité métabolique

L’utilisation des plaques Biolog permet d’étudier la capacité métabolique des bactéries c’est-

à-dire leur aptitude à dégrader diverses sources de carbone. Une éventuelle modification de

cette capacité métabolique pourrait indiquer une modification de l’équipement enzymatique

au niveau d’une même communauté ou une modification dans la communauté elle-même. Les

sources de carbone de la plaque Biolog sont classées par famille (AES, Biolog). Pour notre

étude, nous ne nous intéresserons qu’ à l’évolution de la capacité de dégration des hydrates de

carbone et en particulier du glucose ainsi qu’à celle des acides organiques.

Dans les sédiments de la Marne, la capacité à dégrader les hydrates de carbone diminue après

une semaine d’incubation pour augmenter ensuite (figure 19a). Il en est de même pour les

acides organiques puisqu’après 1 semaine d’incubation, les microorganismes ne sont plus

capables de dégrader qu’environ 4 % des acides organiques présents. Cependant, cette

capacité augmente de nouveau en fin d’incubation. S’il l’on s’intéresse plus particulièrement

à la dégradation du glucose et des acides organiques produits par fermentation dans les

incubations (acétique, lactique, butyrique et propionique), on observe une corrélation entre la

capacité de dégradation de ces substrats (résultats des Biolog) et leur évolution au cours de

l’incubation (figure 20a, tableau 20). Ainsi, avant incubation, les puits correspondants à ces

substrats sont positifs donc dégradés. Après une semaine d’incubation, les bactéries ne sont

plus capables de dégrader le glucose mais cette aptitude apparaît de nouveau après 2 semaines

d’incubation. Il en est de même pour l’acide lactique. Puisque les bactéries ont dégradé le

glucose en 4 jours d’incubation, on peut supposer qu’elles sont aussi capables de dégrader

l’acide lactique pendant ces 4 jours et qu’elles perdent leur capacité à dégrader le glucose et

l’acide lactique entre le 4ème et le 7ème jour. Les communautés microbiennes sont donc

capables de dégrader l’acide lactique ce qui explique la disparition observée après 4 jours

d’incubation. A l’inverse, les bactéries ne peuvent pas dégrader les acides acétique, butyrique

et propionique pendant toute la durée de l’incubation. Une augmentation de la concentration

en solution de ces acides a effectivement été observée.

Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-réductrices


142

Pourcentage de familles de C dégradées en fonction du temps d'incubation (en semaine) - Marne

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Polysaccharides Amines Hydrates decarbone

Acidesorganiques

Acides aminés Autres

Sources de carbone

Pour

cent

age t0

t1t2t3t4

a) Marne

Pourcentage de familles de C dégradées en fonction du temps d'incubation (en semaine) - Seine

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Polysaccharides Amines Hydrates decarbone

Acidesorganiques

Acides aminés Autres

Sources de carbone

Pour

cent

age t0

t1t2t3t4

b) Seine

Figure 19 : Evolution de la dégradation des sources de carbones dans les sédiments de la Marne (a) et de la Seine (b)

au cours de l’incubation (glucose 0,5 %)



143

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Temps (jours)

Con

cent

ratio

n (m

g.L

-1)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Conc

entr

atio

n de

glu

cose

et d

'aci

de

buty

rique

(mg.

L-1

)

Acide acétique Acide propioniqueAcide lactique Acide butyriqueGlucose

a)Marne

0

50

100

150

200

250

300

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Temps (jours)

Con

cent

ratio

n (m

g.L

-1)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Con

cent

ratio

n de

glu

cose

et d

'aci

de

buty

rique

(mg.

L-1

)

Acide acétique Acide propioniqueAcide butyrique Glucose

b) Seine Figure 20 : Evolution de la concentration en glucose et acides organiques dans les incubations des sédiments de la Marne et de la Seine (0,5 % de glucose)

Tableau 20 : Capacité des microorganismes des sédiments de la Marne et de la Seine à dégrader le glucose et les acides organiques au cours du temps

Marne Seine Sources de carbone ( N° de puits de la plaque Biolog)

Temps (semaine) Temps (semaine) 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Glucose (B10) + - + + + + + + + + Acide acétique (E2) + - - - - + - - - - Acide butyrique (E6) + - - - - - - - - - Acide lactique (E11) + - + + + + + + + - Acide propionique (F4) + - - - + + - - - -


réductrices


144

De même que pour la Marne, nous avons étudié la capacité des bactéries de la Seine à

dégrader le glucose et les acides organiques produits par fermentation (figure 20b, tableau 20).

D’une manière générale, la communauté microbienne des sédiments de la Seine dégrade

beaucoup moins de sources de carbone que celle des sédiments de la Marne et ceci quel que

soit le type de substrat carboné (figure 19b), alors que les quantités de bactéries anaérobies

cultivables sont du même ordre.

Les bactéries peuvent dégrader le glucose pendant toute la durée de l’incubation. Les acides

butyrique et propionique sont dégradés avant incubation mais ne le sont plus pendant

l’incubation. Ceci explique donc que leurs concentrations aient augmenté. L’acide acétique

n’est dégradé qu’avant incubation. Cependant, au cours de l’incubation, nous observons une

diminution de la concentration en acide acétique entre le 1er et le 3ème jour d’incubation puis à

nouveau une augmentation. On peut donc supposer que des bactéries ont été capables de

dégrader l’acide acétique en début d’incubation puis ont disparu ou ont adopté une autre voie

métabolique après 1 semaine d’incubation. Enfin, les bactéries sont capables de dégrader

l’acide lactique tout au long de l’incubation. C’est pourquoi il n’a pas été détecté en solution

lors des incubations alors qu’il s’agit d’un produit de fermentation très commun.

Pour les deux types de sédiments, les capacités métaboliques des communautés microbiennes

sont différentes avant l’incubation. En effet, la plupart des sources de carbone sont dégradées

alors qu’elles ne le sont plus après une semaine d’incubation. Une modification de la capacité

métabolique dans les deux sédiments s’est donc produite au cours de la 1ère semaine. L’ajout

de glucose a pu favoriser le développement de bactéries de type fermentaire inhibant les

bactéries dont le métabolisme était de type respiration anaérobie, c’est-à-dire oxydant les

acides organiques, par exemple. L’augmentation du pourcentage d’acides organiques

dégradés en fin d’incubation montre qu’après 4 semaines, les microorganismes utilisent à

nouveau la voie de la respiration anaérobie alors que la voie de la fermentation était

privilégiée en début d’incubation.

Par ailleurs, si l’on étudie les pourcentages de sources de carbones oxydées, on observe des

différences entre les deux sédiments, ce qui laisse penser que les communautés microbiennes

sont différentes.


réductrices


145

La modification de la capacité métabolique au cours de l’incubation peut être due soit à une

modification de la population microbienne soit à une modification des voies métaboliques de

ces mêmes communautés. Afin de connaître lequel de ces processus s’est produit dans les

incubations, nous avons étudié l’évolution de la diversité microbienne.

III.3. Evolution de la diversité microbienne

Nous avons comparé les empreintes des bandes d’ADN observées en DGGE en fonction du

temps d’incubation. Chaque bande d’ADN a été numérotée (figure 21). Pour les deux

sédiments, on observe une très grande variation avant et après une semaine d’incubation, ce

qui confirme le fait que la modification de la capacité métabolique est très probablement due à

un changement de communautés. En particulier, de nombreuses bandes d’ADN apparaissent

ou s’intensifient. Ces bandes peuvent donc correspondre à l’apparition de microorganismes de

types bactéries fermentatrices qu’il n’y avait pas ou peu avant l’incubation et qui se sont

développés suite à l’ajout de glucose. Après une semaine d’incubation, on remarque, pour les

deux sédiments, que les empreintes d’ADN ne varient plus ce qui laissent supposer que la

diversité génétique des communautés microbiennes n’a pas varié. Aussi, les changements de

capacité métabolique observés en fin d’incubation et en absence de glucose seraient-ils

probablement dus à une modification des voies métaboliques plutôt qu’à des modifications de

communautés.


réductrices


146

1

2

3

456

7

8

10 111213

15

16

17

1 1 11

22

33

3 44

44

5 5

55

66 6

7778

88

9 910

1010

10

111111 11

1212

1212 1313

131314

14 1414

16

1717 17

1

2

3

456

7

8

10 111213

15

16

17

1 1 11

22

33

3 44

44

5 5

55

66 6

7778

88

9 910

1010

10

111111 11

1212

1212 1313

131314

14 1414

16

1717 17

t0 t1 t2 t3 t4

1

2

3

456

7

8

10 111213

15

16

17

1 1 11

22

33

3 44

44

5 5

55

66 6

7778

88

9 910

1010

10

111111 11

1212

1212 1313

131314

14 1414

16

1717 17

1

2

3

456

7

8

10 111213

15

16

17

1 1 11

22

33

3 44

44

5 5

55

66 6

7778

88

9 910

1010

10

111111 11

1212

1212 1313

131314

14 1414

16

1717 17

t0 t1 t2 t3 t4

a) Marne


réductrices


147

t1 t2 t3 t4

11

2 2 22

3 3 33

4 4 4

5 5 5 5

66 6 6

7

8 8 8 89 9 9 9

10 10 10

11

12 12 1213 13 13

14 14 141516 16

11

2 2 22

3 3 33

4 4 4

5 5 5 5

66 6 6

7

8 8 8 89 9 9 9

10 10 10

11

12 12 1213 13 13

14 14 141516 16

t1 t2 t3 t4

11

2 2 22

3 3 33

4 4 4

5 5 5 5

66 6 6

7

8 8 8 89 9 9 9

10 10 10

11

12 12 1213 13 13

14 14 141516 16

11

2 2 22

3 3 33

4 4 4

5 5 5 5

66 6 6

7

8 8 8 89 9 9 9

10 10 10

11

12 12 1213 13 13

14 14 141516 16

b)Seine (remarque : le profil a t0 n’a pas été représenté car inexploitable) Figure 21 : Evolution des profils DGGE au cours de l’incubation (en semaine) des sédiments de Marne (a)

et de Seine (b)


réductrices


148

Afin de déterminer la contribution des différentes voies anaérobies dans la dégradation de la

matière organique, nous avons étudié l’importance des accepteurs d’électrons présents. En

effet, pour oxyder la matière organique en conditions anaérobies, les bactéries utilisent les

accepteurs d’électrons présents dans un ordre bien établi qui dépend de l’apport énergétique

fournit par la réduction de chaque oxydant. Les processus suivant peuvent ainsi se succéder :

dénitrification, réduction du Fe, réduction des sulfates puis méthanogénèse (Reeburgh, 1983).

Jones (1985) estime que la décomposition de la matière organique en système aquatique

résulte de la respiration aérobie (45 %), la méthanogénèse (25 %), la dénitrification (20 %),

des processus de fermentation (7 %), de la réduction des sulfates (2 %) et enfin de la

réduction du fer (1 %).

Nous nous sommes donc intéressés à l’évolution des sulfates et du fer au cours des

incubations, ceci afin de souligner l’importance des bactéries ferri-réductrices dans les

sédiments.

III.4. Importance du fer dans la décomposition de la matière

organique dans les sédiments

III.4.1. Sulfato-réduction

La vitesse de diminution des sulfates est très lente au cours de l’incubation des deux

sédiments (figure 22). De plus, la concentration initiale en sulfates était faible dès le début de

l’incubation dans les deux sédiments (5 mg.l-1). Par conséquent, l’utilisation des sulfates

comme accepteur terminal d’électrons est une voie très minoritaire dans les sédiments. Ceci

d’autant plus que l’utilisation des sulfates intervient après celle des nitrates, du manganèse et

du fer (Reeburgh, 1983). Cependant, bien que la réduction des sulfates soit faible, les sulfures

produits pourraient néanmoins réagir avec les métaux dissous pour former des sulfures

métalliques.


réductrices


149

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25Temps (jours)

Con

cent

ratio

n (m

g.l-1

)

Sulfate-MarneSulfates-Seine

Figure 22 : Evolution des sulfates dans les incubations de la Marne (a) et de la Seine (b)

III.4.2. Réduction du fer

On constate une dissolution croissante du fer dans les sédiments de la Marne au cours de

l’incubation jusqu’à 1600 µg.g-1 de sédiments secs (figure 23). Dans les sédiments de la Seine,

le fer est rapidement dissout durant les 4 premiers jours d’incubation puis se stabilise à partir

du 5ème jour et jusqu’à la fin de l’incubation avec environ 600 µg.g-1 de sédiments secs de fer

désorbé. Le potentiel d’oxydo-réduction étant d’environ -300 mV, une simulation sur Visual

Minteq nous indique qu’environ 99 % du fer est sous forme de Fe(II) donc quasiment réduit

en totalité.


réductrices


150

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 2 4 6 8 10 12

Temps (jours)

Tene

urs

déso

rbée

s (µ

g.g

-1 s

édim

ents

sec

s)

Fe-MarneFe-Seine

Figure 23 : Evolution des teneurs en Fe désorbé (µg.g-1 sédiments secs) dans les sédiments de la Seine et de

la Marne

Dans nos sédiments, le fer est donc l’accepteur d’électrons majoritaire lors de la dégradation

de la matière organique.

III.5. Estimation des populations microbiennes majoritaires

Dans ce volet, nous avons donc tenté d’estimer par le calcul, la biomasse formée et impliquée

dans les principales réactions cataboliques identifiées, de façon à mettre en évidence

l’importance de certaines voies métaboliques et qui pourraient jouer dans la mobilité des

métaux. Un intérêt particulier a été donné à la réduction du fer.

Pour ce faire, nous nous sommes basés sur le modèle proposé par (Dassonville et al., 2004a;

Dassonville et al., 2004b). Ce modèle prend en compte six communautés microbiennes

fonctionnelles classées en fonction de leur activité catabolique : les bactéries dénitrifiantes, les

ferri-réductrices, deux communautés fermentatrices produisant soit de l’acétate et de l’éthanol

ou du butyrate, les bactéries acétogènes et les sulfato-réductrices. Ce modèle permet

d’estimer la biomasse microbienne en fonction de l’énergie produite (ATP) par mole de

substrat consommé et de la biomasse produite par mole d’ATP produite selon l’équation :


réductrices


151

Bm = ([S].Vw.YATP.Ybm/ms) . eN

avec

Bm = biomasse estimée (g.kg-1 de sol ou sédiment)

[S] = quantité de substrat consommé par m3 de solution,

Vw = volume de la solution (m3),

YATP = ATP par mole de substrat consommé (mole ATP.mol-1 de substrat)

Ybm = biomasse produite par mole d’ATP produite (g de biomasse.mol-1 d’ATP)

ms = masse de sol ou sédiments (kg)

eN = 50 ou 100 % si l’on considère la dépense en énergie pour la fixation de l’azote par les

microorganismes.

Pour utiliser ce modèle, les données obtenues après 2 jours d’incubation ont été utilisées car

nous avions toutes les données disponibles en glucose, acide acétique, butyrique, sulfate et fer

(tableau 21). Par ailleurs, après deux jours d’incubation, la dégradation du glucose atteint une

vitesse maximale, ce qui nous permet de mieux évaluer les voies fermentaires ainsi que les

principaux accepteurs d’électrons.

Tableau 21 : Concentrations en glucose, sulfates, fer dissous, acide butyrique et acétique (en mg.l-1)

utilisées pour modéliser l’importance des communautés microbiennes

Temps (jours)

Glucose Sulfates Fe Acide butyrique Acide acétique

0 5533 5,7 0 0 0 Marne 2 2210 3,4 59 130 222 0 5777 3,5 0 0 0 Seine 2 1515 2,4 29 864 120

Etant donnée l’évolution faible des nitrates au cours du temps dans les sédiments de la Marne,

nous avons choisi de ne pas les inclure dans le modèle.

Ce modèle nous a permis d’estimer la biomasse maximale de chacune des six communautés

microbiennes au cours de l’incubation. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 22.



152

Tableau 22 : Estimation de la biomasse des différentes communautés microbiennes fonctionnelles dans les sédiments de la Marne et de la Seine

Voie métabolique ATP par mole de substrat consommé Biomasse par mole d'ATP produite Ybm (g biomasse par mole d'ATP consommée)

Substrat consommé S (mol.m-3)

Biomasse estimée (50% d'efficacité) g.kg-1 de sédiment

Biomasse estimée (100% d'efficacité) g.kg-1 de sédiment

Réduction du Fe(III) 4 (Lovley, 1995) 6,5 1,06 0,10 0,21 Fermentation acétique 3 (Pelmont, 1993) 12 3,70 0,50 1,00 Fermentation butyrique 3 (Pelmont, 1993) 12 1,48 0,20 0,40

Marne

Réduction des sulfates 0,5 (Widdel, 1988) 6,5 0,02 2,92E-04 5,84E-04

Réduction du Fe(III) 4 (Lovley, 1995) 6,5 0,52 5,07E-02 1,01E-01 Fermentation acétique 3 (Pelmont, 1993) 12 2,00 0,27 0,54 Fermentation butyrique 3 (Pelmont, 1993) 12 9,77 1,32 2,64

Seine

Réduction des sulfates 0,5 (Widdel, 1988) 6,5 0,01 1,40E-04 2,79E-04

(Widdel, 1988; Pelmont, 1993; Lovley, 1995)


réductrices


153

Dans les sédiments de la Marne, après deux jours d’incubation et au cours de la fermentation

du glucose, les bactéries fermentant le glucose en acide acétique et butyrique sont majoritaires.

La fermentation acétique prédomine sur la fermentation butyrique si l’on considère la quantité

de biomasse formée. Les bactéries ferri-réductrices sont prépondérantes devant les bactéries

sulfato-réductrices. L’accepteur d’électrons au cours de la fermentation du glucose est donc

majoritairement le fer devant les sulfates.

Dans les sédiments de la Seine, les résultats sont similaires. Les bactéries fermentatrices de

glucose prédominent, ce qui confirme les suppositions que nous avions émises dans le sous-

chapitre précédent. Cependant, contrairement aux sédiments de la Marne, les bactéries

fermentant le glucose en acide butyrique sont majoritaires. La biomasse réduisant le fer est

plus faible dans les sédiments de la Seine que de la Marne après 2 jours d’incubation, ce qui

résulte des concentrations en fer dissous plus faibles dans les essais avec les sédiments de la

Seine (figure 23) ; les communautés ferri-réductrices semblent donc moins nombreuses dans

les sédiments de la Marne. Une autre explication serait également que les teneurs en fer et la

nature des oxydes de fer sont différentes dans les deux sédiments, les oxydes de fer amorphes

étant plus facilement réduits par les bactéries ferri-réductrices que les oxydes de fer

cristallisés. La biomasse réduisant les sulfates est très faible (1,4.10-4 g.kg-1 de sédiment) : les

sulfates jouent donc un rôle très faible comme accepteurs d’électrons lors de l’oxydation de la

matière organique.

Contrairement à ce qui est rapporté dans la littérature (Jones, 1985), l’oxydation du glucose

résulte très peu de la dénitrification et de la réduction des sulfates dans les sédiments. Au

contraire, il semble que dans notre cas, la fermentation du glucose avec réduction du fer

prédomine. La fermentation du glucose serait donc couplée à la réduction dissimilatrice des

oxydes de fer par les bactéries ferri-réductrice selon le modèle (Lovley, 1991):

Substrat fermentable (glucose) → ne- + nH+ + produits de fermentation (acide butyrique,

acétique…)

e- + Fe(OH)3 + 3H+ → Fe2+ + 3 H2O


réductrices


154

Dans les sédiments, la fermentation du glucose entraîne la formation des acides acétique et

butyrique que les bactéries présentes sont peu capables de dégrader, d’après les résultats

obtenus lors de l’analyse de la capacité métabolique.

Tous ces résultats semblent souligner l’importance et la prédominance des bactéries ferri-

réductrices dans les incubations. C’est pourquoi, nous avons tenté de les isoler et de les

identifier.

III.6. Identification des bactéries ferri-réductrices

Sur l’ensemble des bactéries ayant poussé et s’étant avérées comme ferri-réductrices, 48

bactéries ont été isolées et identifiées. 72 % de ces 48 bactéries ferri-réductrices appartiennent

à l’espèce Clostridium butyricum (97-99 % de probabilité), 16 % à l’espèce Paenibacillus

polymyxa (96-98 % de probabilité), 4 % à l’espèce Bacillus thurigiensis, cereus ou anthracis

(97-99 % de probabilité) et 2 % à l’espèce Bacillus subtilis (94 % de probabilité).

Dans les sédiments de la Seine, peu de bactéries ferri-réductrices ont poussé contrairement

aux sédiments de la Marne. Néanmoins, les expérimentations entreprises ont montré que les

quelques colonies ayant pu être identifiées appartenaient toutes à l’espèce Clostridium

butyricum.

Les performances ferri-réductrices de Clostridium butyricum ont été décrites dans la

littérature (Lovley, 1991 ; Bousserrhine, 1995). Il s’agit d’une bactérie hétérotrophe dont le

métabolisme est de type fermentaire avec réduction dissimilatrice du fer (Bousserrhine, 1995 ;

Munch et Ottow, 1983). On la rencontre dans la plupart des milieux environnementaux tels

que les sédiments de rivières (Lovley et Phillips, 1986) ou les sols ferralitiques (Bousserrhine,

1995). Cette espèce présente la propriété de réduire plus facilement les oxydes de fer

amorphes que cristallins (Munch et Ottow, 1980).

Les propriétés ferri-réductrices de Paenibacillus polymyxa ont été décrites pour la première

fois par Roberts (1947). Il s’agit d’une bactérie présente dans les sols et sédiments. En

présence de fer, P. polymyxa oxyde plus de glucose qu’en son absence (Roberts, 1947). De

même que pour C. butyricum, P. polymyxa réduit préférentiellement les oxydes de fer

amorphes (Ehrlich, 1990) lorsque le glucose joue le rôle de donneur d’électrons.


réductrices


155

Bacillus cereus et Bacillus subtilis ont été décrites comme ferri-réductrices et isolées dans des

sols glaiseux (Ottow et Glathe, 1971). Cependant ces bactéries sont plus connues pour leur

réduction des nitrates que du fer (Ottow et Glathe, 1971; Nakano et Zuber, 1998). Aussi, leur

activité ferri-réductrice dans les sédiments est-elle sans doute limitée par rapport aux activités

ferri-réductrices de C. butyricum et P. polymyxa.


réductrices


156


Le premier chapitre de cette étude a montré une solubilisation des éléments métalliques au

cours de l’incubation des sédiments de la Marne et de la Seine en présence de glucose. En

particulier, la dissolution du fer semble être corrélée à celle d’autres éléments traces

métalliques. Parallèlement, les microorganismes fermentent le glucose avec la production

d’acides organiques. Nous avons alors supposé que la dissolution des ETM était

probablement liée à la présence de bactéries ferri-réductrices qui, lors de la fermentation du

glucose, réduisaient les oxydes de fer, ceux-ci jouant le rôle d’accepteur terminal d’électrons.

La réduction de ces oxydes entraînait donc la dissolution des ETM y étant adsorbés.

L’objectif de ce deuxième chapitre était donc d’étudier plus précisément les communautés

microbiennes présentes dans les sédiments au cours de l’incubation, de façon à montrer que

les bactéries réalisant la fermentation avec réduction dissimilatrice du fer étaient majoritaires

ainsi que de les identifier. Nous avons donc étudié très précisément leur métabolisme et les

avons caractérisés d’un point de vue génétique.

L’étude métabolique et génétique a révélé une modification de population lors de la première

semaine d’incubation, très probablement liée à l’ajout de glucose. La diversité génétique des

communautés microbiennes semble ensuite n’avoir pas varié durant les 4 semaines

d’incubation. Au cours de la première semaine d’incubation, les microorganismes ont oxydé

le glucose par voie fermentaire mais ont été incapables d’oxyder les acides organiques

produits par fermentation, en particulier les acides acétique et butyrique. Après 4 semaines,

d’incubation, les microorganismes ont été à nouveau capables d’oxyder ces acides organiques

en mettant en place la respiration anaérobie.

L’analyse des sulfates au cours de l’incubation a montré que la sulfato-réduction était un

processus minoritaire dans les sédiments. Par conséquent, les sulfates ne sont pas utilisés

comme accepteurs terminaux d’électrons.

Inversement, les teneurs désorbées en fer sont très importantes et le fer est pratiquement sous

forme réduite. Le fer est donc bien utilisé comme accepteur terminal d’électrons lors de la

fermentation du glucose. Ces résultats ont également la présence de bactéries ferri-réductrices.


réductrices


157

Les bactéries ferri-réductrices identifiées dans les sédiments de la Marne sont majoritairement

Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa, bactéries connues pour fermenter la

matière organique, et en particulier le glucose, avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer,

en particulier les oxydes de fer amorphes.

Il est intéressant de noter que malgré le fait que les sédiments soient complètement différents

d’un point de vue physico-chimique, les phénomènes observés aux niveaux cataboliques et

génétiques sont similaires.

Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa sont les principales bactéries impliquées

dans la fermentation du glucose et la réduction des oxydes. Lors des incubations, nous avons

observé une diminution du pH et la production d’acides organiques. Il nous faut à présent

savoir si la mobilité des ETM est liée à un contact direct entre bactéries et oxydes de fer ou si

l’acidification du milieu et la présence des oxydes organiques suffisent à entraîner une

dissolution des ETM.

Partie 2 : Comparaison des mécanismes chimiques et microbiologiques dans la mobilité des ETM

158

Partie 2 : Comparaison des mécanismes microbiologiques et

chimiques dans la mobilité des éléments traces métalliques

Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM

159

Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des

éléments traces métalliques


Introduction

160

I. Introduction

Les travaux réalisés dans le chapitre précédent ont mis en évidence une mobilité des éléments

traces métalliques et du fer dans les sédiments de Seine et de Marne, liée à la présence de

bactéries fermentatrices réduisant les oxydes de fer. En particulier, nous avons mis en

évidence la présence de deux bactéries ferri-réductrices majoritaires, Clostridium butyricum et

Paenibacillus polymyxa. Ce processus de réduction bactérienne a déjà été décrit dans la

littérature comme étant un mécanisme microbiologique clé dans les sols en conditions

anaérobie (Lovley, 1987; Lovley et Phillips, 1988; Coates et al., 1998; Chen et al., 2003).

L’objectif de ce chapitre est d’étudier précisément l’impact de l’une de ces bactéries ferri-

réductrices, Paenibacillus polymyxa, sur la mobilité des éléments métalliques. Nous nous

sommes intéressés à son métabolisme ainsi qu’aux différentes fractions du sédiment porteuses

d’éléments métalliques concernées par son action solubilisatrice. En particulier, nous avons

cherché à savoir si l’attaque des différentes phases porteuses de métaux se faisait

simultanément ou bien par étape. En effet, la plupart des études portant sur l’impact des

bactéries sur la mobilité des métaux dans les sédiments s’intéresse uniquement à la répartition

des éléments métalliques avant et après incubation (Chartier et al., 2001) mais ne se focalise

pas sur l’aspect cinétique. Or, il se peut que les oxydes de fer soient réduits après la

dissolution de la fraction échangeable ou carbonatée, par exemple.

De plus, la littérature rapporte que les bactéries ferri-réductrices réduisent plus facilement les

oxydes de fer amorphes que cristallisés (Munch et Ottow, 1980 ; Rajot, 1992 ; Bousserrhine,

1995). Nous avons également donc cherché à mettre en évidence l’impact de P. polymyxa sur

les différents types d’oxydes de fer.

Afin d’atteindre nos objectifs, des sédiments stériles ont été incubés dans un milieu de culture

et ensemencés avec P. polymyxa.



161


II.1. Caractéristiques des sédiments étudiés

Les sédiments étudiés sont ceux de la Marne, prélevés en mai 2006 au même endroit qu’en

novembre 2005, à Méry-sur-Marne. Les caractéristiques physico-chimiques et les teneurs

totales en métaux sont assez proches de celles des sédiments prélevés en novembre 2005

(tableaux 23 et 24). Les sédiments de la Seine n’ont pas été étudiés car les échantillons

prélevés en mai 2006 à Andrésy présentaient des caractéristiques complètement différentes de

celles prélevées en novembre 2005. En particulier, si les sédiments présentaient une texture de

sable grossier en novembre 2005, les sédiments de mai 2006 étaient majoritairement

constitués de feuilles et autres matières organiques grossières. Aussi, pour des raisons de

comparaison avec les expériences effectuées précédemment, nous sommes-nous attachés à ne

travailler que sur les sédiments de la Marne. Tableau 23 : Caractéristiques physico-chimiques des sédiments de Marne (mai 2006)

Paramètres Marne (mai 2006) Méthode Physiques Granulométrie (g.kg-1) NF X 31-107 Argile (<2 µm) 203 Limons fins (2/20 µm) 194 Limons grossiers (20/50 µm) 206 Sable fin (50/200 µm) 310 Sable grossier (200/2000 µm) 60 Chimiques pH 8.1 NF ISO 10390 Carbone organique (g.kg-1) 24 C/N 11.2 Matière organique (g.kg-1) 41.5


CEC (cmol+.kg-1) 9.91 NF X 31-130

Tableau 24 : Teneurs en métaux totaux (µg.g-1 de sédiments secs) dans les sédiments de la Marne

(mai 2006)

Ag Al Cd Co Cr Cu Fe Mn Ni Pb Sr Zn Moyenne 0.54 5272 0.68 5.1 32 26 11700 325 15 15 100 68 Ecart-type 0.20 3252 0.41 0.6 2 3 950 43 1 1 88 10

II.2. Incubation des sédiments

II.2.1. Stérilisation des sédiments

Avant d’être incubés avec P. polymyxa les sédiments ont été stérilisés par autoclavage selon la

méthode suivante :



162

- 40 g de sédiments humides sont autoclavés à 120 °C pendant 20 min dans un flacon

sérum de 500 ml,

- après refroidissement, le flacon est dégazé à l’azote,

- le flacon est mis à incuber à 28 °C pendant 24 h afin de faire pousser les germes qui

auraient résisté à l’autoclave,

- après 24 h, le CO2 est à nouveau mesuré. Si la concentration en CO2 n’est pas nulle,

les sédiments sont autoclavés à nouveau et les étapes 2 à 4 sont ré-effectuées.

Afin de stériliser totalement les sédiments, trois cycles d’autoclavage ont été nécessaires.

II.2.2. Préparation de l’inoculum et ensemencement de Paenibacillus

polymyxa

L’ensemencement de P.polymyxa est réalisé avec une suspension bactérienne de 107

cellules.ml-1 de milieu de culture, concentration habituellement utilisée pour permettre une

bonne adaptation et donc une bonne croissance dans le milieu. La suspension bactérienne a

été préparée dans de l’eau physiologique et calibrée après dénombrement microscopique sur

cellule de Malassez.

II.2.3. Incubation

L’incubation de 40 g de sédiments stériles avec 300 ml de milieu de culture (0,5 % de glucose

+ 0,15 g.l-1 de levure) est réalisée dans des flacons sérums. L’expérimentation démarre avec

l’ajout des bactéries ferri-réductrices. Après dégazage à l’azote, les flacons sont incubés à 28

°C pendant 10 jours. Les incubations sont réalisées en triplicat.

Des blancs en triplicat contenant le sédiment mais sans ajout de bactéries ont été incubés dans

les mêmes conditions que les sédiments ensemencés.

II.3. Suivi de la croissance microbienne

La croissance microbienne a été suivie en analysant le CO2 ainsi que le métabolisme carboné

(glucose, acides organiques, pH). Les méthodes d’analyse des paramètres suivis ont été

décrites précédemment (chapitre 1, matériels et méthodes). Par ailleurs, après incubation,

nous avons vérifié que les souches de bactéries étaient restées pures en les isolant, en les

purifiant puis en les identifiant par des techniques moléculaires, selon les méthodes de culture

et de séquençage des bactéries ferri-réductrices décrites précédemment (chapitre 2, matériels

et méthodes).



163

II.4. Suivi de la mobilité des éléments métalliques

Au cours de l’incubation, les métaux dissous ont été analysés suivant le protocole décrit dans

le chapitre 1, matériels et méthodes.

Nous avons également réalisé une extraction séquentielle afin de savoir quel type d’oxydes de

fer (amorphe ou cristallin) ont été attaqués, en mettant en oeuvre trois méthodes d’extraction

séquentielle (Kostka et Luther III, 1994; Arunachalam et al., 1996; Krasnodebska-Ostrega et

al., 2001). L’objectif de cette extraction est de savoir si P. polymyxa s’attaque

préférentiellement à un type d’oxyde de fer. Différents auteurs ont en effet rapporté des

attaques différentielles des oxydes amorphes ou cristallisés par les bactéries ferri-réductrices

(Munch et Ottow, 1980 ; Rajot, 1992 ; Bousserrhine, 1995).

- Discussion du choix du protocole d’extraction :

Les protocoles d’extractions séquentielles ont toujours fait l’objet de nombreuses polémiques

quant à leur spécifité d’attaque et les réadsorptions possibles de métaux (Xiao-Quan et Bin,

1993; Li et al., 2001; Baeyens et al., 2003). En particulier, les réactifs utilisés ne s’attaquent

pas vraiment à une fraction minéralogique spécifique (ex : oxyde de manganèse ou oxydes de

fer) mais à l’ensemble des fractions minéralogiques réagissant à des conditions physico-

chimiques (ex : baisse du pH ou conditions oxydantes ou réductrices). C’est pourquoi, dans de

nombreux protocoles, sont indiquées phase échangeable, acido-soluble, réductible, oxydable

et résiduelle. Etant donné notre objectif, nous avons choisi d’employer un protocole utilisant

des réactifs permettant de distinguer les fractions minéralogiques correspondant aux phases

réductibles, c’est-à-dire les oxydes de manganèse, les oxydes de fer amorphes et cristallisés.

Dans leur protocole permettant de distinguer oxydes de fer amorphes et réductibles, Kostka et

Luther III (1994) ont montré que l’utilisation du dithionite attaquait entièrement les oxydes de

Fe (III) cristallisés et que l’ascorbate s’attaquait uniquement aux oxydes de fer amorphes alors

que les autres réactifs couramment utilisés tels que l’oxalate détruisait les deux types

d’oxydes. Par ailleurs, Krasnodebska-Ostrega et al (2001) ont montré que l’augmentation de

la concentration en hydroxylamine acidifiée n’avait pas d’influence sur le taux d’oxydes de

manganèse dissous. Cependant, une augmentation de la durée de contact pouvait commencer

à dissoudre les oxydes de fer. Les conditions optimales pour dissoudre les oxydes de

manganèse étaient donc d’utiliser de l’hydroxylamine (0,05 M) acidifiée avec de l’acide

nitrique à pH 2 et en contact avec le sédiment pendant 30 min, ce qui permettait de solubiliser



164

entre 70 et 80 % des oxydes de Mn. Dans le protocole d’Arunchalam et al (1996), l’acétate

d’ammonium est dilué 100 fois par rapport aux protocoles habituellement utilisés (Kersten et

Förstner, 1987; Chester et al., 1988). Arunchalam et al (1996) ont constaté que de diluer 100

fois l’acétate d’ammonium entraînait une diminution de 2 à 16 fois, les concentrations en

métaux échangeables. Nous avons donc conservé la concentration habituellement utilisée qui

est de 1 mol.l-1.

Dans notre étude, l’extraction séquentielle a été réalisée sur 400 mg de sédiments humides

avec un volume de réactif de 20 ml pour chaque étape. Toutes les étapes ont été réalisées sous

flux d’azote dans une boîte à gants afin de préserver les conditions anaérobies et éviter toute

réoxydation. De plus, tous les réactifs ont été préalablement dégazés à l’azote. A la fin de

chaque étape, les tubes de réaction ont été centrifugés à 20000 tours par min pendant 10 min,

puis le surnageant a été récupéré, filtré à 0,45 µm et acidifié avant analyse par ICP-AES et

ICP-MS.

Le protocole de chaque phase analysée est résumé dans le tableau 25.

Tableau 25 : Résumé des différentes étapes de l’extraction séquentielle (oxydes de Fe amorphes/cristallins)

Phase Réactif Protocole

Echangeable Acétate d’ammonium (1 M), pH 7 Agitation à 200 tr.min-1 sur table d’agitation pendant 1 h

« Carbonatée » ou phase acido-soluble

Acide acétique (0,1 M), pH 3,5 Idem

« Oxydes de manganèse » ou phase réductible 1

Chlorure d’hydroxylamine (0,05 M), pH 2

Idem pendant 30 min

« Oxydes de fer amorphe » (selon méthode de Ferdelman) ou phase réductible 2

10 g de citrate de sodium, 10 g de bicarbonate de sodium dans 200 ml d’eau ultrapure. Après dégazage, ajout de 4 g d’acide ascorbique

Agitation à 125 tr.min-1 pendant 24 h

« Oxydes de fer cristallin » ou phase réductible 3

0,5 g de dithionite de sodium Chauffage à 60 °C pendant 4 h avec agitation à 125 tr.min-1

« Matières organiques/sulfures » ou phase organique

1) 6 ml de H2O2 (30 %) + 20 ml de HNO3 (65 %). 2) Après refroidissement, 10 ml d’acétate d’ammonium (1 M), pH 7

1) Chauffage à 90 °C pendant 1h30 avec agitation de temps en temps puis refroidissement à température ambiante 2) idem 1)

« Résiduelle » (terme opérationnel puisqu’il reste encore quelques particules de sédiments après traitement)

1) 6 ml d’HNO3(65 %) 2) idem 1) 3) après refroidissement, ajout de 6 ml d’eau ultrapure

1) chauffage à 90 °C pendant 1h30 2) idem 1)



165


III.1. Métabolisme de Paenibacillus polymyxa

Les résultats obtenus montrent que le glucose introduit à 5 g.l-1 est totalement consommé par

Paenibacillus polymyxa en 6 jours (figure 24). Cette consommation s’accompagne de la

production d’acides lactique, acétique et succinique. Les variations des concentrations des

acides lactique et succinique sont similaires avec une très forte augmentation durant les 2

premiers jours, atteignant un maximum de 43 et 32 mgC, respectivement. Puis entre le 3ème et

le 6ème jour d’incubation, les quantités d’acides présents diminuent fortement pour se

stabiliser à partir du 6ème jour à 10 et 8 mgC, respectivement. L’acide acétique est produit en

moindre quantité par rapport aux acides précédents avec une quantité maximale de C de 11mg

qui est atteinte après 4 jours d’incubation. Une stabilisation est ensuite observée. On remarque

que la quantité totale de carbone inorganique (CO2 + H2CO3 + HCO3-) produit est très forte et

augmente régulièrement au cours de l’incubation pour se stabiliser vers la fin à 365 mg. Dans

les blancs, nous n’avons observé qu’une très faible augmentation du dioxyde de carbone (0,35

µgC) et aucune production d’acides organiques.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Temps (jours)

m C

(mg)

0

100

200

300

400

500

600

m C

gluc

ose

(mg)

Cinorg acide lactique Acide acétique Acide succinique Glucose

Figure 24 : Consommation de glucose et production d’acides organiques au cours de l’incubation de

P.polymyxa (barres d’erreur = écart-types des 3 réplicats)



166

Le bilan de carbone au cours de l’incubation est résumé dans le tableau 26. Tableau 26 : Masse de C produite (mg) ou disparue pendant l’incubation de P. polymyxa

Temps (jours)

Cinorg glucose lactique acétique succinique Total (Cinorg + Cacides)

0 0 510 0 0 0 0 1 34 333 24,32 3,04 3,49 64 2 65 171 43,19 6,89 31,98 146 3 252 103 36,67 8,32 27,96 324 4 341 8 27,25 10,89 17,70 395 6 360 3 13,45 10 8,29 391 8 360 0 10,89 8,92 8,14 388

Le glucose est transformé majoritairement en métabolites organiques comme les acides

lactique, acétique et succinique mais des alcools sont aussi très probablement formés, ainsi

qu’une augmentation de la masse microbienne. En effet, en mettant en culture des souches de

P. polymyxa dans un milieu contenant du glucose, Marwoto et al. (2004) ont montré une

transformation du glucose en (R,R)-2,3-butanediol, d’éthanol, d’acétate, d’acétoine, de lactate,

formate, succinate, CO2 et de masse microbienne (tableau 27). Les acides obtenus dans notre

incubation correspondent donc bien à ceux normalement produits par cette bactérie. De plus,

la faible quantité d’acide acétique produite est également retrouvée dans leur étude puisque

après ajout de 36 g.l-1 de glucose, 1,8 g.l-1 d’acide lactique et 2,36 g.l-1 d’acide succinique ont

été produits contre 0,12 g.l-1 d’acide acétique. Dans les incubations, après ajout de 5 g.l-1 de

glucose, P. polymyxa a produit environ 0,45 g.l-1 d’acide lactique, 0,300 g.l-1 d’acide

succinique et 0,140 g.l-1 d’acide acétique.

Tableau 27 : Comparaison des bilans en carbone obtenus après consommation du glucose par P. polymyxa

Concentration (g.l-1) (Marwoto et al, 2004)

Notre étude (g.l-1)

Glucose introduit 36 5 Glucose consommé 32,4 5 (R-R)-2,3-butanediol 9,09 Ethanol 5,70 Acide acétique 0,12 0,14 Acétoïne 3 Acide lactique 1,80 0,45 Acide formique 2,25 Acide succinique 2,36 0,30 H2 0,15 CO2 8,39 1,25 Biomasse formée 1,8

Parallèlement, une acidification du milieu se produit durant les trois premiers jours, le pH

passant de 8,1 à 6,0 en 3 jours puis le pH remonte pour se stabiliser à 6,3 à partir du 6ème jour



167

(figure 25). Dans les blancs, le pH est resté relativement stable avec une valeur de 7,5 en fin

d’incubation.

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Temps (jours)

pH

Figure 25 : Evolution du pH au cours de l’incubation en présence de P. polymyxa (barres d’erreur = écart-

types des 3 réplicats)

La chute de pH observée dans les incubations est due à la fermentation du glucose et

notamment à la production des acides organiques. En effet, dans une autre étude, des cultures

de P. polymyxa en milieu Bromfield liquide enrichi en glucose et sans carbonate de calcium

ont conduit à une chute du pH dans le milieu de 7 à 4,5 (Lefebvre-Drouet et Rousseau, 1995).

Dans les incubations, une partie de la quantité de protons produite est neutralisée par la

capacité tampon du sédiment ce qui permet au pH de remonter et de se maintenir à une valeur

stable en fin d’incubation.

Les caractéristiques physico-chimiques des blancs n’ayant pas varié pendant l’incubation,

nous déduisons que les résultats obtenus sont uniquement dus à l’activité de P. polymyxa. La

vérification de la pureté des souches après incubation, par culture et par voie moléculaire, a

confirmé qu’il s’agissait bien de souches de P. polymyxa.



168

III.2. Mobilité des éléments métalliques au cours de l’incubation

III.2.1. Eléments métalliques dissous

Les éléments métalliques dissous peuvent être classés en trois groupes. Le 1er groupe

comprend les éléments dont les teneurs extraites en solution sont les plus importantes, c’est-à-

dire le fer, le manganèse et le strontium et que nous appellerons Eléments Métalliques

Majeurs (EMM) (figure 26). Le 2ème groupe rassemble les ETM dont les teneurs extraites en

solution sont plus faibles et qui augmentent au cours de l’incubation, soit le cobalt, le chrome,

le nickel et le plomb (figure 27). Enfin, le 3ème groupe comprend les ETM dont les teneurs

extraites évoluent faiblement ou peu (figure 28).

En présence de P. polymyxa, les quantités de fer et de manganèse extraites sont importantes

durant les 4 premiers jours et atteignent environ 400 µg.g-1 de sédiments secs et 60 µg.g-1 de

sédiments secs, respectivement (figure 26) On remarque néanmoins une légère baisse du Fe et

Mn en solution en fin d’incubation, qui pourrait être due à une précipitation, notamment sous

forme de sulfures (Fakih, 2004). La vitesse de solubilisation du strontium est plus faible mais

les teneurs extraites se stabilisent également au bout du 4ème jour d’incubation. Les teneurs

extraites dans les blancs en Fe, Mn et Sr sont très faibles comparées à celles extraites dans les

incubations avec respectivement 1,97 ± 0,41, 2,32 ± 0,64 et 1,59 ± 0,24 µg.g-1 de sédiments

secs après 8 jours d’incubation.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 2 4 6 8 10

Temps (jours)

Tene

urs

extr

aite

s (µ

g.g-

1 de

séd

imen

ts

secs

)

0

100

200

300

400

500

600

Tene

urs

extra

ites

en F

e (µ

g.g-

1 de

sé

dim

ents

sec

s)

MnSrFe

Figure 26 : Dissolution du Fe, Mn et Sr au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres d’erreur =

écart-types des 3 réplicats)



169

Le nickel et le cobalt sont les deux éléments du second groupe dont les vitesses de

solubilisation sont les plus importantes (figure 27). Les teneurs extraites en cobalt se

stabilisent après 4 jours d’incubation à 0,35 µg.g-1 de sédiments secs pour légèrement

diminuer en fin d’incubation ; le nickel se stabilise après 6 jours à 0,37 µg.g-1 de sédiments

secs. Les teneurs extraites en Cr et Pb sont beaucoup plus faibles avec un maximum de 0,05

µg.g-1 de sédiments secs atteint après 4 jours d’incubation pour ces deux éléments. On

remarque une remontée significative du chrome à 0,9 µg.g-1 de sédiments secs en fin

d’incubation dans les trois réplicats. Les teneurs extraites dans les blancs après 8 jours

d’incubation pour le Co, Cr, Ni et Pb sont respectivement de 0,025 ± 0,002 ; 0,064 ± 0,001 ;

0,20 ± 0,01 et 0,019 ± 0,003 µg.g-1 de sédiments secs. On remarque que les teneurs en Cr

extraites sont proches de celles obtenues lors de l’extraction avec P. polymyxa.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 2 4 6 8 10

Temps (jours)

Tene

urs

extra

ites

(µg.

g-1

de s

édim

ents

sec

s)

CoCrNiPb

Figure 27 : Dissolution du Co, Cr, Ni et Pb au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres d’erreur =




170

Les teneurs extraites en Ag et Cu diminuent au cours de l’incubation et celles du Cd restent

stables. Cependant, les écarts-types étant importants, il est difficile d’interpréter les variations

de teneurs extraites de ces ETM au cours de l’incubation. De plus, les teneurs extraites dans

les blancs en Ag, Cd et Cu après 8 jours d’incubation sont respectivement de 0,001 ± 0,001 ;

(3,12 ± 0,56).10-4 et 0,15 ± 0,03 µg.g-1 de sédiments secs. Ces teneurs sont proches de celles

obtenues au cours de l’incubation avec P. polyxmya et nous pouvons supposer que celle-ci

n’aura qu’une très faible influence sur la dissolution de ces ETM.

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0 2 4 6 8 10

Temps (jours)

Tene

urs

extra

ites

(µg.

g-1

de s

édim

ents

se

cs)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Tene

urs

extr

aite

s en

Cu

(µg.

g-1

de

sédi

men

ts s

ecs)

AgCdCu

Figure 28 : Dissolution de l’Ag, Cd et Cu au cours de l’incubation avec P. polyxmyxa (barres d’erreur =


Nous pouvons constater une diminution de certains métaux dissous en fin d’incubation

notamment pour le Fe, le Mn et le Co. Or, nous avons pu observer une très forte production

de carbone inorganique et notamment de CO2 dissous. Aussi, les métaux ont-ils pu précipiter

sous forme de carbonates. Nous avons donc réalisé un calcul des indices de saturation (log

(produit des activités ioniques / Ks)) des minéraux métallo-carbonatés sur Visual Minteq à

partir des concentrations de métaux dissous et de carbonates à pH 6 (annexe 10).



171

Tableau 28 : Calcul des indice de saturation des minéraux métallo-carbonatés à pH 6 par Visual Minteq

Minéral Index de saturation (log)

Ag2CO3 -14 Aragonite (CaCO3) -1 Artinite (Mg2CO3(OH)2) - 3H2O -11 Azurite (Cu(OH)2, 2CuCO3) -7 CaCO3,H2O -2 Calcite (CaCO3) -1 Cerrusite (PbCO3) -2 CoCO3 -1 CuCO3 -2 Dolomite (disordered) (CaMg(CO3)2) -3 Dolomite (ordered) (CaMg(CO3)2) -2 Huntite CaMg3(CO3)4 -9 Hydrocerusite Pb3(CO3)2(OH) -8 Hydromagnesite Mg5(CO3)4(OH)2·4(H2O)

-23

Hydrozincite Zn5(CO3)2(OH)6 -15 Magnesite (MgCO3) -2 Malachite Cu2(CO3)(OH)2 -4 MgCO3, 5H2O -5 MnCO3 (am) 0 Natron Na2CO3·10H2O -11 Nesquehonite Mg(HCO3)(OH)·2(H2O) -5 NiCO3 -1 Pb10(OH)6O(CO3)6 -70 Pb2OCO3 -11 Pb3O2CO3 -20 Rhodochrosite (MnCO3) 0.4 Siderite (FeCO3) 0.9 Smithsonite (ZnCO3) -1 Strontianite (SrCO3) -2 Thermonatrite Na2CO3.H2O -13 Vaterite (CaCO3) -1 ZnCO3 -1 ZnCO3,H2O -2

Cette simulation montre une précipitation possible du Mn et du Fe sous forme carbonates

(tableau 28), ce qui peut expliquer la diminution des concentrations de ces métaux en fin

d’incubation.

Par ailleurs, nos résultats montrent que les profils d’extraction du fer sont similaires à ceux

des autres éléments métalliques étudiés (hormis les ETM du 3ème groupe). Quel que soit

l’élément considéré, les vitesses d’extraction sont maximales durant les 4 premiers jours

d’incubation correspondant à la phase de croissance exponentielle de P. polymyxa. Les profils

de solubilisation des EMM et ETM sont liés au profil de consommation du glucose, c’est-à-



172

dire que lorsque le glucose est totalement consommé, l’extraction des éléments métalliques

atteint un palier maximal quand la consommation du glucose est maximale (figure 24).

P.polymyxa est une bactérie connue pour son activité fermentaire avec réduction

dissimilatrice du fer (Robert, 1947). En réduisant les oxydes de fer, celle-ci peut donc

contribuer à la solubilisation des ETM y étant adsorbés.

Nous avons donc tenté d’estimer la part des éléments métalliques dissous provenant des

oxydes de fer, en essayant de savoir si P. polymyxa réduisait préférentiellement les oxydes de

fer amorphes et/ou cristallisés.

III.2.2. Attaque des différentes fractions du sédiment

Le tableau 29 regroupe les teneurs en éléments métalliques dans les différentes fractions du

sédiment avant incubation. Les extractions séquentielles ont été réalisées sur trois échantillons

de sédiment.



173

Tableau 29 : Teneurs des éléments métalliques dans les différentes fractions du sédiment avant incubation (µg.g-1 de sédiments secs)

(3 réplicats ont été extraits séparément)

Phases Réplicats Fe Mn Sr Co Ni Cr Pb 1 0,14 4,9 1,9 0,05 0,09 0,0004 0,11 2 0,12 7,8 2,0 0,09 0,07 0,00 0,13

Echangeable

3 0,17 8,5 2,3 0,07 0,13 0,00 0,16 1 128 65 90 0,36 0,19 0,10 0,21 2 144 99 83 0,54 0,27 0,04 0,14

Acido-soluble (Carbonates)

3 241 93 84 0,55 0,42 0,47 0,13 1 93 14 18 0,11 0,02 0,05 0,02 2 61 25 31 0,07 0,02 0,05 0,01

Réductible 1 (oxydes de manganèse) 3 102 23 28 0,09 0,02 0,05 0,01

1 377 8,7 11 0,25 0,02 1,26 0,62 2 892 18 13 0,60 0,02 1,71 0,92

Réductible 2 (oxydes de fer amorphes) 3 930 16 14 0,49 0,02 1,56 0,82

1 3001 18 3,0 0,99 0,02 3,36 2,55 2 6854 71 58 1,01 2,65 6,86 0,11

Réductible 3 (oxydes de fer cristallisés) 3 17367 40 18 1,40 2,00 5,26 3,98

1 22 3,33 6,0 0,20 0,76 2,97 2,05 2 17 2,20 10 0,04 0,17 4,56 0,03

Oxydable (Matière organique/ Sulfures)

3 28 4,47 1,9 0,36 1,35 1,38 1,59

1 855 2,47 0,72 0,26 0,79 1,93 2,19 2 2645 15 3,5 1,3 3,63 4,85 10,5

« Résiduelle »

3 2045 5,03 1,1 0,54 1,44 3,07 4,01



174

Le fer est principalement présent dans les fractions réductibles 2 et 3 qui correspondent

majoritairement aux oxydes de fer amorphes et cristallisés ainsi que sur la fraction résiduelle.

Le manganèse se trouve sous forme la forme acido-soluble et en particulier sous forme de

carbonates, ce qui concorde avec les formes décrites dans la littérature (Stumm et Morgan,

1996). On le retrouve également dans les phases réductibles (oxydes de manganèse et de fer).

On remarque que le strontium est présent sur les mêmes phases que le manganèse et dans des

teneurs similaires à celles du manganèse.

Certains ETM, tels que le Ni, Cr et Pb, présentent de très faibles teneurs dans les phases

échangeable, carbonates et réductible 1 et des teneurs un peu plus fortes dans les phases

réductibles 2 et 3, correspondant majoritairement aux oxydes de Fe amorphes et cristallisés.

On remarque que les triplicats ne sont pas toujours répétables. Le fer est l’élément qui

présente la plus forte variation entre les triplicats : les teneurs dans la phase réductible,

correspondant majoritairement aux oxydes de fer amorphes, varient de 377 à 930 µg.g-1 de

sédiments secs, celles correspondant majoritairement aux oxydes de fer cristallisés de 3000 à

17367 µg.g-1 de sédiments secs et dans la fraction résiduelle de 855 à 2645 µg.g-1 de

sédiments secs. Pour les autres éléments métalliques, la variation entre réplicats est

importante sur la phase oxydable (matière organique/sulfures) et la phase résiduelle. Cette

variation peut s’expliquer par le fait que les sédiments n’ont été ni séchés ni broyés ni

homogénéisés avant incubation afin de préserver les conditions anaérobies et de ne pas

modifier la répartition des éléments métalliques dans les fractions du sédiment. Cette méthode

présente l’inconvénient de ne pas avoir un sédiment homogène. Par conséquent, certaines

zones du sédiment seront plus ou moins riches en éléments métalliques.

III.2.3. Provenance des éléments métalliques solubilisés

III.2.3.1. Approche qualitative

Afin d’estimer de quelle phase provenaient les éléments métalliques solubilisés, nous avons

utilisé le fer comme élément de référence et avons procédé de la façon suivante. Pour chaque

élément métallique étudié, nous avons tracé les teneurs extraites en solution du métal en

fonction des teneurs extraites en solution en Fe au cours de l’incubation, ceci afin de vérifier

que la dissolution du métal était bien corrélée à celle du fer.

Puis, nous avons placé sur le même graphique, les teneurs du métal en fonction de celles du

fer dans chacune des phases du sédiment avant incubation. Les phases étudiées (échangeable,



175

carbonates, phases réductibles 1, 2 et 3 (oxydes de Mn et oxydes de Fe amorphes et

cristallisés) sont celles susceptibles d’être attaquées lors de la croissance de P. polymyxa. Ceci

nous permet donc de tirer des conclusions quant à la provenance de l’élément métallique en

solution : en effet, si les points d’une phase du sédiment sont proches de la droite de

régression des ETM dissous et si la quantité extraite est inférieure à celle déterminée dans

cette phase avant incubation (tableau 29), l’élément métallique dissous provient alors

probablement de cette phase.

Les teneurs en Mn dissous sont très fortement corrélées à celles du Fe (R²>0,96) et ceci dans

les 3 réplicats (figure 29). On remarque que ces rapports sont proches de ceux observés dans

les carbonates et les oxydes de Mn. En tenant compte des teneurs extraites maximales en Mn

et des teneurs sur les carbonates, entre 60 et 70 % du Mn pourrait provenir des « carbonates »,

en fin d’incubation. Les rapports dans les phases réductibles (oxydes de fer amorphes et

cristallisés) sont très éloignés de ceux des teneurs solubilisées, ce qui signifie que la part de

Mn provenant des « oxydes de fer » est faible.



176

y1 = 0,19x + 7,96R2 = 0,96

y2 = 0,13x + 6,44R2 = 0,99

y3 = 0,12x + 6,36R2 = 0,98

0,0000

10,0000

20,0000

30,0000

40,0000

50,0000

60,0000

70,0000

80,0000

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)

Tene

urs

en M

n (µ

g.g-

1 de

séd

imen

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 1)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)

Zoom du graphique ci-dessous

0,0000

20,0000

40,0000

60,0000

80,0000

100,0000

120,0000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000


Tene

urs

en M

n (µ

g.g-

1 de

séd

imen

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3

Figure 29 : Teneurs en Mn en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes phases du

sédiment (dans les 3 réplicats)



177

Les teneurs en Sr dissous sont fortement corrélées (r² = 0,92 et r² = 0,98 pour deux réplicats) à

celles du Fe dissous (figure 30). Bien que le Sr soit majoritairement fixé sur les « carbonates »,

le Sr en solution semble provenir en majorité des « oxydes de manganèse » (50 % de cette

phase) et de la phase réductible « oxydes de fer amorphes » (90 % de cette phase). En effet,

les fractions « carbonates » et « oxydes de Mn » portent des quantités de Sr importantes et

pourraient donc être la source des quantités mobilisées lors des expériences. Cependant, étant

données les quantités de Fe mobilisées simultanément, il est probable que les fractions

« oxydes de fer amorphes » jouent un rôle important comme source de Sr mobilisable.

y3 = 0,03x + 1,63R2 = 0,98

y2 = 0,03x + 1,86R2 = 0,98

y1 = 0,04x + 2,57R2 = 0,92

0,0000

10,0000

20,0000

30,0000

40,0000

50,0000

60,0000

70,0000

80,0000

90,0000

100,0000

0 500 1000 1500


Tene

urs

en S

r (µg

.g-1

de

sédi

men

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1 echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 3)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 1)


0,0000

10,0000

20,0000

30,0000

40,0000

50,0000

60,0000

70,0000

80,0000

90,0000

100,0000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000


Tene

urs

en S

r (µg

.g-1

de

sédi

men

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3

Figure 30 : Teneurs en Sr en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes phases du

sédiment (dans les 3 réplicats)



178

Les teneurs en Co dissous sont fortement corrélées (r² = 0,97 et r² = 0,98 pour deux réplicats)

à celles du Fe extrait (figure 31). Le Co en solution semble provenir des phases réductibles

« oxydes de manganèse » et « oxydes de Fe amorphes ». Il est probable que la désorption du

Co provient d’abord d’une attaque des carbonates (50 %) due à l’acidification du milieu puis

d’une attaque des oxydes de Fe amorphes par réduction bactérienne des oxydes de fer (60 %).

y3 = 0,0007x + 0,0181R2 = 0,989

y2 = 0,0008x + 0,0282R2 = 0,9762

y1 = 0,0011x + 0,0298R2 = 0,936

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000


Tene

urs

en C

o (µ

g.g-

1 de

séd

imen

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 3)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 1)


0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000


Tene

urs

en C

o (µ

g.g-

1 de

séd

imen

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3

Figure 31 : Teneurs en Co en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases

du sédiment (dans les 3 réplicats)

Les teneurs en Ni extrait sont fortement corrélées (r² = 0,64 et r²>0,83 pour deux réplicats) à

celles du Fe extrait (figure 32). Le nickel en solution semble provenir majoritairement des

« carbonates », ce qui concorde avec les teneurs déterminées lors des extractions séquentielles



179

où le nickel est majoritairement fixé sur la fraction « carbonatée ». Cependant, une partie non

négligeable semble aussi provenir des oxydes de fer cristallisé.

y2 = 0,0005x + 0,094R2 = 0,64

y3 = 0,0005x + 0,113R2 = 0,83

y1 = 0,0009x + 0,103R2 = 0,89

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,3500

0,4000

0,4500

0,5000

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000


Tene

urs

en N

i (µg

.g-1

de

sédi

men

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1 Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)Linéaire (extrait - 1)


0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000


Tene

urs

en N

i (µg

.g-1

de

sédi

men

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés avant 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3

Figure 32 : Teneurs en Ni en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases


Les teneurs en Pb extrait sont également très fortement corrélées aux teneurs en Fe extrait

(figure 33), en particulier pour 2 réplicats (r²>0,92). De plus, ces deux éléments semblent

provenir de la phase réductible « oxydes de Mn ». Or, si l’on se réfère au tableau 29, on

constate qu’il n’y a quasiment pas de plomb dans cette phase (0,01 – 0,02 µg.g-1 de sédiments

secs). Le plomb est en effet majoritairement fixé sur les phases réductibles « oxydes de fer



180

amorphes » et « oxydes de fer cristallisés ». Puisque le fer est également fixé majoritairement

sur ces phases réductibles, il est donc probable qu’une partie du plomb extrait provienne de

ces phases.

y1 = 0,0002x + 0,0167R2 = 0,923

y2 = 6E-05x + 0,0157R2 = 0,9699

y3 = 8E-05x + 0,0175R2 = 0,7939

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500


Tene

urs

en P

b (µ

g.g-

1 de

séd

imen

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1 echangeable 2echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 1)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)


0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

3,5000

4,0000

4,5000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000


Tene

urs

en P

b (µ

g.g-

1 de

séd

imen

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3

Figure 33 : Teneurs en Pb en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases


Les teneurs en Cr extrait en solution ne sont pas corrélées à celles du Fe extrait en solution en

début d’incubation (figure 34). Néanmoins, après 2 jours d’incubation, une corrélation entre

ces deux éléments apparaît. Le Cr dissous semble provenir en majorité de la phase acido-

soluble « carbonates » et de la phase réductible « oxydes de Mn ». Or, le chrome est

majoritairement présent dans les phases réductibles « oxydes de fer amorphes et cristallisés ».

Une partie non négligeable en solution provient donc de ces phases.



181

y1 = 0,0002x - 0,004R2 = 0,83

y2 = 0,0002x - 0,005R2 = 0,86

y3 = 0,0001x - 0,006R2 = 0,79

-0,0200

0,0000

0,0200

0,0400

0,0600

0,0800

0,1000

0 100 200 300 400 500 600


Tene

urs

en C

r (µg

.g-1

de

sédi

men

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 1)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)


0,0000

1,0000

2,0000

3,0000

4,0000

5,0000

6,0000

7,0000

8,0000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000


Tene

urs

en C

r (µg

.g-1

de

sédi

men

ts s

ecs)

extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3

Figure 34 : Teneurs en Cr en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases


En conclusion de cette première approche, nous observons que la dissolution du Cr, Cu, Ni,

Mn et Sr est fortement corrélée à celle du fer, comme nous le supposions.

L’étude qualitative, en fonction des phases attaquées, montre que les rapports métal/Fe

extraits en solution sont proches de ceux de la phase acido-soluble « carbonates » et de la

phase réductible « oxydes de Mn ». Or, la phase réductible « oxydes de Mn » n’est pas

forcément celle sur laquelle sont fixés les métaux en majorité (tableau 30). De plus, nous

avons vu que le Cr et le Pb pouvaient difficilement provenir de la phase acido-soluble



182

« carbonate » et de la phase réductible « oxydes de manganèse » puisque les teneurs dans ces

phases sont très faibles. En effet, ces ETM sont majoritairement situés sur les phases

réductibles « oxydes de fer amorphes » et « oxydes de fer cristallisés ». Cette approche

qualitative présente donc des limites.

Tableau 30 : Phases majoritaires et pourcentage de phase attaquée des différents éléments métalliques au

cours de l’incubation (estimation qualitative)

Métal Phases attaquées Pourcentage de phase attaquée Mn Carbonates 60-70 % Sr Oxydes de Mn

Phase réductible « oxydes de fer amorphe » 50 % 90 %

Co Carbonates Phase réductible « oxydes de fer amorphe »

50 % 60 %

Ni Carbonates 90 % Pb Phases réductibles « oxydes de fer amorphes » et

« oxydes de fer cristallisés » ?

Cr Phases réductibles « oxydes de fer amorphes » et « oxydes de fer cristallisés »

?

Nous avons alors quantifié la part de chacune des phases impliquée dans les teneurs en

éléments métalliques dissous pour chaque point cinétique de l’incubation. Le but recherché

est d’estimer plus précisément dans quelle proportion les fractions sont solubilisées et si elles

sont attaquées successivement ou non au cours de l’incubation.

III.2.3.2. Approche quantitative

Les pourcentages de chaque fraction participant aux teneurs dissoutes en éléments métalliques

pour chaque point cinétique de l’incubation ont été calculés à partir de l’équation suivante :

Mi = jj *ϕ∑j

im

avec φj = fraction de la phase j solubilisée et mij = teneurs en éléments métalliques dans cette

phase (µg.g-1 de sédiments secs).

Sous une autre forme, cela revient à résoudre l’équation suivante d’inconnue vecteur B, dans

laquelle A est la matrice des compositions de chaque fraction (en µg.g-1 de sédiments secs) et

C la quantité d’ETM libérée (en µg.g-1 de sédiments secs) pour un instant donné de

l’incubation.



183

X =

La résolution de l’équation a été réalisée par optimisation à l’aide d’une fonction quadratique

des inconnues φj dont la formule est la suivante :

)( métal poids*nobservatio poids*²∑ ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

nobservationobservatioestimationMinimum

sous contrainte 0< φj <1, le logiciel R permettant de résoudre facilement ce problème de

minimisation sous contrainte.

Le poids des observations correspond à la pertinence de la teneur en métal dissoute obtenue

lors des incubations au cours du temps. La valeur du poids est comprise entre 0 et 1. Celle-ci a

été attribuée en fonction des écarts entre les triplicats (répétabilité des triplicats) et par rapport

à l’évolution au cours du temps. Si l’écart d’une mesure par rapport aux deux autres réplicats

est faible (écart-type relatif < 10 %) et si la teneur augmente par rapport aux points cinétiques

précédents, la mesure est jugée valable donc son poids est de 1. Si l’écart-type relatif est

compris entre 50 et 60 %, un poids de 0,5 est donné. Ceci permet de corriger les erreurs dues

au fait que les échantillons sont parfois assez hétérogènes entre eux. Le poids de chaque métal

a ensuite été attribué par rapport à ses teneurs solubilisées et par rapport à l’évolution au cours

du temps. Si le métal est très fortement solubilisé et augmente au cours du temps, son poids

est de 1. Si le métal est très faiblement solubilisé et/ou sa teneur alterne entre augmentation et

diminution dans le temps, son poids est de 0.

Les poids attribués à chaque métal sont regroupés dans le tableau 31 : Tableau 31 : Poids attribué à chaque élément métallique dans le calcul des pourcentages de chaque

fraction attaquée

Pb Cu Cr Ni Co Cd Sr Mn Fe Poids 0 0 0 1 1 0 1 1 1

BVecteur 838281

...

...030201

5%.........1%

ttt

ttt

PhasePhase

−−−

−−−

CVecteur ...83

8281

.......

0302

...01...

ttt

ttt

FeCuPb

−−−

−−−

MatriceA...5

432

...1...

PhasePhasePhasePhasePhase

FeCuPb



184

Les poids attribués à chaque mesure observée sont regroupés dans le tableau 32. Seuls sont

indiqués les poids des mesures observées pour les métaux auxquels ont été attribués un poids

de 1. Tableau 32 : Poids attribué à chacune des mesures observées au cours de l’incubation

Ni Co Sr Mn Fe 1-t0 1 1 1 1 1 2-t0 1 1 1 1 1 3-t0 1 1 1 1 1 1-t1 1 1 1 1 0,5 2-t1 1 1 1 1 1 3-t1 1 1 1 1 1 1-t1' 0,2 1 1 1 0,5 2-t1' 0,5 1 1 1 1 3-t1' 0,5 1 1 1 1 1-t2 1 1 1 1 0,5 2-t2 1 1 1 1 1 3-t2 1 1 1 1 1 1-t3 1 1 1 1 0,5 2-t3 1 1 1 1 1 3-t3 1 1 1 1 1 1-t4 1 1 1 1 0,5 2-t4 0,5 1 1 1 1 3-t4 1 1 1 1 1 1-t6 1 1 1 1 0,5 2-t6 1 1 1 1 1 3-t6 1 1 1 1 1 1-t8 1 1 1 1 0,5 2-t8 1 1 1 1 1 3-t8 1 1 1 1 1 4-t0 1 1 1 1 1 5-t0 1 1 1 1 1 6-t0 1 1 1 1 0,5 4-t8 1 1 1 1 1 5-t8 1 1 1 1 1 6-t8 1 1 1 1 0,5

Après résolution de l’équation, nous obtenons une matrice nous indiquant la fraction de

chaque phase solubilisée ainsi que la teneur dissoute de chaque EMM et ETM recalculée pour

chaque point cinétique d’incubation et pour chaque réplicat.

La phase 1 correspond à la fraction échangeable, la phase 2 à la fraction acido-soluble

« carbonatée », la phase 3 aux « oxydes de manganèse », la phase 4 aux « oxydes de fer

amorphes » et la phase 5 aux « oxydes de fer cristallisés ».

Pour bien identifier le rôle des incertitudes sur la matrice A, nous avons réalisé les tests avec

chacun des réplicats des extractions séquentielles effectuées avant incubation.



185

Les résultats obtenus pour chaque triplicat sont pratiquement semblables ce qui montre que

malgré les écarts de teneurs de métaux entre les triplicats d’extraction séquentielle, des

conclusions peuvent néanmoins être tirées. Nous ne présenterons ici que les résultats liés au

1er réplicat d’extraction séquentielle ; pour les deux autres réplicats, le même type de

raisonnement et de conclusions peuvent être tenus.

Nous avons testé 3 modèles différents en regroupant ou non les différentes phases. En effet,

nous avons constaté des rapports semblables Sr/Mn dans les phases 2 et 3, ce qui semble

étonnant. Nous avons donc décidé de regrouper ces deux phases dans l’un des modèles. Ainsi,

le 1er modèle simule la dissolution des éléments métalliques pour chacune des 5 phases

séparées, dans le 2ème modèle, les phases 2 et 3 ont été regroupées et dans le 3ème modèle, les

phases 3 et 4 ont été regroupées.

Les résultats du modèle 1 sont les suivants :

La figure 35 nous montre que très rapidement, la fraction échangeable (phase 1) est dissoute

en solution et ceci pour les 3 réplicats de flacons incubés avec P. polymyxa. Les ETM dissous

en solution proviennent donc majoritairement de la fraction échangeable au tout début de

l’incubation. A partir du 2ème jour, on observe une augmentation de la dissolution des

« oxydes de fer amorphes » (fraction 4) et ceci jusqu’au 4ème jour puis une diminution. On

peut donc supposer que les « oxydes de fer amorphes » commencent à être réduits et donc à

participer à l’augmentation des teneurs en métaux dissous après 2 jours d’incubation, ce qui

correspond à l’activité maximale de P. polymyxa. En effet, celle-ci est en pleine croissance à

cette période de l’incubation, au regard de la cinétique de consommation de glucose (figure

24). On remarque une diminution du taux de dissolution des oxydes de fer amorphes en fin

d’incubation et ceci pour les 3 flacons d’incubation. Par ailleurs, nous avons remarqué une

légère diminution des teneurs en Fe, Mn et Co. On peut supposer qu’une précipitation de ces

éléments métalliques se produit et notamment une réadsorption voire une substitution par le

Co et le Mn sur les oxydes de fer amorphes. Or, Bousserrhine (1995) a montré que la

substitution de goethite en Mn et Co ralentissait la réduction de ces oxydes par les bactéries

ferri-réductrices. Ceci pourrait donc expliquer le fait qu’en fin d’incubation les « oxydes de

fer amorphes » soient moins attaqués.



186

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Temps (jours)

Taux

de

diss

olut

ion

phase1phase2phase3phase4phase5

Figure 35 : Evolution du taux de dissolution des fractions du sédiment au cours de l’incubation

On constate une faible dissolution de la phase acido-soluble « carbonates » (phase 2) alors

que le pH de la solution diminue jusqu’à 6 et que les résultats de l’analyse qualitative

montraient une dissolution importante des carbonates, notamment pour le Mn, Sr, Co et Ni.

Or, dans les extractions séquentielles, l’attaque des « carbonates » est réalisée à pH 3,5.

L’acidification du milieu n’est sans doute pas assez forte pour entraîner une dissolution

complète des carbonates. Par ailleurs, nous observons que les « oxydes de Mn » ne sont

pratiquement pas solubilisés. Or, l’analyse qualitative a montré que le Sr semblait provenir à

50 % des « oxydes de Mn ». Il est donc fortement probable que lors de l’attaque séquentielle,

l’acide acétique à pH 3,5 utilisé pour dissoudre les « carbonates » dissout aussi une partie des

oxydes de Mn. Cette hypothèse est fortement probable car il a été montré qu’un pH 5 était

suffisant pour libérer la majeure partie des métaux adsorbés sur les « oxydes de manganèse »

(Baeyens, 2003). On observe également une faible dissolution des « oxydes de fer

cristallisés ». Il est donc possible que P. polymyxa réduise plus facilement les « oxydes de fer

amorphes » que « cristallisés » comme la plupart des bactéries ferri-réductrices.

Nous avons donc réalisé le même test en additionnant les teneurs des phases 2 + 3 (carbonates

et oxydes de Mn) (modèle 2). Nous avons donc supposé que l’acide acétique à pH 3,5 avait

attaqué aussi les oxydes de Mn (figure 36).



187

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Temps (jours)

Taux

de

diss

olut

ion

phase1phase2.3phase4phase5

Figure 36 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates+oxydes de Mn, oxydes

de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de l’incubation

Les résultats obtenus lors de cette simulation des phases dissoutes sont proches de ceux

obtenus lorsque les phases acido-soluble « carbonates » et réductible « oxydes de Mn »

étaient séparées. On constate toujours la dissolution complète de la fraction échangeable après

deux jours d’incubation. De même la dissolution des « oxydes de fer amorphes » augmente

jusqu’au 4ème jour pour diminuer en fin d’incubation. Les « oxydes de fer cristallisés » sont

toujours moins dissous que les « oxydes de fer amorphes ». Nos hypothèses émises

précédemment concernant l’explication du comportement des « oxydes de fer » restent donc

valables. Les taux de dissolution des phases acido-soluble « carbonates » + phase réductible

« oxydes de fer amorphes » sont proches de ceux observés lorsque la phase « carbonates »

était dissociée de celle des « oxydes de manganèse ». On peut donc supposer que la phase des

« oxydes de manganèse » a bien été attaquée par l’acide acétique lors de l’extraction

séquentielle.

Nous avons néanmoins testé l’évolution du taux de dissolution des fractions si l’on supposait

que dans l’extraction séquentielle, l’hydroxylamine acidifiée à pH 2 n’attaquait pas les oxydes

de fer amorphes. Nous avons donc regroupé les phases 3 et 4 (« oxydes de Mn » et « oxydes

de Fe amorphes ») pour la simulation (modèle 3) Les résultats obtenus sont présentés figure

37.



188

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Temps (jours)

Taux

de

diss

olut

ion

phase1phase2phase3.4phase5

Figure 37 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates, oxydes de Mn +

oxydes de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de l’incubation

Dans ce cas, on observe une dissolution beaucoup plus faible de la phase réductible « oxydes

de fer amorphes » voire une dissolution nulle dans certains cas. Ce résultat n’est donc pas

acceptable quant à nos hypothèses émises sur la réduction des oxydes de fer par P. polymyxa.

Il est donc hautement probable que les oxydes de Mn aient été en grande partie attaqués par

l’acide acétique à pH 3,5 lors de l’attaque de la fraction « carbonatée ».

L’ensemble des résultats obtenus pour les 3 modèles est regroupé dans les tableaux 33 et 34.

Le tableau 33 présente les taux de dissolution des différentes phases au 4ème jour, c’est-à-dire

au moment où l’activité microbienne est maximale et au 8ème jour soit en fin d’incubation. Les

résultats obtenus après le 4ème jour sont difficiles à interpréter, des phénomènes de

reprécipitations, ayant probablement eu lieu. C’est pourquoi nos conclusions ne s’attacheront

qu’à tenter d’interpréter les phénomènes de solubilisation des différentes phases lorsque

l’activité microbienne est à son maximum.



189

Tableau 33 : Taux de dissolution (valeurs minimales et maximales) des différentes phases au 4ème jour et

en fin d’incubation obtenus pour les différents modèles

Taux de dissolution Modèle 1 4ème jour 8ème jour Phase 1 1 1 Phase 2 0-0,14 0,08-0,14 Phase 3 0-0,3 0 Phase 4 0,2-0,85 0,13-0,56 Phase 5 0,01-0,14 0,02-0,14 Modèle 2 4ème jour 8ème jour Phase 1 1 1 Phase 2+3 0,04-0,12 0,06-0,11 Phase 4 0,24-0,91 0,13-0,57 Phase 5 0,006-0,13 0,01-0,13 Modèle 3 4ème jour 8ème jour Phase 1 1 1 Phase 2 0-0,17 0,05-0,15 Phase 3+4 0-0,52 0-0,29 Phase 5 0,04-0,16 0,05-0,15

Le tableau 34 présente les teneurs extraites dissoutes calculées par modèle ainsi que les

teneurs extraites dosées expérimentalement.



190

Tableau 34 : Quantités d’éléments métalliques désorbés calculées par les différents modèles et observées

Quantités d’éléments métalliques désorbés calculées (µg.g-1 de sédiments secs) Quantités d’éléments métalliques désorbés observées (µg.g-1 de sédiments secs)

Modèle 1 Modèle 2 Modèle 3 4ème jour 8ème jour 4ème jour 8ème jour 4ème jour 8ème jour 4ème jour 8ème jour Fe 440 ± 107 408 ± 105 439 ± 107 407 ± 106 448 ± 106 416 ± 105 400 ± 102 371 ± 100 Mn 18 ± 1 16 ± 1 17± 1 16 ± 1 19 ± 1 17 ± 1 61 ± 3 56 ± 3 Sr 18 ± 1 16 ± 1 18 ± 1 16 ± 1 18 ± 1 15± 1 15 ± 1 13 ± 1 Ni 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,03 0,12 ± 0,01 0,12 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,25 ± 0,09 0,37 ± 0,02 Co 0,30 ± 0,03 0,26 ± 0,02 0,30 ± 0,03 0,26 ± 0,02 0,28 ± 0,03 0,24 ± 0,02 0,35 ± 0,03 0,30 ± 0,02 Cr 0,98 ± 0,24 0,75 ± 0,09 1,01 ± 0,27 0,75 ± 0,10 0,73 ± 0,20 0,56 ± 0,03 0,05 ± 0,01 0,08 ± 0,01 Pb 0,66 ± 0,08 0,57 ± 0,04 0,66 ± 0,10 0,56 ± 0,04 0,56 ± 0,08 0,50 ± 0,06 0,051 ± 0,008 0,047 ± 0,014 Cu 0,35 ± 0,17 0,39 ± 0,15 0,34 ± 0,17 0,38 ± 0,15 0,43 ± 0,16 0,45 ± 0,15 0,11 ± 0,03 0,12 ± 0,11 Cd 0,010 ± 0,001 0,010 ± 0,001 0,010 ± 0,001 0,010 ± 0,001 0,013 ± 0,001 0,012 ± 0,001 (3,86 ± 0,55).10-4 (3,76 ± 0,32).10-4



191

Le modèle retenu est donc celui pour lequel les phases acido-soluble et réductible 1

(carbonates et oxydes de Mn) ont été regroupées soit le modèle 2 car il reflète mieux les

processus chimiques et microbiologiques qui pourraient intervenir au cours de l’incubation,

notamment l’attaque de la phase acido-soluble « carbonates » et de la phase réductible

« oxydes de fer amorphes ». Si l’on compare les teneurs extraites recalculées par le modèle 2

par rapport à celles observées expérimentalement, on observe que ce modèle fonctionne

parfaitement avec le Fe et le Sr mais sous-estime les teneurs extraites en Mn (tableau 34).

Cela semble normal puisque nous avons constaté que les teneurs en Mn et Sr étaient

similaires sur chacune des phases étudiées (figure 27) bien que de sérieux doutes puissent être

émis quant à la sélectivité des réactifs utilisés. Le modèle surestime les teneurs extraites en Cr,

Pb, Cu et Cd par rapport à celles réellement analysées au cours de l’incubation. Il se pourrait

que cette surestimation soit due au fait que l’optimisation ne prend pas en compte des re-

précipitations sous forme de sulfures. Nous avons donc réalisé une simulation de la

distribution des sulfures métalliques à pH 6 à partir des concentrations totales dissoutes en

éléments métalliques analysées et des concentrations en sulfures, ainsi qu’en rentrant les

concentrations en acides organiques présents. Les sulfures n’ayant pas été analysés, nous

avons estimé leurs concentrations par rapport aux concentrations en sulfates mesurées dans le

chapitre 2. Nous avons fait l’approximation que les sulfates disparus étaient tous transformés

en sulfures (HS-), potentiellement libres et pouvant conduire à de nouvelles précipitations. Les

indices de saturation des sulfures de métaux calculés par Visual Minteq (log ((produit des

activités ioniques)/ Ks)) sont présentés dans le tableau 35 et ont été calculés en entrant les

concentrations en métaux et éléments majeurs indiquées en annexe 11.



192

Tableau 35 : Indices de saturation des sulfures métalliques à pH 6 calculé par Visual Minteq

Minéraux Indice de saturation (log)

Acanthite (Ag2S) 2 CaS -14 Chalcopyrite (CuFeS2) 23 CoS (alpha) 0,7 CoS (beta) 5 Covellite CuS 14 FeS -0,5 Galena PbS 4 Greenockite CdS 1 Mackinawite (Fe,Ni)1 + xS (où x = 0 to 0,11) 0,06 MgS -21 MnS (vert) -4 MnS (rose) -7 NiS (alpha) -1 NiS (beta) 4 NiS (gamma) 6 Spharelite (ZnS) 4 SrS -19 Wurtzite (ZnS) 2

Nous observons que l’Ag, le Cd et le Pb peuvent précipiter sous forme de sulfures puisque

leurs indices de saturation sont positifs, en particulier sous forme de Ag2S, CdS et PbS. Il en

est de même pour le cuivre dont la modélisation indique une sursaturation en covellite (CuS)

ainsi qu’en CuFeS2 avec un indice de saturation très élevé (23,9). Par ailleurs, on observe

également une précipitation de sulfure de nickel.

Les variations de teneurs extraites observées au cours de l’incubation pour les éléments du

groupe 3 (Ag, Cd et Cu) sont donc vraisemblablement dues à des phénomènes de relargage et

reprécipitation sous forme de sulfures.

Par ailleurs, on observe des variations entre réplicats du pourcentage de phase « oxydes de fer

amorphes » attaquée alors que ces variations sont moins marquées voire inexistantes pour les

autres phases. Or, les extractions séquentielles ont montré une forte variabilité du fer et des

autres métaux dans les différentes phases et en particulier dans les « oxydes de fer amorphes »

(tableau 29). On peut donc supposer que les cinétiques de dissolution des oxydes de fer

amorphes sont différentes à cause de cette inhomogénéité. En effet, des études ont montré que

l’attaque des oxydes de fer par les bactéries ferri-réductrices est différente selon la pureté des

oxydes de fer. Par exemple, le taux de goethite attaqué par Clostridium butyricum est différent

selon que la goethite est pure ou substituée ou non en métaux (Bousserrhine, 1995). Plus de



193

90 % du fer est relargué de la goethite pure après 150 h de contact. Ce taux de dissolution

descend à 40 et 15 % si la goethite est substituée avec 5 et 35 % d’aluminium. De plus, les

substitutions des oxydes de fer par les métaux conduisent à une efficacité plus ou moins

grande de la réduction des oxydes de fer par les bactéries ferri-réductrices. Ainsi, des

substitutions de la goethite par le Mn et le Co ralentissent la dissolution du fer. De même, si

une goethite est substituée en Cr, les pourcentages finaux de dissolution du fer ne dépassent

par 60 %. Dans un sol latéritique du Burundi contenant 70 % de goethite (substituée à 20 %

en Al), 10 % d’hématite (substituée à 7 % en Al) et 20 % de kaolinite, les 3 oxydes de fer

étant substitués en Cr (2 %) et présentant des phases polymétalliques Fe-Cr-Cu et Mn-Cr-Fe,

les résultats ont montré une faible solubilisation des métaux (Bousserrhine, 1995). Le taux de

réduction de la goethite n’atteint pas 17 %.

Puisque les oxydes de fer présentent des teneurs en métaux inhomogènes entre réplicats,

certaines parties des oxydes de fer seront plus ou moins rapidement réduites par les

microorganismes, suivant que les oxydes sont peu ou fortement substitués en métaux. Cette

hypothèse de substitution pourrait donc expliquer les variations de pourcentage d’attaque de

cette phase entre réplicats. Cette inhomogénéité dans la dissolution des oxydes de fer

amorphes pourrait également montrer qu’il s’agit de la phase préférentiellement attaquée par

P. polymyxa dans les incubations.

L’implication des différentes fractions dans la solubilisation des éléments métalliques se fait

donc par dissolution des phases par étape. En début d’incubation, les éléments métalliques

dissous proviennent de la fraction échangeable puis après 2 jours d’incubation, les éléments

métalliques dissous sont issus des oxydes de fer amorphes, preuve de l’activité importante de

P. polymyxa dans la réduction des oxydes de fer jusqu’au 4ème jour d’incubation, puisque

jusqu’à 95 % des oxydes de fer amorphes peut être solubilisé. Cette phase correspond à sa

période de pleine croissance puisqu’après 4 jours tout le glucose a été consommé. Malgré les

résultats de l’étude qualitative, il semble que les carbonates soient peu impliqués dans la

solubilisation des éléments métalliques, ce qui signifie que l’acidification du milieu participe

moins à la dissolution des éléments métalliques que la réduction des oxydes de fer. De même,

P. polymyxa s’attaque beaucoup moins aux oxydes de fer cristallisés qu’aux oxydes de fer

amorphes.



194


L’objectif de ce chapitre était d’étudier le métabolisme d’une des bactéries majoritaires

isolées, Paenibacillus polymyxa, et ses conséquences sur la mobilité des éléments traces

métalliques dans les sédiments.

Le métabolisme mis en place par P. polymyxa est un mécanisme de type fermentaire avec

production d’acides acétique, lactique et succinique accompagné d’une production de dioxyde

de carbone. Le glucose ajouté est consommé très rapidement, comme nous l’avions déjà

constaté dans les incubations en présence du consortium bactérien total. Nous avons

également constaté une diminution du pH jusqu’à 6. L’acidification est donc moins marquée

que dans les incubations précédentes où le pH descendait jusqu’à 5.

Parallèlement à ce métabolisme, nous avons observé une dissolution du Fe, Mn, Co, Cr, Ni,

Pb et Sr. La dissolution du Fe est corrélée à celle des autres éléments métalliques. Par

conséquent, cette dissolution est bien liée à la réduction des oxydes de fer par P. polymyxa.

Les résultats obtenus lors de l’extraction séquentielle et la modélisation effectuée, nous

montrent que la dissolution des différentes phases du sédiment participe à l’augmentation des

teneurs en éléments métalliques dissous de façon différente au cours de l’incubation. En début

d’incubation, les éléments métalliques dissous proviennent de la fraction échangeable puis on

constate une augmentation des métaux provenant des oxydes de fer amorphes. Cette

dissolution des oxydes de fer amorphes atteint son paroxysme au bout du 4ème jour, moment

où l’activité de P.polymyxa atteint son maximum. A partir du 4ème jour, le glucose a été

entièrement consommé et l’on observe une diminution de la participation des oxydes de fer

amorphes aux teneurs dissoutes en métaux. Ceci est donc lié au fait que P. polymyxa ne réduit

plus autant les oxydes de fer étant donné qu’il n’y a plus de source de carbone facilement

dégradable, c’est-à-dire de glucose. Cette diminution de la réduction peut également être due

à une substitution de certains éléments métalliques (Co, Cr et Mn) dans les oxydes de fer,

inhibant alors l’activité réductrice des bactéries (Bousserrhine, 1995).

On constate également que P. polymyxa réduit beaucoup plus les oxydes de fer amorphes que

cristallisés puisque ces derniers ne participent quasiment pas à la mobilisation d’éléments

métalliques.



195

Enfin, la modélisation montre que les carbonates ne sont que faiblement dissous au cours de

l’incubation (<10 %). Ceci laisserait donc supposer que l’acidification du milieu n’est pas

suffisante pour entraîner une mobilité des éléments métalliques et que cette dernière est

principalement due à l’activité réductrice de P. polymyxa et des bactéries ferri-réductrices en

général.

Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM

196

Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens

dans la mobilité des éléments traces métalliques


Introduction

197

I. Introduction

La fermentation de la matière organique entraîne la production de métabolites tels que des

acides organiques et une diminution du pH du milieu (Ehrlich et al., 1981; Lovley et Phillips,

1986; Lovley, 1987). L’acidification du milieu et la production d’acides organiques ont,

effectivement, été observées dans les incubations que ce soit en présence de la communauté

microbienne ou en présence de Paenibacillus polymyxa seule.

Lors de l’incubation avec P. polymyxa, nous avons observé que la majeure partie du fer et des

éléments métalliques dissous en solution provenait de la fraction échangeable et de la

réduction des oxydes de fer amorphes. Des études réalisées à l’aide de membranes à dialyse,

séparant les oxydes de fer des bactéries, ont montré que très peu de fer était solubilisé,

soulignant le faible impact des métabolites microbiens sur la réduction et la solubilisation des

oxydes (Munch et Ottow, 1983; Rajot, 1992). La réduction des oxydes de fer nécessite donc

un contact direct entre bactéries et oxydes de fer.

Cependant, il a été en effet montré que l’acidification du milieu entraînait la désorption des

ETM liés aux carbonates dans les sols et sédiments (Chen et Lin, 2001; Shanableh et Omar,

2003; Qureshi et al., 2004). Dans la rhizosphère, en milieu aérobie, des études ont rapporté

que des acides organiques tels que l’acide oxalique, malique et citrique provoquaient la

dissolution des éléments métalliques par complexation (Gyliene et Salkauskas, 1998; Jones,

1998; Glover et al., 2002).

Les objectifs de ce chapitre sont donc :

- d’étudier le rôle du pH et des acides organiques produits par les bactéries ferri-

réductrices dans la désorption du fer et des éléments métalliques, respectivement par

acidification et par complexation,

- de comparer acidification et complexation à la réduction microbienne enzymatique

dans la mobilité du fer et des éléments métalliques.



198


L’objectif de cette étude est de comparer la part du fer et des ETM dissous liée à l’activité

réductrice de P.polymyxa à celle liée à la dissolution des éléments métalliques par

complexation avec les acides organiques et par acidification du milieu.

Le principe des expérimentations est donc de mettre en contact les sédiments avec une

solution d’acide organique à différentes valeurs de pH. La capacité tampon du sédiment étant

particulièrement importante, il nous a fallu maintenir le pH à la valeur souhaitée, à l’aide d’un

pH-stat.

La partie ci-dessous décrit donc le choix et la préparation des acides organiques ainsi que le

dispositif expérimental et le pH-stat en particulier.

II.1. Choix des acides organiques

Les acides organiques étudiés ont été choisis en fonction de ceux identifiés et quantifiés dans

les incubations comprenant le consortium bactérien total et dans celles réalisées avec

Paenbacillus polymyxa. Les acides ont été préparés dans les concentrations maximales

obtenues lors des incubations, à partir de solutions commerciales de pureté supérieure à 98 %

(Sigma-Aldrich).

L’ensemble des acides organiques étudiés et leurs concentrations sont regroupés dans le

tableau 36. La deuxième colonne indique quelles bactéries produisent l’acide considéré. Par

exemple, l’acide acétique a été détecté dans les incubations avec P. polymyxa mais également

dans les incubations où l’ensemble des bactéries autochtones (consortium) était présent. Tableau 36 : Acides organiques étudiés et produits au cours des essais à partir de 5 g.l-1 de glucose

Acides organiques produits Bactéries Acide acétique (400 mg.l-1) Consortium/Paenibacillus polymyxa Acide lactique (700 mg.l-1) Consortium/Paenibacillus polymyxa Acide succinique (480 mg.l-1) Paenibacillus polymyxa Acide propionique (100 mg.l-1) Consortium Acide butyrique (1000 mg.l-1) Consortium

Afin de comparer l’effet complexant des acides organiques entre eux, une solution d’acide

oxalique (1 g.l-1) a également été préparée. En effet, l’oxalate est un excellent ligand des

cations métalliques qui tendent à former de nombreux précipités insolubles. Les constantes de

complexation de l’acide oxalique avec les métaux sont en effet très élevées (Martell et Smith,

1989). Il s’agit habituellement de ligands bidentates formant des cycles à 5 membres de type

MO2C2.



199

Après préparation à la concentration souhaitée, les acides organiques ont été ramenés à pH 7

avec une solution de NaOH (2 M) afin d’être proche du pH des sédiments et donc ne pas

entraîner une solubilisation de la fraction échangeable et carbonatée, sensible aux variations

de pH.

II.2. Dispositif expérimental

Pour chacun des acides organiques, le dispositif expérimental est le suivant : 40 g de

sédiments humides (soit 20 g de sédiments secs) de Marne (issus de la campagne de

prélèvement de mai 2006) autoclavés – afin d’être dans les mêmes conditions que dans les

incubations menées avec P. polymyxa – ont été mis en contact avec 300 ml d’acide organique.

La solution d’acide organique – sédiment est successivement ramenée aux pH suivants : 6,5 ;

6 ; 5,5 et 5. Ces pH correspondent approximativement à ceux observés au cours des

incubations de sédiments enrichis en glucose. La baisse du pH est réalisée à l’aide de micro-

ajouts d’acide nitrique Normatom à 1,5.10-2 M. à l’aide du pH-stat (785 DMP Titrino,

Metrohm) piloté à l’aide du logiciel Tiamo 1.2 (Metrohm) (figure 38). Dès que le pH a été

atteint, celui-ci est maintenu constant pendant 24 h à l’aide de micro-ajouts d’acide nitrique

pour contrer l’effet tampon du sédiment.

La solution a été dégazée continuellement sous flux d’azote afin de ne pas être en conditions

oxydantes et le bullage d'azote a permis une agitation suffisante de la solution pour

l’homogénéiser sans remettre les sédiments en suspension. En effet, si l’on veut comparer les

phénomènes liés à la mobilité des métaux, il est important de respecter au maximum les

conditions dans lesquelles ont été réalisées les expériences. En particulier, les sédiments n’ont

jamais été agités durant les incubations. C’est pourquoi, il était important de ne pas les

remettre en suspension lors des expériences avec le pH-stat.



200

Figure 38 : Dispositif expérimental du pH-stat (vue d’ensemble)

Après 24 h, 20 ml de solution a été prélevé, filtré et acidifié avant analyse des métaux par

ICP-AES et ICP-MS.

II.3. Modélisation

Afin d’étudier la spéciation des métaux dissous et la capacité de complexation des acides

organiques sur les métaux, une modélisation des espèces en solution a été réalisée aux

différents pH et avec les différents acides en utilisant le logiciel Visual Minteq

(www.lwr.kth.se/English/OurSoftware/vminteq/), qui est une version dérivée de MINTEQA2

ver 4.0, crée par l’US EPA en 1999 et dont les bases de données, notamment les constantes de

complexations entre métaux et acides organiques proviennent de NIST (National Institute of

Standards and Technology).



201


III.1. Rôle du pH dans la dissolution des ETM

Les sédiments ont été mis en contact avec de l’eau MilliQ puis le pH a été abaissé

progressivement à l’aide du pH stat aux pH 6.5, 6, 5.5 et 5. On constate que le pH présente un

faible impact sur la mobilité des métaux (figure 39). Les concentrations solubilisées sont très

faibles comparées à celles obtenues lors des incubations avec P. polymyxa. Par exemple, le

fer n’atteint ici qu’une concentration de 30 µg.l-1 au maximum à pH 6 alors que la

concentration dissoute était de 50 000 µg.l-1 dans l’incubation avec P. polymyxa.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

pH

Conc

entra

tion

(µg.

L-1

)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Conc

entra

tion

en F

e, M

n et

Sr (

µg.L

-1)

CoCrCuNiPbFeMn Sr

Figure 39 : Evolution de la concentration en métaux dissous en fonction du pH en absence de P. polymyxa

Le pH a donc un faible impact sur la mobilité des éléments métalliques. Ceci est confirmé par

le fait que les carbonates, normalement attaqués en milieu acide, ne sont que très peu dissous

(<10 %) et participent donc peu à la quantité d’éléments métalliques dissous ainsi que nous

l’avons constaté lors de la modélisation réalisée à partir des extractions séquentielles et des

teneurs désorbées dans l’incubation avec P. polymyxa.

Nous avons donc tenté de savoir quelle était la part d’éléments métalliques dissous par

complexation avec les acides organiques produits par P. polymyxa mais aussi produits lorsque

l’ensemble de la communauté microbienne était présent dans les sédiments.



202

III.2. Rôle des acides organiques dans la dissolution des éléments

métalliques

La dissolution des éléments métalliques est différente suivant l’acide organique considéré. La

figure 40 représente la dissolution des métaux par les acides organiques aux différentes

valeurs de pH étudiées ainsi que les concentrations dissoutes obtenues lors de l’incubation

avec P. polymyxa.

III.2.1. Approche globale

On remarque que les acides organiques ont un faible impact dans la dissolution des métaux

comparée à la concentration en métaux dissous lors de la présence de P. polymyxa (figure 40).

En particulier, les acides succinique, lactique et acétique dissolvent 10 fois moins de fer qu’en

présence de P. polymyxa. L’acide succinique est l’acide produit par cette bactérie qui désorbe

le plus de manganèse comparé aux concentrations dissoutes lors de l’addition d’acides

lactique et acétique, ce dernier ayant la plus faible influence sur la dissolution du manganèse.

Néanmoins, même si l’acide succinique semble jouer un rôle dans la dissolution du

manganèse, les concentrations dissoutes sont 10 fois plus faibles qu’en présence de la bactérie.

L’acide succinique et l’acide lactique dissolvent le strontium dans les mêmes concentrations,

l’acide acétique entraînant la plus faible dissolution. On remarque que plus le pH diminue et

plus la concentration en strontium augmente, ce qui signifie que cet élément est sensible à

l’acidification du milieu. Cependant aux valeurs de pH considérées dans l’incubation avec P.

polymyxa, on constate que celle-ci dissout environ 6 fois plus de Sr qu’en présence d’acides

organiques.

Le cobalt est peu solubilisé en présence d’acides organiques. L’acide succinique est à

nouveau l’acide qui entraîne la plus forte solubilisation et la concentration en solution

augmente lorsque le pH diminue. Cependant, P. polymyxa dissout 20 fois plus de Co que les

acides organiques qu’elle produit.

Les mêmes conclusions peuvent être tirées avec le Ni et le Pb.



203

0

100

200

300

400

500

600

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

pH

Fe d

isso

us p

ar a

cide

s (µ

g/L)

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Fe d

isso

us p

ar P

.pol

ymyx

a (µ

g/L)

lactique (700mg/L) Acétique (400mg/L)Succinique (480mg/L) Paenibacillus polymyxa

a) Fe

0

100

200

300

400

500

600

700

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

pH

Mn

diss

ous

par

acid

es (µ

g/L)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Mn

diss

ous

par

P.p

olym

yxa

(µg/

L)


b) Mn



204

0

50

100

150

200

250

300

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

pH

Sr d

isso

us p

ar a

cide

s (µ

g/L)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Sr d

isso

us p

ar P

.pol

ymyx

a (µ

g/L)


c) Sr

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

pH

Co d

isso

us p

ar a

cide

s (µ

g/L)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Co d

isso

us p

ar P

.pol

ymyx

a (µ

g/L)


d) Co



205

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

pH

Ni d

isso

us p

ar a

cide

s (µ

g/L)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ni d

isso

us p

ar P

.pol

ymyx

a (µ

g/L)


e) Ni

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

5,00 5,50 6,00 6,50 7,00

pH

Pb d

isso

us p

ar a

cide

s (µ

g/L)

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

Pb d

isso

us p

ar P

.pol

ymyx

a (µ

g/L)


f) Pb

Figure 40 : Concentrations en métaux dissous en présence des acides lactique, acétique, succinique et de la bactérie P.polymyxa en fonction du pH



206

III.2.2. Etude quantitative

Afin d’étudier plus précisément la dissolution des métaux par complexation avec les acides

organiques produits par P. polymyxa, d’une part et par l’ensemble de la communauté

microbienne, d’autre part, nous avons modélisé la spéciation des espèces métalliques

dissoutes en fonction du pH, à l’aide de Visual Minteq.

Pour chaque acide organique étudié, nous avons utilisé les concentrations en éléments

métalliques et éléments majeurs (Ca, Mg, Na, K) mesurées en ICP-AES et ICP-MS lors des

expériences réalisées à l’aide du pH-stat à pH 6,5 ainsi que les concentrations en sulfates

mesurées lors des incubations en présence de la communauté microbienne totale (chapitre 2)

(annexe 12). De plus pour le fer, des calculs réalisés à partir de la constante de solubilité du

fer III ont montré que la majorité du fer était sous forme réduite. Ceci est confirmé par la

valeur du potentiel d’oxydo-réduction que nous avons estimé à partir de l’étude de Miao et al.

(2006). En passant d’un milieu oxydant à un milieu réducteur, ces auteurs ont montré une très

forte dissolution du fer et du manganèse, éléments les plus sensibles aux conditions d’oxydo-

réduction comme ce que l’on a pu observer pour des Eh compris entre -200 et -150 mV.

Les concentrations en fer utilisées pour les simulations sont donc celles du fer ferreux. Nous

avons alors simulé une titration de pH 6,5 à pH 1 afin d’estimer la concentration des

différentes espèces métalliques et donc le pouvoir complexant des acides organiques sur une

large gamme de pH. Cette gamme permet de déterminer la zone de pH dans laquelle les

acides ont le pouvoir complexant maximal et ainsi proposer des réactifs chimiques permettant

de mieux appréhender les phénomènes de solubilisation en milieu naturel par rapport à ceux

traditionnellement utilisés (acide oxalique, EDTA…).

Pour chacun des acides, nous n’avons représenté que les espèces métalliques dont les

distributions étaient supérieures à 1 %. De plus, nous avons représenté l’évolution des

distributions par groupes d’éléments métalliques précédemment définis :

- groupe 1 : Fe, Mn et Sr qui sont les éléments majoritairement dissous lors de

l’incubation avec P. polymyxa,

- groupe 2 : Co, Ni et Pb

- groupe 3 : Cd et Cu.



207

III.2.2.1. Acide acétique

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Fe+2Fe-Acetate+Mn+2Mn-Acetate+Sr+2Sr-Acetate+

a) groupe1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pHPo

urce

ntag

e

Co+2Co-Acetate+Ni+2Ni-Acetate+Pb+2Pb-Acetate+Pb-(Acetate)2 (aq)

b) groupe 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Cd+2Cd-Acetate+Cu+2Cu-Acetate+Cu-(Acetate)2 (aq)

c) groupe 3

Figure 41 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’acétate (400 mg.l-1)en fonction du

pH

Les résultats montrent que l’acide acétique est un faible complexant pour les espèces majeures

c’est-à-dire le fer, le manganèse et le strontium (groupe 1) (figure 41). En effet, quel que soit

le pH étudié plus de 90 % de ces espèces se trouvent sous forme libre. Pour les ETM du

groupe 2, seul le plomb est lié à l’acétate à près de 60 % si l’on considère les deux formes

complexées et ceci entre pH 6,5 et 5, soit la gamme de pH dans laquelle se déroulent les



208

incubations. Entre 20 et 30 % du Cd et entre 30 et 40 % du Cu sont liés à l’acétate entre pH

6,5 et 5.

III.2.2.2. Acide lactique

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Fe+2Mn+2Mn-Lactate+Sr+2Sr-Lactate+

a) groupe1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Co+2Co-(Lactate)2 (aq)Co-Lactate+Ni+2Ni-(Lactate)2 (aq)Ni-Lactate+Pb+2Pb-(Lactate)2 (aq)Pb-Lactate+

b) groupe 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Cd+2Cd-(Lactate)2 (aq)Cd-Lactate+Cu+2Cu-(Lactate)2 (aq)Cu-Lactate+

c) groupe 3

Figure 42 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au lactate (700 mg.l-1) en fonction du

pH

Les éléments métalliques du groupe 1 sont très peu complexés au lactate (figure 42). Le

manganèse est l’élément le plus complexé au lactate : légèrement supérieur à 10 % entre pH

6,5 et 5. Les éléments du groupe 2 sont nettement plus complexés au lactate. Le plomb est lié



209

au lactate à plus de 70 %, le nickel à environ 45 % et le cobalt à environ 30 %. Pour les

éléments du groupe 3, le Cu est complexé à plus de 85 % au lactate et le cadmium à

seulement 20 % entre pH 6,5 et 5.

III.2.2.3. Acide succinique

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pou

rcen

tage

Fe+2Mn+2Mn-Succinate (aq)MnH-Succinate+Sr+2SrH-Succinate+Sr-Succinate (aq)

a) groupe1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pou

rcen

tage

Co+2CoH-Succinate+Co-Succinate (aq)Ni+2NiH-Succinate+Ni-Succinate (aq)Pb+2PbH-(Succinate)2-PbH-Succinate+Pb-(Succinate)2-2Pb-Succinate (aq)

b) groupe 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pou

rcen

tage

Cd+2CdH-Succinate+Cd-Succinate (aq)Cu+2CuH-Succinate+Cu-Succinate (aq)

c) groupe 3

Figure 43 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au succinate (480 mg.l-1) en fonction

du pH



210

L’acide succinique se complexe plus fortement les éléments du groupe 1 que les deux acides

précédents (figure 43), hormis le fer qui se trouve à presque 100 % sous forme libre. Si le

succinate est lié au manganèse à un peu plus de 20 % à pH 6,5, ce pourcentage diminue

rapidement pour n’atteindre que 8 % à pH 5. Le strontium suit la même tendance que le

manganèse. Au cours des incubations menées avec P.polymyxa, nous observions des

tendances similaires de dissolution du Sr et du Mn, qui étaient principalement liés à la phase

acido-soluble. On peut donc supposer qu’une partie de la dissolution de ces deux éléments est

liée à la complexation par l’acide succinique produit par cette bactérie. Dans le groupe 2, le

plomb est l’élément majoritairement complexé par le succinate, entre 80 et 90 % de Pb-

succinate entre pH 5 et 6,5. Ces pourcentages diminuent ensuite rapidement lorsque le pH est

inférieur à 5. La complexation du Co et du Ni par le succinate suivent les mêmes tendances,

passant de 30 à 10 % d’espèces complexées entre pH 6,5 et 5. Enfin pour le groupe 3, le Cu

est complexé au succinate entre 50 et 75 % et le Cd entre 15 et 35 % entre pH 5 et 6,5.



211

III.2.2.4. Acide propionique

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age Fe+2

Mn+2Sr+2Sr-Propionate+

a) groupe1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Co+2Co-Propionate+Ni+2Ni-Propionate+Pb+2Pb-Propionate+Pb-(Propionate)2 (aq)

b) groupe 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age Cd+2

Cd-Propionate+Cu+2Cu-Propionate+

c) groupe 3

Figure 44 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au propionate (100 mg.l-1) en fonction

du pH

L’acide propionique se complexe très faiblement aux éléments métalliques quel que soit le

groupe d’éléments considérés (figure 44). En effet, le fer, le manganèse et le strontium sont

quasiment uniquement sous forme libre. Dans le groupe 2, le plomb est l’élément le plus

fortement complexé à l’acide propionique, entre 20 et 30 %, entre pH 5 et 6,5. Enfin, dans le

groupe 3, le cuivre est complexé entre entre 10 et 12 % et le cadmium à environ 3 entre pH 5

et 6,5.



212

III.2.2.5. Acide butyrique

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age Fe+2

Mn+2Sr+2Sr-Butyrate+

a) groupe1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pHPo

urce

ntag

e

Co+2Co-Butyrate+Ni+2Ni-Butyrate+Pb+2Pb-Butyrate+

b) groupe 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Cd+2Cu+2Cu-Butyrate+

c) groupe 3

Figure 45 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liée au butyrate (1 g.l-1) en fonction du pH

De même que l’acide propionique, l’acide butyrique complexe très peu les éléments

métalliques, quel que soit le groupe étudié. Le nickel et le cuivre sont les deux éléments les

plus fortement complexés au propionate, entre 40 et 45 % entre pH 5 et 6,5.



213

III.2.2.6. Acide oxalique

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Fe+2Fe-(Oxalate)2-2Fe-Oxalate (aq)Mn+2Mn-(Oxalate)2-2Mn-Oxalate (aq)Sr+2Sr-Oxalate (aq)

a) groupe1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pHPo

urce

ntag

e

Co+2CoH-Oxalate+Co-(Oxalate)2-2Co-OxalateNi+2Ni-(Oxalate)2-2Ni-Oxalate (aq)Pb+2PbH-Oxalate+Pb-(Oxalate)2-2

b) groupe 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7

pH

Pour

cent

age

Cd+2Cd-(Oxalate)2-2Cd-Oxalate (aq)Cu+2Cu-(Oxalate)2-2Cu-Oxalate (aq)

c) groupe 3

Figure 46 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’oxalate (1 g.l-1) en fonction du pH

L’acide oxalique complexe très fortement les ETM en solution, à plus de 95 % si l’on

additionne les espèces complexées (figure 46) entre pH 5 et 6,5. Le Sr est le seul élément qui

se complexe le moins à l’acide oxalique, entre 46 et 48 % entre pH 5 et 6,5.

En conclusion, on observe que les acides organiques produits par les microorganismes ont des

propriétés complexantes en solution différentes vis-à-vis des éléments métalliques (tableau

37).



214

Tableau 37 : Pourcentage des formes complexées aux acides entre pH 5 et 6,5

Acide acétique (400 mg.l-1)

Acide lactique (700 mg.l-1)

Acide succinique (480 mg.l-1)

Acide propionique (100 mg.l-1)

Acide butyrique (1000 mg.l-1)

Acide oxalique (référence) (1000 mg.l-1)

Fe <10 % - - - - 97-98% Mn <10 % ≈ 10 % 8-20 % - - 96 % Sr <10 % 5 % 8-20 % - 5 % 46-48 % Co <10 % 30 % 10-30 % - 5 % ≈ 100 % Ni <10 % 45 % 10-30 % - 5 % ≈ 100 %

Pb 60 % > 70 % 80-90 % 20-30 % 38-45 % ≈ 100 % Cd 20-30 % 20 % 15-35 % <5 % - 95 % Cu 30-40 % 85 % 50-75 % 10-12 % 40-45 % ≈ 100 %

Ainsi, l’acide propionique est l’acide le moins complexant, suivi de l’acide butyrique. A

l’inverse, l’acide succinique est l’acide dont la forme complexée aux métaux est la plus

importante. Si l’on analyse le pourcentage de forme complexée par éléments métalliques, on

remarque que quel que soit l’acide, le fer est majoritairement sous forme libre, sauf pour

l’acétate. Le plomb et le cuivre sont les éléments dont les pourcentages de formes complexées

sont les plus importants. Par ailleurs, les acides organiques produits ont un faible pouvoir

complexant si l’on compare les pourcentages d’espèces complexées pour chaque acide par

rapport à ceux obtenus avec l’acide oxalique.

Cependant, dans la discussion ci-dessus, nous n’avons pas pris en compte l’effet du pH. Il

nous faut donc distinguer l’effet du pH de celui du pouvoir complexant des acides organiques.

Nous nous sommes donc placés à pH 6. Ce pH est la valeur minimale obtenue lors de

l’incubation avec P.polymyxa. Ceci permettra donc de comparer ensuite directement, l’effet

du pH, des acides organiques et de la capacité réductrice de P.polymyxa dans la solubilisation

des éléments métalliques.

Afin de distinguer l’effet du pH de l’effet de complexation, nous avons calculé une valeur

théorique totale de métaux dissous (tableau 38) à partir des concentrations dissoutes dans le

blanc (effet pH) et du pourcentage complexés aux acides déterminés lors de la modélisation

selon la formule : Mtot = Mblanc + M-acide avec

Mtot = concentration totale dissoute du métal (µg.l-1),

Mblanc = concentration dissoute du métal dans le blanc (µg.l-1) (effet pH)

M-acide = concentration dissoute du métal complexé à l’acide organique (µg.l-1) (effet

complexant de l’acide organique)



215

Tableau 38 : Comparaison des teneurs totales théoriques et expérimentales extraites en métaux à pH 6 en

présence d’acides organiques (µg.l-1)

Groupe 1 Fe Mn Sr Total théo Total exp Total théo Total exp Total théo Total exp Acetate 30 14 400 157 166 123 butyrate 27 16 360 266 163 155 Lactate 27 56 410 230 164 208 Propionate 27 22 360 271 158 154 Succinate 27 83 449 447 183 201 Oxalate 1319 49 10635 56 301 20 Blanc expérimental (effet pH)

27 360 158

Groupe 2 Co Ni Pb Total théo Total exp Total théo Total exp Total théo Total exp Acetate 0,64 0,35 1,12 0,61 0,05 0,12 butyrate 0,59 0,58 1,04 0,7 0,03 0,11 Lactate 0,83 0,29 1,91 0,61 0,08 0,24 Propionate 0,58 0,71 1,02 0,93 0,02 0,15 Succinate 0,79 0,68 1,40 0,82 0,23 0,2 Oxalate 305 0,38 8357 0,89 13 0,19 Blanc expérimental (effet pH)

0,58 1 0,02

Groupe 3 Cd Cu Total théo Total exp Total théo Total exp Acetate 0,03 0,01 0,91 0,76 butyrate 0,02 0,02 1,00 1,2 Lactate 0,03 0,01 4,21 1,91 Propionate 0,02 0,03 0,61 1,45 Succinate 0,03 0,01 2,13 3,92 Oxalate 0,46 0,01 178 1,45 Blanc expérimental (effet pH)

0,02 0,53

Si l’on compare les valeurs expérimentales de concentrations métalliques dissoutes par les

acides organiques par rapport aux concentrations obtenues dans le blanc à pH 6, on constate,

d’une manière générale, que les acides organiques ont une très faible influence sur la

dissolution des éléments métalliques. Ceci confirme les résultats obtenus par Münch (1983),

Rajot (1992) et Bousserrhine (1995) qui observaient une très faible dissolution des éléments

métalliques par les produits de fermentation des bactéries ferri-réductrices.

De plus, on observe des différences entre les concentrations théoriques totales et celles

trouvées expérimentalement quel que soit l’élément métallique considéré. En particulier, des

différences très importantes sont observées entre les concentrations dissoutes expérimentales



216

et celles théoriquement attendues pour l’acide oxalique alors que celui-ci est un très fort

complexant métallique et devrait donc fortement dissoudre les métaux. On pourrait donc

supposer que les acides organiques jouent un rôle très faible dans la dissolution des éléments

métalliques et que la dissolution des métaux observés est due principalement à un effet

cinétique. En effet, les tests ont été effectués sur 24 h. Si l’on avait laissé les sédiments plus

longtemps en contact avec les acides organiques aux pH étudiés, les concentrations dissoutes

par complexation auraient certainement été plus importantes.

On pourrait donc à partir de la concentration dissoute en 24 h estimer la concentration

dissoute en n jours et arriver ainsi à une concentration maximale désorbée et ainsi à un

pourcentage maximal de désorption métallique non lié à l’activité réductrice de P. polymyxa

mais due à la complexation par les acides organiques à un pH donné.

III.2.2.7. Mélange d’acides en présence de Paenibacillus

polymyxa

Lors de l’incubation avec Paenibacillus polymyxa, l’acide acétique, lactique et succinique

sont produits simultanément. Nous avons donc simulé la distribution des espèces métalliques

en solution en présence de ces trois acides. Cette distribution a été simulée à pH 6 avec les

concentrations métalliques déterminées expérimentalement et en tenant compte également des

sulfures présents dans le milieu (tableau 39 et annexe 13). Les éléments métalliques du

groupe 1 sont majoritairement sous forme libre, entre 76 et 91 %. L’acétate est ensuite l’acide

organique auquel le Fe, Mn et Sr sont le plus lié alors que les simulations réalisées avec les

acides seuls montraient que le succinate était l’acide succinique le plus complexant.

Pour le groupe 2, le Co et le Ni sont majoritairement sous forme libre avec 75 et 72 % de Co2+

et Ni2+. Le Pb2+ ne représente que 17 % des espèces de Pb en solution. Cela confirme les

résultats obtenus lors des modélisations réalisées avec les acides organiques seuls dans

lesquelles nous avons pu observer que le Pb était l’un des éléments qui se complexait le plus

aux acides organiques. Le cobalt se complexe à l’acétate, au lactate et succinate dans les

mêmes proportions alors que le nickel se complexe davantage au lactate. Le plomb est

majoritairement complexé au succinate (42 %) et à l’actétate (25 %).

Enfin, pour le groupe 3, le cadmium est majoritairement sous forme libre (65 %) puis

complexé à l’acétate. Le cuivre est majoritairement lié au lactate (26 %), ce qui concorde avec

les simulations réalisées avec les acides seuls où le cuivre était complexé à 85 % au lactate.



217

Tableau 39 : Estimation par Visual Minteq de la distribution (%) des espèces métalliques à pH 6 dans les

incubations réalisées avec P.polymyxa

M libre M-acetate M-lactate M-succinate Fe 76 7 - - Mn 79 8 3 4 Sr 91 5 1 3 Co 74 7 8 6 Ni 64 7 12 5

Pb - - - - Cd 65 21 4 7 Cu 26 17 39 17

III.3. Bilan : Comparaison de l’effet du pH, des acides organiques

et de l’activité réductrice de Paenibacillus polymyxa.

Afin de comparer l’effet du pH, des acides organiques et de l’activité réductrice de

Paenibacillus polymyxa, nous avons calculé le pourcentage de chacun de ces facteurs à partir

de la concentration totale dissoute obtenue lors de l’incubation avec P. polymyxa et qui, par

conséquent, tenait compte de tous ces paramètres. Les calculs ont été effectués à pH 6.

Les concentrations dissoutes dues à l’activité réductrice de P. polymyxa ont été calculées, par

différence, en retranchant aux concentrations totales, les concentrations dissoutes par l’effet

pH et celles dissoutes par le pouvoir complexant des acides lactique, acétique et succinique

(tableau 40). Tableau 40 : Part (%) de l’activité réductrice de P.polymyxa, du pH 6 et des acides organiques dans la

solubilisation des éléments métalliques

Activité réductrice

Effet pH Complexation par les acides organiques

Total Paenibacillus polymyxa

HNO3 Acide lactique

Acide acétique

Acide succinique

Cd (µg.l-1) 0,02 ? 0,02 0,03 0,03 0,03 Co (µg.l-1) 35 32,16 0,58 0,83 0,64 0,79 Pourcentage 100 91,88 1,65 2,37 1,82 2,25 Cu (µg.l-1) 8 3,6 0,53 0,76 1,2 1,91 Pourcentage 100 45 6,62 9,5 15 23,87 Fe (µg.l-1) 48500 48302 28 56 31 83 Pourcentage 100 99,59 0,05 0,11 0,06 0,17 Mn (µg.l-1) 6300 4681 360 410 400 449 Pourcentage 100 74 5,71 6,51 6,35 7,12 Ni (µg.l-1) 39 33 1 1,91 1,12 1,4 Pourcentage 100 86 2,56 4,89 2,87 3,59 Pb (µg.l-1) 5 4 0,02 0,24 0,12 0,2 Pourcentage 100 88 0,4 4,8 2,4 4 Sr (µg.l-1) 1500 768 157 208 166 201 Pourcentage 100 51 10,47 13,87 11,01 13,4



218

III.3.1. Eléments du groupe 1 (Fe, Mn, Sr)

Le fer solubilisé provient à plus de 99 % de l’activité réductrice de P.polymyxa. Le pH et les

acides organiques ont donc un très faible pouvoir de dissolution du fer en milieu réducteur. Le

manganèse dissous provient à 74 % de l’activité réductrice de P.polymyxa. Les effets du pH et

des acides organiques sont sensiblement équivalents et participent entre 5 et 7 % à la

dissolution du Mn. Bien que la courbe de dissolution du Sr soit similaire à celle du Fe, les

résultats montrent que finalement l’activité réductrice microbienne ne compte que pour 51 %

de la dissolution totale de cet élément. Environ 13 % du Sr est dissous par complexation avec

les acides acétique et succinique et 11 % par l’acide acétique. L’effet du pH compte pour 10

%. L’effet de l’acidité et de la complexation par les acides organiques est compatible avec le

fait que le Sr était principalement lié aux carbonates, phase sensible aux variations de pH. De

même, le Mn semblait également principalement lié aux carbonates. On aurait donc pu

s’attendre aussi à un effet plus important du pH et des acides organiques dans la dissolution

du Mn. Cependant, les bactéries ferri-réductrices peuvent aussi réduire le manganèse des

oxydes de manganèse avant les oxydes de fer (Lovley, 1991), ce qui s’est vraisemblablement

produit dans les incubations.

III.3.2. Eléments du groupe 2 (Co, Ni, Pb)

L’activité réductrice de P. polymyxa contribue à près de 92 % du Co mis en solution. Puisque

le fer dissous provient à plus de 99 % de l’activité ferri-réductrice et que les courbes de

dissolution du Fe et du Co ont le même profil et que le Co est en majorité fixé sur la phase

réductible des oxydes de fer, on en déduit que le Co est issu de cette phase et est donc dissous

lors de la réduction microbienne des oxydes de fer. Les mêmes conclusions peuvent être tirées

pour la dissolution du Ni, qui provient à 86 % de l’activité réductrice de P. polymyxa.

Cependant, le Ni est principalement fixé sur la phase réductible «oxydes de fer cristallisés ».

On peut donc penser que P. polymyxa réduit aussi une partie de cette phase. Les résultats

trouvés pour le Co et le Ni en relation avec l’activité des bactéries ferri-réductrices a déjà été

observée dans des sols ferralitiques hydromorphes (Quantin et al, 2001).

Le Pb provient à 88 % de l’activité ferri-réductrice de P. Polymyxa. Le pH a un très faible

impact sur la mobilité du Pb. L’acide acétique et succinique contribuent, respectivement, à 5

et 4 % de la dissolution du Pb en solution. La dissolution du Pb est donc liée à la réduction

des oxydes de fer et ceci d’autant plus que la courbe de dissolution du Pb était similaire à



219

celle du Fe et que le Pb se trouve majoritairement dans les phases réductibles « oxydes de Fe

amorphes » et « oxydes de Fe cristallisés ».

III.3.3. Eléments du groupe 3 (Cd, Ag)

Il est particulièrement difficile d’estimer l’origine de la dissolution du Cd et de l’Ag car ces

éléments sont en très faibles concentrations dans les incubations. L’activité ferri-réductrice ne

semble pas à l’origine de leur dissolution. Il se pourrait que ces éléments se trouvent sur la

phase échangeable ou extractible à l’eau ou dans la fraction résiduelle. Comme ces éléments

étaient présents en faibles teneurs dans les sédiments, respectivement 0 ,35 et 0,38 µg.g-1, il a

été particulièrement difficile de les doser en solution et lors des extractions séquentielles.

C’est pourquoi il serait hasardeux de tenter d’émettre des hypothèses quant à l’origine exacte

de leur solubilisation.



220


L’objectif de ce chapitre était de comparer la part de l’acidification et de la complexation par

les acides organiques dans la dissolution des éléments métalliques par rapport à la réduction

enzymatique effectuée par les bactéries ferri-réductrices et en particulier par Paenibacillus

polymyxa.

Il en résulte que l’activité réductrice contribue à plus de 99 % à la dissolution du fer, 92 % du

cobalt, 88 % du Pb, 86 % du Ni et 74 % du Mn. Ceci montre donc que la majorité des métaux

dissous provient des phases réductibles « oxydes de fer amorphes » et « oxydes de fer

cristallisés ». Le pH et les acides organiques ont un faible rôle dans la dissolution des métaux,

hormis pour le Sr pour lequel 10 % proviennent du pH et 37 % des acides organiques.

Les acides organiques les « plus » impliqués dans la dissolution des ETM sont les acides

acétique et succinique.

Ces résultats confirment ceux observés par Münch (1983), Rajot (1992) et Bousserrhine

(1995) qui avaient montré que la dissolution des ETM co-précipités sur les oxydes de fer

nécessitait un contact direct entre la bactérie et les oxydes de fer. Néanmoins, notre étude a

permis de quantifier plus précisément la contribution de chacun des paramètres à la

dissolution des éléments métalliques.

Conclusions générales et perspectives

221



222

La mobilité des éléments traces métalliques dans les sols et sédiments dépend des conditions

environnementales. En particulier, le pH du milieu et le potentiel d’oxydo-réduction sont des

paramètres majeurs modifiant la distribution des ETM dans les phases minérales et

organiques constituant les sols et sédiments (Sposito, 1989; Stumm et Morgan, 1996).

Cependant, ces paramètres environnementaux sont, dans la majorité des cas, modifiés par

l’activité des microorganismes autochtones. Ainsi, ces derniers peuvent être à l’origine d’une

solubilisation des ETM par des mécanismes directs ou indirects, tels que l’oxydation, la

réduction, la protonation et la complexation (Gadd, 2000; Ledin, 2000; Gadd, 2004). Si la

plupart de ces phénomènes sont bien décrits dans les sols, rares sont les études qui s’y sont

intéressé dans les sédiments. La connaissance de ces mécanismes est cependant primordiale

pour comprendre la mobilité des ETM dans les sédiments, d’une part et des sédiments vers les

nappes phréatiques et eaux superficielles, d’autre part. Une telle connaissance est également

importante pour la gestion des sédiments, notamment lors de leur stockage suite aux

opérations de dragage, où des conditions aérobie et anaérobie peuvent se succéder.

Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de comprendre et d’évaluer l’importance de

certains des processus microbiens et chimiques de mobilité des ETM dans des sédiments de

compositions chimiques et minéralogiques différentes (Marne et Seine) en condition

anaérobie.

Les incubations des différents sédiments effectuées en microcosmes et en milieu anaérobie,

montrent qu’en présence d’une source de carbone facilement dégradable, telle que le glucose,

les communautés microbiennes autochtones mettent en place un métabolisme fermentaire.

Les acides organiques, tels que l’acide acétique, lactique, butyrique et propionique ainsi que

du dioxyde de carbone sont les principaux produits observés. De plus, le milieu de culture

s’acidifie. Parallèlement, à cette fermentation, une dissolution de certains éléments

métalliques se produit. Le fer est l’élément le plus solubilisé et se trouve sous forme réduite.

Sa solubilisation est fortement corrélée à celle du manganèse, cobalt, cuivre et nickel. On peut

donc supposer que ces métaux sont associés aux oxydes de fer, ce qui est confirmé par les

extractions séquentielles. Un tel résultat a souvent été rapporté dans les sols (Lovley, 1991,

Bousserrhine, 1995, Quantin et al., 2001) et indique la présence de bactéries ferri-réductrices

qui couplent fermentation du glucose à la réduction des oxydes de fer, entraînant ainsi la

dissolution des ETM associés. Dans notre étude, les oxydes de fer servent de puits mineurs

d’électrons puisque le pourcentage des équivalents d’électrons produits et utilisés pour la


223

réduction n’excède pas 6 %, quel que soit le sédiment considéré. Ces résultats sont en accord

avec ceux rapportés par Lovley (1991).

Les analyses minérales de la solution montrent que parallèlement au processus de réduction

du fer, des phénomènes de sulfato-réduction se produisent. Ce dernier phénomène pourrait

être à l’origine de la formation de sulfures de fer. L’ampleur de ces processus reste cependant

minoritaire comparativement à la réduction microbienne des oxydes de fer.

L’utilisation d’outils moléculaires nous a permis d’identifier les bactéries ferri-réductrices

majoritaires dans l’un des deux sédiments étudiés (la Marne) : Clostridium butyricum et

Paenibacillus polymyxa. Ces bactéries ont déjà été rapportées pour leur capacité à fermenter

la matière organique, en particulier le glucose, avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer,

en particulier les oxydes de fer amorphes. Il est intéressant de noter que, malgré le fait que les

sédiments soient complètement différents d’un point de vue minéralogique, les communautés

microbiennes (analyse par DGGE) et les processus métaboliques (étude du métabolisme,

Biolog…) mis en place semblent similaires.

Une acidification du milieu et une apparition d’acides organiques se sont produit dans les

incubations. Nous avons alors souhaité évaluer la contribution de la baisse du pH et de la

complexation par les acides organiques (solubilisation indirecte) des métaux par rapport à

celle liée à la réduction bactérienne des oxydes de fer (solubilisation directe).

Pour ce faire, nous avons étudié :

- la capacité solubilisatrice de l’une des deux bactéries ferri-réductrices majoritaires

identifiées, Paenibacillus polymyxa, en la mettant en contact avec un sédiment de Marne

préalablement stérilisé,

- les propriétés complexantes des acides organiques avec les éléments métalliques en les

mettant en contact avec ces mêmes sédiments et

- l’effet de l’acidification en réalisant la même expérimentation avec de l’eau ultrapure dans

les mêmes conditions de pH que précédemment.

Comparativement à ce qui a été rapporté par d’autres auteurs (Bousserrhine, 1995 ; Rajot,

1992 ; Munch et Ottow, 1983), les résultats obtenus montrent, de façon plus fine, que

l’acidification du milieu impacte très peu sur la solubilité des éléments métalliques. De même,


224

la complexation par les acides organiques entraîne une dissolution des métaux très faible : les

concentrations en ETM dissous sont 10 à 40 fois plus faibles que celles observées lors de

l’incubation avec P.polymyxa. La réduction enzymatique directe du fer semble donc être le

processus majeur (>75 %) dans les phénomènes de solubilisation des éléments métalliques en

milieu anaérobie, notamment pour le fer, le manganèse, le cobalt, le nickel et le plomb. Les

acides organiques et le pH des incubations contribuent surtout à la dissolution du Sr, la

réduction enzymatique ne comptant que pour 51 %. De plus, les extractions séquentielles

montrent que P. polymyxa réduit principalement les oxydes de fer amorphes comme cela est

le cas pour de nombreuses bactéries ferri-réductrices (Lovley, 1991).

Au terme de ce travail de recherche, et bien que nous ayons mis en évidence l’importance des

bactéries ferri-réductrices dans la mobilité des métaux dans les sédiments en milieu anaérobie,

certaines questions demeurent posées.

Si l’ajout de glucose avait pour objectifs de stimuler la croissance et l’activité microbienne,

cette source a probablement favorisé certaines souches bactériennes, notamment celles qui

fermentent. On peut donc se poser la question de savoir si l’utilisation d’autres sources de

carbone, telles que des matières organiques naturelles, conduirait aux mêmes observations ou

favoriserait d’autres groupements fonctionnels. L’utilisation de l’acétate pourrait constituer

une piste intéressante de ce point de vue car cette source de carbone est plus souvent

rencontrée dans le milieu naturel que le glucose. Il constitue également un substrat de choix

pour certains microorganismes hétérotrophes anaérobies.

L’étude menée a souligné l’effet mineur de paramètres comme le pH et la complexation par

les produits métaboliques dans les phénomènes de dissolution des éléments métalliques

observés. Il reste cependant à évaluer l’effet de ces mêmes paramètres dans des conditions

d’oxydo-réduction similaires à celles rencontrées dans les sédiments. En particulier, il serait

intéressant de simuler des remises en suspension de sédiments en passant d’un milieu

anaérobie à un milieu aérobie et d’étudier la mobilité des métaux ainsi que les modifications

des communautés microbiennes et d’établir un lien entre ces deux phénomènes.

Les résultats obtenus ouvrent une voie vers la mise en place de nouvelles méthodes

d’extraction séquentielle impliquant des microorganismes. En effet, les reproches faits aux

méthodes chimiques classiques résident dans le fait que les réactifs utilisés manquent de


225

sélectivité et sont loin de prendre en compte l’activité microbienne autochtone et ses

conséquences sur le relargage des ETM. Ces conséquences, ainsi que nous venons de le voir,

peuvent être très importantes. Une nouvelle façon de réaliser des extractions séquentielles

pour estimer la part des ETM liée aux différentes fractions du sédiment serait donc d’avoir

recours à certaines « bactéries phase spécifique » : les bactéries ferri-réductrices non

fermentatrices semblent être des candidates idéales pour estimer la part des ETM liée aux

oxydes de fer amorphes La mise en œuvre de tels procédés implique cependant l’utilisation de

milieux de culture simples et la maîtrise des métabolismes microbiens. De plus, ainsi que l’a

montré la modélisation de la cinétique d’extraction séquentielle, l’activité de P.polymyxa

conduit également à une dissolution des métaux échangeables et de ceux liés aux carbonates

et oxydes de Mn. Aussi, pourrait-on envisager de combiner les extractions séquentielles

chimiques et microbiennes afin d’affiner la quantification des teneurs en métaux sur les

différentes phases des sols et sédiments.

Bibliographie

226

Bibliographie

Bibliographie

227

Admiraal, W., Tubbing, G. M. J. et Breebaart, L. (1995) Effects of phytoplankton on metal

partitioning in the lower River Rhine. Water Research; 29: 941-946.

Adriano, D. C. (2001). Trace Elements in Terrestrial Environments: Biogeochemistry,

Bioavailability and Risks of Metals. New-York, Springer-Verlag.866 p.

Akcay, H., Oguz, A. et Karapire, C. (2003) Study of heavy metal pollution and speciation in

Buyak Menderes and Gediz river sediments. Water research; 37: 813-822.

Araujo do Nascimento, C. W. (2006) Organic acids effets on desorption of heavy metals from

a contaminated soil. Science Agriculture; 63: 276-280.

Arunachalam, J., Emons, H., Krasnodebska, B. et Mohl, C. (1996) Sequential extraction

studies on homogenized forest soil samples. Science of The Total Environment; 181: 147-159.

Bacon, J. R., Hewitt, I. J. et Cooper, P. (2005) Reproducibility of the BCR sequential

extraction procedure in a long-term study of the association of heavy metals with soil

components in an upland catchment in Scotland. Science of The Total Environment; 337:

191-205.

Baeyens, W., Monteny, F., Leermakers, M. et Bouillon, S. (2003) Evaluation of sequential

extractions on dry and wet sediments. Analytical and Bioanalytical Chemistry; 376: 890-901.

Baize, D. (1997). Teneurs totales en éléments traces métalliques dans les sols (France), INRA

Editions.409 p

Baker, B. J. et Banfield, J. F. (2003) Microbial communities in acid mine drainage. FEMS

Microbiology Ecology; 44: 139-152.

Balashova, V. V. et Zavarzin, G. A. (1980) Anaerobic reduction of ferric iron by hydrogen

bacteria. Microbiology; 48: 635-639.

Banwart, S., Davies, S. et Stumm, W. (1989) The role of oxalate in accelerating the reductive

dissolution of hematite (α-Fe2O3) by ascorbate. Colloids and Surfaces; 39: 303-309.

Bibliographie

228

Barré, H., Greau-Hoveman, L., Houeix, N., Lepot, B., Lehnhoff, C. et Schneider, M. (2008).

Les substance dangeureuses pour le milieu aquatique dans les rejets industriels et urbains.

Bilan de l'action nationale de recherche et de réduction des rejets de substances dangereuses

dans l'eau par les installations classées et autres installations. Verneuil-en-Halatte, Oise,

INERIS: 611 p.

Barrow, N. J., Brümmer, G. W. et Strauss, R. (1993) Effects of surface heterogeneity on ion

adsorption by metal oxides and by soils. Langmuir; 9: 2606-2611.

Beckett, P. H. T. (1989). The use of extractants in studies on trace metals in soils, sewage

sludges and sludge treated soils. Andvances in Soil Sciences. New York, Springer-Verlag:

142-176.

Benjamin, M. M. et Leckie, J. O. (1981) Competitive adsorption of Cd, Zn, Cu and Pb on

amourphous iron oxyhydroxide. Journal of Colloid and Interface Science; 79: 410-419.

Bermond, A. (2001) Limits of sequential extraction procedures re-examined with emphasis on

the role of H+ ion reactivity. Analytica Chimica Acta; 445: 79-88.

Berthelin, J. (1988). Microbial weathering processes in natural environments. Physical and

ChemicalWeathering in Geochemical Cycles. Lerman, A.etMeybeck, M. London, Kluwer

Academic Press: 33–59.

Berthelin, J., Munier-Lamy, C. et Leyval, C. (1995). Effect of microorganisms on mobility of

heavy metals in soils. Environmental impact of soil component interactions. London, Lewis

Publishers. II.

Bettinelli, M., Beone, G. M., Spezia, S. et Baffi, C. (2000) Determination of heavy metals in

soils and sediments by microwave-assisted digestion and inductively coupled plasma optical

emission spectrometry analysis. Analytica Chimica Acta; 424: 289-296.

Beveridge, T. J. et Murray, R. G. (1980) Sites of metal deposition in the cell wall of Bacillus

subtilis. Journal of Bacteriology; 141: 876-887.

Bibliographie

229

Biksham, G., Subramanian, V., Ramanathan, A. L. et Van Grieken, R. (1991) Heavy metal

distribution in the Godavari River basin. Environmental Geology; 17: 117-126.

Billon, G., Ouddane, B. et Boughriet, A. (2001) Artefacts in the speciation of sulfides in

anoxic sediments. Analyst; 126: 1805-1809.

Birch, G. F., Taylor, S. E. et Matthai, C. (2001) Small-scale spatial and temporal variance in

the concentration of heavy metals in aquatic sediments: a review and some new concepts.

Environmental Pollution; 113: 357-372.

Blais, J. F., Tyagi, R. D. et Auclair, J. C. (1992) Bioleaching of metals from sewage sludge by

sulfur-oxidizing bacteria. Journal of Environmental Engineering; 118: 690-707.

Bliefert et Perraud (2001). Chimie de l'environnement, air, eau, sols, déchets, DeBoeck

Université.478 p.

Bosecker, K. (1997) Bioleching : metal solubilization by microorganisms. FEMS

Microbiology Reviews; 20: 591-604.

Bosecker, K. (2001) Microbial leaching in environmental clean-up programmes.

Hydrometallurgy; 59: 245-248.

Boudreau, B. P. (1996) The diffusive tortuosity of fine-grained unlithified sediments.

Geochimica et Cosmochimica Acta; 60: 3139-3142.

Boudreau, B. P. (1999) Metals and models: Diagenic modelling in freshwater lacustrine

sediments. Journal of Paleolimnology; 22: 227-251.

Boukhalfa, H. et Crumbliss, A. L. (2002) Chemical aspects of siderophore mediated iron

transport. BioMetals; 15: 325-339.

Bousserrhine, N. (1995) Etude de paramètres de la réduction bactérienne du fer et application

à la defferification de minéraux industriels. Université Henry Poincaré, Nancy I; 331 p.

Bibliographie

230

Bousserrhine, N., Gasser, U. G., Jeanroy, E. et Berthelin, J. (1999a). Comparison between

bacterial and chemical dissolution of Al-substituted goethite. Incidence on mobilization of

iron. Effect of mineral-organic-microorganism interactions on soil and freshwater

environments. Berthelin, J., Huang, P. M., Bollag, J.-M.etAndreux, F., Kluwer Academic /

Plenum Publishers: 378 p.

Bousserrhine, N., Gasser, U. G., Jeanroy, E. et Berthelin, J. (1999b) Bacterial and chemical

reductive dissolution of Mn-, Co-, Cr-, and Al- substituted goethites. Geomicrobiology

Journal; 16: 245-258.

Boust, D., Fischer, J.-C., Ouddane, B., Petit, F. et Wartel, M. (1999). Fer et Manganèse :

Réactivités et recyclages, Programme Seine-Aval, IFREMER: 40 p.

BradleyMoran, S. et Woods, W. L. (1997) Cd, Cr, Cu, Ni and Pb in the water column and

sediments of the Ob-Irtysh Rivers, Russia. Marine Pollution Bulletin; 35: 270-279.

Brock, T. D. et Gustafson, J. (1976) Ferric iron reduction by sulfur- and iron-oxidizing

bacteria. Applied and Environmental Microbiology; 32: 567-571.

Brombacher, C., Bachofen, R. et Brandl, H. (1998) Development of a Laboratory-Scale

Leaching Plant for Metal Extraction from Fly Ash by Thiobacillus Strains. Appl. Environ.

Microbiol.; 64: 1237-1241.

Bruins, M. R., Kapil, S. et Oehme, F. W. (2000) Microbial resistance to metals in the

environment. Ecotoxicology and Environmental Safety; 45: 198-207.

Brümmer, G. W., Gerth, J. et Tiller, T. G. (1988) Reaction kinetics of the adsorption and

desorption of nickel, zinc and cadmium by goethite. I. Adsorption and diffusion of metals.

Journal of Soil Science; 39: 37-52.

Brune, A., Frenzel, P. et Cypionka, H. (2000) Life at the oxic-anoxic interface : microbial

activities and adaptations. FEMS Microbiology Reviews; 24: 691-710.

Bibliographie

231

Burckhard, S. R., Schwab, A. P. et Banks, M. K. (1995) The effects of organic acids on the

leaching of heavy metals from mine tailings. Journal of Hazardous Materials

Selected papers presented at the Conference on Hazardous Waste Remediation; 41: 135-145.

Caille, N., Tiffreau, C., Leyval, C. et Morel, J.-L. (2003) Solubility of metals in anoxic

sediment during prolonged aeration. The Science of the Total Environment; 301: 239-250.

Campanella, L., D'Orazio, D., Petronio, B. M. et Pietrantonio, E. (1995) Proposal for a metal

speciation study in sediments. Analytica Chimica Acta; 309: 387-393.

Camusso, M., Balestrini, R. et Binelli, A. (2001) Use of zebra mussel (Dreissena polymorpha)

to assess trace metal contamination in the largest Italian subalpine lakes. Chemosphere; 44:

263-270.

Cappuyns, V. et Swennen, R. (2005) Kinetics of element release during combined oxidation

and pHstat leaching of anoxic river sediments. Applied Geochemistry; 20: 1169-1179.

Cappuyns, V., Swennen, R. et Devivier, A. (2004) Influence of ripening on pHstat leaching

behaviour of heavy metals from dredged sediments. Journal of Environmental Monitoring; 6:

774-781.

Carpentier, S., Moilleron, R., Beltran, C., Herve, D. et Thevenot, D. (2002a) Quality of

dredged material in the River Seine basin (France). I. Physico-chemical properties. The

Science of The Total Environment; 295: 101-113.

Carpentier, S., Moilleron, R., Beltran, C., Herve, D. et Thevenot, D. (2002b) Quality of

dredged material in the river Seine basin (France). II. Micropollutants. The Science of The

Total Environment; 299: 57-72.

Cawse, P. A. (1980). Deposition of Trace Elements from the Atmosphere in the UK.

Inorganic Pollution and Agriculture. London, Ministry of Agriculture Fisheries and Food,

HMSO.22-46

Bibliographie

232

Ceto, N. et Mahmud, S. (2000). Abandoned mine site characterization and cleanup handbook,

Environmental Protection Agency: 129 p.

Chamley, H. (2000). Bases de sédimentologie. Paris, Dunod.178 p.

Chartier, M., Mercier, G. et Blais, J. F. (2001) Partitioning of trace metals before and after

biological removal of metals from sediments. Water Research; 35: 1435-1444.

Chebbo, G., Gromaire, M. C., Ahyerre, M. et Garnaud, S. (2001) Production and transport of

urban water weather pollution in combined sewer systems : the "Marais" experimental urban

catchment in Paris. Urban Water 3: 3-15.

Chen, J., Gu, B., Royer, R. A. et Burgos, W. D. (2003) The roles of natural organic matter in

chemical and microbial reduction of ferric iron. The Science of the Total Environment; 307:

167-178.

Chen, S.-Y. et Lin, J.-G. (2001) Bioleaching of heavy metals from sediments : significance of

pH. Chemosphere; 44: 1093-1102.

Chester, R., Thomas, A., Lin, F. J., Basaham, A. M. et Jacinto, G. (1988) The solid state

speciation of copper in surface water particulates and oceanic sediments. Marine Chemistry;

24: 261-292.

Ciceri, E., Guissani, B., Pozzi, A., Dossi, C. et Recchia, S. (2008) Problems in the application

of three-steps BCR sequential extraction to low amounts of sediments: an alternative

validated route. Talanta; doi:10.1016/j.talanta.2008.04.006

CITEPA (2007). Emissions dans l'air en France métropolitaine- Substances relatives à la

contamination par les métaux lourds, CITEPA: 28 p.

Coates, J. D., Councell, T., Ellis, D. J. et Lovley, D. R. (1998) Carbohydrate oxidation

coupled to Fe(III) reduction, a novel form of anaerobic metabolism. Anaerobe; 4: 277-282.

Cojan, I. et Renard, M. (1997). Sédimentologie. Paris, Masson.418 p.

Bibliographie

233

Cornell, R. M. et Schindler, P. W. (1987) Photochemical dissolution of goethite in

acid/oxalate solution. Clays and Clay Minerals; 27: 402-410.

Cornell, R. M. et Schwertmann, U. (2003). The Iron Oxides, Wiley-VCH.664 p.

Couillard, D. et Chartier, M. (1991) Removal of metals from aerobic sludges by biological

solubilization in batch reactors. Journal of Biotechnology; 20: 163-180.

Crisenti, L. J. et Sverjensky, D. A. (1999) The role of electrolyte anion (ClO4-, NO3

- and Cl-)

in divalent metal (M2+) adsorption on oxide and hydroxide surfaces in salt solutions.

American Journal of Science; 299: 828-899.

Crundwell, F. K. (1988) The influence of the electronic stucture of solids on the anodic

dissolution and leaching of semiconducting sulphide minerals. Hydrometallurgy; 21: 155-190.

Dassonville, F., Godon, J. J., Renault, P., Richaume, A. et Cambier, P. (2004a) Microbial

dynamics in an anaerobic soil slurry amended with glucose, and their dependence on

geochemical processes. Soil Biology and Biochemistry; 36: 1417-1430.

Dassonville, F., Renault, P. et Vallès, V. (2004b) A model describing the interactions between

anaerobic microbiology and geochemistry in a soil amended with glucose and nitrate.

European Journal of Soil Science; 55: 29-45.

Dominik, P., Pohl, H. N., Bousserrhine, N., Berthelin, J. et Kaupenjohann, M. (2002)

Limitations to the reductive dissolution of Al-substituted goethites by Clostridium butyricum.

Soil Biology and Biochemistry; 34: 1147-1155.

Dopson, M. et Lindström, E. B. (1999) Potential role of Thiobacillus caldus in arsenopyrite

bioleaching. Applied and Environmental Microbiology; 65: 36-40.

Douglas, G. B. et Adeney, J. A. (2000) Diagenetic cycling of trace elements in the bottom

sediments of the Swan River Estuary, Western Australia. Applied Geochemistry; 15: 551-566.

Bibliographie

234

Duffus, J. (2001) Heavy Metals "A meaningless term." Chemistry International; 23

Dziurla, M.-A. (1995) Contribution à l'étude de réactions à l'interface bactérie-minéral au

cours de la lixiviation de minéraux sulfurés (pyrites) par Thiobacillus ferrooxidans. Université

Henri Poincaré, Nancy I; 234 p.

Dzombak, D. A. et Morel, F. M. M. (1990). Surface complexation modelling. Hydrous ferric

oxide. New-York, Wiley.393 p.

Edwards, K. J., Gihring, T. M. et Banfield, J. F. (1999) Seasonal variations in microbial

populations and environmental conditions in an extreme acid mine drainage environment.

Applied and Environmental Microbiology; 65: 3627-3632.

Eggleton, J. et Thomas, K. V. (2004) A review of factors affecting the release and

bioavailability of contaminants during sediment disturbance events. Environment

International; 30: 973-980.

Ehrlich, G. G., Goerlitz, D. F., Bourell, J. H., Eisen, G. V. et Godsy, E. M. (1981) Liquid

Chromatographic Procedure for Fermentation Product Analysis in the Identification of

Anaerobic Bacteria. Appl. Environ. Microbiol.; 42: 878-885.

Ehrlich, H. L. (1990). Geomicrobiology. New York.646 p.

Einax, J. W. et Nischwitz, V. (2001) Inert sampling and sample preparation - the influence of

oxygen on heavy metal mobility in river sediments. Fresenius Journal of Analytical

Chemistry; 371: 643-651.

El Bilali, L., Rasmussen, P. E., Hall, G. E. M. et Fortin, D. (2002) Role of sediment

composition in trace metal distribution in lake sediments. Applied Geochemistry; 17: 1171-

1181.

Elbaz-Poulichet, F., Seidel, J.-L., Casiot, C. et Tusseau-Vuillemin, M.-H. (2006) Short-term

variability of dissolved trace element concentrations in the Marne and Seine Rivers near Paris.

Science of The Total Environment; 367: 278-287.

Bibliographie

235

Fakih, M. (2004) Impact des facteurs biotiques et abiotiques sur la mobilisation des métaux

présents dans les sédiments de dragage (site du Rouillard). Université Paris 12- Val de Marne;

46 p.

Fernández, E., Jiménez, R., Lallena, A. M. et Aguilar, J. (2004) Evaluation of the BCR

sequential extraction procedure applied for two unpolluted Spanish soils. Environmental

Pollution; 131: 355-364.

Fernandez Espinosa, A. J., Ternero Rodriguez, M., Barragan de la Rosa, F. J. et Jimenez

Sanchez, J. C. (2002) A chemical speciation of trace metals for fine urban particles.

Atmospheric Environment; 36: 773-780.

Förster, J. (1993). The influence of atmospheric conditions and storm characteristics on roof

runoff pollution: studies with an experimental roof system. VIth International Conference on

Urban Storm Drainage, Niagara falls, Ontario, Canada.

Foster, I. D. L. et Charlesworth, S. M. (1996) Heavy metals in the hydrological cycle: trends

and explaination. Hydrological Processes; 10: 227-261.

Fowler, T. A., Holmes, P. R. et Crundwell, F. K. (1999) Mechanism of pyrite dissolution in

the presence of Thiobacillus ferrooxidans. Applied and Environmental Microbiology; 65:

2987-2993.

Francis, A. J. et Dodge, C. J. (1988) Anaerobic microbial dissolution of transition and heavy

metal oxides. Applied and Environmental Microbiology; 54: 1009-1014.

Francis, A. J. et Dodge, C. J. (1990) Anaerobic microbial remobilization of toxic metals

coprecipitated with iron oxide. Environmental Science and Technology; 24: 373-378.

Fredrickson, J. K., Zachara, J. M., Kukkadapu, R. K., Gorby, Y. A., Smith, S. C. et Brown, C.

F. (2001) Biotransformation of Ni-substituted hydrous ferric oxide by an Fe(III)-reducing

bacterium. Environmental Science and Technology; 35: 703-712.

Bibliographie

236

Gadd, G. M. (2000) Bioremedial potential of microbial mechanisms of metal mobilization

and immobilization. Current Opinion in Biotechnology; 11: 271-279.

Gadd, G. M. (2001) Microbial metal transformations. The Journal of Microbiology; 39: 83-88.

Gadd, G. M. (2004) Microbial influence on metal mobility and application for bioremediation.

Geoderma; 122: 109-119.

Gao, Y., Leermakers, M., Gabelle, C., Divis, P., Billon, G., Ouddane, B., Fischer, J.-C.,

Wartel, M. et Baeyens, W. (2006) High-resolution profiles of trace metals in the pore waters

of riverine sediment assessed by DET and DGT. Science of The Total Environment; 362:

266-277.

Garban, B., Ollivon, D., Poulin, M., Gaultier, V. et Chesterikoff, A. (1995) Exchanges at the

sediment-water interface in the river Seine, downstream from Paris. Water Research; 29: 473-

481.

Garland, J. L. et Mills, A. L. (1991) Classification and characterization of heterotrophic

microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source

utilization. Applied and Environmental Microbiology; 57: 2351-2359.

Garnaud, S. (1999) Transfert et évolution géochimique de la pollution métallique en bassin

versant. Ecole Nationale des Ponts et Chaussées; 396 p. + annexes

Gerth, J. et Brümmer, G. (1983) Adsorption und Festlegung von Nickel, Zink und Cadmium

durch Goethite (α-FeOOH). Fresenius Zeitschrift von Analytik Chemistry; 316: 616-620.

Gismera, M. J., Lacal, J., da Silva, P., Garcia, R., Teresa Sevilla, M. et Procopio, J. R. (2004)

Study of metal fractionation in river sediments. A comparison between kinetic and sequential

extraction procedures. Environmental Pollution; 127: 175-182.

Glover, L. J., Eick, M. J. et Brady, P. V. (2002) Desorption kinetics of cadmium and lead

from goethite : influence of time and organic acids. Soil Science Society of America Journal;

66: 797-804.

Bibliographie

237

Gomez, C. et Bosecker, K. (1999) Leaching Heavy Metals from Contaminated Soil by Using

Thiobacillus ferrooxidans or Thiobacillus thiooxidans. Geomicrobiology Journal; 16: 233 -

244.

Goyer, R. A. et Clarkson, T. W. (2001). Toxic effects of metals. Casarett and Doull's

Toxicology-The Basic Science of Poisons. Klaassen, C. D., McGraw-Hill Professional: 1275

p.

Gromaire, M. C., Chebbo, G. et Constant, A. (2002) Incidence of zinc roofing on urban runoff

pollutant loads. The case of Paris. Water, Science and Technology; 45: 113 -122.

Gromaire, M. C., Garnaud, S., Saad, M. et Chebbo, G. (2001) Contribution of different

sources to the pollution of wet weather flows in combined sewers. Water research; 35: 521-

533.

Gromaire-Mertz, M.-C. (1998) La pollution des eaux pluviales urbaines en réseau

d'assainissement unitaire, caractéristiques et origines. Ecole Nationale des Ponts et Chaussées;

506 p. + annexes

Gundacker, C. (1999) Tissue-specific heavy metal (Cd, Pb, Cu, Zn) deposition in a natural

population of the zebra mussel Dreissena polymorpha pallas. Chemosphere; 38: 3339-3356.

Gyliene, O. et Salkauskas, M. (1998) Precipitation of metal ions by organic acids as a mean

for metal recovery and decontamination of wastewater. Journal of Radioanalytical and

Nuclear Chemistry; V229: 123-128.

Hansel, C. M., Benner, S. G., Nico, P. et Fendorf, S. (2004) Structural constraints of ferric

(hydr)oxides on dissimilatory iron reduction and the fate of Fe(II). Geochimica et

Cosmochimica Acta; 68: 3217-3229.

Hassen, A., Saidi, N., Cherif, M. et Boudabous, A. (1998) Resistance of environmental

bacteria to heavy metals. Bioresource Technology; 64: 7-15.

Bibliographie

238

Herr, C. et Gray, N. F. (1997) Sampling riverine sediments impacted by acid mine drainage :

problems and solutions. Environmental Geology; 29: 37-45.

Hersman, L., Lloyd, T. et Sposito, G. (1995) Siderophore-promoted dissolution of hematite.


Hillier, S., Sangha CM, Plunkett, B. et Walden, P. (1999) Long term leaching of toxic trace

metals from Portland cement concrete. Cement and Concrete Research; 29: 515-521.

Hirner, A. V. (1992) Trace element speciation in soils and sediments using sequential

chemical extraction methods. International Journal of Environmental and Analytical

Chemistry; 46: 77-85.

Hirner, A. V., Kritsotakis, K. et Tobschall, H. J. (1990) Metal-organic associations in

sediments--I. Comparison of unpolluted recent and ancient sediments and sediments affected

by anthropogenic pollution. Applied Geochemistry; 5: 491-505.

Hjorth, T. (2004) Effects of freeze-drying on partitioning patterns of major elements and trace

metals in lake sediments. Analytica Chimica Acta; 526: 95-102.

Hlavay, J., Prohaska, T., Weisz, M., Wenzel, W. W. et Stingeder, G. J. (2004) Determination

of trace elements bound to soils and sediments fractions. Pure Applied Chemistry; 76: 415-

442.

Huerta-Diaz, M. A., Tessier, A. et Carignan, R. (1998) Geochemistry of trace metals

associated with reduced sulfur in freshwater sediments. Applied Geochemistry; 13: 2113-233.

Hunter, K. S., Wang, Y. et Van Cappellen, P. (1998) Kinetic modeling of microbially-driven

redox chemistry of subsurface environments: coupling transport, microbial metabolism and

geochemistry. Journal of Hydrology; 209: 53-80.

Imhoff, K. R., Koppe, P. et Dietz, F. (1981) Heavy metals in the Ruhr river and their budget

in the catchment area. Progress in Water Technology; 12: 735-749.

Bibliographie

239

Jain, C. K. (2004) Metal fractionation study on bed sediments of River Yamuna, India. Water

Research; 38: 569-578.

Jones, D. L. (1998) Organic acids in the rhizosphere : a critical review. Plant and Soil; 205:

25-44.

Jones, J. G. (1985) Microbes and microbial processes in sediments. Philosophical

Transactions of the Royal Society of London; A 315: 3-17.

Jones, J. G., Gardener, S. et Simon, B. M. (1984) Reduction of ferric iron by heterotrophic

bacteria in lake sediments. Journal of General Microbiology; 130: 45-51.

Juste, C. (1988) Appréciation de la mobilité et de la biodisponibilité des éléments en traces du

sol. Science du Sol; 26: 103-112.

Kalinowski, B. E., Liermann, L. J., Givens, S. et Brantley, S. L. (2000) Rates of bacteria-

promoted solubilization of Fe from minerals : a review of problems and approaches. Chemical

Geology; 196: 357-370.

Kersten, M. et Förstner, U. (1986) Chemical fractionation of heavy metals in anoxic estuarine

and coastal sediments. Water science and technology; 18: 121-130.

Kersten, M. et Förstner, U. (1987) Effect of sample pretreatment on the realibility of solid

speciation data of heavy metals-Implications for the study of early diagenetic processes.

Marine Chemistry; 22: 294-312.

Klavins, M., Briede, A., Rodinov, V., Kokorite, I., Parele, E. et Klavina, I. (2000) Heavy

metals in rivers of Latvia. The Science of The Total Environment; 262: 175-184.

Konhauser, K. O., Fyfe, W. S., Ferris, F. G. et Beveridge, T. J. (1993) Metal sorption and

mineral preicipitation by bacteria in two Amazonian river systems: River Solimoes and Rio

Negro. Geology; 21: 1103-1106.

Bibliographie

240

Konstantinidis, K. T., Isaacs, N., Fett, J., Simpson, S., Long, D. T. et Marsh, T. L. (2003)

Microbial diversity and resistance to copper in metal-contaminated lake sediment. Microbiol

Ecology; 45: 191-202.

Korthals, G. W., Ende, A. v. d., Megen, H. v., Lexmond, T. M., Kammenga, J. E. et Bongers,

T. (1996) Short-term effects of cadmium, copper, nickel and zinc on soil nematodes from

different feeding and life-history strategy groups. Applied Soil Ecology; 4: 107-117.

Kostka, J. E. et Luther, G. W. (1995) Seasonal cycling of Fe in saltmarsh sediments.

Biogeochemistry; 29: 159-181.

Kostka, J. E. et Luther III, G. W. (1994) Partitioning and speciation of solid phase iron in

saltmarsh sediments. Geochimica et Chosmochimica Acta; 58: 1701-1710.

Kraemer, S. M. (2004) Iron oxide dissolution and solubility in the presence of siderophores.

Aquatic Sciences; 66: 3-18.

Krasnodebska-Ostrega, B., Emons, H. et Golimowski, J. (2001) Selective leaching of

elements associated with Mn-Fe oxides in forest soil and comparison of two sequential

extraction methodes. Fresenius Journal of Analytical Chemistry; 371: 385-390.

Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic Acids Techniques in Bacterial

Systematics. Stackebrandt, E.etGoodfellow, M. New York, Wiley: 115-175.

Lebourg, A., Sterckeman, T., Ciesielski, H. et Proix, N. (1996) Intérêt de différents réactifs

d'extraction chimique pour l'évaluation de biodisponibilité des métaux en traces du sol.

Agronomie; 16: 201-215.

Ledin, M. (2000) Accumulation of microorganisms-processes and importance for soil systems.

Earth-Science Reviews; 51: 1-31.

Leduc, L. G. et Ferroni, G. D. (1994) The chemiolithotrophic bacterium Thiobacillus

ferrooxidans. FEMS Microbiology Reviews; 14: 103-120.

Bibliographie

241

Lefebvre-Drouet, E. et Rousseau, M. F. (1995) Dissolution de differents oxyhydroxydes de

fer par voie chimique et par voie biologique: Importance des bacteries reductrices. Soil

Biology and Biochemistry; 27: 1041-1050.

Legret, M. et Pagotto, C. (1999) Evaluation of pollutant loadings in the runoff waters from a

major rural highway. The Science of The Total Environment; 235: 143-150.

Lewis, G. N. et Randall, M. (1961). Thermodynamics

Li, B., Wang, Q., Huang, B. et Li, S. (2001) Evaluation of the results from a quasi Tessier's

sequential extraction procedure for heavy metal speciation in soils and sediments by ICP-MS.

Analytical Sciences; 17 supplement: i1561-i1564.

Lim-Nunez, R. et Gilkes, R. J. (1987). Acid dissolution of synthetic metal-containing

goethites and hematites. International Clay Conference, Denver, Clay Mineral Society.

Lovley, D. R. (1987) Organic Matter Mineralization with the Reduction of Ferric Iron : A

Review. Geomicrobiology Journal; 5: 375-399.

Lovley, D. R. (1991) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. Microbiological reviews;

55: 259-287.

Lovley, D. R. (1995) Bioremediation of organic and metal contaminants with dissimilatory

metal reduction. Journal of Industrial Microbiology; 14: 85-93.

Lovley, D. R. et Coates, J. D. (1997) Bioremediation of metal contamination. Current Opinion

in Biotechnology; 8: 285-289.

Lovley, D. R., Fraga, J. L., Blunt-Harris, E., Hayes, L. A., Phillips, E. J. P. et Coates, J. D.

(1998) Humic substances as a mediator for microbially catalysed metal reduction. Acta

Hydrochimica and Hydrobiologica; 26: 152-157.

Bibliographie

242

Lovley, D. R. et Lonergan, D. J. (1990) Anaerobic oxidation of toluene, phenol and p-cresol

by the dissimilatory iron-reducing organism, GS-15. Applied and Environmental

Microbiology; 56: 1858-1864.

Lovley, D. R. et Phillips, E. J. P. (1986) Organic matter mineralization with reduction of

ferric iron in anaerobic sediments. Applied and Environmental Microbiology; 51: 683-689.

Lovley, D. R. et Phillips, E. J. P. (1988) Novel mode of microbial energy metabolism :

organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied

and Environmental Microbiology; 54: 1472-1480.

Lovley, D. R. et Phillips, E. J. P. (1989) Requirement for a microbial consortium to

completely oxidize glucose in Fe(III)-reducing sediments. Applied and Environmental


Luu, Y.-S. et Ramsay, J. A. (2003) Review : microbial mechanisms of accessing insoluble

Fe(III) as an energy source. World Journal of Microbiology and Biotechnology; 19: 215-225.

Martell et Smith (1989). Critical stability constants - Other Organic Ligands. New York &

London, Plenum Press.495 p.

Martin, J.-M. et Meybeck, M. (1979) Elemental mass-balance of material carried by major

world rivers. Marine Chemistry; 7: 173-206.

Martin, L. (2001) Fonctionnement écologique de la Seine à l'aval de la station d'épuration

d'Achères - Données expérimentales et modélisation bidimensionnelle. Ecole Nationale

Supérieure des Mines de Paris, Paris; 279 p.

Marwoto, B., Nakashimada, Y., Kakizono, T. et Nishio, N. (2004) Metabolic analysis of

acetate accumulation during xylose consumption by Paenibacillus polymyxa. Applied

Microbiology and Biotechnology; 64: 112-119.

Bibliographie

243

Mathias, E. (2007). Inventaire des émissions de polluants atmosphériques en France au titre

de la convention sur la pollution atmosphérique transfrontalière à longue distance et de la

directive européenne relative aux plafonds d'émissions nationaux (NEC), CITEPA: 219 p.

McKenzie, R. M. (1980) The adsorption of lead and other heavy metals on oxides of

manganese and iron. Australian Journal of Soil Research; 18: 61-73.

McKnight, D. M., Kimball, B. A. et Bencala, K. E. (1988) Iron photoreduction and oxidation

in an acidic mountain stream. Science; 240: 637-640.

McLean, R. J. C., Beauchemin, D. et Beveridge, T. J. (1992) Influence of oxidation state on

iron binding by Bacillus licheniformis capsule. Applied and Environmental Microbiology; 58:

405-408.

Meybeck, M., de Marsily, G. et Fustec, E. (1998). La Seine en son bassin. Fonctionnement

écologique d'un système fluvial anthropisé, Elsevier.749 p.

Meybeck, M., Horowitz, A. J. et Grosbois, C. (2004) The geochemistry of Seine River Basin

particulate matter: distribution of an integrated metal pollution index. Science of The Total

Environment; 328: 219-236.

Meybeck, M., Idlafkih, Z., Fauchon, N. et Andreassian, V. (1999) Spatial and temporal

variability of Total Suspended Solids in the Seine basin. Hydrobiologia; 410: 295-306.

Meysman, F. J. R., Boudreau, B. P. et Middelburg, J. J. (2005) Modeling reactive transport in

sediments subject to bioturbation and compaction. Geochimica et Cosmochimica Acta; 69:

3601-3617.

Miao, S., DeLaune, R. D. et Jugsujinda, A. (2006) Influence of sediment redox conditions on

release/solubility of metals and nutrients in a Louisiana Mississippi River deltaic plain

freshwater lake. Science of The Total Environment; 371: 334-343.

Millward, G. E. et Liu, Y. P. (2003) Modelling metal desorption kinetics in estuaries. The

Science of the Total Environment; 314-316: 613-623.

Bibliographie

244

Mossop, K. F. et Davidson, C. M. (2003) Comparison of original and modified BCR

sequential extraction procedures for the fractionation of copper, iron, lead, manganese and

zinc in soils and sediments. Analytical Chimica Acta; 478: 111-118.

Mouabad, A. et Pihan, J.-C. (1993) Le test comportemental de Dreissena polymorpha : un

outil biologique de prévision et d'évaluation de la toxicité en milieu d'eau douce.

Hydroécologie Appliquée; 1: 97-109.

Mucci, A., Boudreau, B. et Guignard, C. (2003) Diagenetic mobility of trace elements in

sediments covered by a flash flood deposit: Mn, Fe and As. Applied Geochemistry; 18: 1011-

1026.

Munch, J. C. et Ottow, J. C. G. (1980) Preferential reduction of amorphous to crystalline iron

oxides by bacterial activity. Soil Science; 129: 15-21.

Munch, J. C. et Ottow, J. C. G. (1983) Reductive transformation mechanism of ferric oxides

in hydromorphic soils. Environmental Biogeochemistry; 35: 383-394.

Muyzer, G., de Waal, E. C. et Uitterlinden, A. G. (1993) Profiling of complex microbial

populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-

amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol.; 59: 695-700.

Nagy, P., Bakonyi, G., Bongers, T., Kádár, I., Fábián, M. et Kiss, I. (2004) Effects of

microelements on soil nematode assemblages seven years after contaminating an agricultural

field. Science of The Total Environment; 320: 131-143.

Naimo, T. J. (1995) A review of the effects of heavy metals on freshwater mussels.

Ecotoxicology; 4: 341-362.

Nakano, M. M. et Zuber, P. (1998) ANAEROBIC GROWTH OF A "STRICT AEROBE"

BACILLUS SUBTILIS. Annual Review of Microbiology; 52: 165-190.

Bibliographie

245

Neilands, J. B. (1995) Siderophores : structure and function of microbial iron transport

compounds. The Journal of Biological Chemistry; 270: 26723-26726.

Nriagu, J. O. (1989) A global assessment of natural sources of atmospheric trace metals.

Nature; 338: 47-49.

Nriagu, J. O. (1990) Human influence on the global cycling of trace metals. Palaeogeography,

palaeoclimatology, palaeoecology; 82: 113-120.

Ohmura, N., Kitamura, K. et Saiki, H. (1993) Selective adhesion of Thiobacillus ferrooxidans

to pyrite. Applied and Environmental Microbiology; 59: 4044-4050.

Okibe, N. et Johnson, D. B. (2004) Biooxidation of pyrite by defined mixed cultures of

moderately thermophilic acidophiles in pH-controlled bioreactors : significance of microbial

interactions. Biotechnology and Bioengineering; 87: 574-583.

Ottow, J. C. G. et Glathe, H. (1971) Isolation and identification of iron-reducing bacteria from

gley soils. Soil Biology and Biochemistry; 3: 43-55.

Pacyna, J. M. (1995) The origin of Arctic air pollutants: lessons learned and future research.

Science of The Total Environment

Ecological Effects of Arctic Airborne Contaminants; 160-161: 39-53.

Padmanabham, M. (1983) Comparative study of the adsorption-desorption behavior of

copper(II), zinc(II), cobalt(II) and lead(II) at the goethite-solution interface. Australian

Journal of Soil Research; 21: 515-525.

Park, G. A. (1965) The isoelectric points of solid oxides, solid hydroxides, and aqueous

hydroxo complex systems. Chemical Reviews; 65: 177-198.

Paschke, A., Wennrich, R. et Morgenstern, P. (1999) Comparison of 24 h and Long-term pH-

stat: Leaching Tests for Heavy Metal Mobilization from Solid Matrices. Acta hydrochimica et

hydrobiologica; 27: 223-229.

Bibliographie

246

Pelmont, J. (1993). Bactéries et environnement: adaptations physiologiques. Grenoble,

Presses Universitaires de Grenoble

Perez, D. V., De Campos, R. C. et Meneguelli, N. D. A. (2004) Effects of soil sample storage

treatment on the composition and Fe, Al, and Mn speciation of soil solutions obtained by

centrifugation. Water, Air and Soil Pollution; 151: 195-214.

Phillips, D. J. H. et Rainbow, P. S. (1989) Strategies of trace metal sequestration in aquatic

organisms. Marine Environmental Research; 28: 207-210.

Pichler, T. et Veizer, J. (1999) Natural input of arsenic into a coral-reef ecosystem by

hydrothermal fluids and its removal by Fe(III) oxyhydroxides. Environmental Science &

Technology; 33: 1373-1378.

Pickering, W. F. (1986) Metal ion speciation -- soils and sediments (a review). Ore Geology

Reviews; 1: 83-146.

Pierre, J. L., Fontecave, M. et Crichton, R. R. (2002) Chemistry for an essential biological

process : the reduction of ferric iron. BioMetals; 15: 341-346.

Planchon, F. A. M., Boutron, C. F., Barbante, C., Cozzi, G., Gaspari, V., Wolff, E. W., Ferrari,

C. P. et Cescon, P. (2002) Changes in heavy metals in Antarctic snow from Coats Land since

the mid-19th to the late-20th century. Earth and Planetary Science Letters; 200: 207-222.

Ponthieu, M., Juillot, F., Hiemstra, T., van Riemsdijk, W. H. et Benedetti, M. F. (2006) Metal

ion binding to iron oxides. Geochimica et Cosmochimica Acta; 70: 2679-2698.

Quantin, C., Becquer, T., Rouiller, J. H. et Berthelin, J. (2001) Oxide weathering and trace

metal release by bacterial reduction in a New Caledonia Ferralsol. Biogeochemistry; 53: 323-

340.

Quevauviller, P., Ure, A., Muntau, H. et Griepink, B. (1993) Improvement of analytical


Bibliographie

247

applied to soil and sediment analysis. International Journal of Environmental and Analytical

Chemistry; 51: 129-134.

Quirk, J. P. et Posner, A. M. (1975). Trace element adsorption of minerals. Trace elements in

soil-plant-animal system. Nicholas, J. D. D.etEgon, A. R. New-York, Academic Press.

Qureshi, S., Richards, B. K., Steenhuis, T. S., McBride, M. B., Baveye, P. et Dousset, S.

(2004) Microbial acidification and pH effects on trace element release from sewage sludge.


Rajot, J.-L. (1992) Dissolution des oxydes de fer (hématite et goethite) d'un sol ferralitique

des Llanos de Colombie par des bactéries ferri-réductrices. Université de Nancy; 185

Rawlings, D. E. (2005) Characteristics and adaptability of iron- and sulfur-oxidizing

microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates.

Microbial Cell Factories; 4

Reeburgh, W. S. (1983) Rates of biological processes in anoxic sediments. Annual Review of

Earth and Planet Science; 11: 269-298.

Renfrew, C. et Bahn, P. G. (1991). Archaeology, Theories, Methods and Practice. London,

Thames and Hudson.543 p.

Robert, M. (1996). Le sol : interface dans l'environnement, ressource pour le développement,

Masson.226 p.

Roberts, J. L. (1947) Reduction of ferric hydroxide by strains of Bacillus polymyxa. Soil

Science; 63: 135-140.

Rocher, V. (2003) Introduction et stockage des hydrocarbures et des éléments métalliques

dans le réseau d'assainissement unitaire parisien. Université Paris XII - Val de Marne; 222 p.

Roden, E. E. (2006) Geochemical and microbiological controls on dissimilatory iron

reduction. Comptes Rendus Geosciences

Bibliographie

248

Les hydroxydes ferrosiques, les rouilles vertes et la fougerite dans le cycle biogeochimique du

fer; 338: 456-467.

Roden, E. E. et Zachara, J. M. (1996) Microbial reduction of crystalline Iron(III) oxides :

influence of oxide surface area and potential for cell growth. Environmental Science and

Technology; 30: 1618-1628.

Rohwerder, T., Gehrke, T., Kinzler, K. et Sand, W. (2003) Bioleaching review part A :

Progress in bioleaching : fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation.

Applied Microbiology and Biotechnology; 63: 239-248.

Salomons, W. et Förstner, U. (1984). Metals in the hydrocycle. Berlin, New-York, Springer-

Verlag.349 p.

Sand, W., Rohde, K., Sobotke, B. et Zenneck, C. (1992) Evaluation of Leptospirillum

ferrooxidans for leaching. Applied and Environmental Microbiology; 58: 85-92.

Sanger, F., Nicklen, S. et Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with Chain-Terminating

Inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America;

74: 5463-5467.

Schippers, A. et Sand, W. (1999) Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect

mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur. Applied and Environmental


Schwertmann, U. (1991) Solubility and dissolution of iron oxides. Plant and Soil; 130: 1-25.

Shanableh, A. et Omar, M. (2003) Bio-acidification and leaching of metals, nitrogen, and

phosphorus from soil and sludge mixtures. Soil & Sediment Contamination; 12: 565-589.

Sherrell, R. M. et Ross, J. M. (1999) Temporal variability of trace metals in new jersey

pinelands streams: relationships to discharge and pH. Geochimica et Cosmochimica Acta; 63:

3321-3336.

Bibliographie

249

Shipley, H. J., Gao, Y., Kan, A. T. et Tomson, M. B. (2004). The mobilisation of metals in

inorganic compounds during resuspension of anoxic sediment. International petroleum

environmental conference, Albuquerque, New Mexico.

Shriver, D. F. et Atkins, P. W. (2001). Chimie inorganique, De Boeck Université.763 p.

Shuman, L. M. (1988) Effect of organic matter on the distribution of manganese, copper, iron

and zinc in soil fractions. Soil Science; 146: 192-198.

Shuman, L. M. et Hargrove, W. L. (1985) Effect of tillage on the distribution of manganese,

copper, iron and zinc in soil fractions. Soil Science Society of America Journal; 49: 1117-

1121.

Shuttleworth, K. L. et Unz, R. F. (1993) Sorption of heavy metals to the filamentous

bacterium Thiothrix strain A1. Applied and Environmental Microbiology; 59: 1274-1282.

SIAAP (2007). Rapport annuel 2006: 36 p.

Simpson, S. L., Apte, S. C. et Batley, G. E. (1998) Effect of short-term resuspension events

on trace metal speciation in polluted anoxic sediments. Environmental Science and

Technology; 32: 620-625.

Soetaert, K., Herman, P. M. J. et Middelburg, J. J. (1996) A model of early diagenetic

processes from the shelf to abyssal depths. Geochimica et Cosmochimica Acta; 60: 1019-

1040.

Sorme, L. et Lagerkvist, R. (2002) Sources of heavy metals in urban wastewater in Stockholm.

The Science of the Total Environment; 298: 131-145.

Spokes, L. J. et Jickells, T. D. (2006). Speciation of metals in the atmosphere. Chemical

speciation in the environment. Ure, A.etDavidson, C. M., Blackwell Science: 452 p.

Sposito, G. (1989). The chemistry of soils. Oxford, Oxford University Press.277 p.

Bibliographie

250

Sposito, G., Lund, L. J. et Chang, A. C. (1982) Trace metal chemistry in arid-zone field soils

amended with sewage sludge: I. Fractionation of Ni, Cu, Zn, Cd and Pd in solid phases. Soil

Science Society of America Journal; 46, : 260–264.

Starkey, R. L. et Halvorson, H. O. (1927) Studies on the transformations of iron in nature. II.

Concerning the importance of microorganisms in the solution and precipitation of iron. Soil

Science; 24: 381-402.

Statistiques Canada (1998). Mines métalliques. no.26-223-XIB, C.

Stephens, S. R., Alloway, B. J., Parker, A., Carter, J. E. et Hodson, M. E. (2001) Changes in

the leachability of metals from dredged canal sediments during drying and oxidation.


Stumm, W. et Furrer, G. (1987). The dissolution of oxides and aluminum silicates: Examples

of surface-coordination-controlled-kinetics. Aquatic surface chemistry. Stumm, W. New-

York, Wiley&Sons: 197-219.

Stumm, W., Furrer, G., Wieland, E. et Zinder, B. (1985). The effects of complex-forming

ligands on the dissolution of oxides and aluminosilicates. The chemistry of weathering.

Drever, J. J. Dortrecht, The Netherlands, Reidel: 55-74.

Stumm, W. et Morgan, J. J. (1996). Aquatic chemistry : chemical equilibria and rates in

natural waters, Wiley interscience.1022 p.

Suzuki, I. (2001) Microbial leaching of metals from sulfide minerals. Biotechnology

Advances; 19: 119-132.

Tack, F. M. et Verloo, M. G. (1999) Single extractions versus sequential extraction for the

estimation of heavy metal fractions in reduced and oxidised dredged sediments. Chemical

Speciation and Bioavailability; 11: 43-50.

Tessier, A., Campbell, P. G. S. et Bisson, M. (1979) Sequential extraction procedure for the

speciation of particulate trace metals. Analytical Chemistry; 51: 844-851.

Bibliographie

251

Thévenot, D., Meybeck, M. et Lestel, L. (2002). Métaux lourds: des bilans en mutation.

Rapport de synthèse PIREN-Seine 1998–2001: 76 p.

Thévenot, D. R., Moilleron, R., Lestel, L., Gromaire, M.-C., Rocher, V., Cambier, P., Bonté,

P., Colin, J.-L., de Ponteves, C. et Meybeck, M. (2007) Critical budget of metal sources and

pathways in the Seine River basin (1994-2003) for Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb and Zn. Science of

The Total Environment

Human activity and material fluxes in a regional river basin: the Seine River watershed -

Seine Special Issue; 375: 180-203.

Tormo, M. et Izco, J. M. (2004) Alternative reversed-phase high-performance liquid

chromatography method to analyse organic acids in dairy products. Journal of

Chromatography A; 1033: 305-310.

Torrent, J., Schwertmann, U. et Barron, V. (1987) The reductive dissolution of synthetic

goethite and hematite in dithionite. Clay Minerals; 22: 329-337.

Torsvik, V. L. (1980) Isolation of bacterial DNA from soil. Soil Biology and Biochemistry;

12: 15-21.

Ure, A. M., Quevauviller, P., Muntau, H. et Griepink, B. (1993) Speciation of Heavy Metals

in Soils and Sediments. An Account of the Improvement and Harmonization of Extraction

Techniques Undertaken Under the Auspices of the BCR of the Commission of the European

Communities. International Journal of Environmental Analytical Chemistry; 51: 135-151.

Urrutia, M. M. et Beveridge, T. J. (1993) Remobilization of Heavy Metals Retained as

Oxyhydroxides or Silicates by Bacillus subtilis Cells. Appl. Environ. Microbiol.; 59: 4323-

4329.

Urrutia, M. M. et Beveridge, T. J. (1995) Formation of short-range ordered aluminosilicates

in the presence of bacteria surface (Bacillus subtilis) and organic ligands. Geoderma; 65: 149-

165.

Bibliographie

252

Van Cappellen, P. et Wang, Y. (1996) Cycling of iron and manganese in surface sediments; a

general theory for the coupled transport and reaction of carbon, oxygen, nitrogen, sulfur, iron,

and manganese. Am J Sci; 296: 197-243.

Verlaan, P. A. J. (2000) Marine vs Fluvial Bottom Mud in the Scheldt Estuary. Estuarine,

Coastal and Shelf Science; 50: 627-638.

Wang, Y. et Van Cappellen, P. (1996) A multicomponent reactive transport model of early

diagenesis: Application to redox cycling in coastal marine sediments. Geochimica et


Wasay, S. A. (1998) Bioremediation of soils polluted by heavy metals using organic acids.

McGill University, Montréal;

Wehrli, B., Sulzberger, B. et Stumm, W. (1989) Redox processes catalysed by hydrous oxide

surfaces. Chemical Geology; 78: 167-179.

Welz, D. et Rosenburg, M. (1987) Electronic band structure of tetrahedral iron sulphides.

Journal of Physics C: Solid State Physics: 3911.

Widdel, F. (1988). Microbiology and ecology of sulfate and sulfur-reducing bacteria. Biology

of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. New York, John Wiley & Sons: 469-587.

Xiao-Quan, S. et Bin, C. (1993) Evaluation of sequential extraction for speciation of trace

metals in model soil containing natural minerals and humic acid. Analytical Chemistry; 65:

802-807.

Yu, K.-C., Tsai, L.-J., Chen, S.-H. et Ho, S.-T. (2001) Chemical binding of heavy metals in

anoxic river sediments. Water Research; 35: 4086-4094.

Zachara, J. M., Fredrickson, J. K., Smith, S. C. et Gassman, P. L. (2001) Solubilization of

Fe(III) oxide-bound trace metals by a dissimilatory Fe(III) reducing bacterium. Geochimica et


Bibliographie

253

Zeien, H. et Brümmer, G. W., . pp. (1989) Chemische Extraktion zur Bestimmung von

Schwermetallbindungsformen in Böden. Mitteilungen der Deutschen Bodenkundlichen

Gesellschaft; 59: 505–510.

Zhang, H., Davison, W., Miller, S. et Tych, W. (1995) In situ high resolution measurements

of fluxes of Ni, Cu, Fe, and Mn and concentrations of Zn and Cd in porewaters by DGT.


Annexes

254

Annexes

Annexes

255

Annexe 1 : Caractéristiques analytiques de la mesure du CO2

Les mesures de CO2 ont été réalisées à l’aide d’un spectromètre infra-rouge (Beryl 100

Cosma). Un flux d’azote traverse le détecteur infrarouge. Le gaz contenu dans la seringue de

prélèvement est injecté dans le flux d’azote et la concentration par pic de CO2 est rapportée

lors de la traversée du détecteur.

La précision et la justesse de la mesure de CO2 a été déterminée en injectant 10 fois un certain

volume de CO2 pur contenu dans un flacon sérum de 250 ml (330 mL en réalité) et prélevé à

l’aide d’une aiguille et d’une seringue dans les mêmes conditions que les prélèvements

effectués au cours de l’incubation.

Les résultats obtenus sont regroupés dans les Tableau 41, 42, 43 et 44 et figure 47.

Les masses de CO2 injectées ont été calculées en tenant compte de la diminution de la

pression partielle de CO2 dans le flacon due aux prélèvements successifs (tableaux 41 et 43).

Puis nous avons représenté les concentrations maximales lues sur le spectrophotomètre en

fonction de la quantité de CO2 injectée (tableau 42 et figure 47). Le gaz porteur diluant le gaz

injecté, nous avons calculé ce facteur de dilution en effectuant le rapport de concentration de

CO2 lu sur la concentration de CO2 dans le flacon (tableau 44). On remarque que le gaz

injecté est moins dilué par le gaz vecteur (N2) lorsqu’un volume plus important est injecté.

Aussi, avons-nous corrigé toutes nos valeurs mesurées en tenant compte du facteur 130 ± 4

obtenu lors de l’injection d’1 ml de CO2, quantité d’air injectée lors des incubations. Par

ailleurs, il est à noter que cette procédure d’étalonnage pourrait intégrer un éventuel dés-

étalonnage de la pente de réponse de l’appareil.

Annexes

256

Tableau 41 : Masse de CO2 injecté (mg) en tenant compte de la diminution de pression en CO2 dans le

flacon due aux prélèvements successifs pour l’injection

Volume de CO2 injecté (µL)

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

0,178 0,354 0,528 0,698 0,861 1,018 1,166 1,305 1,433 1,549 0,178 0,354 0,527 0,697 0,860 1,016 1,164 1,302 1,429 1,545 0,177 0,354 0,527 0,696 0,859 1,014 1,162 1,299 1,425 1,540 0,177 0,353 0,527 0,695 0,858 1,013 1,159 1,296 1,421 1,535 0,177 0,353 0,526 0,694 0,856 1,011 1,157 1,292 1,417 1,531 0,177 0,353 0,526 0,693 0,855 1,009 1,154 1,289 1,414 1,526 0,177 0,353 0,525 0,693 0,854 1,007 1,152 1,286 1,410 1,521 0,177 0,353 0,525 0,692 0,852 1,005 1,149 1,283 1,406 1,517 0,177 0,352 0,524 0,691 0,851 1,003 1,147 1,280 1,402 1,512 0,177 0,352 0,524 0,690 0,850 1,002 1,144 1,277 1,398 1,508

Tableau 42 : Concentration maximale de CO2 (vpm) dans le flux d’azote determinée par le

spectrophotomètre Béryl 100 Cosma


100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

995 2424 3096 3724 4692 5285 5642 5930 6541 6977 923 2520 3192 3750 4613 5041 5564 6105 6401 6628 920 2355 3035 3741 4561 5451 5320 6113 6113 6576 898 2451 3131 3733 4622 5337 5538 5948 6358 6453 968 2520 3070 3924 4483 5267 5581 5939 6270 6279 1047 2451 3140 3994 4439 5320 5669 6017 6323 6558 872 2529 3000 3994 4552 5363 5686 5887 6366 6480 1099 2407 3113 3837 4422 5058 5625 5843 6497 6698 1056 2267 3209 3820 4578 5058 5407 6087 6349 6837 918 2372 3183 3872 4648 4884 5555 5887 6497 6645

Tableau 43 : Pression partielle de CO2 (Pa) dans le flacon au cours des prélèvements successifs


100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

100000 99697 99095 98198 97014 95554 93831 91859 89656 87241 99970 99637 99005 98079 96867 95380 93632 91637 89412 86977 99939 99577 98915 97960 96720 95207 93433 91414 89168 86713 99909 99516 98825 97841 96574 95034 93235 91193 88925 86450 99879 99456 98735 97722 96427 94861 93037 90972 88682 86188 99849 99396 98645 97604 96281 94688 92840 90751 88441 85927 99818 99335 98556 97486 96135 94516 92643 90531 88199 85667 99788 99275 98466 97367 95990 94344 92446 90312 87959 85407 99758 99215 98376 97249 95844 94173 92250 90093 87719 85148 99728 99155 98287 97132 95699 94002 92055 89874 87480 84890

Annexes

257

Tableau 44 : Facteurs de dilution obtenus en calculant le rapport concentration de CO2 lue sur le

spectrophotomètre (Béryl Cosma 100) sur la concentration de CO2 dans le flacon (vpm)


100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

1005 411 320 264 207 181 166 155 137 125 1083 395 310 262 210 189 168 150 140 131 1086 423 326 262 212 175 176 150 146 132 1112 406 316 262 209 178 168 153 140 134 1032 395 322 249 215 180 167 153 141 137 954 406 314 244 217 178 164 151 140 131 1145 393 329 244 211 176 163 154 139 132 908 412 316 254 217 187 164 155 135 128 945 438 307 255 209 186 171 148 138 125 1086 418 309 251 206 192 166 153 135 128

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000

Quantité de CO2 injectée (mg)

Sig

nal (

vale

ur p

ic) d

e l'a

naly

seur

(vpm

)

Figure 47 : Concentration maximale de CO2 (vpm) mesurée dans le flux d’azote en fonction de la masse de

CO2 injectée (mg)

Annexes

258

Annexe 2 : Caractéristiques analytiques du dosage du glucose par

spectrophotométrie UV (avec le kit D-Glucose, Roche)

D’après la notice du kit, la limite de détection du glucose est 0.2 mg.l-1 d’échantillon pour un

volume maximum de 2 ml d’échantillon. Le domaine de linéarité s’étend sur une gamme de 1

µg à 100 µg de glucose/prise d’essai soit de 0.4 mg pour un volume d’échantillon de 2 ml à 1

g pour un volume d’échantillon de 100 µl.

Concernant la précision de la mesure, entre deux analyses, une différence de 0.005 à 0.01

unité d’absorbance peut être constatée, ce qui correspond à 4-8 mg.l-1 de glucose pour un

échantillon de 100 µl.

Les moyennes des concentrations en glucose analysées avant incubation sont de 5.15 ± 0.53

g.l-1. Nous pouvons donc considérer que les valeurs obtenues sont acceptables.

Annexes

259

Annexe 3 : Caractéristiques analytiques de la séparation et de la

quantification des acides organiques par HPLC

La méthode de séparation des acides organiques a été mise au point à l’aide de solutions

commerciales d’acides organiques (Fluka). La phase mobile est constituée d’un mélange de

KH2PO4 (20mM) ajusté à pH 2,2 avec de l’acide phosphorique (solution A) et d’acétonitrile

(solution B). Un gradient a été réalisé au cours de l’élution avec une pompe Spectra series

P200 selon les conditions suivantes :

1) 0-7 min : 100% de A

2) 7-12 min : 93% de A et 7% de B en gradient linéaire

3) 12-19 min : 93% de A et 7% de B (isocratique)

4) après 19 min, retour aux conditions initiales.

Ces conditions, associées à ce type de colonne, permettent de séparer les acides formique et

pyruvique en début d’analyse puis le gradient permet d’accélérer la sortie des autres acides.

En effet les acides formique et pyruvique sont très difficiles à séparer à cause de leur structure

et de leur polarité très proches.

La vitesse d’élution est de 1 ml.min-1 et le volume injecté est de 100 µl (Shimadzu)

Les composés ont ensuite été détectés en UV à une longueur d’onde de 210 nm (spectromètre

UVD340S, Gynkotek), qui correspond à l’absorbance maximale de tous les acides étudiés.

L’acquisition des chromatogrammes et leur traitement ont été effectués à l’aide du logiciel

Chroméléon.

Les acides ont tout d’abord été injectés un par un afin de déterminer le temps de rétention puis

la répétabilité de la mesure (exemple pour l’acide lactique tableau 45) Tableau 45 : Répétabilité de la mesure de l’acide lactique (20 mg.l-1)

Temps de rétention (min)

Aire du pic (mUA.min)

Hauteur du pic (mUA)

6,3 8,83 55 6,31 8,9 56 6,31 9,11 57 6,28 9,06 58 6,27 9,17 58 6,25 9,15 58 6,24 9,07 58 6,23 9,23 59 6,18 9,08 58 6,19 9,1 58

Annexes

260

Une gamme étalon (0-1 g.l-1), contenant un mélange d’acides, a ensuite été injectée afin de

déterminer le domaine de linéarité de chaque acide (figure 48 et tableau 46)

pyruvique (0-1 mg.l-1)

y = 1,54x + 0,03R2 = 0,9955

0

0,5

1

1,5

2

0 0,5 1 1,5

Concentration (mg.l-1)

Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 1,6857x - 0,0989R2 = 0,9994

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 1,7777x - 0,6352R2 = 0,9998

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

lactique (20-100 mg.l-1)

y = 0,0759x + 8,0422R2 = 0,9799

0

5

10

15

20

0 50 100 150


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

lactique (100-500 mg.l-1)

y = 0,0858x + 7,9225R2 = 0,9991

0

10

20

30

40

50

60

0 200 400 600


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

Annexes

261

acétique (0-10 mg.l-1)

y = 0,096x - 0,0033R2 = 0,9999

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 0,0966x - 0,0079R2 = 1

-1

0

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60


Hau

teur

du

pic

(mU

A)

acétique (50-200 mg.l-1)y = 0,0974x - 0,056

R2 = 0,9999

-5

0

5

10

15

20

25

0 100 200 300


Hau

teur

du

pic

(mU

A)


y = 0,095x + 0,5593R2 = 0,9996

0

20

40

60

80

100

120

0 500 1000 1500


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

succinique (0-10 mg.l-1)y = 0,073x - 0,0017

R2 = 0,9999

00,10,20,30,40,50,60,70,8

0 5 10 15


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

succinique (10-50 mg.l-1)y = 0,0736x + 0,0021

R2 = 1

00,5

11,5

22,5

33,5

4

0 20 40 60


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

succinique (50-200 mg.l-1)

y = 0,0726x + 0,006R2 = 1

02468

10121416

0 100 200 300


Haut

eur

du p

ic (m

UA)

succinique (200-1000 mg.l-1)

y = 0,0727x - 0,0996R2 = 0,9999

01020304050607080

0 500 1000 1500


Haut

eur

du p

ic (m

UA)

Annexes

262

propionique (0-10 mg.l-1)

y = 0,061x - 0,0083R2 = 0,9978

00,10,20,30,40,50,60,7

0 5 10 15


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 0,0593x + 0,0068R2 = 1

00,5

11,5

22,5

33,5

0 20 40 60


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 0,0585x - 0,002R2 = 0,9999

02468

101214

0 100 200 300


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 0,0505x + 1,291R2 = 0,9951

0

10

20

30

40

50

60

0 500 1000 1500


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

butyrique (0-10 mg.l-1)

y = 0,021x + 0,0017R2 = 0,9992

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 5 10 15


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 0,0246x - 0,0304R2 = 0,9964

00,20,40,60,8

11,21,4

0 20 40 60


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 0,0219x + 0,068R2 = 0,9989

0

1

2

3

4

5

0 100 200 300


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)


y = 0,0201x + 0,4167R2 = 0,9949

0

5

10

15

20

25

0 500 1000 1500


Haut

eur d

u pi

c (m

UA)

Figure 48 : Gammes étalons de chaque acide organique étudié

Annexes

263

Tableau 46 : Domaine de linéarité (mg.l-1) des acides organiques étudiés

Acide Domaine de linéarité (mg.l-1)

Pyruvique 0-50

Lactique 20-500

Acétique 0-1000

Succinique 0-1000

Propionique 0-1000

Butyrique 0-1000

Annexes

264

Annexe 4 : Exemples de gammes d’étalonnage du carbone

organique dissous

a) Gamme faible 29/08/2006 par: C. GOUNOU29/08/2006

381 137518

Gamme d'étalonnage

Position Conc. (mgC/L) Aire (cts) Aire corrigée

(cts)

Erreur sur concentration

(mgC/L)3 0 457 320 0,22484 0,5 3210 3073 0,22295 1 5053 4916 0,22186 2 9092 8955 0,21957 5 21956 21819 0,21488 8 34722 34585 0,21409 11 47657 47520 0,2172

10 15 65541 65404 0,228011 20 89905 89768 0,2528

Rmq : lorsqu'une des valeurs est aberrante ne pas remplir la colonne des concentrations et inscrire "a"

dans la colonne des aires.

Aire du blanc eau (counts) :Delta (counts) :

Gamme préparée le:passée le:

Aire du réactif (counts) :

y = 0,0002268x - 0,0187478R2 = 0,9992909

0

5

10

15

20

25

0 20000 40000 60000 80000 100000Aire corrigée (cts)

Con

cent

ratio

n (µ

gC)

gammed'étalonnage

Linéaire (gammed'étalonnage)

Annexes

265

b) Gamme forte

28/08/2006 par: C. GOUNOU28/08/2006

235 11246

Gamme d'étalonnage

Position Conc. (mgC/L) Aire (cts) Aire corrigée

(cts)

Erreur sur concentration

(mgC/L)3 0 265 254 0,99104 2,5 2700 2689 0,98505 5 5162 5151 0,97946 10 9987 9976 0,96967 20 20141 20130 0,95418 40 40046 40035 0,94579 60 59574 59563 0,9658

10 80 81082 81071 1,018311 100 103569 103558 1,1025

N° ANA002 Version 00

Delta (counts) :

Gamme préparée le:passée le:

Aire du réactif (counts) :

Rmq : lorsqu'une des valeurs est aberrante ne pas remplir la colonne des concentrations et inscrire "a"

dans la colonne des aires.

Aire du blanc eau (counts) :

FEUILLE DE CALCUL COD ETALONNAGE

y = 0,0009774x + 0,2604755R2 = 0,9994853

0

20

40

60

80

100

120

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000Aire corrigée (cts)

Con

cent

ratio

n (µ

gC)

gammed'étalonnage

Linéaire (gammed'étalonnage)

Annexes

266

Annexe 5 : Caractéristiques analytiques des mesures de métaux en

ICP-AES et ICP-MS Les limites de détection (µg.l-1) des métaux mesurés en ICP-AES et en ICP-MS sont données

dans les tableaux 47 et 48 : Tableau 47 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-AES

Métal Ag Al B Ba Be Ca Cd Co Cr Cu Fe K Li 1,8 1,6 0,8 0,2 0,05 0,1 0,15 0,6 0,4 0,5 0,3 20 0,1 Métal Mg Mn Mo Na Ni P Pb Sb Si Sn Sr V Zn 0,02 0,05 1 0,5 0,8 3 2 0,8 3 2,5 0,05 0,5 0,2

Tableau 48 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-MS

Elément Concentration (µg.l-1) 64 Zn 0,03 66 Zn 0,34 63 Cu 0,02 65 Cu 0,04 60 Ni 0,5 61 Ni 0,55 59 Co 0,01 52 Cr 0,01 53 Cr 0,02 107 Ag 0,01 109 Ag 0 111 Cd 0,01 114 Cd 0,01 207 Pb 0,01 209 Pb 0

Pour les analyses en ICP-AES, les courbes d’étalonnages effectuées pour 4 gammes ont

montré que les mesures étaient parfaitement linéaires (r²>0,9999) sur 0-5, 5-20, 20-50, 50-200,

200-1000 µg.l-1. Il en est de même en ICP-MS sur la gamme 0-20 µg. .l-1.

Annexes

267

Annexe 6 : Exemple de gamme d’étalonnage du Fe(II)

y = 0,3027xR2 = 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentration (Fe (II) (mg.l-1)

Abso

rban

ce (U

A)

ALinéaire (A)

Annexes

268

Annexe 7 : Spéciation des métaux dans les sédiments

Mise en place et vérification du protocole

Annexes

269

I. Introduction

La plupart des méthodes de spéciation des métaux contenus dans les sédiments s’intéressent

aux métaux associés à la fraction échangeable, liés aux carbonates, aux oxydes de fer et de

manganèse, à la matière organique et à la fraction résiduelle (Tessier et al., 1979;

Quevauviller et al., 1993; Xiao-Quan et al., 1993; Quevauviller et al., 1997; Rauret, 1998;

Tokalioglu et al., 2000; Yu et al., 2001; Baeyens et al., 2003).

Cependant très peu de méthodes de spéciation permettent de différencier les métaux liés à la

matière organique de ceux liés aux sulfures car les métaux associés à ces deux phases sont

solubilisés en une seule étape oxydative. Or, dans le cadre de l’étude du devenir des métaux

présents dans les sédiments sous l’action des microorganismes, il est primordial de pouvoir

déterminer les métaux liés à la matière organique de ceux liés aux sulfures. En effet, ces deux

compartiments ont des devenirs tout à fait différents au sein des processus de diagénèse, et ils

sont tous deux porteurs de quantités éventuellement importantes de métaux traces. Il a été

constaté qu’au cours du temps et sous l’action des bactéries sulfato-réductrices, les métaux

précipitaient sous forme de sulfures (Boust et al, 1999). De même, il a été constaté que

parallèlement à la dégradation de la matière organique par les microorganismes, les métaux se

retrouvaient en solution (Boust et al, 1999). Aussi, est-il important, de pouvoir quantifier à la

fois les métaux liés à la matière organique de ceux liés aux sulfures. Campanella et al. (1995)

propose un protocole permettant de séparer ces deux fractions en utilisant l’hydroxyde de

sodium pour obtenir les métaux liés aux matières organiques (acides fulviques et humiques) et

l’acide nitrique pour obtenir ceux liés aux sulfures (Tableau 49).

Tableau 49 : Protocole d’extraction séquentielle permettant de distinguer les métaux liés à la matière

organique de ceux liés aux sulfures (Campanella et al, 1995)

Réactifs Phases

NH4OAc(1 M), pH 5 Acido-soluble

NH2OH, HCl (1 M) + AcOH (25 %) Réductibles

HCl (0,1 M) Matières organiques

NaOH (0,5 M) Acides humiques

HNO3 (8 M), 85°C Sulfures

Annexes

270

D’autres auteurs (Hall et al., 1996; Hall et al., 1997; Tonelli et al., 1997) proposent d’extraire

les métaux liés à la matière organique en utilisant du pyrophosphate de sodium à la place de

l’hydroxyde de sodium.

En se basant sur le protocole de spéciation de Campanella et al. (1995), les objectifs de ce

travail étaient de

- comparer l’efficacité de l’hydroxyde de sodium par rapport au pyrophosphate de

sodium pour solubiliser les métaux liés à la matière organique,

- vérifier que l’utilisation de l’hydroxyde de sodium n’entraînait pas la formation

d’hydroxyde de métaux lors de la dissolution des métaux liés la matière organique,

- vérifier que l’hydroxyde de sodium et le pyrophosphate de sodium ne mobilisaient pas

également les métaux liés aux sulfures,

- évaluer l’efficacité de dissolution métaux liés aux sulfures en utilisant l’acide nitrique

- appliquer la méthode de spéciation retenue sur des sédiments certifiés et dopés en

acides humiques dopés en métaux et en sulfures de métaux.

II. Matériels et méthodes

II.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique

Les matières organiques peuvent être dispersées par différents réactifs. Nous avons testé le

NaOH et le pyrophosphate de sodium qui ont été utilisés par Campenalla et al. (1995) et Hall

et al. (1996), respectivement. Des acides humiques commerciaux ont été dopés en métaux.

Une fois dopés, les métaux ont été dissous en utilisant d’une part l’hydroxyde de sodium et

d’autre part le pyrophosphate de sodium. Toutes les manipulations ont été réalisées en

triplicat.

II.1.1. Dopage des acides humiques

Après purification des acides humiques commerciaux (Fluka) selon le protocole de Varrault

(2001), les acides humiques ont été dopés selon la méthode suivante (Gossart, 2001) :

Annexes

271

- 100 mg d’acides humiques sont mélangés avec 50 ml de solution métallique dans des

flacons plastiques, bouchés et placés sous atmosphère inerte (N2) et sous agitation

mécanique pendant 24h,

- le mélange est ensuite centrifugé pendant 40 min à 4200 trs.min-1,

- le surnageant est récupéré et analysé par ICP-AES pour calculer le rendement

d’adsorption et connaître ainsi les teneurs en métaux dans les acides humiques.

La solution métallique contient les éléments suivants : Cd, Cu, Pb et Zn à 2,5 mg.l-1

(provenant d’une solution-mère mono-métallique (Normadose) de cadmium, cuivre, plomb et

zinc à 1 g.l-1 dans HCl 2M ). Cette concentration a été choisie, après plusieurs essais, d’une

part pour avoir le meilleur rendement d’adsorption possible et d’autre part pour se rapprocher

des teneurs réelles en métaux dans la phase organique contenus dans les sédiments d’après la

littérature (Campanella et al, 1995).

II.1.2. Dissolution des acides humiques par l’hydroxyde de sodium

La dissolution des acides humiques dopés par l’hydroxyde de sodium est réalisée selon le

protocole de Campanella et al (1995) :

- 50 ml de NaOH (0,5M) est ajouté aux acides humiques dopés

- agitation mécanique pendant 24h

- centrifugation pendant 20 min à 4200 trs.min-1, récupération et filtration du surnageant

sur filtres hydrophiles en PolyTétraFluoroEthylène (0,45 µm) (Millipore).

Le filtrat est récupéré et analysé en ICP-AES.

II.1.3. Dissolution des acides humiques par le pyrophosphate de sodium

La dissolution des acides humiques dopés par le pyrophosphate de sodium est réalisée selon le

protocole modifié de Hall et al (1996) :

- 50 mL de pyrophosphate de sodium (0,1 M) est ajouté aux acides humiques dopés

- agitation mécanique pendant 1h,

- centrifugation pendant 20 min à 4200 trs.min-1, récupération et filtration du surnageant sur

filtres hydrophiles en Polyfluorure de Vinylidène PVDF (0,45 µm) (Millipore).

Le filtrat est récupéré et analysé en ICP-AES.

Annexes

272

Remarque : deux types de filtres ont été testés car il fallait que ceux-ci résistent à des pH

élevés (de l’ordre de 13). Il en résulte que ce sont les filtres hydrophiles en PVDF qui sont les

mieux adaptés.

II.2. Dissolution des métaux liés aux sulfures

Les sulfures de métaux suivants ont été choisis : sulfure de cadmium, de fer, de plomb et de

zinc (poudre, pureté > 99 %, Sigma-Aldrich). Afin de ne pas oxyder les sulfures en sulfate,

toutes les manipulations ont été effectuées sous azote dans une boîte à gants. 0,1g de sulfure

de chaque métal a été pesé et les sulfures ont été mélangés dans un même flacon en plastique.

Tous les réactifs utilisés pour la dissolution des métaux ont été préalablement désoxygénés en

faisant circuler un flux d’azote.

II.2.1. Hydroxyde de sodium puis acide nitrique

Afin de vérifier que le traitement par l’hydroxyde de sodium ne solubilisait pas les métaux

liés aux sulfures, les deux dernières étapes du protocole proposé par Campanella et al (1995)

ont été appliquées sur les sulfures de métaux. Tout d’abord, les sulfures de métaux ont été

traités à l’hydroxyde de sodium comme précédemment (cf II.1.2).

Le culot obtenu est ensuite traité de la façon suivante :

- 50 ml de HNO3 (8 M) sont ajoutés

- le mélange est chauffé à 85 °C au bain marie pendant 3 h avec agitation

- centrifugation pendant 20 min à 4200 trs.min-1

- récupération du surnageant et analyse des métaux à l’ICP-AES

II.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique

De la même façon, afin de vérifier que le pyrophosphate de sodium ne solubilisait pas les

métaux liés aux sulfures, le protocole décrit au paragraphe II.1.3. a été appliqué aux sulfures

puis le culot obtenu a été traité à l’acide nitrique comme décrit au paragraphe II.2.1.

Annexes

273


III.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique (acides humiques

dopés)

III.1.1. Par l’hydroxyde de sodium

Les teneurs en Cd, Pb et Zn dans les acides humiques sont respectivement et en moyenne

pour les trois réplicats effectués de 900 ppm, 700 ppm et 900 ppm.

Les rendements de dissolution obtenus après traitement au NaOH (0,5 M) sont les suivants

(Tableau 50) :

Tableau 50 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par l’hydroxyde de sodium

Cd Pb Zn

Moyenne (%) 66.6 79.6 82.3

Ecart-type (%) 2.3 1.1 12.8

Il en résulte que le Cd est l’élément qui est le moins bien solubilisé.

III.1.2. Par le pyrophosphate de sodium

Les teneurs en Cd, Pb et Zn dans les acides humiques sont respectivement et en moyenne

pour les triplicats effectués de 600 ppm, 675 ppm et 560 ppm.

Après traitement par le pyrophosphate de sodium (0,1 M) des acides humiques dopés, les

rendements de dissolution sont les suivants (Tableau 51):

Tableau 51 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par le pyrophosphate de

sodium

Cd Pb Zn

Moyenne (%) 80.5 79.0 78.0

Ecart-type (%) 0.7 2.8 15.5

Annexes

274

On constate que le pourcentage de dissolution du Cd est plus important avec le pyrophosphate

de sodium qu’avec l’hydroxyde de sodium.

Compte-tenus des résultats obtenus dans cette première partie, il semble a priori que le

pyrophosphate permettrait de solubiliser plus de cadmium que le NaOH (les autres éléments

étant solubilisés avec le même ordre de grandeur), ce qui nous ferait opter pour l’utilisation du

pyrophosphate de sodium.

Le choix du réactif va donc se faire en fonction de son comportement vis-à-vis des sulfures de

métaux.

III.2. Dissolution des sulfures de métaux

III.2.1. Par l’hydroxyde de sodium puis par l’acide nitrique

Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn dans les sulfures sont respectivement et en moyenne pour les

triplicats effectués de 820 mg.g-1, 745 mg.g-1, 1180 mg.g-1 et 1030 mg.g-1. Après avoir été

traités à l’hydroxyde de sodium, les sulfures de métaux sont solubilisés à l’acide nitrique. Les

résultats sont les suivants (Tableau 52) :

Tableau 52 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et HNO3

(50ml)

Cd Fe Pb Zn

Moyenne 0.00 1.33 1.44 0.54 % de dissolution par NaOHEcart-type 0.00 0.33 0.95 0.46

Moyenne 0.4 62.27 1.59 133.27 % de dissolution par HNO3

(50 ml) Ecart-type 0.28 4.14 0.99 20.19

L’utilisation d’hydroxyde de sodium solubilise de façon très peu significative les sulfures de

métaux au bout de 24h. Concernant le traitement à l’acide nitrique, on remarque que le

cadmium et le plomb sont très peu solubilisés contrairement au fer et au zinc. On peut

supposer que le rapport masse de sulfure/volume d’acide était trop important compte-tenues

des teneurs en métaux dans les sulfures. Aussi, a-t-il été décidé de diminuer ce rapport en

augmentant le volume d’acide nitrique utilisé.

Annexes

275

Dans une deuxième expérience, nous avons ajouté 200 ml d’acide nitrique (8M) au lieu de 50

ml comme préconisé par Campanella et al (1995). Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn sont

respectivement et en moyenne sur les trois réplicats de 805, 700, 915 et 820 mg.g-1. Les

résultats obtenus ont été les suivants (Tableau 53) :

Tableau 53 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et HNO3

(200ml)

Cd Fe Pb Zn

Moyenne 0.00 0.01 0.78 0.29 % de dissolution par NaOH Ecart-type 0.01 0.00 1.24 0.25


(200 ml) Ecart-type 0.72 22.37 2.33 12.73

Les rendements de dissolution des sulfures de métaux par le NaOH sont du même ordre de

grandeur que ceux trouvés précédemment, ce qui confirme le fait que ce réactif solubilise très

peu les métaux adsorbés sur les sulfures. De plus, le fait d’augmenter le volume d’acide

nitrique permet de solubiliser plus de 85 % du cadmium et du plomb. La dissolution du Fe est

également plus importante.

Le même type d’expérience a été réalisé en utilisant le pyrophosphate de sodium à la place de

l’hydroxyde de sodium.

III.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique

Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn sont respectivement et en moyenne sur les trois réplicats de

930, 760, 1485 et 780 mg.g-1.

Les rendements de dissolution après traitement au pyrophosphate de sodium puis à l’acide

nitrique ont été les suivants (Tableau 54) :

Annexes

276

Tableau 54 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au pyrophosphate de

sodium et HNO3 (50 ml)

Cd Fe Pb Zn

Moyenne 0.18 0.22 6.29 0.19 % de dissolution par le

pyrophosphate de sodium Ecart-type 0.07 0.03 0.95 0.06


(50 ml) Ecart-type 0.30 9.43 1.43 29.08

On remarque les pourcentages de dissolution des sulfures de métaux par le pyrophosphate de

sodium sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus par l’hydroxyde de sodium.

Néanmoins, une petite différence est constatée concernant le sulfure de plomb, celui-ci étant

légèrement plus solubilisé par le pyrophosphate de sodium (6 % au lieu d’1% environ pour le

traitement par NaOH). Concernant la dissolution par l’acide nitrique, on remarque que les

sulfures de cadmium et de plomb sont très peu solubilisés comme ceci a été constaté

précédemment.

Aussi, avons-nous décidé de diminuer le ratio masse de sulfures / volume d’acide nitrique en

utilisant 200 ml d’acide nitrique au lieu de 50 ml. Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn sont

respectivement et en moyenne sur les trois réplicats de 890, 665, 955 et 840 mg.g-1.

Les résultats obtenus sont les suivants (Tableau 55) :

Tableau 55 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au pyrophosphate de

sodium et au HNO3 (200 ml)

Cd Fe Pb Zn

Moyenne 0.17 0.14 5.96 0.20 % de dissolution par le

pyrophosphate de sodium Ecart-type 0.01 0.02 0.97 0.01

Moyenne 98.4

7

47.83 91.1

3

87.07 % de dissolution par HNO3

(200 ml) Ecart-type 5.41 3.72 1.83 7.43

De même que précédemment, on constate une dissolution un peu plus importante pour le

sulfure de plomb que pour les autres sulfures de métaux par le pyrophosphate de sodium et

ceci avec le même ordre de grandeur (environ 6 %), ce que l’on ne remarque pas dans le cas

du NaOH. Par ailleurs, les rendements de dissolution des sulfures de métaux après diminution

Annexes

277

du rapport masse de sulfures / volume d’acide nitrique sont nettement supérieurs à ceux

obtenus en utilisant 50 ml d’acide (hormis pour le fer).

En comparant l’effet du pyrophosphate de sodium et du NaOH sur la dissolution des sulfures

de métaux, on constate que le pyrophosphate solubilise plus de plomb que le NaOH ; les

autres sulfures n’étant pratiquement pas solubilisés. 6 % de dissolution est assez élevé

compte-tenu du faible écart-type. Par ailleurs, ce protocole sera avant tout utilisé pour

déterminer la part des métaux liés aux sulfures sous l’action des microorganismes. Nous

avons donc choisi d’utiliser le NaOH pour solubiliser les métaux liés à la matière organique

afin de préserver au maximum la composition des sulfures de métaux.

Concernant le volume d’acide nitrique à utiliser, il est clair que nous allons opter pour 200

mL afin d’être sûrs de solubiliser complètement les métaux (sachant qu’en réalité, les teneurs

en sulfures de métaux seront sûrement beaucoup plus faibles que celles utilisées dans cette

étude).

Ce protocole a ensuite été testé sur des sédiments certifiés (LGC 6139, River Clay sediments)

dopés en sulfures de métaux et acides humiques dopés en métaux et sur ces mêmes sédiments

mais non dopés. Les résultats ont montré que les réactifs utilisés dans les étapes précédant

l’extraction des métaux liés aux sulfures n’attaquaient pas les sulfures métalliques. De plus,

nous avons constaté une bonne extraction des métaux liés aux sulfures.

IV. L’acétate d’ammonium, solubilisant d’une partie des métaux liés aux

acides humiques ?

Cependant, il est apparu que le réactif permettant de solubiliser les métaux liés à la fraction

échangeable et carbonatée, à savoir l’acétate d’ammonium, semblait également solubiliser les

métaux liés aux acides humiques, en particulier pour le cadmium, le plomb et le zinc. Des

tests ont donc été menés pour vérifier si l’acétate d’ammonium solubilisait aussi les métaux

liés aux acides humiques.

Annexes

278

IV.1. Matériel et méthodes

IV.1.1. Dopage des acides humiques

0,1g d’acides humiques Fluka purifié ont été mis en contact avec 50 ml de solution métallique

contenant 2.5 mg.l-1 de cadmium, fer, plomb et zinc pendant 24 h sous agitation et sous

atmosphère inerte. Puis le surnageant a été récupéré après centrifugation et analysé pour

déterminer la teneur en métaux sur les acides humiques.

IV.1.2. Dissolution par l’acétate d’ammonium

Après séchage, les acides humiques ont été mis en contact avec 90 mL d’acétate d’ammonium

(1M) (ajusté à pH 5 avec de l’acide acétique) pendant 24h sous agitation à 130 tours par

minute. Puis après centrifugation, le surnageant a été récupéré et analysé par ICP-AES.

IV.2. Résultats

IV.2.1. Cadmium

Le pourcentage de dissolution du cadmium est assez aléatoire variant de 22 à 67 %. Il est

donc tout à fait probable que dans le cas des sédiments dopés une partie du cadmium fixé sur

les acides humiques aient été solubilisés par l’acétate d’ammonium.

IV.2.2. Fer

Concernant le fer, le pourcentage de dissolution est répétable atteignant en moyenne 46 %.

Cependant très peu de fer avait été retrouvé dans la partie liée aux carbonates et facilement

échangeable.

IV.2.3. Plomb

Environ 20 % du plomb fixé sur les acides humiques est solubilisé par l’acétate d’ammonium,

ce qui prouve qu’une partie trouvée du plomb trouvée dans la partie échangeable et liée aux

carbonates provenait bien des acides humiques.

Annexes

279

IV.2.4. Zinc

Le pourcentage de zinc solubilisé des acides humiques est relativement variable (entre 15 et

54 %). On observe un comportement similaire à celui obtenu lors de la dissolution du

cadmium. Aussi n’est-il pas surprenant d’obtenir une quantité importante de zinc dans la

partie échangeable et liée aux carbonates car celle provient certainement des acides humiques

dopés.

IV.2.5. Conclusions

Les résultats obtenus concernant la dissolution des métaux liés aux acides humiques par

l’acétate d’ammonium sont très élevés. Il existe donc un risque potentiel de dissolution des

métaux liés aux acides humiques, le pourcentage de dissolution pouvant aller jusqu’à 68 %

pour le cadmium ! Ces résultats seraient sûrement à reconfirmer en effectuant le test sur plus

de 3 échantillons pour obtenir une plus grande représentativité.

V. Conclusion

Les objectifs de cette étude étaient de choisir les réactifs permettant de solubiliser les métaux

liés à la matière organique d’une part et aux sulfures d’autre part. Il apparaît que pour la

dissolution de la matière organique, l’hydroxyde de sodium est le meilleur réactif devant le

pyrophosphate de sodium car ce dernier attaque légèrement le sulfure de plomb ce qui n’est

pas le cas du NaOH. De plus, l’utilisation du NaOH n’entraîne pas la formation d’hydroxyde

de métaux, à condition qu’il soit laissé en contact avec les acides humiques uniquement

pendant 24 h, des hydroxydes de métaux, se formant au bout de 48 h.

Les résultats obtenus montrent que la partie des métaux liés aux sulfures est effectivement

bien solubilisée. Par contre, on ne peut rien dire concernant la dissolution des métaux liés aux

acides humiques puisqu’une partie des métaux liés aux acides humiques tels que le cadmium,

le fer, le plomb et le zinc semble être solubilisés par l’acétate d’ammonium et se retrouver

dans la fraction des métaux échangeables et liés aux carbonates.

Il convient donc de refaire des tests avec des sédiments dopés en acides humiques dopés en

métaux et appliquer le protocole de spéciation pour vérifier que l’acétate d’ammonium

solubilise aussi une partie des métaux liés aux acides humiques.

Annexes

280

Bibliographie

Baeyens, W., Monteny, F., Leermakers, M. and Bouillon, S. (2003). "Evaluation of sequential

extractions on dry and wet sediments." Analytical and Bioanalytical Chemistry 376: 890-901.

Campanella, L., D'Orazio, D., Petronio, B. M. and Pietrantonio, E. (1995). "Proposal for a

metal speciation study in sediments." Analytica Chimica Acta 309: 387-393.

Gossart, P. (2001). Contribution à l'étude des interactions de la matière organique des sols

avec les métaux lourds. Etude structurale et analytique de molécules modèles., Université des

Sciences et Technologies de Lille: 131.

Hall, G. E. M. and Pelchat, P. (1997). "Comparison of two reagents, sodium pyrophosphate

and sodium hydroxyde, in the extraction of labile metal organic complexes." Water, Air and

Soil Pollution 99: 217-223.

Hall, G. E. M., Vaive, J. E. and MacLaurin, A. I. (1996). "Analytical aspects of the

application of sodium pyrophosphate reagent in the specific extraction of the labile organic

component of humus and soils." Journal of Geochemical Exploration 56: 23-36.

Quevauviller, P., Rauret, G., Lopez-Sanchez, J.-F., Rubio, R., Ure, A. and Muntau, H. (1997).

"Certification of trace metal extractable contents in a sediment reference material (CRM 601)

following a three-step sequential extration procedure." The Science of the Total Environment

205: 223-234.

Quevauviller, P., Ure, A., Muntau, H. and Griepink, B. (1993). "Improvement of analytical


applied to soil and sediment analysis." International Journal of Environmental and Analytical

Chemistry 51: 129-134.

Rauret, G. (1998). "Extraction procedures for the determination of heavy metals in

contaminated soil and sediment." Talanta 46: 449-455.

Tessier, A., Campbell, P. G. S. and Bisson, M. (1979). "Sequential extraction procedure for

the speciation of particulate trace metals." Analytical Chemistry 51(7): 844-851.

Tokalioglu, S., Kartal, S. and Elçi, L. (2000). "Determination of heavy metals and their

speciation in lake sediments by flame atomic absorption spectrometry after a four-stage

sequential extraction procedure." Analytica Chimica Acta 413: 33-40.

Tonelli, D., Seeber, R., Ciavatta, C. and Gessa, C. (1997). "Extraction of humic acids from a

natural matrix by alkaline pyrophosphate. Evaluation of the molecular weight of fractions

obtained by ultrafiltration." Fresenius Journal of Analytical Chemistry 359: 555-560.

Annexes

281

Varrault, G. (2001). Étude cinétique de l'extraction des métaux traces des sols : application à

l'évaluation de l'efficacité de techniques de réhabilitation in situ, Université Paris VII: 185.

Xiao-Quan, S. and Bin, C. (1993). "Evaluation of sequential extraction for speciation of trace

metals in model soil containing natural minerals and humic acid." Analytical Chemistry 65:

802-807.

Yu, K.-C., Tsai, L.-J., Chen, S.-H. and Ho, S.-T. (2001). "Chemical binding of heavy metals

in anoxic river sediments." Water Research 35(17): 4086-4094.

Annexes

282

Annexe 8 : Description des plaques biolog (familles et composés)

Annexes

283

A2-E1 : hydrates de carbones, sucres, alcools et acides

E2-F12 : Acides organiques

G1-H6 : Acides aminés, peptides et dérivés

H7-H12 : Nucléotides et nucléosides

Annexes

284

Annexe 9 : Validation de l’analyse des sulfates

Concentration Aire (counts) SCE (i) Droite: y = b1u + b0 Pente:b1Origine à

l'ordonnée : b0

0 0,0001 1,7948E-05 Coefficients de la droite 11,7827512 1,54175860 0,0002 Ecart-type sur les coefficients 0,13440974 0,48636550 0,0003 Limite inf. à 99% 11,41829 0,222950 0,0005 Limite sup. à 99% 12,14721 2,860570 0,005

0,5 8,29 2,07120,5 6,36 Unité: mg/L0,5 70,5 7,60,5 7,5 Ecart-type des résidus 2,05978

1 13,83 2,23372 Limte de détection 0,31 12,11 Limite de quantification 0,51 13,941 131 13,5

1,5 20,63 33,0674 Source des variations Somme Degré de Variance F Valeur critique1,5 18,75 des carrés liberté estimée à 1%1,5 18,34 Régression 32604 1 32604 7,777E+03 7,51,5 25,48 Erreur de modèle 27 6 5 1,08E+00 3,431,5 19,75 Erreur expérimentale 134,1626179 32 4

2 25,13 16,92092 Totale 32765,33739 392 28,922 23,282 26,052 25,2

4 49,41 27,72468 CONCLUSIONS4 52,824 46,79 Limite de détection 0,3 mg/L4 46,94 Limite de quantification 0,5 mg/L4 46,85 63,12 26,37268 Linéarité modèle de régression linéaire acceptable5 63,1 domaine d'étalonnage validé5 57,475 59,05 REMARQUE:5 62,1

7,5 89,9 25,7727,5 92,157,5 85,27,5 88,97,5 89,9

CARACTERISATION DE METHODEANALYSE sulfates

Gamme faible

TEST DE LINEARITE

Représentation graphique

y = 0,084452x - 0,116981R2 = 0,995079

02468

10

0 50 100

Annexes

285

Concentration Aire (counts) SCE (i) Droite: y = b1u + b0 Pente:b1Origine à

l'ordonnée : b0

0 0,0001 1,7948E-05 Coefficients de la droite 12,9547021 -7,44378790 0,0002 Ecart-type sur les coefficients 0,21622801 4,39576830 0,0003 Limite inf. à 99% 12,36839 -19,363210 0,0005 Limite sup. à 99% 13,54102 4,475630 0,0055 54,47 47,868925 55,28 Unité: mg/L5 57,355 63,125 59,2 Ecart-type des résidus 17,25913

7,5 87,09 33,04948 Limte de détection 0,47,5 88,9 Limite de quantification 2,87,5 85,27,5 92,157,5 91,2510 115,93 68,6361772 Source des variations Somme Degré de Variance F Valeur critique10 123,8 des carrés liberté estimée à 1%10 115,489 Régression 1069224 1 1069224 4,015E+03 7,510 124,149 Erreur de modèle 2798 6 466 1,75E+00 3,4310 120,3 Erreur expérimentale 8521,439914 32 26615 172,68 411,184891 Totale 1080543,747 3915 197,2315 182,8915 191,40115 195,325

20 265,18 904,280307 CONCLUSIONS20 245,0920 230,212 Limite de détection 0,4 mg/L20 259,66 Limite de quantification 2,8 mg/L20 235,6830 372,365 5222,51015 Linéarité modèle de régression linéaire acceptable30 302,716 domaine d'étalonnage validé30 376,76630 397,099 REMARQUE:30 375,96340 502 1833,9099740 550,9840 506,37540 541,8340 525,745

CARACTERISATION DE METHODEANALYSE sulfates

Gamme forte

TEST DE LINEARITE

Représentation graphique

y = 0,076383x + 0,735537R2 = 0,989524

01020304050

0 200 400 600

Annexes

286

Annexe 10 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le

calcul des indices de saturation des minéraux métallo-carbonatés

Annexes

287

Annexe 11 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le

calcul des indices de saturation des sulfures métalliques

Annexes

288

Annexe 12 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées

pour la modélisation de la spéciation des métaux en fonction du

pH et des acides organiques

a) Acide acétique

b) Acide lactique

Annexes

289

c) Acide succinique

Annexes

290

d) Acide propionique

e) Acide butyrique

Annexes

291

f) Acide oxalique

Annexes

292

Annexe 13 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées

pour la modélisation de la spéciation des métaux à pH 6 avec

mélange des acides organiques

Résumé Les activités anthropiques entraînent une contamination des sédiments de rivière en de nombreux polluants et en particulier en éléments traces métalliques (ETM). Si la majorité des ETM se retrouvent piégés dans les sédiments, ceux-ci peuvent être remobilisés et passer en solution dans certaines conditions physico-chimiques et sous l’action des microorganismes autochtones. Les métaux relargués peuvent alors constituer un danger potentiel pour les organismes vivants dans les sédiments et dans la colonne d'eau. Dans le cas des sols, l’impact de l’activité microbienne autochtone sur la mobilité des ETM a souvent été rapporté. Cependant une telle activité de solubilisation n’a été que rarement étudiée dans le cas des sédiments. Une telle connaissance est pourtant importante pour la prédiction du comportement des métaux contenus dans les sédiments et la gestion de ces derniers, notamment lors de leur stockage suite aux opérations de dragage. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de comprendre et d’évaluer l’importance de certains des processus microbiens et chimiques de mobilité des ETM dans les sédiments en conditions anaérobies. La première phase de notre étude qui a consisté à incuber des sédiments de Seine et de Marne en milieu anaérobie dopé en glucose avait pour objectif d’étudier la corrélation entre le métabolisme microbien et le comportement des métaux en solution et dans les sédiments. Dans ces conditions opératoires, une forte solubilisation du fer et du manganèse (sous forme réduite) associée à une solubilisation de métaux traces (Co, Cu, Ni) a été mise en évidence, ce qui a laissé supposer l’intervention de bactéries ferri-réductrices dans les phénomènes observés. Une activité fermentaire importante a été observée et caractérisée par la production d’acides organiques majoritaires tels que les acides acétique et butyrique. Un tel résultat souligne l’importance des bactéries fermentatrices dans les phénomènes de dissolution observés. La deuxième étape de ce travail a consisté à confirmer l’importance de l’activité ferri-réductrice et à en identifier les acteurs principaux. Les analyses moléculaires menées ont montré que les bactéries ferri-réductrices majoritairement identifiées, appartiennent aux espèces Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa. L’utilisation d’un modèle géochimique nous a permis de montrer que les voies métaboliques supportant la réduction du fer et la mobilité des métaux étaient les fermentations butyrique et acétique. La troisième étape a consisté à comparer les impacts directs (réduction enzymatique) et indirects (propriétés des acides organiques produits) de Paenibacillus polymyxa et Clostridium butyricum sur la mobilité du fer, du manganèse et des autres métaux. Une telle étude a montré que les acides organiques produits (acétique, lactique, succinique, propionique et butyrique) ont un très faible impact sur la solubilisation aux pH rencontrés dans les sédiments et que la réduction enzymatique microbienne est le principal mécanisme de dissolution des éléments métalliques en milieu anaérobie.

Mots-clés : éléments traces métalliques, sédiments, bactéries ferri-réductrices, fermentation

UNIVERSITE PARIS 12 – VAL DE MARNE THESEdoxa.u-pec.fr/theses/th2008PEST0074.pdf · Microbial...

Documents

Transcript of UNIVERSITE PARIS 12 – VAL DE MARNE THESEdoxa.u-pec.fr/theses/th2008PEST0074.pdf · Microbial...