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B.O

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Terminale S – Spécialité : Énergie et cellule vivante

Problématique scientifi que La lumière permet au sein des chloroplastes la production de matière organique (glucose) et de dioxygène à partir de mo-lécules minérales (dioxyde de carbone, eau) :

6 CO2 + 6 H2O ➝ C6H12O6 + 6 O2

Équation bilan simplifi ée de la photosynthèse

Vers la fi n des années 1930, Robert HILL (1899 – 1991), biochimiste anglais, émet l’hypothèse que la produc-tion de dioxygène par des chloroplastes nécessite la présence d’un accepteur d’électrons (un oxydant) en plus de la lumière.

TP La réaction de Hill Nombre de séances : 2Niveau de diffi culté :Nombre de séances : 2Niveau de diffi culté :

Mode opératoire

Il s'agit de mesurer l'évolution de la concentration en dioxygène dans une suspension de chloroplastes lésés placée dans différentes conditions expérimen-tales afi n de tester l'hypothèse de Robert HILL :

la production de dioxygène par une suspension de chloroplastes se fait à la lumière en présence d'un accepteur d'électrons (oxydant).

La mise en œuvre du protocole se fait en 2 phases :

Avant le TP

Obtention d’une suspension de chloroplastes d’épinards : 1. Découper 60 à 80 g de feuilles d’épinard dans le

mortier sortant du réfrigérateur, ajouter un peu de sable fi n, verser 3 mL de solution tampon tris-saccharose pH = 10,5 et broyer ;

2. Verser progressivement en cours de broyage 20 ml de solution tampon phosphate-saccharose pH = 6,5 ;

3. Broyer fermement pendant au moins 2 minutes ;4. Filtrer dans un entonnoir garni de gaze (3 ou

4 épaisseurs) et de coton hydrophile. Presser la gaze pour obtenir le maximum de fi ltrat ;

5. Recueillir le fi ltrat dans un erlenmeyer refroidi recouvert de papier aluminium ;

6. Conserver la suspension de chloroplastes ainsi btenue à l’obscurité (erlenmeyer bouché enve-loppé de papier aluminium) et au froid (cristallisoir rempli de glaçons) jusqu’au moment de la mesure.

L’obtention d’une suspension de chloroplastes (phase n°1) pourra être réalisée au laboratoire ou par les élèves eux-mêmes, juste avant la réalisation de mesures par Ex.A.O. (phase n°2).

PHASE N°1OBTENIR UNE SUSPENSION

DE CHLOROPLASTES

PHASE N°2MESURER PAR Ex.A.O.

LA CONCENTRATION EN O2 DANS LA SUSPENSION OBTENUE

Trucs et astuces On peut utiliser d'autres végé-taux que l'épinard, comme la menthe, le persil, le plantain lancéolé, etc. qui donnent également de très bons résul-tats. On peut enfi n préférer un ap-pareil type « mixer-blender » au mortier et pilon.

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Pendant le TP

Pour mesurer la concentration en dioxygène dans la suspension de chloroplastes (Ex.A.O.) :

1. Verser 10 mL de la suspension de chlo-roplastes dans la cuve du bioréacteur. Placer un agitateur dans celle-ci. Recouvrir la cuve avec le couvercle du bioréacteur.

2. Disposer les sondes oxymétrique et photométrique dans les orifices prévus au niveau du couvercle.

3. Disposer la source de lumière éteinte devant la fenêtre du bioréacteur. NB : la sonde photomètre doit pouvoir mesurer la présence ou non de lumière.

4. Vérifier :a. que la sonde oxymétrique plonge

dans la suspension de chloroplastes et qu’il n’y a pas de bulle d’air sous son extrémité ;

b. que la sonde photométrique est bien orientée vers la lumière.

5. Fermer les volets du bioréacteur afin que la suspension de chloroplaste soit à

l’obscurité. Lancer l’agitation à vitesse minimale. Préparer, en utilisant des gants, une seringue contenant 0,2 mL de solution d’accepteur d’électrons (oxydant).

Démarrer la mesure de la concentration en dioxygène dans la suspension de chloro-plastes :- de t = 0 à t = 3 min : la suspension est à

l’obscurité sans l’accepteur d’électrons (oxydant) ;

- de t = 3 min à t = 6 min : la suspension est éclairée ;

- de t = 6 min à t = 9 min : la suspension est éclairée en présence de l’accepteur d’électrons suite à l’injection de 0,2 mL de l’oxydant (Potassium hexacyanoferrate) dans la suspension à t = 6 min ;

- de t = 9 min à la fin : la suspension en présence de l’accepteur d’électrons est à l’obscurité.

Résultats et exploitations

La production de dioxygène par la suspen-sion de chloroplastes lésés n'a lieu qu'à la lumière et en présence d'un accepteur arti-ficiel d'électrons.

En l'absence d'au moins un de ces deux fac-teurs, la production de dioxygène n'a pas lieu ce qui valide l'hypothèse de Robert HILL.

En résumé

L’énergie lumineuse, absorbée par les pig-ments chlorophylliens présents dans la membrane des thylacoïdes, permet l’oxyda-tion de l’eau.

Les protons (H+) et électrons (e-) libérés sont transférés à un accepteur naturel d’électrons (A) présent dans le stroma du chloroplaste, qui devient réduit (AH2).

Pour aller plus loinLa phase photochimique permet aussi la fabrication (régénération) d’ATP, autre com-posé intermédiaire utilisé ensuite, comme AH2, pour la synthèse de glucose à partir de dioxyde de carbone (phase chimique).

Matériel nécessaireLogiciel Atelier Scientifique SVT (version établissement) Réf. 000 583

Potassium hexacyano-ferrate (III) (50 g) Réf. 107 267

Tampon TRIS saccharose - pH 10,5 Réf. 107 534

Tampon Phosphate Saccharose - pH 6.5 Réf. 107 535

Gants PVC blanc T. 7/8 Réf. 150 179

Sonde Oxymétrique Clark Réf. 453 001

Sonde à éthanol Réf. 453 084

Kit de réactif biologie cellulaire Réf. 453 086

Capteur Luxmètre Réf. 482 037

Capteur Oxymètre Réf. 482 039

Console Foxy® Réf. 485 000

Lampe halogène à hauteur réglable Réf. 554 012

Ciseaux fins en acier inox Réf. 564 035

Poire à pipeter modèle "Flip" Réf. 703 664

Sable grain moyen Réf. 704 029

Erlenmeyer 250 mL à ouverture étroite en verre borosilicaté 3.3 Réf. 713 205

Pipette graduée 5 mL en verre Classe de précision A Réf. 713 281

Entonnoirs 50 ml en polypropylène (lot de 10) Réf. 723 047

Seringue 1 mL avec cathéter Réf. 723 088

Mortier avec pilon 300 mL en porcelaine émaillée Réf. 723 130

Éprouvettes graduées à bec - TPX - 25 mL Réf. 723 161

TP SV

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