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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spécialité : Microbiologie

JURY

Pr. Bernard DUCOMMUN (Président du Jury) Pr. Alain SARASIN

Pr. Francis MEGRAUD Pr. Claude PETIT

Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies

Unité de recherche : UMR 1225 INRA/ENVT Interactions Hôtes-Agents Pathogènes

Directeur(s) de Thèse : Pr. Claude PETIT et Dr. Jean-Philippe NOUGAYREDE Rapporteurs : Pr. Alain SARASIN et Pr. Francis MEGRAUD

Présentée et soutenue par Gabriel Cuevas Ramos

Le 13 Octobre 2010

Titre :

Effets génotoxiques des souches de Escherichia coli produisant la Colibactine

Table de Matières

I. Remerciements 4 II. Liste de figures et tableaux 5 III. Abréviations 7 IV. Résumé 8 V. Summary 9 Synthèse Bibliographique

1. Escherichia coli, une espèce bactérienne polymorphe 11 1.1. Diversité et clonalité de l’espèce E. coli 13 1.2. La diversité génétique et les éléments génétiques mobiles 14

1.2.1. Les îlots génomiques et/ou de pathogénicité 15 1.3. Les E. coli pathogènes 17

1.3.1. Les souches pathogènes du tractus intestinal 17 1.3.2. Les E. coli pathogènes extra‐intestinales (ExPEC) 18 1.3.3. Facteurs de virulence et de performance chez les ExPEC 20

2. Les Cyclomodulines, des toxines bactériennes qui altèrent le cycle cellulaire 25 2.1. CNF (Cytotoxic Necrotizing Factor) 25 2.2. CDT (Cytolethal Distending Toxin) 26 2.3. La Colibactine 28

2.3.1. Machinerie PKS et synthèse de la Colibactine 28 2.3.2. NRPS et PKS 29 2.3.3. Effets de la Colibactine 32 2.3.4. Distribution de l’îlot pks 34

3. Les cassures double‐brin de l’ADN et la réponse cellulaire 37 3.1. Formation des cassures double‐brin de l’ADN (CDB) 38 3.2. Réponse cellulaire aux dommages à l’ADN 39

3.2.1. Cascade de signalisation ATM et activation du checkpoint G2/M 41

3.2.1.1. γH2AX, marqueur de cassures double‐brin 43 3.3. Checkpoints pendant la mitose 44 3.4. Systèmes de réparation de cassures double‐brin de l’ADN 46

3.4.1. Système de recombinaison homologue 46 3.4.2. Système de recombinaison illégitime 48 3.4.3. Choix entre les systèmes NHEJ et HR et le cycle cellulaire 50 3.4.4. Polymorphisme génétique des gènes de réparation 51

4. L’après‐réparation 52 4.1. Remaniements chromosomiques 54

2

4.2. Perte des télomères 56 4.3. Cycles BFB (Breakage‐Fusion‐Bridges) 57 4.4. Perte de matériel génétique 58 4.5. Aneuploïdie et Tétraploïdie 59 4.6. Instabilité chromosomique et instabilité génomique 61

5. Instabilité génomique 65 5.1.1. Stress réplicatif 67 5.1.2. Transformation Cellulaire 68

6. Conclusion bibliographique et positionnement du travail expérimental 72 Travail Expérimental

7. Introduction au travail expérimental 76 8. Publication 80

9. Discussion et Perspectives 91

9.1. La Colibactine, déclenche‐t‐elle une instabilité génétique au niveau du côlon? 92 9.2. Bactéries et cancer 94

9.2.1. Helicobacter pylori 99 9.2.2. Streptococcus infantarius (bovis) 100 9.2.3. Enterococcus faecalis 100 9.2.4. Helicobacter hepaticus 101

9.3. Perspectives 101 9.3.1. Etudes in vivo 102 9.3.2. Etudes in vitro 104

Références 106

3

I. Remerciements.

Pr. Claude PETIT,

Je te remercie pour ton amitié et ton soutien, j’admire beaucoup ta grande humanité et ta sympathie. C’est grâce à toi que j’ai eu l’opportunité de débuter cette thèse et je t’en suis très reconnaissant.

CR. Jean‐Philippe NOUGAYREDE,

Merci de me guider au sein du labo, merci pour toutes ces heures passées dans le couloir à discuter des résultats et des manipulations à suivre. Toujours des bonnes idées. La qualité de la publication est grâce à toi.

PUPH. Eric OSWALD,

J’apprécie beaucoup ta façon de gérer l’équipe, ceci nous permet de travailler dans un environnement très agréable, mais qui reste en même temps exigeant et perfectionniste. Merci de m’avoir donné la possibilité de travailler avec ton groupe et toi.

L’ensemble de l’équipe,

Ce fût très agréable de travailler avec vous tous ; des moments que je garderai précieusement dans mes souvenirs.

Caro,

Des week‐ends au laboratoire, des heures dévant l’ordinateur, en se couchant tard, en se reveillant tôt. Merci pour ta compréhension et ta solidarité.

Aux membres du jury,

Je vous remercie d’avoir cordialement accepté de juger mes travaux de thèse.

ARC et ENVT,

Merci à l’Association pour la Recherche sur le Cancer d’avoir financé ce projet et merci à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse d’avoir accepté de m’accueillir dans ses instalations.

4

II. Liste desfFigures et tableaux

Chapitre 1 Figure 1. Diversité phylogénétique des E. coli 13 Figure 2. La plasticité génomique des E. coli 15 Figure 3. Les éléments génétiques mobiles 16 Figure 4. Distribution des souches ExPEC 19 Figure 5 Toxines produites par les ExPEC 23

Chapitre 2 Figure 1. CNF1 et ses effets cytopathiques 26 Figure 2. Mégalocytose et arrêt du cycle cellulaire induit par CDT 27 Figure 3. Représentation schématique de l’îlot génomique pks 28 Tableau 1. Liste des 23 gènes composant l’îlot pks 29 Figure 4. Structure putative de la Colibactine d’après l’analyse in silico 30 Figure 5. Molécules synthétisées à partir des NRPS‐PKS 31 Figure 6. Mégalocytose dans les cellules exposées à la Colibactine 32 Figure 7. Cinétique du cycle cellulaire suivant une infection avec E. coli pks+ 32 Figure 8. Induction des cassures double‐brin de l’ADN après infection avec des E. coli produisant la Colibactine 33 Figure 9. Distribution de l’îlot pks dans l’organisation phylogénétique de E. coli 34 Figure 10. Rôle de la Colibactine et impact sur l’hôte 36

Chapitre 3 Figure 1. Les checkpoints du cycle cellulaire en relation avec les phases du cycle 41 Figure 2. Le checkpoint G2/M 42 Figure 3. La cascade de signalisation d’ATM et les checkpoints du cycle cellulaire 43

Figure 4. Foci γH2AX comme marqueurs des cassures double‐brin de l’ADN 44 Figure 5. NHEJ et HR dans le cycle cellulaire 45 Figure 6. Système de réparation HR 47 Figure 7. Le système NHEJ 50

Chapitre 4 Figure 1. Remaniements chromosomiques. 55 Figure 2. Principaux remaniements chromosomiques 56 Figure 3. Cycles de cassure‐fusion‐pontage 57 Figure 4. Formation des micronoyaux et des ponts nucléoplasmiques 59 Figure 5. Le développement de l’aneuploïdie 60 Figure 6. Mérotélie 63 Figure 7. Mécanismes pouvant déclencher une instabilité chromosomique 64

5

Chapitre 5 Figure 1. Développement du cancer induit par l’activation des oncogènes 67 Figure 2. Les caractéristiques principales du cancer 69 Figure 3. Modèle de transformation cellulaire 71

Discussion et Perspectives Figure 1. Les souches E. coli pks+, sont‐elles cancérigènes ? 94 Figure 2. Transformation épithéliale au niveau du côlon 103

6

7

7

III. Abréviations

8

IV. Résumé

Effet génotoxique des souches d’Escherichia coli produisant la Colibactine

scherichia coli (E. coli) est une bactérie commensale qui réside dans le tractus gastro‐intestinal des es, principalement au niveau du côlon. Certaines souches de E. coli sont aussi des pathogènes

testinaux ou du système urinaire voire systémique (souches pathogènes extra‐intestinales). Environ 34% des souches commensales de E. coli du groupe phylogénétique B2 et 53% des souches isolées d’infections extra‐intestinales possèdent dans leur génome un îlot génomique « pks » qui code pour la production d’un polyketide‐peptide non‐ribosomal, la Colibactine. Les souches de E. coli pks+ provoquent des cassures double‐brin de l’ADN (CDB) dans des cellules eucaryotes en culture.

Dans mes travaux de thèse, j’ai examiné l’expression et l’activité de la Colibactine in vivo, et étudié les conséquences pour les cellules hôte des dommages à l’ADN infligés par la toxine. J’ai pu montrer dans un modèle murin d’anses ligaturées du côlon, avec un système rapporteur GFP, que les gènes de l’îlot pks étaient bien exprimés in vivo. En utilisant comme marqueur des CDB l’histone H2AX phosphorylée

(γH2AX), j’ai démontré la présence de ces lésions dans les cellules épithéliales du côlon après l’injection d’une E. coli pks+ mais pas après l’injection d’un mutant isogénique déficient pour la production de Colibactine. Ces résultats ont été confirmés avec un autre modèle murin dans lequel les souris étaient traitées par des antibiotiques puis gavés avec les E. coli pks+.

Pour examiner les conséquences des dommages à l’ADN infligés par la Colibactine, j’ai utilisé un modèle de cellules en culture infectées avec les E. coli pks+ à une dose infectieuse comparable à celle qui peut avoir lieu in vivo. Les cellules exposées aux faibles doses de bactéries (1 à 20 bactéries/cellule) produisant la Colibactine répondaient aux dommages à l’ADN de façon transitoire et réversible, puis ces cellules poursuivaient leurs divisions. Toutefois, une fraction de ces cellules en mitose montrait des signes de persistance des CDB, des ponts anaphasiques et des micronoyaux. Ceci entrainait des aberrations chromosomiques (translocations, anneaux, dicentriques), ainsi que de l’aneuploïdie / tétraploïdie. La persistance des aberrations chromosomiques et mitotiques jusqu’à 21 jours après l’infection indiquait la propagation de cycles BFB (« breakage‐fusion‐bridge ») et une instabilité chromosomique. Enfin, j’ai montré que ces cellules présentaient une élévation significative de leur fréquence de mutation génique ainsi que de leur capacité à former des colonies en agar.

En conclusion, mes résultats indiquent que la Colibactine est exprimée in vivo, et qu’elle induit des CDB dans les entérocytes. L’exposition de cellules en culture aux souches produisant la Colibactine induit des CDB qui sont incorrectement réparés, ce qui déclenche une instabilité chromosomique persistante, des mutations et la transformation cellulaire. Cet enchaînement d’évènements délétères pour la stabilité génétique des cellules est déclenché par une simple infection, à faible dose, de E. coli pks+. Ces résultats suggèrent que la présence de ces bactéries génotoxiques dans le microbiote intestinal pourrait représenter un facteur prédisposant pour le cancer sporadique du côlon.

Emammifèrin

9

V. Summary

Genotoxic effect of Escherichia coli strains producing Colibactin.

Escherichia coli (E. coli) is a commensal bacterium that inhabits the mammalian gastrointestinal (GI) tract, especially the colon. Some E. coli strains are pathogenic, infecting the GI tract, or extra‐intestinal tissues. Up to 34% of commensal strains of phylogenetic group B2 and 53% of E. coli strains isolated froextra‐intestinal infections have in their genome the genomic island “pks”, which codes for the production of a non‐ribosomal polyketide‐peptide hybrid compound, called Colibactin. E. coli pks+ strains cause DNA double strand breaks (DSB) in cultured eukaryotic cells.

m

During my thesis, I examined the in vivo expression and activity of Colibactin, and studied the

a re

occur in vivo. Cells exposed to low dose

ngs and

ally, I ation

ing with

unrepaired DSB, triggering genomic instability. These cellular anomalies appeared following a single low y

consequences of Colibactin‐inflicted DSB in infected cells. I showed in a colon loop mice model, using a GFP reporter system, that the pks genes were expressed in vivo. Using the phosphorylated histone H2AX

(γH2AX) as a marker of DSB, I showed that Colibactin inflicted DSBs in colonocytes following injection ofE. coli pks+ strain, but not an isogenic mutant impaired for Colibactin production. These results weconfirmed using an antibiotic‐treated mice model in which animals were fed per os with the strains afterfive days of antibiotic treatment.

In order to study the consequences of this genotoxic exposure, I used various cultured cell lines that were infected in vitro with infection doses relevant to what caninfections (1 ‐ 20 bacteria/cell) showed a transient DNA damage response followed by cell division. However, some of these cells showed signs of persistent DSB during mitosis, anaphase bridging and micronuclei formation, accompanied by chromosome rearrangements such as translocations, ridicentrics. These changes were followed by aneuploidy / tetraploidy formation. Abnormal mitosis and chromosomes persisted as long as cells were kept under culture (up to 21 days), indicating the development and maintenance of breakage‐fusion‐bridge cycles and chromosome instability. Finshowed that exposed cells had a higher gene mutation frequency and anchorage‐free colony formcapacity.

To conclude, the results obtained during my thesis showed that Colibactin is expressed in vivo, causDSB in mice colonocytes. Under in vitro culture conditions, cells exposed to Colibactin enter mitosis

dose infection with a Colibactin producing strain. These results suggest that E. coli pks+ strains commonlfound in the microbiota could be a predisposing factor for sporadic colon cancer development.

12

1. Escherichia coli, une espèce bactérienne polymorphe

L’espèce bactérienne Escherichia coli a été isolée pour la première fois par Theodor Escherich (1857‐1911), connu comme le premier médecin spécialiste des maladies infectieuses de l’enfant. Escherich avait appris les techniques de culture bactérienne avec Wilhelm Frobenius, un médecin qui s’était lui‐même formé auprès de Robert Koch (1843‐1910) ; ce dernier, célèbre pour sa découverte de la bactérie responsable de la tuberculose qui porte son nom, est l'un des fondateurs de la bactériologie. En premier lieu, Escherich avait réussi à prouver que le méconium était stérile, que la colonisation bactérienne de l’intestin était liée directement à l’environnement du nouveau né, y compris le lait maternel, et que cette colonisation avait lieu pendant les premières 24 heures. Il réussit à isoler 19 souches différentes, entre bacilles et coques, et en suivant les méthodes de culture anaérobie, développées par le biologiste Hans Buchner (1850‐1902), Escherich décrit en détail une bactérie appelée Bacterium lactis aërogenes, aujourd’hui connue comme Klebsiella pneumoniae, et la souche Bacterium coli commune, aujourd’hui connue comme Escherichia coli (E. coli). Il démontrait aussi que, en condition anaérobie, la croissance bactérienne dépendait entièrement de la fermentation des glucides25.

De nos jours, E. coli est probablement la bactérie la mieux connue et la plus étudiée. Gram négative, et non‐sporulante, E. coli est l’une des premières bactéries à coloniser le tractus intestinal des mammifères. La niche écologique de cette bactérie se trouve dans la couche de mucus secrétée par l’épithélium du côlon, mais aussi dans le sol. Etant donné qu’elle est hautement compétitive dans cet environnement, E. coli est la bactérie anaérobie facultative la plus abondante dans le côlon humain, dans celui d’autres mammifères et des oiseaux 4, 26, 27. Les souches commensales de E. coli sont donc très bien adaptées à une « coexistence pacifique » avec l’hôte.

L’une de souches de E. coli la mieux caractérisée est la souche K‐12. Cette souche est utilisée comme un outil de travail dans la recherche scientifique, dans des études de génétique, de biologie moléculaire, de physiologie, et de biochimie. E. coli est aussi utilisée en tant que marqueur de la qualité de l’eau et des sédiments, particulièrement comme indicateur de contamination fécale.

Cependant, E. coli est non seulement une bactérie qui réside en symbiose dans le côlon et un outil très efficient dans les laboratoires, mais elle peut être aussi un redoutable pathogène pouvant provoquer des maladies sévères, non seulement au niveau du tractus intestinal mais aussi dans d’autres systèmes comme le système urinaire, nerveux ou sanguin (infections extra‐intestinales). E. coli est responsable de la mort de deux millions de personnes par an, que ce soit par infections intestinales ou extra‐intestinales28, 29. Ces caractéristiques soulignent l’intérêt de

13

Figure 1. Diversité phylogénétique des E. coli. Les cercles représentent l’analyse de 161 souches isolées d’une bactériémie ; les carrés représentent 67 souches ECOR ; et les triangles représentengénomes de référence. En rouge

t 7

le groupe B2, en vert le B1, en jaune le D, et en bleu le groupe A

salisme, de trouver comment le lien entre les deux peut fluctuer d’une relation de symbiose à celle d’une pathologie.

s

putP, .

ches s

,

5.

chercher la transition entre pathogénicité et commen

1.1 Diversité et clonalité de l’espèce E. coli

En 1976, Orskov et al. ont proposé l’une des premières classifications de l’espèce, basée sur la distribution non aléatoire des antigènes ou serotypage30. Dans les années 1990s la classification ECOR (E. coli Collection Reference) est apparue. En utilisant la méthode MLST (multilocusequence typing), Ochman H. et Sealander RK. ont pu référencer 72 souches de E. coli qui représentaient l’espèce totale. Cette classification se fondait sur la séquence nucléotidique de plusieurs gènes de ménage31, 32.

Dés les années 2000, en utilisant la PCR, l’espèce a pu être classifiée en six groupes phylogénétiques (A, B1, B2, C, E, et D), sur la base de six gènes essentiels (trpA, trpB, pabB,icd, and polB). Les groupes A, B1, D, et B2 (Figure 1) sont les quatre groupes les plus importantsL’analyse phylogénétique a permis de comprendre que le groupe B2 est le plus ancien, et à l’inverse, les groupes A et B1 sont très proches et plus récents7, 32, 33.

Ces études ont permis une description phylogénétique de haute qualité. Les premières bran(les plus anciennes) sont donc les groupes B2 et deux sous‐groupes du groupe actuel D, appelégroupes F et E. Le groupe D proviendrait des branches F et E, les groupes A et B1 seraient apparus plus tard comme des branches sœurs. Comme le groupe B2 est le plus ancien, il contient la plus haute diversité génétique. Le groupe phylogénétique B2 pourrait être considéré

14

du fait de son ancienneté, comme une sous‐espèce. Il possède une structure clonale et neuf sous‐groupes phylogénétiques. Les souches qu’on trouve dans le sous‐groupe VII n’ont aucun facteur de virulence, ce sont donc principalement des souches commensales. La prévalence du

st en nette augmentation dans les flores des 5, 34‐37

pnt

gue sévère, majoritairement associées à la production de toxines ) les souches

ge a souche prédominante réside

dans le côlon pendant de longues périodes, tandis que la souche secondaire le fera pour quelques jours ou semaines. D’autres études ont montré que s souches varie entre les populations humaines, avec la plus haute diversité entre tropicaux.

Les isolats de E. coli des animaux domestiques, comme le chi té plus faible comparée à celle des animaux sauvages. Cette variation variété et/ou exposition aux souches de E. coli quand le niveamoins bien contrôlé36, 38, 39. La diversité phylogénétique dépeenvironnementaux; on peut ainsi expliquer la prévalence des s principaux (A, B1, D, et B2). Chez les humains, le groupe A est minant (40.5%), suivi du groupe B2 (25.5%), puis des groupes B1 et D (17% chacun). Chez les animaux, le groupe dominant est le B1 (41%), suivi du groupe A (22%) et B2 (21%), puis D (16%). Cette variabilité ne peut toutefois pas être attribuée à une affinité pour un hôte spécifique. A ce jour, seulement quelques souches du groupe B1 ont été isolées chez des animaux exclusivement, et un seul clone non‐pathogène u groupe B2 a été isolé, uniquement chez l’homme7, 39‐43.

érise ts

fonds génétiques principaux ; (i) Le fond commun (« core genome »), présent dans toutes les

groupe B2, depuis les 20 dernières années, epopulations humaines des pays industrialisés et/ou au climat tempéré .

En ce qui concerne la répartition des souches de E. coli athogènes au sein de l’arbre phylogénétique, nous retiendrons essentiellement que (i) les souches pathogènes produisades infections extra‐intestinales (ExPEC) appartiennent principalement au groupe B2, et minoritairement au groupe D, mais à aucun autre groupe ; (ii) les souches pathogènes responsables de diarrhée ai etet/ou l’invasion de cellules eucaryotes ne se retrouvent pas dans le groupe D ; et (iiiassociés à une diarrhée chronique et légère sont distribuées un peu partout dans l’arbre phylogénétique.

En suivant cette organisation phylogénétique, il a pu être établi que chaque personne héberune souche de E. coli prédominante et une autre secondaire. L

la diversité des ce les individus des pays

en et le chat, ont une diversi peut être due à une plus grandeu d’hygiène est plus faible ou nd donc des facteurs quatre groupes phylogénétique do

d

1.2 La diversité génétique et les éléments génétiques mobiles

La variabilité génétique qu’on retrouve chez E. coli est due à la grande plasticité qui caractleur génome12. Les comparaisons des séquences des génomes disponibles et des différenfacteurs de virulence acquis avec l’évolution de l’espèce ont mis en évidence l’existence de deux

15

Figure 2. La plasticité génomique des E. coli. En bleu la totalité des gènes connus dans l’espèce (« pan‐genome »), en jaune le contenu

e »)

moyen en nombre de gènes chez une souche de E. coli donnée et en rouge le nombre de gènes communs (fond commun, ou « core genomà toutes les souches12.

souches de E. coli; et (ii) le fond dérivé, très différent entre les souches, qui permet l’expresside facteurs de virulence provoquant des maladies plus sévères. Par exemple, les souches associées à une diarrhée sévère et aigue proviennent toutes du groupe D, indiquant un point important dans l’évolution de l’espèce7.

on

Le répertoire total de gènes de l’espèce est estimé, à ce jour, à 17.838. La majorité des souches , c’est‐à‐

uns à de gènes

des gènes qui confèrent à

des

porte environ 4.721 gènes, et seulement 1.976 gènes appartiennent au fond commundire que uniquement 11% des gènes connus sont communs à toutes les souches de E. coli (Figure 2)37. Avec les séquences génomiques connus à ce jour, on sait que les gènes commtoutes les souches n’augmentent pas plus que ceux déjà connus, par contre le nombre propres aux sous‐groupes ne cesse d’augmenter42.

Cette diversité est due aux éléments génétiques mobiles qui portent les facteurs d’adaptabilité (« fitness ») et de virulence. La première preuve de l’existence de ces éléments a été obtenue il y a un peu plus de 30 ans, lorsqu’il a été prouvé que l’activité entérotoxique des certaines souches était transmissible par un plasmide. Les plasmides ne sont pas les seuls vecteurs de diversité génétique ; le matériel génétique peut être transféré aussi par des transposons, des bactériophages et par des îlots de pathogénicité (Figure 3)4, 44.

1.2.1 Les îlots génomiques et/ou de pathogénicité

Les îlots génomiques (GEI) et/ou de pathogénicité (PAI) regroupentleurs bactéries hôtes des caractères de versatilité et d’adaptabilité (« fitness ») ainsi que de virulence. Ces îlots se caractérisent par un contenu G+C qui diffère du reste du génome, par motifs de séquences répétés qui flanquent leurs extrémités, et par une insertion chromosomique au niveau des gènes d’ARN de transfert (tARN). Ces caractéristiques

16

témoignent de leur acquisition par un processus de transhorizontal. Ils comprennent

fert

environ entre 10 et 200 kb, ce qui représente de vastes parties du génome45.

Ils ont été initialement identifiés chez les E. coli uropathogènes, plus particulièrement chez la souche 536, isolée d’une infection du

e PAI46.

ion d’hémolysine et du fimbriae P. Le premier PAI à avoir été décrit chez les E. coli diarrhéiques est le LEE (locus of enterocyte effacement)47.

Les PAI portent donc les gènes

homogène : il s’agit de régions d’ADN mosaïque instables.

Cependant, les facteurs de virulence qu’ils encodent peuvent être d’importants facteurs de

rcer des effets s suggère

tractus urinaire. Cette souchpossède au moins quatrePar exemple le PAI II, d’une taille de 100 kb, se trouve inséré au niveau du gène leuXtRNA, et il code pour la product

qui codent pour un ou plusieursfacteurs de virulence, et ils sontformés par plusieurs étapes d’intégration et de remaniements de l’ADN, doncils n’ont pas une séquence

survie et de compétition dans des niches différentes de celles où la bactérie induit une pathologie : les PAI représentent ainsi des facteurs de performance et de compétition48.

Les PAI peuvent intégrer des gènes d’autorégulation. Ces gènes peuvent aussi exerégulateurs en dehors de leur propre PAI, et vice‐versa49. L’ensemble des ces élément

Figure 3. Les éléments génétiques mobiles. Les facteurs de virulence peuvent être codés par des gènes trouvés dans des transposons (Tn), des îlots de pathogénicité (PAI), des bactériophages (Phage) et/ou dans des plasmides (Plasmid). Selon le pathovar, on trouvera les différents éléments acquis par le transfert horizontal d’information génétique. De cette façon, les souches produisant une dysenterie, une méningite, une diarrhée, une infection urinaire (UTI), ou un syndrome d’hématurie (HUS), portent des éléments génétiques différents, qui leur confèrent des facteurs de virulence spécifiques et donc des avantages de colonisation et survie dans un environnement spécifique4.

17

une forme d’intercommunication entre les différents PAI. D’autrelation avec la régulation des PAI sont les gènes tARN. Ils serve d’insertion d’ADN. Mais il existe des gènes tARN mineurs, qui on régulatrice (théorie des codons mineurs)50, 51.

Les îlots confèrent donc à la bactérie hôte des fonctions ou des supplémentaires d’adaptation au milieu; de résistance aux antibiotiques, capacités métaboliques (la capture du fer), capacité de symbiose ou de vir plupart des gènes codant pour la production de facteurs de virulence ch trouvent dans des îlots de pathogénicité (PAI)45.

1.3 Les E. coli pathogènes.

Les souches pathogènes de E. coli sont classées en plusieurs pathovars,de virulence acquis par transfert horizontal, des environnementd’invasion et de la pathologie induite.

Le pathovar EPEC (E. coli entéro‐pathogènes) est divisé en deux appartiennent au groupe phylogénétique B1 et B2, respectivem . coli entéro‐hémorragique) est distribué entre les groupes A et B1, mdans le groupe E, comme le sérovar O157:H7. Le pathovar ETEC distribué (E. coli entéro‐agréga tique saE létiquF tinaux) est principalement classé d

O en sérp les ant( fèr térie, et le «

1 du tractus intestinal

EC ant une une

réponse inflammatoire et une diarrhée. Les EHEC produisent également une lésion

res types de gènes en possible nt principalement comme sitest probablement une fonction

capacités

ulence. Par exemple, la ez les E. coli pathogènes se

en fonction des facteurs s colonisés, des caractéristiques

sous‐groupes EPEC1 et 2, qui ent. Le pathovar EHEC (Eais on trouve aussi des EHEC (E. coli entéro‐toxigéniques) estatives) et DAEC (diffusely‐uf les groupes E. Shigella et les e hautement spécialisé.

entre les groupes A, B1 et C. EAECdherent E. coli) se trouvent dans tout l’arbre phylogénéIEC (E. coli entéro‐invasives) forment un groupe monophyinalement, le pathovar ExPEC (E. coli pathogènes extra‐intesans le groupe B2, avec une petite partie dans le groupe D7.

utre les pathovars, E. coli peut être aussi sous‐classifiéerésence d’antigènes particuliers ; L’antigène « O » pourlipopolysaccharides)(LPS), le « H » pour les flagelles, qui con K », pour les antigènes capsulaires4.

.3.1 Les souches pathogènes

ovars, en fonction de la igènes de membrane e la mobilité à la bac

Parmi les souches pathogènes du tractus intestinal, on trouve les EPEC, EHEC, ETEC, EAEC, EIet DAEC. Les EPEC s’attachent aux entérocytes en détruisant leurs microvillosités, induislésion très caractéristique d’attachement et d’effacement. Ces perturbations déclenchent

d’attachement et d’effacement mais au niveau du côlon. En outre, elles produisent la toxine Shiga (Stx) qui peut induire des complications graves comme une diarrhée aigüe et profuse,

18

accompagné d’une colite hémorragique et un syndrome hémolytique‐urémique. Les ETECs s’attachent aux entérocytes mais ils produisent des toxines thermolabiles (LT) ou thermostables(ST), induisant une diarrhée profuse. Les EAEC s’attachent aux entérocytes et sécrètent des entérotoxines cytotoxiques, tandis que les EIEC

pénètrent dans les cellules intestinales, dans laquelle elles se déplacent en utilisant les filaments d’actine. Enfin, les DAEC s’attachent aux

ont par la suite

Les souches ExPEC se caractérisent par leur pouvoir de coloniser d’autres systèmes en dehors l26 et elles représentent possiblement un risque sanitaire plus élevé

que celui des E. coli pathogènes intestinales, même si les ExPEC ne provoquent pas de grandes

du nouveau né, de la pneumonie nosocomiale, et de 52

fer, et

différents pathotypes, selon les ils

représenter les souches de E. coli intestinales 26 e raison, il a été suggéré que des facteurs

de virulence comme la fimbriae‐P sont plutôt des facteurs de colonisation intestinale qui

F1C, S, M, et Dr, qui aident à la colonisation, puis des toxines comme l’hémolysine, CNF, et Sat 4.

entérocytes où elles stimulent la formation de projections cellulaires qui venvelopper la bactérie.

1.3.2 Les E. coli pathogènes extra‐intestinales (ExPEC)

du système gastro‐intestina

épidémies et que leur morbidité reste relativement faible (ex. cystite)29. Les souches ExPEC sont responsables d’infections du tractus urinaire (cystites et pyélonéphrites), de la cavité abdominale (péritonite), de méningitessepsis . Elles peuvent être retrouvées pratiquement partout dans l’organisme, par exemple enprovoquant une ostéomyélite53.

Les ExPEC sont distribués principalement dans le groupe phylogénétique B2, et dans une moindre mesure dans le groupe D (Figure 4). La virulence des souches ExPEC est un processus basé sur de multiples facteurs génétiques, c’est la combinaison de plusieurs facteurs de virulence qui confère le niveau de virulence à chaque souche. Ces facteurs comprennent principalement des systèmes d’adhésion, de synthèse de LPS et de capsule, de capture dudes toxines, qui sont codés par des plasmides, des bactériophages et des îlots génomiques de pathogénicité35, 36. Les ExPEC peuvent être sous‐classifiées en sites extra‐intestinaux qu’ils colonisent et les caractéristiques cliniques de la maladie qu’déclenchent.

Les ExPEC n’induisent pas de pathologie dans le tractus intestinal, et peuvent y cohabiter en tant que souches « commensales », et mêmedominantes chez 20% des humains sains . Pour cett

confèrent aux ExPEC une grande capacité d’adhésion au niveau du côlon54, 55.

Parmi les ExPEC, on peut différencier le sous‐pathovar UPEC (E. coli uropathogènes). Les UPEC sont les bactéries les plus fréquemment isolées dans les infections du système urinaire, et ce sont seulement six sous‐groupes « O » qui provoquent 75% des infections urinaires (cystites etpyélonéphrites), en exprimant des adhésines comme l’adhésine P (Pap), les fimbriae type 1,

19

Lors du développement d’une infection urinaire, les UPEC colonisent d’abord le tractus intestinal, puis de façon ascendante l’urètre et la vessie. Mais elles peuvent aussi arriver au système urinaire depuis l’environnement ou par une transmission entre individus. Une fois dle système urinaire, le fimbriae de type 1 favorise leur attachement, principalement dans le système urinaire bas (urètre et vessie). Cette première phase provoque une exfoliation épithéliale et une apoptose cellulaire56. L’exfoliation favorise la formation d’amas bactérierecouverts d’une riche c

ans

ns ouche de polysaccharides dans l’épithélium vésical formant ainsi des

IBC (intracellular bacterial communities), qui jouent le rôle de réservoir bactérien provoquant tions multiples chez un même patient

trôle la

des reins, la bactérie se fixe, grâce à la production du fimbriae‐P, aux

. Une

ine et ns

l est fort, la bactérie est capable de traverser la paroi des tubules

e

‐60.

Le deuxième sous‐pathovar que

li

ainsi des infections récurrentes57, 58. De ce fait, des infecsont généralement dues à la même souche bactérienne. Parallèlement, les UPEC ont aussi unegrande capacité à pousser dans l’urine puisqu’elles sont très efficaces pour capturer le fer, qui est présent en très faible quantité dans la vessie, et elles tolèrent bien le fait que l’urine soit unesolution hypertonique. Pour que les UPEC atteignent le système urinaire haut et provoquer une pyélonéphrite, il leur faut pouvoir se détacher de l’épithélium. Ainsi le système qui conproduction de fimbriae type 1 est régulé négativement, elles peuvent donc migrer de façon

ascendante. Une fois au niveau

récepteurs de digalactosidefois le rein atteint, la production de toxines telles l’hémolysSat, de composants bactériecomme le LPS, et les adhésines de type 1 et P pili déclenchent une pyélonéphrite. Si le dommage provoqué au niveau épithélia

proximaux ainsi que les cellulesendothéliales, puis elle pénètrdans la circulation sanguine et déclenche une bactériémie58

l’on peut différentier chez les ExPEC est celui des MNEC (E. coméningitiques). Les MNEC sont l’une des causes principales de

Figure 4. Distribution des souches ExPEC entre les groupes phylogénétiques D et B2. Les ExPEC (violet) sont distribuées majoritairement dans le groupe B2. Dans ces groupes, on trouve également des souches commensales (blanc), DAEC (gris), EPEC (bleu), et EAEC (vert). Les souches ExPEC ont été isolées soit des infections urinaires, donc ce sont des UPEC, soit de méningites du nouveau né, donc des MNEC (modifié de 7).

20

méningite chez le nouveau né, avec une mortalité qui peut atteindre 40%, et des risquesde séquelles neurologiques61. Comme les UPEC, les MNEC sont représentées par un petit groupe de bactéries de sérotype « O », avec 80% des MNEC portant un antigène capsulaire de type K1. Lors d’une méningite, l’invasion bactérienne se fait par voie sanguine, et la sévérité la maladie est associée au niveau de bactéries trouvées dans le sang. Le seuil de déclencd’une méningite est de >103 CFU par ml de sang62, 63. Les souches MNEC porteuses de l’antigèK1 produisent aussi fréquemment le fimbriae S et la protéine transmembranaire OmpA qui leupermettent de s’attacher aux parois luminales de l’endothélium cérébral des nouveaux nés, enutilisant les récepteurs d’une glycoprotéine64. D’autres protéines membranaire sont aussi nécessaires pour l’invasion des MNEC ; IbeA, IbeB, IbeC et AslA63.

Il n’existe pas de frontière nette entre les souches causant des infections urinaires, des septicémies et des méningites, les ExPEC sont des souches généralement apparentées. Ainsi, les souches de sérotype O18:K1:H7, associée à la méningite, est aussi le groupe le plus souvent trouvé dans les cystites non compliquées chez la femme65. Les souches connues pour provoq

rouvées aussi dans les infectionspe O1:K1:H7, qui provoquent une ns extra‐intestinales chez EC. En outre, les souches isolées galement été associées aux es septicémies68. Toutes ces lutôt en un seul bloc que de façoue différents facteurs de virulence provoquer des multi‐syndromes,e les ExPEC sont de bons

.

nt une stratégie d’adaptation, quité du génome de E. coli est à la xplique que des clusters de dans des groupes spécifiques de

élevés

de hement

ne r

uer une cystite et/ou une pyélonéphrite chez les humains sont ret extra‐intestinales du chat et du chien66. Les souches de sérotycolibacillose chez la volaille, est aussi trouvé dans des infectiol’homme67. Il existe donc une potentialité zoonotique des ExPchez des patients humains atteints de péritonite à E. coli ont ésouches trouvées dans des infections du système urinaire et dobservations suggèrent que l’évolution des ExPEC ait eu lieu p n séparée ou par sous‐groupes. Il est donc logique d’observer qont une activité dans des environnements différents, pouvant selon le système et l’hôte affecté26. Enfin, gardons à l’esprit qucolonisateurs du tractus intestinal, particulièrement du côlon.

1.3.3 Facteurs de virulence et de performance chez les ExPEC

L’acquisition des facteurs de virulence représente probableme i co asticb environnement particulier. Ceci eg sentsE. irulence co si che

P i caractérise g sitiontoxines7, 53, 71. La plupart de ces gènes se trouvent dans des îlo

nfère un avantage sélectif au cours de l’évolution. La plase de leur adaptation à unènes, des îlots génomiques de pathogénicité, soient pré coli. Par exemple, les facteurs de « fitness » et de vlonisation du tractus intestinal chez l’humain mais aus

armi le large répertoire de gènes de virulence quènes codant pour des systèmes de captation et d’acqui

des ExPEC favorisent la z les animaux39, 54, 55, 69, 70.

nt les souches ExPEC on trouve les du fer, des adhésines et des ts de pathogénicité.

21

Principaux systèmes d’utilisation du fer. Chez les mammifères, le fer est fixé et transporté par des protéines (hémoglobine, ferritine, transferrine, et lactoferrine). Cofacteur enzymatiqumétal entre dans les structures de transporteurs d’électrons comme les cytochromes et les protéines fer‐soufre, et il est aussi un régulateur global de nombreux systèmes métaboliques72. Pour que les bactéries puissent disposer d’une quantité suffisante de fer, elles utilisent au moins deux systèmes de capture différents : (i) l’expression de récepteurs de molécules riches en fer comme l’hème, hémoglobine, lactoferrine, et transferrine, (ii) la sécrétion de sidérophores, molécules de bas poids moléculaire, ayant une affinité élevée pour des composants liant le fer73. Il existe plusieurs systèmes de capture du fer, comme l’aérobactine, la yersiniabactinsystème de capture de l’hème (chu et hma), ou le système de trans

e, ce

e, le port du fer (sit).

capture

ans

de pour une machinerie de synthèse de peptides non‐ribosomaux, composée d’au moins cinq produits : deux protéines de

btE, et YbtS 77. Un autre système d’exploitation du fer est l’entérobactine, qui est aussi un sidérophore. La protéine

r ; par es de

synthèse de sidérophores. Tous les gènes codant pour ces récepteurs et systèmes ont été

nicit

Le cluster de gènes aer ou iut code pour l’Aérobactine, qui est un important système dede fer pour les E. coli pathogènes et commensales. On l’a retrouvé dans 69% des souches isolées d’une septicémie, dans 75% d’une pyélonéphrite, dans 60% d’une cystite asymptomatique, d63% d’une cystite symptomatique et dans 35% de souches commensales du côlon74. Pour cette raison, il a été suggéré que le système Aérobactine contribuerait à une meilleure compétitivité et adaptabilité de la bactérie commensale, tandis que chez des bactéries pathogènes il contribuerait à la virulence45.

La Yersiniabactine est un phénolate sidérophore synthétisé par la machinerie enzymatiquecodée par les gènes ybt. Le cluster de gènes ybt se trouve dans le HPI (« high pathogenicity island », PAI IV, 30 kb, inséré au niveau de l’ARNt AsnT) initialement identifié chez Yersinia spp, chez laquelle il est essentiel pour la pathogénicité. Ce HPI est largement distribué dans d’autres entérobactéries, dont E. coli, où 80% des souches ExPEC isolées des septicémies, méningites et cystites le portent, ainsi que parmi des souches du groupe phylogénétique D, et plus minoritairement dans les groupes A et B175, 76. Le cluster ybt co

haut poids moléculaire HMWP1 et 2, et les thioestérases YbtT, Y

(FepA) est extra‐membranaire, elle s’attache à l’entérobactine qui est un chélateur du fer, puis à la protéine FepB qui augmente l’hydro‐solubilité du complexe. De cette façon, le fer peut être introduit dans le cytoplasme bactérien et ensuite utilisé72.

Les UPEC possèdent, par exemple, un large répertoire de systèmes d’exploitation du feexemple la souche CFT073 code pour 14 récepteurs membranaires différents, et 4 systèm

identifiés comme les plus actifs pendant une infection expérimentale du système urinaire chez la souris78, 79. Cela montre que la capture du fer est essentielle pour la survie, colonisation, etpathogé é de cette souche dans l’environnement urinaire, très carencé en fer.

22

Adhésines. Les adhésines confèrent à la bactérie la capacité de s’attacher aux récepteurs spécifiques de l’hôte. Par exemple, chez les UPEC le PAI II code pour la production de fimbriae P

qui utilise les récepteurs galactose‐α1‐4‐galactose des cellules uroépitheliales. Les gènes (paou prs) qui codent pour cette adhésine sont souvent liés génétiquement aux clusters hly et cnf, codant pour l’hémolysine et la toxine CNF45. Une autre adhésine, le fimbriae S, codée par les gènes sfa, est utilisée par les UPEC et MNEC pour s’attacher aux récepteurs de l’acide sialique dans les cellules uroépitheliales et du cerveau. Dans le PAI où se trouvent les gènes sfa, on trouve aussi les gènes iro, un système d’utilisation de fer. Les fimbriae de type 1 (fim), et pap(pyelonephritis‐associated pilus) ou fimbriae P, sont les adhésines les mieux caractérisées ; ellesconfèrent aux bactéries la capacité de s’attacher aux cellules de l’hôte, une étape clé

,

p

dans la pathogenèse de l’infection. Leur expression est régulée par des stimulations

ant la de 80 types antigéniques de capsules (antigènes « K »). Les

capsules sont constituées de couches de polysaccharides assemblés à la surface de la bactérie.

s RTX qui

lpha

olisme13, 45, 84, 85.

environnementales. Leur fonction est très importante pendant l’infection et la colonisation du tractus urinaire, jusqu’aux reins80.

Capsule K1. Les souches ExPEC et tout particulièrement les MNEC sont fréquemment encapsulées. 80% des MNEC expriment la capsule K1. Les capsules sont des facteurs de virulence majeurs, elles permettent à la bactérie d’évader le système immunitaire pendphase d’infection. Il existe plus

Elles interférent avec l’action du complément et des phagocytes. Dans certains cas, les capsulessont faiblement immunogèniques81‐83.

Hémolysine alpha. Parmi les toxines décrites chez les ExPECs, on trouve l’hémolysine alpha, codées par le cluster hly. Les trois gènes qui codent pour le système de sécrétion de type I, et la toxine sont principalement réunis dans des PAI. Elle fait partie de la famille des toxineforment des pores au niveau de la membrane cellulaire. La toxine HlyA est sécrétée par un système de sécrétion de type I. HlyA s’incère dans la membrane cellulaire et y forme un pore (Figure 5). Outre la destruction cellulaire, l’une des fonctions plausibles de l’hémolysine aest l’obtention des nutriments, libérés soit par la destruction cellulaire soit via les pores membranaires. HlyA peut aussi inhiber l’activation d’Akt (protéine kinase B) et provoquer des oscillations de la concentration de calcium intracellulaire, ce qui module la survie de la cellule hôte, la réponse inflammatoire, la prolifération et le métab

23

Sat et Vat. Sat (secreted autotransporter toxin) et Vat (vacuolating autotransporter toxin) des toxines de type V, de la famille des auto‐transporteurs. Elles vont produire une vacuolisation et un engorgement cellulaire. Le rôle de Vat dans la pathogénèse d’une infection extra‐intestinale n’a pas encore été bien identifié. Par contre, la toxine Sat provoque un dommage sévère dans les reins ; perte de la membrane glomérulaire, perte de l’épithélium des tubules, une vacuolisation du tissue, mais sans avoir un rôle déterminé dans la colonisation de la bactérie86, 87.

sont

et

isation d la sphère extra‐intestinale, tout en résidant comme commensales dans le côlon. Elles utilisent un répertoire de mécanismes et facteurs de virulence pour se faire, qui leur permet d’envahir et coloniser les tissus et organes, en manipulant et en échappant les réponses cellulaires de l’hôte13. Il a été proposé récemment que l’une des stratégies utilisées par les bactéries lors de ce processus complexe serait la manipulation du cycle cellulaire des cellules hôte.

Les souches ExPEC sont donc hautement spécialisées pour la colon e

Figure 5 Toxines produites par les ExPEC. HlyA (hémolysine alpha) peut provoquer une lyse cellulaire ou la libération de nutriments. La toxine Sat provoque une vacuolisation cellulaire avec deeffets cytopathiques. CNF facilite la colonisation bactérienne par stabilisation des protéines Rho

GTPases13.

s

25

2. Les Cyclomodulines, des toxines bactériennes qui altèrent le cycle cellulaire de l’hôte

es cyclomodulines sont une famille de toxines et effecteurs bactériens qui perturbent le déroulement normal du cycle cellulaire des cellules hôtes, soit en l’arrêtant (cyclomodulines hibitrices) soit en le stimulant (cyclomodulines stimulatrices)14, 88. Parmi les cyclomodulines hibitrices on trouve CDT (« cytoletal distending toxin ») ou Cif (« cycle inhibiting factor »). CDT

agit comme une DNAse, induit des dommages à l’ADN des cellules hôtes et bloque le cycle ellulaire en activant les points de contrôle (checkpoints) du cycle cellulaire. Cif, produit par des PEC et EHEC, est capable de déclencher l’arrêt du cycle cellulaire sans produire un dommage à l’ADN, mais en induisant la stabilisation des protéines (p21 et p27) inhibitrices des machineries ui contrôlent la progression dans le cycle89. On trouve aussi la protéine IpaB produite par

comme cyclomoduline inhibitrice, qui inhibe l’entrée en mitose en modifiant l’action du e APC (anaphase‐promoting complex). Les cyclomodulines stimulatrices, comme la

xine CNF (cytotoxic necrotizing factor), au contraire favorisent l’entrée en mitose.

n modifiant le déroulement du cycle cellulaire, les cyclomodulines peuvent manipuler la réponse de l’hôte. D’un côté, un effet inhibiteur pourrait modifier la réponse immunitaire, uisque l’expansion clonale des lymphocytes, par exemple, serait altérée. En inhibant la rolifération cellulaire, elles pourraient également ralentir le renouvellement épithélial,

résultant en la facilitation de la colonisation et de l’invasion bactérienne. Un effet stimulateur ourrait altérer la différenciation et le développement cellulaire.

.1 CNF (« cytotoxic necrotizing factor »). Cette toxine a été découverte par Caprioli et al. en 98390. Cette équipe a observé qu’un facteur produit par des E. coli isolées d’entérites de l’enfant produisait une nécrose de la peau du lapin (d’où son nom), et des changements orphologiques marquants dans plusieurs lignées cellulaires. La toxine CNF2 a été décrite en

91, 92 avec des effets similaires à ceux induits par CNF1. CNF2 est codée par le plasmide pVir que CNF1 est codée par un gène chromosomique. Chez les ExPEC le gène cnf1 est

ouvent associé aux clusters hly et pap. Les toxines CNFs sont capables de modifier par déamidation la protéine RhoA (Figure 1). Les protéines Rho font partie d’une super famille de TPases « Ras » et régulent l’assemblage des filaments d’actine, favorisant la formation des

cellules en augmentant leur contractilité. Les protéines Rho cyclent entre un état inactif, fixé au GDP, et un état actif, fixé au GTP. Ceci est sous le strict contrôle des activateurs GEFs (guanine nucleotide exchange factor) et des inactivateurs GAPs (GTPase‐activating proteins)93. Quand RhoA est active, elle augmente la stabilité des structures d’actine, comme les fibres de stress et les adhésions focales. Plusieurs facteurs en aval dans la voie d’activation de RhoA affectent la stabilité des différents facteurs du cytosquelette. ROCK1 confère à RhoA la capacité de

L

inin

cE

qShigellacomplexto

E

pp

p

21

m1987tandiss

Gfibres de stress et des adhésions focales par le recrutement des Rho kinases ROCK1 et 2 (Rho‐associated, coiled‐coil containing protein kinases), intervenant ainsi dans la migration des

26

Figure 1. CNF1 et ses effets cytopathiques. A gauche : mode d’action de la toxine CNF1. Une activation des Rho GTPases stimule la transitionG1/S du cycle cellulaire et la réplication de l’ADN. A droite : CNF1 stimule la re‐réplication de l’ADN en inhibant la cytokinèse. Ceci entraîne la production de cellules multinucléées. Bleu : ADN, Vert : actine14.

phosphoryler la chaine légère de myosine, et facilite la phosphorylation de la Cofiline, qui à son tour inhibe la polymérisation de l’actine, et modifie ainsi la structure cellulaire. Les protéines

ycline

ome.

s

Rho ont aussi rôle dans la progression du cycle cellulaire en influençant les niveaux de la cD1, et des inhibiteurs des CDK (cyclin‐dependent kinases) comme p27KIP1 et p21CIP1 94.

Les toxines CNFs activent donc les Rho GTPases en modifiant un résidu glutamine essentiel pour l’hydrolyse de GTP, résultant en leur activation permanente. Ces toxines stimulent ainsi la transition du cycle cellulaire G1/S et la réplication de l’ADN tout en inhibant la cytokinèse, ce qui entraîne la formation de cellules multinucléées (Figure 1)14, 95. Les toxines CNFs provoquent donc une réorganisation des structures de F‐actine en activant de manière permanentes les protéines de la famille Rho par deamidation, avant qu’elles soient dégradées par le protéas

Ce mécanisme confère aux bactéries UPEC qui les produisent des capacités d’invasion96. Il a étéaussi proposé le possible rôle des toxines CNFs dans la progression des tumeurs, où les cellulequi auraient perdu la capacité d’ubiquitiner les protéines Rho pourraient subit un effet pro‐prolifératif soutenu97‐101.

2.2 CDT. CDT (Cytolethal distending toxin) est la première toxine bactérienne décrite comme provoquant un arrêt du cycle cellulaire eucaryote (Figure 2)14, 102. Les premiers effets toxiquesavaient été décrits dix ans auparavant103, 104. Les toxines CDTs sont produites par de nombreux genre bactérien pathogènes: E. coli (ExPEC et EPEC), Shigella dysenteriae, Campylobacter spp.,Salmonella typhi, Haemophilus ducreyi, Helicobacter hepaticus, et Actinobacillus

27

Figure 2. Mégalocytose et arrêt du

pour la production de CNF2. Les CDTs sont des holotoxines comprenant trois sous‐unités, CdtA, et CdtC. La sous‐unité CdtB est enzymatiquement active, et les un CdtA et C ont pour fonction de faire pénétrer CdtB dans la cellule106, 107, à l’exceptide S. typhi qui a un système différent d’internalisation

cycle cellulaire induit par CDT. A gauche, on note la différence de taille des noyaux (en bleu) des cellules intoxiquées avec CDT. A droite, les mêmes cellules présentent une accumulation en G2/M à la suite de l’arrêt du cycle14.

ie. Cette qui code aussi

CdtB,

on

du cycle

augmentation cellulaire la cellule la phase G2/M mitotique »

108. L’effet CDT observé dans des lymphocytes nette augmentation de la taille cellulaire et les cellules meurent plus précocement par apoptose109.

L’analyse de la structure de la sous‐unité active CdtB110 a permis de mettre en évidence des h le de métalloenzymes (metal ion binding) comme la d 1, l’e ses ou les sphingomyélines type SMase de B catalyse ou l’effet cytotoxique de CDT, émontrant ainsi leur rôle clé dans l’activité enzymatique de CdtB110‐112.

pendante aboutissant à l’arrêt du cycle cellulaire et éventuellement la mort cellulaire114.

t aider à

actinomycetemcomitans105. Chez E. coli on connait aujourd’hui au moins quatre types de CDT. Par exemple CDTIII a été identifié dans la souche ExPEC 1404, isolée d’un veau atteint d’une septicémsouche porte le plasmide bactérien pVir

ités

de CdtB. Les cellules épithéliales en cultureintoxiquées avec CDT présentent un arrêtcellulaire à la transition G2/M avec une marquée de leur taille puis une mortalitétardive. Cette mortalité intervient quanddébloque l’arrêt du cycle cellulaire dans et entre dans une phase de « catastrophe

est différent puisque il n’y a pas une

omologies structurales avec la superfamilésoxyribonucléase (DNase) I humaine, l’endonucléase de réparation de l’ADN humaine Hapxonucléase III de E. coli, les inositol phosphataacillus cereus105, 111. Certaines mutations dans ces résidus structuraux critiques pour la la fixation du magnésium comme dans la DNase type I inhibent

d

CDT induit donc rapidement des casures double brins de l’ADN (CDB), similaires à ceux produits par une irradiation, détectables avec une phosphorylation de l’histone H2AX et la relocalisation du complexe de réparation de l’ADN Mre11‐Rad50112, 113. En réponse aux CDB, les cellules recrutent une voie ATM dé

CDT possède donc une capacité antiproliférative remarquable, observée dans plusieurs lignéescellulaires de type épithélial et immunitaire. Le principal avantage qui pourrait être conféré par CDT à la bactérie pourrait être le ralentissement du renouvellement épithélial et donc une colonisation facilitée. En outre, son effet cytotoxique sur les lymphocytes pourrai

28

Figure 3. Représentation schématique de l’îlot génomique pks. Les gènes clb permettant la synthèse des peptides‐polykétides (PKS/NRPS) en relation avec l’effet cytopathique sont représentés en bleu (foncé et clair). Les gènes qui ne sont pas indispensables pour l’effet cytopathique sont en bla s gènes codant pour des intégrasses et transposasses sont en gris. Les différents d ma

nc. Le

o ines et activités enzymatiques putatifs sont 1notés .

diminuer l’efficacité de la réponse de l’hôprovoqués dans l’architecture épithéliale récepteurs de surface) pourraient aussi ai

2.3 La Colibactine. Cette toxine est codéesynthase, initialement décrit en 2006 par région chromosomique située dans le locL’îlot pks a les caractéristiques générales locus tARN (asnW), (ii) il a un contenu moest flanqué par des motifs de répétitions lik séqueno e comCF e consgè achpe (polykne e 3)1. Jusqpr s non ch a eriaceae étaient les ch

,

par l pks sont

composé (ou mélange de composés) n’a pas été purifié

ept

te à une invasion bactérienne. Les changements (distribution cellulaire donc changements de der la bactérie à envahir les tissus sous‐jacents.

par un îlot génomique « pks » pour polyketide‐Nougayrède et al. 1. L’îlot comprend 54 kb d’uneus ARNt asnW, un site d’insertion et d’échange d’ADN. des ilots génomiques et PAI ; (i) il est inséré dans unyen en G‐C différent de celui du génome moyen, (iii)directes de 18 pb, ainsi que par (iv) un gène intégrasse‐ncé dans une souche E. coli isolées d’une méningite du mensale Nissle1917, et dans les souches UP

ervation >99%. Le cluster de gènes pks compte 19 inerie comprenant trois NRPS (non‐ribosomal etide megasynthases), deux hybrides NRPS/PKS, et u'à cette découverte, les seuls systèmes connus ribosomaux et polyketides peptides non ribosomaux élateurs du fer enterobactine (un peptide non

ribosomal), et la yersiniabactine (un polyketide peptide non ribosomal)115.

2.3.1 Machinerie PKS et

il

EC

e P4. L’îlot pks a été entièrementuveau né (IHE3034), dans la souchT073, 536 et UTI89 et montre unnes (clbA‐R), qui codent pour une mptides megasynthases), trois PKSuf enzymes accessoires (Figuroduisant des hybrides de peptideez les Enterob ct

synthèse de la Colibactine

Comme mentionné ci‐dessusl’ilôt pks possède 23 gènes (clb) (Tableau 1). A l’exception du gène ClbM, toutes les protéines codées

e clusternécessaires pour que la machinerie puisse produire un métabolite final actif putatif, la « Colibactine ». Ce

à ce jour, mais sa structure a été modélisée in silico (Figure

4). Avec la souche E. coli commensale Nissle 1917, Homburg S. et al. ont analysé l’activité transcriptionnelle des gènes clb. Ils ont montré que cette activité est divisée en au moins s

29

Tabc

cluent qu’il est possible qu’il y ait une relation la source de carbone et d’énergie, et l’activité

nscriptionnelle de ces quatre gènes.

.2 NRPS, PKS.

différe

leau 1omposa

n lux

ité polycistronique (6.2 kb) correspond aux gènes clbC – clbG, c’est la partie la moins ordinaire pour

raux

résidu sérine117.

Homburg et al. ont aussi montré que la transcription des gènes clbA ‐ clbH était plus élevée dans des cultures bactériennes sous agitation que dans des cultures statiques, et que la transcription des gènes clbJ – clbQ était considérablement plus basse. En analysant quatre gènes essentiels clbA, clbR, clbB, et clbQ, les auteurs ont montré que cette variation était liéeconentretra

2.3

A la nce de la synthèse de protéines pas les ribosomes, où ssont utilisés, et où des sous‐unités non‐aminoacides ne sont pas in

. Liste des 23 gènes nt l’îlot pks 1

eulement 21 acides aminés clues dans la synthèse, les

bactéries et les champignons ont développé des NRPS et des PKS, systèmes de synthèse demacromolécules indépendants des ribosomes, pour produire des chaines complexes de

unités. L’unité la plus importante comprend les gènes polycistroniques clbI – clbN, d’enviro23.3 kb, codant pour des protéines NRPS et PKS, une amidase (ClbL) et une pompe à effputative (ClbM) du type MATE (multidrug and toxic compound extrusion). La deuxième un

des systèmes NRPS/PKS puisqu’elle code pour des protéines avec des domaines architectupeu communs. ClbC et ClbE ne possèdent pas le domaine acyltransférase, et elles sont possiblement complémentées par ClbG, à activité putative malonyl‐CoA transacylase. Les gènes clbD et clbF codent pour des enzymes qui servent probablement comme substrats acyl, 3‐hydroxyacyl‐CoA déshydrogénase et acyl‐CoA déshydrogénase, respectivement1, 116.

Une co‐transcription entre les gènes clbR/clbA et clbO/clbP a aussi été détectée. Le gène clbR code pour une protéine LuxR‐like, avec un motif helix‐turn‐helix, suggérant qu’il pourrait être un régulateur. Le gène clbA code pour une phosphopantétheinyl transférase (PPT), qui est une enzyme activatrice essentielle dans les systèmes NRPS et PKS. Les enzymes PPT activent des protéines transporteuses par le transfert d’un phosphopantétheinyl sur un

aussi au type du milieu de culture utilisé. Ils

30

peptides et/ou de polyketides. Les NRPS et les PKS sont parmi les plus longues protéines connues118. Les composés synthétisés par ces enzymes forment une large famille avec des fonctions biologiques multiples. On les retrouve dans des bactéries et champignons microscopiques produisant une grande variété de peptides et polyketides. Plusieurs de ces molécules sont devenues des médicaments importants (Figure 5)119, comme la pénicilline (antibiotique) et la cyclosporine (immunosuppresseur) qui sont produites par des systèmNRPS. Les NRPS et PKS sont capable de catalyser plusieurs réactions enzymatiques en chaine ; par exemple la PKS qui synthétise la rapamycine (un immunosuppresseur) et la NRPS qui synthétise la cyclosporine catalysent respectivement 51 et 40 réactions d’assemblage

es

120. Pendant leur cycle de synthèse, il y a toujours trois phases principales : (i) initiation (ii)

t être répété plusieurs fois de façon itérative. dulaires, organisées en modules, eux‐mêmes

gnes d’assemblage.

it l’acide aminé spécifique et l’active par our peptidyl‐carrier protein) fixe l’acide aminé

de condensation (C) permet la liaison

élongation et (iii) terminaison, où l’élongation peuLes enzymes NRPS/PKS sont des enzymes multi mosubdivisés en domaines, et fonctionnent comme des li

Chez les NRPS, le domaine d’adenylation (A) reconnaadenylation, le domaine de thiolation (T, ou PCP psur la NRPS par une liaison thioester, puis le domainepeptidique entre deux monomères, enfin le domaine tcomposé peptidique néoformé. Il existe des dommodifications au cours de l’élongation du composémonomères qui sont assemblés par les NRPS sont lesaussi une centaine d’autres « non‐conve

hioesterase (TE) libère (ou cyclise) le aines secondaires qui effectuent des (épimérisation, methylation). De plus, les 20 acides aminés protéogéniques mais

ntionnels », ce qu ité structurale aux composés issus de ce type de synthèse118,

Les PKS assemblent des monomères acides carboxyliques dérivés de l’acide malonique. Les PKS

i confère une énorme divers 121.

de type I ont un mode d’assemblage linéaire, qui utilise trois domaines enzymatiques fondamentaux ; (i) le domaine kétosynthase (KS) qui condense le substrat sur la chaine, (ii) le domaine acyltransférase (AT) qui reconnaît le substrat et l’active, et (iii) le domaine transporteur d’acyle (ACP) qui porte la chaine en cours d’élongation. Outre ces domaines

Figure 4. Structure putative de la Colibactine d’après l’analyse in silico

31

Figure 5. Molécules synthétisées à partir des NRPS‐PKS. Quelques exemples de molécules produites à partir des

fondamentaux il existe des domaines secondaires ; ketoreductase (KR), déhydratase (DH)énoylréducatse (ER) qui réduisent le substrat. Chez les PKS de type II, on trouve les domaineet ACP (c’est ce dernier qui reconnaît le substrat en l’absence de domaine AT), dont lefonctionnement est itératif, un seul module pouvant condenser plusieurs fois le substrat. Enle composé est libéré par l’action d’une TE119. Il existe trois types de systèmes PKS, leur classification dépend des caractéristiques de la protéine produite. Les protéines multi‐modulaires, avec plusieurs fonctions, sont produites par le type I. Le type II produit des agrégatde protéines monofonctionnelles, et le type III n’utilise pas les domaines ACP119, 122, 123.

systèmes de synthèses NRPS ou PKS. Parmi les molécules synthétisées on trouve l’antibiotique Erythromycine, le sidérophore Yersiniabactine, l’immunosuppresseur Cyclosporine, et la Bléomycine utilisée pour la thérapie contre le

et s KS

fin

s

s

ille

s ce du

aire des modules PKS et NRPS détermine leur spécificité pour un substrat donné125‐127. L'analyse in silico de la séquence en

cancer.

Les systèmes hybrides NRPS/PKS ont les domaines catalytiques conservés des PKS et NRPS maiportent aussi un domaine ketoacyl‐synthase (KS) unique qui permet d’accepter des peptides et non des groupements acyls. Les métabolites produits par ces systèmes hybrides sont donc dérivés des acides aminés et des chaînes courtes des acides carboxyliques122. Dans cette famde métabolites on trouve le sidérophore yersiniabactine124 ainsi que la Colibactine.

Comme les enzymes PKS, NRPS et PKS‐NRPS fonctionnent essentiellement comme des chained’assemblage (donc de façon colinéaire), l’enchainement des modules gouverne la séquenpolyketide/peptide qui est assemblé. De plus la séquence prim

acides aminés des trois PKS et NRPS codées sur l’îlot pks et impliquées dans la biosynthèse de la Colibactine a ainsi permis de proposer une structure théorique (Figure 4).

32

Figure 7. Cinétique du cycle cellulaire suivant une infection avec E. coli pks+. La ligne supérieure montre des cellules infectées avec les bactéries portant le BAC vecteur. Au cours du temps, elles présentent un cycle cellulaire normal. Les cellules infectées avec les bactéries hébergeant le BACpks qui porte l’ilot pks montrent un ralentissement de la phase S puis une accumulation en G2/M 1.

Figure 6. Mégalocytose dans les cellules exposées à la Colibactine.

2.3.3 Effets de la Colibactine

L’îlot pks code donc pour un composé hybride polyketide‐peptide putatif la Colibactine. Même si ce métabolite n’est pas purifié à ce jour, un faisceau d’évidences permet d’affirmer qu’elle agit comme une cyclomoduline

Cellules infectées avec la souche IHE3034, produisant la Colibactine, et cellules contrôle ou infectées avec une souche de laboratoire DH10B. Le trait blanc représente 10µm 1.

antiproliférative, en arrêtant le cycle cellulaire la souche h terial artifical c ( pu étudier les effets induits par la Colibactine dans différents t rent que les cellules ayant été en contact direct avec les bactéries v pks développent une megalocytose (cellules géantes) (Figure 6) et un a que les cellules infectées avec la souche DH10B porteuse du BAC v té sur les gènes codant pour les NRPS ou PKS, ne présentent pas c ce phénotype est exprimé seulement quand la bactérie vivante a été e . Aucun effet n’apparait si l’interaction est effectuée avec des b rées du tapis cellulaire par une membrane perméable (pores de

En étudiant le cycle cellulaire des

Une cinétique avec des cellules

2/M, tandis que les cellules contrôle traversent la phase S en oins de 12 heures (Figure 7)1.

eucaryote. En utilisant E. coli de laboratoire DH10B

ébergeant un BAC (bachromosome) portant l’îlot pks completBACpks), Nougayrède et al. ontypes cellulaires. Ils montivantes portant le BACrrêt de la prolifération, tandis ide ou encore le BACpks mues changements. De plus,n contact direct avec la celluleactéries mortes, lysées, ou sépa 0.22 µm)

cellules infectées, Nougayrède et al. ont découvert que les cellules qui montrent une megalocytose présentent aussi un arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M.

synchronisées dans la phase G1/S montre que les cellules infectées avec le BACpks restent plus longtemps dans la phase S du cycle (environ 48 heures) pour après s’arrêter à la transition G

m

33

L’un des facteurs qui peuvent déclencher l’arrêt du cycle cellulaire est la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN (DDR, cellular DNA‐damage response).

mutated protein) qui joue un rôle central dans la DDR128, oint kinase 2) sont activés dans les cellules infectées

. Chk2 est connu pour désactiver, via une phosphorylation,

‐3‐3. Une a toplasmique de Cdc25C a pu être ec le B aboutit

horylée in la DDR

évaluer le dommage à l’ADN et plus particulièrement e

er la

et

t au signal γH2AX, indiquant dans les conditions de l’expérience une augmentation en CDB (Figure 8)1.

La protéine ATM (ataxia‐telangiectasiaet son transducteur de signal Chk2 (checkpavec les bactéries portant le BACpksla protéine Cdc25C (Cyclin‐Dependent Kinasesle cytoplasme par les protéines 14observée dans les cellules infectées avà l’accumulation de la forme phospcycle cellulaire est dû à l’activation de

L’un des marqueurs les plus utilisés pour les cassures double brins de l’ADN (CDB) est la forme phosphorylée sur la sérine 139 de l’histonH2AX 129. Dans des cellules infectées par les bactéries portant le BACpks on a ainsi pu détect

forme nucléaire phosphorylée de H2AX (γH2AX), 4 heures après la fin de l’infection. Le signal γH2AX des cellules infectées augmente en relation avec la dose d’infection, en commençant par des foyers bien définis jusqu’à une réaction de type pan‐nucléaire. Le signal devient saturé à partir d’une dose d’infection de 100 bactéries par cellule. La présence de CDB dans des cellules infectées avec le BACpks a été confirmée par le test d’électrophorèse unicellulaire en gel (Comassay), la queue de la « comète » s’allongeant avec l’augmentation de la dose d’infection,

parallèlemen

phosphatase C), qui a son tour est retenue dansccumulation cyACpks, et non avec le contrôle BACvec. Ceciactive de Cdk1, démontrant ainsi que l’arrêt du dans les cellules infectées avec le BACpks.

Figure 8. Induction des cassures double‐brin de l’ADN après infectiavec des E. coli produisant la Colibactine. A : Identification de l’histone H2

phosphorylée (γH2AX) en vert. B : Test comète. En présence des CDune queue de « comète » se formesuite à l’électrophorèse des fragmentsd’ADN hors des noyaux1.

on

AX

B,

34

Figure 9. Distribution de l’îlot pks dans l’organisation phylogénétique d’E. coli 1.

ire s’arrête dans la transition G2/M et la cellule développe une megalocytose.

EC et commensales (Figure 9) .

e 32% dans des isolats fécaux . Donc, l’îlot pks se trouverait principalement distribué dans les souches ExPEC qui ont un profil de haute virulence. Par contre une relation d et le niveau de virulence des souches donc possible que la présenc d’autres facteurs de v ns la pathogénicité de la so ois D et al. ont trouvé que l’îlot pks e eure colonisation des so UPEC et non à une v

Récemment, J Putze et al. ont étudié, par criblage par PCR, la distribution de l’îlot pks dans 1,565 isolats d’Enterobacteriacae (entérobactéries). L’îlot était détecté chez E. coli, mais aussi ans des souches de Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, et Citrobacter koseri115,

qui sont tous des microorganismes isolés des infections extra‐intestinales. L’îlot est hautement conservé entre ces espèces, et il est fortement associé au HPI (déterminant de la

La Colibactine est donc une toxine qui induit des CDB dans plusieurs lignées cellulaires in vitro. Le dommage à l’ADN déclenche la DDR, puis le cycle cellula

2.3.4 Distribution de l’îlot pks

Dans une première étude épidémiologique, l’îlot génomique pks a été retrouvé dans 53% des souches ExPEC et 34% d’isolats de souches E. coli commensales. En revanche il n’était jamais trouvé dans des souches pathogènes intestinales comme les EPEC ou EHEC. Un criblage par PCR de la collection ECOR, a montré que l’îlot pks est presque exclusivement, mais largement présent dans le groupe phylogénétique B2, qui comprend principalement des souches ExP

1, 71

Dans une deuxième étude, JR Johnson et al. ont étudié la distribution de l’îlot pks, parmi d’autres facteurs de virulence, dans 131 souches de E. coli isolées chez des vétérans américains, dont 62 isolats sanguins isolés chez des patients malades, et 69 isolats fécaux de patients sains. Les gènes marqueurs de l’îlot pks clbA, clbB, clbN et clbQ étaient significativement associés à une bactériémie, et principalement identifiés chez des bactéries du groupe phylogénétique B2 avec une virulence élevée. Les gènes étaient présents majoritairement dans des isolats sanguins, à raison de 58%, contr 130

irecte entre la présence de l’îlot n’a pas pu être établie. Il este de l’îlot pks soit un marqueur

irulence sans jouer un rôle direct dauche. Dans ce contexte, Dubst principalement associé à une meilluches commensales du côlon et desirulence plus importante131.

d

35

yersiniabactine), même si la production de la Colibactine ne semble pas dépendre de celle de layersiniabactine, puisqu’elle la Colibactine est produite par la souche de laboratoire DH10B portant le BACpks. L’îlot pks se trouve da

ns 53% des ExPEC, et il est inséré dans le locus asnW tARN. J Putze et al. montrent que dans K. pneumoniae, E. aerogenes, C. koseri, et trois souches

ique B1, l’îlot pks se trouve associé aux éléments intégratifs et

e

les E.

ns la souche Nissle1917 ainsi que dans les souches commensales souche ABU (asymptomatic bacteriuremia) 83972132, ainsi que

qui sont

tho

s l, la

in c

te. Cette du

rait à longdans les

de E. coli du groupe phylogénétconjugatifs ICEEc1 et ICEkp1. Parmi les souches E. coli, on retrouve l’îlot pks principalement dansle groupe B2 (53%), avec l’exception de l’identification de l’ilot pks dans trois souches du groupB1. Chez ces trois isolats du groupe B1, plusieurs gènes asn tARN (asnU tRNA) ont servi de site d’intégration, et il en est de même pour plusieurs loci asn tRNA chez K. pneumoniae. Chezcoli du groupe phylogénétique B2, l’îlot pks est très présent dans les souches commensales intestinales (34%), comme dadu tractus urinaire, comme ladans les ExPEC (53%) comme les souches SP15 et IHE3034536.

En raison de sa distribution dans les souches commensales et papeut être considéré à la fois comme un facteur de colonisation et decommensales et comme un facteur de virulence chez les soucheentérobactéries pathogènes. Au niveau de l’épithélium intestinaprolonger la colonisation bactérienne ; en arrêtant le cycle cellulaire,épithélial se trouverait ralenti, permettant donc une meilleure

Mais la Colibactine induit des CDB dans les cellules fectées. Uned’une souche du côlon par une entérobactérie produisant la Colibadommages chroniques et répétés à l’ADN des cellules de l’hôparticiper aux évènements initiaux et/ou promoteurs de cancerqu’une bactérie qui se comporte comme commensale pourdes pathologies les plus diagnostiquées et les plus mortelles développés.

des MNEC, et la souche UPEC

gènes, l’îlot génomique pks survie chez les bactéries

ExPEC et d’autres Colibactine pourrait le renouvellement

colonisation de la niche19.

colonisation à long terme tine, pourrait générer des exposition pourrait

côlon (Figure 10). C’est ainsi terme participer à l’une populations des pays

36

Figure 10. Rôle de la Colibactine et impact sur l’hôte. L’exposition répétée des entérocytes aux bactéries pks+ pourrait entraîner la formation chronique de CDB. A long terme, la mutation des cellules exposées pourrait contribuer à déclencher un cancer sporadique du côlon19.

38

3. Les cassures double‐brin de l’ADN et la réponse cellulaire

La découverte des dommages à l’ADN est liée à l’étude de la biologie de l’irradiation. En 1930, Herman Muller fut le premier à observer que des agents externes, comme les radiations ionisantes, pouvaient provoquer des mutations chez les organismes vivants. Dix ans plus tard, Albert Kelner ébauchait une théorie de la réparation de l’ADN ; mais ce n’est qu’en 1953, avec la découverte de la double hélice par Watson et Crick que l’on réalise la possibilité de disposer d’un brin d’ADN intact pour réparer l’autre133‐135.

3.1 Formation des cassures double‐brin de l’ADN (CDB)

Les CDB représentent l’une des lésions les plus délétère et mutagène que l’ADN peut subir. Les CDB sont générées quand les deux brins complémentaires de l’hélice d’ADN se rompent en même temps, et suffisamment près l’un de l’autre pour que la juxtaposition des parties simple brin proéminentes soit impossible. Les deux bouts terminaux des brins cassés peuvent ainsi être dissociés l’un de l’autre, ce qui complique la tache de réparation et facilite une possible recombinaison inappropriée avec d’autres parties du génome136. Une seule CDB pourrait provoquer la mort de la cellule si elle induit l’inactivation d’un gène essentiel. Outre le fait que les CDB posent un problème pour l’intégrité du génome, les CDB sont aussi produites délibérément dans le cadre d’une réponse physiologique. Par exemple le système de recombinaison V(D)J mis en place pendant le développement des lymphocytes B et T, qui donne lieu à la grande diversité de fixation d’antigènes des immunoglobulines et des protéines réceptrices chez les cellules T. Dans ce système, les CDB sont générées dans des sites spécifiques par les nucléases Rag1 et Rag2. Ces cassures sont réparées par les mêmes protéines qui réparent les CDB provoquées par des agents génotoxiques137, 138.

En dehors des processus physiologiques normaux, les dommages à l’ADN cellulaire peuvent être provoqués par plusieurs facteurs :

‐ La fixation d’adduits covalents aux bases de l’ADN : c’est l’action majeure de cancérogènes tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques ou les amines hétérocycliques. Les adduits de petite taille comme les groupes méthyle forment généralement des lésions codantes et les adduits de grande taille des lésions non codantes : ces lésions provoquent notamment un arrêt de la fourche de réplication.

‐ La formation de dimères de thymine ou de liaison 6‐4 pyrimidine‐pyrimidone, sous l’influence de rayonnements ultraviolets, sources également d’arrêts de réplication.

39

‐ La formation d’adduits oxygénés et/ou de lésions double brins sous l’influence de stress oxydatif, de radiations ionisantes ou de molécules telles que l’étoposide ou la

ayonnement cosmique, des radiations ionisantes et par des agents chimiques dits radiomimétiques (bléomycine, mitomycine C,

ples

s

me la ss

écine. es

fin, l’érosion des télomères est également capable de déclencher la formation de CDB2.

ges à l’ADN

n, t et la

tant la

identiques. Le cycle comporte 4 phases : la phase G1 (cellule à 2N quantité d’ADN), la phase S nt à rôle

(checkpoint), qui bloquent la division cellulaire quand l’intégrité de la cellule et de son génome est altérée. Toute perturbation de ces checkpoints pourrait permettre la multiplication de

bléomycine.

Plus généralement, un agent génotoxique peut exercer une interaction directe avec l’ADN, produire des radicaux libres oxygénés, favoriser un processus métabolique, une réparation déficiente, ou une érosion télomérique2, 139, 140. On trouve parmi ces agents des génotoxines bactériennes telles que CDT ou la Colibactine.

Les CDB peuvent être provoqués de façon directe par le r

neocarzinostatine)141. Le stress oxydatif peut aussi provoquer des CDB : quand des radicaux libres oxygénés (ROS) se trouvent suffisamment près de l’ADN, ils génèrent des lésions multiqui aboutiront à des CDB. Les ROS sont formés par des radiations ionisantes, mais aussi par des agents endogènes comme une phosphorylation oxydative, le métabolisme des cytochromes mitochondriaux ou P450, une réponse inflammatoire, ou encore par des agents exogènecomme les composés chlorés, les ions superoxides ou H2O2

142, 143.

Certains agents peuvent former des CDB en altérant certains processus cellulaires comréplication de l’ADN. Parmi ces agents on trouve le cisplatine et l’hydroxyurée. Ce streréplicatif peut aussi être provoqué par des inhibiteurs des topoisomérases (TOP) 1 et 2, qui affectent les fourches de réplication. Parmi les inhibiteurs de TOP1 on trouve la camptothLes inhibiteurs de TOP2 comme l’étoposide, la mitoxantrone et la doxorubicine sont dmolécules très utilisées dans la thérapie antitumorale144‐146. En outre, des défauts dans les systèmes de réparation de l’ADN peuvent aussi provoquer des CDB. En

3.2 Réponse cellulaire aux domma

Il existe des systèmes de surveillance cellulaires, à différents point du cycle de divisiopermettant de vérifier le l’intégrité de la cellule, ainsi que l’accomplissement, l‘achèvemencoordination des différentes phases. Rappelons que le cycle cellulaire est un processus étroitement régulé nécessitant la réalisation ordonnée de différents programmes permetproduction, à partir d’une cellule mère, de deux cellules filles aux patrimoines génétiques

(réplication de l’ADN), la phase G2 (cellule à 4N quantité d’ADN) et la phase M correspondala mitose et le retour en G1. Ce sont des systèmes de verrous de sécurités, ou points de cont

40

cellules anormales qui, accumulant des mutations successives, conduisent aux phénomènes de transformation et d’oncogenèse à l’origine des cancers.

L’étroite régulation du cycle cellulaire est sous la dépendance des complexes de protéines tion au

iété de substrats qui contrôlent les processus entre les différentes étapes du cycle cellulaire147, 148.

cle ,

Si

initif de sa division par sénescence. Les checkpoints permettent donc essentiellement à la cellule de reconnaître les

la

du cycle cellulaire est schématiquement divisée en deux grandes branches de signalisation : (i) La voie ATM‐Chk2,

hk1, qui répond principalement à la présence de ATM

’elles

formées par les Cdk (Cyclin‐dependent kinases) et les Cyclines. Les Cdks requièrent l’associaavec des cyclines pour que leur fonction kinase s’exprime. Pendant le cycle cellulaire, le nivedes différentes Cdk reste stable tandis que celui des cyclines varie selon l’étape du cycle. Les complexes Cdk/Cyclines phosphorylent une var

La cellule eucaryote répond donc aux dommages à l’ADN en activant les checkpoints du cycellulaire, qui sont les checkpoints (i) de la transition G1/S, (ii) intra S, (iii) de la transition G2/M(iv) de l’antéphase mitotique, et (v) du fuseau mitotique (Figure 1). Quand un checkpoint est activé, plusieurs réseaux de signalisation de kinases sont activés et le cycle est arrêté. En parallèle de l’arrêt du cycle, les checkpoints recrutent les systèmes de réparation de l’ADN10. le dommage est trop important, d’autres réseaux de signalisation s’activent pour assurer l’élimination de la cellule endommagée par apoptose, ou l’arrêt déf

lésions de l’ADN et d’initier la réponse réparatrice et de s’assurer de l’intégrité de l’ADN pendant sa réplication. Pour cela, il existe trois étages de signalisations principales : (i) lesprotéines qui détectent les lésions de l’ADN, (ii) les protéines qui transmettent ces signaux, outransductrices, principalement des kinases, à la fois en les amplifiant et en activant par phosphorylation d’autres facteurs et (iii) les protéines effectrices, qui se trouvent à la fin decascade, et qui une fois activées vont réguler la progression du cycle cellulaire.

La réponse cellulaire aux dommages à l’ADN (DDR) qui aboutit à l’arrêt

activée en présence de CDB, et (ii) la voie ATR‐Ccassures simple brin de l’ADN. Les deux systèmes ciblent les phosphatases Cdc25, et la voiecible aussi p53, pour aboutir au blocage du cycle cellulaire149. Le rôle principal des checkpoints est donc de contribuer à conserver une stabilité génomique et ainsi de prévenir le développement du cancer. En conséquence, les cellules qui présentent des défauts dans la signalisation des différents checkpoints vont développer une instabilité génomique puisqune peuvent pas répondre correctement aux dommages infligés à l’ADN : la réparation sera erronée, et la ségrégation de chromosomes deviendra aberrante, accélérant ainsi une instabilitéet un phénotype cancéreux150.

41

3.2.1 Cascade de signalisation ATM et activation du checkpoint G2/M

Parmi les premiers facteurs recrutés au niveau de la cassure double brin, on trouve le complexe

.

s ATM activée, elle phosphoryle l’histone H2AX sur son résidu

Ser139, formant ainsi γH2AX153. γH2AX est ensuite reconnue par MDC1, et le recrutement de DC1 induit l’accumulation de complexes MRN additionnels, résultant en l’amplification locale

de l’activité d’ATM et l’étalement de γH2AX le long de la chromatine de part et d’autre de la

Mre11‐Rad50‐Nbs1 (MRN) et ATM, qui est recrutée par Nbs1151. ATM est alors activée par (auto)phosphorylation, et phosphoryle à son tour un variant de l’histone H2A, l’histone H2AX

(γH2AX). Cette étape clé permet d’amplifier le signal, recruter d’autres facteurs et ainsi augmenter l’activation locale d’ATM152.

En présence des CDB, ATM s’auto‐phosphoryle rapidement au niveau de la serine (Ser) 1981Cette phosphorylation a lieu même si le nombre des CDB est faible (par exemple suite à une irradiation de 0,5 Gy)128. Une foi

M

Figure 1. Les checkpoints du cycle cellulaire en relation avec les phases du cycle. Le cycle cellulaire consiste en quatre phases (G1, S, G2, M). Pendant le déroulement du cycle, il existe des checkpoints qui sont activés en réponse aux dommages à l’ADN. Les checkpoint G1/S, S, et G2/M (en rouge), et les checkpoints de l’antéphase et du fuseau mitotique (gris)20.

42

CDB. Ceci conduit au recrutement d’autres acteurs de la DDR, comme la protéine 53BP1 qui interagit avec MDC1. Il semblerait que d’autres modifications (methylation) locales des histones

ctivité d’ATM au delà d’un seuil permet de recruter les acteurs de la DDR qui transduisent le signal. Tous les acteurs de la DDR ne s’accumulent pas aux sites CDB. Ainsi, quand les dommages à l’ADN excédent le seuil critique, la kinase Chk2 se localise de façon transitoire aux sites de dommages à l’ADN ou elle est phosphorylée par ATM. Cette kinase diffuse ensuite le signal aux sites distants, vers les effecteurs Cdc25 et p53. En premier lieu, ATM va phosphoryler (activer) la kinase Chk2, qui régule négativement Cdc25C en la phosphorylant sur la Ser216. Cette phosphorylation crée un site de fixation pour les protéines 14‐3‐3. Celles‐ci fixées, Cdc25C devient catalytiquement inactive et/ou séquestrée dans le cytoplasme158. Une autre cascade implique ATM et ATR, qui phosphorylent la Polo‐like kinase (Plk1), qui exerce une action pro‐

illeurs, Plk3, connue pour inhiber l’activité de Cdc25C, est aussi activée par ATM ou ATR

aval de la cascade d’ATM ; cette phosphorylation va diminuer l’activité d’ubiquitinase de Mdm2,

amplifient ce recrutement de 53BP1154. MDC1 et 53BP1 jouent un rôle clé pour établir le cycle d’auto‐activation155‐157.

Au cours de la DDR l’augmentation de l’a

mitotique. Plk1 phosphoryle Cdc25C, ATM ou ATR l’inactivent par l’intermédiaire de Chk2 ou Chk1 ; l’inactivation de Plk1 est associée à une réduction du complexe CDK1‐cycline B. Par a

(Figure 2) 10, 159.

L’inactivation de Cdc25 permet l’arrêt rapide du cycle cellulaire, mais il existe une autre voie majeure qui intègre les signaux de la DDR. ATM régule également p53, qu’elle phosphoryle auniveau de la Ser15 : cette activation stimule la transcription de p53 qui est normalement présente en faible quantité. De plus, p53 peut être phosphorylé sur la Serine 20 par Chk2, en

Figure 2. Le checkpoint G2/M. L’objectif principal du checkpoint est d’inhiber l’action du complexe Cdc2/Cycline B. Ceci en arrêtant la phosphatase Cdc25C par la fixation des protéines 14‐3‐3. Les flèches grises indiquent les fonctionsarrêtées par l’activation de cette cascade. Leaminoacides nommés indiquen

s

t les sites de phosphorylation10.

43

ce qui ralentit la translocation cytoplasmique de p53, qui est ainsi moins dégradée et plus actau niveau nucléaire (Figure 3)160, 161. p53 fonctionne comme un facteur de transcription et active la transcription de p21, un inhibiteur des CDK, aboutissantactive aussi la transcription de Cdc25C et GADD4sévères, p53 est transcrit

ive

à l’arrêt du cycle cellulaire162. p53 5. Quand la cellule subit des dommages

et stabilisé à un niveau tel qu’il déclenche les voies conduisant à l’apoptose163. p53 active aussi la transcription de facteurs de réparation de l’ADN.

, du cycle cellulaire permettent de déterminer té temporairement ou de façon permanente. Ces

e cellulaire aux dommages à l’ADN.

rin

irradia AX,

teurs montraient que

double‐brin de l’ADN129, 164. En fait, de grandes nes H2AX sont phosphorylées autour de chaque CDB, formant une

« plateforme » pour le recrutement des protéines de réparation et reconstruction de la

r

En résumé, les checkpoints, ou points de contrôlesi le cycle peut continuer ou s’il doit être arrêcheckpoints peuvent être activés par une répons

3.2.1.1 γH2AX, marqueur de cassures double‐b

En 1998, Rogakou et al. montraient qu’après

est phosphorylée sur la Ser139 (γH2AX). Un an plusγH2AX est localisée au niveau des cassuresquantités d’histo

tion des cellules eucaryotes, l’histone H2

tard, les mêmes au

chromatine2. La taille de ces plateformes augmente au cours du temps165. γH2AX peut s’étalejusqu’à des centaines de kilo paire de bases du dommage, avec une taille moyenne de 30 kpb. Il

en résulte que sur chaque CDB, les molécules de γH2AX forment des foci de dimensions

comprises entre 0,6 et 1,6 μm, facilement détectable par cytologie: un marquage avec des

Figure 3. La cascade de signalisation d’ATM et les checkpoints du cycle cellulaire. La présence de CDBs active ATM. En aval, ATM active à son tour le complexe MRN, p53 et

γH2AX. ATM peut ainsi déclencher l’arrêt du cycle cellulaire ou la mort de la cellule par apoptose. Les lignes rouges indiquent les checkpoints du cycle cellulaire3.

44

anticorps permet donc d’identifier et de quantifier la présence des lésions génétiques de ce type (Figure 4). Il existe une relation directe entre le nombre des foci et celle des cassures double‐

brin, soit un foci pour une cassure. Notons que

γH2AX peut aussi être détectée à la périphdu noyau, de façon pan‐nucléaire ou dans descorps apoptotiques. Cette répartitio

érie

n peut refléter l’intensité du dommage à l’ADN : par

répartit de façon pan‐nucléaire2.

Un a eu lieu, les

fodé des m et pa i sont réparés des foci tandis que des lésions persistantes et difficiles à réparer auront tendance à former des foci plus larges166.

métaphase et l’anaphase représente une chromosomes dupliqués et condensés sont alignés

endant la métaphase, puis les microtubules, attachés aux kinétochores, séparent les chromosomes pour les distribuer dans chaque cellule fille. Les chromosomes sont condensés

es complexes des cohésines jouent un rôle

ce

exemple lorsqu’ une cellule reçoit une irradiation ionisante, des foci apparaissent, mais

si la dose est trop importante, γH2AX se

e fois que la réparation de l’ADN

ci de γH2AX sont progressivement sassemblés, probablement du à l’actionachineries de modelage de la chromatine r des phosphatases dédiées. Les CDB qu

rapidement formeront donc plutôt transitoires, de petite taille,

3.3 Checkpoints pendant la mitose.

La ségrégation des chromatides sœurs entre latransition critique pour la cellule. En bref, les p

par l’action des complexes des condensines I et II. Lde maintient de la cohésion entre les chromatides sœurs, qui restent associées jusqu’au moment où les kinétochores sont attachés aux microtubules167‐169. Une fois les chromosomesalignés et attachés, les cohésines sont dégradées et les chromosomes sont séparés par la traction des microtubules, amenés ainsi vers le pôle de chaque future nouvelle cellule. C’estmoment qui est critique pour le maintien de la stabilité génomique : par exemple, des mutations ou déplétions en cohésines provoquent des pontages d’ADN pendant l’anaphase et des cytokinèses abortives170. La ségrégation chromosomique est donc finement régulée à chaque division cellulaire171. A ce jour, on connaît deux checkpoints durant la phase de mitose : le checkpoint de l’antéphase, et le checkpoint du fuseau mitotique.

Figure 4. Foci γH2AX comme marqueurs des cassures double‐brin de l’ADN. L’ADN est coloré en rouge, et les anticorps reconnaissant la phosphorylation de l’histone H2AX sont visualisés en vert2.

45

Le checkpoint juste avant l’entrée en mitose, différent du checkpoint G2/M, s’appelle le checkpoint de l’antéphase mitotique (AM). Sa principale fonction est d’éviter la condensation

ement l’entrée en mitose. L’antéphase est le ndensation des chromosomes commence, et ckpoint AM, les cellules sont capables de téphase d’une façon réversible20, 172. Carlsonransformées, irradiées ou traitées avec la une phase plus précoce, dans laquelle leseci suggère que ce checkpoint AM peut être

des chromosomes et donc de bloquer éventuellmoment entre la fin de la phase G2, quand la col’entrée en mitose proprement dite. Avec le cheretarder l’entrée en mitose ou de revenir en an et al. ont montré que des cellules humaines non‐tcolchicine en prophase, pouvaient revenir dans chromosomes étaient moins condensés173, 174. Cactivé juste avant l’entrée en métaphase.

Le checkpoint du fuseau mitotique (CFM) est le plus étudié. Il se situe au moment de l’assemblage des microtubules. Quand ce checktransition métaphase‐anaphase20, 23. La fonction n déroulement de la ségrégation chromosomiquel’aneuploïdie et des erreurs de ségrégation comch onté t)

L complpromoting osome). Normalement, gardée dans sa forme inactive par la sécurine (SEC). Les kinétochores contribuent à la formation

t complex, constitué par Mad2, Bubr1, Bub3, et Cdc20), qui à son tour inhibe la capacité de Cdc20 à activer APC/C. La fixation de tous les kinétochores aux

de

éasome.

aphase

tive

vorisent

t à ce

les23, 176‐178.

point est activé, il se produit un retard dans la principale du CFM est d’assurer le bo et donc de prévenir le développement de me les chromosomes retardés (lagging été identifiés chez la levure. Les gènes identifiés ou leur homologue humain BUBR1175.

exe ubiquitine‐ligase APC/C (anaphase‐ avant l’anaphase, la protéine séparase est

romosomes). Les premiers gènes du CFMtaient MAD1, 2, et 3 (mitotic‐arrest deficien

e CFM cible Cdc20, qui est cofacteur du complex/cycl

du complexe MCC (mitotic checkpoin

microtubules et leur bi‐orientation régule négativement l’activité du FM. Ceci a pour effetlibérer Cdc20, qui, une fois libre, active APC/C. Le complexe actif APC/C va polyubiquitiner les substrats d’anaphase comme la cycline B et SEC, et induire leur dégradation par le protLa dégradation de SEC va, à son tour, cibler l’anneau de cohésine qui maintient ensemble les deux chromatides sœurs, provoquant ainsi leur séparation : l’anaphase peut alors avoir lieu. Si le CFM est activé, il va cibler Cdc20, donc la cascade en aval ne se produit pas, la pro‐méts’allonge jusqu’au moment où la bi‐orientation est adéquate et les chromosomes sont bien positionnés dans le fuseau mitotique. A son tour, le bon alignement chromosomique désacle CFM et le passage à l’anaphase se produit. Les protéines amplificatrices du FM sont : le complexe MCC, Mad1, Bub1, MPS1 (multipolar spindle‐1) et Aurora‐B. Ces protéines fale signal du CFM et la formation du complexe même du MCC. Pendant la pro‐métaphase, Cdc20et les autres protéines du CFM se concentrent au niveau de kinétochores. Quand Cdc20 esniveau là, la formation du complexe MCC s’accélère. L’activité du CFM est surtout liée à la surveillance des kinétochores et à son alignement avec les microtubu

46

3.4 Systèmes de réparation de cassures double‐brin de l’ADN.

Il existe deux systèmes principaux pour la réparation des CDB, la recombinaison homologue (HR) et la jonction des extrémités non‐homologues (NHEJ). Dans la HR, le système de réparatiutilise les chromatides sœurs non‐endommagées comme source de séquence homologuechromatides affectées. Dans le cas de la NHEJ, deux doubles brins cassés sont directement religués bout à bout sans faire intervenir d’échanges de brins homologues. Le système NHactif tout le long du cycle cellulaire et c’est le système le plus important chez les eucaryotetandis que le système de HR est principalement actif dans la phase S et G2, donc pendant ou après la réplication de l’ADN, puisqu’il a be 17, 179

on des

EJ est s,

soin des chromatides sœurs (Figure 5) .

varie selon

la et G2 du

De on des

183,

lus importants185. HR

L’activité des deux systèmes NHEJ et HR la phase du cycle cellulaire. Le fait d’avoir une chromatide sœur stimule l’utilisation du mécanisme HR, mais elle dépend également dedisponibilité des dNTPs pendant la phase Scycle. L’activité du système HR est facilitée aussi par la relative proximité entre les deux

chromatides, de la phase S jusqu’à l’anaphase.simême, les cohésines, en charge de la cohé

chromatides, migrent dans les CDB indépendamment de la phase du cycle, facilitant également l’activation du HR180, 181. De là nait l’hypothèse d’existence d’une certaine compétition avec le système NHEJ, qui peut être activé même en présence des chromatides sœurs182. Néanmoins, il existe des processus cellulaires pour lesquels l’utilisation de l’un de deux systèmes est restreinte. Les CDB produits

pendant la recombinaison V(D)J sont ainsi exclusivement réparés par NHEJ, tandis que ceux produits pendant la méiose par des nucléases sont exclusivement réparés par le système HR184.

3.4.1 Système de recombinaison homologue (HR)

Le système HR est basé sur l’échange ou le transfert de séquences quasi identiques entre la molécule d’ADN qui possède le CDB ou le pontage interbrins (ICL, interstrand crosslinks) et la molécule intacte. HR est un système fiable si la séquence originale est intacte. Dans le cas contraire, HR peut induire des mutations locales ou des remaniements p

Figure 5. NHEJ et HR dans le cycle cellulaire. Tandis que le système NHEJ est actif tout le long du cycle cellulaire, le système HR l’est principalement pendant la phase S et G2

17.

47

est caractérisé par trois réactions successives : (i) la résection 5’ terminale du CDB ; (ii) la ; (iii) la résolution des intermédiaires de

s

rotéine RecA chez les procaryotes. Les orthologues

léases ,

tion des

me la

cher sœur et

e

nt

formation d’un duplex d’ADN et l’échange des brins. Le déplacement d’un brin vers l’autre forme un hétéro‐duplex hybride

p),

chez les mammifères, le facteur le plus important pour que la recombinaison ait lieu185, 187‐189.

formation d’un duplex d’ADN et l’échange des brins recombinaison (Figure 6)6, 186. Ce système de réparation est sous‐divisé en quatre cascades deréparation : (i) la cascade SDSA (synthesis‐dependent strand‐annealing), (ii) la cascade CDBR (double‐strand break repair), (iii) la cascade BIR (break‐induced replication) et (iv) la cascade SSA (single‐strand annealing).

Le système HR utilise plusieurs protéinede recombinaison qui sont Rad51 et sesorthologues, les équivalents de la p

sont Rad52 chez la levure, les protéines XRCC2 et 3, et le complexe MRN. Le système utilise aussi des ADN nucExo1, des hélicases (RecQL, RecQ4, RecQ5)la topoisomérase Top3a, des polymérases et des ligases186. Le premier pas pour la réparation via HR est la dégradanucléotides, via les nucléases et le complexe MRN, dans la partie 5’ terminale du CDB. Cette dégradation transforpartie terminale 5’ en un large simple brin3’ terminal, prêt pour cher son homologue dans sa chromatidepromouvoir la synthèse d’ADN. Les deux chromatides restent proches l’une dl’autre grâce à l’action de Rad50 du complexe MRN. Cette action permet derécupérer les séquences perdues pendala cassure ainsi que les nucléotides dégradés. La deuxième action est la

d’ADN, appelé D‐loop (displacement‐loopuis il y a échange des brins. Cette

deuxième action est dirigée par un filament nucléoprotéique composé d’un brin 3’ fixé à larecombinasse Rad51, qui à son tour est fixée à la RPA. Puis RPA interagit avec BRCA1, qui est,

Figure 6. Système de réparation HR. RAD51 forme des filaments sur l’ADN simple brin en 3’ et permet le transfert des séquences homologues pour la resynthèse de l’ADN endommagé. RAD52 participe

brins. Finalement, les jonctions de Holliday sont à la formation d’un duplex d’ADN et à l’échange des

résolues par le complexe XRCC3/RAD51L26.

48

Une fois ce point atteint, les différentes cascades de réparation peuvent avoir lieu. Dans lemodèle CDBR, la synthèse d’ADN à partir du D‐loop aboutit à une structure de Hollyday. La recombinaison homologue peut être aussi associée à un échange réciproque des séquences (crossovers) selon la cascade utilisée, qui peut à son tour induire une perte en hétérozygotie oudes remaniements chromosomiques190.

3.4.2 Système de recombinaison illégitime (Non Homologous End Joining, NHEJ).

NHEJ est un système de réparation particulièrement substitution de séquences de tailles variables est fréqdes bouts sont le plus souvent nécessaires pour permpeut relier deux chromatides libres sans contrôle d’hhétérologue (illégitime) est augmenté lorsque plusieu . Le système NHEJ fait intervenir en premier lieu des protniveau des CDB, ce qui limite la destruction de nucléogénétique. Puis les deux bouts de chromatides sont jcourte, de 1 à 4 nucléotides sur chaque chromatide, terminales, qui facilitent l’activité des ligases et l’asse

La protéine la plus importante dans le système NHEJ comportant deux sous‐unités, Ku70 et Ku80. Ce hétérodimèrequi vient entourer la partie cassée de la double hélice s’agit d’un alignement des aminoacides de charge pol’alignement avec la structure en duplex du phosphonégative. L’autre côté de l’anneau est le lieu de fixatiintermédiaire avoir accès au CDB. La structure en anneau interagit avec l’ADN, mais elle prévient également la e le rapprochement des deux bouts d’ADN. L’activité d nositol 6 phosphate qui se fixe à l’hétérodimère. De cette fapartie endr La fi le dérou tant l’ ration, à

L IV‐XRCpour faciliter leur attachement. Cette action est rend ‐PK

sujet à l’erreur. L’effacement et/ou la uent, dû au fait (i) que des modifications ettre la religation et (ii) que le système omologie. Le risque de religation rs CDB ont lieu en même temps185, 191

éines spécifiques qui se positionnent au tides et donc la perte d’information uxtaposés (end‐bridging). Une synthèse donne lieu à des micro‐homologies mblage des brins cassés185, 192.

est Ku. Il s’agit d’un hétérodimère forme une structure en anneau

193. Un côté de l’anneau est fixé à l’ADN. Ilsitive qui permet l’interaction et diester de l’ADN, dont la charge est on de protéines qui peuvent par cet

explique non seulement comment Kudégradation de nucléotides et elle facilite Ku dans NHEJ est dépendante de l’içon Ku sert de point de fixation pour la ante (DNA‐PKcs), qui est une enzyme de holoenzyme de réparation, la DNA‐PK.lage d’environ un tour d’hélice, facili

en premier lieu l’ADN ligase IV associée

C4 et le présente au niveau des brins cassés ue possible grâce au fait que la DNA

glisse entre les deux bouts d’ADN en les rapprochant en même temps197, 198. L’activité du

catalytique de la protéine kinase DNA‐dépéparation, et l’ensemble de ce complexe forme unexation de la DNA‐PKcs provoque également accès des protéines qui viennent finaliser la répa XRCC4194‐196.

’holoenzyme DNA‐PK fixe le complexe ligase

49

complexe ligase IV‐XRCC4 dépend de la formation de l’ holoenzyme DNA‐PK, formée à partiKu et DNA‐PKcs199.

L’activité de ligase du complexe ligase IV‐XRCC4 est sous la dépendance de la PNK (polynucleotide kinase), qui va se fixer da

r de

ns la sous‐unité XRCC4. La PNK est à la fois une kinase au niveau de la partie terminale d’ADN 5’, et une phosphatase dans la partie terminale d’ADN

llules radiosensibles (Figure 7)200. De même, la recombinaison V(D)J a besoin de tous ces facteurs du

ines

couverte

s. tivité

le‐se dans

ol µ et Pol

. Elles

r ATM et se co‐localise avec 53BP1 dans des foyers γH2AX. L’activation de sa fonction dépend du complexe MRN et du DNA‐PK. Ce système arrive à réparer 10% des CDB

3’. Il a été montré que l’interruption de cette interaction PNK‐XRCC4 produit des ce

système NHEJ, déclenché par les endonucléases RAG1 et RAG2. Le manque d’une des protécomme la DNA‐PKcs va provoquer la maladie de SCID (severe combined immunodeficiency)201.

Un autre élément clé du système NHEJ est la protéine Artemis. Cette protéine a été déchez des patients atteints du syndrome SCID. Le déficit en Artemis limite la capacité des cellulesde produire les micro‐séquences homologues nécessaires pour la juxtaposition des brins casséArtemis interagit avec DNA‐PKcs et sert aussi de substrat pour le complexe DNA‐PK. Son acde nucléase est régulée par la phosphorylation induite par DNA‐PK. Artemis est une 5’‐3’ simpbrin ADN exonucléase, mais le complexe DNA‐PKcs/Artemis agit comme une endonucléales deux parties terminales, soit 5’ ou 3’201.

Dans la dernière phase de la réparation des CDB par NHEJ, trois ADN polymérases, la

déoxynucléotidyl transférase (TdT), Pol µ et Pol λ, vont remplir les dernières portions de nucléotides manquants, juste avant la ligation finale des deux brins d’ADN. TdT est capable d’ajouter des nucléotides aux bouts des brins en l’absence de brin complémentaire ; P

λ appartiennent à la famille Pol X, qui se fixent à Ku quand associées aux DNA‐PKcs185, 202

sont capables de remplir des trous de séquences avant même la ligation finale203.

Il existe sans doute d’autres protéines qui jouent un rôle important dans le système NHEJ, et d’autres systèmes parallèles au NHEJ. Baumann et West ont montré ainsi que des extraits cellulaires pouvaient joindre des extraits non‐homologues de simples‐brins d’ADN. Leurs résultats ont permis la découverte d’IP6, mais ont aussi suggéré l’existence d’autres facteurs non identifiés à ce jour204, 205. De même, le complexe MRN qui joue un rôle important dans la cascade de signalisation ATM/Chk2 pourrait aussi avoir une activité importante dans le NHEJ206.Dans leur étude de 2004, Riballo et al. proposent un système dans lequel Artemis est hyper‐

phosphorylée pa

induits par irradiation. Par contre, Artemis n’a aucun rôle dans la cascade de signalisation ATM/Chk2 et l’activation du checkpoint G2/M.

50

3.4.3 Choix entre les systèmes NHEJ et HR et le cycle cellulaire.

51

la chromatide homologue dans le système

pas uniquement de l’existence des e l’activité

207, 208.

d’ATM

De plus en plus de résultats suggèrentl’existence d’une régulation cellulaire du choix entre NHEJ et HR. Par exemple, l’expression de la recombinasse Radaugmente dans la phase S. Rad51 est nécessaire pour la formation du filament nucléoprotéique et pour la recherche de

HR. En amont de la cascade de signalisation, l’expression de Rad51 est régulée par les CDKs, qui est donc inhibé pendant la mitose puis activé progressivement durant la phase G1. La régulation du système HR ne dépend ainsi

chromatides sœurs mais aussi dde CDKs pendant le cycle cellulaireDans la régulation de NHEJ, la phosphorylation de la Ser2056 et la Thréonine 3950 de la DNA‐PKcs par ATM ainsi que l’autophosphorylation

jouent un rôle essentiel. Cette phosphorylation est réduite pendant la phase S, système le NHEJ ux

es qui peuvent agir avec un certain degré de compétition entre eux, mais qui en même temps peuvent réparer simultanément des CDB. Ils sont régulés par les phases du cycle cellulaire et aussi par des facteurs qu’ils possèdent en

est moins actif pendant cette phase. Par ailleurs, la phosphorylation de DNA‐PKcs dans ces derésidus est critique pour la radiorésistance cellulaire209‐211.

La réparation d’un CDB par les deux systèmes est aussi possible. On retrouve dans des CDB lesprotéines des deux mécanismes de réparation, ceci peut être en accord avec l’idée que le choixdu système de réparation d’un CDB peut être induit par des facteurs communs aux deux

systèmes comme γH2AX et DNA‐PKcs212, 213. Pierce A.J. et al. ont montré que la partie Ku70 del’héterodimère Ku pourrait jouer un rôle capital dans la régulation du choix entre des deux systèmes. Les cellules Ku70‐/‐ présentaient ainsi une activité du système HR six fois supérieurepar rapport aux cellules non mutées214.

Il apparaît donc que NHEJ et HR sont des systèm

Figure 7. Le système NHEJ. Le complexe DNA‐PK (ku/DNA‐PKcs) va d’abord reconnaître le CDB puis positionner en juxtaposition les deux bouts d’ADN. La liaison aura lieu grâce au complexe Ligase IV‐XRCC43.

51

commun. Il existe également des circonstances particusystème unique de réparation.

3.4.4 Polymorphisme génétique des gènes de répara

Il est clair aujourd’hui que des polymorphismes généti cité de réparation de l’ADN. Des groupes cellulaires peuveinsuffisante ou défectueuse en raison de variations au des gènes spécifiques, constituant donc un polymorphpeuvent coder pour des protéines à fonctions aberranDes études statistiques montrent que 35 à 45% des PGde l’ADN ont un effet dans la fonction du gène et/ou d

Les donnés épidémiologiques montrent en outre que lesgénétiques dans les gènes des systèmes de réparationdévelopper un cancer216. Plusieurs études montrent q (poumon, côlon, vessie, glande mammaire) les cellules sont défeavec des variations entre les systèmes de réparation, equalité de réparation diminue avec l’âge217‐220.

L’ ositionde da fonction du érozy en fa mutations216, 221, 222.

menté de cancer de la glande mammaire223. Le gène BRCA2 fait partie de gènes de réparation des cassures double‐brin par

leur et/ou répétés, comme une infection par des E. coli pks+ à faible dose, puissent avoir une signification pathologique chez certains individus et dans

lières où l’un ou l’autre devient le

tion.

ques peuvent diminuer la qualité/capant être prédisposés à une réparation niveau de la séquence génétique dansisme génétique (PG). Certains allèles tes ou d’efficacité métabolique réduite. observés dans des gènes de réparation u système de réparation215.

individus portant des variations de l’ADN ont un risque plus élevé de ue dans la plupart des cancers ctueuses dans la réparation de l’ADN, t ces études montrent aussi que la

à certaines tumeurs est la conséquence nt la vie de l’individu, la perte degotie et à la prédisposition au cancer

Parmi les gènes de réparation où un PG a été identifié et lié avec un risque de cancer, on trouve le gène XRCC1 du système de réparation BER (excision de bases), où trois variations dans la séquence génique ont été documentées, avec un risque aug

hypothèse de Knudson suggère que la prédisp l’héritage d’allèle(s) muté(s) ou défectueux ; Pen seul allèle fonctionnel conduit à la perte d’hétvorisant l’accumulation de

recombinaison homologue. Au total, six variations géniques ont été documentées et selon ces variations une association anti ou pro‐cancéreuse a été mise en évidence. Dans le gène XRCC3, du même système de réparation, il a été trouvé une variation allélique liée au cancer de lavessie, au mélanome et au cancer du poumon224‐226.

Au bilan, les allèles « défavorables » entraînant un risque accru, il semble plausible que des évènements génotoxiques de faible amp

certains tissus.

53

4. L’après‐réparation.

Nous avons vu dans le chapitre précédent que les cellules disposent de systèmes dont la nction est d’assurer la stabilité de leur génome et la transmission fidèle du matériel génétique

aux cellules filles. Pour cela, elles ont développé des mécanismes pour le monitoring de l’intégrité génomique. Elles activent plusieurs systèmes en réponse au dommage à l’ADN, comme l’arrêt du cycle cellulaire via les checkpoints, et les gènes des systèmes de réparation, NHEJ et HR principalement. L’incapacité d’une cellule à répondre correctement aux attaques affectant son ADN peut déclencher une réparation erronée. Le dommage à l’ADN peut dans ce cas être le point de départ d’une instabilité génomique, qui à son tour augmentera les probabilités du développement d’un cancer227. Il est de plus en plus clair que les déficiences cellulaires dans la réparation de l’ADN constituent un facteur clé pour l’initiation de la grande majorité des cancers chez les humains.

Parmi les lésions de l’ADN que l’on peut trouver, les plus dangereuses et mutagènes sont probablement les CDB. Les CDB sont considérées comme très dangereuses parce que leur réparation est biologiquement difficile, pouvant induire une perte ou une amplification du matériel génétique, des translocations ou des remaniements chromosomiques, et même des échanges complets de bras entre chromosomes. Ces altérations peuvent initier la tumorigénèse, par exemple, si la portion délétée d’un chromosome code pour une protéine suppresseur de tumeurs, ou à l’inverse si la région amplifiée code pour une protéine oncogène. La fusion des gènes peut aussi déréguler leur fonction et former un oncogène228.

Outre des défauts de réparation, un paramètre important pour définir comment sont déclenchés ces réarrangements chromosomiques délétères et plus généralement pour la maintenance de la stabilité génomique, est la sensibilité des checkpoints. Premièrement, combien de CDB sont requis pour l’activation du système ? Deuxièmement, quel est le niveau de sensibilité pour la maintenance du checkpoint, jusqu’à réparation complète de tous les CDB ? En effet, si les cellules sont incapables de maintenir un checkpoint actif suffisamment longtemps pour tout réparer, elles rentreront en mitose, en présence de CDB, parce que le faible niveau des dommages ne suffit pas pour maintenir les checkpoints activés. Deckbar D et al. ont montré qu’une irradiation gamma de 1 Gy dans des cellules humaines en phase G2 produit entre 9 et 12 CDB, et que ces CDB ne sont pas réparés dans l’immédiat. De surcroît, ces cellules débloquent l’arrêt en G2/M et entrent en mitose. Ceci donne lieu à des remaniements chromosomiques qui sont dix fois plus nombreux que dans les cellules contrôles. Deckbar D et al. montrent ainsi que : (i) la plupart des cellules ne sont pas capables de maintenir un arrêt du cycle cellulaire dans la

transition G2/M quand il y a moins de vingt foyers d’histone H2AX phosphorylée (γH2AX), (ii) que les cellules humaines ne maintiennent pas l’arrêt du cycle jusqu’à la fin de la réparation des CDB et (iii) que ceci représente donc un risque majeur pour l’initiation de remaniements et le

fo

54

développement d’une instabilité chromosomique (CIN)227, 229, 230. Syljuasen et al. ont obtenu des résultats similaires mais avec une dose d’irradiation de 6 Gy. Les cellules étudiées restaient

aient

iples

ent actif, de

ent. Ceci va contribuer à l’amplification des cassures de chromatides et donc aux remaniements entre chromosomes. Par la suite, les CDB qui n’ont pas

u ent

Les premières mitoses aberrantes ont été identifiées en 1890 par von Hansemann. Cette ri, en

t

arrêtées dans la transition G2/M pendant de longues périodes (40 heures), mais elles entrfinalement en mitose. Ce redémarrage est interprété comme une « adaptation » de la cellule au checkpoint, qui implique que les cellules recommencent à se diviser en présence de multCDB231, 232.

Le mécanisme de désactivation du checkpoint G2/M en présence de moins de vingt foyers

γH2AX est probablement lié au fait que la transduction du signal n’excède pas le seuil critique. Le noyau n’est pas complètement libéré de Cdc25 et le complexe cycline B‐Cdk1 redevila cellule peut donc progresser en mitose. On peut donc estimer que la présence de cassures chromatides pendant la mitose, tard après une exposition génotoxique, est indicative du fait que la DDR n’a pas fonctionné correctem

pu être restaurées avant la réactivation du cycle cellulaire seront difficilement réparées, amoins de façon correcte. En effet, les cellules mitotiques qui portent des CDB peuvent perddu matériel génétique, ce qui réduit la probabilité que la réparation soit correcte. Les CDB apparaissent donc comme un facteur de risque majeur pour l’apparition de remaniements chromosomiques et le développement d’une instabilité génomique233.

4.1 Remaniements chromosomiques.

observation a permis l’identification des remaniements chromosomiques (RC) par Bove1914. La première translocation directement associée à une néoplasie a été appelée « le chromosome de Philadelphie » en 1973234, 235. Aujourd’hui on sait que les RC sont la conséquence des CDB, qu’ils sont présents dans la grande majorité des cancers, et qu’ils servent comme un indicateur de la dérive génomique de la tumeur et donc comme un important facteur pronostique3, 236. Structurellement, on peut classifier les RC en deux types : (i) le type chromosome et (ii) le type chromatide. Pour le premier, les changements de structure affectenles deux chromatides ; pour le deuxième, les changements affectent seulement l’une des deux (Figure 1)8. Après la fusion de deux brins cassés (appartenant ou non au même chromosome), les remaniements provoqués entraînent des délétions, duplications, inversions ou translocations. Chacun de ces remaniements induit donc des réarrangements de gènes de différentes façons. En outre, il y a deux types de remaniements, ceux qui sont équilibrés et ceux qui ne le sont pas. Les remaniements équilibrés ne suppriment ni ne dupliquent de matériel génétique. Les inversions et les translocations réciproques en font partie. Dans les remaniements déséquilibrés, on observe soit la perte du matériel génétique, donc des délétions, soit une addition d’une copie supplémentaire, donc des duplications (Figure 2).

55

Dans les études cytogénétiques, les RC sont classifiés en deux types principaux :

‐ les RC primaires, qui sont des lésions, parfois uniques, trouvées dans beaucoup de tumeurElles sont considérées comme l’un des facteurs ayant déclenché la tumeur et comme un facteur de pronostic pour le patient. Dans cette classe on trouve les remaniements chromosomiqueséquilibrés comme les translocations réciproques.

‐ Les RC secondaires sont des lésions qui apparaissent plus tard dans le développementtumeur et qui affectent le pronostic vital. On trouve dans cette classe les délétions et les

s.

de la

Fcigure 1. Remaniements chromosomiques. En haut le type chromosome, et en bas le type hromatide8.

56

duplications237, 238. Les RC équilibrés peuvent entraîner une dérégulation ou une amplification de gènes. Ils sont bien corrélés à certaines tumeurs spécifiques, et leur disparition est un indicateur de l’efficacité du traitement239‐241.

L’une des conséquences des RC peut être la fusion de gènes, ce qui peut non seulement modifier l’activité transcriptionnelle des gènes affectés mais aussi des gènes ayant une relation avec eux. En 2005, Tomlins et al. ont montré que plus de la moitié des cancers de la prostate portaient une fusion génique de gènes TMPRSS2‐ERG, puis d’autres rapports on suivi. Aujourd’hui on sait que la majorité des tumeurs portent une fusion de gènes en particulier, et que le fait de pouvoir les identifier aide à mieux diriger le traitement242‐244. La plupart des ces fusions sont provoquées par des remaniements chromosomiques comme la délétion, la duplication et/ou l’inversion.

4.2 Perte des télomères.

Les télomères sont les complexes nucléoprotéiques situés dans les parties terminales des chromosomes. Ils contiennent des répétitions courtes d’ADN (TTAGGG chez r la télomérase et protégés par des complexes protéiques

spécifiques. Ils sont essentiels pour la protection des parties terminales des chromosomes et pour éviter des fusions entre eux. La perte d’un télomère peut par conséquent déclencher des remaniements chromosomiques245, 246. Cette perte peut être due aux erreurs de maintenance

d’un r les CDB à ce niveau ne sont pas efficacement réparées par le système NHEJ. Les

DB qui se produisent près des télomères déclenchent donc fréquemment la perte du télomère. La fusion chromosomique provoquée par la perte d’un télomère est reconnue comme un

tumorales et/ou des cellules souches embryonnaires humaines, les chromosomes peuvent récupérer le

des translocations non‐réciproques, c’est‐à‐dire qu’un chromosome donne son matériel génétique par translocation, mais sans en

e

les vertébrés) qui sont assemblées pa

télomérique, comme la déficience en TRF1 et/ou 2, ou à un CDB qui se produit prèstélomère, caC

facteur important dans les RC associés au cancer. En revanche, dans des cellules

télomère d’un autre chromosome, donnant lieu à des insertions et délétions, et à un nouveau chromosome manquant d’un télomère247, 248. 249, 250.

La plupart des acquisitions des télomères se font par

recevoir251. Le chromosome donneur peut ainsi perdre une large partie de sa structure. Plus d

Figure 2. Principaux remaniements équilibrés (inversion et translocation réciproques) et remaniements déséquilibrés

(délétion et duplication).

57

la moitié des chromosomes donneurgénétique. En conséquence, ces chrod’autres chromosomes et ainsi de su

Un autre mécanisme de récupération Cette duplication n’augmente pas l’inchromosome sans un télomère, maisnombre de chromosomes affectés reva présenter une grande variété de ccaryotype même. La perte d’un seul tchromosomique dans une population

4.3 Cycles de cassure‐fusion‐pontage

En 1938 McClintock a décrit pour la prupture d’une chromatide par un CDB e, lachromatides a lieu au niveau de la cacette fusion, les deux chromatides n t l’anaphase. centromères fuseau vers leurs pôles respectifs, un pont est formé.

ces cycles BFB sont connus pour

nombre de chromosomes affectés reva présenter une grande variété de ccaryotype même. La perte d’un seul tchromosomique dans une population

4.3 Cycles de cassure‐fusion‐pontage

En 1938 McClintock a décrit pour la prupture d’une chromatide par un CDB e, lachromatides a lieu au niveau de la cacette fusion, les deux chromatides n t l’anaphase. centromères fuseau vers leurs pôles respectifs, un pont est formé.

ces cycles BFB sont connus pour

s souffrent ainsi d’une délétion importante de leur matériel mosomes peuvent induire l’échange de télomères avec ite.

des télomères est la duplication du matériel génétique.

e si le e si le stabilité puisqu’elle ne produit pas un deuxième elle produit de facto une instabilité allélique251. Mêmste minime dans une cellule, la population cellulaire per se hangements affectant plusieurs chromosomes et leur élomère peut ainsi amplifier une instabilité cellulaire donnée.

(BFB: Breakage‐Fusion‐Bridges)

remière fois la formation des cycles BFB. A la suite de la , ou à la perte d’un télomèr fusion entre deux ssure, générant des chromatides dicentriques. A cause de

instabilité allélique251. Mêmste minime dans une cellule, la population cellulaire per se hangements affectant plusieurs chromosomes et leur élomère peut ainsi amplifier une instabilité cellulaire donnée.

(BFB: Breakage‐Fusion‐Bridges)

remière fois la formation des cycles BFB. A la suite de la , ou à la perte d’un télomèr fusion entre deux ssure, générant des chromatides dicentriques. A cause de

e peuvent pas se séparer pendan Tandis que les deux sont attachés au

mitotique et tirent

e peuvent pas se séparer pendan Tandis que les deux sont attachés au

mitotique et tirent

L’augmentation de la tension provoque la rupture du pont et les deux cellules sœurs héritent chacune d’une chromatide cassée. A nouveau, cette chromatide cassée est fusionnée à une autre, et un nouveau cycle BFB redémarre (Figure 3)18, 252. Les ponts de chromatides observés pendant l’anaphase indiquent donc des fusions illégitimes entre chromosomes. Au niveau de l’ADN,

L’augmentation de la tension provoque la rupture du pont et les deux cellules sœurs héritent chacune d’une chromatide cassée. A nouveau, cette chromatide cassée est fusionnée à une autre, et un nouveau cycle BFB redémarre (Figure 3)18, 252. Les ponts de chromatides observés pendant l’anaphase indiquent donc des fusions illégitimes entre chromosomes. Au niveau de l’ADN,

induire des recombinaisons avec de larges amplifications et délétions des parties terminales des

induire des recombinaisons avec de larges amplifications et délétions des parties terminales des

Figure 3. Cycles de cassure‐fusion‐pontage. Après une cassure double brin de l’ADN (CDB), la fusion des chromosomes donne lieu un pont d’anaphase. En conséquence, un nouveau CDB se forme pendant la cytokinèse, ce qui donne lieu à des remaniements chromosomiques et à une nouvelle fusion18.

58

chromatides cassées. Les parties amplifiées peuvent à leur tour être transmises à d’autres chromosomes. Puisque la cassure du pont ne se présente pas exactement au niveau de la fusion, une cellule sœur gagne en matériel génétique et l’autre en perd. En conséquence, l’une aura une duplication du matériel avec une séquence inversée, tandis que l’autre aura une

ieurs s

llules fréquemment retrouvés dans des

cellules qui présentent des BFB sont des chromosomes en anneaux et dicentriques. La centriques dans des

dysfonctionnement des télomères, qui a été associée à une la transition bénigne‐maligne des tumeurs intestinales253‐

cles BFB est la formation des chromosomes DM (double‐ fragments de matériel génétique extra‐chromosomique. Ils

du matériel et sont témoins d’une importante chromosomes normaux, les DM sont répliqués pendant le

centromère, ni télomère256, 257.

uent un rôle important dans le maintien des cycles de BFB. cientes en p53 entrent moins facilement en apoptose et

romosomiques. Les cellules déficientes pour la voie de entation des ponts d’anaphase, et des cycles BFB plus

délétions plus nombreuses258, 259.

ue, micronoyaux et pont nucléoplasmiques.

n centro ste « en retard ent pas

les c naphase, ans le n éaire

hro nent la terph plus petite

pal : ils sont appelés pour cette raison des micronoyaux. Comme ce matériel génétique n’est pas incorporé dans le noyau, il sera possiblement perdu pendant la

délétion terminale. Ceci provoque la perte d'un télomère dans les deux chromosomes et de cette façon le cycle est auto‐entretenu. Les cycles BFB peuvent continuer pendant plusgénérations cellulaires, provoquant des amplifications importantes et des délétion terminales progressives250.

La propagation des cycles de BFB contribue à l’hétérogénéité caryotypique des cetumorales253. Les remaniements chromosomiques les plus

fréquence avec laquelle on trouve des anneaux ou des chromosomes diétalements métaphasiques peut indiquer la fréquence des BFB dans une population cellulairedéterminée. La corrélation est donc positive entre le nombre des remaniements chromosomiques et le nombre des ponts d’anaphase. Il existe aussi une corrélation directe entre les cycles BFB et la perte ou leinstabilité chromosomique pendant 255. Une autre conséquence des cyminute). Ceux‐ci représentent desapparaissent à cause de la duplicationamplification des gènes. Comme les cycle cellulaire, mais ils n’ont ni

Les checkpoints du cycle cellulaire joPar exemple, des cellules défidéveloppent plus de remaniements chréparation NHEJ montrent une augmmarqués, donc des duplications et

4.4 Perte de matériel génétiq

Quand un chromosome perd socours de l’anaphase, il reincorporé dans le noyau. De même, peuvent ne pas être incorporés dse forme malgré tout autour de ces cforme de chromatine condensée inpar rapport au noyau princi

mère, il n’est pas attaché au fuseau mitotique et au» sur la plaque métaphasique, et il n’est finalemhromosomes dicentriques formant un pont d’aoyau. Pendant la télophase, une enveloppe nuclmosomes anormaux, qui progressivement prenasique. La différence est que leur taille est

59

mitose suivante. Les micronoyaux représentent donc la perte du matériel génétique provoqpar des erreurs de ségrégation des chromosomes acentriques ou dicentriques. Outre la formation des micronoyaux, on peut aussi observer la formation de ponts nucleoplasmiques, qui dérivent des ponts d’anaphase recouverts par l’enveloppe nucléaire et reliant les deux noyaux. Tandis que les micronoyaux témoignent donc de la présence de chro

ué

mosomes acentriques et dicentriques, les ponts nucleoplasmiques signant

oïdie ont

On ue, donc des

hypodiploïdes, et des cellules qui gagnent du matériel génétique, donc des hyperdiploïdes. e est défectueux, et

n’arrive plus à reporter l’entrée en anaphase. Il y a donc des chromosomes mal alignés et/ou

des cellules qui forment des ponts d’anaphase (Figure 4)9. 4.5 Aneuploïdie et tétraploïdie

Les défauts de ségrégation chromosomique (mérotélie), les cycles BFB et la formation de micronoyaux peuvent induire la perte ou le gain de chromosomes. Les ponts anaphasiques peuvent aussi affecter la séparation finale des cellules sœurs (cytokinèse) et déclencher la formation d’une cellule aneuploïde ou tétraploïde260, 261.

L'aneuploïdie caractérise une cellule qui possède un nombre anormal de chromosomes. La polyploïdie est l’augmentation du nombre de chromosomes selon un multiple du nombre normal de chromosomes. Les premières analyses des effets physiologiques de l'aneuplété réalisées en 1902 par Theodor Boveri, qui conclut que le gain ou la perte de chromosomesaffectait le développement embryonnaire et provoquait finalement la mort de l’embryon11.peut également observer des cellules qui perdent du matériel génétiq

L’aneuploïdie peut être déclenchée quand le checkpoint du fuseau mitotiqu

retardés. Le résultat sera des mitoses anormales et une répartition du matériel génétique irrégulière. Par exemple, si un chromosome présente une fixation au fuseau mitotique irrégulier (un attachement mérotélique) où un seul kinétochore est attaché, l’orientation bipolaire sera erronée mais la cellule entrera néanmoins en anaphase. Le résultat sera une migration des deuxchromatides sœurs dans une seule cellule, ou le retardement du chromosome complet et la possible formation d’un micronoyau, puis la perte du matériel génétique puisqu’il ne fera partied’aucune cellule sœur. Sur un panel d'échantillons du cancer du côlon, 95% d’entre eux

Figure 4. Formation des microdes ponts nucléoplasmiques. (a) par des erreurs de ségrégation chromosomique, (b) par une cassure des chromatides et la formation d’un pont nucléoplasmique après un pont d’anaphase9

noyaux et

60

présentaient des mutations dans des gènes reconnus pour leur rôle dans la ségrégation chromosomique (Figure 5)262‐264. La perte ou le gain de matériel génétique sont donc liésdéfauts de ségrégation des chromosomes epeut se produire quand les ponts d’anaphase ne se cytokinèse et la séparation finale des deux cellules noyaux et une cellule avec un doublement du contétraploïdie peut aussi se produire par fusion cellulaà la mitose (mitotis slippage) au cours duquchromosomes260‐263, 265, 266.

aux t à la formation des micronoyaux. La polyploïdie

résolvent pas ; Ceci peut affecter la sœurs. Le résultat est une refusion des deux

tenu d’ADN, donc une tétraploïdie. La ire, endoréduplication, et un passage rapide

el la cellule termine la mitose sans avoir séparé ses

Figure 5. Le développement de l’aneuploïdie. Au milieu en bleu, sont représentées les phases normales de la mitose. A gauche, une ségrégation non‐homogène des chromosomes provoquée par un défaut de cohésion, où les deux chromatidemigrent dans la même cellule, conséquence d’un défaut du checkpoint du fuseau mitotique (MC). A droite, un chromosome retardé peut affecter le déroulement normal de la cytokinèse provoquant une cellule qui tétraploïde, ou deux cellules sœurs dont l’une a perdu un chromosome et l’autre en a gagné un. La présence d’une mitose multipolaire (en vert à droite) peut aussi déclencher une mauvaise ségrégation et la formation de cellules aneuploïdes24.

s

61

Au niveau cellulaire, la maladie la mieux connue où l’aneuploïdie est présente dans 90% est le cancer. Dans ce cas, l’aneuploïdie est caractérisée par une forte variabilité du nombre dechromosomes et du caryotype. Le paradoxe de l’aneuploïdie est qu’elle va affecter négativement la santé de la cellule principalement à cause d’une dérégulation de la syntdes protéines, mais en même temps, les cellules aneuploïdes vont proliférer plus rapidement11, 262, 265, 267 .

La cellule aneuploïde peut donc présenter une perte ou un gain en chromosomes. Ce changement dérégule la phy

des cas, s

hèse

siologie de la cellule, soit par la perte de la capacité de production de certaines protéines, soit par la surproduction d’autres, selon le niveau de trisomie. En général, les études montrent que les cellules hyperdiploïdes sont en meilleur état que les hypodiploïdes, vraisemblablement parce qu’il est plus facile de compenser la surproduction de certains facteurs que le manque total d’autres. La compensation a lieu au niveau de la transduction, puisqu’il est probablement plus facile d’éliminer les protéines produites en excès que d’hyper‐réguler la production de certaines protéines pour compenser le manque d’autres. Ceci est peut‐être la raison pour laquelle les cellules tolèrent mieux une trisomie qu’une monosomie. En contrepartie, même si la cellule est dérégulée pour sa production de protéines, si elle a gagné une copie d’un oncogène ou si elle a perdu une copie d’un gène suppresseur de tumeur, elle aura tendance à proliférer de manière anormale. C'est pour cela que l’aneuploïdie est une caractéristique du cancer, et que plus de 90% des tumeurs solides ont un caryotype aberrant11, 265.

Même s’il existe des tumeurs qui ont une aneuploïdie stable, et que cela reflète des problèmes de ségrégations chromosomiques passées, la plupart des cancers développent une aneuploïdie active liée à une instabilité chromosomique (CIN) caractérisée par un gain ou une perte élevée des chromosomes complets. Il faut donc remarquer que l’aneuploïdie est différente de la CIN. Tandis que l’aneuploïdie exprime l’anormalité du nombre de chromosomes, la CIN est décrit comme un niveau élevé de perte/gain des chromosomes. L’exemple le mieux connu est le syndrome de Down, où l’aneuploïdie est présente mais pas la CIN24, 268, 269.

L’ d’une cellule à développer les mutations inch ce su

4.

’une des caractéristiques qui accompagne les cycles BFB, les micronoyaux et les défauts dans le contenu d’ADN est l’instabilité chromosomique (CIN). Cette instabilité favorise la progression et

aneuploïdie augmente donc les probabilités dispensables pour sa transformation et la tumorisation, puisque le gain ou la perte des romosomes affecte la transcription de centaines des gènes : un grand nombre de systèmesllulaires pourront se trouver dérégulés et ceci peut être la cause d’acquisition des mutationsbséquentes nécessaires à la survie et la prolifération des cellules tumorales270, 271.

6 Instabilité chromosomique et instabilité génomique

L

62

la pérennisation de ces anomalies. L'instabilité génomique (IG) est classifiée en deux types principaux : (i) MIN (microsatellite instability) et (ii) CIN. MIN se caractérise par des changements simples des nucléotides d’ADN, générés par des défauts de réparationdans les systèmes BER (base excision repair), MR (mismatch repair) et NER (nucleotide excisionrepair). CIN se caractérise par des changements structuraux des chromosomes et la perte/gain de ceux‐ci.

de l’ADN

MIN et CIN s’excluent mutuellement et produisent des phénotypes différents. L’IG est l’augmentation de la tendance d’un génome à acquérir des mutations. Le taux estimé de

‐275.

ifiées en

t NHEJ

quand une cellule présente un taux élevé de perte ou de gain de chromosomes. Plus spécifiquement, une cellule cancéreuse avec un phénotype CIN présente entre 10 et 100

oint s. En outre, il a été

montré que la présence des défauts de fixation des kinétochores aux microtubules (mérotélie) rs de du

d kinesin), Mad2, Aurora kinase, Cdc4, et la surexpression de cycline E. Ceci reflète la nature très complexe

ore‐microtubule adéquate. Par

mutations dans un gène dans une population cellulaire normale est de 2x10‐8/division.L’instabilité génomique est définie lorsque ce taux est augmenté. Ceci a pour conséquence le développement de nouveaux phénotypes pouvant être transformant et prolifératifs269, 272

Les anomalies dans les systèmes de réparation de l’ADN peuvent aussi augmenter la fréquence et la complexité de l’IG. Comme mentionné ci‐dessus, ces anomalies peuvent être classMIN ou CIN. Les cancers avec un phénotype MIN ont des anomalies dans les systèmes de réparation BER, MR, et NER. Le phénotype CIN a quant à lui des anomalies dans les systèmes HRet NHEJ, c'est‐à‐dire que les erreurs pendant la réparation des CDB par les systèmes HR epeuvent déclencher CIN. Par exemple, BRCA1 joue un rôle essentiel dans les deux systèmes de réparation. La perte de fonction de BRCA1 provoque donc à la fois une accumulation des anomalies chromosomiques et du cycle cellulaire276‐278.

On parle de CIN

fois plus de perte/gain de chromosomes, et entre 3 et 14 fois plus de chromosomes retardés qu’une cellule tumorale sans CIN. En outre, la CIN a été impliqué dans le développement tumoral, le changement phénotypique lié à l’aneuploïdie, et l’acquisition par les cellules de la tumeur primaire de propriétés métastatiques266, 269, 279, 280.

Le phénotype CIN peut être entretenu principalement par des défauts au niveau du checkpdu fuseau mitotique et au niveau de l’alignement bipolaire des chromosome

du fuseau peut aussi être une cause d’entretien de CIN, puisque ceci conduit à des erreuségrégation chromosomique, même si les cellules ne présentent pas un défaut au niveau checkpoint du fuseau mitotique (CFM) (Figure 6). Cette augmentation des chromatides retardées peut être due à la perturbation de plusieurs protéines comme BRCA1, APC (adenomatous polyposis coli), les protéines kinesin‐13 (mitotic centromere associate

de l’établissement et de l’entretien d’une fixation kinétochailleurs, un défaut dans cette fixation n’active pas le CFM et donc une correction de l’attachement merotélique ne peut pas avoir lieu. Outre des problèmes dans le CFM et les

63

problèmes de mérotélie, la CIN peut aussi se développer à partir des anomalies formées pendant la réparation des CDB et les cycles BFB (Figure 7)15, 23, 24, 266, 268, 281, 282.

CIN. Des sidérées

hot‐laire

ces

Il existe donc une corrélation entre le type de remaniements chromosomiques (délétion, duplication, translocation), le type structural des chromosomes (anneaux, dicentriques) et la CIN. Certaines études ont permis de montrer qu'il y existe des points préférentiels de cassures(« hot‐spots »), dans les chromosomes, qui sont des séquences instables facilitant la recombinaison et le remaniement de l’ADN, et qui peuvent potentiellement favoriser la régions de répétitions mono‐, di‐, et tri‐nucléotidique, riches en contenu GC, sont concomme des régions de potentielles de translocation et de délétion du contenu AT. Les séquences Alu occupent environ 10% du génome humain et elles peuvent participer de manière préférentielle aux recombinaisons par les systèmes de réparation HR et NHEJ. Un troisièmespot reconnu est la région du centromère. Sa situation spatiale pendant le cycle cellupourrait contribuer à sa tendance à remanier, mais le fait d’avoir des répétitions de séquen

Figure 6. Mérotélie. En haut un attachement amphitélique avec la bi‐orientation normale. Plus bas, un attachement monotélique qui peut être normal avant la bi‐orientation. L’attachement syntélique est par contre anormal, les deux chromatides sont attachées au même pôle. En bas, l’attachement merotélique est le plus fréquent dans la mérotélie : l’une des chromatides part normalement dans une cellule sœur tandis que l’autre subit une tension due à un attachement aux deux pôles, ce qui provoque la formation d’un pont pendant l’anaphase23.

64

homologues avec plusieurs régions différentes du génome est la cause principale de remaniements de cette région283‐287. En plus des hot‐spots, il y existe des sites chromosomiques dits « fragiles », composés des répétitions Alu et GC. Ils sont, de plus, riches en gènes. Ces sites ont tendance à se casser et à échanger du matériel génétique, donc à produire des tr ns et amplifications géniques288. En outre, les cycles BFB produisent ég aniements chromosomiques, des répétitions inversées, dé s, pouvant donner lieu à de grandes variations du caryotype.

anslocations, délétioalement des amplifications, des remlétions et des grosses duplication

Figure 7. Mécanismes pouvant déclencher une instabilité chromosomique. A la suite de cassures double brin de l’ADN, la cellule peut réparer son ADN via les systèmes NHEJ. Mais quand ceux‐ci sont erronés, ils peuvent induire une variété de remaniements chromosomiques (listés en bas de la figure) selon le système utilisé. En outre, quand il y a une fusion chromosomique l’addition d’un télomère et le déclenchement des cycles cassure‐fusion‐pontage peuvent avoir lieu15.

HR ou

66

5. Instabilité génomique

L’instabilité génomique (IG) est une caractéristique de presque tous les cancers. La plupart présentent une IG sous forme d’instabilité chromosomique (CIN), une part réduite d’entre eux sous forme d’instabilité des microsatellites (MIN). Dans le cas de cancers héréditaires, l’IG est liée à des mutations des gènes des systèmes de réparation de l’ADN. Un exemple bien documenté est le cancer héréditaire du côlon sans polypose appelé syndrome de Lynch. Toutes les tumeurs de Lynch présentent un phénotype MIN, principalement à cause de mutations dans les gènes du système de réparation BER (base excision repair). D’autres exemples de cancers héréditaires caractérisés par une CIN liée à des mutations dans les systèmes de réparation de l’ADN sont la mutation du gène BRCA1 dans le cancer mammaire, la mutation du gène NBS1 dans le syndrome des cassures de Nijmegen, WRN dans le syndrome de Werner, BLM dans le syndrome de Bloom269, 289‐291.

L’identification de mutations dans les gènes de réparation de l’ADN dans les cancers héréditaires a donné lieu à « l’hypothèse de mutagenèse » ou des « gènes mutateurs ». Cette hypothèse considère que l’IG est présente dans des lésions précancéreuses et qu’elle conduit au développement de la tumeur via une augmentation de la fréquence de mutation. Ceci s’explique par la mutation initiale de gènes impliqués dans le maintien de la stabilité génomique. Dans cette hypothèse, toutes les cellules des patients porteurs d’un cancer héréditaire ont des mutations dans des gènes de réparation de l’ADN et c’est la perte du dernier allèle normal (évènement de perte d’hétérozygotie) qui déclenche l’IG et ainsi le développement du cancer150, 292, 293.

Les mutations dans les gènes chargés du maintien de la stabilité du génome peuvent expliquer la présence de l’IG dans les cancers héréditaires. Cependant, les études qui ont cherché à identifier ces gènes mutés dans les cancers sporadiques (non‐héréditaires) ont donné peu de résultats. Par exemple, le séquençage de 100 types de cellules provenant de cancers sporadiques du côlon, a détecté seulement quelques mutations des gènes de réparation294. Donc à la différence des cancers héréditaires, le développement de l’IG dans des cancers sporadiques reste mal compris22, 295‐298. Des études récentes ont visé au séquençage massif de cancers chez l’homme ; après un séquençage effectué sur 20 661 gènes provenant d’échantillons de tumeurs du côlon, cancer mammaire, pancréatique, et de glioblastomes, il a été montré que les mutations dans des gènes (connus ou suspectés) de la maintenance de la stabilité du génome étaient peu fréquentes. Seuls 14 à 31% des cancers sporadiques présentaient une ou plusieurs mutations de ces gènes299‐301. On pourrait en conclure qu’environ 70% des cancers sporadiques ne portent pas de mutations au niveau de ces gènes et donc que l’IG n’est pas déclenchée par leur mutation. Toutefois, la fréquence de mutation peut être sous estimée car la fonction des gènes peut également être altérée. La mutation sur un seul allèle

67

peut être aussi insuffisante pour la perte de fonction totale du gène. Néanmoins, puisque la CIN est fréquente dans les cancers sporadiques, il peut être proposé que ce type d’IG soit provoqué

ées

ées, c'e à‐dire une dissociation entre les protéines de réplication et

ctivation

c

par les gènes qui sont retrouvés le plus fréquemment mutés. Les études de séquençage mentionnées ci‐dessus ont ainsi identifié les gènes TP53 (qui code pour p53, protéine de checkpoint et suppresseur de tumeur), des gènes régulant positivement (les oncogènes RAS etEGFR), ou négativement (CDKN2A et PTEN) la prolifération cellulaire299, 302, 303. Ces donnsupportent le modèle de l’induction de l’IG par des oncogènes.

5.1.1 Stress réplicatif

Dans ce modèle, l’activation de certains oncogènes, en dérégulant la prolifération via la dérégulation d’entrée dans le cycle cellulaire, provoque un stress réplicatif, des CDB et l’activation de la DDR (Figure 1). On parle de stress réplicatif quand la cellule porte des fourchesde réplication collaps st‐l’ADN. Le stress apparait quand le nombre de fourches collapsées augmente et que l’adu checkpoint S ne suffit pas pour tout corriger : il y a donc formation de CDB. Le collapsus desfourches de réplication est souvent observé dans les sites fragiles (hot‐spots) chromosomiques : ces loci ont tendance à former des délétions et remaniements chromosomiques et donpermettre la formation des CDB et la perte d’hétérozygotie22, 304.

Le stress réplicatif, l’activation de la DDR et l’activation des checkpoints du cycle cellulaire en réponse à la présence des CDB sont associés à l’activation de p53 et ATM, aboutissant à la sénescence et l’apoptose. Par conséquent, l’activation de la DDR pourrait également favoriser

Figure 1. Développement du cancer induit par l’activation des oncogènes. La présence des CDB

éponse

t a d les

nt

.

provoquée par la surexpression des oncogènes provoque une activation de la rcellulaire au dommage del’ADN, principalemen viATM/ATR et p53. QuanCDB apparaissent de façon répétée, elles peuvedéclencher une IG et la transformation cellulaire22

68

l’entrée d’une cellule en sénescence et la DDR apparaît comme une barrière contre la transformation cellulaire. Dans des modèles murins, l’apoptose déclenchée par certains oncogènes comme myc est dépendante de la DDR. De façon concomitante, l’inhibition deprotéines comme Chk2 ou ATM facilite le développement du cancer22, 305. Plusieurs étudemontrent que des cellules précancéreuses non mutées dans TP53 présentent des CDB,

identifiées par la formation de foyers γH2AX et 53BP1. Des cellules cancéreuses mutées dangène TP53 présentaient aussi ces foci, mais également des défau

s s

s le ts dans les checkpoints du cycle

par le manque d’expression de p53, ATM, 53BP1, et Chk2. Ces travaux la présence des CDB est une caractéristique des lésions pré

mages

e s de ress génotoxique, ce qui est

également lié à certaines résistances thérapeutiques22, 308‐310.

5.1.2 Transformation cellulaire

Même s’il existe plusieurs types de cancers, avec des caractéristiques ble de particularités physiologiques responsables de la capacité maligne est s les cellules cancéreuses. Hanahan et Weinberg ont décrit en 2000 six carafonctionnelles des cancers : (i) autosuffisance dans les signaux de divisignaux inhibiteurs de la prolifération, (iii) inhibition de l’apoptose, (ivillimité, (v) angiogenèse, (vi) invasion et métastase. Ils considèrent l’incomme le facteur permettant l’acquisition des ces six caractéristiquesseptième facteur311. Aujourd’hui d’autres caractéristiques communes identifiées (Figure 2) comme (a) l’évasion du système immunitaire, (b) le stress mitotique et (d) les dommages à l’ADN et le stress réplicatif21

cellulaire, principalementont ainsi pu prouver quecancéreuses, puisque les cellules normales ne présentent pas spontanément de tels domà l’ADN et d’activation de la DDR296, 297, 306, 307.

Dans cette réponse cellulaire p53 est un médiateur critique, son activation déclenche une sénescence / apoptose cellulaire et joue un rôle de barrière anti‐transformation ; la perte de fonction de cette protéine confère donc un avantage prolifératif. Le gène TP53 qui code pour p53 a une fréquence élevée de mutation : presque la moitié des cancers ont une mutation dans ce gène et dans la majorité des cellules transformées la cascade de signalisation de p53 est affectée. Ce changement pourrait représenter une réponse au stress réplicatif. La perte dfonction de la cascade est sélectionnée de façon positive lor st

multiples, un ensempartagé par toutectéristiques sion, (ii) insensibilité aux ) potentiel réplicatif stabilité génomique et non comme un aux cancers ont été le stress métabolique, (c).

69

Pendant le processus de transformation, les cellules doivent acquérir des caractéristiquesspécifiques qui leur donneront des capacités de prolifération et survie quasiment indéterminées. Ces changements sont acquis via la réception des signaux qui sont normalement transmis par des récepteurs transmembranaires qui fixent plusieurs typ

es moléculaires comme les facteurs de croissance, les composants de la matrice extracellulaire et des molécules liées à adhésion et à l’interaction cellule‐cellule. Les cellules normales ne peuvent pas proliférer en l’absence de ces facteurs. En revanche, dans des cellules tumorales, l’activité de certains ncogènes imite ces signaux, réduisant la dépendance à l’environnement et au milieu xtracellulaire21, 311. Les cellules transformées peuvent ainsi acquérir une résistance aux signaux inhibiteurs de la prolifération, un potentiel réplicatif illimité, etc.312‐314.

l’

oe

Figure 2. Les caractéristiques principales du cancer.

a : Initialement, Hanahan et Weinbergavaient décrit six caractéristiquesprincipales du cancer, plus l’instabilité génomique (IG). Actuellement, d’autres caractéristiques communes aux cancers sont proposées, comme l’évasion du système immunitaire et les stress réplicatif, mitotique et métabo

lique.

b et c : les caractéristiques du cancer héréditaire (b) ou sporadique (c), en

(permettant une évasion de l’apoptose).

Comme dans les cancers héréditaires

cipales21.

relation avec l’IG. Dans les cancers héréditaires l’instabilité génomique pourrait être l’évènement initiateur des autres caractéristiques du cancer. Dans les cancers sporadiques, une dérégulation des gènes contrôlant la prolifération pourrait initier les dommages à l’ADN et un stress réplicatif, puis une IG et une pression de sélection pour l’inactivation de p53

l’IG serait alors motrice pour l’accumulation de mutations additionnelles et l’acquisition des autres caractéristiques prin

70

En étudiant des cellules en culture, Hayflick a découvert que le s ont un potentiel limité de réplication. Une fois atteint un certain nombHayflick), le raccourcissement des télomères (qui sont incompl e cycle de division) induit la sénescence réplicative. Néanmoins, les ce peuvent continuer à proliférer au‐delà de la limite de Hayflick,exacerber la dysfonction des télomères. Ces cellules entrent al dite de crise, caractérisée par une instabilité génomique et uneToutefois, les cellules qui peuvent émerger de cette crise (une constellation d’altération génétiques qui confèrent la capacité ans limite. Elles acquièrent des mécanismes de maintenance des téexprimant la télomérase (le complexe enzymatique qui additiod’hexanucléotides et prévient l’atrésie télomérique)18, 315, 316. Cl’acquisition des facteurs nécessaires pour devenir cancéreuse, er la barrière de la mortalité imposée par l’attrition des télomèreréplicative illimitée.

Pendant l’évolution d’une tumeur, la mort cellulaire reste élev donc liée aux cellules capables de se diviser, de surmonter la mortcroissance tumorale. Cette capacité est donc favorisée par la c des cellules transformées à conserver ces télomères. Environ 90% des cellules tumorales présentent une surexpression de la télomérase et 10% utilisent un mécanisme osomique des télomères22, 317‐319.

Une instabilité génomique peut donc favoriser l’émergence de la transformation cellulaire et la tumorigenèse : Bien que les facteurs de transformation duisent initialement des changements qui peuvent entraîner la mort cellulaire, une perte de

performance ou un stress métabolique (par exemple l’aneuploïdie), les cellules qui subiront les ure

s cellules normalere de divisions (limite de ètement répliqués à chaqullules mutées sur les voies p53 l’attrition se poursuit jusqu’à ors dans une deuxième phase mort cellulaire massive. cellule sur 107) aura acquis la de continuer à se répliquer slomères, le plus souvent en nne des répétitions eci signifie que pendant une cellule doit aussi surmonts et acquérir une capacité

ée, la croissance tumorale est cellulaire et d’assurer la

ompétence

d’échange inter‐chrom

s modifications nécessaires pour

in

mutations et modifications des gènes qui, au cours du temps, favoriseront sa sélection (Fig3)271, 320, 321.

71

Figure 3. Modèle de transformation cellulaire à partir d’un stress génotoxique et l’accumulation des ch11

angements nécessaires pour une tumorigenisation (modifié à partir de )

73

Conclusion bibliographique et positionnement du travail expérimental

ous les animaux supérieurs hébergent un nombre important de bactéries au sein de leur tractus intestinal. Chez les mammifères, la densité bactérienne est estimée entre 1011 à 1012 par ramme de contenu colique, ce qui représente 60% de la masse fécale totale. L’ensemble de ces actéries constitue le microbiote intestinal, qui compte environ dix fois plus de bactéries que les

cellules somatiques et germinales de l’organisme. A la naissance, le tractus intestinal est stérile ais il est rapidement colonisé, principalement par des entérobactéries (dont E. coli) et des ifidobactéries322, 323.

es fonctions physiologiques du microbiote intestinal ont été étudiées dans des modèles animale avec ou sans colonisation bactérienne intestinale. Les animaux

digestive enzymatique réduite, un niveau plus faible d’immunoglobulines plasmatiques et un tissu lymphatique intestinal absent ou peu développé323. Le microbiote exerce donc des fonctions métaboliques et immunitaires spécifiques et très importantes : (i) exercer un effet de barrière contre les microorganismes pathogènes, soit par compétition avec des récepteurs et/ou des nutriments, soit par une stimulation du système immunitaire, (ii) influencer la différenciation et la prolifération des cellules intestinales, favoriser la digestibilité des matières organiques et la synthèse des vitamines et (iii) favoriser le recyclage de molécules endogènes ou exogènes (xénobiotiques) en les déconjuguant322. La microflore intestinale est donc un facteur clé de l’homéostasie entérique. Une modification de la composition de cette flore peut aider à améliorer l’état général du tractus intestinal, mais dans certains cas, comme chez les patients génétiquement sensibles, cette modification peut provoquer une pathologie inflammatoire, métabolique, ou immunitaire324.

armi les bactéries du microbiote, E. coli est l’une des premières à coloniser le tractus intestinal es mammifères : elle reste ensuite la bactérie anaérobie facultative la plus abondante dans le

côlon humain, comme dans celui d’autres mammifères et des oiseaux4. Pour arriver à être ompétitives, des souches de E. coli, et d’autres bactéries, ont développé des facteurs de performance ou de virulence qui facilitent la colonisation et l’adaptabilité au milieu, comme les systèmes de capture du fer. Les bactéries ont un accès plus ou moins performant à ce minéral essentiel pour leur croissance, et en le fixant plus facilement, elles deviennent plus compétitives vis‐à‐vis des bactéries qui ne l’ont pas. Parmi ces facteurs, on trouve également les cyclomodulines. Grâce à elles, les bactéries sont capables de modifier le déroulement normal du cycle cellulaire de la cellule hôte, soit en l’arrêtant soit en le stimulant. On trouve dans cette famille de cyclomodulines les toxines Cif, CNF1, CDT, et la Colibactine88.

La Colibactine est présente principalement dans les souches de E. coli du groupe phylogénétique B2. On la trouve dans les souches commensales, mais également dans les souches ExPEC, qui

T

gb

mb

Ld’expérimentationdépourvus de flore bactérienne (axéniques) sont plus sensibles à l’infection, ils ont une activité

Pd

c

74

sont aussi de bonnes colonisatrices du tractus intestinal. Environ 53% des ExPEC et 34% des

les

s

Pour cette raison, dans ce travail de thèse nous nous

souches commensales B2 expriment la Colibactine. Cette toxine bactérienne est une cyclomoduline inhibitrice du cycle cellulaire qui induit des CDB dans les cellules hôtes. Produire des cassures double‐brin de l’ADN lui permet vraisemblablement, en déclenchant une réponse cellulaire aux dommages à l’ADN, d’arrêter le cycle cellulaire par l’activation du checkpoint G2/M. Comme montré par Nougayrède et al.1, les cellules exposées in vitro aux bactéries qui produisent cette toxine répondent par un arrêt du cycle cellulaire, conduisant à une absence demitose, donc de la prolifération ; cet arrêt prolongé induit finalement la mort cellulaire.

Du point de vue de la cellule eucaryote, les cassures double‐brin sont les lésions de l’ADNplus sévères au plan génotoxique. Les conséquences les plus graves apparaissent après leurréparation, puisque quand la cellule ne meurt pas les systèmes de réparation de l’ADN peuvent provoquer des mutations et des remaniements chromosomiques qui peuvent induire l’inactivation ou la sur‐activation de plusieurs gènes. Ceci peut déclencher une instabilité génomique caractérisée principalement par une instabilité chromosomique et une aneuploïdie. Quand la cellule présente des mutations clés dans des gènes onco‐suppresseurs ou une sur‐activation de gènes pro‐tumoraux, une transformation cellulaire peut se déclencher et aboutiréventuellement aux modifications malignes séquentielles qui caractérisent les tissus tumoraux.

Sachant que la Colibactine est produite par des bactéries qui résident depuis la naissance puis de façon persistante dans le côlon humain, il est important d’évaluer les possibles conséquencede cette exposition génotoxique à bas niveau mais sur un mode chronique. Dans les travaux de Nougayrède et al.1, les doses d’infection étaient élevées et donc la mort cellulaire facilement déclenchée. Il est très probable qu’in vivo, les entérocytes soient exposés à des niveaux plus faibles de bactéries, donc de Colibactine.sommes attachés à étudier tout d’abord les effets génotoxiques dans des cellules qui survivent àune infection par de petites quantités de E. coli produisant la Colibactine, en tentant d’établir des relations dose‐effet. La question se posait par ailleurs de savoir si la Colibactine était exprimée in vivo dans le tractus intestinal et si les souches bactériennes la produisant étaientcapables d’induire dans les colonocytes les mêmes types de lésions génétiques que celles observées en culture cellulaire.

77

Travail Expérimental

Les E. coli produisant la Colibactine induisent des cassures double‐brin de l’ADN in vivo et une instabilité génomique in vitro.

Résumé : Cet article présente une partie des résultats obtenus pendant mes travaux de thèse. Nous montrons ici que l’îlot pks est exprimé in vivo, que les bactéries entrent en contact étroit avec la muqueuse colique et qu’elles induisent des cassures double‐brin de l’ADN des entérocytes, dans deux modèles d’expérimentation animale ; (i) un modèle d’anse ligaturée du côlon et (ii) un modèle de traitement antibiotique préalable à une inoculation per os. Nous montrons aussi que les cellules épithéliales en culture infectées in vitro par de faibles doses de bactéries produisant la Colibactine, montrent une instabilité chromosomique et une augmentation de la fréquence de mutation.

‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐

Les données initialement obtenues1 ne permettaient pas d’affirmer que ce qui avait été observé in vitro à des doses infectieuses relativement élevées ait nécessairement une signification physiopathologique in vivo. La complexité métabolique des bactéries, leur sensibilité aux variations de milieux aurait pu conduire à une expression faible, voire nulle, de la toxine par les bactéries dans la lumière intestinale in vivo. Par ailleurs, la barrière constituée par le mucus intestinal aurait pu protéger les entérocytes du contact direct et des lésions subséquentes.

La première question posée était donc de vérifier si les souches E. coli pks+ produisaient la Colibactine in vivo, et si elles entraient en contact avec les entérocytes. Pour cela, nous avons utilisé une souche E. coli pks+ portant un plasmide codant pour la GFP sous contrôle d’un promoteur constitutif, ou sous le contrôle de la région régulatrice de l’un des gènes de l’îlot pks (clbA). Ces souches ont été injectées dans le lumen colique d’anses ligaturées du côlon préparées chez des souris. On a pu observer ainsi que les bactéries étaient en contact direct avec la bordure épithéliale du côlon et que l’îlot pks était bien exprimé (Figure 1A). Afin d’examiner si la Colibactine induisait des cassures double‐brin au niveau des cellules épithéliales

du côlon, nous avons visualisé la phosphorylation de H2AX (γH2AX) par immunohistochimie et western blot, en utilisant des souris irradiés in toto (0,5 et 2 Gy de rayons gamma) comme contrôle positif. Nous avons constaté que les souches pks+ étaient capables d’activer la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN (DDR) in vivo, mais pas une souche mutée (clbA) déficiente pour la production de Colibactine, alors que la souche complémentée (avec un plasmide pclbA) se comportait comme la souche sauvage (Figure 1B et C). Ces résultats ont été confirmés en utilisant un modèle murin de prétraitement antibiotique suivi d’un gavage avec les mêmes souches bactériennes (Figure SI 1A et B).

78

Dans ces modèles murins, nous avons de l’infection à 4 bactéries par cellule. Nous avons utilisé ce chiffre comme base de départ pour explorer en culture cellulaire

conformément à nos conditions in vivo. Pour cela, nous avons utilisé des doses d’infection de 1 é

cycle

ficiente dans le système de réparation par

recombinaison illégitime (Ku80) nous avons observé une forte mortalité (Figure 2C) signant une

mutées dans la réparation est entrée en mitose environ 24 heures après l’infection. Toutefois

une sures

s ces cellules, 24 et 72 heures après l’infection. Nous avons observé des remaniements

noyaux

genèse aux loci tk et hprt, respectivement (Tableau 1). Nous avons aussi examiné le potentiel transformant en utilisant un test de la formation de colonies (clonogénie) dans un milieu agar, qui s’est révélé positif. (Tableau 2). L’ensemble de ces

estimé la multiplicité

les conséquences d’un dommage à l’ADN de faible niveau induit par la Colibactine,

à 20 bactéries par cellule, avec les souches pks+, pks‐, clbA, et pclbA. De manière extrêmementreproductible, les cellules en culture qui ont été infectées à de faibles doses ont d’abord marquun arrêt temporaire du cycle cellulaire dans la transition G2/M (Figure 2A). Cet arrêt du

était accompagné d’une augmentation passagère concomitante des niveaux de γH2AX (Figure 2B). Ces résultats témoignent d’une DDR réversible et de courte durée.

A la suite de ces infections à faibles doses, peu de cellules sont entrées en apoptose. Enrevanche, en utilisant une lignée cellulaire dé

grande sensibilité aux cassures double‐brin. En revanche, la grande majorité des cellules non

ces cellules montraient des signes de lésions à l’ADN, ou au moins la trace de cassures récentes, mises en évidence par la présence de H2AX phosphorylée (Figure 2D et E). Par conséquent,DDR était activée pour une période limitée mais semblait incapable de reconnaitre des casdouble‐brin à faible niveau.

Nous avons ensuite examiné la morphologie des chromosomes et la qualité de la mitose dan

chromosomiques, principalement des anneaux, des translocations, des chromosomes dicentriques et des cassures de chromatides (Figure SI 2A et B). Dans les cellules mitotiques, nous avons mis en évidence des mitoses multipolaires, des chromosomes retardés et des pontsanaphasiques (Figure 3A). La conséquence de ces lésions est un défaut de ségrégation chromosomique et une perte de matériel génétique, révélées par la formation de microet de cycles BFB (breakage‐fusion‐bridge) (Figure 3B‐C).

D’après nos résultats, il suffit d’une seule infection à faible dose pour déclencher ces modifications, qui entrainent par la suite une aneuploïdie et une tétraploïdie (Figure 4A‐C et Tableau SI 1). De surcroit, ces changements perdurent et provoquent une modification de lapopulation cellulaire en culture. Même trois semaines après l’infection, les cellules continuent de montrer des anneaux chromosomiques, des ponts d’anaphase et de l’aneuploïdie (Figure 4D).

Enfin, nous avons étudié la fréquence de mutations, en utilisant la 6‐thioguanine et la trifluorothymidine pour quantifier la muta

79

résultats montre que les souches produisant la Colibactine sont mutagènes et génotoxiquesavec un effet aneugénique et clastogénique.

E. coli pks+ pourrait donc être un facteur déclenchant de l’instabilité génomique au niveau du côlon. Ces résultats sont potentiellement très importants puisque on sait que l’îlot pks est amplement distribué dans les souches de E. coli du groupe phylogénétique B2, dont les souches commensales et les ExPEC, où l’îlot est présent dans environ 30 et 50% des souches respectivement. En outre, il a été noté une nette augmentation des souches B2 dans les populations des pays plus développés ces dernières années. Si la signification

,

physiopathologique de la présence de ces souches dans le microbiote se révélait importante, ce que la qui devra être exploré par des études épidémiologiques approfondies, on peut imaginer

mise au point d’un vaccin permettant d’éradiquer les souches pks+ serait susceptible de contribuer à diminuer la fréquence de certains cancers.

Escherichia coli induces DNA damage in vivo andtriggers genomic instability in mammalian cellsGabriel Cuevas-Ramosa,b, Claude R. Petita,b, Ingrid Marcqa,b, Michèle Bourya,b, Eric Oswalda,b,c,d, andJean-Philippe Nougayrèdea,b,1

aInstitut National de la Recherche Agronomique, Unité Mixte de Recherche 1225, F-31076 Toulouse, France; bUniversité de Toulouse, Ecole NationaleVétérinaire de Toulouse Unité Mixte de Recherche 1225, F-31076 Toulouse, France; cFaculté de Médecine, Université de Toulouse, Université Paul Sabatier,F-31400 Toulouse, France; and dLaboratoire de Bactériologie-Hygiène, Centre Hospitalier Universitaire de Toulouse, F-31059 Toulouse, France

Edited by Ralph R. Isberg, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, and approved May 14, 2010 (received for review February 1, 2010)

Escherichia coli is a normal inhabitant of the human gut. However,E. coli strains of phylogenetic group B2 harbor a genomic islandcalled “pks” that codes for the production of a polyketide-peptidegenotoxin, Colibactin. Here we report that in vivo infection withE. coli harboring the pks island, but not with a pks isogenic mutant,induced the formation of phosphorylated H2AX foci in mouse enter-ocytes. We show that a single, short exposure of cultured mamma-lian epithelial cells to live pks+ E. coli at low infectious doses induceda transient DNA damage response followed by cell division withsigns of incomplete DNA repair, leading to anaphase bridges andchromosome aberrations. Micronuclei, aneuploidy, ring chromo-somes, and anaphase bridges persisted in dividing cells up to 21 dafter infection, indicating occurrence of breakage–fusion–bridge cy-clesandchromosomal instability. Exposedcells exhibitedasignificantincrease in gene mutation frequency and anchorage-independentcolony formation, demonstrating the infection mutagenic and trans-forming potential. Therefore, colon colonization with these E. colistrains harboring the pks island could contribute to the developmentof sporadic colorectal cancer.

bacteria | genotoxin | aneuploidy | chromosomal instability | cancer

The dense bacterial consortium, called “microbiota,” that in-habits the intestinal tract is recognized increasingly as playing

amajor role in human health and disease. Themicrobiota generallyinfluences the host in a beneficial fashion by shaping gastrointesti-nal and immune functions, exerting protection against pathogens,and contributing to metabolic pathways (1). Escherichia coli isa consistentmember of the human intestinalmicrobiota, colonizingthe intestine within a few days after birth and persisting throughoutthe life of the host. TheE. coli strain population can be categorizedin at least four major phylogenetic groups (A, B1, B2, and D), eachgroup being more specifically associated with certain ecologicalniches.E. coli strains belonging to group B2 are recovered from theenvironment less frequently but can persist longer in the colon thanother groups and represent 30–50% of strains isolated from thefeces of healthy humans living in high-income countries (2, 3). Werecently discovered that up to 34% of commensal E. coli strains ofthe phylogenetic groupB2 carry a conserved genomic island named“pks island” (4–6). This gene cluster codes for nonribosomal pep-tide synthetases (NRPS) and polyketide synthetases (PKS) thatallowproductionof aputative hybridpeptide-polyketidegenotoxin,Colibactin. In vitro infection with these strains induces DNA dou-ble-strand breaks (DSBs) in cultivated human cells, but the pksisland was not proved to cause DNA damage in vivo (4).In this study, we wished to explore whether those bacteria were

able to induce genetic damage in vivo on the colonic mucosa andto characterize the consequences of this damage on mammaliancells in relation with the number of infecting bacteria. We reportthat pks+ E. coli induced DSBs in vivo. In addition, infection ofvarious mammalian cells with pks+ E. coli induced, at very lowmultiplicity of infection (MOI), reversible DNA damage responsethat did not repair all DSBs, leading to chronic mitotic andchromosomal aberrations together with increased frequency of

gene mutation and anchorage-independent growth. Taken to-gether, these findings strongly suggest that these pks+ strains aregenotoxic in vivo and provide insights into mechanisms by whichcommon E. coli strains may contribute to cellular transformationand possibly sporadic colorectal cancer tumorigenesis.

Resultspks+ E. coli Induces γH2AX Foci in Vivo. To test whether pks+ E. coliexpressed Colibactin genes and induced DNA damage in vivo, wefirst used a mouse intestinal loop model. Colon loops wereinfected with E. coli harboring the pks island and a plasmid-encoded GFP under control of either a constitutive promoter orthe native clbA promoter. The clbA gene is localized on the pksisland and encodes a phosphopantetheinyl transferase requiredfor Colibactin biosynthesis by theNRPS and PKS enzymes (4).Weobserved that GFP-expressing bacteria were localized close to orin contact with the intestinal brush border (Fig. 1A). Next, weassessed by immunohistology and Western blotting the S139-phosphorylation of histoneH2AX (γH2AX), a sensitive marker ofDSBs (7). Gamma-irradiated mice (0.5 or 2 Gy) were used aspositive controls. Colon loops were infected with wild-type pks+

E. coli, the isogenic clbA mutant, or the mutant complementedwith a plasmid bearing the clbA allele. After 6 h of incubation,tissue samples were collected. Significant numbers of γH2AX fociwere found in the nuclei of enterocytes exposed to pks+ E. coli ascompared with the isogenic clbA mutant and negative control(Fig. 1B). γH2AX foci were found in 22.7% of enterocytes infectedwith wild-type pks+ E. coli, three times more than in enterocytesinfected with the isogenic clbAmutant (P < 0.001, ANOVA). West-ern blot analyses of colonocytes also indicated increased γH2AX inthe intestinal loops infected with the wild-type pks+ E. coli or withthe complemented clbA mutant, similar to levels seen with 0.5-Gygamma irradiation (Fig. 1C).To substantiate these results, we used a second in vivo model

in which antibiotic-treated mice were given the pks+ bacteria peros. Similar clbA:gfp expression and γH2AX foci were observed inthe colons of mice treated for 5 d with streptomycin-bacitracin-neomycin and then inoculated by gastric gavage with pks+ E. coli(Fig. S1). Together these results indicated that pks+ E. coli inducedγH2AX in vivo, suggesting DNA damage to colonic epithelial cells.

Transient DNA Damage Response, Incomplete DNA Repair, and CellDivision After Low-Dose Infection with pks+ E. coli. We next exam-ined in vitro the consequences of the DNA damage inflicted onmammalian cells by infection with low numbers of pks+ E. coli as

Author contributions: C.R.P., E.O., and J.-P.N. designed research; G.C.-R., C.R.P., and J.-P.N.performed research; I.M. and M.B. contributed new reagents/analytic tools; G.C.-R., C.R.P.,E.O., and J.-P.N. analyzed data; and G.C.-R., C.R.P., E.O., and J.-P.N. wrote the paper.

The authors declare no conflict of interest.

This article is a PNAS Direct Submission.1To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected].

This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1001261107/-/DCSupplemental.

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1001261107 PNAS Early Edition | 1 of 6

MICRO

BIOLO

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http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1001261107/-/DCSupplemental/pnas.201001261SI.pdf?targetid=nameddest=SF1

mailto:[email protected]

http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1001261107/-/DCSupplemental

http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1001261107/-/DCSupplemental

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1001261107

observed in vivo. Chromosomally stable CHO cells were infectedwith live pks− or pks+ E. coli. Because the estimated in vivo in-fectious dose was about four bacteria per enterocyte (SI Materialsand Methods), we usedMOIs of 1–20 bacteria per cell. After a 4-hinfection, cells were washed and incubated with antibiotics to killremaining bacteria. Cell-cycle distribution, γH2AX response, andcell death were monitored 16–30 h later. Cells exposed to pks−

E. coli exhibited a normal cell cycle and background levels ofγH2AX, whereas cells infected with pks+ E. coli shown a transientincrease in G2/M population and γH2AX response that wasstronger at MOI 20 than at MOI 5 (Fig. 2 A and B). Sub-G1 peakand active caspases levels indicated that the cell death remainedat background levels for MOI 5 and below 15% for MOI 20(Fig. 2 A andC). In contrast to wild-type CHO cells, Ku80 mutant

Fig. 1. pks+ E. coli induces DSBs in vivo. Ligated colon loops were prepared in BALB/c mice, and then the loops were injected with sterile culture medium orwith 3 × 109 wild-type pks+ E. coli (WT), the isogenic clbAmutant impaired for biosynthesis by the NRPS-PKS enzymes, or the clbAmutant complemented witha plasmid-encoded clbA allele. After 6-h incubation, the loops were removed and processed for immunohistology or Western blot analysis. (A) Frozen tissuesections were stained for DNA (blue) and F-actin (red) and then were examined by confocal microcopy. Bacteria expressing GFP (constitutive promoter) or GFPunder control of the clbA promoter (clbA:GFP) were detected in the green channel. (Scale bars, 10 μm.) (B) Paraffin tissue sections were stained for γH2AX(brown) and counterstained with hematoxylin. Gamma-irradiated mice (whole-body, 2 Gy) were used as positive controls. (Scale bars, 10 μm.) (C) Western blotanalysis of γH2AX in colonocytes 6 h after inoculation of colon loops with wild-type pks+ E. coli, the clbA isogenic mutant, or the mutant complemented witha plasmid coding for clbA. Gamma-irradiated mice (whole-body, 2 or 0.5 Gy) were use as positive controls. Histone H3 and actin were probed as protein-loading controls. γH2AX levels relative to histone H3 content were estimated by densitometry.

Fig. 2. DNA damage repair, cell death, and division after low-dose infection with pks+ E. coli. CHO cells were infected for 4 h with live pks+ or pks− E. coliwithan MOI of 5–20 bacteria per cell or were left uninfected (Ctrl). At the end of the infection, the cells were washed and grown with gentamicin. (A) Cell-cycleanalysis 16 and 30 h after infection. (B) γH2AX levels were quantified by flow cytometry 16 or 30 h after infection. (C) CHO or xrs-6 Ku80-defective cells wereinfected; 24 h later, apoptotic cells were labeled with a carboxyfluorescein fluoromethyl ketone peptide inhibitor of caspases (FLICA) for 1 h and quantified byflow cytometry. Error bars represent SE from three experiments. (D) The cells were examined by confocal microscopy for DNA (blue), Ser10-phosphorylatedhistone H3 (pH3, red), and γH2AX (green) 24 h after infection. (Scale bars, 10 μm.) (E) Quantification of γH2AX foci in mitotic cells. Error bars represent SEsfrom three experiments.

2 of 6 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1001261107 Cuevas-Ramos et al.

http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1001261107/-/DCSupplemental/pnas.201001261SI.pdf?targetid=nameddest=STXT



cells, which are deficient for the nonhomologous end-joining(NHEJ) repair pathway and thus are hypersensitive to DSBs (8),died massively (Fig. 2C). These results indicate that cells exposedto low numbers of pks+ bacteria suffered DNA damage but wereable to repair, primarily by the NHEJ pathway, and resumed cellcycle and division. However, 24 h after infection 50% of mitoticcells previously infected with pks+ E. coli still harbored one to fourγH2AX foci, in contrast to control cells or cells infected with pks−

bacteria showing no foci (Fig. 2 D and E). These γH2AX foci onmitotic chromosomes represent scars of repaired lesions or evenunrepaired DNA breaks (9, 10). Thus, low-dose infection withpks+ E. coli induces reversible activation of the DNA damage re-sponse followed by cell division with signs of damaged DNA.

Infection with pks+ E. coli Induces Anaphase Bridging and ChromosomeAberrations. Misrepaired DSBs can induce chromosome fusionsresulting in chromatin bridges that often break during anaphase(11). Such anaphase bridges harboring γH2AX foci could bedetected 24 h after infection with pks+ E. coli (Fig. 3A). Moreover,anaphase bridges, lagging chromosomes, and multipolar mitosisalso were observed in the cell population 72 h (three to four celldivisions) after infection with pks+ bacteria (Fig. 3A). The ana-phase bridge index increased with the MOI of pks+ E. coli, where-as it remained at background level in cells exposed to pks− or tothe clbA mutant and was restored to pks+ level upon mutantcomplementation (Fig. 3B). NHEJ-deficient Ku80 mutant cellswith a constitutively enhanced rate of bridge formation (12) alsoshowed an increase in bridging after infection with pks+ E. coli.Anaphase bridges were found not only in CHO cells but also inhuman colon cancer HCT-116 cells and nontransformed rat in-testinal epithelial IEC-6 cells 3 d after infection with pks+ E. coli(Fig. 3B). To corroborate these results, we performed a cytokine-

sis block assay that allows scoring of lagging or acentric chromo-somes, which give rise to micronuclei, and anaphase bridges thatresult in nucleoplasmic bridges (13). Three days after infectionwith pks+ but not with pks− E. coli, binucleate cells harboredsubstantial numbers of micronuclei and nucleoplasmic bridgesthat increased with the MOI (Fig. 3C).We next assessed metaphasic chromosomes 24 h and 3 d after

infection. A variety of chromosome aberrations were observed, in-cluding translocations, chromatid breaks, and dicentric and ringchromosomes (Fig. S2A). The number of aberrant chromosomesdiminished at 3 d compared with 24 h after infection (Fig. S2B).Heavily damaged cells likely died after the first division, consistentwith the cell death that was measured 24 h after infection with pks+

E. coli (Fig. 2C). Threedays after pks+E. coli infection,we found2%metaphaseswith centric rings and5%with translocations; 21 d later,1%ofmetaphases still harbored ring chromosomes. Together theseresults indicate that cells infected with pks+ E. coli seem to propa-gate lasting chromosome aberrations and cycles of breakage–fusion–bridges.

Infection with pks+ E. coli Induces Aneuploidy and Tetraploidy.Anaphase bridging can induce aneuploidy (gain or loss of chro-mosomes) and tetraploidy (8n DNA content for a cell in G2) (14,15). Chromosomes were counted in metaphase spreads 3 d afterinfection. About 40% of CHO cells infected with pks+ E. coliharbored abnormal chromosome numbers, even at the lowestinfection dose (one bacterium per cell) (Fig. 4A). To evaluateaneuploidy and tetraploidy further in CHO, HCT-116, and IEC-6 cells, mitotic cells were stained for phosphorylated histone H3,and their DNA content was determined by flow cytometry (16)3 d after infection (Fig. 4B). We found significant increases inaneuploid (hypodiploid and hyperdiploid) and tetraploid cells

Fig. 3. Infection with pks+ E. coli induces anaphase bridges and micronuclei. (A) (Upper) Anaphase bridge 24 h after infection with pks+ E. coli (DNA shown inblue, γH2AX in green, and pH3 in red). (Lower) Seventy-two hours after infection (i) normal anaphase, (ii) anaphase bridge (arrow), (iii) multipolar mitosis, (iv)lagging chromosomes (arrow). (Scale bars, 10 μm.) (B) Anaphase bridge index in CHO, ku80-defective CHO, HCT-116, and IEC-6 cells 3 d after infection. (C)Cytochalasin-B–induced cytokinesis block assay. (Left) Images and arrows show a nucleoplasmic bridge (formed by anaphase bridging) and a micronucleus(formed by lagging or acentric chromosomes) in CHO cells 3 d after infection. (Right) Micronuclei and nucleoplasmic bridges were counted in 1,000 bi-nucleated cells. Error bars in B and C represent the SE from three experiments.

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after infection with pks+ or complemented clbA mutant E. colicompared with the control population or cells that were infectedwith the pks− or clbA mutant E. coli (Fig. 4C and Table S1). Thisincrement of cells with abnormal DNA content persisted up to21 d after pks+ E. coli infection, and the number of polyploidcells even increased. In parallel, the anaphase bridge index in-creased to 20% at 7 d and persisted (Fig. 4D). It thus appearsthat cells exposed to low infectious doses of pks+ E. coli propa-gated breakage–fusion–bridge cycles, generating chromosomenumerical instability in the long term.

Increased Gene Mutation Frequency and Anchorage-IndependentGrowth After Infection with pks+ E. coli. Chromosome rearrange-ments generate gene mutations, and, conversely, gene mutationsare required to allow maintenance of chromosomal instability andaneuploidy (17). Therefore, we tested gene mutation frequenciesat the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (hprt) andthymidine kinase (tk) loci after infection of CHO or HCT-116cells (Table 1). We found a significant increase in 6-thioguanine–resistant (hprt mutant) colonies after infection with the pks+ orcomplemented clbAmutant E. coli compared with uninfected cellsor cells that were infected with pks− or clbA mutant E. coli. In-fection with pks+ E. coli also resulted in a significant increase of tkmutants selected with trifluorothymidine.To examine further whether this increased frequency of gene

mutation correlated with a transformed phenotype (18), we testedthe cell anchorage-independent proliferation in soft agar afterinfection of CHO, HCT-116, or IEC-6 cells (Table 2). The cellsinfected with the pks+ or complemented mutant E. coli formeda significantly higher number of colonies in soft agar comparedwith pks−- or clbA-infected and control cells. Together theseresults indicate the mutagenic and transforming potential of theinfection with pks+ E. coli.

DiscussionColorectal cancer is a disease primarily occuring in high-incomecountries, where it represents the second most frequently di-agnosed malignancy and accounts for 500,000 (3.3%) humandeaths annually (19). Sporadic colorectal cancer essentially isa genetic disease in which chromosomal instability, found in 85%of cases, is central to the tumorigenesis process (20, 21). Agetogether with dietary practices, alcohol and tobacco consump-tion, physical activity, and body weight are major risk factors(19), but several studies also have implicated the colonicmicrobiota in the development of colorectal cancer (22). How-ever, epidemiological approaches attempting to identify linksbetween colonic bacteria and colorectal cancer are hampered by

Fig. 4. Infection with pks+ E. coli induces aneuploidy and tetraploidy. (A) Chromosome counts in CHO cells 3 d after infection. At least 100 metaphase spreadswere examined in each group. (B) Aneuploidy assay by flow cytometry (16). At least 2 × 105 mitotic (Ser10-phosphorylated histone H3-positive) cells wereanalyzed for DNA content. Normal (4n), hypodiploid (<4n), hyperdiploid (4 < n < 8) and polyploid (8n) cells were gated and counted. (C) Three days afterinfection (MOI of 1–20), CHO cells were analyzed for aneuploidy as in B. *, P < 0.001, exact Fisher’s test. Similar results were found with IEC-6 and HCT-116 cells(Table S1). (D) Cells were infected (MOI = 20) and then were grown for 21 d (with six passages). Aneuploidy (histograms) was assessed as in B, and theanaphase bridge index (curves) was scored as in Fig 2B.

Table 1. Increased mutation frequencies at the hprt and tk lociafter infection with pks+ E. coli

Locus Cells Infection MF ± SE × 10−5

hprt CHO Control 1.68 ± 1.17E. coli pks− 2.89 ± 2.02E. coli pks+ 11.40 ± 1.16*E. coli clbA 1.54 ± 1.11E. coli clbA + pclbA 11.80 ± 1.14*

tk CHO Control 31.7 ± 2.44E. coli pks− 29.1 ± 3.18E. coli pks+ 48.3 ± 2.02*

hprt HCT-116 Control 1.52 ± 0.18E. coli pks− 1.52 ± 0.27E. coli pks+ 3.58 ± 0.20*

CHO and HCT-116 cells were infected (MOI = 20) or left uninfected, thengrown for 7 or 3 d before plating with 6-thioguanine or trifluorothymidineto select for hprt or tk mutants, respectively.*P < 0.05, x2- Mc Nemar test compared with control, pks−, and clbA. MF,mutation frequency.


http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1001261107/-/DCSupplemental/pnas.201001261SI.pdf?targetid=nameddest=ST1

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the long (20–40 yr) lag time between initiation and disease, bythe enormous complexity of the microbiota, and by bacterialstrain-to-strain variations (23, 24). Nonetheless, bacterial strainsproducing metabolites or toxins that insult host DNA (25–27)represent an important factor for chronic DNA damage in thecolon and thus constitute a potential etiologic component ofsporadic colorectal cancer.Our previous findings (4) and the present study (showing the

higher sensitivity of NHEJ-deficient cells) demonstrate that in-fection of eukaryotic cells with pks+ E. coli strains induces host-cellDNA DSBs and activation of the DNA damage signaling cascade,including the ATM–CHK–CDC25–CDK1 pathway and Ser139phosphorylation of histone H2AX. Infection with high numbers oftoxigenic bacteria induces an irreversible cell cycle arrest andeventually apoptotic cell death (cells with sub-G1 DNA contentand activated caspases). In this study, we also observed that wheneukaryotic cells were infected with infectious doses more relevantto those occuring in vivo with commensal bacteria, most cellsexhibited only a transient DNA damage response and rapidly re-sumed division cycles. However, these cycling cells frequently dis-played γH2AX foci during the subsequent mitosis. The smallnumbers of gamma foci were below the threshold level of 10–20foci activating theG2/M checkpoint maintenance, thus allowing thegeneration of chromosome breaks during mitosis (28–30). Theseobservations raise the question of the impaired reparability ofColibactin-induced DSBs. Consistent with this model, we observedmitotic aberrations such as lagging chromosomes and anaphasebridges. Bridging is known to result from the fusion of brokenchromosome ends, generating dicentric chromosomes that arepulled to both poles of the mitotic spindle (11). After breakage ofthe bridge and rejoining in the next interphase, breakage–fusion–bridge cycles propagated and further generated genetic aberrationsincluding aneuploidy/polyploidy and gene mutation (31). Propa-gation of this chromosomal instability phenotype continued, be-cause a significant fraction of the cells harbored chromosome rings,aneuploid/polyploid DNA content, and anaphase bridging 21 d af-ter transient infection with pks+ E. coli. The clonogenic survivalassays confirmed that cells infected with pks+ E. coli continued toproliferate in the presence of DNA damage and exhibited in-creased mutation frequency and transformed phenotype.E. coli is primarily a commensal inhabitant of the mammalian

colon, colonizing the gut early after birth and remaining residentthroughout the life of the host, but commensal strains differ in theircolonization efficiency. E. coli strains belonging to phylogenetic

groupB2 seem to have a superior capacity to colonize and persist inthe colonicmicrobiota (3), and during the last decade the incidenceof B2 strains has risen quickly in colonic microflora of humanbeings living in high-income countries (2). Surveys have shown thatthe pks island is present in up to 34% of commensal isolates ofphylogenetic group B2 from healthy individuals (4–6). A recentcomparative metagenomic analysis of fecal samples from 13 healthyindividuals of various ages, including unweaned infants, showed thatpks island genes are found in 40% of samples, especially in infants(32). Thus, the pks island is hosted by commensal E. coli strainscommonly found in the humanmicrobiota at birth, and these strainscould remain in the colon for years or even decades. A key finding inthe present study is that the Colibactin genes are expressed in vivoand induce γH2AX foci in enterocytes. The effect was estimated tobe similar to that of a 0.5-Gy gamma ray whole-body irradiation andwas enough to trigger in vitro breakage–fusion–bridge cycles, chro-mosomal instability, aneuploidy, and gene mutations in mammaliancells. In conclusion, our results indicate that common pks+ E. colistrains could play a role in colon carcinogenesis by repeatedly pro-voking low-grade DNA damage at the enterocyte level. The role ofthe human intestinal microflora in colon cancer has been over-looked (33) and deserves further scrutiny.

Materials and MethodsBacterial Strains and Cell Lines. The wild-type E. coli B2 pks+ strain SP15 (4)was used for in vivo experiments. An isogenic mutant was constructed byallelic replacement of the clbA gene on the pks island with a kanamycinresistance cassette, and the mutant was complemented with the wild-typeclbA allele cloned on a plasmid (pclbA), as previously described (4). To vi-sualize the bacteria in vivo, the strains were transformed with plasmids thatencode a gfp gene under control of a constitutive promoter (pFPV25.1) (34)or gfp under control of the clbA promoter/regulatory region (pJN871; clbA:gfp). For in vitro infections we used the E. coli strain DH10B hosting a BACbearing the pks island (pBACpks; pks+ E. coli), or hosting the pBeloBAC11vector (pks− E. coli), the isogenic DH10B pBACpks clbA mutant, or the com-plemented mutant (4). The cell lines used were CHO AA8, CHO xrs-6 (Ku80-deficient), nontransformed rat intestinal epithelial IEC-6 cells (ATCC CRL-1592), and human colon cancer cells HCT-116 (ATCC CCL-247).

Murine Colon Loop and Antibiotic Treatment Models. Animal experimentationswere carried out in accordance with European Guidelines for the Care and Useof Animals for Research Purposes. For the colon loop assay, BALB/cJ mice wereanesthetized, a midline abdominal incision was made, a ligature was placed atthe proximal and distal ends of the colon, and 3 × 109 bacteria (300 μL) wereinjected into the colonic lumen. The incision was sutured, and animals wereallowed to recover. The mice were killed 6 h later, and the colons were col-lected immediately. For the antibiotic treatment assay, BALB/cJ mice weretreated for 5 d with streptomycin (2 g/L), bacitracin (2 g/L), and neomycin(1 g/L) in the drinking water. Antibiotic treatment was stopped 24 h beforegastric gavage with 109 bacteria twice at 24-h intervals. Mice were killed 12 hlater, and the colons were collected immediately. Gamma-irradiated mice (0.5-or 2-Gy 137Cs whole-body irradiation) were used as positive controls for DNAdamage. For Western blot analyses, colonocytes were prepared in a 1.5-mMEDTA, 0.5-mM DTT buffer. Western blot and immunohistological analyseswere done following standard procedures.

In Vitro Infection Assay. Cells (∼75% confluent) were washed four times andincubated in infection medium based on DMEM for IEC-6 and HCT-116 cells orMEMα for CHO cells, supplemented with 25 mM Hepes and 5% FCS (Invi-trogen). Bacteria were pregrown in infection medium to the midlogarithmicphase; then the infection dose was calculated according to an MOI of 1–20(number of bacteria per cell at the onset of infection). After a 4-h infection at37 °C and 5% CO2, cells were washed four to six times and incubated untilanalysis in cell culture medium supplemented with gentamicin.

Genomic instability Analyses. Cell cycle, γH2AX flow cytometry, and micro-scopic analyses were done as before (4). Apoptotic cell death was quantifiedby staining with carboxyfluorescein-labeled fluoromethyl ketone caspase in-hibitor (Chemicon) and flow cytometric measurement of sub-G1 peak. Ana-phase bridges (35), micronuclei, and nucleoplasmic bridges (13) were scored asdescribed. Metaphase spreads were prepared and analyzed using standardcytogenetic procedures. DNA quantification in mitotic (phospho-histone H3-

Table 2. Anchorage-independent growth in soft agar afterinfection with pks+ E. coli

Infection CFU ± SE per 10,000 cells

CHOControl 0.00E. coli pks− 0.00E. coli pks+ 3.33 ± 0.41**E. coli clbA 0.00

E. coli clbA + pclbA 4.33 ± 0.58**IEC-6Control 0.33 ± 0.25E. coli pks− 0.00E. coli pks+ 10.33 ± 0.62**

HCT-116Control 4.67 ± 0.36E. coli pks− 2.67 ± 0.41E. coli pks+ 12.33 ± 0.41***

CHO, IEC-6, and HCT-116 cells were infected (MOI = 20) or left uninfected,then grown for 3 d before plating in 0.3% soft agar. Colonies (>50 cells)were counted after 7 d.**P < 0.01 and ***P < 0.001 by ANOVA with Bonferroni posttest.

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positive) cells was done as previously described (16). For tk and hprt genemutation assay, established methods were used (36). Anchorage-independentgrowth was determined using a soft agar colony formation assay (37).

Statistical Analyses. All microscopic quantifications (γH2AX foci, chromosomeaberrations, micronuclei, and nucleoplasmic bridges) were done blindly. Experi-ments were repeated at least three times. For statistical analyses a P value wasconsidered significant if P < 0.05, P < 0.01, or P < 0.001. Gene mutation fre-quencies were calculated as described (36).

Materials and methods are detailed thoroughly in SI Materials andMethods.

ACKNOWLEDGMENTS. We thank A. Pinton for help in the cytogeneticstudies, M. Defais (Centre National de la Recherche Scientifique, Toulouse,France) for the donation of the CHO cell lines and for advice, F. Pierre for helpin the clonogenic assay, and J.-S. Hoffmann and B. Ducommun for helpfuldiscussions and suggestions. This work was supported by grants from FrenchAssociation pour la Recherche sur le Cancer and La Ligue Contre le Cancer.

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Supporting InformationCuevas-Ramos et al. 10.1073/pnas.1001261107SI Materials and MethodsBacterial Strains and Plasmids. For the in vitro assays, we used thepreviously described (1)E. coli strainDH10Bhosting aBACbearingthe pks island (E. coli pks+) that produces Colibactin, the isogenicclbAmutant (deficient in the phosphopantetheinyl transferase geneand thus impaired for Colibactin biosynthesis), or DH10B hostingthe pBeloBAC11 vector only (E. coli pks−). For the in vivo assay, thewild-type E. coli strain SP15 (1) was used. The isogenic SP15 clbAmutant was constructed using lambda red recombination and theprimers IHAPJPN44/45 as previously described (1, 2).Cloning of the clbA gene for complementation of both mutants

was performed by high-fidelity PCR amplification (DeepVent;New England Biolabs) using primers IHAPJPN118 (5′-GGA TCCTAG ATT ATC CGT GGC GAT TC) and IHAPJPN119 (5′-GGA TCC TAA ATG GCA CAC CTA TCC GC) and cloninginto pCR-Script (Stratagene). The resulting pMB808 (pclbA)plasmid was transformed into each clbA mutant.

To visualize SP15 strains in vivo, the bacteria were transformedwith plasmid pFPV25.1 that encodes a gfp gene under control of anrpsM constitutive promoter (3). To construct the plasmid pJN871that encodes the gfp gene under control of the clbA promoter/reg-ulatory region, the PCR amplicon using primers IHAPJPN115 (5′-GAA TTC ATC ACC TTA TTA TCG GAT TTA TAG) andIHAPJPN117 (5′-GGA TCC TTA GAT AAT CTC ATT CCTGTT AGC) was cloned (BamHI/EcoRI) into pFPV25 (3).For the infection assay, bacteria were cultured overnight in LB

broth at 37 °C with shaking. The next day, this culture was diluted1:100 in interaction medium (IM), consisting of DMEM orMEMα (Invitrogen) buffered with 25 mM Hepes and supple-mented with 5% FCS (Eurobio). This preactivated culture wasincubated at 37 °C with shaking until an optical density of 0.6 at600 nm was obtained. Then the bacteria were added to the cells.

Cell Culture. Parental CHO AA8 cells from the ATCC, and CHOxrs-6 (Ku80-deficient) cells (a kind gift of M. Defais, Institute ofPharmacology and Structural Biology, Centre National de laRecherche Scientifique 205, Toulouse, France) were grown inMEMαwith 10%FCS and 80 μg/mL gentamicin. Nontransformedrat intestinal epithelial cells (IEC-6; ATCC CRL-1592) were cul-tured in DMEM, 10% FCS, 80 μg/mL gentamicin, supplementedwith 4 μg/mL insulin (Sigma). Human colon tumor cells (HCT-116) were cultured in McCoy’s medium (Invitrogen) with 10%FCS, 80 μg/mL gentamicin, and 1% nonessential amino acids(Invitrogen). All cell lines were grown at 37 °C in a 5% CO2 hu-midified atmosphere and split regularly to maintain exponentialgrowth. A fresh culture was started from a liquid nitrogen stockevery 20 passages. The cell lines were confirmed free from myco-plasma contamination by PCR.

In Vitro Infection Assay. Cells (∼75% confluent) were washed fourtimes with warmHBSS (Invitrogen) and incubated in IM based onDMEM for IEC-6 and HCT-116 cells or MEMα for CHO cells.The infection dose was calculated according to a multiplicity ofinfection (number of bacteria per cell at the onset of infection,MOI). After a 4-h infection at 37 °C in a 5%CO2 atmosphere, cellswere washed four to six times with warm HBSS and incubated incell-culture medium supplemented with 200 μg/mL gentamicin.The culture medium was changed the next day, and thereafter,cells were split twice a week until analysis (up to 21 d).

Cell Cycle, Apoptosis, γH2AX, and Aneuploidy Flow Cytometry Analyses.Cells were collected by trypsin treatment.

For cell-cycle analysis, cells were fixed overnight in 70% eth-anol at −20 °C, treated with PBS 0.1% Triton ×100 for 5 min,washed and resuspended in PBS containing 15 μg/mL propidiumiodide (Sigma), and 100 μg/mL RNase (Fermentas).For cell-death quantification, cells were stained (1 h at 37 °C,

5% CO2) with carboxyfluorescein-labeled fluoromethyl ketonepeptide inhibitor of caspases (FAM-VAD-FMK, FLICA Cas-paTag; Chemicon) diluted in PBS.For γH2AX quantification, cells were fixed in PBS 1% formal-

dehyde, then in 90%methanol. After treatment in PBS 0.5%BSA(Sigma), cells were incubated with mouse anti- γH2AX mono-clonal antibodies (Upstate) diluted 1:400 in blocking solution,washed, and incubated with FITC-conjugated anti-mouse anti-body (Zymed) 1:1,000 in blocking solution. Cells were washed andresuspended in PBS.Foraneuploidy evaluation,DNA-content analysis inmitotic cells

wasperformedasdescribed (4)with somemodifications:Cellswerefixed overnight at −20 °C in 70% ethanol, rehydrated with PBS0.1% Tween, and incubated with anti-phosphorylated histone H3(Ser10, pH3) antibody (CST) diluted 1:400 in PBS. After rinsing,thecellswere incubatedwithFITC-conjugatedanti-rabbit antibody(Zymed) at 1:1,000 and then rinsed and resuspended in PBS.Flow cytometry analyses were done with a FACScalibur flow

cytometer (Beckton Dickinson). Aggregates were removed fromanalysis by FL2W/FL2A gating during acquisition (4). Data wereanalyzed with the FlowJo software (Tree Star). At least 2× 104 cellswere acquired per sample, and every experiment was repeated atleast three times.

γ-H2AX Foci and Anaphase Bridges Scoring. Cells were grown andinfected on Lab-Tech slides (Falcon). For γ-H2AX and pH3 im-munofluorescence, cells were fixedwith PBS 4% formaldehyde for12 min, permeabilized in PBS 0.25% Triton X-100 for 5 min, andblocked with PBS 0.1% Tween and 5% normal goat serum for30 min. Primary antibodies [mouse anti-γH2AX (Upstate) andrabbit anti-pH3 (Ser10; CST)] were diluted 1:400 in blocking so-lution and incubated overnight at 4 °C. FITC- or TRITC-conju-gated secondary antibodies (Zymed) were diluted 1:1,000 inblocking solution and incubated for 5 h.DNAwas stained for 5minwith TO-PRO-3 (Molecular Probes) or with DAPI (Vector).Anaphase bridge quantification was done as described (5). Slideswere mounted in VectaShield containing DAPI. Images were ac-quired with a Leica DMRB fluorescence microscope equippedwith a DFC300FX digital camera or with an Olympus IX70 laserscanning confocal microscope, in sequential mode, with theFluoview software FV500, the confocal aperture being set toachieve a z optical thickness of ∼0.5 μm for foci quantificationand ∼0.26 μm for foci localization analysis. At least 300 cells peranaphase were counted by three different observers withoutknowledge of the cell treatment. We repeated the experimentsthree times.

Metaphasic Chromosome Spreading.Cells were treatedwith 1 μg/mLColchicine (Sigma) for 24 h and then were collected by trypsintreatment and suspended in a hypotonic solution (FCS 1:6 in dis-tillatedH2O) for 20 min at 37 °C. After overnight fixation at−20 °Cin 75%methanol/25% acetic acid, cells were streamed on wet, coldmicroscopic slides and stained with Giemsa-R (RAL) or DAPI.Metaphases were analyzed with the Genus software (AppliedImaging). Slides were scored blindly as above. At least 100 meta-phases were scored per group; the total quantification was obtainedafter three independent experiments.

Cuevas-Ramos et al. www.pnas.org/cgi/content/short/1001261107 1 of 4

www.pnas.org/cgi/content/short/1001261107

Micronuclei and Nucleoplasmic Bridges Assay. The assay was per-formed as described (6). Briefly, cells were treated with 2 μg/mLcytochalasin-B (Sigma) for 24 h, washed, and incubated in culturemedium for 20 min. Cells were collected by trypsin treatment andresuspended in hypotonic solution for 20 min at 37 °C, and werefixed overnight at −20 °C in methanol. Streams were done on drymicroscopic slides and stained with Giemsa. Slides were scoredblindly as above. At least 1,000 binucleate cells were counted pergroup, and the experiments were repeated three times.

Gene Mutation Assay. 6-Thioguanine (6-TG) (Sigma) was dissolvedinDMEMataconcentrationof2mg/mL.Trifluorothymidine(TFT)(Sigma) was dissolved in sterile DMSO and diluted in culture me-diumto2μg/mLsolution, then storedat−20 °C.CHOandHCT-116cells were treated with culture medium supplemented with 10 mMdeoxycytidine, 200 mM hypoxanthine, 0.2 mM aminoprotein, and17.5 mM thymidine for 1 wk to eliminate preexisting hprt or tkmutants (7). After infection, the cells were cultured 1 wk for the 6-TG (hprt) test, and 3 d for the TFT (tk) test. Then 10-cm2 Petridishes were seeded with 2 × 105 cells, using culture medium con-taining 400 μg/mL 6-TG or 2 μg/mL TFT. Cells also were platedwithout 6-TG or TFT to determine plating efficiency. The culturemediumwas changed twice a week for 21 d for the 6-TG test and for18 d for the TFT test (8). Then plates were fixed with 4% formal-dehyde and stainedwithGiemsa. Four repeats were doneper groupper test, and each test was done at least three times.

Clonogenicity in Soft Agar. After infection, the cells were culturedfor 3 d. Then 10,000 cells were seeded in culture medium with0.3% soft agar and plated on 3.5-cm2 dishes. After incubation for7 d and staining with 0.005% crystal violet (RAL) for 1 h, col-onies (>50 cells) were counted using a stereomicroscope (9).

In Vivo Assays.Animal experiments were carried out in accordancewith European Guidelines for the Care and Use of Animals forResearch Purposes.For the ligated colon loop assay, 6-wk-old BALB/cJ Rj (Janvier)

female mice were starved for 24 h before anesthesia with a mix ofketamine and xylazine.After amidline incisionwasmade, the colonwasexteriorized,aligaturewasplacedontheproximalanddistalendsof the colon, and 300 μLof a bacterial concentrate (3× 109 bacteria)grown in IM was injected directly into the lumen. Because the ro-dent colon contains, on average, 295 × 103 cells/mm2 (10), and thatthe ligated colon measured, on average, 2.5 cm2, the calculatedinfectious dose was four bacteria per enterocyte. The midline in-cision was sutured, and the mice were left in a dark, warm envi-ronment to recover. Mice were killed by neck dislocation 6 h later,and the colon was recovered immediately. The experiment was re-peated three times.For theantibiotic treatmentassay, 3-wk-oldBALB/cjRj (Janvier)

female mice were treated for 5 d with a mix of streptomycin (2 g/L;Sigma),bacitracin(2g/L;Sigma),andneomycin(1g/L;Sigma) in thedrinkingwater (11); antibioticswerewithdrawn24hbeforebacterialinoculation. Mice were inoculated with 109 bacteria by intragastricgavage twice at 24-h intervals. Mice were killed by neck dislocation12 h after the second inoculation, and the colon was recoveredimmediately.Irradiated mice were used as positive control. Mice received

either 0.5- or 2-Gy gamma ray irradiation from a 137Cs radiationsource (630 rad/min). Mice were killed 30 min later by neckdislocation, and the colon was recovered immediately.

Colonocyte Western Blot Analyses. The colon was placed in ice-coldPBSandopened through itsmesenteric band.Mucusand feceswerewashed out. Then, for enterocyte collection, the colonwas placed ina solution composed of 67.5 mM NaCl, 1.5 mM KCl, 0.96 mMNaH2PO4, 26.19 mMNaHCO3, 27 mMNaCl, 1.5 mM EDTA, 0.5mM DTT, pH 7.4, for 10 min, at 37 °C, under agitation (12). Theremnants of soft tissue were discarded, and the cell solution wascentrifuged for 5min at 300× g. The cell pellet was rinsed with PBSplus DTT 0.5 mM, and resuspended in 500 μL of Laemmli samplebuffer. Sampleswere sonicated twice for 2 s incubatedat 100 °C for 5min, and stored at−20 °C. Proteins were separated on NuPage gels(Invitrogen), transferred to nitrocellulosemembranes, blockedwith5% skimmed milk buffer, and probed with mouse anti-γH2AX(Upstate), mouse anti-histone H3 (Upstate), and mouse anti-Actin(Sigma). Secondary antibodies used were HRP goat anti-mouse(Zymed) and HRP goat anti-rabbit (Zymed). Proteins were de-tectedby chemiluminescencewith theChemiDocXRSsystem(Bio-Rad). Densitometric analyses were done using QuantityOne 4.6.5software (Bio-Rad).

GFP Imaging and γH2AX Immunohistology. For GFP-expressing bac-teria imaging, after mice had been killed, 0.5-cm sections of colonwere placed immediately on optimum cutting temperature com-pound (O.C.T.; Tissue-Tek) and frozen in liquid nitrogen. Frozensections (8 μm) were placed on microscope slides and fixed in 4%formaldehyde. DNA was stained with TO-PRO-3 (MolecularProbes) diluted 1:1,000 in PBS, and actin was stained with rho-damine-phalloidin (Invitrogen) diluted 1:1,000 in PBS. Imageswere acquired with an Olympus IX70 laser scanning confocalmicroscope with the confocal aperture set to achieve a z opticalthickness of ∼0.5 μm.For γH2AX immunohistochemistry, the entire colon was re-

covered immediately after mice had been killed, was placed in 10%formalin for 24 h, and then was embedded in paraffin according tostandard procedures. Slides of 8-μm sections were washed in xylenefor 10 min, then washed with 100% ethanol, and finally rinsed withdistillated water. For antigen unmasking, slides were incubated inboiling 10 mM Na-Citrate for 10 min. Samples were stained anddeveloped using the Vectastain ABC and DAB kits (Vector). Theprimary antibody was rabbit anti- γH2AX (Cell Signaling Tech-nology); the secondary antibody was the biotinylated anti-rabbit(Vector). Counterstaining was done using nuclear HematoxylinQS(Vector). SlidesweremountedwithVectamount (Vector).Gammafoci were counted in at least 1,000 cells per group by three differentobservers without knowledge of the colon treatment.

Statistical Analyses. SD and SEM were calculated as previouslysuggested (13). The exact Fisher test was used to calculate sig-nificant variances between cellular populations in the aneuploidytest. The mutation frequency for mammalian cell gene mutationassays was calculated following Arlett et al. (14), and the x2

McNemar test was used to calculate the P value. For γH2AX fociquantification in mice colons, the ANOVA test with an exactFisher posttest was used. For the soft agar clonogenicity test, anANOVA with a Bonferroni posttest was used. The softwareGraphPad-Prism 5 was used for statistical testing. A P value wasconsidered significant if P < 0.05, P < 0.01, or P < 0.001.

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Fig. S1. Antibiotic-treated mice enterocytes show γH2AX foci after gavage with pks+ E. coli. BALB/c mice were treated for 5 d with a mix of streptomycin-neomycin-bacitracin and then inoculated by gastric gavage with 109 bacteria or PBS as a control. (A) Frozen colon sections were stained for DNA (blue) andF-actin (red) and then were examined by confocal microcopy. pks+ E. coli expressing GFP under control of the clbA promoter (clbA:GFP) were detected in thegreen channel. (Scale bars, 10 μm.) (B) Twelve hours after inoculation with wild-type pks+ E. coli (WT), clbA mutant, or complemented mutant (clbA + pclbA),paraffin colon sections were stained for γH2AX (brown) and counterstained with hematoxylin.(Scale bars, 10 μm.) γH2AX foci were found in enterocytes frommice inoculated with the wild-type pks+ E. coli or the complemented mutant (8.25 and 7%, respectively) but not in the other groups.

Fig. S2. Chromosome aberrations in metaphasic cells after infection with pks+ E. coli. (A) Metaphasic chromosomes of CHO cells 24 h after infection with pks+

E. coli. The chromosomes were labeled with DAPI after metaphase spreading. The most frequent chromosome rearrangements are shown. (B) Abnormalchromosomes were counted in 100 metaphases per group, 24 and 72 h after exposure to pks+ or pks− E. coli. Error bars represent the SEM from three in-dependent experiments.



Table S1. Infection with pks+ E. coli induces aneuploidy and tetraploidy in CHO, IEC-6, and HCT-116 cells

Infection MI (%)

Distribution of mitotic population (%)

Hypodiploid Normal Hyperdiploid Polyploid

CHOControl 3.69 0.76 96.57 1.44 1.23E. coli pks− 3.36 0.72 96.01 1.76 1.52E. coli pks+ 3.56 1.4*** 90.45 3.23*** 4.92***E. coli clbA 3.72 0.71 96.76 1.47 1.24E. coli clbA+ pclbA 3.53 1.43*** 90.86 3.20*** 4.41***

IEC-6Control 6.7 0.65 96.29 1.28 1.78E. coli pks− 6.93 0.52 96.19 1.41 1.87E. coli pks+ 6.22 1.88*** 91.4 2.23*** 4.49***

HCT-116Control 9.01 0.89 95.09 1.31 2.72E. coli pks− 9.17 0.97 94.71 1.5 2.83E. coli pks+ 10.68 1 93.15 2.12** 3.73**

The distribution of mitotic cells according to their DNA content 3 d after infection with pks−, pks+, clbAmutant, or complemented mutant (pclbA) E. coli, was assessed by flow cytometry as in Fig. 3B.**P < 0.01 and ***P < 0.001 in an exact Fisher test compared with controls. Mitotic indexes were not statis-tically different between treatments.



92

9. Discussion et Perspectives

os résultats expérimentaux peuvent être résumés en deux points majeurs :

(i) Les souches de E. coli exprimant la Colibactine sont mutagènes, induisent des dommages chromosomiques et une instabilité génétique in vitro. Ces effets dépendent de la dose.

(ii) La Colibactine est exprimée in vivo et capable, dans le côlon de souris, d’induire en l’espace de quelques heures des cassures double‐brin de l’ADN.

a question peut donc se poser de l’impact physiopathologique de la présence dans le icrobiote d’une souche exprimant la Colibactine et de sa contribution au processus de

cancérogenèse colique.

9.1 La Colibactine déclenche‐t‐elle une instabilité génétique au niveau du côlon ?

L’instabilité génomique (IG), conséquente à l’exposition aux bactéries produisant la Colibactine, depuis longtemps été proposée comme une constante de la transformation cancéreuse. outefois, la question de savoir s’il s’agit d’un facteur causal (initiateur) ou d’une conséquence de la transformation n’est pas totalement résolue. Des études permettent de pencher en faveur ’une initiation de la cancérogenèse par l’acquisition de l’IG, qui se comporterait donc comme n évènement initial, où la mutation d’oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeurs

(l’hypothèse de mutagenèse) serait suffisante pour enchainer une transformation cellulaire150, 9, 292, 293, 325, 326.

on observe l’organisation histologique du côlon, on note que chaque crypte héberge des ellules souches et des cellules progénitrices en division rapide. Les cellules souches se localisent à la base des cryptes, entourées de cellules mésenchymateuses du type

Les myofibroblastes influencent et déterminent le comportement des ellules souches, leur différenciation et leur migration. Un peu plus haut dans la crypte on trouve les cellules progénitrices, qui se trouvent dans une étape de prédifférenciation et qui se divisent plus rapidement que les cellules souches327‐330. La Colibactine pourrait, avec son effet mutagène et clastogène, induire des changements au niveau des cellules souches, mais aussi des cellules progénitrices (Figure 1). Selon nos données in vitro, une infection à faible dose peut déclencher les cycles BFB, caractérisés par des ponts d’anaphase. Si ce phénotype devait être confirmé in vivo, cela pourrait signifier que les cellules des cryptes ayant subi des CDB auraient enclenché les phénomènes de BFB que nous avons caractérisés in vitro.

N

Lm

aT

du

26

Sic

myofibroblastique.c

93

En sachant que E. coli est une des premières espèces bactérienne à coloniser le tractus intestinal et que ces

est fortement des

effetsprécoc t/ou urinaire. On peut ainsi établir un parallèle avec les observations réalisées sur les populations Japonaises d’Hiroshima et Nagasaki. Selon les

et 331, 332.

étude

ontre aussi les conséquences qu’un effet génotoxique peut avoir à ur

croissance et développement ont été étudiés pendant un an. Les résultats montrent que le taux

s de

une

que l’irradiation a des effets génétiques délétères à long terme chez des 333.

ès vingt

des nouveaux nés, et que ces souches vont y habiter pour des périodes prolongéssouches appartiennent fréquemment au groupe phylogénétique B2, où l’îlot pksprévalent4, on pourrait en première analyse, évaluer la signification pathologique possible

génotoxiques à long terme de souches produisant la Colibactine et colonisant ement le tractus intestinal e

données épidémiologiques actualisées, un dommage génétique de type irradiation subi entre 09 ans augmente plus fortement les probabilités d’un cancer à l’âge adulte

Les études dans ces populations ont démontré qu’une exposition estimée à 0,5 Gy étaitsuffisante pour augmenter les fréquences de cancer, notamment du côlon. En outre, unesur des poissons zèbres mlong terme. Dans cette étude des poissons jeunes et adultes ont été irradiés, puis le

de survie par rapport aux non‐irradiés est le même chez les poissons jeunes, mais plus faible chez les adultes. Ceci suggère que les jeunes poissons compensent mieux les effets précocel’irradiation. Dans les deux groupes (jeunes et adultes), les poissons morts ne montrent pas de signes de maladie chronique ou d’affaiblissement. Huit mois après l’irradiation, une partie des poissons ont subi une amputation de la nageoire caudale, afin d’étudier la régénération épithéliale et restructuration de la nageoire. La majorité des poissons irradiés présentent incapacité à régénérer la nageoire (70%) ou une nageoire anormale et atrophiée (15%). Les auteurs concluentpoissons jeunes et adultes, même si l’état général de l’organisme reste cliniquement normalSi l’on prend également comme exemple les conséquences des thérapies génotoxiques appliquées chez les enfants, avec une chance sur dix de développer un autre cancer aprans d’âge334‐339, on pourrait supposer qu’une souche bactérienne produisant une génotoxine,colonisant précocement l’épithélium du côlon, pourrait avoir des conséquences une fois lamaturité atteinte. De plus, les souches E. coli du groupe phylogénétique B2 qui produisent fréquemment la Colibactine sont connues comme de bonnes colonisatrices4, cette colonisation pourrait donc se poursuivre bien au‐delà de l’enfance. Les cellules souches épithéliales ont besoin de temps pour accumuler des mutations et se transformer progressivement. Avec un dommage à l’ADN constant et répété, consécutif à l’instabilité génomique et/ou la présence continue des bactéries génotoxiques, il est possible que ces cellules puissent acquérir les changements nécessaires pour leur transformation.

94

9.2 Bactéries et cancer

Une souche bactérienne résidente est‐elle capable d’être à l’origine de transformations morales ? La réponse est oui au moins en ce qui concerne Helicobacter pylori. Des infections

bactériennes, virales ou parasitaires ont par ailleurs souvent été associées au développement e certains cancers chez les humains. Les premières associations suggérées entre agent

tu

d

Figure 1. Les souches E. coli pks+, sont‐elles cancérigènes ? Les souches de E. coli commensales du groupe phylogénétique B2 et les ExPEC pks+ sont de bonnes colonisatrices du côlon, 30‐50% d’entre elles, en moyenne, produisent la Colibactine1, 4. Elles déclenchent la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN, évaluée par la formation des foyers

γH2AX. Si les phénomènes que nous avons observés in vitro se reproduisent in vivo, les cellules affectées pourraient développer des ponts anaphasiques, une instabilité chromosomique et progressivement accumuler des mutations, affectant le renouvellement normal de l’épithélium et favoriser la transformation cellulaire.

95

pathogène et cancer datent du XVIII siècle. En 1772, il a été observé que les carcinomes pulmonaires se retrouvaient les plus souvent au niveau des cicatrices provoquées par Mycobacterium tuberculosis. Au milieu du XIX siècle, Rudolf Virchow décrivait une fréquence très élevée du cancer de la vessie chez les personnes habitant dans des régions endémiques à Schisostomia haematobium en Afrique du nord. En 1911, Askanzy rapportait une association entre Opisthorchis felineus et le cancer hépatique et dans la même année, Rous montrait le potentiel carcinogène du CRP (cotontail rabbit papillomavirus)340.

On estime que environ 18% de diagnostics tumoraux sont associés à une infection. Autour de 1.9 millions des cas de cancer par an sont donc diagnostiqués qui seraient liés à une infection bactérienne ou virale341. Parmi les agents infectieux et parasitaires les mieux documentés on trouve les papillomavirus qui provoquent le cancer cervical, le virus d’Epstein‐Barr impliqué dans des lymphomes, les virus des hépatites B et C qui provoquent des cancers hépatiques, HIV et le sarcome de Kaposi et des lymphomes, la bactérie Helicobacter pylori qui provoque des cancers et lymphomes gastriques, le parasite Schistosoma haematobium impliqué dans le cancer de la vessie et Salmonella enterica serovar typhi liée au cancer des voies biliaires. Les mécanismes exacts du déclenchement de la formation d’un tissu malin par les agents pathogènes demeurent mal connus. Plusieurs mécanismes pourraient influencer ce développement : inflammation chronique, évasion du système immunitaire, dommages à l’ADN, modification du cycle cellulaire et de la prolifération cellulaire340, 342‐344.

L’association épidémiologique entre un pathogène et le cancer reste un processus pour le moins complexe. Cette relation est influencée par le mode de vie, la localisation géographique, le niveau socioéconomique et les facteurs environnementaux. Par ailleurs, le délai entre l’infection e des années, voire des dizaines d’années, cette a m va d

Unemutagène et pro‐tumoral . Les cellules de l’inflammation génèrent en effet des médiateurs omme les radicaux libres, les prostaglandines et des cytokines, qui participent aux différentes

n. L’exposition chronique à ces médiateurs provoque une augmentation de la prolifération cellulaire, de la mutagenèse et l’activation des oncogènes. Les radicaux libres

, mais

t l’apparition ou le diagnostic du cancer peut demander ce qui complique les études. En outre, la nature multifactorielle du cancer rend

nalyse encore plus compliquée. Le meilleur exemple est celui d’H. pylori, puisque plus de laoitié de la population mondiale porte cette bactérie dans l’estomac, mais seulement 1%évelopper un cancer gastrique et encore moins un lymphome gastrique340.

infection peut s’accompagner d’une inflammation chronique qui peut avoir un effet 345

cphases de l’inflammatio

se présentent soit sous la forme de ROS (reactive oxygen species) ou de RNOS (reactive nitrogenspecies). Leur fonction physiologique principale est de tuer les pathogènes, mais ils peuvent également générer un stress oxydatif important, phénomène essentiellement pathologique. ROS et RNOS peuvent induire une mort cellulaire et une augmentation de la prolifération

96

également endommager l’ADN, en générant des lésions oxydatives de l’ADN comme la 8oxoguanine, des cassures simple et double‐brin de l’ADN. Les phagocytes produisent édu NO (nitric oxide), qui est oxydé et transformé en ND (nitrogen dioxide), molécule égalemencapable d’induire des dommages à l’ADN346‐348. Les prostaglandines (PG) sont des dérivés de l’acide arachidonique produits par les cyclooxygénases, COX1 COX2 et COX3. COX1 est constitutive et exprimée dans de nombreux tissus, alors que COX2 est inductible, exprimée ples monocytes et les macrophages pendant l’inflammation. Les PG

‐galement

t

ar modulent la réponse aiguë et

chronique de l’inflammation, principalement la prostaglandine E2 (PGE2). Certaines études ont

si de

y se

4.

.

montré que les PG pourraient stimuler l’angiogenèse et faciliter ainsi le développement de la

tumeur. Les cytokines comme le TNFα (tumor necrosis factor alpha) sont également des facteurs clés dans l’inflammation. Par exemple, chez les patients colonisés par H. pylori, mêmeune minorité développe un cancer, une grande majorité ont des niveaux plasmatiques élevés

TNFα et PG, qui sont associés à une inflammation gastrique chronique. En outre, NF‐kappaB (Nuclear factor‐kappaB), une protéine qui joue un rôle clé dans la réponse immunitaire contrel’inflammation, pourrait aussi avoir une influence dans le développement du cancer, principalement dans son rôle d’inhibition/stimulation de la prolifération cellulaire et l’apoptose.Par ailleurs, une fois que le dommage à l’ADN a entrainé des mutations, il se peut qu’ilproduise une sélection des clones cellulaires transformés. Cette sélection peut être stimulée par le fait que l’inflammation entraîne une augmentation de la prolifération cellulaire pour compenser la mortalité qu’elle a elle‐même déclenchée340, 349‐35

D’une part, on trouve donc des microorganismes pathogènes, qui provoquent une infection et/ou une maladie et éventuellement un cancer, de l’autre, on trouve les microorganismes commensaux, qui résident dans un environnement spécifique et qui en général ont une relation de symbiose avec l’hôte. Aujourd’hui, l’hypothèse que le microbiote intestinal pourrait jouer unrôle très important est de plus en plus fondée. L’expression de métabolites issus de microorganismes du microbiote pourrait moduler directement la sensibilité vis‐à‐vis de certaines affections. Le génotype du microbiote pourrait être aussi important que le génotypede l’hôte en la matière355, 356.

Le microbiote intestinal humain est composé de plus de 2500 espèces bactériennes différentes,avec une diversité d’espèce propre à chaque individu, réparties dans 4 phylums (Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria et Proteobacteria) sur plus de 50 connus, ce qui représente une grande sélection évolutive. Le microbiote facilite la digestion des nutriments, fournit des facteurs de croissance et de différenciation pendant la maturation de la muqueuse, il stimule la maturation du système immunitaire et exerce un effet barrière contre l’invasion des pathogènes357, 358. Cependant, cette relation hôte‐microbiote peut aussi devenir délétère358, 359

Par exemple, le Streptocoque α‐hémolytique est un commensal de la muqueuse orale et intestinale humaine. Toutefois, cette bactérie peut se retrouver dans le système sanguin quand

97

il y a défaut de continuité dans la muqueuse : si l’hôte est affaibli ou immunodéficient, ce streptocoque peut provoquer des infections graves comme des endocardites360. La différence entre un commensal et un pathogène est donc fréquemment mal déterminée. Des microorganismes commensaux peuvent provoquer une maladie grave et à l’inverse des pathogènes connus peuvent résider dans un organisme sans déclencher de maladie.

Cet exemple concerne également les souches de E. coli produisant la Colibactine. Outre les souches ExPEC, dont environ 50% ont l’îlot pks, cet îlot a aussi une forte prévalence dans les souches de E. coli commensales, avec 12 à 32% des isolats positifs. Un autre point important eque la Colibactine est produite presque exclusivement par des E. coli du groupe phylogénétiqueB2, dont la proportion dans les flores intestinales humaines est en augmentation depuis ces 20 dernières années en Europe, au Japon et au Etats‐Unis1, 36, 115, 130, 131. Les souches de E. coli du groupe B2 sont d’excellents colonisateurs et il a été observé qu’elles peuvent persister plus durablement dans le côlon que d’autres souches de E. coli. Cette prédominance du groupe B2 s’observe même dès la naissance puisque plus de 50% des souches de E. coli isolées à partir deselles d’enfants sont des B24, 361, 362. En outre, deux études renforcent ces donnés : (i) l’analyse du microbiome (ensemble des gènes de la microflore intestinale) de 13 Japonais en bonne santé a montré que les gènes codant pour la Colibactine sont présents dans près de 40% des selles des individus étudiés et plus particulièrement chez les nourrissons et jeunes enfants363 et (ii) un analyse du microbiome de 11 nourrissons montre aussi une présence des gènes de la Colibactine à 1 mois d’âge chez 6 d’entre eux (55%) ; les

st

gènes étaient retrouvés chez les mêmes +

dégénératifs au niveau chromosomique. Ainsi si on se place dans

faire

dans

individus à 24 mois (analyse basée sur les données du consortium MetaHIT, métagénome desmicroflores intestinales humaines, données non publiées). Il apparaît donc que les E. coli pkssont hautement présentes dans les flores intestinales humaines et ont la capacité de coloniser l’Homme dès la naissance puis de se maintenir durablement dans le côlon.

Le fait d’héberger une souche de E. coli commensale ou non, produisant la Colibactine, pourraitdonc représenter une exposition génotoxique chronique au niveau épithélial. Même de faible niveau, cette génotoxicité pourrait être significative car on sait qu’il suffit d’une seule CDB pourdéclencher des changements le cadre d’un individu génétiquement susceptible, souffrant de problèmes intestinaux chroniques, ou d’infections urinaires récurrentes, immunodéficient, ou tout simplement avecdes habitudes alimentaires favorisant la flore colibacillaire, la Colibactine pourrait jouer un rôledans le développement du cancer, sur un épithélium qui n’est pas tout à fait en mesure deface à des assauts génotoxiques répétés.

Hormis l’effet potentiel sur le côlon de la présence dans le microbiote de E. coli produisant la Colibactine, il pourrait être intéressant d’examiner l’impact de ces bactéries génotoxiques le contexte d’infections urinaires. Le microorganisme principalement isolé dans les infections

98

urinaires humaines (80 à 90%) est E. coli. Les souches de E. coli uropathogènes font partie souches extra‐intestinales, dans lesquelles la prévalence de la Colibactine est d’environ 50%. Ces souches sont connues pour former des colonies bactériennes intracellulaires. Poraison, elles sont difficiles à éradiquer et elles provoquent ainsi des infections récurrenteindividus ayant présenté plus de deux infections urinaires ont un risque plus importan

des

ur cette s. Les

t d’avoir un carcinome de la vessie, principalement chez les femmes57, 364, 365. La Colibactine pourrait

La

tion de

é avec les souches marquées par la GFP dans nos résultats expérimentaux). Nous avons ainsi pu montrer avec des

t‐ils similaires à ceux déclenchés par la Colibactine ?

jouer aussi un rôle chez les individus génétiquement susceptibles, où un polymorphisme génétique a été associé au cancer de la vessie217, 366, 367. Les cellules sont en général affectéesdans le(s) système(s) de réparation de l’ADN et elles sont moins efficaces pour réparer des cassures double‐brin : si l’épithélium est confronté à des infections récurrentes de E. coli pks+, ceci pourrait participer au déclenchement d’un cancer.

Selon Blaser et al.344, il existe trois types de microorganismes pouvant provoquer un cancer. classe A regroupe les microorganismes qui ciblent les cellules du système immunitaire et donc qui peuvent induire des lymphomes ou une immunosuppression qui pourrait faciliter le développement de cancers. La classe B rassemble les microorganismes qui peuvent déclencher un cancer par leur relation directe avec le parenchyme de l’organe colonisé, soit via l’épithélium, l’endothélium, ou le mésenchyme. Finalement, la classe C comprend les microorganismes qui modifient leur environnement et déclenchent une altération locale ou àdistance, soit par la modification du microbiote dans l’organe cible, soit par la modifical’activité de cet organe (provoquant éventuellement des effets à distance), comme c’est le cas dans les altérations de type hormonal. Dans ce cadre E. coli pks+ pourrait être un microorganisme carcinogène de classe B. Même si, pour les souches E. coli commensales et ExPEC qui résident dans le côlon, le milieu le plus favorable est le mucus intestinal, un contact direct avec les cellules épithéliales reste probable (et a d’ailleurs été visualis

modèles animaux que la Colibactine a bien un effet sur l’épithélium colique. La question reste donc de savoir si le fait de provoquer des cassures double‐brin de l’ADN au niveau de l’épithélium colique, de façon chronique et répétée, à faible niveau, pourrait être suffisant pour déclencher (ou favoriser) une transformation cellulaire et l’apparition d’un cancer.

Il semble donc nécessaire de s’appuyer sur des exemples déjà existants pour essayer d’approfondir nos recherches et mieux comprendre les possibles effets de la Colibactine sur l’épithélium colique. Comment fonctionnent d’autres bactéries ? Quels mécanismes utilisent‐elles ? Les effets qu’elles provoquent, son

99

9.2.1 Helicobacter pylori

H. pylori, l’espèce dominante dans le microbiote gastrique, est responsable de l’infection bactérienne la plus fréquente dans le monde. La présence d’H. pylori provoque une réponse inflammatoire chronique, qui est le facteur de risque le plus important du cancer de l’estomac. Au niveau mondial, l’adénocarcinome gastrique est la deuxième cause de mort par cancer, amoins de 15% de survie au‐delà de 5 ans. Même si une petite partie des personnes colonipar cette bactérie développent un adénocarcinome, toutes ont une gastrite chronique persistante368, 369.

Comme dans le cas de E. coli, cette espèce bactérienne a une diversité génétique importante, due principalement à une diversification intra‐génomiqu

vec sées

e (mutations ponctuelles, 370

e à

e

A é pendant

néral l’une d’elles prédomine. OipA est également une adhésine associée à une adhérence aux cellules

vation de

expression de la β‐caténine est associée à 50% d’adénocarcinomes gastriques. H. pylori peut

augmenter l’expression de la β‐caténine et ceci est probablement lié à l’évolution des lésions ré‐tumorales377, 378.

recombinaison génomique) . Plusieurs protéines exprimées dans des souches différentes ont été identifiées et corrélées au développement du cancer. Parmi ces protéines on trouve VacA, BabA, SabA, OipA et CagA.

VacA (vacuolating cytotoxin) provoque la formation de vacuoles dans des cellules épithéliales enculture. Les gènes codant pour cette protéine ont une grande variabilité de séquencegénétique : chaque cluster de gènes code pour une cascade métabolique différente, liél’activité de vacuolation de chaque souche. VacA stimule également l’apoptose des cellules épithéliales gastriques et modifie la réponse adaptative immunitaire de l’hôte, favorisant ainsi

une longue colonisation : VacA se fixe à l’intégrine β2 pour interférer avec l’interleukine‐2 et cette action bloque la prolifération des cellules T activées par des antigènes, avec pourconséquence une réponse immunitaire absente. Les souches d’H. pylori qui expriment la formactive de VacA sont associées à un risque plus élevé de cancer371‐373.

Les protéines BabA, SabA et OipA sont des protéines de membrane externe. BabA est une adhésine qui confère à H. pylori la faculté de s’attacher aux cellules épithéliales gastriques. Sabest aussi une adhésine qui reconnait l’antigène tumoral FUT4, un marqueur surexpriml’inflammation gastrique chronique. Les souches BabA+ et SabA+ sont associées à un risque plus élevé de cancer ; environ 85% des souches expriment ces deux protéines mais en gé

épithéliales gastriques. En outre elle est capable de déclencher et/ou augmenter l’acti

la β‐caténine374‐376. La β‐caténine est un composant des jonctions cellulaires qui lie les

récepteurs de la cadhérine à l’actine du cytosquelette. Dans le cytoplasme, β‐caténine et cadhérine sont aussi des composants de la cascade de signalisation Wnt. Une augmentation de

l’

p

100

H. pylori est donc officiellement reconnue comme un cancérigène par l’IARC et représente le principal facteur de risque d’adénocarcinome gastrique. La diminution du nombre d’infections

al

n commensal du côlon humain, mais elle peut être à l’origine d’une bactériémie, d’infections du tractus urinaire et elle est la deuxième cause d’endocardites. En

emment

18 et 62%. Gold et al. ont montré dans une étude rétrospective que parmi les patients qui ont présenté une bactériémie par S. infantarius, 41% de patients

Il ence on

E. faecalis est un commensal de la flore intestinale humaine. De nombreuses souches

2O2

à

orée in rs de

t ales hébergent dans leur flore intestinale des entérocoques produisant O2

‐

de H. pylori aux Etats‐Unis est corrélée à une diminution des cancers gastriques, mais ces changements ont été associés à une augmentation de l’incidence de la GERD (gastroesophagereflux disease), avec sa principale complication, l’adénocarcinome gastro‐œsophagien369, 379, 380.

9.2.2 Streptococcus infantarius (bovis)

Cette bactérie est u

1951, McCoy et Mason ont suggéré une relation entre le cancer du côlon et l’historique d’une endocardite septique. C’est en 1974 qu’une association entre S. infantarius (précédappelé S. bovis) et le cancer du côlon a été suggérée. Entre 25 et 80% des patients ayant eu unebactériémie provoquée par S. infantarius développent un cancer du côlon. L’incidence de cetterelation a été estimée entre

subissent une coloscopie dans les années suivantes, 39% sont diagnostiqués avec un néoplasie du côlon, 32% avec un cancer invasif, dont 60% avec une forme maligne du cancer du côlon.semblerait que S. infantarius, par l’intermédiaire de ses WEA (wall extracted antigens), influla formation de lésions pré‐néoplasiques dans le côlon, avec une augmentation de l’expresside l’IL8, PGE2 et COX2. Ces données suggèrent un rôle des ROS dans la carcinogenèse colorectale induite par l’infection chronique avec ces bactéries381‐385.

9.2.3 Enterococcus faecalis

produisent des quantités importantes de radicaux libres oxygénés extracellulaires comme Het O2

‐ via l’oxydation d’un composant membranaire, la démethylménaquinone. Il a été montré qu’E. faecalis produit des CDB dans des colonocytes de rats et que ce dommage à l’ADN déclenche in vitro une aneuploïdie et une CIN. En outre, cet effet génotoxique se propage de cellule à cellule (« bystander effect »), c'est‐à‐dire que la bactérie n’a pas besoin d’un contact direct avec l’entérocyte pour produire son effet génotoxique : elle provoque des dommages l’ADN des colonocytes par l’intermédiaire de macrophages activés par une exposition préalable, qui produisent à leur tour des radicaux libres oxygénés. Cette génotoxicité a été corrobvitro par l’accumulation des cellules en phase G2 du cycle cellulaire et la formation de foye

γH2AX. D’autres études ont montré, dans un modèle murin (IL10 KO), qu’E. faecalis induit une inflammation chronique de l’intestin aboutissant au développement d’adénocarcinomes et de dysplasie rectale. Finalement, une étude rétrospective a montré que 40% des patients souffrande dysplasies colorect

101

Toutefois les auteurs de cette étude n’ont pas mis en évidence une association entre la colonisation par ces bactéries et la prévalence de cancer colorectal386‐390.

9.2.4 Helicobacter hepaticus

H. hepaticus fait partie des espèces bactériennes produisant la génotoxine CDT, qui a une les cellules intoxiquées. Dans un modèle murin

d’hépatocarcinogénèse, il a été montré que des souris infectées avec une souche de s,

ée

prévention/déclenchement de

activité DNase I‐like et produit des CDB dans

Helicobacter hepaticus produisant CDT développent des nodules dysplasiques hépatiquequatre et dix mois après inoculation, contrairement aux souris infectées avec une souche mutne produisant pas CDT. En outre, les souris infectées avec la souche produisant CDT présentent

aussi des niveaux élevés de facteurs pro‐inflammatoires comme TNFα, COX2 et NF‐κB, des facteurs anti‐apoptotiques comme Bcl2, ainsi qu’une augmentation de la prolifération391. Cette étude montre ainsi le rôle possible de CDT dans la transformation cellulaire.

Au bilan, H. pylori est la seule bactérie officiellement reconnue comme cancérigène, même s’il existe d’autres espèces suspectées d’avoir un lien avec le développement du cancer, comme Streptococcus infantarius (bovis) et Enterococcus faecalis. Des faisceaux d’éléments concordants s’accumulent de telle manière qu’il semble probable que nous aboutirons à un consensus scientifique pour reconnaître que les bactéries qui résident dans l’organisme, flores commensales ou pathogènes, jouent un rôle important dans la tumeurs.

9.3 Perspectives

Les résultats que nous avons obtenus ne permettent pas encore d’affirmer positivement l’existence d’un rôle des souches mutagènes de E. coli dans la cancérogenèse, ni sa place chronologique et son importance relative dans le processus multifactoriel qui conduit de la cellule saine à la tumeur maligne.

De nombreuses études complémentaires vont être nécessaires pour éclaircir cette problématique et nos perspectives devront impliquer des études in vitro et in vivo. L’objectif majeur des études in vivo sera l’estimation de l’impact et des effets réels que pourrait avoir la présence de souches de E. coli pks+ dans un microbiote humain. Celui des études in vitro sera plus orienté vers la recherche des évènements initiaux permettant à la Colibactine de léser l’ADN et de leurs mécanismes.

102

9.3.1 Etudes in vivo.

En considérant l’ensemble de nos résultats, il apparaît plausible que des souches de E. coli pks+ ement et la physiologie de l’épithélium intestinal et que, même si

l’individu porteur ne montre pas de changements graves, les effets de cette génotoxicité se duire

ts

in vivo avec ceux obtenus in vitro, dans l’espoir de mieux cerner la relation dose/effet.

En dehors d’études de cancérogenèse classiques à long terme, une autre méthode pour étudier

d’étude qui pourra être envisagé sera de coloniser des animaux avec les souches, puis de provoquer chimiquement l’induction des ACF par injection d’AOM (Azoxyméthane)396. n évalue l’effet promoteur d’un agent quelconque (chimique, nutritionnel, infectieux…) par la

ACF qui se développent en quelques semaines dans le côlon397. Une autre possibilité serait de tester directement le possible effet initiateur des souches produisant la

sont e la

modifier directement l’ADN des cellules épithéliales et selon

puissent modifier le renouvell

manifestent plus tard dans la vie, sous la forme de transformations tissulaires pouvant conau cancer.

Un autre marqueur que nous nous proposons d’étudier est la quantification in vivo des pond’anaphase et/ou des mitoses anormales, ainsi que l’index mitotique, au niveau des cryptes du côlon, témoins de lésions génétiques majeures. De même, il sera intéressant d’analyser la formation des micronoyaux (MIC) in vivo au niveau intestinal, un test qui est reconnu pour identifier des clastogènes et aneugènes au niveau intestinal, plus sensible que la quantification de MIC dans la moelle osseuse392. Nous pourrons ainsi comparer les résultats

cette possibilité est l’étude du développement de lésions pré‐néoplasiques ACF (aberrant cryptfoci) et de tumeurs au niveau du côlon (Figure 2)16. Les ACF sont considérés comme la lésion précurseur du cancer du côlon, puisque l’un des premiers pas vers cette pathologie est l’altération du pattern prolifératif épithélial provoquée par une modification de la cinétiquecellulaire (prolifération, mort, changements génétiques)393‐395.

Un modèle

Oquantification des

Colibactine : on colonise les animaux précocement avec les souches de E. coli pks+, puis ilssacrifiés au terme d’un an et un comptage des lésions épithéliales est effectué. Notons quColibactine a plus les caractéristiques d’un facteur initiateur du cancer que d’un promoteur, puisqu’elle est capable d’agir et denos donnés in vitro de déclencher une instabilité génomique et de la mutagenèse.

103

Il serait aussi pertinent dans notre problématique d’utiliser des animaux mutés dans le gène APC (souris min). Dans ce modèle, l’hôte est génétiquement susceptible de développer plus

des cancers au niveau gastro‐intestinal. Evaluer l’effet de la Colibactine dans ce type d’environnement serait intéressant. Elle pourrait aggraver la sélection cellulaire et exercer ne pression de sélection, au cours de laquelle les cellules survivantes seraient les plus

prolifératives et invasives. Elle pourrait aussi, sur le versant potentiellement protecteur,

fréquemment

u

Figure 2. Transformation épithéliale au niveau du côlon.Pour évaluer l’effet cancérigène possible des souches de E. coli produisant la Colibact e, la quantification des lésions prénéoplasiques in vivo (ACF) est un modèle de choix. La formation de foyers de cryptes aberrantes est un bon indicateur d’une hyperprolifération épithéliale et du commencement d’une transformation. Le possible effet initiateur et/ou promoteur de ces souches pourrait ainsi être testé (figure modifié de 16).

in

104

éliminer les cellules qui commencent à se transformer, puisqu’elles sont en général beaucoup plus sensibles aux dommages à l’ADN.

Il semble en tout état de cause très important de continuer les recherches en ce sens et de tester cette hypothèse de manière approfondie pour le côlon, mais aussi d’autres organes potentiellement exposés à des ExPEC pks+, principalement la vessie et la prostate.

9.3.2 Etudes in vitro

Profil et mécanismes de mutagenèse :

Déterminer avec exactitude le type des mutations que les souches pks+ induisent pourrait aussi nous aider à mieux comprendre le type d’effet que ces souches pourraient avoir in vivo. Le modèle Big‐Blue est en ce domaine un outil puissant qui permet d’évaluer avec exactitude, jusqu’au niveau de la séquence, le type des mutations de l’ADN cellulaire suivant une exposition. Nous espérons également explorer dans ce modèle la localisation des cassures, dans le cas où celles‐ci ne seraient pas stochastiques.

Reste également à élucider la cascade permettant d’expliquer qu’une seule exposition aux souches de E. coli pks+ soit suffisante pour déclencher à long terme des changements dégénératifs au niveau chromosomique. S’agit‐il d’un modèle identique à celui observé après une irradiation, ou existe‐t‐il des effets secondaires spécifiques déclenchés par l’exposition à la Colibactine qui vont, à leur tour, perpétuer ses effets génotoxiques ? Par exemple, il a été montré que le fait d’exposer les cellules à des agents génotoxiques ou à une irradiation ionisante peut déclencher un état de stress oxydatif persistant maintenu par des mitochondries dysfonctionnelles398, 399. Est‐ce que ceci pourrait être le cas dans les cellules infectées par les E. c

Ed stème p dans la r ge à l’ADN. Il a été montré que sur des CDB ui n’ont pas pu être réparés avant la mitose, ou si la réparation à laissé une « cicatrice », la

γ γ

chromosomiques persistants, spécialement des anneaux et translocations, il serait intéressant

oli pks+ ?

n outre, étudier la voie de signalisation FANC (mutated in Fanconi anemia) pourrait être ’intérêt. FANC est considérée comme un gardien de la stabilité chromosomique : ce syrévient les défauts de ségrégation chromosomique pendant la mitose et il a un rôle éponse cellulaire à un stress réplicatif et/ou dommaq

protéine FANCD2 colocalise avec H2AX. Les foci de FANCD2/ H2AX dans des chromosomes suggèrent des sites défectueux de chromatides associés à une séparation anormale, donc des

sites chromosomiques fragiles400. On pourrait donc rechercher la colocalisation FANCD2/γH2AXaprès une exposition génotoxique avec la Colibactine, en comparaison avec d’autres molécules ou agents produisant aussi des CDB.

Etant donné qu’on observe des BFB (breakage‐fusion‐bridge) et des remaniements

105

d’évaluer l’état des télomères. En effet l’un des mécanismes du développement de ces phénotypes et de la CIN est la perte des télomères. De manière générale les cellules cancéreuses ont un taux élevé de perte et de dysfonctionnement de ces structures. La perte

i s et

iques, donc ifications importants. Le résultat peut être une résistance à la limite de

Hayflick et donc une capacité permanente à proliférer18, 250, 251, 253, 401, 402.

La Colibactine, provoque‐t‐elle des CDB au niveau ou proche des télomères et/ou un

TIF

à ssi les

ure

ne pourrait également être un facteur de stress oxydatif comme la bléomycine, ou provoquer des modifications dans la structure de l’ADN qui pourraient déclencher un stress

té

u

d’un télomère est suivie par l’addition d’un autre télomère au niveau de la cassure, mais cecentraine la perte du télomère d’un autre chromosome ou la fusion entre deux chromosomedonc une évolution vers des cycles BFB, des remaniements chromosomiques chrondes délétions et ampl

dysfonctionnement des télomères ? L’un des signes « précoce » que l’on pourrait évaluer est la colocalisation de 53BP1 et TRF1 (telomeric repeat binding factor), signalé comme une lésion(telomere dysfunction‐induced foci), ou des agrégats télomériques au niveau des cellules interphasiques. Ces agrégats représentent en fait des fusions télomériques et donc la formationde chromosomes dicentriques, qui peuvent former des ponts anaphasiques et des cycles BFB403, 404.

Enfin, mieux comprendre le mécanisme d’action de la Colibactine pourrait aussi nous aider déterminer le type des lésions qu’elle provoque, de façon directe ou indirecte, mais aueffets secondaires qui se déclenchent après l’exposition. Est‐ce que la Colibactine est un poisondes topoisomérases (I et II), comme l’etoposide ? Les topoisomérases catalysent l’ouverture et la religation de la structure de phosphodiester de l’ADN pendant le cycle cellulaire. Les inhibiteurs affectent partiellement la fonction des topoisomérases en autorisant l’ouvertmais en inhibant la religation, ce qui provoque des cassures simple et double‐brin.

La Colibacti

réplicatif. La principale limitation pour arriver à comprendre ces mécanismes est la difficulactuelle à purifier la Colibactine.

En conclusion, nos résultats démontrent que les souches de E. coli pks+ sont génotoxiques : elle peuvent déclencher la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN in vivo et provoquer une instabilité génomique in vitro. Elles sont donc potentiellement cancérigènes pour des tissus acontact, particulièrement le côlon, le système génito‐urinaire et éventuellement d’autres organes colonisés sur un mode asymptomatique à la suite de bactériémies.

106

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Résumé

Effet génotoxique des souches d’Escherichia coli produisant la Colibactine

Escherichia coli (E. coli) est une bactérie commensale qui réside dans le tractus gastro‐intestinal des mammifères, principalement au niveau du côlon. Certaines souches de E. coli sont aussi des pathogènes intestinaux ou du système urinaire voire systémique (souches pathogènes extra‐intestinales). Environ 34% des souches commensales de E. coli du groupe phylogénétique B2 et 53% des souches isolées d’infections extra‐intestinales possèdent dans leur génome un îlot génomique « pks » qui code pour la production d’un polyketide‐peptide non‐ribosomal, la Colibactine. Les souches de E. coli pks+ provoquent des cassures double‐brin de l’ADN (CDB) dans des cellules eucaryotes en culture.

Dans mes travaux de thèse, j’ai examiné l’expression et l’activité de la Colibactine in vivo, et étudié les conséquences pour les cellules hôte des dommages à l’ADN infligés par la toxine. J’ai pu montrer dans un modèle murin d’anses ligaturées du côlon, avec un système rapporteur GFP, que les gènes de l’îlot pks étaient bien exprimés in vivo. En utilisant comme marqueur des CDB l’histone H2AX

phosphorylée (γH2AX), j’ai démontré la présence de ces lésions dans les cellules épithéliales du côlon après l’injection d’une E. coli pks+ mais pas après l’injection d’un mutant isogénique déficient pour la production de Colibactine. Ces résultats ont été confirmés avec un autre modèle murin dans lequel les souris étaient traitées par des antibiotiques puis gavés avec les E. coli pks+.

Pour examiner les conséquences des dommages à l’ADN infligés par la Colibactine, j’ai utilisé un modèle de cellules en culture infectées avec les E. coli pks+ à une dose infectieuse comparable à celle qui peut avoir lieu in vivo. Les cellules exposées aux faibles doses de bactéries (1 à 20 bactéries/cellule) produisant la Colibactine répondaient aux dommages à l’ADN de façon transitoire et réversible, puis ces cellules poursuivaient leurs divisions. Toutefois, une fraction de ces cellules en mitose montrait des signes de persistance des CDB, des ponts anaphasiques et des micronoyaux. Ceci entrainait des aberrations chromosomiques (translocations, anneaux, dicentriques), ainsi que de l’aneuploïdie / tétraploïdie. La persistance des aberrations chromosomiques et mitotiques jusqu’à 21 jours après l’infection indiquait la propagation de cycles BFB (« breakage‐fusion‐bridge ») et une instabilité chromosomique. Enfin, j’ai montré que ces cellules présentaient une élévation significative de leur fréquence de mutation génique ainsi que de leur capacité à former des colonies en agar.

En conclusion, mes résultats indiquent que la Colibactine est exprimée in vivo, et qu’elle induit des CDB dans les entérocytes. L’exposition de cellules en culture aux souches produisant la Colibactine induit des CDB qui sont incorrectement réparés, ce qui déclenche une instabilité chromosomique persistante, des mutations et la transformation cellulaire. Cet enchaînement d’évènements délétères pour la stabilité génétique des cellules est déclenché par une simple infection, à faible dose, de E. coli pks+. Ces résultats suggèrent que la présence de ces bactéries génotoxiques dans le microbiote intestinal pourrait représenter un facteur prédisposant pour le cancer sporadique du côlon.

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