ÉTUDE COMPARATIVE DES PROTÉINES

SÉCRÉTÉES PAR LES KÉRATINOCYTES DE

PEAU SAINE ET DE CICATRICE

HYPERTROPHIQUE

Mémoire

Elnaz Salekzamani

Maîtrise en Biologie Cellulaire et Moléculaire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Elnaz SALEKZAMANI, 2013

III

Résumé

Les kératinocytes de l‘épiderme interagissent fortement avec les fibroblastes du derme sous-

jacent. Notre équipe a précédemment démontré que les cellules de l‘épiderme des cicatrices

hypertrophiques jouent un rôle dans le développement de la fibrose de cette pathologie.

Une étude comparative des protéines sécrétées par les kératinocytes de peau et des kératinocytes

pathologiques a été réalisée. Les analyses ont été effectuées par la technique d‘électrophorèse en

deux dimensions (Gel 2D-DIGE: Two-Dimensional Difference gel electrophoresis). La première

dimension permet la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique et la

deuxième dimension permet une séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaires

La comparaison des gels effectués avec des surnageants de 7 populations de kératinocytes de

peau et 7 populations de kératinocytes provenant de cicatrices hypertrophiques a permis de

détecter des différences entre les deux types cellulaires. Seize points ont été séquencés par

spectrométrie de masse permettant de déterminer la présence de 12 protéines potentiellement

sécrétées différemment selon l‘origine des kératinocytes. La concentration de deux de ces

protéines (MMP-1 et SPINK5) a ensuite été mesurée par des méthodes quantitatives afin de

valider les résultats obtenus par les gels 2D-DIGE. Nos résultats montrent que les kératinocytes

provenant de cicatrices hypertrophiques sécrètent une moins grande quantité de MMP (Matrix

MetalloProteinase) que les kératinocytes provenant de peau saine, pouvant ainsi expliquer

l‘augmentation de la fibrose lors du développement de cette pathologie.

IV

V

Remerciements

Je tiens à remercier ma directrice de recherche, Dre Véronique

Moulin pour son encadrement et sa gentillesse. Véronique, merci

pour la confiance que tu m’as accordée pendant ce travail. J’ai appris

beaucoup de choses à travers cette maîtrise et j’avoue que j’ai bien

grandi. Merci de ta patience. Tu es une merveille du monde de la

recherche. Mille mercis pour ton soutien au cours de ma grossesse et

après la naissance de ma fille.

Je remercie également Dr Auger et Dre Germain de m’avoir accepté

au sein de leur centre de recherche LOEX.

Un grand merci à Sébastien Larochelle, un vrai appui pendant ce

travail, pour sa présence et sa collaboration.

Je remercie également les étudiants de maîtrise précédents de

l’équipe, Judith Bellemare, Danielle Bergeron et Franck Simon. Mon

travail était la suite de leurs recherches.

Je remercie les membres de notre équipe, et également tous mes

amis au LOEX.

Je remercie tout particulièrement mon mari, mes parents et ma fille

pour leurs encouragements. Ma petite fille (mon rayon du soleil)

avec son petit sourire.

Et finalement, je voulais remercier Dr Stéphane Chabaud, un vrai

enseignant tout au long de cette étude. Merci pour le temps

consacré. Merci infiniment pour la disponibilité.

À ma famille, à mes enseignants

«Finally I made a beautiful success»

VI

VII

Table des matières

Résumé III

Remerciements V

Table des matières VII

Liste des figures IX

Liste des abréviations XI

CHAPITRE 1: Introduction 1

1.1. Généralités 2

1.2. La cicatrisation cutanée 3

1.2.1. La phase inflammatoire 5

1.2.2. La phase proliférative 6

1.2.3. La phase de remodelage 8

1.3. Les cicatrices hypertrophiques 9

1.3.1. Mécanisme moléculaire de la formation d‘une cicatrice hypertrophique 9

1.3.1.1. Les cellules 10

1.3.1.2. Les cytokines 13

1.3.2. Traitement d‘une cicatrice hypertrophique 14

1.4. Les interactions épithélio-mésenchymateuses 16

1.5. Les métalloprotéinases matricielles (MMPs) 19

1.5.1. MMP-1 20

1.5.2. Les MMPs et la cicatrice hypertrophique 20

1.6. Les protéines inhibitrices des MMPs (TIMPs) 21

1.7. Serine peptidase inhibitor Kazal type 5 (SPINK5) 22

VIII

1.8. Mise en contexte du projet et objectif 23

CHAPITRE 2: MATÉRIELS ET MÉTHODES 24

PARTIE I: Culture cellulaire 25

PARTIE II: Électrophorèse en deux dimensions (Gel 2D-DIGE) 29

Partie III: Western blot, ELISA, test de mortalité cellulaire et

dosage de l‘activité MMP

43

CHAPITRE 3: RÉSULTATS 49

3.1. Composition protéique des différents surnageants (gel 2D)

50

3.2. Analyse des gels par le logiciel Delta 2D

51

3.3. Analyse par spectrométrie de masse

54

3.4. Détermination du taux de mortalité cellulaire 56

3.5. Quantification de la protéine SPINK5 par la méthode ELISA 57

3.6. Comparaison des niveaux de différenciation des kératinocytes

par Western blot

58

3.7. Dosage enzymatique de l‘activité des MMPs dans les surnageants

de kératinocytes normaux et hypertrophiques

59

CHAPITRE 4: DISCUSSION, PERSPECTIVES ET CONCLUSION 60

CHAPITRE 5: BIBLIOGRAPHIE 67

IX

Liste des figures

Figure 1: Schéma d‘une coupe histologique de peau humaine

Figure 2: Schéma représentant les trois phases de la cicatrisation cutanée

Figure 3: Illustration de la phase inflammatoire

Figure 4: Illustration de la phase proliférative

Figure 5: Illustration de la phase de remodelage

Figure 6: Schémas représentant les trois degrés de brûlure

Figure 7: Photographie de deux cicatrices hypertrophiques

Figure 8: Caractérisation des différentes populations cellulaires de kératinocytes testées

Figure 9: Les étapes de marquage CyDye

Figure 10: Les bandelettes sont utilisées pour permettre la migration dans une première dimension

Figure 11: Schéma du système Ettan IPG phore

Figure 12: Schéma représentant les migrations des échantillons selon les deux dimensions

Figure 13: Dépôt des bandelettes dans la cassette déjà assemblée et contenant le gel de migration selon

2ème

dimension

Figure 14: Scanneur Typhoon pour l‘acquisition des images en fluorescence

Figure 15: Analyse des images acquises par le scanneur Typhoon avec le logiciel Delta 2D Figure 16: Exemple d‘un gel coloré au nitrate d‘argent

Figure 17: Principe général de spectrométrie de masse

Figure 18: Image générale du logiciel Scaffold Viewer

Figure 19: Image générale d‘un gel 2D avec les points à analyser par spectrométrie de masse Figure 20: Image générale de la carte protéomique obtenue par le logiciel Delta 2D Figure 21: La carte protéomique avec un test non paramétrique de Wilcoxon- Mann-Whitney

Figure 22: Sélection des points montrant ± 50% de variation dans le patron de sécrétion

Figure 23: Image de gel 2D coloré au nitrate d‘argent afin de visualiser et exciser les points d‘intérêt Figure 24: Carte protéomique avec le nom des protéines identifiées

Figure 25: Décompte des cellules mortes dans les surnageants de culture afin d‘évaluer la mortalité

cellulaire

Figure 26: Dosage ELISA de la protéine SPINK5 dans les surnageants de culture des deux familles des

kératinocytes (KA et KH)

Figure 27: Comparaison du niveau de différenciation des kératinocytes de deux familles (KA et KH) par

Western blot Figure 28: Dosage enzymatique de l‘activité MMPs dans les surnageants des kératinocytes normaux et

hypertrophiques

X

XI

Liste des abréviations

AP: Activator Protein

ARNm: ARN messager

MCP: monocyte chemotactic protein

CTGF: Connective Tissu Growth Factor

Cy: Cyanin

2D-DIGE: Two-Dimensional Difference gel electrophoresis

DMF: Dimethyl formamide

DTT: Dithiothréitol

EGF: Epidermal Growth Factor

FGF: Fibroblast Growth Factor

GM-CSF: Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor

HGF: Hepatocyte Growth Factor

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

IEF: Isoelectric Focusing

IFN: Interféron

IgE: Immunoglobine E

IGF: Insuline-like Growth Factor

IL: Interleukine

IPG: Immobilized pH gradient

KA: Kératinocyte Normal

kDa: Kilodalton

KGF: Keratinocyte Growth Factor

KH: Kératinocyte Hypertrophique

KLK: Kallikrein

XII

MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase

MCP: Monocyte Chemoattractant Protein

MMP: Matrix MetalloProteinase

NHS: N-hydroxy-succinimidyl

PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen

PDGF: Platelet-Derived Growth Factor

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SLRP: Small Leucin-Rich Proteoglycan

SPINK5: Serine peptidase inhibitor Kazal type 5

TE: Tampon d‘échantillon

TEMED: Tétraméthyléthylènediamine

TGF: Transforming Growth Factor

TIMP: Tissue Inhibitor of MetalloProteinase

TNF: Tumor Necrosis Factor

VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor

1

CHAPITRE 1:

INTRODUCTION

2

1.1. Généralités:

La peau est l‘organe le plus lourd et étendu de notre corps. Elle est nécessaire pour survivre car

elle est une barrière protectrice entre l‘individu et son environnement (Eckert 1989; Singer et

Clark 1999). Elle représente 8% de la masse corporelle et a une épaisseur qui varie entre 1 à 5

mm selon sa localisation dans le corps (Odland 1991). La peau joue un rôle essentiel comme

barrière physique qui protège l‘organisme des agressions de nature chimique, osmotique,

thermique, mécanique et infectieuse tout en limitant la déshydratation (Collins 2005; Eckert

1989). La peau contient trois couches qui sont de l‘extérieure vers l‘intérieur du corps:

l‘épiderme, le derme et l‘hypoderme. Chaque couche est composée de différents types de

cellules. Les kératinocytes représentent 95% des cellules de l‘épiderme (Stevens 2005). Le

derme est un tissu conjonctif qui contient majoritairement de la matrice extracellulaire se

composant essentiellement des collagènes I et III et des fibroblastes (Breathnach and Bannister,

1995). L‘hypoderme est une couche contenant surtout des adipocytes (Guyton and Hall, 1996).

http://ekiacosmetiques.wordpress.com/2011/01/21/quand-la-peau-devient-mature-partie-1/

Figure 1: Schéma d‘une coupe histologique de peau humaine. Les trois couches de la peau: l‘épiderme, le

derme et l‘hypoderme.

3

1.2. La cicatrisation cutanée:

Une plaie se forme quand l‘intégrité du tissu est compromise. Une plaie peut être considérée

comme une rupture de la barrière cutanée. La rupture tissulaire par blessure ou brûlure constitue

une véritable catastrophe biologique. Une plaie, dépendamment de sa profondeur et de sa

surface, peut avoir des conséquences très néfastes sur la qualité de vie d‘une personne et peut

même provoquer la mort. Une brûlure profonde, peut être la cause d‘une perte liquidienne

importante et peut mettre la vie du patient en danger en augmentant les risques d'hypotension, de

déséquilibre ionique et d'infections. La cicatrisation cutanée se divise en 3 phases en fonction de

son évolution temporelle: 1) la phase inflammatoire; 2) la phase proliférative qui consiste en la

réépithélialisation en surface de la plaie et la formation du tissu de granulation en profondeur; 3)

la phase de remodelage ou maturation cicatricielle dans le but de mener à un derme cicatriciel

solide semblable au derme initial (Moulin 1995). Le déroulement du processus varie selon

l‘importance de la blessure. Une brûlure superficielle ne nécessite pas le même processus

cicatriciel qu‘une brûlure profonde. D‘autres facteurs ont une influence sur l‘évolution du

processus, notamment l‘état de santé, la nutrition et l‘âge de la personne (Kirsner et Eaglstein

1993).

4

Figure 2: Schéma représentant les trois phases de la cicatrisation cutanée. La cicatrisation cutanée se

divise en trois phases qui se chevauchent et qui requièrent de nombreux types cellulaires. La première

étape est celle de l‘inflammation (les 3 premiers jours), la deuxième étape est la phase proliférative qui

aboutit à une réépithélialisation et à la formation d‘un tissu de granulation (du jour 3 au jour 15) et

finalement la troisième étape est celle du remodelage (du jour 15 au jour 30). Une accumulation du

collagène est observée au fils de la guérison d‘une plaie. (Moulin 1995)

5

1.2.1. La phase inflammatoire:

Une lésion tissulaire peut causer une perturbation des vaisseaux sanguins et une extravasation

des constituants du sang (Heldin et al. 1996). La phase inflammatoire, qui dure environ 3 jours,

commence directement après le traumatisme en réaction à la nécrose cellulaire.

Figure 3: Illustration de la phase inflammatoire (Singer and Clark 1999)

Le caillot sanguin rétablit l‘homéostasie et fournit une matrice extracellulaire provisoire pour la

migration cellulaire. Les plaquettes sanguines sécrétant les différents médiateurs de guérison des

plaies comme le Platelet-derived Growth Factor (PDGF), attirent et activent les fibroblastes et les

macrophages. Plusieurs facteurs chimiotactiques produits au cours de la coagulation recrutent les

leukocytes inflammatoires au site de la plaie (Clark 1996). Les monocytes, en réponse aux

différents facteurs comme le Transforming Growth Factor β (TGF β) et le Monocyte

Chemoattractant Protein 1 (MCP-1), pénètrent dans la région de la plaie et deviennent les

macrophages actifs qui sécrètent du PDGF et initient la formation du tissu de granulation. Les

neutrophiles et les macrophages nettoient la surface de la plaie en phagocytant les particules

étrangères et les bactéries. Les différentes cytokines exprimées par les monocytes et les

macrophages comme le TGF α et β, l‘Interleukine-1 (IL-1) ou l‘Insuline-like Growth Factor 1

(IGF-1) sont importants pour l‘initiation et la propagation des mécanismes aboutissant à la

formation des nouveaux tissus dans la plaie.

(Singer and Clark 1999)

6

1.2.2. La phase proliférative:

La réépithélialisation d‘une plaie commence quelques heures après la cicatrisation. Les cellules

épithéliales du bord de la plaie et des follicules pileux migrent dans la plaie grâce à une série de

mécanismes. Les liens hémidesmosomaux entre l‘épiderme et la membrane basale sont dissous

entraînant une dissociation entre les cellules de l‘épiderme et la matrice du derme. Ceci permet

un mouvement latéral des cellules épidermiques (Clark 1990; Clark et al. 1996). La migration

des cellules de l‘épiderme dissèque la plaie et sépare les sections de la plaie desséchée des tissus

viables. La dégradation de la matrice extracellulaire est nécessaire pour la migration des cellules

épidermiques entre le collagène du derme et la fibrine de la plaie (scarification). Ceci est

dépendant de la sécrétion de collagénases par les cellules épidermiques (Pilcher et al. 1997). Un

ou deux jours après la formation de la plaie, les cellules épidermiques situées aux marges de la

plaie, commencent à proliférer derrière les cellules en migration. La sécrétion locale des facteurs

de croissance comme l‘Epidermal Growth Factor (EGF), le Transforming Growth Factor α (TGF

α) et le Keratinocyte Growth Factor (KGF) est également suivie d‘une augmentation de

l‘expression des récepteurs de ces facteurs (Nanney et al. 1996; Abraham et al. 1996). Quatre

jours après le début de la cicatrisation, le tissu de granulation commence à envahir les espaces de

la plaie. Les nouveaux capillaires sanguins se développent par angiogenèse et donnent une

apparence granuleuse à ce tissu. Les macrophages et les fibroblastes se déplacent en même temps

vers la zone de la plaie (Hunt et al. 1980). Les macrophages fournissent une source continue des

facteurs de croissance nécessaires à la fibroplasie et à l‘angiogenèse. Les fibroblastes produisent

une nouvelle matrice extracellulaire afin de soutenir la croissance des cellules et les vaisseaux

sanguins fournissent l‘oxygène et les nutriments nécessaires au métabolisme des cellules (Hunt

et al. 1980). Les fibroblastes sont responsables de la synthèse, du dépôt et du remodelage de la

matrice extracellulaire. La matrice extracellulaire a un effet positif ou négatif sur la capacité des

fibroblastes d‘interagir avec la matrice extracellulaire (Xu et al. 1996; Clark et al. 1995). Après

leur migration dans la plaie, les fibroblastes commencent la synthèse d‘une matrice

extracellulaire provisoire. Celle-ci va être remplacée graduellement par une matrice de collagène

plus dense et structurée (Clark et al.1995; Welch et al. 1990). Lorsque la densité en collagène du

tissu de granulation est assez importante, les cellules de la plaie disparaissent par apoptose afin

de diminuer le nombre de cellules productrices de matrice (Desmouliere et al. 1995). La

contraction d‘une plaie implique une interaction entre les cellules, la matrice extracellulaire et

7

des cytokines. Pendant la deuxième semaine de la cicatrisation, les fibroblastes se transforment

en myofibroblastes (Welch et al. 1990; Desmouliere et al. 1996) Les myofibroblastes jouent un

rôle dans la synthèse et la compaction du tissu conjonctif et la contraction de la plaie. Cette

contraction est due probablement à une stimulation des cellules par le TGF β1 ou β2 (Montesano

et al. 1988) et le PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) (Clark et al. 1989) ainsi que l'adhésion

des fibroblastes à la matrice de collagène par les intégrines (Schiro et al. 1991).

Figure 4: Illustration de la phase proliférative (Singer and Clark 1999)

(Singer and Clark 1999)

8

1.2.3. La phase de remodelage:

La phase de remodelage est considérée comme la phase de finition du processus de cicatrisation.

Elle se caractérise par les processus de réparation plus lents, orientés vers le retour à l‘état initial.

Les cellules excédentaires, vestige du tissu de granulation, disparaissent par apoptose

(Demouliere, Redard et al.1995) alors que la matrice extracellulaire provisoire du tissu de

granulation va être dégradée par les collagénases (métalloprotéinases matricielles (MMPs))

fibroblastiques et des élastases (Park 1999). Durant la phase de remodelage, la sécrétion du

collagène de type I est augmentée par rapport au collagène de type III (Singer et Clark 1999). Le

remodelage du collagène est dépendant de la synthèse et du catabolisme continu du collagène. La

dégradation du collagène de la plaie est contrôlée par les MMPs qui sont sécrétées par les

macrophages, les cellules épidermiques, les cellules endothéliales et les fibroblastes (Mignatti et

al. 1996). Les différentes phases de la guérison d‘une plaie impliquent des combinaisons

distinctes de MMPs et de TIMPs (Tissu Inhibitor of Metalloproteinase) (Madlener et al. 1998).

Figure 5: Illustration de la phase de remodelage (Singer and Clark 1999)

(Singer and Clark 1999)

9

1.3. Les cicatrices hypertrophiques:

La cicatrice hypertrophique est une des formes de fibrose du derme (Amadeu et al. 2004). C‘est

une complication qui se développe à la suite d‘un traumatisme ou d‘une brûlure profonde de 2ème

et 3ème

degré (Peacock et al. 1970). Elle se développe généralement entre trois à six mois après la

blessure (Brissett et al. 2001). La cicatrice hypertrophique est le résultat d‘un échec général dans

le processus normal de la fin de la guérison d‘une plaie (Van der Veer et al. 2009). C‘est un

désordre fibroprolifératif du derme qui est caractérisé par un dépôt excessif de matrice et une

altération de la morphologie du collagène et d‘autres protéines de la matrice extracellulaire

(Zhensen Zhu et al. 2013). La cicatrice hypertrophique est identifiée par une couleur différente,

une raideur du tissu et une texture rugueuse (Bock et al.2006; Mazharinia et al. 2007). Elle cause

une faiblesse importante au niveau fonctionnel et des problèmes graves au niveau cosmétique.

Parmi les symptômes, le prurit et la douleur sont responsables d‘une diminution de la qualité de

vie du patient (Van Loey et al. 2008).

1.3.1. Mécanisme moléculaire de la formation d‘une cicatrice

hypertrophique:

Les cicatrices hypertrophiques se développent quand la réponse inflammatoire est prolongée de

façon trop importante entrainant une augmentation de la vascularisation, une hypercellularité, un

dépôt excessif de collagène et un retard de réépithélialisation (Tredget et al. 1997; Wang et al.

2011a, b; Armour et al. 2007). Une diminution de l‘expression des SLRP (small leucin-rich

proteoglycan) et de la décorine ainsi qu‘une augmentation de l‘expression du TGF-β1 ont été

également remarquées dans ces cicatrices (Honardoust et al. 2012a, b). Différentes cellules et

cytokines jouent un rôle dans le développement de la fibrose dans les cicatrices hypertrophiques.

10

1.3.1.1. Les cellules:

Les plaquettes:

L‘agrégation plaquettaire et leur dégranulation marquent le début de l‘inflammation. La

dégranulation des plaquettes libèrent de nombreux facteurs de croissance qui ont comme

fonction principale d‘être des agents chimiotactiques pour le recrutement des cellules

inflammatoires: le PDGF, le TGF-β, le FGF2 (Basic fibroblast growth factor), le VEGF

(Vascular endothelial growth factor), le HGF (Hepatocyte growth factor), l‘IGF et l‘EGF. En

plus de ses fonctions chimiotactiques, le PDGF stimule la guérison de la plaie en augmentant la

prolifération des fibroblastes et par conséquent, la production de matrice extracellulaire (Warner

et al. 2003; Steed 2006). La présence d‘un niveau élevé de PDGF dans les tissus de cicatrice

hypertrophique a été relevée (Krotzsch-Gomez et al. 1998; Niessen et al.2001).

Les mastocytes:

Les mastocytes font partie des candidats susceptibles de jouer un rôle dans la formation des

cicatrices hypertrophiques (Atkins et al. 1987; Smith et al. 1987). En effet, ces cellules sont

présentes dans le derme, proches des faisceaux de collagène (Kischer et al. 1982; Tredget et al.

1998). Les mastocytes peuvent être stimulés directement lors de la formation de la plaie ou par la

présence d‘IgE et d‘autres facteurs comme l‘histamine, des protéoglycanes, des protéases ou les

cytokines impliquées dans la production de la matrice dermique (Gruber 2003; Gailit et al. 2001;

Hebda et al. 1993). Il est suggéré que les mastocytes activent les fibroblastes à travers les

communications intercellulaires, y compris les jonctions communicantes (Moyer et al. 2004).

L‘histamine, un stimulateur de la formation du collagène par les fibroblastes in vivo (Gailit et al.

2001; Kendall et al. 1997; Kupietzky et al. 1996), est significativement élevée dans le plasma des

patients ayant des cicatrices hypertrophiques (Tredget et al. 1997). Les mastocytes ont également

la capacité de promouvoir la prolifération des fibroblastes par sécrétion de TGF-β1, de TNF-α et

d‘IL-4 (Van der Veer et al. 2009).

11

Les neutrophiles:

Présents dans le sang, les neutrophiles se trouvent au site de la plaie suite à tout saignement. En

plus de leur capacité d‘ingérer et de détruire les micro-organismes et microparticules, les

neutrophiles produisent également des cytokines pro-inflammatoires comme l‘IL-1α et le TNF-α.

Ces cytokines sont considérées comme les premiers signaux permettant d‘activer les fibroblastes

et les kératinocytes voisins par l‘induction de l‘expression de FGF7 (Martin 1997; Werner et al.

2003). Le FGF7 stimule également la prolifération des cellules épithéliales (Grose et al. 2004),

mais son rôle dans le développement de la cicatrice hypertrophique n‘est pas encore clair (Van

der Veer et al. 2009).

Les fibroblastes:

Les fibroblastes sont les cellules les plus communes dans le tissu conjonctif et sont un élément

clé dans la guérison d‘une cicatrice. Les fonctions principales des fibroblastes sont de maintenir

l‘intégrité physique du tissu conjonctif, de participer à la fermeture de la plaie et de produire et

remodeler la matrice extracellulaire (McDougall et al. 2006; Kwan et al. 2009). Les tissus

provenant de cicatrices hypertrophiques possèdent un grand nombre de fibroblastes avec un

phénotype différent de ceux retrouvés dans la peau normale (Nedelec et al.2001). De plus, il a

été montré que les fibroblastes d‘une cicatrice hypertrophique réagissent d‘une façon différente

par rapport aux fibroblastes normaux. Ces fibroblastes pathologiques montrent une expression

élevée du TGF- β1 par rapport aux fibroblastes normaux (Scott et al. 1995). Cette augmentation

conduit à une surproduction et à un dépôt excessif du collagène par les fibroblastes (Shah et al.

1995). Les fibroblastes de cicatrices hypertrophiques contiennent moins d‘ARNm pour les

collagénases et montrent une capacité diminuée à dégrader les collagènes solubles (Ghahary et

al. 1996). Au cours de la cicatrisation, les fibroblastes se différencient en myofibroblastes. Les

myofibroblastes de cicatrice hypertrophique sont moins sensibles aux signaux apoptotiques. Ils

produisent plus de collagène et moins de collagénase que les fibroblastes normaux (Nedelec et

al. 2000; Moulin et al. 2004).

12

Les macrophages:

Les monocytes circulants dans le sang sont attirés au site de la plaie par l‘intermédiaire des

cytokines comme le TGF-β, le PDGF et le MCP-1. Au site de la plaie, les monocytes se

transforment en macrophages qui, non seulement perpétuent les processus inflammatoires et leur

rôle de phagocytose, mais également stimulent la production du collagène, l‘angiogenèse et la

réépithélialisation (Baum et al. 2005). À ce titre, les macrophages jouent un rôle pivot dans la

transition entre les phases inflammatoire et proliférative. Ils coordonnent et soutiennent les

évènements de la guérison de la plaie (Singer et Clark, 1999). Les macrophages produisent les

cytokines proinflammatoires, y compris les IL-1α, IL-1β et IL-6 qui sont non seulement

responsables du contrôle de l‘adhésion et de la migration des cellules inflammatoires, mais

également stimulent la prolifération des kératinocytes et des fibroblastes (Werner et al. 2003).

Les fibrocytes:

Les fibrocytes sont des précurseurs des myofibroblastes qui jouent un rôle central dans la

formation de cicatrices hypertrophiques (Zhensen Zhu et al. 2013; Yang et al. 2002). Les

fibrocytes présents dans le sang périphérique peuvent rapidement être recrutés au site de la plaie,

en même temps que les cellules inflammatoires et participer à certains aspects de la guérison de

la plaie comme la production de la matrice extracellulaire, la présentation d‘antigènes, la

production de cytokines, l‘angiogenèse et la fermeture des plaies (Chesney et al. 1997; Abe et al.

2001; Metz 2003). L‘analyse du sang périphérique des patients brûlés montre un nombre élevé

de fibrocytes en comparaison avec le sang provenant de patients dont la cicatrisation est terminée

(Yang et al. 2005).

Les kératinocytes:

Les kératinocytes jouent également un rôle dans la formation de la fibrose des cicatrices

hypertrophiques. Les kératinocytes sécrètent des cytokines qui stimulent les cellules du derme de

façon paracrine (Boyce 1994; Lim et al. 2001). Il a été montré que les surnageants de culture de

kératinocytes stimulent la prolifération des fibroblastes en culture monocouche (Delaporte et al.

1989). Le rôle des kératinocytes en ce qui concerne la synthèse de la matrice extracellulaire est

plus discuté puisqu‘une étude a montré un rôle inhibiteur (Garner 1998) et une autre a montré un

rôle stimulateur de la synthèse du collagène. Les kératinocytes sécrètent également du

13

Connective Tissu Growth Factor (CTGF) (Inoue et al. 2003) qui stimule la croissance des

fibroblastes et la sécrétion du collagène. Bellemare a montré une augmentation de l‘épaisseur du

derme lors de l‘ajout des kératinocytes de la cicatrice hypertrophique vs les kératinocytes

normaux (Bellemare et al. 2005). D‘autres études ont montré une diminution d‘IL-1α (un

stimulateur de dégradation de la matrice (Heckmann et al.1993)) et une augmentation de PDGF

(un stimulateur de la production de la matrice (Pierce et al. 1991)) dans l‘épiderme provenant de

cicatrice hypertrophique en comparaison avec l‘épiderme de cicatrice normale (Niessen et al.

2001). Notre laboratoire a montré un niveau élevé de TIMP-1 (Un inhibiteur de MMP) sécrété

dans les surnageants des kératinocytes de cicatrice hypertrophique par rapport aux kératinocytes

normaux (Simon et al. 2012). Les kératinocytes d‘une cicatrice hypertrophique sécrètent

également plus de TGF-β, PDGF, FGF et TNF-α ce qui favorisent la prolifération des

fibroblastes (Kirsner et al. 1993; Maas-Szabowski et al. 1999).

1.3.1.2. Les cytokines:

IL-1:

IL-1 stimule la sécrétion des MMPs et d‘une façon synergique induit une activité collagénase en

conjonction avec l‘interféron g (IFN-gamma) et le TNFα sécrétés par les cellules inflammatoires

(Elias et al. 1987; Postlethwaite et al. 1988). Donc, une diminution d‘IL-1 au niveau de la plaie

peut conduire à une accumulation de la matrice extracellulaire et la formation d‘une cicatrice au

site de la lésion. Niessen et al. 2001 ont montré une réduction du niveau d‘IL-1 dans les

cicatrices hypertrophiques.

TGF-β:

Le TGF-β est une protéine sécrétée qui existe sous 3 isoformes distincts chez les mammifères,

TGF-β1, TGF-β2 et TGF-β3 (Bock et al. 2005). Chaque isoforme à une fonction unique dans le

processus de guérison de la plaie. Le TGF-β1 et le TGF-β2 sont sécrétés par les plaquettes

dégranulées, et également par les monocytes et les macrophages alors que le TGF-β3 est produit

par les kératinocytes. Des expériences ont montré que le TGF-β joue un rôle important en tant

14

que médiateur de nombreux troubles fibrotiques, y compris la fibrose pulmonaire, la

sclérodermie (Broekelmann et al. 1991) et les cicatrices hypertrophiques (Ghahary et al. 1995b).

Des études ont montré le rôle du TGF-β1 et du TGF-β2 dans la formation de la cicatrice

hypertrophique (Shah et al. 1994). Le TGF-β1 joue le rôle d‘un inducteur puisant de la

différenciation des myofibroblastes par une stimulation de l‘expression de α-SMA et il diminue

l‘activité des MMPs en stimulant la synthèse des TIMPs chez les fibroblastes. De cette façon, le

processus de dégradation de la matrice extracellulaire par les MMPs est abrogé. Pendant ce

temps, le dépôt de la matrice extracellulaire par les fibroblastes est promu par le TGF-β1. Toutes

ces caractéristiques peuvent contribuer à la formation d‘une cicatrice hypertrophique

(Desmoulière et al. 1993).

1.3.2. Traitement d‘une cicatrice hypertrophique:

Les cicatrices hypertrophiques sont souvent traitées selon une approche multimodale qui utilise

des méthodes traditionnelles comme la chirurgie suppressive, la radiothérapie post-opératives,

l‘injection de corticostéroïdes, la thérapie au laser et les traitements par compression (vêtements

compressifs) (Ogawa 2010). Le choix de la méthode de traitement de la cicatrice est surtout

dépendant de la présence ou non de contracture. En cas de contracture, l‘approche chirurgicale

va être privilégiée afin de relâcher la contracture. Cette approche comprend les techniques de

plastie en z ou une greffe de peau et de lambeaux cutanés (Ogawa 2010). Indépendamment des

méthodes de thérapie utilisées, un suivi à long terme est recommandé. Pour déterminer

l‘incidence d‘une cicatrice hypertrophique ou l‘efficacité du traitement choisi, différents critères

peuvent être pris en compte comme le type de peau, l‘âge, la profondeur de la plaie, le temps de

cicatrisation, le traitement, le moment de la chirurgie, la zone de la plaie et la zone de la cicatrice

hypertrophique. Malgré toutes les techniques de traitement, les cicatrices hypertrophiques sont

difficiles à traiter correctement et les patients restent souvent à la prise avec des cicatrices

douloureuses et inesthétiques (Bloemen et al. 2009).

15

Figure 6: Schémas représentant les trois degrés de brûlure (A.D.A.M. 2013)

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/1078.htm

Figure 7: Photographie de deux cicatrices hypertrophiques

http://www010.upp.so-net.ne.jp/r-ogawa/en/ http://www.dermaheal.com/Scars-Before-After-Photos-c25.html

16

1.4. Les interactions épithélio-mesenchymateuses:

L‘épithélium et le mésenchyme sont deux types distincts de tissus qui se trouvent dans tous les

organes. L‘épithélium est composé en grande partie de cellules immobiles étroitement associées.

Au contraire, le mésenchyme contient des cellules plus mobiles qui forment des agglomérats plus

lâches. Dans les différentes étapes du développement des organes, comme la croissance, la

morphogenèse et la différenciation, l‘épithélium et le mésenchyme sont essentiels et une

communication fine entre ces deux types de cellules est primordiale. Une des façons de

communiquer est par la présence de signaux paracrines (Birchmeier et al. 1993). Les facteurs

paracrines provenant des cellules mésenchymateuses peuvent induire la croissance, la

morphogenèse et la différenciation des cellules épithéliales voisines. Trois méthodes de

transduction de signal ont été suggérées: a) une interaction médiée par le contact directe de

cellule à cellule, b) une interaction médiée par la matrice extracellulaire, c) une diffusion par des

facteurs solubles (Grobstein 1956; Barcellos-Hoff et al 1989; Hay 1990; Trautman et al 1991;

Montesano et al 1991b; Hirai et al 1992). La signalisation à travers des composantes de la

matrice extracellulaire se produit au cours du développement de la peau (Vainio et al 1992a;

Streuli et al 1991; Hirai et al 1992). Les cellules mésenchymateuses impliquées dans les

interactions épithélio-mésenchymateuses sont des cellules généralement non polarisées et

entourées par de la matrice extracellulaire. Les fibroblastes sont des cellules mésenchymateuses.

Leur contact à la matrice extracellulaire est médié premièrement par les molécules d‘adhésion

cellules-substrat. Par exemple, les fibroblastes expriment divers types de récepteurs de type

intégrine (comme α5β1 qui est un récepteur de la fibronectine) qui sont impliqués dans les

contacts de type contacts focaux (Hynes 1992). La morphologie des cellules épithéliales est

entièrement différente des fibroblastes. Ces cellules sont organisées en couches cellulaires

continues et sont généralement polarisées et moins mobiles (Simons & Fuller 1985; Rodriguez-

Boulan & Nelson 1989). La peau est un exemple d‘un épithélium multi-couches dans lequel les

cellules basales sont recouvertes par des couches de cellules graduellement différenciées. Les

cellules épithéliales sont connectées entre-elles via les jonctions adhérentes et des desmosomes

(Birchmeier et al 1993). Les cellules épithéliales sont connectées à la membrane basale via des

hémidesmosomes. Les hémidesmosomes sont riches en intégrines α6β4 (Sonnenberg et al 1991).

Au cours des interactions épithélio-mésenchymateuses, les différentes molécules d‘adhésion

cellulaire jouent un rôle important. Une de ces molécules est la ténascine qui est spécifiquement

17

exprimée au cours du développement des dents (Chiquet-Ehrismann et al 1986), du rein

(Aufderheide et al 1987) et d‘une façon sélective dans les glandes mammaires (Mackie et al

1987). Une autre molécule qui joue un rôle dans l‘adhésion des cellules durant les interactions

épithélio-mésenchymateuses est le syndécane. Le syndécane est également exprimé au cours du

développement des dents, du rein et des glandes mammaires (Vainio et al 1989a, b; Leppa et al

1992). Des études ont montré la présence des récepteurs du facteur de croissance KGF dans les

cellules épithéliales alors que leurs ligands correspondants sont synthétisés essentiellement par

les cellules mésenchymateuses (Stoker et al 1987; Miki et al 1991). L‘association du ligand à son

récepteur engendre la stimulation de mécanismes mitogènes. Cet ensemble envoie également des

signaux qui dirigent la différenciation, le mouvement et la morphogenèse (Birchmeier et al

1993). Le KGF est un facteur mitogène puissant pour les kératinocytes uniquement. Il est un

membre de la famille des FGFs (Fibroblast Growth Factor) (Rubin et al. 1989). Le KGF est

exprimé dans les compartiments mésenchymateux des organes embryonnaires et adultes. La

stimulation ciblée du KGF sur les kératinocytes suscite des changements importants dans la

différenciation épithéliale chez les souris transgéniques (Guo et al. 1993; Rubin et al. 1989). La

famille du TGF joue un rôle important dans les interactions épithélio-mésenchymateuses. La

famille du TGF est un ensemble de signaux autocrines et paracrines inhibant la croissance et la

différenciation du compartiment de l‘épithélium d‘un côté et la formation de la matrice

extracellulaire et la stimulation mitotique des cellules mésenchymateuses de l‘autre (Birchmeier

et al 1993). Le TGFα est une cytokine ayant un effet autocrine sur les kératinocytes pendant la

cicatrisation (Antoniades, Galanopoulos et al. 1993). Il augmente le niveau de prolifération des

kératinocytes et constitue un marqueur d‘hyperprolifération kératinocytaire (Gottlieb, Chang et

al. 1988). Des études ont montré l‘importance de la présence des cellules mésenchymateuses

humaines (Limat, Hunziker et al. 1989; Smola, Thiekotter et al. 1993) et murines (Rheinwald et

Green 1975) dans le développement d‘un épiderme humain différencié et organisé. Une boucle

de régulation initiée par l‘IL-1 sécrétés par les kératinocytes induit la sécrétion du KGF, de l‘IL-

6 et du Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) par les fibroblastes, ces

molécules agissent alors sur le compartiment épithélial (Waelti, Inaebnit et al. 1992; Boxman,

Ruwhof et al. 1996). L‘AP-1 (Activator Protein-1, un facteur de transcription), présent chez les

fibroblastes, influence positivement la prolifération et la différenciation des kératinocytes en

permettant la transcription du KGF/FGF7, du GM-CSF et de la pléiotropine en co-culture

(Szabowski, Maas-Szabowski et al.2000; Florin, Maas-Szabowski et al. 2005). Ce système

18

paracrinien induit la production de facteurs de croissance pour les kératinocytes par les

fibroblastes voisins (Maas-Szabowski, Shimotoyodome et al. 1999). Une autre famille jouant un

rôle dans les interactions épithélio-mésenchymateuses est la famille des protéines 14-3-3. La

famille des protéines 14-3-3 est un groupe hautement conservé de protéines acides qui ont été

découvertes par Moore et Perez en 1967. Son nom atypique de 14-3-3 vient du patron de

migration distinct du premier membre de cette famille par chromatographie en deux dimensions

et électrophorèse starch-gel (Moore et Perez 1967). Ces protéines ont été initialement identifiées

dans le cerveau et sont associées à de nombreuse fonctions cellulaires (Ichimura et al.

1987;1988). Ce groupe est constitué de sept isoformes avec des poids moléculaires entre 25 et 30

kDa. Ces isoformes sont codés par sept gènes chez les mammifères et identifiés avec des lettres

grecques (beta, epsilon, eta, gamma, tau/theta, zeta et sigma). Alors qu‘elles sont exprimées dans

les cellules d‘une façon ubiquitaire, les protéines 14-3-3 interagissent avec plusieurs molécules et

exercent des nombreuses fonctions intracellulaires. Par exemple, elles agissent dans le contrôle

du cycle cellulaire et l‘apoptose, la régulation des voies de transduction des signaux, le trafic

cellulaire, la prolifération et la différenciation cellulaire et ainsi que dans le pliage des protéines.

Un des membres de cette famille, le 14-3-3 sigma ou stratifine, est un marqueur de

différenciation des kératinocytes. La stratifine est exprimée dans l‘épiderme et joue un rôle

fonctionnel dans la formation de l‘épiderme (Medina et al. 2007). Une diminution de

l‘expression de la stratifine est observée chez les kératinocytes. Cette diminution cause la

différenciation de ces cellules (Westfall et al. 2003). Des études ont montré que les kératinocytes

différenciés sont capables de sécréter de la stratifine (Ghahary et al. 2004; 2005). Dans un

système de co-culture de kératinocytes/fibroblastes, la sécrétion de la stratifine engendre une

augmentation de plus de 10 fois l‘expression de MMP-1 par les fibroblastes dermiques (Ghahary

et al. 2004; Lam et al.2005).

L'implication des interactions épidermo-dermiques dans la cicatrisation hypertrophique a déjà été

supposée (Hakvoort, Altun et al. 1999) et démontrée (Bellemare, Roberge et al. 2005). Les

épidermes de cicatrices hypertrophiques possèdent moins de kératinocytes différenciés que les

épidermes de cicatrices normales (Machesney, Tidman et al. 1998). Quant aux protéines

sécrétées au cours de la fibrose dermique, l‘équipe de Dre Moulin a montré que TIMP-1 un

inhibiteur des MMPs est sécrété à un niveau plus élevé dans les tissus pathologiques par rapport

à des tissus sains (Simon et al. 2012).

19

1.5. Les Métalloprotéinases matricielles (MMPs):

L‘intégrité structurale d‘une peau normale est généralement maintenue par une balance entre la

synthèse de la matrice extracellulaire et sa dégradation par une famille d‘enzymes nommées les

MMPs. Les MMPs sont un groupe d‘enzymes protéolytiques diversifiées qui sont impliquées

dans le renouvellement de la matrice extracellulaire et le remodelage du tissu conjonctif dans des

conditions physiologiques comme la croissance et le développement de l‘embryon, l‘involution

utérine, la croissance de l‘os, de la résorption et la guérison de la plaie (Nagase et al. 1999). Chez

les mammifères, la famille des MMPs se compose de 25 protéinases qui sont dépendantes de la

présence de zinc et/ou de calcium. Selon leur spécificité du substrat, leur structure primaire et

leur localisation cellulaire, ces enzymes peuvent être divisées en cinq sous-familles différentes

(Murphy et al. 2002):

a) Collagénase: Les membres de cette famille sont MMP-1 avec un poids moléculaire de 52

kDa, MMP-13 avec un poids moléculaire de 54 kDa, sécrétée essentiellement par les

fibroblastes (Birkedal-Hansen, Moore et al. 1993) et MMP-8 avec un poids moléculaire de

85 kDa, sécrétée par les leucocytes. Les collagénases ont la capacité de couper les

collagènes de type I, II et III.

b) Gélatinase: comprenant les gélatinases A ou MMP-2 avec un poids moléculaire de 72 kDa et

les gélatinases B ou MMP-9 avec un poids moléculaire de 92 kDa (Bode, Fernandez-Catalan

et al. 1999).

c) Stromélysine: Les membres principaux de cette famille sont: MMP-3 avec un poids

moléculaire de 72 kDa et MMP-10 avec un poids moléculaire de 57 kDa. Ces deux MMPs

sont secrétées par les kératinocytes et les fibroblastes (Holvoet 2001) et elles jouent un rôle

dans la dégradation de la lame basale et de l‘élastine (Massova, Kotra et el. 1998).

d) Les MMPs de types membranaires: Elles se trouvent à la surface des cellules

mésenchymateuses et sont présentes dans différents carcinomes (côlon et hépatique)

(Holvoet 2001).

Le niveau d‘expression des MMPs est faible dans les cellules normales, permettant un

remodelage lent du tissu conjonctif. Dans certaines conditions pathologiques comme les fibroses

dermiques (Ghahary et al. 1996), un déséquilibre dans l‘expression de MMP est détectable.

20

1.5.1. MMP-1:

MMP-1, aussi appelée collagénase-1, est sécrétée essentiellement par les fibroblastes (Birkedal-

Hansen, Moore et al. 1993) mais est exprimée de manière ubiquitaire dans tous les tissus. C‘est

une sous-famille des MMPs qui clive les collagènes stromales. Les MMP-1 (collagénase) et

MMP- 3 (stromélysine) sont essentielles en raison de leur capacité à dégrader des molécules de

la matrice extracellulaire et à activer les autres MMPs (Fiedorczyk et al. 2006). Elles jouent un

rôle important dans la dégradation du collagène. La MMP-1 dégrade le collagène de type I, ainsi

que d'autres types de collagènes fibrillaires II, III, V, IX et X. Comme ces types de collagènes

sont les protéines les plus abondantes du corps, MMP-1 est essentielle pour le remodelage de la

matrice extracellulaire (Arakaki et al.2009). Des études ont montré une augmentation du niveau

de MMP-1 chez les patients atteints d‘arthrite rhumatoïde et de nombreuses autres maladies

suggérant un lien entre le niveau de MMPs et les lésions tissulaires (Green et al. 2003). Dans les

maladies hépatiques humaines il y a une régulation négative de MMP-1, ce qui peut expliquer la

dégradation diminuée de la matrice de type interstitielle observée dans les lésions hépatiques

humaines (Benyon et Arthur. 2001). Des études ont montré la présence du MMP-1 non

seulement chez les fibroblastes, mais également chez les kératinocytes normaux (Jinlong et al.

2011). La présence du MMP-1 et son rôle chez les kératinocytes hypertrophiques sont inconnus.

1.5.2. Les MMPs et la cicatrice hypertrophique:

Les MMPs sont une famille des protéinases qui jouent un rôle essentiel dans le processus de

remodelage du tissu (Das et al. 2003) particulièrement dans le clivage protéolytique du

collagène et la dégradation d‘autres éléments de la matrice extracellulaire (Chakraborti et al.

2003). Une surexpression des MMPs conduit à un déséquilibre entre la production de la matrice

extracellulaire et sa dégradation qui peut aboutir aux ulcères chroniques (Saito et al. 2001). De

nombreux types de MMPs sont liés à la formation d‘une cicatrice hypertrophique. Les études

ont montré que les MMP-1, 2, 9 sont impliquées dans la formation des cicatrices

hypertrophiques (Zhensen Zhu et al. 2013). L‘équipe du Dr Ghahary a montré que la stratifine

sécrétée par les kératinocytes différenciés peut stimuler l‘expression de MMP-1 par les

21

fibroblastes dermiques via la voie de signalisation MAPK (Lam et al. 2005) qui contrôle la

dégradation de la majorité des composantes de la matrice extracellulaire dermique et fournit des

cibles utiles pour l‘intervention clinique de la formation des cicatrices hypertrophiques (Ghahary

et al. 2005). Une étude a également montré que le niveau des MMP-2 et MMP-9 est augmenté

par les interactions entre les fibroblastes et les kératinocytes favorisant la dégradation des

composantes de la matrice extracellulaire accumulées (Sawicki et al. 2005). Une diminution du

niveau des MMP-2 et MMP-9 ainsi qu‘une augmentation du niveau de TIMP-1 sont observées

chez les patients atteints de cicatrices hypertrophiques suggérant que la concentration

systémique élevée de TIMP-1 peut contribuer à la fibrose du tissu aboutissant à la formation de

cicatrices hypertrophiques (Ulrich et al. 2003)

1.6. Les protéines inhibitrices des MMPs (TIMPs):

Les Tissue Inhibitor of Metalloproteinases Proteins (TIMPs) sont des protéines qui régulent la

fonction des MMPs (Stamenkovic 2003). Quatre petites protéines (TIMP-1;2;3;4) de 20 à 30

kDa composent la famille. Elles sont exprimées par de nombreux types cellulaires (Overall

1994). Les membres de la famille TIMPs montrent jusqu‘à 40% d‘homologie structurale entre

eux (Dumont 2004). Les protéines TIMPs bloquent l‘activité des MMPs de façon

stœchiométrique avec un rapport de 1:1 (Gomez, Alonso et al. 1997; Stamenkovic 2003).

Alternativement, la modification de l‘expression des MMPs et des TIMPs peut entrainer une

cirrhose du foie, résultant d‘une diminution de la dégradation du collagène et une accumulation

excessive de la matrice extracellulaire (Lichtinghagen et al. 2001). La protéine TIMP-1 humaine

possède un poids moléculaire variant entre 20 et 28,5 kDa et elle est capable d‘inhiber la plupart

des MMPs, exception faite des MMPs de type membranaire. TIMP-1 réagit fortement avec la

MMP-1 et forme un complexe réversible inactif (Hornebeck 2003). Cet inhibiteur peut

également jouer dans certains cas un rôle de facteur de croissance par exemple en stimulant la

prolifération des kératinocytes in vitro (Bertaux, Hornebeck et al. 1991). Le niveau du TIMP-1

est élevé dans le derme des cicatrices hypertropiques (Simon et al. 2012).

22

1.7. Serine peptidase inhibitor Kazal type 5 (SPINK5):

Chez l‘humain, SPINK5 est un gène qui code pour une protéine inhibitrice de la sérine protéase

de 120 kDa qui contient 2 domaines classiques de type Kazal et 13 domaines de type non Kazal

qui joue un rôle dans la croissance et la différenciation des cellules épidermiques (Magert et al.

1999; Komatsu et al. 2002; Bitoun et al. 2003). Le gène SPINK5 est composé de 33 exons

(Komatsu et al. 2002; Sprecher et al. 2001). La protéine SPINK5 est une protéine de 1064 acides

aminés qui est exprimée par le gène SPINK5 (Galliano et al. 2005). Elle est fortement exprimée

dans la couche granuleuse et dans le haut de la couche épineuse de l‘épiderme (Bitoun et al.

2003; Ishida-Yamamoto et al. 2005). Des études ont montré que SPINK5 joue un rôle important

dans la régulation des enzymes sérine protéase kallikréine 5 et kallikréine 7 sécrétées dans la

couche stratum corneum (Bitoun et al. 2003; Ishida-Yamamoto et al. 2005; Wei-Li Di et al.

2011). KLK5 et KLK7 sont impliquées dans la desquamation en induisant une protéolyse des

molécules d‘adhésion intracellulaires comme la desmogléine (Ekholm et al. 2000; Ishida-

Yamamoto et al. 2005). L‘expression et la sécrétion de SPINK5 sont plus précoces que celles de

ses protéases cibles (KLK5 et KLK7). Ce décalage permet à SPINK5 de prévenir la protéolyse

prématurée des protéines de la matrice extracellulaire ou des molécules d‘adhésion de la surface

cellulaire par KLK5 et KLK7.

SPINK5 joue également un rôle dans la régulation du temps de desquamation (Ishida-Yamamoto

et al. 2005). Une mutation du gène SPINK5 entraînant une diminution de la quantité de cette

protéine, aboutit au syndrome de Netherton qui est une maladie récessive autosomale et sévère

qui affecte la peau et les cheveux (Bamboo hair) (Chavanas et al. 2000; Bitoun et al. 2001, 2003;

Sprecher et al. 2001, 2004; Ishida-Yamamoto et al. 2005; Yang et al. 2004). Ce syndrome de

Netherton est caractérisé par une desquamation excessive des cornéocytes, par un

dysfonctionnement de la perméabilité de la barrière cutanée, par des syndromes ichthyosiformes,

par des défauts au niveau de la tige de cheveu et par des dermatites atopiques (Green and Muller

1985; Judge et al. 1994; Komatsu et al. 2002; Ishida-Yamamoto et al. 2005; Bitoun et al. 2003;

Comèl 1949; Netherton 1958; Chavanas et al. 2000). Les résultats obtenus par spectrométrie de

masse montrent un niveau élevé de la protéine SPINK5 dans les kératinocytes normaux. De plus

cette protéine est essentiellement présente dans les kératinocytes différenciés (Bitoun et al. 2003;

Ishida-Yamamoto et al. 2005). Le rôle de cette protéine dans les kératinocytes provenant de

cicatrices hypertrophiques reste inconnu.

23

1.8. Mise en contexte du projet et objectif:

Ce projet s‘inscrit dans la continuité d‘un programme de recherche portant sur l‘influence de

l‘épiderme dans la formation des cicatrices hypertrophiques. Les travaux précédents de l‘équipe

de la Dre Moulin ont montré l‘action significative de la présence d‘un épiderme formé de

cellules provenant de cicatrices hypertrophiques sur la formation d‘un derme fibrotique

(Bellemare, Roberge et al. 2005). Des études ont également montré que l‘effet de l‘épiderme sur

le derme dans les cicatrices hypertrophiques est un effet paracrine pouvant être mimé par l‘ajout

de milieu conditionné par des kératinocytes cultivés en monocouche (Bergeron 2005). Des

expériences ont montré que cet effet peut partiellement être expliqué par une augmentation de la

production de TIMP-1 par les cellules pathologiques (Simon et al. 2012). Le but de mes travaux

était donc d‘identifier l‘ensemble des facteurs sécrétés par les kératinocytes responsables de

l‘augmentation de la fibrose induite par les kératinocytes de cicatrices hypertrophiques.

Objectif:

Trouver le ou les facteurs kératinocytaires responsables de la fibrose dans les cicatrices

hypertrophiques.

Objectifs spécifiques:

Déterminer les variations dans les profils de sécrétions protéiques des kératinocytes

normaux et hypertrophiques cultivés en monocouche grâce à la méthode d‘électrophorèse

en deux dimensions 2D-DIGE suivie d‘une identification des protéines d‘intérêt par

spectrométrie de masse

Valider les résultats en quantifiant les protéines d‘intérêt par des méthodes spécifiques

comme l‘ELISA, le Western blot et les dosages enzymatiques

24

CHAPITRE 2:

MATÉRIELS ET MÉTHODES

25

PARTIE I: Culture cellulaire

26

Cellules utilisées:

La constitution d‘une banque de cellules se fait à partir de biopsies cutanées prélevées chez des

donneurs volontaires. Chaque population de cellules provient d‘un donneur dont l‘anonymat est

protégé par un numéro suivant l‘abréviation des différents types cellulaires. Une biopsie de peau

normale permet l‘isolement des kératinocytes normaux (KA). L‘isolement des kératinocytes

hypertrophiques (KH) est effectué à partir d‘une biopsie de cicatrice obtenue suite à une

chirurgie correctrice chez un patient ayant une cicatrice hypertrophique. Les cellules récupérées

de la biopsie sont congelées après un passage en culture in vitro. Les cellules sont cultivées au

moins pendant un passage après décongélation avant d‘être utilisées.

Le numéro de passage (Px) pour chaque lignée cellulaire représente le nombre d‘ensemencement

de ces cellules in vitro. Le P0 ou passage zéro correspond au premier ensemencement post-

extraction. Dans nos études, les cellules épidermiques (KA et KH) sont utilisées en passage 2.

Milieu de culture:

Les kératinocytes, KA et KH sont cultivés dans le milieu DME Ham‘s complété avec 5% de

sérum de veau reconstitué (FCS) (Hyclone, Flow Labs Missisauga, Ontario, Canada), 10 ng/ml

d‘EGF (Chiron Corp., Emeryville, CA), 5 µg/ml d‘insuline (I), 10 -10

M de toxine du choléra

(Tc) (Schwarz/Mann, Cleveland, OH), 0,4 µg/ml d‘hydrocortisone (H) (Calbiochem, La Jolla,

CA), 100 U/ml de pénicilline (P) et 25 µg/ml de gentamicine (Sigma, St. Louis, MO). Les

cellules sont toutes cultivées en présence de fibroblastes de souris 3T3 irradiés à une température

de 37° C dans une atmosphère contenant 8% de CO2.

27

Préparation des milieux conditionnés des populations de cellules:

Huit populations différentes de KA et de KH ont été utilisées. La liste des populations est donnée

dans le tableau ci-après. Lorsque les kératinocytes sont à 80% de confluence, quatre lavages

successifs des cellules sont effectués avec du milieu DME Ham‘s afin d‘enlever le sérum. Les

cultures sont ensuite mises en présence de (10 ml/75 cm2) milieu DME Ham‘s sans additifs

pendant 24 h.

Récupération des surnageants de KA et KH pour gels 2D:

Les surnageants de culture sont récupérés après 24 heures. Ils sont centrifugés, aliquotés et

congelés à -80° C.

28

Population

cellulaires Provenance de la biopsie

Endroit de

prélèvement

Sexe du

donneur

Âge du

donneur

(ans)

Âge de la

cicatrice

Traitement

administré

KKA Peau normale humaine Bras Femme 29 ø ø

KKB Peau normale humaine Bras Femme 29 ø ø

KMC Peau normale humaine Bras Femme 25 ø ø

KND Peau normale humaine Bras Femme 34 ø ø

KBP Peau normale humaine - Homme 23 ø ø

KSL Peau normale humaine - Homme 24 ø ø

KMJG Peau normale humaine - Femme 23 ø ø

KH5 Cicatrice hypertrophique Limite pubis-

abdomen Femme 60 6 mois Inconnu

KH6 Cicatrice hypertrophique Épaule Inconnu Inconnu Inconnu Inconnu

KH7 Cicatrice hypertrophique Abdomen Femme 13 Qqles

années Inconnu

KH8 Cicatrice hypertrophique Inconnu Inconnu Inconnu Inconnu Inconnu

KH9 Cicatrice hypertrophique Abdomen Femme 69 4 ans Inconnu

KH10s Cicatrice hypertrophique Sein Femme 48 8 mois ø

KH12 Cicatrice hypertrophique Inconnu Inconnu Inconnu Inconnu Inconnu

Figure 8: Caractéristiques des différentes populations cellulaires de kératinocytes testées lors de ces

travaux. Ce tableau résume le nom de la population, la provenance, l‘endroit du prélèvement de la

biopsie, le sexe, l‘âge du donneur, l‘âge de la cicatrice et le traitement administré à la cicatrice avant la

biopsie.

29

PARTIE II: Électrophorèse en deux

dimensions (Gel 2D-DIGE)

30

Analyse différentielle des surnageants de KA et KH par la méthode

d’électrophorèse en deux dimensions:

Pour chaque population cellulaire, 50 ml de milieu conditionné pendant 24 h sont

précipités par la technique du TCA-DOC.

1. Précipitation de protéines faiblement concentrées par la méthode de

TCA-DOC:

La précipitation au TCA (acide trichloracétique) est une méthode pour précipiter les protéines

lorsqu‘elles sont en concentration faible. De plus, cette méthode permet le retrait des sels

indésirables pour effectuer une analyse électrophorétique. La précipitation TCA-DOC

(Déoxycholate de Sodium) permet d‘éliminer certains éléments interférents comme les agents

réducteurs, les détergents, les sels, les lipides, les composés phénoliques et les acides nucléiques

tout en conservant intactes les protéines de l‘échantillon. L‘élimination de ces contaminants

améliore l‘efficacité du marquage CyDye et augmente la résolution du patron de migration

électrophorétique. Les études ont montré que la quantité de protéines précipitées est dépendante

de la concentration du TCA. Bensadoun et Weinstein (1976) ont montré que l‘ajout d‘un agent

coprécipitant, le DOC, améliore la récupération. Le DOC est un détergent à pH neutre. Par

contre, son acidification réduit considérablement sa solubilité. Pour effectuer la précipitation, 33

ml de milieux conditionnés sont récupérés à lesquels sont ajoutés 330 µl de solution 2% de DOC

(1% v/v) suivie d‘une incubation sur glace pendant 30 minutes. Un point important à noter est

d‘éviter la production de bulles en mélangeant avec la pipette car cela peut causer la dénaturation

des protéines. Après 30 minutes d‘incubation, 3.33 ml de TCA (10% v/v final) sont ajoutés

entraînant un changement de couleur de la solution du rouge vers l‘orange, suite à une

modification du pH. Après une incubation sur glace d‘une heure, une centrifugation de

15000g/20 min est effectuée à 4°C. Vingt ml d‘acétone 100% sont déposés sur le culot qui est

vortexé doucement en évitant de le dissocier. Le culot est conservé à -20°C pour 5 minutes. Une

centrifugation de 15000g/5 min est réalisée à 4°C et le surnageant est enlevé. Un 2ème

lavage avec

5 ml d‘acétone 100% est ensuite réalisé comme précédemment. Le culot de protéines est séché

en utilisant un vacuum avec une pipette pasteur avant d‘être resolubilisé dans 200 µl de tampon

31

IEF (Isoelectric Focusing) (7 M urée, 2 M thiourée, 30 mM Tris et 4% CHAPS) en vortexant

jusqu‘à dissolution complète. Afin de faciliter la solubilisation du culot, l‘échantillon est soniqué

avec une micropointe pour dissoudre les agrégats (pulse court de faible intensité, sur glace). Il est

important que la température des échantillons ne dépasse pas 37°C, la chaleur accélérant la

carbamylation des protéines en présence de l‘urée. La carbamylation affecte le patron de

migration des protéines en provoquant l‘étalement des spots lors d‘une migration en première

dimension (IEF). Une centrifugation de 15000g/10 min à température pièce est ensuite effectuée

afin d‘éliminer les débris insolubles. Le surnageant est transféré dans un nouveau microtube et le

pH de l‘échantillon est mesuré. Le pH optimal pour le marquage protéique avec le CyDye est de

8.5. Si le pH diffère de 8.5±0.5, il faut effectuer un réajustement car une valeur différente de pH

va diminuer l‘efficacité de la réaction de marquage. Une fois le pH ajusté, la concentration

protéique est dosée par la méthode de Bradford.

2. Dosage de la concentration protéique par la méthode de Bradford:

La méthode de Bradford est un dosage protéique de type colorimétrique impliquant la liaison du

colorant Bleu de Coomasie G-250 avec les acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine et

phénylalanine) et avec les résidus hydrophobique d‘acides aminés composants les protéines. Le

colorant existe sous trois formes: cationique (rouge), neutre (vert) et anionique (bleu). Sous

condition acide, le colorant est majoritairement dans la forme cationique rouge doublement

protonée (Amax=470 nm). Par contre, lorsque le colorant se lie à une protéine, il est converti en

forme stable non-protonée de couleurs bleu (Amax=595 nm). Le changement d‘absorbance à 595

nm est proportionnel à la quantité de colorant lié; ainsi, en condition d‘excès de colorant et en

utilisant une gamme étalon d‘un standard protéique nous pouvons déterminer la concentration

protéiques d‘un échantillon. Contrairement aux autres méthodes de mesure de la concentration

protéique, la méthode de Bradford est moins sensible aux interférences causées par différents

agents présents dans les échantillons protéiques. Elle est toutefois affectée par les détergents,

modifiée par le pH, ne réagit pas avec les protéines de faible poids moléculaire (<3000 Da) et

possède une faible linéarité. Les échantillons solubilisés dans du tampon IEF peuvent être dosés

par la méthode de Bradford dite de «High Range» sans dilution dans un autre tampon ou «Low

Range» en diluant au 1/80 au minimum sans tenir compte de la concentration protéique de

32

l‘échantillon qui possiblement requiert des dilutions supérieures pour se situer à l‘intérieure de la

gamme du standard. La méthode utilisée dans mes expériences est la méthode «High Range» qui

n‘a pas besoin de dilution dans un autre tampon sauf d‘une première dilution dans le tampon

d‘IEF. Le tampon IEF contient 7 M urée, 2 M thiourée, 30 mM Tris et 4% CHAPS. Le réactif de

Bradford est brun à l‘état libre. Quand il se lie aux protéines, il prend une teinte bleue qui

possède un coefficient d‘extinction molaire élevé à 595 nm.

3. Marquage des échantillons:

Le marquage des échantillons se fait avec le réactif «CyDye DIGE Fluor minimal dye labeling»

qui est composé de trois fluorochromes de cyanines (Cy2, Cy3 & Cy5) avec des caractéristiques

spectrales distinctes; ceux-ci ont été sélectionnés pour la similitude de leurs masses et de leurs

charges. Lorsque conjugué à une protéine, chaque fluorochrome ajoute 650 Da à la masse de la

protéine. Cet ajout n‘affecte pas visiblement le patron de migration lors de la séparation sur IEF

et SDS-PAGE. De plus, la charge globale des protéines n‘est pas modifiée par l‘ajout de

cyanines fluorescentes en raison du remplacement d‘une charge +1 de lysine en milieu acide par

une charge +1 des cyanines. Le marquage repose sur la présence du groupement N-hydroxy-

succinimidyl (NHS) ester présent sur les 3 réactifs CyDyes, et une réaction de substitution

nucléophile avec le groupe amine en epsilon des lysines. Le groupement NHS ester permet la

formation d‘une liaison amide entre les résidus lysines des protéines et les fluorochromes

CyDyes. Les échantillons protéiques à analyser sont dilués à une concentration unique de 5 à 10

µg/µl dans du tampon IEF. Il est important d‘avoir tous les échantillons prêts pour effectuer une

expérience de séparation par électrophorèse 2D-DIGE afin de pouvoir préparer un échantillon

regroupant un aliquot de tous les échantillons (pool). Ce pool contient une même quantité de tous

les échantillons et sera marqué avec le fluorochrome Cy2. Dans cette expérience, les surnageants

de culture de 8 populations de KA et 8 populations de KH ont été utilisés. La moitié (sélection

aléatoire) des échantillons ont été marqués avec le fluorochrome Cy3 et l‘autre moitié avec le

marqueur Cy5. Le but de cette sélection aléatoire des échantillons est d‘éliminer les biais

possibles liés aux marquages. La quantité optimale de protéines à déposer par puits pour un

marquage CyDye est 40% de la quantité totale. Une concentration protéique de 2 µg/µl est

nécessaire pour le marquage CyDye. Quarante µg (pour un volume de 20 µl) de chaque

33

échantillon ont donc été utilisés pour chaque marquage avec les CyDyes. Chaque CyDye est

dilué dans du tampon DMF (Dimethyl formamide) à une concentration de 1 mM puis 0.8 µl du

marqueur est ajouté dans chaque tube contenant 40 µg de protéines à marquer, avant d‘être

incubé pendant 30 minutes, sur la glace et à l‘abri de la lumière. Pour arrêter la réaction, de la

lysine (0.2 mM de concentration finale) est ajoutée dans les échantillons. Les mélanges sont

ensuite vortexés et incubés 10 minutes sur glace à la noirceur. Les échantillons sont conservés à

la noirceur à -80ºC pour un maximum de 3 mois. Il est à noter que le réactif «CyDye DIGE Fluor

minimal dye» ne permet le marquage que d‘une faible proportion des protéines d‘un échantillon.

Le ratio de 400 pmol CyDye par 50 µg de protéine assure que le colorant marque seulement 1 à 2

% des résidus lysines, impliquant le marquage des protéines avec un seul fluorochrome par

protéine (absence de conjugaison multiple).

Figure 9: Les étapes de marquage CyDye. Les protéines sont précipitées. Un mélange de tous les

échantillons permet d‘obtenir un pool des échantillons qui sera le standard interne de l‘expérience. Le

standard interne (pool) est marqué avec Cy2 et les échantillons sont marqués avec Cy3 ou Cy5 d‘une

façon aléatoire avec un ratio de 400 pmol de colorant/50 μg de protéines.

(http://www.bio.iitb.ac.in/~sanjeeva/virtual_lab/Virtual_Laboratory/2DG_manual.html)

34

4. Migration selon une première dimension:

La migration selon une première dimension est une migration dans laquelle la séparation des

protéines se fait en fonction de leur point isoélectrique. Le point isoélectrique est un pH où les

charges positives et négatives d‘une protéine sont en même quantité, induisant une charge

globale nulle. La migration selon la première dimension se fait dans des bandelettes. La

technique du gel 2D-DIGE permet la migration concomitante de 3 échantillons différents dans la

même bandelette. Dans cette expérience, un échantillon de KA marqué avec Cy3/5, un

échantillon de KH marqué avec Cy5/3 et un standard interne marqué avec Cy2 sont déposés dans

chaque bandelette. Pour cela, 16 µl de chaque échantillon sont mélangés dans un tube puis

l‘échantillon est dilué de moitié avec du tampon d‘échantillon composé du 500 µl Tampon I+ 5

µl IPG buffer (0.5 % final) + 4.7 µl DTT (1 mM final) (Le tampon I est un tampon

d‘équilibration qui réduit les protéines. Le tampon d‘IPG est un ampholyte transportant des ions;

le DTT (dithiothréitol) est un agent réducteur fort réduisant les ponts disulfures des protéines) +

0.25 µl de Bleu bromophénol (pour visualiser la migration). Une quantité totale.de 90 µg de

protéines est déposée par bandelette (30 µg pour les échantillons Cy2, Cy3 et Cy5). Cette

quantité est optimale selon la compagnie vendant les bandelettes (GE-Amersham). Les

bandelettes sont réhydratées avec une solution contenant 3 ml tampon I + 49.4 µl Destreak + 15

µl tampon IPG + 1.5 µl de Bleu bromophénol. Destreak est un réactif qui joue plusieurs rôles au

cours de la migration en deux dimensions. Il améliore la reproductibilité et la qualité des gels 2-

D en empêchant les rayures et élimine les taches supplémentaires causées par l'oxydation non

spécifique des protéines. Il stabilise également les protéines tout au long de la migration en 2-D,

assurant des profils protéiques simplifiés et bien résolus. La solution protéique est ensuite diluée

dans la solution de réhydratation des bandelettes afin d‘obtenir un volume finale de 450 µl avec

une concentration finale de 90 µg/ml. 450 µl du mélange sont déposés dans l‘appareil IPG box

en présence d‘une bandelette de 24 cm pour une incubation à température pièce pendant 16-20 h.

35

La bandelette réhydratée contenant les échantillons protéiques est ensuite déposée sur la plaque «

strip holder » du système Ettan IPG phore pour une migration selon la première dimension. Les

bandelettes sont constituées d‘un côté positif (+) et d‘un côté négatif (-). Du côté acide (+) de la

bandelette, de l‘eau apyrogène est ajoutée ainsi qu‘un morceau de papier. Du côté (-), un

mélange du tampon I + Destreak est ajouté ainsi qu‘un morceau de papier. Les électrodes sont

déposées sur le papier vis-à-vis du gel et 110 µl de Drystrip Cover Fluid (huile afin d‘éviter

l‘évaporation) sont ajoutés afin de recouvrir la bandelette. Le logiciel Ettan ™ IPG phore permet

de suivre les différentes étapes d‘avancement de la première migration. Les conditions de

migration sont un voltage de 500V pendant une heure.

Figure 10: Les bandelettes sont utilisées pour permettre la migration selon une première dimension.

Comme la bandelette reçue est sèche et congelée, il faut la réhydrater avant d‘utilisation. Les étapes de

réhydratation et de dépôt d‘échantillons se font en même temps.

Figure 11: Schéma du système Ettan IPG-phore.

36

Figure 12: Schéma représentant les migrations des échantillons selon les deux dimensions. Les

échantillons préparés sont marqués avec des marqueurs CyDyes. Ensuite, une même portion des 3

échantillons est mélangée afin de préparer le pool. Les protéines du pool sont également marquées avec

les marqueurs CyDyes. Les échantillons à étudier et les protéines du pool sont ensuite séparés grâce à un

gel 2D-DIGE. La première dimension (a-c) montre la migration des protéines en fonction de leur point

isoélectrique qui est un pH auquel la charge des protéines est neutre. La deuxième dimension (d-e) est une

séparation en fonction du poids moléculaire des protéines.

(http://www.ucl.ac.uk/ich/services/lab-services/mass_spectrometry/proteomics/technologies/2d_page

37

5. Migration selon une deuxième dimension:

La migration selon la deuxième dimension est une migration selon laquelle les protéines sont

séparées en fonction de leur poids moléculaire. Pour réaliser cette étape, des gels SDS-PAGE

12.5% sont préparés. Les bandelettes contenant les échantillons protéiques et ayant subi une

première migration sont rincées deux fois avec un tampon permettant de réduire les ponts di-

sulfures. Un rinçage rapide des bandelettes avec du tampon de migration (Running Buffer 5X,

1.5 M Tris, pH 8.8 qui contient 60.5 g Tris+ 288 g glycine+ 40 g SDS complété à 4L d‘eau

appyrogène) est ensuite effectué avant de déposer les bandelettes sur les cassettes du gel SDS-

PAGE en gardant toutes les sections acides (+) du même côté. La solution violette d‘agarose,

permettant de solidifier la bandelette sur le gel de polyacrylamide, est ajoutée en faisant attention

d‘éviter les bulles d‘air qui peuvent s‘accrocher sur les bandelettes et gêner la migration. Les

cassettes sont ensuite placées dans la cuve de migration remplie du tampon de migration et un

voltage de départ de 0.5 V par gel est appliqué. Il est ensuite possible d‘augmenter le voltage

jusqu‘à 1.75 V. Les échantillons migrent dans le gel en fonction de leur poids moléculaire.

Figure 13: Dépôt des bandelettes dans la cassette déjà assemblée et contenant le gel de migration selon la

2ème

dimension. L‘ensemble est mis dans la cuve de migration et un réglage de voltage permet aux

échantillons de migrer selon leurs poids moléculaire.

38

6. Acquisition et analyse des images en fluorescence:

L‘acquisition des images des gels après migration est faite avec un scanneur Typhoon TRIO +

(GE-Healthcare) permettant de détecter la fluorescence des protéines. Les logiciels ImageQuant

(GE-Healthcare) et Typhoon scanner (GE-Healthcare) control sont utilisés. Pour chaque gel,

trois images sont acquises en fonction de la longueur d‘onde d‘émission de chaque fluorochrome

(Cy2, Cy3 et Cy5). Les images sont ensuite analysées avec le logiciel Delta 2D (Decodon). C‘est

un logiciel qui permet de corriger les variations entre les gels en manipulant chaque image,

permettant de mettre au même endroit les points provenant des standards internes.

Figure 14: Scanneur Typhoon pour l‘acquisition des images en fluorescence. Deux cassettes peuvent être

placées en même temps pour l‘acquisition des images.

39

Figure 15: Schéma des analyses des images acquises par le scanneur Typhoon avec le logiciel Delta 2D.

Trois images de chaque gel en fonction de la longueur d‘onde des différents fluorochromes (Cy2 jaune,

Cy3 rouge, Cy5 vert) sont prises pour les analyses.

La figure 15 est un exemple d‘analyse réalisée avec 5 gels. Une connexion entre les 3 images du

même gel est faite par le logiciel (connexion intragel), puis via chaque standard interne de

chaque gel (connexion intergel). Une correction des variations intergels est effectuée puis

transférée aux gels liés (intragel). Par la suite, la fusion de tous les gels est faite et une carte

protéomique est créée correspondant à un patron général de tous les points présents dans

l‘ensemble des gels. Dans mes travaux, 7 membres de la famille KA et 7 membres de la famille

KH sont comparés au niveau de leur patron de sécrétion protéique. Les quantifications et

analyses statistiques sont réalisées. Dans cette analyse, un regroupement hiérarchique

(Hierarchical Clustering) et le test statistique de Mann-Whitney avec α = 0.01 ont été réalisés, les

points montrant une moyenne de densité entre les deux catégories de cellules de plus de 50% de

variations sont sélectionnés.

40

7. Coloration du gel et excision des points d’intérêt:

Pour pouvoir envoyer les points au centre de spectrométrie de masse pour analyser leur contenu

en protéines, il faut exciser les points d‘intérêt. Les points étant marqués avec un marqueur

fluorescent, ils ne peuvent être visualisés facilement. Il est donc important de colorer le gel avec

un marqueur visible à l‘œil. Il y a différentes façons de colorer un gel comme la coloration au

bleu de Coomassie (technique peu sensible) et au nitrate d‘argent (plus sensible mais pouvant

créer des produits interférants avec la spectrométrie de masse). Une coloration au nitrate d‘argent

a été réalisée selon 3 protocoles différents (Silver standard (O‘Connell, Stults, 1997), Sweet

Silver (Chevallet et al. 2008) et Blue Silver (Candiano et al. 2004)). Les tests effectués montrant

une meilleure sensibilité à la détection des protéines par spectrométrie de masse, la coloration

Blue Silver a été finalement utilisée.

Figure 16: Exemple d‘un gel coloré au nitrate d‘argent.

41

8. Spectrométrie de masse:

La spectrométrie de masse (en anglais, mass spectrometry ou MS) est une technique physique

d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d‘intérêt par mesure de leur masse,

et de caractériser leur structure chimique. Son principe réside dans la séparation en phase

gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). Le travail

a été effectué au CHUL par le service de protéomique. À partir d'une bande/point provenant d'un

gel SDS-PAGE 1D ou 2D coloré au bleu de coomassie, SYPRO Ruby ou nitrate d‘argent, une

digestion à la trypsine est effectuée et les peptides obtenus sont injectés dans un système HPLC

(High-performance liquid chromatography) capillaire couplé à un spectromètre de masse avec

source nanospray. Le spectromètre mesure la masse (m/z) du peptide et le fragmente aux niveaux

des liens peptidiques. Cette fragmentation génère un spectre MS/MS qui est une représentation

de la séquence du peptide. L'interrogation d'une banque de protéines par la suite à l'aide de

logiciel spécifique (exemple: Mascot®) permet de trouver la séquence du peptide et donc de la

protéine par comparaison de la fragmentation théorique des séquences de la banque de données

avec celle obtenue expérimentalement.

Figure 17: Principe général de spectrométrie de masse.

42

9. Analyses des résultats de spectrométrie de masse:

L‘analyse des résultats obtenus par la spectrométrie de masse a été faite avec le logiciel Scaffold

Viewer (Proteome Software). C‘est un logiciel qui compare les séquences obtenues avec une

banque de données pour déterminer la similitude des séquences présentes dans l‘échantillon

étudié avec les séquences de la banque de données. Seules les séquences concordantes avec plus

de 95% de probabilité ont été retenues et les protéines correspondantes à ces séquences sont

analysées.

Figure 18: Image générale du logiciel Scaffold Viewer.

43

Partie III: Western blot, ELISA, test de

mortalité cellulaire et dosage de l’activité

MMP

44

1. Western blot:

Un western blot (ou immunoblot) est une méthode de protéomique pour détecter un/des

épitope(s) spécifique(s) (protéine) dans un échantillon donné d‘extrait ou d‘homogénat tissulaire.

La technique utilise l‘électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium

dodécylsulfate (SDS-PAGE) pour séparer les protéines selon leur masse. Le réseau de

polyacrylamide est formé par polymérisation de monomère d‘acrylamide en présence d‘une

petite quantité de bis-acrylamide. Le bis-acrylamide permet de lier les polymères d‘acrylamide

entre eux, il est utilisé comme agent pontant. La polymérisation de l‘acrylamide est une catalyse

par radicaux libres initiée par l‘addition de persulfate d‘ammonium et de TEMED qui catalyse la

décomposition des ions persulfates pour donner un radical libre. La polymérisation continue

jusqu‘à ce qu‘il n‘y ait plus de monomère d‘acrylamide libre. Le système utilisé pour le western

blot comprend deux modes successifs de migration électrophorétique, un gel de concentration

(stacking gel) et un gel de séparation (resolving gel). Le passage de l‘un à l‘autre se fait avec un

changement de pH et par une augmentation de la concentration en acrylamide du gel. L‘objectif

du gel d‘électrophorèse en deux parties est de pallier aux problèmes liés aux faibles quantités de

protéines et aux volumes parfois non négligeables déposés dans les puits. Les protéines séparées

selon leur poids moléculaires sont ensuite transférées sur une membrane, où elles sont exposées à

un anticorps spécifique à la protéine d‘intérêt. Il est possible grâce à cette technique de détecter

la présence d‘une protéine dans un homogénat protéique, d‘évaluer son poids moléculaire, sa

concentration, d‘effectuer des comparaisons entre différents extraits, etc. Il est important de

travailler sur glace pendant cette technique afin de prévenir la dégradation des protéines par les

protéases. Il est conseillé d‘extraire un maximum de protéines, de les doser, d‘en préparer une

partie pour l‘électrophorèse et d‘en conserver pour éventuellement en faire un autre usage

(Sébastien Larochelle, protocole LOEX).

45

o Extraction des protéines cellulaires:

Les cellules cultivées et traitées avec du milieu DH sans additifs pendant 24 heures sont

trypsinées, comptées au compteur Coulter® et rincées 2 fois par centrifugation avec 5 ml de PBS

afin d‘enlever le sérum résiduel. Le culot cellulaire est ensuite suspendu dans un volume du

tampon d‘échantillon (TE 2X + Complete® (Roche) (un ensemble d‘inhibiteurs de protéases afin

d‘éviter la dégradation des protéines : staurosporine à 200 nM (inhibiteur de protéine kinase C)

et Na3VO4 à 2 mM (inhibiteur des phosphatases)). Les échantillons sont homogénéisés par

sonication avec des impulsions courtes à 15% d‘amplitude pour éviter de briser les protéines,

puis chauffés à 95ºC pendant 5 minutes afin de dénaturer les protéines de l‘extrait. Les

échantillons sont vortexés et centrifugés afin de récupérer les échantillons présents sur les parois,

aliquotés et gardés congelés.

o Dosage des protéines par la méthode micro BCA:

La méthode de dosage des protéines par la méthode de micro BCA (Thermo Scientific) est basée

sur un dosage colorimétrique des protéines. Elle a été effectuée comme décrit dans le protocole

de la compagnie.

o Préparation des solutions protéiques:

Les extraits sont dilués dans du tampon TE 2x afin d‘obtenir une concentration protéique

identiques pour tous les échantillons de 3 µg/ µl permettant de déposer 10 µl soit 30 µg par puits.

Du β-mercaptoéthanol (0.12 µg/ µl final) et du bleu de bromophénol (0.15 µg/ µl final) sont

également ajoutés avant de chauffer les échantillons 5 minutes à 95ºC avant d‘être congelés.

o SDS – PAGE: Sodium Dodecyle Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

C‘est une technique de migration des échantillons sur des gels d‘acrylamide. Pour cette

technique, 2 gels avec le pourcentage d‘acrylamide différent sont utilisés en séquence. Le gel de

concentration (stacking gel) est un gel avec 4% d‘acrylamide qui permet de concentrer les

protéines avant leur entrée dans le deuxième gel, un gel de séparation. C‘est un gel avec 10 %

46

d‘acrylamide qui permet la migration des protéines selon leur poids moléculaire. Les

échantillons sont déposés à raison d‘un volume de 5 µl/puits. Pour minimiser la diffusion latérale

des protéines, il faut remplir les puits vides avec du tampon d‘échantillon complet (TE 1X). La

migration des échantillons est effectuée à un voltage de 100 V pendant 2 heures jusqu‘à ce que le

bleu de bromophénol ajouté aux échantillons atteigne le bas du gel.

o Transfert:

C‘est une étape qui permet de transférer sur une membrane les protéines ayant migrées dans le

gel. Il existe 2 types de membranes utilisées pour transférer les protéines: la membrane de PVDF

et la membrane de nitrocellulose. Pour avoir un transfert correct, il est important d‘utiliser le

tampon de transfert adéquat pour le type de membrane utilisée. Une membrane de nitrocellulose

ainsi qu‘un tampon CAPS ont été utilisées dans mes expériences. Le tampon CAPS est un

mélange de 4.426 g de CAPS + 1.8 L d‘eau apyrogène + 200 ml de MeOH (méthanol). Pour

transférer les protéines du gel à la membrane il y a deux possibilités: soit un transfert en 2 heures

avec un voltage de 110 V, soit un transfert toute la nuit avec un voltage de 30 V.

o Coloration de la membrane:

Lorsque le transfert est terminé, la membrane est colorée au Rouge S Ponceau en l‘incubant 5

minutes avec agitation. La coloration au Rouge S Ponceau permet de vérifier l‘uniformité du

transfert. Après 5 minutes, la membrane est rincée avec de l‘eau distillée afin d‘augmenter le

contraste entre les bandes protéiques et le bruit de fond. Une fois les bandes visualisées, la

membrane est rincée avec du tampon de transfert afin d‘éliminer le colorant et est conservée

dans du PBS à 4ºC.

o Immuno détection (blotting):

Cette étape permet de détecter les protéines d‘intérêt dans l‘extrait cellulaire grâce à l‘ajout

d‘anticorps. La membrane est lavée avec du PBST (PBS + 0.05% Tween 20) et les sites

antigéniques sont saturés avec du PBS + 5% lait en poudre par incubation 1 heure avec agitation.

47

L‘anticorps primaire, déjà dilué dans du PBS + 5% lait, est ensuite ajouté pour une incubation de

1 heure avec agitation. Après lavage, un deuxième blocage des sites antigéniques est fait avec

PBST + 5% lait pendant 45 minutes avec agitation. Une incubation de 1 h avec agitation avec

l‘anticorps secondaire dilué dans du PBST + 5% lait est ensuite effectuée. Après rinçage, la

membrane est conservée dans du PBS à 4ºC jusqu‘à la révélation.

o Révélation par chimioluminescence:

L‘étape de révélation est une dernière étape qui permet de détecter l‘enzyme couplé à l‘anticorps

secondaire. Le luminol contenu dans la solution de révélation est oxydé en condition alcaline par

le système HRP/H2O2 ce qui l‘amène dans un état d‘excitation. La membrane est rincée une fois

dans du PBS 1X. La solution de Supersignal® (Thermo Scientific) est préparée selon les

indications de la compagnie. La membrane est incubée 1 minute dans le réactif puis déposée sur

une pellicule de plastique. Une acquisition de la lumière émise est ensuite rapidement effectuée

selon différents temps d‘acquisition par l‘appareil de lecture Fusion FX7 (MBI Lab Equipment)

et le logiciel Fusion (vilber lourmat).

2. ELISA:

La technique d‘ELISA est une technique pour quantifier la protéine d‘intérêt dans les

échantillons. Une trousse ELISA permettant de doser la quantité de la protéine SPINK5 dans les

surnageants de culture a été utilisée selon le protocole de la compagnie USCNK. La lecture de la

plaque est faite grâce à un spectrophotomètre et le logiciel SoftMax Pro (Molecular Devices) à

une longueur d‘onde de 450 nm.

48

3. Décompte des cellules mortes au compteur Coulter®:

La mortalité cellulaire dans les cultures a été évaluée par comptage des cellules flottantes dans le

surnageant. Pour réaliser cette expérience, les différentes populations de kératinocytes en

passage 1 sont cultivées en monocouche. À 80% de confluence, les cellules sont lavées puis du

milieu sans sérum et sans additif est ajouté. Après 24 heures, le surnageant de culture est

récupéré et centrifugé à 15000g pendant 20 minutes à 4 ºC. Le culot est alors dilué avec 10 ml

d‘isoton avant de faire un comptage au compteur Coulter®.

4. Dosage de l’activité enzymatique de MMPs:

Pour déterminer le niveau d‘activité des MMPs dans les surnageants de culture des kératinocytes

un dosage enzymatique est effectué sur les surnageants de différentes populations de

kératinocytes en utilisant le kit de dosage SensoLyte® 520 Generic MMP Assay (AnaSpec).

Afin de doser l‘ensemble des MMPs présentes dans le milieu de culture, celles si sont activées en

incubant les échantillons avec le réactif de mercure (APMA à une concentration de 1 mM)

pendant 3 heures à 37°C. Un peptide, substrat des MMPs est ensuite ajouté à l‘échantillon et une

lecture de la fluorescence générée lors de la coupure du substrat est effectuée par

spectrofluoromètre à une longueur d‘émission de 520 nm. Le logiciel «Skanlt RE for Varioskan

Flash 2.4.3» (Thermo) permet de suivre les modifications de fluorescence en fonction du temps.

49

CHAPITRE 3:

RÉSULTATS

50

3.1. Composition protéique des différents surnageants (gel 2D):

La composition protéique de différents surnageants de kératinocytes normaux et hypertrophiques

(7 par catégories de cellules) a été analysée par électrophorèse bidimensionnelle puis

spectrométrie de masse afin de déterminer les facteurs épithéliaux responsables de

l‘augmentation de la fibrose dans les cicatrices hypertrophiques.

Figure 19: Image générale d‘un gel 2D avec les points à analyser par spectrométrie de masse. Les points

de différentes couleurs montrent une différence dans le patron de sécrétion de deux familles de

kératinocytes.

51

3.2. Analyse des gels par le logiciel Delta 2D:

Les analyses de tous les gels, le transfert des corrections aux gels liés et une fusion de tous les

gels permettent de créer une carte protéomique (Figure 20). L‘axe des X présente les différents

échantillons: 7 surnageants de culture de KA et 7 de KH. L‘axe des Y présente les numéros

d‘identification de chaque point détecté sur le gel. Chaque point correspond à un groupe des

protéines/peptides ayant un poids moléculaire et un point isoélectrique similaires. Au croisement

de X et Y, la couleur représente l‘intensité fluorescente de chaque point. La couleur verte signifie

une faible expression de la/les protéines par rapport à la moyenne de l‘ensemble des protéines

du gel et la couleur violette, une expression élevée.

Afin de déterminer les points protéiques significativement différents entre les surnageants de

culture provenant des KA et des KH, un test non paramétrique Wilcoxon-Mann-Whitney (alpha

= 0.01) a été effectué. Ce test permet de comparer l‘intensité de fluorescence obtenue pour

chaque point protéique et entre les deux catégories de populations (Figure 21). Ce test nous a

permis de déterminer que 107 points sur 1057 points détectés étaient significativement différents

entre les surnageants des KA et des KH. Ce nombre de points étant encore trop important pour

une analyse par spectrométrie de masse, nous avons sélectionné les points qui avaient en

moyenne plus de 50% de variation entre les surnageants de KA et de KH. Ceci a permis de

mettre en évidence 16 points distinctifs entre les deux catégories de kératinocytes (Figure 22).

Des analyses statistiques par «Hierarchical Clustering» (regroupement hiérarchique) regroupent

les échantillons en fonction du schéma d‘expression des protéines observées. Ceci permet de trier

les échantillons en fonction de l‘homologie de leur patron de sécrétion. Les résultats sont donnés

sous la forme d‘un arbre placé sous la liste des échantillons en X. Ce classement nous a permis

de démontrer que les surnageants de culture des KA sont nettement différents de ceux des KH

puisque l‘ensemble des surnageants est nettement divisé entre les KA (à gauche) et les KH (à

droite) (Figures 20, 21, 22).

52

Figure 20: Image générale de la carte protéomique obtenue par le logiciel Delta 2D. Le patron de

sécrétion des protéines est détecté par l‘intensité de fluorescence de chaque point. La couleur verte

signifie une expression moins élevée des protéines et la couleur rose signifie une expression plus élevée

des protéines.

Figure 21: La carte protéomique suite à un test non paramétrique de Wilcoxon-Mann-Whitney, alpha =

0.01, (n=7) permettant d‘éliminer les points de densité identique entre les deux catégories de populations.

KA KH

KA KH

Points significatifs: 107

Points non significatifs: 950

% points significatifs: 10%

53

Figure 22: Sélection des points montrant ± 50% de variation dans le patron de sécrétion

des protéines entre les Kératinocytes normaux (KA) et hypertrophiques (KH) (n=7). La couleur

verte signifie une expression moins élevée des protéines alors que la couleur rose signifie une

expression plus élevée des protéines.

Points significatifs: 16

Points non significatifs: 1041

% points significatifs: 1.5%

KMC

KKB

KND

KBP

KKA

KMJG

KSL

KH11

KH8

KH6

KH12

KH10s

KH5

KH7

KA KH

54

3.3. Analyse par spectrométrie de masse:

L‘analyse par spectrométrie de masse des 16 points protéiques (réalisée par la plateforme

protéomique du Centre de génomique de Québec du CHUQ) a permis d‘identifier différentes

protéines extracellulaires, intracellulaires et certains fragments inconnus. Les protéines SPINK5

et MMP-1 sont des protéines qui sont présentes à un niveau élevé dans le surnageant de culture

des kératinocytes normaux. Par contre, les protéines B4DPD5, PCNA (Proliferating cell nuclear

antigen), chaîne légère de la myosine, kératines de type I et II, A0N4V7, VATB2, calsyntenine-1

sont des protéines intracellulaires qui sont présentes à un niveau élevé dans le surnageant de

culture des kératinocytes hypertrophiques.

Figure 23: Image de gel 2D coloré en nitrate d‘argent afin de visualiser et exciser les points d‘intérêt. Les

protéines de 16 points ont été identifiées par spectrométrie de masse. Les protéines SPINK5 et MMP-1,

observées en plusieurs endroits, sont des protéines d‘intérêt dont la concentration est significativement

augmentée dans les surnageants de culture des kératinocytes normaux par rapport aux surnageants de

culture des kératinocytes de cicatrices hypertrophiques.

55

Figure 24: Carte protéomique avec le nom des protéines identifiées.

Les protéines obtenues dans la première moitié sont les protéines extracellulaires

alors que les protéines de la deuxième moitié sont les protéines intracellulaires.La

couleur rose signifie une expression plus élevée des protéines et la couleur verte

signifie une expression moins élevée des protéines. (n=7)

KMC

KKB

KND

KBP

KKA

KMJG

KSL

KH11

KH8

KH6

KH12

KH10s

KH5

KH7

KA KH

1021 MMP-1 1020 MMP-1 1044 MMP-1 223 Kazal-5 280 Kazal-5 1001 B4DPD5 990 PCNA 97 Myosine 641 Kératine 79 - 917 A0N4V7 526 VATB2 1019 - 401 A0N4V7 386 - 384 Calsyntenine-1

56

3.4. Détermination du taux de mortalité cellulaire:

La présence dans les surnageants analysés de protéines normalement présentes dans les cellules pourrait

être due à une augmentation du nombre de cellules mortes dans les cultures des KH par rapport aux KA.

Pour confirmer cette hypothèse, une évaluation des cellules mortes présentes dans les surnageants de

culture a été réalisée. Les résultats présentés dans la figure 25 confirment la présence faible mais

significative d‘une mortalité cellulaire plus élevée chez les KH que chez les KA.

Figure 25: Décompte des cellules mortes dans les surnageants de culture de kératinocytes

normaux (KA) et hypertrophiques (KH) afin d‘évaluer la mortalité cellulaire. Les résultats

montrent un taux de mortalité significativement plus élevé chez les kératinocytes hypertrophiques

(**P < 0.05, test t). (n=3 populations par catégorie)

**

N° des cellules mortes

/ml de surnageant de culture

57

3.5. Quantification de la protéine SPINK5 par la méthode ELISA:

Le dosage quantitatif de la protéine SPINK5 dans les surnageants de culture des deux familles de

kératinocytes par la méthode d‘ELISA ne montre aucune différence significative de cette

protéine entre les deux familles cellulaires.

Dosage SPINK5 par ELISA sur les surnageants

de culture KA et KH

KA

KH

0

50

100

150

200

250

La

qu

an

tité

de

pro

téin

e

SP

INK

5 p

g/1

06 c

ell

ule

s

Figure 26: Dosage ELISA de la protéine SPINK5 dans les surnageants de culture des

deux familles des kératinocytes (KA et KH). Les résultats montrent qu‘il n‘y a pas de

différence significative de la quantité de la protéine SPINK5 sécrétée par les deux

familles de cellules (n=7 populations par catégories).

58

3.6. Comparaison des niveaux de différenciation des kératinocytes par Western

blot:

Afin de déterminer si la sécrétion élevée de SPINK5 (chez les KA) est liée au niveau de

différenciation de ces cellules, le niveau de différenciation de deux familles des kératinocytes a

été analysé par la méthode de Western blot en évaluant deux marqueurs de différenciation des

kératinocytes, l‘involucrine et la filaggrine. Les résultats n‘ont pas montré de différence

significative du taux de différenciation chez les KA par rapport aux KH bien qu‘une

augmentation légère des marqueurs de différenciation soit perceptible chez les KA.

KA

KH

0

100

200

300

400

500

Invo

lucri

ne/A

cti

ne

KA

KH

0

100

200

300

400

500KA

KH

Filag

gri

ne/A

cti

ne

Comparaison du niveau de différenciation des KA et KH

Figure 27: Comparaison du niveau de

différenciation des kératinocytes dans les deux

populations de kératinocytes (KA et KH) par

Western blot grâce aux marqueurs de

différenciation des kératinocytes (filaggrine,

involucrine et actine est servie de contrôle pour

la normalisation). Une augmentation non

significative de différenciation est observée

chez les kératinocytes normaux. (n=6 pour

chaque population de kératinocytes)

59

3.7. Dosage enzymatique de l‘activité des MMPs dans les surnageants de

kératinocytes normaux et hypertrophiques:

Afin de valider les résultats obtenus par spectrométrie de masse, le niveau d‘activité des MMPs

dans les deux familles de kératinocyte normaux et hypertrophiques a été dosé par une méthode

de dosage fluorimétrique. Les résultats montrent une augmentation significative de cette activité

chez les kératinocytes normaux.

KA

KH

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Dosage de l'activité MMP dans lesmilieux conditionnés des KA et KH

L'a

cti

vit

é M

MP

(p

g/1

06 c

ell

ule

s)

Figure 28: Dosage enzymatique de l‘activité MMP dans les surnageants de culture de

kératinocytes normaux (KA) et de cicatrices hypertrophiques (KH). Une augmentation significative

de l‘activité MMP est observée dans les surnageants de culture des kératinocytes normaux. (*p <

0.05, test t) (n= 6 pour chaque population de kératinocytes)

*

60

CHAPITRE 4:

DISCUSSION, PERSPECTIVES ET

CONCLUSION

61

Les cicatrices hypertrophiques qui surviennent à la suite d‘une brûlure de 2ème

et 3ème

degré sont

le résultat d‘altérations mal connues du processus de cicatrisation. Ces cicatrices sont

douloureuses et rouges à cause de la présence de nombreux capillaires sanguins. Un dépôt

excessif de matrice extracellulaire, une hyperprolifération des fibroblastes et une persistance

anormale des myofibroblastes sont des caractéristiques de cette cicatrisation pathologique. Les

travaux précédents de l‘équipe de la Dre Moulin ont montré pour la première fois un rôle majeur

de l‘épiderme pathologique sur l‘augmentation de l‘épaisseur du derme dans les cicatrices

hypertrophiques (Bellemare, Roberge et al. 2005). Les travaux subséquents ont montré que

l‘effet de l‘épiderme sur le derme est une action paracrine qui pouvait être simulée par l‘ajout de

milieux conditionnés par des kératinocytes hypertrophiques cultivés en monocouche (Bergeron

et al. 2005). Une première analyse a permis de montrer que TIMP-1, un inhibiteur des

collagénases responsables de la dégradation de la matrice extracellulaire, était augmenté dans le

milieu conditionné des kératinocytes hypertrophiques et que cette augmentation pouvait

expliquer partiellement l‘augmentation de l‘épaisseur dermique dans les cicatrices

hypertrophiques (Simon et al. 2012). TIMP-1 ne pouvant expliquer l‘ensemble des différences

observées dans la fibrose, nous avons voulu déterminer l‘ensemble des facteurs

différentiellement sécrétés entre les kératinocytes normaux ou de cicatrices hypertrophiques et

susceptibles d‘induire une telle différence dans l‘épaisseur dermique. Ces différences ont été

étudiées en comparant les profils de sécrétion des kératinocytes en fonction de leur origine. Les

profils de sécrétions protéiques ont été analysés par la technique d‘électrophorèse

bidimensionnelle (technique de gel 2D-DIGE). Par cette technique, les protéines sont séparées en

fonction de leur point isoélectrique et de leur poids moléculaire. La technique du gel 2D-DIGE

est une technique semi-quantitative qui permet la migration de 3 échantillons sur le même gel

contrairement à la technique classique du gel 2D qui ne permet pas de faire migrer plus d‘un

échantillon par gel. Les points protéiques ont été analysés par le logiciel Delta 2D et 16 points

d‘intérêt ont été analysés par spectrométrie de masse permettant de déterminer la présence de

plusieurs protéines potentiellement impliquées dans la fibrose. Parmi ces protéines, 2 protéines

ont été particulièrement étudiées: SPINK5 et MMP-1.

62

SPINK5:

Chez l‘humain, SPINK5 est un gène qui code pour une protéine de 120 kDa qui contient 15

domaines inhibiteurs de protéases à sérine dont 2 domaines de type Kazal et 13 domaines de type

non Kazal. La protéine joue un rôle non seulement dans la croissance et la différenciation des

cellules épidermiques, mais également elle est considérée comme un régulateur négatif important

pour l‘action des protéases in vivo (Magert et al. 1999; Komatsu et al. 2002; Bitoun et al. 2003).

Une mutation de ce gène aboutit au syndrome de Netherton qui est une maladie récessive

autosomale et sévère qui affecte la peau et les cheveux (Bamboo hair) (Chavanas et al. 2000;

Bitoun et al. 2001, 2003; Sprecher et al. 2001, 2004; Ishida-Yamamoto et al. 2005; Yang et al.

2004). Les résultats obtenus par l‘analyse en spectrométrie de masse montrent un niveau élevé de

fragments de la protéine SPINK5 dans les surnageants de culture des kératinocytes normaux par

rapport aux kératinocytes hypertrophiques. Pour confirmer ce résultat, nous avons quantifié cette

protéine dans les milieux conditionnés par les kératinocytes avec une trousse d‘ELISA

spécifique pour la SPINK5. Le dosage ELISA n‘a montré aucune différence significative au

niveau de cette protéine entre les surnageants de culture des deux catégories de kératinocytes. Ce

résultat est contradictoire avec les résultats obtenus par l‘analyse en spectrométrie de masse.

Cependant, ceci peut être expliqué par le fait que le dosage par ELISA utilise deux anticorps

différents dirigés contre deux épitopes de la protéine, le dosage quantifie ainsi la protéine entière

présente dans le surnageant de culture. Au contraire, les résultats obtenus par spectrométrie de

masse révèlent que les fragments permettant d‘identifier SPINK5 étaient présents dans deux

points protéiques différents et que ces deux points avaient migrés au niveau des faibles poids

moléculaires (plus faibles que MMP-1 qui a un poids moléculaire de 43/52 kDa). Ceci montre

que ces points contenaient des fragments de SPINK5 et non la protéine entière (120 kDa). Nous

supposons donc qu‘il existe dans les kératinocytes normaux une digestion enzymatique plus

importante de SPINK5 que dans les kératinocytes hypertrophiques. Afin de confirmer ces

résultats, il faudra réaliser un western blot afin de valider la présence des fragments de SPINK5

dans les surnageants de culture. Si cela se confirme, l‘hypothèse d‘une augmentation de la

présence ou de l‘activité d‘une enzyme pouvant digérer SPINK5 pourra être émise. Parmi ces

enzymes, MMP-1 est la première enzyme que nous étudierons puisque les résultats montrent une

augmentation de cette enzyme dans les surnageants. Nous rajouterons de la MMP-1 active dans

un surnageant de culture de kératinocytes de cicatrices hypertrophiques et étudierons l‘apparition

63

possible des fragments dégradés de SPINK5 par western blot. Les données de la littérature ont

montré une augmentation de la présence de la protéine SPINK5 chez les kératinocytes

différenciés (Bitoun et al. 2003; Ishida-Yamamoto et al. 2005). L‘augmentation de SPINK5 dans

les surnageants de culture des kératinocytes normaux pourrait être liée à un niveau de

différenciation des kératinocytes différent entre les deux catégories de kératinocytes. Il faut noter

que des kératinocytes utilisés pour nos tests sont les kératinocytes cultivés en monocouche. Lors

de la récolte des milieux conditionnés, les kératinocytes étaient visuellement non différenciés, à

une confluence de 80%. Il est cependant difficile d‘évaluer le taux exact de différenciation de ces

cellules. Nous avons donc effectué une expérience complémentaire avec les mêmes populations

de kératinocytes que celles utilisées pour les analyses en gel 2D mais avec de nouveaux

surnageants de culture. Un western blot a été réalisé afin de déterminer la quantité de deux

marqueurs de différenciation des kératinocytes: la filaggrine (un marqueur tardif de la

différenciation des kératinocytes) et l‘involucrine (un marqueur précoce de la différenciation des

kératinocytes). Nos résultats ne montrant pas de différence significative dans l‘expression de ces

deux marqueurs entre les deux catégories de kératinocytes, la différence de sécrétion des

fragments de SPINK5 ne peut donc être liée au taux de différenciation des cellules. Pour la suite

des études, les fragments de SPINK5 pourraient être ajoutés dans les surnageants de culture de

fibroblastes ou kératinocytes avant de quantifier différents marqueurs de la fibrose comme la

sécrétion de collagènes ou des MMPs. D‘un autre côté, il est possible de réaliser la technique de

l‘interférence à l‘ARN (RNAi) afin d‘inhiber la production de la protéine cible, ici SPINK5. Ceci

pourrait nous aider à comprendre le rôle de ces fragments dans la fibrose.

64

MMP-1:

Les résultats de spectrométrie de masse ont détecté la présence de MMP-1 dans 3 points

protéiques analysés. Ces trois points étaient à la même distance de migration dans le gel en 2ème

dimension mais à des points isoélectriques légèrement différents, reflétant des différences dans

leur charge électrique probablement liées à des modifications post-traductionnelles

(glycosylation…) sans que cela n‘influence leur poids moléculaire. Les MMPs représentent une

famille comprenant vingt enzymes zinc-dépendantes (23 MMPs humaine connues) (Nagase and

Woessner 1999) qui peuvent dégrader certaines des protéines constituant la matrice

extracellulaire (Bode, Fernandez-Catalan et al. 1999). Les résultats obtenus montrent un niveau

plus élevé de MMP-1 dans les surnageants de culture des kératinocytes normaux. Dans la

littérature, il a été montré que MMP-1 est sécrétée par les cellules de kératinocytes normaux

(Jinlong et al. 2010) mais également par les fibroblastes (Westermarck et al. 1998). Dans nos

expériences, les kératinocytes sont cultivés en monocouche et en présence de fibroblastes 3T3

irradiés de souris. Afin de valider que la MMP-1 détectée par spectrométrie de masse est bien

d‘origine humaine (et donc sécrétée par les kératinocytes) et non murine (sécrétée par les

fibroblastes 3T3), une comparaison des séquences des protéines humaines et murines (blast) a été

réalisée grâce à une banque de données du site NCBI (Pubmed). La comparaison des séquences

de MMP-1 humaine et murine montre une forte différence de séquence de cette protéine en

fonction de l‘espèce. La comparaison avec les fragments identifiés par spectrométrie de masse a

permis de confirmer que la protéine MMP-1 détectée était bien d‘origine humaine et provenait

donc des kératinocytes.

Afin de valider les résultats obtenus, un dosage de l‘activité enzymatique des MMPs présentes

dans les milieux de culture a été réalisé. Les résultats montrent une augmentation significative de

cette activité dans les surnageants de culture des kératinocytes normaux confirmant notre

hypothèse que les kératinocytes normaux sécrètent plus de MMPs que les kératinocytes de

cicatrices hypertrophiques. Si la sécrétion de MMP-1 par les kératinocytes de peau normale est

connue (Jinlong et al. 2010), la diminution de la sécrétion de MMP-1 par les kératinocytes de

cicatrices hypertrophiques n‘a pas été rapportée dans la littérature. Cette diminution du potentiel

de dégradation (Birkedal-Hansen, Moore et al. 1993) de la matrice extracellulaire au niveau des

cicatrices hypertrophiques pourrait expliquer la fibrose de ces cicatrices pathologiques. Il est à

65

noter que l‘ajout de Galardin (un inhibiteur général des MMPs) dans le milieu de culture entraîne

une augmentation très marquée de l‘épaisseur du derme lors de la fabrication de peau par génie

tissulaire par la technique d‘auto-assemblage (Simon et al. 2012). La sécrétion diminuée de

MMP-1 par les kératinocytes de cicatrices hypertrophiques pourrait donc être à l‘origine d‘une

diminution de la dégradation de la matrice extracellulaire et ainsi induire une forte accumulation

de la matrice extracellulaire dans les cicatrices hypertrophiques telle qu‘observée cliniquement.

Les protéines intracellulaires:

En plus de l‘augmentation des protéines SPINK5 et MMP-1 dans les surnageants de

kératinocytes normaux, des protéines intracellulaires ont été détectées par spectrométrie de

masse. Ces protéines, essentiellement connues dans la littérature comme étant intracellulaires,

sont à un niveau plus élevé dans les surnageant des kératinocytes hypertrophiques. Ceci nous a

amené à vérifier si le nombre de cellules mortes (pouvant avoir sécrétées ces protéines) était

identique dans les deux catégories de kératinocytes. Là encore, pour les expériences

complémentaires ayant été menées sur des cultures différentes de celles utilisées pour les

analyses par gel 2D, les résultats doivent être interprétés avec précaution. Un test de décompte de

la mortalité cellulaire a montré une augmentation faible mais significative du taux de mortalité

dans les cultures de kératinocytes de cicatrices hypertrophiques, confirmant notre hypothèse

qu‘une augmentation des cellules mortes dans ces cultures pourrait être à l‘origine de la présence

accrue de protéines intracellulaires dans les surnageants analysés. Ces protéines n‘ont donc pas

été étudiées en détail vis-à-vis de leur action possible dans la fibrose.

66

Limite de la méthode utilisée:

Les résultats des travaux précédents ont déterminé que TIMP-1 était sécrétée de façon plus

marquée par les kératinocytes des cicatrices hypertrophiques (Simon et al. 2012). Nos analyses

des composantes protéiques des surnageants de culture de deux familles de kératinocytes n‘ont

cependant pas détecté de différence dans la sécrétion de TIMP-1. Ceci provient de nos choix lors

des analyses. En effet, nous n‘avons sélectionné que les points ayant un taux de variation entre

les deux catégories de ±50%. TIMP-1 montrant une augmentation de +30% dans les surnageants

de KH, ce point, bien que présent dans la carte protéomique, a été éliminé de notre analyse. Il est

fort possible que d‘autres points intéressants pour la compréhension de la fibrose aient été

éliminés du fait de leur faible variation entre les deux catégories. L‘autre limite de cette méthode

est que nous n‘avons pas détecté de cytokines. Ceci peut venir du fait qu‘il n‘y a pas de

différence dans la sécrétion de ces protéines entre les KA et les KH, mais plus probablement

provient du fait que les concentrations des cytokines sécrétées sont en dessous du seuil de

détection de la méthode par spectrométrie de masse. Une analyse des cytokines par une méthode

quantitative (ELISA) reste donc à faire afin de s‘assurer que la stimulation pro-fibrotique des KH

ne résulte pas d‘une production différente de cytokines. Malgré ces limites, l‘utilisation des gels

2D-DIGE suivie d‘une analyse par spectrométrie de masse a permis de déterminer des

différences dans le patron de sécrétion des kératinocytes normaux et hypertrophiques, différences

qui pourraient être à l‘origine de la fibrose dans la formation des cicatrices hypertrophiques.

67

CHAPITRE 5:

BIBLIOGRAPHIE

68

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