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DGAL/BSSV/CASDAR

Année et N° du projet : 2014

Titre du projet : Gestion durable des résistances génétiques à Ralstonia solanacearum chez l’aubergine (Solanum melongena)Acronyme : RESAUBER

RAPPORT FINAL

Organisme chef de file : CIRAD UMR PVBMT

Nom et organisme du chef de projet : DINTINGER Jacques, CIRAD.

A – Compte rendu technique synthétique

I – Le déroulement du projet- Action par action (intitulés correspondants aux actions du dossier déposé et accepté par le jury)

o rappel des objectifs attenduso méthodes de travail utiliséeso organisation mise en place par le chef de file et chaque partenaire: travail réalisé, moyens

humains, matériels et financiers mobiliséso étapes et calendriero résultats finaux obtenus

Action 1 : Typologie des situations épidémiologiques sur les sites partenaires

L’objectif était d’évaluer la variabilité de Ralstonia solanacearum entre les différents sites partenaires en terme (i) de composition des populations pathogènes présentes, (ii) de profils de virulence présents (pathoprofils). La répartition géographique des sites partenaires était d’autant plus intéressante qu’elle englobait la majorité de la diversité phylogénétique du pathogène : phylotype I, IIA, IIB et III d’Afrique (TECHNISEM) et de l’Océan Indien (CIRAD Réunion et ARMEFLHOR), phylotype I et IIB « émergent » en Guyane (CIRAD UR 106).Les méthodes employées s’appuyaient sur l’expérience acquise lors du projet INRA-CIRAD-Consortium de semenciers privés «Résistance des solanacées à graines à R. solanacearum » (2007-2010). Six pathoprofils (a à f) avaient alors été identifiés chez R. solanacearum ; les principaux profils de résistance identifiés (phénoprofils) avaient aussi permis de définir une gamme différentielle restreinte de 12 accessions de 3 espèces (tomate, aubergine, piment), appelée coreTEP2 (Lebeau, 2010).

Cette action s’est déclinée en 3 grandes tâches :

Tâche 1.1. : Production du matériel végétal (INRA-GAFL)

Le matériel végétal utilisé pour cette tâche était la « Core-TEP », une core collection de 30 acces-sions de tomate (« T »), aubergine (eggplant « E ») et piment (« P »), consistant en un échantillon de géniteurs de résistance à Ralstonia solanacearum, supposés représentatifs de la diversité géné-tique pour la résistance dans chacune des 3 espèces. S’y rajoutait un témoin sensible pour chaque


espèce. Les essais de cette core-TEP dans les différentes conditions environnementales se sont étalés de 2014 à 2016. Les semences nécessaires ont été produites en quantité suffisante sur toute cette période par le partenaire INRA-GAFL pour quelques accessions de la Core-TEP dont les stocks de semences étaient insuffisants et qui ont dû être ré-abondés sur cette période, cela par production en serre sur 4 plantes autofécondées par accession (Tableau 1). Les accessions dont le stock était suffisant n’ont pas été reconduites.

Tableau 1 : Bilan de la production de semences de la Core-TEP sur la période 2014 – 2016

genotype code species accessions summer

2014

spring-summer 2015

harvest autumn 2016

T1 tomato CRA 66 24,6gT2 tomato Okitsu sozai n°1

additional tomato BF-Okitsu 24,7gT3 tomato NC 72 TR 4-4T4 tomato IRAT L3T5 tomato Hawaii 7996T6 tomato TML 46 (oblong) 79gT7 tomato CLN 1463 80,3gT8 tomato R3034 51,5gT9 tomato L 285 L. escul. var. cerasiforme 32gT10 tomato Susceptible control: Floradel

E1 eggplant MM 853, Dingras multiple purple (Japan)E2 eggplant MM 643, SM6 (India). E3 eggplant MM 152, Ceylan SM 164 (Sri Lanka)E4 eggplant MM 1811, EG203 (Surya) Indian via AVRDCE5 eggplant AG91-01 (MM 931) RFM 07-04 E6 eggplant AG91-25 (MM 960) SD 20 64,4gE7 eggplant S. linnaeanum MM 195,TunisiaE8 eggplant MM 738 Western Europe (parent of mapping pop.)E9 eggplant MM 1800, S56B, TerongE10 eggplant Susceptible control: Florida Market MM 136

P1 pepper Narval, PM 1443P2 pepper PI 322719, PM 687P3 pepper Cristal Blanco, PM 1022 = Pen 79 (C. baccatum)P4 pepper CM 334, PM 702 P5 pepper 0209-4, BC3F5 (BC3F5[C. annuum x C. chinense ]), PM 1579P6 pepper CA8, PBC631A, PM 1580P7 pepper MC4, PBC66, PM 1581P8 pepper Perennial, PM 659P9 pepper PBC384, PM 1582P10 pepper Susceptible control: Yolo Wonder, PM 0031

La Core-TEP a été envoyée, intégralement ou partiellement, selon les besoins, aux partenaires du projet RESAUBER, ainsi qu’à d’autres équipes de recherche, au cours de la période 2014-2016 (Ta-bleau 2). Quelques autres accessions d’aubergine et de S. torvum, présentant aussi un intérêt du fait de leur résistance au flétrissement bactérien, sont listées en bas du Tableau 2.

/tt/file_convert/5e301314903fba7d2c514439/document.docx sur 41Tableau 2 : Accessions de la Core TEP envoyées aux partenaires de RESAUBER ainsi qu’à d’autres équipes de recherche sur la pé-riode 2014-2016 correspondant au projet RESAUBER

origin accession name and/ codeCIRAD, La Reunion, janvier 2015

Technisem Cameroun, mars 2015

Technisem Cameroun, juin 2015

VEGENOV (M. Bodin) août 2015

VEGENOV (M. Bodin)

septembre 2015

CIRAD Reunion, décembre 2015

Technisem Cameroun,

décembre 2015

M. Lewis Ivey, Louisiana State Univ., USA, Janvier 2015

L. da Ponte, Keygene, janvier 2015

B. Vinatzer, Virginia Tech, USA, Janvier 2015

Salim Lamini CSIR, Ghana, Janvier 2015

Boris Vinatzer, mars 2015

Dousheng Wu, Tuebingen Univ., Allemagne, Juillet 2015

INRA CRA 66 2g 1g 1gOkitsu sozai n°1 2g 1g 1g

INRA BF-Okitsu 101 (LS3844) (introduced from AVRDC, 2010) 2g 1g 1gINRA NC 72 TR 4-4 5g 2g 1g 1gINRA IRAT L3 5g 2g 1g 1gINRA Hawaii 7996 5g 2g 1g 1g

AVRDC TML 46 (oblong) 2g 1g 1gAVRDC CLN 1463 2g 1g 1gAVRDC R3034 5g 2g 1g 1gAVRDC L 285 L. escul. var. cerasiforme 2g 1g 1g

INRA Susceptible control: Floradel 2gAVRDC Susceptible control: L 390 8,7g 1g 1g

INRA MM 853, Dingras multiple purple (Japan) 5g 1g 1g 20 graines 2g 1g 1gINRA MM 643, SM6 (India). 5g 1g 1g 20 graines 2g 1gINRA MM 152, Ceylan SM 164 (Sri Lanka) 5g 1g 1g 4g 2g 1g

AVRDC MM 1811, EG 203 Surya 5g 1g 1g 50 graines 2g 4g 2g 1gINRA AG91-01 (MM 931) 1g 1g 2g 1gINRA AG91-25 (MM 960) 10g 2g 2g 1,5g 2g 5g 1gINRA S. linnaeanum MM 195 1g 1g 2g 1g 1gINRA S. melongena MM 738 5g 2g 2g 20 graines 50 graines 2g 1,5g 2g 1g 1g

AVRDC MM 1800, S. melongena S56B, Terong Bulat Hijau (Indonesia) 5g 1g 1g 50 graines 1,5g 2g 1gINRA Susceptible control: Florida Market MM 136 5g 1g 1g 1,5g 2g 1g

AVRDC Susceptible control: Black Beauty EG048

INRA Narval, PM 1443 (C. annuum , inbred cultivar, large fruited) 250 seeds 100 grainesINRA PI 322719, PM 687 (C. annuum , parent of mapping population) 250 seeds 100 graines

INRA Cristal Blanco, PM 1022 = Pen 79 (C. baccatum , parent of introgression library) 250 seeds 100 graines

INRA CM 334, PM 702 (C. annuum , parent of mapping population) 250 seeds 100 grainesAVRDC 0209-4, BC3F5 (BC3F5[C. annuum x C. chinense ]), PM 1579 10g 250 seeds 100 grainesAVRDC CA8, PBC631A (C. annuum ), PM 1580 250 seeds 100 grainesAVRDC MC4, PBC66 (C. annuum ), PM 1581 250 seeds 100 graines

INRA Perennial, PM 659 (C. annuum , parent of mapping population) 250 seeds 100 grainesAVRDC PBC384 (AVRDC, C. annuum ), PM 1582 250 seeds 100 graines

INRASusceptible control: Yolo Wonder, PM 0031 (C. annuum , parent of mapping population) 5g 250 seeds 100 graines

AVRDC Susceptible control: PBC1367 (C. annuum ) 250 seeds

MM 127, TurquieMM 134, S. aethiopicum Aculeatum group

LS 1934 (MM 1933)LS 2436 (MM 1799)

S. torvum MM 353 0,5g 0,5gS. torvum MM 1966 0,5g 0,5g

J. Scott Fla 8109

Envois 2015 à partenaires RESAUBER et sous contractant (VEGENOV) Envois 2015 à destinataires hors RESAUBER


Tâche 1.2. : Phénotypage multilocal des sources de résistance (core-TEP)

Il était convenu que chaque partenaire évalue les sources de résistance sur son site d’expérimentation, selon un dispositif statistique commun (blocs randomisés). Ce site devait avoir été géo-référencé par GPS. Les niveaux de résistance vis-à-vis de la souche dominante ont été évalués par suivi de l’évolution de l’incidence de la maladie sur chaque accession et détection des infections latentes en fin d’essai. L’objectif était d’évaluer le niveau de résistance des accessions dans chaque situation épidémiologique vis-à-vis de la souche dominante caractéristique du site d’essai, et ensuite éventuellement de faire une analyse multi-locale afin de repérer les sources de résistance généralistes.

Les sites d’essais :

- TECHNISEM, site de MFOU (Cameroun) : test réalisé d’octobre 2014 à janvier 2015 sur la station « Iroko ».

La parcelle est située sur la station expérimentale d’Iroko, dans la localité de Nkilzok en bordure de la ville de Mfou (37 km au Sud Est de Yaoundé). Le site est à 689 m d’altitude, aux coordonnées : 3.676° N, 11.646° E.

- ARMEFLHOR, site de Bassin Martin (Réunion) : test réalisé en juin-octobre 2015.

La parcelle est située sur la station expérimentale de Bassin Martin, à 307 m d’altitude, aux coordonnées 21.309°S, 55,506°E.

- CIRAD Guyane, site de Combi (Guyane française) : test réalisé en 2016La parcelle est située sur la station expérimentale de Pointe Combi, sur la commune de Sinamary, aux coordonnées : 5.333 °N, 52.954° W.

Les résultats obtenus pour les variables % de flétrissement maximal et % de plants colonisés sont présentés dans la figure 1. Il est important de noter que les mesures de colonisation n’ont pu être exploitées pour le site du Cameroun.


Figure 1. Incidence du flétrissement (gauche) et taux de colonisation (droite) observés sur aubergine (haut), piment (milieu), tomate (bas).


Sur aubergine, les niveaux de maladie les plus élevés ont été observés sur le site du Cameroun (Phylotype III-29). L’accession E4, et dans une moindre mesure E9, se distinguent par leur haut niveau de résistance sur les 3 sites. E2, E3 et E6, très résistants en Guyane (IIB-4NPB) et à la Réunion (I-31), sont attaqués significativement au Cameroun. A noter une incohérence pour l’aubergine sensible E8 en ce qui concerne le % de colonisation qui est < incidence du flétrissement, due probablement à des erreurs de notation et/ou saisie des données, donc à ne pas prendre en compte.Sur piment, aucune accession n’est résistante dans les 3 sites. Le contraste est saisissant entre le site de Guyane - où la plupart des accessions sont sensibles à part P7, P4 et P9 – et les deux autres sites où la plupart sont résistantes, ou tolérantes comme P1 et P4 à la Réunion.Sur tomate, aucune accession ne s’est révélée résistante sur les 3 sites. Le contraste est aussi très fort entre Guyane (toutes sensibles), Cameroun (T7 partiellement résistant, toutes les autres accessions étant sensibles à très sensibles) et la Réunion où toute la gamme de résistant à sensible est observée. L’accession Hawaï7996 (T5), seule source de résistance bien connue chez la tomate, apparaît ainsi très sensible au Cameroun et en Guyane, alors qu’à la Réunion elle apparaît comme résistante mais pas plus que T9, T7, T8, T6 et T4. A noter encore comme dans le cas de l’aubergine E8, que le témoin sensible T10 présente une valeur de % de plants colonisés aberrante proche de 0, donc à éliminer.

Tâche 1.3. : Caractérisation moléculaire des populations de Ralstonia solanacearum échantillonnées dans chaque site partenaire

Sur chaque site partenaire, il était prévu que les populations bactériennes naturellement présentes soient échantillonnées sur symptômes, au cours d’une culture de tomate sensible (hôte très peu sélectif). Les prélèvements ont été menés par chaque partenaire suivant un protocole d’échantillonnage commun ; les isolements et purifications bactériennes, la mise en collection, le génotypage des souches purifiées ont eu lieu chez le partenaire CIRAD, au Pôle de Protection des Plantes de St Pierre (La Réunion). Les méthodes ont été détaillées dans le rapport d’exécution de l’année 1 (2015).

Sur les 3 sites partenaires, seul le site de Pointe Combi (CIRAD Guyane) n’a pu être échantillonné, à cause de problèmes techniques entrainant l’échec des isolements bactériens. La Station Expérimentale de Pointe Combi (commune de Sinnamary) avait été échantillonnée en 2012 (Deberdt et al., 2014), et des souches de l’écotype « émergent » (Phylotype IIB/sequevar 4NPB) y avaient été détectées. Par la suite, la station expérimentale a été replantée en café, notamment la parcelle sur laquelle avaient été isolées les souches émergentes. Il a donc été décidé que l’essai CORETEP (Tâche 1.2.) serait inoculé par un mélange de souches isolées à Sinnamary.Les deux autres sites, au Cameroun et à la Réunion, ont mis en évidence des populations phylogénétiquement bien différenciées.

Le site TECHNISEM Cameroun (sur la base des 17 isolats typés) est infecté par un unique séquençotype du phylotype III, sequevar 29, egl-ST059, mutS-


ST047. Le phylotype III, d’origine exclusivement africaine, est à présent englobé dans l’espèce Ralstonia pseudosolanacearum (Safni et al., 2014).Cette lignée, qui a déjà été décrite au Cameroun, est spécifique de ce pays dans l’état actuel de nos connaissances. Le génome de la souche représentative de cette lignée, CMR15, a été séquencé en 2010 (Remenant et al., 2010).

Le site ARMEFLHOR Réunion (sur la base des 41 isolats typés) est infecté par le phylotype I (lui aussi englobé dans l’espèce R. pseudosolanacearum (Safni et al., 2014)), mais là on a identifié deux séquençotypes :

o 69.1% d’eST072, mST046 (Sequevar 14): déjà décrit en Inde uniquement,

o 30.9% d’eST043, mST022 (Sequevar 31): déjà décrit à la Réunion (notamment sur la parcelle « Le Vallon » au CIRAD St Pierre), mais aussi en Inde, Afrique du Sud, Côte d’Ivoire, et tout dernièrement au Benin (Sikirou et al., 2015). Le sequevar 31 est par ailleurs identifié dans la plupart des îles du Sud-Ouest de l’océan Indien : Île Maurice, Comores, Seychelles, Mayotte (N. Yahiaoui et al, 2016). Nous avons actuellement 3 génomes séquencés dans cette lignée : TD1301, RD1301, TF3108.

La cartographie précise des deux séquençotypes sur la parcelle est détaillée dans le rapport de l’année 1 (2015).


Action 2. Spécificité de la résistance chez l’aubergine AG91-25 (gène majeur ERs1) et recherche de facteurs de résistance complémentaires dans la diversité génétique de l’aubergine

Le contrôle de la résistance par ERs1 dans l’accession AG91-25 (E6) avait été testé initialement seulement vis-à-vis de souches du phylotype I (CMR134, PSS366, GMI1000, PSS4, To10) (Lebeau, 2010 ; Lebeau et al, 2013). Les objectifs de cette action étaient (i) de préciser l’efficacité et le spectre d’action de ce gène également vis-à-vis de souches appartenant aux phylotypes IIA, IIB et III, et (ii), d’identifier éventuellement d’autres gènes/QTLs de résistance présents chez AG91-25, mais aussi dans d’autres sources de résistance potentielles de l’aubergine.

Les tests de résistance menés à la Réunion sur une core-collection d’aubergines ont montré la présence de résistances à spectre large prometteuses, notamment chez certaines accessions d’origine indienne ou asiatique : Dingras multiple purple (E1), SM-6 (E2), Ceylan (E3), Surya (E4) et Terong Bulat Hijau (E9) (Lebeau et al., 2011; N'Guessan et al., 2012). Des tests préliminaires en conditions d’inoculation contrôlée des générations F1, F2 et backcross dérivant de ces lignées ont été réalisés, afin de savoir si l’on est en présence de résistances contrôlées par un ou 2 gènes/QTLs majeurs, ou plutôt de résistances polygéniques.

Des descendances d’haploïdes doublés à partir des générations F1 obtenues entre les accessions les plus intéressantes et le parent sensible MM738 (E8) ont été produites afin de rechercher et cartographier ces facteurs de résistance. Cette action faisait partie de la thèse de doctorat de Sylvia Salgon soutenue le 23 mai 2017, dont le 1er objectif était de disséquer les bases génétiques de la résistance à R. solanacearum chez l’aubergine AG91-25 (E6).

La dissection de la résistance chez AG91-25 vis-à-vis de la diversité génétique du pathogène a été réalisée à la Réunion et au Cameroun sur la population de RILs (E8 x E6). A la Réunion, plusieurs essais ont été réalisés sur cette population vis-à-vis d’une souche de phylotype I (To10), une souche de phylotype IIA (CFBP2957= RUN36), une souche de phylotype IIB (CMR34= RUN147), 2 souches de phylotype III (CFBP3059=RUN39, RUN3598). Chaque essai a été répété à 2 saisons différentes, sauf en ce qui concerne la souche TO10 pour laquelle un seul essai a été effectué à la Réunion, mais dont les résultats ont pu être combinés avec ceux obtenus précédemment par la société Vilmorin en Indonésie. Au Cameroun, 2 essais ont été effectués consécutivement vis-à-vis de la souche dominante RUN3598, séquévar 29 (phylotype III) détectée sur la station de Mfou et typée par le Cirad Réunion.

Les essais sur les générations issues des croisements entre les accessions résistantes les plus prometteuses et le parent sensible E8 ont permis de cibler E3, E4 et E9 comme les sources prioritaires de résistance à étudier pour trouver des gènes/QTL pouvant contrôler les souches virulentes contournant le gène majeur Ers1. Des descendances haplo-diploïdes ont pu être produites au cours du projet à partir des F1 (E8 x E4) et (E8 x E3), cela avec tous les avantages que représente ce type de population (lignées 100% fixées immédiatement) mais également les inconvénients (obtention parfois laborieuse de plants fertiles issus de culture d’anthères). Les essais de la core-collection d’aubergine ont montré que les sources de résistance E3 et E4 étaient les plus intéressantes pour contrôler les souches de R. solanacearum présentes à la Réunion et au Cameroun, respectivement. Par conséquent, la descendance HD (E8 x E3) a été testée uniquement à la Réunion,


tandis que HD (E8 x E4) a été testée à la fois à la Réunion et au Cameroun, chaque fois à 2 saisons différentes.

Les moyens techniques et humains qui ont été utilisés à la Réunion sont ceux dont dispose le CIRAD sur sa station de Ligne Paradis ainsi que ceux de l’Armefhlor sur sa station de Bassin Martin : chambres climatiques, tunnels et serres NS2, équipe technique formée à l’expérimentation. Au Cameroun, Technisem a, en début de projet et grâce à celui-ci, mis en place sur la station de M’Fou une structure permettant de mener à bien des tests de résistance sous serres de façon similaire à la Réunion. Il s’agit d’une structure de type tunnels compartimentables, avec la possibilité d’inoculer et de suivre près de 3000 plants, ainsi que d’un laboratoire permettant de faire des tests de détection de la bactérie (production de l’inoculum, étalement et culture de bactérie, étuves). Le partenaire INRA-GAFL avait en charge la production des semences de lignées d’haploïdes doublés qu’il a sous-traité à la société Vegenov pour ce qui est de la culture d’anthère et la production des plantules.

Déroulement des travaux et calendrier

Les travaux réalisés au cours du projet (période avril 2014–décembre 2016) ont été conformes au calendrier Resauber :

-Deux essais cartographie génétique de la population RIL (E8 x E6) versus la souche CFBP3059 de phylotype III réalisés à la Réunion au cours de 2 saisons différentes en 2014, conformément au calendrier.

-Deux essais cartographie génétique de la population RIL (E8 x E6) versus la souche CMR34 de phylotype IIB réalisés à la Réunion au cours de 2 saisons différentes en 2014-2015, conformément au calendrier.

-Un essai cartographie génétique de la population RIL (E8 x E6) versus la souche TO10 de phylotype I mené à la Réunion sur une seule saison en 2015 (mais analyse combinée avec les résultats obtenus en Indonésie), hors calendrier. -Deux essais cartographie génétique de la population RIL (E8 x E6) versus la souche RUN3598 de phylotype III menés au Cameroun par Technisem à 2 saisons différentes en 2014-2015, conformément au calendrier.

-Deux essais cartographie génétique de la population HD (E4 x E8) versus la souche RUN3598 de phylotype III menés au Cameroun par Technisem à 2 saisons différentes en 2016 ; à noter que la décision de tester cette descendance au Cameroun avait été prise fin 2015 à la lumière des 1er résultats de Technisem sur la coreTEP, qui montraient clairement l’intérêt de E4 comme source de résistance permettant de contrôler la souche prévalente sur la station de M’Fou. Les tests au Cameroun prévus au calendrier sur les générations ont alors été abandonnés et la décision prise, d’un commun accord entre les partenaires, de les remplacer par 2 essais cartographie génétique sur la population HD (E8 x E4).

-Deux essais cartographie génétique de la population HD (E4 x E8) versus la souche PSS4 de phylotype I menés à la Réunion à 2 saisons différentes en 2015-2016, hors calendrier.

-Deux essais cartographie génétique de la population HD (E8 x E3) menés en chambre climatique à la Réunion versus la souche de phylotype I PSS4 (stage M2 Edith Garot), hors calendrier.

-Un essai cartographie génétique de la population HD (E8 x E3) mené à la Réunion en 2016 sur une seule saison versus la souche de phylotype I PSS4, hors calendrier.


-La production par Végénov et l’INRA des semences HD (E8 x E4) (135 lignées) et HD (E8 x E3) (180 lignées) s’est faite en 2015-2016, conformément au calendrier. La production des semences HD (E8 x E9) a été démarrée au cours du projet mais ne sera achevée que mi-2017. Le détail de cette action de production du matériel génétique est présenté plus loin (voir tâche 2.3).


Tâche 2.1 : Cartographie génétique de la résistance à R. solanacearum dans la pop. RIL [E8 x E6]

Tableau 3. Caractéristiques des souches utilisées dans l’étude depuis le démarrage du pro-jet RESAUBERCMR Souche du Cameroun; RUN collection du Pole 3P-CIRAD, Saint Pierre, Réunion; CFBP Collection Française des bactéries Phytopathogènes, Angers, France.

Souches Autres noms Hôte d’isolement Origine géo-graphique

Phylotype-sequevar

CFBP2957 RUN0036, MT5 Solanum lycopersicum Martinique IIA-36

CMR34 RUN0147, CFBP7029 Solanum lycopersicum Cameroun IIB-1

CFBP3059 RUN0039, JS904 Solanum melongena Burkina Faso III-23

TO10 RUN0969 Solanum lycopersicum Thaïlande I-47

- RUN3598 Solanum lycopersicum Cameroun III-29

Essais réalisés à la Réunion

Les matériels et méthodes utilisés pour la recherche de QTL ont été décrits en détail dans le rapport d’avancement 2015 (1ère année).

- L’analyse QTL en utilisant la nouvelle carte dense construite en parallèle avec la population RIL (E8 x E6) à partir de données GBS (Salgon et al, 2017) amène aux conclusions suivantes :

La présence du gène majeur Ers1 (Lebeau et al, 2013) est confirmée et sa position est précisée sur le bras long du chromosome 9 de l’aubergine (Fig 1) ; ce gène n’est détecté que vis-à-vis des souches de phylotype I GMI1000, PSS366 et CMR134 précédemment utilisées lors du travail de thèse d’A. Lebeau (2010) et est totalement contourné par la souche virulente PSS4 du même phylotype I, mais également par les autres souches testées. L’analyse QTL effectuée avec la nouvelle carte génétique dense de la population RIL (E8 x E6) renforce l’hypothèse de l’existence d’un système gène pour gène entre Ers1 et un effecteur bactérien présent chez les souches contrôlées par ce gène majeur.

La présence d’un QTL mineur/intermédiaire à effet généraliste détecté sur le chromosome 2 (Fig 2) de l’aubergine avec les souches « contournant » le gène majeur CFPB2957 (IIA), CFPB3059 (III), PSS4 (I) et TO10 (I) ; ce QTL mineur apparaît comme le seul détectable vis-à-vis des souches très virulentes que sont PSS4 et TO10, avec un effet se limitant à un retard de l’apparition et de l’évolution des symptômes. Ce QTL a un effet faible à moyen (13 à 33% de variance phénotypique expliquée), mais possède un large spectre d’efficacité puisqu’il est détecté vis-à-vis de souches appartenant à des groupes phylogénétiques


différents. Pour les souches virulentes TO10 et PSS4, ce QTL ne semble avoir qu’un effet limité au stade précoce de l’infection (retard de développement du pathogène, mais incidence finale similaire au parent sensible dans nos conditions).

La présence d’un QTL majeur contrôlant partiellement à la fois les souches de phylotypes IIA et III sur le chromosome 5 de l’aubergine (Fig 2) ; on peut néan-moins supposer que l’effet de ce QTL (29 à 42% de variance phénotypique expli-quée), en combinaison avec le QTL mineur généraliste du chr 2, est suffisamment fort pour un contrôle efficace de ces souches en conditions d’infestation naturelle. Nous avons confirmé que ce QTL est bien différent du gène Ers1 et est positionné dans une région génomique différente.

Figure 2 : Détection du gène majeur Ers1 sur le bras long du chromosome 9 chez AG91-25 à partir d’une analyse combinée avec les souches de phylotype I GMI1000, PSS366 et CMR134 (courbe de LOD et position des marqueurs en centimorgans à partir du début du bras court du chromosome)

Figure 3 : Détection du QTL majeur sur le chr 5 (gauche) et du QTL de résistance généraliste sur le chr 2 (droite) chez AG91-25 avec les différentes souches testées (courbe de LOD et position des marqueurs en centimorgans à partir du début du bras court du chromosome)

novo

_430

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5907

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105

110


- L’analyse QTL pour la souche TO10 a combiné les résultats obtenus en 2015 à la Réunion avec ceux obtenus en Indonésie en 2010 vis-à-vis de cette même souche. Le retard au développement de l’infection, qui avait déjà été observé avec la souche virulente PSS4, est retrouvé avec cette souche TO10. La distribution des RILs suggère la présence d’un système de résistance polygénique dont l’effet est très variable selon les conditions environnementales (Fig 4). L’héritabilité de la variable Waudpc est élevée en Indonésie (0,81) et beaucoup plus faible à la Réunion (0,38). Parmi les accessions mises en témoin, E7 et E10 se sont révélées très sensibles, E1 et E3 tolérantes mais pas résistantes (peu de symptômes, mais beaucoup d’infections latentes). Seul le QTL généraliste sur le chromosome 2 a pu être détecté de façon sûre (méthode CIM) dans notre analyse ; il est néanmoins probable qu’il y est présence d’autres QTLs mineurs, qui concourent à ce système quantitatif de résistance, tel qu’il est observé dans notre essai. Les résultats qui avaient été obtenus par Vilmorin en Indonésie montraient une agressivité plus faible de la souche et un écart entre E6 et E8 très important. Le caractère quantitatif expliquerait la différence d’expression de cette résistance en fonction du site d’essai, c’est-à-dire principalement de la pression d’infestation obtenue.

Figure 4 : Fréquence de distribution de la population RIL (E8 x E6) pour la variable AUDPC du flétris-sement avec la souche TO10 en Indonésie (gauche) et à la Réunion (droite). Les flèches représentent le positionnement des moyennes des parents et de la F1.

- Enfin, nous avons confirmé qu’aucun QTL n’était associé avec la souche très viru-lente CMR34 du phylotype IIB. Les distributions quantitatives des RILs (E8 x E6) ob-servées correspondent donc quasi-exclusivement aux effets de l’environnement (aux effets fond génétique prés) (Fig 5). Le contrôle de ce type de souche exige donc d’ex-plorer d’autres sources de résistance potentielles chez l’aubergine, notamment E1 et E9 qui semblent les plus prometteuses. Ces souches de phylotype IIB bien que pré-sentes à la Réunion, dans la région Océan Indien et en Afrique, ne constituent pas les souches majoritaires dans les bassins de production. Cependant, il convient de garder à l’esprit que leur incidence pourrait être favorisée par le déploiement mal rai-sonné des résistances.

Figure 5 : Fréquence de distribution de la population RIL (E8 x E6) pour le % de plants colonisés (CI %) avec la souche CMR34 à la Réunion aux 2 saisons (gauche) et en analyse combinée (droite). Les flèches représentent le positionnement des moyennes des parents et de la F1.


Essais réalisés au Cameroun avec la souche RUN3598 (phylotype III)

Les matériels et méthodes utilisés ont été décrits en détail dans les rapports d’avancement de 1ère et 2ème année. L’analyse QTL sur la population RIL (E8 x E6) avec la souche RUN3598 n’a donné aucun résultat probant laissant supposer que la résistance présente chez AG91-25 n’était d’aucune efficacité vis-à-vis de la souche de phylotype III RUN3598.

Au 1er essai, l’inoculation n’a pas été réussie et le niveau d'infestation obtenu était loin de celui souhaité. Les plantes n'ont globalement pas flétri, et dans les rares cas où elles flétrissaient les symptômes n'évoluaient pas. De plus, suite aux prélèvements, la bactérie ne s'est pas développée sur SMSA. Malgré cela, l’analyse statistique des résultats a permis de mettre en évidence un effet significatif du génotype. Une cartographie génétique de la résistance a été malgré tout tentée avec, à la clé, la détection de quelques QTL à effet mineur. La présence/absence de ces derniers variait selon la variable analysée et la méthode utilisée. Par la méthode CIM (Composite Interval Mapping), nous n’avons détecté que 2 QTL à effet très faible, mais cela pour un risque alpha=0,05%, soit donc une probabilité de faux positif importante.

Au 2ème essai, l'inoculation a mieux réussi. Un effet significatif du génotype a également été mis en évidence et des QTLs à effet faible ont été détectés pour les variables AUDPC score et incidence, mais cela uniquement avec la méthode marqueur par marqueur. Une analyse sur la variable indice de colonisation a permis de mettre en évidence un QTL quelque-soit la méthode utilisée, et avec un risque alpha = 0,001. Ce QTL putatif expliquerait 10% de la variabilité phénotypique observée.

Ces analyses suggèrent que la résistance présente chez E6 est très probablement inefficace vis-à-vis de la souche camerounaise utilisée, avec des différences trop faibles obtenues entre les 2 parents E6 et E8, voir pas de différence significative. Ce résultat corrobore les observations faites sur la coreTEP au Cameroun qui indiquaient que AG91-25 présentait une incidence très élevée (près de 70%) de la maladie et proche de celle observée sur E8 (85%), le parent sensible, alors que l’accession E4 présentait un niveau de résistance très élevé (aucun plant flétri mais en revanche des infections latentes).

Au vu de ces résultats, nous en avons conclu qu’AG91-25 avait peu d’intérêt dans la situation épidémiologique du Cameroun et qu’il fallait réorienter nos recherches sur E4, ce que nous aborderons dans le chapitre 2.2.

En conclusion de la tâche 2.1

Au final, la résistance présente chez AG91-25 aura été disséquée versus 9 souches couvrant la diversité génétique de R. solanacearum. Les résultats obtenus dans les 2 sites (Réunion et Cameroun) confirment la présence chez AG91-25 d’un système polygénique de gènes/QTL de résistance associant un gène majeur, Ers1, qui contrôle spécifiquement des souches du phylotype I, avec des QTLs phylotype-non spécifiques qui confèrent un niveau de résistance partielle à des souches virulentes des phylotypes I, IIA et III, non contrôlées par Ers1. Très probablement, ce système polygénique n’a que très peu d’efficacité vis-à-vis de la souche camerounaise RUN3598 de phylotype III, contrairement à la résistance partielle qui avait été observé vis-à-vis de la souche CFBP 3059 également de phylotype III, mais originaire elle du Burkina Faso. On pourrait se trouver dans un cas similaire à ce qui avait été observé vis-à-vis de la souche CMR34 de phylotype IIB, pour laquelle les deux parents paraissaient quasiment aussi sensibles avec logiquement aucun QTL détecté.


Tâche 2.2 : Tests des générations issues de sources de résistance potentielles vis-à-vis des souches de la bactérie contournant le gène ERs1

Des tests de résistance ont été réalisés à la Réunion en conditions contrôlées (chambre climatique) sur les accessions E1, E2, E3, E4 et E9 vis-à-vis de la souche virulente PSS4 contournant le gène majeur ERs1 (Fig 6).

L’analyse mendélienne sur les générations issues des croisements E8 x E3 et E8 x E9 suggérait un déterminisme génétique plutôt récessif avec un ou deux facteurs de résistance, comme le montraient les comparaisons de ratio observés et théoriques (tableau 3). Le caractère supposé récessif des résistances présentes dans ces accessions laissait penser à des mécanismes de résistance différents de ceux contrôlés par le gène majeur ERs1 chez AG91-25. Ce résultat paraissait donc très intéressant dans la perspective de sélectionner des résistances à spectre large et potentiellement durables, grâce notamment au pyramidage de gènes et QTL majeurs contrôlant des mécanismes de défense différents dans la plantes.

Ce travail a permis au moins de cibler les sources de résistance à étudier prioritairement et pour lesquelles des populations HD devaient être produites. Les niveaux de résistance les plus élevés ont été observés dans les accessions E3 et E9, dans une moindre mesure E4, au cours des deux saisons d’essais pour les principales variables mesurées. Les croisements E8 x E3 et E8 x E9 ont donc été ciblés en priorité pour une production des descendances HD. Néanmoins, c’est la population HD E8 x E4 qui a été disponible la première en 2015 et a donc été la première testée. Il se trouve que l’accession E4 est aussi celle qui a montré le niveau de résistance le plus élevé au Cameroun vis-à-vis de la souche locale RUN3598 de phylotype III, nous incitant à tester cette descendance dans le cadre du projet Resauber.

Figure 6 : Evolution de l’incidence du flétrissement bactérien (%) sur les accessions résistantes vis-à-vis de la souche virulente PSS4

GénérationNombre de plants Un gène récessif Deux gènes récessifs

Total sains flétris Ratio attendu (R:S) sain flétris chi2 P Ratio attendu

(R:S) sain flétris chi2 P

E3 30 29 1 1-0 1-0E8 30 5 25 0-1 0-1

F1(E3xE8) 30 5 25 0-1 0-1F2(E3xE8) 120 50 70 1-3 30 90 17,78 0,000 7-9 52,5 67,5 0,2116 0,645

BC(E3xE8)xE3 80 41 39 1-1 40 40 0,05 0,823 3-1 60 20 24,0679,31E-07BC(E3xE8)xE8 80 34 46 0-1 0-1

E9 30 25 5 1-0 1-0E8 30 5 25 0-1 0-1

F1(E9xE8) 30 3 27 0-1 0-1F2(E9xE8) 120 36 84 1-3 30 90 1,6 0,206 7-9 52,5 67,5 9,22 0,002

BC(E9xE8)xE9 80 58 22 1-1 40 40 16,2 0,000 3-1 60 20 0,27 0,61BC(E9xE8)xE8 80 41 39 0-1 0-1

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

0 10 20 30

W (%

)

Jours après inoculation par PSS4

E1E10E2E3E4E8E9 0

102030405060708090

100

0 10 20 30

W (%

)

Jours après inoculation par PSS4

F1 (E1xE8)F1 (E2 x E8)F1 (E3 x E8)F1 (E4 x E8)F1 (E9 x E8)

Evolution du pourcentage de flétrissement (W) dans les lignées parentales et les F1

Tableau 3: Résultats d’une analyse mendélienne sur les générations issues des accessions E3 et E9 (test d’hypothèse) testées vis-à-vis de la souche virulente PSS4 à la Réunion.


Cartographie génétique de la résistance à R. solanacearum dans les descendances HD [E8 x E4] et HD [E8 x E3]

Figure 7 : Processus de phénotypage et génotypage haut-débit des descendances HD [E8 x E4] et HD [E8 x E3]

Ce travail a bénéficié de la construction par le CIRAD Réunion de 2 nouvelles cartes génétiques denses avec des marqueurs SNPs produits à partir de la méthode GBS (séquençage Illumina).

-HD (E8 x E4) : une carte de 1431 cM, avec 1113 marqueurs et une densité moyenne de 1 marqueur tous les 1.29 cM, 12 groupes de liaison correspondant aux 12 chromosomes de l’aubergine.

-HD (E8 x E3) : une carte de 1442 cM, avec 992 marqueurs et une densité moyenne de 1 marqueur tous les 1.46 cM, 12 groupes de liaison correspondant aux 12 chromosomes de l’aubergine.

Phénotypage à la Réunion vis-à-vis de la souche virulente PSS4 de phylotype I

Les distributions de fréquences obtenues indiquent un contrôle quantitatif polygénique de la résistance chez E4 (Fig 8). L’Anova a montré un effet génotype hautement significatif à chaque saison et dans la l’analyse multi-saisons. Un effet significatif de la saison et de l’interaction Génotype * Saison a néanmoins été observé. Les valeurs d’héritabilité au sens large estimées sont moyennes. Les analyses QTL (tableau 4) ont montré la présence d’un grand nombre de QTLs mineurs répartis sur l’ensemble du génome chez E4, avec des

Phénotypage (2 tunnels × 2 saisons = 4 rep) souche RUN3598 (III-29) Technisem Cameroun

Génotypage plateforme (préparation des librairies au CIRAD- AGAP MontpellierSéquençage plateforme GeT-PlaGe-Genotoul INRA Toulouse

Phénotypage en chambres clima-tiques (2 rotoplans × 2 essais = 4 répétitions) souche PSS4 (I-15) Cirad Réunion stage Edith Garot

Phénotypage (2 tunnels × 2 saisons = 4 rep) souche PSS4 (I-15) Cirad Réunion

160 HD [E3×E8] + lignées parentales + F1 + Témoin E6

135 HD [E4×E8] + lignées parentales + F1, F2, BC1P1, BC1P2 + témoins E6, E9, E3 et E10


interactions épistatiques significatives entre certains. Certains QTLs semblent spécifiquement associés avec une diminution du % de plants colonisés. Les % de variance expliqués par l’ensemble de ces QTL atteignent des valeurs importantes, suggérant néanmoins un contrôle correct de la résistance à cette souche virulente chez E4.

Saison 1 Saison 2

Saisons combinées

H2=0,69 H2=0,58

H2=0,64

Figure 8 : Distributions de fréquence pour la variable Waudpc (audpc de l’incidence du flétrissement) sur la population HD (E4 x E8) testée à 2 saisons différentes à la Réunion vis-à-vis de la souche PSS4 (I-15)


Tableau 4 : analyse QTL dans la descendance HD (E4 x E8) vis-à-vis de la souche PSS4, par la méthode MQM (méthode d’analyse multiple, fonction stepwise de R/qtl) pour les variables audpc de l’incidence du flétrissement (Wa) et % de plants colonisés (CI)

Les résultats obtenus en chambre climatique dans la population HD (E3 x E8) sont apparus comme non répétables, une seule des 4 répétitions ayant pu être exploitée pour la recherche de QTL, cela en dépit d’une distribution quantitative observée pour les variables incidence maximale du flétrissement et % de plants colonisés (Fig 8). Quelques QTL mineurs putatifs ont pu être identifiés sur les chr 1, 2 et 3 (tableau 5).Les essais menés en rotoplans n’ont pas été réussis et doivent être répétés sous tunnels dans de meilleures conditions de croissance et d’inoculation des plants : un essai a déjà été réalisé en septembre-novembre 2016 et un 2ème a été réalisé au 1er semestre 2017 ; les résultats seront analysés très prochainement.

Figure 8 : Distribution de fréquences des valeurs obtenues pour la variable % de plants colonisés (CI %) dans la population HD (E3 x E8) testée en chambre climatique à la Réunion vis-à-vis de la souche PSS4.

Histogramme Index de colonisation CI (%)

H2=0,46


Tableau 5 : analyse QTL dans la descendance HD (E3 x E8) vis-à-vis de la souche PSS4, par la méthode MQM (méthode d’analyse multiple, fonction stepwise de R/qtl) pour les variables audpc de l’incidence du flétrissement (Wa) et % de plants colonisés (CI)

Répétition Trait Chr Pos LOD Intervalle R2 R2 total effet addifif

1 Wa - - - - - - -CI - - - - - - -

2 Wa - - - - - - -CI - - - - - - -

3 Wa - - - - - - -CI - - - - - - -

4Wa 2 25,5 3,17 8,0-60,3 8,6 24,7 -5,6***

3 133 5,44 129,4-141,0 15,3 -7,6***

CI 1 150,8 3,36 134,0-165,0 9,6 20,5 -7,5***3 133 3,54 110,0-142,0 10,2 -7,8***

comb Wa 3 135 4,02 130,9-142 12,8 12,8 -3,6***CI 3 133 3,83 112,0-141,0 12,2 12,2 -5,4***

Phénotypage au Cameroun vis-à-vis de la souche de phylotype III RUN3598

Seule la population HD (E4 x E8) a été testée au Cameroun vis-à-vis de la souche RUN3598, dans le cadre du projet, et cela au cours de 2 saisons successives. Rappelons que cette accession E4 est celle qui avait montré le plus haut niveau de résistance au Cameroun vis-à-vis de cette souche utilisée également pour tester la coreTEP. Les essais ont été réalisés en tunnels selon le même protocole que celui déjà mis en œuvre dans le cas de la descendance RIL (E8 x E6), l’année précédente (Fig 9). On a observé une distribution non normale des lignées HD (Fig 10), laissant à première vue penser à un déterminisme de type gène majeur ou un système oligogénique comprenant un gène majeur, d’autant que la F1 se positionnait très près du parent résistant. Cette observation n’a pas été confirmée par l’analyse QTL qui ne faisait pas ressortir clairement un gène/QTL majeur (Tableaux 6 et 7). Néanmoins, la présence d’un QTL à effet intermédiaire à fort a été clairement établie sur le chromosome 3 dans la zone correspondant au QTL identifié à la Réunion dans la même descendance vis-à-vis de PSS4, mais également dans la population HD (E3 x E8) testée en chambre climatique à la Réunion vis-à-vis de cette même souche. La question se pose donc de savoir s’il s’agit chez E4 d’un même QTL généraliste efficace contre les 2 souches testées et dont une forme allélique serait aussi présente chez E3 ?

Figure 9. Processus d’inoculation en serre au Cameroun (gauche), et symptômes de flétrissement bactérien observé sur aubergine (droite).


Figure 10 : Distributions de fréquence pour la variable % de plants colonisés (CI %) dans la population HD (E4 x E8) testée à 2 saisons différentes au Cameroun vis-à-vis de la souche RUN3598

Tableau 6 : analyse QTL dans la descendance HD (E4 x E8) vis-à-vis de la souche RUN3598, par la méthode SIM pour la variable % de plants colonisés (CI), au cours de 2 saisons au Cameroun

Trait Saison Chr Pos LOD P-value Intervalle R2 R2 total effet addififSCOmax

13 5,35 2,8 0,033 0-163,3 9,2 9,2 -0,08***

Wa 3 5,35 2,87 0,034 0-150,0 9,8 9,8 -0,61***CI 3 5,75 8,79 0 4-6,4 35,4 35,4 -12,67***

SCOmax2

9 49,7 3,21 0,019 39,0-92,9 9,8 9,8 -0,05***Wa 9 49,7 3,1 0,016 11,0-93,0 8,7 8,7 -0,27***CI 9 49,7 3,73 0,006 40,0-92,0 12 12 -5,7***

CI comb 3 4,7 8,38 0 2,0-6,4 25,3 38,5 -8,30***9 48 3,73 0 41,0-67,8 10,2 -5,25***

Tableau 7 : analyse QTL dans la descendance HD (E4 x E8) vis-à-vis de la souche RUN3598, par la méthode MQM (méthode d’analyse multiple, fonction stepwise de R/qtl) pour la variable % de plants colonisés (CI), au cours de 2 saisons au Cameroun

Saison Trait Chr Pos LOD Intervalle R2 R2 total effet addifif

1 CI 3 5,7 12,17 4,7-6,4 36,0 44,6 -12,74***6 50,0 3,90 40,9-71,3 9,6 -6,67***

2 CI 9 49,7 3,09 40,0-92,0 11,95 11,95 -5,73***

comb CI 3 4,7 8,38 2,0-6,4 25,3 38,5 -8,3***9 48 3,73 41,0-67,8 10,2 -5,3***



L’exploration de la résistance présente chez d’autres accessions que AG91-25 a été motivée par la nécessité d’identifier des facteurs de résistance permettant de contrôler les souches virulentes contournant le gène majeur, ces souches pouvant appartenir à tous les phylotypes comme l’ont montré nos essais, mais également toutes les études menées par le CIRAD Réunion depuis 10 ans. Dans l’état actuel de nos connaissances, des facteurs de résistance sont présents dans les accessions E3 et E4, mais on est probablement confronté à des systèmes polygéniques, a priori difficilement exploitables en sélection.

Dans un premier temps, il faudrait confirmer la présence et l’effet de quelques QTL à effet fort et développer des marqueurs liés de façon à pouvoir les utiliser en sélection. L’objectif est de trouver dans la diversité naturelle de l’aubergine plutôt un ou deux gènes/QTLs majeurs facilement manipulables en combinaison avec le gène majeur ERs1 (EBWR9). Les QTLs identifiés chez AG91-25 en combinaison avec Ers1 permettent déjà de contrôler une part de la diversité génétique de la bactérie à la Réunion, mais s’avèrent inefficaces ou insuffisants au Cameroun vis-à-vis de la souche de phylotype III RUN3598. En effet, des interactions spécifiques entre QTLs de résistance et souches bactériennes rendent très complexe le contrôle de la bactérie pour des situations épidémiologiques éloignées et nécessitent de développer des programmes de sélection ciblés à une échelle régionale.

Tâche 2.3 : Production et fourniture de ressources génétiques scientifiques

Le matériel « aubergine » pour les essais était constitué :

-de générations F1, F2 et BC issues du croisement entre les parents résistants les plus inté-ressants de la Core-aubergine (E1, E2, E3, E4, E6, E9) et le parent sensible E8,-de lignées recombinantes RILs-F7 (E8 x E6),-de populations de lignées haploïdes doublées, issues chacune d’un des hybrides entre le parent sensible E8 et les parents résistants.

2.3.1. Production et fourniture de semences des générations F1, F2 et BC.

Le détail de l’identité des générations et des destinataires auxquels elles ont été envoyées durant toute la période du projet se trouve dans le Tableau 8. Les envois de témoins paren-taux s’y trouvent aussi, car ils sont généralement envoyés avec les générations, à titre de té-moins (hors envoi matériel Core-TEP).


Tableau 8 : Générations F1, F2 et BC : bilan des semences envoyées aux partenaires, pour phénotypage de la résistance à Ralstonia solanacearum.

Code témoin et génération N° ou nom d'accession

Envoi à Technisem Cameroun, mars 2015

Envoi à Technisem Cameroun, juin 2015

Envoi à VEGENOV août 2015

Envoi à VEGENOV septembre

2015

envoi à CIRAD

Réunion dec.2015

envoi à Technisem Cameroun,

dec.2015

E1 MM 853 Dingras multiple purple 20 grainesF1 (E1 X E8) F1 (MM 853 Dingras mult. purp. X MM 738) 100 graines

F2 (E1 X E8) F2 (MM 853 Dingras mult. purp. X MM 738)BC1 [F1(E1 X E8) x E8)] BC1 [F1 (MM 853 Dingras mult. purp.X MM 738)] X MM 738BC1 [F1(E1 X E8) x E1)] BC1 [F1 (MM 853 Dingras mult. purp.X MM 738)] X MM 853 Dingras mult. purp.

E2 MM 643 SM6 20 grainesF1 (E2 X E8) F1 (MM 643 SM6 X MM 738) 100 graines

F2 (E2 X E8) F2 (MM 643 SM6 X MM 738)BC1 [F1(E2 X E8) x E8)] BC1 [F1 (MM 643 SM6 X MM 738)] X MM 738BC1 [F1(E2 X E8) x E2)] BC1 [F1 (MM 643 SM6 X MM 738)] X MM 643 SM6

E3 (témoin résistant) MM 152 Cey lan 4gF1 (E3 X E8) F1 (MM 152 Cey lan X MM 738)

F2 (E3 X E8) F2 (MM 152 Cey lan X MM 738)BC1 [F1(E3 X E8) x E8)] BC1 [F1 (MM 152 Cey lan X MM 738)] X MM 738

BC1 [F1(E3 X E8) x E3)] BC1 [F1 (MM 152 Cey lan X MM 738)] X MM 152 Cey lan

E4 (témoin résistant) MM 1811 Sury a 50 graines 2g 4g

F1 (E4 X E8) F1 (MM 1811 Sury a X MM 738) 1g 1g 1,5gF2 (E4 X E8) F2 (MM 1811 Sury a X MM 738) 2g 4gBC1 [F1(E4 X E8) x E8)] BC1 [F1 (MM 1811 Sury a X MM 738)] X MM 738 2g 4g

BC1 [F1(E4 X E8) x E4)] BC1 [F1 (MM 1811 Sury a X MM 738)] X MM 1811 Sury a 2g 4g

E6 (témoin résistant) MM 960, AG91-25F1 (E8 x E6) F1 (MM 738 x AG91-25) 1g 1gF2 (E8 x E6) F2 (MM 738 x AG91-25) 2g 2gBC1 [F1 (E8 x E6) x E8)] BC1 [F1(MM 738 x AG91-25) x MM 738] 2g 2gBC1 [F1 (E8 x E6) x E6)] BC1 [F1(MM 738 x AG91-25) x AG91-25] 2g 2g

E9 (témoin résistant) MM 1800 Terong bulat hijau 50 graines 1,5gF1 (E9 X E8) F1 (MM 1800 Terong Bulat Hijau X MM 738) 1gF2 (E9 X E8) F2 (MM 1800 Terong Bulat Hijau X MM 738)

BC1 [F1(E9 X E8) x E8)] BC1 [F1 (MM 1800 Terong Bulat Hijau X MM 738)] X MM 738BC1 [F1(E9 X E8) x E9)] BC1 [F1 (MM 1800 Terong Bulat Hijau X MM 738)] X MM 1800 Terong Bulat Hijau

E8 (témoin sensible) MM 738 20 graines 50 graines 2g 1,5gE10 (témoin sensible) MM 136, Florida Market


2.3.2. Production et fourniture de semences de RILs (E8 x E6)

La population de 196 lignées RIL (E8 x E6), créée entre 1999 et 2008 au GAFL, a été régu-lièrement entretenue pour disposer d’un stock de semences de réserve. Les semences de la génération F7, utilisées régulièrement et maintenues depuis 2008, ont été produites en fonc-tion des besoins et du stock disponible : 26 lignées en 2013, 5 lignées en 2014 et 9 lignées en 2015. En mars 2015, 1 gramme de semences de chacune des 196 lignées a été envoyé à Technisem-Semagri (Cameroun) pour phénotypage avec la souche de Ralstonia solana-cearum locale.

2.3.3. Production par VEGENOV de plantes haploïdes doublées

La production de plantes haploïdes doublées à partir de culture in vitro d’anthères d’hybrides F1 est sous traitée à VEGENOV BBV (http://www.vegenov.com/) depuis 2013. Les hybrides F1, créés à l’INRA-GAFL, sont issus du croisement d’un géniteur sensible (E8) par plusieurs géniteurs résistants à Ralstonia solanacearum, dont l’intérêt respectif a évolué au fil des phé-notypages réalisés au CIRAD Réunion entre 2008 et 2016. Aussi, in fine, la culture d’an-thères a-t-elle été réalisée sur cinq hybrides issus du croisement d’un parent sensible (E8) avec 5 géniteurs, E1, E2, E3, E4 et E9.

La production d’haploïdes doublés s’est heurtée à divers écueils, en particulier :- une productivité en embryons issus de microspores réduite, très irrégulière selon les

génotypes et les saisons (l’automne et le printemps étant les meilleures périodes pour la mise en culture d’anthères),

- une proportion variable de plantules haploïdes ou spontanément diploidisées, - une fiabilité imparfaite de la cytométrie de flux utilisée en laboratoire pour distinguer

haploïdes et diploïdes. En effet, la culture ultérieure en serre au GAFL permet de ré-véler la stérilité de certaines plantes, qui est liée à leur état haploïde. Cet état est également visible morphologiquement (prolifération végétative, feuilles étroites, pe-tites fleurs, étamines nécrosées ou très fines, pollen absent ou très peu abondant).

VEGENOV a procédé à des envois successifs vers le GAFL de plantes haploïdes doublées (c'est-à-dire supposées 2n d’après la cytométrie de flux), par exemple pour un total de 452 plantes reçues au stade 2-4 feuilles entre janvier et septembre 2015. Le détail du matériel re-çu au GAFL pour cette période est donné dans le Tableau 9.


Tableau 9. Détail des haploïdes doublés envoyés à l’INRA-GAFL par VEGENOV en 2015

réception des plantes au GAFL

ascendance des HDA

Nombre de plantes

14 janvier 2015 E1 x E8 4E2 x E8 6E3 x E8 52E4 x E8 12Total 74

11 mars 2015 E1 x E8 4E2 x E8 12E3 x E8 26E4 x E8 14Total 56

20 mai 2015 E3 x E8 34

24 juin 2015 E3 x E8 86E9 x E8 20Total 106

22 juillet 2015 E3 x E8 98E9 x E3 47Total 145

15 septembre 2015 E9 x E8 37

2.3.4. Production de semences par le GAFL sur les plantes d’haploïdes doublés

Cet effectif important de plantes reçues progressivement a été acclimaté, rempoté, mis en place en pots avec ferti-irrigation en serre de culture, et autofécondé durant toute la période du projet. Il faut compter au moins 5 mois entre la réception des plantes et la première ré-colte des semences.

Les difficultés rencontrées en production de plantes haploïdes doublées ont eu des réper-cussions sur la production de semences sur ces plantes par le GAFL :

- arrivées échelonnées des plantes et étalement à l’année de toutes les étapes de la prise en charge,

- fertilité très variable d’une plante à l’autre, - nécessité de traiter à la colchicine un certain nombre de plantes stériles et à phéno-

type haploïde, puis de greffer les rameaux néoformés et doublés (devenus 2n) pour produire ensuite des semences sur des plantes à la fertilité rétablie,

- une production de semences nulle ou insuffisante en premier cycle, nécessitant soit une multiplication végétative pour un deuxième cycle de culture, soit une nouvelle


production de semences sur plantes de deuxième génération (issues du semis de graines récoltées sur les plantes reçues),

Compte tenu des délais extrêmement courts entre l’arrivée des plantes au GAFL et la fourni-ture de semences aux partenaires de RESAUBER, la production de semences a été faite pour l’essentiel sur les plantes de première génération (celles sorties d’in vitro et reçues au GAFL). Une production de semences sur la deuxième génération (issue de graines récoltées sur les plantes reçues) a eu lieu pour certains des cas mentionnés ci-dessus. Le détail des effectifs de plantes gérés au GAFL depuis 2014, des difficultés rencontrées et des résultats en termes de production de semences, est fourni dans le Tableau 10. Ce tableau montre en particulier que d’une descendance haploïde doublée à une autre, les statistiques varient beaucoup, ce qui contribue à compliquer la planification de la gestion du matériel en serre. Les plannings au GAFL sont d’autant plus serrés, que la saison optimale de production de semences est restreinte d’Avril à Octobre, dans les conditions de serre du sud de la France et des limites budgétaires pour le chauffage des serres en contre saison.

Tableau 10 : Statistiques récapitulatives sur la gestion, par le GAFL, des plantes reçues en 2014 et 2015 de VEGENOV

série reçu en nbre de plantes reçues

nbre de plantes en 2è cycle de

culture

nombre plantes mortes

nombre de plantes avec assez de semences

nombre de plantes avec pas assez de semences

nombre de plantes sans descendance

HDA (E1 x E8) 2014, 2015 70 12 3 51 1 15

Pour cent 17,1% 4,3% 72,9% 1,4% 21,4%

HDA (E2 x E8) 2014, 2015 87 33 6 50 5 26

Pour cent 37,9% 6,9% 57,5% 5,7% 29,9%

HDA (E3 x E8) 2015 296 25 15 225 20 36

Pour cent 8,4% 5,1% 76,0% 6,8% 12,2%

HDA (E4 x E8) 2014, 2015 182 36 7 142 3 30

Pour cent 19,8% 3,8% 78,0% 1,6% 16,5%

HDA (E9 x E8) 2015 104 0 0 44 33 27

Pour cent 0,0% 0,0% 42,3% 31,7% 26,0%

TOTAL 739 4,2% 69,3% 8,4% 18,1%

Malgré un effort similaire déployé sur chaque plante en serre, avec une consigne d’accro-cher au moins 6 fruits autofécondés par plante, les résultats en termes de nombre total de fruits et quantité totale de graines récoltés par plante sont très variables d’une plante mère à l’autre, allant de pas assez à beaucoup trop, ainsi que le montre le Tableau 11 (sans comp-ter ici le nombre de plantes sans descendances, qui est précisé dans le Tableau 10). On re-marquera aussi que d’une plante à l’autre, et d’un fruit à l’autre, les fruits contiennent des quantités de semences très variables. Les résultats du Tableau 10 sont légèrement biaisés par le fait que quelques plantes ont eu deux cycles de culture, mais néanmoins ces chiffres donnent une idée de la difficulté à harmoniser la production de semences (au moins 10 grammes) pour l’ensemble des plantes cultivées.


Tableau 11 : Fourchettes minimum et maximum du nombre de fruits et quantité de graines récoltés en 2015 par plante haploïde doublée autofécondée dans les différentes descendances produites

descendance (code bref) minimum (2015) maximum (2015) minimum (2015) maximum (2015)

HDA (E1 x E8) 9 36 2 graines 100 grammesHDA (E2 x E8) 1 35 1 graine 154 grammesHDA (E3 x E8) 1 14 1 graine 94 grammesHDA (E4 x E8) 1 37 1 graine 121 grammesHDA (E9 x E8) 1 12 quelques graines 79 grammes

quantité de graines récoltées par plantenombre de fruits récoltés par plante

2.3.5. Fourniture aux partenaires de semences d’haploïdes doublés

Dans le cadre de RESAUBER, le GAFL a fourni tout au long du projet les semences des li-gnées d’haploïdes doublés au CIRAD et au partenaire TECHNISEM, cela dans un délai le plus court possible après la réception des plantes produites par VEGENOV (sous-traitant pour la production d’haploïdes doublés). Malgré les difficultés rencontrées tant au niveau de la production de plantes haploïdes doublées que de la production de semences par ces plantes, grâce à un effort soutenu, le matériel voulu a pu être produit et fourni dans les délais impartis par la programmation RESAUBER. Les envois sont détaillés dans le Tableau 12.

Tableau 12. Populations HDA envoyées aux partenaires

date d'envoi destinataire descendance (libellé complet) descendance (code bref)

Nombre de lignées envoyées

quantité de semences envoyées

août 2015 CIRAD, Réunion HDA (MM 1811 Surya EG203 x MM 738) HDA (E4 x E8) 135 5g

novembre 2015 Technisem-Semagri, Cameroun HDA (MM 1811 Surya EG203 x MM 738) HDA (E4 x E8) 135 1g

février 2016 CIRAD, Réunion HDA (MM 152 Ceylan x MM 738) HDA (E3 x E8) 225 5g


Ce volet du projet a été très actif au GAFL en termes de production et d’envois de se-mences, grâce à un travail à flux tendu entre les producteurs (INRA-GAFL et VEGENOV) et les utilisateurs (CIRAD, TECHNISEM) de ressources génétiques patrimoniales (Core-TEP) et scientifiques (F1, F2, BCs, RILs et HDA). Les engagements du GAFL ont été tenus malgré les difficultés liées à ce type de matériel végétal.

Conclusion générale de l’action 2 du projet

Les travaux de cartographie génétique réalisés dans le cadre du projet sont un premier pas vers l’identification de facteurs de résistance pyramidables dans le futur pour contrôler la maladie dans des situations épidémiologiques complexes et susceptibles d’évoluer. La recherche de gènes/QTLs de résistance majeurs ou à effet fort doit se poursuivre chez l’aubergine, notamment dans l’accession E9 pour laquelle une descendance HD sera disponible en 2017. Le développement en parallèle de marqueurs moléculaires « breeder friendly » permettra de faciliter le transfert et le pyramidage de quelques-uns de ces gènes/QTLs dans des cultivars d’intérêt mais sensibles à R. solanacearum.


Action 3. Approche de la durabilité potentielle du gène ERs1 et dynamique évolutive associée à son contournement

Cette action avait pour objectif d’identifier les phases clés du cycle infectieux de R. solanacearum impactées par l’action du gène ERs1, ainsi que les mécanismes moléculaires et populationnels impliqués dans le contournement éventuel de ce gène. Cette action a durant la période du projet fait l’objet d’une thèse de Doctorat (J. GUINARD, financement CIRAD/Université Réunion) soutenue en décembre 2015. Tâche 3.1 : Impact du gène Ers1 sur la structuration génétique des populations de R. solanacearum observée dans une parcelle de plein champ

Les matériels et méthodes ont été précédemment détaillés (Rapport d’Activité Année 1).

La présente étude a été réalisée sur la parcelle expérimentale du Vallon, située à la station Ligne Paradis CIRAD de Saint Pierre, à la Réunion (21.3208°S, 55.4845°E), et naturellement infestée par des souches de phylotype I (Poussier et al. 2000) (Carine N’Guessan, données non publiées 2009).Un cycle de tomate sensible (hôte très peu sélectif) destiné à multiplier l’inoculum présent, et à cartographier les zones les plus infestées, a été réalisé en 2012. Sur chacune des trois zones les plus infestées, un couple de microparcelles (E6, résistant ; E8, sensible) a été défini. Des cycles successifs de culture ont été ensuite réalisés, à raison de 2 cycles par an (cycles 1 à 5).Lors du cycle 6, en fin 2015, les parcelles E8 et E6 ont été inversées (celles ayant porté E8 durant 5 cycles ont été implantées en E6, et vice-versa).Il est important de noter que les isolements bactériens sur plantes malades (E8) et sur plantes asymptomatiques (E6) ont été menés pour les cycles 1, 2, et 4. Des isolements de sol ont été menés également pour le cycle 5. En parallèle du suivi de la maladie au champ, une méthode de génotypage haut débit (Multi Locus VNTR Analysis, ou MLVA) des populations bactériennes a été mise au point. Un schéma MLVA à 7 loci a ainsi été publié récemment (Guinard et al., 2017) :Guinard, J., Latreille, A., Guérin, F., Poussier, S., and Wicker, E. 2017. New Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis (MLVA) Scheme for Fine-Scale Monitoring and Microevolution-Related Study of Ralstonia pseudosolanacearum Phylotype I Populations. Applied and Environmental Microbiology 83(5): e03095-03016. doi:10.1128/AEM.03095-16.

1.2.3.

3.1.Résultats

1. AG91-25 (E6) aurait une résistance plus durable qu’attendu, avec un possible effet suppressif sur la population du sol

Nous n’avons observé aucun flétrissement au cours des différents cycles de culture d’E6, et des infections latentes n’ont été isolées qu’au premier cycle. Au cycle 1, 71 souches de R. solanacearum phylotype I ont été isolées d’E6. D’après différents estimateurs de diversité génétique (Fst et Rst, AMOVA), la variété de l’hôte ne semble pas être un facteur structurant la variabilité génétique des populations (P= 0.9 NS). Si la diversité génétique et haplotypique des populations infectant E6 est bien moindre que celle trouvée sur E8, les deux accessions piègent les mêmes haplotypes MLVA.

https://dx.doi.org/10.1128/AEM.03095-16


Par la suite, plus aucune infection latente n’a pu être détectée sur E6, comme déjà mentionné dans le rapport d’activité 2015. Au cycle 2, 103 colonies « suspicieuses », morphologiquement très proches de Ralstonia solanacearum, avaient été isolées. Elles se sont révélées appartenir soit au genre Bosea (alpha-protéobactérie, Bradyrhizobiacée vivant dans la rhizosphère et nodules de Légumineuses), soit au genre Inquilinus (alpha-protéobactérie rhizosphérique, parfois nosocomiale, de la famille des Rhodospirillaceae). La question du rôle de ces espèces isolées des vaisseaux du xylème, notamment de leur implication possible dans la résistance à l’infection par R. solanacearum, reste posée.

Lors du cycle 5, des échantillonnages de sol sur les localisations E6 où nous avions observé des infections latentes au cycle 1, ont révélé des niveaux de population cultivable très bas (aucune bactérie isolée dans 4 prélèvements sur 13 ; moyenne des 9 autres prélèvements = Log 1.03.g sol-1), alors que ceux relevés sur le témoin E8 sont supérieurs d’au moins un degré de magnitude (moyenne = Log 2.45 .g sol-1). Ces résultats nous mènent à poser l’hypothèse que la résistance de E6 s’exprime peut-être par des composés bactériostatiques ou bactéricides émis dans les exsudats racinaires, qui font chuter le niveau de population pathogène jusqu’à empêcher toute infection latente, mais aussi empêcher toute apparition d’un quelconque variant virulent. Ce type de résistance a déjà été décrit chez Arabidopsis thaliana (Bais et al., 2005) pour contrôler Pseudomonas syringae.

Lors du cycle 6, aucun symptôme n’a été observé sur les plants E6 implantés sur les anciennes placettes E8. Ceci suggère que E6 a une résistance encore efficace malgré la forte augmentation du potentiel infectieux sur ces parcelles. D’autre part, aucun symptôme n’a été observé sur les plants E8 implantés sur les anciennes parcelles E6, suggérant que le potentiel infectieux est devenu trop faible pour induire des symptômes même sur l’accession sensible.

2. Les aubergines testées ne présentent pas un « effet-filtre » détectableLes populations prélevées dans la rhizosphère et dans les tiges n’étaient pas significativement différentes, bien qu’une chute de diversité haplotypique ait été observée sur certains couples. De plus, les analyses de variance moléculaire n’ont pas montré d’effet prépondérant de l’habitat sur la structuration des populations. A partir du cycle 2, nous avons donc isolé des tissus du xylème.

3. La succession de cycles d’aubergine sensible E8 induit une accélération de la progression de la maladie

Les incidences maximales (phase plateau en fin de cycle) sont plus faibles au cycle 1 (24 à 40% de plantes flétries à l’issue de 84 JAP), qu’aux cycles suivants (100% d’incidence pour le cycle 2 (72 JAP), le cycle 3 (70 JAP) et le cycle 4 (84 JAP)).Cette forte progression de la maladie sur l’aubergine sensible entre les cycles n’est pas corrélée avec les conditions de température et pluviométrie de la parcelle ; elle est probablement d’avantage liée à l’augmentation constante de la pression d’inoculum dans la parcelle.

4. L’adaptation des populations à l’aubergine sensible E8 se traduit par une diminution de diversité et l’apparition de nouveaux génotypes

On constate une nette diminution de la diversité génétique entre le cycle 1 (H.u.b.=0.251, G/N=0.076) et le cycle 2 (H.u.b.=0.173, G/N=0.016), suivie d’une stabilisation au cycle 4 (H.u.b.=0.192, G/N=0.013) ; cette chute de diversité est accompagnée de l’apparition de nouveaux haplotypes à partir du cycle 2 (Figure 11), et l’augmentation en fréquence de deux haplotypes principaux. Ces tendances évoquent un phénomène d’adaptation locale en cours. De façon intéressante, ce phénomène est observé sur chacune des 3 placettes E8. Nous avons voulu savoir si cette adaptation locale se traduisait par un gain d’agressivité des souches au cours des différents cycles. Des inoculations de souches Cycle 1 et Cycle 2 sur


E8 n’ont montré aucun gain significatif, les souches du Cycle 2 étant même légèrement moins agressives.

Figure 11. Diversité des haplotypes MLVA sur la parcelle du Vallon, sur tomate au cours du cycle 0 (« Farmer »), sur E8 au cours des cycles 1 (« 2012-E8 »), 2 (« 2013-E8 »), 4 (« 2014-E8 »), et sur E6 au cycle 1 (« 2012-E6 »).

Nous avons aussi testé l’hypothèse que les souches d’infections latentes sur E6 avaient, par compensation, perdu en agressivité sur E8 (trade-off). Les inoculations de telles souches sur E6 et E8 ont complètement infirmé cette idée, les souches E6 se montrant plus agressives sur E8 que les souches isolées d’E8. Ces résultats suggèrent plutôt que la pression de sélection de E6 aurait provoqué un gain d’agressivité général chez les populations de R. solanacearum pour réussir l’infection ; un tel phénomène évoque le gain d’agressivité sélectionné par une résistance quantitative, déjà observé sur la septoriose du blé (Zymoseptoria tritici) (Zhan et al., 2015), les rouilles, Phytophthora infestans sur pomme de terre (Pariaud et al., 2009).

Conclusion


Nous avons démontré sur ce dispositif que l’accession E6, porteuse du locus majeur Ers1, porte une résistance plus durable qu’attendue (5 cycles successifs de culture), qui se manifesterait par une diminution des populations pathogènes rhizosphériques.Ce phénotype de résistance pré-infection, s’il est confirmé lors d’études in vitro, pourrait faire l’objet d’études plus poussées, incluant une cartographie génétique de ce trait spécifique, la décomposition des différents facteurs impliqués, l’étude de son spectre d’efficacité sur les différents phylotypes du complexe d’espèces Ralstonia solanacearum.L’accession E6 pourrait donc être utilisée en mélange variétal pour limiter la dissémination de la maladie. Elle pourrait éventuellement être aussi associée à d’autres cultures suppressives en rotation de culture.Cette étude a également permis de mieux comprendre la dynamique de la population bactérienne dans une épidémie de parcelle sous pression de sélection.

Tâche 3.2. Diversité et contraintes évolutives sur les gènes bactériens d’avirulence et fitness sur aubergine

Le séquençage complet Illumina HISeq de 9 souches virulentes ou avirulentes sur E6 (dont 2 ont été isolées sur le dispositif d’évolution expérimental du Vallon, au Cirad Réunion, St Pierre) a permis d’accéder au répertoire complet d’effecteurs de type III sans a priori (50 à 73 effecteurs suivant les souches) grâce au « genome scan » proposé par la plateforme « RalstoT3E » (Peeters et al., 2013). Nous n’avons pas trouvé une association claire entre répertoire d’effecteurs de type III (T3E) et virulence sur E6 (Guinard et al., 2016). En mettant en regard ces données avec celles de phénotypage Ers1 (cf. Action 2), il apparaît cependant que la prévalence des gènes ripAX2, ripA1, ripC2, ripE2, ripS6, et ripP2 était différente entre souches avirulentes et souches virulentes (Tableau 9). L’avirulence sur ERs1 semble associée à la présence de ripP1 et ripAX2, mais aussi ripA1 (présents chez tous les avirulents Ers1, absents chez les virulents sauf une souche). Les génomes ont également été annotés automatiquement par la plateforme MicroScope (Vallenet et al., 2013) pour comparer les environnements génomiques de ces effecteurs. Ces résultats ont fait l’objet d’une note dans Genome Announcements : Guinard J, Vinatzer BA, Poussier S, Lefeuvre P, Wicker E: Draft Genome Sequences of Nine Strains of Ralstonia solanacearum Differing in Virulence to Eggplant (Solanum melongena). Genome announcements 2016, 4(1):e01415-01415.

Tableau 13. Fréquences des effecteurs de type III dans les génomes bactériens avirulents ou virulents sur Ers1

Famille Description AVIR (2 genomes) VIR (4 genomes)

RipA1 1 0.25

RipP2 (PopP2) ; Acetyl-transferase 1 0.25

RipAX2

Metallo-protéase avec un domaine de liaison zinc-dé-pendant

1 0.25

RipS6 1 0.5RipC2 0 (2 PS) 0.75RipE2 0 0.75

https://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/site/prj/T3Ev2/


Les analyses de sélection prévues sur les séquences d’effecteurs n’ont finalement pas été menées en 2015 faute de temps ; suite aux travaux menés au LIPM (cf. Tâche 3.3), nous nous sommes focalisés sur la diversité de l’effecteur ripAX2. Cet effecteur est majoritairement présent dans le phylotype I, et plus spécifiquement dans les populations africaines et asiatiques du phylotype I. Sur les 26 allèles protéiques observés à l’échelle mondiale, celui porté par GMI1000 est majoritaire (44 souches sur 73 porteuses du gène), et 13 autres donnent une protéine tronquée (Figure 12). Il serait cependant intéressant de phénotyper chacun des 12 autres allèles fonctionnels, pour identifier notamment les résidus critiques pour l’avirulence (cf. Tâche 3.3).


Figure 12. Alignement protéique de 22 des 26 allèles de RipAX2 identifiés dans la collection mondiale de Ralstonia solanacearum (91 souches). Chaque numéro d’allèle est accompagné de sa souche représentative, et le nombre de souches dans lesquelles il a été détecté. Les séquences protéiques ont été alignées (MUSCLE), et regroupées par la méthode FastTree. Le motif de fixation du Zinc (HEXXH) décrit par (Nahar et al., 2014) est grisé (positions 152-158). La séquence d’effecteur est considérée comme non-fonctionnelle (NF) si sa longueur est inférieure à 80% de la séquence de référence GMI1000 (219 amino-acids).

NFNFNFNFNFNFNFNFNFPROTPROTPROTPROTPROTPROTPROTPROTPROTPROTPROTPROTPROT

EFFECTOREFFECTOR


Tâche 3.3 Validation fonctionnelle des propriétés d’avirulence des effecteurs bactériens

Comme précisé dans le rapport d’activité de l’année 1 du projet, le stage de Jeremy Guinard au LIPM, sous l’encadrement de Nemo Peeters, a permis de mener deux types d’essais. Dans un premier temps, des clones d’Agrobacterium tumefaciens portant chacun un effecteur différent ont été inoculés sur E6 et E8 par infiltration dans les feuilles, afin d’observer une éventuelle réaction hypersensible, révélatrice d’une interaction classique effecteur d’avirulence/gène de résistance (Avr/R).Par ailleurs, l’ensemble des mutants d’effecteurs de type III disponibles dans la souche GMI1000 ont été inoculés par voie racinaire sur E6 (présence Ers1) et E8 (absence Ers1). Si la résistance Ers1 est liée à la reconnaissance d’un effecteur, un des 70 mutants devrait donc avoir un phénotype virulent sur E6 (Ers1). 18 mutants simples et 6 mutants multiples d’effecteurs ont ainsi été phénotypés sur E6 et E8. L’ensemble de ces tests nous a permis de phénotyper les mutants dans 41 des 71 effecteurs de la souche GMI1000. Nous avons identifié que le mutant simple dans RipAX2 était virulent à la fois sur E8 et E6.

Résultats

1. Individuellement, les ET3 de R. solanacearum n’induisent pas de réaction hypersen-sible par agro-infiltration des feuilles de l’aubergine résistante E6 comme de la sen-sible E8Les souches agro-infectieuses contenant un seul ET3 de la souche GMI1000 ont été infil-trées dans les feuilles d’aubergine résistante (E6) ainsi que dans les feuilles d’aubergine sensible (E8). Des symptômes de faible intensité ont été observés sur les plantes résistantes (E6) et sensibles (E8) 24 heures après inoculation (hai), 48 hai et 72 hai. Ce n’est qu’à 120 hai (J+5) que l’on commence à observer quelques chloroses très légères. Aucune nécrose caractéristique de réaction de mort cellulaire n’est observée, quelle que soit la date d’obser-vation. Il n’y a donc a priori pas d’HR après infiltration des différentes souches agro infec-tieuses exprimant chacune un seul ET3 de GMI1000, même à 48 hai où l’expression de la protéine est censée être maximale (N. Peeters, comm. pers., 2014).

2. RipAX2 est impliqué dans l’avirulence de R. solanacearum sur E6Les 10 mutants simples d’ET3 de la souche GMI1000 ont été inoculés par scarification raci-naire. Quatre plants d’aubergine résistante E6 et d’aubergine sensible E8 ont été inoculés par souche. La souche GMI1000 a aussi été inoculée en tant que témoin positif (E8 est sen-sible à GMI1000 alors que E6 est résistante). Des mutants multiples d’ET3 ont aussi été ino-culés afin de mettre en évidence une potentielle redondance fonctionnelle des effecteurs. Les taux de flétrissement finaux de la variété sensible sont très similaires entre les différents mutants testés : entre 75 et 100% des plants d’E8 ont flétri au bout de 12 jours après inocu-lation. Aucun symptôme n’a été observé sur les aubergines résistantes (E6) : ni pour la souche sauvage GMI1000, ni pour 18 mutants simples défectifs d’ET3, ni même pour les 6 mutants multiples. Cependant, la souche GRS359 mutée dans l’ET3 ripAX2 provoque un flétrissement final de 100% des plants d’aubergine résistante (E6). Ces résultats ont ensuite été confirmés par l’équipe de N. Peeters sur des effectifs de plantes plus importants, et dans plusieurs répéti-tions d’essai. Par ailleurs, le transfert de ripAX2GMI1000 dans la souche virulente PSS4 induit l’avirulence de cette souche sur E6 (figure 13).


Figure 13. Aubergines E6 et E8, 10 jours après inoculation par différents construits de GMI1000 et PSS4.

Pss4-384(Pss4::ripAX2)

Pss4 (ripAX2-)

GRS359-384(GRS359::ripAX2)

GRS359 (GMI1000ripAX2)

E8E6

GMI1000 (ri-pAX2+)


Des suivis de cinétique de croissance bactérienne intra-plante ont montré que le type sau-vage GMI1000 se multiplie beaucoup moins que le mutant sans ripAX2GMI1000 (3 magnitudes de différence) (Figure 14)

Figure 14. Croissance in planta des souches Ralstonia solanacearum GMI1000, Pss4, GRS359 (GMI1000 ΔRipAX2), GRS359::RipAX2 and Pss4::RipAX2 inoculés sur l’aubergine E6, 5 jours après inoculation. 11 plants ont été échantillonnés pour chaque souche.

Ces différents résultats spectaculaires indiquent collectivement que ripAX2 a une réelle fonc-tion d’avirulence sur la lignée résistante E6, et que la reconnaissance de ripAX2 par l’acces-sion résistante E6 se localiserait dans la tige.

D’après nos données, la virulence des souches sur E6 ne semble pas clairement associée à la variabilité allélique de ripAX2 ou à son environnement génomique. Il reste cependant à déterminer si les souches virulentes porteuses de RipAX2 expriment réellement le gène et sont capables d’injecter la protéine correspondante dans les cellules végétales.Ces résultats ouvrent donc la voie à plusieurs perspectives intéressantes qui pourraient être approfondies dans un ou des projets ultérieurs.


II – Les modalités de suivi du projet

- Etat du conventionnement avec les organismes tiersLes conventions de reversement CIRAD Armeflhor, CIRAD Technisem et CIRAD INRA ont été signées en 2015, ainsi que le contrat de Consortium entre les partenaires accompagné de l’annexe 4 sur les connaissances propres à chacune des parties qui comprend aussi le matériel végétal.

- Modalités de pilotage :o comités de pilotage :

Les dates, lieux et participants des différents comités de pilotage sont synthétisés dans le tableau ci-dessous.

INRA GAFLINRA Toulouse (LIPM)

TECHNISEM CIRAD ReunionCIRAD Montpellier, Dgdrd-dcaf-saurs

CIRAD Guyane

ARMEFLHOR Réunion

Réunion de lancement

20/03/2014

INRA Avignon, Domaine St Maurice, Montfavet

Marie-Christine DAUNAYPauline BORIES, élève ingénieur (INRA-GAFL/ISARA Lyon)S. LEPIOUFLE, gestionnaire de l’Unité

Nemo PEETERS

Chloé MOISSON

Jacques DINTINGERJeremy GUINARD (doctorant) Emmanuel WICKER

Christian LANGLAIS, chargé de valorisationDaniel SANNIE, chargé de la gestion financière de RESAUBER

Absent excusé (J. GUYOT)

Absent excusé (Guillaume INSA)

Réunion année 1 10/06/2015

Pole de Protection des Plantes, La Réunion

Marie-Christine DAUNAY (visio)Nemo PEETERS (visio)

Florine POIROUX(tel)

Jacques DINTINGERJeremy GUINARD (doctorant)Sylvia SALGON (doctorante) Emmanuel WICKER

Christian LANGLAIS(valo)Virginie AMELINE (gestion financière)

Jean GUYOT (visio)

Thomas DESLANDES

Réunion année 2 21/07/2016

INRA Avignon, Domaine St Maurice, Montfavet

Marie-Christine DAUNAY absent excusé

Morgane RAYNAL (visio)

Jacques DINTINGER (visio)Jeremy GUINARD (visio)Sylvia SALGON (visio)Emmanuel WICKER

absentsJean GUYOT (visio)

Thomas DESLANDES (visio)

Réunion finale 24/05/2017

Pole de Protection des Plantes, La Réunion

Marie-Christine DAUNAY (visio)Nemo PEETERS

Morgane RAYNAL

Jacques DINTINGER Sylvia SALGONEmmanuel WICKER

absentsJean GUYOT (visio)

Thomas DESLANDES

PARTENAIRES

Comités de pilotage Date Lieu

o autres modalités de pilotageLe pilotage des différentes actions a été assuré de la façon suivante :

CIRAD/Technisem : -Visite Florine Poiroux lors de ses congés en juin 2015-Stage de Morgane Raynal à la Réunion du 7 juillet au 8 août 2015-Plusieurs entretiens par skype pour la réalisation des essais au Cameroun-Plusieurs entretiens téléphoniques: points sur les inoculations, notamment.

CIRAD/Armeflhor : Réunions régulières (bimensuelles minimum) : discussion sur les protocoles, le calendrier des essais, les croisements et la production de semences backcross.

CIRAD/INRA Avignon :-Entretiens téléphoniques et échanges de mail réguliers avec MC Daunay, notamment en ce qui concerne la production du matériel végétal (production de semences des lignées d’haploïdes doublés). -Plusieurs visites à Avignon de J Dintinger sur la période 2014-2016.


CIRAD/INRA Toulouse : -Contacts réguliers principalement en ce qui concerne les travaux de thèse de J Guinard sur les effecteurs bactériens (collaboration étroite avec Nemo Peters) et ceux de S Salgon sur les facteurs de résistance chez l’aubergine (collaboration étroite avec Fabienne Vaillaud).Une participation au 6ème IBWS à Toulouse a eu lieu du 3 au 7 juillet 2016.

- Tableau de bord de suivi des moyens mis en œuvre

ANNEETRIMESTRE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A1 et 2. Production de semences (matériel génétique) x x x X X X X X X

A1. Phénotypage CoreTEP, typage moléculaire des populations pathogènes

A2. Mapping E8xE6La Réunion, 4 essais (4 saisons)

X X

A2. Mapping E8xE6Cameroun, 2 saisons

X X

A2. Mapping HD E8xE4 ( en remplacement des tests de générations)Cameroun, 2 saisons

X X

A2. Phénotypage générations E1, E2, E3, E4, E9 - La Réunion, 2 saisons X

A2. Production d'haploïdes doublés (2 pop HD produites)

A3. Suivi de durabilité de E6: Cycles culturaux E6 et E8 sur la parcelle "Le Vallon"

X (cycle

2)

X (cycle

3)

X (cycle 4)

X (cycle 5)

X (cycle

6)

X (cycle 6)

A3. Génotypage des populations R.solanacearum du champ (MLVA) X X

A3. Séquençage et analyses de sélection sur les gènes d'avirulence (effecteurs de type III, T3Es)

X X

A3. Validation de la fonction d'avirulence des T3Es X

LEGENDEACTION PREVUE

X ACTION REALISEE

X

X

X

ANNEE 1 (2014) ANNEE 2 (2015)

X X

X (Technisem) X (Armeflhor)

X

X X

X (Guyane)

ANNEE 3 (2016)


III – Bilan et perspectives

Ces points sont déclinés en détail dans la partie I : déroulement du projet action par action.

Globalement sur la réalisation des travaux programmés/calendrier :

- Les travaux de cartographie génétique sur la population RIL (E8 x E6) réalisés dans le cadre de la thèse de S Salgon durant la période du projet ont permis de finaliser la dissection de la résistance chez AG91-25 avec à la clé une publication :« Eggplant resistance to the Ralstonia solanacearum species complex involves both broad-spectrum and strain-specific quantitative trait loci » Salgon et al, 2017, Vol 8, Article 828, doi: 10.3389/fpls.2017.00828, frontiers in Plant Science.

Ces travaux ont révélé chez AG91-25 la présence d’un système oligogénique combinant un gène majeur et 2 QTLs généralistes ou spécifiques vis-à-vis des souches testées, et qui, au final, permet de contrôler une part importante de la diversité génétique du pathogène à la Réunion, mais pas au Cameroun. En effet, la résistance présente chez AG91-25 s’est révélée inefficace versus la souche RUN3598 dominante sur la station Technisem au Cameroun.

- Une inflexion importante du programme a été l’abandon fin 2015 des tests sur les générations programmées à l’origine au Cameroun et leur remplacement par les tests sur la descendance HD (E8 x E4) vis-à-vis de la souches RUN3598 (III), cela suite aux résultats obtenus sur la coreTEP montrant que E4 était l’accession ayant le meilleur niveau de résistance vis-à-vis de la souche camerounaise (test de la coreTEP sur la station de M’Fou). En effet, des tests sur les générations n’auraient pas apporté d’informations supplémentaires quant au potentiel de résistance chez l’aubergine et quant aux sources de résistance les plus prometteuses qui avaient d’ores et déjà été ciblées et fait l’objet du développement de populations HD.

La recherche de QTL réalisée en parallèle à la Réunion sur cette même population HD (E8 x E4) vis-à-vis de la souche PSS4 a permis de comparer les résultats dans les 2 sites et de repérer des QTLs communs aux 2 souches. Le déterminisme polygénique de cette résistance chez E4 ne permet pas d’envisager de l’exploiter aisément en sélection, au contraire du gène majeur Ers1. La poursuite de l’étude des résistances chez l’aubergine est nécessaire si on veut identifier 1 ou plusieurs facteurs majeurs de résistance exploitables en sélection, en combinaison avec Ers1 (mais également avec le gène cloné RE-bw, Xi’ou et al, 2014, si tant est que celui-ci soit disponible à l’avenir)

- Hors calendrier/planning du projet, des travaux de cartographie génétique engagés à la Réunion sur la population HD (E8 x E3) viennent compléter les résultats obtenus en vue de l’identification d’autres facteurs de résistance aux souches virulentes contournant le gène majeur Ers1. Les premiers résultats obtenus en chambre climatique suggèrent un déterminisme quantitatif de la résistance chez E3. Les résultats de 2 essais réalisés cette année sous tunnels restent à analyser pour y voir plus clair. Par ailleurs, la production de la population HD (E9 x E8) dans le cadre du projet nous permettra de poursuivre cette recherche de nouveaux gènes/QTLs majeurs de résistance aux souches virulentes.

- Les travaux qui ont été développés dans l’action 3 du projet ont confirmé tout l’intérêt d’utiliser la résistance présente chez AG91-25 pour contrôler la maladie à la Réunion, tout en restant prudent quant à la durabilité potentielle du gène majeur ERs1 et donc du risque qu’il soit contourné à plus ou moins long terme. L’hypothèse d’une interaction gène à gène entre RipAX2 et Ers1 a été renforcée par les travaux réalisés


à Toulouse, en grande partie dans le cadre du projet. Les bases génétiques et moléculaires de l’avirulence/virulence ne sont pour l’instant pas clairement établies et demanderaient de poursuivre des recherches par différentes approches sur cette question.

Références

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B – Compte rendu financier

Voir service Valo Cirad Montpellier

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