UE1. M RenaudinPhysiologie du développement des plantes

Le développement a deux aspects: l'ontogenèse, et la physiologie. Nous allons nous intéresser à ce deuxième aspect.

Notions de développement:

Les animaux, végétaux et champignons présentent beaucoup de similitude, ce qui est confirmé par les études génomiques. On parle d'unicité du monde vivant. Même si beaucoup de choses sont différentes: plans de développement, phénotypes, stratégies de reproduction…Voyons le cycle de développement classique:

Le développement de la plante correspond à l'établissement de plusieurs programmes spécifiques, que nous allons énumérer ici.Ce qui est remarquable par rapport aux animaux, c'est que la croissance végétative établit de nouveaux organes absents chez l'embryon, en plus de la croissance en taille. Cela s'explique par le fait que la plante est fixe. Elle doit ainsi subir les contraintes nombreuses de l'environnement. S'il existait des cellules souches ou des ébauches d'organes chez l'embryon, tout prêts et qu'ils étaient endommagés, la plante n'aurait aucun recours. En établissant les organes au fur et à mesure, elle se donne une certaine "plasticité" dans son développement, qui lui permet de faire face aux conditions extérieures. L'exemple classique est l'absence de cellules germinales chez les végétaux. Ce sont les méristèmes qui en changeant leur mode de fonctionnement vont construire les organes reproducteurs et le gamétophyte. Ainsi, la croissance végétative est très variable au sein de la même espèce. C'est le principe de l'organe jetable! Cela sert aussi à explorer le milieu extérieur, pour aller chercher lumière, nutriments dans le sol…De même la floraison est dépendante de facteurs internes (hormones…) et externes (température, lumière…). La plante "teste" les conditions extérieures pour savoir si elle a le temps d'assurer la fabrication de la graine, et la germination.Après libération de la graine, la plante (si elle est annuelle) ou l'organe seul (si la plante est vivace) entre en sénescence puis en abscission. La sénescence correspond au recyclage de l'organe (la plante récupère tout son contenu énergétiquement utile), ce n'est donc pas un phénomène passif. Il ne reste que la lignine, cellulose et autre, à faible valeur énergétique. Puis survient l'abscission, qui correspond à la chute de l'organe sur le sol. C'est aussi un phénomène actif qui correspond à la modification de la paroi des cellules (subérine?).La raison d'être de la graine est double: dissémination et organe de survie. En effet, de nombreuses espèces ont développé des stratégies de disséminations, soit grâce à des insectes ou oiseaux disséminateurs (baies…) soit grâce à des "graines volantes" (pissenlit…). La graine est aussi une forme de survie pour l'embryon, grâce à des structures de protection et des réserves, qui permettent d'attendre les bonnes conditions de germination.Après l'abscission, la plante entre en dormance, qui est un état de vie ralentie entretenu. C'est là encore un programme actif. C'est un programme de protection, notamment contre la déshydratation. L'exemple type est l'arbre à feuilles caduques en hiver.La plantule est un organisme hétérotrophe, qui dépend des réserves de la graine, qui ne sont pas inépuisables. Elle est donc très fragile. Son établissement nécessite lumière et enracinement. L'étiolement est un programme qui fait passer toute l'énergie de la croissance dans la tige, pour aller chercher la lumière. Cela se traduit par une plante qui n'a pas de photosynthèse (car elle manque de lumière donc ça ne servirait à rien).

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Sénescence

graine

plantule

Plante adulte (stade végétatif)

Stade reproducteur

germination

Croissance végétative, organogenèse

Induction florale

Fécondation, embryogenèse

La croissance végétative est sous le contrôle (entre autres) du tropisme. C'est un ensemble de programmes visant à orienter la croissance, en réponse à un signal extérieur asymétrique. On parle de phototropisme positif pour la tige et négative pour les racines, de gravitropisme positif pour les racines et négatif pour la tige.Un autre programme important lors de la croissance végétative est la ramification. Elle est très variable selon les espèces et les facteurs extérieurs. Elle est la résultante de la dominance du méristème apical caulinaire sur les méristèmes latéraux, mais aussi du tropisme (recherche de la lumière…).La croissance végétative permanente touche les organes mais aussi les tissus fonctionnels, pour la croissance en épaisseur. Ainsi le cambium qui donne le xylème et le phloëme. Même le méristème est une structure qui peut être néoformée par dédifférenciation cellulaire. C'est la base de toute culture cellulaire: on prend un protoplaste (cellule dont on a digéré la paroi) isolé sur un milieu nutritif. Après quelques divisions, on obtient un cal (massif de cellules), qui pourra donner rapidement un méristème, puis une plante entière! On peut même induire le développement d'un embryon à partir du protoplaste de départ!C'est la totipotence des cellules végétales: capacité des cellules végétales somatiques à changer d'état de différenciation ou à se dédifférencier pour s'engager dans d'autres programmes de développement. C'est le principe du bouturage, des vaisseaux néoformés en cas de blessure… Bien sûr cette capacité de dédifférenciation est dépendante de la nature de la paroi cellulaire (cellulose, lignine, subérine).

Voyons quelques signaux qui commandent l'établissement de ces programmes de développement. On peut les ranger en deux classes: Contraintes abiotiques: lumière, eau (potentiel hydrique), température, stress mécaniques, ce qui induit

tropisme, croissance orientée. Contraintes biotiques: pathogènes, insectes, herbivores, blessure qui induit synthèses de protéases et autres

molécules spécifiques, modifications parois, croissance orientée, apoptose autour du point d'infection, organogenèse pathologique (galles) ou symbiotiques (mycorhizes, nodules).

Ces signaux externes vont induire une cascade de signalisation (à partir de récepteurs spécifiques), ce qui va mettre en place le programme spécifique.

Les signaux internes sont l'ensemble des hormones végétales. Ce sont de vraies hormones, sécrétées par un tissu, transportées jusqu'à une cellule cible ce qui induit une réponse spécifique. Mais contrairement aux animaux, le transport peut être très court, et de plus, il n'y a pas de glandes sécrétrices spécialisées. Les hormones sont fabriquées un peu partout dans la plante mais de façon plus importante dans certains organes, qui apparaissent ainsi "spécialisés".Ce sont tout de même des composés actifs en tant que messagers et à faible concentration (nM à M). Ce sont des composés endogènes à la plante qui induisent bien une réponse. On parle donc bien d'hormones.La réponse au niveau macroscopique est l'établissement d'un programme de développement. Au niveau moléculaire, les hormones se fixent à des récepteurs protéiques, ce qui induit une cascade de signalisation (transduction du signal), pour aboutir au contrôle de l'expression de gènes spécifiques et/ou au contrôle enzymatique, de canaux ioniques… On parle de phytohormones.Il existe une nuance de vocabulaire: les régulateurs de croissance sont tous les produits qu'on peut ajouter de l'extérieur, utilisés par l'homme, qui agissent sur la croissance. Cela peut être de vraies phytohormones ou des produits chimiques autres. On parle de substances de croissance qui constituent les régulateurs de croissance et les hormones végétales (?).

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Les hormones végétales sont des médiateurs entre les signaux externes et le programme de développement établi. D'autres programmes que ceux déjà cités sont mis en œuvre chez la plante: métabolisme (primaire: synthèse de sucres, d'acides aminés, lipides et secondaire: pigments, produits dérivés…), économie d'eau (au niveau des stomates), arrêt de croissance (protection, réserves, déshydratation). D'autres programmes apparaissent plus "intégrés": formation des graines et des fruits, qui mettent en jeu la dormance, réserves, maturation, croissance…Chez les végétaux, les hormones sont très souvent de petites molécules non protéiques. On connaît depuis longtemps 5 grandes classes d'hormones: Les auxines La cytokinine L'acide gibbérellique L'acide abscissique L'éthylène.De nouveaux produits découverts plus récemment sont aussi des phytohormones, mais leur rôle est moins connu. On parle alors de composés mineurs: stéroïdes, composés terpéniques divers, acide salicylique (issue du saule, comme l'acide acétylsalicylique = aspirine!), mais aussi de petits peptides.Il est courant d'appliquer des hormones de façon exogène pour induire la réponse voulue (floraison tardive, croissance/maturation des fruits…)

L'auxine:Elle a été découverte au début du 20ème siècle, grâce aux travaux de Darwin sur le phototropisme.Chez les graminées, il existe un organe chargé de protéger les primordium de feuilles de la plantule, la coléoptile. Cette coléoptile a une croissance importante, qui accompagne d'abord la croissance des feuilles, avant d'être déchiré. Darwin a travaillé sur cette coléoptile et sur son phototropisme:

Darwin a mis en évidence que seulement une zone réduite, la zone d'allongement, est à l'origine de cette croissance (zone pointillée). Il a eu l'idée de masquer l'apex à la lumière, avec un cache opaque. Une coléoptile dont l'apex est masqué ne présente plus de phototropisme. Il a alors émis l'hypothèse qu'il y a dans l'apex un signal produit et qui oriente la croissance de la coléoptile.La croissance orientée se fait par croissance différentielle du côté non éclairé. On parle d'auxèse grandissement cellulaire).Ces travaux ont été poursuivis par Went qui a identifié ce facteur. Pour cela il a coup l'apex de la coléoptile et l'a déposé sur un bloc d'Agar, substance hydrophile qui va s'imprégner des substances sécrétées par ces apex.

Cette substance est l'auxine, appelée comme cela car elle stimule l'auxèse, c'est à dire le grandissement cellulaire dans la zone de croissance.

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Croissance verticale si lumière symétrique Mise en évidence du

phototropisme du coléoptile avec une lumière asymétrique

ApexAGAR

Coléoptile sans apexpas de croissance

le "facteur de croissance" du coléoptile est donc bien passé dans l'Agar.

La substance qui diffuse dans le bloc d'Agar induit bien la croissance orientée du coléoptile.

C'est un médiateur important dans les phénomènes de tropisme. Elle est fabriquée par les tissus jeunes de l'apex des tiges et descend le long des tiges pour stimuler d'autres organes. En plus de ce mode de transport latéral, ces expériences mettent en évidence un mode de transport latéral, qui explique le tropisme qu'elle induit.Pendant longtemps, on a dosé l'auxine par bio essais, grâce à sa capacité à induire la croissance différenciée. On comparait l'angle de courbure avec une gamme étalon.

D'un point de vue métabolique, le nom chimique de l'auxine est l'acide indole 3 acétique (IAA). Elle est issue du tryptophane. C'est une métabolite simple de part sa formule chimique et part sa voie de biosynthèse. Seulement deux enzymes permettent de la fabriquer à partir du Trp. Les animaux savent en fabriquer (mais pas pour le même rôle!). il existe plusieurs formes d'auxines naturelles, comme l'indol 3 butyric acid (IBA), mais aussi des auxines de synthèse, qu'on utilise comme régulateur de croissance en agronomie (comme de 2,4D).Les hormones (pas seulement l'auxine), peuvent être naturellement inactivée par conjugaison: elles sont greffées sur des molécules de sucres ou des aa, ce qui les rends inactives. Ainsi, le taux d'hormone libre active dépend de la synthèse, de la dégradation mais aussi de la conjugaison. Ainsi, dans une graine, on trouve très peu d'auxine libre (dormance), contrairement à la plantule.On ne connaît pas de mutant pour l'auxine, car c'est une hormone trop importante pour le développement. Un mutant auxine - ne pourrait germer. C'est pour cela que malgré une voie de biosynthèse simple, on ne connaît pas encore les gènes codant pour les enzymes. De plus, il existe plusieurs voies de biosynthèse, soit à partir du Trp, soit plus en amont encore. Au moins 4 voies ont été identifiée (sans qu'on connaisse les gènes). On les a mis en évidence grâce à des marquages au TRp-14C ou autre, ce qui donne des intermédiaires marqués. De plus, ces différentes voies se croisent à plusieurs endroits, ce qui ne simplifie pas les choses! Mais en général un tissu ou une cellule choisira une voie préférentielle, par soucis d'économie. d'un point de vue général (organisme entier), la multiplicité des voies de synthèse, la multiplicité d'enzymes permet une grande plasticité, une grande capacité d'adaptation et enfin une régulation très fine de ces voies, chaque enzyme étant sensible à différents facteurs.Il faut savoir que certaines bactéries savent fabriquer de l'auxine, ce qui leur permet d'entrer en interaction avec les végétaux. Ainsi, la formation de galles, correspond à une libération d'auxine de façon circulaire, par des bactéries ou larves d'insectes. l'utilisation de ces bactéries en agronomie est très importante.Par exemple Pseudomonas est responsable de la galle de l'olivier. elle agit par sécrétion d'auxine circulairement.Mais d'autres bactéries sont plus pernicieuses. Elle induit la formation de tumeur chez le végétal infecté. Elle agit par transformation génétique, en transférant une partie de son plasmide dans le génome de la cellule végétale. Cette cellule va ainsi produire de l'auxine endogène, ce qui va déclencher la prolifération cellulaire, d'où la tumeur.Grâce à elle, on peut réaliser "facilement" des OGM, en conservant les séquences de transferts (le tDNA) de son plasmide Ti (tumor inductor) mais en changeant les gènes transférés (résistance à maladie à la place de production d'auxine…).

L'auxine a plusieurs rôles: Rhyzogenèse: allongement et ramification de l'appareil racinaire. Stimulation de l'activité des cambium et leur différenciation en xylème et phloëme. Stimulation des zones de croissance de la tige (phototropisme). Croissance des fruits (le fruit correspond à la transformation de l'ovaire après la fécondation). En traitant des

fleurs à l'auxine, on peut induire la formation du fruit sans graine (sans qu'il y ait eu fécondation).L'auxine détermine la dominance apicale dans le végétal (l'axe principal a un développement plus rigoureux que les axes secondaires). Elle inhibe ainsi le développement des bourgeons latéraux (elle n'a pas qu' un rôle activateur).

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L'auxine est aussi déterminante de la force d'appel de sucres dans les organes puits pour le glucose. Ce mécanisme est mal connu.

Voyons un peu plus en détail le phénomène de régulation de la dominance apicale par l'auxine:

Le rameau vertical est orthotrope (vertical) et vigoureux par rapport aux rameaux secondaires plagiotropes (obliques). La décapitation entraîne la levée de la dominance apicale.Si en plus de la décapitation on applique sur le rameau orthotrope de l'AIA, on conserve la dominance apicale.

L'auxine issue du bourgeon principal est transportée vers le bas et empêche les bourgeons latéraux de se développer. (On ne connaît pas son mode d'action précis).

C'est la seule hormone qui subit un transport actif et polarisé de cellule à cellule. Ce n'est pas un transport vasculaire, par la sève brute ou élaborée. Cette polarisation est très importante dans le fonctionnement intégrée de la plante.

Pour mettre en évidence ce transport, on peut réaliser des expériences avec le l'AIA marquée (14C) sur l'apex de la tige:

Ce transport actif nécessite de l'énergie (ATP) fournie par la photosynthèse ou la respiration. Si on traite l'apex avec du cyanure (inhibe la production d'ATP par la mitochondrie) ou par des agents découplants (de la photosynthèse dans les chloroplastes), on observe rapidement l'arrêt du transport d'auxine.

Le transport d'auxine est assez rapide, de l'ordre de 1cm/h. On connaît des inhibiteurs biologiques directs de ce transport.

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Décapitation

AIA-14CPar découpage longitudinal, chaque tranche de la tige mettra en évidence le transport vers le bas de l'auxine.

AIA-14CAucun transport vers le haut de l'apex.Ce n'est donc pas u ne diffusion passive ou même facilitée de l'auxine selon la gravité mais bien un transport actif polarisé.

Système d'influxSystème d'efflux

COOH

COOH

COO-

COOHCOO-

COOHCOO-

L'auxine est aussi transportée latéralement. Cela explique le phototropisme latéral du coléoptile (vpc).

L'auxine se concentre au niveau des tissus jeunes, pour induire la division des cellules (ici le cambium de la tige).

L'auxine est une petite molécule légèrement hydrophobe, car issue du Trp. Elle peut donc diffuser facilement à travers la membrane. Cela est supprimé par des systèmes très performants de polarisation du transport.Un dosage à l'échelle de l'organe de l'auxine est ridicule. Il faut un dosage à l'échelle du tissu ou même d'une cellule à une autre pour étudier ses effets.

Deux systèmes de transport existent pour l'auxine: le transport d'influx et le transport d'efflux.

L'auxine peut être ionisée ou non selon le pH (COOH/COO-). Le pH de la paroi est de 5, le pH cytoplasmique à 7.5. Ainsi, le système d'influx transport l'auxine protonée (CCOH) et le système d'efflux l'auxine ionisée COO-. Cette spécificité aide à la polarisation du transport.Par ce système, le transport d'auxine suit les courbures des tissus, comme au niveau du méristème apical racinaire, où elle "remonte".

Ces transporteurs ont été purifiés grâce à la génétique moléculaire chez Arabidopsis thaliana. En traitant des lots de

graines par des agents mutagènes comme les UV, RX, EMS ou par mutagenèse insertionnelle ou par transposon, on obtient des lots de graines. Ces graines sont semées et on observe quelques

phénotypes mutants pour le transport de l'auxine. l'analyse génétique de ces mutants permet de cibler le gène muté (grâce à la séquence insérée connue…). On peut alors le cloner et étudier la fonction de la protéine…

Voyons le principe de la mutagenèse insertionnelle:

L'insert entraîne une perte de fonction pour le gène. On observe alors le phénotype mutant. On peut retrouver cet insert grâce à une sonde spécifique, donc retrouver le gène impliqué dans le phénotype mutant.

Le phénotype mutant qui nous intéresse est le même que la plante sauvage traitée aux phytotropines.

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[auxine]

tige

Phloème Cambium XylèmeNon fonctionnel Fonctionnel Fonctionnel Non fonctionnel

P P

insert

gène

Les inhibiteurs du transport de l'auxine sont les phytotropines, appelées ainsi car elles perturbent le tropisme de la plante. Elles inhibent le transport d'efflux. Elles modifient ainsi le gradient haut/bas et latéral. Ce sont des composés de synthèse mais aussi des régulateurs naturels. Ces régulateurs sont des flavonoïdes, stockés dans les vacuoles. Le traitement par des phytotropines d'une plante induit la perturbation du pattern des vaisseaux. Cela nous indique que l'AIA est nécessaire pour leur bon établissement.Grâce à ces études génétiques, on dispose maintenant d'anticorps dirigés contre ces transporteurs et on peut voir par immunocytochimie leur répartition (vérification du modèle).

Ces transporteurs constituent une famille multigénique. Ce sont différents transporteurs ce qui permet de redistribuer l'auxine selon l'axe haut/bas mais aussi latéralement.Dès l'embryogenèse, ce transport polarisé et différentiel de l'auxine va induire le développement de l'embryon. cela permettra notamment la mise en place des cotylédons.

Comment l'auxine induit le grandissement cellulaire:On incube des fragments de tiges jeunes dans un milieu nutritif contenant de l'auxine. On observe un

allongement rapide du tronçon. Ce mécanisme nécessite du sucre (les tiges jeunes ne sont pas photosynthétiques), une traduction protéique importante. On contrôle cela avec le milieu nutritif: ajout de cycloheximide inhibe la traduction pas d'allongement. L'allongement nécessite aussi des cellules turgescentes (pour déformer la jeune paroi) (la plasmolyse des cellules empêche leur grandissement). L'ajout d'auxine entraîne l'abaissement du pH pariétal. Cette acidification seule (sans auxine) suffit pour induire le grandissement cellulaire. C'est la croissance acide du végétal. L'auxine stimule la croissance par acidification de l'apoplaste. Cela correspondrait à l'activation d'enzymes qui permettraient un remodelage de la paroi donc le grandissement cellulaire.L'auxine active des pompes à protons de la membrane plasmique ce qui cause une hyperpolarisation. Cela active les enzymes impliquées dans le grandissement de la paroi ainsi que l'entrée de K+.L'auxine agit sur un récepteur, ce qui entraîne une hyperpolarisation. Mais on ne connaît pas la voie de transduction induite par ces récepteurs.Le pH cytoplasmique est régulée par des pompes à protons. Si le cytosol s'acidifie, les ATPases s'activent. On a donc un contrôle enzymatique.

L'auxine contribue à acidifier le cytoplasme (pas systématiquement) et le milieu externe. Il existe des mécanismes possibles d'action de l'ATPase. Toutes les actions de l'auxine ne passent pas uniquement par les ATPases. L'hyperpolarisation est due à un système de transport d'ions modifié par l'auxine.

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Cytosol

Activité ATPasique du plasmalemme

pH6,5 7,57

Le récepteur (ABP: auxin binding protein) à l'auxine (IAA) est extracellulaire. Une fois qu'il a complexé l'auxine, il se fixe à son récepteur membranaire (ABP-receptor), ce qui induit la cascade de transduction.

ABP a été purifiée:1980: recherche de protéines affines pour l'auxine: 14C-IAA sur des fractions subcellulaires de coléoptile de maïs. Ils ont purifié ABP1, une protéine membranaire affine pour l'auxine. Grâce à la séquence protéique de ABP1, ils ont pu déduire la séquence génomique, puis cloner le gène. Grâce à un marquage par anticorps, ils ont pu localiser ABP1 au niveau subcellulaire.

ABP1 est une protéine de 20 kD, d'environ 200aa. La séquence est assez conservée dans les différentes espèces végétales. Il y a trois boîtes où la séquence est la plus conservée. Ces séquences se terminent par un signal KDEL qui prouve que la protéine est résidente du réticulum endoplasmique. Sur le plan fonctionnel, de nombreuses évidences montrent que l'ABP est active sur la mpl.

On a une hyperpolarisation des protoplastes en quelques secondes, selon la dose d'auxine. cette réponse est inhibée par le blocage des ABP (anticorps), quel que soit [IAA]. On retrouve le contrôle en ajoutant de l'ABP au milieu.Ces macromolécules agissent sur la membrane plasmique. Le récepteur ABP se trouve à plus de 90% dans le RE et un peu localisé sur la mpl où il joue son rôle de récepteur. La manière dont il sort du RE n'est pas connue, mais il y a toujours la séquence KDEL présente.Parfois, certains Ac contre le récepteur se comporte comme l'auxine sur le récepteur selon un effet dose. L'ABP est une structure hydrophile qui n'est pas enterrée dans la membrane. Elle est accrochée à l'extérieur sur une protéine d'ancrage (ABP-R).

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Modèle schématique de quelques chaînes de réponses élémentaires de l'auxine au niveau de la membrane plasmique.

ABP

IAA

ABP

IAA

ATPase

H+

Canal K+ entrant

K+

Canal anionique voltage-dépendant

Cl-

?

?

pH

Expression de gènes spécifiquesélongation, division…

ABP-R

Ac anti ABP

Ajout de ABP

Control

Log [IAA]

ddp (mV)0

-10

10 nM 1 M

L'auxine induit aussi l'expression de gènes spécifiques nécessaires au grandissement cellulaire. Ce mécanisme est assez général à toutes les hormones, qui peuvent agir en stimulant ou en inhibant l'expression des gènes.On incube des segments d'épicotyles de Pois dans l'eau avec de l'auxine. On observe alors un allongement. On extrait les ARNm et on recherche des gènes à expression précoce. A t+10 minutes après ajout de IAA, les transcrits précoces augmentent de façon significatives, contrairement au gène contrôle. Des gènes sont exprimés très rapidement par stimulation à l'auxine.

Pour comprendre l'action de l'auxine, on regarde les gènes d'expression précoce. Chez Ar.th. on a trouvé plus de 20 familles de gènes spécifiques répondant à l'auxine.La famille des gènes AUX/IAA (gènes précoces de réponse primaire) codent pour de petites protéines de moins de 20kD, à faible durée de vie. C'est à dire que soit leur ARNm sont instables soit la protéine à un faible turn-over. En ajoutant de la cycloheximide (inhibiteur de la traduction), on va ralentir la traduction, ce qui va stabiliser les ARNm, soit au final nous permettre d'observer l'expression de ces gènes (car au final on augmente la traduction). D'autres familles de gènes sont aussi sensibles à l'auxine, comme les SAUR, ACJ, GH2-4 like.La famille des AUX/IAA code pour des facteurs de transcription impliquée dans la réponse secondaire. La famille SAUR (Small auxine up RNAs) code pour une protéine qui régule la signalisation calmoduline-Ca2+. La famille GH3 a une fonction inconnue. La famille ACJ code pour des enzymes comme l'ACC synthase (impliquée dans la synthèse de l'éthylène). La famille GH2-4 like code pour des enzymes de détoxification (réponse au stress dû à l'auxine).

Grâce à la famille des AUX/IAA, on peut faire deux choses: Quel est le lien entre l'auxine et le gène primaire? On a des séquences en Cis spécifiques sur le promoteur

qui confèrent une spécificité de la réponse. Quelle réponse en cascade déclenche le gène primaire? On connaît les séquences qui confèrent leur

spécificité grâce à des expérience sur le promoteur:

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Auxine

Récepteur Expression de gènes spécifiques (facteurs de transcription…)

Expression d'autres gènes

Grandissement cellulaire

Réponse précoce (min)

Réponse tardive(hr)

Gène primaireRécepteur

AuxinePromoteur

Promoteur (2000 pb) Gène rapporteur (Gus)+ IAA

Délétion en 5' du promoteur activité gène rapporteur?

+

+

-

-

Informations spécifiques

Ces informations spécifiques de réponse à l'auxine sont communes à toutes les familles vues plus haut. C'est un motif TGTCTC.Les gènes précoces sont composés de deux éléments: Un élément qui permet la transcription du gène quel que soit le signal (non spécifique) Un autre qui joue un rôle inhibiteur sur le premier. L'auxine lève cette inhibition spécifiquement, d'où la

spécificité de réponse.L'élément TGTCTC est un inducteur constitutif de l'expression du gène.Ce sont des éléments composites AURE (auxine responsive element). Ces promoteurs agissent en fixant des facteurs de transcription en trans qui permettent la transcription. Ce sont les ARF (auxine response factor).

Ce sont des protéines nucléaires. Ces domaines s'associent en dimères: homodimères (ARF/ARF; AUX,IAA/AUX,IAA), ou hétérodimères (AUX,IAA/ARF).Cela contrôle (stimulation ou inhibition) l'expression des gènes secondaires.La réponse à l'auxine est importante pour la construction de la plante.

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NI II III IV

C

N C

DNA binding domain

AUX/IAA

ARF

Il apparaît clairement que l'auxine active des gènes primaires (AUX/IAA, Saur) qui sont des facteurs de transcription. Ces gènes vont induire une cascade de régulation transcriptionnelle. On a vu que dans les gènes AUX/IAA on a des domaines conservés qui vont permettre la dimérisation des produits de ces gènes, pour former des homodimères AUX/IAA - AUX/IAA ou hétérodimères AUX/IAA - Saur, ou ARF. Les gènes ARF ne sont pas vraiment inductibles par l'auxine. on ne connaît pas trop tout cela. Les dimères peuvent être activateurs ou inhibiteurs sur beaucoup de gènes variés. On connaît beaucoup de mutants de gènes de réponse à l'auxine liés au développement de la plante. On montre ainsi le caractère essentiel de l'auxine dans le développement.Au stade plantule, l'auxine inhibe la croissance racinaire (rhizogenèse ). Cette action se fait par activation de la ACC synthase (gène primaire de réponse), qui va fabriquer de l'éthylène. Cette hormone inhibe alors la rhizogenèse (vpl). La sensibilité à l'auxine est variable selon le stade de développement.

Les cytokinines:

A l'origine, elles ont été découvertes grâce à l'avancée des techniques de culture in vitro. En effet, autant la racine peut pousser sur des milieux assez simples, autant pour faire pousser des parties aériennes in vitro il faut ajouter au mieux de l'auxine, au pire d'autres substances. On a découvert que l'ADN de sperme de hareng a un pouvoir mitogène important qui permet la croissance du fragment de tige. La substance active est la kinétine. On a cherché et trouvé la molécule équivalente chez les végétaux: les cytokinines. On l'a mise en évidence dans des tissus à forte activité mitotique, comme les embryons. On observe que l'auxine et la cytokinine induisent la mitose alors que si on met seulement de l'auxine ou seulement de la CK (cytokinine) on a un pouvoir mitogène limité.On a beaucoup travaillé avec du lait de coco, car c'est un albumen liquide (albumen solide constitue le râpé de coco) qui contient donc beaucoup de CK (l'albumen est un tissu très actif).Il existe deux CK principales: la zéanite et l'isopentényladénine IPA.Les cytokinines sont des adénines substituées par un groupe isopenténylpyrophosphate.

La cytokinine active est la forme sans ribose.La biosynthèse est simple, en une seule étape enzymatique. L'IPT est l'isopentényl transférase. Cette enzyme est caractérisée par son activité pais le gène endogène est toujours inconnu.Les cytokinines peuvent aussi être fabriquées par des pathogènes bactériens ou fongiques. Cela forme une galle. Les galles correspondent à une croissance anarchique du tissu, soit ce qu'on obtient in vitro avec un cal. Cela correspond à la synthèse de IPA et d'auxine par le pathogène. Ainsi Agrobacterium tumefaciens transfère son plasmide Ti (tumor inductor) au génome de la plante. Ce plasmide contient principalement trois gènes:

Cela a été mis en évidence par des constructions: A+B+C+ donne des tumeurs indifférenciée (cal // galle) A+B+C- donne une tumeur avec des racines rôle rhizogène de l'auxine A-B+C+ donne des tumeurs avec des tiges rôle de stimulation des bourgeons de la cytokinine.Agrobacterium transfère le gène de la IPT bactérienne, mais l'IPT végétale reste inconnue.

Les cytokinines induisent une mitose importante, de façon synergique avec l'auxine. Et elles stimulent la formation de bourgeons feuillés (contrairement à l'auxine). En effet, la CK s'oppose à la dominance apicale. Les cytokinines sont fabriquées par les racines jeunes, soit établissement d'un gradient du bas vers le haut de la plante, opposé à celui de l'auxine. la CK est transportée par la sève brute, par le xylème. Mais la CK peut aussi être fabriquée par des fruits… Les CK s'opposent à la dominance apicale, contrairement à l'auxine:

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Ribose

Adénine

IPP

PAdénosine monophosphate (AMP)

+ IPP IPA

IPT

A B C

Auxine IPT

L'application de CK sur un bourgeon va entraîner la levée de l'inhibition apicale par l'auxine, soit la croissance du bourgeon.

On ne connaît pas grand chose au mode d'action de l'IPA: récepteurs, transduction, gènes primaires de réponse…Les cytokinines contrôleraient la machinerie des gènes du cycle cellulaire (cdc2, cyclines…).Il faut noter que la cytokinines peut être stockée de façon inactive, sous forme conjuguée.

La cytokinine induit aussi une différenciation des chloroplastes, en présence de lumière. Elle accélère leur différenciation à la lumière. Cette action se fait par activation de la transcription de la machinerie photosynthétique.La présence de cytokinine permet au tissu d'attirer les nutriments (important pour réguler la compétition entre les organes puits de la plante comme fruits/racines). On peut réaliser une expérience de marquage avec 14C-Leu. Cet acide aminé marqué sera incorporé et pompé comme un nutriment normal.

La cytokinine induit une force d'attraction des nutriments vers les organes qui en ont besoin. Dans la même expérience, on peut aussi faire bouturer la tige (racines), on aura alors Leu qui reste à droite (CCK produite endogène Leu reste à droite car ya pas de raison d'aller à gauche- c'est trop fatigant;-)L'appel de nutriments se fait par expression des transporteurs du glucose, acides aminé, meilleure énergisation de la membrane (gradient H+ augmenté…).

La cytokinine est anti-sénescente. Si on met une feuille jaune (sénescente) dans du terreau, en présence de cytokinine, elle reverdit rapidement. On utilise souvent une cytokinine synthétique, la benzylaminopurique.On verra plus tard des hormones qui activent la sénescence (éthylène).On ne sait pas comment la cytokinine agit ici.Cette action antisénescente est utilisée par des pathogènes. En effet, on peut observer sur des feuilles naturellement jaunes, des spots verts. Cela correspond à la production et diffusion de CCK par le pathogène, les tissus verts pourront le nourrir.

Si on surexprime le gène IPT de Agrobacterium dans une plante, on obtient une plante tout à fait torturée, avec des ramifications très abondantes (pas d'inhibition apicale), sénescence très retardée, anomalies florales, problèmes de croissance racinaire… Ce phénotype mutant très varié (effets pléiotropes) indique que la cytokinine joue un rôle primordial dans le développement de la plante. Des mutants incapables de produire la CK ne pourront pas pousser. (comme on avait pour l'auxine).En biotechnologie, on utilise IPT agrobacterium exprimée avec un promoteur tissu-spécifique pour limiter la sénescence (des fleurs par exemple).

12

14C-Leu

La Leu marquée envahit la feuille de droite puis passe à gauche.On ajoute de la kinétine à gauche: on accélère le passage de Leu à gaucheOn ajoute de la kinétine à droite: on ralentie le passage de Leu à gauche.

IAA

(-)

(-)(-)

CK

(+)(+) IPA

IAA

Les gibbérellines:

Au Japon en 1925, on étudiait une maladie du riz dit de la "plante folle", qui est caractérisée par un grandissement des tiges du riz jusqu'à cassure. Cette maladie est due à un champignon, Gibberella fujïkoroi qui provoque ces symptômes par la production d'une toxine, la gibbérelline.Cette molécule est aussi produite par les végétaux supérieurs. Ce composé provoque l'allongement des tiges et est synthétisé par des agents pathogènes. Les gibbérellines sont des diterpènes (C20) qui sont des composés terpéniques. Ce sont des structures hydrophobes. On connaît 125 gibbérellines différentes dont 10 chez les champignons, 100 chez les végétaux et 15 communes. Elles sont notées de GA1 à GA125.C'est la même séquence mais avec des modifications des chaînes latérales. Les GA sont actives avec un hydroxyle sur le C3 et inactives quand il est sur le C2. Cela est dû à la reconnaissance par les récepteurs.La voie de biosynthèse est connue:

Il existe beaucoup de GA qui ne sont que des intermédiaires de la voie de biosynthèse mais ils ne sont pas tous actifs. Les GA1 et GA3 sont les plus actives. Il existe un très grand nombre d'enzymes impliquées dans la biosynthèse. Quand une enzyme manque, on n'a alors pas de GA actives, mais on a quand même un développement de la plante. Ce sont des hormones non essentielles.

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Kaurène GA12 aldéhydeOxydation + hydroxylation

GA1 + GA3

Voie de Biosynthèse des terpénoïdes

Pyruvate + Glycéraldéhyde-3-P

1-deoxyxylulose-5-P

Isopentényl-diPIPP

Acide mévolonique

PolymérisationDiméthylollyl-diP Cytokinines

Geranyl-diP

Farnésyl-diP

Geranylgeranyl-diP Kaurène

GA

Squalenne Brasimostéroïde

Phytoène Acide abscissique

IPP

IPP

IPP

PlasteCytosol

C5

C10

C15

C20

C30

C40

Monoterpène

Sasquiterpène

DiterpèneGroupe prényls

Triterpène(stérols)

Tetraterpène (caroténoïdes)

GA

Saccharose

Tige de Pois excisée

Paille courte Paille longue

Sucre

Il existe des inhibiteurs qui sont des retardateurs de croissance. Ils inhibent des enzymes de la voie de biosynthèse des GA (avant et après le kaurène).Par exemple le paclobutrazol, ancymidol, tetcyclaris.Si on bloque la synthèse au niveau du kaurène, on modifie aussi les autres voies terpéniques. On a donc une communication entre les voies du plaste et cytosolique.Les GA sont synthétisées dans les organes jeunes; les jeunes feuilles, racines et les graines en formation. Dans les feuilles et les racines, on a quelques dizaines de ng de GA par gramme de MF. Dans les graines, environ 50g/gMF.Ces GA sont transportées dans toute la plante par la sève brute et la sève élaborée. Il existe des formes conjuguées: les glucosides qui sont des GA associées à une partie sucre. Ce sont des formes de stockages, de transport, de dégradation, mais inactives.

Les GA agissent surtout sur l'allongement des parties aériennes: les tiges. Au niveau cellulaire, cela repose sur l'auxèse (expansion cellulaire), mais dans de nombreuses espèces les GA ont un effet sur la mitose (cycle cellulaire). Ce phénomène est connu depuis longtemps grâce à des plantes naines. Ce sont des plantes normales en organisation mais la tige est plus courte, mais avec le même nombre d'entrenœuds mais une distance plus courte entre chaque. Chez le pois, on connaît 7 variétés naines donc 7 locus différents. Quand on les traite avec des GA, on a une croissance normale, donc ils ont un défaut dans la biosynthèse des GA. Parmi ces 7 locus, 5 interviennent dans la biosynthèse. Le locus Le code pour une enzyme (3hydroxylase), qui hydroxyle GA20 en GA1. On fait des bio essais pour mettre en évidence la fonction d'une molécule.Le sucre n'a aucun effet sur l'allongement.Les GA seules permettent un allongementmodéré. Les deux ensembles permettent unallongement *5!

Les retardateurs de croissance bloquent la biosynthèse des GA:

Les retardateurs de croissance évitent la cassure de la tige.L'allocation des assimilas est meilleure dans les grains, ce qui explique l'utilisation des retardateurs de croissance?

L'auxine provoque aussi un allongement, mais pas par les mêmes mécanismes. Elle agit par l'acidification de la paroi, contrairement aux GA. Les gibbérellines permettent un relâchement des parois (extensibilité). Il existe des liens entre ces deux hormones. L'auxine permet la synthèse de GA, donc l'allongement des tiges (rôle complémentaire).

Métabolisme des GA:

14

GA19 GA20

GA1 active

GA29

GA8

GA29 catabolite

Feuille en croissance

GA20 *(inactive)

Plus de GA1GA8 peu forméeGA1 et GA8

présentes

On observe un ralentissement de la croissance des entrenœuds car on a enlevé

la source d'auxine.(on peut doser les GA présentes. On

se rend compte que GA1 et GA8 disparaissent progressivement).

On peut fixer sur l'apex un bouchon de cire contenant de l'auxine. On observe alors un allongement normal, ainsi que GA1 fort.

L'auxine permet une augmentation de l'expression du gène qui code pour la 3hydroxylase. Cela a un effet sur l'auxèse qui s'ajoute aux effets des GA ainsi induites.

Les gibbérellines agissent aussi comme activateur de floraison. Les plantes naines fleurissent moins vite que les plantes normales. Les retardateurs de croissance peuvent aussi retarder le programme de floraison. On accélère la floraison en ajoutant des GA. Chez les plantes ligneuses (: conifères), on a une apparition de fleurs sur les parties végétatives.Les signaux activateurs de floraison sont externes (lumière…), et internes à la plante. Ces signaux internes sont par exemple l'augmentation des GA.Quant le méristème végétatif reçoit assez de GA, il devient méristème d'inflorescence. Il n'existe pas vraiment de "florigène", ou hormone de la floraison. Il s'agit en fait d'un ensemble de facteurs, dont font partie les GA ainsi que de facteurs nutritifs.Toutes les plantes ne réagissent pas aux GA externes, mais toutes réagissent aux GA internes. En fonction de la concentration en GA, on a une réponse saturante.

15

Les gibbérellines permettent aussi la germination de la graine. Elles permettent de lever la dormance, permettent la mise en place du métabolisme des réserves, et l'auxèse.Les GA favorisent la synthèse d'enzymes d'hydrolyse de l'amidon, soit les amylases (qui libèrent des blocs de 5 à 7 glucoses) soit des phosphorylases (qui libèrent du maltose, c'est à dire deux glucoses). Les GA augmentent surtout l'expression des amylases. Des facteurs externes propices à la germination sont détectés par la graine en dormance, ce qui induit la synthèse de GA qui activent le programme de germination.Cela a été très étudié chez les céréales. Toutes les enzymes de catabolisme des réserves sont synthétisées par une couche de cellules périphérique, la couche à aleurones. Il s'agit en fait de 2 ou 3 assises de cellules. Les enzymes migrent alors vers le centre de la graine, l'albumen (appelé "endosperm" en anglais).Les hydrolases sont des gènes de réponse primaire aux GA.Le promoteur du gène de -amylase a des motifs de reconnaissance aux GA. On parle de GRE pour GA responsive element. (par analogie aux AURE de l'auxine).La couche à aleurones peut être facilement disséquée et digérée pour donner des protoplastes en culture in vitro. Ce sont des cellules à dominance sécrétoire. Ce modèle est très utiliser pour étudier la voie de transduction des GA.

Les GA permettent aussi le développement des fruits. Elles induisent la transformation de la fleur en fruit. Cela dépend de l'espèce. Certaines espèces répondent bien aux GA (crucifères, comme A.th.) mais d'autres sont plus sensibles à l'auxine (tabac). On peut arriver à induire le développement du fruit à la place de la fleur même s'il n'y a pas eu fécondation. On obtient un fruit parthénocarpique, c'est à dire que le carpelle donne la chair du fruit mais que les ovules ne peuvent donner des graines.

On ne connaît pas le récepteur aux GA, mais on sait qu'il existe. Leur action est très rapide pour l'induction des gènes primaires, ce qui suggère qu'il n'y a que peu d'intermédiaire.

Apports de la génétique moléculaire:BA, ABA et éthylène ne sont pas des hormones essentielles. On peut trouver des mutants sans ces hormones ou insensibles, et qui sont viables, contrairement à auxine/cytokinines. Les plantes naines [GA-] sont tout à fait normales sur les autres points de vue que la taille. On connaît plusieurs phénotypes mutants: Plante naine:

Défaut de synthèse des GA (la mutation est complémentée par traitement aux GA): gène ga1. Plante insensible aux GA (pas de complémentation par traitement): gai (insensible). GAI (i) est un

régulateur transcriptionnel négatif de d'autres gènes. Plante anormalement grande, comme si on traitait le sauvage avec des GA. C'est le mutant spy pour spindly,

en forme de fuseau. Il présente une réponse exagérée aux GA endogènes. Cela peut être un mutant touchant un inhibiteur de la biosynthèse ou un inhibiteur de la voie de transduction. SPY est un inhibiteur de la voie de transduction des GA, impliqué dans la modification post-traductionelle des protéines, ce qui a pour effet d'inhiber la formation de facteurs de transcription…

Dans les années 50-70, on a parlé de "Révolution verte". Cela correspond à l'époque de l'explosion des rendements de culture, grâce à la sélection de céréales à paille courte (donc plus d'épis par hectare), qui sont [GA-] (gai-like), du point de vue synthèse et transduction.

Acide Abscissique ABA:

Elle a été purifiée en 67, après de longues recherches. Les auteurs s'intéressaient à la dormance et à l'abscission (chute des feuilles, fleurs, fruits).Le modèle d'étude de l'abscission est le fruit du cotonnier, le modèle de dormance est le bourgeon d'érable.Des extraits organiques induisent la dormance ou l'abscission d'un organe. On parlait de "dormine" et d' "abscissine".ABA n'est que faiblement impliquée dans l'abscission, sauf chez quelques espèces. C'est surtout l'éthylène qui est responsable de l'abscission. ABA est surtout impliquée dans la dormance.La dormance est un programme actif d'arrêt du développement et de protection. ABA est spécifique aux végétaux terrestres, ce qui est logique.Du point de vue métabolique, il est issu d'un sesquiterpénoïde (C15), qui sera converti en caroténoïde (C40) dans les plastes puis en ABA (plastes et cytoplasme).Il existe des formes conjuguées de ABA, avec de sucres notamment.

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On connaît des mutants déficients ABA qui présentent un phénotype caractéristique: flétrissement rapide car défaut d'économie d'eau. On observe en effet que les stomates sont toujours ouverts. Mais on a aussi levée de la dormance des graines. Ainsi, les graines peuvent germer sur la plante mère. On parle de viviparité, soit les mutants vp. Si la mutation est suffisamment en amont dans la chaîne de biosynthèse, on peut avoir un défaut de coloration de la graine (: caroténoïdes). C'est souvent le cas chez le maïs. ABA est impliquée dans la gestion de l'eau (protection contre le stress hydrique) et mise en dormance d'organes (bourgeons et graines).On connaît des inhibiteurs de la voie de biosynthèse, ce qui inhibe la formation des caroténoïdes et ABA. La plante sauvage traitée par ces inhibiteurs va donner un phénotype mutant [ABA-].

Réponses physiologiques à ABA: Réponses au stress hydrique: (manque d'eausynthèse ABA)

Fermeture des stomates: chute de la transpiration. Limitation du flux de sève brute: idem.ABA induit l'ouverture de canaux K+ du xylème racinaire. Ainsi, cela diminue l'absorption d'ions donc d'eau donc le flux de sève brute. En effet, si le sol manque d'eau, ça ne sert à rien d'absorber des ions qui peuvent devenir toxiques si trop concentrés. Rhizogenèse de sécheresse: pour aller chercher l'eau plus profond dans le sol. Tolérance à la dessiccation: protection physique (écailles, téguments) et synthèse d'osmolytes pour

diminuer le potentiel hydrique de la plante (si sol diminue, il faut que plante diminue pour encore pouvoir absorber de l'eau). ces osmolytes sont des protéines ou des sucres.

ABA n'est pas toujours sécrétée, seulement en conditions de stress. Réponse au stress salin: correspond à sol trop bas, comme un sol trop sec. La réaction est la même que pour

un stress hydrique. Réponse à la blessure: la cicatrisation est favorisée par l'action de ABA. Tolérance au gel: les cristaux de glace déchirent les tissus. La plante fabrique en conditions de gel des

protéines antigel ou des osmolytes pour faire chuter son (une solution concentrée gel moins facilement). Mais cela demande une période d'adaptation à un froid modéré. C'est la période d'endurcissement, pendant laquelle ABA est fabriquée pour permettre la mise en place des mécanismes de résistance. ("hardening" en anglais)

Développement de l'embryon: ABA inhibe la germination précoce et active la dormance, et permet la résistance à la dessiccation.

(la dormance est levée par les gibbérellines, c'est un bon exemple d'antagonisme des ces hormones, sur la graine). Dormance des bourgeons: idem. Cela est très compliqué et mal connu. ABA n'agit pas seule ici. Cas particuliers: production de trichomes (poils, pour limiter transpiration) ou épines (feuilles modifiées,

pour diminuer surface de transpiration), en cas de sécheresse. Elle permet aussi la morphogenèse des plantes aquatiques, et elle est une réponse aux pathogènes (cicatrisation).

17

ABA est capable d'activer un très grand nombre de gènes, les ABRE (ABA responsive elements). Des conditions de stress induisent ces gènes (vpc).Ces gène sont par exemple les gènes Lea: late embryogenesis abundant protéins. Ce sont des protéines accumulées en grande quantité dans les graines en fin de développement, sous l'action de ABA. Elles sont des protéines de réserves et de résistance à la dessiccation.Mais les protéines Lea peuvent s'accumuler dans d'autres organes de la plante, si un stress les induit.On ne connaît pas le récepteur à l'ABA.On connaît quelques seconds messagers de la voie de transduction. On peut étudier cela sur deux modèles: Cellules de garde des stomates (ABAplasmolyse de ces cellulesfermeture des stomates). On peut

préparer des protoplastes de ces cellules de garde et étudier la réponse à ABA. Germination: car ABA inhibe la germination. On peut faire facilement des analyses génétiques de

descendances.

ABI3: chez A.th., il s'agit d'un équivalent du Maïs VPI (vivipare, vpc). Ces gènes codent pour des facteurs de transcription qui peuvent activer des gènes ABRE. Si ABI3 est muté, la graine ne pourra plus répondre à ABA sur la germination résistante à ABA.

ABI2 et ERA2: codent pour des enzymes. ABI2 code pour une protéine phosphatase de type 2C, ERA2 pour une farnésyl transférase. Ce sont des éléments de la cascade de transduction. ABI2 et ERA2 sont exprimés à la fois dans la graine et dans le stomate. abi2 et era2 ont un fonctionnement modifié des stomateset des changements au niveau de la graine. La plante ABI2- présente un flétrissement rapide et une entrée en dormance ralentie. ERA2- présente une meilleure économie d'eau (-30% transpiration), sans effet sur la croissance. Cela représente des applications en biotechnologies intéressantes.

On sait que l'ouverture des stomates est contrôlée par des canaux ioniques. On pense que ABI2 (la phosphatase) contrôle leur ouverture.

ABA ne peut pas être utilisée par traitement exogène. Mais l'intérêt biotechnologique réside dans le contrôle de la réponse à ABA (voir ERA2).

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%germination

[ABA]M

Mutants:ABAI: plantes insensibles à ABA.

Graines sauvages.

ERA (enhanced response to ABA): hypersensibles

ABA RécepteurABI2

ERA2

Voie "stomate"

Voie "graine"ABI3

Ethylène

C2H4: H2C=CH2

C'est un gaz. C'est la seule phytohormone pour laquelle on connaît le récepteur. On sait depuis longtemps (début du siècle) que l'éthylène agit sur les plantes: révolution industrielle: charbongaz, éthylènesymptômes. Mais cela ne suffit pas pour dire que c'est une hormone.L' éthylène induit: Défoliation: perte des feuilles (abscission) sans sénescence (la feuille reste verte). Sénescence: le feuille peut jaunir avant de tomber. Epinastie: la feuille penche vers le bas. C'est réversible.On a mis en évidence que les tissus végétaux contiennent de l'éthylène. On a cherché à mettre en évidence le système enzymatique car on était pas sûr que l'éthylène est fabriqué par la plante.Le modèle d'étude est la maturation du fruit. On peut doser l'éthylène par chromatographie en phase gazeuse. Certaines espèces contiennent beaucoup d'éthylène en début de maturation: tomate, banane, pomme, poire…Mais des fruits n'en fabriquent pas: poivrons, agrumes, raisin.L'éthylène pourrait servir à quelque chose en rapport avec la maturation ou pourrait être un déchet.

La production d'éthylène est accompagnée d'un pic de respiration du fruit. On parle de crise respiratoire ou crise climactérique. On parle ainsi de fruits climactériques. On ne peut pas dire avec ces données que l'éthylène est un déchet.On cueille un fruit climactérique non mûr et on le laisse mûrir en présence d'éthylène: on accélère ainsi la maturation.Le modèle fruit a servi pour mettre en évidence les enzymes de biosynthèse de l'éthylène. lors du pic de respiration, on a pu cloner ces enzymes:

SAM: S-adénosyl méthionine. L'ACC synthase était appelée EFE: ehtylene forming enzyme.C'est une voie de biosynthèse simple. LA voie spécifique à l'éthylène commence à ACC synthase, car SAM représente une plaque tournante entre plusieurs voies métaboliques.ACC synthase et oxydase sont très régulées car c'est là que se régule la synthèse d'éthylène. L'éthylène n'est pas régulé dans son action (récepteur…) car il est très diffusible (gaz). Il s'échappe facilement de la plante et doit toujours être fabriqué.

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Production éthylène Respiration

tdvlpt

maturation

Méthionine

SAM synthase

ATP ADP+Pi

SAM (méthionine

activée)ACC synthase

CH3-S-Ado

ACCACC oxydase

Ethylène

AVG AIB

(-) (-)

Les gènes de ces enzymes ont été clonés par criblage différentiel entre fruit mûr et non mûr.Il existe des molécules de synthèse qui inhibent ces enzymes: AVG et AIB. On les utilise énormément pour étudier l'effet de l'éthylène sur tel ou tel mécanisme. On peut aussi inhiber l'action de l'éthylène par des sels d'argent: Ag2+ bloque les récepteurs.On dispose de molécules solubles, comme l'étéphon, qui peuvent libérer de l'éthylène quand elles sont en solution acide. Ainsi, on peut traiter une plante à l'éthylène sans avoir à s'embêter à contrôler la teneur de la serre en éthylène. On peut aussi traiter une plante par l'ACC, le précurseur physiologique.

Effets de l'éthylène: L'éthylène accélère la maturation des fruits climactériques. Des approches transgéniques de perte de

fonction de ACC synthase et oxydase, par stratégie anti-sens ont permis de l'étudier. Un fruit [ACC synthase]- ne pas va mûrir. Si on ajoute de l'éthylène, on permet le mûrissement. Mais chez le sauvage, le fait d'ajouter de l'éthylène ne permet pas d'accélérer la maturation.

Un des gènes de réponse à l'éthylène est les gènes des enzymes de sa synthèse: on dit que l'éthylène est auto-catalytique. Le phénomène s'amplifie.On connaît les enzymes impliquées dans ces différentes voies de réponse à l'éthylène, par des approches anti-sens ou de mutation. On a établi un modèle de contrôle de la maturation par l'éthylène:L'éthylène est toujours présent mais les tissus du fruit immature y sont insensibles. La maturation correspond au fait que le tissu devient sensible à l'éthylène. Le phénomène s'amplifie par le pouvoir auto-catalytique de l'éthylène. On ne connaît pas bien le signal qui rend le fruit sensible à l'éthylène. On sait juste que cela correspond à une baisse du taux d'auxine.C'est le fruit qui fabrique l'éthylène. On peut donc cueillir le fruit climactérique non mûr et le laisser mûrir. Pour les fruits non climactériques, la maturation est aussi éthylène dépendante mais on pense que l'information qui déclenche la synthèse d'éthylène provient d'un autre organe, comme les feuilles.En matière de voie de transduction, ABA et éthylène possèdent de nombreuses interactions.

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Ethylène

Récepteur

Transduction du signal

Contrôle de l'expression de gènes de réponse (ERE)

Augmentation de la production d'éthylène

Changement du métabolisme des parois cellulaires (ramollissement du fruit)

Production de caroténoïdes colorés (mûrissement apparent)

Perte des chlorophylles et des thylakoïdes(chloroplasteschromoplastes

Synthèse de nouveaux arômes et saveurs (dissémination du fruit)

Pic de respiration (crise climactérique)

L'éthylène dans certaines espèces peut stimuler la floraison, la production de poils absorbants, peut inhiber la croissance racinaire, inhiber l'expansion foliaire. L'effet sur la floraison est utilisé sur l'ananas: un traitement à l'etephon des fleurs pourra accélérer leur développement donc l'obtention des fruits. Dans les pays tropicaux, la méthode traditionnelle veut qu'il faut faire des feux à proximité des arbres: on s'est rendu compte que la fumée contenait de l'éthylène.L'éthylène est surtout inducteur des fleurs femelles: dans une plante à sexes séparés, un traitement à l'étéphon induit un nombre important de fleurs femelles, au dépend des fleurs mâles. Cela est utilisé par exemple pour le concombre, car on pourra obtenir des fruits parthénocarpiques (sans fécondation).

D'une façon générale, l'éthylène induit la sénescence et l'abscission des végétaux. Cela peut être la réponse à un programme de développement (chute des feuilles à l'automne) ou pathologique (réaction de défense). Cet effet touche les feuilles, les pétales sépales et étamines après la fécondation, et les graines et fruits.

L'éthylène est fortement inductible par des stress environnementaux: froid, excès d'eau du sol, pathogène, blessure… Ce genre de stress va induire l'activité des enzymes de la voie de biosynthèse de l'éthylène, ce qui induira la réponse par des gènes spécifiques. Mais l'éthylène est fabriqué normalement par la plante en conditions physiologiques.

Ces effets de l'éthylène se font pas activation de gènes de réponse primaire à l'éthylène. On connaît des motifs sur les promoteurs de ces gènes, qu'on appelle ERE pour ethylen responsive element (l'équivalent de AURE pour auxine). On connaît des facteurs qui se fixent à ces séquences pour les activer: EREBP pour ERE binding protein. (l'équivalent de ARF pour auxine).

On connaît des mutants en relation avec l'éthylène: Le sauvage peut répondre à un signal Certains mutants répondent même en absence de signal: mutants constitutifs ou hypersensibles. D'autres ne peuvent répondre au signal: mutants insensibles.Cette approche a été déjà détaillée avec les autres hormones étudiées.La réponse à l'éthylène étudiée ici est la "triple réponse": inhibition de la croissance racinaire, crosse apicale exagérée, hypocotyle plus épais et plus court au noir (pas d'étiolement). Ce phénotype se voir au stade plantule, en présence d'éthylène.Après avoir soumis des graines à un traitement mutagène, on les fait germer en présence d'éthylène ou non. Les plantules qui présentent une triple réponse en présence d'éthylène sont WT, celles qui ne présentent pas de réponse à l'éthylène sont dites insensible: mutants ein (ethylen insensible). Les plantules qui présentent la triple réponse même en absence d'éthylène sont hypersensibles, comme par exemple ctr: constitutive response.On a ainsi identifié de nombreux gènes de réponse à l'éthylène, impliqués dans tous les effets de l'éthylène (pas seulement sur la plantule, mais aussi chez l'adulte).

Les mutants hypersensibles: Fabriquent de l'éthylène. Ce sont les mutants eto: ethylene overproducer. Les enzymes de synthèse de

l'éthylène ne sont plus réprimées. Sensibilité accrue à l'éthylène: ctr: constitutive triple response.Les mutants insensibles: Mutants de biosynthèse pour l'éthylène: on ne peut pas les voir avec ce type d'expérience. Mutants qui ne perçoivent pas l'éthylène: ein.On a cloné les gènes mutés et on est remonté dans beaucoup de cas à la fonction du gène.

EIN1 est un récepteur à l'éthylène, aussi appelé ETR1 (ethylene receptor). La mutation est dominante. Par comparaison de séquence, on voit des homologies avec des récepteurs bactériens et de levure dits récepteurs à deux composants. C'était surprenant de retrouver ces récepteurs chez les eucaryotes supérieurs. C'est la partie Ct de EIN1 qui ressemble à un récepteur à deux composants.

C'est le récepteur à 2 composants qui sert à la transduction du signal. On parle de récepteur à 2 composants car il porte un domaine d'auto-phosphorylation His kinase, le sensor, qui induit un changement de conformation et qui transmet la phosphorylation au domaine régulateur de la réponse, pour activer la cascade de transduction.

21

Nt Ct

Récepteur à 2 composants

Partie Nt fixant l'éthylène, à 3DTM

Ces deux composants peuvent être fusionnés en une seule protéine (comme c'est le cas ici), ou séparés (souvent chez la bactérie): la protéine régulatrice étant soluble.Ce type de récepteur agit en se dimérisant.

On connaît plusieurs récepteurs: 5 gènes, dont EIN1. Certains récepteurs n'ont pas de régulateur. On pense que cette partie peut être soluble cytosolique ou que le senseur d'un récepteur active le régulateur de l'autres (par la dimérisation de deux récepteurs différents).Les mutations touchent le domaine NT de liaison à l'éthylène ou le linker avec le domaine His kinase. On n'a donc plus de fixation de l'éthylène ou plus de transduction du signal.Ces mutations sont dominantes. Cela sous-entend que la dimérisation de deux récepteurs sauvages est nécessaire.On a cherché des mutants révertants, c'est à dire des mutants de ces mutants, qui retrouvent une réponse normale à l'éthylène. On a mis en évidence des révertants intragéniques, c'est à dire que la réversion se fait sur le même gène que la mutation initiale. La première mutation touche par exemple la partie Nt du récepteur, ce qui empêche l'éthylène de se fixer. Si une deuxième mutation touche le domaine du récepteurs à deux composants, on complémente la mutation, voir on a une activité constitutive de réponse.Cela s'explique par le gène CTR1: il code pour une protéine kinase Ser/Thr. Il fait partie des MAPKKK (l'équivalent de Raf des animaux).CTR1 se fixe au récepteur et empêche la transduction du signal qui se ferait par défaut. La fixation de l'éthylène sur le récepteur EIN1 entraîne le relargage de CTR1, soit l'activation de la voie de transduction de l'éthylène. Si le récepteur est muté, CTR1 ne peut pas s'y fixer, et on a donc transduction du signal (même s'il n'y a pas de signal). C'est le révertant hypersensible ou constitutif. On n'a donc plus besoin de l'éthylène: la mutation sur Nt est donc silencieuse.

Une mutation ctr1 entraîne ainsi une réponse constitutive à l'éthylène. on vérifie ainsi ce modèle.

On connaît d'autres mutants ein plus en aval dans la voie de transduction mais les MAPKKK et MAPK restent inconnues.

On sait que EIN3 active EREBP.

22

N

C C

Sensor His kinase

Partie régulatrice

P

Transduction

Mutation

Mutation

Ethylène

Récepteur

MAPKKK ?

MAPK ?

Transcription des gènes de réponse primaire

CTR1(-)

Le phénotype triple réponse a une signification biologique. En effet, si la germination se fait dans un sol compact, la plantule va fabriquer de l'éthylène ce qui va induire un hypocotyle épais pour pousser le sol, augmenter la croissance de la tige (étiolement) pour percer, et ce n'est pas la peine d'ouvrir les cotylédons avant d'avoir atteint la surface.

D'un point de vue évolutif, la voie de transduction de l'éthylène est très comparable à ce qui se passe chez S. cerevisiae, en cas de stress hyperosmotique. Dans cette situation, elle se met à fabriquer du glycérol pour rééquilibrer l'osmoralité intracellulaire. C'est une protéine de type récepteur à deux composants qui détecte cette hyperosmolarité. Dans ce cas, c'est le récepteur qui active directement un facteur cytosolique qui s'avère être la MAPKKK. Il n'y a pas de facteurs équivalents à CTR1.En séquençant le génome de A. thaliana, on a mis en évidence plusieurs autres récepteurs à deux composants, sans connaître encore le signal détecté par ces récepteurs.

Les stéroïdes végétaux

On parle de brassinostéroïdes, car ils ont été mis en évidence chez les brassicacées. Dans les années 70, on s'intéressait aux hormones qui pouvaient contrôler la croissance du tube pollinique. A partir de 250 kg (!) de grains de pollen de brassicacées on a purifié la brassinolide, principal hormone stéroïde végétale.

Ces hormones induisent l'allongement des tiges, inhibent la croissance racinaire, et peuvent activer la sénescence.La voie de synthèse de ces hormones passe par la synthèse des stéroïdes: catastérone et brassinolide. On a trouvé beaucoup de mutants pour cette voie de biosynthèse, ce qui nous a permis de connaître toutes les enzymes.Le phénotype mutant déficient pour les stéroïdes est une plante naine au noir (pas d'étiolement). A la lumière, on a des phénotypes nains avec des feuilles, comme un petit choux. On peut isoler des mutants insensibles, hypersensibles, pour la voie de biosynthèse…La plante doit toujours fabriquer des stéroïdes pour s'établir.

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Les effets de la lumière

Le rôle principale de la lumière est celui de la nutrition par le biais de la photosynthèse. Les végétaux sont phototrophes du point de vue de l'énergie et autotrophes du point de vue du carbone.Cette importance vitale de la lumière permet d'expliquer son rôle dans le développement et la croissance des plantes. Ce rôle de la lumière se fait pas des mécanismes totalement différents de ceux de la photosynthèse. La lumière agit sur le développement des végétaux par l'intermédiaire de photorécepteurs, qui agissent comme des récepteurs aux hormones. La lumière est vue comme un signal, comme une hormone.Les chlorophylles et les caroténoïdes sont les récepteurs à la lumière pour la photosynthèse.Toutes les lumières n'ont pas le même effet sur le développement et la croissance, selon leur . On distingue trois types de récepteurs, selon la fenêtre de adsorbée: Rouges: proches et lointains. Les photorécepteurs à ces sont les phytochromes. Bleus et UVA (proches): les cryptochromes sont les récepteurs. Les UVB (lointains): les photorécepteurs restent inconnus.Ces photorécepteurs sont communs à tous les végétaux. Les champignons ne sont seulement sensibles à la lumière bleue. Ils ne possèdent donc que les cryptochromes.On a caractérisé récemment une flavoprotéine qui sert de récepteur à la lumière bleue, en plus des cryptochromes.Les animaux aussi présentent des réponses à la lumière, en plus de la vision. Les cryptochromes sont universels à tous les eucaryotes pluricellulaires.

Les réponses à la lumière: Photomorphogenèse: la lumière contrôle l'acquisition d'une forme particulière. C'est l'étiolement. Cultivée à

l'obscurité, une plante utilise toute sa croissance dans la tige. Les feuilles ne sont pratiquement pas développées. La plante ne verdit pas (pas de différenciation de l'appareil chloroplastique). Cet étiolement disparaît si on replace la plante à la lumière. L'étiolement est un programme de croissance. La lumière inhibe le programme d'étiolement. Elle empêche l'allongement des tiges, stimule l'expansion des feuilles et la différenciation des chloroplastes. Toutes les peuvent induire l'inhibition de l'étiolement, donc tous les récepteurs. La même réponse sera induite par des récepteurs différents. On retrouvera ce principe souvent.

Croissance des tiges: la quantité de lumière et son orientation peut influencer la croissance des tiges, en dehors du programme d'étiolement. Une plante en présence de peu de lumière grandit beaucoup, alors qu'une plante en conditions de lumière importante grandit moins. (on retrouve le rôle inhibiteur de croissance de la lumière). C'est le phototropisme des plantes: croissance orientée par une lumière asymétrique. Cela permet (agronomie) le couvert végétal uniforme:

La bonne connaissance de cette croissance permet de calculer la meilleur densité de semis. (les tiges à l'ombre des autres poussent plus vite, ce qui permet de fermer le couvert végétal).Cela permet aussi la croissance par évitement de l'ombre (chade avoidance response):La longueur d'onde de la lumière est modifiée en traversant le feuillage du premier végétal. Cette modification est captée par le deuxième végétal, qui met alors au point un croissance différenciée qui lui permet d'éviter son voisin.

Le phototropisme est principalement induit par la lumière bleue. Elle permet une distribution asymétrique de l'auxine (vpc et vpl).

Rythmes de développement: floraison, germination, sénescence, débourrage des bourgeons… Ces programmes sont induits par le programme génétique de la plante mais aussi par les facteurs environnementaux. Parmi ces facteurs, la lumière joue un rôle très important. C'est la photopériode qui est importante, c'est à dire la durée d'ensoleillement journalier. Ce n'est pas seulement la durée de la photopériode qui est détectée par le végétal, mais aussi le fait de savoir si elle augmente ou diminue d'un jour à l'autre:

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photopériodeLe fait de détecter la variation de photopériode d'un jour à l'autre permet au végétal de savoir en quelle saison il est.

Ce sont des cycles circannuels qui sont mis en jeu ici.Ce système de mesure repose sur un photorécepteur (phytochrome et cryptochrome) et un oscillateur (inconnu) qui permet de garder en "mémoire" la durée de la photopériode du jour précédent.La température est aussi utilisée secondairement à la lumière comme indicateur climatique. Très souvent, la température agit dans le photopériodisme. Ainsi la floraison, débourrage des bourgeons et la germination ont lieu (pour la majorité des plantes en régions tempérées) quand la photopériode augmente (printemps), mais aussi après avoir subit une période de vernalisation, c'est à dire quand la T°C a été pendant quelques jours assez basse (0-5°C). La lumière induit aussi la synthèse de pigments terpéniques (caroténoïdes) et de flavonoïdes (anthocyane).

Ils servent à protéger la future machine chloroplastique des UV agressifs. Synthèse de lignine (métabolisme proche de celui des flavonoïdes). Rythmes biologiques: il s'agit ici de rythmes circadiens (jour-nuit). Certaines activités sont modifiées selon

le jour ou la nuit:

On peut voir que les oscillations continuent pendant la nuit: il existe un oscillateur qui mesure la variation jour/nuit. A la nuit, l'oscillateur continue à fonctionner. On peut mettre la plante de façon prolongée à l'obscuritéon observe un décalage progressive du rythme.Le photorécepteur sert à reseter l'oscillateur. On pense que sont les cryptochromes.Par exemple, certaines espèces ouvrent leur fleurs à l'obscurité, ou encore la croissance en hélice de la tige de haricot.Les gènes de la photosynthèse sont aussi exprimés selon un rythme circadien.

La lumière induit aussi la fermeture des stomates: ils sont ouverts le jour et fermés la nuit (turgescence des cellules de garde), car la photosynthèse n'est pas possible. (les stomates permettent les échanges gazeux de la photosynthèse). La lumière bleue agit encore ici de façon prépondérante. Ce n'est pas un rythme circadien car il n'y a pas d'oscillateurs.

Photopériodisme et vernalisation:Cela a permis de mettre en évidence les phytochromes. Dès 1920 des expériences sur des variétés de tabac adaptées au SUD des USA: ils ne peuvent pas fleurir au Nord des USA.rôle de la photopériode, car les jours sont plus longs au Nord.La floraison est possible si et seulement si la photopériode est inférieure à un seuil.D'une façon générale, on classe les pantes en trois groupes: Les plantes jour-long (fleurissent au printemps) Les plantes jour-court (fleurissent en automne) Les plantes jour-indifférent.C'est la lumière rouge qui induit le mieux la floraison.

Grâce à ces études, on a pu mettre en évidence les phytochromes.

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Activité rythmique

jour nuit

C'est la lumière rouge proche qui est actif. Tout se passe comme si la plante voyait l'éclairement bref comme un rallongement du jour.Si on fait un deuxième éclairement après le premier, en rouge sombre, on annule l'effet du premier. Il existe un pigment qui perçoit les deux , et qui fonctionne de façon réversible. C'est le phytochrome.

Fr: far red=rouge lointain

C'est le Pfr qui est actif.La nuit, le phytochrome n'est pas actif. Le jour il l'est.

Le phytochrome est naturellement présent sous ses deux formes dans le végétal. Ce mélange est fonction de l'intensité et de la qualité de la lumière: on définit le rapport Roug clair/Rouge sombre.En agronomie, cela est utile: une culture en rouge proche donnera plus de fleur.

En 1960, on a purifié le phytochrome. Pr est bleu-vert, Pfr est vert-clair, car ils absorbent différents.La floraison n'est qu'un exemple. Tous les effets du photopériodisme, réversibles, sont expliqués par ce modèle.Mais on connaît des réponses non réversibles à la lumière rouge: Réponses non réversibles à des faibles intensité d'éclairement, rouge proche et lointain. Réponses non réversibles à des fortes intensités d'éclairement, rouge proche et lointain.il existe d'autres phytochromes qui ne suivent pas ce modèle.

Une ancienne classification des phytochromes: les phytochromes I et II. Les phytochromes I sont instables à la lumière, notamment impliqués dans l'étiolement. Les phytochromes II sont stables à la lumière mais ils sont moins abondants que I.

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Plante jour court

Eclairement bref à faible intensité

Pas defloraison

Plante jour long

Floraison

Pr Pfr

Rouge clair

Rouge lointain

Réponse

Plante jour court

Floraison

Pfr

Floraison

Pfr

FloraisonPr

En conditions éclairées, Pfr est majoritaire, car les vitesses de réversibilité vers Pr sont différentes: la plante répond donc à la lumière. Si on enrichit la lumière en rouge lointain, on déplace cet équilibre vers Pr.

Il existe des mutants qui restent étiolés, même à la lumière. Grâce à ces approches de génétiques moléculaires, on a mis en évidence 5 phytochromes A,B,C,D,E, dont seulement 3 sont connus (clonés): A,B,D.Phy B est impliqué dans la réponse à la lumière rouge. Ainsi, un mutant phyB en lumière rouge restera étiolé. On note que la lumière bleu n'a aucun effet chez ce mutant la lumière bleue est captée par d'autres pigments: CRY1 par exemple (cryptochrome). Le mutant cry1 en lumière bleue reste étiolé, mais pousse normalement en lumière rouge.

Une même réponse est due à plusieurs récepteurs.

Phytochrome I= phytochrome A.Phytochrome II= les autres.

On peut surexprimer CRY1: lumière bleuebaisse croissance; lumière rouge: WT. Cette plante devient hypersensible à la lumière bleue. De plus, on voit qu'elle fabrique des anthocyanes. la synthèse des anthocyanes est sous la dépendance de CRY1 à la lumière bleue.

Un même photorécepteur induit des réponses différentes.

Le phytochrome A (I) exposé à la lumière est transformé en Pfr puis dégradé.

Le phytochrome Pr est une protéine couplée covalemment à un chromophore (: groupement prosthétique). Le chromophore est formé par un noyau tétrapyrolique ouvert (l'hémoglobine ou chlorophyle sont des noyaux tétrapyroliques fermés). L'adsorption de la lumière induit un changement d'isomérisation du chromophore, ce sui entraîne un changement de conformation de l'apoprotéine, en Pfr. La partie Ct est une Ser/Thr kinase, et sans doute aussi Kis kinase. Cela ressemble à un système à deux composants, sans en être un:

La voie de transduction est inconnue.On sait que Pr est cytosolique et que Pfr est transloqué dans le noyau. Ce serait une voie de transduction très courte. Pfr s'associerait avec des facteurs de transcription dans le noyau.

On a montré (mutants) que les phytochromes A et B ont des fonctions différentes: On cultive des plantules d'A.th. au noir ou en lumière rouge proche ou lointain, en intensité croissante. On mesure la longueur de l'hypocotyle:WT: hypocotyle diminue quand lumière augmente (rôle inhibiteur de croissance de la lumière).phyB -/-: rouge clair: étiolée. Rouge sombre: WTphyA -/-: rouge clair: WT. Rouge sombre: étiolée.Ces expériences sont compliquées à interpréter dans le détail (dégradation de PhyA, vitesses de réversibilité…) mais on voit bien que PhyA et PhyB ne captent pas la même : PhyB capte le rouge clair, alors que PhyA capte le rouge sombre.

D'un point de vue phylogénétique:Ainsi, certains végétaux primitifs ne possèdent pas de PhyD…

CRY1 et CRY2: cryptochromes. Sensibles à la lumière bleue. Découverts grâce à la biologie moléculaire, contrairement aux phytochromes.La flavoprotéine: c'est un pigment photorécepteur du bleu. Elle est impliquée dans le phototropisme.

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P

N CSer/Thr

KHis K

Ser/Thr K

P

P

Chromophore

Transduction

A

C

BDE

A

B