Thèses de l'INSA de Lyon | Les Thèses de l'INSA de Lyon - Mise au...

THESE

Mise au point de biocapteurs basés sur la mesure

d’activités enzymatiques de cellules algales pour la

surveillance des milieux aquatiques

Présentée devant

L’institut National des Sciences Appliquées de Lyon

Pour obtenir le grade de docteur

ECOLE DOCTORALE : Chimie de Lyon (Chimie, Procédés, Environnement)

Spécialité : Sciences de l’environnement industriel et urbain

Par

GUEDRI HOUSSEMEDDINE

Soutenue publiquement le 17 mars 2010 devant la Commission d’examen

Jury

________________________________________________________

Directeurs de thèse

Mme DURRIEU Claude, Enseignant-Chercheur, LSE-ENTPE

M. PERRODIN Yves, Directeur de recherche, LSE-ENTPE

Rapporteurs

Mme MEZZANOTTE Valeria, Professeur, Université de Milan Bicocca

M. MARTY Jean Louis, professeur, Université de Perpignan Via Domitia

Examinateurs

Mme JAFFREZIC Nicole, directeur de recherche, CNRS

M. CHOVELON Jean Marc, professeur, Université Claude Bernard Lyon1

M. LEJEUNE Philippe, professeur, INSA de Lyon

M. BAUSSANT Thierry, IRIS, Stavanger, Norvège

M. TRAN Canh Minh, membre invité

Cette thèse a été préparée au Laboratoire des Sciences de l’Environnement de L’ENTPE

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 2

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 3

INSA Direction de la Recherche - Ecoles Doctorales – Quadriennal 2007-2010

SIGLE ECOLE DOCTORAL NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE

CHIMIE

CHIMIE DE LYON

http://sakura.cpe.fr/ED206

M. Jean Marc LANCELIN

Insa : R. GOURDON

M. Jean Marc LANCELIN Université Claude Bernard Lyon 1 Bât CPE

43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex

Tél : 04.72.43 13 95 Fax : [email protected]

E.E.A.

ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

http://www.insa-lyon.fr/eea M. Alain NICOLAS

Insa : D. BARBIER [email protected] Secrétariat : M. LABOUNE AM. 64.43 – Fax : 64.54

M. Alain NICOLAS Ecole Centrale de Lyon Bâtiment H9

36 avenue Guy de Collongue 69134 ECULLY

Tél : 04.72.18 60 97 Fax : 04 78 43 37 17 [email protected] Secrétariat : M.C. HAVGOUDOUKIAN

E2M2

EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION

http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2

M. Jean-Pierre FLANDROIS

Insa : H. CHARLES

M. Jean-Pierre FLANDROIS CNRS UMR 5558 Université Claude Bernard Lyon 1

Bât G. Mendel 43 bd du 11 novembre 1918

69622 VILLEURBANNE Cédex Tél : 04.26 23 59 50 Fax 04 26 23 59 49

06 07 53 89 13 [email protected]

EDIIS

INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE

http://ediis.univ-lyon1.fr

M. Alain MILLE

Secrétariat : I. BUISSON

M. Alain MILLE Université Claude Bernard Lyon 1

LIRIS - EDIIS Bâtiment Nautibus

43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72. 44 82 94 Fax 04 72 44 80 53 [email protected] - [email protected]

EDISS

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE

Sec : Safia Boudjema M. Didier REVEL

Insa : M. LAGARDE

M. Didier REVEL Hôpital Cardiologique de Lyon

Bâtiment Central

28 Avenue Doyen Lépine 69500 BRON

Tél : 04.72.68 49 09 Fax :04 72 35 49 16 [email protected]

Matériaux

MATERIAUX DE LYON

M. Jean Marc PELLETIER

Secrétariat : C. BERNAVON 83.85

M. Jean Marc PELLETIER INSA de Lyon

MATEIS Bâtiment Blaise Pascal

7 avenue Jean Capelle 69621 VILLEURBANNE Cédex Tél : 04.72.43 83 18 Fax 04 72 43 85 28

[email protected] Math IF

MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE

M. Pascal KOIRAN

Insa : G. BAYADA

M.Pascal KOIRAN Ecole Normale Supérieure de Lyon

46 allée d’Italie 69364 LYON Cédex 07

Tél : 04.72.72 84 81 Fax : 04 72 72 89 69 [email protected]

Secrétariat : Fatine Latif - [email protected]

MEGA

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE

M. Jean Louis GUYADER

Secrétariat : M. LABOUNE PM : 71.70 –Fax : 87.12

M. Jean Louis GUYADER INSA de Lyon

Laboratoire de Vibrations et Acoustique

Bâtiment Antoine de Saint Exupéry 25 bis avenue Jean Capelle

69621 VILLEURBANNE Cedex Tél :04.72.18.71.70 Fax : 04 72 18 87 12

[email protected]

ScSo

ScSo*

M. BRAVARD Jean Paul

Insa : J.Y. TOUSSAINT

M. BRAVARD Jean Paul Université Lyon 2

86 rue Pasteur 69365 LYON Cedex 07

Tél : 04.78.69.72.76 Fax : 04.37.28.04.48 [email protected]

*ScSo : Histoire, Geographie, Aménagement, Urbanisme, Archéologie, Science politique, Sociologie, Anthropologie

http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 4

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 5

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au sein du Laboratoire des Sciences de l’Environnement (LSE) de

l’Ecole Nationale des Travaux Publics de l’Etat (ENTPE) dirigé par Yves Perrodin. Je le

remercie pour m’avoir accueilli dans son laboratoire pendant l’année du Master et trois ans et

demi de thèse.

Je remercie sincèrement mon encadrante, Claude Durrieu, enseignant-chercheur à l’ENTPE

pour m’avoir accompagné tout le long de mes travaux, pour sa disponibilité, pour ses

conseils, pour m’avoir laissé la liberté de m’épanouir, et pour ses relectures de mon rapport.

Je tiens également à remercier les membres du comité de pilotage de la thèse pour leurs

conseils et remarques; Jean-Marc Chovelon, Canh Tran-Minh, Laurence Volatier et surtout

Nicole Jaffrezic qui m’a ouvert les portes de son laboratoire pour réaliser quelques essais en

électrochimie.

Je remercie Jean Louis Marty, professeur à l’université de Perpignan Via Domitia et Valeria

Mezzanotte, professeur à l’université de Milan Bicocca pour avoir accepté d’examiner ce

travail et d’en être les rapporteurs.

Je tiens également à remercier les autres membres de jury, Nicole Jaffrezic, directeur de

recherche au CNRS, Jean Marc Chovelon, professeur à l’université Claude Bernard Lyon1,

Philippe Lejeune, professeur à l’INSA de Lyon, Thierry Baussant, chercheur à IRIS

(Norvège) et Canh Tran-Minh, ex-professeur à l’école des Mines de Saint-Etienne.

Je remercie toute l’équipe des chercheurs au LSE : Jean Phillipe Bedell, Bernard Clément,

Cécile Delolme, Alain Devaux, Laurence Volatier, Thierry Winiarski, Rafaël Angoulo,

Sylvie BONY et Marc Desmet.

Je remercie également l’équipe technique du LSE : Martine, Thérèse, Isabelle, Lydie, Myriam

et Marc (avec qui j’ai eu la chance de parler foot) pour leur aide précieuse.

Merci également aux thésards du LSE avec qui j’ai partagé de beaux moments : les deux

Hélène, Manuelle, Ruth, David , Anne- Laure, Clotilde, Urbain, Anne-Sophie, Murielle,

Raphaël, Andrey, Aude, Emilie , Gwenaëlle, Le Binh et Salim.

Un grand Merci à ceux qui m’ont aidé à réaliser ce travail en mettant la main à la pâte :

Isabelle Gaillard, François Ghione, Chaker Tlili et Héla Mansouri.

Un grand merci à Alicia pour son aide, sa patience et sa disponibilité.

Enfin je tiens à remercier toute ma famille (Mon père Hédi, Ma mère Najet, mon frère Seif, la

petite de la famille Sana et ma grande sœur Jihène, ainsi que Youssouf, mon petit neveux) qui

m’a soutenu moralement et mentalement pendant toute ma scolarité ainsi qu’à tous mes amis

et particulièrement Amal.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 6

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 7

Résumé

Le contrôle de la qualité des écosystèmes aquatiques nécessite des outils de détection en

continu et in situ comme les biocapteurs.

Ce travail propose le développement de biocapteurs pour la détection de certaines familles de

polluants. Ces outils sont basés sur la mesure de deux activités enzymatiques de cellules

algales représentatives des eaux douces et salines.

La première étape a consisté au choix des activités en fonction des polluants étudiés en

bioessais. Ainsi nous avons montré que l’Activité Phosphatase Alcaline (APA) est sensible à

la présence de métaux lourds et de phosphates et que l’Activité Estérase (AE) est sensible à la

présence de pesticides. Ces résultats nous ont permis de développer différents biocapteurs.

Pour la détection des métaux lourds, deux biocapteurs conductimétriques ont été développés.

Le premier, basé sur la mesure de l’APA de la microalgue d’eau douce Chlorella vulgaris

(Cv) immobilisée par des monocouches autoassemblées, a permis d’améliorer la répétabilité

et la reproductibilité des mesures. Le deuxième, basé sur la même mesure, a permis de

s’affranchir des effets du phosphate sur l’APA de Cv.

Pour la détection du phosphate, un biocapteur conductimétrique à cellules algales à été

développé, la limite de détection est de 0.4µM d’ions phosphates.

Enfin pour la détection des pesticides en milieu marin, un biocapteur conductimétrique basé

sur la mesure de l’AE de deux algues marines a été développé. Les résultats ont montré qu’il

est sensible à la présence du diuron et du glyphosate.

Les biocapteurs développés lors de cette étude, et après essais sur des échantillons naturels,

pourraient servir aux gestionnaires pour une prise de décision.

Mots-clés : biocapteur, bioessais, écotoxicologie, Chlorella vulgaris, algues marines, activité

phosphatase alcaline, activité estérase, métaux lourds, pesticides, phosphate, SAMs

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 8

Development of biosensors based on measurement of algal cells enzymatic activity for

aquatic media quality monitoring

Abstract

The quality control of aquatic ecosystems requires tools for continuous and in situ detection

as biosensors.

This work proposes the development of biosensors for detection of some pollutants families.

These tools are based on the measurement of two enzymatic activities in saline and freshwater

algal cells. The first step was to find enzymatic activities varying with the presence of

pollutants, this was studied in bioassays. Thus, we have shown that Alkaline Phosphatase

Activity (APA) is sensitive to heavy metals and phosphates and that the Esterase Activity

(AE) is sensitive to some pesticides. These results enabled us to develop different biosensors.

For the detection of heavy metals, two conductometric biosensors have been developed. The

first, based on the measurement of the APA of freshwater microalgae Chlorella vulgaris (Cv)

immobilized by self assembled monolayers, lead to an improvement the repeatability and

reproducibility measures as compared to previous works. The second biosensor, based on the

same measurement, resulted in the overcoming of the effects of phosphate on Cv APA. For

phosphate detection, a conductometric whole algal cells biosensor was developed with a

detection limit of 0.4μM phosphate ions. Finally, for pesticides detection in the marine

environment, a conductometric biosensor based on measurement of AE in two marine algae

has been developed. The results showed that it is sensitive to the presence of diuron and

glyphosate. The biosensors developed in this study, will require same additional testing on

natural samples, and then they could be used by managers for decision making.

Key-words: biosensor, bioessais, Ecotoxicology, Chlorella vulgaris, marine algae, alkaline

phosphatase activity, esterase activity, heavy metals, pesticides, phosphate, SAMs

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 9

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES .............................................................................................. 9

INRODUCTION GENERALE .................................................................................... 17

PARTIE A Bibliographie ............................................................................................... 21

Chapitre I La pollution des milieux aquatiques ......................................................... 23 1 Les écosystèmes aquatiques ..................................................................................... 25

2 La pollution des milieux aquatiques ......................................................................... 25

2.1 Origine de la pollution des milieux aquatiques ............................................ 26

2.2 Les polluants des milieux aquatiques ........................................................... 27

2.2.1 Les métaux lourds .................................................................................... 27

2.2.2 Les pesticides ........................................................................................... 31

2.2.3 Les phosphates ......................................................................................... 32

2.3 Conséquences sur les écosystèmes aquatiques ............................................. 34

2.3.1 Bio-accumulation-concentration à travers la chaîne trophique ................ 34

2.3.1.1 Notion de biodisponibilité et de spéciation .......................................... 34

2.3.1.2 La bioaccumulation ............................................................................... 34

2.3.1.3 La bio-concentration ............................................................................. 34

2.3.1.4 La bioamplification ............................................................................... 35

2.3.2 Effets des polluants sur le compartiment biotique ................................... 36

3 Conclusion ................................................................................................................ 38

Chapitre II Contrôle de la qualité des milieux aquatiques : les tests au laboratoire 41 1 La législation en cours .............................................................................................. 42

1.1 La Directive européenne (2006/60/CE) ....................................................... 42

1.2 La réglementation REACH .......................................................................... 42

1.3 Les polluants et les normes .......................................................................... 43

1.3.1 Les métaux lourds .................................................................................... 43

1.3.2 Les pesticides ........................................................................................... 43

2 Evaluation de la qualité des milieux aquatiques ...................................................... 43

2.1 Analyses chimiques ...................................................................................... 44

2.1.1 Dosage des métaux lourds ........................................................................ 45

2.1.2 Dosage des polluants organiques ............................................................. 46

2.2 Mesures physico-chimiques et biologiques .................................................. 46

2.3 Les bioessais écotoxicologiques ................................................................... 47

2.3.1 Bioessais utilisant des producteurs ........................................................... 48

2.3.2 Bioessais utilisant les consommateurs ..................................................... 49

2.3.3 Bioessais utilisant des décomposeurs ....................................................... 50

2.3.4 Choix des bioessais écotoxicologiques .................................................... 50

2.3.5 Bioessais en microcosmes ........................................................................ 51

3 Conclusion ................................................................................................................ 51

Chapitre III Les biocapteurs : contrôle in situ et en continu ................................... 53 1 Généralités sur les biocapteurs ................................................................................. 54

1.1 Définition et domaine d’application ............................................................. 54

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 10

1.2 Structure et principe de fonctionnement ...................................................... 55

1.3 Classification des biocapteurs ...................................................................... 56

2 Le biorécepteur ......................................................................................................... 56

2.1 La catalyse .................................................................................................... 57

2.1.1 Les enzymes ............................................................................................. 57

2.1.2 Les cellules entières et les organites ........................................................ 58

2.2 Affinité ......................................................................................................... 59

2.2.1 Les immuno-récepteurs ............................................................................ 60

2.2.2 Les récepteurs membranaires ................................................................... 60

2.3 Hybridation ................................................................................................... 61

3 Le transducteur ......................................................................................................... 63

3.1 Détection optique ......................................................................................... 63

3.1.1 Détection par fluorescence ....................................................................... 64

3.1.2 Détection par bio/Chimiluminescence ..................................................... 65

3.1.3 Détection par résonance de plasmon de surface (SPR) ............................ 65

3.1.4 Détection par ellipsométrie ...................................................................... 66

3.2 Détection électrochimique ............................................................................ 67

3.2.1 Mesures ampérométriques ........................................................................ 67

3.2.2 Mesures potentiométriques ...................................................................... 68

3.2.3 Mesures conductimétriques ...................................................................... 69

3.3 Détection mécanique / électromécanique ..................................................... 70

3.3.1 Microbalance à quartz .............................................................................. 71

3.3.2 Microstructure mobile .............................................................................. 71

3.3.3 Billes magnétiques ................................................................................... 72

3.4 Détection thermique ..................................................................................... 72

4 Les méthodes d’immobilisation ............................................................................... 72

4.1 Adsorption .................................................................................................... 73

4.2 Emprisonnement physique ........................................................................... 73

4.3 Réticulation .................................................................................................. 74

4.4 Liaison covalente .......................................................................................... 74

4.4.1 Couplage direct ........................................................................................ 74

4.4.2 Couplage indirect ..................................................................................... 75

5 Conclusion ................................................................................................................ 75

PARTIE B Matériels et méthodes ................................................................................ 77

1 Réactifs utilisés ........................................................................................................ 79

2 Matériel biologique .................................................................................................. 80

2.1 Présentation des souches utilisées ................................................................ 80

2.1.1 Chlorella vulgaris ..................................................................................... 80

2.1.2 Les algues marines ................................................................................... 81

2.1.2.1 Dunaliella tertiolecta (Dt) ...................................................................... 81

2.1.2.2 Phaeodactylum tricornutum (Pt) ........................................................... 81

2.1.2.3 Ostreococcus tauri (Ot) ......................................................................... 82

2.2 Mise en culture des algues ........................................................................... 83

2.2.1 Stérilisation ............................................................................................... 83

2.2.2 Ensemencement ........................................................................................ 83

2.2.3 Comptage des cellules algales .................................................................. 84

3 Microscopie .............................................................................................................. 84

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 11

4 Techniques expérimentales ...................................................................................... 85

4.1 Bioessais sur algues libres ............................................................................ 85

4.1.1 Principe de mesures des activités enzymatiques ...................................... 85

4.1.1.1 Mesure de l’activité phosphatase alcaline (APA) ................................. 86

Chlorella vulgaris ........................................................................................................... 86

Les algues marines .......................................................................................................... 87

4.1.1.2 Mesure de l’activité estérase ................................................................. 87

4.1.2 Mesure des effets des toxiques sur les activités enzymatiques en bioessais

89

4.2 Mise au point des biocapteurs ...................................................................... 90

4.2.1 Les microélectrodes interdigitées ............................................................. 90

4.2.1.1 Les microélectrodes interdigitées en platine ......................................... 90

4.2.1.2 Les microélectrodes interdigitées en or ................................................. 91

4.2.1.3 Nettoyage des microélectrodes .............................................................. 91

4.2.2 Immobilisation des algues ........................................................................ 91

4.2.2.1 Membrane à base d’albumine de sérum bovin (BSA) .......................... 91

4.2.2.2 Les monocouches auto-assemblées ....................................................... 92

4.2.2.3 La matrice BSA-Nafion ........................................................................ 93

4.2.2.4 Membrane à base d’agarose .................................................................. 93

4.2.2.5 Immobilisation sur filtres en fibres de verres ........................................ 94

4.2.3 Mesure des activités enzymatiques avec le biocapteur ............................ 94

4.2.3.1 Principe des mesures conductimétriques ............................................... 94

4.2.3.2 Détection de l’activité phosphatase alcaline ......................................... 95

4.2.3.3 Détection de l’activité estérase .............................................................. 96

4.2.3.4 Mesure des effets des toxiques sur les activités enzymatiques ............. 97

4.3 La voltamétrie cyclique ................................................................................ 97

PARTIE C Résultats et discussion .............................................................................. 101

Chapitre I Bioessais écotoxicologiques sur algues libres ......................................... 103 1 Introduction ............................................................................................................ 105

2 Mesure des activités enzymatiques ........................................................................ 106

2.1 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline. ................................... 106

2.2 Cinétique enzymatique des estérases ......................................................... 107

3 Etude de l’atteinte des activités enzymatiques en présence de toxiques ................ 108

3.1 Etude de l’atteinte de l’APA En présence de métaux lourds ..................... 108

3.1.1 Effets de la charge algale sur l’atteinte de l’APA .................................. 109

3.1.2 Effets de la concentration du substrat sur l’atteinte de l’APA ............... 110

3.1.3 Effets du temps de contact sur l’atteinte de l’APA ................................ 110

3.1.4 Calibration .............................................................................................. 111

3.1.5 Conclusion .............................................................................................. 113

3.2 Etude de l’atteinte de l’APA en présence de pesticides ............................. 113

3.3 Etude de l’atteinte de l’AE en présence de métaux lourds ......................... 114

3.4 Etude de l’atteinte de l’AE en présences de pesticides .............................. 115

4 Conclusion .............................................................................................................. 116

Chapitre II Application des bioessais au développement d’un biocapteur optique 119 1 Etude de l’immobilisation de Chlorella vulgaris ................................................... 121

1.1 Introduction ................................................................................................ 121

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 12

1.2 Etude en microplaque ................................................................................. 121

1.2.1 Influence de la concentration du gel sur le métabolisme de l’algue ...... 121

1.2.1.1 Influence de la concentration du gel sur l’APA de Chlorella vulgaris122

1.2.1.2 Influence de la concentration du gel sur l’AE de Chlorella vulgaris .. 123

1.2.2 Influence de la charge algale dans le gel ................................................ 123

1.2.3 Essais de toxicité sur les algues immobilisées dans un gel d’agarose ... 124

1.2.3.1 Action des métaux lourds sur l’APA d’algues immobilisées dans un gel

d’agarose ............................................................................................................ 125

1.2.3.2 Action des pesticides sur l’AE d’algues immobilisées dans un gel

d’agarose ............................................................................................................ 126

1.2.4 Conclusion .............................................................................................. 127

2 Etude en biocapteur ................................................................................................ 127

2.1 Le prototype ............................................................................................... 127

2.2 Mesures avec algues immobilisées à l’agarose .......................................... 128

2.2.1 Mesure du bruit de fond du biocapteur .................................................. 128

2.2.2 Activité du témoin .................................................................................. 129

2.2.3 Reproductibilité de la réponse du biocapteur ......................................... 130

2.2.4 Reproductibilité inter membranes .......................................................... 130

2.2.5 Reproductibilité intra-membranes .......................................................... 131

2.3 Mesures avec algues immobilisées sur des filtres GFC couplés à une

membrane d’agarose .................................................................................................. 132

2.3.1 Bruit de fond du biocapteur .................................................................... 133

2.3.2 Cinétique de l’AE ................................................................................... 133

2.3.3 Répétabilité du signal ............................................................................. 134

2.3.4 Effets du méthyl parathion sur l’AE de Chlorella vulgaris .................... 134

3 Conclusion .............................................................................................................. 135

Chapitre III Développement d’un biocapteur conductimétrique a cellules algales

immobilisées par la technique SAMs .............................................................................. 139 1 Introduction ............................................................................................................ 141

2 Matériel et méthodes .............................................................................................. 142

2.1 Matériel ...................................................................................................... 142

2.2 Culture cellulaire et mesure de l’activité phosphatase alcaline .................. 142

2.3 Conception du capteur ................................................................................ 143

2.4 Immobilisation des microalgues ................................................................. 143

2.5 Mesures ...................................................................................................... 144

3 Résultats et discussion ............................................................................................ 144

3.1 Voltamétrie cyclique .................................................................................. 144

3.2 Formation des couches SAMs .................................................................... 145

3.3 Microscopie des cellules algales immobilisées .......................................... 147

3.4 Détection de l’activité phosphatase alcaline .............................................. 147

3.5 Analyse de la variabilité de la réponse ....................................................... 149

3.6 Stabilité du capteur au cours du temps ....................................................... 150

3.7 Conclusion .................................................................................................. 151

Chapitre IV Développement d’un biocapteur conductimétrique a cellules algales

pour la détection du phosphate ....................................................................................... 153 1 Introduction ............................................................................................................ 155


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 13

2.1 Matériel ...................................................................................................... 156

2.2 Culture cellulaire et mesure de l’activité phosphatase alcaline .................. 156

2.3 Conception du capteur ................................................................................ 157


2.5 Mesures de l’APA ...................................................................................... 158

2.5.1 Mesures en bioessais .............................................................................. 158

2.5.2 Mesures en biocapteur ............................................................................ 159

2.6 Détection du phosphate .............................................................................. 160

2.6.1 Détection en bioessais ............................................................................ 160

2.6.2 Détection en biocapteur .......................................................................... 160

3 Résultats et discussion ............................................................................................ 160

3.1 Observation microscopique des algues immobilisées ................................ 160

3.2 Détection de l’activité phosphatase alcaline .............................................. 161

3.3 Optimisation de la sensibilité de détection du phosphate .......................... 162

3.4 Courbes de calibration ................................................................................ 168

3.5 Réutilisation du capteur .............................................................................. 169

3.6 Stabilité du biocapteur ................................................................................ 169

4 Conclusion .............................................................................................................. 170

Chapitre V Développement d’un biocapteur conductimétrique basé sur

l’immobilisation de cellules algales dans une matrice Nafion/BSA ............................. 173 1 Introduction ............................................................................................................ 175


2.1 Matériel ...................................................................................................... 176

2.2 Culture des algues ...................................................................................... 176

2.3 Conception du biocapteur ........................................................................... 177


2.5 Mesure de l’APA ........................................................................................ 178

2.5.1 Mesures en bioessais .............................................................................. 178

2.5.2 Mesures en biocapteur ............................................................................ 178

3 Résultats ................................................................................................................. 179

3.1 Observation microscopique ........................................................................ 179

3.2 Détection de l’APA .................................................................................... 179

3.3 Inhibition de l’APA en bioessais ................................................................ 180

3.4 Optimisation de la sensibilité de détection du cadmium en biocapteur ..... 181

4 Conclusion .............................................................................................................. 185

Chapitre VI Etude préalable au développement d’un biocapteur conductimétrique

à cellules algales pour le monitoring des milieux salins ................................................ 187 1 Introduction ............................................................................................................ 189

2 Les souches utilisées .............................................................................................. 189

3 Détection de l’AE chez les algues marines en bioessais ........................................ 190

4 Effets de différents pesticides sur l’AE des algues marines ................................... 192

4.1 Effets du glyphosate sur l’AE des algues marines ..................................... 193

4.2 Effets du Round Up® sur l’activité estérase des algues marines ............... 196

4.3 Effets du diuron et de ses produits de dégradation sur l’AE ...................... 199

4.3.1 Effets sur l’AE de l’algue Dt .................................................................. 199

4.3.2 Effets sur l’AE de l’algue Pt .................................................................. 202

5 Mesure de l’AE des algues marines en biocapteur conductimétrique ................... 206

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 14

6 Conclusion .............................................................................................................. 208

Chapitre VII Conclusions générales et perspectives de recherche ......................... 211 1 Conclusions générales ............................................................................................ 213

Les biocapteurs ........................................................................................................... 214

Pour la détection de métaux lourds ........................................................................ 214

Pour la détection d’ions phosphates ....................................................................... 215

2 Perspectives de recherche ....................................................................................... 216

2.1 Mieux comprendre le mécanisme d’action des polluants .......................... 216

2.2 Etude de nouveaux bioindicateurs et biomarqueurs ................................... 216

2.3 Mise au point d’un biocapteur pour la détection de métaux lourds ........... 217

2.4 Poursuite des travaux sur les biocapteurs à pesticides ............................... 217

2.5 Adaptation des biocapteurs pour des mesures sur sites .............................. 217

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .................................................................. 221

TABLE DES FIGURES .............................................................................................. 233

TABLE DES TABLEAUX ......................................................................................... 237

PUBLICATIONS, ENCADREMENT ET COMMUNICATIONS ....................... 239

ANNEXES .................................................................................................................... 241

ANNEXE 1 : Composition du milieu AFNOR LC .................................... 241

ANNEXE 2 : Composition du milieu f/2 ................................................... 242

ANNEXE 3 : Articles en anglais ................................................................ 243

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 15

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 16

Introduction Générale

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 17

INRODUCTION GENERALE

L’eau est une ressource indispensable tant pour la vie en général que pour les

différentes activités humaines. Afin de préserver les écosystèmes aquatiques très fragiles et la

qualité de la ressource, une nouvelle réglementation européenne visant à assurer un « bon

état » de ces milieux en Europe à partir de 2015 a été adoptée (Directive-Cadre européenne

2000/60/CE).

Dans ce cadre il apparaît nécessaire de mettre en place des essais de toxicité rapides et

sélectifs et des systèmes de surveillance en continu et en temps réel des milieux aquatiques.

Les biocapteurs permettent de répondre à cette demande. Le travail présenté ici contribue au

développement de ces outils de contrôle.

Depuis une vingtaine d’années le développement de biocapteurs destinés au domaine

biomédical et à l’analyse de composants alimentaires s’est élargi au domaine du contrôle de

l’environnement et en particulier des eaux de surface. Le travail présenté ici s’inscrit dans ce

domaine de recherche et fait suite à des études initiées sur le développement de capteurs à

cellules algales depuis une dizaine d’années. De nouvelles techniques de conception de

capteurs sont ici mises au point et développées; elles ont permis d’améliorer l’efficacité et la

sensibilité de la détection des polluants classiquement recherchés pour la surveillance des

écosystèmes. Les outils développés sont basés sur l’analyse de la perturbation métabolique

des algues en milieux contaminés par les grandes familles de polluants chimiques (métaux

lourds, phosphates, pesticides..). Le développement des capteurs s’appuie ici sur la réponse de

bioessais écotoxicologiques réalisés sur les souches algales préalablement selectionnées pour

leur sensibilité aux polluants que nous souhaitons pouvoir détecter.

Cette thèse s’inscrit dans une démarche globale du LSE portant sur l’étude de

l’impact des polluants sur les écosystèmes.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 18

La première partie est une revue bibliographique axée sur la pollution des milieux

aquatiques, les méthodes de contrôle de la qualité de ces milieux et enfin une présentation des

biocapteurs environnementaux comme des outils de détection de la pollution.

La deuxième partie présentera le matériel utilisé et les nouvelles techniques de

conception des capteurs qui ont abouti à des outils innovants dans le domaine de la

surveillance des milieux aquatiques d’eaux douces et salées

La troisième partie, quant à elle, présentera les résultats obtenus, leurs interprétations,

les conclusions tirées et les perspectives de recherche :

Dans un premier chapitre des bioessais écotoxicologiques sur la microalgue d’eau

douce Chlorella vulgaris basés sur la mesure d’activités enzymatiques seront

présentés. Ces bioessais sont déterminant pour le choix des activités métaboliques

adéquates pour la détection de certaines familles de polluants dans l’objectif de

développer des biocapteurs.

Dans un deuxième chapitre nous présenterons les essais d’évaluation de

l’immobilisation des microalgues par différentes méthodes ainsi que l’application de

ces essais pour le développement d’un biocapteur optique pour la détection des

pesticides.

Dans un troisième chapitre, un biocapteur conductimétrique basé sur la détection de

l’activité phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris immobilisée par le biais de

monocouches autoassemblées destiné pour la détection des métaux lourds dans l’eau

sera proposé. Ce travail a fait l’objet d’une publication scientifique dans un journal à

comité de lecture : Microchimica Acta, (2008) 163 :179-184.

Le quatrième chapitre présentera un biocapteur conductimétrique pour la détection du

phosphate basé sur la mesure de l’activité phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris

immobilisée dans un gel de BSA réticulé par le glutaraldéhyde. Ce travail fait l’objet


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 19

d’un article scientifique dans le journal à comité de lecture : Sensors Letters, (2009) 7 (5):

788–794.

Un cinquième chapitre sera consacré à la présentation d’un travail portant sur le

développement d’un biocapteur conductimétrique pour la détection de métaux lourds

basé sur l’immobilisation de Chlorella vulgaris dans une matrice nafion/BSA. Ce

travail a fait l’objet d’un article dans le journal : Progress in Environmental Science and

Technology (2009) Vol. II, PartA 623-628.

Le sixième chapitre présente la potentialité d’utilisation des algues marines pour la

détection de pesticides dans les milieux salins. Ce travail s’inscrit dans le programme

de recherche national Ecosphère Continentale et Côtière dont l’objectif est d’étudier

l’impact environnemental de produits phytosanitaires sur les lagunes côtières. Des

bioessais écotoxicologiques sur trois souches d’algues marines ont été réalisés en

présence de deux molécules modèles. Ces bioessais ont été à la base du

développement d’un biocapteur conductimétrique basé sur la mesure de l’activité

estérase d’algues marines.

Le dernier chapitre présentera les conclusions générales ainsi que les perspectives de

recherche.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 20

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 21

PARTIE A Bibliographie

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 22

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 23

Chapitre I La pollution des milieux aquatiques

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 24

Bibliographie La pollution des milieux aquatiques

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 25

1 Les écosystèmes aquatiques

Tansley (1935) [1] a dénommé écosystème « l’association d’un environnement

physico-chimique spécifique (le biotope) avec une communauté vivante (biocénose).

Biocénose et biotope exercent l’un sur l’autre de perpétuelles interactions marquées

essentiellement par d’incessants transferts d’énergie et échanges de matière entre ces deux

entités et à l’intérieur de chacune d’elle ». Parmi tous les écosystèmes de la biosphère, les

écosystèmes aquatiques sont les plus abondants car l’eau représente 72% de la surface de la

terre. Les écosystèmes aquatiques regroupent une grande diversité de milieux, tous

caractérisés par l’omniprésence de l’eau (douce ou salée, vive ou lente).

2 La pollution des milieux aquatiques

Fort utilisé de nos jours, le terme de pollution recouvre une multitude d’actions qui,

d’une façon ou d’une autre dégradent le milieu naturel. Ce terme désigne certes, sans aucune

ambiguïté, les rejets dans l’environnement de substances polluantes toxiques que l’homme

disperse dans l’écosphère. En revanche, cette terminologie paraît moins évidente lorsqu’elle

se rapporte à des substances peu dangereuses voire inoffensives pour les êtres vivants mais

exerçant une influence perturbatrice sur les processus biologiques fondamentaux du seul fait

de leur excessive concentration [2]. Un des exemples les plus connus est celui des

phosphates, indispensables pour les organismes autotrophes mais qui, à fortes concentrations,

peut induire l’eutrophisation.

Par le biais du cycle de l’eau (Figure 1), les écosystèmes aquatiques sont susceptibles d’être

contaminés par des pollutions diverses et variées, d’origine accidentelle ou d’usage.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 26

Figure 1 Cycle de l’eau (d’après le site internet de Wikipedia [3])

2.1 Origine de la pollution des milieux aquatiques

Les activités humaines sont à l’origine des principaux types de pollution. On distingue

quatre sources : la production d’énergie, les industries chimiques et métallurgiques, les

activités agricoles et la pollution domestique. Le déversement dans le milieu aquatique de

substances ou d’effluents contaminés n’est pas la seule cause de pollution des eaux. En effet,

l’eau de pluie permet aux polluants rejetés dans l’atmosphère de retomber sur les sols et

lessive les zones polluées. Par ruissellement et/ou infiltration, ces xénobiotiques peuvent alors

rejoindre le milieu aquatique. Suivant la nature de la pollution on distingue trois types de

pollutions regroupées dans le tableau ci-après.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 27

Type de la

pollution

Nature de la pollution Milieu affecté

Atmosphère Hydrosphère Sols

Physique

Radiations ionisantes + + +

Caléfaction (pollution thermique) + +

MES (matières en suspensions) +

Chimique

Dérivés gazeux du carbone + +

Hydrocarbures + +

Dérivés du soufre + + +

Dérivés de l’azote + + +

Métaux et métalloïdes toxiques + +

Fluorures +

Détersifs +

Pesticides et autres composés

organiques de synthèse non volatils

+ +

Matière organique fermentescibles +

Biologique

Contamination microbiologique + +

OGM + +

Espèces invasives + +

Tableau 1 Classification des principaux types de pollutions en fonction des polluants (d’après Ramade,

2007 [2])

2.2 Les polluants des milieux aquatiques

Parmi l’inventaire de polluants présenté dans le Tableau 1 , cette étude

bibliographique se limitera aux métaux lourds, quelques pesticides, et le phosphate étant

donné que ce travail ne traitera que ces polluants.

2.2.1 Les métaux lourds

La définition des métaux lourds demeure un concept très ambigu. En effet et à titre

d’exemple, le rapport d’information au Sénat français « Les effets des métaux lourds sur


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 28

l’environnement et la santé », indiquait : « L’appellation métaux lourds est cependant une

appellation courante qui n’a ni fondement scientifique ni application juridique. ». Certains

auteurs définissent les métaux lourds comme les éléments métalliques ayant une masse

volumique supérieure à 4000 kg/m3, pour d’autres il s’agit de tous les éléments métalliques à

partir de la quatrième période du tableau périodique des éléments. Quoi qu’il en soit, les

métaux les plus nocifs pour l’homme et l’environnement sont le cadmium, le plomb, le

mercure et l’arsenic.

Le cadmium : Le cadmium fut découvert en 1808 par Magnus Martin , mais c’est en 1817

que l’allemand Friedrich Stromeyer le prépara pour la première fois [4]. Dans les eaux

naturelles l’ion Cd2+

prédomine au-dessous de pH 8 , CdCO3 est prédominant entre les pH de

8 à 10 unités [5]. Dans sa spéciation, il est généralement considéré comme dissout, seules les

rivières très riches en matières en suspension ou des eaux proches du fond des rivières,

peuvent présenter du Cd adsorbé à la fraction solide [6]. L’adsorption du Cd dans la fraction

solide est considérée comme étant un enjeu majeur pour expliquer la concentration de cet

élément dans les eaux naturelles [7].

Le cadmium est incorporé dans les réseaux trophiques aquatiques par le biais de la

bioaccumulation. Même en milieu marin dans des zones exemptes de pollution, de fortes

concentrations en cadmium ont pu être observées [8] dans l’organisme de certains invertébrés

(Tableau 2).

Phylum Concentration

(en ppm/poids frais)

Mollusques 0,83 à 38

Echinodermes 0,24 à 15

Crustacés 0,15 à 13

Cnidaires 1,2

Eponges 1,9

Protozoaires 1,2

Tableau 2 Concentration en cadmium dans certains invertébrés marins (d’après Mullins, 1956 [8])


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 29

Le plomb : Le plomb est un produit naturel de la désintégration de l'uranium [4]. Le plomb a

deux états d’oxydation 2+ et 4

+. L’état tétravalent est un très fort oxydant, mais il n’est pas

fréquent dans l’environnement, en revanche l’état divalent est le plus stable dans

l’environnement [9]. Dans les eaux naturelles Pb2+

se complexe par les carbonates, parce que

ces eaux se trouvent en général dans un domaine de pH entre 6 et 8 [10]. Toutefois dans les

eaux acides, Pb2+

sera associé aux sulfates, alors que pour des pH élevés (>8) Pb2+

se trouvera

sous forme complexe avec des hydroxydes. En revanche, la spéciation peut varier de manière

importante en fonction des concentrations en chlore et phosphore [11]. la toxicité des espèces

organiques du plomb est beaucoup plus grande que celle des espèces inorganiques, son

passage chez l’homme se produit par la chaîne alimentaire [12]. L’Organisation Mondiale de

la Santé (OMS) signale aussi le risque grave produit par la forme du plomb inorganique

introduite par la voie de la consommation de l’eau.

L’arsenic : L’arsenic est un élément chimique présentant des propriétés intermédiaires entre

celles des métaux et des métalloïdes (Mahan, 1987). La configuration électronique de

l’arsenic induit quatre degrés d‘oxydation possibles :(-3), (0), (+3), (+5). Les composés de

l’arsenic rencontrés dans l’environnement correspondent principalement à des espèces

inorganiques, présentant les deux degrés d‘oxydation As(V) et As(III) : arséniates et arsénites,

respectivement. La connaissance de la spéciation de l’arsenic permet de mieux mesurer

l’impact et le risque environnemental, car la nature de l’espèce affecte la biodisponibilité, la

toxicologie, la mobilité et la bioturbation de l’arsenic. La toxicité de l’arsenic dépend de sa

nature chimique : l’arsenic inorganique est plus toxique que l’arsenic organique. La toxicité

de l’arsenic dépend de son degré d’oxydation : As(O) > As(III) > As(V) [9] et augmente avec

le degré de méthylation de l’arsenic [13, 14].

Le mercure : Cet élément chimique est abondant dans l’environnement du fait de sa forte

présence dans la croûte terrestre. Néanmoins, les activités anthropiques tendent à bouleverser

le cycle géochimique du mercure et en particulier : la combustion du charbon, l'orpaillage,

l'incinération de déchets contenant du mercure et l’utilisation de pesticides contenant cet

élément.

Le Tableau 3 résume l’origine des métaux lourds les plus couramment rencontrés dans

l’environnement, leurs utilisations ainsi que leurs effets toxiques.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 30

Métal Minerai Utilisation Effets toxiques

Cadmium Greenockite (CdS) Revêtements anticorrosion

Ecrans de télévision

Colorants

Batterie d'accumulateurs

Problèmes rénaux

Augmentation de la tension

Cancérigène

Mutagène

Plomb galène (PbS) Plomberie

Munitions de guerre ou de

chasse

l’industrie du verre

Accumulateurs électriques

Dommages vasculaires

Pertes de mémoire

Stérilité

Perturbations des fonctions

cognitives

Arsenic Arséniate

Sulfure, sulfosel

Arsénite

Fabrication de verre ou de

cristal

Additif au mélange plomb-

antimoine des électrodes des

accumulateurs.

As2O3 est un poison violent

Arythmie cardiaque

Cancer du poumon

Mercure sulfure de mercure

(HgS)

Fongicides et bactéricides

Lampes fluorescentes

Amalgames dentaires

Neurotoxique

Perturbateur endocrinien

Inhibition de la croissance

des algues, des bactéries et

des champignons

Mortalité embryo-larvaire

chez les amphibiens

Zinc sphalérite (ZnS) Galvanisation des aciers

Agriculture

Phytotoxique

Réduction des fonctions

immunitaires chez l’homme

Tableau 3 Origine, utilisation et effets toxiques de quelques métaux lourds


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 31

2.2.2 Les pesticides

Un pesticide est une substance destinée à repousser ou à combattre toute espèce

indésirable végétale ou animale, pendant la production, le stockage, le transport, la

distribution ou la transformation des denrées destinées à l’alimentation humaine ou animale.

Ce terme désigne aussi toute substance destinée à servir comme régulateur de la croissance,

défoliant ou dessiccateur [15]. Les types les plus connus de pesticides sont :

Les insecticides destinés à tuer les insectes ;

Les herbicides pour éliminer les mauvaises herbes ;

Les fongicides pour éliminer les champignons.

Le Tableau 4 présente les principales classes de pesticides, leurs utilisations, leurs modes

d’action.

Classes Exemples Utilisation/Action Caractéristiques

Insecticides

Organochlorés DDT, aldrine

lindane, chlordane

Paralysie et mort des

insectes

Bioaccumulation

Bioamplification

Organophosphorés Parathion,

Diazinone,

Malathion

Neurotoxique Persistances dans les

milieux

Hydrosolubles

Carbamates Carbaryl

Aldicarbe

Neurotoxique Hydrosolubles

Herbicides Les Triazines Atrazine Agit sur la

photosynthèse

Utilisé dans les cultures

de maïs

Très hydrosoluble

Toxique pour le

phytoplancton et les

algues d’eau douce

Dérivé des

pyridines

Paraquat Désherbant de la vigne Lésions pulmonaires

irréversibles

Les Urées

substituées

Diuron Inhibiteur de la

photosynthèse

Toxicité faible pour

l’homme

Les acides

organiques

Glyphosate Désherbant total

Toxicité faible due à la

pénétration difficile

dans les feuilles

Fongicides Pentachlorophénol

(PCP)

Tue les champignons

lignivores

Hautement toxique pour

l’homme

Tableau 4 Classification et caractéristiques des groupes de pesticides


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 32

Seuls 1 à 2% des quantités d’insecticides et 5% des herbicides dispersés par voie

aérienne atteignent leurs cibles biologiques. Les 95 à 99% restant vont se déposer dans les

sols, se disperser dans les eaux superficielles et profondes et se fixer dans les aliments et les

organismes non visés spécifiquement tels que l’homme et les animaux. Ainsi les insecticides

comme le DDT, liposolubles, non biodégradables, vont subir une bioamplification conduisant

à des concentrations multipliées par des facteurs de plusieurs millions au sommet des chaînes

alimentaires (Figure 2) pour des durées de plusieurs dizaines d’années.

Figure 2 bioamplification du DDT (modifié d’après Miller, 1994 [16])

2.2.3 Les phosphates

Le minerai de phosphate (roche concentrée en sels de phosphate) est une roche

sédimentaire dite exogène : elle se forme par concentration lorsque des ions phosphate

précipitent dans une roche en diagenèse. Le phosphate est généralement libéré par l’érosion.

Durant son parcours vers les milieux aquatiques, les ions phosphates pourront être absorbés

par des plantes ou des animaux puis retourneront au sol ou à l’eau par le biais de la


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 33

décomposition végétale, animale ou par voie urinaire. Le cycle biogéochimique et écologique

du phosphore a été modifié par l'Homme qui l'a récemment massivement introduit sous forme

d'engrais (eutrophisant) dans les agrosystèmes, et indirectement dans les écosystèmes.

Les phosphates sont utilisés principalement dans l'agriculture comme engrais en tant

que source de phosphore. Depuis le 1er juillet 2007, les phosphates sont interdits dans les

lessives en France. Grâce à l'utilisation d'autres molécules actives de la même famille que le

phosphate (tensioactifs anioniques) comme les sels d’acides carboxyliques ou les sulfonates,

la qualité des eaux de nombreux lacs polluées par les eaux urbaines s'est améliorée.

Dans les eaux, le phosphore se trouve principalement sous forme d’orthophosphate(HxPO4x-3

),

de polyphosphates (polymères d’acide phosphorique) et de forme organique du phosphore. La

forme orthophosphate est la prépondérante, en raison de l’hydrolyse des deux autres espèces.

L’ion phosphate peut se trouver sous trois états de protonisation:

KAi désigne les constantes d’acidité des espèces H3-iPO4

i-

Le phosphore est un élément indispensable à la vie. En soi, il n’est pas toxique mais il

provoque l’eutrophisation lorsqu’il est en excès dans l’eau. Le phosphate est la forme sous

laquelle le phosphore peut être assimilé par les êtres vivants, en particulier les algues. La

prolifération de ces algues peut avoir de nombreux effets néfastes, tels par exemple,

l’augmentation de la turbidité et la déoxygénation de l’eau, la diminution de l’aspect

esthétique et la réduction des activités de loisirs. Certaines algues (algues bleues) peuvent

produire des substances qui empoisonnent le zooplancton, les poissons, les oiseaux, le bétail

et les humains.

Présentes en forte densité, les algues font augmenter les coûts de traitement de l’eau

potable et donnent à l’eau une mauvaise odeur et un mauvais goût.

H3PO4 + OH- H2PO4

- + H2O pKA1 = 2.1

H2PO4 + OH

- HPO4

2- + H2O pKA2 = 7.2

HPO4 2-

+ OH-

PO4 3-

+ H2O pKA3 = 12.5


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 34

2.3 Conséquences sur les écosystèmes aquatiques

2.3.1 Bio-accumulation-concentration à travers la chaîne trophique

2.3.1.1 Notion de biodisponibilité et de spéciation

En réalité, la valeur de la concentration d’un polluant dans un biotope aquatique ne

présente pas une grande signification en écologie et en écotoxicologie. En effet, la

concentration des polluants dans les eaux n’apporte aucune information sur la quantité

réellement absorbée par un être vivant.

La biodisponibilité d’un polluant est la fraction de ce dernier présente dans le biotope qui est

absorbable et qui peut être transférée, stockée et métabolisée par les êtres vivants [17].

La notion de biodisponibilité est particulièrement importante dans la mesure où selon leurs

spéciations, certains polluants sont plus ou moins toxiques. Ainsi le chrome III est plus

toxique que le chrome VI ; de même, à concentration identique le plomb sous forme de nitrate

présente une toxicité 10-4

fois plus faible pour le zooplancton marin que sous la forme de

plomb tétraéthyle [2].

2.3.1.2 La bioaccumulation

On désigne par bioaccumulation, en écotoxicologie, le processus d’absorption par

lequel les êtres vivants peuvent accumuler des polluants dans leurs organismes. Chez les

organismes aquatiques, c’est la somme des absorptions par contact et par ingestion, plus celle

par voie transbranchiale pour les animaux aquatiques. La bioaccumulation n’implique pas

obligatoirement une augmentation de la concentration d’un polluant quand il passe du biotope

à la biocénose.

2.3.1.3 La bioconcentration

La bioconcentration est le processus par lequel un polluant rentre dans un organisme

vivant avec une concentration Ci et se retrouve à l’intérieur de cet organisme avec une

concentration Cf > Ci. Contrairement à la bioaccumulation, la bioconcentration s’accompagne

d’un accroissement de la concentration quand le polluant passe du biotope à la biomasse dans

le cas de la bio-concentration.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 35

Plusieurs organismes aquatiques se comportent comme des hyper-bioconcentrateurs :

Le vanadium, à l’état de traces dans les eaux, se rencontre à des taux très élevés

dans le sang des calamars [2].

En 1954, Foster relevait dans le phytoplancton de la rivière Columbia des taux de

radio-phosphore (32P) mille fois supérieurs à celui de ses eaux.

L’hépato-pancréas des mollusques bivalves retient jusqu’à plus d’un g/kg de

cadmium rapporté à son poids sec. On en a même trouvé chez Pecten jusqu’à

1500 ppm dans cet organe. Ces mollusques peuvent accumuler le DDT à un

taux 70000 fois supérieur à ceux trouvé dans l’eau [18].

2.3.1.4 La bioamplification

Il s’agit de la circulation des polluants à travers la chaine trophique. A des degrés

divers, tous les êtres vivants présentent une bioaccumulation ou une bioconcentration de

substances peu ou pas biodégradables. De ce fait, il apparaîtra des phénomènes

d’amplification biologique des polluants dans tout écosystème contaminé. En effet, les

organismes qui ont concentré les polluants vont servir de nourriture à d’autres espèces qui les

accumuleront dans leurs tissus. Il va se produire une contamination de tout le réseau

trophique, initiée par les producteurs primaires qui « pompent » les polluants dispersés dans le

biotope, les phénomènes de bioaccumulation se produisant dans l’ensemble de la chaîne

trophique. Les prédateurs, situés au sommet des chaines alimentaires présenteront les taux de

contamination les plus élevés. Ce phénomène est appelé bioamplification ou biomagnification

[2].

Hunt et Bischoff [19] ont été les premiers à observer ce phénomène dans un lac de

Californie, le Clear lake, le facteur de concentration était de 166000.

De façon générale, les facteurs de concentration dans les chaînes trophiques

aquatiques sont largement supérieurs à ceux des chaînes trophiques terrestres. Ceci est dû

essentiellement au fait que la base des chaines alimentaires aquatiques (phytoplancton et

zooplancton) possède une forte aptitude à la bio-concentration avec des facteurs allant jusqu’à

10000. Des records de facteurs de bioamplification ont été observés dans le lac Kariba au

Zimbabwe pollué par le DDT. Les crocodiles (Crocodilus niloticus), situés au sommet de la

chaîne alimentaire présentait un facteur de concentration supérieur à 1,7 million [20].


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 36

2.3.2 Effets des polluants sur le compartiment biotique

Les polluants des milieux aquatiques ont des effets divers sur les populations vivantes.

Dans ce paragraphe nous ne développerons que les principaux : les effets sur la mortalité, sur

la reproduction et sur la croissance.

Les effets sur la mortalité résultent d’une toxicité aiguë ou chronique. Ils se manifestent par

une mort immédiate suite à une pollution accidentelle ou différée si la concentration dans

l’environnement est assez élevée. Dans les milieux aquatiques les effets létaux s’observent

généralement dans les populations victimes de pollutions accidentelles. C’est le cas de

l’accident de l’Erika qui a affecté en décembre 1999 les côtes atlantiques françaises

provoquant la mort d’environ 200000 oiseaux de mer.

Les effets sur la reproduction peuvent s’observer à de faibles concentrations en polluants.

Ces derniers sont responsables de l’échec du processus de la reproduction à différents

niveaux : gamétogenèse, maturation des gamètes, comportement de reproduction,

fécondation, développement embryonnaire, éclosion et mortalité néonatale. Dans la majeure

partie des cas, ce sont les organochlorés qui sont mis en cause. Les premiers travaux sur les

effets des organochlorés sur le potentiel biotique des populations animales ont été réalisés par

De Witt (1955) [21] et par Genelly et Rudd (1956) [22]. Dans ces travaux, les auteurs ont

montré que la dieldrine, le DDT et le toxaphène incorporés à raison de 25 mg/kg dans

l’alimentation de faisans provoquaient une forte diminution du nombre d’œufs pondus et de la

viabilité des jeunes. Koeman et al. (1967) [23] ont été les premiers à démontrer l’existence

des effets des organochlorés sur la reproduction dans le milieu naturel dans une étude sur la

régression catastrophique des colonies de sternes Caugeck (Sterna sandwicensis) du littoral

hollandais (50000 couples en 1952, seulement 150 en 1965). Cette régression provient de la

diminution du potentiel biotique suite à la contamination par la dieldrine et la telodrine

rejetées par une usine Shell en aval de Rotterdam.

Les effets sur la croissance: suite au contact avec des polluants, des effets sur la croissance

ont été mis en évidence sur des populations terrestres et aquatiques. Plusieurs recherches ont

montré que de faibles concentrations de polluants étaient susceptibles de ralentir la croissance

d’un grand nombre d’espèces d’invertébrés.

Ainsi d’infimes concentrations d’insecticides organochlorés ou de PCB perturbent la

croissance des mollusques. Un ppb d’arochlor 1254 suffit pour provoquer une diminution de

la croissance de la coquille chez l’huitre Crassostraea virginica.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 37

Davis et Hidun [24] ont étudié les effets de quelques insecticides organochlorés sur deux

espèces de bivalves. Ils ont mis en évidence un effet sur le développement larvaire et sur la

survie (Tableau 5).

Insecticide Espèce Concentration

(en ppm)

Développement

larvaire(%)

Survie (%)

Aldrine Mercenaria

mercenaria

0.25

1

90

17

75

0

DDT Mercenaria

mercenaria

0.2

2

91

60

88

94

Dieldrine Crassostraea

virginica

0.025

0.25

95

67

69

58

Endrine Crassostraea

virginica

0.025

0.25

100

52

79

67

Toxaphène Mercenaria

mercenaria

0.25

1

89

51

33

0

Tableau 5 Effets de divers insecticides organochlorés sur le développement des œufs et la survie larvaire

de mollusques Lamellibranches. D’après Davis, 1969 [24]

Contrairement aux pesticides, quelques xénobiotiques peuvent conduire à une

augmentation de la croissance des producteurs et par conséquent l’eutrophisation.

L’eutrophisation est une forme naturelle de pollution de certains écosystèmes

aquatiques qui se produit lorsque le milieu reçoit trop de matières nutritives assimilables par

les algues et que celles-ci prolifèrent. Les principaux nutriments à l’origine de ce phénomène

sont le phosphore et l’azote. L’eutrophisation s’observe surtout dans les écosystèmes dont les

eaux se renouvellent lentement et en particulier dans les lacs profonds.

Un lac reçoit en effet, de manière naturelle et continue, quantités de matières nutritives

apportées par les torrents et les eaux de ruissellement. Stimulées par cet apport, certaines

algues croissent et se multiplient de manière excessive. Cette croissance s’effectue dans les

couches d’eaux superficielles car les végétaux ont besoin de lumière pour se développer. Ces

algues en excès conduisent, lorsqu’elles se décomposent, à une augmentation de la charge

naturelle de l’écosystème en matières organiques biodégradables. Dans les profondeurs du

lac, là où les algues mortes viennent se déposer, les bactéries aérobies qui s’en nourrissent


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 38

prolifèrent à leur tour, consommant de plus en plus d’oxygène. Or en l’absence d’une

circulation suffisante des eaux, ce qui est souvent le cas dans un lac profond, le fond du lac est

peu oxygéné et les bactéries finissent par épuiser l’oxygène des couches d’eaux profondes.

Elles ne peuvent plus dégrader toute la matière organique morte et celle-ci s’accumule dans

les sédiments. On dit que le lac vieillit. Les régions littorales et les estuaires ne sont pas

épargnés par l’eutrophisation car leurs eaux sont peu brassées et reçoivent beaucoup de rejets

issus de l’activité humaine. C’est en particulier le cas de nombreux estuaires bretons. Ce

processus naturel est très lent : il peut s’étaler sur des siècles ou des millénaires, et parfois sur

de plus longues périodes encore. Mais l’eutrophisation peut être fortement accélérée par

l’apport d’effluents domestiques, industriels et/ou agricoles et conduire à la mort de

l’écosystème aquatique en quelques décennies voire même en quelques années. On parle alors

d’hypereutrophisation ou encore de dystrophisation [25].

3 Conclusion

Les écosystèmes aquatiques sont des milieux très fragiles et sont soumis de plus en

plus aux pressions anthropiques et aux polluants de diverses natures. Les conséquences d’une

pollution n’étant généralement pas visible immédiatement, il est impératif de mettre en place

à la fois une législation adéquate et des contrôles de la qualité des eaux rigoureux. Plusieurs

types d’analyses au laboratoire sont de choix : les analyses physico-chimiques et biologiques

et les bioessais écotoxicologiques. Mais comme ces analyses sont décalées dans le temps, ils

ne permettent pas un suivi en continu et in situ des écosystèmes. Les seuls systèmes capables

d’une analyse rapide, sur site et en continu sont les biocapteurs.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 39

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 40

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 41

Chapitre II Contrôle de la qualité des milieux aquatiques : les

tests au laboratoire

Bibliographie Contrôle de la qualité des milieux aquatiques au laboratoire

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 42

1 La législation en cours

1.1 La Directive européenne (2006/60/CE)

La Directive européenne (2006/60/CE) établit un cadre pour une politique globale

communautaire dans le domaine de l'eau. La directive-cadre prévoit l'identification des eaux

européennes et de leurs caractéristiques, recensées par bassin et district hydrographiques, ainsi

que l'adoption de plans de gestion et de programmes de mesures appropriés à chaque masse

d'eau. Par cette directive-cadre, l'Union européenne organise la gestion des eaux intérieures

(de surface et souterraines), de transition (lagunes, deltas) et côtières, afin de prévenir et de

réduire leur pollution, de promouvoir leur utilisation durable, de protéger leur environnement,

d'améliorer l'état des écosystèmes aquatiques et d'atténuer les effets des inondations et des

sécheresses.

L’objectif principal de cette directive est de garantir le bon état des eaux en 2015. Ceci

passera forcément par la mise au point de systèmes de détection performants des polluants des

eaux permettant de réagir rapidement en cas de contamination.

1.2 La réglementation REACH

L’enregistrement, évaluation et autorisation des produits chimiques — en anglais :

Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals (REACh) — est un règlement du

Parlement européen et du Conseil de l'Union européenne, adopté le 18 décembre 2006, qui

modernise la législation européenne en matière de substances chimiques, et met en place un

système intégré unique d'enregistrement, d'évaluation et d'autorisation des substances

chimiques dans l'Union européenne. Il s’agit d’un outil contribuant à la mise en application de

la DCE. Son objectif est d'améliorer la protection de la santé humaine et de l’environnement,

tout en maintenant la compétitivité et en renforçant l'esprit d’innovation de l'industrie

chimique européenne. REACH vise toutes les substances chimiques, produites ou importées,

existantes ou nouvelles, à partir d'un volume annuel supérieur à une tonne, soit 30 000

substances (parmi les plus de 100 000 utilisées en Europe). La proposition de règlement a été

votée le 17 novembre 2005 par le parlement européen et a été adoptée en deuxième lecture le

13 décembre 2006. Le règlement est entré en application progressivement à partir de 2007. En

France, il s'applique à partir du 1er

juin 2007.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 43

1.3 Les polluants et les normes

Les émissions de rejets contenant des polluants sont réglementées par les pouvoirs

publics. Des valeurs limites selon les milieux considérés ont été retenues.

1.3.1 Les métaux lourds

Le Tableau 6 regroupe les valeurs limites des concentrations en métaux lourds dans

l’eau potable ainsi que dans les rejets industriels. Les valeurs limites des rejets émis par les

installations classées pour la protection de l’environnement (ICPE) sont fixées en France par

arrêté préfectoral pour chaque installation en fonction du type d’activité et des rejets.

Métal lourd Eau potable Rejet industriel (cas général)

Cadmium 5µg/l 0.02mg/l

Zinc 5µg/l 2 mg/l si rejet > 20 g/jour

Plomb 50µg/l 0.5 mg/l si rejet > 5 g/jour

Arsenic 50µg/l -

Cuivre 50µg/l 0.5 mg/l si rejet > 5 g/jour

Tableau 6 Normes françaises pour la qualité de l'eau potable (Décret n° 89-3 du 3 janvier 1989 modifié) et

des rejets industriels (cas général)

1.3.2 Les pesticides

Ni la législation française ni la législation européenne ne prévoient des valeurs limites

pour les pesticides dans les milieux aquatiques étant donné qu’il est considéré qu’ils ne sont

pas directement rejetés dans l’environnement. Néanmoins, la réglementation française pose

des valeurs limites pour les pesticides et leurs produits de dégradation dans les eaux potables.

Ainsi elle fixe une concentration maximale de 0.1ppb pour chaque pesticide ou métabolite et

une concentration totale de 0.5ppb pour l’ensemble des pesticides et métabolites (arrêté

ministériel du 11 janvier 2007).

2 Evaluation de la qualité des milieux aquatiques

L’évaluation de la qualité des milieux aquatiques peut être réalisée par le biais de

différentes approches :

Les analyses chimiques au laboratoire

La mesure des paramètres physico-chimiques et biologiques globaux

Les bioessais écotoxicologiques


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 44

Ces approches peuvent être appliquées séparément ou simultanément suivant le but de

l’étude. Ainsi, dans le but de détecter la présence des PCB dans un cours d’eau, par exemple,

il suffit de réaliser une analyse chimique au laboratoire. Par contre, dans le but d’un suivi de

la qualité d’une rivière, les trois approches donneront des informations complémentaires.

2.1 Analyses chimiques

Les analyses chimiques au laboratoire donnent des informations qualitatives et

quantitatives sur la composition d’une solution. Aujourd’hui, les analyses chimiques sont très

performantes et permettent de déceler des composés à l’état de traces. Sachant « que l’on ne

retrouve que ce que l’on cherche », plusieurs analyses sur le même échantillon doivent être

pratiquées. Ces analyses sont généralement coûteuses, produisent des déchets toxiques et

demandent une main d’œuvre qualifiée.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 45

2.1.1 Dosage des métaux lourds

Le Tableau 7 présente les techniques les plus utilisées aujourd’hui pour doser les

métaux lourds. Ces techniques permettent de doser des concentrations inferieures au ppb.

Métal Délai d’analyse Conservateur Méthode d’analyse

conseillée

Limite de

détection

Cadmium 1 mois après ajout du

conservateur

Filtration in-situ si

dosage de Cd dissous

Acidification

HNO3 à pH < 2

Polarographie

Spectrométrie

d'absorption

atomique

ppb

Zinc 1 mois après ajout du

conservateur, filtration

immédiate avant

acidification si Zn

dissous

Comme Cd Spectrophotométrie

d'absorption atomique

Colorimétrie au

Zincon si photomètre ou

au vert brillant

ppb

Plomb 1 mois après ajout du

conservateur

Filtration in-situ si

dosage de Pb dissous

Comme Cd Comme Cd ppb

Chrome

III

filtration immédiate si

détermination du Cr

total dissous

Comme Cd Spectrométrie

d'absorption atomique du

Cr total et différence

avec le CrIV

ppb

Chrome

VI

24 h après ajout de

conservateur

Filtration in-situ

Acidification

à pH < 2

avec H2SO4

Colorimétrie à la

diphénylcarbazide

ppb

Tableau 7 Méthodes analytiques pour le dosage de quelques métaux lourds

Notons que ces analyses ne peuvent, en aucun cas, prédire l’impact des métaux lourds sur

l’environnement.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 46

2.1.2 Dosage des polluants organiques

Le Tableau 8 présente les techniques les plus utilisés pour le dosage de quelques

polluants organiques.

Composé Technique conseillé pour le dosage dans l’eau Temps d’analyse

dioxine Chromatographie en phase gazeuse couplée à un

spectromètre de masse

<30mn

HAP Extraction au dichlorométhane

Dosage par chromatographie en phase gazeuse

Détection par spectrométrie de masse

<30mn

Pesticides de type

triazine,

organophosphoré,

carbamate

Extraction liquide-liquide avec du dichlorométhane

Concentration sous jet d’argon

Chromatographie en phase gazeuse

Détection par spectrométrie de masse

30à 60mn

diquat et

paraquat

Extraction et purification avec C-18

Dosage par chromatographie en phase liquide

30à 60mn

pesticides

organochlorés

Extraction avec de l’hexane et du dichlorométhane

Dosage par chromatographie en phase gazeuse

<30mn

Tableau 8 Méthodes analytiques conseillées pour le dosage de quelques polluants organiques dans l’eau

Le dosage des polluants organiques permet de détecter des concentrations sub-

micromolaires mais comme pour les métaux lourds, ne permet pas, d’identifier une

écotoxicité potentielle.

2.2 Mesures physico-chimiques et biologiques

En plus des analyses chimiques, des mesures physico-chimiques et biologiques

globales peuvent être réalisées pour contrôler la qualité des eaux. On distingue deux types de

mesures : des mesures in situ (Température, pH, conductivité…) et des mesures en laboratoire

(DBO51, DCO

2, MES

3…).

Ces mesures donnent des informations générales sur l’état de santé du milieu. Ainsi, la

présence de MES en forte quantité, peut conduire à une consommation accrue en oxygène lors

de la métabolisation de la partie biodégradable des MES, ce qui peut perturber l’équilibre de

1 Demande Biologique en Oxygène

2 Demande Chimique en Oxygène

3 Matières en suspension


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 47

l’écosystème. La présence de matière organique et de particules en suspension peut également

influer sur la biodisponibilité des polluants et la spéciation des métaux lourds [26].

2.3 Les bioessais écotoxicologiques

La seule connaissance de la concentration des polluants dans les milieux aquatiques et

des paramètres physico-chimiques du milieu ne permet pas d’évaluer l’impact sur les

écosystèmes.

Un vaste spectre de bioessais écotoxicologiques effectués au laboratoire a été développé au

cours des dernières décennies [27]. Leur but est de déterminer la toxicité d’une substance

chimique, d’un mélange de substances ou encore d’un échantillon naturel. Les bioessais

écotoxicologiques reposent sur la perturbation des paramètres biologiques ou biomarqueurs

(mortalité, croissance, photosynthèse, respiration…) de différents organismes vivants

(bioindicateurs), représentants la chaine alimentaire (producteurs, consommateurs,

décomposeurs).

Définition d’un bioindicateur

Blandin, 1986 [28] a dénommé un indicateur biologique ou bioindicateur « comme un

organisme ou un ensemble d’organismes qui - par référence à des variables biochimiques,

cytologiques, physiologiques, éthologiques ou écologiques- permet, de façon pratique et sûre,

de caractériser l’état d’un écosystème et de mettre en évidence aussi précocement que

possible leurs modifications naturelles ou provoquées ».

Définition d’un bio-marqueur

Un bio-marqueur est un changement observable et/ou mesurable au niveau moléculaire,

biochimique, cellulaire, physiologique ou comportemental, qui révèle l’exposition présente ou

passée d’un individu à au moins une substance chimique à caractère polluant [29]. En

écotoxicologie, il permet de détecter la présence de polluants dans l'environnement. Le

principe de l'utilisation d'un bio-marqueur est de rechercher la signature biologique de

l'impact ou de la présence d'un xénobiotique dans l'organisme, ou de l'effet induit par un

changement ou un stress environnemental.

Pour qu’un bioessai soit normalisé, il doit répondre à un ensemble de critères :

simplicité, rapidité d’exécution, reproductivité, sensibilité, représentativité des conditions

naturelles et en fin un coût modéré [2].


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 48

En réalité l’ensemble de ces critères n’est jamais forcément réuni surtout celui de la

représentativité. La raison est qu’aucun test, aujourd’hui, n’est capable de représenter la

réponse d’un écosystème pris dans son ensemble. Néanmoins, ces bioessais, tels qu’ils sont

actuellement normalisés, apportent des informations indispensables pour évaluer l’impact

potentiel de polluants sur les écosystèmes.

D’autres types de tests plurispécifiques4 ont été développés pour combler le déficit de

représentativité comme les microcosmes (miniaturisation de l’écosystème) et les indices

biotiques comme l’IBGN5 et l’IBD

6 réalisés sur le terrain.

Les tests écotoxicologiques monospécifiques7 développés jusqu’à l’heure concernent toute la

chaine trophique. Les paragraphes suivants ne traiteront que des bioessais réalisés avec des

organismes aquatiques.

2.3.1 Bioessais utilisant des producteurs

Plusieurs bioessais écotoxicologiques sur des producteurs primaires ont été

développés. Ils sont soit aiguës8 ou chroniques

9 et font intervenir différents biomarqueurs de

toxicité.

Pour les algues, nous pouvons citer le test de croissance de Pseudokirchneriella subcapitata

(NF T 90 375). C’est un test chronique permettant d’étudier l’inhibition de la croissance de la

microalgue pendant 72heures en présence d’un toxique ou d’un échantillon naturel. La

détermination de l’inhibition de la croissance permet typiquement de déterminer la CE5010

et

la NOEC11

. Ce test a été normalisé par l’EPA12

pour évaluer la toxicité des effluents d’égouts

urbains et industriels.

Pour les végétaux supérieurs, le test de référence est réalisé sur la lentille d’eau : Des

monocultures du genre Lemna (Lemna gibba et Lemna minor habituellement), en phase de

4 Test écotoxicologique faisant intervenir plusieurs espèces

5 L’indice Biologique Global Normalisé (IBGN) constitue une méthode d’évaluation de la qualité des cours

d’eau et des habitats des petits cours d’eau peu profonds à l’échelle de la station. Cette méthode est normalisée

(Norme NF T90-350). 6 L’Indice Biologique Diatomées (IBD) est un outil d’évaluation de la qualité des eaux applicable à l’ensemble

des cours d’eau de France. Cet indice a été normalisé en 2000 (AFNOR NFT 90-354 ) et fait actuellement l’objet

d’une révision. 7 Test écotoxicologique faisant intervenir une seule espèce

8 Test réalisé sur une durée inferieure au temps de génération de l’organisme considéré

9 Test réalisé sur une durée supérieure au temps de génération de l’organisme considéré

10 Concentration efficace 50, Concentration d'un polluant qui cause un effet toxique donné chez 50 % des

individus exposés 11

No observed effect concentration (concentration sans effets) 12

Environnemental Protection Agency (Washington DC)


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 49

croissance exponentielle, sont exposées à au moins cinq concentrations de la substance d'essai

sur une période de sept jours. L'objectif de l'essai est de quantifier les effets de la substance

sur la multiplication végétative des lentilles d'eau durant cette période, à partir de l’évaluation

de plusieurs paramètres. Cette étude inclut la mesure du pH, le comptage du nombre de thalles

et la mesure d'un autre paramètre au moins (superficie totale des thalles, poids sec ou poids

frais).

Ces bioessais donnent une idée sur la toxicité potentielle d’une substance ou d’un échantillon

naturel, mais ne peuvent, en aucun cas renseigner sur l’existence d’un polluant ou d’une

famille de polluants.

D’autres bioessais s’intéressent à un métabolisme spécifique de l’organisme d’essai et

permettent de donner des informations plus spécifiques quant à la présence de familles de

polluants. Ainsi, l’étude de la photosynthèse des microalgues (Chlorella vulgaris et

Pseudokirchniriella subcapitata pour les eaux douces et Dunaliella et Phaeodactylum pour le

milieu marin) permet de donner des informations sur la présence de substances anti PSII13

comme l’atrazine [30].

2.3.2 Bioessais utilisant les consommateurs

Pour étudier la toxicité des polluants des eaux, les organismes d’essai appartenant à la

classe des consommateurs les plus utilisés sont Daphnia magna (consommateur primaire) et

la truite arc-en-ciel (consommateur secondaire).

Daphnia magna est un organisme test qui occupe une place confirmée pour

l’évaluation de la toxicité aiguë et chronique de polluants sur les écosystèmes d’eau douce.

Cette espèce est choisie en raison de son rôle clé dans la chaîne trophique, sa sensibilité, sa

facilité d’élevage et son cycle de vie qui est mis à profit pour le test de reproduction de 21

jours. Outre la détermination des CE50 dans des essais de toxicité aiguë (24 ou 48 H) basés

sur la mobilité des daphnies (NF T 90 320), l’étude de la toxicité chronique permet la

détermination de la LOEC14

(Lowest effect concentration) et de la NOEC15

(No effect

concentration) qui sont des valeurs remarquables adoptées dans les études d’évaluation de

risques de nouvelles molécules par les instances de réglementation internationales [31].

13

Les substances anti-Photosystème II agissent sur la chaîne de transport d’électrons de la photosynthèse 14

Plus petite concentration induisant un effet observé. 15

Plus grande concentration sans effet


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 50

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus gairdneri) est représentative des consommateurs

secondaires dans les écosystèmes aquatiques d’eau douce. Le test de toxicité réalisé avec cet

organisme d’essai (NF T 90 305) mesure la mortalité des poissons après exposition de 96h à

différentes concentrations d’un polluant. C’est un test aiguë où la CL50-96h16

est déterminée.

Ce test présente l’inconvénient de son coût élevé (échantillonnage en rivière) et de la

variabilité de la réponse d’un individu à un autre [3].

L’évaluation de la toxicité d’un sédiment est généralement réalisée avec un amphipode

marin : Rhephroxnius abronius. Le problème de la contamination des sédiments aquatiques

est devenu au cours des dernières décennies un problème majeur en matière de pollution des

eaux continentales et littorales, les sédiments accumulant pour des durées indéfinies des

substances nocives qu’ils relarguent dans la colonne d’eau. Le test consiste à prélever R.

abronius dans des sites non contaminés et à les mettre en contact avec des sédiments pollués

prélevés dans des sites contaminés à une profondeur comprise entre 2.5 et 5cm. La mortalité

est évaluée après 10 jours d’exposition [32].

2.3.3 Bioessais utilisant des décomposeurs

Le test de référence pour le compartiment des décomposeurs est le test d’inhibition de

la bioluminescence de bactéries Vibrio fischeri (NF EN ISO 6341) en présence de toxiques

[27]. Ce test est commercialisé sous le nom de Microtox® et est très utilisé puisqu’il est

simple à réaliser. Le problème majeur de ce test est la représentativité écologique puisque la

bactérie est d’origine marine et le test est souvent réalisé pour évaluer la qualité des eaux

douces.

2.3.4 Choix des bioessais écotoxicologiques

Comme on vient de le voir, les bioessais développés sont très nombreux et il n’est pas

facile de sélectionner le ou les plus pertinents d’entre eux. Le choix est souvent fait selon le

type du test (aiguë ou chronique) et le niveau trophique (producteur, consommateur ou

décomposeur) sur lequel doit être évalué l’impact de l’échantillon étudié. D’autres critères

sont également à prendre en considération. C’est ainsi que l’exploitation d’un test plutôt

qu’un autre peut être liée à des obligations législatives, économiques ou plus simplement à

une habitude d’une équipe ou d’un laboratoire [33].

16

Concentration pouvant tuer 50% des effectifs à 96h


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 51

2.3.5 Bioessais en microcosmes

Un microcosme est une miniaturisation partielle d’un écosystème où on retrouve des

représentants des différents niveaux trophiques. Ces microcosmes sont le plus souvent

constitués d’une colonne d’eau ensemencée d’algues, de lentilles d’eau de cladocères, et d’un

sédiment qui constitue un support pour des macrophytes enracinés, des mollusques et des

crustacés [34].

L’évaluation de la toxicité d’une substance passe par son introduction dans la colonne

d’eau ou incorporée aux sédiments. Les effets de cette substance sont évalués sur les

différentes composantes du microcosme. Malgré les progrès considérables, ces microcosmes

sont encore très difficiles à réaliser et souffrent d’une répétabilité faible.

3 Conclusion

La nouvelle réglementation européenne et la prise de conscience collective de la

nécessité de préserver les milieux aquatiques dans un bon état écologique suppose que les

gestionnaires disposent d’outils de contrôle performants, robustes, automatisés et donnant des

informations quantitatives et qualitatives en temps réel. Les analyses au laboratoire ainsi que

les tests écotoxicologiques ne le permettent pas mais y contribuent et gardent tout de même

leurs intérêts.

De nombreuses équipes travaillent aujourd’hui sur la mise au point de biocapteurs

environnementaux permettant un monitoring in situ et en continu. Ces outils paraissent

correspondrent aux instruments nécessaires pour répondre aux exigences des gestionnaires. Ils

constituent des systèmes d’alerte précoce pouvant prévenir dès la survenue de la pollution du

biotope et pourraient ainsi permettre d’agir avant l’apparition d’effets irréversibles.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 52

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 53

Chapitre III Les biocapteurs : contrôle in situ et en continu

Bibliographie Les biocapteurs

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 54

1 Généralités sur les biocapteurs

1.1 Définition et domaine d’application

Un biocapteur est un outil analytique composé d'un élément biologique appelé

biorécepteur lié à un transducteur. Le biorécepteur reconnaît spécifiquement une molécule du

milieu et l'information biologique qui en résulte est convertie par le transducteur en un signal

analytiquement utile [35].

Le premier biocapteur a été développé par Clark en 1962 [36] et depuis, les communautés de

recherches de divers domaines ont travaillé ensemble pour développer des dispositifs de

détection de plus en plus sophistiqués et fiables pour des applications dans différents

domaines.

L’objectif du développement d’un biocapteur est d’aboutir à un dispositif de taille réduite

(portatif) permettant de détecter, d’alerter, voire de doser directement l’analyte d’intérêt, de

façon rapide, de préférence sans nécessiter l’ajout d’autres réactifs ou de prétraitement de

l’échantillon [37].

De façon générale, les domaines d’applications, présentés de façon non exhaustive dans le

tableau suivant, sont particulièrement nombreux.

Médical/Clinique Glucose[38-40]

Hormones[41, 42]

Maladies infectieuses ou parasitaires[43, 44]

Vétérinaire/Agriculture/Alimentaire Détection de contaminants (Salmonelles [45], listeria

[46], Escherichia coli [47], hormones de croissance

[48]…)

Vérification fraîcheur poisson, viande, fruits (nez /

langues électroniques [49, 50]

Environnement Contrôle d’effluents[51]

Pesticides [52]

Métaux lourds[53]

HAP [54]

Contrôle de process Contrôle processus de fermentation[55]

Sécurité Détection de drogues illicites et d’explosifs [56]

Tableau 9 Domaines d’application des biocapteurs


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 55

1.2 Structure et principe de fonctionnement

La construction d'un biocapteur est essentiellement basée sur l'immobilisation du

biorécepteur au contact du transducteur correspondant (Figure 3). En effet, c'est grâce à la

combinaison judicieuse d'un composant biologique et d'un transducteur qu'un biocapteur

permet la détection et le dosage d'un composé d'intérêt dans un milieu complexe.

Le capteur est composé de trois éléments principaux [37]:

le biorécepteur, c’est le matériel biologique qui assure la reconnaissance de l’élément

cible (signal d’entrée).

le transducteur, qui assure la conversion de ce signal d’entrée (événement de

reconnaissance moléculaire) en un signal mesurable.

le conditionneur, qui peut assurer des rôles d’amplification, acquisition et traitement

du signal, pour le transformer en une information dans un format approprié pour

l’utilisateur.

Figure 3 Représentation schématique d’un biocapteur ( d’après C.T.Minh, 2001, [35])


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 56

1.3 Classification des biocapteurs

Les biocapteurs peuvent être classés suivant différents types de critères :

Par type de biorécepteur : biocapteurs enzymatiques, immunologiques, à cellules

entières…

Par type de transducteur : biocapteurs optiques, électrochimiques, thermiques…

Par type de réaction suivie : biocapteurs à affinité, à catalyse, à hybridation, à

empreinte moléculaire…

2 Le biorécepteur

Le biorécepteur est ainsi l’élément du biocapteur qui doit assurer la reconnaissance

moléculaire de l’analyte d’intérêt. Il doit présenter, par rapport à cette espèce cible, une

bonne affinité, une bonne sélectivité (terme classique dans le domaine des capteurs), ou

spécificité (terme plus fréquemment rencontré en biologie), ainsi qu’une réponse rapide [37].

Les biorécepteurs peuvent être classés selon trois types principaux, suivant le principe de base

utilisé : la catalyse (réactions enzymatiques), l’affinité (anticorps-antigène, chémorécepteurs)

ou encore l’hybridation (brins d’ADN). La Figure 4 illustre les principaux biorécepteurs

utilisés dans le développement de biocapteurs.

Figure 4 Représentation schématique de quelques biorécepteurs


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 57

2.1 La catalyse

Le principe de la catalyse correspond à l’accélération d’une réaction chimique sous

l’effet d’une substance (catalyseur) qui intervient dans la réaction et qui est régénérée à la fin

de celle-ci. Un biorécepteur peut ainsi être un catalyseur; les éléments les plus utilisés à cet

effet sont les enzymes. A la place d’enzymes isolées et purifiées, qui nécessitent des étapes de

purification et d’extraction coûteuses, ce sont parfois des coenzymes, des tissus animaux ou

même des cellules entières qui sont utilisées. Ces dernieres sont généralement plus stables et

plus robustes que les enzymes isolées.

2.1.1 Les enzymes

Ce sont des protéines globulaires qui jouent le rôle de catalyseurs biologiques, c'est-à-

dire qu'elles règlent et accélèrent la vitesse des réactions biochimiques sans toutefois être

modifiées ou détruites au cours de ces réactions. Les enzymes accélèrent 108

à 1013

fois la

réaction correspondante qui se déroulerait avec un catalyseur non-biologique [57].

En abaissant l'énergie d'activation de la réaction qu'elle catalyse, une enzyme abaisse le

niveau énergétique de l'état de transition et accélère ainsi la réaction. Les enzymes ont une

stéréospécificité tellement forte qu'elles effectuent des réactions leur permettant de choisir

parmi différents énantiomères ou de discriminer d'autres groupes pratiquement identiques

entre eux [58].

La vitesse des réactions enzymatiques est fonction de paramètres physico-chimiques comme

le pH, la température, la salinité ou encore la présence d’ions activateurs ou inhibiteurs. C’est

sur cette dernière propriété que la majorité des biocapteurs sont basés. Plusieurs familles

d’enzymes ont été utilisées pour la conception de biocapteurs mais les plus représentées sont :

Les oxydoréductases : oxydases, réductases, hydrogénases…

Les hydrolases : phosphatases alcalines, estérases, lipases…

Les transférases : Kinases, transaminases, mutases…

Les enzymes pures restent à ce jour les biorécepteurs les plus largement utilisés pour la mise

au point de biocapteurs [59-64]. Néanmoins elles sont relativement coûteuses et pour la

plupart, souffrent d’un manque de stabilité au cours du temps [26].


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 58

2.1.2 Les cellules entières et les organites

Plusieurs équipes ont choisi de travailler sur des cellules entières. Il a été démontré

qu’on peut suivre plusieurs activités métaboliques in vivo sur des microorganismes ainsi que

leurs perturbations après exposition à un inhibiteur [65]. La respiration cellulaire peut être

suivie grâce à la consommation de l’O2 ou la production de CO2 [66]. Le dysfonctionnement

de la respiration cellulaire ne permet pas, quant à lui, d’identifier des familles de toxiques car

c’est un critère très global.

Par contre en s’intéressant à des activités métaboliques plus spécifiques, il est alors possible

de mettre en évidence la présence de certaines molécules perturbatrices [67]. D’autres travaux

ont montré qu’il est possible d’avoir le même type de résultats en utilisant des thylakoïdes ou

des chloroplastes [68, 69].

L’utilisation de cellules entières présente plusieurs avantages :

Elles sont sollicitées dans leurs milieux naturels

Eviter le long et coûteux processus d’extraction-purification que nécessitent les autres

biorécepteurs tels que les enzymes ou les acides nucléiques.

La biosélectivité et la réactivité additionnelle de la membrane cellulaire peuvent être

exploitées avantageusement.

Possibilité de régénérer le biocatalyseur in situ sans nécessité de reconstruire le

biocapteur.

Avec l'avancement considérable dans les techniques de biologie moléculaire et de

l'ADN recombinant, d'extraordinaires possibilités de transformer génétiquement des

microorganismes en vue d'améliorer leurs activités enzymatiques ou de leur permettre

d'exprimer de nouvelles activités ont amélioré davantage les performances des

microorganismes. Toutefois la réglementation au niveau communautaire ne permet

pas l’utilisation d’OGM17

in situ (directive 2001/18/CE).

Plusieurs microorganismes ont été utilisés pour mettre au point des biocapteurs à cellules

entières (bactéries, levures, champignons, algues…). Le Tableau 10 présente quelques

exemples de biocapteurs à cellules entières.

17

Organisme Génétiquement Modifié


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 59

Analyte Microorganisme Transducteur Référence

O2 C.parapsilosis Ampérométrique [70]

Ethanol P.methanolica Ampérométrique [71]

Organophosphoré Flavobacterium sp Potentiométrique [72]

Urée Bacillus sp Potentiométrique [73]

Méthyl-paraoxon Chlorella.v Conductimétrique [74]

Cadmium Chlorella.v Optique [75]

Sucrose S.cervisiae Potentiométrique [76]

Cyanide T.ferrooxidans Ampérométrique [77]

Eau oxygénée A.peroxydans Ampérométrique [78]

Arsenite Recombinant E.coli Optique [79]

Acide acétique F.solani Ampérométrique [80]

Cuivre S.cervisiae Ampérométrique [81]

Composés phénoliques P.putida Ampérométrique [82]

Trichloroethylène P.aeruginosa Potentiométrique [83]

Sélénite H. arsenicoxydans Conductimétrique [58]

Tableau 10 Quelques exemples de biocapteurs à base de cellules entières

2.2 Affinité

Par rapport aux biorécepteurs catalytiques, les biorécepteurs d’affinité, comme les

réactions antigènes - anticorps, sont encore plus spécifiques. De plus, alors que, dans le cas

d’une activité catalytique, les sites récepteurs sont régénérés au cours de la réaction, ici un

nombre élevé d’espèces cibles sature progressivement le capteur [37]. Aussi, ce type de

récepteur est plutôt utilisé pour des détections « one-shot » de préférence à des applications de

suivi, ou pour la détection de très faibles concentrations (10-6

à 10-9

M) par rapport à une

gamme 10-3

à 10-6

M avec des récepteurs catalytiques [84].

Dans cette classe de biorécepteurs, nous retrouvons principalement les immuno-récepteurs

(anticorps – antigènes) et les récepteurs membranaires.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 60

2.2.1 Les immuno-récepteurs

Le développement des biocapteurs immunologiques repose sur la reconnaissance

moléculaire des anticorps-antigènes. L'interaction de l’anticorps avec un antigène ou un

haptène est spécifique et sa détection peut être amplifiée à l'aide de marqueurs fluorescents ou

enzymatiques [58]. La liaison mise en jeu n’est pas covalente, mais elle est forte du fait

d’interactions moléculaires nombreuses.

Dans le cadre de la conception de biocapteurs, les anticorps sont généralement immobilisés

chimiquement à la surface du transducteur. L'immobilisation doit être judicieusement

contrôlée afin d'assurer une orientation uniforme des sites récepteurs pour une réaction

d'affinité optimale.

Les immunocapteurs ont été appliqués pour la détection de plusieurs pathogènes tel que le

virus de la grippe A (H1N1) [85], la grippe aviaire (H5N1) [86], le virus Ebola [87] ou encore

Salmonella [88].

L’inconvénient majeur de ce dispositif est que la liaison anticorps-antigène est irréversible. Il

est toutefois possible de la détruire par un choc de pH (lavage acide), au prix d’une perte

progressive de sensibilité et de spécificité du récepteur.

2.2.2 Les récepteurs membranaires

Les cellules de l’organisme reçoivent des informations nécessaires à la modulation de

leurs activités par l’intermédiaire de signaux et de molécules extracellulaires [58]. Ces

molécules peuvent être des hormones, des neurotransmetteurs ou encore des molécules

odorantes, elles viennent se lier à des récepteurs membranaires de la cellule cible et vont

permettre la transmission de l’information dans le cytosol.

Les récepteurs membranaires sont des protéines non catalytiques et d’origine non-immune,

qui traversent la membrane plasmique en déclenchant une modification structurelle, ouverture

d’un canal ionique ou l’activation d’une enzyme. Ces trois processus peuvent être utilisés

comme moyen de reconnaissance par un biocapteur.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 61

2.3 Hybridation

L’acide désoxyribonucléique ou ADN est une molécule, retrouvée dans toutes les

cellules vivantes, qui renferme l'ensemble des informations nécessaires au développement et

au fonctionnement d'un organisme [84]. L'ADN est composé de deux brins se faisant face, et

formant une double hélice. Ils peuvent être immobilisés en tant que tel (double brin) sur un

transducteur afin d’étudier les interactions avec des molécules cibles ou sous forme d’une

seule chaine d’acides nucléiques (simple brin) dans le but de détecter des processus

d’hybridation [89]. Ainsi une séquence d’oligonucléotides synthétisée in vitro et fixée sur un

support devient un récepteur pour capturer sa séquence complémentaire. La détection d’un

fragment d’ADN par hybridation a gagné beaucoup d’importance ces dernières années en

raison de son intérêt pour la détection précoce de certains cancers [90] et de certaines

maladies héréditaires.

Le développement des puces à ADN a permis, depuis 1995 (date du développement de

la première puce [91]), d’analyser en même temps des milliers de séquences de nucléotides.

Une puce à ADN est un ensemble de molécules d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une

petite surface. Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes

(transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange

complexe et dans un état donné par rapport à un échantillon de référence.

Concrètement, les ARN totaux sont extraits des cellules puis amplifiés. Ensuite ces ARN sont

transformés en ADN complémentaires (ADNc) par la technique de rétro transcription. Enfin

ils sont transformés au cours d'une dernière étape en ARN complémentaires (ARNc) et

marqués par des colorants spécifiques comme le montre la Figure 5. Une fois marqués ces

ARN complémentaires sont déposés sur la puce à ADN et l’hybridation est révélée par une

détection laser.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 62

Figure 5 Principe d’utilisation d’une puce à ADN (d’après wikipédia [92])

révélation


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 63

3 Le transducteur

Le transducteur est l’élément physique qui sert à exploiter la modification biochimique

issue de l’interaction entre l’analyte et le biorécepteur pour le transformer en un signal

mesurable. Le type de transducteur est choisi en fonction des transformations biochimiques au

niveau du biorécepteur. Le signal ainsi obtenu doit avoir un bruit de fond minimal pour

assurer un seuil de détection bas et améliorer les performances du biocapteur [93].

Le choix du transducteur dépend [94]:

du type de réaction et de substances libérées ou consommées : modification de charge,

de pH, variation de la fluorescence…

de l’utilisation du biocapteur : un biocapteur pour l’usage biomédical doit être à usage

unique tandis qu’un biocapteur pour le contrôle de l’environnement doit être robuste…

des possibles interférences : dans les milieux réactionnels troubles, la détection

optique n’est pas conseillée…

Quatre types de transducteurs sont généralement utilisés pour la conception de biocapteurs.

Ainsi le transducteur peut être optique (mesurant des changements tels que l’absorption

optique, la fluorescence ou l’indice de réfraction), mécanique ( mesurant un changement de

masse qui accompagne une réaction biologique), électrochimique (basé sur le changement des

propriétés électriques) ou thermique (mesurant le changement de température accompagnant

une réaction endo ou exothermique).

Dans cette partie, et pour chaque type de transducteur, le principe de la technique sera défini

et un ou plusieurs exemples d’utilisation dans le domaine du contrôle de l’environnement

seront présentés.

3.1 Détection optique

Les variations de la fluorescence ou de l’indice de réfraction de la surface d’un capteur

affectent les propriétés optiques du faisceau lumineux qu’elle réfléchit (intensité, phase,

polarisation…). Ces informations, transportées par la lumière, sont à la base des capteurs

optiques qui forment le plus large groupe de transducteurs.

La majorité de ces capteurs utilisent la technique de fluorescence. Les autres méthodes font

appel à des phénomènes d’interférences de la lumière. Elles mesurent la variation de l’indice

de réfraction induite, à la surface, par l’interaction biologique ou chimique. Ceci revient à

mesurer les effets sur la polarisation et sur la phase du faisceau réfléchi par la surface. Les


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 64

capteurs optiques issus de cette dernière technologie sont basés sur l’ellipsométrie, les ondes

évanescentes ou la résonance de plasmon de surface [93].

3.1.1 Détection par fluorescence

La spectroscopie de fluorescence est la méthode de référence pour l’étude des

interactions biomoléculaires pour sa sensibilité, sa sélectivité [95] et sa capacité d’analyse

simultanée d’un très grand nombre de données. Cette méthode constitue la méthode de

détection la plus fréquemment rencontrée en biologie [96].

Lorsqu’une substance est éclairée par une radiation lumineuse du domaine du visible ou du

proche ultraviolet, l’énergie absorbée peut être restituée sous la forme d’énergie thermique,

et/ou par émission de lumière à une longueur d’onde supérieure, ou moins énergétique, donc

décalée vers le rouge par rapport à la longueur d’onde d’excitation [37]. On parle de

fluorescence lorsque les durées de vie sont de l’ordre de 1 ns à 10 ms et de phosphorescence

au-delà de 100 ms. En dehors des molécules possédant une fluorescence naturelle, beaucoup

peuvent le devenir par association avec une autre molécule fluorescente, appelée alors «

marqueur fluorescent ». Cette technique est largement utilisée, notamment pour la

visualisation de tissus biologiques à l’aide de microscopes fluorescents.

Pour la réalisation des dosages, le phénomène de fluorescence est détecté à l’aide d’un

fluorimètre à rapport de fluorescence, qui quantifie la fluorescence par rapport à un standard

sur une bande étroite de longueurs d’onde (deux monochromateurs permettent de sélectionner

une longueur d’onde d’excitation et une longueur d’onde d’émission). L’intensité de

fluorescence est proportionnelle à la concentration du produit dosé [97].

Vedrine et al. [67] ont développé un biocapteur optique pour le dosage des herbicides

dans les milieux aquatiques. La détection est basée sur la mesure de la fluorescence

chlorophyllienne des microalgues Chlorella vulgaris immobilisées sur un filtre en

microfibres de quartz. La fluorescence chlorophyllienne a été mesurée à l’aide d’un faisceau

de fibres optiques et s’est avérée sensible à la présence de pesticides comme le diuron,

l'atrazine, la simazine et l'isoproturon avec des limites de détection de l’ordre du ppb.

En utilisant le même principe, Nguyen-Ngoc et al. [98] ont développé un biocapteur

optique en mesurant la fluorescence des cellules végétales encapsulées dans une matrice sol-

gel pour détecter la présence de pesticides anti- PSII.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 65

3.1.2 Détection par bio/Chimiluminescence

La bioluminescence est la production et l'émission de lumière par un organisme vivant

résultant d'une réaction chimique au cours de laquelle l'énergie chimique est convertie en

énergie lumineuse. Le composé chimique à l'origine de la luminescence est la luciférine.

Celle-ci émet de la lumière en s'oxydant grâce à l'intervention de la luciférase, une enzyme.

La réaction chimique peut avoir lieu à l'intérieur ou à l'extérieur de la cellule. Chez les

bactéries, l'expression des gènes liés à la bioluminescence est contrôlée par un opéron appelé

lux operon.

Chez certaines bactéries le gène reporter lux est fusionné à un promoteur régulé par la

concentration d'un composé d'intérêt. En conséquence, la concentration de la substance peut

être analysée par la détection quantitative de l’intensité de la bioluminescence [97].

Dollard et al. [99] ont développé un biocapteur pour la mesure de la biodisponibilité

du phosphate basé sur la mesure de la bioluminescence en présence de phosphate. Dans ce

travail, le promoteur inductible du gène de la phosphatase alcaline (phoA) d’Escherichia coli

est fusionné aux gènes de la bioluminescence de Vibrio fischeri. Le reporter ainsi construit a

été introduit dans E. coli MG1655 et dans Pseudomonas fluorescens DF57, et produit de la

lumière de manière dose-dépendante lorsque la concentration de phosphate exogène descend

en dessous de 60 et 40 µM, respectivement chez les deux souches.

3.1.3 Détection par résonance de plasmon de surface (SPR)

La résonance de plasmon de surface (SPR) est un phénomène optique découvert pour

la première fois par R.W. Wood [100]. C’est une technique exploitant les ondes

électromagnétiques de surface pour sonder les variations d’indice et d’épaisseur survenant à la

surface d’un métal. Elle permet de suivre en temps réel [101], et sans aucun marquage, toute

sorte d’interactions se déroulant sur une surface métallique [93].

Le plasmon de surface est une onde à décroissance exponentielle à l’interface d’un métal (or,

argent…) et d’un milieu diélectrique sans perte (milieu biologique par exemple),

parallèlement à laquelle elle se propage. Le champ électromagnétique dans le milieu

biologique présentant un caractère d’onde évanescente (l’amplitude décroît avec la distance à

l’interface), la fixation de molécules sur l’interface va modifier l’information contenue dans

l’onde tant au niveau de sa phase que de son amplitude [102]. L’onde plasmon joue le rôle de


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 66

sonde dans le milieu où se situe la réaction biomoléculaire. L’information pourra alors être

recueillie soit sur la phase soit sur l’amplitude du faisceau réfléchi [95].

La SPR a été étudiée au cours des vingts dernières années, et s’est révélée être une technique

assez puissante pour l’étude de l’interaction d’un anticorps avec un antigène [103-105], de

l’interaction protéine/ADN [106, 107] et de l’hybridation de l’ADN [108, 109].

La limitation principale de cette technique est qu’il est difficile de miniaturiser le système

puisque l’appareillage externe n’est pas négligeable [110].

Dans leur travail [111], May May et al. ont rapporté la conception d’un biocapteur

enzymatique basé sur l’inhibition de l’uréase immobilisée par des monocouches auto-

assemblées pour la détection du cadmium. L’enzyme a été modifiée par le N-succinimidyl 3-

(2-pyridyldithiol) propionate pour faciliter son immobilisation et le suivi de l’inhibition a été

réalisé par SPR. Ce biocapteur peut détecter le cadmium sur une gamme de concentration de 0

à 10 mg/l.

Rajan et al. [112] ont développé un biocapteur enzymatique avec une transduction

SPR pour la détection des pesticides. La détection est basée sur le principe de l’inhibition

compétitive du pesticide (agissant comme inhibiteur) pour le substrat (l’acétylcholine) de

l'enzyme acétylcholinestérase. Il a été observé que les longueurs d'ondes SPR diminuent avec

l'augmentation de la concentration du pesticide pour une concentration fixe du substrat.

3.1.4 Détection par ellipsométrie

L’ellipsométrie consiste à mesurer les modifications d’amplitude et de phase subies

par une lumière polarisée, avant et après réflexion à l’interface de deux milieux d’indices de

réfraction différents [113]. Ces mesures donnent des informations sur l’épaisseur et l’indice

de réfraction d’une couche adsorbée en surface. Cette technique, nécessitant un équipement

sophistiqué, est très sensible et permet de détecter par exemple des variations d’épaisseur de

l’ordre de l’angström18

[37].

Nabok et al.[114] ont pu constater que leur technique (total internal reflection ellipsometry :

TIRE) est plus sensible que la SPR pour la détection de pesticides en développant un

immuno-capteur.

18

10-10

mètre


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 67

3.2 Détection électrochimique

Dans le cas de la transduction électrochimique, la fixation de l’analyte sur le

biorécepteur génère une réaction d’oxydo-réduction ou encore une modification de la

conductivité locale qui modifie le signal électrique. Ces transducteurs incluent généralement

une ou plusieurs électrodes fonctionnalisées par des composés biologiques et opèrent le plus

souvent en milieu liquide. On distingue dans ce cadre les transducteurs potentiométriques,

ampérométriques, impédancemétriques et finalement conductimétriques.

3.2.1 Mesures ampérométriques

Les mesures ampérométriques sont basées sur la détermination de l’intensité du

courant qui traverse une cellule électrochimique à un potentiel imposé [115]. La réaction de

l’analyte avec le biorécepteur provoque une variation de courant à potentiel constant. Cette

variation provient de l’oxydation ou de la réduction d’une espèce électroactive à un potentiel

donné se produisant au contact de l’électrode de travail. L’intensité du courant induit est

directement proportionnelle à la concentration du substrat.

Les biocapteurs ampérométriques peuvent êtres classés en trois catégories [115] :

Biocapteurs basés sur la mesure de la concentration des substrats naturels ou les

produits des réactions enzymatiques. Les enzymes qui catalysent ces réactions sont

généralement des oxydases [116, 117].

Biocapteurs utilisant des médiateurs comme transporteurs d'électrons de l'enzyme

active à l'électrode [118, 119]

Biocapteurs utilisant un transfert direct entre l’enzyme active et l’électrode. Ce

phénomène est appelé bioélectrocatalyse [115, 120].

Kuralay et al. [121] ont développé un biocapteur ampérométrique basé sur l’immobilisation

de l’uréase à travers un film polyvinylferrocenium sur une électrode en platine pour la

détection des ions Hg2+

. L’inhibition de l’uréase par les ions mercure se traduit par une

diminution de l’intensité de courant d’oxydation. La réponse de ce capteur est linéaire sur la

gamme de concentration 9.2 × 10−6

M à 4.2 × 10−4

M avec une limite de détection de

7.4 × 10−6

M.

En utilisant le même type de transduction, Touloupakis et al., [122] ont développé un

multi-biocapteur pour la détection d’herbicides et de polluants dans les rivières. Les

thylakoïdes photosynthétiques de Spinacia oleracea, Senecio vulgaris et de leurs mutants


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 68

résistant à l’atrazine ont été utilisés comme biorécepteurs et ont été immobilisés, sur une

électrode sérigraphiée, par la bovine sérum albumine co-réticulée par le glutaraldéhyde. Le

biocapteur est composé de quatre cellules d'écoulement avec éclairage indépendant de 650 nm

pour activer le transfert d'électrons dans le photosystème II. Le principe de la détection est

basé sur le fait que les herbicides bloquent sélectivement l'activité de transport des électrons

avec une relation dose-effet et que les quatre PSII montrent une activité de reconnaissance

différente devant les herbicides. Les changements de l'activité ont été enregistrés avec une

méthode ampérométrique en fonction du taux de photoréduction de l'accepteur d'électrons

artificiel DQ. La limite de détection de ce biocapteur est de l’ordre de 10-8

M.

Plusieurs biocapteurs ampérométriques pour usage clinique sont commercialisés

aujourd’hui tel que le biocapteur de la Campanie Yellow Springs Instrument qui détecte le

glucose, le lactate et la choline [123].

3.2.2 Mesures potentiométriques

Le transducteur potentiométrique mesure l’accumulation de charges électriques à la

surface d’une électrode. Concrètement cela se traduit par une mesure d’une différence de

potentiel entre une électrode de travail et une électrode de référence, pour une intensité de

courant nulle. La détermination des potentiels des électrodes permet de mesurer directement

la concentration de l’analyte à doser [35] selon la loi de Nernst.

On distingue deux types de transducteurs potentiométriques :

Ion-Selective-Electrode (ISE, Figure 6): Dans ce cas, deux électrodes sont plongées

dans la solution à analyser. L’électrode de mesure est recouverte d’une membrane

sélective échangeuse d’ions à détecter et la membrane de référence est soumise à un

potentiel fixe qui ne dépend pas du milieu dans lequel elle est plongée. La différence

de potentiel entre les deux électrodes est enregistrée. Elle est proportionnelle au

logarithme de l’activité de l’ion spécifique [93]. C’est le principe même du pH mètre.

Field Effect Transistor (FET) : transistors à effet de champ. Ces transistors sont

sensibles aux charges sur la surface de la grille. En modifiant la surface de l’isolant de

grille avec un matériau échangeur d’ions on obtient un ISFET (ion sensitive field

effect transistor) sensible aux ions (Figure 7). L’application de ces structures est assez

vaste : détection de métaux lourds [124], immunocapteurs [125] et capteurs génétiques

[126].


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 69

Figure 6 Principe de l’ISE (d’après Schmitt, 1995 [127])

Figure 7 Principe de l’ISFET (d’après Lei, 2006 [97])

3.2.3 Mesures conductimétriques

La conductivité électrique des solutions est l’aptitude à laisser passer le courant

électrique. La valeur de la conductivité dépend de la nature des ions présents dans la solution

et de leurs concentrations. En effet, la conductivité des liquides est le résultat de la

dissociation de l’électrolyte en ions et la migration de ces derniers sous l’effet d’un champ

électrique (les anions sont attirés par l’anode et les cations vers la cathode). La mesure de la

conductivité ne peut pas être effectuée en courant continu, en effet, il se produirait une

polarisation de l’électrode. Il est donc indispensable de réaliser les mesures en courant

1 : électrode de référence

2 : grille

3 : résine isolante

4 : canal

S : source

D : drainage

B : fibre


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 70

alternatif de fréquence élevée pour éliminer les effets perturbateurs. Afin d’atteindre une

sensibilité élevée, une distance courte doit séparer les électrodes et pour fournir une grande

surface sensible, les électrodes sont réalisées sous forme d’électrodes interdigitées (Figure 14)

Ces transducteurs offrent plusieurs avantages : [58]

Ils sont produits à grande échelle et à faible coût

Ils ne nécessitent pas d’électrode de référence

Ils ne sont pas sensibles à la lumière

Ils sont de petite taille

Ils offrent de nombreuses possibilités de miniaturisation

Cette technique de détection est aujourd’hui largement utilisée pour les raisons

évoquées ci dessus. En utilisant des microélectrodes interdigitées en platine, Marrakchi et al.

[128] ont développé un biocapteur pour le monitoring des protéines totales dans les milieux

aquatiques en immobilisant la proteinase K et en utilisant la BSA comme protéine de

référence. Sachant que 30% de la demande chimique en oxygène (DCO) provient des

protéines, il a été possible de déterminer la concentration de la matière organique totale dans

un échantillon.

En utilisant la même approche, Anh et al. [129] ont développé un biocapteur pour la détection

du diuron, de l’atrazine et de leurs métabolites. Ce biocapteur est basé sur la mesure de

l’inhibition de la tyrosinase après contact avec le pesticide et l’immobilisation de l’enzyme

par la BSA co-réticulée par le glutaraldehyde. Les résultats des travaux ont montré une limite

de détection de 1ppb et une durée de conservation de 23 jours.

3.3 Détection mécanique / électromécanique

Dans le cas d’une détection mécanique ou électromécanique, une grandeur physique,

telle que la masse, la viscoélasticité ou la géométrie, est modifiée en présence d’un analyte, ce

qui entraîne une variation d’un signal électrique. Les principales techniques représentant ce

mode de transduction sont : la microbalance à quartz, les microstructures mobiles et les billes

magnétiques.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 71

3.3.1 Microbalance à quartz

La microbalance à quartz (QCM : Quartz Crystal Microbalance) est le système le plus

répandu pour le mode de transduction mécanique. L’élément de base est un disque de quartz

dont les deux faces sont recouvertes par des électrodes métalliques (Or, Platine, Argent…).

Un champ électrique alternatif est appliqué à travers le cristal qui le déforme physiquement et

l’oblige à osciller. La résonance se produit lorsque la fréquence du signal est égale à 5 Mhz.

Quand une masse adhère au cristal, la fréquence de résonance diminue. La mesure de la

fréquence est très précise et les variations mesurées sont de l’ordre du dixième de Hz [130].

Traditionnellement, la microbalance à quartz est utilisée pour le suivi du dépôt de métaux. Le

passage en milieu liquide a été initié par les travaux de Nomura et al [131] et il a été possible

par la suite de développer des immunocapteurs [132, 133], de suivre l’hybridation de l’ADN

[134, 135], l’adhésion de cellules [136, 137] ou encore les interactions entre protéines [138].

3.3.2 Microstructure mobile

L’utilisation des microstructures mobiles pour la détection de biomolécules à ajouté

une nouvelle dimension au champ des biocapteurs [139]. Ces structures peuvent être

exploitées selon deux modes de fonctionnement : en mode statique (Figure 8A) c’est la

modification des contraintes qui se traduit par une variation de la courbure de la micropoutre.

En mode dynamique, la variation de masse liée à la sorption d’espèces cibles provoquera une

variation de la fréquence de résonance de la structure (Figure 8B).

Figure 8 Principe d’un capteur à micropoutre, détection en mode statique (A) et en mode dynamique (B),

d’après Gäberlein, 2000 [37]

A B


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 72

Les deux modes de fonctionnement requièrent un dispositif de mesure de la déflexion.

La solution la plus couramment utilisée consiste à suivre la variation de l’angle de réflexion

d’un faisceau laser sur la microstructure. Cherian et al. [140] ont exploité ce principe de

détection pour développer un biocapteur pour la détection des métaux lourds tel que le

mercure et le zinc. Les micropoutres en nitrure de silicium enduites d’or sont fonctionnalisées

par une protéine : la AgNt84-6 ; protéine connue pour son pouvoir fixateur de plusieurs

métaux lourds. La fixation d’un métal par la protéine AgNt84-6 induit une flexion des

micropoutres proportionnellement à la concentration en métal.

3.3.3 Billes magnétiques

L’utilisation de billes magnétiques pour la conception de biocapteurs est en constante

évolution depuis quelques années. Les billes magnétiques servent à fixer le biorécepteur qui

fixera à son tour les espèces cibles. Leur utilisation permet d’augmenter la surface active et de

ce fait augmenter la sensibilité. L’application d’un champ magnétique permet d’attirer les

billes magnétiques et leur revêtement biologique contre le transducteur.

Cette technique peut être utilisée en association avec un transducteur micropoutre dont les

billes magnétiques amplifient la déflexion lors de la détection [141].

Bayramoglu et al. [142] ont utilisé les billes magnétiques pour fixer l’enzyme HRP

(Horseradish) avec une liaison covalente afin de détecter les composés phénoliques dans

l’eau.

3.4 Détection thermique

Du fait que la plupart des réactions biologiques s’accompagnent d’un dégagement de

chaleur, l’utilisation de ce type de transduction peut être possible pour développer des

biocapteurs. Cependant, des dispositifs différentiels sont nécessaires pour palier aux

variations de température parasite. Malgré le caractère universel de la technique, elle reste très

peu utilisée notamment pour des contraintes technologiques.

4 Les méthodes d’immobilisation

L’immobilisation du biorécepteur est l’une des étapes les plus délicates dans la

conception d’un biocapteur. C’est elle qui va conditionner l’utilisation de toutes les

potentialités du biorécepteur et du transducteur. Le biorécepteur doit être immobilisé sur la

surface ou au voisinage du transducteur généralement sous la forme d’un film, tout en


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 73

conservant ses propriétés de reconnaissance moléculaire vis-à-vis de l’analyte d’intérêt. La

méthode d’immobilisation doit respecter plusieurs critères :

Le film biologique doit présenter des propriétés de reproductibilité et d’uniformité de

distribution des éléments actifs

Une stabilité au cours du temps

Facilité d’adaptation à différents biorécepteurs (dans le cas des capteurs multi-

détection)

Compatibilité avec l’environnement de test (pH, température, force ionique,

composition du milieu réactionnel…).

Il existe plusieurs types d’immobilisation allant de la simple adsorption physique à

l’élaboration de structures chimiques complexes.

4.1 Adsorption

C’est l’une des techniques les plus simples à mettre en œuvre et ne nécessite

généralement pas l’utilisation de réactifs. L’adsorption des biomolécules en solution se fait

sur une surface solide et résulte d’interactions physiques ou chimiques. Les liaisons physiques

sont de faible énergie : liaison ionique, interaction hydrophobe ou liaison de Van Der Waals.

Les liaisons chimiques impliquent le partage ou le transfert d’électrons, ce qui les rend plus

sélectives et plus fortes. Du fait de la faible énergie mise en jeu, les molécules peuvent se

désorber lors de la modification physico-chimique du milieu [143]. Cependant, du fait de sa

simplicité et de son faible coût, l’adsorption directe des protéines et autres biomolécules

demeure la technique de référence pour les tests ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Assay) et les biocapteurs qui en découlent [144].

4.2 Emprisonnement physique

Les méthodes d’emprisonnement physique sont utilisées pour immobiliser les grosses

molécules et les cellules entières. Les techniques les plus utilisées sont l’inclusion dans un

gélifiant tel que l’agar [145], le polyacrylamide [146] ou l’agarose [147] mais également

l’adsorption sur des membranes de dialyse [148] ou de filtration [67]. C’est ainsi que Vedrine

et al. [67] ont immobilisé des cellules algales sur un filtre de fibres de quartz pour la détection

des herbicides par le biais de la mesure de la fluorescence chlophyllienne.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 74

4.3 Réticulation

La réticulation est le processus par lequel des protéines sont liées entre elles à l’aide

d’un agent de réticulation (glutaraldéhyde, acide bis-diazobenzidin-2,2’-disulfure…). Ainsi, le

glutaraldéhyde possède deux groupements aldéhyde à ses extrémités, qui réagissent avec les

groupements amines primaires des protéines. On obtient ainsi un gel réticulé très stable,

néanmoins des problèmes de superposition de biomolécules apparaissent et il peut en découler

un effet sur la sensibilité du biocapteur. La réticulation est parfois utilisée en complément

d’autres méthodes pour améliorer la stabilité mécanique de la structure, on parle alors de co-

réticulation.

4.4 Liaison covalente

L’immobilisation par liaison covalente est l’une des techniques les plus répendue pour

immobiliser les protéines et les acides nucléiques. Elle est basée sur la formation d’une liaison

covalente, de forte énergie, entre le biorécepteur et le transducteur. Cette liaison peut être

directe (couplage avec une fonction amine ou thiol) ou indirecte (système biotine-avidine

[149]). Dans tout les cas, la surface du transducteur doit être préalablement fonctionnalisée ou

bien c’est la biomolécule qui doit être modifiée.

4.4.1 Couplage direct

C’est la technique de référence pour la fixation des biomolécules de petite taille. Cette

technique est basée sur la fonctionnalisation de la surface d’une électrode (Or, silice…) avec

une monocouche auto-assemblée (thiol [150] ou silanes [151]) ou encore avec un film

polymère conducteur (polypyrrole [152], polyaniline [153]…). Pour que la fixation soit

réalisable, il faut que la biomolécule contienne un groupement fonctionnel tel qu’une amine

primaire, un aldéhyde ou encore un thiol.

Dans le cas du couplage avec une fonction amine, la réaction est basée sur une substitution

nucléophile entre les amines primaires des biomolécules (résidus lysine par exemple) et une

terminaison carboxyle de la surface modifiée par un thiol par exemple. Le schéma général de

la réaction se présente comme suit :

R-COOH + R1NH2 RCO- NHR1 + H2O


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 75

On note aussi le grand intérêt qui est porté sur la chimie des thiols. En effet la liaison

avec un groupement thiol (SH) est plus robuste que la liaison amine et les conditions de

greffage sont généralement moins critiques.

Enfin notons que des étapes supplémentaires d’activation des groupements

fonctionnels sont préconisées soit pour diminuer le temps de réaction soit pour améliorer le

rendement.

4.4.2 Couplage indirect

Contrairement au couplage direct, les biomolécules sont immobilisées sur la surface

du transducteur à l’aide d’un intermédiaire chimique (par exemple le 3, acide

mercaptopropionique), ou biologique (par exemple le système biotine-avidine). Ce dernier

intervient quand le couplage direct est peu convenable ou impossible. L’utilisation du système

biotine-avidine est dû à sa constante d’affinité très élevée (10-15

M) et qui est la plus forte dans

la nature [154]. Les biomolécules peuvent être immobilisées par interaction d’affinité par

l’assemblage du film biotine/avidine-biotine/biomolécule. Cette stratégie permet d’avoir un

biocapteur stable et surtout régénérable puisque le complexe biotine/avidine-biotine peut être

désassemblé par un surfactant.

5 Conclusion

Devant la grande diversité des biorécepteurs, des transducteurs et des méthodes

d’immobilisation et dans le but de mettre au point un biocapteur environnemental, des choix

sont à faire.

Le choix du transducteur est conditionné par plusieurs paramètres : l’adéquation avec le type

de mesure, le biorécepteur et le matériel à disposition.

Le choix du biorécepteur dépendra, quant à lui, de la sensibilité et la sélectivité par rapport à

l’analyte.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 76

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 77

PARTIE B Matériels et méthodes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 78

Matériels et méthodes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 79

1 Réactifs utilisés

Le Tableau 11regroupe tous les produits utilisés au cours de cette étude en fonction de

leurs utilisations.

Milieux de cultures Milieu AFNOR LC (Annexe 1) Merck

Sels de mer (Sea salts) Sigma-Aldrich

Milieu f/2 (Annexe 2)

Milieu k

Substrats et réactifs pour la

mesure de la phosphatase

alcaline

Paranitrophénylphosphate (pNPP) Sigma-Aldrich

Méthylumbelliférylphophate (MUP)

Méthylumbelliférone (MUF)

Substrats et réactifs pour la

mesure des estérases

Diacétate de fluorescéine (FDA) Sigma-Aldrich

Acétylcholine

Fluorescéine

Milieu réactionnel pour les

mesures des activités

enzymatiques

Pour l’activité phosphatase alcaline

Tampon Tris-HCl

Pour l’activité estérase

Tampon Citrate

Toxiques Cd (NO3)2

ZnSO4

Pb(NO3)2

Sigma-Aldrich

KH2PO4 Prolabo

Méthyl parathion

Méthyl paraoxon

Diuron

Glyphosate

Sigma-Aldrich

Round Up® solution

commerciale

Immobilisation du

biorécepteur

Bovine serum albumine (BSA)

Glutaraldéhyde à 25%

Nafion perfluorinated ion-exchange resin, 5%

Sigma-Aldrich

L’acide 3-Mercaptopropionic (MPA) Fluka

Nettoyage des électrodes H2SO4

H2O2

éthanol

Voltamétrie cyclique Couple redox K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]

Tampon PBS

Sigma-Aldrich

Tableau 11 Liste des réactifs utilisés


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 80

2 Matériel biologique

Dans cette étude, quatre espèces ont été utilisées : une algue d’eau douce, Chlorella

vulgaris et trois algues marines, Dunaliella tertiolecta (Dt), Phaeodactylum tricornutum (Pt)

et Ostreococcus tauri (Ot).

2.1 Présentation des souches utilisées

2.1.1 Chlorella vulgaris

Chlorella vulgaris (Figure 9) est une microalgue ubiquiste des milieux dulçaquicoles19

appartenant à la classe des chlorophycées, elle mesure moins de 10µm et a un mode de

reproduction asexuée : la cellule mère se divise en quatre spores qui s’échappent

individuellement et germent en donnant chacun un organisme identique à celui qui les a

produites [155].

Figure 9 La microalgue Chlorella vulgaris

Dans une culture en batch la croissance de Chlorella vulgaris connaît trois phases

successives : une phase de latence (1 à 2 jours) correspondante à l’adaptation de la microalgue

à son milieu de culture, une phase de croissance exponentielle (une semaine) avec

multiplication rapide puis une phase de croissance ralentie jusqu’a l’épuisement des

nutriments du milieu [30].

Cette microalgue représente un potentiel pour des applications écotoxicologiques. Elle

sera utilisée dans le cadre de ce travail comme bioindicateur de toxicité des milieux

19

Adjectif relatif aux eaux douces


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 81

aquatiques du fait qu’elle possède des biomarqueurs de présence de certaines familles de

polluants notamment ses activités photosynthétiques et enzymatiques.

2.1.2 Les algues marines

Trois souches ont été sélectionnées pour étudier l’impact des contaminants chimiques

en milieu marin. Les deux premières pour leur large utilisation dans les tests normalisés (Pt et

Dt) et la troisième (Ot) pour sa représentativité écologique des lagunes côtières.

2.1.2.1 Dunaliella tertiolecta (Dt)

Dunaliella tertiolecta est une algue eucaryote unicellulaire flagellée de forme ovoïde

(9à 12 µm) et commune des eaux marines. Elle appartient à la classe des Chlorophycées et la

famille des Dunaliellaceae .Cette algue peut être facilement cultivée au laboratoire et est

utilisée dans plusieurs essais de toxicité notamment pour la rapidité de sa croissance et sa

sensibilité modérée aux toxiques [156].

Figure 10 Observation microscopique de Dunaliella tertiolecta (x 400)

2.1.2.2 Phaeodactylum tricornutum (Pt)

Phaeodactylum tricornutum (Figure 11) est une diatomée appartenant à la classe des

Bacillariophycées et la famille des Phaeodactylacées. Cette algue est largement utilisée dans

les tests normalisés et c’est l’une des deux diatomées qui ont vu leurs génomes totalement

séquencé.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 82

Figure 11 Observation microscopique de Phaeodactylum tricornutum au microscope inversé (x32, zoom

numérique x 5)

2.1.2.3 Ostreococcus tauri (Ot)

Ostreococcus tauri (Figure 12) est une espèce d'algue verte unicellulaire coccoïde20

appartenant à la classe des Prasinophycées et à la famille des Mamiellacées. Elle a été

découverte en 1994 dans l'étang de Thau par Courties [157], et depuis elle a été trouvée dans

de nombreuses régions océaniques et côtières. Avec une taille moyenne de 0,8 µm, c’est le

plus petit eucaryote libre connu à ce jour. Outre sa petite taille, ce protiste marin est surtout

caractérisé par une organisation cellulaire minimale avec un noyau, un seul chloroplaste et

une seule mitochondrie dans un cytoplasme réduit.

Figure 12 Observation microscopique de Ostreococcus tauri au microscope électronique

( CNRS / H.Moreau)

20

Se dit d'un organisme unicellulaire non mobile


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 83

2.2 Mise en culture des algues

2.2.1 Stérilisation

Les milieux de culture sont stérilisés par autoclavage à 120°C sous une pression de 1,5

bar pendant 20mn.

Les manipulations sont effectuées avec du matériel stérile à usage unique sous une hotte à

flux laminaire dont l’enceinte est stérilisée par un rayonnement ultraviolet. Les paillasses

sont nettoyées à l’éthanol avant toute manipulation.

2.2.2 Ensemencement

Chlorella vulgaris

La souche d’algue d’eau douce Chlorella vulgaris (CCAP 211/12) provient de la

« Culture Collection of Algae and Protozoa », Cumbria (UK). Un repiquage hebdomadaire est

nécessaire pour entretenir la culture algale. Les microalgues sont cultivées en milieu AFNOR

LC (norme AFNOR NT 90 304) dont la composition est donnée en annexe 1.Les repiquages

se font dans des erlenmeyers stériles préalablement autoclavés pour diminuer le risque de

contamination et à raison de 1 ml de solution mère pour 50ml de milieu de culture. Ces erlens

sont ensuite placés sur un agitateur rotatif afin d’éviter la décantation des algues, ces dernières

sont soumises à un cycle nycthéméral de 16 heures d’éclairement de 5000 lux sous lumière

Sylvania (lumière du jour) et de 8 heures d’obscurité dans une chambre thermostatée à 20°C.

Préconditionnement des algues en milieu AFNOR sans phosphate

Durrieu et al. [75] ont montré que pour avoir une activité phosphatase alcaline

maximale, les algues doivent épuiser leur stock interne de phosphate. Pour cela, les cultures

algales en phase exponentielle (4 à 6 jours après repiquage) sont centrifugées (4500 tours/mn

pendant 10mn) puis remises en suspension dans un milieu AFNOR LC sans phosphate

(AFNOR-P) pendant 3 semaines au bout desquelles elles atteignent leur activité maximales.

Elles sont ensuite conservées à 4°C où elles conservent une activité constante pendant quatre

semaines [158].


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 84

Les algues marines

Les algues marines utilisées (Dunaliella tertiolecta (Dt), Phaeodactylum (Pt) et

Ostreococcus tauri (Ot) proviennent de la station biologique de Roscoff et sont mises en

culture dans un milieu salin reconstitué. Ce dernier est composé de 40g de sels de mer dissous

(sea salts Sigma) dans un litre d’eau ultra pure et enrichi au moyen du milieu f/2 (apport en

silice, vitamines et oligo-éléments) pour les algues Dt et Pt et du milieu k pour les algues Ot.

A ce milieu sont ajoutés la vitamine B12 et de la Biotine nécessaires aux algues et qu’elles ne

peuvent pas synthétiser. La composition des différents milieux est décrite en annexes en fin de

document.

2.2.3 Comptage des cellules algales

Le comptage des microalgues se fait au moyen d’un microscope optique sur des

cellules de Thoma. Pour les cultures assez concentrées (>106 cellules /ml) une dilution

préalable est nécessaire. Pour les algues marines mobiles, une fixation au formol doit être

réalisée préalablement.

3 Microscopie

Lors de cette étude deux types de microscopes ont été utilisés.

Microscopes optiques : Le premier est à champ large de marque Carl Zeiss, il a

servi pour le comptage cellulaire et la vérification de l’état des membranes sur

les microéléctrodes lors des mesures conductimétriques. Le deuxième est un

microscope à statif inversé de même marque et a servi pour réaliser des

photomicrographies des cellules algales, l’acquisition des images est réalisée

directement avec un appareil photo numérique Canon.

Microscope à épifluorescence : Les photomicrographies des cellules algales

immobilisées ont été obtenues à l’aide d'un microscope epi-fluorescent

Axioskop équipé d’un filtre d’excitation de 450-490 nm d’un filtre d’émission

de 530-750 nm et d’une caméra CCD (Cohu).L’acquisition des images a été

faite grâce au logiciel d'analyse Komet 4.0 (Kinetic Imagining Ltd.).


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 85

4 Techniques expérimentales

4.1 Bioessais sur algues libres

Lors de cette étude, deux méthodes de mesure des activités enzymatiques ont été

utilisées. La première est une mesure sur des algues libres en micro-plaques et la deuxième

sur des algues immobilisées en biocapteur. Les essais en micro-plaques permettent une

mesure rapide et avec beaucoup de réplicats des activités enzymatiques. Cette méthode

permettra, en outre, de sélectionner les biomarqueurs de toxicité les plus intéressants pour le

développement de biocapteurs. Enfin ces essais permettront de valider les résultats obtenus en

biocapteurs.

4.1.1 Principe de mesures des activités enzymatiques

Ces essais se déroulent dans des micro-plaques Costar 96 puits et le principe repose

sur la détection par un spectrofluorimétrie du produit fluorescent (P) suite à la réaction entre

l’enzyme (E) et le substrat (S) comme le montre la Figure 13.

L’appareil utilisé (Fluostar de BMG) permet une lecture quasi instantanée des puits.

Cet appareil est commandé par le logiciel BIOLISE permettant d’étudier les cinétiques

enzymatiques avec la possibilité de calcul des vitesses de réaction, des concentrations des

produits formés et des coefficients de variation (CV) entre les réplicats. Deux types de

cinétiques peuvent être réalisés : une cinétique en fonction de la concentration du substrat et

une deuxième en fonction du temps.

Notons que la fluorescence peut être évaluée soit par une valeur arbitraire en absence

de traceur, soit en termes de concentration par rapport au traceur de fluorescence.

Figure 13 Principe de mesure des activités enzymatiques en bioessais


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 86

4.1.1.1 Mesure de l’activité phosphatase alcaline (APA)

Chlorella vulgaris

Dans des études précédentes [26], plusieurs protocoles ont été mis au point pour

mesurer l’activité enzymatique de Chlorella vulgaris. La majorité de ces protocoles ont

utilisés des ions activateurs (Mg2+

), toutefois nous avons remarqué que ces ions n’ont pas un

rôle déterminant dans l’activité phosphatase alcaline. Nous avons, alors, décidé de ne pas

l’incorporer dans le milieu réactionnel pour ne pas complexer d’avantage ce dernier. Le

protocole retenu est le suivant :

Volumes utilisés Concentrations finales

Tris-HCl (1M, pH 8,5) 30 µl 0,1 M

Suspension algale 80 µl 106 à 5.10

7

Substrat : MUP (20µM) 0 à 190 µl 0 à 15µM

Eau distillée qsp 300 µl

Tableau 12 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité phosphatase alcaline de

Chlorella vulgaris en bioessais

La réaction entre la MUP et la phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris entraîne la

formation d’un produit fluorescent : la MUF (MéthylUmbelliFérone) dont les longueurs

d’excitation et d’émission sont respectivement de 355 et 460 nm, la cinétique enzymatique

consiste à suivre la formation de ce produit en fonction du temps et en fonction de la

concentration du substrat. La MUP présente une autolyse spontanée conduisant à la formation

de MUF. Il est donc nécessaire de réaliser des blancs sans algue de manière à soustraire des

résultats obtenus la fluorescence provenant de la dégradation spontanée du substrat. Il est à

noter que dans le cas des mesures de L’APA la quantité de substrat est choisie volontairement

élevée afin que ce dernier ne soit pas un facteur limitant de la réaction. Ceci est possible du

fait qu’aucune inhibition par excès de substrat n’a été observée dans le cas de la mesure de

l’APA sur Chlorella vulgaris en bioessais.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 87

Les algues marines

La mesure de l’activité phosphatase alcaline chez les algues marines est analogue à

celle réalisée avec Chlorella vulgaris. La composition du milieu réactionnel est donnée par le

Tableau 13.

Une gamme étalon avec le produit de la réaction enzymatique, la MUF, est réalisée en même

temps. Cette gamme (Tableau 13) est valable pour les souches Dt et Pt. La souche Ot ayant

une activité enzymatique moins forte, les concentrations de MUF sont diluées 10 fois.


Tris-HCl (1M, pH 8,5) 30 µl 0,1 M


7

Substrat : MUP (20µM) 0 à 170 µl 0 à 13 µM

Milieu de culture qsp 300 µl

MUF (gamme étalon) 2.10-7

à 2.10-9

M

Tableau 13 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité phosphatase alcaline des

algues marines en bioessais

Lors de cette étude, l’évolution de l’activité phosphatase au cours du temps à été

étudiée. Les algues se reproduisant rapidement, la population algale est croissante au cours du

temps. Pour éviter de considérer, une augmentation générale de la fluorescence due à une

augmentation de la population algale, comme une augmentation de l’activité enzymatique des

algues au cours du temps, il est nécessaire d’effectuer quotidiennement et simultanément aux

mesures, un comptage cellulaire qui permet de ramener la fluorescence obtenue à une activité

par cellule.

4.1.1.2 Mesure de l’activité estérase

Chlorella vulgaris

Le protocole de mesure de l’activité estérase de Chlorella vulgaris en microplaques a

été défini dans plusieurs travaux précédents [3, 26]. Comme pour l’APA nous avons décidé de

ne pas incorporer les ions activateurs Mg2+

pour ne complexer davantage le milieu


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 88

réactionnel. Le Tableau 14 donne la composition du milieu réactionnel pour la mesure de

l’activité estérase de Chlorella vulgaris.


Tampon citrate (0,1M, pH

5,4)

30 µl 10 mM


7

Substrat : FDA (20µM) 0 à 100 µl 0 à 7 µM

Eau distillée qsp 300 µl

Tableau 14 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité estérase de Chlorella vulgaris

en bioessais

La réaction entre la FDA et les estérases de Chlorella vulgaris entraîne la formation

d’un produit fluorescent : la fluorescéine dont les longueurs d’excitation et d’émission sont

respectivement de 480 et 538 nm, la cinétique enzymatique consiste à suivre la formation de

ce produit en fonction du temps et de la concentration du substrat.

Les algues marines

Le Tableau 15 donne la composition du milieu réactionnel pour mesurer l’activité

estérase des algues marines. Un traceur de fluorescence (la fluorescéine) sert à réaliser une

gamme étalon pour les mesures quantitatives.

Volumes utilisés Concentrations

finales


7

Substrat : FDA (20µM) 0 à 200 µl 0 à 13 µM

Fluorescéine 0 à 300µl 2.10-5

à 2.10-7

M

Milieu de culture qsp 300 µl

Tableau 15 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité estérase des algues marines

en bioessais

Remarque : cette gamme est valable pour les souches Dt et Pt. La souche Ot ayant une activité

enzymatique moins forte, cette gamme est utilisée diluée 100 fois. Notons enfin qu’aucun


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 89

tampon n’a été utilisé pour ne pas changer la force ionique du milieu, paramètre important

pour la mesure de l’AE.

4.1.2 Mesure des effets des toxiques sur les activités enzymatiques en bioessais

Pour évaluer la toxicité potentielle des xénobiotiques sur les activités enzymatiques

des algues, différentes techniques d’exposition ont été utilisées.

Chlorella vulgaris

Les algues sont introduites dans des plaques de culture cellulaire de type Costar 48

puits à fond adhérent. Lorsque toutes les cellules ont sédimenté, le milieu de culture est retiré

et remplacé par la solution toxique (dans certaines expériences le milieu de culture est retiré

après centrifugation). Lorsque le temps d’exposition est écoulé les plaques sont centrifugées

à 2500 t/min, le toxique est retiré et les algues sont remises en suspension dans le milieu

réactionnel de mesure et transférées dans des microplaques de 96 puits. Des témoins sans

toxique sont réalisés dans les mêmes conditions que l’essai.

Les algues marines

Les algues marines sont incubées en présence de toxiques dans des tubes à hémolyses

(5ml) à différentes concentrations. Pour évaluer la toxicité d’un xénobiotique à un instant t,

les algues sont prélevées et mises dans les microplaques 96 puits. La mesure de l’activité

enzymatique se fait selon les conditions données par le Tableau 15 en présence d’un témoin.

Lors de ce travail, plusieurs paramètres ont été étudiés : concentrations des toxiques, des

algues et du substrat ainsi que les effets de la lumière et de l’obscurité. La détermination de

l’activité résiduelle et du taux d’inhibition se fait grâce aux formules suivantes :

Activité résiduelle, % (Ares ,%) = 100 − 100 ×(Atémoin − Aéchantillon )/ Atémoin

Inhibition, % = 100 × (Atémoin − Aéchantillon )/ Atémoin

Avec : Atémoin : Activité du témoin et Aéchantillon : activité de l’échantillon

Les mesures en bioessais donnent une bonne répétabilité (RSD < 5%). Nous

considèrerons que l’effet sur l’activité enzymatique est significatif s’il est supérieur à 10%.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 90

4.2 Mise au point des biocapteurs

4.2.1 Les microélectrodes interdigitées

Dans cette étude deux types d’électrodes interdigitées ont été utilisées (l’une en or,

l’autre en platine). Des électrodes plates en or ont servi pour la caractérisation de

l’immobilisation avec les couches SAMs.

4.2.1.1 Les microélectrodes interdigitées en platine

Le transducteur conductimétrique (Figure 14) est composé de deux paires identiques

d’électrodes interdigitées en platine fabriquées à l’institut de Chemo et Biosensorics

(Münster, Allemagne). Les deux paires d’électrodes interdigitées en platine de 150 nm

d’épaisseur sont déposées sur un substrat en pyrex.

Une couche intermédiaire de titane de 50 nm d’épaisseur a été utilisée pour améliorer

l’adhésion du platine sur le substrat. La largeur des doigts constituant les électrodes

interdigitées, ainsi que la distance entre elles est de 10 µm leur longueur est d’environ 1mm,

ce qui permet d’avoir une zone sensible sur chacune des deux électrodes d’environ 1mm2.

Pour définir la partie sensible du capteur, la partie centrale du capteur a été couverte de résine

en époxyde.

Figure 14 Les électrodes interdigitées en platine, d’après Wang (2006) [159]


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 91

4.2.1.2 Les microélectrodes interdigitées en or

Les microélectrodes sont composées de deux paires identiques d’électrodes

interdigitées en or fabriquées par l’Institute of Semiconductors Physics, Kiev, Ukraine. Elles

diffèrent des précédentes par le substrat (céramique : AlO3) et la matière de dépôt (l’Or). La

couche intermédiaire est en chrome et les doigts interdigités font 20 nm de large pour une

longueur de 1 mm. La surface de chacune des parties sensibles fait 1,5 mm2.

4.2.1.3 Nettoyage des microélectrodes

Selon leurs utilisations les électrodes interdigitées sont nettoyées différemment. Ainsi

pour la réalisation des monocouches auto-assemblées, les électrodes sont soumises à un

traitement au piranha (cf. paragraphe 4.2.2.2) alors que pour les autres modes

d’immobilisation un traitement à l’acide sulfo-chromique est suffisant.

4.2.2 Immobilisation des algues

L’immobilisation du biorécepteur constitue la première étape de la réalisation d’un

biocapteur. Lors de cette étude, plusieurs méthodes ont été testées. Notons que pour les

mesures conductimétriques deux membranes sont nécessaires : une membrane active

(contenant les algues actives) et une membrane de référence (contenant soit des algues

inactives soit une membrane blanche).

4.2.2.1 Membrane à base d’albumine de sérum bovin (BSA)

L’utilisation de la technique d’immobilisation d’un biorécepteur avec la BSA a été

introduite par Dzyadevych et al. (1994) dans le cadre du développement de biocapteurs

enzymatiques [160] et a été adaptée par Chouteau et al. (2005) pour immobiliser des

microalgues [74].

La membrane active est composée de 100µl de suspension algale à différentes

concentrations, de 3 à 10 mg de BSA et de 5µl de glycérol pour limiter les fissures dans la

membrane de BSA [161]. Pour les mesures de l’APA de Chlorella vulgaris, la membrane

active contient des algues préconditionnées dans un milieu AFNOR-P et pour les autres

mesures (AE de toutes les souches et l’APA des algues marines) des algues fraîchement

repiquées.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 92

La membrane de référence est composée soit de BSA et d’algues non préconditionnées

(mesure de l’APA de Chlorella vulgaris) ou de membrane « blanche » ne contenant pas

d’algues.

0.3µl des mélanges ainsi réalisés sont déposés sur chacune des parties sensibles des

microélectrodes interdigitées puis placés dans une atmosphère saturée en glutaraldéhyde

pendant 20 minutes afin de permettre la réticulation des membranes. Enfin les électrodes sont

laissées à l’air libre pendant 10 minutes, le temps de sécher.

4.2.2.2 Les monocouches auto-assemblées

Les monocouches auto-assemblées (En anglais : Self Assembled Monolayers, SAMs)

avaient été utilisées pour immobiliser des protéines [162], des anticorps/antigènes [163], de

l’ADN [164] ou encore des levures [165] mais jamais, avant ce travail, des cellules algales.

Les électrodes interdigitées sont tout d’abord nettoyées aux ultrasons pendant 10

minutes, puis subissent une réduction chimique par immersion dans une solution de Piranha

(H2O2/H2SO4, 1:3 v/v) pendant 15 minutes (Avertissement : cette solution réagit violemment

avec beaucoup de résidus organiques, elle devra donc être manipulée avec précaution). Les

électrodes sont ensuite rincées à l’éthanol absolu et séchées sous un flux d'azote.

Les électrodes ainsi prétraitées sont immergées dans une solution d’acide 3-

mercaptopropionic (MPA) à 2 mM pendant 10 h à la température ambiante. Après la

formation des couches SAMs, les électrodes modifiées sont rincées plusieurs fois à l'eau

ultra-pure pour éliminer le MPA adsorbé physiquement sur la surface de l’électrode. 5 µl de

culture algale sont ensuite déposés sur les électrodes. On utilise pour cela une culture APA

active (préconditionnement sans phosphate) pour le dépôt sur une des deux électrodes et une

culture APA inactive (non préconditionnées) pour le dépôt sur la deuxième électrode qui

constituera ainsi l’électrode de référence. Le dépôt sera maintenu entre 12 et 14 heures sur les

électrodes qui seront ensuite lavées avec de l’eau ultrapure afin d’enlever l'excès de cellules

adsorbées physiquement.

Notons qu’une étape intermédiaire a été réalisée après la formation des couches SAMs

et qui consiste à fonctionnaliser les terminaisons carboxyles des thiols avec L’EDC (N-(3-

dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) et le NHS (N-

hydroxysuccinimide). Cette étape s’est avérée inutile puisque aucune amélioration de

l’immobilisation n’a été observée.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 93

Etant donné qu’avec les électrodes interdigitées, nous ne pouvons pas contrôler la

formation des couches SAMs ni la liaison des algues avec les méthodes électrochimiques (la

voltamétrie cyclique par exemple) nous avons réalisé une immobilisation des microalgues

avec la même méthode sur des électrodes plates en or. Ces dernières serviront à caractériser le

processus d’immobilisation.

4.2.2.3 La matrice BSA-Nafion

Les algues sont concentrées par centrifugation à 109 cellules/ml et mélangées à la

solution de nafion et 3 mg de BSA avant dépôt sur la zone sensible de l’électrode. Sur

l’électrode active des algues préconditionnées dans un milieu sans phosphate ont été utilisées

tandis que sur l’électrode de référence des algues non préconditionnées ont été déposées.

Différentes membranes sont ainsi réalisées et testées pour des pourcentages de nafion variant

de 1 à 10. Un ratio de 1 % correspond à 1 µl de Nafion, 3mg de BSA et 100 µl d’algues

concentrées.

Deux autres membranes à base de nafion ont été aussi réalisées mais la méthode

décrite précédemment a été retenue. La première consistait à immobiliser les microalgues

dans la BSA (cf. paragraphe 4.2.2.1) et la recouvrir d’une membrane Nafion et la deuxième à

inclure directement les algues dans trois membranes Nafion superposées. Ces deux

membranes se sont avérées fragiles et se décomposaient au cours du temps.

Les électrodes sont enfin laissées à l’air libre pendant 10 minutes puis conservées dans le

milieu de culture sans phosphate.

4.2.2.4 Membrane à base d’agarose

Cette méthode d’immobilisation a été utilisée pour le développement du biocapteur

optique. Deux types d’agarose ont été testés au cours de cette étude :

Agarose type VII, Low gelling temperature, plant cell culture tested (point de

gélification à 38°C).

Agarose type VII-A, Low Gelling Temperature (point de gélification à 30°C).

Ces deux types d’agarose ont été testés et ont montré qu’ils ont presque le même

comportement. Toutefois le type VII est plus consistant et maniable.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 94

Différentes concentrations du gel ont été testées : 0.5%, 1%, 1.5%, et 2%. Ce gel est

préparé suivant le protocole expérimental suivant (exemple d’un gel à 1%) :

0,5 g de gel sont mis en solution dans 49 ml d’eau ultrapure. Le mélange est porté à

ébullition sous agitation continue puis refroidi. Lorsque la température atteint 38 ° C une

suspension algale de 1 ml (obtenue après remise en suspension dans de l’eau ultrapure d’un

culot de centrifugation à 3000 tours/mn de 25 ml d’une suspension de 107 cellule/ml

d’algues). Lorsqu’il est refroidit, le gel est coulé en boîte de pétri sur une épaisseur comprise

entre 3 et 5 mm. Il est conservé à 4° C imbibé de milieu de culture et découpé en disques de 7

mm pour utilisation. Ces disques sont utilisés pour l’évaluation de la méthode

d’immobilisation et pour le développement du capteur.

4.2.2.5 Immobilisation sur filtres en fibres de verres

Cette méthode d’immobilisation a servi aussi pour le développement d’un biocapteur

optique.

25 ml d’une suspension algale de concentration égale à 106 cellules /ml sont dilués 20

fois et filtrés sous vide modéré à travers des filtres en fibres de verre (Whatman, GF/C) de

porosité égale à 1.2µm. La dilution est nécessaire pour une répartition plus homogène des

algues sur la surface du filtre. Les filtres ainsi obtenus sont découpés par une perforeuse en

disques de 7mm de diamètre, taille correspondante à la surface du fond d’une microplaque 96

puits et à la surface de la fibre optique. Ces filtres ainsi préparés sont recouverts d’une couche

mince d’agarose à 0,5% pour éviter tout décrochage éventuel des algues.

Les disques non utilisés peuvent être conservés à 4°C dans une boite de Pétri dont le

fond est recouvert par un papier imbibé d’eau distillée.

4.2.3 Mesure des activités enzymatiques avec le biocapteur

4.2.3.1 Principe des mesures conductimétriques

Les mesures conductimétriques (Figure 15) sont basées sur une mesure différentielle

entre l’électrode de travail (sur laquelle sont déposées les algues préconditionnées) et

l’électrode de référence (sur laquelle sont déposées les algues non préconditionnées). Grâce à

un générateur, un signal d’excitation sinusoïdal de fréquence 100 kHz peut être appliqué aux

deux électrodes excitatrices. Les signaux de sortie mesurés au niveau des électrodes


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 95

réceptrices dépendent, quant à eux de l’impédance du système. Dans le domaine des hautes

fréquences utilisées ici, l’impédance réelle est alors égale à la résistance de la solution ce qui

permet d’accéder à la conductance.

Les signaux mesurés sont traités par la technique du look in, c’est à dire filtrés à l’aide d’une

bande passante faible centrée sur la fréquence d’excitation puis transmis à la détection

synchrone qui fournit la différence de conductivité entre l’électrode de travail et l’électrode de

référence.

Figure 15 Représentation schématique des mesures conductimétriques

Les mesures ont été effectuées à la lumière du jour et à température ambiante dans

une cellule en verre de 2 ml. Le biocapteur a été immergé dans le tampon vigoureusement

remué. Après stabilisation du signal, différentes quantités de substrat ont été ajoutées dans la

cellule de mesure. Le signal différentiel a été enregistré en utilisant l'amplificateur synchrone

SR830 (Stanford Research Systems) et le logiciel d’acquisition de données LabView.

4.2.3.2 Détection de l’activité phosphatase alcaline

Etant donné que la méthode de détection est différente de celle en bioessais, le substrat

de la réaction enzymatique est différent. Les mesures conductimétriques nécessitent un

substrat capable d’interagir avec l’enzyme et de produire des espèces chargées capables de

changer la conductivité locale au niveau des zones sensibles de l’électrode. Le substrat utilisé

est le pNPP (paranitrophenyl phosphate), il sera dissous dans le tampon pour ne pas changer


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 96

la conductivité totale de la réaction lors de l’ajout du substrat. Le Tableau 16 donne la

composition du mélange réactionnel dans une cellule de mesure de 2 ml.

Volumes utilisées Concentrations finales

Tampon Tris-HCl 1980 10 mM

Substrat (pNPP) 0 à 20 µL 0 à 1,5 mM

Eau ultrapure qsp 2000 µl

Tableau 16 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’APA en biocapteur

Les étapes permettant de réaliser une cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline

sont les suivant :

Plonger délicatement l’électrode dans la cellule de mesure jusqu’à l’obtention d’un

signal stable noté dSi

Injecter un volume donné de substrat et après stabilisation relever la valeur de la

conductivité noté dSf puis calculer la variation du signal noté dS = dSf - dSi

Rincer l’électrode et refaire le même protocole pour un nouveau volume de substrat

4.2.3.3 Détection de l’activité estérase

Comme pour l’APA, la détection de l’activité estérase en biocapteur nécessite un

substrat approprié. Les travaux de Chouteau (2004) [26] ont permis de sélectionner le substrat

le plus adapté à la mesure de l’activité estérase en biocapteur conductimétrique :

l’acétylcholine (AchCl). Cette étude s’est limitée à la mesure de l’AE des algues marines.

Le Figure 17 donne la composition du milieu réactionnel pour la mesure de l’AE en

biocapteur. Notons qu’aucun tampon n’a été utilisé étant donné que les activités estérases des

algues marines sont très sensibles aux changements de la force ionique.

Volumes utilisées Concentrations finales

Substrat (AChCl) 0 à 20 µl 0 à 7 mM

Milieu de culture qsp 2000 µl 10 mM

Tableau 17 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’AE en biocapteur


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 97

Les étapes permettant de mesurer l’activité estérase en biocapteur sont identiques à

celles utilisées pour mesurer l’activité phosphatase alcaline (cf. paragraphe 4.2.3.2).

4.2.3.4 Mesure des effets des toxiques sur les activités enzymatiques

Pour évaluer les effets des toxiques sur les activités enzymatiques en biocapteur, des

mesures ont été réalisées avant (dSavant) et après (dSaprès) incubation dans une solution

contenant un ou plusieurs xénobiotiques. Des mesures avec une électrode témoin incubée

dans les mêmes conditions, en absence de toxique, sont réalisées.

Le taux d’inhibition est donné par la formule suivante :

Inhibition, % = (dSaprès / dSavant) × 100

L’activité résiduelle est donnée par la formule suivante :

Arésiduelle, % = 100 – Inhibition, %

4.3 La voltamétrie cyclique

La voltamétrie cyclique est une technique électrochimique qui nous a servi à

caractériser les monocouches auto-assemblées et à vérifier leur intégrité. Elle peut également

donner des informations sur la capacité des ions dans une solution de traverser la monocouche

et d’atteindre le substrat sur lequel sont immobilisées les microalgues.

Cette technique consiste à soumettre l’électrode de travail à une rampe de potentiel (balayage

triangulaire) et à mesurer le courent résultant. Le potentiel appliqué varie entre deux valeurs

E1 et E2 avec une vitesse de balayage v.

La Figure 16 montre un exemple de voltamogramme réalisé par Helali et al. [166]

dans le cadre de la caractérisation de l’immobilisation des billes magnétiques sur la surface de

l’électrode en or dans le but de fabriquer un biocapteur pour la détection de l’atrazine.

L’immobilisation des billes magnétiques provoque le changement des propriétés

électrochimique de la surface d’or et influe sur les pics d’oxydo-réduction.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 98

Figure 16 Voltamogramme du couple redox K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]: (a) électrode en or nue et (b)

électrode en or/billes magnétiques. Vitesse de balayage 100 mV/s.

Les mesures de voltamétrie cyclique ont été effectuées dans une cellule en plexiglass,

à trois électrodes ; une électrode de travail en or, une contre électrode en platine et une

électrode de référence au calomel saturée (SCE) dans une cage de Faraday. Toutes les

mesures électrochimiques ont été conduites en utilisant l'analyseur d'impédance Voltalab 80

de Radiométre Instrument Analytiques S.A., piloté par ordinateur (Figure 17). Il permet

d'appliquer une tension alternative d'amplitude 10 mV et d'effectuer un balayage dans la

gamme de fréquences comprises entre 500 MHz et 100 kHz. Cet appareil permet aussi de

fixer la tension de polarisation de la structure à zéro volt.

Figure 17 Montage expérimentale pour la mesure de la voltamétrie cyclique

Electrode de référence

Electrode de travail

Contre électrode

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 99

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 100

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 101

PARTIE C Résultats et discussion

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 102

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 103

Chapitre I Bioessais écotoxicologiques sur algues libres

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 104

Résultats Bioessais écotoxicologiques sur algues libres

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 105

1 Introduction

Les bioessais écotoxicologiques sur les cellules libres de Chlorella vulgaris

constituent un préliminaire nécessaire au développement de biocapteurs basés sur les activités

métaboliques de cette microalgue.

Chez Chlorella vulgaris, une partie des enzymes testées (phosphatase alcaline et

estérases) est membranaire [3]. Ceci les rend particulièrement intéressantes pour la détection

optique. Il est en effet indispensable que la réaction se passe à la périphérie de la cellule pour

avoir une réponse rapide.

Des essais sur algues libres en microplaques ont été réalisés de manière à tester la

réponse de Chlorella vulgaris aux deux familles de toxiques étudiées : les métaux lourds et

les pesticides. L’intérêt majeur de ces bioessais en microplaques est de pouvoir réaliser de

grandes séries de réplicats.

Ces bioessais permettront de choisir le bio-marqueur adéquat en fonction des familles

de polluants. Cette étape est primordiale et est à la base du développement des biocapteurs.

La première étape consiste à s’assurer que les algues cultivées présentent des activités

enzymatiques et la deuxième à évaluer les effets de polluants sur ces activités.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 106

2 Mesure des activités enzymatiques

Les mesures des activités enzymatiques ont été réalisées selon le protocole donné dans

la partie expérimentale. Les mesures ont été réalisées après 20 minutes d’incubation dans le

milieu réactionnel. Les résultats sont donnés sous forme de courbe exprimant la quantité de

fluorescence formée au bout de 20 minutes en fonction de la concentration du substrat.

2.1 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline.

Les phosphatases sont des enzymes présentes dans presque tous les organismes. Chez

les microalgues, leur rôle consiste à hydrolyser les phosphomonoesters en phosphate et alcool.

Le phosphate étant un facteur limitant de leur croissance, les microalgues gèrent leurs stocks

de phosphate grâce à leurs phosphatases.

Les courbes présentées sur la Figure 18 montrent la cinétique enzymatique de l’APA

de cellules de Chlorella vulgaris cultivées dans un milieu sans phosphate pour deux

concentrations algales.

Cette cinétique présente une allure Michaëlienne : l’activité augmente linéairement

avec la concentration du substrat (MUP) jusqu’à atteindre un plateau correspondant à la

saturation des enzymes pour des concentrations supérieures ou égales à 9µM de MUP. La

phosphatase alcaline est considérée alors comme une enzyme Michaëlienne et par conséquent

elle n’a qu’un seul site actif pour le substrat. La concentration algale n’influe ni sur l’allure de

la courbe ni sur la concentration de saturation, elle ne fait qu’augmenter l’amplitude du signal

La réaction entre la phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris le substrat (MUP) est

schématisée comme suit :

MUF

Phosphatase alcaline + H2O + H2PO4

MUP


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 107

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 1 2 3 4 6 8 10 11 12

concentration en MUP, µM

Flu

ore

scen

ce, U

A

10E+7 cell/ml

5*10E+6 cell/ml

Figure 18 Cinétique enzymatique de l’APA Chlorella vulgaris mesurée en bioessais (Tris-HCl 0,1 M ; pH

8,5)

2.2 Cinétique enzymatique des estérases

Les estérases sont des enzymes qui hydrolysent les liaisons ester des molécules. Elles

existent chez tous les organismes supérieurs. Chez les végétaux, elles sont impliquées dans la

photosynthèse et la régulation de l’absorption de l’eau.

Le substrat utilisé pour révéler l’activité estérase est la fluorescéine diacétate (FDA).

L’hydrolyse de la FDA conduit à la formation de la fluorescéine (produit fluorescent pour des

longueurs d’ondes d’excitation et d’émission de 480 et 538 nm).

La Figure 19 présente la cinétique enzymatique des estérases de Chlorella vulgaris.

Comme dans le cas des phosphatases, l’activité est Michaëlienne avec une saturation à 3 µM

pour les algues à 107 cellules/ml et 2,5 µM pour les à 5*10

6 cellules/ml. La variation n’a

jamais excédé les 5%.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 108

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 0,5 0,73 1,5 2 2,5 3 3,5 4 5 6

concentration en FDA, µM

flu

ore

sc

en

ce,

UA

10E+7 cell/ml

5*10E+6 cell/ml

Figure 19 Cinétique enzymatique des estérases de Chlorella vulgaris mesurée en bioessais ( Tampon citrate

10 mM ; pH 5,4)

3 Etude de l’atteinte des activités enzymatiques en présence de

toxiques

Deux grandes familles de polluants sont considérées dans cette étude : les métaux

lourds et les pesticides à différentes concentrations allant de 0,1ppb à 1ppm.

Les activités enzymatiques phosphatases et estérases sont mesurées sur des cellules

algales préalablement exposées aux polluants. Les résultats sont exprimés en pourcentage

d’activité résiduelle (valeur des activités obtenues après exposition aux toxiques rapportées

aux activités témoins obtenues dans les conditions de l’essai sur des algues non exposées).

Compte tenu de la variabilité obtenue pour ces essais (±7 %), on estime que l’activité

résiduelle après exposition aux toxiques est significativement différente de celle du témoin

pour un pourcentage de variation supérieur à 10%.

3.1 Etude de l’atteinte de l’APA En présence de métaux lourds

Trois métaux sont testés au cours de cette étude : Cd, Zn, et Pb pour cinq

concentrations (1ppm, 100ppb, 10ppb, 1ppb et 0.1ppb). Les sels des métaux utilisés sont

donnés par le Tableau 11. Différents essais ont été réalisés pour tester l’influence de différents

paramètres : la concentration algale, la concentration du substrat et le temps de contact.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 109

3.1.1 Effets de la charge algale sur l’atteinte de l’APA

Quatre concentrations algales ont été testées en présence de deux concentrations de

cadmium (1ppm et 10ppb) pendant deux heures d’exposition et à une concentration de

substrat de 9µM (Figure 20). Nous remarquons que plus la concentration algale est faible plus

le taux d’inhibition est grand. Ceci peut être expliqué par le fait qu’à de faibles concentrations

algales, le rapport algues/toxique est grand et les cellules ont plus de chance de rentrer en

contact avec le toxique. Aussi, les fortes concentrations algales favorisent la formation d’amas

cellulaires ce qui ne favorise pas le contact avec le toxique. Quelques excitations ont pu être

observées avec une concentration de 10ppb de cadmium, les paragraphes suivants

expliciteront ce phénomène.

Notons enfin que techniquement, avec l’appareil de mesure que nous utilisons, il est

impossible de travailler avec des concentrations algales inferieures à 106 cellules/ml pour des

raisons de sensibilité de l’appareil.

0

20

40

60

80

100

120

140

temoin C1 C2 C3 C4

concentration algale

Acti

vit

é r

ésid

uell

e,

%

1ppm

10ppb

Figure 20 Effets de la charge algale sur l’atteinte de l’APA de Chlorella vulgaris en présence de cadmium

(Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5, MUP 9µM, temps de contact 2h) C1=5*107 ; C2=10

7 ; C3=5*10

6 ;

C4=106 cellules/ml


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 110

3.1.2 Effets de la concentration du substrat sur l’atteinte de l’APA

Trois concentrations de MUP ont été testées, une concentration de saturation (9µM)

une concentration intermédiaire (5µM) et une concentration correspondante au début de la

cinétique enzymatique (1µM). Ces trois conditions ont été réalisées en présence de deux

concentrations de cadmium. Il apparaît d’après la Figure 21 que l’atteinte de l’APA est

indépendante de la concentration du substrat. Pour que la concentration du substrat ne soit pas

un facteur limitant pour la réaction enzymatique, il est nécessaire que celle-ci (la

concentration du substrat) soit en excès. Nous travaillerons par la suite avec des

concentrations de 9µM de MUP.

0

20

40

60

80

100

120

temoin 1 5 9

concentration en MUP, µM

acti

vit

é r

ésid

uell

e,

%

10ppb

1ppm

Figure 21 Effets de la concentration du substrat sur l’atteinte de l’APA de Chlorella vulgaris en présence

de cadmium (Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5, concentration algale 3*106 cellule/ml, temps de contact 2h)

3.1.3 Effets du temps de contact sur l’atteinte de l’APA

Afin d’évaluer le temps de contact optimal pour obtenir la meilleur sensibilité, les

microalgues ont été incubées pendant 30 minutes, 2 heures et 24 heures et les résultats sont

donnés par la Figure 22. Les temps de contact utilisés correspondent aux durées d’un test

aiguë étant donné que le but est d’avoir un test rapide qui pourra servir pour le développement

d’un outil d’alarme précoce.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 111

Nous remarquons qu’un temps de contact de 30 minutes n’est pas suffisant pour

provoquer une réponse chez Chlorella vulgaris. Les temps de contact de 2 et 24 heures

permettent de déceler des inhibitions significatives proches. Le temps de contact retenu pour

ces bioessais est de deux heures.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,5 2 24

temps, heures

acti

vit

é r

ésid

uell

e,

%

Figure 22 Effets de la concentration du substrat sur l’atteinte de l’APA de Chlorella vulgaris en présence

de 100 ppb de cadmium (Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5, concentration algale 3*106 cellule/ml, MUP

9µM)

3.1.4 Calibration

Une fois tous les paramètres mis au point, toutes les concentrations des différents

métaux ont été testées et nous avons obtenu les résultats donnés par la Figure 23 .


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 112

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

temoin 0,1ppb 1ppb 5ppb 10ppb 100ppb 1ppm

concentration en métaux

AP

A r

és

idu

ell

e,

%

Cd

Zn

Pb

Figure 23 Effets du Cd, du Zn, et de Pb sur l’APA de Chlorella vulgaris (Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5,

concentration algale 3*106 cellule/ml, MUP 9µM)

Rappelons que compte tenu de la variabilité de l’activité de la phosphatase alcaline, on

estime qu’une modification de l’activité est significative pour un écart supérieur à 10% à

l’activité du témoin.

La Figure 23 montre une inhibition significative de l’APA pour des concentrations de

1ppm et 100 ppb pour tous les métaux, de 10 ppb pour le Zn et de 5ppb pour le Cd. Pour tous

les métaux la relation dose-effet est respectée et le coeficient de variation (CV) n’a pas excédé

les 6%. Des études antérieures ont permis de réaliser un classement de la toxicité des métaux

lourds : Cd>Zn>Pb [26] et les résultats montrés par la Figure 23 montrent la même tendance.

La deuxième constatation est qu’avec de faibles concentrations (dès 10ppb pour le Pb et 1ppb

pour le Cd et le Zn), nous remarquons des activations (activité résiduelle> 100%). Des études

antérieures ont montré les mêmes résultats notamment les travaux de Chouteau, 2004 [26] sur

Chlorella vulgaris et Olabarrieta et al. (2001) [167] sur les phosphatases de cellules animales.

Deux hypothèses ont pu être formulées : il peut s’agir de la stimulation des défenses

cellulaires qui peut se traduire par l’activation de certaines enzymes. La deuxième à été

énoncée par Linden et al.(1977) : les métaux lourds et en particulier le cadmium peuvent

jouer un rôle d’ions activateurs [168].


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 113

Les résultats obtenus lors de ce travail mettent en évidence des limites de détection

plus faibles en comparaison avec des études précédentes [26, 30]. En effet pour le cadmium,

la limite de détection est de 5ppb alors qu’elle était de 10ppb. Pour le zinc, elle est de 10ppb

alors qu’elle était de 100ppb. La principale raison est l’utilisation de concentrations cellulaires

assez faibles (de 1 à 3*106 cellule/ml) qui permettent de travailler avec un rapport

algues/métaux assez grand.

3.1.5 Conclusion

En conclusion nous pouvons dire que l’utilisation de l’APA de Chlorella vulgaris

comme biomarqueur de toxicité pour la détection de métaux lourds dans le milieu aquatique

semble intéressante. Ces travaux ont donné lieu au développement de deux biocapteurs

conductimétriques pour la détection de métaux lourds basés sur la mesure de l’APA de

Chlorella vulgaris immobilisée par deux méthodes différentes.

3.2 Etude de l’atteinte de l’APA en présence de pesticides

Quatre pesticides ont été testés au cours de cette étude suivant le protocole donné dans

la partie expérimentale :

Le diuron : c’est un herbicide systémique de la famille des urées substituées. Il est

utilisé en viticulture et pour le désherbage des zones non agricoles.

Le méthyl parathion : c’est un insecticide et acaricide organophosphoré de formule

C10H14NO5PS utilisé dans la lutte contre les organismes nuisibles vivant dans le sol et

contre une grande variété d’insectes et acariens infestant les cultures.

Le méthyl paraoxon : c’est un produit de dégradation du méthyl parathion, c’est un

oxydant fort à polymérisation dangereuse et de toxicité aiguë très importante.

Le groupe des triazines : représenté par le 1, 3, 5, triéthylhexahydro-S-triazine, c’est

un microbiocide/microbiostatique utilisé généralement dans la culture du maïs.

Quatre concentrations de ces pesticides ont été testées dans une gamme qui s’étend de 1ppm à

1ppb. La Figure 24 montre les effets de ces composés sur l’APA de Chlorella vulgaris.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 114

0

20

40

60

80

100

120

140

160

temoin 1ppb 10ppb 100ppb 1ppm

concentration en pesticides

AP

A r

es (

%)

Diuron

Methyl paraoxon

Methyl parathion

Triazine

Figure 24 Effets de quatre pesticides sur l’APA de Chlorella vulgaris (Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5,

concentration algale 3*106 cellule/ml, MUP 9µM)

On ne constate aucune inhibition significative sauf avec le méthyl parathion à 1ppm,

la relation dose-effet est moins franche que dans le cas des métaux et on observe même des

excitations surtout en présence de diuron et de méthyl paraoxon. Il semble donc que l’APA de

Chlorella vulgaris ne puisse pas constituer un marqueur de présence de pesticides dans les

milieux aquatiques.

3.3 Etude de l’atteinte de l’AE en présence de métaux lourds

Le Cd, le Zn, et le Pb ont été utilisés. La Figure 25 montre les effets de ces métaux sur

l’AE de Chlorella vulgaris en bioessais par rapport à des cellules témoins non exposées aux

toxiques.

Sur la gamme de concentration utilisée, seules les concentrations de 1ppb pour tous les

métaux et la concentration de Zn à 10ppb produisent des excitations significatives. Le métal

qui induit la plus forte excitation est le Zn, il excite l’AE pour les faibles concentrations. Ce

résultat pourrait être intéressant dans la mesure où nous pouvons le confirmer et trouver le

mécanisme par lequel ce métal agit sur l’AE, des études plus poussées devront être réalisées

pour mieux appréhender ces résultats.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 115

0

20

40

60

80

100

120

140

160


concentration en métaux

AE

résid

uell

e,

%

Cd

Zn

Pb

Figure 25 Effets des métaux lourds sur l’AE de Chlorella vulgaris en bioessais (Tampon citrate 10 mM, pH

5,4, temps d’incubation 2h)

Malgré les résultats intéressants obtenus, l’AE ne représente pas un potentiel

équivalent à celui de l’APA pour la détection de métaux lourds dans les milieux aquatiques.

En effet, les activations produites ne sont pas suffisamment significatives pour faire de l’AE

un marqueur de toxicité intéressant. Ces résultats ne font que confirmer des études

antécédentes [169] qui ont montré que l’AE est sensible à la présence de produits

phytosanitaires et très peu sensible à la présence de métaux lourds.

3.4 Etude de l’atteinte de l’AE en présences de pesticides

La Figure 26 montre les effets de pesticides sur l’AE de Chlorella vulgaris. D’après

ces résultats, tous les pesticides testés inhibent l’AE des microalgues mais à des degrés

différents et nous pouvons alors les classer suivant leur pouvoir d’inhibition croissant :

triazine > méthyl paraoxon > diuron >méthyl parathion.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 116

0

20

40

60

80

100

120

140


concentration en pesticides

AE

résid

ell

e ,

%

Diuron

Methyl paraoxon

Methyl parathion

Triazine

Figure 26 Effets de quelques pesticides sur l’AE de Chlorella vulgaris en bioessais (Tampon citrate 10 mM,

pH 5,4, temps d’incubation 2h)

La relation dose-effet est respectée, en effet en augmentant la concentration des

pesticides, l’inhibition de L’AE augmente. Les inhibitions les plus importantes sont obtenues

pour le méthyl paraoxon et la triazine à des concentrations de 10ppb et le méthyl parathion et

le diuron à 100ppb, ces valeurs sont inférieures à celles trouvées par des essais sur l’enzyme

pure [170]. L’inhibition du méthyl parathion est nettement inferieure à celle observée avec le

méthyl paraoxon (qui est son produit de dégradation), enfin le diuron et le méthyl parathion

produisent à 1 ppb une activation non significative de l’AE.

Ces résultats sont fort intéressants en eux même et pour le développement éventuel de

biocapteurs basés sur l’AE comme bioindicateur de toxicité aux pesticides.

4 Conclusion

Les paragraphes précédents ont été consacrés à l’étude de deux biomarqueurs de

toxicité chez l’algue unicellulaire Chlorella vulgaris ; l’activité estérase et l’activité

phosphatase alcaline. L’étude menée tout le long de ce chapitre est consacrée à l’optimisation

de la mesure de ces deux biomarqueurs, à l’étude des effets de certains polluants, et

l’adaptation des bioessais développés au développement d’un biocapteur optique. Plusieurs

conclusions peuvent être formulées :


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 117

Le temps de réponse des bioessais est rapide (10 à 20 minutes) mais ce temps

n’inclut pas la période d’exposition qui peut varier d’un essai à l’autre. Une telle constatation

a pu être mise en évidence par des travaux précédents [3, 75]. Le temps de réponse court est

lié à la localisation membranaire des estérases et phosphatases alcalines. En effet dès l’ajout

du substrat, le produit fluorescent de la réaction enzymatique est formé. Comparé à d’autres

bioessais écotoxicologiques aigües, les essais avec les activités enzymatiques paraissent en

tête de classement.

La répétabilité des mesures est bonne puisque la déviation standard est inférieure à

7%. L’avantage majeur des bioessais réalisés en microplaques est de réaliser plusieurs

réplicats sur une même plaque. Les traceurs fluorescents (produits des réactions

enzymatiques) permettent, quant à eux, de comparer des plaques entre elles.

La reproductibilité des bioessais est généralement bonne, en effet d’un essai de

toxicité à l’autre nous retrouvons les mêmes résultats ou presque. Néanmoins dans certains

cas des différences peuvent apparaître et cela est dû probablement au changement de la

quantité d’algues dans les puits de la microplaque lors de l’élimination du milieu de culture

ou du milieu échantillon.

La stabilité des activités enzymatiques au cours du temps est différente entre les deux

enzymes étudiées : pour la phosphatase alcaline, une période de trois semaines de stabilité à

été décrite par Badreddine (1996) [158] après la période de starvation. Pour l’activité estérase,

l’activité est croissante lors des premiers jours de repiquage, puis cette activité baisse au cours

du temps [26] ce qui implique que le recours à cette mesure nécessite l’utilisation de cultures

fraîchement repiquées.

Les essais de toxicité réalisés au cours de cette étude ont montré que l’activité

phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris est sensible aux métaux lourds (Cd, Zn et Pb) avec

des limites de détection qui vont de 5ppb pour le cadmium à 100ppb pour le plomb. L’APA,

testée avec différents pesticides, a montré que ce biomarqueur n’est pas pertinent pour la

détection des pesticides dans les milieux aquatiques. Ces mêmes essais ont pu montrer que

l’activité estérase de Chlorella vulgaris était sensible à la présence de quelques pesticides

testés avec des limites de détection variables suivant le toxique étudié. Les bioessais réalisés

sur algues libres sont à la base d’une réflexion pour un développement d’un biocapteur

optique basé sur la mesure des activités enzymatiques.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 118

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 119

Chapitre II Application des bioessais au développement d’un biocapteur optique

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 120

Résultats Application des bioessais au développement d’un biocapteur optique

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 121

1 Etude de l’immobilisation de Chlorella vulgaris

1.1 Introduction

Les résultats obtenus en bioessais pourront être appliqués au développement de

biocapteurs destinés au contrôle de la toxicité des milieux aquatiques. La performance d’un

biocapteur est directement liée à l’efficacité de la méthode d’immobilisation du biorécepteur

dont la viabilité ne devra pas être affectée. D’autre part il sera nécessaire de veiller à ne pas

gêner l’accessibilité au biorécepteur pour les différents composés chimiques à détecter. Deux

méthodes ont été testées : l’inclusion dans un gel d’agarose et l’immobilisation sur un filtre

GFC couplé à une membrane à base d’agarose. Le choix de ces deux méthodes est basé sur la

compatibilité avec la détection optique. Ces méthodes ont été évaluées tout d’abord en

microplaques puis en biocapteur optique.

1.2 Etude en microplaque

Les essais ont été réalisés en microplaques comme pour les algues libres et n’ont

concernés que la membrane à base d’agarose. Les filtres de fibres de verres ont été testés

directement sur le biocapteur.

Certains paramètres caractérisant le gel, comme le pourcentage en agarose, la

concentration en algues sont testés dans un premier temps. La viabilité des algues ainsi

immobilisées est testée au moyen des cinétiques enzymatiques et de la fluorescence

chlorophyllienne.

1.2.1 Influence de la concentration du gel sur le métabolisme de l’algue

Des gels d’agarose à 4 concentrations différentes (0,5 %, 1%, 1,5% et 2 %) ont été

réalisés. Néanmoins, le gel à 0,5% s’est montré très fragile et ne sera donc pas utilisé lors de

cette étude. Des témoins composés par une quantité d’algues libres égale à celle immobilisée

dans le gel d’agarose sont testés en même temps dans les mêmes microplaques.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 122

1.2.1.1 Influence de la concentration du gel sur l’APA de Chlorella vulgaris

L’APA de Chlorella vulgaris a été suivie à différents temps de contact avec le

substrat. La Figure 27 illustre une comparaison entre l’APA des algues libres et celle des

cellules immobilisées à différentes concentrations du gel d’agarose.

La Figure 27 montre que l’intensité de l’APA est inversement proportionnelle à la

concentration du gel. Cela peut être expliqué par la nature physique du gel, en effet plus il est

concentré plus le maillage est serré et donc plus le substrat à du mal à diffuser à l’intérieur

pour se fixer sur les algues qui sont en profondeur.

0

20

40

60

80

100

120

temoin 1% 1,50% 2%

concentrations en gel

AP

A r

es (

%)

30 min

60 min

120 min

240 min

Figure 27 Influence de la concentration du gel d’agarose sur l’APA de Chlorella vulgaris pour différents

temps de contact entre le gel et le substrat

Pour le gel à 2%, on enregistre l’activité la plus basse, celle-ci augmente en fonction

du temps de contact sans atteindre un maximum au cours du temps de l’expérience, par

contre, pour les deux gels à 1.5% et à 1% on atteint une saturation au bout de 60min environ

avec une activité nettement supérieure pour le gel à 1% qui atteint 90% de l’activité des

algues libres. Ce dernier sera privilégié pour les mesures d’APA de Chlorella vulgaris.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 123

1.2.1.2 Influence de la concentration du gel sur l’AE de Chlorella vulgaris

L’AE de Chlorella vulgaris a été suivie à différents temps de contact avec le substrat.

La Figure 28 illustre une comparaison entre l’AE des algues libres et celle des cellules

immobilisées dans des gels d’agarose à différentes concentrations.

Les mêmes constatations que dans le cas de l’APA peuvent être faites. Toutefois après

30 min de contact avec le substrat, l’AE atteint 50 % de l’activité des algues témoins, contre

35 % pour l’APA. Ceci peut être dû à la forme ou à la taille des molécules du substrat. La

saturation est observée vers une heure de contact avec le substrat. Pour le gel à 1 %, l’activité

atteint 90% des algues témoins. Le gel à 1% est donc retenu pour les essais de toxicité.

0

20

40

60

80

100

120

temoin 1% 1,50% 2%

concentrations du gel d'agarose

AE

re

s (

%)

30 min

60min

120 min

240 min

Figure 28Influence de la concentration du gel d’agarose sur l’AE de Chlorella vulgaris pour différents

temps de contact entre le gel et le substrat

1.2.2 Influence de la charge algale dans le gel

Différentes concentrations d’algues ont été testées mais seulement trois parmi elles

seront présentées: 105, 10

6 et 10

7 cellule/ml. En effet les gels à concentration en algues

inférieure à 105 ne présentent pas de signal détectable et ceux à des concentrations algales

supérieures à 108 cellule/ml sont lâches et se cassent rapidement. En effet le rapport


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 124

algues/concentration du gel est très élevé et par conséquent le gel n’est pas suffisamment

réticulé et casse rapidement. La Figure 29 représente les cinétiques enzymatiques de l’APA de

Chlorella vulgaris pour différentes charges algales dans gel de 1%.

Ces courbes montrent qu’il est possible de mesurer les activités enzymatiques avec les

algues immobilisées dans un gel d’agarose et qu’en augmentant la charge algale dans le gel

l’amplitude de la réponse est plus importante. La cinétique est de type Michaëlienne comme

dans le cas des algues libres et nous retiendrons alors 107 cellule/ml comme concentration

optimale des microalgues dans le gel d’agarose pour les mesures de l’APA de Chlorella

vulgaris.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 2,63 4 6 8 10 12,76

MUP, µM

flu

ore

scen

ce,

UA

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

Figure 29 Influence de la charge algale sur les cinétiques enzymatiques de la phosphatase alcaline de

Chlorella vulgaris dans un gel d’agarose

Pour la cinétique enzymatique des estérases de Chlorella vulgaris, les mêmes résultats

ont été trouvés et nous utiliserons la même charge algale dans le gel pour détecter l’AE.

1.2.3 Essais de toxicité sur les algues immobilisées dans un gel d’agarose

Les essais de toxicité sur les algues immobilisées dans le gel d’agarose ont été réalisés

en même temps que les algues libres. Compte tenu des résultats obtenus sur les algues libres

nous avons choisi de ne réaliser que les essais qui se sont avérés pertinents à savoir :

L’inhibition de l’APA par les métaux lourds

L’inhibition de l’AE par les pesticides


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 125

Ces essais sont réalisés avec une concentration du gel de 1% et une charge algale de 107

cellule/ml.

1.2.3.1 Action des métaux lourds sur l’APA d’algues immobilisées dans un gel d’agarose

Les mêmes métaux lourds que dans le cas des essais de toxicité avec les algues libres

sont utilisés : Cd, Zn et Pb sur la même gamme de concentration. La Figure 30 illustre les

effets des métaux lourds sur l’APA des microalgues immobilisées dans le gel d’agarose ainsi

que les résultats trouvés sur les algues libres.

0

20

40

60

80

100

120

140

Cd Zn Pb Cd Zn Pb

Algues libres Algues immobilisées

AP

A r

es

(%

) temoin

1ppM

100ppb

10ppb

1ppb

Figure 30 Effets des métaux lourds sur l’APA de Chlorella vulgaris (comparaison entre algues libres et

algues immobilisées)

A première vue les résultats obtenus sur les algues immobilisées sont comparables

avec ceux obtenues sur les algues libres mais avec des inhibitions moins importantes, la

relation dose-effet est respectée dans le cas des algues immobilisées. Des excitations pour de

faibles concentrations en toxique ont été constatées. Ceci pourrait être expliqué par le fait que

les métaux ont du mal à pénétrer à l’intérieur du gel et dans ce cas les concentrations en

métaux au contact des algues sont moins importantes que dans le cas des algues libres. Notons

que des inductions d’activités enzymatiques en présence de très faibles concentrations de

toxique sont rapportées par la littérature [26]. En effet, Chouteau et al. ont expliqué que la

BSA, protéine très réactive, peut adsorber les métaux lourds et de ce fait les algues n’auront

plus le même contact avec les métaux. Des expériences complémentaires ont été réalisées de


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 126

manière à savoir si le gel d’agarose adsorbe ou non les métaux lourds et par conséquent s’il

protège les algues de l’action de ces composés.

Pour cela des gels ont été réalisés avec et sans algues et immergés pendant 72 heures

dans des solutions contenants des métaux lourds. Des analyses de métaux en absorption

atomique ont été réalisées sur les solutions de métaux avant et après immersion des gels. Les

résultats ont montré que :

Les concentrations des solutions avant et après immersion des gels restent identiques.

La concentration des solutions en éléments métalliques diminue après immersion des

gels avec algues, ce qui montre que ce sont les algues qui accumulent les métaux en

non le gel.

Ces résultats nous montrent bien qu’il est possible d’utiliser le gel d’agarose pour

immobiliser les cellules de Chlorella vulgaris afin de déceler des changements sur son activité

phosphatase alcaline, paramètre important pour détecter la présence des métaux dans les

milieux aquatiques.

1.2.3.2 Action des pesticides sur l’AE d’algues immobilisées dans un gel d’agarose

La Figure 31 présente les résultats d’inhibition de l’AE de Chlorella vulgaris obtenus

sur des algues libres et immobilisées exposées à quelques pesticides : Le diuron, le méthyl-

paroxon, le méthyl-parathion et une triazine.

Contrairement aux résultats trouvés dans le cas de l’APA, les pesticides ne produisent

pas les mêmes effets sur l’AE des algues libres ou immobilisées. En effet à part des

inhibitions ne dépassant pas les 20% à des concentrations de 1ppm, tous les effets sont non

significatifs, ce qui nous amène à dire que les algues à l’intérieur du gel ne sont pas exposées

aux pesticides et que le gel d’agarose protège les algues contre l’action de ces polluants en

empêchant ces derniers de pénétrer.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 127

0

20

40

60

80

100

120

140

Diu

ron

Me

thyl

pa

rao

xo

n

Me

thyl

pa

rath

ion

Tria

zin

e

Diu

ron

Me

thyl

pa

rao

xo

n

Me

thyl

pa

rath

ion

Tria

zin

e

Algues libres Algues immobilisées

AE

re

s (

%) temoin

1ppM

100ppb

10ppb

1ppb

Figure 31 Effets des pesticides sur l’AE de Chlorella vulgaris (comparaison entre algues immobilisées et

algues libres)

Les fortes concentrations arrivent pour certains pesticides à induire une inhibition. On

peut penser que dans ce cas une certaine fraction arrive toujours à pénétrer dans le gel. Le

méthyl parathion, pesticide organophosphoré n’induit aucune inhibition pour les algues

immobilisées et une inhibition très faible sur les algues libres. Les pesticides sont de grosses

molécules et peuvent avoir plus de difficultés que les métaux à pénétrer dans les gels.

1.2.4 Conclusion

L’étude des activités métaboliques de Chlorella vulgaris immobilisées au sein d’un

gel d’agarose a montré que les mesures de ces activités sont compatibles avec ce mode de

piégeage, néanmoins la détection des effets des pesticides par le biais de l’AE a montré les

limites de l’utilisation de ce type d’immobilisation pour détecter la présence de ces

xénobiotiques dans les milieux aquatiques. Un autre type d’immobilisation a été envisagé et

testé directement en biocapteur.

2 Etude en biocapteur

2.1 Le prototype

Le prototype de biocapteur utilisé dans ce travail a été mis au point par l’Ecole des

Mines de Saint Etienne. Le transducteur est un faisceau de fibres optiques rendu solidaire du

biorécepteur au moyen d’un boîtier. Le biorécepteur est constitué de membranes algales


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 128

immobilisées. Un espace est ménagé entre l’extrémité des fibres et la membrane algale de

manière à permettre la circulation d’un flux dont la circulation est générée par une pompe

péristaltique.

Figure 32 Vue en perspective de la cellule du biocapteur

La méthode de mesure utilisée dans cette étude est la FIA (flow, injection analysis) a

été mise au point au Laboratoire des Sciences de l’Environnement. Cette méthode FIA est la

plus adaptée pour les mesures in situ, dans ce cas le substrat ou l’échantillon à analyser

circulent l’un après l’autre. Lors du passage du substrat un pic d’activité est constaté. La

modification de l’amplitude de ce pic après passage d’un échantillon pollué traduira une

modification de l’activité enzymatique des microalgues.

Pour avoir un pic d’activité, une solution de tampon circule entre le biorécepteur et la

fibre optique et le substrat est rajouté grâce à deuxième pompe péristaltique.

2.2 Mesures avec algues immobilisées à l’agarose

2.2.1 Mesure du bruit de fond du biocapteur

Les algues sont immobilisées dans un gel d’agarose découpé sous forme de disques et

placés à l’intérieur de la cellule de mesure. Une solution de substrat circule en continu dans le

système en absence d’algue. La Figure 33 montre la réponse du capteur en fonction du temps.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 129

Figure 33 Mesure du bruit de fond du biocapteur

La courbe est linéaire et sa pente est nulle, aucune fluorescence liée à l’autolyse du

substrat n’est observée. On peut dire alors que la variation de fluorescence qui va être

observée lors des essais résulte uniquement de la réaction enzymatique étudiée.

2.2.2 Activité du témoin

Deux cinétiques enzymatiques en fonction du temps sont réalisées sur les algues

immobilisées, la première sur l’APA et la deuxième sur l’AE de Chlorella vulgaris pour

s’assurer que les deux enzymes testées sont fonctionnelles, les Figures 34 et 35 montrent la

réponse du biocapteur.

Figure 34 Cinétique témoin de l’APA de Chlorella vulgaris mesurée par le biocapteur optique


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 130

Figure 35 Cinétique témoin de l’AE de Chlorella vulgaris mesurée par le biocapteur optique

Les deux courbes obtenues sont croissantes et linéaires, ceci suggère que les deux

activités enzymatiques restent constantes pendant la durée de l’essai. Nous remarquons aussi

que l’amplitude de l’APA est supérieure à celle de l’AE.

2.2.3 Reproductibilité de la réponse du biocapteur

Deux types d’essais de reproductibilité sont réalisés pour détecter l’APA de Chlorella

vulgaris

Essais inter-membranes : réalisés sur des membranes d’agarose différentes et vont

servir à évaluer les différences entres deux gels préparés dans les mêmes conditions

expérimentales.

Essais intra-membranes : réalisés sur la même membrane selon la méthode FIA et

permettront de valider la méthode.

2.2.4 Reproductibilité inter membranes

Quatre disques de gel d’agarose ont été préparés et testés dans les mêmes conditions

expérimentales, les réponses du biocapteur sont illustrées par la Figure 36 .


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 131

Figure 36 Essais de reproductibilité inter-membranes

Ces courbes montrent que le signal est répétable à quelques unités arbitraires près. Des

résultats similaires ont été observés avec l’AE, on peut alors dire que ce mode de détection est

compatible avec le mode d’immobilisation étudié.

2.2.5 Reproductibilité intra-membranes

Ces essais sont réalisés suivant la méthode FIA qui est la plus adaptée pour les

mesures in situ. La Figure 37 montre la réponse du capteur pendant 500 mn aux cours

desquelles trois injections du substrat ont été réalisées.

Figure 37 Essais de reproductibilités intra-membrane


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 132

Nous remarquons que le retour à la ligne de base est respecté mais la répétabilité des

pics est moyenne. Le temps dédié à chaque pic varie de 100 à 250 mn avec des temps de

retour à ligne de base assez long (60 à 120 mn), ceci peut être dû à la sortie lente du produit

fluorescent produit par la réaction enzymatique (MUF). Ce problème peut être résolu en

diminuant l’épaisseur du gel.

Comme les autres types d’immobilisations, le gel d’agarose a montré des limites

d’utilisation et ne s’avère utile que pour la détection des métaux lourds en bioessais, mais en

biocapteur, cette méthode s’avère très limitée surtout pour des causes de diffusion du substrat

l’intérieur du gel. C’est pour cela qu’une méthode alternative à base d’agarose a été testée et

présentée dans le paragraphe suivant.

2.3 Mesures avec algues immobilisées sur des filtres GFC couplés à une membrane

d’agarose

L’immobilisation des algues a été réalisée en filtrant sous vide les algues avec un filtre

GFC. Des disques de 7mm de diamètre ont été découpés et recouverts par une membrane

d’agarose afin d’empêcher un décrochage éventuel des microalgues. Cette méthode est

inspirée de la première mais la seule différence est l’épaisseur du gel qui posait problème.

Dans ce cas l’épaisseur de la membrane ne dépasse pas le millimètre.

Nous présentons dans ce qui suit les résultats acquis avec les mesures de l’AE avec le

biocapteur optique et un essai de toxicité réalisé avec le méthyl paraoxon.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 133

2.3.1 Bruit de fond du biocapteur

Figure 38 Mesure du bruit de fond avec le biocapteur optique

Une solution de tampon circule en continu dans le système en absence d’algue. Le

substrat est rajouté après 5mn. La courbe est linéaire et sa pente est nulle, aucune fluorescence

liée à l’autolyse du substrat n’est observée. On peut dire alors que la variation de fluorescence

qui va être observée lors des essais résulte uniquement de la réaction enzymatique étudiée.

2.3.2 Cinétique de l’AE

Figure 39 Cinétique enzymatique de l’AE de Chlorelle vulgaris mesurée par le biocapteur optique

Cette figure montre une cinétique enzymatique du type Mikaeilis-Menten et valide

ainsi l’utilisation de cette méthode pour mesurer l’AE.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 134

2.3.3 Répétabilité du signal

Afin de s’assurer que le signal biologique est répétable trois pics d’activité ont été

obtenus après l’ajout de la même concentration de FDA. Les résultats montrent une bonne

Répétabilité (Figure 40).

Figure 40 Essais de répétabilité mesurés en biocapteur optique

2.3.4 Effets du méthyl parathion sur l’AE de Chlorella vulgaris

Après un premier pic d’activité temoin, une solution de méthyl-paraoxon circule à la

surface des algues immobilisées pendant 200 minutes. Un deuxième pic d’activité est alors

enresistré après rajout du substrat (Figure 41). Nous notons une baisse de l’amplitude du

signal liée probablement à une inhibition de l’activité estérase des microalgues. Ce résultat

est intéressant et mérite d’être confirmé par la poursuite des travaux sur la mise au point du

biocapteur (concentration du substrat, charge algale, dépôt de l’agarose…).Des essais

d’inhibitions par différents pesticides à différentes concentrations devront être poursuivis.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 135

Figure 41 Effet du méthyl-paraoxon sur l’AE de Chlorella vulgaris mesuré en biocapteur optique

3 Conclusion

L’immobilisation des cellules algales dans une matrice adéquate est la première étape

pour le développement du biocapteur. Cette étape est primordiale et la méthode utilisée ne

doit interférer ni avec la mesure de l’activité ni avec l’exposition aux différents toxiques.

Deux méthodes ont été testées et malgré le peu de résultats que nous avons eu, il paraît que

l’immobilisation dans un filtre de fibres de verres couplée à une membrane d’agarose est la

plus adéquate.

Le biocapteur optique développé est adapté aux mesures in situ et en continu puisque

les mesures se déroulent suivant la méthode FIA. Les premiers résultats obtenus sont

encourageants et des essais complémentaires sont à réaliser.

Méthyl-paraoxon

50ppb

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 136

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 137

PREAMBULE AUX CHAPITRES III, IV ET V

Les chapitres III, IV et V ont fait l’objet de publications dans des revues à comité de

lecture. Par souci de respect de l’intégrité de ces articles, ils ont été traduits de l’anglais tel

qu’ils sont été publiés. Néanmoins quelques passages ont été ajoutés suite à des travaux

réalisés après publication. La partie matériels et méthodes étant commune à tous les chapitres

de la thèse, quelques redondances peuvent apparaître.

Les chapitre III et V présenteront le développement de biocapteurs à cellules algales

pour la détection de métaux lourds dans les milieux aquatiques, les microalgues étant

immobilisées de deux manières différentes pour palier à des problèmes de répétabilité et de

spécificité des mesures respectivement.

Le chapitre IV, quant à lui, présentera la mise au point d’un biocapteur

conductimétrique pour la détection du phosphate.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 138

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 139

Chapitre III Développement d’un biocapteur conductimétrique a cellules algales immobilisées par la technique SAMs

Ce Chapitre a fait l’objet d’une publication scientifique dans une revue à comité de lecture :

Guedri, H. and C. Durrieu, A self-assembled monolayers based conductometric algal whole

cell biosensor for water monitoring. Microchimica Acta, 2008. 163(3): p. 179-184.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 140

Résultats Développement d’un biocapteur conductimétrique à cellules algales immobilisées

par la technique SAMs ___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 141

1 Introduction

La microalgue Chlorella vulgaris a été utilisée dans différents travaux pour la

réalisation de biocapteurs à cellules entières destinés au monitoring du milieu aquatique [75,

171]. Cette algue verte unicellulaire a été choisie pour son grand intérêt écologique (elle est

ubiquiste de tous les milieux dulçaquicoles et possède la propriété d’accumuler de grandes

quantités de polluants. Le premier biocapteur à cellules algales entières a été développé par

Pandard et al.(1993)[171] . Le fonctionnement de celui-ci est basé sur la mesure de la

production d’oxygène des algues immobilisées. Dans des travaux antérieurs nous avons

développé des capteurs optiques et conductimétriques basés sur la mesure de la fluorescence

chlorophyllienne ou de l’activité d’enzymes localisées sur la membrane externe des algues

[172, 173].

La première étape de la conception d’un biocapteur concerne l’immobilisation des

cellules algales. Différentes techniques d’immobilisation ont été testées à ce jour, chacune

présentant un certain nombre d’avantages et d’inconvénients. Le principal problème rencontré

est la faible reproductibilité des résultats obtenus entre différents capteurs pouvant s’expliquer

par l’hétérogénéité des couches d’algues immobilisées. Concernant les processus

d’immobilisation utilisés, on peut citer l’adsorption physique qui est la technique la plus

simple à mettre en œuvre , cependant une désorption est possible lors de variations du pH, de

la force ionique, de la température ou en présence d'un solvant [174]. Le piégeage physique

dans une matrice polymère (polyacrylamide [175], Polypyrrole [176],) ou dans un gélifiant

(agar [177], K-carrageenan [178], Alginate [179], sol-gel [180], BSA [181]) est une technique

largement utilisée, ne dénaturant pas l'élément biologique et permettant de protéger les

activités métaboliques. Cependant la matrice ainsi réalisée peut constituer une barrière

diffusionnelle limitant l’accessibilité du substrat et /ou des inhibiteurs vis-à-vis des cellules

algales. La technique des « Self Assembly Monolayer » (SAMs) a été utilisée pour fournir des

surfaces modèles afin d’examiner le comportement cellulaire dans le domaine des

bioanalyses et de l'ingénierie des tissus [165]. Cette technique a permis d’immobiliser des

protéines [162], des antigènes/anticorps [163],de l’ADN [164] ou encore des levures [165],

sur des substrats divers (Au, Ag, SiO2, ZrO2, ….). Le biorécepteur est dans ce cas rendu

solidaire du substrat par une liaison covalente, il est donc libre dans le milieu réactionnel au



________________________________________________________________________ 142

lieu d’être emprisonné dans une matrice. L’objectif de ce travail est d’étudier la faisabilité de

l’immobilisation de cellules algales sur des couches SAMs dans la conception d’un capteur

basé sur la mesure de l’activité phosphatase alcaline membranaire de Chlorella vulgaris. La

répétabilité des mesures réalisées à partir d’un même capteur, la reproductibilité entre

capteurs ainsi que la durée de vie du dispositif seront considérées. Les améliorations

apportées par cette technique d’immobilisation seront discutées.

2 Matériel et méthodes

2.1 Matériel

Le paranitrophenyl phosphate (pNPP) de Sigma-Aldrich a été utilisé comme substrat

pour mesurer l'activité phosphatase alcaline. L’acide 3-Mercaptopropionic (MPA) a été acheté

chez Fluka. Tous les autres réactifs utilisés sont de qualité analytique et ont été utilisés sans

aucun traitement.

Les photomicrographies des cellules algales immobilisées ont été obtenues à l’aide

d'un microscope epi-fluorescent Axioskop équipé d’un filtre d’excitation de 450-490 nm d’un

filtre d’émission de 530-750 nm et d’une caméra CCD (Cohu).L’acquisition des images a été


Avec un objectif (× 40) et un oculaire (× 10), l'agrandissement total est de × 400.

2.2 Culture cellulaire et mesure de l’activité phosphatase alcaline


« Culture Collection of Algae and Protozoa », Cumbria (UK). Cette souche est repiquée

hebdomadairement en conditions stériles en milieu Lefèvre-Czarda (norme AFNOR NT 90

304). Pour la mesure de l’activité phosphatase, un préconditionnement de 21 jours dans un

milieu sans phosphate est nécessaire[182] . L’activité phosphatase alcaline est mesurée au

moyen de para nitrophenylphosphate utilisé comme substrat, le milieu réactionnel est

tamponné à pH 8,5 (TRIS 0,1M).



________________________________________________________________________ 143

2.3 Conception du capteur

Le transducteur conductimétrique est composé de deux paires identiques d’électrodes

interdigitées en platine fabriquées à l’institut de Chemo et Biosensorics (Münster,

Allemagne). Les deux paires d’électrodes interdigitées en platine de 150 nm d’épaisseur sont

déposés sur un substrat en pyrex.

Une couche intermédiaire de Ti de 50nm d’épaisseur a été utilisée pour améliorer

l’adhésion du platine sur le substrat. La largeur des doigts constituant les électrodes

interdigitées, ainsi que la distance entre elles est de 10µm leur longueur est d’environ 1mm,

ce qui permet d’avoir une zone sensible sur chacune des deux électrodes d’environ 1mm2.

Pour définir la partie sensible du capteur, la partie centrale du capteur a été couverte de résine

en époxyde[159].

Les mesures sont basées sur la détection des variations de conductivité au niveau des

zones sensibles liées à des mouvements d’ions entre l’anode et la cathode.

La phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris, comme d'autres enzymes, induit des réactions

catalytiques générant des espèces ioniques aboutissant à des changements de conductivité

mesurables [173].

2.4 Immobilisation des microalgues

Les électrodes interdigitées sont tout d’abord nettoyées aux ultrasons pendant 10

minutes dans l'eau, puis subissent une réduction chimique par immersion dans une solution

de Piranha (H2O2/H2SO4, 1:3 v/v) pendant 15 minutes (Avertissement : cette solution réagit

violemment avec beaucoup de résidus organiques, elle devra donc être manipulée avec

précaution). Les électrodes sont ensuite rincées à l’éthanol absolu et séchées sous un flux

d'azote.

Les électrodes ainsi prétraitées sont immergées dans une solution d’acide 3-

mercaptopropionic (MPA) à 2 mM pendant 10 h à température ambiante. Après la formation

des couches SAMs, les électrodes de platine modifiées sont rincées plusieurs fois à l'eau ultra-

pure pour éliminer le MPA adsorbé physiquement sur la surface de l’électrode. 0.05µl de

culture algale sont déposées sur les électrodes. On utilise pour cela une culture d’algues

phosphatases alcalines (PA) active pour le dépôt sur une des deux électrodes et une culture à

PA inactive pour le dépôt sur la deuxième électrode qui constituera ainsi l’électrode de



________________________________________________________________________ 144

référence. Le dépôt sera maintenu entre 12 et 14 heures sur les électrodes qui seront ensuite

lavées avec de l’eau ultrapure afin d’enlever l'excès de cellules adsorbées physiquement.

En même temps, des électrodes en or ayant subi le même traitement que les électrodes

interdigitées ont été caractérisées par voltamétrie cyclique pour vérifier l’immobilisation des

microalgues par les monocouches auto-assemblées.Entre les expériences, les électrodes sont

stockées à 4°C dans un milieu de culture sans phosphate.

2.5 Mesures

Les mesures conductimétriques sont basées sur une mesure différentielle entre

l’électrode de travail (sur laquelle sont déposées les algues PA active) et l’électrode de

référence (sur laquelle sont déposées les algues PA inactive). Grâce à un générateur, un signal

d’excitation sinusoïdal de fréquence 100 kHz peut être appliqué aux deux électrodes

excitatrices. Les signaux de sortie mesurés au niveau des électrodes réceptrices dépendent,

quant à eux de l’impédance du système.

Les signaux mesurés sont traités par la technique du look in, c’est à dire filtrés à l’aide

d’une bande passante faible centrée sur la fréquence d’excitation puis transmis à la détection


référence. Les mesures ont été effectuées à la lumière du jour et à température ambiante dans

une cellule en verre de 2ml. Le biocapteur a été immergé dans du tampon Tris-HCl, pH 8.5

vigoureusement remuée. Après stabilisation du signal, différentes quantités de substrat ont été

ajoutés dans la cellule de mesure. Le signal différentiel est enregistré au moyen de

l’amplificateur synchrone SR830.

3 Résultats et discussion

3.1 Voltamétrie cyclique

La voltamétrie cyclique d'une espèce électroactive tels que [Fe (CN) 6] 4-/3-

est un outil

précieux pour tester la barrière cinétique à l’interface. L'étendue de la cinétique entrave au

processus de transfert d'électrons qui devient plus grande quand l'épaisseur augmente et la

densité des défauts de la barrière diminue. Le voltamogramme présenté par la Figure 42

confirme qu'une monocouche auto assemblée a été correctement formée à la surface d'or.

Lorsque la surface de l'électrode a été modifiée par ajout de matière, la cinétique de transfert



________________________________________________________________________ 145

d'électrons de Fe (CN) 64-/3-

ont été perturbés. La Figure 42 montre les voltamogrammes

cycliques de Fe (CN) 6 4-/3-

d’une électrode d'or nue (courbe a), après avoir été recouverte avec

les monocouches auto assemblées (courbe b) et après avoir déposé les microalgues (courbe c).

Figure 42 Mesure de la voltamétrie cyclique en présence de 5mM de K3[Fe(CN) 6]/K4[Fe(CN)6]: (a)

électrode nue, (b) électrode modifiée par les SAMs et (c) électrode modifiée+algues. Vitesse de balayage

100 mV/s.

3.2 Formation des couches SAMs

Le film préparé avec les cellules algales a été lavé avec l'eau ultrapure plusieurs fois

pour éliminer les cellules adsorbées physiquement. Après ce lavage rigoureux, l’analyse

microscopique montre les cellules algales immobilisées sur la surface de platine, ce qui laisse

supposer que les microalgues sont liées d’une manière covalente. Une électrode nue a été

préparée et la Figure 43 montre que dans ce cas les algues ne s’adsorbent pas

préférentiellement sur le platine.



________________________________________________________________________ 146

Figure 43 Image microscopique d’une électrode non modifiée (× 400)

Le groupement carboxylique terminal des alkanethiolate SAM est souvent utilisé pour

l'immobilisation des protéines en raison de sa réactivité avec certains groupements chimiques

de biomolécules [183]. L'interaction entre les cellules algales et la surface des couches SAMs

résulte probablement de la réaction entre certains groupements terminaux des

protéines intercalées dans la membrane des cellules algales et le groupement COOH de la

couche SAM. On obtient ainsi un groupement C comme le montre la Figure 44.

Figure 44 Représentation schématique de l’immobilisation des cellules algales sur l'électrode de platine

modifiée par les couches SAMs. La figure n’est pas à l’échelle



________________________________________________________________________ 147

3.3 Microscopie des cellules algales immobilisées

Figure 45 Les électrodes de platine modifiées par les monocouches auto-assemblées sans (A) et avec (B)

des cellules algales immobilisées, grossissement × 400

La Figure 45 montre une photographie en épifluorescence de la monocouche algale

immobilisée sur les doigts de l’électrode interdigitée. Dans cette étude, les cellules algales ont

été immobilisées sur une surface de platine au moyen des couches SAM. Ce procédé permet

une bonne fixation covalente, les fonctions vitales de la cellule restent toutefois à contrôler.

Contrairement au piégeage physique par un gélifiant (type alginate, BSA..) largement utilisé

cette technique d’immobilisation supprime toute barrière diffusionnelle.

Comme le montre la Figure 45, les microalgues ne sont fixées que sur le platine mais

des défauts dans la monocouche apparaissent. Cela peut être expliqué par des fissures dans le

substrat en platine comme l’ont constaté plusieurs auteurs en travaillant sur un substrat en or

[184, 185] et/ou par la taille des cellules (environs 5µm), en effet des encombrements

peuvent avoir lieu donnant naissance à des « trous » dans la monocouche algale.

3.4 Détection de l’activité phosphatase alcaline

La Figure 46 montre que le capteur réalisé permet de suivre l’activité phosphatase

alcaline des cellules de Chlorella vulgaris immobilisées en monocouches. La cinétique

obtenue a une allure Michaelienne, comme il avait était observé dans les travaux précédents

[173] réalisés avec d’autres techniques d’immobilisation. La fixation des cellules algales en



________________________________________________________________________ 148

monocouches SAM ne semble donc pas perturber leur activité phosphatase alcaline. On

observe ici une perte d’activité pour des concentrations en substrat supérieures à 70µM. Il

s’agit probablement d’une inhibition par excès de substrat. Dans tout ce qui suit les mesures

d’activité ont donc été réalisées pour des concentrations de substrat inférieures à 70µM. Ce

phénomène n’avait pu être observé avec le biocapteur conductimétrique basé sur

l’immobilisation des microalgues avec la BSA réticulée par le glutaraldéhyde. On peut

imaginer qu’une diffusion du substrat se produise à l’intérieur des gels de BSA impliquant

ainsi un piégeage du substrat qui atteindra plus difficilement les cellules algales. Dans un tel

cas la concentration de substrat au contact de l’algue est toujours inférieure à la concentration

du milieu d’essai. L’immobilisation chimique quant à elle permet un contact direct entre les

enzymes membranaires et le substrat. Ainsi, l’enzyme est atteinte par la totalité du substrat.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200

pNPP, µM

dS

, µ

S

Figure 46 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline mesurée avec un biocapteur

conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)

Le biocapteur conductimétrique a été développé dans ce travail dans l’optique d’une

utilisation dans la détection de polluants et en particulier les métaux lourds. Les premiers

résultats d’inhibition avec le cadmium ont montré une sensibilité du capteur avec une limite

de détection de 1ppb (Figure 47).



________________________________________________________________________ 149

0

20

40

60

80

100

120

0 ppb 0,1ppb 1ppb 10ppb 100ppb

concentration en cadmium

AP

A r

es,

%

Figure 47 APA résiduelle de Chlorella vulgaris pour 30 min d’exposition au Cd2+

(10 mM Tris–HCl, 50

μM pNPP, pH 8.5)

3.5 Analyse de la variabilité de la réponse

Trois mesures ont été réalisées pour chaque concentration de substrat. Dans tous les

cas l'écart type relatif n’a pas excédé 5 % (Figure 46). Cette variabilité est inférieure à celle

observée jusqu’à présent dans des travaux antérieurs dans lesquels elle pouvait atteindre 8%

[173]. L’immobilisation en monocouche semble donc pouvoir améliorer ce problème de

reproductibilité du fait de la meilleure homogénéité de la répartition des cellules à la surface

du transducteur.

La Figure 48 montre que l’ immobilisation des algues en monocouches SAM semble

également induire une diminution de la variabilité de la réponse entre différents capteurs par

rapport aux techniques classiques d’immobilisation comme la BSA [74]. Des variations

moyennes de 24 % ont également été décrites pour des biocapteurs à glucose utilisant la

glucose oxydase comme biorécepteur [186]. La variabilité des mesures réalisées ici entre

différents capteurs n’excède pas 10 %.

Dans les techniques d’immobilisation classiques (BSA, alginate…), les algues forment

à la surface du transducteur une couche d’une certaine épaisseur. Dans ce cas le substrat peut

ne réagir uniquement qu’avec les cellules en surface de couche, ou pénétrer, selon les

conditions expérimentales, plus ou moins bien dans l’épaisseur de la couche. Le dépôt des

algues étant réalisé manuellement à la surface du transducteur, l’épaisseur de la couche de



________________________________________________________________________ 150

cellules varie d’un capteur à l’autre ce qui induit de toute évidence un problème de variabilité.

L’immobilisation en monocouche semble supprimer ce problème.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60

pNPP concentration, µM

Co

nd

uc

tan

ce

, µ

S

Electrode 1

Electrode 2

Electrode 3

Electrode 4

Electrode 5

Figure 48 Cinétiques enzymatiques de l’activité phosphatase alcaline mesurées avec cinq biocapteurs

conductimétriques dans les mêmes conditions (10mM Tris–HCl, pH 8.5).

3.6 Stabilité du capteur au cours du temps

La Figure 49 montre la réponse du capteur suivie régulièrement pendant une période

de 30 jours, les conditions de stockage étant celles décrites dans la section 3.4. Trois zones

différentes apparaissent. De J0 à J5 : la réponse diminue légèrement jusqu’au cinquième jour,

ceci peut être dû soit à un relargage de certaines cellules algales qui n’ont pas été bien fixées

sur l'électrode soit à une adaptation cellulaire au nouveau milieu. De J6 à J22 la réponse est

stable. De J23 à J30 la réponse diminue constamment, cela peut être expliqué par une mort

cellulaire ou encore un relargage partiel des cellules algales. Ces résultats ont été obtenus sur

trois capteurs différents, ils montrent qu’après une brève période de décroissance de l’activité,

la réponse du capteur est stable sur une période de 17 jours.



________________________________________________________________________ 151

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35

Temps, jour

Co

nd

ucta

nce, µ

S

biocapteur 1

biocapteur 2

biocapteur 3

Figure 49 Evolution du signal de trois biocapteurs conductimétriques stockés à 4°C (10mM Tris–HCl, 50

µM pNPP, pH 8.5)

3.7 Conclusion

Les résultats obtenus montrent qu’il est possible d’immobiliser des algues entières sur

des couches SAM à la surface d’une électrode conductimétrique.

Nous avons montré dans ce travail qu’une immobilisation en monocouche permet

d’améliorer la répétabilité (RSD<5%) et la reproductibilité (RSD<10%) de la réponse. La

durée de vie du capteur est de 17 jours et la limite de détection du cadmium est de 1ppb.

L’objectif de ce travail était de trouver un mode d’immobilisation ne produisant pas

d’interférences avec les éléments toxiques à détecter comme il avait été observé dans des

études antérieures. L’absence d’interactions entre le mode d’immobilisation et le milieu

réactionnel est une nécessité pour l’obtention d’un capteur sensible et spécifique d’une

famille de polluants. Il reste donc à démontrer la potentialité de notre outil dans

l’identification de ces familles de polluants dans le milieu naturel avec des seuils de détection

intéressants pour les gestionnaires.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 152

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 153

Chapitre IV Développement d’un biocapteur conductimétrique a cellules algales pour la détection du phosphate

Ce Chapitre a fait l’objet d’une publication scientifique dans une revue à comité de lecture :

GUEDRI, H. and C. DURRIEU, Development of a conductometric algal whole cells

biosensor for phosphate monitoring. Sensor letters, 2009. 7(5): p. 788–794.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 154

Résultats Développement d’un biocapteur conductimétrique à cellules algales pour la

détection du phosphate

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 155

1 Introduction

La pollution des eaux de surface par le phosphate inorganique est un problème

environnemental important. L’augmentation des concentrations en phosphate peut induire

l’eutrophisation des lacs et des rivières [187].

La majeure quantité de phosphate présente dans les eaux de surface provient des

engrais et des détergents. La détermination des concentrations en phosphate est importante en

horticulture et agriculture pour optimiser l’utilisation des engrais [188] et pour le monitoring

effectif de l’eutrophisation [189].

Afin de pouvoir doser le phosphate inorganique dans les eaux de surface deux

méthodes classiques sont couramment utilisées : la spectrophotométrie [190] et la

chromatographie qui sont deux techniques performantes mais couteuses. L’ « Ion sélective

électrode » basé par exemple sur les « Sn complexes » [191], l’hydroxypatite [192] ou encore

le cobalt metallic wires [193] , est une autre méthode largement utilisée mais souffre d’un

manque de sélectivité et d’une faible stabilité [194].

Toutes ces méthodes ne permettent pas un monitoring en continu du phosphate dans le

milieu naturel. Seule l’utilisation de biocapteurs permet un contrôle in situ et en continu.

Depuis une dizaine d’année plusieurs biocapteurs à phosphate ont été développés ; la plupart

sont basés sur une séquence de réactions enzymatiques. La première enzyme (généralement

une phosphorylase) utilise le phosphate comme co-substrat donnant un produit qui servira de

substrat pour une deuxième enzyme (généralement une oxydase) [194] . Plusieurs couples

d’enzymes ont ainsi été utilisés : la nucléoside phosphorylase et la xanthine oxydase [195] ;

La phosphatase alcaline [196] ou acide [197] et la glucose oxydase; la sucrose phosphorylase,

la phosphoglucomutase et la glucose 6-phosphate déshydrogénase [198]. Dans ces travaux des

transducteurs optiques [199] et électrochimiques [193, 197, 200]ont été utilisés et les enzymes

ont été immobilisées de différentes manières: la co-immobilisation dans une membrane de

cellulose régénérée [197], dans un hydrogel [194], dans un gel de laptonite [187], ou encore

dans de la BSA réticulée par une vapeur de glutaraldéhyde [200].

Alors que la majorité des biocapteurs développés à ce jour ont pour biorécepteur des

enzymes pures, le travail décrit ici est réalisé sur des cellules algales entières et non modifiées

génétiquement. Ainsi les résultats sont un reflet direct de l’impact du phosphate sur le



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 156

compartiment algal dans le milieu naturel ce qui donne à ces capteurs un intérêt manifeste

pour le contrôle de la qualité des écosystèmes.

Des essais ont été préalablement réalisés sur cellules algales libres pour optimiser les

conditions optimales de détection du phosphate préalables à la réalisation d’un capteur

conductimétrique. Le fonctionnement de ce dernier est basé sur le fait que certaines réactions

biochimiques libèrent des espèces chargées qui induisent une résistance électrique (inverse de

la conductivité). L’Activité Phosphatase Alcaline (APA) étant directement liée aux

concentrations de phosphate disponibles dans le milieu [196], c’est la mesure de cette activité

sur Chlorella vulgaris au moyen du capteur conductimétrique qui permettra de doser

différentes concentrations de phosphate.


2.1 Matériel

Le paranitrophenyl phosphate (pNPP) et le methylumbellifery phosphate (MUP) de

Sigma-Aldrich ont été utilisés comme substrats pour mesurer l'activité phosphatase alcaline.

La bovine sérum albumine (BSA) et la solution de glutaraldéhyde (GA) à 25% ont été

achetés chez Sigma Aldrich.

KH2PO4 provient de chez Prolabo et a été utilisé pour inhiber l’activité phosphatase alcaline

de Chlorella vulgaris

Tous les autres réactifs utilisés sont de qualité analytique et ont été utilisés sans aucun

traitement.






2.2 Culture cellulaire et mesure de l’activité phosphatase alcaline



hebdomadairement en conditions stériles en milieu Lefèvre Czarda (norme AFNOR NT 90



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 157


milieu sans phosphate est nécessaire [182]. L’activité phosphatase alcaline est mesurée de

deux manières différentes :

Pour les bioessais le substrat est le methylumbellifery phosphate (MUP) et génère

après réaction un produit fluorescent, milieu réactionnel est tamponné à pH 8,5 par le

tampon TRIS à 100mM

En biocapteur le substrat est le para nitrophenylphosphate (pNPP) qui génère après

réaction une mobilité de charges, le milieu réactionnel est tamponné à pH 8,5 par le

tampon TRIS à 10mM.

2.3 Conception du capteur


interdigitées en or commercialisées par l’Institute of Semiconductors Physics, Kiev, Ukraine.

Les deux paires d’électrodes interdigitées en or de 150 nm d’épaisseur sont déposés sur un

substrat en céramique.

Une couche intermédiaire de Ti de 50 nm d’épaisseur a été utilisée pour améliorer

l’adhésion de l’or sur le substrat. La largeur des doigts constituant les électrodes interdigitées,

ainsi que la distance entre elles est de 10 µm alors que leur longueur est d’environ 1mm, ce

qui permet d’avoir une zone sensible sur chacune des deux électrodes d’environ 1mm2. Pour

définir la partie sensible du capteur, la partie centrale a été couverte de résine en époxyde

(Figure 50) [159].



Ici, c’est la phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris qui induit des réactions catalytiques

produisant des espèces ioniques aboutissant aux changements de conductivité mesurables

[201].



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 158

Figure 50 Schéma des électrodes interdigitées


Les algues sont mélangées à la BSA et réticulées au glutaraldéhyde [173]. Le mélange

est composé de 100µl d’algues préconditionnées sans phosphate, de 3 à 10mg de BSA. 5µL

de glycérol ont été ajoutés pour limiter les fissures dans la membrane de BSA [98]. 0.3µL de

mélange ont été déposés sur une des deux parties sensitives de l’électrode. Sur l’autre partie le

même volume de mélange réalisé avec des algues non actives (non préconditionnées) est

déposé et constitue ainsi la référence.

Les capteurs sont ensuite placés dans une atmosphère saturée en vapeur de

glutaraldéhyde pendant 20 mn puis laissés à l’air ambiant pendant 10 mn.

2.5 Mesures de l’APA

2.5.1 Mesures en bioessais

Les mesures sont basées sur la fluorescence détectée par un Spectrofluorimètre

(Fluostar, BMG). La réaction enzymatique utilisant le methylumbellifery phosphate (MUP)

comme substrat donne un produit fluorescent : la MUF MethylUmbelliFerone (MUF) qui est

facilement détectée par une fibre optique à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission

respectivement de 365 et 460 nm [75].

Les essais ont été réalisés dans des microplaques de 96 puits. Pour chaque

concentration huit réplicas ont été réalisés. Chaque puits contient le tampon Tris-HCl (pH 8.5,

0.1M) et la solution algale (80µL), le substrat est rajouté au dernier moment.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 159

Les cinétiques enzymatiques tracées avec les biocapteurs conductimétriques seront comparées

avec celles obtenues en bioessais. Etant donné que les protocoles de mesure sont différents,

surtout pour les substrats utilisés (MUP et pNPP), les comparaisons porteront surtout sur

l’allure de la cinétique pour valider la méthode.

2.5.2 Mesures en biocapteur

Pour le biocapteur, les mesures conductimétriques sont basées sur une mesure

différentielle entre l’électrode de travail (sur laquelle sont déposées les algues

préconditionnées) et l’électrode de référence (sur laquelle sont déposées les algues non

préconditionnées). Grâce à un générateur, un signal d’excitation sinusoïdal de fréquence 100

kHz peut être appliqué aux deux électrodes excitatrices. Les signaux de sortie mesurés au

niveau des électrodes réceptrices dépendent, quant à eux de l’impédance du système. Dans le

domaine des hautes fréquences utilisées ici, l’impédance réelle est alors égale à la résistance

de la solution ce qui permet d’accéder à la conductance.




référence.


une cellule en verre de 2mL. Le biocapteur a été immergé dans du tampon Tris-HCl, pH 8.5

vigoureusement remué. Après stabilisation du signal, différentes quantités de substrat ont été

ajoutées dans la cellule de mesure. Le signal différentiel a été enregistré en utilisant

l'amplificateur synchrone SR830 (Stanford Research Systems).



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 160

2.6 Détection du phosphate

2.6.1 Détection en bioessais

Pour les bioessais, les microplaques contenant les solutions algales sont centrifugées

pendant 8mn à 4000tr/mn puis le milieu de culture est remplacé par l’eau distillée pour le

témoin et des concentrations différentes en phosphates pour les autres. Après différents temps

d’exposition l’activité phosphatase alcaline est déterminée. On appelle alors activité résiduelle

l’activité après exposition aux polluants. Elle est exprimée en pourcentage d’activité initiale

obtenue avant exposition aux polluants. L’activité résiduelle est calculée selon la formule

suivante :

Ares(%) = 100 − 100 × (Atémoin − Aéchantillon )/ Atémoin

2.6.2 Détection en biocapteur

Pour les biocapteurs, la différence de conductivité dS est mesurée avant et après

incubation dans différentes concentrations de phosphate. dS avant (dSavant ) et dS après

(dSaprès) sont comparé et l’activité résiduelle (Ares) est calculée selon la formule suivante :

Ares (%) = 100 − 100 ×(dSavant + dSaprès )/ dSavant

Dans toutes les expériences un témoin est réalisé (électrode incubée dans l’eau distillée).

Pour les essais de régénération du biocapteur, celui-ci a été incubé, après inhibition, dans le

tampon TRIS-HCl.

3 Résultats et discussion

3.1 Observation microscopique des algues immobilisées

Les observations au microscope ont été réalisées après immobilisation et durant les

mesures pour s’assurer de la solidité des membranes constituées par les couches d’algues

immobilisées. L’observation microscopique montre que la membrane est bien solidaire de

l’électrode. Toutefois, les algues ne sont pas réparties de manière homogène (Figure 51).

Avec une épaisseur moyenne des membranes de 10 à 15 µm, celle-ci peut contenir par endroit

deux épaisseurs de cellules algales. Cette hétérogénéité de répartition conduit à d’importantes

variations de réponse du capteur. Dans le paragraphe 3.2 nous montrerons comment

s’affranchir de ce problème.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 161

Figure 51 Observation microscopique des algues immobilisées par la BSA réticulé par le glutaraldéhyde

sur une électrode interdigitée, grossissement (× 400)

3.2 Détection de l’activité phosphatase alcaline

Dans des travaux précédents [75, 173], il a été prouvé que l’APA de Chlorella

vulgaris pouvait être mesurée directement sur la cellule entière par les bioessais et par un

biocapteur conductimétrique. Comme le montre les Figures 52 et 53, les mesures effectuées

par le biocapteur à algues immobilisées par la BSA réticulé par le glutaraldéhyde montrent

une activité enzymatique du type Michaelis–Menten comparable à celle obtenue en bioessais

sur algues libres. Ceci permet de valider l’utilisation des biocapteurs conductimétriques pour

la détection de l’APA.

Le dépôt des algues étant très hétérogène d’un capteur à l’autre il a été nécessaire pour

la réalisation de cette étude de sélectionner des capteurs ayant des réponses comparables (la

déviation standard entre deux capteurs ne doit pas excéder 7%).



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 162

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 5 10 15 20

MUP, µM

Flu

ore

sc

en

ce,

AU

Figure 52 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline mesurée en bioessais (100 mM Tris–HCl, pH

8.5)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0,5 1 1,5

pNPP, mM

dS

, µ

S

Figure 53 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline mesurée en biocapteur conductimétrique

(10mM Tris–HCl, pH 8.5)

3.3 Optimisation de la sensibilité de détection du phosphate

La mise au point des bioessais et du biocapteur ont nécessité de tester la concentration

algale, le ratio algues/BSA, le temps d’incubation dans le phosphate, la concentration du

substrat, ainsi que l’effet de certaines espèces anioniques et cationiques. Le temps de

réticulation au glutaraldéhyde a été fixé grâce aux travaux de Chouteau et al. [173] à 20mn.

Ces différents paramètres seront déterminés de manière à obtenir la limite de détection des

ions phosphates la plus basse et la plus large gamme de détection.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 163

En bioessais, quatre concentrations algales ont été testées en présence de quatre

concentrations en phosphate pendant 30mn pour déterminer celle qui donne l’inhibition la

plus grande comme le montre la Figure 54. Nous remarquons que plus la concentration

algale est élevée plus le taux d’inhibition est faible surtout pour les faibles concentrations en

phosphate. Ceci peut être expliqué par le fait que pour de grandes concentrations algales et de

faibles concentrations en phosphates, les microalgues ne sont pas toutes en contact avec les

ions phosphates ; il est donc logique que l’inhibition soit moindre. Nous remarquons aussi

que pour une même concentration algale et différentes concentrations en phosphates la

relation dose effet est respectée.

0

20

40

60

80

100

120

0,1 1 10 100

PO4, µM

AP

A

résid

uell

e,

%

1,00E+06

5,00E+06

1,00E+07

5,00E+07

Figure 54 Effets de la concentration algale sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à différentes

concentrations en phosphates en bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5, temps de contact 30mn)

La même expérience a été réalisée en biocapteur et les résultats montrent qu’une

concentration algale de 3×107 à 4×10

7 cellules/ml est optimale pour avoir une inhibition

maximale.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 164

0

20

40

60

80

100

1 100

concentration en PO4, µM

AP

A r

ésid

uelle, %

5,00E+07

3,00E+07

Figure 55 Effets de la concentration algale l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à différentes

concentrations en phosphates en bioessais (10mM Tris–HCl, pH 8.5, temps de contact 60mn)

En biocapteur le facteur qui influe le plus sur la sensibilité est l’immobilisation du

biorécepteur. Dans ce travail les microalgues ont été immobilisées dans de la BSA réticulée

par le glutaraldéhyde. Il parait donc logique de tester différents ratios BSA/algues. Pour cela

quatre ratios ont été testés et un rapport de 5mg de BSA/100ml d’algues (5%) paraît le plus

adapté pour la mesure de l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris par le phosphate

comme le montre la Figure 56. En effet avec un ratio de 3% nous avons remarqué au

microscope un décollement partiel de la membrane et donc un relargage partiel des algues.

Par contre avec des ratios de 7 et 10% nous remarquons une sensibilité inferieure à celle

obtenue avec un ratio de 5%.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0,010,11101001000

PO4, µM

dS

, µ

S 3%

5%

7%

10%

Figure 56 Effets du phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris à différents ratios BSA/algues (10mM Tris–

HCl, pH 8.5, temps de contact 60mn)



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 165

Notons une observation importante : l’APA est activée pour de très faibles

concentrations en phosphate. Plusieurs auteurs ont pu mettre en évidence cette activation

avec la phosphatase alcaline surtout en présence de Cd2+

. Cela a pu être expliqué par la

stimulation des défenses cellulaires qui se traduit par une activation enzymatique. Les essais

réalisés sur des algues non complètement starvées montrent que leur APA n’est pas activée

en présence de faibles concentrations en phosphate. On pense que c’est l’état de la cellule

dépourvue de phosphate pendant 21jours qui favoriserait cette activation.

Pour déterminer la durée minimale d’incubation des microalgues, ces dernières ont

été incubées dans le phosphate pendant 15, 30, 60 et 120 mn selon le protocole donné dans la

partie méthodes. Les Figures 57 et 58 montrent l’évolution de l’inhibition au cours du temps

en présence de trois concentrations en phosphate respectivement en bioessais et en

biocapteur conductimétrique. En bioessais nous remarquons qu’après un temps d’incubation

de 30 mn, l’inhibition de l’APA est maximale pour les trois concentrations de phosphate

utilisées. En biocapteur, un temps de contact de 60 mn est nécessaire pour obtenir une

inhibition maximale. Ceci peut être dû à un problème de diffusion des ions phosphates à

l’intérieur de la membrane algues/BSA.

0

20

40

60

80

100

120

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135

temps, mn

AP

A r

ésid

uell

e,

%

1µM

10µM

100µM

Figure 57 Effets du temps sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à trois concentrations de

phosphate en bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5)



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 166

0

20

40

60

80

100

0 15 30 45 60 75 90 105 120 135

temps, mn

AP

Are

s,

%

1µM

10µM

100µM

Figure 58 Effets du temps sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à trois concentrations de

phosphate en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)

Il a été constaté que la concentration du substrat (dans notre cas le pNPP) influe sur

la sensibilité de la mesure. Les Figures 59 et 60 montrent les effets de la concentration du

substrat sur la sensibilité de la mesure de l’inhibition de l’APA en bioessais et en biocapteur.

Deux concentrations de substrat ont été testées : une faible concentration correspondante au

démarrage de la réaction enzymatique (2µM de MUP et 0.1µM de pNPP) et une deuxième

concentration saturante (10µM de MUP et 0.8µM de pNPP). Il paraît qu’une faible

concentration de substrat soit la plus adaptée pour la mesure de l’inhibition de l’APA. En

biocapteur conductimétrique nous constatons qu’à de fortes concentrations en phosphate

l’inhibition est comparable avec les deux concentrations en substrat, tandis qu’à de faibles

concentrations en phosphate (1µM) l’inhibition de l’APA est plus grande pour de faibles

concentrations en substrat (0.1µM de pNPP). Cela peut être expliqué par le fait que les algues

ne sont pas réparties sur une seule couche. En effet, une concentration plus importante en

substrat favoriserait la réponse des algues non inhibées situées à proximité des parties

conductrices de l’électrode. Ces algues non inhibées, surtout à de faibles concentrations en

phosphate, vont participer à diminuer l’inhibition globale du capteur.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 167

0

20

40

60

80

100

120

1 10 100

PO4, µM

AP

A r

és

idu

elle

, %

2µM

10µM

Figure 59 Effets de la concentration du substrat sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris en

bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5)

0

20

40

60

80

100

120

1 10 100

PO4, µM

AP

Are

s, %

0,1µM

0,8µM

Figure 60 Effets de la concentration du substrat sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris en

biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 168

3.4 Courbes de calibration

Comme le montrent les Figures 61 et 62, deux courbes de calibration ont été obtenues

après toutes les mises au point effectuées. La Figure 61 correspond à celle obtenue en

bioessais sur algues libres : avec une gamme linéaire s’étendant entre 0.5 à 1000µM, la limite

de détection avec cette méthode est de 0.5µM. La Figure 62 correspond à la courbe de

calibration obtenue avec un biocapteur conductimétrique, la gamme linéaire est comprise

entre 0.4 et 800µM avec une limite de détection de 0.4µM.

Le biocapteur conductimétrique développé dans le cadre de ce travail pourra servir au

monitoring des écosystèmes aquatiques et suivre les concentrations en phosphate in situ et en

continue.

0

20

40

60

80

100

120

0,010,11101001000

PO4, µM

AP

A r

ésid

uell

e,

%

Figure 61 Courbe de calibration obtenue en bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5, MUP, 2µM, temps de

contact 30mn)

0

20

40

60

80

100

120

140

0,010,11101001000

PO4, µM

AP

A r

ésid

uell

e,

%

Figure 62 Courbe de calibration obtenue en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5,

pNPP 0,1 µM, temps de contact 60 mn)



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 169

3.5 Réutilisation du capteur

Pour évaluer la possibilité de réutilisation du biocapteur après inhibition de l’APA

après contact avec différentes concentrations de phosphate, des mesures ont été réalisées au

cours du temps après l’obtention d’une inhibition. Il a été constaté que la régénération de

l’activité n’est que partielle et se stabilise au bout de 12 heures comme le montre la Figure 63.

Ceci peut être expliqué par le fait que les algues ont pu faire un stock de phosphate et par

conséquent l’activité des enzymes se restaure lentement au cours de la consommation du

phosphate par la cellule. Il est donc possible d’envisager l’utilisation de ces capteurs après

inhibition mais en considérant que l’activité de base est celle des algues déjà inhibées. Ils

seront dans ce cas beaucoup moins sensibles.

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30

temps, heures

AP

A r

es,

%

10µM PO4

100µM PO4

1000µM PO4

Figure 63 Mesure de l’APA résiduelle après inhibition à différentes concentrations en phosphate en

fonction du temps en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)

3.6 Stabilité du biocapteur

Le biocapteur conductimétrique à cellules algales à été conservé dans un tampon Tris-

HCl à 4°C à l’obscurité pour éviter la multiplication cellulaire et la contamination

bactérienne. Dans ces conditions et comme le montre la Figure 64 l’APA reste stable pendant

22 jours puis l’activité baisse rapidement. Cela peut être expliqué par une mort cellulaire, le

relargage des cellules algales ne peut pas être la raison de cette diminution d’activité puisque

pendant cette période les microalgues restent immobilisées sur l’électrode. Notons qu’aucune

interférences de certaines espèces chimiques largement trouvées dans le milieu naturel tel que

NaCl, KCl, KNO3, CaCO3 and KHCO3 n’a été observée.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 170

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35

temps, jours

dS

, µ

S électrode 1

électrode 2

électrode 3

Figure 64 Evolution du signal de trois biocapteurs conductimétriques au cours du temps stockés à 4°C

(10mM Tris–HCl, pH 8.5)

4 Conclusion

Dans ce travail, un biocapteur conductimétrique à cellules algales à été développé.

Les microalgues Chlorella vulgaris ont été immobilisées dans de la BSA réticulée par le

glutaraldéhyde. Ce biocapteur est relativement fiable et simple d’utilisation. Etant de faible

coût, ce biocapteur permettra de suivre en continu les concentrations de phosphate dans

différents milieux. Ce dispositif à une large gamme de détection allant de 0.4 à 800µM avec

une limite de détection de 0.4µM de phosphate. Aucune interférence avec les espèces

anioniques n’a été observée. Finalement ce biocapteur peut être stocké enivrent 22 jours et les

mesures sur site sont en cours d’investigation.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 171

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 172

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 173

Chapitre V Développement d’un biocapteur conductimétrique basé sur l’immobilisation de cellules algales dans une matrice

Nafion/BSA

Ce Chapitre a fait l’objet d’une publication scientifique dans une revue à comité de lecture : GUEDRI. H , C.Durrieu A Nafion/BSA based conductometric algal whole cell biosensor for heavy

metal monitoring, Progress in Environmental Science and Technology (Vol. II), Part A p.623-628

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 174

Résultats Développement d’un biocapteur conductimétrique basé sur l’immobilisation

de cellules algales dans une matrice Nafion/BSA

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 175

1 Introduction

La contamination du milieu aquatique par les ions de métaux lourds constitue une

menace aussi bien pour la santé humaine que pour l’équilibre des écosystèmes. Il est donc

important de pouvoir les détecter rapidement dans l’environnement avant que ceux-ci ne

causent des dégâts irréversibles. Plusieurs techniques permettent de doser les métaux lourds

notamment l’absorption atomique (SAA), la spectrométrie de masse (ICP-MS) ou encore la

polarographie. Toutes ces méthodes ne permettent pas un monitoring en continu des métaux

lourds dans le milieu naturel. Seule l’utilisation de biocapteurs permet un contrôle in situ et en

continu. Depuis une dizaine d’années plusieurs biocapteurs pour la détection des métaux ont

été développés ; la plupart sont basés sur l’inhibition d’enzymes pures tels que l’uréase [202]

et la phosphatase alcaline [203]. Ces capteurs ne tiennent pas compte des effets

synergique/antagoniste des polluants et ne reflètent pas la « santé écologique » des milieux

naturels.

L’utilisation des biocapteurs à cellules entières et en particulier les microalgues peut

être une alternative intéressante aux biocapteurs à enzymes pures ; en effet les algues sont à la

base de la chaine trophique et la détection des polluants à ce niveau permet d’intervenir pour

éviter des conséquences irréversibles. En plus la détection des polluants par le biais des

cellules algales donne un intérêt écologique manifeste pour le contrôle de la qualité des

écosystèmes.

Dans ce cadre des biocapteurs à cellules entières ont été développés et basés sur

l’inhibition de la fluorescence chlorophyllienne d’algues immobilisées [204] ou encore sur

l’inhibition de la phosphatase alcaline membranaire [75] . Dans les travaux de Chouteau et al.

[74, 173], les microalgues Chlorella vulgaris ont servi à détecter des métaux lourds en

mesurant l’inhibition de l’activité phosphatase alcaline. Ces travaux n’ont pas tenu compte de

l’effet inhibiteur du phosphate sur la phosphatase alcaline. Sachant que les phosphates sont

présents dans tous les milieux naturels, il est nécessaire de prendre en compte cet élément

pour que la réponse du capteur en milieu naturel ne soit pas perturbée par la présence des ions

phosphates.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 176

L’objectif de ce travail est de développer un biocapteur conductimétrique à cellules

algales immobilisées dans une membrane Nafion/BSA et basé sur l’inhibition de la

phosphatase alcaline en présence de cadmium.

Des essais ont été préalablement réalisés sur cellules algales libres pour optimiser les

conditions optimales de détection des métaux préalables à la réalisation d’un capteur

conductimétrique. Le fonctionnement de ce dernier est basé sur le fait que certaines réactions

biochimiques libèrent des espèces chargées qui induisent une résistance électrique (inverse de

la conductivité). L’Activité Phosphatase Alcaline (APA) étant directement liée aux

concentrations de métaux disponibles dans le milieu, c’est la mesure de cette activité sur

Chlorella vulgaris au moyen du capteur conductimétrique qui permettra de doser différentes

concentrations de cadmium.


2.1 Matériel

Le paranitrophenyl phosphate (pNPP) et le methylumbellifery phosphate (MUP) de

Sigma-Aldrich ont été utilisés comme substrats pour mesurer l'activité phosphatase alcaline.

La bovine sérum albumine (BSA) et la solution de Nafion perfluorinated ion-exchange resin,

5% proviennet de chez Sigma Aldrich. Le nitrate de cadmium de chez Merck.

KH2PO4 (Prolabo) a été utilisé pour inhiber l’activité phosphatase alcaline de Chlorella

vulgaris.

Tous les autres réactifs utilisés sont de qualité analytique et ont été utilisés sans aucun

traitement.






2.2 Culture des algues



hebdomadairement en conditions stériles en milieu Lefèvre Czarda (norme AFNOR NT 90



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 177


milieu sans phosphate est nécessaire.

2.3 Conception du biocapteur


interdigitées en or commercialisées par l’Institute of Semiconductors Physics, Kiev, Ukraine.

Les deux paires d’électrodes interdigitées en or de 150 nm d’épaisseur sont déposés sur un

substrat en céramique. Une couche intermédiaire de Ti de 50 nm d’épaisseur a été utilisée

pour améliorer l’adhésion de l’or sur le substrat. La largeur des doigts constituant les

électrodes interdigitées, ainsi que la distance entre elles est de 10 µm alors que leur longueur

est d’environ 1mm, ce qui permet d’avoir une zone sensible sur chacune des deux électrodes

d’environ 1mm2. Pour définir la partie sensible du capteur, la partie centrale a été couverte de

résine en époxyde [159].



Ici, c’est la phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris qui induit des réactions catalytiques

produisant des espèces ioniques aboutissant aux changements de conductivité mesurables

[201].


Les algues sont concentrées par centrifugation à 109 cellules/ml et mélangées à la

solution de nafion et 3mg de BSA avant dépôt sur la zone sensible de l’électrode. Les algues

phosphatase alcaline (PA) actives sur l’électrode de travail et les algues PA inactives sur

l’électrode de référence. Différentes membranes sont ainsi réalisées et testées pour des

pourcentages de nafion variant de 1 à10. Un ratio de 1% correspond à 1µl de Nafion, 3mg de

BSA et 100µl d’algues concentrées. Les capteurs sont enfin laissés à l’air ambiant pendant 10

minutes puis conservés dans le milieu de culture sans phosphate.

Notons enfin que plusieurs techniques basées sur l’immobilisation avec la membrane

Nafion ont été testées tel que le mélange nafion/algues en une ou plusieurs couches. Ces

méthodes se sont avérées inefficaces puisque la membrane se décollait à chaque fois.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 178

2.5 Mesure de l’APA

2.5.1 Mesures en bioessais

Les mesures sont basées sur la fluorescence détectée par un Spectrofluorimètre

(Fluostar, BMG). La réaction enzymatique utilisant le methylumbellifery phosphate (MUP)

comme substrat donne un produit fluorescent : la MUF MethylUmbelliFerone (MUF) qui est

facilement détectée par une fibre optique à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission

respectivement de 365 et 460 nm [75].

Les essais ont été réalisés dans des microplaques de 96 puits. Pour chaque

concentration huit réplicas ont été réalisés. Chaque puits contient le tampon Tris-HCl (pH 8.5,

0.1M) et la solution algale (80µL), le substrat est rajouté au dernier moment.

Les cinétiques enzymatiques tracées avec les biocapteurs conductimétriques seront comparées

avec celles obtenues en bioessais. Etant donné que les protocoles de mesure sont différents,

surtout pour les substrats utilisés (MUP et pNPP), les comparaisons porteront surtout sur

l’allure de la cinétique pour valider la méthode.

2.5.2 Mesures en biocapteur

Pour le biocapteur, les mesures conductimétriques sont basées sur une mesure

différentielle entre l’électrode de travail (sur laquelle sont déposées les algues

préconditionnées) et l’électrode de référence (sur laquelle sont déposées les algues non

préconditionnées). Grâce à un générateur, un signal d’excitation sinusoïdal de fréquence 100

kHz peut être appliqué aux deux électrodes excitatrices. Les signaux de sortie mesurés au

niveau des électrodes réceptrices dépendent, quant à eux de l’impédance du système. Dans le

domaine des hautes fréquences utilisées ici, l’impédance réelle est alors égale à la résistance

de la solution ce qui permet d’accéder à la conductance.




référence.


une cellule en verre de 2mL. Le biocapteur a été immergé dans du tampon Tris-HCl, pH 8.5



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 179

vigoureusement remué. Après stabilisation du signal, différentes quantités de substrat ont été

ajoutées dans la cellule de mesure. Le signal différentiel a été enregistré en utilisant

l'amplificateur synchrone SR830 (Stanford Research Systems).

3 Résultats

3.1 Observation microscopique

Figure 65 Observation microscopique des algues immobilisées dans une matrice BSA/Nafion sur une

électrode interdigitée, grossissement (× 400)

Les observations au microscope ont été réalisées après immobilisation et durant les

mesures pour s’assurer de la solidité des membranes constituées par les couches d’algues

immobilisées. L’observation microscopique montre que la membrane est bien solidaire de

l’électrode mais les algues ne sont pas réparties de manière homogène (Figure 65).

3.2 Détection de l’APA

La cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline a été mesurée en bioessais et les

résultats sont analogues à ceux présentés par la Figure 52.

Comme le montre les Figures 52 et 66, les mesures effectuées par le biocapteur à

algues immobilisées dans une matrice BSA/Nafion montrent une activité enzymatique du type

Michaelis–Menten comparable à celle obtenue en bioessais sur algues libres. Ceci permet de

valider l’utilisation des biocapteurs conductimétriques basés sur l’immobilisation de

Chlorella vulgaris dans une matrice BSA/Nafion pour la détection de l’APA.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 180

0

2

4

6

8

10

12

14

0 0,5 1 1,5 2

pNPP, mM

dS

, µ

S

Figure 66 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris mesurée en biocapteur


3.3 Inhibition de l’APA en bioessais

Pour vérifier l’effet du phosphate et du cadmium sur l’APA de Chlorella vulgaris

différentes concentrations ont été testées. Les Figures 67 et 68 montrent une corrélation

linéaire entre l’APA de Chlorella vulgaris d’une part et les différentes concentrations de

phosphate et de cadmium d’autre part. Plus la concentration est grande plus l’inhibition est

forte. L’utilisation du Nafion pour immobiliser les microalgues permettra de s’affranchir des

effets inhibiteurs du phosphate.

0

20

40

60

80

100

120

0,0010,010,1110

PO4, mg/l

AP

A r

ésid

uel

le, %

Figure 67 Effets du phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées en bioessais (100mM Tris–HCl,

pH 8.5)



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 181

0

20

40

60

80

100

16111621

Cd, µg/l

AP

A r

ésid

uel

le, %

Figure 68 Effets du cadmium sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées en bioessais (100mM Tris–HCl,

pH 8.5)

3.4 Optimisation de la sensibilité de détection du cadmium en biocapteur

La mise au point du biocapteur a nécessité de tester la concentration algale, le

pourcentage de nafion, le temps d’incubation dans le cadmium et la concentration du

substrat Ces différents paramètres seront déterminés de manière à obtenir la limite de

détection des ions cadmium la plus basse et la plus large gamme de détection.

Trois concentrations algales ont été testées en présence de trois concentrations de

cadmium pendant 60mn pour déterminer celle qui donne l’inhibition la plus grande comme le

montre la Figure 69. Nous remarquons que plus la concentration algale est élevée plus le

taux d’inhibition est faible surtout pour les faibles concentrations en cadmium. Ceci peut être

expliqué par le fait que pour de grandes concentrations algales et de faibles concentrations en

phosphates, les microalgues ne sont pas toutes en contact avec les ions cadmium ; il est donc

logique que l’inhibition soit moindre. L’observation la plus importante est l’activation de

l’APA à de très faibles concentrations en cadmium. Plusieurs auteurs ont pu mettre en

évidence cette activation avec la phosphatase alcaline surtout en présence de Cd2+

. Cela a pu

être expliqué par la stimulation des défenses cellulaires qui se traduit par une activation

enzymatique. Nous remarquons aussi que pour une même concentration algale et différentes

concentrations de cadmium la relation dose effet est respectée.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 182

0

20

40

60

80

100

120

1 5 20

Cd, µg/l

AP

Are

s, % 2,00E+06

8,00E+06

5,00E+07

Figure 69 Effets de la concentration algale concentration sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris

par cadmium mesurées par le biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)

Il a été constaté que la concentration du substrat (dans notre cas le pNPP) influe sur

la sensibilité de la mesure. La Figure 70 montre l’effet de la concentration du substrat sur la

sensibilité de la mesure de l’inhibition de l’APA en biocapteur. Deux concentrations de

substrat ont été testées : une faible concentration correspondant au démarrage de la réaction

enzymatique (0.1µM de pNPP) et une deuxième concentration saturante (0.8µM de pNPP). Il

semble qu’une faible concentration de substrat soit la plus adaptée pour la mesure de

l’inhibition de l’APA. Nous constatons qu’à de fortes concentrations en cadmium

l’inhibition est comparable avec les deux concentrations en substrat, tandis qu’à de faibles

concentrations en cadmium (3ppb) l’inhibition de l’APA est plus grande pour de faibles

concentrations en substrat (0.1µM de pNPP). Cela peut être expliqué par le fait que les algues

ne sont pas réparties sur une seule couche. En effet, une concentration plus importante en

substrat favoriserait la réponse des algues non inhibées situées à proximité des parties

conductrices de l’électrode. Ces algues non inhibées, surtout à de faibles concentrations en

cadmium, vont participer à diminuer l’inhibition globale du capteur.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 183

0

20

40

60

80

100

120

3 10 20

Cd, µg/l

AP

Are

s, %

0,1µM, pNPP

1,2µM, pNPP

Figure 70 Effets de la concentration du substrat sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris par

cadmium mesurées par le biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)

Dans ce travail les microalgues ont été immobilisées dans une membrane

Nafion/BSA. Il parait donc logique de tester différents ratios Nafion,BSA/algues. Pour cela

cinq ratios ont été testés et c’est la membrane à 3% de Nafion/BSA qui permet d’obtenir la

meilleure cinétique pour l’activité phosphatase Figure 71. Les ratios inférieurs à 3% donnent

une membrane trop fragile qui se désolidarise de l’électrode alors que pour un ratio de 10%

de nafion l’accès du substrat aux algues semble plus limité.

0

2

4

6

8

10

12

0 0,5 1 1,5 2

pNPP (µM)

dS

, µ

S

1%

3%

5%

7%

10%

Figure 71 Effets du ratio Nafion, BSA/Algues sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées par le biocapteur


Ces différentes membranes ont également été testées en présence de différentes

concentrations de phosphate (1µg / l à 10 mg / l). Il apparaît que la concentration en nafion

doit être au moins de 6% pour neutraliser l’action inhibitrice des phosphates (Figure 72). Le

capteur sera par conséquent réalisé avec des membranes à 6% de nafion.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 184

0

20

40

60

80

100

120

0,001 0,01 0,1 1 10

PO4, mg/l

AP

A r

es,

%

3%

4%

5%

6%

7%

8%

Figure 72 Effets du phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées par le biocapteur


Des mesures sont réalisées sur des solutions contenant en mélange des ions cadmium

et phosphate (Figure 73). Les résultats montrent que le taux d’inhibition de la phosphatase

(exprimée en pourcentage d’inhibition de l’activité du témoin) en présence d’ions cadmium

n’est pas modifié en présence de phosphate, quel qu’en soit la concentration et correspondent

parfaitement à ceux trouvées avec le cadmium tout seul.

0

20

40

60

80

100

0,0010,010,1110

PO4, mg/l

AP

Are

s, %

3ppb Cd

5ppb Cd

10ppb Cd

100ppb Cd

Figure 73 Effets du mélange Cadmium + phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris APA mesurées par le

biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)

Pour déterminer la durée minimale d’incubation des microalgues, ces dernières ont

été incubées dans le cadmium pendant 15, 30, 60 et 120 mn selon le protocole donné dans la

partie méthodes. La mesure de l’inhibition au cours du temps en présence d’une

concentration en cadmium de 100 ppb montre qu’un temps de contact minimum de 120 mn



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 185

est nécessaire pour obtenir une inhibition optimale. Néanmoins, étant donné la faible

différence entre les inhibitions obtenues en 60 et 120 minutes, nous retiendrons la durée de

60 minutes, durée satisfaisante pour un biocapteur dont la vocation est d’être un outil

d’alarme précoce (Figure 74).

0

20

40

60

80

100

120

temoin 15 30 60 120

temps, heures

AP

A r

ésid

uell

e,

%

Figure 74 Effets du temps sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris mesurés par le biocapteur


4 Conclusion

Dans ce travail, un biocapteur conductimétrique à cellules algales à été développé.

Les microalgues Chlorella vulgaris ont été immobilisées dans une membrane Nafion/BSA.

Ce biocapteur est relativement fiable et simple d’utilisation. Etant de faible coût, cet outil

permettra de suivre en continu les concentrations de cadmium dans différents milieux. Ce

biocapteur peut être utilisé comme un outil d’alerte précoce pour la contamination par les

métaux lourds, il semble particulièrement intéressant pour la détection du cadmium. Les

essais sur des échantillons naturels sont en cours d’investigation.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 186

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 187

Chapitre VI Etude préalable au développement d’un biocapteur conductimétrique à cellules algales pour le monitoring des

milieux salins

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 188

Résultats Etude préalable au développement d’un biocapteur conductimétr ique

à cellules algales pour le monitoring des milieux salins

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 189

1 Introduction

Les milieux salins (lagunes, deltas, côtes…) sont particulièrement vulnérables aux

pollutions du fait que la majorité des affluents continentaux y sont déversés. Les biocapteurs

constituent donc également des outils intéressants pour leur surveillance. C’est pourquoi nous

avons choisi de faire évoluer et d’adapter au milieu marin les sytèmes mis au point sur les

eaux douces.

Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un programme national de recherche (EC2CO)21

et

l’objectif principal de ce travail est de déterminer la toxicité des phytosanitaires les plus

fréquemment rencontrés dans les étangs et les milieux marins côtiers et de déterminer les

techniques les mieux adaptées à leur détection en milieu naturel. Pour cela, deux molécules

modèles sont étudiées : le diuron et le glyphosate. Cette toxicité sera étudiée sur plusieurs

espèces de micro algues unicellulaires représentatives des milieux marins. Suite à des travaux

préalables à cette étude, nous nous sommes intéressés exclusivement à l’activité estérase des

microalgues marines comme bioindicateur de toxicité aux pesticides.

Le second objectif de cette étude est de suivre ces algues immobilisées par différents

procédés, pour déterminer si l’immobilisation elle-même n’a pas trop d’effets sur les algues,

dans le but d’une éventuelle adaptation et utilisation en biocapteurs in situ et en continu dans

les milieux naturels. Il est nécessaire avant tout de déterminer les souches les plus sensibles et

les plus adaptées à être utilisées en biocapteurs.

2 Les souches utilisées

Le choix d’une souche de microalgues pour effectuer des tests en écotoxicologie doit

répondre à plusieurs critères : représentativité de l’espèce dans le milieu d’analyse, résistance

et stabilité de l’organisme, utilisation éventuelle dans les tests standardisés.

21

Le programme de recherche Ecosphère Continentale et Côtière dont l’objectif est d’étudier l’impact

environnemental de produits phytosanitaires sur les lagunes côtières.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 190

Les organismes retenus pour mener l’étude doivent également présenter une sensibilité

suffisante aux différents toxiques que nous allons tester ici. Des travaux préalables [205, 206]

menés au LSE nous ont permis de nous orienter vers deux espèces fréquemment utilisées :

Dunaliella tertiolecta (Dt),

Phaeodactylum tricornitum (Pt)

Le milieu d’étude étant les lagunes côtières, nous nous sommes orientés vers une

troisième souche représentative des milieux lagunaires.

Ostreococcus tauri (Ot)

Cette souche a été découverte dans la lagune de Thau (notre milieu d’étude) en 1995 et

quelques travaux seulement sur cette microalgue ont pu être réalisés.

Les algues marines sont entretenues au laboratoire comme indiqué dans la partie matériels et

méthodes.

3 Détection de l’AE chez les algues marines en bioessais

La mesure de l’activité estérase chez les algues marines a été réalisée tout d’abord

avec un protocole semblable à celui de Chlorella vulgaris. Nous avons remarqué qu’aucune

activité n’a pu être enregistrée. Nous avons essayé de modifier les paramètres de mesure et

nous nous sommes aperçu que l’activité estérase des algues marines ne peut être mesurée

qu’en absence de tampon. Ceci peut être dû à la force ionique liée à la présence du tampon.

En effet, les activités estérases sont sensibles à la force ionique [26, 74]. Les résultats obtenus

sont présentés par la Figure 75. Nous remarquons que l’allure des courbes est michaelienne et

que l’amplitude de la fluorescence est proportionnelle à la taille des souches. Notons

qu’aucun tampon n’a été utilisé car nous avons remarqué que son utilisation induit une baisse

considérable de l’activité. Ceci peut être dû à la variation de la force ionique, paramètre

important pour la mesure de l’AE.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 191

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 2 4 6 8 10 12 14

FDA, µM/l

Flu

ore

sc

en

ce,

UA

Ot

Pt

Dt

Figure 75 AE des algues marines

L’AE a été suivie au cours du temps pour savoir le moment le plus opportun pour

réaliser les tests de toxicité. En effet, plus l’activité est grande plus les effets sur l’activité sont

visibles. Les mesures ont été effectuées aux jours 3, 4, 5 et 6 de la croissance des algues Dt et

Pt (culture de 3jours) et aux jours 1, 2, 3 et 4 pour l’algue Ot (culture de 1jour). Un

dénombrement cellulaire a également été réalisé pour mesurer l’activité enzymatique

spécifique et nous permettre de mener la comparaison sur plusieurs jours.

Etant donné que les activités des trois souches sont différentes, nous les avons représentées

dans deux figures distinctes.

0,00E+00

5,00E-12

1,00E-11

1,50E-11

2,00E-11

2,50E-11

3,00E-11

1 2 3 4

temps de suivi, jours

Flu

ore

scen

ce/m

n/c

ellu

le

Pt

Dt

Figure 76 AE des algues Dt et Pt au cours du temps ; FDA 3,3 µM/l



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 192

0,00E+00

5,00E-15

1,00E-14

1,50E-14

2,00E-14

2,50E-14

1 2 3 4

temps de suivi, jours

flu

ore

scen

ce/m

n/c

ell

ule

Figure 77 AE de l’algue Ot au cours du temps ; FDA 3,3 µM/l

Chez les trois souches, le suivi de l’activité montre une décroissance au cours du

temps. Un viellissement des souches n’est donc pas favorable à l’étude de l’évolution de l’AE

par exemple pour des tests de toxicité. Il est à noter toutefois que cette décroissance est

rassurante quant à la contamination des algues par des bactéries. En effet, si les activités

bactériennes prédominaient sur celles des algues, l’activité serait croissante au cours temps

car leur nombre serait également croissant. Etant donné cette décroissance au cours du temps,

il est donc préférable de travailler avec des cultures fraîchement repiquées (2 à 3 jours).

La croissance initiale chez Ot (Figure 77) peut s’expliquer par le fait qu’une pèriode

de latence soit nécessaire pour que les algues retrouvent une activité normale suite au stress

subi lors du repiquage. Les valeurs de l’AE chez Ot restent respectivement prêt de 100 fois et

1000 fois inférieurs aux activités des souches Pt et Dt, ce qui peut s’expliquer soit par la

différence de taille entre les algues soit par la différence des activités intrinsèques entre les

souches.

4 Effets de différents pesticides sur l’AE des algues marines

L’objectif de cette étude est de déterminer la toxicité des principaux pesticides

rencontrés sur les zones côtières et lagunaires. Cette toxicité sera étudiée à travers les effets de

deux pesticides modèles (diuron et glyphosate) sur l’activité estérase de trois algues



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 193

représentatives du milieu étudié. Les produits de dégradation du diuron seront testés ainsi

qu’une solution commerciale de désherbant à base de glyphosate (Round Up®).

Cette étude doit également permettre de faire ressortir les souches les plus sensibles aux

différents polluants testés pour être réutilisées dans la conception d’un biocapteur adapté au

milieu marin.

4.1 Effets du glyphosate sur l’AE des algues marines

La bibliographie [207] fait référence à des produits de photodégradation du glyphosate

qui pourraient jouer un rôle dans sa toxicité, c’est pourquoi nous avons réalisé deux séries de

mesures : une série à la lumière et une deuxième à l’obscurité.

Les tests de toxicité ont été réalisés avec une concentration en substrat (FDA) de

1.3μM/l et sur des concentrations en glyphosate allant de 1mg/l, à 0.001mg/l.

0

20

40

60

80

100

120

140

temoin 1 0,1 0,01 0,001 0,0001

glyphosate, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 78 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Dt à la lumière

0

20

40

60

80

100

120

140

160

temoin 1 0,1 0,01 0,001 0,0001

glyphosate, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 79 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 194

En étudiant les figures ci-dessus, nous pouvons voir que pour des temps ne dépassant

pas 24h, le glyphosate ne présente pas de réelle toxicité pour l’algue. Nous pouvons toutefois

noter deux activations à 24h et à l’obscurité.

Nous pouvons voir que le glyphosate se révèle très toxique pour les algues (avec des

inhibitions allant jusqu’à plus de 60% à fortes concentrations.) seulement à la lumière. Nous

pouvons noter un seuil de 0.001mg/l, qui est la concentration après laquelle le glyphosate ne

produit plus d’inhibition. A l’obscurité, le polluant entraine des activations pouvant aller

jusqu’à 40%.

Le polluant ayant des effets différents à la lumière et à l’obscurité, il est possible qu’il

interagisse avec les rayons lumineux. Cette remarque va dans le sens de la formation de

produits de photo-dégradation qui seraient encore plus toxiques pour les algues que le

glyphosate lui-même.

La toxicité du glyphosate qui n’apparaît que très tardivement peut être due au fait que le

polluant a du mal à pénétrer les cellules. C’est notamment pour cette raison que des adjuvants

sont ajoutés au Round Up® dont le glyphosate est le principe actif.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

temoin 1 0,1 0,01 0,001 0,0001

glyphosate, ppm

AE

ré

sid

ue

lle

, %

2h

24h

48h

Figure 80 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Pt à la lumière



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 195

0

20

40

60

80

100

120

140

temoin 1 0,1 0,01 0,001 0,0001

glyphosate, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 81 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité

Au vu des résultats des tests de toxicité sur la souche Pt, nous pouvons remarquer que

comme précédemment, le glyphosate a peu d’effet à court terme : seules quelques petites

activations peuvent être notées suivant les concentrations.

Nous pouvons voir que des inhibitions importantes (jusqu’à 55% d’inhibition) font leur

apparition à partir de 24h d’exposition à la lumière comme à l’obscurité. Il n’est donc pas

possible de tirer de conclusions sur les effets de la lumière. Mais en contrepartie, ceci

confirme les difficultés du polluant à rentrer dans les cellules.

A la lumière, le glyphosate semble atteindre un seuil de toxicité pour les algues à partir de

0.01mg/l : pour des concentrations supérieures, la toxicité n’augmente pas.

A l’obscurité, les toxicités mesurées sont plus fortes qu’à la lumière avec un maximum de

toxicité atteint pour une concentration de 0.01mg/l.

Il est difficile de tirer des conclusions au vu de ces résultats. Il est nécessaire de refaire ces

mesures pour les valider et pouvoir se prononcer sur d’éventuels seuils de toxicité.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

temoin 1 0,1 0,01 0,001 0,0001

glyphosate, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 82 : Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Ot à la lumière



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 196

L’algue Ot réagit comme les deux autres après un faible temps d’exposition, à savoir, pas de

toxicité importante. Une activation non négligeable peut être notée pour une concentration de

0.1mg/l de polluant.

Encore une fois, à 48h, le glyphosate prend un caractère très toxique (allant jusqu’à 80%

d’inhibition). L’algue semble réagir par une réponse « oui/non », c'est-à-dire que la toxicité ne

semble pas dépendante de la concentration en polluant.

Ce temps de latence précédent l’apparition d’une toxicité peut, comme précédemment, être

rattaché à l’apparition de produits de photo-dégradation et/ou à une difficulté du toxique à

pénétrer dans les cellules.

Des mesures de la toxicité du Round Up® faites par la suite vont également pouvoir nous

éclairer sur les résultats que nous avons obtenus, et notamment les difficultés que semble

avoir le polluant à rentrer dans les cellules.

Des études de toxicité des produits de photo-dégradation du glyphosate pourraient

également éclaircir ce point.

4.2 Effets du Round Up® sur l’activité estérase des algues marines

Les essais de toxicité du Round Up® sont à mettre en relation avec ceux effectués sur

le glyphosate. En effet, le Round Up® utilise le glyphosate comme principe actif auquel sont

ajoutés des adjuvants qui permettent une meilleure pénétration dans les cellules.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

temoin C=30ml/l C/10 C/10E2 C/10E3 C/10E4 C/10E5 C/10E6

round up, ml/l

AE

rés

idu

ell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 83: toxicité du round up sur algues Dt libres à la lumière



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 197

0

100

200

300

400

500

tem

oin

C=30

ml/l

C/1

0

C/1

0E2

C/1

0E3

C/1

0E4

C/1

0E5

C/1

0E6

round up, ml/l

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 84 : toxicité du Round Up® sur algues Dt libres à l’obscurité

0

100

200

300

400

500

600

temoin C=30ml/l C/10 C/10E2 C/10E3 C/10E4 C/10E5 C/10E6

round up, ml/l

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 85 : toxicité du round up sur algues Pt libres à la lumière



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 198

0

100

200

300

400

500

600

tem

oin

C=30

ml/l

C/1

0

C/1

0E2

C/1

0E3

C/1

0E4

C/1

0E5

C/1

0E6

round up, ml/l

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 86: toxicité du round up sur algues Pt libres à la lumière

Ces résultats nous permettent de voir que comme voulu par les fabricants, le Round

Up® a une action immédiate sur les algues. Le temps de latence que nous avons mis en

évidence avec le glyphosate seul est supprimé. En effet, pour de fortes concentrations le

Round Up® présente des inhibitions proches de 100% dès deux heures d’exposition.

Suivant les concentrations utilisées, le Round Up® provoque chez les algues une inhibition ou

une activation qui indique sa toxicité. C’est seulement une fois que la solution préconisée par

les fabricants est diluée un million de fois qu’elle commence à avoir des effets moins nocifs,

bien que des effets soient tout de même visibles pour des temps d’expositions plus long.

Nous pouvons noter quelques différences entre le comportement du Round Up® à la lumière

et à l’obscurité. Des différences existent même entre les deux souches étudiées. Nous pouvons

dire que pour l’algue Dt, la toxicité se traduit principalement à la lumière par des inhibitions

tandis que ce sont des activations qui sont mesurables à l’obscurité. Le Round Up® a

exactement l’effet inverse sur l’algue Pt, sauf à fortes concentrations où les effets sont

identiques pour l’ensemble des souches et des conditions.

Ces essais nous permettent de confirmer en partie les remarques formulées lors de l’étude du

glyphosate quant à sa difficulté de pénétration dans les cellules ou à l’apparition de produits

de photodégration eux même toxiques.

Il est toutefois nécessaire de mener de nouveaux essais sur les adjuvants du Round

Up® pour s’assurer que ce ne sont pas eux qui sont responsables des résultats obtenus.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 199

4.3 Effets du diuron et de ses produits de dégradation sur l’AE

Les essais de toxicité du diuron et de deux de ses produits de dégradation ont été

réalisés sur deux souches d’algues marines : Pt et Dt. Les concentrations des xénobiotiques

varient de 0.005ppm à 5ppm et les essais ont été réalisés suivant le protocole donné par la

partie matériels et méthodes. Etant donné que le diuron et ses produits de dégradation ne sont

pas des molécules stables et peuvent se dégrader en présence de lumière, des essais à la

lumière et à l’obscurité ont été réalisés.

4.3.1 Effets sur l’AE de l’algue Dt

La Figure 87 présente les effets du diuron sur l’AE de l’algue Dt à lumière. Nous

remarquons deux relations dose-effet d’une part entre la concentration du diuron et l’AE

résiduelle et d’autre part entre le temps d’incubation et l’AE résiduelle pour une même

concentration de diuron. Les limites de détection sont de 0,5ppm à 2h, de 0,05ppm à 24h et de

0,005 ppm à 48h. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus avec la souche d’algue d’eau

douce Chlorella vulgaris.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

diuron, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24

48

Figure 87 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Dt à la lumière

Contrairement à ce qui a pu être observé à la lumière, le diuron n’a pas le même effet à

l’obscurité. En effet aucune relation dose-effet n’a pu être décelée ni par rapport à la

concentration du diuron ni par rapport au temps d’exposition. Il paraît aussi d’après la Figure

88 que l’inhibition de l’AE est totalement indépendante de la concentration du substrat et du



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 200

temps d’incubation. Pour ces deux paramètres l’inhibition reste constante autour de 20%. Vu

les résultats, nous pouvons évoquer l’hypothèse de l’existence de produits de dégradation qui

se forment exclusivement à lumière et qui ont un effet sur l’AE de l’algue Dt.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

diuron, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 88 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité

Le premier produit de dégradation du diuron testé est le DCPU [N-(3,4

dichlorophényl)-urée (DCPU)]. A la lumière (Figure 89) il paraît que le DCPU n’a pas une

grande influence sur l’AE de l’algue Dt. Néanmoins quelques constatations peuvent être

faites : les effets à 48 heures sont globalement inferieurs à ceux obtenues à 2h et à 24h.

Remarquons aussi qu’à fortes concentrations en DCPU, l’inhibition à 2h est légèrement plus

importante que les deux autres temps de contact surtout à fortes concentrations, ce qui peut

suggérer que cette molécule à un effet instantané qui s’estompe au cours du temps. Ceci

pourrait être vérifié en raccourcissant les intervalles entre les temps de contact.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 201

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPU, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 89 Effets du DCPU su l’AE de l’algue Dt à la lumière

A l’obscurité (Figure 90), le DCPU provoque une inhibition maximale à 2 heures

d’exposition sur toute la gamme de concentration. Ceci confirme l’hypothèse donnée

précédemment et nous indique que cette molécule agit instantanément et l’inhibition diminue

au cours du temps. Si cette hypothèse est vraie, nous pouvons supposer que cette molécule ne

rentre pas dans la cellule puisque c’est des enzymes membranaires qui sont considéré dans

cette étude.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPU, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 90 Effets du DCPU sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité

Le deuxième produit de dégradation du diuron testé est le DCPMU [N-(3,4

dichlorophényl)-N-(méthyl)-urée (DCPMU)]. A la lumière (Figure 91), le DCPMU inhibe



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 202

l’AE sur toute la gamme de concentrations utilisées pour des durées d’exposition de 2 heures,

pour les autres temps de contact aucune inhibition significative n’a été observée. Les mêmes

hypothèses et conclusions que pour le DCPU peuvent être alors formulées. A l’obscurité

(Figure 92) aucune inhibition significative n’a pu être observée.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPMU, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 91 Effets du DCPMU sur l’AE de l’algue Dt à la lumière

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPMU, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 92 Effets de DCPMU sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité

4.3.2 Effets sur l’AE de l’algue Pt

Le diuron et ses deux produits de dégradation ont été testés comme précédemment sur

l’algue Pt. A la lumière (Figure 93) et comme pour l’algue Dt, le diuron provoque une



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 203

inhibition de l’AE sur toute la gamme de concentration avec une relation dose-effet entre le

temps d’exposition et l’AE résiduelle. La relation dose-effet entre le temps d’incubation et

l’AE résiduelle est moins franche que dans le cas de l’algue Dt. Les limites de détection avec

l’algue Pt restent comparables à celles obtenues avec l’algue Dt.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

diuron, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 93 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Pt à la lumière

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

diuron, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 94 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité

A l’obscurité, mis à part pour les temps de contact de 24h, la réponse de l’AE paraît

indépendante de la concentration en diuron, et les taux d’inhibition, comme pour l’algue Dt,



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 204

se situent autour de 20%. La différence de la réponse de l’AE à la lumière et à l’obscurité

laisse, encore une fois, penser qu’il existe un phénomène de photodégradation du diuron

responsable des effets sur l’AE. Les inhibitions à l’obscurité, quant à elles, peuvent être liées

à l’effet du diuron lui même sur les microalgues.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPU, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 95 Effets du DCPU sur l’AE de l’algue Pt à la lumière

A la lumière (Figure 95), le DCPU provoque une réponse instantanée et qui décroît au

cours du temps pour la même concentration en DCPU. Aucune relation dose-effet n’a pu être

observée. Encore une fois, les niveaux d’inhibition restent constants autour de 20%. A

l’obscurité (Figure 96), aucune inhibition significative n’est à signaler et les mêmes

remarques que pour la souche d’algues Dt peuvent être formulées.

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPU, ppm

AE

résid

uelle, %

2h

24h

48h

Figure 96 Effets du DCPU sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 205

Les effets du DCPMU sur l’algue Pt à la lumière sont illustrés par la Figure 97 . Nous

remarquons que les relations dose-effet entre les trois paramètres (AE résiduelle,

concentration du DCPMU et le temps d’exposition) sont respectées. Des inhibitions

maximales sur l’ensemble des essais réalisés ont été obtenues avec ce produit de dégradation

du diuron. L’hypothèse que nous avons émise concernant la rentrée du DCPMU dans la

cellule pour l’algue Dt n’est plus valable. En effet, les inhibitions observées sur l’AE de

l’algue Pt persistent dans le temps et nous pouvons émettre l’hypothèse suivante pour l’algue

Pt : le DCPMU rentre dans la cellule et inhibe l’ensemble du métabolisme de l’algue et

entraine une inhibition avec une relation dose-effet. Nous pensons que c’est la nature de la

membrane cellulaire qui peut favoriser la rentrée ou non du DCPMU dans la cellule. En effet,

contrairement à l’algue Dt qui est une algue verte à membrane squelettique, l’algue Pt est une

diatomée avec une membrane de cellulose imprégnée de silice pure. Notons enfin qu’à

l’obscurité, les inhibitions sont globalement non significatives (Figure 98).

0

20

40

60

80

100

120

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPMU, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 97 Effets du DCPMU sur l’AE de l’algue Pt à la lumière



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 206

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,005 0,05 0,5 5

DCPMU, ppm

AE

résid

uell

e,

%

2h

24h

48h

Figure 98 Effets du DCPMU sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité

5 Mesure de l’AE des algues marines en biocapteur

conductimétrique

Les essais en biocapteurs ont été réalisés suivant le protocole décrit par la partie

méthodes. Les algues ont été immobilisées sur la surface des microélectrodes interdigitées en

or par la BSA et réticulées par le glutaraldéhyde. Seuls des essais sur le glyphosate avec les

souches Pt et Ot et sur le diuron avec les algues Dt et Pt ont pu être réalisés.

Nous pouvons noter que l’activité estérase suit une cinétique de type mickaelienne (Figure

99). Notons également une inhibition par excès de substrat qui apparaît ici pour des

concentration supérieures à 5mM.

L’activité reste identique quand elle est mesurée à deux instants (t et t+16h). Les

mesures de toxicité pourront donc être menées et les variations d’activité pourront être

imputées aux toxiques auxquelles les algues auront été exposées.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 207

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8

acétylcholine, mM

dS

, µS t=0

t+16h

Figure 99 : Témoin de l'AE : algues Dt immobilisées sur microélectrodes. Mesures faites à t=0 et t+16h

0

20

40

60

80

100

120

temoin 1 0,1 0,01

glyphosate, ppm

AE

résid

uelle, %

Pt

Dt

Figure 100 Effets du glyphosate sur l’AE des algues Pt et Dt en biocapteur conductimétrique,

acétylcholine 2mM, temps de contact 24h

Les essais en biocapteurs montrent des inhibitions significatives à fortes

concentrations en glyphosate pour les deux souches étudiées (Figure 100). Une seule

excitation a pu être mesurée avec la concentration de 0.01ppm avec la souche Dt. Ces

résultats sont intéressants dans la mesure où nous avons pu mesurer l’AE en biocapteur

conductimétrique et quelques effets du glyphosate sur cette activité enzymatique.

Les essais réalisés sur la toxicité du diuron en biocapteur conductimétrique (Figure 101)

montre des inhibitions significatives de l’AE des deux algues Pt et Dt sur toute la gamme de

concentration utilisée. Ces inhibitions sont largement supérieures à celles obtenues en

bioessais. Ceci est dû probablement à la quantité d’algues immobilisées qui est largement

inferieure à celle utilisée en bioessais.



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 208

0

20

40

60

80

100

120

témoin 0,042 0,42 4,2

diuron, ppm

AE

résid

uell

e,

%

Dt

Pt

Figure 101 Effets du diuron sur l’AE des algues Pt et Dt en biocapteur conductimétrique, acétylcholine

2mM, temps de contact 24h

Ce modèle de biocapteur mérite d’être mis au point pour améliorer la sensibilité et la

sélectivité en faisant varier les paramètres d’étude : la concentration du substrat, la charge

algale, le ratio algues/BSA, le temps de contact, la durée de vie et la réversibilité.

6 Conclusion

Le but de cette partie était de trouver des biomarqueurs pertinents pour la détection

des pesticides les plus rencontrés dans les milieux côtiers et lagunaires et d’essayer de

développer un biocapteur qui pourra être utilisé en continu et sur site.

La première étape était de choisir des biomarqueurs en adéquation avec les

caractéristiques spécifiques tel que la représentativité du milieu d’étude, la résistance, la

sensibilité à certains polluants.

Les souches retenues était des algues unicellulaires à savoir : Dunalielle tertiolecta

(Dt), Phaeodactylum tricornitum (Pt) et Ostreococcus tauri.

Lors de cette étude deux activités enzymatiques ont été testées, l’activité phosphatase

alcaline et l’activité estérase. Des études antérieures ont montré que l’activité phosphatase

alcaline n’était pas sensible aux pesticides, c’est donc pour cette raison que seule l’activité

estérase a été étudiée ici. Cette activité a été mesurée pour les trois souches et a montré un

comportement mickaëlien en bioessais en microplaques. La deuxième constatation est que

cette activité décroit au cours du temps. Ceci implique que le biocapteur basé sur la mesure de

cette activité aura une stabilité réduite à quelques jours, sauf si nous pouvons montrer que



___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 209

dans des conditions particulières de conservation nous pouvons stabiliser cette activité et

rendre le biocapteur plus performant.

Les essais de toxicité ont été réalisés sur deux pesticides modèles : le glyphosate et le

diuron. Deux produits de dégradation du diuron ainsi qu’une solution commerciale contenant

le glyphosate ont également été testés. Ces essais ont été réalisés à l’obscurité et à la lumière

Les effets du glyphosate sur l’AE des trois souches ont été globalement identiques :

une inhibition tardive (48h) à lumière et des activations à l’obscurité. L’hypothèse qui a pu

être émise est que le glyphosate a du mal à pénétrer dans la cellule. Ces essais réalisés avec le

round up ne font que confirmer ces résultats. En effet, ce désherbant agit immédiatement et

inhibe l’AE sur toute la gamme de concentration testée. Ce résultat admet deux hypothèses :

soit les adjuvants permettent au glyphosate de rentrer dans le cellule soit les adjuvants sont la

cause de l’inhibition immédiate de l’AE. Dans tous les cas des essais sur la toxicité des

adjuvants doivent être réalisés pour pouvoir interpréter les résultats obtenus.

Les effets du diuron et de ses produits de dégradation ont été testés sur deux souches

algales : Dt et Pt.

Pour l’algue Dt , le diuron inhibe l’AE avec des relations dose-effet à la lumière. A

l’obscurité, le niveau d’inhibition n’est fonction ni de la concentration du toxique ni de temps

d’exposition. Le DCPU et le DCPMU, quant à eux, n’agissent qu’à des temps d’exposition

réduit (2h) et l’effet s’estompe au cours du temps.

Pour l’algue Pt, les mêmes conclusions pour le diuron et le DCPU ont pu être

formulées. La seule différence est que pour le DCPMU, l’inhibition persiste au cours du

temps et nous avons émis l’hypothèse que cette molécule rentre dans la cellule pour des

raisons liées à la constitution de la membrane cellulaire. Pour confirmer ou infirmer cette

hypothèse, des essais complémentaires doivent être réalisés. Nous pensons , par exemple, à

marquer la molécule toxique par un fluorophore et de suivre son comportement vis à vis de la

cellule algale.

Le biocapteur conductimétrique développé lors de cette étude est basé sur la mesure

de l’AE des microalgues immobilisées sur des microélectrodes interdigitées. Les premiers

résultats ont montré qu’il est possible de mesurer l’AE avec cet outil et que les niveaux

d’inhibition obtenus sont supérieurs à ceux trouvés en bioessais. Il est à noter enfin que ce

biocapteur est un prototype à améliorer et à mettre au point.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 210

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 211

Chapitre VII Conclusions générales et perspectives de recherche

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 212

Conclusions générales et perspectives de recherche

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 213

1 Conclusions générales

Ce travail présente le développement de biocapteurs à cellules algales destinés au

contrôle in situ de la qualité des milieux aquatiques. Il contribue ainsi au développement

d’outils de surveillance capables de détecter rapidement la présence de contaminants

chimiques pouvant être délétères pour les écosystèmes aquatiques d’eaux douces et marines.

Ce travail a été réalisé selon les quatre phases suivantes :

Sélection des biorécepteurs les plus adaptés pour la détection de polluants dans les

milieux aquatiques. Ces biorécepteurs ont été sélectionnés grâce à des travaux

précédents réalisés au LSE. Il s’agit d’une algue unicellulaire d’eau douce : Chlorella

vulgaris ainsi que trois espèces d’algues marines.

Etude des effets de familles de polluants sur les cellules algales en bioessais en

microplaques permettant de réaliser de nombreux réplicats et de mieux comprendre

les effets des polluants sur les algues.

Mise au point de techniques d’immobilisation des microalgues. Cette étape est

cruciale pour avoir un signal détectable, pour laisser accessible les polluants et les

réactifs pour les cellules et pour améliorer la répétabilité et la reproductibilité des

résultats.

Mise au point sur le biocapteur et détermination des limites de détection pour chaque

polluant.

Lors de ce travail, deux milieux d’étude ont été considérés. Les milieux d’eau douce pour

lesquels nous avons choisi la microalgue Chlorella vulgaris comme bioindicateur de toxicité

et les milieux salins, dans ce cas trois souches d’algues marines ont été utilisées.

Pour l’évaluation de la toxicité de certaines familles de polluants sur les milieux d’eau

douce, deux biomarqueurs ont été choisis : l’activité phosphatase alcaline et l’activité

estérase. Ces deux enzymes sont membranaires et permettent donc une détermination de


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 214

l’activité en un temps assez court (<20 minutes). Les résultats obtenus ont montré que l’APA

est sensible à la présence de métaux lourds (Cd, Zn et Pb) avec des effets variables suivant le

métal considéré, sa concentration et le temps d’incubation. Le cadmium s’est avéré être le

métal ayant le plus d’effets sur l’APA avec une limite de détection de 5ppb tandis que le

plomb est le métal qui induit le plus faible effet. Ainsi, l’APA semble être un biomarqueur

intéressant pour l’évaluation de la toxicité liée aux métaux lourds. Les résultats obtenus ont

permis d’obtenir des limites de détection plus faibles que dans les travaux réalisés au

préalable [26]. Les essais réalisés sur l’AE de Chlorella vulgaris ont montré que cette activité

est sensible à la présence de pesticides. Ce biomarqueur paraît très intéressant pour la

détection de pesticides dans les milieux d’eau douce.

Pour la détection en milieu salin trois souches ont été retenues : Pt, Dt et Ot. Un seul

biomarqueur a été testé, l’AE étant donné que les polluants étudiés sont des pesticides. En

effet, les travaux précédents ont montré que l’activité estérase est sensible à la présence de

produits phytosanitaires.

Les essais ont été réalisés sur deux molécules modèles : le diuron et le glyphosate. Deux

produits de dégradation du diuron ainsi qu’un produit commercial (dont le glyphosate est le

principe actif) : le Round up, ont également été testés.

Les résultats ont montré que l’AE des algues marines est sensible à la présence de ces

polluants avec des effets différents suivant le temps de contact et la présence ou l’absence de

lumière.

Tous ces résultats obtenus en bioessais ont été exploités pour la mise au point de biocapteurs

optiques et conductimétriques basés sur les activités enzymatiques des microalgues.

Les biocapteurs

Pour la détection de métaux lourds

Lors de cette étude deux biocapteurs conductimétriques basés sur la mesure de l’APA

de Chlorella vulgaris pour la détection des métaux lourds dans les milieux d’eau douce ont

été développés. Le premier basé sur l’immobilisation de Chlorella vulgaris par le biais de

couches monoassemblées (SAMs). Cette technique a permis d’améliorer la répétabilité et la

reproductibilité des mesures ainsi que les limites de détection. Notons l’originalité de ce

résultat : en effet, c’est la première fois que des algues sont immobilisées par des couches


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 215

SAMs ; ainsi cette méthode peut permettre d’ouvrir de nouveaux horizons quant à la détection

des polluants par le biais des cellules algales.

Le deuxième biocapteur a été développé dans le but de s’affranchir des effets du phosphate

sur l’APA de Chlorella vulgaris. En effet le milieu naturel contient des ions phosphates qui

inhibent l’APA de Chlorella vulgaris. Cette inhibition peut donc interférer avec la détection

des métaux lourds, ce qui rend le capteur inutilisable pour des applications au milieu naturel.

C’est pour tenter d’apporter une solution à ce problème que nous avons développé le

biocapteur basé sur l’utilisation d’une membrane Nafion ; les résultats de nos travaux ont

abouti à la conception d’un capteur capable de détecter la présence de métaux lourds en

présence de phosphates. En effet la membrane Nafion est chargée négativement et repousse

les ions phosphates également chargés négativement. De cette façon, il n’y a que les métaux

lourds qui agissent sur l’APA de Chlorella vulgaris.

Pour la détection d’ions phosphates

Nous avons utilisé la propriété inhibitrice du phosphate pour l’APA pour concevoir

un capteur capable de détecter la présence du phosphate. Il s’agit d’un biocapteur

conductimétrique basé sur la mesure de l’APA de Chlorella vulgaris immobilisée par la BSA

réticulée au glutaraldéhyde. Notons que ce capteur pourra fonctionner en présence d’ions

métalliques. En effet des études antérieures ont montré que la BSA (permettant

l’immobilisation des algues), fixe les ions métalliques qui de ce fait ne sont plus inhibiteurs

pour l’enzyme. Plusieurs mises au point ont été réalisées comme la concentration du substrat,

le ratio BSA/algues et la concentration algale. La réversibilité ainsi que la stabilité du

biocapteur ont été étudiées. Les résultats montent que cet outil peut être réutilisé et qu’il est

stable pendant trois semaines. Ce dispositif à une gamme de détection allant de 0.4 à 800µM

avec une limite de détection de 0.4µM de phosphate. Comparé à d’autres biocapteurs, le

dispositif mis au point a une gamme de détection plus large et une limite de détection plus

basse [187, 195].

Nous disposons ainsi de deux capteurs différents : le premier destiné à la détection des métaux

lourds et le deuxième à celle des phosphates. Ces deux systèmes peuvent être

complémentaires pour la surveillance des milieux.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 216

Pour la détection des pesticides

Deux prototypes de biocapteurs pour la détection de pesticides ont été présentés. Le

premier est un biocapteur optique pour la détection en eau douce, il est basé sur la mesure de

l’AE de Chlorella vulgaris en mode FIA. Les premiers résultats sont encourageants,

cependant les mises au point devront être poursuivies. Le deuxième est un biocapteur

conductimétrique basé sur la mesure de l’AE de souches d’algues marines et comme pour le

premier les premiers résultats sont satisfaisants et des améliorations sont nécessaires.

2 Perspectives de recherche

Au vu des résultats obtenus nous proposons quelques voies de réflexion pour la

poursuite de ce travail.

2.1 Mieux comprendre le mécanisme d’action des polluants

Lors de cette étude, les biorécepteurs utilisés ont été considérés comme des « boites

noires ». Ainsi aucune étude n’a été réalisée sur le mécanisme d’action des polluants sur les

cellules algales. En mettant l’accent sur l’aspect mécanistique, nous pourrions mieux

interpréter les résultats obtenus. Ceci peut être réalisé de plusieurs manières ; nous pouvons

envisager de marquer les molécules de polluants par un traceur fluorescent par exemple et de

les suivre dans la cellule algale. Nous pouvons aussi envisager d’isoler les enzymes

(phosphatases alcalines et estérases) et de faire des essais comparatifs de toxicité entre les

enzymes pures et les cellules entières. Ainsi nous pourrions mieux comprendre les

mécanismes d’inhibition en différenciant les mécanismes directs (dans ce cas la cible du

polluant est l’enzyme) des mécanismes indirects (le polluant agit sur le métabolisme général

de l’enzyme et dans ce cas l’inhibition de l’enzyme membranaire est une conséquence de la

perturbation engendrée).

2.2 Etude de nouveaux bioindicateurs et biomarqueurs

Chlorella vulgaris apparaît dans ce travail être un bioindicateur de toxicité

particulièrement adapté à la détection de métaux lourds, de pesticides et d’ions phosphates.

L’utilisation de nouveaux biomarqueurs chez Chlorella vulgaris (nitrate réductase,

déshydrogénase, phosphatase acide…) ou de nouveaux biorécepteurs (bactéries,

champignons…) sensibles à d’autres familles de polluants est à envisager.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 217

2.3 Mise au point d’un biocapteur pour la détection de métaux lourds

Les deux biocapteurs pour la détection des métaux lourds mis au point lors de cette

étude ont permis de réaliser deux avancées majeures. En effet, nous avons pu, grâce à

l’utilisation des monocouches autoassemblées, améliorer la répétabilité et la reproductibilité

des mesures et grâce à l’utilisation de la membrane nafion, limiter les effets des ions

phosphates sur l’APA de Chlorella vulgaris. Par rapport à ces améliorations nous pouvons

envisager de coupler ces deux techniques pour aboutir à un biocapteur fonctionnel dans le

milieu naturel. Concrètement, les algues peuvent être immobilisées par le biais des couches

SAMs puis recouvertes d’une membrane Nafion. Il est nécessaire de s’assurer de la

compatibilité de ces deux techniques et de leur absence d’interférence avec les mesures

biologiques.

2.4 Poursuite des travaux sur les biocapteurs à pesticides

Lors de cette étude, deux biocapteurs pour la détection des pesticides ont été

développés, l’un en milieu d’eau douce et l’autre en milieu salin.

Pour le premier, il est nécessaire de terminer les travaux entamés sur le développement d’un

biocapteur optique pour la détection des pesticides. Les premiers résultats ont montré que

l’AE de Chlorella vulgaris est sensible à la présence du méthyl paraoxon. Une mise au point

de la concentration du substrat, de la concentration cellulaire, du débit, de la méthode

d’exposition et de la méthode d’immobilisation devraient permettre d’obtenir un outil

performant pour la détection des pesticides en milieux d’eau douce.

Les premiers résultats obtenus avec le biocapteur conductimétrique pour la détection de

pesticides en milieu salin sont encourageants. En effet, nous avons pu observer que l’activité

estérase des algues marines est sensible aux deux molécules modèles (glyphosate et diuron).

Des mises au point complémentaires pourraient améliorer les limites de détection et permettre

de réaliser un outil performant pour la détection de pesticides dans les milieux salins. Des

essais sur des échantillons naturels permettront de valider ce dispositif.

2.5 Adaptation des biocapteurs pour des mesures sur sites

L’ultime étape pour l’adaptation des biocapteurs pour des mesures sur sites est

l’automatisation du système. Ainsi il est nécessaire d’associer un système de prélèvement

automatique d’échantillons et un système informatique adéquat pour le monitoring sur site.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 218

Toutefois, la mise en place des biocapteurs sur site soulève un certain nombre de questions

notamment la réutilisation du biorécepteur, la contamination bactérienne et la

complémentarité avec les mesures chimiques.

Concernant la réutilisation du biorécepteur, nous avons remarqué avec tous les biocapteurs

que la régénération des activités enzymatique n’est pas naturelle. Ainsi nous pouvons

envisager la réactivation des activités par le biais de méthodes décrites dans la bibliographie

comme l’utilisation de l’EDTA pour l’APA et le PAM (pyridine-2-aldoximide methiodide)

pour l’AE.

Un des principaux problèmes des biocapteurs implantés sur sites est la contamination

bactérienne des membranes actives. En effet les échantillons naturels contiennent des

bactéries qui peuvent coloniser les membranes contenant le biorécepteur et peuvent interférer

avec les mesures des activités enzymatiques. Pour palier à ce problème des membranes

filtrantes peuvent être une solution, néanmoins les problèmes liés à la biodisponibilité des

polluants restent à résoudre. L’utilisation d’antibiotiques peut être une solution mais leurs

effets restent à déterminer.

Les biocapteurs à cellules entières peuvent jouer un rôle d’outil d’alarme précoce. Ils restent

toutefois des systèmes d’évaluation qualitative Les coupler à des mesures chimiques lors

d’un signal d’alerte émis par le biocapteur reste, pour l’instant, la seule manière de quantifier

une pollution donnée.

Les travaux réalisés ainsi que ceux qui doivent être entrepris devraient permettre d’obtenir des

outils performants pour répondre aux exigences des gestionnaires afin d’être en conformité

avec la réglementation en vigueur et préserver une qualité acceptable de la ressource en eau

(objectif de la directive cadre européenne).


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 219

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 220

Références bibliographiques

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 221

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1. Tansley, A.G., The use and abuse of vegetational concepts and terms. Ecology, 1935.

16(3): p. 284-307.

2. Ramade, F., Introduction à l'écotoxicolgie, fondements et applications. 2007, Paris:

Lavoisier. 618.

3. Barthet, L., Contribution à l'évaluation de l'impact sur les écosystèmes de la

valorisation de résidus de procédès thèrmiques en BTP. 2003, INSA de Lyon: Lyon.

p. 217.

4. Mahan, B.H., Química. Curso Universitario.Fondo Educativo Interamericano S. A.,

1987.

5. Hem, J.D., Chemistry and occurrence of cadmium and zinc in surface water and

ground water. Water Resources Research, 1972. 8: p. 661-679.

6. Li, Y.-H., Burkhardt, L. and H. Teraoka, Desorption and coagulation of trace

elements during estuarine mixing. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1984. 48(10):

p. 1879-1884.

7. Lum, R.R., Cadmium in freshwaters: the Great Lakes and St. Lawrence River. In: J.O.

Nriagu et J.B. Sprague (Eds.), Cadmium in the Aquatic Environment. Wiley, New

York, 1987: p. 35-50.

8. Mullins, J., Cadmium in sea water and in marine organisms and sediments. journal of

marine ressource, 1956. 15: p. 103-108.

9. Callender, E., Heavy Metals in the Environment-Historical Trends. In: B.S. Lollar

(Ed.), Environmental Geochemistry. Treatise on Geochemistry. Elservier-Pergamon,

Oxford, 2003: p. 67-105.

10. Hem, J.D., Geochemical controls on lead concentrations in stream water and

sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1976. 40(6): p. 599-609.

11. Nriagu, J.O., Lead orthophosphates--IV Formation and stability in the environment.

Geochimica et Cosmochimica Acta, 1974. 38(6): p. 887-898.

12. Goyer, R.A. and T.W. Clarkson, Toxic effects of metals. In: D.C. Klassen (Ed.),

Casarett and Doull’s Toxicology: the Basic Science of Poisons. McGraw-Hill, New

York. 2001: p. 811–868.

13. Alloway, B.J. and D.C. Ayres, Chemical Principles of Environmental Pollution.

Blackie Academic and Profesional, an imprint of Chapman and Hall. 1997, London.

14. Chung, J.S., Kalman, D.A., Moore, L.E., Kosnett, M.J., Arroyo, A.P., Beeris, M.,

Guha-Mazumder, D.N., Hernandez, A.L. et Smith, A.H.,, Family Correlations of

Arsenic Methylation Patterns in

Children and Parents Exposed to High Concentrations of Arsenic in Drinking Water.

Children ´s Health, 2002. 110(7): p. 729-733.

15. Chassard-Bouchaud.C, l'écotoxicologie, ed. P.u.d. France. 1995, paris.

16. Miller.G, T., Living in the Environment, ed. W.P. Company. 1994, Belmont, USA.

17. W. Kördel, M.D., J. Lintelmann and S. Padberg, The importance of natural organic

material for environmental processes in waters and soils Pure and Applied Chemistry,

1997. 69(7): p. 1571-1600.

18. Encyclopaedia Universalis. 1988.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 222

19. EG, H. and B. AI, Inimical effects on wildlife of periodic application of DDD to clear

lake. california fish game, 1960. 46: p. 91-106.

20. BERG, H., K. M, and K. N, DDT and others insecticides in the lake Kariba

ecosystem, Zimbabwe. Ambio, 1992. 21: p. 444-450.

21. JB, D.W., EFFECTS OF CHLORINATED HYDROCARBONS INSECTICIDES UPON

QUAIL AND PHEASANT. JOURNAL OF AGRICULTURE AND FOOD

CHEMESTRY, 1955. 3: p. 672.

22. RE, G. and R. RL, Effects of DDT, Toxaphene and Dieldrin on pheasant reproduction.

Auk, 1956. 73: p. 529-539.

23. JH, K. and B. F, Future hazards from pesticide use. The environmentalist, 1984. 4.

24. Davis, H. and H. Hidu, Effects pesticides on embryonic development of calms and

oysters on survivial ang growth of the larvae. Fish. Bull. (US. Fish and Wildl. Serv.

Publ.), 1969. 67: p. 393-404.

25. site internet du CNRS: Dossier scientifique: L'l'eau.

26. Chouteau, C., Développement d'un biocapteur conductimétrique bi-enzymatique à

cellules algales. 2004, INSA de Lyon: Lyon. p. 178.

27. Keddy, C.J., J.C. Greene, and M.A. Bonnell, Review of Whole-Organism Bioassays:

Soil, Freshwater Sediment, and Freshwater Assessment in Canada. Ecotoxicology and

Environmental Safety, 1995. 30(3): p. 221-251.

28. Blandin, P., Bioindicateurs et diagnostic des systèmes écologiques. Bulletin

d'écologie, 1986. 17(4): p. 215-307.

29. Atkinson, A., et al., Biomarkers and surrogate endpoints: Preferred definitions and

conceptual framework*. Clin Pharmacol Ther, 2001. 69(3): p. 89-95.

30. Vedrine, C., Exploitation de signaux biologiques pour la réalisation de capteurs

environnementaux. application à la construction d'un biocapteur à micro-algues

immobilisées et d'une bioélectrode à enzyme immobilisée., in ENMSE. 2003: Saint

Etienne. p. 308.

31. Bessi, H. and M. ElAlami, Les bio-essais dans l’évaluation d’impact des polluants sur

les écosystèmes dulçaquicoles. Les technologies de laboratoire, 2009. 15.

32. Hopkin, S., In situ biological monitoring of pollution in terrestrial and aquatic

ecosysems. Hanbook of ecotoxicology, 1993. 1: p. 397-427.

33. Sekkat, N., M. Guerbet, and J. Jouany, Etude comparative de huit bioessais à court

terme pour l'évaluation de la toxicité de lexiviats de déchets urbains et industriels.

Revue des sciences de l'eau 2001. 14(1): p. 63-72.

34. Clément, B., Apports des essais en microcosmes aquatiques lentiques de laboratoire a

l’evaluation ecotoxicologique des polluants, in INSA de LYON. 2006: Lyon.

35. C.T.Minh, Les biocapteurs : principes, construction et applications. 1991: Masson.

36. Clark, L.C. and C.Lyon, Electrode systems for continuous monitoring in

cardiovascular surgey. Annals of the New York Academy of Sciences, 1962. 102: p.

29-45.

37. Dejous, C., Contribution à l'étude de microcapteurs à ondes acoustiques visant la

biodétection rapide sur site. 2005, Université Bordeaux 1. p. 126.

38. Harborn, U., et al., Evaluation of a miniaturized thermal biosensor for the

determination of glucose in whole blood. Clinica Chimica Acta, 1997. 267(2): p. 225-

237.

39. Pan, D., et al., Amperometric glucose biosensor based on immobilization of glucose

oxidase in electropolymerized o-aminophenol film at copper-modified gold electrode.

Sensors and Actuators B: Chemical, 2005. 104(1): p. 68-74.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 223

40. Kong, T., et al., An amperometric glucose biosensor based on the immobilization of

glucose oxidase on the ZnO nanotubes. Sensors and Actuators B: Chemical, 2009.

138(1): p. 344-350.

41. Mooney, M.H., et al., Biosensor-based detection of reduced sex hormone-binding

globulin binding capacities in response to growth-promoter administrations.

Analytica Chimica Acta, 2009. 637(1-2): p. 235-240.

42. Carmon, K.S., R.E. Baltus, and L.A. Luck, A biosensor for estrogenic substances

using the quartz crystal microbalance. Analytical Biochemistry, 2005. 345(2): p. 277-

283.

43. Hofstadler, S.A., et al., TIGER: the universal biosensor. International Journal of Mass

Spectrometry, 2005. 242(1): p. 23-41.

44. Brown, D.R., et al., Evanescent-wave biosensor for field serodiagnosis of tortoise

mycoplasmosis. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008. 124(3-4): p.

322-331.

45. Lan, Y.-b., et al., Using a Surface Plasmon Resonance Biosensor for Rapid Detection

of Salmonella Typhimurium in Chicken Carcass. Journal of Bionic Engineering, 2008.

5(3): p. 239-246.

46. Nanduri, V., et al., SPR biosensor for the detection of L. monocytogenes using phage-

displayed antibody. Biosensors and Bioelectronics, 2007. 23(2): p. 248-252.

47. Park, S., et al., Enzyme-linked immuno-strip biosensor to detect Escherichia coli

O157:H7. Ultramicroscopy, 2008. 108(10): p. 1348-1351.

48. Heutmekers, T.H.J., et al., A rapid surface plasmon resonance (SPR) biosensor

immunoassay for screening of somatotropins in injection preparations. Analytica

Chimica Acta, 2007. 586(1-2): p. 239-245.

49. Ampuero, S. and J.O. Bosset, The electronic nose applied to dairy products: a review.

Sensors and Actuators B: Chemical, 2003. 94(1): p. 1-12.

50. Winquist, F., et al., An electronic tongue in the dairy industry. Sensors and Actuators

B: Chemical, 2005. 111-112: p. 299-304.

51. Durrieu, C., et al., Whole cell algal biosensors for urban waters monitoring, in

Novatech. 2007: Lyon.

52. Schöning, M.J., et al., A dual amperometric/potentiometric FIA-based biosensor for

the distinctive detection of organophosphorus pesticides. Sensors and Actuators B:

Chemical, 2003. 95(1-3): p. 291-296.

53. Tsai, H.-c. and R.-a. Doong, Simultaneous determination of pH, urea, acetylcholine

and heavy metals using array-based enzymatic optical biosensor. Biosensors and

Bioelectronics, 2005. 20(9): p. 1796-1804.

54. Doong, R.-a., H.-m. Shih, and S.-h. Lee, Sol-gel-derived array DNA biosensor for the

detection of polycyclic aromatic hydrocarbons in water and biological samples.

Sensors and Actuators B: Chemical, 2005. 111-112: p. 323-330.

55. Min, R.W., et al., Simultaneous monitoring of glucose and -lactic acid during a

fermentation process in an aqueous two-phase system by on-line FIA with

microdialysis sampling and dual biosensor detection. Analytica Chimica Acta, 1998.

366(1-3): p. 127-135.

56. Du, D., et al., Comparison of drug sensitivity using acetylcholinesterase biosensor

based on nanoparticles-chitosan sol-gel composite. Journal of Electroanalytical

Chemistry, 2007. 611(1-2): p. 60-66.

57. Madou, M. and M.J. Tierney, Required technology breakthroughs to assume widely

accepted biosensors. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1993. 41: p. 109-128.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 224

58. Marrakchi, M., Développement et optimisation de biocapteurs à base de biomolécules

et micro-organismes sur microélectrodes interdigitées. 2006, Ecole centrale de Lyon:

Lyon. p. 157.

59. Malitesta, C. and M.R. Guascito, Heavy metal determination by biosensors based on

enzyme immobilised by electropolymerisation. Biosensors and Bioelectronics, 2005.

20(8): p. 1643-1647.

60. Njagi, J. and S. Andreescu, Stable enzyme biosensors based on chemically synthesized

Au-polypyrrole nanocomposites. Biosensors and Bioelectronics, 2007. 23(2): p. 168-

175.

61. El Kaoutit, M., et al., The Sonogel-Carbon materials as basis for development of

enzyme biosensors for phenols and polyphenols monitoring: A detailed comparative

study of three immobilization matrixes. Biosensors and Bioelectronics, 2007. 22(12):

p. 2958-2966.

62. Razumas, V., et al., Electrochemical biosensors for glucose, lactate, urea, and

creatinine based on enzymes entrapped in a cubic liquid crystalline phase. Analytica

Chimica Acta, 1994. 289(2): p. 155-162.

63. Schuhmann, W., Amperometric enzyme biosensors based on optimised electron-

transfer pathways and non-manual immobilisation procedures. Reviews in Molecular

Biotechnology, 2002. 82(4): p. 425-441.

64. Kim, B., et al., Immobilization of enzymes within hydrogel microparticles to create

optical biosensors for the detection of organophosphorus compounds. Current Applied

Physics. In Press, Accepted Manuscript.

65. Bousse, L., Whole cell biosensors. Sensors and Actuators B: Chemical, 1996. 34(1-3):

p. 270-275.

66. Mulchandani, P., et al., Microbial biosensor for p-nitrophenol using Moraxella sp.

Analytica Chimica Acta, 2002. 470(1): p. 79-86.

67. Védrine, C., et al., Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for

monitoring herbicides. Biosensors and Bioelectronics, 2003. 18(4): p. 457-463.

68. Rouillon, R., et al., Immobilization of thylakoids in polyvinylalcohol for the detection

of herbicides. Sensors and Actuators B: Chemical, 1995. 27(1-3): p. 477-479.

69. Carpentier, R., et al., A photoelectrochemical cell using immobilized photosynthetic

membranes. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1989. 22(3): p. 391-401.

70. Konig, A., et al., Multimicrobial Sensor Using Microstructured Three-Dimensional

Electrodes Based on Silicon Technology. Analytical Chemistry, 2000. 72(9): p. 2022-

2028.

71. Reshetilov, A.N., et al., Characteristics of Gluconobacter oxydans B-1280 and Pichia

methanolica MN4 cell based biosensors for detection of ethanol. Process

Biochemistry, 2001. 36(10): p. 1015-1020.

72. Gäberlein, S., F. Spener, and C. Zaborosch, Microbial and cytoplasmic membrane-

based potentiometric biosensors for direct determination of organophosphorus

insecticides. Applied Microbiology and Biotechnology, 2000. 54(5): p. 652-658.

73. Verma, N. and M. Singh, A disposable microbial based biosensor for quality control

in milk. Biosensors and Bioelectronics, 2003. 18(10): p. 1219-1224.

74. Chouteau, C., et al., A bi-enzymatic whole cell conductometric biosensor for heavy

metal ions and pesticides detection in water samples. Biosensors and Bioelectronics,

2005. 21(2): p. 273-281.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 225

75. Durrieu, C. and C. Tran-Minh, Optical Algal Biosensor using Alkaline Phosphatase

for Determination of Heavy Metals. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2002.

51(3): p. 206-209.

76. Rotariu, L., C. Bala, and V. Magearu, Yeast cells sucrose biosensor based on a

potentiometric oxygen electrode. Analytica Chimica Acta, 2002. 458(1): p. 215-222.

77. Mina, O., et al., Development of an automated water toxicity biosensor using

<I>Thiobacillus ferrooxidans</I> for monitoring cyanides in natural water for a

water filtering plant. 2004. p. 905-911.

78. Rajasekar, S., R. Rajasekar, and K.C. Narasimhan, Acetobacter peroxydans based

electrochemical biosensor for hydrogen peroxide. Bulletin of Electrochemistry, 2000.

16(1): p. 25-28.

79. Wells, M., et al., Ultrasensitive reporter protein detection in genetically engineered

bacteria. Analytical Chemistry, 2005. 77(9): p. 2683-2689.

80. Subrahmanyam, S., et al., Development of a sensor for acetic acid based on Fusarium

solani. Electroanalysis, 2001. 13(15): p. 1275-1278.

81. Lehmann, M., et al., Amperometric measurement of copper ions with a deputy

substrate using a novel Saccharomyces cerevisiae sensor. Biosensors and

Bioelectronics, 2000. 15(3-4): p. 211-219.

82. Timur, S., et al., Screen printed graphite biosensors based on bacterial cells. Process

Biochemistry, 2004. 39(11): p. 1325-1329.

83. Han, T.-S., et al., Flow injection microbial trichloroethylene sensor. Talanta, 2002.

57(2): p. 271-276.

84. Lowe, C.R., et al., Biosensors. Journal of Chromatography A, 1990. 510: p. 347-354.

85. Peduru Hewa, T.M., et al., The detection of influenza A and B viruses in clinical

specimens using a quartz crystal microbalance. Journal of Virological Methods. In

Press, Corrected Proof.

86. Wang, R., et al., Interdigitated array microelectrode based impedance immunosensor

for detection of avian influenza virus H5N1. Talanta, 2009. 79(2): p. 159-164.

87. Yu, J.-S., et al., Detection of Ebola virus envelope using monoclonal and polyclonal

antibodies in ELISA, surface plasmon resonance and a quartz crystal microbalance

immunosensor. Journal of Virological Methods, 2006. 137(2): p. 219-228.

88. Su, X.-L. and Y. Li, A QCM immunosensor for Salmonella detection with

simultaneous measurements of resonant frequency and motional resistance.

Biosensors and Bioelectronics, 2005. 21(6): p. 840-848.

89. E.Palecek and M.Fojta, DNA hybridisation and damage. Analytical chemistry, 2001.

2: p. 75.

90. Wang, J. and A.-N. Kawde, Pencil-based renewable biosensor for label-free

electrochemical detection of DNA hybridization. Analytica Chimica Acta, 2001.

431(2): p. 219-224.

91. Schena, M., et al., Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a

Complementary DNA Microarray. 1995. p. 467-470.

92. Site internet de Wikipédia. Volume,

93. TLILI, C., Etude et réalisation de biocapteurs impédancemétriques en utilisant

différentes approches d'immobilisation. 2006, université paris 11: paris. p. 168.

94. MINH, C.T., Les biocapteurs, principes constructions et applications. 1991, Paris:

Masson. 158.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 226

95. Velasco-Garcia, M.N., Optical biosensors for probing at the cellular level: A review

of recent progress and future prospects. Seminars in Cell & Developmental Biology,

2009. 20(1): p. 27-33.

96. Tan, W., K. Wang, and T.J. Drake, Molecular beacons. Current Opinion in Chemical

Biology, 2004. 8(5): p. 547-553.

97. Lei, Y., W. Chen, and A. Mulchandani, Microbial biosensors. Analytica Chimica

Acta, 2006. 568(1-2): p. 200-210.

98. Nguyen-Ngoc, H. and C. Tran-Minh, Fluorescent biosensor using whole cells in an

inorganic translucent matrix. Analytica Chimica Acta, 2007. 583(1): p. 161-165.

99. Dollard, M.-A. and P. Billard, Whole-cell bacterial sensors for the monitoring of

phosphate bioavailability. Journal of Microbiological Methods, 2003. 55(1): p. 221-

229.

100. R.W.WOOD, On a remarkable case of uneven distribution of light in a diffraction

grating spectrum. Philysophical magazine, 1902. 4: p. 396-402.

101. Wangkam, T., et al., Investigation of enzyme reaction by surface plasmon resonance

(SPR) technique. Sensors and Actuators B: Chemical, 2009. 139(2): p. 274-279.

102. O'Brien Ii, M.J., et al., SPR biosensors: simultaneously removing thermal and bulk-

composition effects. Biosensors and Bioelectronics, 1999. 14(2): p. 145-154.

103. Song, S.Y., et al., Selective antigen-antibody recognition on SPR sensor based on the

heat-sensitive conformational change of poly(N-isopropylacrylamide). Colloids and

Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2008. 313-314: p. 504-508.

104. Toyama, S., et al., Surface design of SPR-based immunosensor for the effective

binding of antigen or antibody in the evanescent field using mixed polymer matrix.

Sensors and Actuators B: Chemical, 1998. 52(1-2): p. 65-71.

105. Choi, S.H., J.W. Lee, and S.J. Sim, Enhancement of the sensitivity of surface plasmon

resonance (SPR) immunosensor for the detection of anti-GAD antibody by changing

the pH for streptavidin immobilization. Enzyme and Microbial Technology, 2004.

35(6-7): p. 683-687.

106. Wu, L., et al., Effects of small molecular inhibitors on the binding between HIV-1

reverse transcriptase and DNA as revealed by SPR biosensor. Sensors and Actuators

B: Chemical, 2007. 122(1): p. 243-252.

107. Yang, N., et al., Evaluation of two- and three-dimensional streptavidin binding

platforms for surface plasmon resonance spectroscopy studies of DNA hybridization

and protein-DNA binding. Biosensors and Bioelectronics, 2007. 22(11): p. 2700-2706.

108. Ananthanawat, C., et al., Thiolated pyrrolidinyl peptide nucleic acids for the detection

of DNA hybridization using surface plasmon resonance. Biosensors and


109. Wang, R., et al., Immobilisation of DNA probes for the development of SPR-based

sensing. Biosensors and Bioelectronics, 2004. 20(5): p. 967-974.

110. Hoa, X.D., A.G. Kirk, and M. Tabrizian, Towards integrated and sensitive surface

plasmon resonance biosensors: A review of recent progress. Biosensors and


111. May May, L. and D.A. Russell, Novel determination of cadmium ions using an enzyme

self-assembled monolayer with surface plasmon resonance. Analytica Chimica Acta,

2003. 500(1-2): p. 119-125.

112. Rajan, S. Chand, and B.D. Gupta, Surface plasmon resonance based fiber-optic sensor

for the detection of pesticide. Sensors and Actuators B: Chemical, 2007. 123(2): p.

661-666.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 227

113. Çaglayan, M.O., et al., Stepwise formation approach to improve ellipsometric

biosensor response. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2009.

5(2): p. 152-161.

114. Nabok, A.V., et al., Total internal reflection ellipsometry and SPR detection of low

molecular weight environmental toxins. Applied Surface Science, 2005. 246(4): p.

381-386.

115. Dzyadevych, S.V., et al., Amperometric enzyme biosensors: Past, present and future.

IRBM. 29(2-3): p. 171-180.

116. Bardeletti, G., F. Sechaud, and P. R. Coulet, A reliable -lactate electrode with a new

membrane for enzyme immobilization for amperometric assay of lactate. Analytica

Chimica Acta, 1986. 187: p. 47-54.

117. Mizutani, F., et al., An enzyme electrode for -lactate with a chemically-amplified

response. Analytica Chimica Acta, 1985. 177: p. 153-166.

118. Bradley, J. and R.D. Schmid, Optimisation of the biosensor for in situ fermentation

monitoring of glucose concentration. Biosensors and Bioelectronics, 1991. 6(8): p.

669-674.

119. Dempsey, E., et al., A lysine dehydrogenase-based electrode for biosensing of -lysine.


120. Marcus, R.A. and N. Sutin, Electron transfers in chemistry and biology. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Bioenergetics, 1985. 811(3): p. 265-322.

121. Kuralay, F., H. Özyörük, and A. YildIz, Inhibitive determination of Hg2+ ion by an

amperometric urea biosensor using poly(vinylferrocenium) film. Enzyme and

Microbial Technology, 2007. 40(5): p. 1156-1159.

122. Touloupakis, E., et al., A multi-biosensor based on immobilized Photosystem II on

screen-printed electrodes for the detection of herbicides in river water. Biosensors and


123. http://www.ysi.com.

124. Jaffrezic-Renault, N., et al., ISFET microsensors for the detection of pollutants in

liquid media. Sensors and Actuators B: Chemical, 1999. 59(2-3): p. 154-164.

125. Selvanayagam, Z.E., et al., An ISFET-based immunosensor for the detection of [beta]-

Bungarotoxin. Biosensors and Bioelectronics, 2002. 17(9): p. 821-826.

126. Estrela, P., et al., Field effect detection of biomolecular interactions. Electrochimica

Acta, 2005. 50(25-26): p. 4995-5000.

127. Schmitt, N., Fonctionnalisation de la microbalance à quartz et fixation covalente

d’anticorps : application aux immunocapteurs gravimétriques. 1995, Université

François Rabelais: Tours.

128. Marrakchi, M., et al., A novel proteinase K biosensor based on interdigitated

conductometric electrodes for proteins determination in rivers and sewers water.

Sensors and Actuators B: Chemical, 2005. 111-112: p. 390-395.

129. Anh, T.M., et al., Conductometric tyrosinase biosensor for the detection of diuron,

atrazine and its main metabolites. Talanta, 2004. 63(2): p. 365-370.

130. Bizet, K., et al., La microbalance à quartz électrochimique: perspectives d'application

en biologie médicale. Immuno-analyse & Biologie Spécialisée, 1995. 10(4): p. 205-

211.

131. Nomura, T. and O. Hattori, Determination of micromolar concentrations of cyanide in

solution with a piezoelectric detector. Analytica Chimica Acta, 1980. 115: p. 323-326.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 228

132. Kurosawa, S., et al., Evaluation of a high-affinity QCM immunosensor using antibody

fragmentation and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer.


133. Sakti, S.P., et al., Disposable HSA QCM-immunosensor for practical measurement in

liquid. Sensors and Actuators B: Chemical, 2001. 78(1-3): p. 257-262.

134. Passamano, M. and M. Pighini, QCM DNA-sensor for GMOs detection. Sensors and

Actuators B: Chemical, 2006. 118(1-2): p. 177-181.

135. Feng, K., et al., QCM detection of DNA targets with single-base mutation based on

DNA ligase reaction and biocatalyzed deposition amplification. Biosensors and


136. Wei, X.-L., et al., Disruption of HepG2 cell adhesion by gold nanoparticle and

Paclitaxel disclosed by in situ QCM measurement. Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces, 2007. 59(1): p. 100-104.

137. Lord, M.S., et al., Extracellular matrix remodelling during cell adhesion monitored by

the quartz crystal microbalance. Biomaterials, 2008. 29(17): p. 2581-2587.

138. Zhang, H., et al., QCM-FIA with PGMA coating for dynamic interaction study of

heparin and antithrombin III. Biosensors and Bioelectronics, 2005. 21(1): p. 121-127.

139. Gimzewski, J.K., et al., Observation of a chemical reaction using a micromechanical

sensor. Chemical Physics Letters, 1994. 217(5-6): p. 589-594.

140. Cherian, S., et al., Detection of heavy metal ions using protein-functionalized

microcantilever sensors. Biosensors and Bioelectronics, 2003. 19(5): p. 411-416.

141. Raiteri, R., et al., Micromechanical cantilever-based biosensors. Sensors and

Actuators B: Chemical, 2001. 79(2-3): p. 115-126.

142. Bayramoglu, G. and M.Y. ArIca, Enzymatic removal of phenol and p-chlorophenol in

enzyme reactor: Horseradish peroxidase immobilized on magnetic beads. Journal of

Hazardous Materials, 2008. 156(1-3): p. 148-155.

143. Sadana, A., Protein adsorption and inactivation on surfaces. Influence of

heterogeneities. Chemical Reviews, 2002. 92(8): p. 1799-1818.

144. Choi, S. and J. Chae, A microfluidic biosensor based on competitive protein

adsorption for thyroglobulin detection. Biosensors and Bioelectronics, 2009. 25(1): p.

118-123.

145. Ziegler, W., et al., Agar-supported lipid bilayers -- basic structures for biosensor

design. Electrical and mechanical properties. Colloids and Surfaces A:

Physicochemical and Engineering Aspects, 1998. 140(1-3): p. 357-367.

146. Hervás Pérez, J.P., et al., Amperometric tyrosinase biosensor based on polyacrylamide

microgels. Biosensors and Bioelectronics, 2006. 22(3): p. 429-439.

147. Tembe, S., et al., Electrochemical biosensor for catechol using agarose-guar gum

entrapped tyrosinase. Journal of Biotechnology, 2007. 128(1): p. 80-85.

148. Kurita, R., N. Yabumoto, and O. Niwa, Miniaturized one-chip electrochemical

sensing device integrated with a dialysis membrane and double thin-layer flow

channels for measuring blood samples. Biosensors and Bioelectronics, 2006. 21(8): p.

1649-1653.

149. Barhoumi, H., et al., Urease immobilization on biotinylated polypyrrole coated

ChemFEC devices for urea biosensor development. IRBM. 29(2-3): p. 192-201.

150. Du, D., et al., Development of acetylcholinesterase biosensor based on CdTe quantum

dots modified cysteamine self-assembled monolayers. Journal of Electroanalytical

Chemistry, 2008. 623(1): p. 81-85.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 229

151. Tlili, A., et al., A novel silicon nitride biosensor for specific antibody-antigen

interaction. Materials Science and Engineering: C, 2005. 25(4): p. 490-495.

152. Rubio Retama, J., et al., Design of an amperometric biosensor using polypyrrole-

microgel composites containing glucose oxidase. Biosensors and Bioelectronics, 2004.

20(6): p. 1111-1117.

153. Tahir, Z.M., E.C. Alocilja, and D.L. Grooms, Polyaniline synthesis and its biosensor

application. Biosensors and Bioelectronics, 2005. 20(8): p. 1690-1695.

154. Green, N.M., Avidin. Advances in Protein Chemistry, 1975. 29: p. 85-133.

155. Gayral, P., Les algues. 1975, Paris: Doin.

156. Livia, M., et al., The use of a test battery in marine ecotoxicology : The acute toxicity

of sodium dodecyl sulfate

Environmental toxicology, 2006. 21(4): p. 373-379.

157. Courties, C., et al., Smallest eukaryotic organism. Nature, 1994. 370(6487): p. 255-

255.

158. Badreddine, I., Mise au point d'un test de toxicité basé sur la mesure de la

phosphatase alcaline de microphytes. 1996, Université de Savoie: Chambéry. p. 195.

159. Wang, X., et al., Development of a conductometric nitrate biosensor based on Methyl

viologen/Nafion(R) composite film. Electrochemistry Communications, 2006. 8(2): p.

201-205.

160. Dzyadevych, S.V., A.A. SHUL'GA, and S.V. PATSKOVSKY, Thin film

conductometric sensors for enzyme biotransducers. Russian journal of

electrochemestry, 1994. 30(8): p. 987-991.

161. Babu, P.S.R. and T. Panda, Studies on improved techniques for immobilizing and

stabilizing penicillin amidase associated with E. coli cells. Enzyme and Microbial

Technology, 1991. 13(8): p. 676-682.

162. Gau, J.-J., et al., A MEMS based amperometric detector for E. Coli bacteria using

self-assembled monolayers. Biosensors and Bioelectronics, 2001. 16(9-12): p. 745-

755.

163. Hleli, S., et al., Atrazine analysis using an impedimetric immunosensor based on

mixed biotinylated self-assembled monolayer. Sensors and Actuators B: Chemical

Special Issue - In honour of Professor Karl Cammann, 2006. 113(2): p. 711-717.

164. Zhao, Y.-D., et al., DNA-modified electrodes; part 4: optimization of covalent

immobilization of DNA on self-assembled monolayers. Talanta, 1999. 49(4): p. 751-

756.

165. Chen, H., et al., Detection of Saccharomyces cerevisiae immobilized on self-assembled

monolayer (SAM) of alkanethiolate using electrochemical impedance spectroscopy.

Analytica Chimica Acta, 2005. 554(1-2): p. 52-59.

166. Helali, S., et al., A disposable immunomagnetic electrochemical sensor based on

functionalised magnetic beads on gold surface for the detection of atrazine.

Electrochimica Acta, 2006. 51(24): p. 5182-5186.

167. Olabarrieta, I., et al., In vitro effects of cadmium on two different animal cell models.

Toxicology in Vitro, 2001. 15(4-5): p. 511-517.

168. Linden, G., D. Chappelet-Tordo, and M. Lazdunski, Milk alkaline phosphatase.

Stimulation by Mg2+ and properties of the Mg2+ site. Biochimica and Biophysica

Acta-Enzymology, 1977. 483(1): p. 100-106.

169. GUEDRI, H., Développement d'un biocapteur optique à cellules algales pour le

monitoring des milieux aquatiques. 2006, Master SEIU, INSA de Lyon: Lyon. p. 71.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 230

170. Duffus, J., "Heavy metals" a meaningless term? Pure applied Chemestry, 2002. 74(5):

p. 793-807.

171. Pandard, P., P. Vasseur, and D.M. Rawson, Comparison of two types of sensors using

eukaryotic algae to monitor pollution of aquatic systems. Water Research, 1993.

27(3): p. 427-431.

172. Vedrine, C., et al., Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for

monitoring herbicides. Biosensors and Bioelectronics, 2003. 18(4): p. 457-463.

173. Chouteau, C., et al., Development of novel conductometric biosensors based on

immobilised whole cell Chlorella vulgaris microalgae. Biosensors and Bioelectronics,

2004. 19(9): p. 1089-1096.

174. Albareda-Sirvent, M., A. Merkoci, and S. Alegret, Configurations used in the design

of screen-printed enzymatic biosensors. A review. Sensors and Actuators B: Chemical,

2000. 69(1-2): p. 153-163.

175. Peter, J., et al., Detection of chlorinated and brominated hydrocarbons by an ion

sensitive whole cell biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 1996. 11(12): p. 1215-

1219.

176. Cosnier, S., C. Gondran, and A. Senillou, Functionalized polypyrroles : a

sophisticated glue for the immobilization and electrical wiring of enzymes. Synthetic

Metals, 1999. 102(1-3): p. 1366-1369.

177. Aksu, Z., G. Egretli, and T. Kutsal, A comparative study of copper(II) biosorption on

Ca-alginate, agarose and immobilized C. vulgaris in a packed-bed column. Process

Biochemistry, 1998. 33(4): p. 393-400.

178. Calik, G., et al., Growth and [kappa]-carrageenan immobilization of Pseudomonas

dacunhae cells for -alanine production. Enzyme and Microbial Technology, 1999.

24(1-2): p. 67-74.

179. Kumar, P. and T. Satyanarayana, Optimization of culture variables for improving

glucoamylase production by alginate-entrapped Thermomucor indicae-seudaticae

using statistical methods. Bioresource Technology, 2007. 98(6): p. 1252-1259.

180. Nguyen-Ngoc, H. and C. Tran-Minh, Sol-gel process for vegetal cell encapsulation.

Materials Science and Engineering: C, 2006. In Press, Corrected Proof.

181. Dzyadevych, S.V., et al., Development of enzyme biosensor based on pH-sensitive

field-effect transistors for detection of phenolic compounds. Bioelectrochemistry,

2002. 55(1-2): p. 79-81.

182. Fitzgerald, G.P., Nelson, T.C.,, Extractive and enzymatic analyses for limiting or

surplus phosphorous in algae. phycology, 1966. 2: p. 32-37.

183. Choi, S.H., J.W. Lee, and S.J. Sim, Enhanced performance of a surface plasmon

resonance immunosensor for detecting Ab-GAD antibody based on the modified self-

assembled monolayers. Biosensors and Bioelectronics, 2005. 21(2): p. 378-383.

184. Bucher, J.-P., L. Santesson, and K. Kern, Thermal Healing of Self-Assembled Organic

Monolayers: Hexane- and Octadecanethiol on Au(111) and Ag(111). Langmuir, 1994.

10(4): p. 979-983.

185. Guo, L.-H., et al., Effect of Gold Topography and Surface Pretreatment on the Self-

Assembly of Alkanethiol Monolayers. Langmuir, 1994. 10(12): p. 4588-4593.

186. De Corcuera, J.I.R., R.P. Cavalieri, and J.R. Powers, Improved platinization

conditions produce a 60-fold increase in sensitivity of amperometric biosensors using

glucose oxidase immobilized in poly-o-phenylenediamine. Journal of Electroanalytical

Chemistry, 2005. 575(2): p. 229-241.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 231

187. Mousty, C., et al., Trienzymatic biosensor for the determination of inorganic

phosphate. Analytica Chimica Acta, 2001. 443(1): p. 1-8.

188. Engblom, S.O., The phosphate sensor. Biosensors and Bioelectronics, 1998. 13(9): p.

981-994.

189. Zou, Z., et al., A disposable on-chip phosphate sensor with planar cobalt

microelectrodes on polymer substrate. Biosensors and Bioelectronics

Selected Papers from the Ninth World Congress On Biosensors. Toronto, Canada 10 - 12 May

2006, Alice X. J . Tang, 2007. 22(9-10): p. 1902-1907.

190. (Ed.), W., Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical

Chemistry. 1990. 1: p. 329.

191. Chaniotakis, N.A., K. Jurkschat, and A. Rühlemann, Potentiometric phosphate

selective electrode based on a multidendate--tin (IV) carrier. Analytica Chimica Acta,

1993. 282(2): p. 345-352.

192. Giovanni C. Petrucelli, E.Y.K., Lauro T. Kubota and Celso A. Bertran,

Hydroxyapatite-based electrode: a new sensor for phosphate. Anal. Commun, 1996.

33: p. 227 - 229.

193. Chen, Z., R. De Marco, and P.W. Alexander, Flow-injection Potentiometric Detection

of Phosphates Using a Metallic Cobalt Wire Ion-selective Electrode. Analytical

Communications, 1997. 34(3): p. 93-95.

194. Fernandez, J.J., et al., Reagentless carbon paste phosphate biosensors: preliminary

studies. Sensors and Actuators B: Chemical, 1998. 47(1-3): p. 13-20.

195. Male, K.B. and J.H.T. Luong, An FIA biosensor system for the determination of

phosphate. Biosensors and Bioelectronics, 1991. 6(7): p. 581-587.

196. Guilbault, G.G. and M. Nanjo, A phosphate-selective electrode based on immobilized

alkaline phosphatase and glucose oxidase. Analytica Chimica Acta, 1975. 78(1): p.

69-80.

197. Conrath, N., et al., A novel enzyme sensor for the determination of inorganic

phosphate. Analytica Chimica Acta, 1995. 309(1-3): p. 47-52.

198. Mori, H., et al., Determination of inorganic phosphate by the use of immobilized

enzymes in a FIA system. Analytical Letters, 1994. 27(2): p. 309-321.

199. Ikebukuro, K., et al., A novel biosensory system for the determination of phosphate.

Journal of Biotechnology, 1996. 48(1-2): p. 67-72.

200. Zhang, Z., et al., Development of a conductometric phosphate biosensor based on tri-

layer maltose phosphorylase composite films. Analytica Chimica Acta, 2008. 615(1):

p. 73-79.

201. Nishida, Y., et al., Immobilization of Escherichia coli cells having aspartase activity

with carrageenan and locust bean gum. Enzyme and Microbial Technology, 1979.

1(2): p. 95-99.

202. Zhylyak, G.A., et al., Application of urease conductometric biosensor for heavy-metal

ion determination. Sensors and Actuators B: Chemical, 1995. 24(1-3): p. 145-148.

203. Marcos, J. and A. Townshend, Studies on the inhibition of immobilised alkaline

phosphatase by metal ions and EDTA in a flow-injection system. Analytica Chimica

Acta, 1994. 299(1): p. 129-136.

204. Campanella, L., et al., An algal biosensor for the monitoring of water toxicity in

estuarine environments. Water Research, 2001. 35(1): p. 69-76.

205. SAGNET, D.,

Pertinence des biomarqueurs à cellules algales pour la surveillance des milieux marins.

2008, INSA de Lyon: Lyon. p. 70.


___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 232

206. TERNISIEN, J., Etude préliminaire à la conception d'un biocapteur algal pour la

surveillance du milieu marin. 2007, INSA de Lyon: Lyon. p. 54.

207. D. Landry, S.D., J.C. Fournier and F. Andreux, Leaching of glyphosate and AMPA

under two soil management practices in Burgundy vineyards. Environmental

Pollution, 2005. 138: p. 191-200.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 233

TABLE DES FIGURES

Figure 1 Cycle de l’eau (d’après le site internet de Wikipedia [3]) ......................................... 26

Figure 2 bioamplification du DDT (modifié d’après Miller, 1994 [16]) ................................. 32

Figure 3 Représentation schématique d’un biocapteur (modifié d’après C.T.Minh, 2001, [36])

.......................................................................................................................................... 55

Figure 4 Représentation schématique de quelques biorécepteurs ........................................... 56

Figure 5 Principe d’utilisation d’une puce à ADN (modifié d’après wikipédia [93]) ............ 62

Figure 6 Principe de l’ISE (d’après [128]) .............................................................................. 69

Figure 7 Principe de l’ISFET (d’après [98]) ............................................................................ 69

Figure 8 Principe d’un capteur à micropoutre, détection en mode statique (A) et en mode

dynamique (B), d’après [38] ............................................................................................ 71

Figure 9 La microalgue Chlorella vulgaris .............................................................................. 80

Figure 10 Observation microscopique de Dunaliella tertiolecta (x 400) ................................. 81

Figure 11 Observation microscopique de Phaeodactylum tricornutum au microscope inversé

(x32, zoom numérique x 5) .............................................................................................. 82

Figure 12 Observation microscopique de Ostreococcus tauri au microscope électronique

(d’après : CNRS / H. Moreau) ......................................................................................... 82

Figure 13 Principe de mesure des activités enzymatiques en bioessais .................................. 85

Figure 14 Les électrodes interdigitées en platine, d’après Wang (2006) [160] ....................... 90

Figure 15 Représentation schématique des mesures conductimétriques ................................. 95

Figure 16 Voltamogramme du couple redox K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]: (a) électrode en or

nue et (b) électrode en or/billes magnétiques. Vitesse de balayage 100 mV/s. ............... 98

Figure 17 Montage expérimentale pour la mesure de la voltamétrie cyclique ........................ 98

Figure 18 Cinétique enzymatique de l’APA Chlorella vulgaris mesurée en bioessais (Tris-

HCl 0,1 M ; pH 8,5) ....................................................................................................... 107

Figure 19 Cinétique enzymatique des estérases de Chlorella vulgaris mesurée en bioessais (

Tampon citrate 10 mM ; pH 5,4).................................................................................... 108

Figure 20 Effets de la charge algale sur l’atteinte de l’APA de Chlorella vulgaris en présence

de cadmium (Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5, MUP 9µM, temps de contact 2h)

C1=5*107 ;C2=10

7 ; C3=5*10

6 ; C4=10

6 cellules/ml .................................................... 109

Figure 21 Effets de la concentration du substrat sur l’atteinte de l’APA de Chlorella vulgaris

en présence de cadmium (Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5, concentration algale 3*106

cellule/ml, temps de contact 2h) ..................................................................................... 110

Figure 22 Effets de la concentration du substrat sur l’atteinte de l’APA de Chlorella vulgaris

en présence de 100 ppb de cadmium (Tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8,5, concentration

algale 3*106 cellule/ml, MUP 9µM) .............................................................................. 111

Figure 23 Effets du Cd, du Zn, et de Pb sur l’APA de Chlorella vulgaris (Tampon Tris-HCl

0,1M, pH 8,5, concentration algale 3*106 cellule/ml, MUP 9µM) ................................ 112

Figure 24 Effets de quatre pesticides sur l’APA de Chlorella vulgaris (Tampon Tris-HCl

0,1M, pH 8,5, concentration algale 3*106 cellule/ml, MUP 9µM) ................................ 114

Figure 25 Effets des métaux lourds sur l’AE de Chlorella vulgaris en bioessais (Tampon

citrate 10 mM, pH 5,4, temps d’incubation 2h) ............................................................. 115

Figure 26 Effets de quelques pesticides sur l’AE de Chlorella vulgaris en bioessais (Tampon

citrate 10 mM, pH 5,4, temps d’incubation 2h) ............................................................. 116

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 234

Figure 27 Influence de la concentration du gel d’agarose sur l’APA de Chlorella vulgaris

pour différents temps de contact entre le gel et le substrat ............................................ 122

Figure 28Influence de la concentration du gel d’agarose sur l’AE de Chlorella vulgaris pour

différents temps de contact entre le gel et le substrat ..................................................... 123

Figure 29 Influence de la charge algale sur les cinétiques enzymatiques de la phosphatase

alcaline de Chlorella vulgaris dans un gel d’agarose .................................................... 124

Figure 30 Effets des métaux lourds sur l’APA de Chlorella vulgaris (comparaison entre

algues libres et algues immobilisées) ............................................................................. 125

Figure 31 Effets des pesticides sur l’AE de Chlorella vulgaris (comparaison entre algues

immobilisées et algues libres) ........................................................................................ 127

Figure 32 Vue en perspective de la cellule du biocapteur ...................................................... 128

Figure 33 Mesure du bruit de fond du biocapteur .................................................................. 129

Figure 34 Cinétique témoin de l’APA de Chlorella vulgaris mesurée par le biocapteur optique

........................................................................................................................................ 129

Figure 35 Cinétique témoin de l’AE de Chlorella vulgaris mesurée par le biocapteur optique

........................................................................................................................................ 130

Figure 36 Essais de reproductibilité inter-membranes ........................................................... 131

Figure 37 Essais de reproductibilités intra-membrane ........................................................... 131

Figure 38 Mesure du bruit de fond avec le biocapteur optique .............................................. 133

Figure 39 Cinétique enzymatique de l’AE de Chlorelle vulgaris mesurée par le biocapteur

optique ............................................................................................................................ 133

Figure 40 Essais de répétabilité mesurés en biocapteur optique ............................................ 134

Figure 41 Effet du méthyl-paraoxon sur l’AE de Chlorella vulgaris mesuré en biocapteur

optique ........................................................................................................................... 135

Figure 42 Mesure de la voltamétrie cyclique en présence de 5mM de K3[Fe(CN)

6]/K4[Fe(CN)6]: (a) électrode nue, (b) électrode modifiée par les SAMs et (c) électrode

modifiée+algues. Vitesse de balayage 100 mV/s. .......................................................... 145

Figure 43 Image microscopique d’une électrode non modifiée (× 400) ................................ 146

Figure 44 Représentation schématique de l’immobilisation des cellules algales sur l'électrode

de platine modifiée par les couches SAMs. La figure n’est pas à l’échelle ................... 146

Figure 45 Les électrodes de platine modifiées par les monocouches auto-assemblées sans (A)

et avec (B) des cellules algales immobilisées, grossissement × 400 .............................. 147

Figure 46 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline mesurée avec un biocapteur

conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ................................................................ 148

Figure 47 APA résiduelle de Chlorella vulgaris pour 30 min d’exposition au Cd2+

(10 mM

Tris–HCl, 50 μM pNPP, pH 8.5) ................................................................................... 149

Figure 48 Cinétiques enzymatiques de l’activité phosphatase alcaline mesurées avec cinq

biocapteurs conductimétriques dans les mêmes conditions (10mM Tris–HCl, pH 8.5).150

Figure 49 Evolution du signal de trois biocapteurs conductimétriques stockés à 4°C (10mM

Tris–HCl, 50 µ M pNPP, pH 8.5) .................................................................................. 151

Figure 50 Schéma des électrodes interdigitées ...................................................................... 158

Figure 51 Observation microscopique des algues immobilisées par la BSA réticulé par le

glutaraldéhyde sur une électrode interdigitée, grossissement (× 400) ........................... 161

Figure 52 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline mesurée en bioessais (100 mM

Tris–HCl, pH 8.5) ........................................................................................................... 162

Figure 53 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline mesurée en biocapteur

conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ................................................................. 162

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 235

Figure 54 Effets de la concentration algale sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à

différentes concentrations en phosphates en bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5, temps

de contact 30mn) ............................................................................................................ 163

Figure 55 Effets de la concentration algale l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à

différentes concentrations en phosphates en bioessais (10mM Tris–HCl, pH 8.5, temps

de contact 60mn) ............................................................................................................ 164

Figure 56 Effets du phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris à différents ratios BSA/algues

(10mM Tris–HCl, pH 8.5, temps de contact 60mn) ....................................................... 164

Figure 57 Effets du temps sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à trois

concentrations de phosphate en bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5) ......................... 165

Figure 58 Effets du temps sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris à trois

concentrations de phosphate en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5)

........................................................................................................................................ 166

Figure 59 Effets de la concentration du substrat sur l’inhibition de l’APA de Chlorella

vulgaris en bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5) ......................................................... 167


vulgaris en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ............................ 167

Figure 61 Courbe de calibration obtenue en bioessais (100mM Tris–HCl, pH 8.5, MUP,

2µM, temps de contact 30mn) ........................................................................................ 168

Figure 62 Courbe de calibration obtenue en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl,

pH 8.5, pNPP 0,1 µM, temps de contact 60 mn) ........................................................... 168

Figure 63 Mesure de l’APA résiduelle après inhibition à différentes concentrations en

phosphate en fonction du temps en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH

8.5) .................................................................................................................................. 169

Figure 64 Evolution du signal de trois biocapteurs conductimétriques au cours du temps

stockés à 4°C (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ....................................................................... 170

Figure 65 Observation microscopique des algues immobilisées dans une matrice BSA/Nafion

sur une électrode interdigitée, grossissement (× 400) .................................................... 179

Figure 66 Cinétique enzymatique de la phosphatase alcaline de Chlorella vulgaris mesurée

en biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) .......................................... 180

Figure 67 Effets du phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées en bioessais

(100mM Tris–HCl, pH 8.5) ............................................................................................ 180

Figure 68 Effets du cadmium sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées en bioessais (100mM

Tris–HCl, pH 8.5) ........................................................................................................... 181

Figure 69 Effets de la concentration algale concentration sur l’inhibition de l’APA de

Chlorella vulgaris par cadmium mesurées par le biocapteur conductimétrique (10mM

Tris–HCl, pH 8.5) ........................................................................................................... 182


vulgaris par cadmium mesurées par le biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl,

pH 8.5) ............................................................................................................................ 183

Figure 71 Effets du ratio Nafion, BSA/Algues sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées par

le biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ........................................... 183

Figure 72 Effets du phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris mesurées par le biocapteur

conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ................................................................. 184

Figure 73 Effets du mélange Cadmium + phosphate sur l’APA de Chlorella vulgaris APA

mesurées par le biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ..................... 184

Figure 74 Effets du temps sur l’inhibition de l’APA de Chlorella vulgaris mesurés par le

biocapteur conductimétrique (10mM Tris–HCl, pH 8.5) ............................................... 185

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 236

Figure 75 AE des algues marines ........................................................................................... 191

Figure 76 AE des algues Dt et Pt au cours du temps ; FDA 3,3 µM/l ................................... 191

Figure 77 AE de l’algue Ot au cours du temps ; FDA 3,3 µM/l ............................................ 192

Figure 78 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Dt à la lumière ...................................... 193

Figure 79 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité ..................................... 193

Figure 80 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Pt à la lumière ....................................... 194

Figure 81 Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité ...................................... 195

Figure 82 : Effets du glyphosate sur l’AE de l’algue Ot à la lumière .................................... 195

Figure 83: toxicité du round up sur algues Dt libres à la lumière .......................................... 196

Figure 84 : toxicité du Round Up® sur algues Dt libres à l’obscurité ................................... 197

Figure 85 : toxicité du round up sur algues Pt libres à la lumière ........................................ 197

Figure 86: toxicité du round up sur algues Pt libres à la lumière ......................................... 198

Figure 87 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Dt à la lumière ............................................. 199

Figure 88 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité ............................................ 200

Figure 89 Effets du DCPU su l’AE de l’algue Dt à la lumière .............................................. 201

Figure 90 Effets du DCPU sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité ............................................ 201

Figure 91 Effets du DCPMU sur l’AE de l’algue Dt à la lumière ......................................... 202

Figure 92 Effets de DCPMU sur l’AE de l’algue Dt à l’obscurité ........................................ 202

Figure 93 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Pt à la lumière .............................................. 203

Figure 94 Effets du diuron sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité ............................................. 203

Figure 95 Effets du DCPU sur l’AE de l’algue Pt à la lumière ............................................. 204

Figure 96 Effets du DCPU sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité ............................................ 204

Figure 97 Effets du DCPMU sur l’AE de l’algue Pt à la lumière .......................................... 205

Figure 98 Effets du DCPMU sur l’AE de l’algue Pt à l’obscurité ......................................... 206

Figure 99 : Témoin de l'AE : algues Dt immobilisées sur microélectrodes. Mesures faites à

t=0 et t+16h .................................................................................................................... 207

Figure 100 Effets du glyphosate sur l’AE des algues Pt et Dt en biocapteur conductimétrique,

acétylcholine 2mM, temps de contact 24h ..................................................................... 207

Figure 101 Effets du diuron sur l’AE des algues Pt et Dt en biocapteur conductimétrique,

acétylcholine 2mM, temps de contact 24h ..................................................................... 208

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 237

TABLE DES TABLEAUX

Tableau 1 Classification des principaux types de pollutions en fonction des polluants (d’après

Ramade, 2007 [2]) ............................................................................................................ 27

Tableau 2 Concentration en cadmium dans certains invertébrés marins (d’après Mullins, 1956

[8]) .................................................................................................................................... 28

Tableau 3 Origine, utilisation et effets toxiques de quelques métaux lourds ........................... 30

Tableau 4 Classification et caractéristiques des groupes de pesticides .................................... 31

Tableau 5 Effets de divers insecticides organochlorés sur le développement des œufs et la

survie larvaire de mollusques Lamellibranches. D’après Davis, 1969 [24] ..................... 37

Tableau 6 Normes françaises pour la qualité de l'eau potable (Décret n° 89-3 du 3 janvier

1989 modifié) et des rejets industriels (cas général) ........................................................ 43

Tableau 7 Méthodes analytiques pour le dosage de quelques métaux lourds .......................... 45

Tableau 8 Méthodes analytiques conseillées pour le dosage de quelques polluants organiques

dans l’eau .......................................................................................................................... 46

Tableau 9 Domaines d’application des biocapteurs ................................................................ 54

Tableau 10 Quelques exemples de biocapteurs à base de cellules entières ............................. 59

Tableau 11 Liste des réactifs utilisés ........................................................................................ 79

Tableau 12 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité phosphatase

alcaline de Chlorella vulgaris en bioessais ...................................................................... 86

Tableau 13 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité phosphatase

alcaline des algues marines en bioessais .......................................................................... 87

Tableau 14 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité estérase de

Chlorella vulgaris en bioessais ........................................................................................ 88

Tableau 15 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’activité estérase des

algues marines en bioessais .............................................................................................. 88

Tableau 16 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’APA en biocapteur ..... 96

Tableau 17 Composition du milieu réactionnel pour les mesures de l’AE en biocapteur ....... 96

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 238

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 239

PUBLICATIONS, ENCADREMENT ET COMMUNICATIONS

Publications dans une revue à comité de lecture

GUEDRI. H. and C. Durrieu, A self-assembled monolayers based conductometric algal whole cell

biosensor for water monitoring. Microchimica Acta, 2008. 163(3): p. 179-184.

GUEDRI. H, C.Durrieu , Development of an algal whole cell biosensor for phosphate monitoring.

Sensor Letters, 2009. 7 (5): p. 788–794.

GUEDRI. H , C.Durrieu A Nafion/BSA based conductometric algal whole cell biosensor for heavy

metal monitoring, Progress in Environmental Science and Technology (Vol. II), Part A p.623-628

C. Durrieu, H. Guedri, A. Berhezetsky et J.M. Chovelon, Whole cell algal biosensors for urban

waters monitoring, Novatech, Lyon, France, June 2007

Participation à des congrès/colloques avec acte

DURRIEU. C, GUEDRI. H, VOLATIER. L, BOSSANT. T, Developement of whole cell biosensor

based on marine algae for the environment monitoring of polluants at sea, 9th workshop on

biosensors and bioanalytical microtechniques in environmental and clinical analysis. 2009: Montréal,

Canada

GUEDRI. H, C.Durrieu., A Nafion/BSA based conductometric algal whole cell biosensor for heavy

metal monitoring, ISEST2009, Shanghai, Chine

GUEDRI. H, C.Durrieu., Microélectrode algale conductimétrique à membrane nafion pour la

détection d’ions de métaux lourds dans l’environnement, Xième colloque du groupe français de

bioélectrochimie. 2008: Lacaneau, France

GUEDRI H, C.Durrieu , Development of an algal whole cell biosensor for phosphate monitoring, in

6ème journées Maghreb-Europe MADICA 2008. 2008: Rabat, Maroc

GUEDRI. H. and C. Durrieu, A self-assembled monolayers based conductometric algal whole cell

biosensor for water monitoring. Third international workshop on biosensors for food safety and

environmental monitoring. 2007: Fez, Morocco

C. Durrieu, H. Guedri, A. Berhezetsky and J.M. Chovelon, Whole cell algal biosensors for urban

waters monitoring, Novatech, Lyon, France, June 2007

DURRIEU C. and Guedri. H , A microalgal cell biosensor based on Nitrate Reductase activity

measurement for ammoniacal level monitoring in freshwater. 4th International workshop on biosensor

for food and environmental monitoring. 2007: Fez ,Morocco

DURRIEU C. and Guedri. H . A microalagal cell biosensor based on Nitrate reductase Activity for

ammoniacal level monitoring in freshwater. Nitrogen 2007, Lancaster (Royaume Uni), du 27 au 31

juillet 2007.

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 240

GUEDRI. H ,C. Durrieu , C. Chouteau , J.M. Chovelon et C. Tran-Minh, Développement de

biocapteurs enzymatiques à cellules algales adaptés à la détection de métaux lourds et de produits phytosanitaires dans les milieux aquatiques. XI ième colloque du groupe français de bioélectrochimie.

2006 : Ceret, France

Encadrement et co-encadrement d’étudiants

Développement de biocapteurs à algues marines pour le monitoring des lagunes côtières. GHIONE

François. TFE/ENTPE : 56p.

Pertinence des biomarqueurs à cellules algales pour la surveillance des milieux marins. SAGNET

Delphine. Master, TFE, INSA/ENTPE : 2008. 70p.

Etude préliminaire à la conception d'un biocapteur algal pour la surveillance du milieu marin.

Optimisation d'un biorécepteur. TERNISIEN Julie.TFE/ENTPE : 2007. 54p.

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 241

ANNEXES

ANNEXE 1 : Composition du milieu AFNOR LC

Les solutions mères peuvent être conservées à +4°C pendant une durée de 1 mois

Solution 1

Nitrate de calcium (Ca (NO3)2, 4H2O 4g

Eau qsp 100ml

Solution 2

Nitrate de potassium (KNO3) 10g

Eau qsp 100ml

Solution 3

Sulfate de magnésium (MgSO4, 7H2O) 3g

Eau qsp 100ml

Solution 4

Monohydrogénophosphate anhydre(K2HPO4) 4g

Eau qsp 100ml

Solution 5

Sulfate de cuivre (CuSO4, 5H2O) 30mg

Heptamolybdate d’ammonium (NH4)6Mo7O24, 4H2O) 60mg

Sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) 60mg

Chlorure de cobalt (CoCl2, 6H2O) 60mg

Nitrate de manganèse (Mn(NO3)2, 4H2O) 60mg

Acide citrique (C6H8O, 7H2O) 60mg

Acide borique (H3BO3) 60mg

Eau qsp 1000ml

Solution 6

Citrate de fer 1.625g

Sulfate de fer (FeSO4, 7H2O) 0.625g

Chlorure de fer (FeCl3, 6H2O) 0.625g

Eau qsp 1000ml

Préparer le milieu de culture en ajoutant pour 1 litre d’eau distillée :

Solutions 1, 2, 3 et 4 1ml

Solutions 5 et 6 0.5ml

Ajuster le pH à 7 avec une solution d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de sodium puis

stériliser à l’autoclave (120°C, 1.5 bar, 20mn).

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 242

ANNEXE 2 : Composition du milieu f/2

Milieu f/2 : Gauillard’ s (f/2) marine enrichment basal salt mixture

Cobalt Chloride Hexahydrate 0,010mg/l

Cupric Sulfate Pentahydrate 0,010mg/l

Disodium EDTA Dihydrate 4,360mg/l

Ferric Chloride Anhydrous 1,890 mg/l

Manganese Chloride Tetrahydrate 0,180 mg/l

Sodium Phosphate Monobasic 4,3470 mg/l

Sodium Metasilicate (vacuum-dried) 6,5890 mg/l

Sodium Molybdate Dihydrate 0,0060 mg/l

Sodium Nitrate 75,0 mg/l

Zinc Sulfate Heptahydrate 0,0220 mg/l

0,462 g de poudre sont nécessaires pour préparer cinq litres de milieu.

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 243

ANNEXE 3 : Articles en anglais

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 244

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 245

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 246

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 247

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 248

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 249

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 250

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 251

Houssemeddine Guedri, Claude Durrieu. Development of a conductometric algal whole cells

biosensor for phosphate monitoring. Sensor Letters, 2009, vol. 7 ; pp. 788-794.

Houssemeddine Guedri, Claude Durrieu. A nafion/BSA based conductometric algal whole

cell biosensor for heavy metal monitoring.

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 252

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 253

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 254

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 255

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 256

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 257

Annexes

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________ 258

THESE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

NOM : GUEDRI DATE de SOUTENANCE : 17 mars 2010

Prénoms : Houssemeddine

TITRE : Mise au point de biocapteurs basés sur la mesure d’activités métaboliques de cellules algales pour le monitoring de

la qualité des milieux aquatiques

NATURE : Doctorat Numéro d'ordre : 2010 ISAL0020

Ecole doctorale : Chimie de Lyon

Spécialité : Génie des procédés

Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 /et bis CLASSE :

RESUME :

Le contrôle de la qualité des écosystèmes aquatiques nécessite des outils de détection en continu et in situ comme les

biocapteurs.

Ce travail propose le développement de biocapteurs pour la détection de certaines familles de polluants. Ces outils sont basés

sur la mesure de deux activités enzymatiques de cellules algales représentatives des eaux douces et salines.

La première étape a consisté au choix des activités en fonction des polluants étudiés en bioessais. Ainsi nous avons montré

que l’activité phosphatase alcaline (APA) est sensible à la présence de métaux lourds et de phosphates et que l’activité

estérase (AE) est sensible à la présence de pesticides. Ces résultats nous ont permis de développer différents biocapteurs.

Pour la détection des métaux lourds, deux biocapteurs conductimétriques ont été développés. Le premier, basé sur la mesure

de l’APA de la microalgue d’eau douce Chlorella vulgaris (Cv) immobilisée par des monocouches autoassemblées, a permis

d’améliorer la répétabilité et la reproductibilité des mesures. Le deuxième, basé sur la même mesure, a permis de s’affranchir

des effets du phosphate sur l’APA de Cv.

Pour la détection du phosphate, un biocapteur conductimétrique à cellules algales à été développé, la limite de détection est

de 0.4µM d’ions phosphate.

Enfin pour la détection des pesticides en milieu marin, un biocapteur conductimétrique basé sur la mesure de l’AE de deux

algues marines a été développé. Les résultats ont montré qu’il est sensible à la présence du diuron et du glyphosate.

Les biocapteurs développés lors de cette étude, et après essais sur des échantillons naturels, servirons aux gestionnaires pour

une prise de décision.

MOTS-CLES :

Biocapteur, Bioessais, écotoxicologie, Chlorelle vulgaris, algues marines, activité phosphatase alcaline, activité estérase,

métaux lourds, phosphate, SAMs

Laboratoire de recherche : Laboratoire des Sciences de l’Environnement, Ecole Nationale des Travaux Publics de l’Etat

Directeur de thèse:

Claude DURRIE

Yves PERRODIN

Président de jury :

Composition du jury :

Mme DURRIEU Claude, Enseignant-Chercheur, LSE-ENTPE,

M. PERRODIN Yves, Directeur de recherche, LSE-ENTPE

Mme MEZZANOTTE Valeria, Professeur, université de Milan Bicocca

M. MARTY Jean Luis, professeur, Université de Perpignan Via Domitia

Mme JAFFREZIC Nicole, directeur de recherche, CNRS

M. CHOVELON Jean Marc, professeur, Université Claude Bernard Lyon1

M. LEJEUNE Philippe, professeur, INSA de Lyon

M. Baussant Thierry, IRIS, Norvège

M. TRAN Canh Minh, ex-professeur à l’école des Mines de Saint-Etienne

Thèses de l'INSA de Lyon | Les Thèses de l'INSA de Lyon - Mise au...

Documents

Transcript of Thèses de l'INSA de Lyon | Les Thèses de l'INSA de Lyon - Mise au...