UNIVERSITE DE NANTES

FACULTE DES SCIENCES ET DES TECHNIQUES

ETUDE DU FRACTIONNEMENT ISOTOPIQUE NATUREL

DANS DES EAUX, DES JUS DE FRUITS ET CAFE DE COTE-D'IVOIRE.

COMPARAISON ENTRE DES PRODUITS MODELES

ET DES PRODUITS DU COMMERCE

THESE DE DOCTORAT D'ETAT

Discipline : SciencesSpécialité : Chimie moléculaire

présentée et soutenue publiquement par

Doubou DANHO

le 1er Mars 1990

devant le jury ci-dessous

M. MARTIN Gérard, Professeur à l'Université de Nantes

M. CARRIE Robert, Professeur à l'Université de RennesM. SINAy Pierre, Professeur à l'Université de Paris VI

Président

} Rapporteurs

M. N'GUESSAN Thomas Yao, Professeur à l'Université d'Abidjan }ExaminateursMme MARTIN Maryvonne, Professeur à l'Université de Nantes

Directeur de Thèse : M. Gérard MARTIN

Ce travail a été effectué au Laboratoire de RMN et Réactivité Chimique de la

Faculté des Sciences et des Techniques (Université de NANTES), cependant que les

premiers essais de fermentation de jus de fruits ont été réalisés au Laboratoire de Chimie

Organique Structurale de l'Université d'Abidjan.

Je remercie vivement les Professeurs M.-L. Martin et G.-J. Martin de

m'avoir maintenu leur confiance quant à l'issue de ce travail en dépit de mes conditions

de séjour au Laboratoire assez particulières de 1984 à 1988. Je suis particulièrement

sensible à l'honneur qu'ils me font de participer tous les deux à ce jury de thèse.

Je tiens à remercier MT le Professeur R. Carrié et MT le Professeur P. SinaS'

d'avoir bien voulu juger mon travail.

Je voudrais enfin, remercier Mr le Professeur T. Y. N'Guessan d'avoir

effectué le déplacement à Nantes pour juger ce travail.

Mes remerciements vont aussi à tous les membres du Laboratoire, notamment à

Mme F. Lantier, MM. M. Trierweiler et N. Naulet pour l'intérêt porté à ce

travail, et à tous les Collègues Enseignants de la Faculté des Sciences et des Techniques

d'Abidjan qui ont assuré mes heures de cours pendant mon séjour à Nantes.

** *

REMERCIEMENTS

Les dépJacements annuels que j'ai dû effectuer entre Abidjan et

Nantes au cours de ce travail m'ont conduit à mettre de

nombreux amis, connaissances et proches à contribution. Je

tiens à les remercier pour leur compréhension et leur renouvelle

mon amitié:

- Mr Brou LOUKOU, Architecte à Abidjan;

- Mr Thomas DIACO, Maître-Assistant à Abidjan;

- Mme Dominique Bernard de Sanchez, Assistante à Abidjan;

- Mr Seikou Amadou Touré, Assistant à Abidjan;

- Mr Degny Etchié, Maître de Conférence à Abidjan;

- Mme Claude Vallet, CNRS à Nantes;

- Mme Annick Durand et Mr Michel BourigauJt, à Nantes;

- Mlle Sandra Rabiller, à Nantes;

- Jean et Nicole DAVID, à Nantes;

- Bernard et Colette AIRIEAU, Le Cerisier (Vendée).

Mes remerciements vont enfin aux Sociétés et Institut de

recherche de France et de Côte-d'Ivoire .. qui nous ont fourni

gratuitement des échantillons de fruits, de jus de fruits, de

café, ainsi que des données météorologiques de 1983 à 1988

• Bric-Fruit (Mr Claude Mineau), à La Haye-Fouassière;

- Katell-Roc (Morbihan);

- La Cana, à Ancenis (Loire·Atlantique);

- Arômes de Bretagne (IlIe·et-Vilaine);

- IRCC (Mr Irié Bi ZahouJi), à Bingerville;

• SAFCO (Mr Zahoui), à Tiassalé;

• ANAM (Mrs Bilé et N'Zi), Service de la Météorologie

NationaJe, à Abidjan .

** *

A

FRANÇOIS,

A mes Parents

HELENE

et

ANNIE DANHO

Ahoua DANHO Amos

KOUTOUAN Akolia Dina

SOMMAIRE:

l:i1œ: Etude du Fractionnement Isotopique Naturel dans

des Eaux, des Jus de Fruits et Café de Côte-d'Ivoire.

Comparaison avec des Boissons alcoolisées et Bases

puriques du Commerce.

INTRODUCTION GENERALE:

Première Partie:

METABOLISME et ENVIRONNEMENT

!:..b api t rel . Physiologie des Plantes C3, C4 et

CAM.

1·1. 1 n t r 0 duc t ion : 5

1-2. Rappels bibliographiques de Physiologie Végétale : 6

1-3. Con c 1 u s ion ............................................13

!:..b api t r e 2. Etude du Fractionnement Isotopique

dans des Eaux Naturelles de la Côte-d'Ivoire.

2·1. 1 n t r 0 duc t ion : 16

2-2. Résultats et Discussion: 18

2-2-1. Corrélations entre BD et B18 0 des eaux de la nappe

phréatique; 19

2-2-2. Influence des facteurs géographiques sur les paramètres

isotopiques BD et B180 des eaux ; 21

2-2-3. Influence des facteurs météorologiques sur les teneurs en

deutérium et en oxygène-18 des eaux ; 24

2-3. Con c 1 u s o n ..............................................27

ç h api t r e 3 . Discrimination des isotopes 2U, 13C et180 par les Plantes C3, C4 et CAM.

li: Application de la RMN quantitative 2U à l'étude d'une plante

CAM : Ananas cosmosus L. . Comparaison avec des Plantes C3 et

C4 issues de la même région géographique.

3-1.1. 1 n t r 0 duc t ion: 29

3-1-2. Résultats ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••32

3-1-3. Interprétation et Discussion des résultats: 37

3-1.4. Con c 1 u s ion : 42

H: Discrimination du Carbone-13 par les Plantes C3 ,C4 et

CAM.

3-2·1. 1 n t r 0 duc ton : 43

3·2·2. Rés u 1 t a t s 44

3·2·3. Interprétation et Discussion: .47

3·2·4. Con c 1 u s ion: 52

J.:.J. : Distinction des trois types photosynthétiques C3, C4 et CAM

au moyen des rapports isotopiques 180/160 .

3-3-1. 1 n t r 0 duc t ion : 53

3·3·2. Rés u 1 t a t s et Dis c u s s ion : 55

3·3-3. Con c 1 u s ion : 62

li. Influence des facteurs météorologiques sur les teneurs

isotopiques des substances organiques et des eaux de plantes C3,

C4 et CAM.

3·4.1. 1 n t r 0 duc t ion : 64

3·4·2. Résultats et Interprétation : 66

3·4·3. Con c 1 u s ion : 74

Deuxième Partie:

EFFETS MECANISTIQUES de la FERMENTATION

Cha pit r e : 4. Transferts Isotopiques au cours de la

transformation du glucose en éthanol par Saccharomyces

cerevisiae .

4-1. 1 n t r 0 duc t ion : 76

4-2. Matériels et Méthodes 77

4·3. Rés u 1 t a t s : 80

4-3-1. Effet de la nature botanique des sucres; 80

4-3-2. Effet des mélanges de sucres; 81

4-3-3. Influence de la teneur isotopique du milieu

de fermentation; 83

4-3-4. Influence de la concentration en sucres; 84

4-3-5. Résultats spécifiques relatifs à la formation

de la biomasse. . 86

4-4. Discussion des Résultats : 87

4-4-1. Paramètres de redistribution B13C 88

4-4-2. Coefficients de transfert des isotopes B18a 89

4-4-3. Détermination multidimensionnelle des paramètres de

redistribution 2 H 92

4-5. Con c 1 u s ion : 96

Troisième Partie:

CARACTERISATION D'ORIGINE ET DE

QUALITE DES PRODUITS ALIMENTAIRES.

Cha pit r e : 5. Etude du Fractionnement Isotopique

Naturel des Ethanols de céréales, de jus de fruits et de

plantes sucrières.

5-1. 1 n t r 0 duc ton 97

5-2. Résultats et Discussion: 100

5-2-1. Utilisation des molécules d'eau et d'éthanol comme

enrégistreurs du métabolisme des plantes et des conditions

climatiques; 101

5-2-2. Distribution des isotopes stables dans des éthanols issus de

plantes; ........................................................•...... 102

5-2-3. Représentation et classification des groupes; 105

5·3. Con c 1 u s ion : ......•.....................................109

Cha pit r e 6. Contribution à l'étude des Bases

Puriques au moyen de la RMN quantitative 2H et de la

SMRI (ôD, ô13C et ô15N ).

6·1. 1 n t r 0 duc ton 112

6-2. Résultats des mesures par spectrométrie de masse : 114

6-3. Interprétation et Discussion : 119

6-4. Résultats et Discussion des rapports isotopiques spécifiques

(D/H)i: 122

6-5. Con c 1 u s ion : 129

CONCLUSION GENERALE : 131

PAR T 1 E EXP E R 1 MEN T ALE : 135

B 1 B LlO G R A PHI E : 149

Liste des TABLEAUX et FIGURES

** *

INTRODUCTION

1

GENERALE

S'il existait un doute quant à la nécessité d'une étude de la photosynthèse des

végétaux supérieurs, nous rappellerions - sans aucune prétention de notre part - la récente

attribution du Prix Nobel de Chimie à trois chercheurs Allemands" pour l'élucidation de la

structure moléculaire du centre réactionnel d'une bactérie photosynthétique" (Le Monde,

1988).

On sait depuis plus d'une cinquantaine d'années que la composition isotopique d'une

molécule donnée peut varier en fonction de son origine géographique: il en est ainsi de l'eau

de robinet d'Abidjan ( D/H = 154,5 ppm ), de celle de Nantes ( D/H = 150,0 ppm ) et de

l'eau de la région Antarctique ( D/H = 89,0 ppm ) - Gonfiantini, 1978 - . La composition

en isotopes stables des composés organiques et des jus de fruits n'échappe pas à cette

observation. Celle-ci s'explique par la propriété que possèdent les plantes supérieures de

discriminer les isotopes lourds 2H, l3C et 180, selon leur appartenance à un type métabolique

détenniné.

Les espèces végétales des pays tropicaux sont essentiellement alimentées par les eaux de la

nappe phréatique, en dehors de la saison des pluies dont la durée moyenne est de trois mois

par année. Seules les eaux de précipitation alimentent celles du sol et du sous-sol. Nous avons

donc entrepris d'analyser les facteurs géographiques (longitude, latitude, altitude et distance à

l'océan) et de l'environnement (température, précipitation, humidité relative et insolation) qui

sont susceptibles d'influencer la composition en isotopes stables 2H et 180 de ces eaux

d'alimentation des plantes aériennes considérées dans ce travail (Chapitre 2).

La répartition des différentes plantes en groupes C3, C4 et CAM par la Physiologie

végétale, reposait initialement sur des critères physiologiques (anatomie de la structure des

feuilles notamment), puis plus tard sur le mode de fixation du C02 atmosphérique par ces

végétaux supérieurs. Enfin, depuis la découverte des isotopes et l'avènement des techniques

d'analyse isotopique par spectrométrie de masse, cette différenciation a trouvé des fondements

quantifiables grâce aux mesures isotopiques.

2

En effet, les rapports isotopiques en abondance naturelle constituent l'une des meilleures

méthodes d'investigation de la physiologie des plantes et des mécanismes de leurs réactions de

biosynthèse (Garson et Staunton, 1979 ; Hutchinson, 1982). Ainsi les rapports

13C/12C du C02 ou d'un composé organique quelconque extrait d'une plante, constitue une

méthode standard pour la détermination du type métabolique de cette plante.

Les dénominations C3 et C4 trouvent leur justification dans le fait que, d'une part, le

premier produit de la photosynthèse des plantes qui utilisent le cycle C3 est le

3-phosphoglycérate, composé à trois atomes de carbone, et que d'autre part, celui des espèces

qui suivent la voie C4, est un composé tétracarboné, l'oxaloacétate. Par contre, la

dénomination CAM (Crassulacean Acid Meatabolism) traduit à la fois une appartenance

systématique et une caractéristique photosynthétique.

Pour en savoir plus sur cette classification, nous avons étudié par deux méthodes d'analyse

isotopique ( RMN 2H et Spectrométrie de masse) :

- des plantes C3 : riz (Oriza sativa L. ), oranges (c. aurantium dulcis) et pamplemousses (

Citrus aurantium decwnana );

- des plantes C4 : maïs (Zea mays), mil (Eleusine coracana), sorgho (Sorghum vulgare)

et canne à sucre ( Saccharum officinarum );

- et une plante CAM: Ananas cosmosus L.

à travers la molécule d'éthanol résultant, soit de la fermentation de glucoses obtenus par

hydrolyse acide des amidons, soit de la fermentation directe de jus sucrés, à l'aide de la levure

de boulangerie appartenant aux espèces Saccharomyces cerevisiae (Chapitre 3, § 1, 2 et

3). Les plantes C3 qui fixent le C02 libre selon le cycle de Calvin (Calvin et Bassham,

1962) ont des sucres à rapports isotopiques 13C/12C relativement faibles; les sucres dérivant

de plantes C4 (voie de Hatch & Slack) - Hatch et Slack, 1966 - ont les teneurs en

carbone-l3 les plus élevées, tandis que les sucres provenant de plantes CAM, possèdent des

paramètres Bl3C intermédiaires entre ceux des espèces C3 et C4. Nos résultats montrent que

cette observation est également vraie pour les valeurs isotopiques BD et Bi80. La complexité

du système CAM est cependant loin d'être totalement élucidée.

3

Afin de pouvoir appréhender l'incidence des conditions météorologiques sur les teneurs

isotopiques ôD et ô13C des substances organiques, et ôD et ô18a des eaux issues de plantes

C3, C4 et CAM, nous avons soumis l'ensemble des paramètres isotopiques mesurés et des

données climatiques relatives aux origines géographiques des échantillons étudiés (et collectés

en 1987) à un traitement statistique (Chapitre 3~ §3-4).

Nous avons ensuite appliqué les résultats de cette analyse multi-isotopique des jus naturels

de Citrus, de canne et d'ananas, à la vérification de l'authenticité de plusieurs dizaines de jus

de fruits de commerce. En effet, le développement très rapide de la demande des

Consommateurs en jus de fruits (oranges, pamplemousses, pommes et ananas), a eu pour

conséquences, un recours à l'adultération (mouillage, addition de sucres exogènes) ou des

fraudes à l'étiquetage Gus de fruits reconstitués vendus purs jus naturels). Il y a donc un intérêt

économique, indépendamment de la défense des Consommateurs, à disposer de tels critères de

vérification. L'ensemble des paramètres isotopiques de ces jus naturels et commerciaux a

permis de constituer une banque de données en vue d'éventuelles expertises par suite de

pratiques frauduleuses dans le commerce des boissons non alcoolisées.

Malgré les innombrables informations sur les différentes réactions biochimiques et

physiologiques auxquelles elle a permis d'accéder, la spectrométrie de masse, du fait qu'elle ne

fournit que des rapports isotopiques moyens, limite singulièrement les informations relatives

aux mécanismes de la biosynthèse des composés organiques.

La méthode RMN-FINS (Martin et Martin~ 1981) permet de combler cette lacune

puisqu'elle donne accès aux rapports isotopiques spécifiques (D/H)i des différents sites

monodeutériés d'une molécule organique pure. Son application à la molécule d'éthanol issu de

plantes de diverses origines botaniques, conduit à la différenciation des trois types

métaboliques à l'aide des paramètres (D/H) l, mais aussi à la distinction entre des échantillons

de jus de Citrus "chaptalisés" et les purs jus naturels (Chapitre 5), tandis que les valeurs

(D/Hh informent sur l'origine géographique de l'échantillon de jus sucré dont dérive l'éthanol

considéré (Chapitre 3~ § 3-1).

4

En plus des mesures isotopiques l3e, 2H et 180, nous avons, pour la première fois à notre

connaissance, appliqué la méthode d'analyse isotopique en abondance naturelle 15N à des

composés azotés purs, la Xanthine et ses dérivés. L'un des principaux résultats obtenus est

que les rapports isotopiques 15N/14N permettent de distinguer les différentes variétés de café

entre elles (Chapitre 6).

Enfin, cette récente méthodologie, appliquée à la molécule de caféine, fournit de précieux

renseignements sur les mécanismes de la méthylation du noyau des Xanthines, et sur l'origine

géographique du café ainsi étudié (Chapitre 6).

** *

5

Première Partie:

METABOLI8ME et ENVIRONNEMENT

Chapitre 1 Physiologie des Plantes C3, C4 et CAM.

1·1. 1 n t r 0 duc t ion:

La plupart des espèces végétales assimilent le C02 atmosphérique selon l'une des trois

voies C3, C4 et CAM (Crassulacean Acid Metabolism). La dénomination des voies C3 et C4

traduit le nombre d'atomes de carbone du composé final issu des réactions biochimiques

caractéristiques de chacune d'elles. Le symbole du CAM quant à lui se rappone à la fois à une

caractéristique métabolique et à une appartenance systématique (Bourdu, 1976).

Si les plantes à métabolismes C3 et C4, plus répandues et mieux étudiées sont à présent

bien connues, il n'en est pas de même du Métabolisme Acide Crassulacéen ou type CAM selon

la terminologie anglo-saxonne. L'étude systématique des espèces CAM par la Physiologie

végétale est plus récente. Elle a permis de montrer que de par sa traduction en terme de

composition isotopique, ce mécanisme est intermédiaire entre les types C3 et C4. Il apparaît

ainsi qu'une plante CAM peut être tantôt à dominante C3, tantôt à caractère C4 dominant

(Deléens et Garnier·Dardart, 1977). La rareté des travaux consacrés à ce type de plantes

en général pourrait s'expliquer par la complexité de leur mécanisme photosynthétique et par le

fait que ces plantes grasses sont peu répandues, contrairement aux espèces de type C3 et C4. Il

existe pourtant une espèce CAM par excellence, fon répandue, l'une des rares sans doute à être

cultivée à grande échelle, c'est l'Ananas (Ananas cosmosus L.) - et sa variété commerciale,

Cayenne lisse -.

La première cause des différences que l'on observe dans la composition isotopique des

tissus au sein du monde végétal est celle liée à la spécificité des caractères anatomiques de

chaque groupe de plantes. En effet, le fractionnement isotopique associé aux transformations

biochimiques intracellulaires vient en supplément de celui dû au transfen intercellulaire de

matière dont la mobilité diffère selon les isotopes véhiculés et la physiologie de la plante

considérée.

6

Cene observation nous a paru suffisamment importante pour nous décider à introduire la

présentation de ce travail par un chapitre sur des éléments bibliographiques de la physiologie

des espèces végétales de type C3, C4 et CAM. Nous sommes convaincus que ce rappel

contribuera à l'interprétation et à une meilleure compréhension de la discrimination des

isotopes par ces plantes.

1-2. Rappels bibliographiques de Physiologie Végétale

En Physiologie végétale, la classification des végétaux supérieurs en grands groupes

était d'abord fondée sur les structures foliaires et anatomiques, puis plus tard sur les différents

modes de fixation du CÜ2 libre par ces végétaux.

COU... Ir.n....rllal. d"une ,...m.

A pl.nl. en C.

• • • • •••• • • • •• • •

• •• ••

taca lup.rieur.

• ••••• •--- cellule. panl,Niqu••

•• •

FiKure 1-1: Coupe transversale dans une feuille de plante en C3. D'après Berkaloff et

coll., Biologie et Physiologie Cellulaire, III, Hermann, 1981.

En effet, sans qu'ils puissent établir une relation univoque et causale entre la fixation du

7

COz par les plantes et leurs structures, les Physiologistes ont observé qu'à chaque type

métabolique correspondent des caractères structuraux propres et différents, que l'on rencontre

plus souvent chez les uns que chez les autres (Bourdu, 1976). Il en est ainsi de la porosité

des feuilles et de l'ouverture des stomates, diurne chez les plantes C3 et C4 , et nocturne chez

les espèces de type CAM.

1·2·1. Structures foliaires et anatomiques des plantes C3, C4 et CAM.

Les plantes C3 possèdent des feuilles de faibles dimensions, largeur et épaisseur

notamment, ce qui entraîne un rappon Volume/Surface très faible. D'une façon très générale,

elles sont caractérisées par de nombreuses lacunes dans la structure des feuilles. Il s'ensuit

qu'elles ont des échanges gazeux très imponants (Gerbaud, 1981).

8 pIMte .. C.

Ieee "'~rleu,.

lace inltneure

Fiente 1·2: Coupe transversale dans une feuille de plante en C4. D'après Berkaloff et

coll., Biologie et Physiologie Cellulaire, III, Hermann, 1981.

8

Ce qui frappe à première vue chez les plantes C4 (maïs et canne à sucre notamment), c'est la

longueur des feuilles. Par rapport aux plantes C3, ces feuilles sont plus larges et plus épaisses.

Les Physiologistes parlent de structure en couronne (ou de type Kranz), caractérisée par la

présence de gaines périvasculaires, véritables réserves d'eau, contrairement aux plantes C3

(Bourdu, 1976).

Spécificité de la physiolQ2ie de l'ananas: L'ananas est un exemple unique parmi

les végétaux cultivés à grande échelle, de plante à métabolisme acide crassulacéen. Il est

produit sur les cinq continents et dans plusieurs pays dont :

- Brésil, Mexique, Hawaï, Martinique (Amérique);

- Chine, Inde, Philippines, Thaïlande (Asie);

- Cameroun, Côte-d'Ivoire, Kénya, Zaïre, Afrique du Sud (Afrique);

- Açores, Canaries (Europe);

- Australie, Polynésie française (Océanie) - Py et al., 1984 -

La plante d'ananas que nous avons eu l'occasion d'observer à plusieurs reprises, est

caractérisée par des feuilles de dimensions moyennes, intennédiaires entre celles des feuilles de

Plantes C3 et C4.

Elles sont épaisses, très compactes et donc difficiles à déchirer. On remarque en outre

qu'elles sont recouvertes d'une fine pellicule blanche qui les met pratiquement à l'abri de toute

transpiration au soleil. Contrairement aux espèces C4, les plantes CAM n'ont pas de gaines

périvasculaires. Elles ont cependant la particularité essentielle de résister à la sécheresse par

rétention d'eau, car les stomates (tubes respiratoires des feuilles), peu nombreux, restent

fermés à la lumière, ce qui réduit dans de fortes proportions leurs échanges gazeux (Moyse,

1976), comme l'atteste la faible valeur du rapport Surface/Volume des feuilles. D'après

Osmond (1978), une diminution de l'alimentation hydrique se traduit par une réduction de

l'absorption du C02.

Par contre, quand la quantité de précipitations augmente, on observe une ouverture précoce

des stomates, ce qui peut entraîner un accroissement diurne de l'évapotranspiration qui

9

l ""IDON

PO.

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CIlIO'ODI..,.

'"jAOP + po,

CYTOPLASME

FiI:ure 1·3: Cycle de Calvin.

est pratiquement nulle dans les conditions où les facteurs climatiques évoluent vers une plus

grande sécheresse (Py et al., 1984). Cette alimentation en eau apparaît ainsi comme le

premier facteur régulant le mécanisme crassulacéen, puis viennent la thermopériode journalière

commandée par les variations de température, et le rayonnement global (insolation) dont

l'action sur le rendement de la photosynthèse est bien connue.

Enfin, grâce à sa morphologie, la plante d'ananas possède une efficience hydrique très

élevée: stockage de l'eau dans des tissus aquifères, très bonne utilisation de faibles pluies et de

la rosée.

Selon Py et al.(1984), il existerait un équilibre entre les différentes voies

photosynthétiques dont l'évolution dépend des paramètres climatiques. Ainsi, lorsque le déficit

hydrique va vers une plus grande sécheresse ou en présence d'une plus grande amplitude

thermique, cet équilibre se déplacerait vers le métabolisme crassulacéen. Celui-ci apparaît donc

comme un moyen pour les plantes de poursuivre leur activité photosynthétique, mais à un

rythme réduit, tout en consommant très peu d'eau.

10

Par contre, si ces plantes ont une activité de type C3 ou C4, la photosynthèse, mais aussi la

consommation d'eau, seront plus élevées.

1·2·2. Différentes voies de fixation du C02 atmosphérique par les végétaux

supérieurs.

Les plantes à métabolisme C3 sont constituées par la quasi totalité des arbres fruitiers des

régions tempérées ou à climat humide. Pour ces espèces, la fixation initiale du C02

atmosphérique a lieu à la lumière.

Cette réaction est catalysée par une enzyme, la Ribulose 1,5·di phosphate

Carboxylase, et aboutit à la formation d'un composé à 3 atomes de carbone, le

phosphoglycérate, d'où leur dénomination de plantes C3. Les composés tricarbonés obtenus

sont ensuite réduits en glucides.

Air

llSJ

1

celluledu

mesophylle

cellule dela pine

vuc:ulaire

/ OxaJoacetate _.;;.""__ Phosphoenolpyruvate "

NAD'Hj, r,,"\IP • PP,

NADP- [ ~ AT? + P,

Ma!ate Pyruvate

r::===::> 1C==NAO==P=.=N=AD==PH==~)fc=====::\.~Malate -~_....+---Pyruvate

C~

~3PC RuDP

~GI._1

Membranescellulaires

Fjpre 1·4: Cycle de Hatch & Slack (Lehninger, p. 671, édition 1985).

1 1

Le mécanisme de fixation et de réduction du C02, appelé cycle de Calvin, est

exclusivement localisé dans les chloroplastes (Calvin et Bassham, 1951).

Les espèces de type C4 auxquelles appartiennent la plupart des végétaux d'origine

tropicale, fixent le CÜ2 libre d'abord à la lumière.

PEPC MOH EMCO2 + PEP .. AOA ~. malat- ---..:=-__ CO, .. <:::::- pyr + 2

NADH l:t "-pool NADPH

--..... """ ~.-...... ..... ~réactions dominantes pendant la nuit :dominantes pendant le jour

11,

",.--:- ......... ------ : ..................

......... Teneur y .........,... en malate ........, ....

~ ....~~ ........

~ ...... ~~

c:.2;;te

:'=0r--------~---~-..jo

18h 9h1

18h

Fjpre 1·5: Schéma de la compartimentation dans le temps de la chaîne de réactions

caractéristiques du CAM. Feuilles jeunes de Kalancho blossfeldiana après 25 jours courts,

d'après Queiroz (1976).

12

Cette carboxylation est catalysée par une enzyme, la Phosphoénolpyruvate

Carboxylase. Le produit final de cette réaction est un oxaloacétate (composé tétracarboné),

d'où la dénomination de plantes C4 attribuée à ces végétaux. On dit aussi qu'elles assimilent le

C02 selon le cycle de Hatch et Slack.

La principale caractéristique - et donc l'originalité - des plantes CAM est sans aucun doute la

compartimentation dans le temps de la chaîne de leurs réactions photosynthétiques.

On observe chez ces végétaux que l'étape de la fixation primaire de C02 est identique au

mécanisme C4 sauf - et c'est la différence essentielle - qu'elle a lieu à l'obscurité.

Les stomates, ouverts la nuit, sont fermés le jour et permettent une absorption du C02

atmosphérique tout en réduisant au maximum les pertes d'eau. L'oxaloacétate formé est

aussitôt réduit en malate qui fournira le jour suivant le C02 nécessaire à la carboxylation du

Ribulose 1,5-diphosphate, avec formation de composés trlcarbonés (Moyse, 1976).

En résumé, nous dirons que les plantes non CAM, de type C3 ou C4 ont une fixation de

C02 atmosphérique uniquement diurne, et pendant la même période, leur perte d'eau par

évapotranspiration est maximale comme la température. Pour les plantes CAM typiques ­

comme l'ananas -, au contraire, le besoin de lumière et la fixation de C02 sont séparés dans le

temps; pour elles la perte d'eau maximale accompagne la fixation nocturne, et est donc moindre

que dans le cas des espèces C3 et C4 (Moyse, 1976).

1-2-3. Activités photosynthétiques des plantes C3, C4 et CAM.

L'activité photosynthétique des plantes est essentiellement gouvernée par un

paramètre météorologique: la température. C'est ce paramètre, et lui seul, qui permet

d'atteindre le seuil optimum de l'activité photosynthétique (Moyse, 1976; Somerville et

Somerville, 1984).

Chez les plantes C3, le résultat essentiel de cene activité est qu'elle conduit à une importante

perte du CÜ2 initialement fixé.

13

Les végétaux de type C4 ont pour principale caractéristique d'avoir une fone affinité pour

le C02, et donc de le concentrer dans leurs cellules sous forme de malate.

Quant aux plantes CAM, leur activité photosynthétique reste très variable, et difficilement

mesurable car elle se manifeste essentiellement pendant la nuit

Les principales caractéristiques de l'activité photosynthétique des plantes C3, C4 et CAM

ont été établies par Zélitch (1971) et Black (1973), et résumées dans le tableau ci-après:

1C3

1'4

1CAM

Intensité lumineuse

1

1saturation non :1ttemte 1 VT:Iisemblablement <:lU platuu de satura- SO - 150tion (air) en W.m·: pour SOO oue celle des C~

. 1 •

T optimale de

1

15 - ~o C1

30-~7° C i :.: 3SO Cphotosynthèse

Point de compensati01 30-701

0-10 1 0 à .200 selon ~ ~nodede C02. ppm. en voL du Jour

Ouverture des storna-

1snnde

1f:Lible 1nulle ou presquetes j la lumière

apoarente (20 i 50 $ de non :1ooarente, 10 iolS

I,ppum"Photorespir:ltion b. photosynthèse brute. plus faible en moyen-

d:Ins l':1ir selon T, 3 i S fois plus ne que la respuationgr:l.rIde que la le$pira- à l'obscuritétion à l'obscurité

Vitesse de la photo-synthèse nene :mg CO., dm':h- 1

10- 30 50 - 70 1·10Clum. satunnte,C02 = 300ppm02=21%.T=25°C

Tableau 1-1: Quelques caractéristiques de l'activité photosynthétique des plantes de type

C3, C4 et CAM, d'après ZéJitch (1971) et Black (1973).

1-3. Con c 1 u s ion:

La complexité des contributions isotopiques au cours de la photosynthèse des végétaux

supérieurs vient en panie de la multiplicité de leurs structures anatomiques et foliaires.

Celles-ci déterminent l'imponance des facteurs de fractionnement relatifs aux isotopes lourds

2H,13C, 180 et 15N.

14

Le mérite de la Physiologie végétale est d'avoir fait apparaître des caractères généraux liés à

chaque type métabolique. Nous pensons que ces éléments de physiologie éclairent relativement

bien les fractionnements isotopiques observés panni les espèces qui utilisent les trois

principales voies photosynthétiques, et associés à la fixation du C02, à l'assimilation de

l'azote et au transfert de l'eau dans les cellules de ces plantes.

*

* *

15

Dans tout ce qUI suit, nous formulerons les corrélations linéaires par

l'équation: Y= ao + alX , dans laquelle ao et al désignent respectivement

l'ordonnée à l'origine et la pente des droites considérées.

Nous définissons par ailleurs tous les paramètres isotopiques 1 utilisés dans

ce travail sous la forme :

(L/O éCh • J *ôI(%() = (LlO - 1 1000

std.

où LI) représente le rapport isotopique absolu de l'isotope lourd L sur

l'isotope léger) de l'échantillon considéré i ou de l'étalon international qui a

selVi de standard (std.). C'est ainsi que:

- pour LI) = 2U/1 U ou 180/160 ,la référence internationale utilisée est

le SMOW (Standard Mean Ocean Water);

- pour LI) = 13C/12C, cette référence est le PDB (Pee Dee Belemnite);

- enfin, pour LI) = 15N/14N, on utilise plus communément l'azote

atmosphérique.

*

* *

CARTE ADMINISTRATIVEET STATIONS METEOROLOGIQUES

DE COTE D'IVOIRE

BURKINA- FASO

GUINEE

LIBERIA

29

IABIO~AN 1 Stafion météorologique

• Principaux sommets

>l'

11

-)."587....... ,--. ....• Niéné \ ..

t'-,t "...."'-c.

• FERKESSEDO~18

Butte ou montagnea sommet plat

Butte isolée

GHANA

,11\\

100 km

~ A.lignement de collines

16

Cha pit r e 2: Etude du Fractionnement Isotopique dans

des Eaux Naturelles de Côte-d'Ivoire.

2·1. 1 n t r 0 duc t ion :

L'analyse par Spectrométrie de Masse des Rappons Isotopiques (SMRI) de la teneur en

deutérium et en oxygène-18 des eaux naturelles a fait l'objet de nombreux travaux spécifiques

de différentes régions géographiques. C'est ainsi que l'application de cette méthode d'analyse

des isotopes stables en abondance naturelle a contribué à mieux faire connaître le cycle de l'eau

à travers l'étude des eaux de précipitation. Celle-ci a permis en particulier de mieux

appréhender d'une part la contribution au fractionnement isotopique global des diverses étapes

de ce cycle (Fontes et Gonfiantini, 1967), et d'autre pan les facteurs météorologiques

qui influencent la composition isotopique de ces eaux (Dansgaard, 1964). Depuis les

travaux de cet auteur, on sait que d'une façon générale, les concentrations en isotopes stables

2R et 180 des eaux de précipitation sont essentiellement gouvernées par deux phénomènes

physiques: l'évaporation des eaux de surfaces (océans, lacs, fleuves, sources, etc ...) et la

condensation de la vapeur d'eau atmosphérique (Vuataz, 1982).

La composition isotopique des eaux de surfaces dont l'évaporation est plus intense,

notamment dans les régions à climat chaud et sec, se traduira par un enrichissement plus

important en deutérium et en oxygène-18. Plusieurs études montrent que cette teneur en

isotopes lourds est fonement soumise aux effets de la latitude, de la distance à l'océan (effet de

continentalité) et de l'altitude (Dansgaard, 1964). Cet auteur qui, le premier, a mis en

évidence les relations entre oD et 0180 des eaux de précipitation et les paramètres

géographiques et climatologiques, montre que ces valeurs isotopiques décroissent quand la

latitude, l'altitude et la distance à l'océan augmentent.

Deux des facteurs climatiques ont une nette influence sur le devenir isotopique des eaux de

précipitation: la température et l'humidité relative, du fait de leur effet sur la vitesse

d'évaporation, ce qui se traduit notamment par des corrélations linéaires entre 0180 et la

17

température (Fontes, 1976). L'importance du nombre de facteurs qui ont une influence

réelle sur la teneur isotopique de ces eaux indique d'ores et déjà qu'il faut s'attendre à des

différences sensibles dans la concentration en deutérium et en oxygène-18 entre les diverses

zones climatiques.

Le contenu et l'identité des isotopes stables de l'eau se sont avérés être d'importants

indicateurs pour détecter et suivre les évolutions climatiques d'il y a plusieurs milliers d'années

(Dansgaard et al., 1973; Jouzel et al., 1982). Plus récemment, l'utilisation de cette

méthode dans des domaines comme les sciences de la Nature, en particulier en physiologie

végétale, a foumi d'intéressantes informations sur les eaux de jus de fruits (Bricout et al.,

1972; Bricout, 1973; Dunbar, 1982; Dunbar et Wilson, 1983), sur le traçage

isotopique dans le continuum sol-plante-atmosphère (Bariac, 1987) et sur les eaux

transpirées par les feuilles de plantes terrestres (Bariac, 1988). D'après cet auteur, la vapeur

d'eau transpirée par les espèces végétales en se diluant dans celle des océans contribuerait à

modifier la teneur en deutérium et en oxygène-18 des eaux de précipitation résultantes. Quant à

l'influence des paramètres climatiques, Fôrstel et al.(1975) ont montré que les teneurs

maximales en oxygène-18 vont de pair avec une humidité relative minimale et une température

de l'air maximale.

L'eau de la nappe phréatique des pays tropicaux est alimentée uniquement par l'infiltration

dans le sol des eaux de précipitation, alors que dans les zones tempérées, en plus des

précipitations, il faut tenir compte de l'apport en eaux dû à la fonte de la neige en hiver. Cette

eau de précipitation, avant de s'infiltrer dans le sol, subit un fractionnement isotopique, plus

ou moins important, dû à l'évaporation à la surface du sol.

Enfin, sa composition en isotopes stables 2H et 180 dépend de la profondeur du puits.

Selon Barnes et al.(1983), on observe un enrichissement de ces eaux en éléments lourds

jusqu'à 20 cm, un appauvrissement de 20 à 100 cm, puis une stabilité de la teneur en

oxygène-18 au délà de 100 cm de profondeur. Cependant, d'après les résultats obtenus au

laboratoire sur les rapports isotopiques D/H et 180/160 des eaux de la nappe phréatique de

quatre régions de FRANCE (Bordeaux, Cholet, Auxerre et Mulhouse) _ Moussa, Thèse

Unique, 1990 _ , ces teneurs isotopiques sont peu variables et seraient proches de celles des

eaux de précipitation, en moyenne annuelle, de ces mêmes régions.

Nous avons réuni dans ce chapitre les résultats des mesures de la teneur en deutérium et en

oxygène-18 de plus de 100 échantillons d'eau de puits prélevés dans différentes localités de

NATURELLESISOTOPIQUE

ZONES DE PRELEVEMENTD'ECHANTILLONS D'EAUX

POUR ANALYSE

-10,4-

BURKINA- FASO

GHANA

\\\\\\

_.1\

0,"

100 km

BONDOUKOU

-.9,6

),11

-).-,,... , .......

\"\t,-,

t" ..."., l.

o FERKESSEDOUGOÜ'

-{4,.9

LIBERIA

o Vil/es où ont eu lieu les prélèvements d'eau

18

Côte-d'Ivoire. Ces eaux de la nappe phréatique ont été collectées, en même temps que des

échantillons de jus de fruits analysés dans ce travail, sur une période de quatre années (de 1984

à 1988).

Le but de ce chapitre est de mettre en évidence, au moyen de traitements statistiques, les

paramètres géographiques et météorologiques dont dépend la composition en isotopes stables

2H et 180 de ces eaux naturelles, d'analyser l'évolution de ces teneurs isotopiques au cours de

ces années de prélèvement et d'établir une carte isotopique de la Côte-d'Ivoire à partir de

l'ensemble des résultats obtenus.

2-2. Résultats et Discussion:

Nous avons indiqué sur la carte ci-contre l'ensemble des localités de prélèvement des eaux

naturelles (eaux de puits, de surface et de pluie) pendant la période de 1984 à 1988, ainsi que

les valeurs moyennes des paramètres BD de ces eaux obtenus par SMRI. Ces deux cartes

pennettent de connaître les données géographiques des lieux de prélèvement.

Abidjan Gagnoa Daloa Dimbokro Yamoussoukro

1984 -5,5 (-2,1) -4,0 (-1,8) -6,8 (-2,0) -4,2 (-2,1)

1985 -14,1 (-1,4) -5,5 (-0,1) -9,4 (-2,7) -8,7 (-2,5)

1986 -10,7 (-2,2) -5,5 (-2,4) -12,4(-2) -11,3(-1,2)

1987 -5,4 (-2,7) -0,8 (-1,4) -7,4 (-2,7) -3,7 (-1,9)

1988 -10,4(-1,4) -13,2(-1,7) -14,6(-2,2) -15,7(-1,5)

-3,0 (-1,4)

-6,8 (-1,5)

-1,7 (-0,1)

-2,1 (-1,4)

-17,2(-2,6)

TableaU 2-1 : Moyennes annuelles des valeurs BD et B180 obtenues sur l'ensemble des

eaux naturelles dans cinq stations météorologiques. Les B180 sont indiquées entre

parenthèses.

Le tableau 2-1 comporte les moyennes des teneurs isotopiques BD et B180 de ces eaux par

station météorologique indiquée dont dépendent leurs origines géographiques, et par année de

19

prélèvement.

2·2·1. Corrélation entre aD et alSo des eaux de la nappe phréatique :

Le tableau 2-2 résume l'ensemble des analyses par régression linéaire des paramètres aD et

a 180 des eaux de puits, de 1984 à 1988.

D'une façon générale, nous avons obtenu une bonne corrélation entre ces deux paramètres.

La pente aIdes droites de corrélation (figure 2-1) relatives aux différentes années de

prélèvement apparaît comme une caractéristique de la sensibilité de ces teneurs isotopiques aux

conditions climatiques subies par les eaux au cours de ces années.

ao al R cr F n

1984 8,0 6,9 0,862 0,88 60,96 23

1985 -3,8 3,0 0,914 0,38 60,58 14

1986 -1,6 3,4 0,838 0,91 14,12 8

1987 3,7 3,8 0,941 0,78 23,0 12

1988 -2,4 6,0 0,915 0,79 56,44 13

Tableau 2·2 : Résultats des régressions linéaires entre les compositions en deutérium et

en oxygène-18 des eaux de puits (n=nombre d'échantillons analysés).

Toutes les pentes des courbes aD = f(a180) sont positives, ce qui indique, comme prévu,

que les variations des teneurs en deutérium et en oxygène-18 de ces eaux naturelles évoluent

dans le même sens au cours du temps. On peut donc envisager le suivi de l'évolution de ce

couple de paramètres pendant les cinq années de prélèvement. Nous avons choisi de l'observer

à travers les résultats de l'analyse isotopique des eaux provenant de 5 stations

météorologiques choisies en fonction de la distance à l'océan (tableau 2-1).

L'examen de ce tableau montre que les variations observées d'une année à l'autre ne sont

pas linéaires comme on pouvait s'y attendre, compte tenu du nombre relativement important de

20

facteurs qui influencent ces valeurs isotopiques.

eaux météoriques _ ......

Filmee 2·1: Evolution des pentes des droites aD = f( a180) de l'ensemble des eaux

naturelles de 1984 à 1988.

Ces résultats font apparaître par ailleurs que quelles que soient la localité et l'année de

prélèvement considérées, les eaux de la nappe phréatique sont toujours plus riches en

oxygène-18 qu'en deutérium. Ceci confirme les résultats obtenus par d'autres auteurs sur des

eaux de précipitation (Dansgaard, 1964; Merlivat et Jouzel, 1979; Rozanski,

1985) et prouve par conséquent que les nappes phréatiques considérées ici sont bien

alimentées par les seules eaux de précipitation.

Enfin, on remarque que d'une année sur l'autre, si les variations de la teneur en deutérium

sont imponantes, en revanche celles de la composition en oxygène-18 sont relativement

faibles. Cette observation reste également vraie lorsqu'on parcourt les différentes stations

d'observation au cours d'une même année. On peut en conclure que la concentration en

deutérium est meilleur enrégistreur des évolutions climatiques que celle en oxygène-18.

Sur la figure 2-1, nous avons tracé la droite représentant la composition isotopique des eaux

21

de précipitation (de pluie) d'origine océanique (Craig, 1961) : ôD = 8 ô180 + 10.

L'observation de cette figure montre que les cinq droites représentées s'écartent plus ou

moins fortement de celle des eaux météoriques. En effet les pentes a1 de ces droites qui vont

de +3,0 à +6,9 sont toutes inférieures à celle de la droite des eaux météoriques (Craig,

1961), mais proches des valeurs généralement observées dans le cas de l'enrichissement en

isotopes lourds des eaux de régions tropicales (Yurtsever et Gat, 1981), soumises à une

forte évaporation (pentes de +4,0 à +5,0).

2-2-2. Influence des facteurs géographiques sur les paramètres isotopiques

ôD et ô180 des eaux.

Nous avons tenté de corréler l'ensemble des valeurs ôD et ô180 des eaux naturelles (eaux

de la nappe phréatique, de surface et de pluie) recueillies de 1984 à 1988, aux données

géographiques des localités d'où elles proviennent.

•

50 100 150 200 250 300 350 400

•

00

-2-4-6 •-8

·10-12

-14

·16

-18

-20

-22

aD

••

•

•••

•

••

•

•

•

••

Art,

ao =- 2,2

ao = - 0,03

FioR 2-3: Influence de l'altitude (AIt.) sur les valeurs ôD des eaux naturelles.

A l'exception de la variable longitude (Long.), tous les résultats indiquent une sensibilité

plus ou moins importante de ôD et ô180 à la latitude (Lat.), à l'altitude (Ait.) et à la distance

EAUX NATURELLES de 1984:

y Long. Lat. Alt. Dist. ao R F

- 0,35 - 5,84 0,07 1,08 0,1

- 3,31 15,5 0,705 0,73 20,7

- 0,03 - 2,16 0,55 0,01 9,1

- 0,02 -2,79 0,587 0,01 Il,05

BD(n=23)

-5,7 0,02 27,69 0,731 4,44 11,49

-5,785 0,01 0,02 27,81 0,733 4,54 7,35

-4,812 0,02 22,4 0,724 4,49 10,99

° -0,02 - 2,78 0,587 5,27 5,26

-3,318 -0,01 -0,004 7,3 0,766 4,41 6,4

Tableau 2·3 : Régressions linéaires entre les paramètres BD des eaux de puits (1984) et les

facteurs géographiques de leurs lieux d'origine.

EAUX NATURELLES de 1984:

y Long. Lat. AIt. Dist. R F

-0,102 -1,75

-0,351 0,17

-0,003 -1,65

-0,003 -1,72

0,165 0,01

0,594 0,1

0,505 °0,536 °

0,58

Il,43

7,2

8,45

-0,405

-0,43

0,001

°

0,42

-0,002 -1,71

- 0,001 0,58

0,596

0,536

0,596

0,66

0,69

0,66

5,5

4,03

5,51

-0,434 ° ° 0,58 0,596 0,67 3,49

Tableau 2-4: Résultats des régressions linéaires entre la concentration en oxygène-18 des eaux

de puits (1984) et les paramètres géographiques de leurs lieux d'origine.

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 Lat.0

-2 •-4 •-6 • ao = 15,5• • ••-8 • • • •·10 • a =-3 31

• o '·12 • •·14

•·16·18·20 •·22 •

8D

Fimre 2·2: Evolution des paramètres ro des eaux naturelles (1984) en fonction de la latitude(Lat).

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 Lat.-1

·1,5 ••

-2 • • •• •• ••

-2,5 • ao =0,17• •

-3 • ••-3,5 • a

1=-0,35

-4 •-4,5

8180

Fieure 2·5: Répartition des valeurs ôI8a des eaux naturelles (1984) en fonction de la latitude(Lat).

• • aO=-2,79

•• • • •t• • • a,:::-O,02

•t

150 200 250 300 350 400 450 500 I>ist.

t

50 lO

••

o·1 +--+-+--+-+--+-+---+-+---+-+--....

·1,5

-2

-2,5

-3

·3,5

·4

-4,5

318 0

Fjpre 2-4 : Variations des paramètres a180 des eaux naturelles en fonction de la distance àl'océan (Dist.).

0 50 100 150 200 250 300 350 400 Alt.

.1·,:l ~

•·2 • t t

ao=-1,65

• t t. •-2,5 • t

• al= - 0,003·3 t

• •·3,5 •

·4 t

·4,5

ai8aFhwre 2.6; Evolution des teneurs~des eaux naturelles en fonction de l'altitude(Alt).

])Îst.

22

à l'océan (Dist.). Compte tenu du nombre important d'échantillons analysés, nous avons

choisi d'illustrer ces corrélations par les résultats relatifs aux eaux de 1984 (tableaux 2-3 et 2-4

ci-contre). Ces tableaux fournissent respectivement les résultats de l'analyse par régression

linéaire entre ôD, ô180 et les facteurs géographiques, relatifs à l'année 1984.

Ces tableaux montrent que si les coefficients de régression et de corrélation entre ÔD, ô180

et la longitude ne sont pas significatifs, en revanche ceux obtenus entre ces paramètres

isotopiques et les autres facteurs géographiques le sont tous. Les figures 2-2 à 2-7 sont des

illustrations de ces corrélations simples.

o 50 10 150 200 250 300 350 400 450 500-1 +--+-+--+-+--+--+--+--+---f--+---~

-1,5 ••-2

•-2,5

-3 •-3,5

-4

-4,5

8180

••• •

•

•

•

•

••

•• a1:::-0,003

Fieure 2-7: Evolution des paramètres ô180 des eaux naturelles en fonction de la distance

(Dist.) à l'océan.

Toutes les droites ôD et ô180 en fonction des variables Lat., AIt. et Dist. possèdent une

pente négative, ce qui indique que ôD, ô180 et ces paramètres varient en sens contraire, c'est à

dire que les concentrations en deutérium et en oxygène-18 diminuent lorsque la latitude,

l'altitude et la distance à l'océan augmentent, confirmant les résultats de Dansgaard (1964)

relatifs aux eaux de précipitation.

23

Ces variations pourraient s'expliquer de la façon suivante: par suite de l'évaporation des

eaux des océans, on observe la fonnation puis le déplacement des masses nuageuses de la

proximité des océans vers les continents. Ce déplacement s'accompagnerait d'un

appauvrissement en deutérium et en oxygène-18 de ces nuages (Barïac, 1988), et par suite

des eaux de pluie qui résulteront de la condensation des vapeurs nuageuses (effet de

continentalité). Ces mêmes nuages, lorsqu'ils se déplacent en altitude perdent des isotopes

lourds 2H et 180 au passage (Blavoux, 1978). Il en résulte que les eaux de la nappe

phréatique alimentées par celles des précipitations seront elles mêmes appauvries quand

l'altitude augmente ou qu'on s'éloigne des océans. Enfin, Fôrstel et al.(1975) ont montré

que la teneur en oxygène-18 (et donc en deutérium) diminue quand on passe de l'équateur aux

régions polaires, c'est à dire quand la latitude croît.

1984

Abidjan Dimbokro Bouaké Korhogo

ôD -4,6 -9,8 -13,1 -15,2

ô180 -1,9 -2,9 -3,1 -3,1

Distance 5 164 280 475

1988

Gd Lahou Gagnoa Man Touba Ferké

ID -10,4 -12,4 -13,2 -22,2 -25,8

ô180 -1,4 -1,6 -2,4 -3,1 -3,8

Distance 0 125 336 410 570

Tableau 2-5 : Effet de continentalité sur les teneurs isotopiques ôD et ô180.

Nous avons extrait des résultats relatifs à quelques villes et pendant les périodes 1984 et

1988 (tableau 2-5), des éléments qui reflètent l'effet de continentatIité.

24

2-2-3. Influence des facteurs météorologiques sur les teneurs en deutérium

et en oxygène-18 des eaux.

Dans tout ce qui suit, les données climatiques annuelles utilisées dans cette étude ont été

calculées à partir des moyennes mensuelles des 12 mois précédant celui du prélèvement.

L'analyse de l'ensemble des résultats par un traitement statistique des données

météorologiques et des paramètres isotopiques 8D et 8180 fait apparaître que l'influence de la

température sur les valeurs isotopiques des eaux de la nappe phréatique est pratiquement

négligeable: aucun des coefficients de corrélation entre 8D, 8180 et la température fT en OC)

n'apparaît significatif. Par contre, pour une année donnée, ces teneurs isotopiques sont bien

corrélées à au moins un facteur climatique.

Les échantillons d'eau de 1988 se distinguent des quatre autres par le nombre de facteurs de

l'environnement qui semblent avoir une influence sur leurs concentrations en deutérium et en

oxygène-18. Bien que son rôle sur les individus de 1984 n'apparaîsse pas significatif,

l'insolation 1 exprimée en heures est présente parmi les variables influentes de tous les autres

groupes d'échantillons. Ce résultat semble tout à fait original dans la mesure où la plupart des

analyses isotopiques des eaux de précipitation ou des eaux de la nappe phréatiqiue ne font pas

état d'un tel rôle de l'insolation. Cependant, pour des eaux provenant d'un pays tropical, cela

paraît plutôt naturel!

al. Effet de l'humidité de l'ajr: L'humidité relative de l'air exprimée en %, apparaît

comme un facteur influençant la composition en isotopes stables 2H et 180 des eaux de 1984

et de 1988.

Ces corrélations se traduisent par des droites (figures 2-8 et 2-9) dont les pentes positives

sont comparables pour une année donnée, ce qui souligne le fait que ces teneurs isotopiques

croissent avec l'humidité de l'air.

25

60 65 70 75 80 85 H-10 •-12

•-14 ••-16 ••·18

-20 •-22

-24 •-26 •

BD

Fja:ure 2-9 : Corrélation entre la composition en deutérium BD et l'humidité relative de

l'air (en %).

Ce résultat qui est en accord avec ceux de la littérature relatifs à la composition isotopique de

la vapeur d'eau atmosphérique, pourrait s'expliquer par l'observation selon laquelle des

situations de forte humidité atmosphérique favorise l'émergence de vapeurs d'eau riches en

isotopes lourds au-dessus des surfaces (White et Gedzelman, 1984).

b/. Effet de l'jnsolation :

Les valeurs ôD et ô180 des eaux de 1985, 1987 et 1988 sont dépendantes de l'insolation.

Les droites ôD = f(l) et ô180 = f(l) qui traduisent ces relations linéaires ont toutes les deux une

pente négative, ce qui signifie que lorsque 1 croît, BD et Ô180 diminuent (figure 2-10

ci-après).

En effet, la croissance de l'insolation entraîne un développement plus important de

l'évaporation des eaux de surface et de l'évapotranspiration des espèces végétales.

26

160 170 180 190 200 210 220 1-10 •·12

•·14 •·16 • •·18 •-20 •-22

-24 •-26 •

BD

Fj2ure 2·10: Effet de l'insolation 1 (en heures) sur la teneur BD des eaux de la nappe

phréatique.

Il en résulterait des vapeurs nuageuses pauvres en isotopes lourds, et par suite des

précipitations également pauvres en isotopes stables 2H et 180 qui iraient alimenter les eaux

des nappes phréatiques en de tels éléments.

cl. Effet des précjpitations: Deux groupes d'échantillons d'eau apparaissent

sensibles à la variable P exprimée en mm d'eau tombée: les eaux de 1985 et celles de 1988.

95 10-4

-6•

-8•

-10

-12

-14

-16

-18

-20

BD

105 110 115 120 125 130 135 140 145

•

•

••

•

p

Fj2ure 2·12 : Evolution de la teneur en deutérium des eaux de puits en fonction des

27

précipitations.

Cette sensibilité est caractérisée par des corrélations linéaires illustrées par des droites de

pente négative: ainsi BD et B180 décroissent quand P croît (figure 2-12). Ces résultats sont en

accord avec ceux obtenus par Dray (1976) et par Blavoux (1978) sur des eaux de

précipitation.

La diminution des paramètres BD et B180 lorsque la quantité des précipitations croît pourrait

s'expliquer par le phénomène de dilution. En effet, les précipitations résultant de la

condensation des vapeurs d'eau transpirées par les végétaux (plantes, arbres, ... ) et de

l'évaporation des océans sont plutôt pauvres en isotopes lourds 2H et 180. L'apport en

quantités croissantes de ces eaux entraîne un appauvrissement de celles de la nappe phréatique

en deutérium et en oxygène-18.

Un exemple de la grande capacité des analyses isotopiques à traduire ce type de phénomène

nous est fourni par les résultats obtenus sur des eaux de 1987 prélevées en juin, 1 mois après

le début de la grande saison des pluies en Côte-d'Ivoire, et celles de 1988 collectées 1 mois

après la fin des pluies (en Novembre 1987). L'évolution des concentrations en deutérium de

ces eaux recueillies aux mêmes puits pendant ces deux dates enrégistrent parfaitement

l'appauvrissement en isotopes lourds consécutif à l'accroissement des quantités d'eau infiltrée

dans le sol à la suite de ces pluies (tableau 2-1). Les variations de la composition en

oxygène-18 étant de façon très générale peu importantes, traduisent moins ces observations

faites sur les valeurs BD.

C'est probablement ces chutes d'eau qui expliquent l'importante influence des paramètres P

et H sur les teneurs 6D et B180 de ces eaux.

2-3. Con c 1 u s ion :

L'analyse isotopique par SM RIdes eaux issues de la nappe phréatique de la

Côte-d'Ivoire et leur traitement statistique en fonction des données géographiques et

météorologiques de leurs lieux de provenance nous a permis de mettre en évidence quatre

28

résultats principaux :

1. il existe une bonne corrélation entre les concentrations en deutérium et en oxygène-18 de

ces eaux. Les coefficients de corrélation obtenus varient selon les années de prélèvement,

conséquence de l'impact des facteurs d'environnement;

2. des quatre paramètres géographiques, seules la latitude, l'altitude et la distance à l'océan

ont une influence significative sur les données isotopiques BD et B18a de ces eaux. Toutes les

droites traduisant ces relations linéaires possèdent une pente négative, indiquant des variations

de sens contraires;

3. contrairement à la plupart des résultats de la littérature, l'effet de la température sur les

teneurs isotopiques de ces eaux apparaît insignifiant, alors que dans le même temps le rôle de

l'insolation semble prédominant. Les pentes des droites corrélant BD et B18a aux variables p.

H et 1sont respectivement négatives, positives et négatives;

4. enfin, l'analyse des résultats des régressions multiples implique une description

multidimensionnelle de l'influence des paramètres géographiques et climatiques sur la

composition en isotopes stables des eaux considérées.

L'influence ainsi prouvée des facteurs d'environnement sur les eaux de la nappe phréatique

qui alimentent les plantes de Côte-d'Ivoire étudiées au cours de ce travail, suggère dès à

présent l'impact de ces facteurs sur les teneurs isotopiques des eaux et des glucides de céréales

et de fruits issus de ces plantes.

** *

29

!:.h api t r e 3: Application des Teneurs Isotopiques 2",

13C et 180 à la distinction des Plantes C3, C4 et CAM.

3-1: Application de la RMN quantitative 28 à l'étude d'une plante CAM:

Ananas cosmosus L. . Comparaison avec des Plantes C3 et C4 issues de la

même région géographique.

3-1-1. 1 n t r 0 duc t ion :

On appelle photosynthèse l'ensemble des transfonnations chimiques qui conduisent à la

production de sucres par les végétaux supérieurs, à partir du dioxyde de carbone

atmosphérique, de l'eau et de l'énergie lumineuse (Somerville et Somerville, 1984).

L'essentiel de l'eau utilisée au cours de ces transfonnations est celle qui parvient dans les

feuilles depuis les racines des plantes puisque c'est dans les chloroplastes situés à l'intérieur de

ces feuilles que sont élaborées ces substances hydrocarbonées. Cette eau va subir tout au long

de son parcours, du sol aux feuilles, un fractionnement isotopique c'est à dire un

enrichissement en isotopes lourds 2H et 180, principalement par évaporation. De nombreux

auteurs ont mis en évidence ce phénomène en mesurant par Spectrométrie de Masse des

Rapports Isotopiques (SMRI) les rapports isotopiques DIH et 180/160 des eaux extraites de

divers organes des plantes (Bricout, 1978; Bariac, 1987, 1988).

L'intérêt porté aux rapports isotopiques 2H/IH d'un point de vue métabolisme est bien

moindre et plus récent que celui accordé aux paramètres isotopiques 13C/12C. Ziegler et al.

(1976) ont mesuré les valeurs BD (0/00) de matières organiques et d'eau extraites de plantes

C3, C4 et CAM, et tenté de les corréler avec les paramètres climatiques. Par ailleurs, ces

résultats BD ont été associés aux rapports isotopiques 13C/12C pour distinguer les

métabolismes C4 et CAM dans une série de plantes de diverses régions (Ziegler, 1979).

30

Dans ces études, la substance organique est un extrait sec de plante dont la combustion a fourni

l'eau et le C02 en vue de mesures BD et B13C, mais aucune molécule bien définie n'était

considérée.

Plus récemment, des travaux comparatifs sur des plantes C3, C4 et CAM ont été conduits

par Sternberg et al. (1984) à partir de cellulose (Sternberg et al., 1984) ou de

cellulose et de lipides (Sternberg et al., 1984) extraits de ces plantes. Leur conclusion est

que les différences importantes observées entre les valeurs BD de la cellulose et celles des

fractions lipidiques seraient liées à l'existence de processus métaboliques ou physiologiques

spécifiques. De la même manière, une étude systématique de la composition isotopique de

l'eau des feuilles, en liaison avec celle de matières organiques (Leany et al., 1985) a

conduit à la conclusion qu'il n'est pas possible d'expliquer les différences entre les valeurs BD

de composés organiques déshydratés de plantes C3 et C4 par les seuls effets isotopiques liés

aux processus physiques comme l'enrichissement en deutérium par évaporation.

Dans tous les articles évoqués ci-dessus, les rapports isotopiques D/H sont déterminés par

spectrométrie de masse sur l'eau de combustion de toute la plante ou de fractions spécifiques

telles que la cellulose, les glucides ou les lipides extraits de la plante (Smith et Epstein,

1970) .

Les paramètres isotopiques D/H ainsi obtenus dans ces divers travaux ont permis de

distinguer les Plantes C3 des C4 et CAM. Cependant, malgré l'importante contribution

apportée par ces méthodes à l'étude de la physiologie des plantes, il faut en souligner les

difficultés expérimentales et la perte de précision qu'elles entraînent C'est probablement ce qui

explique les résultats contradictoires obtenus par Ziegler et al. (1976) d'une part et Smith

et Epstein (1970) d'autre part. Dans tous les cas, ils ont amené Sternberg et DeNiro

(1983) à préconiser le choix combiné d'un composé organique bien défini issu de plantes

collectées sur une aire géographique restreinte.

Cette observation nous conduit à souligner l'importance des progrès réalisés par l'utilisation

de la molécule d'éthanol dans l'étude des processus biosynthétiques. Ainsi Martin et al.

(1985) ont montré en appliquant la méthode de Fractionnement Isotopique Naturel

31

Spécifique (FINS) à la caractérisation des Bières Européennes que les atomes de deutérium

du groupement méthyle de la molécule d'éthanol proviennent à 85% du sucre dont est issu cet

éthanol. En d'autres termes, le rapport isotopique (DIH>! serait une caractéristique de la voie

photosynthétique d'élaboration du sucre dont la fermentation a fourni l'éthanol considéré.

C'est sur cette base que nous avons mené une étude systématique des mécanismes C3, C4 et

CAM à travers l'analyse isotopique des rapports (DIH)i des éthanols obtenus par fermentaton

de glucoses de céréales, de jus de fruits (oranges, pamplemousses et ananas) et de jus de canne

à sucre.

Tous les échantillons analysés dans ce chapitre proviennent de la Côte-d'Ivoire dont les

paramètres climatologiques, notamment la température, sont peu variables sur l'ensemble du

territoire. Cette observation nous permet d'éliminer les effets liés aux variations de la

composition isotopique des eaux de précipitation et ceux relatifs aux variations climatiques

(Sternberg et al., 1984) qui peuvent avoir une certaine influence sur les rapports

isotopiques (DIH) moyens.

A notre connaissance, il n'existe pas d'étude analytique de composés organiques issus de

l'ananas fondée sur les mesures isotopiques. Seule l'eau extraite du fruit a fait l'objet de

mesure 180/160 dans un ensemble de jus de fruits provenant en majorité de plantes C3

(Bricout, 1975). Dans ce chapitre, nous appliquons pour la première fois la nouvelle

méthodologie basée sur la RMN 2R en abondance naturelle (Martin et Martin, 1981), à

l'étude du métabolisme acide crassulacéen à travers Ananas cosmosus L . Les paramètres

isotopiques (DIH)i obtenus sont ensuite comparés à ceux relatifs à des plantes C3 et C4 ayant

subi les mêmes conditions climatiques.

A la lumière de nos résultats, nous pouvons affirmer que la RMN quantitative 2R est une

méthode tout à fait adaptée à la résolution du problème de la distinction entre les métabolismes

C3, C4 et CAM à partir de leur teneur en deutérium. La corrélation établie entre la voie

photosynthétique de formation des glucides et l'ensemble des paramètres (DIH>! et Rest

d'autant plus nette que les mesures isotopiques portent sur des molécules bien déterminées et

obtenues dans les mêmes conditions.

32

3-1-2. Rés u 1 t a t s :

Quelques études avaient déjà tenté de démontrer qu'il est possible de distinguer les trois

modes de fIxation du C02 libre C3, C4 et CAM à partir des rapports isotopiques DIH globaux

obtenus par SMRI, de substances organiques (le nitrate de cellulose et les lipides notamment)

extraites de diverses plantes (Sternberg et DeNiro, 1983; Sternberg et al., 1984;

Smith et Epstein, 1970). Au cours de ce travail, nous nous sommes attachés à l'analyse

isotopique de plusieurs dizaines d'éthanols naturels obtenus par fermentation à l'aide de

Saccharomyces cerevisiae :

- de jus d'oranges ( C. aurantium dulcis );

- de pamplemousses ( Citrus aurantium decumana );

- de canne à sucre ( Saccharum officinarum );

- et d'ananas (Ananas cosmosus L. ).

Les glucoses de céréales utilisés résultent de l'hydrolyse acide d'amidon de riz ( Oriza sativa

L. ), de maïs (Zea mays L. ), de sorgho (Sorghum vulgare) et de mil (Eleusine coracana).

Les mesures isotopiques de ces éthanols de diverses origines botaniques, faites au moyen

d'un spectromètre RMN à haut champ (AM 400 MHz) permettent d'accéder aux rapports

isotopiques spécifIques (DIH)i des différents sites i monodeutériés de la molécule d'éthanol

défInis par les isotopomères suivants (Martin et Martin, 1981):

CH3-CHD-OH

II

CH3-CH2-0D

III

HDO

IV

D'une part, pour accéder au rapport isotopique spécifIque (DIH)i d'un site i donné, on

utilise la relation:

33

12 M .m T(O/H), =_* éthanol TMU*~ (1)

P, M TMU .méthanol tQ

où

Pi = nombre de protons du site i ;

Ti =intensité du pic i par rapport au TMU (tétraméthylurée) ;

tQ =% d'éthanol pur dans le distillat;

M = masse molaire; m = masse d'éthanol ou de TMU effectivement utilisé.

D'autre part pour les éthanols 1et II ci-dessus, il a été introduit le paramètre R donné par la

relation (Martin et Martin, 1983):

(0/H)2R = 2 (O/H)1 (2)

Les paramètres isotopiques spécifiques (D/H>! et l'origine botanique des éthanols des

plantes de type C3, C4 et CAM sont rassemblées dans le tableau 3-1, tandis que les teneurs

isotopiques du groupement méthylénique (D/H>2 et les valeurs (D/H)wq des eaux de fin de

distillation mesurées au spectromètre de masse ont été regroupées dans le tableau 3-2.

al. Rapports isotopiques (O/H):1.:

L'observation des paramètres isotopiques (D/H)1 du tableau 3-1 relatif aux plantes C3

montre qu'on peut les répartir en deux groupes bien distincts: ceux des éthanols issus de

l'hydrolyse acide d'amidon (manioc et riz) ont des rapports (D/H>! qui se situent - sauf dans 2

cas - en dessous de 100 ppm, alors que les éthanols obtenus par fermentation directe de jus

34

sucrés (oranges, pamplemousses, vins de palmier et de rônier) ont des valeurs (DIH) 1 qui

s'échelonnent entre 100 et 108 ppm (parties par million).

La moyenne de l'ensemble des valeurs (DIHh du tableau 3-1 est de 102,1 ppm, soit une

variation de 5 à 6 ppm au sein du groupe des plantes C3 considérées ici.

L'appauvrissement de l'ordre de 3 à 5 ppm observé sur les (DIH) 1 des éthanols de

(DIHh Nature (DIH)l Nature (DIHh Nature

97,2 Riz1 110,7 ANANAS 110,6 Maïs1

102,0 Riz2 110,6 li 110,3 Maïs2

99,8 Riz3 109,8 ANANAS 111,5 Maïs3

99,8 Riz4 109,4 li 112,3 Maïs4

99,4 Riz5 108,3 ANANAS 112,7 Mill

99,0 Riz6 109,0 li 112,7 Mil2

107,4 Rônier 109,2 ANANAS 114,1 Sorgho

108,3 Palme 108,8 " 113,8 Sorgho

107,4 Palme 108,5 ANANAS 112,0 Canne

103,8 Orange 110,7 " 110,4 Canne

103,9 Orange 109,1 ANANAS 110,7 Canne

102,3 Orange 110,6 " 112,3 Canne

102,3 ( 1 ) 109,2 ANANAS 111,7 Canne

100,1 li 109,5 " 113,8 Canne

(1) : Pamplemousse.

Tableau 3-1: Rapports isotopiques spécifiques (DIH)l des éthanols C3, C4 et CAM.

glucose de riz, par rapport aux jus sucrés de plantes C3 n'est pas confinné par l'examen des

35

mesures isotopiques (D/H)1 de l'ensemble des éthanols obtenus par hydrolyse acide d'amidon

de plantes C4, puisque ces valeurs sont toutes du même ordre de grandeur que celles des

éthanols de purs jus naturels de canne.

Les rapports isotopiques spécifiques (D/H>! des plantes C4 de notre échantillonnage vont

de 110,6 ppm à 114,1 ppm, avec une moyenne de 112,4 ppm, soit une variation d'environ 3

ppm. Enfin, la lecture des tableaux 3-1 et 3-2 qui comportent les paramètres isotopiques

spécifiques (D/H>i et les rapports isotopiques (D/H)wq des purs jus naturels d'ananas montre

que les valeurs (D/H>! de cette plante CAM sont moins dispersées que celles des groupes C3

et C4 : ainsi, (D/H>!moyen est de 109,7 ppm avec un écart-type de 0,9.

De la comparaison des valeurs (D/H>! de ces tableaux, il ressort qu'à l'exception des trois

vins de plantes C3 (Rônier et Palmier) obtenus par auto-fermentation, c'est à dire sans addition

de levure exogène, des mesures faites sur une molécule bien définie et de pureté connue

(l'éthanol), permettent de délimiter clairement les paramètres isotopiques des plantes

appartenant aux trois mécanismes photosynthétiques, contrairement à la plupart des résultats

que l'on trouve dans la littérature.

b/. Rapports isotopiques (D/Hlz.:

Les valeurs (D/H>2, caractéristiques du milieu de fermentation, indiquent dans le cas des

vins de rônier et de palmier d'une part, et des jus de Citrus d'autre part, qu'il s'agit bien de

purs jus naturels.

Ces paramètres isotopiques constituent donc un bon critère pour identifier l'origine

géographique de tels échantillons, et réflètent aussi la composition isotopique d'un milieu

d'hydrolyse. On distingue ainsi les hydrolyses acides faites avec l'eau de robinet de Nantes

(NTW) de celles obtenues à partir de l'eau de robinet d'Abidjan (ATW).

36

CAM C4 C3

(D/Hh (D/H)wq (D/Hh (D/H)wq (D/Hh (D/H)wq

138,3 161,6 127,5 156,9 130,1 158,7

136,5 160,4 122,4 151,6 135,2 166,5

138,5 158,7 133,4 152,4 129,5 160,4

133,8 160,0 124,9 158,0 126,5 153,6

140,4 158,6 133,3 157,0 125,5 152,4

132,2 160,3 123,9 153,1 126,9 154,0

135,0 158,6 124,8 153,2 136,8 157,2

134,2 159,9 126,2 152,9 132,4 156,4

134,8 157,2 125,8 160,2 132,6 159,3

135,4 160,6 125,6 159,5 132,5 158,9

133,2 158,6 125,5 156,1 131,1 159,3

136,5 159,6 126,5 157,0 129,6 158,9

132,3 158,9 129,4 160,0 135,8 159,7

134,9 158,6 131,6 158,3 133,0 159,6

Tableau 3·2 : Rapports isotopiques (D/Hh du site méthylénique de l'éthanol et (D/H)wq

des eaux de fin de distillation des milieux de fermentation indiqués dans le tableau 3-1.

fi s'agit des trois premiers échantillons de riz dont les valeurs (D/Hh vont de 130,1 à 129,5

ppm pour A1W, et des trois derniers dont les (D/Hh sont comprises entre 126,5 et 126,9 ppm

pour N1W. On remarque de la même manière dans le tableau 3-2 que les maïs 1,2 et 3 d'une

part et les deux échantillons de sorgho d'autre part ont été hydrolysés dans A1W tandis que le

maïs 4 et les deux mil l'ont été dans NTW.

37

Les observations faites sur les jus de plantes C3 sont applicables aux échantillons d'ananas

(plante CAM), comme on peut le constater à la lecture du tableau 3-2, puisque les rapports

isotopiques (D/H>2 de ces jus naturels s'établissent entre 132,2 et 140,4 ppm, mais aussi à

l'ensemble des jus de canne. Les valeurs relativement faibles des (D/H>2 des quatre premiers

échantillons de canne sont probablement dues à une mauvaise résolution sur le site

méthylénique.

cl. Rapports isotopiques (D/H):n:,!l:

La comparaison des rapports isotopiques (D/H)wq avec celles des eaux initiales de jus de

fruits ou avec celles des eaux constituant le milieu d'hydrolyse fait apparaître un

enrichissement en isotopes lourds de 2 à 3 ppm des eaux finales, traduisant l'existence de

transferts isotopiques entre les divers constituants du milieu en fermentation.

3-1-3. Interprétation et Discussion:

TI n'est pas très aisé d'interpréter ces différences établies par la RMN 2H et la SMRI car des

facteurs fort complexes influencent les rapports isotopiques D/H des plantes, ce qui a donné

lieu à certains résultats contradictoires que l'on trouve dans la littérature (Ziegler et al.,

1976; Smith et Epstein, 1970). Il en est ainsi de la composition isotopique des eaux de

précipitations qui varient selon les régions géographiques où sont collectées les plantes

étudiées (Friedman et al., 1964) et des facteurs climatiques (Ferhi et Létolle, 1977;

Lesaint et al., 1974); bref il semble nécessaire d'interpréter ces résultats sous un aspect

pluridisciplinaire (Physiologie végétale, Biochimie, ... ).

Les premières observations relatives à la composition isotopique globale en deutérium d'un

éthanol naturel ont été faites par 8ricout et al. (1975) à partir de mesures obtenues par

spectrométrie de masse. Ces auteurs ont observé que la valeur moyenne (D/H)SM de l'éthanol

est plus faible que celle des glucides dont il dérive par fermentation par Saccharomyces

cerevisiae . Il y a lieu de penser qu'il se produit un fractionnement isotopique au cours des

réactions biochimiques qui jalonnent la glycolyse (DeNiro et Epstein, 1981). Ainsi au

38

fractionnement isotopique qui se produit lors de la biosynthèse des glucides, il faudrait ajouter

celui lié à la glycolyse.

La molécule d'éthanol, produit final d'une suite de réactions (physiologiques,

photosynthétiques, physiques et biochimiques) garderait l'empreinte du cycle métabolique et

de la composition isotopique du sucre initial dont elle provient. Martin et al.(1985) ont

indiqué que c'est le rapport isotopique (D/Hh qui traduirait cette empreinte portée par le

groupement CH3 de l'éthanol, ce que confirment nos résultats relatifs aux alcools de

différentes origines botaniques.

En effet, si les écarts entre les rapports isotopiques (D/Hh relatifs aux jus naturels des trois

groupes de plantes sont très faibles, traduisant la même origine géographique de celles-ci, par

contre ceux des paramètres (D/Hh du site méthyle sont plus importants, entre d'une part les

éthanols de plantes C3 et C4 (environ 10 ppm), et les éthanols de plantes C3 et CAM d'autre

part (environ 8 ppm). n est à noter cependant que ces écarts tombent à 2,5 ppm environ

lorsqu'on considère les (D/Hh des plantes C4 et CAM.

Ces faibles différences semblent indiquer que l'ananas serait une plante CAM à caractère C4

dominant - un C4 like - selon l'appellation de Beardall et Raven (1981), pour signifier que

cette plante aurait un comportement physiologique proche d'une espèce C4. La composition

isotopique en deutérium observée dans des substances organiques de plantes C3, C4 et CAM

dépend d'abord et surtout de celle de l'eau des feuilles utilisée par ces plantes au cours de la

photosynthèse (Epstein et al., 1977; Quandt et al., 1977). Cette teneur isotopique de

l'eau des feuilles dépend elle même de la physiologie propre de la plante, mais aussi de

facteurs isotopiques (composition isotopique de l'eau d'alimentation) et climatiques (humidité

relative et température de l'air)- Bariac, 1988-. D'après cet auteur, les processus

physiologiques conditionnent notamment le taux de renouvellement de la réserve d'eau foliaire.

Il apparaît ainsi que les différences dans la discrimination de l'isotope stable 2H entre les trois

espèces végétales doivent être analysées en termes de conditions environnementales de

croissance de la plante, et s'expliqueraient surtout par la nature du cycle photosynthétique et

des paramètres physiologiques de ces végétaux supérieurs : ainsi la présence des méats et

lacunes cellulaires, l'ouverture diurne ou nocturne des stomates contribueraient à

l'enrichissement ou à l'appauvrissement en isotopes lourds des composés organiques extraits

39

des fruits ou des tissus de plantes (Sternberg et DeNiro, 1983).

L'influence des conditions climatologiques de croissance des plantes sur le paramètre R,

fonction des rapports isotopiques (D/H) 1 et (D/H)2 a été soulignée par Martin et al.

(1982). Ces auteurs ont pu établir une très bonne corrélation entre le paramètre Re, la

moyenne des températures t (oC) et les précipitations h (mm), donnée par la relation :

Re =4,68 • 0,62 x t + 2,64 x 10.3 x h , avec n=8 et un coefficient de corrélation

r=O,99. Cette relation montre ainsi que lorsque h croît et que t diminue, Re augmente de façon

significative. Mais si la glycolyse laisse intacte la valeur (D/H>!, plus étroitement liée à la

composition isotopique du sucre initial, les valeurs (D/Hh de plantes provenant d'une même

région sont, elles, pratiquement constantes, de sorte que c'est, en définitive, la valeur (D/H))

qui varie sensiblement dans les conditions envisagées.

Ces résultats sont probablement le reflet du fractionnement isotopique associé à

l'évapotranspiration de la plante. Ainsi Ziegler et al. (1976) expliquent la valeur élevée des

BD des nitrates de cellulose de plantes CAM par leur capacité à poursuivre une activité

métabolique lors des périodes de déficit hydrique. fis suggèrent donc que cet enrichissement en

deutérium serait dû à l'évapotranspiration. Mais la physiologie végétale enseigne que les

plantes CAM ne transpirent que la nuit (période d'ouverture de leurs stomates) et que par

conséquent leur évapotranspiration est plus faible que celle des espèces de type C3 et C4. fi

s'ensuit que le rapport isotopique (D/H>! des plantes CAM devrait être plus faible que celui

des plantes C3 et C4 s'il s'expliquait uniquement en termes d'évapotranspiration, puisque

celle-ci entraîne un accroissement des BD. Or, nos résultats - obtenus sur des éthanols ­

conduisent à la double inégalité: (D/H>!C3 < (D/H) 1CAM < (D/H>! C4 et contredisent donc

ceux de Ziegler et al. (1976) d'une part et de Sternberg et DeNiro (1983) d'autre

part, relatifs aux celluloses, tout au moins en ce qui concerne les plantes C3 et CAM.

Comme l'ont suggéré Sternberg et al. (1984), ces contradictions seraient dues à la

nature des organes de plante utilisés dont la composition chimique peut contribuer aux

différences obtenues sur les valeurs isotopiques BD (Northfelt et al., 1981). Les faibles

40

valeurs (D/H>! que nous observons chez ces végétaux C3 s'expliqueraient par le fait que

l'importance de leur transpiration entraîne un renouvellement complet de la réserve d'eau de

leurs feuilles, et par suite leur appauvrissement en isotopes lourds 2H. Dans ces conditions, le

fractionnement isotopique observé doit être associé aux réactions physiologiques et

biochimiques qui seraient responsables des différences dans les rapports isotopiques (D/H)1

entre les plantes C3 et C4/CAM (Sternberg et al., 1984). Par contre les écarts de 3 à 5

ppm observés entre les paramètres isotopiques (D/H>! des éthanols de riz et ceux des jus de

Citrus (tableau 3-1), mais non confIrmés dans le cas des éthanols de mil, maïs et sorgho d'une

part et ceux de canne d'autre part, restent inexpliqués dans la mesure où les fermentations ont

été conduites dans les mêmes conditions (même température, mêmes variété et quantité de

levure utilisée). On aurait pu interpréter ces différences en termes d'échanges isotopiques au

cours de l'hydrolyse acide. Mais Martin et al. (1986) ont montré qu'il n'y aurait pas

d'échange isotopique pendant l'hydrolyse acide (ce que confIrment nos résultats sur les

échantillons C4) puisque la teneur en deutérium du milieu d'hydrolyse n'a aucune influence

sur le paramètre R du groupement éthyle de l'éthanol: en conséquence, les rapports (D/H>! et

(D/Hh varient exactement dans le même sens. Seul l'échange isotopique entre Ca(OHh et le

glucose formé au cours de l'étape de neutralisation pourrait expliquer ces différences.

Comme nous l'avons indiqué plus haut, l'interprétation de nos résultats doit aussi

s'appuyer en grande partie sur les acquis de la Physiologie végétale. Ainsi, de part leurs

structures foliaires et anatomiques, les espèces C3 sont celles qui transpirent le plus (ouverture

diurne des stomates et présence de nombreux méats et lacunes dans les cellules des feuilles)

tandis que les plantes C4, grâce à leurs gaines périvasculaires, sont parmi celles qui perdent le

moins d'eau par évapotranspiration, bien qu'elles aient une ouverture stomatique diurne

comme les plantes C3. Quant aux Crassulacées, bien que dépourvus de gaines périvasculaires,

ils sont adaptés aux stress hydriques grâce à leurs tissus aquifères, très typiques des

Broméliacées (Py et al., 1984), et surtout à la fermeture diurne de leurs stomates, ce qui

limite considérablement leur perte d'eau par transpiration.

TI découle de ce qui précède que les plantes C3 qui sont parmi celles qui stockent le moins

d'eau dans leurs feuilles, devraient avoir les plus forts rapports (D/H>!; les plantes C4 étant

celles qui concentrent le plus d'eau, en dépit d'un taux de transpiration comparable à celui des

41

C3, auraient des rapports (D/Hh relativement élevés; tandis que ceux des plantes CAM

seraient intermédiaires grâce à la limitation de leur perte d'eau. Nos résultats montrent, au

contraire, que les plantes C3 ont les plus faibles (D/H)1 par rapport aux plantes C4 et CAM,

tandis que les C4 possèdent les plus fortes valeurs (D/H) l, confIrmant ces prévisions fondées

sur un enrichissement relatif des rapports isotopiques D/H dû à l'évapotranspiration. Les

plantes CAM conservent là aussi des valeurs intennédiaires entre celles des espèces de type C3

et C4, ce qui est conforme à nos résultats relatifs à la composition isotopique l3C de ces trois

types de plantes.

Les légères variations que l'on observe au sein d'un même groupe de plantes n'enlèvent

rien au fait que les frontières entre les rapports isotopiques (D/Hh restent bien nettes entre les

trois types métaboliques: le groupement méthyle des éthanols de plantes C4 est le plus riche en

deutérium, celui des éthanols issus de plantes C3 le moins riche, tandis que les plantes CAM

ont des valeurs (D/Hh intermédiaires entre celles des espèces précitées.

a01 -350 -340 ·330 -320 -310 ·300 ·290 -280 -270

CAM

C4

~C3

-260·165

·170

·175

·180

·185

-190

·195

·200

-205

-210

·215

Fi2ure 3-1 : Répartition des voies métaboliques C3, C4 et CAM en fonction des

paramètres isotopiques spécifiques BOl de la molécule d'éthanol.

42

Dans le cas du métabolisme crassulacéen, ces observations résultent des effets combinés

mais non linéaires des activités de la Ribulose 1,5-diphosphate carboxylase et de la

Phosphoénolpyruvate carboxylase (Lerman et al., 1974).

3·1·4. Con c 1 u s ion:

Nous avons appliqué avec succès la RMN quantitative 2H, pour la première fois, à l'étude

des trois types métaboliques C3, C4 et CAM. Les résultats obtenus montrent que cette

méthode est un outil puissant pour la résolution de tels problèmes, dès lors qu'il est possible

d'obtenir de l'éthanol pur d'une plante quelconque dont on veut connaître le mode de fixation

du C02 atmosphérique. Ainsi les rapports isotopiques (D/H)} couplés au paramètre R qui

traduit l'hétérogénéité de la distribution des atomes de deutérium au sein du groupement éthyle

de la molécule d'éthanol, permettent une répartition non ambigue d'une série de plantes

classées selon leur mécanisme de carboxylation.

Cependant, il peut apparaître quelques cas où il s'avère nécessaire de considérer un

deuxième paramètre isotopique, en l'occurence la teneur ô13C du composé organique étudié.

Cette deuxième mesure isotopique, qui a l'avantage de s'appliquer à toute substance

organique, est en outre plus rapide et plus efficace du point de vue de la classification en

différentes voies photosynthétiques, comme nous le montrons dans le chapitre suivant.

*

* *

43

3·2 Discrimination du Carbone·13 par des Plantes C3 ,C4 et CAM.

3·2·1. 1 n t r 0 duc t ion:

Dans l'étude du problème de la discrimination des isotopes par les plantes à métabolismes

C3, C4 et CAM, la détermination des rapports isotopiques 13C/12C a sans nul doute été la

technique la plus utilisée au cours de ces vingt dernières années.

Les premières observations relatives à la composition isotopique des différents organes de

plantes ont été faites par Craig (1953, 1954) dont les conclusions furent confirmées et

élargies par Park et Epstein (1960). Comme nous l'avons indiqué dans le chapitre 1

précédent, la fixation du carbone inorganique nécessaire à la biosynthèse des glucides et autres

composés organiques par les végétaux supérieurs, se fait, pour les espèces de type C3, selon

le cycle de Calvin (Calvin et al., 1951), tandis que celle des plantes C4 suit le cycle de

Hatch & Slack (Hatch et Slack, 1966).

Ces mécanismes de la photosynthèse se différencient par l'enzyme qui catalyse les

réactions de carboxylation : il s'agit de la Ribulose 1,5-diphosphate carboxylase (RudPCase)

dans le cas des plantes C3 et de la Phosphoénolpyruvate carboxylase (PepCase) pour les

plantes C4, tandis que l'une et l'autre de ces deux enzymes interviennent dans le cas des

plantes CAM (Moyse, 1976). Depuis lors, de nombreux travaux ont montré que les plantes

C3 discriminent davantage le carbone-13 que ne le font les espèces C4 (Bender, 1971;

Vogel et Lerman, 1969). Quant aux plantes à métabolisme acide crassulacéen (CAM), leur

discrimination de l'isotope lourd C-13 apparaît comme intermédiaire entre celles des plantes C3

et C4.

Tous les résultats obtenus jusqu'à présent et relatifs aux différents types photosynthétiques

sont issus de mesures faites sur des extraits organiques de feuilles, de racines, de tiges et

même de plantes entières (Lerman et Raynal, 1972; Brown et Smith, 1972;

Osmond et al., 1973; Bender et al., 1973) par la méthode des combustions. Il ressort

de ces diverses études :

1. qu'il existe des variations non négligeables dans la composition isotopique selon la partie

44

de la plante considérée (O'Leary, 1981). Afin de pouvoir comparer les résultats B13C des

différentes études consacrées à la distinction des métabolismes C3, C4 et CAM, il est

important de spécifier les divers organes végétaux considérés;

2. que si les paramètres B13C de composés provenant d'espèces C3 se distinguent

clairement de ceux des substances de plantes C4 et CAM, il n'en va pas de même entre les

Bl3C des métabolites issus des végétaux C4 et CAM. TI en est ainsi quel que soit l'organe

végétal étudié.

Ces deux observations nous ont amené à entreprendre une étude systématique par

Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques (SMRI) des différentes voies

d'assimilation du C02 atmosphérique à travers des mesures B13C faites sur plusieurs dizaines

d'échantillons d'éthanol. Ceux-ci résultent de la fermentation par Saccharomyces cerevisiae de

jus de fruits de plantes C3 (oranges, pamplemousses), C4 (canne à sucre) et CAM (ananas),

mais aussi de glucoses obtenus par hydrolyse acide d'amidon de plantes C3 (riz, manioc) et de

plantes C4 (mil, maïs, sorgho), provenant tous d'un même lieu géographique, la

Côte-d'Ivoire, et récoltés sur une période de quatre ans.

L'analyse des résultats obtenus montre que l'étude des métabolismes C3, C4 et CAM à

partir de la molécule d'éthanol constitue incontestablement une avancée au regard des

retombées de cette nouvelle approche analytique. C'est ainsi, pour ne citer qu'un exemple, que

les frontières entre les valeurs Bl,~C des éthanols provenant d'espèces C3, C4 et CAM sont

nettement mieux délimitées que celles relatives à la quasi totalité des métabolites étudiés dans la

littérature.

3-2-2. Rés u 1 t a t s :

Il est à présent bien établi que la fixation du C02 atmosphérique - l'unique source de

carbone pour les végétaux supérieurs - par les différentes espèces végétales s'accompagne

d'un fractionnement isotopique, c'est à dire d'une modification du rapport l3C/12C de la

matière carbonée de ces végétaux par suite d'une transformation physique, chimique ou

biologique (Descolas-Gros, 1985; Fontugne, 1978). Ainsi, le carbone fixé

45

photosynthétiquement par la plante, peut être caractérisé par sa valeur ôl3C, sous la fonne :

13Ô C(%o) (4)

Le standard international utilisé est le PDB (Pee Dee Belemnite) qui a la composition

isotopique du C02 extrait du carbonate d'un rostre de Bélemnite du Crétacé

(Descolas-Gros, 1985).

Cette valeur ôl3C qui traduit la composition isotopique en carbone-13 et en carbone-12 de

la matière organique végétale, indique par ailleurs quelle carboxylase a été responsable de

l'incorporation primaire du C02 dans la plante (Bender, 1968; Whelan et al., 1973;

Berry et Troughton, 1974). Le carbone fixé conserverait ensuite sensiblement cette même

valeur ô13C, quelle que soit la voie de biosynthèse où il se trouve engagé, lipides exceptés

(Whelan et al., 1970). Il est donc tout à fait indiqué de faire un diagnostic des trois

principaux types métaboliques sur la base des paramètres Ô13c.

Les résultats des rapports isotopiques 13C/12C établis par divers travaux montrent que la

matière organique végétale et le C02 atmosphérique sont plus pauvres en carbone-13 que le

standard international (PDB). Il en résulte que les valeurs ôl3C observées sont négatives et

ce, d'autant plus que les échantillons étudiés sont appauvris en carbone-13.

Nos résultats obtenus sur des éthanols provenant de diverses origines botaniques, et

consignés dans le tableau 3-3, confrrment ces observations. Ils montrent qu'à partir de la

même source de C02libre dont le ô13C est de -7 à -8 %0 (Craig, 1957), les plantes C3 sont

plus pauvres en 13C (Ô I3C = -27,1 %0 en moyenne) que les espèces CAM (Ô I3C moyen

=-15,30/00), elles mêmes plus appauvries que les plantes C4 (Ôl3C moyen =-12,4 0/00).

46

Quant aux limites des paramètres B13C des trois groupes de plantes, elles vont de -29,5 à

-25,10/00 pour les C3, de -14,3 à -10,3 0/00 pour les C4, tandis que les plantes CAM possèdent

des valeurs intennédiaires entre ces deux extrêmes (-17,0 à -14,2 0/00) si l'on fait exception des

deux échantillons issus des îles de la Réunion (-13,80/00) et de la Nouvelle-Calédonie

(-13,2 0/00).

C3 C4 CAM

-28,4 -10,7 -15,8

-28,0 -10,3 -17,0

-27,8 -11,0 -15,2

-27,1 -10,6 -14,6

-26,7 -11,8 -14,2

-26,1 -11,3 -16,2

-26,7 -11,0 -16,3

-27,3 -13,1 -16,0

-25,2 -13,6 -14,2

-25,1 -12,7 -15,3

-25,6 -13,3 -16,2

-29,5 -12,7 -15,7

-28,1 -12,3 -14,6

-27,4 -12,9 -15,4

-28,2 -13,7 -13,2

-27,4 -14,1 -13,8

-27,6 -13,3 -16,7

-27,2 -14,3 -15,4

-28,1 -13,7 -14,8

Tableau 3-3 : Composition en isotopes stables C-13 des éthanols de Citrus (C3), de

canne (C4) et d'ananas (CAM).

47

On constate de la même manière que les paramètres ô13C les moins négatifs de la série

d'échantillons CAM de Côte-d'Ivoire, proviennent tous de localités situées le long de la

façade maritime. Cette remarque reste vraie pour l'échantillon de lait de noix de cocotier dans la

série des plantes C3. Par contre les vins de Palmier et de Rônier qui ont des valeurs

isotopiques ô13C comparables, sont obtenus par auto-fermentation (sans levure exogène).

Quant aux éthanols de plantes C4, ils se partagent en deux sous-groupes bien distincts: nous

avons d'un côté les éthanols issus de l'hydrolyse acide (maïs, mil et sorgho) dont les valeurs

ô13C sont toutes inférieures à -12,0 %0 (entre -11,8 et -10,3 0/00), et de l'autre des éthanols

obtenus par fermentation directe de jus de canne dont les ô13C vont de -14,3 à -12,3 %0.

L'examen de l'ensemble de ces valeurs montre clairement qu'on peut distinguer sans

ambiguïté les trois modes de fixation du C02 atmosphérique par les végétaux supérieurs, sur

la base des seules valeurs ô13C, dès lors que ces mesures portent sur des composés

organiques bien définis issus des diverses plantes (c'est le cas des molécules d'éthanol)

comme le prouve la figure 3-4.

3-2-3. Discussion et Interprétation:

Nous venons de voir qu'à partir de la même source de C02, les plantes C3 sont appauvries

en carbone-13 par rapport aux plantes C4.

Pour l'essentiel, la différence entre la composition isotopique en carbone-13 des végétaux

C3 et C4 serait liée aux activités enzymatiques au cours des étapes de carboxylations primaires

(O'Leary, 1981; Deléens, 1976; Sternberg et al., 1984). Le rôle des enzymes a été

mis en évidence par Lerman (1975), puis récemment, des modèles mathématiques fondés

sur la mesure des constantes de vitesse de diffusion de la molécule 13C02 impliquée dans les

réactions photosynthétiques (O'Leary, 1981; Peisker, 1982; Farquhar, 1982;

Deléens et al., 1983) ont été proposés pour expliquer la composition isotopique des

plantes terrestres.

Epiderme.

48

~ PhloèmeM.sOphylle 8undle 0

~sheolh 0

PE:?~ Ru8P °~

1 00C4 C02~CG.l '0

COZÔC02~C02::?HCOj OCldsH l n ~o

~ ~ 1\ leof rf/ 0orgonlC~

leof ~mOI"'JOOOorgonrcmalter 0 0

Fi~ure 3-2: Principales étapes de la fixation de C02 lors de la photosynthèse des plantes

C4, d'après M.H. O'Leary (1988).

TI ressort de ces travaux que les carboxylations effectuées par la RudPCase s'accompagnent

d'un enrichissement en carbone-I2 des métabolites formés, alors que la fixation du C02 libre

par la PepCase n'est pas suivie d'un tel phénomène (Whelan et aL, 1973; Christeller et

aL, 1976; Wong et al., 1979).

Ces hypothèses ont été vérifiées par des expériences in vitro (Deléens, 1976) qui

montrent que la réaction catalysée par la RudPCase discrimine davantage contre le carbone-13

que celle qui est catalysée par la PepCase, et cela quelle que soit l'origine végétale de l'extrait

enzymatique utilisé. A l'appui de ce rôle clé des enzymes dont l'activité dépendrait de la

température, d'autres études montrent que la différence en isotopes lourds 13C entre les

composés issus de plantes C3 et C4 s'expliquerait surtout par le fait que la RudPCase fixe le

carbone inorganique sous forme de C02 (Cooper et al., 1969; Raven, 1970), alors que

la PepCase fixe ce même carbone sous la forme HC03- (Maruyama et aL, 1966; Cooper

et Wood, 1971; Coombs et al., 1975).

Mais qu'en est-il des végétaux aquatiques qui utilisent exclusivement la forme HC03- ?

,Atmosphere

49

D'une part, les rares valeurs ô13C de plantes aquatiques dont on dispose sont relativement

dispersées et ne permettent pas de distinguer les plantes CAM des non-CAM (Sternberg et

al., 1984). D'autre part, la difficulté même qu'éprouvent les Physiologistes, à l'étape

actuelle des connaissances, à obtenir une classification de ces plantes sur la base de leurs

rapports isotopiques 13C/lZC, semble corroborer une telle explication.

De la même manière, l'effet isotopique de l'oxygène de l'air, observé sur les paramètres

Ô13C des plantes terrestres C3 (Jacobson et al., 1970) suggère que la photorespiration a

une influence très importante sur la composition isotopique de ces plantes (O'Leary, 1981).

Cette analyse est confirmée par Ivlev (1984) pour qui l'enrichissement en carbone-13 de la

biomasse observée chez les espèces de type C4 aurait pour principale cause l'absence presque

totale de photorespiration de ces végétaux.

Enfin, la Physiologie végétale indique que la photosynthèse selon le cycle de Hatch &

Slack tendrait à maintenir la concentration en COZ à un niveau élevé (Lehninger, 1985), ce

qui pourrait contribuer à enrichir les plantes C4 en molécules 13COZ'

Epiderme COUche Phloème

~d'air interne 0

Oz °~RUBP 00

COz &;JCOz H COz~A&j> go~ l~r~on/~g~ matter 00

0°

Fieure 3·3: Principales étapes de la fixation de COZ au cours de la photosynthèse des

plantes C3, d'après M.H. O'Leary (1988).

50

D'après Somerville et Somerville (1984), deux paramètres climatiques ont une

influence directe sur la teneur en carbone-13 des composés organiques extraits de plantes: la

température et l'humidité. C'est ainsi que les échanges gazeux entre l'air ambiant et l'intérieur

de la feuille diminueraient quand il y a moins d'humidité. Cet effet sur le flux de gaz fixé par la

plante, joint à sa physiologie propre, constitueraient les principaux facteurs dicriminants du

carbone-13 lors de la photosynthèse des plantes supérieures. Les figures 3-Z et 3-3 illustrent

fort bien le rôle clé des stomates (paramètres physiologiques) qui, sous l'effet de ces

paramètres météorologiques, régulerait les échanges gazeux, et donc isotopiques, avec

l'extérieur.

En plus de son impact sur l'activité enzymatique qui augmenterait en même temps qu'elle, la

température aurait un effet différentiel sur la solubilité du COZ et de l'oxygène de l'air, et par

suite sur le rendement de la photosynthèse des plantes.

Chez les végétaux à métabolisme acide crassulacéen, si les détails de leur mécanisme ne

sont pas tous élucidés, on sait que la photosynthèse chez ces espèces se fait avec la

participation des deux enzymes, la RudPCase et la PepCase. Cependant, les paramètres

isotopiques 8l3C observés chez les plantes CAM n'apparaissent pas comme une simple

combinaison linéaire des activités de ces deux carboxylases (Lerman et al., 1974). En

effet, des données isotopiques relatives aux activités carboxylasiques in vivo de plantes CAM,

obtenues chez le Kalanchoe blossfeldiana var.(Lerman et Queiroz, 1974) et chez le

Bryophyllum daigremontianum (Lerman et al., 1974) font apparaître que chez les

Crassulacées, la souplesse de fonctionnement est telle qu'ils peuvent moduler leur métabolisme

en fonction des facteurs du milieu (Descolas·Gros, 1985).

Les plantes CAM peuvent ainsi, dans certains cas, passer graduellement du type C3

dominant au type C4 dominant (Deléens et Garnier.Dardart, 1977; Deléens et al.,

1979; Py et al., 1984) : les rapports isotopiques l3C/IZC observés fluctueraient alors en

fonction des critères physiologiques (Lerman et al., 1974) et des conditions extérieures

telles que la photopériode et la température (Lerman et Queiroz, 1974).

Ces résultats confmnent le fait que les végétaux CAM passent pour être fortement sensibles

aux conditions climatiques (Ranson et Thomas, 1960) et parmi tous les facteurs

environnementaux, la température semble exercer la plus forte influence sur la composition

isotopique de ces espèces (Osmond et al., 1976; Smith et Nadhaven, 1982).

51

_300

synthesis

o citrus

cane

8 G0maize

pineapp/e

rice~ applemanioc x X')ë\

><:.,J borley

-4oo L 0beet

1 1 1---+1----+-1-----II.~_30 _25 _20 _15 _10

Fh:ure 3-4 ; Représentation des éthanols issus de plantes C3, C4 et CAM dans le plan

oD}. ol3e.

On remarque aussi que les valeurs ol3C les plus fortes sont celles d'éthanols provenant de

la Réunion, de Nouvelle-Calédonie et d'Abidjan et sa région. Il faut probablement y

voir l'effet de l'environnement marin qui semble être le point commun aux trois régions.

Enfin s'il est possible de conclure qu'une plante donnée appartient à l'un des trois types

métaboliques sur la base du paramètre o13C d'un composé organique issu de cette plante, il est

aussi important de savoir que des travaux montrent que l'analyse des rapports isotopiques

13C/12C permettraient d'accéder aux proportions relatives des deux activités enzymatiques qui

concourrent à la photosynthèse des plantes CAM (Deléens, 1976).

52

Ces observations, relativement simples, n'expliquent pas cependant les variations des

paramètres ô13C obtenus, car des plantes CAM, même évoluant dans un environnement

identique, possèderaient des valeurs ô13C différentes (Bender et al., 1973). On est donc

amené à postuler que plusieurs voies de fixation du C02 libre prédominent dans une plante

CAM donnée (Lerman et al., 1974).

3-2-4. Con c 1 u s ion :

La mesure des rapports isotopiques 13C/12C de composés organiques extraits de

différentes plantes constitue incontestablement une méthode fiable et très rapide pour

l'attribution du type métabolique d'une plante donnée. Cependant l'efficacité d'une telle

méthode suppose l'utilisation de substances chimiquement pures, issues de diverses parties

(tige, racines, bourgeons, feuilles, etc ...) de cette plante, qu'il est utile de spécifier.

En effet, il est apparu que la composition chimique, qui est variable selon l'organe

considéré, pourrait induire des variations dans la composition isotopique de la molécule

organique qui en dérive. Cette observation montre tout l'intérêt de mesures ô13C sur l'éthanol,

produit dont on peut connaître la pureté avec une grande précision.

Nos échantillons d'éthanols, obtenus par fermentation de glucose ou de jus de fruits

naturels, remplissent sûrement ces conditions puisqu'ils nous ont permis d'accéder à une

distinction des métabolismes C3, C4 et CAM, avec des frontières bien délimitées.

Nous pouvons donc en conclure, d'une part, que la transformation des sucres en éthanol

par Saccharomyces cerevisiae n'empêche pas celui-ci de conserver l'empreinte de la voie de

biosynthèse de ces sucres. D'autre part, que les transferts isotopiques observés au cours des

réactions biochimiques, et qui se traduisent par un enrichissement de la biomasse en

carbone-13, ne dénaturent pas l'origine botanique de ces sucres, et par suite la voie

photosynthétique suivie pour leur élaboration par les plantes.

* * *

53

3·3 : Distinction entre les trois types photosynthétiques C3, C4 et CAM au

moyen des rapports isotopiques 180/160.

3·3·1. 1 n t r 0 duc t ion :

Depuis une quinzaine d'années, des progrès réalisés dans les techniques d'analyse

par spectrométrie de masse isotopique permettent désormais d'accéder à des mesures de grande

précision et par suite à de multiples informations dans de nombreux domaines comme les

Sciences de la Nature. C'est ainsi que l'une des méthodes standards permettant la répartition

des végétaux supérieurs en trois groupes métaboliques principaux C3, C4 et CAM est basée

sur les différences dans la composition isotopique des eaux, des tissus et/ou des constituants

organiques des plantes (amidon, sucres, acides, etc ...).

Mais si des mesures de rapports isotopiques Deutérium/Hydrogène (DIH) et surtout

Carbone-13/Carbone-12 (13C/12C) effectuées sur un grand nombre d'espèces végétales

conduisent de façon sûre à la distinction entre les différents modes de fixation du C02

atmosphérique par les plantes, il n'en va pas de même pour la discrimination de l'oxygène-18

par ces mêmes plantes. De ce fait, les données isotopiques 0180 relatives aux métabolismes

des plantes supérieures sont peu nombreuses et même rares lorsqu'elles sont basées sur l'eau.

Les travaux de Bricout (1972,1973) sur les jus d'oranges ont surtout permis de montrer

que l'eau de ces jus est plus riche en deutérium et en oxygène-18 que celle qui a alimenté les

orangers. Dans une autre étude portant sur des échantillons de jus de raisin, Bricout (1978)

a montré que les rapports isotopiques D/H et 180/160 de ces jus sont similaires pour toutes les

variétés de raisin considérées, lorsqu'elles proviennent d'une même aire géographique. Par

contre, il observe des différences très importantes en étudiant des échantillons prélevés dans

des régions éloignées les unes des autres. De la même manière, les recherches de Dunbar

(1982) sur l'eau des jus de raisin et du vin montrent essentiellement que l'auto-fermentation

du jus de raisin en vin n'apporte pas de variation appréciable du rapport 180/160.

Enfin, considérant des teneurs isotopiques oD et 0180 mesurées sur des eaux extraites de

divers fruits et légumes, Dunbar et Wilson (1983) font apparaître qu'une comparaison

54

directe entre les paramètres 8180 de ces différentes eaux n'est pas possible quand les fruits et

légumes considérés ont été récoltés à différents moments de l'année.

TI est donc nécessaire pour comparer les résultats 8180 des plantes que celles-ci vivent sous

les mêmes conditions climatiques et que les fruits aient été récoltés dans la même période.

Les travaux discutés jusqu'à présent portent certes sur la composition isotopique 180 des

eaux de jus de fruits et légumes, toutes décrites en terme d'évapotranspiration, mais ils

n'abordent pas le problème de la distinction des types métaboliques les uns par rapport aux

autres. Cette question a intéressé Sternberg et al. (1982,1984,1986) mais elle a été

étudiée essentiellement à partir de composés organiques tels que la cellulose. Or l'eau utilisée

par les plantes au cours de la biosynthèse des substances organiques est celle parvenue dans

les feuilles, c'est à dire celle qui subit le plus l'effet de l'évapotranspiration.

Se pose alors la question de savoir si des mesures faites sur des composés organiques et sur

des eaux provenant de fruits de la même plante conduisent aux mêmes conclusions. On peut

en douter car des mesures isotopiques 180/160 faites sur des eaux de différentes parties de

plusieurs plantes montrent que l'enrichissement en isotopes lourds se fait dans l'ordre: feuilles

> fruit> tige> eau du sol (Dunbar et Wilson, 1983).

Enfin, si l'eau est l'unique source d'hydrogène des végétaux supérieurs, leur oxygène par

contre provient, non seulement de l'eau, mais aussi du C02 atmosphérique et de l'oxygène de

l'air. Le C02' en pénétrant dans les feuilles par les stomates, se dissout dans l'eau de ces

feuilles. Il pourrait s'ensuivre un échange isotopique selon la température qui règne au sein du

mésophylle (Bricout,1978). Par conséquent les résultats et l'interprétation de telles mesures

portant sur des eaux de jus de fruits naturels doivent être sensiblement différents de ceux

relatifs aux composés organiques.

Dans ce chapitre, nous proposons une distinction entre les métabolismes C4 et CAM

fondée sur la comparaison des rapports isotopiquesl80/160 obtenus à partir des eaux de jus

de canne à sucre (Saccharum officinarum) et d'ananas (Ananas cosmosus L.) après

fermentation alcoolique par Saccharomyces cerevisiae , et extraction de l'éthanol par

distillation. Ces résultats sont ensuite comparés à ceux obtenus à partir de jus d'oranges et de

pamplemousses issus du même pays (la Côte-d'Ivoire), et collectés pendant la même année

que la canne et l'ananas, mais à 6 mois d'intervalle.

55

Enfin, ces répartitions en trois groupes métaboliques sont corroborées par les teneurs

isotopiques 813C des éthanols associés à ces eaux à l'issue de la fermentation.

3·3·2. Résultats et Discussion:

L'importance des échanges hydriques dans les différents organes des plantes a rendu

nécessaire une meilleure connaissance des facteurs physiques ou biochimiques qui président au

fractionnement isotopique de l'hydrogène et plus encore de l'oxygène.

C4 CAM

8180 8D 8180 8D Localité:

-0,6 27,3 3,4 28,1 Daloa

+0,9 3,1 2,3 30,0 Divo

-0,4 16,3 2,0 29,4 Guessabo

-0,6 17,6 1,5 18,9 Abidjan

+1,0 7,3 2,4 29,3 Adwpé

+0,4 18,2 2,2 37,6 Aboisso

+0,4 17,6 2,5 42,7 Tiassalé

-0,2 20,8 2,8 36,3 Yabayo

+0,4 7,8 2,0 30,9 Bonoua

+0,1 15,0 2,2 29,7 Toumodi

-0,4 14,5 1,9 30,7 Guiglo

Tableau 3·4: Concentration en deutérium et en oxygène-18 des eaux de fin de distillation

des jus de canne (C4) et d'ananas (CAM).

Nous avons rassemblé dans les tableaux 3-4 et 3-5 les résultats des mesures isotopiques 8D

et 8180 relatives à l'un des produits de la glycolyse: l'eau. Tous les jus de fruits étudiés, dont

56

les mesures isotopiques sont consignés dans le tableau 3-4, ont été récoltés au même moment

(Juin 1987).

Ces échantillons de canne et d'ananas proviennent des mêmes localités, comme nous

l'indiquons dans le tableau 3-4. L'examen de ce tableau montre qu'on peut distinguer sans

ambiguïté les plantes C4 et CAM, sur la seule base des paramètres B18a: les eaux issues de

plantes C4 sont moins riches en oxygène-18, mais aussi en deutérium, que celles de plantes

CAM, ce qui tendrait à prouver que l'évapotranspiration contribue pour l'essentiel au

fractionnement isotopique observé.

an constate aussi que pour les jus d'ananas, B18a est toujours positif, alors que pour les

jus de canne, nous avons des valeurs positives ou négatives.

BD B18a Localité:

20,4 2,2 Man

21,0 3,0 Katiola

20,0 3,4 ü<iienné

25,6 5,1 Ferké

24,8 3,9 Adzopé

24,8 3,0 Bongouanou

27,1 7,1 Toumodi

25,2 3,6 Bouaké

25,9 5,6 Touba

23,9 2,3 Gagnoa

22,0 3,8 Tiassalé

Tableau 3-5: Teneurs isotopiques BD et B18a des eaux de fin de distillation des jus de

Citrus (oranges et pamplemousses, plantes C3).

Cette situation semble spécifique à la canne à sucre puisque les B18a des eaux de jus

d'oranges et de pamplemousses (tableau 3-5) sont tous positifs. Elle traduit probablement un

effet isotopique lié aux conditions climatiques locales et à la physiologie de la canne.

57

Nous avons séparé les résultats Ô180 relatifs aux jus d'oranges et de pamplemousses

(tableau 3-5) à dessein car les fruits dont dérivent ces jus ont été collectés dans la même année

que les autres mais à 6 mois d'intervalle, et dans des localités qui coïncident avec celles des

plantes C4 et CAM dans seulement 3 cas sur Il. Cependant, exception faite de deux eaux de

Citrus dont les valeurs Ô180 sont proches de la valeur moyenne obtenue sur les eaux de jus

d'ananas (plante CAM), nous pouvons dire que les écarts entre les concentrations en 180 des

eaux de ces trois types de plantes sont suffisamment importants pour ne pas être attribuables au

seul effet dû à la différence des dates de récolte.

En effet, entre la période de récolte des plantes C4 et CAM et celle des plantes C3, il s'est

écoulé une saison des pluies. Comme nous l'avions indiqué dans le chapitre 2 précédent,

l'abondance des précipitations entraîne, par effet de dilution, une baisse de la concentration en

isotopes lourds 2H et 180 des eaux d'alimentation des plantes, baisse que l'on retrouve

naturellement dans les fruits.

Or, ce n'est pas ce que l'on observe à la lecture des variations des paramètres ôD et ô180

des échantillons de Toumodi, Tiassalé et Adzopé où la comparaison entre ces mesures est

possible.De fait, les teneurs ô180 sont d'autant plus adaptées à une comparaison généralisée

qu'elles sont relativement peu sensibles à l'accroissement des précipitations. Ainsi, lorsqu'on

compare les ô180 des trois localités precitées, on obtient des écarts respectifs de 6,7; 3,4 et

2,9 %0 entre plantes C3 et C4. Par contre, ces écarts sont plus faibles entre les teneurs ô180

des plantes C3 et CAM de ces mêmes localités (4,9 ; 1,3 et 1,5 %0 respectivement).

Cette observation est d'autant plus acceptable que les conditions climatiques sont peu

variables en Côte- d'Ivoire. Par ailleurs nos résultats sont du même ordre de grandeur que

ceux obtenus par Bricout (1972) sur les jus d'oranges du Maroc et d'Israël, ainsi que par

Nissenbaum et al. (1974) sur des jus de Citrus. Si les variations des mesures restent

relativement faibles au sein du groupe CAM (Ô180 moyen =+2,30/00, a=O,5), elles deviennent

par contre plus importantes à l'intérieur du groupe C3 (Ô180 moyen =+3,90/00, a=l,4).

Ces variations traduisent probablement, d'une part, la grande sensibilité des paramètres 180

à l'origine géographique considérée, et d'autre part la contribution plus ou moins importante

de l'une des trois sources d'oxygène de la plante, à savoir: l'eau, le C02 atmosphérique et

58

l'oxygène de l'air. En définitive, l'ensemble des résultats des tableaux 3-4 et 3-5 pennet bien

de distinguer les trois principales voies photosynthétiques sur la base des paramètres B180

comme le prouve la figure 3-5.

Ce diagramme a été obtenu en soumettant les données des tableaux 1 et 2 à une analyse par

régression linéaire. A ces droites relatives aux trois types métaboliques, nous avons ajouté

celle représentant la composition isotopique des eaux de précipitation d'origine océanique

(Craig,I96I). On constate que les droites C3, C4 et CAM de pentes respectives +1,2, -9,1

et +4,6 s'écartent sensiblement de la droite des eaux météoriques, et chacune de ces pentes est

une caractéristique de la voie photosynthétique suivie par la plante.

Fieure 3·5: Droites représentant les mécanismes C3, C4 et CAM, ainsi que la droite des

eaux météoriques dans le plan (BD, BI80).

59

Ce résultat traduit d'une part les différentes contributions au fractionnement isotopique

global qui jalonnent le parcours des eaux d'alimentation de ces plantes, et d'autre part l'origine

géographique de ces fruits, c'est à dire les conditions environnementales de leur culture.

Sternberg et al. (1984) ont observé que les rapports isotopiques 180/160 d'une plante

dépendent non seulement de la physiologie de cette plante mais aussi des conditions

climatologiques et de la composition en isotopes lourds 180 des eaux de précipitation qui

l'alimentent. Pour éliminer les facteurs qui pourraient compliquer l'étude du fractionnement de

l'oxygène par les plantes (variabilité des rapports isotopiques des eaux de précipitation, effet

des variations climatiques, etc ...), ces auteurs suggèrent de ne considérer que des plantes

évoluant sur une superficie restreinte si l'on veut par ailleurs analyser ces données isotopiques

selon la voie photosynthétique utilisée. Or, comme nous l'avons indiqué plus haut,

l'échantillonnage de plantes C3, C4 et CAM considéré dans cette étude provient de la

Côte-d'Ivoire, pays caractérisé par des conditions météorologiques peu variables.

Les conditions posées par Sternberg et al. (1984) sont probablement remplies par nos

plantes puisque nos résultats permettent de les répartir en trois groupes distincts selon leur

mode de fixation du C02 libre. Par contre nos conclusions relatives à chaque type de plantes

contredisent celles de Sternberg et al. (1984); cette contradiction s'expliquerait par la

nature des matières premières utilisées dans ces travaux: Sternberg et al. (1984) utilisent

un composé organique, la cellulose, dont la biosynthèse s'effectue dans les cellules des

feuilles. Or l'eau des feuilles subit plus fortement l'effet de l'évapotranspiration - variable

suivant la physiologie de la plante considérée - que celle des fruits (Dunbar et Wilson,

1983 ; Lesaint et al., 1974). Cette observation, ajoutée aux méthodes d'extraction de la

cellulose, pourrait bien expliquer ces résultats contradictoires.

Les rapports isotopiques D/H des eaux sont dans leur quasi totalité d'une très grande

stabilité au sein de chaque groupe métabolique à une exception près dans chacun d'eux. Cette

faible variabilité pourrait s'expliquer par le fait que l'eau est l'unique source d'hydrogène des

plantes; de plus l'eau des fruits - contrairement à celle des feuilles - présente des variations très

faibles dans sa composition isotopique, car la structure externe des fruits les rend moins

exposés au phénomène d'évapotranspiration.

On constate enfin que si les plantes C3 possèdent les plus fortes valeurs 8180, il n'en va

pas de même de leurs rapports isotopiques D/H. Le fractionnement isotopique que l'on

60

observe chez ces plantes s'expliquerait par des variations de composition isotopique liée aux

transformations biochimiques et non par la seule évapotranspiration, car celle-ci aurait entraîné

un enrichissement simultané en oxygène-18 et en deutérium.

Pour nous résumer, il faut noter que les eaux considérées dans cette étude auront subi du

sol à la fin de la distillation, trois types de fractionnement isotopique:

1. au cours de son passage du sol aux fruits, l'eau s'enrichit en deutérium et en oxygène-18

par évapotranspiration. L'importance de ce phénomène varie selon l'espèce végétale

considérée, soulignant le rôle essentiel que joue la physiologie propre de celle-ci

(transformation physiologique);

2. toutes les transformations levuriennes de glucides en éthanol se traduisent par un

enrichissement en isotopes lourds de l'eau de fin de fermentation (transformation

biochimique);

3. enfin, la séparation de l'éthanol de l'eau par distillation s'accompagne d'un

enrichissement en deutérium et en oxygène-18 de l'eau finale (transformation physique).

Les teneurs isotopiques obtenues constituent donc la résultante de toutes ces contributions et

doivent être analysées et interprétées sous un éclairage pluridisciplinaire. Nous avons résumé

et illustré l'ensemble de ces résultats par un diagramme portant en ordonnée les paramètres

isotopiques ôD de ces eaux de fin de distillation, et en abscisse leurs valeurs ô180. Les pentes

des droites obtenues constituent des caractéristiques des trois mécanismes C3, C4 et CAM

suivis par les plantes considérées au cours de l'élaboration des jus sucrés étudiés.

Cette répartition en trois ensembles distincts fondée sur les paramètres ô180 des eaux est

corroborée par les résultats des mesures ô13C faites sur les éthanols qui leur sont associés

dans le milieu hydro-alcoolique, au cours de la fermentation des différents jus sucrés (tableau

3-6). En effet, il est bien établi que la mesure des rapports isotopiques 13C/12C de composés

organiques constitue un moyen rapide et efficace pour déterminer le type métabolique de la

plante dont ils dérivent (Bender, 1971; Smith et Epstein, 1971).

61

L'examen du tableau 3-6 montre que les valeurs ô13C des éthanols de plantes C3 sont

nettement distinctes de celles des plantes C4 et CAM. Ces résultats montrent en outre, que les

frontières entre les trois types métaboliques sont mieux définies par ces paramètres ô13C des

éthanols que celles que l'on trouve dans la littérature, et relatives aux métabolites isolés de

différentes parties de plantes C4 et CAM (Whelan et al., 1970; Garnier-Dardart et al.,

1975) ou aux plantes entières (Bender, 1971).

C3 C4 CAM

-29,5 -12,9 -15,3

-28,1 -13,7 -17,5

-27,4 -14,1 -16,5

-28,2 -12,1 -14,2

-27,4 -13,3 -15,4

-29,0 -14,4 -14,6

-27,2 -14,3 -16,7

-27,7 -14,3 -16,3

-27,7 -13,7 -15,7

-27,6 -15,1 -16,2

-28,1 -14,1 -15,6

-28,0 (0,7) -13,8 (0,8) -15,8 (0,9)

Tableau 3-6; Teneurs isotopiques ôl3C des éthanols de Citrus, de canne et d'ananas.

Ainsi les éthanols C3, les plus appauvris en carbone-13, présentent des teneurs isotopiques

ô13C variant de -29,5 à -27,2 %0 avec une moyenne de -28,0 %0 ( 0' =0,7 ), suivis des

éthanols CAM (-17,5 à -14,2 0/(0) avec une valeur moyenne de -15,8 %0 ( 0' =0,9 ) et des

éthanols C4, les plus riches en l3C, dont les valeurs s'échelonnent entre -15,1 et -12,1 0/00,

avec une moyenne de -13,8 0/00 (0' =0,8).

62

La différence entre les valeurs isotopiques des espèces de type C3 et celles de type C4 serait

essentiellement liée à l'étape de carboxylation primaire au cours de laquelle la catalyse de cette

réaction par la ribulose -1,5 diphosphate carboxylase (RudPCase) s'accompagnerait chez les

plantes C3 d'un enrichissement des composés formés en 12C alors qu'un tel phénomène n'est

pas observé pendant la fixation du C02 atmosphérique par la phosphoénolpyruvate

carboxylase (PepCase) (Whelan et al., 1973; Christeller et al., 1976; Wong et al.,

1979). Les valeurs B13C, intermédiaires entre celles des plantes C3 et C4, qui caractérisent

les éthanols CAM, seraient alors le résultat des effets combinés des activités de ces deux

enzymes (Lerman et al., 1974).

On observe en effet chez ces espèces de type CAM, une fixation nocturne du C02 catalysée

par la PepCase, suivie le jour suivant d'une carboxylation du ribulose-l,5 diphosphate

(Moyse, 1976).

Enfin, sur la base d'une analyse théorique des données expérimentales, Ivlev (1984)

attribue l'enrichissement en carbone-13 des plantes C4 comparées aux plantes C3 à l'absence

de photorespiration appréciable des premières par rapport aux secondes.

3-3-3. Con c 1 u s ion :

Les mesures des rapports isotopiques 180/160 des eaux extraites de jus de fruits naturels

ou commerciaux, ont surtout servi jusqu'à présent, à la détection de l'addition d'eau dans ces

jus de fruits, ou à la distinction entre un jus à base de concentrés et un pur jus naturel.

L'analyse de telles mesures en termes de différenciation des types photosynthétiques que

nous proposons ici est donc l'une des rares du genre. Sa mise en oeuvre expérimentale est très

simple, comparée à celle utilisant la distillation azéotropique.

Si, comme l'affirme Bricout et al. (1972), une distillation en vase clos n'entraîne pas de

fractionnements isotopiques importants, l'impossibilité de recueillir toute l'eau par évaporation

pose le problème de la précision de la méthode.

Cette observation trouve sa confmnation dans l'étude de Cohen et Saguy (1984) qui,

63

en comparant des mesures isotopiques 8180 portant sur des eaux de jus de citrus obtenues par

deux voies différentes (distillation et traitement au charbon végétal actif), obtiennent des écarts

de 0,5 0/00. Ces auteurs indiquent dans leur conclusion que la distillation peut conduire à

d'importantes erreurs lorsqu'elle est incomplète.

L'intérêt majeur de nos résultats fondés sur l'analyse isotopique des eaux de fin de

distillation, et non sur des eaux extraites par distillation azéotropique, se trouve dans cette

assertion. Cette méthode permet en outre de contourner les difficultés expérimentales

inhérentes à la pyrolyse des composés organiques - la cellulose et l'éthanol notamment - en vue

d'une répartition en différents types métaboliques à partir des teneurs 8180 de ces substances

organiques.

Enfin, comme nous le développons dans le chapitre 4 suivant, nous avons mis en évidence

au laboratoire, des transferts isotopiques relativement importants entre le glucose (glu.,s),

l'eau d'origine (w,s) des jus sucrés et le milieu de fermentation au cours de la glycolyse:

8180 w q(%o) = 0,436.8180sglu. - 14,22, n = 8, r = 0,390 (2)

Les relations (l) et (2), résultats de l'analyse par régression linéaire, montrent

clairement que l'essentiel des échanges en isotopes lourds 180 se fait entre l'eau d'origine des

jus de fruits et l'eau de fin de distillation (w,q). Ainsi, l'ensemble des mesures 8180 et les

corrélations (1) et (2) indiquent que l'eau fmale (w,q) de la fermentation alcoolique porte bien

l'empreinte du mode photosynthétique utilisé par ces plantes.

** *

64

3·4. Influence des facteurs météorologiques sur les paramètres

isotopiques des eaux et des éthanols issus de plantes C3, C4 et CAM.

3·4·1. 1 n t r 0 duc t ion:

La biosynthèse des substances hydrocarbonées par les plantes supérieures se fait dans les

chloroplastes du mésophylle à partir de l'eau des feuilles et du COZ atmosphérique fixé à

travers les stomates. Cette élaboration photosynthétique s'accompagne d'un fractionnement

isotopique généralement associé aux réactions biochimiques et aux facteurs de l'environnement

(Ziegler et al., 1976; Ziegler, 1979; O'Leary, 1988).

Selon les résultats obtenus par Bricout (1978), il apparaît que si la teneur en deutérium

de l'eau des fruits reste pratiquement constante au cours de la journée, en revanche celle de

l'eau des feuilles subit d'importantes variations en fonction de la température et de l'humidité

relative de l'air. C'est ainsi que cet auteur a observé que la valeur 8D de l'eau des feuilles de

vigne (plante C3) - tout comme le paramètre 8180 dont l'évolution est parallèle - est maximale

lorsque la température de l'air est maximale et que l'humidité relative est minimale.

Ces résultats, confirmés par Bariac (1987,1988) montrent que les conditions

climatiques ambiantes et plus particulièrement la température et l'humidité de l'air induisent un

fractionnement isotopique important à -l'eau des feuilles des plantes aériennes. Ce

comportement que l'on attribue à l'évapotranspiration varie selon l'espèce végétale étudiée,

c'est à dire en fonction de la physiologie propre de la plante. En conséquence, on observe des

différences sensibles dans la composition en isotopes stables de l'eau des fruits et des

composés organiques que la plante élabore au cours de la photosynthèse.

On sait par ailleurs que la fixation du COZ nécessaire pour cette photosynthèse se fait avec

65

un fractionnement isotopique lié à la vitesse de diffusion de ce gaz à travers les stomates

(O'Leary, 1988). Or d'après Somerville et Somerville (1984), l'ouverture des

stomates (et donc le volume des échanges gazeux entre la plante et le milieu extérieur) est

commandée par le degré hygrométrique: une faible humidité ambiante entraîne une diminution

du flux gazeux. Enfin, l'activité enzymatique - et par conséquent photosynthétique - est

gouvernée par la température (Moyse, 1976) dont l'élevation au dessus de 30°C favorise la

fixation de C02 (Somerville et Somerville, 1984).

La température est l'un des facteurs climatiques dont l'effet sur les teneurs isotopiques de

composés organiques et des eaux issus de plantes a été l'objet de plusieurs travaux (Ziegler

et al., 1976; O'Leary, 1981; Deléens et al., 1985). Mais les succès sont peu

abondants, notamment en qui concerne les concentrations isotopiques 2H, 13C et 180 de

composés résultant des mécanismes photosynthétiques C3, C4 et CAM en conditions

naturelles.

Smith et al.(1973, 1976) puis Bender et Berge (1979) ont montré que les valeurs

B13C de substances organiques dérivant de plusieurs plantes C3 et C4 deviennent légèrement

plus négatives quand la température croît, tandis que O'Leary (1981) indique que cet effet

aussi réel soit-il s'avère très faible sur ces espèces de type C3 et C4.

De ce qui précède, il apparaît clairement que les données climatiques de l'environnement des

plantes influent sur les teneurs isotopiques BD et B180 des eaux de fruits, et BDi et B13C des

substances organiques comme l'éthanol qui en dérivent.

Après un traitement statistique des résultats, nous avons choisi d'illustrer par des

représentations graphiques, des corrélations linéaires qui résultent de l'influence de la

température (T en OC), des précipitations (P en mm), de l'humidité relative (H en %) et de

l'insolation (1 en h) sur la composition en deutérium, carbone-13 et oxygène-18 des produits

de la fermentation (eau, éthanol) des jus de citrus, de canne et d'ananas collectés en 1987

dans différentes localités de Côte-d'Ivoire.

T

66

3·4·2. Résultats et Interprétation:

Nous avons illustré l'ensemble de nos résultats par quelques unes des analyses par

régression linéaire dont les coefficients sont supérieurs ou égaux à 0,5.

al. Effet de la température sur les mécanismes C3, C4 et CAM.

Nos résultats relatifs à l'influence de la température sur les paramètres isotopiques

spécifiques BD! et BD2 des éthanols et sur les rapports isotopiques BD et B180 des eaux de jus

de citrus (plantes C3) et de canne (plante C4) montrent que ces teneurs isotopiques deviennent

plus faibles quand T croît.

24,5 25 25,5 26 26,5 27 27,5-27 8 t----1t--_---t"-__-......,...-__-_~

•-280

-282

-284 •

-286

·288

-290

ôD~

•

•

••

ao = - 212,4

F;iure 3·6 : Effet de la température sur les teneurs isotopiques spécifiques BOl des

éthanols de jus d'ananas (CAM).

67

Par contre, les variations des teneurs isotopiques de composés provenant de plantes CAM

avec la température, sont nettement plus sensibles. Sur la figure 3-6, on observe que lorsque T

croît, les paramètres isotopiques 8D} des éthanols d'ananas (plante CAM) diminuent.

Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait que l'augmentation de la température rend

l'ouverture nocturne des stomates très faible, ce qui induit une évapotranspiration pratiquement

nulle: le stockage d'eau dans les cellules des chloroplastes où se fait la biosynthèse des

glucides entraînerait alors une dilution de ce milieu en isotopes lourds 2H et 180. Le rôle de la

température dans le mécanisme crassulacéen apparaît essentiel quand on sait que ce sont les

variations journalières de ce facteur qui conditionnent la thermopériode (Py et al., 1984).

1,2

1

0,8

0,6

0,4

0,2

°.OT

25

-0,4

-0,6

25,5

•

•

26

• •26,5 27

•

T27,5

Fi2ure 3-7 : Influence de la température sur la composition en oxygène-18 des eaux de fin

de distillation de jus de canne (C4).

68

Quant à l'accroissement des paramètres ÔD2 d'éthanol issu de plante C4, elle s'expliquerait

au contraire par une forte évapotranspiration, conséquence de l'ouverture diurne des stomates,

quand la température de l'air augmente. Il en est de même de l'évolution des teneurs

isotopiques ôiSO des eaux de citrus et de canne.

Enfin, concernant l'influence de la température sur les concentrations en C-I3, il est à noter

dans le cas des espèces de type CAM, que c'est la température nocturne qui, en régulant la

quantité de C02 fixé par la plante, agit sur le rendement de la biosynthèse de l'acide malique.

Dans ces conditions, Osmond et al.(1976) puis O'Leary (1981) ont pu établir qu'il y a

décroissance des paramètres ô13C en fonction de la température chez des espèces de type

CAM, ce que confIrment nos résultats relatifs aux éthanols de jus d'ananas.

b/. Influence des précipitations sur les teneurs isotopiques des éthanols et

des eaux de plantes C3, C4 et CAM.

Les figures 3-S et 3-9 montrent l'évolution du rapport ôDI d'éthanol de citrus et ôiSO de

l'eau de jus de canne en fonction de l'influence des précipitations. Ces représentations font

apparaître que lorsque la quantité de précipitations augmente, on observe généralement une

diminution des concentrations en isotopes stables 2H et 180.

C'est le résultat que nous avons obtenu sur les eaux de la nappe phréatique, et que confirme

l'effet des précipitations sur les rapports isotopiques ôDwq, ôISOwq et ôDI considérés ici.

Par contre, tous les paramètres isotopiques des éthanols et des eaux provenant de l'ananas

(plante CAM) augmentent avec le facteur P.

69

Ces résultats traduisent l'une des particularités du mécanisme crassulacéen observée par les

physiologistes, et qui se manifeste par une ouverture précoce des stomates dans les situations

où la quantité d'eau dont peut disposer la plante d'ananas s'accroît (Py et aL, 1984).

100 110 120 130 140 150 160 P

•

80 90-332

•-334

-336•-338

-340

-342

-344

-346

-348

-350

oDl

• • •

•

ao =-320,5

Fh:ure 3·8: Représentation des paramètres ôD 1 de Citrus en fonction des

précipitations.

Il s'ensuivrait une évapotranspiration plus importante, et par suite un enrichissement en

isotopes lourds détectés par ces mesures.

70

0180ao = + 3,3

a1= - 0,03

1,2

1 •0,8

0,6•0,4

0,2 P• •°-0,2 •-0,4

•-0,6

70 75 80 85 90 95 100 105 110 115

1

Fil:ure 3·9 : Influence des précipitations sur les paramètres isotopiques 8180 des eaux de

fm de distillation des jus de canne.

cl. Rôle de l'humidité relative de l'air sur 8D et 813C.

Les figures 3-10 et 3-11 qui illustrent l'influence de l'humidité relative montrent que quand

il y a plus d'humidité, les rapports isotopiques 8D1 des éthanols d'ananas et 8Dwq de l'eau de

jus de canne diminuent.

71

llo =+ 65,0

75 76 77 78 79 80 81 82 83 84

•

21

20

19

18

17

16

15•

14

13

12

1174

•

•• H

Fieure 3-]0: Effet de l'humidité sur les paramètres oDwq des eaux de fin de distillation

des jus de canne.

Or dans les conditions de fort degré hygrométrique, on constate que l'évapotranspiration de

la plante diminue, ce qui entraîne un appauvrissement en isotopes lourds de l'eau des feuilles et

des fruits. Par contre la teneur en carbone-13 de l'éthanol de canne et la variable H varient dans

le même sens (figure. 3-11 ci-contre).

73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 H·278----------------...•·280

·282

·284 ••·286 •

·288•• •·290

~D1

ao = - 236,9

Fieure 3-11 : Paramètres isotopiques spécifiques OD! de l'éthanol de jus d'ananas enfonction de l'humidité.

72

155 160 165 170 175 180 185 190 l·266

•·268 ••-270 ao = - 206,0

·272

-274 al= - 0,39

-276 •-278

•-280 •

Fi2ure 3-12: Paramètres isotopiques spécifiques cD 1 d'éthanol de jus de canne en

fonction de l'insolation.

Ce résultat est probablement une des conséquences de l'accroissement des échanges gazeux

entre les cellules de la plante et le milieu qui l'entoure, consécutif à l'élevation du taux

d'humidité (Somerville et Somerville,1984) : moins de quantité de C02 dans les cellules

entraîne plus de 13C02 disponibles pour la biosynthèse des glucides.

"dl. Influence de l'insolation sur les données isotopiques des produits de la

fermentation.

Les figures 3-12 et 3-13 représentant les variations des paramètres isotopiques cD1 et cD2

des éthanols C4, et la figure 3-14 celle des paramètres oDwq de l'eau de jus d'ananas, avec le

155' 160 165 170 175 180 185 190 1·145

1 •

0

15

°1ao = - 82.4

·155 • • al= - 0.43

,

• •·160

·165

1 •·170

BDZ

Fh:ure 3-13: Variations de la teneur isotopique spécifique ôD2 de l'éthanol de canne enfonction de l'insolation.

73

facteur 1 indiquent une évolution de sens contraires entre ces différents paramètres.

ôDwqao=+58,7

3534 • al = - 0,17333231

30 •29 •2827 • • l26 • •

155 160 165 170 175 180 185 190

Fieure 3·14 : Variations de la teneur en deutérium ôDwq des eaux de jus d'ananas

(CAM) en fonction de l'insolation I.

Ces résultats reflètent probablement l'effet positif de l'accroissement de l'énergie lumineuse

sur le rendement de la photosynthèse. Plus d'insolation peut aussi entraîner une élevation de

température, notamment dans les régions tropicales, ce qui aurait pour conséquence de

déclencher une importante évapotranspiration et donc d'enrichir les composés considérés en

isotopes lourds.

74

3·4·3. Con c 1 u s ion :

Nous avons tenté de fonnuler sous fonne de représentations graphiques les effets des

quatre facteurs climatiques T, P, H et 1 sur trois paramètres isotopiques caractérisant les

échantillons d'éthanol ôD l, ôD2 et Ôl3C, et sur les deux teneurs isotopiques ôDwq et

ô180 wq relatives aux eaux des jus de fruits après fennentation alcoolique puis distillation.

L'ensemble de ces graphiques confinnent comme prévu le rôle clé des facteurs

d'environnement pour la photosynthèse des espèces végétales de type C3, C4 et CAM. Il en

est ainsi de l'insolation et de la température pour ne citer que ces deux exemples qui

caractérisent assez bien l'ensemble de nos résultats. Nous avions montré dans le chapitre 2

précédent que lorsque l'insolation croît, on observe une décroissance des teneurs isotopiques

ÔD et ô180 des eaux d'alimentation des plantes. L'influence de ce facteur climatique sur les

paramètres isotopiques spécifiques ôDl et ôD2 des éthanols est tout à fait cohérente avec ce

résultat.

En revanche, si l'effet de la température sur les eaux naturelles est très discret, il n'en va pas

de même sur les produits de la fennentation levurienne (eau, éthanol) des jus de fruits étudiés.

On observe une influence plus marquée, probablement liée à la photosynthèse des plantes dont

l'activité est régulée précisément par ce facteur (Moyse, 1976). En particulier, le degré

d'évapotranspiration des végétaux, qui conditionnent les concentrations en deutérium et en

oxygène-18 des jus de fruits, dépend non seulement de leur physiologie, mais surtout de la

température.

Cependant, quelle que soit l'importance de l'influence de l'un de ces quatre paramètres

météorologiques, il ne faut pas perdre de vue le fait que dans les conditions naturelles, il est

75

extrêmement difficile, voire impossible, de dissocier l'effet de ces différentes caractéristiques

climatiques. La nature impose donc une description multidimensionnelle de l'influence des

facteurs d'environnement sur les teneurs isotopiques des produits dérivant de plantes. La

sensibilité d'un paramètre isotopique à l'un de ces facteurs peut être plus ou moins importante,

mais jamais tout à fait négligeable.

*

* *

76

Deuxième Partie:

EFFETS MECANISTIQUES de la FERMENTATION

Cha pit r e 4. Transferts Isotopiques au cours de la

transformation du glucose en éthanol par Saccharomyces

cerevisiae .

4-1. 1 n t r 0 duc t ion:

Depuis la crise de l'énergie en 1973, par suite du renchérissement des prix du pétrole à la

production, de nombreuses tentatives ont été faites pour trouver d'autres sources d'énergie. li

en est ainsi de la fermentation alcoolique qui constitue une importante source d'énergie. On

conçoit dès lors la nécessité et l'intérêt d'un contrôle des mécanismes de la transformation

levurienne des glucides en éthanol.

Les résultats obtenus par Martin et al.(1986) et relatifs au transfert du deutérium au

cours de la bioconversion du glucose en éthanol, et nos propres résultats discutés dans le

chapitre 3 précédent, montrent que l'analyse des isotopes stables en abondance naturelle est

une méthode adaptée à la résolution de tels problèmes. Dans plusieurs séries de fermentations

spécifiques, nous avons, par application de la méthode RMN-FINS et de la spectrométrie de

masse, pu suivre la redistribution des isotopes lourds 2H, 13C et 180 au sein des éléments

constitutifs du milieu de fermentation, au cours de la transformation biochimique des solutions

ou jus sucrés en éthanol.

L'ensemble de nos résultats démontrent une fois de plus la fiabilité de l'utilisation de la

molécule d'éthanol pour l'étude des facteurs physiques, biochimiques et physiologiques qui

gouvernent les cycles de l'hydrogène, du carbone et de l'oxygène lors des transformations

photosynthétiques. Cette étude, qui est une approche multi-isotopique et une généralisation des

premières observations de Martin et al.(1986), a pour but de mieux appréhender la filiation

77

entre des produits finaux et leurs matières premières au cours des différentes étapes de

transformation de ces éléments.

4·2. Matériels et Méthodes :

Nous avons rassemblé dans le tableau 4-1 tous les réactifs (sucres, amidon, eaux) utilisés

au cours de cette étude, en indiquant leur origine botanique, la pureté - s'il y a lieu - ainsi que

les caractéristiques isotopiques: (D/H) moyen, B13C et B18a obtenues par spectrométrie de

masse.

Nous avons ensuite utilisé du jus de raisin obtenu par pressage manuel de fruits. Le pH du

jus ainsi obtenu est de 3,2 unités. Enfin, en plus des différents mélanges de sucres considérés,

nous avons préparé deux milieux de fermentation enrichis, l'un en deutérium (165,2 ppm) et

l'autre en oxygène-18 (B 18a =+14,3 %0).

Tous les paramètres isotopiques des matières premières ont été obtenus à l'aide de deux

spectromètres de masse: celui de type SIRA-9 pour les mesures D/H des eaux et (D/H)ONE

des nitrates, et l'autre de type DELTA E pour les rapports isotopiques 13C/12C des sucres ou

leurs dérivés.

Les paramètres isotopiques B18a des échantillons de sucres sont déterminés à partir du

Ca2 résultant de la pyrolyse, au moyen du spectromètre de masse DELTA-E. De la même

manière, la mesure au spectromètre de masse de type SIRA-9, de l'eau obtenue par

combustion des éthanols, a permis d'accéder à la teneur globale en deutérium de ces éthanols.

Les teneurs en deutérium des sites hydrogénés non échangeables ont été obtenues par SMRI

sur des nitrates de glucose préparés selon la méthode de Dunbar (1983) modifiée par

Bricout (1985).

Le tableau 4-2 comporte la description détaillée des conditions de préparation des milieux de

fermentation, ainsi que la nature des éléments constitutifs de ces milieux. Les concentrations en

sucres du jus de raisin initial et des divers mélanges envisagés ont été acquises par dosage

HPLC.

78

Cas nO: Facteurs Nature des (D/H)Sgne ô13cs ô18a s (D/H)Sw ô18a sw

analysés: produits:

1 Maïs 151,5 -11,0 36,5 150,1 -5,6

(saccharose)

2 Pomme de 137,2 -25,1 23,6 150,1 -5,6

terre(amidon)

3 Teneur RaisinGus) 145,6 -26,3 24,3 152,3 -2,8

4 isotopique Canne 144,1 -12,0 32,3 150,1 -5,6

5 des sucres Betterave 137,6 -26,7 24,3 150,1 -5,6

6 Jus de raisin

+30% de canne: 145,1 -22,0 26,6 151,7 -4,9

7 Jus de raisin

+30% de betterave: 142,6 -26,4 24,2 151,1 -4,8

8 Jus de raisin +20%

de canne +20% de

betterave: 143,7 -23,5 25,8 151,5 -4,9

9 Composition NTW 151,5 -11,0 36,5 150,1 -5,6

10 isotopique NTW+HaD 151,5 -11,0 36,5 165,2 -5,7

11 de NTW 151,5 -11,0 36,5 150,1 -5,6

12 l'eau NTW + 18aH2 151,5 -11,0 36,5 149,0 +14,3

13 Concentration 50 g/l 151,5 -11,0 36,5 150,1 -5,6

14 en 100 g/l 151,5 -11,0 36,5 150,1 -5,6

15 sucres 200 g/l 151,5 -11,0 36,5 150,1 -5,6

Tableau 4-1: Nature et composition isotopique des produits de départ.

79

Cas nO Masse(gluc): Volume(ntw) VolumeGus) Co(g/l): Masse (1evure):

(g) (ml) (ml) (g)

1 30,05 300 94,48 7

2 30,02 300 90,1 10

3 192 308 104,03 10

4 21,06(canne) 395 305 98,51 10

5 21,03(bett.) 435 260 87,52 10

6 16(c)+16(b) 500 295 101,51 10

7 30,03 300 94,42 7

8 50,02 500 94,38 10

9 50,2 500 94,62 12

10 50,1 500 94,52 10

11 25,08 500 48,69 7

12 30,15 300 94,18 7

13 60,12 300 178,89 7

14 50,03 500 100 10

15 50,02 500 100 ;10

Tableau 4-2 : Conditions de préparation des milieux de fennentation.

Toutes les fermentations sont faites dans les mêmes conditions de température (301K),

avec pratiquement la même quantité et la même espèce de levure de boulangerie appartenant au

genre Saccharomyces cerevisiae.

Enfin, les rapports isotopiques DIH et 180/160 des eaux, les paramètres isotopiques

spécifiques (DlHh et les teneurs en carbone-13 des éthanols ont été obtenus selon des

méthodes clairement décrites dans la Partie expérimentale.

80

4-3. Rés u 1 t a t s :

Nous nous proposons de suivre l'évolution isotopique de quatre effets principaux à panir

des caractéristiques isotopiques des réactifs de dépan (Si) utilisés dans cette étude et que nous

avons rassemblé dans le tableau 4-1, au cours des réactions biochimiques.

En effet, au cours de la fermentation contrôlée des diverses solutions sucrées, il y a

redistribution des isotopes au sein des produits finaux (Qi) dont les teneurs isotopiques sont

consignées dans le tableau 4-3 ci-dessous.

4-3-1. Effet de la nature botanique des sucres :

Dans tout ce qui suit, nous utiliserons les termes Dl D2. Dw et DB pour désigner,

respectivement les rapports isotopiques (D/H) l ' (D/H)2' (D/H)wq et (D/H)B.

Comme nous l'avons indiqué dans le chapitre 3 précédent, les rapports isotopiques

spécifiques (D/H)) d'une part et les teneurs en carbone-13 d'autre part, conduisent sans

ambiguïté à la distinction des sucres dérivant de plantes de type C3 (pomme de terre, raisin et

betterave) de ceux issus d'espèces à métabolisme C4 (maïs et canne à sucre). Les glucides C3

sont plus pauvres en deutérium et en carbone-13 que les C4.

L'observation des mesures isotopiques (D/H) 1Aq et B13CAq du tableau 4-3 montre que les

éthanols de plantes C4 (cas des fermentations 1 et 4) sont plus riches en deutérium et en

carbone-13 que ceux des espèces de type C3 (cas des fermentations 2, 3 et 5), confirmant ainsi

nos résultats des paragraphes 3-1 et 3-2 du chapitre 3.

81

ETHANOL EAU BIOMASSEr

.," r

.,"Cas nO (D/H)IAq(D/H)llAq(D/H)A B13CAq B180 Aq(D/H)wq B180 wq (D/H)Bq B13CBq

(ppm) (ppm) (ppm) (%0) ( %0) (ppm) (%0) (ppm) (%0)

1 110,8 127,6 123,7 -10,7 20,5 150,9 -4,7 146,9 -19,6

2 89,9 126,4 113,5 -26,9 16,2 154,6 -4,3 146,0 -24,1

3 102,8 128,9 120,5 -26,3 20,6 155,1 -2,9 152,0 -24,4

4 108,9 127,5 122,7 -12,7 21,5 150,9 -5,6 145,1 -19,7

5 91,2 126,5 113,6 -28,1 17,9 151,4 -5,9 142,4 -23,5

6 103,2 125,8 119,9 -23,8 20,4 154,0 -2,8 157,0 -22,9

7 97,3 126,6 116,9 -28,7 19,8 152,9 -3,4 148,3 -24,7

8 101,5 126,5 119,0 -24,1 20,6 153,9 -3,4 149,1 -23,0

9 109,8 126,9 123,2 -11,3 20,5 151,8 -5,2 145,4 -19,5

10 111,6 137,6 130,2 -11,5 20,5 167,3 -5,2 154,4 -19,8

11 110,1 124,2 122,2 -11,4 20,5 150,8 -5,1 146,4 -20,7

12 110,5 125,6 123,9 -11,3 28,7 153,0 +15,2 148,4 -19,9

13 109,6 126,7 122,8 -11,3 20,5 150,4 -4,5 144,0 -20,6

14 110,1 125,9 122,8 -10,6 20,5 151,4 -5,4 145,0 -19,9

15 111,1 126,0 123,3 -10,6 20,5 153,6 -4,8 154,4 -19,9

Tableau 4-3: Distribution en isotopes stables 2H, 13C et 180 au sein des produits de la

fermentation: eau (W), éthanol (A), biomasse (B).

On notera au passage les faibles écarts entre les teneurs en carbone-13 du glucose de maïs,

du saccharose de canne et du mélange glucose/fructose de jus de raisin, et celles des éthanols

qui en dérivent par fermentation.

4-3-2. Effet des mélanges de sucres :

L'addition de sucre de canne, à 30%, dans du jus de raisin, se traduit par un léger

accroissement du rapport isotopique (D/H) 1 de ce mélange (l03,2 ppm) comparé à celui du jus

naturel. De ce fait, il se situe entre ceux du pur jus de raisin (102,8 ppm) et de la solution

82

sucrée de canne (108,9 ppm). En outre, lorsqu'on compare la valeur 8 13C de ce mélange à

celles des deux échantillons qui font office de témoins, on constate que la "chaptalisation" du

jus de raisin par le sucre de canne est sans équivoque.

Par contre, le mélange de jus de raisin (70%) et de sucre de betterave (30%), s'il est

détectable par la méthode RMN-FINS - (DIH) 1 =97,3 ppm - par comparaison à la solution de

betterave dans N1W (91,2 ppm) et au pur jus de raisin - (DIH)} = 102,8 ppm -l'est aussi par

sa teneur isotopique 8l3C. En effet, ici comme dans le cas précédent, la "chaptalisation" d'un

jus de raisin par du sucre de betterave se traduit par une diminution de la teneur en isotope

lourd C-13 du mélange considéré, par rapport à celle du pur jus naturel.

8180

20

15 •

10

5 8180 sw

0 , • •-5 • •

-10

Fieure 4-1 : Variations des teneurs 8180 de l'eau finale en fonction de celles de l'eau

initiale.

Enfin, l'addition de 20% de sucre de canne et 20% de sucre de betterave au pur jus de

raisin, donne un éthanol dont le rapport isotopique (DIH)1 et la valeur 813C sont distincts des

valeurs observées pour les deux mélanges précédents, traduisant ainsi l'effet combiné des

origines botaniques de ces sucres.

83

4-3-3. Influence de la teneur isotopique du milieu de fermentation

Les mesures des teneurs globales en deutérium et en oxygène-18, obtenues par

spectrométrie de masse sur les eaux de fin de fermentation (tableau 4-3), font apparaître un

enrichissement en isotopes lourds de ces eaux, et donc une augmentation des rapports

isotopiques (D/R)wq et (180/l60)wq.

al. Cas de l'oxye;ène-18: La comparaison des paramètres isotopiques des eaux

consignés dans les tableaux 4-1 et 4-3 montrent que les processus biochimiques induisent un

fractionnement isotopique: ainsi les valeurs 8180 des eaux finales augmentent de 0,8 à 2 %0

par à celles des eaux de départ. L'analyse par régression linéaire des résultats donne des

corrélations que nous avons illustrées par la figure 4-1.

Ces équations indiquent clairement (r= 0,995, n=8) que les transferts isotopiques en

oxygène-18 se font essentiellement entre l'eau initiale (avant fermentation) et l'eau finale (après

fermentation), mais aussi, dans de moindres proportions (r=0,39), entre les glucides initiaux et

l'eau de fin de fermentation.

b/. Cas du deutériym : Pour apprécier l'influence de la composition en deutérium du

milieu de fermentation sur les rapports isotopiques des produits de la fermentation, nous avons

considéré une série de fermentations de glucose de maïs d'origine commerciale (Sigma).

Ces fermentations ont été faites dans des milieux aqueux de compositions isotopiques

variables, à 25°C, avec une concentration en sucres uniforme de 100 g/l. Tous les résultats de

ces expériences sont rassemblés dans le tableau 4-5. Les rapports isotopiques spécifiques

(D/R)l et (D/Rh des sites méthylique (1) et méthylénique (II) de l'éthanol sont déterminés par

la méthode RMN-FINS, tandis que les teneurs globales des eaux avant et après fermentation

ont été acquises par spectrométrie de masse.

Enfin, les concentrations en sucres résiduels (C en gIl), les taux alcooliques (tn) et les

degrés alcooliques (tQ) ont été obtenus selon des méthodes décrites dans la partie

expérimentale.

On notera la faible sensibilité (a1 = 0,27) du paramètre isotopique spécifique (D/R)} du

84

groupement méthyle de la molécule d'éthanol à la teneur (D/H)wSdu milieu de fermentation

(Martin et al., 1986), lorsque nous la comparons aux variations des paramètres (D/H)2q

et {D/H)wq en fonction de celle-ci. Ces rapports isotopiques croissent linéairement en fonction

du rapport isotopique {D/H)wS des différents milieux aqueux.

Les droites de la figure 4-2 qui traduisent ces corrélations possèdent des pentes

significatives du phénomène de redistribution isotopique qui a lieu au cours de ces

transformations biochimiques.

(DIH)

400

350

300

250

200

150

100

5050 100 150 200 300 400

Fi2ure 4·2: Variations des D/H des produits de la fermentation en fonction de {D/H)ws.

4·3·4. Influence de la concentration en sucres :

Pour évaluer l'influence de la concentration en sucres sur les teneurs isotopiques des

produits de la fermentation, nous avons considéré différents milieux constitués par du

saccharose de canne en solution dans l'eau de NANTES (NTW), puis analysé les résultats

de six fermentations faites dans des conditions spécifiques décrites plus haut.

87

Co(g/l) 44 87 131 174 217 261

Masse de 50 100 150 200 250 300

sucres

(D/H)Qw 149,7 150,6 151,4 152,0 152,5 153,7

(DIU)I 108,6 110,9 109,8 110,6 110,8 110,4

(DIU)n 120,9 122,4 121,3 121,9 122,5 123,5

R 2,23 2,21 2,21 2,22 2,21 2,22

tQ calculé 2,65 5,30 8,0 10,7 13,3 16,0

Tableau 4-4: Influence de la concentration en glucose Co du milieu de fermentation sur

les rapports isotopiques (D/H)wq, (D/H) 1q et (D/H)zq.

L'analyse par régression linéaire de ces résultats donne l'équation:

qui indique que la presque totalité des isotopes C-13 reçus par la biomasse au cours de la

fermentation provient des glucides.

4-4. Discussion des Résultats:

Comme nous l'avons développé dans le chapitre 3 précédent, les méthodes d'analyse

isotopique permettent de mieux comprendre les mécanismes biochimiques et/ou

physiologiques qui président à la biosynthèse des substances organiques par les espèces

végétales. A la lumière des résultats obtenus dans cette étude et présentés ci-dessus, il apparaît

(ÔI3

C)Ssucres .28 -26 -24 ·22 -20 -18 -16 -14 ·12

88

que ces méthodes conduisent aussi à élucider les mécanismes de redistribution des isotopes

stables 2H, BC et 180 au cours de la fermentation.

4·4·1. Paramètres de redistribution ô13C

Les glucoses de céréales (pomme de terre, maïs), les saccharoses de betterave et de canne,

et le mélange fructose/glucose qui compose le jus de raisin, en un mot les glucides,

constituent, avec la levure. les seules sources de carbone des différents milieux fermentés au

cours de cette étude. La teneur en carbone-13 des éthanols issus de ces fermentations reflète

l'identité isotopique de ces glucides, c'est à dire leur origine botanique.

·10...I----+--+-----jt---+--t---t--+---+--+---+ -10

-12

-14

-16

-18

-20

-22

-24

-26

-28

-30

Fi2Ure 4·4 : Variations de la composition en C-13 de l'éthanol (A) et de la biomasse (B)

en fonction de celle des glucides de départ.

Tous les sucres utilisés appartiennent à l'un ou à l'autre des mécanismes C3 et C4, les plus

fréquemment observés dans le monde des végétaux supérieurs. L'observation de la figure 4-4

illustrant les corrélations linéaires entre les valeurs ô13C de l'éthanol et de la biomasse, et la

teneur en carbone-13 des glucides de départ appelle plusieurs remarques:

89

1. on constate une très bonne corrélation entre les paramètres 013C des produits finaux

(éthanol, biomasse) et celui des glucides initiaux illustrée par les coefficients de corrélation et le

bon alignement des points expérimentaux;

2. la pente des deux droites est une caractéristique de l'importance des échanges isotopiques

au cours de ces transformations biochimiques: la droite (A) qui lie les paramètres isotopiques

13C de l'éthanol et des glucides de départ a une pente élevée dont la valeur 1,08 montre que le

contenu en isotopes 13C de cet éthanol dépend uniquement de celui des sucres dissous avant

fermentation. Par rapport à la valeur 013C de la levure de boulangerie utilisée, on note un

enrichissement en carbone-13 de la biomasse de près de +5 %0 quand il s'est agi de sucres

fermentés de type C4.

Par contre, la droite (B) qui traduit la relation entre les teneurs en C-13 de la biomasse et des

sucres mis à fermenter est caractérisée par une faible valeur de la pente (0,29) indiquant la

faible sensibilité isotopique entre ces deux pôles de carbone. Celle-ci pourrait s'expliquer par le

fait que les valeurs o13C de la biomasse et des sucres de type C3 sont relativement proches, ce

qui limite singulièrement les transferts isotopiques. Ceux-ci sont en revanche plus sensibles

entre les glucides de type C4 et la biomasse.

C'est probablement pour cette raison que la pente de l'ensemble n'est pas nulle. La valeur

pratiquement inchangée de la teneur en carbone-13 de la biomasse des milieux contenant des

sucres C3, par rapport à celle de la levure initiale, corrobore cene explication.

4-4-2. Coefficients de transfert des isotopes 180 :

Les résultats relatifs à la redistribution des isotopes stables 18 0 au cours de la

transformation levurienne des sucres C3 et C4 en produits finis (eau, éthanol) sont représentés

par les diagrammes 4-1 et 4-5.

La figure 4-5 qui est une représentation de la relation entre les valeurs 0180 de l'éthanol et

des sucres, possède une pente significativement faible (0,34), tandis que la pente de la droite

de corrélation entre éthanols et eaux (figure 4-1) est légèrement plus élevée (a1=0,47).

90

Ô180

30

•28

26

24

22

20 • • • ••18 B180 s 1g u.

1622 24 26 28 30 32 34 36 38

Figure 4·5 : Evolution des paramètres B180 des éthanols en fonction de la composition

en 0-18 des glucides.

La valeur al = 0,34 traduit un faible coefficient de transfert entre éthanols et sucres de

départ, démontrant ainsi que les atomes d'oxygène du glucose sont peu incorporés dans la

molécule d'éthanol au cours de l'élaboration biologique de celui-ci (r= 0,584; n=lO).

Quant à la pente al =0,47, elle caractérise probablement plus la vitesse d'échange entre le

groupement hydroxyle de la molécule d'éthanol et le milieu aqueux qu'un coefficient de

redistribution, comme en témoigne le coefficient de corrélation eaux/éthanols, r= 0,915 pour

n= 10. L'ensemble des coefficients de transfert obtenus à partir d'analyses par régression

linéaire conduit à la traduction matricielle suivante entre (B180 wq; B180 Aq) et (B180 ws;

0,985

0,465

0,436

0,336

91

Par contre la grande affinité isotopique entre l'eau finale (q) et l'eau de départ (s) se

manifeste par un coefficient de transfert de 0,985, à peine plus faible que l'unité (figure 4-1),

traduisant une filiation sans ambiguïté de ce produit de la fennentation (r =0,995, n =10) avec

l'eau initiale.

(D/H)Sw 99,6 149,4

151,6

199,4

198,5

249,3

245,1

298,8

292,3

349,6

339,7

365,8

353,4

C (gII) <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1

(t =00)

tQ(%) 5,30 5,20 5,25 5,25 5,3 5,25 5,25

Rdt(%) 94,1 92,8 93,2 93,2 94,1 "93,5 93,5

(DIH)} 97,1 110,6 125,1 137,7 153,5 165,1 167,9

(DIH)n 82,3 123,5 159,3 202,6 237,0 279,8 292,1

(D/H)t 93,9 122,3 149,6 178,2 205,7 233,8 241,7

R 1,70 2,23 2,55 2,94 3,09 3,39 3,48

Corrélations: (l) (D/H)Iq = 70,6 + 0,270 (D/H)Sw, r = 0,999 , n = 7

(2) (D/H)nq = 4,47 + 0,786 (D/H)Sw ' r = 1,000 , n = 7

(3) (D/H)wq = Il,7 + 0,937 (D/H)Sw ' r = 1,000 , n = 7

(4) (D/H)tq = 38,8 + 0,557 (D/H)Sw, r = 1,000 , n = 7

Tableau 4-5: Effet de la concentration en deutérium du milieu de fermentation sur les

rapports isotopiques (D/H)wq des eaux et (D/H)1q, (D/H>2q, (D/H)RMN des éthanols.

92

4·4·3. Détermination multidimensionnelle des paramètres de redistribution2U :

L'application de la méthode RMN-FINS à l'analyse isotopique du vin (Martin etal.,1986) a apporté la preuve que cette méthodologie est adaptée non seulement à la détection

de l'addition de sucres exogènes dans des produits naturels, mais aussi au suivi du devenir des

isotopes lourds 2H au cours de la bioconversion des sucres aux origines botaniques diverses

en mélanges hydroalcooliques (Martin et al., 1986). En effet, grâce à cette méthode

analytique, il n'est plus nécessaire de recourir aux marquages isotopiques pour étudier les

effets mécanistiques qui accompagnent certaines réactions biochimiques.

Dans tout ce qui suit, la source initiale de deutérium est constituée par les réactifs de départ

(eau et glucides) qui conduisent aux produits de la fennentation eau, éthanol et biomasse. Dans

la molécule d'éthanol, nous ne considérons que les deux sites non échangeables que sont les

groupements méthyle et méthylène.

Comme dans les deux cas précédents (13C et 180), la linéarité des corrélations établies

entre paramètres isotopiques des produits initiaux et ceux obtenus après extraction de l'éthanol

par distillation conduit à donner un sens mécanistique aux valeurs de la pente des droites.

Ainsi, il apparaît que plus la valeur de la pente est proche de l'unité, plus le transfert isotopique

entre produits initial et final considérés serait complet. A contrario, ce transfert serait d'autant

plus faible que la valeur de la pente tendrait vers zéro.

Nous avons mis sous fonne de diagrammes, les résultats de l'analyse par régression

linéaire entre les constituants finaux eau, éthanol, biomasse et les deux produits de départ eau,

sucres. La figure 4-2 est une illustration de la corrélation entre d'un côté les rapports

isotopiques (DIHhq du site méthylénique et (DIH)wq de l'eau finale et de l'autre la teneur en

deutérium (D/H)ws du milieu aqueux.

93

Les pentes des deux droites obtenues sont tout à fait significatives des effets mécanistiques

lors de la transformation biochimique des sucres, entre l'eau initiale, le site méthylénique et

l'eau finale.

La pente plus élevée de la droite Dwq doit être associée au volume des transferts en

deutérium entre les eaux, tandis que celle de la droite D2q traduit l'incorporation d'atomes de

deutérium issus du milieu aqueux dans la molécule d'éthanol au cours de l'étape de

décarboxylation du pyruvate suivie de la réduction enzymatique de l'acétaldéhyde (Martin et

al., 1983).

(D/H)

160 :Di•150 • •• .140 •

Di 0

130 00

120

110 •100

90 $(DIH)g

80136 138 140 142 144 146 148 150 152

Fieure 4-6 : Variations des rapports isotopiques (D1H)iq des sites méthyle et méthylène de

l'éthanol et (D1H)Bq de la biomasse en fonction de la teneur en deutaérium des glucides.

La figure 4-6 corrèle les rapports isotopiques spécifiques (DIH)! et (D/Hh des

groupements méthyle et méthylène respectifs de la molécule d'éthanol, ainsi que le rapport

isotopique global en deutérium de la biomasse avec celui des sucres de départ.

94

Ces trois paramètres ont pour coefficients de redistribution, respectivement 0,71; 0,11 et

0,40, mais seules les pentes de 0,71 et 0,40 paraissent significatives, cependant que la

corrélation unidimensionnelle entre l'eau finale et les glucides initiaux donne une pente de

-0,09. Ces quatre valeurs de la pente des différentes droites obtenues imposent plusieurs

observations:

1. la teneur en deutérium du glucose apparaît comme essentiellement associée au rapport

isotopique spécifique (DIH)1 du site méthyle de l'éthanol, en d'autres tennes, cette teneur est

beaucoup plus sensible à la composition isotopique du glucose de départ qu'à celle de l'eau

initiale;

CH3(I)

Originer t ,

Glucose Eau

Origine*

151,5 99,7 220 235,9 72% 28% 5% 95%

151,5 149,4 217,8 360,7 63% 37% 4% 96%

151,5 199,4 224,7 469,2 57% 43% 3% 97%

151,5 249,3 217,4 600,8 51% 49% 2% 98%

151,5 298,8 230,0 704,3 48% 52% 2% 98%

151,5 349,6 220,4 834,5 43% 57% 2% 98%

151,5 365,8 215,6 872,2 41% 59% 1% 99%

Tableau 4-6 : Calcul des rapports isotopiques (DIH)Gq, (DIH)wq et des contributions du

glucose et de l'eau aux teneurs en isotopes lourds des sites méthyle et méthylène de l'éthanol.

95

2. dans les conditions expérimentales de cette étude, il semble qu'il n'y a pas de transfert

isotopique significatif entre le site méthylénique et le glucose initial;

3. dans les mêmes conditions, la sensibilité de l'eau finale vis à vis du glucose initial est

pratiquement nulle;

4. il existe un mouvement isotopique, certes faible mais appréciable, entre le glucose et la

biomasse au cours de la fermentation.

Enfin, les résultats obtenus par spectrométrie de masse sur les eaux (initiale et finale) et

illustrés par la figure 4-2 montrent que la composition en isotopes stables 2H du milieu aqueux

à la fin de la distillation est sensiblement modifiée.

L'ensemble de ces résultats et ceux obtenus par Martin et al.(1986), et relatifs aux

coefficients de redistribution entre Dlq, D2q, Dwq et le rapport isotopique (DIH)aNE des

sites non échangeables du glucose nous a permis d'établir la matrice de redistribution suivante:

0,595 0,711 1,05

0,727 0,323 -0,04

0,981 0,629 0,04

96

4-5. Con c 1 u s ion :

L'analyse isotopique par la méthode de la RMN quantitative 2H et par spectrométrie de

masse de molécules d'éthanol (et des eaux) obtenues à partir d'un certain nombre de

fermentations modèles, nous a permis de mettre en évidence les mécanismes de redistribution

des isotopes lourds au cours des transformations biochimiques des glucides.

Ce travail qui est une généralisation des observations faites sur le deutérium (Martin et

al., 1986) nous a par ailleurs conduit à des résultats spécifiques sur la biomasse: sauf dans

le cas précis du milieu contenant le mélange de deux sucres de plantes C3 (raisin et betterave),

la composition isotopique de la biomasse, à la fin de la fermentation, est soit stable, soit en

augmentation. Cette dernière possibilité est plus manifeste concernant le transfert en

carbone-l3. Les corrélations établies par suite de l'analyse par régression linéaire, indiquent

que l'essentiel des isotopes lourds reçus par la biomasse au cours de la bioconversion des

glucides en éthanol provient des sucres de départ pour le carbone-l3 et de la teneur isotopique

du milieu de fermentation pour le deutérium.

De ces mêmes corrélations, il apparaît que la teneur en deutérium du site méthyle de

l'éthanol est plus sensible à celle des sites non échangeables du glucose qu'à la composition en

deutérium de l'eau initiale du milieu fermenté. Par contre, les rapports isotopiques (DIH)2q

sont très faiblement liés au contenu en deutérium du glucose. Enfin, la traduction matricielle

des résultats de telles transformations offre la possibilité d'une interprétation réversible des

informations relatives aux mécanismes de redistribution des isotopes qui se développent au

cours de la fermentation.

D'un point de vue pratique, l'ensemble de ces résultats justifie l'utilisation des paramètres

isotopiques des produits de la fermentation (eau, éthanol) comme empreintes des teneurs en

isotopes stables des composés dont ils dérivent (eau, glucose). Ce concept d'empreinte ou

d'identité isotopique constitue la base des critères analytiques du contrôle d'origine et de

qualité des produits agro-alimentaires, et de l'appartenance aux différents mécanismes

photosynthétiques.

** *

97

Troisième Partie:

CARACTERISATION D'ORIGINE ET DE QUALITE DES

PRODUITS ALIMENTAIRES.

Chapitre 5. Etude du Fractionnement Isotopique Naturel dans

des Ethanols de céréales, de fruits et de plantes sucrières.

5-1. 1 n t r 0 duc t ion:

L'intérêt porté à l'analyse des jus de fruits par de nombreux Chercheurs utilisant divers

moyens techniques peut s'expliquer par deux raisons principales: la première est liée à

l'augmentation vertigineuse des besoins en jus de fruits (oranges, pamplemousses, pommes

et ananas) dans les pays tempérés et en France en particulier. Cette forte demande a incité de

nombreuses productions industrielles à recourir à des produits de substitution, comme en

témoigne la prolifération des articles proposés aux Consommateurs, ou à falsifier en partie ces

produits alimentaires, car - et c'est la deuxième raison selon nous - l'essentiel des jus de fruits

naturels consommés dans les Pays industrialisés provient de Pays en voie de développement

d'Afrique (Côte-d'Ivoire, Maroc, Kénya, etc ... ), du Proche-Orient (Israël notamment),

d'Amérique Latine (Brésil en particulier) et des Iles Hawaï. Pour des raisons économiques

(prix de revient), ces produits importés de pays producteurs lointains, arrivent le plus souvent

sous fonne de jus concentrés, et sont donc reconstitués dans les pays consommateurs.

Par conséquent, il apparaît nécessaire pour l'économie comme pour l'industrie

agro-alimentaire, et face à l'exigence en qualité des organisations de Consommateurs, de

pouvoir vérifier à tout moment qu'il n'y a pas de fraude à l'étiquetage et que ces produits ne

sont pas adultérés par addition d'eau et/ou de sucres ou de tout autre produit exogène. Les

premières études qui ont tenté de résoudre ce problème sur la base de l'analyse des rapports

isotopiques en abondance naturelle sont apparues au cours des années 70. C'est ainsi que la

SMRI de l'hydrogène, du carbone et de l'oxygène a été appliquée à la caractérisation des jus

de fruits, des boissons alcoolisées, des sucres, des miels, etc ...

98

Les jus d'oranges en particulier ont été l'objet d'une grande attention (Bricout et al.,

1971; Nissenbaum et al., 1974, 1980; Doner et al., 1981, 1982, 1985, 1987),

mais aussi les jus de pommes (Bricout et al., 1971, 1973; Doner, 1980, 1981;

Brause, 1987; Lee et al., 1988). Les fruits rouges et autres espèces diverses (Krueger

et al., 1986; Spanos et al., 1987; Dunbar et Wilson, 1983) furent également

analysés. Ces tentatives reposent sur le fractionnement isotopique observé chez les plantes

supérieures et qui se traduit par de sensibles différences dans la composition isotopique des

glucides, lipides et autres métabolites qui en dérivent.

Ces comportements qui sont d'un grand intérêt en biochimie et en physiologie végétale ont

par ailleurs largement servi au contrôle de qualité et d'authentification des produits (Krueger,

1982; Martin et Martin, 1989). Il faut noter cependant, que la technique d'analyse la plus

utilisée dans tous ces travaux est la spectrométrie de masse, et que les mesures des rapports

isotopiques l3C/12C notamment sont faites, dans la quasi totalité des cas, sur des composés

organiques (acides, glucides, lipides, etc...) globaux et non sur des molécules bien définies.

Depuis 1981, la technique de la RMN quantitative 2H et la méthode RMN-FINS mises au

point par MARTIN et MARTIN (1981) permettent désormais l'analyse des rapports

isotopiques spécifiques et autorisent une approche statistique du problème de l'adultération des

boissons (Martin et al., 1988; Martin et Martin, 1988). Cette nouvelle technique

d'investigation qui a été appliquée avec succès à l'analyse des isotopes stables des vins

(Martin et Martin, 1988; Martin et al., 1986, 1988) constitue une importante source

d'informations sur la distribution isotopique dans la vigne, les céréales, la canne à sucre ou la

betterave sucrière.

L'accès aux rapports isotopiques par site spécifique offre la possibilité d'appréhender les

mécanismes de la photosynthèse et de la glycolyse, ainsi que les processus de fractionnement

isotopique qui s'y développent. Elle a permis notamment de mettre en évidence une étroite

corrélation entre la composition en deutérium des isotopomères 1,6,6' du glucose et celle du

site méthylique de l'éthanol (Martin et al., 1986). De la même manière, il a été établi que

les deux sites pro-chiraux des isotopomères méthyléniques proviennent de l'eau constituant le

milieu de fermentation: l'éthanol pro-R résultant de la réduction de l'acétaldéhyde par le

NADH, et le pro-S dérivant de la décarboxylation du pyruvate (RabiHer et al., 1989).

Au cours de ce travail, nous avons analysé plus de 500 échantillons d'éthanols issus de la

fermentation de jus de fruits naturels de plantes C3 et CAM (ananas) et de jus de fruits de

99

commerce. Ces éthanols ont été analysés au moyen de la RMN 2H - (D/fI)i - et de la

Spectrométrie de Masse (Ô13C), tandis que les mesures spectrométriques faites sur les eaux

initiales et finales ont permis d'accéder aux rappons isotopiques 2H11H et 180{160, avant et

après fermentation.

Le but de cette étude est donc d'illustrer l'intérêt et la complémentarité d'une analyse

multi-isotopique (RMN et SMRI) du problème de contrôle d'origine et de qualité des jus de

fruits, produits alimentaires de grande consommation.

EJ C3

Orge, blé, riz } Ami••,

H20

\.~

C 4 Mais, sorgho

Légumes et C3

Pomme de terre, manioc } H,OAmidon \. ..

tubercules S.,,", JPois, lentille fermentescibles Levure~ Ethanol

+ +

}eau eau

EJ C3

Pomme, citrus, fruits rougesJus ..

CAM Ananas

Plantes C 3Betterave à sucre

} ~OSaccharose , ~sucrières

C4 Canne à sucre

100

5-2. Résultats et Discussion:

Le schéma 1 rassemble les différentes plantes étudiées, subdivisées en quatre groupes sur

la base de la nature chimique de leurs fractions glucidiques, ainsi que les diverses étapes qui

conduisent aux mélanges hydro-alcooliques.

_100

synthesisC--x~)

_200

_250

_300

pototo

80 wheol

0 beet

cane

Q0moize

Figure 5-1 : Représentation des éthanols C3, C4 et de synthèse dans le plan formé par les

teneurs isotopiques ôD moyen et ô13C.

1 01

5·2·1. Utilisation des molécules d'eau et d'éthanol comme enrégistreurs du

métabolisme des plantes et des conditions climatiques.

Il est à présent bien établi qu'il existe de bonnes corrélations entre les concentrations en

deutérium des différents constituants du mélange hydra-alcoolique résultant de la fermentation

de solutions aqueuses de sucres.

C'est ainsi qu'il est prouvé que la distribution des atomes de deutérium dans la molécule

d'éthanol est en liaison étroite avec celle de la molécule de glucose. Cette répartition en

isotopes stables 2H dans la molécule de glucose serait soumise à l'influence des mécanismes

photosynthétiques C3, C4 et CAM, mais aussi aux conditions climatiques (température, et

précipitations notamment) qui ont prévalu pendant la période de croissance de la plante étudiée.

On observe d'autre part, une étroite relation entre les teneurs en deutérium de l'eau du

milieu de fermentation (D/H)wq et de l'eau du fruit avant fermentation (D/H)wS, ce qui se

traduit par la relation:

(D/H)wq = (D/H)wS + ,1CD/H)wqs ,dans laquelle le terme constant .1(D/H)wqs

peut être exprimé soit en concentration initiale de sucres, soit en degré alcoolique du milieu

fermenté. Dans les deux cas, la constante de proportionnalité dépend de l'espèce végétale

considérée, même si elle représente en réalité la composition en deutérium des différents sites

de la molécule de glucose (Martin et al., 1986, 1988) :

.1(D/H)wQs = kl.tQ ou k2'Cs, avec kt = 0,35 à 0,5 ppm/degré alcoolique et

k2 =0,02 à 0,03 ppm/g.l-l.

Enfin, nous avons caractérisé chaque échantillon d'éthanol par un vecteur dans un espace

isotopique à cinq dimensions comprenant trois paramètres qui se rapportent à l'éthanol :

(D/H) 1, (D/H)2, 13C/12C et deux paramètres relatifs à l'eau initiale: (D/H)w S et

(180/160)ws.

102

5-2-2. Distribution en isotopes stables dans des éthanols issus de plantes:

Nous avons traduit sous fonne de représentation graphique les compositions en deutérium

et carbone-l3 de molécules d'éthanol provenant de différentes origines botaniques (figure

5-1).

_250

synlhesis

_300

_350

cane

(;\x GX\ .\J \..::...J mOlze

pineopple

® citrus

rice /":l\.~ apple

monioc~;\b\:,"-C-J orley

8beel

'--1-1----+-1---\----+I----+-j-----II~~_30 _25 _20 _/5 _/0

FiI:ure 5-2: Représentation des éthanols de diverses origines botaniques dans le plan

fonné par ôD1 et ôl3C.

103

La composition isotopique moyenne oD de l'éthanol a été calculée à partir des relations:

(D/H)RMN = 112 (D/H)1 + 113 (D/Hh + 116 * (D/H)w q *1,03

(Martin et a1.,1985 )

et

((D/H)éch. J

oD(%o) = (DfH)smow - 1 * 1000 (3)

On distingue clairement sur la figure 5-1, trois groupes d'éthanol correspondant à des

échantillons C3, C4 et de synthèse.

Cette observation est également vraie en ce qui concerne les paramètres isotopiques

spécifiques oD} et les valeurs o13C (figure 5-2), sauf que dans ce cas, les principaux groupes

se repartissent en sous-groupes originaux: ainsi, l'ananas (plante CAM) se distingue de la

canne et du maïs (plantes C4); les citrus et la betterave sont bien séparés des autres espèces C3

(blé, riz, pomme et manioc), tandis que le groupe d'éthanols de lait obtenus par fennentation

alcoolique de lactose est nettement différencié.

D'une façon générale, la répartition des paramètres isotopiques oD1 ou o13C des divers

groupes étudiés est logique, et il est important de noter que la moyenne de l'ensemble des

échantillons est une bonne estimation de celle des populations au sein d'un groupe donné.

_210

_230

beet

104

cane x<:::ri7 pineapple

X apple

20

Fi2ure 5-3: Corrélation entre les paramètres isotopiques spécifiques oD2 relatifs à

l'isotopomère CH3CHDOH de l'éthanol et oDws de l'eau initiale.

La figure 5-3 illustre la très bonne corrélation existant entre les paramètres oD2 de

l'isotopomère CH3CHDOH et les teneurs isotopiques oDwS des eaux de jus de fruits avant

fermentation. Ce résultat est en accord avec ceux obtenus par Martin et al.(1986) à partir

d'expériences modèles.

Par ailleurs, la pente de la droite de régression entre les concentrations oDwS et o180 ws de

l'eau des fruits est égale à 5,7, c'est à dire légèrement inférieure à celle de la droite des eaux

météoriques (Craig, 1961), mais proche de la valeur généralement observée pour les eaux

105

naturelles de régions arides ou des pays tropicaux (Yurtsever et Gat, 1981).

5-2-3. Représentation et classification des groupes :

L'analyse multidimensionnelle constitue un bon moyen pour représenter sous une forme

simplifiée, un grand nombre d'individus dont chacun est caractérisé par une certaine quantité

de paramètres.

C'est par cette méthode que nous avons pu analyser, au cours de cette étude, plus de 500

échantillons d'éthanols répartis dans un espace isotopique à quatre dimensions. Neuf groupes

de produits ont été considérés:

- 3 céréales (maïs et sorgho, orge et blé, riz);

- 1 tubercule (manioc, pomme de terre) et quelques légumes (lentilles, pois);

- 3 fruits (ananas, pomme, citrus);

- 2 plantes sucrières (canne et betterave).

A cette série d'éthanols provenant de plantes, nous avons ajouté - en vue de les comparer ­

deux groupes d'éthanols dont l'un est issu de lait animal et l'autre d'origine fossile (synthèse).

La figure 5-4 montre une classification hiérarchique des sucres résultant de l'analyse par

groupes des onze pools d'éthanols.

La table rectangulaire contenant les valeurs isotopiques moyennes de chaque groupe a été

transformée en une table de proximité sur la base de la distance euclidienne séparant ces

différents groupes.

Au sein du groupe de plantes C3, cela a permis de différencier sans ambiguïté, les citrus

d'un autre sous-groupe à l'intérieur duquel on peut distinguer la betterave du blé.

106

Cette description qualitative des onze groupes d'éthanol peut être rationnalisée par une

méthode plus quantitative à l'aide de l'analyse factorielle en composantes principales.

La figure 5-5 A illustre la représentation des différents groupes d'éthanol associés aux

quatre teneurs isotopiques qui les caractérisent, dans le plan fonné par les deux axes factoriels

principaux qui expliquent 85 % de la variance totale.

d%o

plllnlSC3 plonrs

10

I~

20

30

ID

JL..!:::::~T=====::::!.....-T__LGFiUJre 5-4: Répartition et classification hiérarchique des sucres à partir des onze groupes

d'éthanol.

La figure 5-5 B montre quant à elle, les mêmes individus et variables après une rotation

quartimax des quatre facteurs originaux dont trois pennettent d'expliquer 95% de la variance

totale (Harman, 1976).

107

Cette approche pennet une nette identification des paramètres isotopiques (D/H)1 et B13C

sur le premier axe quartimax, et (D!Hh et (D/H)wS sur le second axe. (D!Hh et B13C qui

représentent les teneurs isotopiques des sucres conduisent à une meilleure discrimination des

groupes: ainsi les plantes C4 ou CAM, les plus riches en isotopes lourds 2H et 13C sont

situées sur le côté droit du diagramme tandis que la betterave et l'orge s'établissent à gauche.

I~

..cone

1.00

citrus•

rice•1.00

0.50

1.

monroc

o -------:~:~-----:~~~:- __1 . bOriey

~:::11! -+- .......__---; moile1 :..----1----....;-----'

_LOO _0.50 0 0.50

7.00 T------------:--------------.,

pv1ecpple

•mcize

..

•borley

•beet

:43%,--,1,1

liQ6>u1 :I(D/HJ~Icitrus ~

rice .. ~ cane... ~)IJo ------------------------ ----- _

.. oppie [613CJ. whey .d6 ~~

-monioc

3.50

7.00o_7.00~.+-----_+_----_;_----__+,----___i---l

3.50

Fieure 5-5 A et B: Exemples d'analyse factorielle en composantes principales.

108

D'autre pan, le deuxième axe qui représente en réalité la composition isotopique de l'eau du

fruit et la concentration en sucres du jus fermenté, est un moyen très utile permettant de

distinguer entre elles les espèces végétales de même mécanisme métabolique ou ayant des

sucres de même teneur isotopique: les éthanols de maïs, de canne à sucre et d'ananas sont de

la sone très bien différenciés par le second axe, de même que ceux de riz et d'orge.

(D/H hI(DI H)~

-'- 2.0

opple

X(26 ech)

96%

-1.01 _0.5

citrus

x(38 ech)

95%

-- 1.0

pineopple

1 ,x 1(D/H II

1 j 1

~13C •0 0.5 1.0

(48 ech)100%

Fi2ure 5-6: Exemple d'analyse discriminante ponant sur des échantillons de fruits

(pommes, citrus et ananas) et des paramètres (D/H>!, (D/H)z, (D/H)wq et ol3c.

109

Cependant, dans les deux derniers cas, il faut souligner que le deuxième axe reflète la

composition isotopique de l'eau qui a servi à dissoudre le glucose de céréales en vue de sa

fennentation alcoolique, les échantillons d'orge étant brassés dans les pays de l'hémisphère

nord et ceux de riz ayant été fennentés dans les régions équatoriales.

5-3. Con c 1u s ion :

Les résultats obtenus et discutés ci-dessus peuvent être interprétés en tennes

d'évapotranspiration des plantes et de la photosynthèse des glucides. De plus, nous avons

recherché les contributions respectives des effets de l'environnement et de la voie métabolique

aux fractionnements isotopiques de l'hydrogène et du carbone de plantes ayant un intérêt

économique.

Mais le but principal de cette étude est avant tout de constituer une banque de données en

vue d'identifier l'origine des produits alcoolisés et des jus de fruits, et par suite de contribuer à

détecter les adultérations de jus de pommes, d'ananas et de citrus.

L'analyse en composantes principales indique que les différents échantillons d'éthanol

dérivant d'une plante donnée pourraient être assignés à un groupe bien détenniné, et ceci est

clairement prouvé par l'analyse du facteur discriminant (AFD).

Considérons dans un premier temps l'exemple des quatre paramètres isotopiques des trois

groupes de fruits fonné par l'ananas, les citrus et les pommes dont la matrice constituée par

112 échantillons d'éthanol (48 ananas, 38 citrus et 26 pommes) a été soumise à l'AFD. La

figure 5-6 montre que la classification qui en résulte est excellente puisque seulement 4 à 5 %

des pommes et citrus se retrouvent dans le mauvais groupe et que tous les ananas sont

parfaitement assignés. L'ajout d'une cinquième variable (les valeurs B180) accroît légèrement

110

b1

_1.0. .0Citrus

1-2.0( 35 ech ) 1

100%

1

L-_ I.O----l

(D/H )n

~-~ 2.0

-r- 1.0 COne--beet- XX

(79 ech) ( 68 ech) (D/H )11 100% 100% -1 1 1 1 1 1 ~

Fi2ure 5-7: Exemple d'analyse discriminante portant sur des jus de Citrus et des deux

principales plantes sucrières, la betterave et la canne.

le pouvoir discriminant du second axe.

Le deuxième exemple illustre la possiblité d'une chaptalisation des jus de citrus à l'aide de

sucre de canne et / ou de saccharose de betterave.

111

Sur la figure 5-7, on observe que les 182 échantillons d'éthanols considérés sont tous

répartis dans les trois groupes indiqués, tandis que 2 échantillons de jus de citrus contenant

10% de saccharose de betterave et 10% de saccharose de canne sont localisés à l'extérieur du

périmètre des citrus.

*

* *

Chapitre 6:

moyen de la RMN

815N).

112

Contribution à l'étude des Bases Puriques au

quantitative 2U et de la SMRI (8D, 813C et

6·1. 1 n t r 0 duc t ion :

Si l'utilisation des isotopes stables du carbone pour l'étude des composés organiques

naturels a connu de vastes champs d'application depuis plusieurs années (Bender, 1971;

Smith et Brown, 1973; Osmond et al., 1975; O'Leary, 1988), celle des isotopes

stables de l'azote ou du couple de rapports isotopiques BC/12C et 15N/14N est plus récente et

s'est surtout développée dans des domaines comme l'archéologie (Bocherens et al., 1988;

DeNiro et Hastorf, 1985) et l'océanographie (Rau et al., 1987; Schoeninger et

DeNiro, 1984) notamment. Par contre cette méthode isotopique, à notre connaissance, a

rarement été appliquée à l'analyse des composés organiques azotés purs, naturels ou de

synthèse.

Pour combler cette lacune, nous avons entrepris une étude par la RMN 2H et par

spectrométrie de masse de la Xanthine et ses dérivés, la Théobromine, la Théophylline et la

Caféine. Ces substances organiques, encore appelées bases Puriques, appartiennent à la

famille des Alcaloïdes comprenant entre autres, la Nicotine, la Quinine et la Morphine. Ce sont

des biomolécules spécialisées - ou nucléotides puriques -, dont les précurseurs sont constitués

par des aminoacides, et qui possèdent un rôle biologique important. Ainsi la caféine qui est un

stimulant doux par son action sur les systèmes nerveux et cardiovasculaire, possède par

ailleurs des propriétés diurétiques (action sur le système rénal).

On trouve la caféine dans les fruits, l'écorce et les feuilles de plus de 60 espèces de plantes

dont les plus répandues sont: le caféier (coffea arabica L. ), le théier (camellia sinensis L.), le

cacaoyer (theobroma cacao) etc ... (Suzuki et Waller, 1988). Et récemment, Stewart

(1985) a pu extraire la caféine à partir de feuilles et de fleurs de citrus. Puisque l'essentiel de

cette étude a trait à la caféine extraite de café, il nous faut rappeler qu'il existe dans la nature

trois espèces de caféiers: l'Arabica, le Robusta et l'Arabusta qui résulte du croisement des deux

premières. L'arabica est cultivé surtout en Amérique Latine, mais aussi sur les hauts plateaux

d'Afrique (Ethiopie, Cameroun, Zaïre, Ruanda, Burundi), entre 1000 et 2500 mètres

113

d'altitude. Il est caractérisé par un arôme développé et une faible teneur en caféine: 0,8 à 1,5

%. Le robusta quant à lui pousse en dessous de 600 mètres d'altitude dans les zones tropicales

d'Afrique et d'Asie. Il a un arôme plus faible mais un taux de caféine plus élevé (2 à 2,7 %)

que l'arabica. On l'utilise donc pour donner du "corps" à l'arabica dans les mélanges. Enfin,

l'arabusta est une espèce plus récente, créée par l'Institut de Recherche sur le Café et le Cacao

(IRCC, Côte-d'Ivoire), par croisement entre le robusta et l'arabica, d'où son nom pour

indiquer sa double origine.

L'intérêt commercial majeur de l'arabusta est d'allier les qualités de l'arabica (arôme) à

celles du robusta (force), tout en ayant un taux réduit de caféine: 1,8 à 2 % (Documents

IRCC, Côte-d'Ivoire). L'attention considérable dont la caféine a été l'objet vient d'abord

de sa présence dans de nombreux aliments (produits à base de chocolat) et en particulier dans

des boissons non alcoolisées de grande consommation comme le café, le thé, Coca Cola, Pepsi

Cola, etc ...Elle joue donc un très grand rôle sur la santé des Consommateurs et ce, d'autant

plus qu'elle constitue l'une des drogues douces les plus largement consommées dans le

monde. Par conséquent, il est important pour des raisons de santé publique de connaître les

origines géographique, naturelle ou synthétique de la caféine qui entre dans la fabrication des

produits consommés, ou plus simplement sa présence ou non dans un produit commercial

donné.

On peut déceler, dans un délai assez bref, la présence de la caféine par un dosage HPLC

(DiNunzio, 1985) utilisant un détecteur UV. C'est essentiellement pour trouver des critères

qui permettraient de connaître leurs origines que nous avons étudié dans ce chapitre plus de 30

échantillons de Xanthine et ses dérivés, dont la caféine en particulier.

Si la Xanthine, la Théobromine, la Théophylline et quatre des échantillons de caféine

analysés sont d'origine commerciale, toutes les autres caféines ont été extraites au laboratoire à

partir de grains de café vert provenant de 14 pays producteurs différents. Ces échantillons ont

été analysés par spectrométrie de masse (D/H, 13C/12C et 15N/14N) et par la RMN

quantitative 2H qui conduit aux rapports isotopiques spécifiques (D/H)i des différents sites

monodeutériés de la molécule de caféine.

La caféine a certes été le sujet de nombreux travaux du fait de son rôle souligné plus haut,

mais rares sont ceux basés sur les méthodes isotopiques. L'étude consacrée à la détermination

de l'origine géographique de la caféine par Dunbar et Wilson (1982) - la seule que nous

ayons trouvée dans la littérature - et fondée sur la mesure des isotopes stables 2H, 13C et

114

180, a surtout le mérite d'être la première du genre, car ces auteurs utilisent peu de sources

géographiques différentes de caféine (6 pays au total dont deux font exception à la conclusion

finale). Ensuite la méthode d'extraction employée dans cette étude nous paraît de nature à

induire des fractionements isotopiques, ce qui peut nuire à la qualité des mesures.

Enfin, il faut savoir que les paramètres Ù13C ne peuvent en aucun cas servir de critère

géographique, puisqu'ils caractérisent le mode de fixation du dioxyde de carbone par une

plante quelle que soit la localité dont elle provient.

La plupart des organismes vivants utilisent l'azote sous forme de nitrates qui, eux mêmes,

dérivent des nitrites par oxydation de l'ammoniaque par des bactéries (Lehninger, 1985).

C'est le cas des végétaux en particulier, dont seule une infime minorité est capable de fixer

directement l'azote atmosphérique. Il en est ainsi des plantes légumineuses telles que les pois,

les haricots, les trèfles, etc ...L'étude des mécanismes de nitrification-dénitrification dans les

sols et de la fixation de l'azote libre par les plantes a fait l'objet de nombreuses études

résumées par Shearer et Kohl (1986).

Le but de ce chapitre est de mettre au point, par des méthodes spectrométriques (RMN 2H

et SMRI), des critères fiables pour caractériser les origines géographique (Afrique ou

Amérique Latine), naturelle ou synthétique de différents échantillons de caféine, extraite au

laboratoire, et dont la pureté est connue par dosage HPLC, et de différencier les trois variétés

de café.

6-2. Résultats des mesures par Spectrométrie de masse :

L'ensemble des mesures effectuées sur la caféine et les autres dérivés de la Xanthine par

spectrométrie de masse et rassemblées dans les tableaux 6-1, 6-2 et 6-3 peut être analysé sous

deux aspects :

1. un aspect analytique ayant pour but de rechercher un ou plusieurs critères permettant de

distinguer, d'une part les origines naturelle ou industrielle d'un dérivé quelconque de la

Xanthine, et d'autre part l'origine géographique et la variété des divers échantillons naturels de

caféine;

115

2. un aspect fondamental fondé sur une tentative de distinction des métabolismes C3 et

C4/CAM à partir des données isotopiques 815N.

Notre échantillonnage de caféine naturelle provenant essentiellement du café, la

discussion sur l'appartenance à un type métabolique sur la base des rapports isotopiques

15N/14N ne pourra se faire qu'en recourrant aux données de la littérature relatives à l'étude

des mêmes parties de plantes (fruits), basées sur la méthode isotopique 15N, ou à défaut, aux

résultats obtenus sur le collagène osseux et/ou aux sédiments archéologiques par exemple.

Variété: 8D 813C Origine:

-110,4 -27,5

-127,5 -27,7

Arabica -105,9 -28,1 Amérique Latine

-105,2 -28,3

-103,4 -28,3

-79,2 -26,8

Arabica -60,9 -28,3

-83,1 -27,2

-60,4 -28,4

Robusta -78,2 -26,5 Afrique

-84,1 -27,9

-88,8 -28,4

-92,9 -26,9

Arabusta -81,5 -28,3

-92,5 -28,3

Tableau 6-1: Composition en deutérium et en carbone-13 de caféines naturelles.

116

Toutes nos mesures a13C et a15N ont été effectuées sur le spectromètre Finnigan Delta

E. Pour l'azote, les résultats obtenus sont exprimés en a%0 selon l'expression:

15a N(%o) (6)

Le standard utilisé est l'azote atmosphérique, caractérisé par sa grande homogénéité et une

composition isotopique remarquablement stable (Sweeney et al., 1978; Mariotti, 1983,

1984).

Les résultats des paramètres isotopiques aD et a15N des tableaux 6-1 et 6-2 permettent une

nette distinction entre les caféines issues de café d'Afrique et celles provenant de café

d'Amérique Latine. Parallèlement, la mesure a15N de la variété arabusta se distingue sans

ambiguïté des deux autres variétés.

L'examen des données isotopiques a13C du tableau 6-1 montre que quelles soient sa variété

et son origine géographique, le caféier est une plante C3, c'est à dire qu'il fixe le C02

atmosphérique selon le cycle de Calvin (-28,8 %0 < a13C < -26,5 %0).

Ces résultats couplés aux valeurs a15N de ces mêmes échantillons naturels doivent

permettre une analyse des a15N en termes de voies photosynthétiques.

En effet, à l'exception de l'échantillon du Pérou dont la variété ne nous a pas été indiquée,

mais qui est probablement un arabica si l'on en juge par sa valeur aD, les paramètres a15N,

tout comme les aD, se distinguent parfaitement d'un continent par rapport à l'autre:

117

Variété: Continent 1Pays; 815N (%0)

{ Amérique Latine +1,8 (n = 5)

Arabica

Kénya - Ethiopie +2,4(n=2)

Arabusta Afrique +4,9 (n = 3)

Robusta Afrique + 2,3 (n =11)

Tableau 6·2; Composition en azote-15 des trois variétés de café.

Les caféines d'Amérique Latine sont moins riches en deutérium et en azote-15 que celles

d'Afrique dont les taux isotopiques 815N sont par ailleurs d'une remarquable stabilité (815N

moyen = +2,3 %0, 0" = 0,4) à une exception près.

Enfin, on peut noter - sous réserve d'une confirmation ultérieure - que ce sont les

échantillons d'arabusta (n=3) qui possèdent les plus fortes valeurs 815N (4,9 %0) de toutes les

caféines étudiées au cours de ce travail.

Le tableau 6-3 comporte les valeurs isotopiques 8D, 8 13C et 8 15N relatives aux

échantillons commerciaux de la Xanthine et ses dérivés la Théobromine, la Théophylline et la

Caféine, vendus par les fournisseurs habituels des laboratoires de recherche Sigma, Aldrich,

Fluka et Prolabo:

118

Nature: lillN Qrjeine:

Xanthine -39,6 -2,8 Sigma

" -116,5 -40,8 -4,5 Fluka

Théophylline -98,8 -39,0 -32,3 Sigma

" -36,9 -30,9 Fluka

Théobromine -112,2 -27,9 + 3,0 Sigma

" -113,8 -27,9 +3,3 Fluka

Caféine -88,2 -35,0 -24,6 Aldrich

" -30,4 -36,1 -20,3 Prolabo

" -59,6 -36,4 -33,6 Sigma

" -94,7 -38,2 -24,0 Fluka

Tableau 6-3: Paramètres isotopiques oD, 0BC et o15N des bases puriques issues du

commerce.

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commerciales ~

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1

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Fi~re 6-1 : Répartition des caféines naturelles et d'origine commerciale en fonction de

leurs teneurs en carbone-l3.

119

La comparaison des paramètres ù13C des tableaux 6-1 et 6-3 fait ressortir qu'il existe de

réelles différences entre les teneurs isotopiques des échantillons de caféine obtenus par

synthèse industrielle et ceux extraits au laboratoire: on peut par exemple les distinguer

clairement sur la base des seules valeurs ù13C (figure 6-1) ou uniquement sur celle des ù15N

illustrées par la figure 6-2.

Les quatre échantillons de caféine et les deux échantillons de théophylline, d'origine

industrielle, sont caractérisés par de très faibles valeurs ù15N dont chacune peut être

considérée comme une caractéristique de la voie de synthèse utilisée par le fabricant. Les

paramètres ù13C des deux échantillons de Xanthine indiquent bien qu'ils sont d'origine

industrielle même si leurs valeurs ù15N sont relativement élevées (-2,8 et -4,5 %0).

Par contre, les teneurs isotopiques ù15N (+3,0 et +3,3 %0) et ù13C (-27,9 %0) des deux

échantillons de théobromine montrent que ceux-ci, bien que commerciaux, ne proviennent

sûrement pas d'une synthèse industrielle mais plutôt d'une extraction à partir de grains, de

feuilles, d'écorce ou de fleurs de plante C3.

Enfin, s'agissant des valeurs ùD des purines d'origine industrielle, on observe, à

l'exception de deux caféines, qu'elles ne sont pas très différentes de celles des caféines

naturelles.

6-3. Interprétation et Discussion

Les mesures isotopiques ù15N ont surtout pennis jusqu'alors de distinguer les plantes

terrestres des plantes marines: les premières qui, en majorité, fixent l'azote sous sa fonne

inorganique (NH4+ et N03-), sont caractérisées par des valeurs ù15N inférieures de 4 %0 par

rapport aux secondes.

120

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Fi~re 6-2 : Répartition des caféines naturelles et commerciales suivant leur composition

en azote-15.

Mais ces paramètres ô15N permettent aussi la distinction entre plantes légumineuses (ou

plantes à nodules) qui fixent directement l'azote atmosphérique et les non légumineuses

constituées par l'immense majorité des végétaux terrestres, celles-ci ayant des rappons

isotopiques 15N/14N plus élevés que les premières (Delwiche et al., 1979).

La possibité d'une lecture des paramètres Ô15N de composés azotés purs, extraits de

plantes, en termes de distinction entre métabolismes C3 et C4/CAM est fondée sur deux

observations:

- appliquant les couples de rapports isotopiques 13C/12C et 15N/14N à l'étude des plantes

préhistoriques provenant du Pérou, DeNiro et Hastorf (1985) ont montré que les teneurs

isotopiques ô13C et ô15N de ces plantes sont semblables à ceux de plantes actuelles ayant les

mêmes mécanismes de fixation du C02libre et d'assimilation de l'azote inorganique;

- Brown (1978) puis Moore et Black (1979) ont montré que les plantes C4 utilisent

plus efficacement l'azote que les plantes C3, en d'autres termes, les espèces de type C4

auraient des valeurs ô15N plus élevées que celles des végétaux de type C3.

121

Ces observations prouvent qu'il serait possible de faire une classification des plantes en

trois groupes distincts:

- plantes légumineuses;

- plantes non légumineuses de type C3;

- et plantes non légumineuses de type C4/CAM

sur la base de leurs valeurs isotopiques ol3C et 015N.

Cependant, pour éviter tout effet isotopique lié à la composition chimique des différents

organes de plantes, il serait nécessaire de ne comparer entre eux que des résultats portant sur

les mêmes parties (grains, feuilles, racines, etc ...). La comparaison de nos résultats à ceux de

la littérature semble confinner ces suggestions: les plantes C3 seraient caractérisées, en valeurs

moyennes, par ol3C = -27,5 %0 et 015N < +7 %0, tandis que les végétaux C4/CAM auraient

des teneurs isotopiques moyennes ol3C et ol5N respectivement égales à -12,0 %0 et> +10,0

%0.

Contrairement aux plantes légumineuses qui fixent directement l'azote atmosphérique, le

caféier - comme la grande majorité des plantes supérieures - assimile l'azote par ses racines,

sous forme de nitrates et de sels d'ammonium du sol. Ce transfert d'azote du sol à la plante se

traduit par une modification de la teneur isotopique 015N de celle-ci (Mariotti et al.,

1980). Plusieurs études consacrées aux rapports isotopiques 15N/14N des nitrates et/ou des

sels d'ammonium (Mariotti et al., 1981; Wellman et al., 1968; Delwiche et

Steyn, 1970), montrent que les processus de nitrification-dénitrification des sols

s'accompagnent d'un fractionnement isotopique qui affecte la composition isotopique de ces

nitrates et sels d'ammonium.

Mariotti et al. (1982) ont montré que le bilan global de ces transformations biologiques

fait apparaître que l'effet isotopique associé à la nitrification est plus important que celui dû à la

dénitrification. L'ensemble des processus proposés par Shearer et Kohl (1986), et que

nous avons légèrement modifié, donne le cycle suivant:

122

Azote organique ---(minéralisation)---> NI4+ ---(nitrification)---> N03-" /~~ ,,/. " /IL Dé " 'Pl *--<---- composltlon------ <------------------ antes

La teneur isotopique ô l5N des ions NI4+ et N03- du sol, par suite de leur fixation ou de

leur échange (transfonnations physiques) par les plantes dépend probablement de celui de

l'azote organique de ce sol, mais aussi des fractionnements isotopiques associés aux processus

biologiques importants que sont la dénitrification et la nitrification. La dénitrification conduirait

à un enrichissement en azote-15 du nitrate restant, tandis que l'ammonium résiduel, résultant

de la perte de NH3 par évaporation selon l'équilibre: NH3 + H+ <======> NH4+

s'enrichirait en azote-15 au cours de la nitrification (Shearer et Kohl, 1986).

Ainsi, le fractionnement isotopique global observé par des mesures ô l5N de grains de café

vert résulterait d'une suite de processus biologiques dont l'interprétation suppose une

appréciation des différentes contributions liées à chaque étape du cycle de l'azote.

Enfin, les teneurs isotopiques ôD obtenues par spectrométrie de masse, sur les eaux de

combustion de la caféine (tableau 6-1), sont confinnées par les résultats de la RMN 2H, et

s'interprètent comme les rapports isotopiques spécifiques (D/H)i.

6-4. Résultats et Discussion des paramètres isotopiques spécifiques (D/H)i

obtenus par la RMN 2H :

Dans tout ce qui suit, les rapports isotopiques (D/H)i des différents sites i ont été calculés à

partir de la relation :

12 mTMU·M f'l SI(D/H)I = -* ca e ne*__*135,O (7)

PI mcafélne .MTMU Sréf.

123

dans laquelle :

- Pi = nombre d'atomes d'hydrogène du site i considéré;

- m = masse en gramme de caféine ou de TMU(tétrarnéthylurée) utilisés;

- M =masse molaire de la caféine ou de TMU;

_Si = surface du pic relatif au site i ;

- Sréf. =surface du pic relatif au TMU.

La méthode de la RMN quantitative 2H a été appliquée avec succès à l'identification de

l'origine des composés organiques comme les Anétholes (Martin et al., 1983) et la

Vanilline (Maubert et al., 1988). Elle a permis de mettre en évidence l'hétérogénéité de la

distribution naturelle du deutérium au sein de ces molécules organiques.

L'un des apports fondamentaux de cette méthode, c'est qu'elle donne accès aux rapports

isotopiques spécifiques (D1H)i de chaque site i monodeutérié de la molécule étudiée. On peut

ainsi obtenir des informations sur les mécanismes biosynthétiques qui ont présidé à

l'élaboration de la substance organique considérée.

Enfin, cette méthode peut conduire à la mesure de l'influence des facteurs

environnementaux comme la température et les précipitations (Martin et al., 1982).

oIl

2O~

Fie;ure 6-3: Molécule de caféine (l,3,7-triméthylxanthine).

124

La molécule de caféine (figure 6-3), à laquelle nous avons appliqué cette nouvelle

méthodologie, possède quatre sites monodeutériés dont trois sont des groupements méthyles.

Va r i été: (D/A)7: (D/A)3: (D/Ah: Origine:

Aldrich 117,7 107,9 109,2

Prolabo 137,3 122,7 125,0

Sigma 129,9 124,4 125,9 Commerce

F 1u k a 117,3 112,2 112,7

104,3 107,3 103,4 Mexique

Arabica 97,8 97,6 97,3 Costa - Rica

107,0 108,1 104,0 Guatemala

107,3 106,5 106,9 Haïti

107,6 110,5 110,6 Pérou

Arabica 112,6 109,9 109,9 Kénya

114,4 115,2 116,9 Ethiopie

123,4 120,4 118,9 Côte - d'Ivoire

123,8 122,1 122,6 Cameroun

Robusta 123,4 123,5 123,0 Madagascar

124,1 121,4 121,5 Centrafrique

Arabusta 118,4 118,4 117,1 Côte - d'Ivoire

122,1 122,2 123,2 " "

Tableau 6-4 : Paramètres isotopiques spécifiques (DlHh des sites i monodeutériés de la

molécule de caféine.

Les résultats des rapports isotopiques spécifiques (DlHh des échantillons de caféine de

125

diverses origines et variétés sont consignés dans le tableau 6-4. L'examen des valeurs (DlHh

des trois méthyles monodeutériés de la caféine montrent qu'on peut répartir les échantillons

naturels et industriels considérés en trois sous-groupes:

- le premier est constitué par deux échantilons arabusta de Côte-d'Ivoire caractérisés par

des valeurs (D1H)1 et (D1H)3 pratiquement identiques;

- le deuxième comprend des échantillons de Haïti, du Pérou, du Kénya, du Cameroun

et de Centrafrique, ayant les mêmes valeurs (DIH)3 et (D1H)7' à 0,2 ppm près en moyenne;

-le troisième sous-groupe est composé de tous les autres échantillons dont les méthyles ont

des paramètres isotopiques (DlHh distincts tous les trois, et provenant du Mexique, de

Guatemala, d'Ethiopie et de Côte-d'Ivoire.

Cette répartition, qui paraît un peu singulière, montre d'abord que les mécanismes de

biosynthèse sont loin d'être identiques et varieraient probablement en fonction des conditions

climatologiques.

Le processus de la biosynthèse du noyau des bases puriques a été élucidé grâce à des

expériences au cours desquelles des métabolites marqués aux isotopes 14C et 15N ont été

fournis à des animaux dans leur alimentation (Lehninger, 1985).

On a pu ainsi déterminer l'origine des atomes de carbone et d'azote (figure 6-4) du noyau de

la Xanthine (et de ses dérivés): chacun des quatre atomes d'azote provient d'un acide aminé

bien défini (Lehninger, 1985).

Cette biosynthèse commence avec le ribose 5-phosphate à partir duquel le noyau des

purines se constitue étape par étape (Beevers, 1976). En outre, Suzuki et Waller

(1984) ont suggéré que la méthylation de la Xanthine qui donne la théobromine, puis la

théophylline et enfin la caféine, se fait elle aussi progressivement, avec la méthionine comme

unique donneur du groupement méthyle.

L'existence des sous-groupes cités ci-dessus semble quelque peu contredire l'idée d'une

méthylation progressive du noyau des bases puriques. En effet, toute méthylation progressive

entraînerait une cinétique différente d'un site méthylé à un autre, et par suite des rapports

126

isotopiques (D/H)i distincts. Ce n'est pas ce qu'indique le tableau 6-4.

La lecture de celui-ci suggère que ce processus de méthylation se fait suivant trois voies

distinctes dans le temps et dans l'espace:

- une méthylation simultanée des positions 1 et 3, utilisant la même cinétique, et mettant en

jeu deux molécules d'un unique donneur de groupements méthyles: elle aboutit à la fonnation

de la Nl,3_diméthylxanthine;

- une méthylation isocinétique des positions 3 et 7, utilisant des méthyles issus de deux

molécules d'un même donneur, et qui conduit au N3,7-diméthylxanthine;

Dans ces deux cas, la simultanéité des réactions peut être favorisée par l'orientation spatiale

de la molécule de caféine.

- enfin, on remarque que les échantillons de Costa-Rica et de Madagascar se

singularisent par une composition isotopique identique des trois sites méthylés, ce qui

s'expliquerait par une isocinétique simultanée des trois positions, impliquant trois molécules

d'un seul et même donneur de groupements méthyles.

Aspar"ta1"e

~

~Fonna1"e

\Azo1"e de l' am i de

de la glu1"amine

Glycocolle

1

~ Forma1"e

Fi~re 6-4 : Origine des atomes de carbone et d'azote du noyau des bases puriques.

L'interprétation des différences que l'on observe dans la composition isotopique des trois

sites méthylés de la molécule de caféine semble plus complexe. On peut cependant imaginer un

127

fractionnement isotopique lié à trois conditions différentes de la réaction de méthylation.

Selon Suzuki et Waller (1984), la biosynthèse de la caféine interviendrait pendant la

période de formation des grains verts. Les différences observées dans les teneurs isotopiques

que nous venons de noter, résulteraient donc de l'influence des données météorologiques, à

travers la composition isotopique de l'eau d'alimentation de la plante à cette période, de celle de

la méthionine, et de la cinétique des voies biosynthétiques.

A une exception près, les résultats des teneurs isotopiques BD obtenus par spectrométrie de

masse sont confirmés par la RMN : on observe en effet que les plus faibles rapports

isotopiques (DIH)i' comme les plus faibles valeurs BD, sont ceux relatifs aux caféines

d'Amérique Latine, où les plantations de caféiers sont situées dans des régions montagneuses.

Mais la situation en altitude ne suffit pas à expliquer ces faibles valeurs BD et (D/H)i des

caféines d'Amérique par rapport à celles d'Afrique. On peut noter, en effet, que les arabica

d'Afrique qui, eux aussi, ne poussent qu'en altitude, à partir de 2000 mètres, ont des valeurs

BD et (D/H)i de même ordre de grandeur que les autres échantillons issus du même continent.

Nous devons donc en conclure, d'une part, que ces paramètres isotopiques sont indépendants

des variétés de café, et que d'autre part, les différences enrégistrées seraient aussi associées

aux conditions climatiques de croissance des caféiers.

TI faut enfin signaler que nous n'avons pas pu obtenir les valeurs (D/H)8 ' et par suite des

informations liées à ce site pour deux raisons:

- une difficulté technique due aux déplacements chimiques trop proches du proton en

position 8 (BH8=7,6 ppm) de la molécule de caféine et celui du solvant CHCl3 utilisé

(ÙH=7,4 ppm) a eu pour résultat de masquer le pic du premier par celui du second;

128

CH3....... N1

5

oIl

7 3 1

TMU

18.0

17.0

16.0

15.0

14.0

1

3.01

2.0

Fi~re 6-5: Spectre RMN 2R de la molécule de caféine, enrégistré à 400 MHz, dans du

chloroforme allégé. S = solvant CHCl3 ; TMU = tétraméthylurée (référence interne) ; X =

impureté.

- selon Jones et Taylor (1981), il existerait un échange isotopique entre le site 8 et l'eau

d'extraction de la caféine.

Si l'on en croît les premiers essais effectués au laboratoire (figure 6-5), le problème du

solvant peut être résolu grâce à l'utilisation simultanée d'un solvant appauvri en deutérium et

d'un appareil RMN plus puissant que le Brüker AM 400 utilisé au cours de cette étude.

Mais, on ne pourra accéder aux valeurs (DIH)8 que par un calcul qui doit tenir compte de la

température et de la cinétique d'échange.

129

6·5. Con c 1 u s ion :

L'analyse muIti-isotopique de la molécule hétérocyclique de caféine (CgH lON402) est

rendue possible par la présence des atomes de carbone, d'hydrogène, d'azote et d'oxygène.

L'intérêt scientifique porté à cette subtance organique s'explique par trois raisons:

- son utilisation ou sa présence dans de nombreuses boissons populaires;

- son extraction à partir de feuilles de thé, de noix de cola ou de grains de café vert permet

de connaître son origine géographique, comme l'attestent nos résultats;

- elle contient les mêmes atomes que les drogues dures telles que la cocaïne et la morphine,

ce qui n'est pas inutile dans la lutte contre la prolifération de ces drogues dans le monde.

Nos résultats montrent ensuite que tout mélange entre caféines naturelle et industrielle d'une

part, et caféines issues de variétés arabica et robusta d'autre part, se traduit par une valeur

spécifique de la composition isotopique (813C et 815N) du mélange considéré. Il est donc

permis de penser qu'il serait possible de déterminer les origines géographique, naturelle ou

synthétique des alcaloïdes sur la base de leurs teneurs isotopiques, si l'on dispose d'une

banque de données d'échantillons naturels de caféine, provenant de variétés de café par

ailleurs bien sélectionnées. Les paramètres 815N semblent être particulièrement sensibles aux

variétés arabica, arabusta et robusta de café, tandis que les rapports isotopiques spécifiques

(DIH)i' obtenus par la méthode RMN-FINS, permettraient de mieux connaître le mécanisme

des processus de méthylation du noyau des bases puriques.

De ce travail, il ressort en particulier que la mesure des rapports isotopiques 15N/14N de

composés azotés purs, constitue un bon critère pour l'identification de leurs origines

(botanique et géographique). Ainsi, les conditions climatiques semblent exercer une grande

influence sur la composition en isotopes lourds 2H et 15N. Mais si l'interprétation des

résultats 8D et (DIH)i est à présent bien maîtrisée, il n'en va pas de même de celle des valeurs

815N. Celle-ci nécessite une connaissance complète du cycle de l'azote et des fractionnements

isotopiques associés aux transformations successives de l'azote organique du sol

(minéralisation, nitrification-dénitrification) et à l'assimilation de l'azote inorganique par le

130

caféier (et les plantes non légumineuses) sous forme d'ions NH4+ et N03-.

Après le carbone-13 et le deutérium, les mesures isotopiques en abondance naturelle 15N

ouvre un nouveau champ d'application pour la détection de la présence de certains composés

organiques azotés indésirables dans les produits alimentaires, et la répartition en métabolismes

C3 ou C4/CAM, puisqu'il a été postulé que les plantes C4 assimilent plus efficacement l'azote

que les plantes C3.

*

* *

CONCLUSION

131

GENERALE

En conclusion de la présentation de ce travail, nous rappelons en les discutant brièvement,

les principaux résultats obtenus, ainsi que leurs traductions pratiques et quelques perspectives.

L'analyse par Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques (SMRI) des eaux

naturelles (eaux de la nappe phréatique et eaux de surface) de Côte·d'Ivoire nous a pennis

de mettre en évidence des relations linéaires entre les teneurs isotopiques BD et BI80 et les

facteurs géographiques et d'environnement. Ces corrélations s'expliquent par l'influence des

variables longitude, latitude, altitude, distance à l'océan et température, précipitation, humidité

relative, insolation sur les concentrations en isotopes lourds des eaux considérées. L'ensemble

de nos résultats montre que ces paramètres BD et BI80 constituent de bons enrégistreurs des

variations climatiques au cours du temps.

L'application de la méthode RMN.FINS, associée à l'analyse isotopique par spectrométrie

de masse, du deutérium provenant d'espèces végétales de type C3, C4 et CAM issues en

majorité d'une même région, nous a permis d'obtenir des résultats cohérents quant à la

distinction entre les trois voies photosynthétiques qu'utilisent les plantes supérieures: cette

fonction de différenciation est assurée par les rapports isotopiques spécifiques (D/H)},

caractéristiques du sucre, et donc de son origine botanique, et par le paramètre R. La

deuxième source d'informations est celle des rapports spécifiques (D/Hh qui donnent accès à

la composition isotopique :

1. du solvant dans lequel a été dissous le glucose avant fermentation;

2. de l'eau qui a servi à reconstituer le jus de fruits à partir de concentrés;

3. du pur jus naturel, et par suite son origine géographique.

C'est donc l'un des paramètres isotopiques qui permet de détecter le mouillage d'un vin ou

un jus de fruits reconstitué à base de concentrés. Si la teneur isotopique BDI de l'isotopomère

CH2DCH20H, plus liée à l'espèce végétale, dépend moins des facteurs climatiques, en

132

revanche, celle oD2 de l'isotopomère CH3CHDOH est plus sensible aux conditions

d'environnement, notamment à la température et aux précipitations. Cette observation

s'explique par le fait que des atomes d'hydrogène de l'eau des fruits sont incorporés dans la

molécule d'éthanol au cours de la transformation levurienne des glucides, et que la

composition en deutérium de cette eau est fortement influencée par ces deux paramètres

météorologiques.

Enfin, il nous semble intéressant d'envisager une analyse des effets climatiques sur les

paramètres isotopiques de l'ananas, en profitant de la diversité des régions de culture de cette

plante qui, rappelons le, pousse sur les cinq continents.

L'analyse par spectrométrie de masse des rapports isotopiques 13C/12C d'éthanols dérivant

de la fermentation de jus sucrés naturels et de glucoses de plantes C3, C4 et CAM nous a

conduit à observer qu'à chaque mode de fixation du C02 atmosphérique correspond une plage

étroite de valeurs 013C, aux frontières bien distinctes les unes par rapport aux autres. Il est à

noter cependant que la composition en carbone-13 des plantes CAM est proche de celle des

espèces de type C4. Si l'effet de la température sur les concentrations en carbone-13 des

éthanols d'origines botaniques différentes apparaît très faible, par contre, l'influence de

l'insolation sur les valeurs 013C de ces mêmes alcools est prépondérante.

Nous avons pu mettre en évidence, pour la première fois, qu'il est possible de différencier

les plantes C3, C4 et CAM ayant subi les mêmes conditions environnementales et récoltées

dans la même période, sur la base de leurs teneurs isotopiques 0180. Ce résultat a été acquis

en mesurant au spectromètre de masse, les rapports isotopiques 180/160 des eaux de purs jus

de fruits issus de plantes de différentes origines botaniques, après fermentation par

Saccharomyces cerevisiae puis extraction de l'alcool par distillation. Comme les teneurs

isotopiques oD et 0180 des eaux naturelles, celles des eaux de jus de fruits sont conditionnées

par les facteurs climatiques qui influencent non seulement la composition en isotopes lourds

des eaux d'alimentation des plantes étudiées, mais aussi l'intensité de leur évapotranspiration.

Celle-ci, dépendant notamment de la température et de l'humidité de l'air, induit des variations

dans la composition en deutérium et en oxygène-18 de ces eaux de fruits selon la physiologie

propre des végétaux considérés.

133

TI avait été observé au laboratoire que les eaux de fin de fermentation étaient enrichies en

deutérium de 2 à 3 ppm environ par rapport aux eaux initiales i.e. d'avant fermentation. Nous

avons prouvé au cours de ce travail qu'il existe bien un transfert isotopique entre les

différents constituants initiaux du milieu de fennentation (eau, sucres, levure) et les produits

fmaux (éthanol, eau, biomasse), et que ce résultat est tout à fait généralisable à l'ensemble des

isotopes mis en jeu (2H, 13C et 180) au cours de ces fermentations réalisées à l'aide de la

levure de boulangerie.

Des corrélations ont pu être établies entre les compositions isotopiques de l'eau et du sucre

avant fermentation et celles des produits finis. D'un point de vue isotopique, l'ensemble des

résultats des analyses par régression linéaire débouche sur l'établissement d'une matrice des

coefficients de transfert caractéristique des transformations biochimiques mises en jeu.

Nous avons pu constituer une banque de données à partir de l'ensemble des analyses

multi-isotopiques effectuées sur plusieurs dizaines d'échantillons de jus de fruits naturels,

"chaptalisés" et reconstitués, mais aussi sur des échantillons de jus de fruits reçus de différents

fabricants de Loire Atlantique, de Floride, ou simplement achetés dans des

supermarchés. La diversité des sources d'approvisionnement (Brésil, Côte-d'Ivoire,

Israël, Maroc, Espagne, Kénya et USA) et des jus de fruits étudiés (oranges,

pamplemousses, raisin, pommes et ananas) nous autorisent à conclure que l'analyse isotopique

est une méthode fiable et adaptée à la résolution du problème de détection des pratiques

frauduleuses (mouillage et/ou addition de sucres exogènes) dans le commerce des jus de fruits.

Enfin, ces résultats nous donnent les moyens d'envisager et de réaliser la vérification de

l'authenticité des jus de fruits.

L'application de l'analyse isotopique en abondance naturelle (2H, l3C et 15N) à la

molécule de caféine constitue sans doute la partie la plus originale de ce travail. Les résultats

obtenus tant par spectrométrie de masse que par RMN-FINS appellent plusieurs remarques:

1. les paramètres ô13C de l'ensemble des échantillons de caféine extraite au laboratoire

(n=24) s'établissent entre -28,4 et -25,7 %0, indiquant ainsi que le caféier - comme la grande

majorité des arbres fruitiers - est une plante de type C3. Ces teneurs isotopiques ô13C ne

permettent pas de distinguer les trois variétés de café les unes par rapport aux autres, ni

l'origine géographique de l'échantillon considéré, démontrant de la sorte que la valeur ô13C

d'un composé organique est une donnée intrinsèque de l'espèce végétale dont dérive ce

134

composé, en dehors des zones urbaines et industrielles.

2. les essais de répétabilité de la méthode d'extraction utilisée ont fourni, en abondance

naturelle de l'azote-lS, les résultats suivants, sur cinq extractions d'un même échantillon de

café: ô1SNl= +1,6; ô1SN2 = +I,S; ô1SN3 = +1,3; ô1SN4 = +1,8 et ô1SNS = +1,3 0/00.

Ces résultats et ceux obtenus en abondance naturelle du carbone-13 prouvent bien que la

méthode d'extraction utilisée n'entraîne pas de fractionnement isotopique d'une extraction à

l'autre, ce qui constitue une preuve supplémentaire de la fiabilité des résultats de l'analyse

isotopique.

3. le nombre d'échantillons de caféine analysés et la diversité de leurs ongmes

géographiques nous autorisent à penser que l'analyse isotopique 2H et ISN est un puissant

moyen pour distinguer la provenance géographique d'un échantillon de café donné et pour

déterminer son appartenance à l'une des trois variétés cultivées dans le monde.

4. l'étude par la RMN 2H de la molécule de caféine promet de connaître un nouveau

développement, et surtout d'intéressants résultats sur les mécanismes de la biosynthèse de cette

molécule et sur la cinétique de la méthylation du noyau des bases puriques.

Disons pour conclure que l'obtention rapide de résultats précis, par spectrométrie de masse

notamment, associée à une sélection rigoureuse des variétés de café et de leurs origines

géographiques, permettraient d'envisager d'une part, la possibilité d'une détermination des

origines des drogues saisies à travers le monde, et d'autre part un développement important de

cette méthode dans l'étude des processus d'incorporation de l'azote inorganique par les

espèces végétales au cours de la biosynthèse des composés organiques azotés.

** *

PARTIE

135

EXPERIMENTALE:

1. Collecte des échantillons

1-1. Collecte des eaux naturelles :

Toutes les eaux naturelles analysées au cours de ce travail, c'est à dire essentiellement des

eaux de la nappe phréatique, ont été prélevées directement dans des puits situés dans les

localités sélectionnées pour notre échantillonnage. Les eaux de robinet proviennent pour la

plupart de débit d'eau mis à la disposition du public dans les villes. Enfin, les eaux de lac, de

fleuve, de source ou de cours d'eau ont été recueillies dans leur lit lors de nos tournées dans

les différentes régions de Côte-d'Ivoire.

Toutes ces eaux sont ensuite conservées dans des flacons standards munis de bouchons

étanches pour éviter toute évaporation avant leur analyse isotopique.

1-2. Collecte des céréales, des fruits et du café :

Le riz et les ananas nous ont été le plus souvent gratuitement fournis par les producteurs.

notamment la société SAFCO de Tiassalé. Par contre, des céréales peu répandus comme le

mil et le sorgho sont rarement proposés sans contrepartie financière. Certains fruits comme les

oranges et les pamplemousses ont été cueillis par nous mêmes sur les arbres. De la même

manière. nous avons assuré la coupe de toutes les tiges de canne à sucre utilisée dans cette

étude.

Dans la majorité des cas, les échantillons de café de Côte-d'Ivoire ont été achetés chez les

producteurs. Les variétés sélectionnées (robusta et arabusta) nous été fournies par l'Institut de

Recherche sur le Café et le Cacao (IRCC) de Côte-d'Ivoire. Tous les autres échantillons de

café provenant d'Amérique Latine et d'Afrique ont été achetés dans le commerce.

Tous ces échantillons de céréales, de fruits et de café collectés sont placés dans des sacs ou

sachets portant la date de la récolte et la localité d'origine.

136

1-3. Collecte des jus de fruits de commerce:

Tous les jus de fruits de citrus et d'ananas, les concentrés de jus de pommes et de fruits

rouges du commerce analysés au cours de ce travail proviennent en majorité d'échantillons

fournis gratuitement par des producteurs de la région nantaise comme Bric-Fruit, Katell-Roc,

la Cana et Arômes de Bretagne (France), et de Floride (USA). Pour le reste, nous avons

effectué des achats dans les supermarchés.

2. Traitement des échantillons:

2-1. Préparations des jus de fruits naturels:

Tous les jus de fruits naturels- que nous qualifierons aussi de purs jus par opposition aux

jus à base de concentrés ou aux jus "chaptalisés"- utilisés au cours de ce travail ont été obtenus

par pressage à la main ou au presse-agrumes de fruits (oranges, pamplemousses et ananas)

récoltés par nos propres soins dans différentes localités de Côte-d'Ivoire. Pour obtenir les

jus de canne à sucre, on enlève d'abord l'écorce, puis on passe les tiges découpées dans le

sens de la longueur dans une centrifugeuse SEB pour extraire le jus sucré.

Les jus d'agrumes, de canne à sucre et d'ananas ainsi préparés sont filtrés pour éliminer la

pulpe, puis conservés dans des bocaux étanches, après pasteurisation à la chaleur dans une

cocotte-minute SEB.

2-2. Préparation et Hydrolyse des Amidons de Maïs, de Manioc, de Mil et

de Sorgho.

al. Préparation des Amidons:

Dans le cadre de l'étude du métabolisme des plantes, nous avons diversifié nos sources

d'échantillons issus de plantes C3 et C4 en collectant aussi des vins de palme et de ronier, mais

surtout du manioc, des grains de riz, de maïs, de mil et de sorgho. Parmi ces échantillons, les

granuleux sont d'abord broyés à l'aide d'un Waring Blendor, puis tamisés à travers quatre

tamis métalliques de diamètres successifs 0,5 ; 0,25 ; 0,16 et 0,08 mm. La poudre très fine

ainsi récupérée est mélangée à environ 500 ml d'eau de robinet de NANTES (NTW). La

solution résultante est ensuite centrifugée à 2500 tours/mn pendant 15 minutes. On récupère le

137

culot que l'on redilue dans l'eau. On ajoute alors du toluène (1/8 du volume total), puis on

agite vigoureusement pendant 30 minutes à l'aide d'un agitateur magnétique. Après

décantation, le surnageant (toluène + protéines) est éliminé. L'opération répétée 2 à 3 fois

pennet d'obtenir un résidu blanchâtre- l'amidon pur- que l'on met à sécher à l'étuve à 50°C

pendant plusieurs heures.

b/. Hydrolyse des Amidons:

Dans un ballon tricol de 2 litres muni d'un agitateur, d'une ampoule à brome et d'un

réfrigérant, on introduit 40 grammes d'amidon, environ IL d'eau et 20 ml d'acide sulfurique

pur (à 98%). Ce mélange est chauffé à reflux pendant 5 à 6 heures. On laisse ensuite refroidir

jusqu'à 60°C, puis on neutralise la solution avec Ca(OHh jusqu'à pH=5-6. On filtre pour

éliminer les sulfates et les résidus organiques. Après un traitement au charbon végétal, le

volume du filtrat est réduit au rotavapor de moitié environ. Le glucose est ensuite utilisé soit

sous forme de solution, soit cristallisé par évaporation de l'eau.

2·3. Extraction de la Caféine:

La méthode d'extraction utilisée au cours de ce travail dérive de celle employée en Travaux

Pratiques (TP) de Chimie Organique du second cycle, à la Faculté des Sciences et Techniques

de IUniversité d'Abidjan.

- Peser 100 g de grains de café vert, puis le moudre à sec et finement au mixer Waring

Blendor;

- Faire bouillir ces 100 g de café moulu dans 500 ml d'eau distillée pendant 10 à 15

minutes;

- Laisser refroidir jusqu'à température ambiante;

- Ajouter 15 g de carbonate ou de nitrate de plomb, puis porter à nouveau à ébullition

pendant 5 minutes;

- Après refroidissement, centrifuger le mélange, pour éliminer tous les sels de plomb;

- Rediluer le culot dans de l'eau tiède, puis centrifuger à nouveau;

- Rassembler les mélanges ainsi obtenus et laisser décanter: les sels de plomb se déposent.

Filtrer.

- Verser doucement la solution dans une ampoule à décanter;

- Extraire la caféine 3 fois par portion de 250 ml de solution dans l'ampoule à extraction, à

l'aide de 60 ml de chlorofonne. Agiter légèrement pendant 1 minute, puis laisser reposer pour

séparer les deux couches (a);

138

- Recueillir lentement la couche inférieure dans un erlenmeyer, puis rassembler toutes les

phases organiques, y ajouter du MgS04 pour sécher la solution de chloroforme (b);

- Filtrer sur Bûchner en rinçant avec un peu de chloroforme;

- Evaporer la solution de chloroforme au rotavapor jusqu'à un volume d'environ 5 ml.

Transférer cette solution encore chaude dans un bécher de 50 ml, puis ajouter rapidement de

l'éther de pétrole froid: la caféine précipite aussitôt. Placer le mélange caféine-éther au

congélateur pendant environ 10 minutes;

- Filtrer sous vide (trompe à eau) sur verre fritté en rinçant avec un peu d'éther de pétrole

froid;

- Sécher la caféine brute ainsi obtenue au dessiccateur, à 30°C pendant plusieurs heures,

avant analyses.

Remarques:

1. Pour améliorer la pureté de la caféine ainsi extraite, on peut faire une recristallisation

dans le méthanol. Les cristaux en forme de paillettes très fines que l'on obtient, ont un point de

fusion de 237-238°C.

2. Les rendements de l'extraction varient selon la variété de café utilisé:

- Arabusta: 0,8 à 1,2 %

- Arabica: 1 à 1,5 %

- Robusta: 2 à 2,7 %.

(a). Il faut éviter d'agiter trop vigoureusement le mélange car il pourrait se former une

émulsion très stable due à la forte tension superficielle de certains composés présents dans ce

mélange.

(b). Il peut se former une émulsion malgré toutes les précautions. Dans ce cas, il est

nécessaire d'ajouter du sulfate de magésium jusqu'à la disparition complète de cette émulsion.

2·4. Extraction des Sucres de Jus de Fruits:

Les jus de fruits naturels ou commerciaux utilisés au cours de ce travail sont d'abord filtrés

ou centrifugés pour éliminer la pulpe ou tout autre dépôt. Puis on fait un traitement au charbon

végétal pendant 20 à 30 minutes en vue d'obtenir un jus presque incolore. Ensuite on élimine

139

l'eau au maximum par évaporation au rotavapor dont le bain thennostaté est chauffé à une

température inférieure ou égale à 60°C. On obtient alors soit des cristaux de sucres, soit un

résidu sucré que l'on sèche dans un dessiccateur, en présence de P205, sous vide dynamique

poussé, pour disposer d'un composé pratiquement anhydre. Le sucre ainsi obtenu peut être

utilisé tel quel dans les opérations de combustion ou de nitration. Mais les jus d'oranges, de

pamplemousses et d'ananas contenant du fructose, du glucose et du saccharose, on peut aussi

transformer l'ensemble en glucose par inversion avant toute utilisation.

2·5. Nitration des Jus Sucrés:

La nitration des jus de fruits a été faite selon une méthode utilisée par Bricout et Koziet

(1985) et dérivée de celle décrite par Dunbar et al. (1983).

al. Préparation du mélanee nitrant: A 60 ml d'acide nitrique fumant (à 100%),

refroidis par un bain de glace salée, et agités magnétiquement, on ajoute lentement - car la

réaction est très exothennique - un mélange de 30 ml d'acide acétique glacial et de 30 ml

d'anhydride acétique. On laisse ensuite reposer ce mélange nitrant ainsi obtenu pendant 1 heure

environ, dans un bain glacé, avant son utilisation.

b/. Nitration des jus de fruits: Le résidu solide correspondant à 30 ml de jus sucré ­

ou 5 g de sucre industriel - est placé dans un tricol de 250 ml refroidi par de la glace salée. On

ajoute goutte à goutte les 120 ml de mélange nitrant, en maintenant une agitation magnétique

constante. On laisse ensuite la réaction se poursuivre durant 4 heures à environ 10°C. A la fm

de la nitration, le mélange est versé lentement dans 500 ml d'eau glacée, sous agitation

magnétique. Il se forme alors un précipité blanc pâteux que l'on rince plusieurs fois à l'eau

glacée jusqu'à neutralisation. Le nitrate obtenu est conservé au congélateur, puis séché pendant

plusieurs heures sous vide dynamique poussé, en présence de P205, avant sa combustion.

cf. Combustion des Nitrates: Environ 20 mg de nitrate de sucre mélangés à 150 mg

d'oxyde de cobalt, dans un four en quartz, sont brûlés complètement à l'aide d'un chalumeau.

Les produits de la combustion sont piégés à l'azote liquide dans un serpentin. L'oxygène en

excès est éliminé sous vide, tandis que le C02 résultant de la combustion est recueilli dans une

ampoule plongée dans un Dewar contenant de l'azote liquide. Enfm, l'eau de combustion est à

son tour piégée dans 4 ampoules baignant dans N2liquide, pour mesures D/H. Cette opération

140

est répétée trois fois pour chaque échantillon étudié. Le résultat D/H total de chaque nitrate est

donc la moyenne portant sur deux ou plusieurs des douze mesures.

2-6. Distillation azéotropique des jus sucrés:

Pour obtenir l'eau d'origine d'un jus de fruits donné, on l'extrait par distillation

azéotropique. La verrerie utilisée comporte:

- un montage Sohxlet muni d'un réfrigérant lisse;

- un piège avec un robinet Norma 2,5 de 17 ml;

- et des tubes de garde rôdés contenant un desséchant (CaCI2).

On utilise du toluène anhydre conservé sur tamis moléculaire comme réactif d'entraînement.

A partir de 15 ml de jus, l'extraction prend fin au bout de 50 minutes environ, quand le sucre

du jus utilisé est caramélisé. On pèse la quantité d'eau extraite et le piège pour calculer le

rendement d'extraction: la perte d'eau doit être inférieure à 0,2 %. Sur cette eau ainsi

récupérée, on pourra faire des mesures de D/H et B180 à l'aide des Spectromètres SIRA-9 et

DELT A-E respectivement, et ainsi accéder aux paramètres isotopiques initiaux i.e. avant

fermentation.

2-7. Fermentation des Solutions Sucrées:

Chaque échantillon de jus naturel ou commercial est fermenté sous la forme de deux, trois

ou/et quatre fractions:

FRACTION B: un volume V de jus de fruits est fermenté sans aucun traitement Gus

brut), autre que l'élimination de la pulpe;

FRACTION C: on évapore au maximum l'eau initiale du jus au rotavapor dont le bain

thermostaté est chauffé à une température inférieure ou égale à 60°C, puis on reconstitue le jus

de fruits à l'aide de l'eau de robinet de NANTES;

FRACTION E: connaissant les concentrations des différents échantillons de jus naturels

et commerciaux, à un volume V contenant X grammes de sucres naturels, nous avons ajouté

X grammes de sucre de canne; dans tous les jus commerciaux reconstitués, nous avons ajouté

la même masse (20 grammes) de sucre de canne;

141

FRACTION F: à partir de V ml de jus de fruits, nous avons concentré à V/2 ml au

rotavapor, puis ajouté V/2 ml d'eau de robinet de NANTES (NTW) dont le rapport

isotopique D/H est connu.

A toutes ces fractions de solutions sucrées dont les volumes vont de 400 ml à 500 ml, nous

avons ajouté 5 g de levure fraîche de boulangerie appartenant à l'espèce Saccharomyces

cerevisiae . Ces jus sont fermentés dans des erlenmeyers de IL surmontés d'un

compte-bulles et placés dans un bain thermostaté dont la température est fixée à 28°C. On

maintient une agitation continue pendant toute la durée de la fermentation. Au bout de 5 à 7

jours, la transformation des sucres en éthanol est totale, c'est à dire que la concentration des

sucres résiduels, dosés par HPLC, est inférieure à 0,5 g/l.

2-8. Distillation des Milieux Fermentés:

Après détennination du degré alcoolique par oxydation chromique, un volume précis du

milieu fermenté est distillé pour en extraire l'éthanol. Pour ce faire, on utilise une colonne

Cadiot à bande tournante en téflon et un ballon à distiller chauffé à l'aide d'une enveloppe

chauffante. On recueille tout le liquide qui bout entre 78,0 et 78,2°C. Cette extraction peut

durer de trois à cinq heures selon le degré alcoolique du mélange. L'éthanol ainsi obtenu est

pesé puis titré par la méthode de Karl-Fischer pour connaître précisément la teneur en eau.

3. Techniques Analytiques utilisées:

3-1. Dosages des Sucres et de la Caféine par HPLC:

al. DQsa~e des Sucres de .Jus de Fruits: Les jus de fruits à doser sont d'abord

centrifugés puis filtrés afin d'éliminer la pulpe ou tout autre élément qui pourrait encrasser la

(pré)colonne. On prélève ensuite 4 ml de jus que l'on pèse exactement. Enfin ce volume de jus

est dilué dans de l'eau distillée dans les proportions 1/5.

La phase mobile est constituée d'un mélange de trois solvants: acétone: 55%, acétate

d'éthyle: 30% et eau distillée: 15%. Ce mélange est filtré puis dégazé dans une cuve à ultra

sons pendant environ 1 heure. On évitera tout échauffement du bain de la cuve qui pourrait

entraîner une modification des proportions des constituants du mélange par évaporation.

142

L'appareillage comprend:

-une pompe WATERS Model 510 dont le débit est fixé à 1,10 ml/mn et la pression à

3000 psi au cours de ces dosages;

- et un détecteur qui est un Réfractomètre Différentiel de type WATERS 410 dont la

température interne est fixée à 32°C et la sensibilité à 4, la performance du détecteur étant

maximale dans ces conditions. Le détecteur peut être couplé à un intégrateur à imprimante de

type SP 4290, de sorte que moyennant une programmation, on dispose des concentrations

des échantillons étudiés, à la sortie du chromatogramme. Dans ce cas - comme dans celui d'un

traitement manuel des concentrations - il est nécessaire d'utiliser un étalon interne dans les

solutions à doser.

Dans tous les dosages de jus de fruits faits au cours de ce travail, nous avons utilisé le

myo-inositol comme étalon interne, du fait de sa grande solubilité dans l'eau, mais aussi à

cause de l'absence d'interactions indésirables avec les constituants des échantillons étudiés.

Les quantités utilisées sont de 300 à 550 mg, ajoutées directement in situ.

Les injections sont faites à l'aide d'une seringue, à raison de 20 JlI par injection, chaque

échantillon étant dosé au moins deux fois. La colonne et la précolonne utilisées sont de type

Lichrosorb NH2(S Jlm).

b/. Dosa2e de la caféine: Les échantillons de caféine sont d'abord mis en solution

pendant au moins 48 heures dans un mélange v/v de deux solvants: le chloroforme et le

méthanol. Puis on ajoute 30 à 40 mg de théobromine - pesée avec précision - directement in

situ, comme étalon interne.

La phase mobile est constituée par un mélange v/v d'une solution d'acétate de sodium à 0,4

% et de méthanol. L'appareillage comporte:

- une pompe Merck de type L-6200 munie d'un système d'injecteur Rhéodyne avec une

boucle d'injection de 20 Jll;- un détecteur UV Merck de type L-4000 que l'on peut coupler à l'intégrateur, ce qui

permet d'accéder aux concentrations des différents constituants, et par suite à la pureté des

échantillons.

143

La colonne et la précolonne sont de type Lichrospher 100 RP-18 (S !lm). Le débit et

la pression de la pompe sont régulés automatiquement par l'appareil lui-même au cours des

dosages.

3-2. Dosage des concentrés de jus de fruits par réfractométrie :

Après avoir nettoyé le prisme à l'eau distillée, puis seché, on applique l'échantillon à

mesurer (eau, jus ou concentré de jus de fruits) sur le prisme à l'aide d'une tige de verre. Au

bout de 2 minutes environ, la température de l'ensemble prisme-échantillon devient stable. On

lit alors directement la concentration sur l'échelle des degrés Brix. Enfin on prend la

température ambiante pour obtenir le degré Brix corrigé à partir des tables de corrections. Le

matériel utilisé se réduit à un réfractomètre gradué à l'échelle Brix et calibré à 20°C.

3-3. Détermination du degré alcoolique par oxydation chromique:

al. Entraînement de l'éthanol à la yapeur: L'appareillage utilisé se compose:

- d'une chaudière (ballon de 2 litres à col rodé muni d'un robinet) contenant de l'eau

distillée;

- d'un barboteur;

- du mélange à étudier (20 ml de milieu fennenté + 60 ml d'eau distillée);

-d'une colonne rectificatrice;

- d'un réfrigérant;

- et d'un réceptacle du distillat.

Les 20 ml du mélange hydro-alcoolique dilués dans 60 ml d'eau distillée sont placés dans

un ballon de IL. La vapeur de la chaudière barbotte dans ce ballon contenant le mélange,

l'échauffe et entraîne l'alcool qui, après condensation, se retrouve dans le réceptacle (fiole

jaugée de 200 ml). On ajuste à 200 ml avec de l'eau distillée. Le distillat réel du mélange est

donc dilué 10 fois.

b/. Dosa2e de l'éthanol par oxydation chromique : Il y a d'abord oxydation de

l'éthanol en acide acétique par le bichromate de potassium, selon la réaction:

2 K2Cr20, + 8 H2S04 + 3 CH3CH20H ---> 3 CH3COOH + 2

Cr2(S04)3 + 2 K2S04 + 11 H20.

144

Puis on dose l'excès de bichromate par le sel de Mohr:

En pratique, on dose d'abord une solution étalon contenant 10 cc de H2S04 semi-normal +

10 cc d'eau distillée + 10 cc de K2Cr2Ü7.

Soit Vécho le volume de solution de sel de Mohr ayant servi à ce dosage. Pour les solutions

hydro-alcooliques à étudier, on part de: 20 cc de K2Cr207 + 20 cc de H2S04 + 10 cc de

mélange hydroalcoolique. Soit Vréf. le volume de solution titrante nécessaire pour le virage de

10 ml de la solution d'alcool oxydé. Le titre alcoolique volumique est alors donné par la

relation:

tQ =XF. (2 _ VéCh.] (5)V réf.

où XF est le facteur de dilution, soit ici XF =10.

3-4. Détermination du taux alcoolique des distillats par la méthode de

KARL-FISCHER:

Le procédé de Karl-Fischer permet de déterminer avec précision de faibles teneurs en eau

dans les solvants organiques. Le matériel utilisé comprend:

- un titrateur Karl-Fischer (balance et imprimante associées);

- une seringue Hamilton de 0,5 ml;

- une solution Karl-Fischer (solvant);

. - une solution titrante Karl-Fischer;

- 1 kg de tamis moléculaire 3 A;

- un ruban thermique;

- et un septum.

145

L'échantillon hydro-alcoolique est précisement pesé (200 mg environ) à l'aide d'une

balance analytique, puis introduit dans la cellule contenant environ 30 ml d'une solution

méthanolique de dioxyde de soufre prétitrée. Le dosage de l'échantillon est alors effectué à

l'aide du titrateur automatique, contrôlé par un micro-processeur. La quantité d'eau résiduelle

de l'échantillon considéré, exprimée en %, est affichée puis imprimée.

4. Détermination des Paramètres Isotopiques:

4-1. Mesures des Rapports Isotopiques DIU des Eaux:

al. Cas des eaux naturelles. initiales et finales :

La détermination des rapports isotopiques en abondance naturelle des divers échantillons

d'eau a été effectuée sur le Spectromètre de Masse VG Instruments SIRA-9 équipé d'un

ordinateur, ce qui permet une programmation des échantillons à analyser. On injecte l'eau à

travers une membrane en élastomère dans une enceinte chauffée soumise à un vide primaire de

10-2 à 10-3 mbar. La réduction de l'eau en hydrogène se fait dans cette enceinte par passage de

la vapeur d'eau sur des copeaux d'Uranium maintenus à 600°C, selon l'équation:

Les molécules H2 et HD formées sont introduites dans la source où elles sont ionisées pour

fournir des ions de masse 2 et de masse 3 :

U2 -----> U2 + + e­

UD -----> UD+ + e-

(masse 2)

(masse 3)

Ces ions sont ensuite séparés en fonction de leur rapport masse sur charge, dans

l'analyseur. Les courants ioniques produits sont alors détectés de façon sélective, puis

amplifiés avant leur admission dans le calculateur.

146

On effectue la même opération sur une eau de référence de travail au Laboratoire

judicieusement choisie et dont le Rapport Isotopique DIH est connu. Cette eau de référence est

injectée au début de la série d'injections, puis tous les deux ou trois échantillons à étudier, et à

la fm des mesures programmées.

Toutes ces injections sont faites à raison de 3 III par injection, et répétées jusqu'à

l'obtention de deux valeurs consécutives dont l'écart est inférieur à 0,4 ppm. L'injection d'un

même échantillon plusieurs fois permet d'éliminer l'effet mémoire dû à la réduction de tous les

échantillons sur le même uranium.

Les résultats des mesures sont exprimés en ppm, puis en %0 par rapport au SMOW, selon

l'équation:

((D/H)éch. J

ôD(o/oo) = (D/H)smow - 1 • 1000

avec une précision de ±0,2 0/00.

(3)

b/. Cas des eaux de combustion: La teneur globale en deutérium de la vapeur d'eau

résultant de la combustion des nitrates (ou des bases puriques) est déterminée au spectromètre

SIRA-9. Comme dans le cas précédent, on injecte d'abord à la seringue une eau de référence

de travail choisie en fonction du rapport DIH attendu de l'échantillon analysé. L'ampoule

contenant cette eau est placée dans un tube cylindrique chauffant en vue de vaporiser le

contenu. C'est seulement lorsque la valeur de la référence est stable que la vapeur d'eau

enfermée dans l'ampoule est admise dans le système de réduction du spectromètre. A la fin des

douze mesures (il y a quatre ampoules par combustion et trois combustions par échantillon),

on injecte à nouveau la référence. Le résultat DIH final de l'échantillon analysé est la moyenne

sur plusieurs mesures dont l'écart-type doit être inférieur à 0,4.

4-2. Mesures des Rapports Isotopiques 180/160 des eaux:

al. Préparation des échantillons d'eau: Cette préparation utilise une méthode

décrite par Epstein et Mayeda (1953).

On prélève à l'aide d'une pipette automatique, 3 ml d'eau (naturelle, initiale ou de fin de

147

distillation) dans une ampoule que l'on fixe sur une rampe porte-échantillons. Chaque rampe

porte 9 échantillons d'eau à étudier et un échantillon d'eau de robinet de NANTES qui sert de

référence de travail au laboratoire. Les échantillons sont refroidis à -70°C dans un bain

éthanol-azote liquide puis dégazés. On répète l'opération 3 à 4 fois pour éliminer les gaz

dissous. On admet ensuite 0,5 atm de CÛ2 dans l'ensemble rampe-ampoules où règne un vide

d'environ 0,5 mbar. Enfin les échantillons d'eau surmontés d'une atmosphère de C02 sont

placés dans un bain thermostaté à 25°C pendant 18 à 24 heures. TI s'établit alors l'équilibre

isotopique suivant:

+ C160 180

Le C02 ainsi enrichi par échange isotopique avec l'eau (naturelle ou de jus de fruits), est

séché par passage dans un tube en U refroidi à -70°C, puis récupéré dans une ampoule par

piégeage à l'azote liquide.

b/. Mesures des teneurs isotopiques ôl8.o des eaux: Les rapports isotopiques

180/160 des eaux naturelles, initiales (obtenues par distillation azéotropique) ou de fm de

distillation sont déterminés à l'aide d'un Spectromètre de Masse FINNIGAN de type

DELT A·E comportant un double système d'introduction des gaz, ce qui permet d'analyser

alternativement le gaz à étudier et le gaz de référence. Le C02 introduit dans la source entraîne

la formation d'ions de masse 44 (12C 160 2), 45 (13C 160 170 ou 13C 170 160) et 46

(12C180 160).

La comparaison du courant ionique de masse 46 à ceux de masses 44 et 45 conduit au

calcul de la teneur en oxygène-18 de l'échantillon. Compte tenu des différences d'abondances

moyennes et de teneurs en 13C et 170 entre l'échantillon à étudier et le gaz de référence, il

est nécessaire d'appliquer diverses corrections (Craig, 1957; Gonfiantini, 1974).

Les résultats ainsi obtenus sont exprimés en 0/00 • par rapport au SMOW • avec une

précision en routine de ± 0,2 0/00, selon la relation:

148

(5)

4·3. Mesures des Rapports Isotopiques 13C/12C des Ethanols et des Bases

Puriques:

On prélève à l'aide d'une pipette automatique (ou d'une spatule) 5 mg d'éthanol (ou de base

purique) dans des capsules en étain, que l'on introduit dans le porte-échantillons du

micro-analyseur couplé au Spectromètre DELTA·E. Cet analyseur élémentaire autorise une

introduction automatique des capsules dans la chambre à combustion. Celle-ci se fait en

présence d'oxygène pur, dans le réacteur de combustion à 1050°C, de façon complète et

instantanée. Les produits de la réaction de combustion sont entraînés par un flux constant

d'hélium, à travers un catalyseur constitué par de l'oxyde de chrome. Celui-ci a la propriété:

- de réduire la formation des oxydes d'azote;

- de ne pas absorber l'azote formé;

- et de ne pas altérer le système chromatographique.

Le cuivre métallique placé dans le second réacteur et chauffé à 650°C, permet de réduire les

oxydes d'azote en azote élémentaire et de piéger l'excès d'oxygène. La vapeur d'eau est

ensuite piégée par l'anhydrone, tandis que le C02 est transféré dans la chambre d'ionisation.

Les ions de masse 44, 45 et 46 sont collectés sélectivement et dirigés vers le spectromètre. Les

résultats obtenus, moyennes de deux mesures consécutives de chaque échantillon, sont

exprimés en 0/00 par rapport au PDB, avec une précision de ± 0,2 0/00.

4·4. Mesures des Rapports Isotopiques Spécifiques (D/H)i des Ethanols et

de la Caféine:

Les spectres RMN ont été enregistrés au moyen d'un Spectromètre BRUKER de type

AM 400, fonctionnant à 61,43 MHz pour le deutérium. Les échantillons d'éthanols (ou de

caféines en solution dans le chloroforme) sont placés dans des tubes de 10 mm de diamètre

contenant en outre 1,3 ml de tétraméthylurée (TMU) et 25~1 d'hexafluorure de benzène

utilisés respectivement comme référence interne et comme lock.

149

Les conditions techniques sont les suivantes:

-fréquence =61,43 MHz;

-largeur du spectre =1200 Hz;

-découplage: BB;

-temps d'acquisition =6,83 s;

- et nombre de passages =200.

Chaque échantillon est mesuré 8 fois, de sorte que les valeurs définitives sont les moyennes

sur les huit spectres. Les rapports isotopiques spécifiques (D/Hh fournis par le calculateur

ASPECT 3000 sont calculés sur la base des intensités (dans le cas des éthanols où les

rapports des largeurs de raies à mi-hauteur sont suffisamment constants) des sites i non

échangeables de la molécule d'éthanol, ou sur la base des surfaces des raies (cas des caféines).

La précision des mesures est de ± 0,2 ppm.

4-S. Mesures des Rapports Isotopiques lSN/14N des Bases Puriques:

On part de 8 mg environ d'échantillon à analyser, précisement pesé au moyen d'une

balance analytique, que l'on met dans une capsule en étain (voir Partie expérimentale § 4-3).

Des collecteurs spécifiques enrégistrent les ions de masse 28 et 29 en vue de l'analyse

isotopique.

Les mesures des concentrations isotopiques o15N des bases puriques ont été effectuées au

moyen du spectromètre de masse DELTA-E. Les résultats défmitifs sont exprimés en %0, par

la relation:

(6)

avec une précision de ± 0,2 %0.

•• •

150

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*

* *

Liste des TABLEAUX

1-1: Caractéristiques de l'activité photosynthétique d'après

Moyse (1976), Zélitch (1971) et Black (1973).

2-1: Moyennes annuelles des valeurs 8D et 818 0 des eaux

naturelles.

2-2: Résultats des régressions linéaires entre les paramètres 8D

et 8180 des eaux de puits.

2-3: Régressions linéaires entre les paramètres 8D des eaux de

puits 1984 et les facteurs géographiques.

2-4: Régressions linéaires entre les valeurs 818 0 des eaux de

puits 1984 et les paramètres géographiques.

2-5: Effet de continentalité sur les teneurs isotopiques 8D et

8180 des eaux de puits.

3-1: Paramètres isotopiques spécifiques (D/H)} des éthanols

issus de plantes C3, C4 et CAM.

3-2: Rapports isotopiques (D/Hh du site méthylénique de la

molécule d'éthanol et (D/H)w q des eaux de fermentation des

fruits C3, C4 et CAM.

3-3: Composition en isotopes stables C-13 des éthanols de

Citrus (C3), de canne (C4) et d'ananas (CAM).

3-4: Concentration en deutérium et en oxygène-18 des eaux de

jus de canne et d'ananas.

3-5: Teneurs isotopiques 8D et 8180 des jus de Citrus.

3-6: Teneurs isotopiques o13C des éthanols de Citrus, de canne

et d'ananas.

4-1: Paramètres isotopiques et nature des réactifs.

4-2: Conditions de préparation des milieux de fermentation.

4-3: Distribution isotopique des produits de la fermentation

(eau, éthanol, biomasse).

4-4: Influence de la concentration en glucose du milieu

fermenté sur les rapports isotopiques (D/H)iq des éthanols et

(D/H)w q de l'eau finale.

4-5: Effet de la concentration en deutérium du milieu fermenté

sur les rapports isotopiques (D/H)wq de l'eau finale, et (D/H)iq

et (D/H)RMN de l'éthanol.

4-6: Calcul de (D/H)G NE, (D/H)w q et des contributions du

glucose et de l'eau aux teneurs isotopiques des sites 1 et II de

la molécule d'éthanol.

6-1: Composition en deutérium et en carbone-13 de caféines

naturelles extraites de café.

6-2: Teneur en azote-15 des trois variétés de café.

6-3: Paramètres isotopiques oD, o13C et o15N des bases

puriques de commerce.

6·4: Paramètres isotopiques spécifiques (D/H)i des sites

monodeutériés de la molécule de caféine.

Liste des FIGURES

1-1: Coupe transversale dans une feuille de plante C3.

1-2: Coupe transversale dans une feuille de plante C4.

1-3: Cycle de Calvin, d'après Somerville et Somerville (1984).

1-4: Cycle de Match et Slack, d'après Lehninger (1985).

1-5: Schéma du mécanisme CAM, d'après Queiroz (1976).

2-1: Evolution des pentes des droites eD = f(e 180) des de puits

de 1984 à 1988.

2-2: Variations des paramètres eD des eaux naturelles en

fonction de la latitude (Lat.).

2-3: Influence de l'altitude (Ait.) sur les valeurs eD des eaux

naturelles (1984).

2-4: Influence de la distance à l'océan sur les teneurs e180 des

eaux naturelles (1984).

2-S: Effet de la latitude sur la concentration en 0-18 des eaux

naturelles (1984).

2-6: Relation entre l'altitude et la composition en 0·18 des eaux

naturelles (1984).

2-7: Evolution des paramètres e180 des eaux naturelles (1984)

en fonction de la distance (Dist.) à l'océan.

2-8: Influence de l'humidité relative de l'air sur la composition

en 0-18 des eaux de la nappe phréatique.

2-9: Corrélation entre la composition en deutérium ùD des eaux

de puits et l'humidité relative de l'air (en %).

2-10: Effet de l'insolation 1 (en heures) sur la teneur ùD des

eaux de la nappe phréatique.

2-11: Influence de l'insolation sur la composition en

oxygène-18 des eaux de puits.

2-12: Evolution de la composition en deutérium des eaux de

puits en fonction des précipitations (P en mm).

3-1: Répartition des espèces végétales de type C3, C4 et CAM

dans le plan (ùDRMN, ùD}).

3-2: Principales étapes de la fixation du C02 au cours de la

photosynthèse des plantes C3.

3-3: Principales étapes de la fixation du dioxyde de carbone

atmosphérique par les plantes C4.

3-4: Répartition des plantes C3, C4 et CAM dans le plan (ÙDl,

ÙI3C) des paramètres isotopiques de leurs éthanols.

3-5: Répartition des plantes C3, C4 et CAM dans le plan (ùD,

Ù180) des eaux de fin de distillation.

3-6: Effet de la température sur les teneurs isotopiques

spécifiques BD 1 des éthanols de jus d'ananas (CAM).

3-7: Influence de la température sur la composition en

oxygène-18 des eaux de fin de distillation de jus de canne (C4).

3-8: Représentation des paramètres BD 1 Citrus en fonction des

précipitations.

3-9: Influence des précipitations sur les paramètres isotopiques

B180 des eaux de fin de distillation des jus de canne.

3-10: Effet de l'humidité sur les paramètres BDwq des eaux de

fin de distillation des jus de canne.

3·11: Evolution des paramètres isotopiques spécifiques BDI de

l'éthanol de jus d'ananas en fonction de l'humidité.

3-12: Paramètres isotopiques spécifiques BD 1 d'éthanol de jus

de canne en fonction de l'insolation.

3-13: Variations de la teneur isotopique spécifique BD 2 de

l'éthanol de canne en fonction de l'insolation.

3·14: Effet de l'insolation sur les valeurs BDwq des eaux de jus

d'ananas (CAM).

4-1: Evolution des paramètres B180 des eaux finales en

fonction de la concentration en 0-18 de l'eau initiale.

4-2: Variations des rapports isotopiques (D/H)iq de l'éthanol et

(D/H)w q de l'eau finale en fonction de la composition en

deutérium de l'eau de départ.

4-3: Evolution de (D/H)i q et (D/H)w q en fonction de la

concentration en glucose Co du milieu fermenté.

4-4: Variations des paramètres ô13 C de l'éthanol et de la

biomasse en fonction de la composition en carbone-13 des

glucides de départ.

4-5: Corrélation entre les paramètres ô180 de l'éthanol et la

concentration en 0-18 des glucides de départ.

4-6: Evolution des rapports isotopiques (D/H)iq de l'éthanol et

(D/H)B q de la biomasse en fonction de la teneur en deutérium

des glucides initiaux.

5-1: Représentation des éthanols C3, C4 et de synthèse dans le

plan formé par ôD moyen et ô13C.

5-2: Représentation des éthanols de diverses origines

botaniques dans le plan (ôDl, ÔI3C).

5-3: Corrélation entre les paramètres isotopiques spécifiques

ÔD2 (relatifs à l'isotopomère CH2DCH20H de l'éthanol) et

ÔDwS de l'eau initiale.

5-4: Répartition et hiérarchisation des sucres à partir des onze

groupes d'éthanols provenant de diverses origines botaniques.

5-5 (A et B): Analyse en composantes principales des différents

d'éthanols caractérisés dans un espace à 4 dimensions (ôD 1,

5-6: Exemple d'analyse discriminante portant sur des

échantillons de fruits et de plantes sucrières. (A): cas des trois

groupes formés par 26 échantillons de jus de pommes, 38

échantillons de jus de citrus et 48 échantillons de jus d'ananas,

et des quatre teneurs isotopiques (D/H)}, (D/Hh, (D/H)w q et

813C.

5-7: (B): cas des trois groupes formés par 38 échantillons de

Citrus et des deux principales plantes sucrières, la betterave

(79 échantillons) et la canne (68 échantillons).

6-1: Répartition des caféines naturelles et de synthèse sur la

base de leurs compositions respectives en C-13.

6-2: Répartition des caféines naturelles et d'origine

commerciale en fonction de leurs teneurs respectives en

azote-IS.

6-3: Molécule de caféine (1,3,7-triméthylxanthine).

6-4: Origine des atomes de carbone et d'azote du noyau des

bases puriques.

6-5: Spectre RMN 2H de la molécule de caféine.

* * *