TP 1 Colimtrie en milieu solide et en milieu liquide (mthode du NPP)

Application la colimtrie du lait

La colimtrie dsigne le dnombrement des coliformes dans un produit suivi (ou non) de leur identification.

1. But du TP raliser un dnombrement en milieu solide et interprter les rsultats en utilisant la norme

AFNOR de 1996 raliser un dnombrement en milieu liquide et interprter les rsultats par la mthode statistique

du NPP Connatre les milieux utiliss en colimtrie Identifier un coliforme prsum .

2. ManipulationsDnombrement des coliformes sur 3 chantillons de lait :

- Un lait cru (1x) : LC- Un lait pasteuris (1x) : LP- Un lait UHT, donc strile au dpart, mais ensemenc volontairement modifi (2x) : LAA

Identification d'un coliforme

2. 1. Prparation du lait pasteuris modifi Introduire strilement dans 100mL de lait UHT un volume (considr ngligeable) de suspension de E. coli de 18h, ventuellement dilue.La concentration finale en cellules de E. coli dans le lait doit tre de environ 103.mL-1.

Analyses effectuesLC LP LM

Coliforme milieu solide 10-1; 10-2; 10-3 100; 10-1; 10-2 100; 10-1 ;10-2

Coliforme milieu liquide 10-3; 10-4; 10-5 100; 10-1; 10-2 10-2; 10-3; 10-4

2.2. Protocole du dnombrement des coliformes dans le laitOn suivra les directives de la norme FIL 73A :1985 (Fdration Internationale de Laiterie), identiques celles de la norme ISO 5541/1-1986, dont voici les extraites essentiels :

Prlvement de l'chantillon...Agiter vigoureusement l'chantillon pour essai, afin de s'assurer d'une rpartition aussi uniforme que possible des micro-organismes, en inversant rapidement 25 fois le rcipient contenant l'chantillon. L'intervalle entre le mlange et le prlvement de doit pas dpasser 3 minutes...

Dilutions...effectuer les dilutions dcimales en tryptone sel (pour 1L peptone: 1g; NaCl: 8,5g) ,ou solution de Ringer dilue au 1/4, en tampon phosphate...) ou en eau physiologique.

Milieux de culture prconiss et ensemencement : dnombrement en milieu solide : glose VRBL au violet, au rouge neutre, la bile et au lactose,

considr en pratique comme quivalent la glose DCL 1g.L-1 (dsoxycholate lactose): une boite par dilution: 1mL incorpor dans

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12mL de milieu + surcouche de 4mL dnombrement en milieu liquide : bouillon BLBVB + cloche par la mthode du NPP, 3 tubes par

dilution teste. Introduire 1mL d'inoculum par tube de BLBVB.

Comptage: retenir les boites qui contiennent entre 10 et 150 colonies ; ne compter que les colonies rouges fonces d'au moins 0,5 mm de diamtre, caractristiques des coliformes...

Compte rendu1) Justifier l'aspect des coliformes sur la glose utilise et l'aspect d'un BLBVB positif.2) Prsenter tous les rsultats bruts sous forme d'un tableau3) Exploiter ces rsultats pour les trois types de lait en donnant le rsultat par mL de lait pour la colimtrie en milieu solide et celui pour la colimtrie en milieu liquide. Comparer aux normes fournies.On assimilera le lait modifi un lait cru destin la consommation.

2.3. Identification d'un coliforme prsumL'isolement fourni sur glose EMB a t ralis partir d'une colonie suspecte d'tre un coliforme sur glose VRBL.Raliser une suspension de la souche et ensemencer une galerie enjube_ permettant l'identification du coliforme prsum.

Compte rendu:4) Dcrire l'aspect des colonies sur EMB.5) Lecture des milieux et identification du coliforme6) On suppose que 5 colonies sur les 47 colonies suspectes prsentes ont t ainsi testes et identifies : elles ont toutes conduit au mme rsultat. Que peut-on conclure quant au dnombrement ? Utiliser pour le calcul la norme ISO 7218.

ANNEXE

Lait la vente : Le lait cru livr en l'tat et destin la consommation humaine doit satisfaire aux critres suivants (arrt du 6 aot 1985) :- absence de micro-organismes pathognes et de toxines,- absence de Salmonella dans 1 litre,- absence de streptocoques -hmolytiques dans 0,1 mL,- cellules somatiques < 4.105/mL,- flore arobie msophile < 9.104 (jour de conditionnement ou de production) et < 3.105 (DLC), - coliformes < 102 (jour de conditionnement ou de production) et < 103 (DLC),- preuve de l'bullition ngative (DLC),- acidit comprise entre 1,4 et 1,8g d'acide lactique/L (14 18 Dornic) (DLC),- absence de rsidus antimicrobiens.

Les critres microbiologiques donns par l'arrt 30 mars 1994 sont les suivants et modifient ou compltent les prcdents (laits lors de leur mise sur le march) :- absence de Salmonella dans 25 g (plan 2 classes : n = 5, c = 0),- absence de streptocoques -hmolytiques (groupes A, B, C, G et L de Lancefield) dans 0,1 mL (plan 2 classes : n = 5, c = 0),- absence d'autres germes pathognes et de toxines,- Staphylococcus aureus < 102/mL (plan classes: n=5, c=2, m= 102, M=5.102), - coliformes ( 30C) < 102/mL (plan 3 classes n = 5, c= 2, m= 102, M= 103), - flore arobie msophile globale (FAMT) 30C < 5.104 (moyenne gomtrique constate sur une priode de 2 mois avec au moins 2 prlvements par mois, si ncessaire l'aptitude la conservation peut tre estime aprs incubation 55C).

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Lait pasteuris : Le lait pasteuris conditionn doit satisfaire aux critres suivants (arrt du 21 juin 1982 modifi par les arrts des 3 janvier 1985 et 30 dcembre 1988) :- preuve de la phosphatase ngative,- preuve de l'bullition ngative ( la DLC),- acidit comprise entre 1,4 et 1,8 g/L d'acide lactique (14 18 Dornic) ( la DLC),- absence de Salmonella dans 250 mL,- absence d'autres micro-organismes pathognes et de toxines.- flore arobie msophile < 3.104 de j j + 4,- coliformes < 10/mL de j j + 4 et < 102/mL ( la DLC),- coliformes thermotolrants ( fcaux ) < 1 /mL

Les critres microbiologiques donns par l'arrt du 30 mars 1994 sont les suivants et modifient ou compltent les prcdents (laits lors de leur mise sur le march) :- absence de Salmonella et de Listeria monocytogenes dans 25 g (plan 2 classes : n = 5, c = 0).- absence d'autres germes pathognes et de toxines,- absence de coliformes ( 30C) dans 1 mL (plan 3 classes : n = 5, c = 1, m = 0, M = 5).- flore globale (FAMT 21C aprs incubation 5 jours 6C) < 5.104/mL (plan 3 classes : n= 5, c= 1, m= 5.104, M= 5.105).En milieu industriel, on considre pour le lait pasteuris destin tre transform, les standards suivants :- flore arobie < 104 germes/mL,- absence d'indolognes et de putrides dans 1 mL,- absence de coliformes dans 1 mL.- absence de Clostridium sulfito-rducteurs dans 50 mL.

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