Thèse de doctorat de l'Université Paris XII Val de Marnedoxa.u-pec.fr/theses/th0246437.pdfDr....

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Thèse de doctorat de l'Université Paris XII Val de Marne

Ecole doctorale des sciences de la vie et de la santé

Soutenue publiquement par

Luc DANNHOFFER

Le 20 décembre 2006

TRANSPORTS IONIQUES TRANSÉPITHÉLIAUX DANS LES VOIES

AÉRIENNES HUMAINES NON-MUCOVISCIDOSIQUES ET

MUCOVISCIDOSIQUES

Directeur de thèse : Professeur Thierry CHINET

JURY

Pr. Frédéric Becq Université de Poitiers Rapporteur Dr. Jacky Jacquot INSERM Rapporteur Pr. Anh-Tuan Dinh-Xuan Université de Paris V René Descartes Examinateur Pr. Jean-François Bernaudin Université de Paris VI Pierre et Marie Curie Examinateur Dr Pascale Fanen Université de Paris XII Val de Marne Examinateur Pr. Thierry Chinet Université de Versailles St Quentin en Yvelines Examinateur,

Directeur de thèse

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Remerciements

La direction de ce travail a été réalisée par le Professeur Thierry Chinet de l’Université de Versailles Saint-Quentin en Yvelines, à qui j’adresse mes plus sincères remerciements. Je tiens à lui exprimer ici toute ma gratitude pour la confiance qu’il m’a accordée tout au long de cette thèse. Je lui suis également extrêmement reconnaissant pour le soutien et le savoir dont il m’a fait bénéficier au cours de cette thèse, je n’oublierai pas ses traditionnelles petites phrases « mais c’est génial, ça !! » ou « il faut avancer, maintenant !! ». Que ce travail soit le témoignage de ma profonde reconnaissance.

Je remercie le Professeur Frédéric Becq, de l’Université de Poitiers, pour avoir

accepté de juger ce travail. Je le remercie également pour m’avoir initié au monde de la recherche durant les stages que j’ai effectué dans son laboratoire.

Je remercie le Docteur Jacky Jacquot, de l’INSERM, pour avoir accepté d’examiner

ce travail et d’en être rapporteur. Je remercie le Professeur Ahn-Tuan Dinh-Xuan, de l’Université Paris V, le

Professeur Jean-François Bernaudin, de l’Université de Paris VI, ainsi que le Docteur Pascale Fanen, de l’Université de Paris XII, pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de faire partie de mon jury.

Je veux aussi remercier le Dr Sabine Blouquit-Laye, pour m’avoir, entre autres,

appris à passer des heures sous une loupe binoculaire pour disséquer quelques millimètres de bronchioles...Je remercie également le Dr Agathe Régnier pour sa convivialité et pour son aide dans l’analyse des immunomarquages.

Je remercie également le Dr Pierre Bonnette et le Dr Philippe Puyo, du service de

chirurgie thoracique de l’hôpital Foch à Suresnes, et le Dr Emmanuel Naline pour m’avoir fourni des prélèvements de poumon humain.

Merci aussi à tous les membres du service de pneumologie et du service d’anatomie

pathologique de l’hôpital Ambroise Paré qui m’ont aidé, Brigitte et Tania, Mariama,… Je veux également remercier le Professeur Edith Puchelle, de l’unité INSERM de

Reims, pour m’avoir permis de réaliser des dosages d’Il-8 dans son laboratoire. Je remercie également Christelle Coraux et Konstantina Fragaki pour leur aide dans ces dosages et pour m’avoir épargné de leurs « bombes stress ».

Cette thèse n’aurait pas été possible sans le soutien financier de l’association Vaincre

La Mucoviscidose et de CARDIF ASSISTANCE auxquels j’adresse mes profonds remerciements.

Je voudrais remercier ma famille : Benoit, Cécile, Jérôme, Sophie, Pascal, Agnès, et

leurs « petiots » : Claire, Pierre-Louis, Charlotte, Ludmilla, Mathéo, Séléna, Juliette, Lucien, Manon et Louis.

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Je souhaite remercier les michouls : Aurélie et Benoit, Dams, Laurette et leur bébé

girondin, Gégètte et Maud, Bubulle et ses Méganes et Camille. Je voudrais également remercier Nico et Angèle ainsi que « les têtes au froid » Marje et Nel pour leur soutien et les bons moments passés ensemble, mais vous ne pouvez donc pas vous empêcher de vous défiler…

Je voudrais tout spécialement remercier Anna : juste merci pour Tout. Et bien sur, je remercie tout particulièrement mes Parents pour « presque » Tout.

Ne laissons pas les chacals brouter nos idéals (Têtes Raides)

Maman, quand je s'rai grand, je voudrais pas être étudiant (Renaud)

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Table des matières

1 LES VOIES AÉRIENNE1 LES VOIES AÉRIENNE1 LES VOIES AÉRIENNE1 LES VOIES AÉRIENNES HUMAINES NORMALESS HUMAINES NORMALESS HUMAINES NORMALESS HUMAINES NORMALES .................................................................................................................................................................... 12121212

1.1 DESCRIPTION DES VOIES AERIENNES HUMAINES .............................................................. 13

1.2 DESCRIPTION DE L'EPITHELIUM DES VOIES AERIENNES HUMAINES................................. 15

1.3 LIQUIDE DE SURFACE DES VOIES AERIENNES .................................................................... 23

1.4 PRINCIPALES FONCTIONS DE L'EPITHELIUM DES VOIES AERIENNES................................ 30

2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS IONIQUES DANS LES VOIESIQUES DANS LES VOIESIQUES DANS LES VOIESIQUES DANS LES VOIES AÉRIENNES HUMAINES AÉRIENNES HUMAINES AÉRIENNES HUMAINES AÉRIENNES HUMAINES .... 34343434

2.1 AU NIVEAU BRONCHIQUE ................................................................................................... 35

2.1.1 REGULATION DE L’ABSORPTION ACTIVE DE Na+....................................................................................... 41

2.1.2 REGULATION DE LA SECRETION DE Cl- ..................................................................................................... 46

2.2 AU NIVEAU BRONCHIOLAIRE ............................................................................................. 49

2.3 DIFFERENCES ET SIMILITUDES ENTRE LES TRANSPORTS D’IONS ET D’EAU DANS LES

VOIES AERIENNES HUMAINES PROXIMALES ET DISTALES ....................................................... 52

2.4 AU NIVEAU ALVEOLAIRE.................................................................................................... 53

2.5 REGULATION DU LIQUIDE DE SURFACE ............................................................................. 56

5

3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE ........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 64646464

3.1 LA MALADIE ....................................................................................................................... 65

3.2 L'ATTEINTE PULMONAIRE DANS LA MUCOVISCIDOSE ...................................................... 67

3.3 LE GENE CF ET LES MUTATIONS ....................................................................................... 69

3.3.1 DU GENE A LA PROTEINE .......................................................................................................................... 69

3.3.2 LES DIFFERENTES CLASSES DE MUTATIONS DE CFTR............................................................................... 76

3.3.3 CORRELATION GENOTYPE/PHENOTYPE ..................................................................................................... 81

3.3.4 LES GENES MODIFICATEURS ..................................................................................................................... 82

3.4 CFTR ................................................................................................................................. 88

3.4.1 FONCTIONS DE CFTR............................................................................................................................... 88

3.4.2 EXPRESSION DE CFTR ............................................................................................................................. 91

3.5 EFFETS DES MUTATIONS DE CFTR SUR LES MOUVEMENTS D'IONS ET D'EAU AU NIVEAU

DES VOIES AERIENNES PROXIMALES ET DISTALES .................................................................. 93

3.6 CONCEPTS ACTUELS SUR LA PHYSIOPATHOLOGIE DE L'ATTEINTE PULMONAIRE DE LA

MUCOVISCIDOSE ...................................................................................................................... 96

3.7 PERSPECTIVES THERAPEUTIQUES ................................................................................... 103

4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 109109109109

4.1 ETUDE DE L’EXPRESSION DE CFTR DANS LES VOIES AERIENNES DISTALES HUMAINES110

6

4.2 EFFETS DU MONOXYDE D'AZOTE (NO) SUR LES TRANSPORTS IONIQUES

TRANSEPITHELIAUX DANS LES VOIES AERIENNES HUMAINES PROXIMALES ET DISTALES

MUCOVISCIDOSIQUES ET NON MUCOVISCIDOSIQUES ............................................................ 111

4.3 DETERMINATION DU POURCENTAGE DE CELLULES NON-CF PERMETTANT DE

NORMALISER LES FONCTIONS EPITHELIALES D'UNE CULTURE PRIMAIRE DE CELLULES

EPITHELIALES BRONCHIQUES CF.......................................................................................... 112

5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR DANS LES VOIES AÉRI DANS LES VOIES AÉRI DANS LES VOIES AÉRI DANS LES VOIES AÉRIENNES HUMAIENNES HUMAIENNES HUMAIENNES HUMAINESNESNESNES........................................ 114114114114

5.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 115

5.2 MATERIELS ET METHODES .............................................................................................. 118

5.2.1 ORIGINE DES PRELEVEMENTS PULMONAIRES.......................................................................................... 118

5.2.2 COLORATION ET ANALYSE HISTOLOGIQUE DES PRELEVEMENTS ............................................................. 118

5.2.3 ANTICORPS ANTI-CFTR ......................................................................................................................... 119

5.2.4 PROCEDURES D'IMMUNOMARQUAGE ...................................................................................................... 120

5.2.5 ANALYSE STATISTIQUE .......................................................................................................................... 121

5.3 RESULTATS....................................................................................................................... 123

5.3.1 EXPRESSION DE CFTR ........................................................................................................................... 123

5.3.2 ETUDE COMPARATIVE ............................................................................................................................ 124

5.4 DISCUSSION ...................................................................................................................... 128

6 EFFETS DU NO SUR L6 EFFETS DU NO SUR L6 EFFETS DU NO SUR L6 EFFETS DU NO SUR LES TRANSPORTS IONIQUES TRANSPORTS IONIQUES TRANSPORTS IONIQUES TRANSPORTS IONIQUES TRANSÉPITHÉLIAUX ES TRANSÉPITHÉLIAUX ES TRANSÉPITHÉLIAUX ES TRANSÉPITHÉLIAUX

DANS LES VOIES AÉRIEDANS LES VOIES AÉRIEDANS LES VOIES AÉRIEDANS LES VOIES AÉRIENNES HUMAINES PROXIMNNES HUMAINES PROXIMNNES HUMAINES PROXIMNNES HUMAINES PROXIMALES ET DISTALES NONALES ET DISTALES NONALES ET DISTALES NONALES ET DISTALES NON

MUCOVISCIDOSIQUES ETMUCOVISCIDOSIQUES ETMUCOVISCIDOSIQUES ETMUCOVISCIDOSIQUES ET MUCOVISCID MUCOVISCID MUCOVISCID MUCOVISCIDOSIQUESOSIQUESOSIQUESOSIQUES .................................................................................................................................................................... 134134134134

7

6.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 135

6.1.1 HISTORIQUE ........................................................................................................................................... 135

6.1.2 SYNTHESE DU NO .................................................................................................................................. 136

6.1.2.1 LES NOS CONSTITUTIVES ............................................................................................................... 136 6.1.2.2 LA NOS INDUCTIBLE ...................................................................................................................... 140 6.1.2.3 VOIES DE TRANSDUCTION DU NO................................................................................................... 140 6.1.2.4 PRINCIPAUX EFFETS DU NO............................................................................................................ 144


6.2.1 ORIGINE DES PRELEVEMENTS ................................................................................................................. 150

6.2.1.1 TISSUS NON MUCOVISCIDOSIQUES .................................................................................................. 150 6.2.1.2 TISSUS MUCOVISCIDOSIQUES .......................................................................................................... 150

6.2.2 CULTURE CELLULAIRE ........................................................................................................................... 151

6.2.2.1 OBTENTION DE CULTURES PRIMAIRES DE CELLULES EPITHELIALES BRONCHIQUES ET

BRONCHIOLAIRES HUMAINES...................................................................................................................... 151 6.2.2.1.1 IDENTIFICATION DES BRONCHES ET DES BRONCHIOLES........................................................... 151

6.2.2.1.2 ISOLEMENT DES CELLULES...................................................................................................... 153

6.2.2.1.3 ENSEMENCEMENT DES CELLULES ........................................................................................... 154

6.2.3 MESURE DES PROPRIETES BIOELECTRIQUES DES CULTURES PRIMAIRES BRONCHIQUES ET BRONCHIOLAIRES

DANS LES CHAMBRES DITES DE USSING........................................................................................................... 155

6.2.3.1 HISTORIQUE.................................................................................................................................... 155 6.2.3.2 DESCRIPTION DU SYSTEME UTILISE DANS LE LABORATOIRE ........................................................... 155 6.2.3.3 PROTOCOLES .................................................................................................................................. 159 6.2.3.4 ANALYSES STATISTIQUES ............................................................................................................... 160

6.3 RESULTATS....................................................................................................................... 161

6.3.1 CARACTERISTIQUES DES PRELEVEMENTS ............................................................................................... 161

6.3.2 EXPOSITION DES CULTURES BRONCHIQUES ET BRONCHIOLAIRES NON-CF A UN DONNEUR DE NO, LE SNP

........................................................................................................................................................................ 162

6.3.3 EXPOSITION DES CULTURES BRONCHIQUES ET BRONCHIOLAIRES CF A UN DONNEUR DE NO, LE SNP.... 164

6.3.4 EXPOSITION DES CULTURES PRIMAIRES DE CELLULES EPITHELIALES BRONCHIQUES NON-CF AU 8-BR-

GMPC ET AU ZAPRINAST................................................................................................................................. 166

6.3.5 EXPOSITION DES CULTURES PRIMAIRES DE CELLULES EPITHELIALES BRONCHIQUES NON-CF AU SNP EN

PRESENCE OU NON D'ODQ, UN INHIBITEUR DE LA GUANYLATE CYCLASE SOLUBLE ........................................ 168

6.4 DISCUSSION ...................................................................................................................... 170

8

7 DÉTERMINATION DU P7 DÉTERMINATION DU P7 DÉTERMINATION DU P7 DÉTERMINATION DU POURCENTAGE DE CELLULOURCENTAGE DE CELLULOURCENTAGE DE CELLULOURCENTAGE DE CELLULES NONES NONES NONES NON----CF PERMETTANT CF PERMETTANT CF PERMETTANT CF PERMETTANT

DE NORMALISER LES FODE NORMALISER LES FODE NORMALISER LES FODE NORMALISER LES FONCTIONS ÉPITHÉLIALESNCTIONS ÉPITHÉLIALESNCTIONS ÉPITHÉLIALESNCTIONS ÉPITHÉLIALES D'UNE CULTURE D'UNE CULTURE D'UNE CULTURE D'UNE CULTURE

PRIMAIRE DE CELLULESPRIMAIRE DE CELLULESPRIMAIRE DE CELLULESPRIMAIRE DE CELLULES ÉPITHÉLIALES BRONCH ÉPITHÉLIALES BRONCH ÉPITHÉLIALES BRONCH ÉPITHÉLIALES BRONCHIQUES CFIQUES CFIQUES CFIQUES CF ............................................................................................ 174174174174

7.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 175

7.1.1 IDENTIFICATION DES CELLULES CIBLES DANS LES VOIES AERIENNES...................................................... 177

7.1.2 LES DIFFERENTS VECTEURS UTILISES DANS LES VOIES AERIENNES HUMAINES ....................................... 179

7.1.2.1 LES VECTEURS VIRAUX................................................................................................................... 179 7.1.2.2 LES VECTEURS NON-VIRAUX........................................................................................................... 182

7.1.3 LA BARRIERE EPITHELIALE ..................................................................................................................... 183

7.1.4 LA THERAPIE GENIQUE DANS LE CADRE DE LA MUCOVISCIDOSE............................................................. 185


7.2.1 ECHANTILLONS ...................................................................................................................................... 187

7.2.2 CULTURES CELLULAIRES ........................................................................................................................ 187

7.2.2.1 CO-CULTURES................................................................................................................................. 187

7.2.3 EVALUATION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE DURANT LE TEMPS DE CULTURE................................ 188

7.2.4 EVALUATION DE L'APOPTOSE AU COURS DU TEMPS DE CULTURE............................................................ 189

7.2.5 MESURE DES PROPRIETES BIOELECTRIQUES DES CULTURES PRIMAIRES BRONCHIQUES DANS LES

CHAMBRES DE USSING .................................................................................................................................... 190

7.2.3.4 PROTOCOLES .................................................................................................................................. 191

7.2.6 DOSAGE DES CYTOKINES IL-8 DANS LE SURNAGEANT DES CULTURES (KIT ELISA) ............................... 191

7.3 RESULTATS....................................................................................................................... 192

7.3.1 CARACTERISTIQUES DES PRELEVEMENTS ............................................................................................... 192

7.3.2 EVALUATION DE LA PROLIFERATION CELLULAIRE DURANT LE TEMPS DE CULTURE (KI67) .................... 192

7.3.3 EVALUATION DE L'APOPTOSE AU COURS DU TEMPS DE CULTURE PAR LA METHODE « TUNEL »............ 193

7.3.4 ÉTUDES EN CHAMBRES DE USSING ......................................................................................................... 194

7.3.5 DOSAGE DE L’IL-8 DANS LE SURNAGEANT DES CULTURES ..................................................................... 197

9

7.4 DISCUSSION ...................................................................................................................... 199

8 CONCLUSIONS ET PER8 CONCLUSIONS ET PER8 CONCLUSIONS ET PER8 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVESSPECTIVESSPECTIVESSPECTIVES .................................................................................................................................................................................................................................................... 203203203203

9 RÉFÉRENCES BIBLIOG9 RÉFÉRENCES BIBLIOG9 RÉFÉRENCES BIBLIOG9 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUESRAPHIQUESRAPHIQUESRAPHIQUES................................................................................................................................................................................................................................................ 207207207207

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Liste des abréviations

A2b-R : Récepteur de l’adénosine de type 2b

AAV : Virus adéno-associé

AC : Adénylate cyclase

ADO : Adénosine

AMPc : Adénosine 3’-5’ monophosphate

cyclique

ASL : Liquide de surface des voies aériennes

ATP : Adénosine tri-phosphate

BAL : Lavage broncho-alvéolaire

BK : Bradikinine

BPCO : Broncho-pneumopathie chronique

obstructive

CaCC : Canaux C- activés par le Ca2+

CAP : Channel activating protease

CE : Clara cell secretory protein Expressing

CF : Cystic fibrosis / mucoviscidose

CFTR : Cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator

ClC : Canaux Cl-

CVF : Capacité vitale forcée

DAG : Diacylglycerol

ddp : différence de potentiel

DMEM/Ham-F12 : Dulbecco’s modified

eagle’s medim/nutrient mixture F-12 Ham

DPC : Diphénylamine-2-carboxylic acid

ENaC : Epithelial Na+ channel

GCs : Guanylate cyclase soluble

G-CSF : Granulocyte colony-stimulating factor

GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony-

stimulating factor

GMPc : Guanosine monophosphate cyclique

GnRH : Gonadotrophin releasing hormon

hCLCA : Canaux Cl- activés par le Ca2+

HLA : Human leukocyte antigen

HSP : Heat shock protein

huASH1: Absent, small or homeotic discs 1

iNANC : système inhibiteur non adrénergique

non cholinergique

IP3 : Inositol 1, 4, 5-triphosphate

Isc : Courant de court-circuit

LPS : Lipopolysaccharide

MAB1660 : Anticorps anti-CFTR dirigé contre

le domaine R

MAB25031 : Anticorps anti-CFTR dirigé

contre la partie C-terminale

MBL : Mannose binding lectin

MOI : Multiplicity of infection

MUC : Mucine

NEB : Neuroendocrin body

NBD ou SFN : Nucleotide binding domain ou

Site de fixation des nucléotides

NO : Nitric oxide, monoxyde d’azote

NOS : NO synthase

ORCC : Outwardly rectifying Cl- channel

P2Y2 : Récepteur purinergique couplé aux

protéines G

PBS : Phosphate buffered saline

PCL : Periciliary liquid / liquide péricilaire

PHA : Pseudo-hypo-aldostéronisme

PI/II : Pneumocyte de type I/II

PIP2 : Phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate

PKA : Protéine kinase A

PLC : Phospholipase C

PNEc : Pulmonary neuroendocrine cells

QRT-PCR : Quantitative RT-PCR

RSV : Respiratory syncitial virus

Rt : Résistance transépithéliale

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RT-PCR : Reverse transcriptase-polymerase

chain reaction

SAF-B: Scaffold attachment factor-B

SDS : Sodium dodecyl sulfate

SLPI : Secretory leukocyte protease inhibitor

TBS : Tris-buffered saline

TLR : Toll-like receptor

TNF-α : Tumor necrosis factor-α

UTP : Uridine tri-phosphate

VEMS : Volume expiratoire maximal en une

seconde

ZO-1, 2, 3 : Zonula occludens 1, 2, 3

ZONAB: ZO-1 associated nucleic acid binding

protein

β2AR : Récepteur β2 adrénergique

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1 LES VOI1 LES VOI1 LES VOI1 LES VOIESESESES AAAAÉÉÉÉRIENNESRIENNESRIENNESRIENNES HUMAINES HUMAINES HUMAINES HUMAINES

NORMALENORMALENORMALENORMALESSSS

13

1.1 Description des voies aériennes humaines

Les voies aériennes supérieures sont composées du nez, du pharynx et du larynx

(figure 1). Elles ont pour fonctions de réchauffer, filtrer, nettoyer et humidifier l'air qui

pénètre dans les poumons. Les voies aériennes de conduction qui font suite aux voies

aériennes supérieures comprennent tous les étages de l'arbre aérien depuis la trachée jusqu'aux

bronchioles terminales. Ces voies aériennes ont pour fonction de conduire l'air jusqu'aux

alvéoles. Les échanges gazeux entre l'air et le sang ont lieu dans les espaces alvéolaires situés

en aval des bronchioles terminales. Ces zones d'échange comportent plusieurs générations de

bronchioles respiratoires dans lesquelles s'ouvrent les canaux alvéolaires et les alvéoles. Au

niveau des alvéoles, le sang veineux provenant de l'organisme contient un taux élevé de CO2

et un taux réduit d'O2. Le CO2 diffuse le long d'un gradient de concentration du sang à l'air

alvéolaire. L'oxygène de l'air alvéolaire diffuse des alvéoles vers le sang.

Les voies aériennes proximales, constituées de la trachée et des bronches, sont

caractérisées par la présence de cartilage et de glandes sous-muqueuses dans leur paroi. En

progressant vers les régions distales, le diamètre des voies aériennes diminue et les cartilages

disparaissent au niveau des bronchioles. Les voies aériennes distales sont composées des

bronchioles et des alvéoles pulmonaires.

14

Figure 1 : Représentation des voies aériennes humaines de la cavité nasale aux alvéoles (d’après http://visualsonline.cancer.gov/).

15

1.2 Description de l'épithélium des voies aériennes

humaines

Les épithéliums sont des tissus dont les cellules sont jointives et solidaires les unes des

autres grâce à des jonctions intercellulaires comme les "tight junctions" ou jonctions serrées.

Dans ce type de tissus, les cellules sont polarisées. On distingue la région apicale de la cellule

et la région basale qui est accolée à la lame basale. L’épithélium des voies aériennes est

capable de maintenir des gradients de concentration chimiques entre les deux compartiments

qu’il sépare ainsi que de transférer sélectivement certaines molécules d’un côté vers l’autre.

L’épithélium des voies aériennes humaines est composé d’au moins une couche de

cellules reposant sur une lame basale qui sert de moyen d’ancrage aux cellules épithéliales. La

lame basale est sécrétée par les cellules épithéliales et est principalement composée de

protéoglycans, de collagène de type IV, de fibronectine, de laminine et d’entactine.

L’observation en microscopie électronique de la lame basale permet de distinguer 2 zones : la

lamina rara (ou lucida) composée principalement de mucopolysaccharides, et la lamina

densa composée de collagène de type IV et de glycoprotéines (laminine, fibronectine). La

lame basale et la lame réticulaire, sécrétée par les cellules du tissu conjonctif sous-jacent et

composée de fibre de collagène de type III, forment ensemble la membrane basale.

L’épithélium des voies aériennes est dit « pseudostratifié » car si toutes les cellules semblent

entrer en contact avec la lame basale, toutes n’atteignent pas la face apicale (Malm et

Toremalm 1988 ; Mercer et al. 1994).

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Les principales cellules rencontrées dans les voies aériennes proximales sont les

cellules basales, les cellules ciliées et les cellules caliciformes (figure 2). Les cellules basales

n’atteignent pas la lumière apicale mais entrent largement en contact et sont fermement

attachées à la lame basale par des hemi-desmosomes (Evans et Moller 1991). Les cellules

ciliées possèdent une partie apicale avec de nombreux cils (environ 250 par cellule) et de

nombreux microvilli de 1 à 2 µm qui font sailli à la surface. La face apicale est recouverte par

un glycocalix probablement produit par les cellules ciliées elles-mêmes (Welsh 1987). Le

noyau des cellules caliciformes est situé dans la partie basale tandis que les granules

sécrétoires occupent la partie apicale du cytoplasme.

Les cellules basales, les cellules ciliées et les cellules caliciformes sont donc

les principaux types cellulaires rencontrés le long de l’arbre bronchique, mais la proportion de

ces cellules est variable le long de l’épithélium. Au niveau bronchique, les cellules basales

représentent environ 30 % de la population totale des cellules (Mercer et al. 1994; Boers et al.

1998), les cellules ciliées de 20 à 35 % et les cellules sécrétantes environ 10 %. Les autres

types cellulaires bronchiques sont les cellules préciliées, des cellules sécrétantes et

neurosécrétantes ou de phénotype indéterminé (Mc Dowell et al. 1978; Kelsen et al. 1992;

Mercer et al. 1994).

L'épithélium bronchique possède également des glandes séromuqueuses qui s'ouvrent

dans la lumière des voies aériennes (figures 3 et 4). La région la plus profonde de la glande est

composée d'acini bordés essentiellement par des cellules séreuses (Engelhardt et al. 1992).

Les acini s'ouvrent dans des tubules qui sont tapissés de cellules à mucus. Un canal collecteur

cilié conduit ensuite les sécrétions vers la lumière des voies aériennes.

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Figure 2 : Principaux types cellulaires des voies aériennes proximales humaines (d’après http://www-sante.ujf-grenoble.fr).

Figure 3 : Aspect histologique des épithéliums bronchique, bronchiolaire et alvéolaire. Les tissus ont été colorés à l'hématoxyline et l'éosine. a) Bronches avec un épithélium pseudostratifié, cilié et mucosécrétant (flèche noire : cartilage, flèche blanche : glande séreuse). b) Bronchiole avec un épithélium cilié et mucosécrétant. c) Alvéoles avec des pneumocytes I (cellules plates) et des pneumocytes II (cellules cuboïdales). Barre d'échelle : 50µm (Photographies provenant du laboratoire).

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Afin de faciliter la sortie des sécrétions, les glandes sont entourées par des cellules

myo-épithéliales contractiles (Murray et al. 1986). La partie la plus profonde de ces glandes

produit des sécrétions plutôt fluides tandis que les tubules muqueux produisent des sécrétions

plus denses et riches en mucines. Le nombre de glandes chez l'homme diminue au fur et à

mesure que l'on progresse vers les régions distales, ainsi à partir de la 6ème génération de

bronches, 30 % des individus ne possèdent plus de glandes sous-muqueuses.

Lorsque l'on progresse vers les régions distales, la hauteur de l'épithélium diminue.

Alors que l'épithélium bronchique mesure environ 50 à 60 µm, l'épithélium bronchiolaire ne

mesure plus qu'environ 10 µm de haut (Fishman 1988; Jeffery et al. 1988; Mercer et al.

1991). L'épithélium n'est alors plus pseudo-stratifié mais il prend l’aspect d’un épithélium

cuboïdal simple (figures 3 et 4). Le nombre des glandes sous-muqueuses et de cellules basales

diminue lorsque l’on progresse vers les régions distales. Dans les bronchioles de 0,5 mm de

diamètre, les cellules basales ne représentent plus que 6% du nombre total de cellules (Boers

et al. 1998). Les deux types cellulaires les plus importants au niveau des bronchioles d'un

diamètre de 1 à 0,4 mm sont les cellules ciliées (46%) et les cellules sécrétantes (34%)

(Mercer et al. 1994). Parmi ces dernières, 4 principaux types cellulaires ont été répertoriés :

les cellules à mucus, les cellules séreuses, les cellules neuroendocrines et les cellules de Clara.

Ces dernières qui sont absentes ou quasiment absentes dans les bronches et les bronchioles

proximales, représentent jusqu'à respectivement 11% et 20% des cellules des bronchioles

terminales et respiratoires humaines (Boers et al. 1999).

Des études ont montré que les cellules de Clara pouvaient servir de progéniteur pour

les cellules ciliées dans les bronchioles (Evans et al. 1976; Boers et al. 1999).

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Figure 4: La paroi des voies aériennes. La paroi des voies aériennes comprend 3 composants majeurs : 1) une muqueuse, composée d'un épithélium reposant sur une lame basale, 2) un manchon de fibres musculaires lisses et 3) une enveloppe de tissu conjonctif partiellement pourvue de cartilage. L'épithélium pseudostratifié des voies aériennes proximales s'affine graduellement et se présente sous la forme d'une couche de cellules cuboïdales dans les bronchioles et très plates dans les alvéoles. L'enveloppe fibreuse se réduit également au fur et à mesure que l'on s'approche des alvéoles (d’après http://www.embryology.ch).

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En plus de leur rôle de cellules sécrétantes, de leur rôle dans le renouvellement de l'épithélium

bronchiolaire, des études ont révélé que ces cellules, chez le lapin, étaient capables de

transports ioniques (Van Scott et al. 1989; Chinet et al. 1997). Ces études ont, en effet, révélé

que les cellules de Clara étaient capables d'absorption de sodium ainsi que de sécrétion de

chlore.

L'épithélium des voies aériennes est une structure polarisée qui constitue une barrière

entre deux compartiments. Pour assurer cette polarité, l'épithélium des voies aériennes est

doté de protéines spécialisées qui assurent les jonctions intercellulaires. Il existe plusieurs

types de jonctions intercellulaires : les jonctions serrées, les jonctions adhérentes, et les

desmosomes qui préservent l'intégrité de l'épithélium et les jonctions communicantes ou "gap

junctions" qui interviennent dans la communication intercellulaire (figure 5). Les jonctions

serrées sont localisées vers le côté apical des espaces intercellulaires formant une sorte de

ceinture continue impliquée dans le contrôle des échanges (d'eau et d'ions) effectués par la

voie paracellulaire (figures 5 et 6) (Schneeberger et al. 2004). La zone correspondant aux

jonctions serrées ou « zonula occludens » s’étend sur 0,1 à 0,7µm de hauteur. Ces jonctions

sont constituées d'un assemblage de plusieurs protéines comme ZO-1 (zonula occludens-1),

ZO-2, ZO-3, cinguline, occludine, claudine,... Les « claudines » dont il existe au moins 24

isoformes formeraient des pores sélectifs à certains ions, tandis que l'occludine entrerait en

relation avec des complexes cytosoliques (Schneeberger et al. 2004). Les jonctions serrées

jouent donc non seulement un rôle vital dans l'établissement de la polarité cellulaire mais de

plus en plus d'autres fonctions leur sont attribuées : la régulation de certains gènes, le contrôle

de la prolifération cellulaire,… (Schneeberger et al. 2004).

21

Figure 5 : Différents types de jonctions présentes au niveau de l’épithélium (d’après http://www.unifr.ch).

Figure 6 : Complexes de jonctions intercellulaires constitués de jonctions serrées (flèches étroites) et de desmosomes (flèche large) observées au microscope électronique à transmission (X96000) (d’après Schneeberger et al. 1978).

Figure 7 : Schéma de jonctions communicantes (d’après http://www.unifr.ch).

22

Située sous la "zonula occludens", se trouve la "zonula adherens" principalement

constituée de cadhérines, puis sous cette zone se trouve la "macula adherens" constituée des

desmosomes (figure 5). Ces jonctions renforcent la cohésion physique des cellules entre elles.

Les cadhérines pourraient également intervenir dans la reconnaissance cellulaire et leur

absence dans les carcinomes pourrait permettre aux cellules cancéreuses de migrer à distance

initiant le processus métastatique.

Ces différents types de jonctions assurent notamment un contrôle des mouvements de

molécules (eau, ions,…) au travers de la couche épithéliale. Les jonctions communicantes

permettent d'établir des communications entre les cellules adjacentes. Ces jonctions forment

en effet des canaux entre 2 cellules, chaque cellule possédant un demi-canal ou "connexon".

Ces connexons sont constitués de 6 connexines qui forment un pore (figure 7). Il existe au

moins une vingtaine d'isoformes pour ces protéines qui sont distribuées spécifiquement selon

les tissus. Les connexines sont finement régulées par plusieurs mécanismes ([Ca2+]

intracellulaire, phosphorylation,..) et possèdent des sélectivités différentes selon les isoformes

impliquées dans le canal. Les jonctions communicantes semblent ainsi impliquées dans la

coordination du battement ciliaire. L’expression différentielle des connexines, notamment de

la connexine 26, semble être impliquée dans le développement des voies aériennes ainsi que

dans le maintien de l'épithélium dans un état différencié (Kumar et al. 1996 ; Carson et al.

1998).

Les différents types de jonctions intercellulaires assurent donc le maintien de la

polarité des épithéliums mais loin d'être des complexes statiques, ces jonctions participent

activement à la vie cellulaire et leurs dysfonctionnements entraînent donc des pathologies. Les

jonctions serrées interviendraient dans la régulation de l'expression de certains gènes. La

23

découverte des protéines des jonctions serrées simplekine, ZO-1 et ZO-2 dans le noyau des

cellules prolifératives, et surtout des facteurs de transcription (huASH1, ZONAB et SAF-B)

associés aux jonctions serrées, a permis d’impliquer ces structures dans la régulation de

l’expression de certains gènes (Zarhaoui 2004). Dans la lignée cellulaire rénale d’origine

canine (MDCK), l’interaction ZO-1/ZONAB régule l’expression du gène codant pour le co-

récepteur du facteur de croissance épithélial, qui a un rôle important dans la différenciation

des cellules épithéliales. Des mutations touchant les "claudines" et entraînant une altération du

passage des ions Mg2+ au niveau des tubules rénaux ont également été rapportées. Les

jonctions adhérentes ainsi que les jonctions communicantes pourraient également intervenir

dans le processus cancéreux.

1.3 Liquide de surface des voies aériennes

L'épithélium de surface des voies aériennes est recouvert d'un liquide : l'ASL (Airway

Surface Liquid ou liquide de surface des voies aériennes). L'ASL est composé de deux phases

: une phase aqueuse (le liquide périciliaire) et une phase muqueuse (figure 8).

Le liquide périciliaire (PCL) baigne les cils dont on estime qu’il mesure à peu près la

même hauteur (environ 7 µm) et le mucus flotte sur le PCL. La composition ionique de ce

liquide a fait l'objet de nombreuses études chez l'animal et chez l'homme, mais compte tenu

de la difficulté de prélever ce liquide et des différentes techniques utilisées, des résultats

différents ont été obtenus. Ces résultats discordants ont provoqué l'émergence de deux écoles.

24

Figure 8 : a) Schéma du liquide de surface des voies aériennes représentant le liquide périciliaire, la couche de mucus et la vélocité normale du transport de mucus. b) Photographie en microscopie optique de cellules humaines bronchiques en culture distinguant une couche de mucus et le liquide périciliaire. Barre d’échelle : 10µm (d’après Boucher et al. 2004).

25

D'une part l'école hypotonique et d'autre part l'école isotonique. Pour les tenants de l'école

hypotonique, la concentration en NaCl du PCL était <50mM et donc inférieure par rapport à

la concentration plasmatique (120 à 140mM) (Zabner et al. 1998; Mc Cray et al. 1999). Ce

système impliquait que l'épithélium régulait la concentration plus que le volume de l'ASL et

que si l'épithélium était perméable au NaCl, il était en revanche imperméable à l'eau. Pour les

défenseurs de l'école isotonique, la concentration en NaCl dans le PCL est identique à celle du

plasma (Boucher et al. 1994a; Knowles et al. 1997; Matsui et al. 1998; Tarran et al. 2001).

Selon cette théorie, l'épithélium régule le volume de l'ASL plutôt que sa composition et

l'épithélium est à la fois perméable au NaCl et à l'eau.

Matsui et al. ont démontré que l'épithélium, par l'intermédiaire de l'escalator

mucociliaire, fait remonter le liquide périciliaire des voies aériennes distales vers la trachée

(Matsui et al. 1998). Or étant donné que la surface cumulée de chaque génération des voies

aériennes diminue des alvéoles (environ 70 m2) jusqu'à la trachée (environ 25 cm2), un

surplus important de liquide devrait donc être engendré par cette réduction de surface

cumulée. Une accélération de la vitesse de l’escalator mucociliaire au niveau des voies

aériennes proximales pourrait permettre d’éviter un « encombrement » des voies aériennes par

le surplus de liquide. Si cette accélération est réelle, elle reste toutefois largement insuffisante

pour compenser le surplus de liquide. L’augmentation de la hauteur de l’ASL pourrait

constituer une autre possibilité permettant de compenser le surplus de liquide provenant des

voies aériennes distales. Cependant, la hauteur de l’ASL demeure relativement constante le

long des voies aériennes (Boucher 1994a). Le surplus de liquide provenant des voies

aériennes distales est en fait réabsorbé au niveau des voies aériennes proximales. Ces données

sont en accord avec la théorie isotonique, l’absorption de liquide n’étant pas consistante avec

le modèle hypotonique dans lequel l’épithélium serait imperméable à l’eau. Cet argument

26

associé aux observations faites sur la concentration isotonique du PCL obtenues sur des

cultures de cellules normales et mucoviscidosiques ainsi que la diminution du volume du PCL

observée dans les cultures de cellules mucoviscidosiques (Jayaramn et al. 2001; Matsui et al.

1998; Tarran et al. 2001; Boucher 2004; Tarran et al. 2005) font qu'aujourd'hui il est admis

que l'ASL est isotonique au plasma.

La phase muqueuse piège les particules étrangères inhalées qui sont transportées par

l'escalator mucociliaire vers le larynx pour être ingérées (figure 9). Le mucus est composé de

glycoprotéines de haut poids moléculaire fortement glycosylées : les mucines. Elles forment

un ensemble de glycoprotéines enchevêtrées et enroulées aléatoirement, formant un réseau

lâche de densité variable qui donne au mucus ses propriétés (élasticité et viscosité) (Verdugo

et al. 1983). Cependant, le pH, les concentrations ioniques et le contenu en eau influencent

également la consistance du mucus (Knowles et al. 2002). Plusieurs gènes codant pour des

mucines (MUC) ont été clonés dans le poumon humain. Associé à un polymorphisme

génétique, une extraordinaire diversité des chaînes glycosylées des mucines confère à la phase

muqueuse le pouvoir de reconnaître, fixer et piéger potentiellement l'ensemble des types de

motifs se présentant dans les voies aériennes (Lamblin et al. 2000). Les mucines MUC1,

MUC2, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC11 et MUC13 sont exprimées dans les

voies aériennes. Il est généralement distingué deux principaux types de mucines : les mucines

monomériques et les mucines oligomériques. Les mucines monomériques (MUC1, MUC4,

MUC7, MUC11 et MUC13) sont principalement transmembranaires, tandis que les mucines

oligomériques sont sécrétées. Les mucines oligomériques MUC2, MUC5AC, MUC5B,

présentes dans le poumon humain, possèdent des domaines riches en cystéine permettant leur

oligomérisation. Ce sont donc principalement ces mucines oligomériques qui confèrent au

mucus ses propriétés rhéologiques (Thornton et Sheehan 2004).

27

Figure 9 : Schéma représentant l’ASL normal. Le mucus piège les particules étrangères (ici représentées par des bactéries) qui sont « remontées » vers l’oropharynx où elles seront ingérées (d’après Knowles et al. 2002).

28

MUC5AC et MUC5B sont présentes en plus grande quantité par rapport à MUC2 (Davies et

al. 1999). Thornton et al. ont suggéré dans leur étude que MUC5AC, produite principalement

par les cellules caliciformes, pourrait jouer un rôle prépondérant pour faciliter la clairance

mucociliaire tandis que MUC5B, provenant principalement des glandes sous-muqueuses,

interviendrait dans la formation d'un gel dont le rôle premier serait de faciliter l'évacuation de

pathogènes et autres particules inhalées (Thornton et Sheehan 2004). Cependant, les mucines

monomériques présentes dans les voies aériennes humaines joueraient également un rôle dans

la composition du mucus mais à l'heure actuelle peu de choses sont connues sur ces mucines

tant au niveau de leurs caractérisations biochimiques que de leurs concentrations ou que de

leurs fonctions.

La coordination du battement ciliaire entre les cellules ciliées voisines permet de faire

remonter le mucus et les particules piégées jusqu'à l'oropharynx où l'ensemble sera éliminé

par la déglutition. La vélocité du mucus est d'environ 4 mm par minute dans la trachée

(Widdicombe et al. 1995 ; Wanner et al. 1996). Des études ont montré que la vélocité du

mucus diminue avec le diamètre des voies aériennes (Wanner et al. 1996). Dans des cellules

ciliées bronchiolaires, récupérées par brossage dans un poumon obtenu après résection

pulmonaire, Clary-Meinesz et al. ont montré que la vitesse de battement ciliaire est inférieure

de 35% par rapport à des cellules épithéliales bronchiques obtenues par la même technique

(Clary-Meinesz et al. 1997). La vitesse du battement ciliaire est régulée par différents facteurs

comme par exemple par les nucléotides triphosphates extracellulaires (ATP et UTP) et par

l'augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2+ (Donaldson et al. 2002). Cependant,

la vitesse du battement ciliaire peut également être inhibée par des agents pathogènes comme

la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ces études menées chez le cobaye suggèrent que cette

29

inhibition permettrait de ralentir l'élimination des bactéries des voies aériennes (Read et al.

1992 ; Denning et al. 1998).

Le mucus pourrait également servir de réservoir de fluide pour le PCL. En effet le

mucus pourrait permettre d'ajuster la hauteur du PCL pour que celui-ci reste continuellement

à la hauteur des cils permettant un battement ciliaire toujours efficace (Tarran 2004). Ce

phénomène pourrait expliquer les variations de la hauteur de la couche de mucus observées

(de 7 à 70 µm in vivo) (Tarran 2004).

L'ASL contient également des agents chimiques importants dans la défense du

poumon. Le lysozyme, la lactoferrine et le SLPI (secretory leukocyte protease inhibitor) font

partie de ces facteurs parmi les plus abondamment sécrétés par les glandes sous-muqueuses et

par l'épithélium de surface (figure 9) (Knowles et al. 2002). Le lysozyme est capable de cliver

les ponts glycosidiques de l’acide N-acétylmuramique entraînant des altérations dans la paroi

bactériennes et en définitive d’éliminer le pathogène par lyse cellulaire (Fernie-King et al.

2002). La lactoferrine a une action bactériostatique principalement en chélatant le fer et en le

rendant inaccessible pour le pathogène. Cependant, une action anti-bactérienne directe faisant

intervenir un domaine situé près de l’extrémité N-terminale et distincte de la partie liant le fer

a été reportée (Bellamy et al. 1992). Le mode d’action anti-microbien du SLPI reste encore

inconnu. Une étude a démontré que la combinaison des peptides deux par deux

(SLPI/lactoferrine, SLPI/lysozyme, lactoferrine/ lysozyme) était synergétique et que cet effet

synergétique était plus important encore quand les trois agents étaient combinés ensembles

(Singh et al. 2000). Le liquide périciliaire contient aussi des peptides antimicrobiens dont par

exemple, les beta-défensines et les cathelicidines (Singh et al. 2000). L'ASL protège donc

l'épithélium des particules infectieuses contenues dans l'air inhalé (Travis et al. 1999). Les

30

antimicrobiens contenus dans l'ASL constituent un "bouclier chimique" efficace pour

préserver l'intégrité de l'épithélium et permettent d’éliminer un grand nombre de pathogène

sans initier de réponse inflammatoire (Singh et al. 2000).

L'ASL par ses propriétés mécaniques et chimiques permet donc une protection

efficace de l'épithélium des voies aériennes. Ces propriétés et leur régulation sont des

éléments essentiels pour les fonctions de défense des poumons.

1.4 Principales fonctions de l'épithélium des voies

aériennes

Selon notre activité physique, nous inspirons quotidiennement entre 1000 et 21000

litres d'air (Wanner 1996). Cet air contient de nombreuses particules minérales et organiques

et parmi ces dernières des allergènes et des agents infectieux susceptibles d’exercer des effets

délétères sur l’organisme. L'épithélium des voies aériennes possède cependant des moyens de

défense permettant de lutter efficacement contre ces particules inhalées.

La clairance mucociliaire constitue une première ligne de défense de l’épithélium des

voies aériennes contre les agents inhalés comme nous l'avons vu précédemment. Nous avons

également vu que l'épithélium possède des défenses anti-infectieuses qui peuvent être des

composants de l'ASL. Les substances antimicrobiennes contenues dans l'ASL peuvent

détruire directement les bactéries ou inhiber la croissance bactérienne (dont le temps de

doublement en conditions optimales est de 20 minutes) pendant un laps de temps relativement

31

court (2 à 6 heures) mais suffisant en conditions normales pour permettre l'élimination des

voies aériennes des bactéries inhalées grâce à la clairance mucociliaire (Knowles et Boucher

2002).

L’épithélium des voies aériennes possède, en plus des peptides contenus dans l’ASL,

des protéines membranaires (récepteurs, transporteurs) situées à la face apicale des cellules

Les récepteurs Toll-like (TLR) semblent également participer à l'élimination des pathogènes

des voies aériennes. Les TLR sont des protéines transmembranaires possédant à leur extrémité

N-terminale extracellulaire des répétitions de motifs riches en leucine qui sont probablement

impliqués dans la liaison de leur ligand mais qui sont aussi probablement nécessaires pour

leur dimérisation (figure 10) (Basu et Fenton 2004). La présence de TLR-2, ARNm et

protéine, a été démontrée dans les pneumocytes de type II ainsi que dans les macrophages

(Droemann et al. 2003). TLR-4 est également exprimé au niveau des macrophages alvéolaires

et dans les cellules épithéliales trachéales humaines (Becker et al. 2000). TLR-4 est capable

de reconnaître le lipopolysaccharide (LPS), qui est le composé le plus pro-inflammatoire

présent sur l’enveloppe des bactéries à Gram négatif comme P. aeruginosa, et d'entraîner en

réponse à cette stimulation la production de cytokines pro-inflammatoires telle que l'IL-8

(Becker et al. 2000). Les TLR semblent également impliqués dans l'élimination des voies

aériennes du virus respiratoire syncitial (RSV pour respiratory syncytial virus). Des études ont

montré que chez des souris déficientes pour TLR-4 et infectées par le RSV l'expression d'IL-

6, d'IL-12 et d'IL-1β était inférieure par rapport aux souris possédant TLR-4 (Haynes et al.

2000; Kurt-Jones et al. 2001).

32

Figure 10 : Les récepteurs Toll-like et leurs ligands. HSP : heat shock protein 60 et 70 (d'après Basu et Fenton 2004).

33

L'épithélium en initiant et en maintenant l'inflammation mais également en attirant et

activant des granulocytes et des leucocytes, semble jouer un rôle majeur dans le déroulement

de la réaction inflammatoire (Cooper et al. 2001). En effet, les cellules épithéliales possèdent

des récepteurs aux médiateurs de l’inflammation comme le TNF-α (facteur nécrosant des

tumeurs / tumor necrosis factor) et l’interleukine-β, deux cytokines pro-inflammatoires

produites entre autres par les macrophages, les monocytes et l’endothélium. L’épithélium est

capable de produire ces mêmes cytokines mais également des éicosanoïdes et des espèces

réactives de l’oxygène qui interviennent dans le déroulement de la réponse immune et

inflammatoire (Adler et al. 1994). Les cellules épithéliales seraient aussi capables de sécréter

le GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) et le G-CSF (Granulocyte

Colony-Stimulating Factor) lorsqu’elles sont mises en présence de P. aeruginosa ou de

Staphylococcus aureus. Ces deux médiateurs auraient la propriété d’augmenter la survie des

polynucléaires neutrophiles en inhibant leur apoptose (Saba et al. 2002).

L’épithélium des voies aériennes possède donc une multitude de moyens de défense

pour protéger le poumon et l’organisme contre les particules inhalées. Dans les conditions

normales, la stérilité et l’intégrité de la barrière épithéliale sont assurées par l’élimination

mécanique de ces agents par l’escalator mucociliaire couplée à la déglutition, voire à la toux ;

par le bouclier chimique constitué pas les molécules antimicrobiennes dans l’ASL, et par les

interactions entres les cellules épithéliales, inflammatoires et immunitaires.

34

2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS ION2 LES TRANSPORTS IONIQUES DANS LES IQUES DANS LES IQUES DANS LES IQUES DANS LES VOIESVOIESVOIESVOIES

AÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNES HUMAINESHUMAINESHUMAINESHUMAINES

35

2.1 Au niveau bronchique

Les premières données sur la différence de potentiel (ddp), la résistance

transépithéliale (Rt), et le courant généré par le mouvement des ions à travers l’épithélium

polarisé (Isc) des voies aériennes humaines ont été obtenues dans les voies aériennes

proximales plus faciles à étudier. Ces différentes études ont reporté que la ddp au niveau de

l'épithélium nasal était environ de -30mV (Knowles et al. 1981). Si les valeurs de ddp

observées au niveau de l'épithélium trachéal sont proches de celles obtenues dans le nez, la

valeur de la ddp diminue avec le diamètre des voies aériennes (Knowles et al. 1982; Boucher

et al. 1994a).

D'autres études ont été réalisées en utilisant les chambres dites de Ussing (cf chapitre

6.2.3), qui permettent de mesurer la ddp, la Rt ainsi que l’Isc dans des tissus excisés ou des

cultures cellulaires polarisées. Ces études ont permis de mettre en évidence dans l'épithélium

des voies aériennes humaines proximales que le transport ionique majoritaire, dans les

conditions expérimentales, est l'absorption active de Na+. L'addition d'amiloride, un inhibiteur

des canaux Na+ épithéliaux, entraîne une diminution d'environ 40 à 60% du courant enregistré

chez des sujets normaux. Ces mouvements de Na+ entraînent une absorption passive de Cl- et

d'eau (Boucher et al. 1994b) (figure 11).

Les mécanismes moléculaires de ces mouvements d’ions impliquent des pompes,

canaux et co-transporteurs situés dans les membranes apicale et basolatérale des cellules

épithéliales et fonctionnent de manière coordonnée (figure 11).

36

Figure 11 : Régulation du volume du liquide périciliaire par des transports ioniques actifs. a) Description des voies de transport du Na+, du Cl- et de l’eau ainsi que des éléments impliqués dans ce transport. Les canaux Na+ épithéliaux (ENaC), les canaux Cl- cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) et les canaux Cl- activés par le Ca2+ (CaCC) sont représentés à la face apicale. CFTR est décrit comme un canal Cl- et comme régulateur d’ENaC et de CaCC. La pompe Na+/K+/ATPase, les canaux K+ et le co-transporteur Na+/K+/Cl2 sont représentés à la face basolatérale. b) Mécanismes de régulation d’un volume excessif du liquide périciliaire (PCL) par l’absorption de Na+ et de maintien d’un volume à une hauteur d’environ 7µm correspondant à la hauteur des cils en extension. c) L’épithélium des voies aériennes humaines peut passer d’un état absorbant à un état sécrétant. Quand un excès du liquide de surface des voies aériennes (ASL) est détecté, l’absorption active de Na+ via ENaC est dominante et les ions Cl- sont absorbés par la voie paracellulaire car il ne semble pas exister de force électromotrice (DFaCl- = 0mV) significative favorable à la sortie des ions Cl- de la cellule. Au contraire, le potentiel négatif de la membrane apicale (Va = -30mV)) et la faible concentration en Na+ intracellulaire (~20mM) favorisent l’entrée du Na+ dans la cellule. Quand le volume de l’ASL est trop faible, ENaC est inhibé rendant le potentiel de la membrane apicale plus négatif (Va = -35mV) et induit une force électromotrice (DFaCl- = -5mV) favorable à la sécrétion des ions Cl-. Il est supposé que les éléments détectant le volume de l’ASL sont contenus dans l’ASL (d’après Boucher 2004).

37

Certains de ces mouvements nécessitent de l'énergie (essentiellement l'ATP) ; on parle alors

de transports ioniques "actifs". Ces transports créent des gradients chimiques, et quand les

éléments transportés sont chargés électriquement comme les ions, ils génèrent des gradients

électriques de part et d’autre de l’épithélium. La résultante des gradients de concentration

ionique et des gradients électriques de part et d'autre d'une couche épithéliale ou d'une

membrane cellulaire est désignée sous le terme "gradient électrochimique". D’autres

transports, dits "passifs", ne consomment pas directement d'énergie mais suivent les gradients

électrochimiques. Le canal Na+ le plus connu est le canal Na+ épithélial amiloride-sensible

ENaC (epithelial Na+ channel). Ce canal qui a été cloné en 1994 (Canessa et al. 1994), est

composé de 3 sous-unités et est présent tout le long des voies aériennes humaines (Pitkänen et

al. 2001; Gaillard et al. 2000). Il est présent à la face apicale des cellules épithéliales et est

responsable de plus de 50 % de la conductance Na+ au niveau des voies aériennes proximales

humaines normales (Knowles et al. 1984). La localisation d’ENaC à la face apicale des

cellules constitue une voie d'entrée pour le Na+ dans la cellule. Au niveau de la membrane

basale, la présence de la pompe Na+/K+/ATPase constitue la voie de sortie du Na+ (Boucher et

al. 1991; Boucher et al. 1994a et b). Cette pompe extrait activement le Na+ avec pour

conséquence la diminution de la concentration intracellulaire de Na+ par rapport au milieu

extracellulaire, créant ainsi un gradient électrochimique favorable à l'entrée de Na+ à travers la

membrane apicale grâce aux canaux ENaC. Le couplage de la pompe Na+/K+/ATPase et des

canaux ENaC constituent la principale voie de transport du Na+ à travers l'épithélium, cette

voie est responsable de l’absorption active de Na+. Ces mouvements d'ions Na+ entraînent une

absorption passive du contre-ion du Na+, l'ion Cl-, afin de préserver l'électroneutralité des

solutions. On considère que l'absorption des ions Cl- se ferait principalement par voie

paracellulaire puisque les études avec des microélectrodes intracellulaires n’ont pas montré de

gradient électrochimique significatif pour le Cl- à travers la membrane apicale (Boucher et al.

38

1994b; Willumsen et al. 1989). Cette absorption de NaCl entraîne une absorption d'eau pour

maintenir l’osmolarité (figure 11). Les mouvements d’eau se font par la voie paracellulaire et

probablement par la voie cellulaire.

A l'état de base, il n'a pas été détecté de sécrétion de Cl- dans l'épithélium des voies

aériennes humaines dans les chambres de Ussing. Cependant, dans certaines conditions,

l'épithélium peut générer une sécrétion nette de Cl-. Cette voie de sécrétion fait intervenir le

co-transporteur électroneutre Na+/K+/2Cl- situé dans la membrane basale des cellules. Ce co-

transporteur utilise le gradient de Na+ de part et d’autre de la membrane basolatérale comme

force motrice et il fait entrer le Cl- dans la cellule du côté basolatéral. Du coté apical, la sortie

des ions Cl- fait intervenir des canaux ioniques (figure 11). Parmi ces canaux se trouvent le

canal CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) et le canal ORCC

(outwardly rectifying chloride channel). D'autres canaux Cl- ont également été mis en

évidence tels que les canaux Cl- activés par le Ca2+, les CaCC (calcium activated chloride

channel) ou les ClC (chloride channel) (figures 12 et 13). Parmi les CaCC, terme générique

regroupant l’ensemble des canaux Cl- activés par le Ca2+, les isoformes hCLCA1, 2, 3 et 4 ont

été identifiées dans les voies aériennes humaines (Eggermont 2004 ; Loewen et Forsyth

2005). hCLCA1 semble être surexprimé chez des personnes asthmatiques, et cette

surexpression pourrait être responsable en partie de la surproduction de mucus (Hauber et al.

2003; Loewen et Forsyth 2005). Les isoformes hCLCA2, hCLCA3 et hCLCA4 ont également

été observées dans les voies aériennes humaines (Loewen et Forsyth 2005). Leur structure

moléculaire est encore discutée. Des études ont démontré une activité de canal ionique pour

hCLCA1 et hCLCA2 (Gruber et al. 1998; Gruber et al. 1999) ce qui n’a pas (encore) été

démontré pour hCLCA3 et hCLCA4.

39

Figure 12 : Proposition de topologie membranaire des hCLCA. A) Topologie membranaire de hCLCA1 avec 4 domaines transmembranaires et un petit segment C-terminal clivé puis sécrété. B) Topologie alternative avec un seul domaine transmembranaire mais présentant un domaine de fixation von Willebrand A (VWA) (d’après Loewen et Forsyth 2005).

Figure 13 : Topologie membranaire des canaux chlorures ClC. La topologie transmembranaire des hélices 4 à 7 reste encore débattue. Deux modèles, basés sur des résultats discordants sont proposés. Les hélices transmembranaires 9 à 12 forment une importante région hydrophobe (d’après Mindell et al., 2001).

40

Les hCLCA étant présent dans les voies aériennes CF, leur activation pourraient constituer

une alternative à la sécrétion de Cl- AMPc-dépendante défectueuse dans ces tissus (Loewen et

Forsyth 2005).

Des canaux chlores appelés ClC, et ressemblant à des canaux voltage-dépendants ont

été initialement découverts chez la torpille (Waldegger et al. 2000). Des études de

cristallographie aux rayons X chez des procaryotes ont montrés que les canaux ClC forment

des dimères (Dutzler et al. 2002) dont chacune des sous-unités possède son propre pore et est

constituée de 18 hélices-α (Dutzler et al. 2004; Jentsch et al. 2005). Estevez et al. ont

démontré que la structure des CLC bactériens pouvait être extrapolée aux ClC des

mammifères (Estevez et al. 2003). A ce jour, 9 gènes codant pour les ClC ont été découverts

chez l'homme (Babini et Pusch 2004). Mummery et al. ont démontré par RT-PCR dans une

lignée cellulaire humaine glandulaire pulmonaire (Calu-3) la présence de l’ARNm des ClC-2,

ClC3,ClC-4, ClC-5, ClC-6, ClC-7, ClC-8, ClC-Ka et ClC-Kb (Mummery et al. 2005). La

présence des isoformes ClC-2 et ClC-3 a également été démontrée dans l’épithélium du

poumon fœtal humain dans lequel ils participeraient à la sécrétion apicale de Cl- et la

production du liquide pulmonaire (Lamb et al. 2001). Les ARNm de ClC2, ClC3 et ClC6

ainsi que les protéines correspondantes ont également été observés dans le poumon adulte

humain (Lipecka et al. 2002). Lipecka et al. ont démontré que ClC2 était exprimé à la face

apicale des cellules ciliées bronchiques humaines, semblant même se superposer avec CFTR

(Lipecka et al. 2002). Malgré leur appartenance à la famille des canaux dépendants du

voltage, les canaux ClC-2 et ClC-3 pourraient être régulés par la baisse du pH extracellulaire

et par l’augmentation du volume cellulaire (Waldegger et al. 2000 ; Jentsch et al. 2002).

L’étude des différents canaux Cl- présents dans la membrane apicale des cellules épithéliales

41

pourrait permettre d’activer d’autres voies de passage du Cl- chez les patients

mucoviscidosiques dont le canal Cl- CFTR est défectueux.

Le potassium (K+) intervient dans l’établissement de la ddp au travers de la membrane

basolatérale (et apicale indirectement) des cellules épithéliales. La présence dans la membrane

de la pompe Na+/K+/ATPase concentre les ions K+ à l’intérieur de la cellule. Ces ions peuvent

ressortir passivement de la cellule via des canaux K+ localisés à la membrane basolatérale de

la cellule. Clarke et al. ont montré, par des mesures de flux radio-isotopiques et des électrodes

intracellulaires que certaines préparations de cellules épithéliales nasales en réponse à l'ATP

pouvaient sécréter du K+. Les auteurs ont alors suggéré l'existence d'un canal K+ activé par

l'ATP et situé à la face apicale des cellules (Clarke et al. 1997).

Al-Bazzaz et al. ont démontré dans les voies aériennes proximales humaines

l'existence d'autres types de protéines intervenant dans les transports d'ions : les échangeurs

Na+/H+ et Cl-/HCO3- (Al-Bazzaz et al. 2001). Dans les cellules épithéliales nasales, il a été

montré l'existence de canaux cationiques non sélectifs (Jorissen et al. 1990). Chinet et al. ont

montré, par la technique du patch-clamp, qu'une partie de ces canaux au moins étaient

sélectifs pour le Na+, sensibles à l’amiloride mais pouvaient être dénaturés par l'excision du

patch (Chinet et al. 1993).

2.1.1 Régulation de l’absorption active de Na+

L'absorption active de Na+ constitue le transport ionique majoritaire dans l'épithélium

des voies aériennes humaines et une fine régulation de ce transport, comme celle du transport

42

de Cl-, est requise pour ajuster le volume de l'ASL. L'absorption de Na+ via ENaC est stimulée

par certains facteurs de l'inflammation. L'épithélium nasal humain possède des récepteurs à la

bradykinine (BK) couplés à la phospholipase C (PLC) qui lorsqu'ils sont activés augmentent

le transport de Na+ (Boucher et al. 1994b). L’exposition de la membrane basolatérale de

cultures de cellules épithéliales nasales humaines à l'ATP stimule l’absorption de Na+ (Mason

et al. 1991). Le mécanisme d'action de la BK et de l'ATP passerait par l'activation de canaux

K+ basolatéraux dont l’augmentation d'activité hyperpolariserait la cellule (figure 14). La

sortie des ions K+ créerait ainsi un gradient électrochimique favorable à l'entrée d'ions Na+ par

le pôle apical des cellules. L'augmentation de Na+ qui en résulte activerait la pompe

Na+/K+/ATPase permettant ainsi la sortie du Na+ de la cellule et aboutissant donc à une

augmentation de l’absorption transépithéliale de Na+ (Boucher et al. 1994b ; Clarke et al.

1992). ENaC pourrait également être régulé par des protéases extracellulaires (Donaldson et

al. 2002 ; Rossier et al. 2004). Des sérines-protéases appelées CAP (« Channel Activating

Protease ») sont capables d'activer ENaC par un mécanisme qui reste actuellement mal connu.

Dans des cellules épithéliales bronchiques humaines, il a été montré qu'un inhibiteur des

sérines-protéases diminuait le courant de base d'environ 30% (Rossier et al. 2004). Une autre

étude a démontré que sur des cultures primaires de cellules épithéliales nasales, l'effet de cet

inhibiteur pouvait être annulé par l'addition de trypsine (Donaldson et al. 2002).

Il existe également des facteurs pouvant inhiber l’activité d’ENaC. Parmi ces

inhibiteurs, se trouvent les agonistes purinergiques (ATP, UTP), qui, s'ils peuvent activer

ENaC lors d'une application basolatérale, seraient susceptibles de l’inhiber lors d'une

application apicale (Boucher et al. 1994b ; Devor et al. 1999 ; Mall et al. 2000).

43

Figure 14 : Régulation des transports de Na+ par l’activation de récepteurs couplés à la PLC. Comparé à l’état de base (A), l’activation de récepteurs basolatéraux par un agoniste (B) entraîne une activation des canaux K+ basolatéraux qui hyperpolarisent l’intérieur de la cellule (le potentiel de la membrane, Va, devient plus négatif) ce qui augmente l’absorption transépithéliale de Na+ (d’après Boucher 1994b).

44

Les récepteurs purinergiques P2Y2, couplés à une protéine Gq, stimuleraient l'hydrolyse du

PIP2 (phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate), via l'activation de la PLC, en DAG

(diacylglycerol) et IP3 (inositol 1, 4, 5-triphosphate). La diminution de la concentration en

PIP2 serait responsable de l'inhibtion d'ENaC plus qu'une action directe de l'IP3/Ca2+ (Yue et

al. 2002 ; Kunzelmann et al. 2005). Kunzelman et al. ont émis l’hypothèse que la régulation

d’ENaC par le PIP2 ferait intervenir un site de fixation du PIP2 sur l’extrémité NH2-terminale

de la sous-unité ß d’ENaC (Kunzelmann et al. 2005).

L'endothéline semble également pouvoir réguler les transports de Na+. Si une étude

réalisée sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques humaines a montré que

l'endothéline n'avait pas d'effet significatif sur l'absorption de Na+ (Blouquit et al. 2003). Une

autre étude, réalisée dans la lignée cellulaire 3T3 d’origine fibroblastique de souris, a montré

que l'endothéline inhibait les transports de Na+ sensible à l’amiloride; cette étude indique

également que cette action passerait par les récepteurs à l'endothéline ETB (Huang et al.

2004). Ces résultats discordants pourraient être dus à l’utilisation d’une lignée cellulaire dans

une étude et de cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques dans l’autre, les lignées

cellulaires et les cultures primaires peuvent en effet présenter des différences de régulation.

ENaC peut également être régulé par des substances affectant son expression plutôt

que son activité. Une étude a démontré que des hormones circulantes, comme la

déxaméthasone, pouvaient augmenter le nombre de canaux ENaC à la surface des cellules

d'une lignée cellulaire pulmonaire humaine (H441) (Sayegh et al. 1999). Récemment, une

étude, par QRT-PCR (réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel), a

démontré que chez des prématurés (26 à 28 semaines de gestation) qui présentent

fréquemment une détresse respiratoire, la quantité d’ARNm d’ENaC était inférieure par

45

rapport aux enfants nés à terme (Helve et al. 2004). Les résultats de cette étude montrent

également que l’expression d’ENaC peut être augmentée par un traitement à la

déxaméthasone. La nicotine pourrait diminuer le nombre de canaux ENaC, par induction de

leur endocytose, et diminuer ainsi l'absorption de Na+ (Klimek et al. 2000). Une étude a

d'ailleurs démontré que les fumeurs présentaient une ddp nasale inférieure par rapport à des

non fumeurs (Knowles et al. 1982). L'état inflammatoire des voies aériennes module

également les transports de Na+. Galietta et al. ont observé sur des cultures épithéliales

bronchiques que l'exposition à l'interféron-γ diminuait l'absorption de Na+ et que ce processus

passait vraisemblablement par une inhibition de l'expression du canal ENaC (Galietta et al.

2000).

La protéine CFTR semble aussi jouer un rôle régulateur sur ENaC (Grubb et al. 1994,

Chinet et al. 1994). Dans les voies aériennes normales, l'augmentation intracellulaire d'AMPc

n'a pas d'effet sur l'absorption de Na+, alors que dans les voies aériennes CF, cette

augmentation induit une activation d'ENaC (Boucher et al. 1986). Dans des expériences de

co-expression de CFTR et d'ENaC, il a été montré que CFTR inhibait le canal ENaC (Stutts et

al. 1995; Jiang et al. 2000). Ismailov et al. ont observé qu'en présence de CFTR, le courant

porté par ENaC était plus faible que lorsque qu'ENaC était exprimé seul (Ismailov et al.

1997). Cependant, si ces différentes études indiquent fortement que CFTR inhibe ENaC, le/les

mécanisme(s) de cette régulation ne sont pas totalement élucidés. Des études ont toutefois

montré qu’une interaction physique existait (Ji et al. 2000; Kunzelmann et al. 1997). Le flux

et l’accumulation d’ions Cl- dans le cytoplasme semblent également essentiels pour une

inhibition d’ENaC (Briel et al. 1998; König et al. 2001). Une étude a montré que dans des

ovocytes de xénope co-exprimant CFTR et ENaC, l’effet inhibiteur de CFTR sur ENaC est

supprimé dans un milieu extracellulaire pauvre en Cl-, suggérant que l’influx de Cl- et

46

éventuellement son accumulation dans le cytosol sont nécessaires pour l’inhibition d’ENaC

(Briel et al. 1998, Kunzelmann 2003). Dans la mucoviscidose, les mutations du gène CF qui

conduisent à l’absence de protéine CFTR fonctionnelle lèvent l’inhibition tonique qu’exerce

CFTR sur ENaC et pourraient soit indirectement inhiber une voie de signalisation inhibitrice

d’ENaC ou bien au contraire permettre l’expression d’une voie de signalisation qui est

normalement réprimée dans les cellules des voies aériennes (Huang et al. 2004).

L’activité du canal ENaC apparaît donc finement contrôlée. Les dysfonctionnements

dans les voies de régulation peuvent conduire, comme dans la mucoviscidose, à une mauvaise

régulation du volume de l’ASL perturbant ainsi la fonction protectrice des voies aériennes.

2.1.2 Régulation de la sécrétion de Cl-

A l’état de base, dans les voies aériennes, il n’y a pas ou peu de transport net

transcellulaire de Cl- dans les voies aériennes humaines proximales. Ceci est dû au fait que

l’ion Cl- est à son équilibre électrochimique, c'est-à-dire que les forces provenant du gradient

de concentration de Cl- et de la ddp de part et d’autre de la membrane apicale se compensent

(Boucher et al. 1994a). Expérimentalement, une sécrétion de Cl- peut être initiée en bloquant

les canaux ENaC (par de l’amiloride). L’inhibition de l’absorption de Na+ entraîne une

hyperpolarisation de la membrane apicale modifiant ainsi les gradients chimiques qui

deviennent favorables à une sécrétion de Cl- (Boucher et al. 1994a). Avec une force

électrochimique motrice favorable, la sécrétion des ions Cl- est proportionnelle à l’état

d’activation de la conductance Cl- de la membrane apicale (Boucher et al. 1994a).

47

La régulation des transports de Cl- passe également par l’action de CFTR sur d’autres

canaux Cl- comme le canal ORCC (Egan et al. 1992 ; Gabriel et al. 1993 ; Schwiebert et al.

1995 ; Schwiebert et al. 1998). Des études de patch-clamp montrent que CFTR module la

sensibilité de ORCC à l’AMPc (Jovov et al. 1995 ; Hryciw et al. 2000). Des expériences

d’expression de CFTR dans une lignée humaine rénale (HEK293T) suggèrent que CFTR

pourrait également inhiber des canaux Cl- dépendant du volume cellulaire (Ando-Akatsuka et

al. 2002).

L’état inflammatoire du poumon peut, comme pour ENaC, modifier les transports de

Cl-. Une étude a en effet démontré que l'interféron-γ entraînait une diminution de l’expression

et de l’activité de CFTR dans des cultures de cellules épithéliales bronchiques humaines

(Galietta et al. 2000). En revanche, des cellules épithéliales bronchiques humaines exposées à

l’'interféron-γ développent, via les CaCC, une réponse significativement supérieure à une

application apicale d’UTP. Cet effet passerait probablement par l’activation des récepteurs

purinergiques (P2Y2) qui entraînerait une augmentation de la concentration du Ca2+

intracellulaire, en favorisant la mobilisation des stocks de Ca2+ intracellulaire ou en stimulant

l’expression des gènes codant pour les CaCC (Galietta et al. 2004). Une hypothèse alternative

serait l’activation, par l’interféron-γ, des canaux K+ basolatéraux, nécessaires dans

l’établissement de la force électrochimique motrice permettant la sécrétion de Cl-. Galietta et

al. ont également démontré que l’interleukine 4 (IL-4), qui joue un rôle important dans les

pathologies pulmonaires, inhibait d’une part l’absorption de Na+ en diminuant fortement le

niveau de l’ARNm de la sous-unité γ et dans une moindre mesure la sous-unité ß d’ENaC, et

stimulait d’autre part le courant Cl- porté par CFTR, probablement en augmentant le niveau

d’ARNm de CFTR (Galietta et al. 2002). L’IL-4 stimulerait également les CaCC par un

processus similaire à celui impliquant l'interféron-γ (Galietta et al. 2002). Enfin les effets de

48

l’IL-4 ont été reproduits par une autre cytokine : l’IL-13 (Galietta et al. 2002, Danahay et al.

2002). Ces agents qui agissent à la fois sur les mouvements de Na+ et de Cl- pourraient

permettre de diminuer l’absorption de fluide voire d’induire une sécrétion de fluide et donc de

faciliter la clairance mucociliaire. Une étude a montré que le TGF-β1 pouvait également

modifier l’activité d’ENaC et de CFTR dans des cellules provenant de polypes nasaux

(Prulière-Escabasse et al. 2005). Dans cette étude, les auteurs ont montré que le TGF-β1

induisait une diminution de l’expression et de la fonction de CFTR. Une étude récente a

démontré que la fumée de cigarette diminuait l’expression et l’activité de CFTR dans des

lignées cellulaires pulmonaires (Cantin et al. 2006). L'endothéline-1 intervient également sur

les transports de Cl-, une étude sur cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques

humaines montre en effet que l'endothéline-1 stimule la sécrétion de Cl-, cet effet impliquant

probablement les récepteurs à l'endothéline de type ETB et la voie de l'AMPc (Blouquit et al.

2003).

La relation entre CFTR et ENaC ne s’arrête pas au simple rôle répresseur de CFTR.

Des travaux ont montré que si la co-onjection de CFTR et d’ENaC dans l’ovocyte de Xénope

diminue la conductance Na+ portée par ENaC, elle augmente au contraire la conductance Cl-

portée par le canal CFTR (Ji et al. 2000). De même que pour la répression de la conductance

Na+ par CFTR, la suractivation de la conductance Cl- par ENaC requiert la présence de la

sous-unité β ou γ (Jiang et al. 2000). L’analyse de ce phénomène en canal unitaire a montré

une augmentation de la probabilité d’ouverture de CFTR, ainsi qu’un nombre de canaux

accessibles accrus (Jiang et al. 2000). Ces résultats ont été confirmés en microscopie

confocale, où le marquage membranaire de CFTR est augmenté de 50% lors de la co-inection

d’ENaC (Jiang et al. 2000).

49

Comme les transports de Na+, les transports de Cl- sont sous le contrôle de multiples

voies de modulation permettant une régulation fine du volume de l’ASL et assurant ainsi le

bon fonctionnement des mécanismes de défense du poumon.

2.2 Au niveau bronchiolaire

Bien que les voies aériennes distales constituent une surface cumulée bien plus

importante que l'épithélium proximal, les études portant sur les transports transépithéliaux

d'ions et d'eau ont été principalement réalisées sur des cellules provenant des voies aériennes

proximales plus faciles d’accès. En effet, la petite taille des bronchioles et la complexité des

structures distales du poumon rendent difficile l’étude de cet étage des voies aériennes. Les

transports d'eau et d'ions transépithéliaux dans les cellules épithéliales bronchiolaires ont en

conséquence fait l'objet de peu d'études.

Des études ont été menées sur les voies aériennes distales chez le mouton (Al-Bazzaz

et al. 1991, 1994, 2001) et chez le porc (Ballard et al. 1992 et 1994 ; Inglis et al. 1996) ; ces

études ont montré qu'à l'état basal les bronchioles de mouton d'un diamètre de 0,6 à 1mm

absorbaient du Na+ (représentant 50 à 65% de l’Isc total) tandis que les plus petites

bronchioles (227µm) sont capables à l'état basal d'une sécrétion de Cl-. En effet, l’utilisation

d’inhibiteurs des canaux Cl- apicaux (DPC : acide carboxylique 2-diphénylamine) ou du co-

transporteur Na+/K+/2Cl- situé dans la membrane basolatérale (bumétanide) induit une baisse

de la ddp d’environ 45%, indiquant que les bronchioles de mouton sont capables d’une

sécrétion de Cl- à l’état basal. Des études réalisées à partir de cultures de cellules

50

bronchiolaire de lapin (cellules de Clara) ont montré une absorption prédominante de Na+ en

conditions basales mais également qu'une sécrétion de Cl- pouvait être induite (Van Scott et

al. 1987; Chinet et al. 1997). Au total, l’ensemble des données obtenues dans les voies

aériennes distales animales met en évidence des similitudes entre les transports ioniques dans

les voies aériennes proximales et distales.

A ce jour, la seule étude portant les transports d'ions et de fluide transépithéliaux sur

des cultures primaires de cellules bronchiolaires humaines non CF a été effectuée par

Blouquit et al. (Blouquit et al. 2002). A partir de fragments de poumon provenant de

lobectomie, les auteurs ont disséqué les bronchioles puis après digestion enzymatique, les

cellules ont été ensemencées sur une membrane de collagène, elle-même reposant sur un

support pouvant être monté dans des chambres dites de Ussing (cf chapitres 6.2.2 et 6.2.3).

Les cultures obtenues sont majoritairement constituées de cellules ciliées et lorsqu'elles sont à

confluence, elles développent une ddp d'environ 1 à 2mV inférieure à celle observée dans des

cultures bronchiques humaines ainsi qu'une faible résistance transépithéliale indiquant un

épithélium très lâche (Blouquit et al. 2002).

L'étude en chambre de Ussing montre qu'à l'état de base, l'addition d'amiloride

entraîne une diminution du courant de court-circuit d'environ 40 % en rapport avec une

absorption active de Na+ (Blouquit et al. 2002). Les additions de forskoline et d'ATP

induisent une sécrétion de Cl-. Ces résultats suggèrent la présence d'ENaC, de CFTR ainsi que

de canaux Cl- activés par l'ATP. Blouquit et al. se sont également intéressés au transport de

fluide à travers l’épithélium bronchiolaire. Les auteurs ont déposé à la face apicale de

bronchioles coupées longitudinalement, 50µl de liquide (DMEM/Ham-F12) qu’ils ont

récupéré après 2h d’incubation (37°C, 5% CO2). Les auteurs ont répété cette opération deux

51

fois avec tout d’abord 50µl de liquide contenant de l’amiloride (10-5M) puis avec 50µl de

liquide contenant de la forskoline (10-5M) et de l’ATP (10-4M). A l’état de base (liquide sans

drogue), les auteurs ont observé une diminution significative (-23,4 ± 10,4 µl/h/cm2) du

volume de liquide déposé à la face apicale. En présence d’amiloride dans le liquide, la

diminution du liquide (-8,8 ± 6,2µl/h/cm2) était significativement inférieure par rapport à

l’état de base. En présence d’amiloride, l’addition de forskoline et d’ATP à la face apicale

entraîne une augmentation significative du volume du liquide (+46,3 ± 8,3µL/h/cm2) par

rapport à l’état de base (Blouquit et al. 2002). Cette étude indique que les transports d'ions

sont accompagnés par des mouvements de fluide transépithéliaux.

Les voies aériennes distales humaines, comme les voies aériennes proximales sont

capables des transports ioniques transépithéliaux intervenant dans la régulation du liquide de

surface des voies aériennes et compte tenu de l’atteinte précoce de cet étage des voies

aériennes dans des pathologies comme la mucoviscidose, l’étude de ces transports et de leurs

régulations demeure nécessaire pour une meilleure compréhension de la pathogenèse de la

mucoviscidose.

52

2.3 Différences et similitudes entre les transports

d’ions et d’eau dans les voies aériennes humaines

proximales et distales

Les voies aériennes distales humaines, comme les voies aériennes proximales, sont

caractérisées par une absorption d’ions et de fluide à l’état basal et peuvent également initier

une sécrétion d’ions et de fluide. Cependant, une étude récente a montré des différences

quantitatives au niveau des transports ioniques entre ces étages des voies aériennes humaines

(Blouquit et al. 2006). Dans cette étude, les auteurs ont étudié en chambres dites de Ussing,

des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires provenant des

mêmes patients minimisant ainsi les variabilités inter-individuelles. Blouquit et al. ont

observé que la ddp et la Rt étaient significativement inférieures dans les cultures

bronchiolaires par rapport aux cultures bronchiques. En revanche, ils n’ont pas observé de

différence de l’Isc de base, ni de l’Isc sensible à l’amiloride et ni de l’Isc sensible à l’ATP

entre les cultures bronchiolaires et bronchiques. A l’inverse, l’augmentation de l’Isc sensible à

la forskoline était significativement supérieure dans les cultures bronchiolaires comparée aux

cultures bronchiques, suggérant que la sécrétion de Cl- dépendante de l’AMPc était supérieure

dans les bronchioles. Des expériences de microscopie confocale ont révélé que la forskoline

entraînait une augmentation de la hauteur de l’ASL, reflétant la sécrétion de fluide, dans les

cultures bronchiques et bronchiolaires. Cette augmentation était significativement supérieure

dans les cultures bronchiolaires (Blouquit et al. 2006).

53

Les sécrétions de Cl- et de fluide plus importantes dans les voies aériennes distales

pourraient compenser, selon certains auteurs, la perte des sécrétions de fluide dues aux

glandes sous–muqueuses absentes dans les voies aériennes distales (Ballard et Inglis 2004).

L’absence de réponse à la forskoline dans les voies aériennes CF pourrait donc avoir des

conséquences plus sévères en terme de sécrétion de fluides dans les bronchioles par rapport

aux bronches.

2.4 Au niveau alvéolaire

Goodman et al. ont mis en évidence, dans le poumon isolé de rat, un transport

actif de Na+ transépithélial alvéolaire en 1987 (Goodman et al. 1987). Une autre étude a

démontré, dans des cultures primaires de pneumocytes de type II (PII) de rat adulte, que les

PII en culture formaient un épithélium polarisé capable de transports actifs d’électrolytes

(Mason et al. 1982). Les progrès techniques ont permis d’obtenir des cultures primaires de PII

humains (Matthay et al. 2003). Ces cellules représentent avec les pneumocytes de type I (PI)

les principales cellules de l'épithélium alvéolaire (Borok et al. 2002 ; Matalon et al. 1999 ;

O'Grady et al. 2003). Les cellules PI plus fines que les cellules PII cuboïdales, recouvrent

environ 95 % de la surface de l'épithélium alvéolaire (figure 15) (Weibel et al. 1989 ; Matthay

et al. 2003). La plupart des études ont été réalisées sur les cellules PII en partie parce qu'elles

sont plus faciles à isoler, mais cependant quelques travaux se sont intéressés aux cellules PI.

54

Figure 15 : Représentation schématique de l’épithélium pulmonaire distal capable de transports d’ions et d’eau (d’après Matthay et al. 2005).

55

Ceux-ci ont mis en évidence la présence d'aquaporines (aquaporine 5), impliquées dans les

transports d'eau (Dobbs et al. 1998), la présence de sous unités de la pompe Na+/K+/ATPase

(Ridge et Sznajder 1997) ainsi que la présence des sous-unités d'ENaC (Johnson et al. 2002,

Borok et al. 2002). Ces résultats suggèrent que les cellules PI peuvent intervenir dans les

transports de NaCl dans le poumon mais ne permettent cependant pas de l'affirmer.

La mise en culture de cellules PII de rat adulte a permis leur étude en chambre dites de

Ussing. Ces études ont montré que les cultures développaient une ddp (-0,2 à -1,0 mV) et que

le courant de court-circuit de base correspondait quasiment entièrement à une absorption

active de Na+ (Cheek et al. 1989, Cott et al. 1986). Cependant, d'autres voies de transports

pourraient également intervenir. En effet, d’autres travaux ont mis en évidence la présence de

co-transporteurs Na+/H+, Na+/phosphate, ainsi que d'autres canaux cationiques non sélectifs

qui pourraient être impliqués dans les transports de Na+ (Brown et al. 1985 ; Clerici et al.

1991 ; Nord et al. 1987).

La présence de CFTR a également été observée dans les PII (Engelhardt et al. 1992;

McCray et al. 1992). Cependant, dans une étude récente, Kreda et al. n'ont pas observé la

présence de protéine CFTR au niveau alvéolaire (Kreda et al. 2005). A l’inverse, Fang et al.

ont montré, par RT-PCR que le niveau d'expression des transcrits de CFTR était similaire à

ceux reportés dans les cellules épithéliales des voies aériennes et des études fonctionnelles ont

apporté la preuve de la présence de canaux Cl- CFTR au niveau alvéolaire (Fang et al.

2006).(cf chapitre 5). Des études récentes ont suggéré que CFTR pourrait jouer un rôle

important dans la régulation AMPc-dépendante de fluide (Fang et al. 2002; Matthay et al.

2005; Fang et al. 2006). Mais le rôle de CFTR dans les transports de Cl- et de fluide reste

56

cependant à élucider, notamment en égard à l'absence de pathologie alvéolaire dans la

mucoviscidose.

Des études sur les cellules alvéolaires fœtales et adultes ont montré la présence de

multiples familles de canaux K+, cependant leur identité et leur fonction restent peu connues

(Matthay et al. 2003). Des canaux K+ voltage-dépendant ont été identifiés dans la lignée

pulmonaire humaine A549 (Koong et al. 1993). Des canaux K+ dépendants de l’ATP ainsi

que des canaux activés par le Ca2+ ont été observés au niveau alvéolaire. Leurs rôles restent

cependant à déterminer, les canaux K+ dépendants de l’ATP pourraient participer au recyclage

des ions K+ nécessaire pour maintenir l'activité de la Na+/K+/ATPase (Matthay et al. 2003).

2.5 Régulation du liquide de surface

La composition du liquide de surface a fait l'objet d'une controverse entre son iso- ou

hypotonicité. Cependant, aujourd'hui la théorie isotonique est admise. La difficulté de mesurer

in vivo les changements de volume de l'ASL et les transferts transépithéliaux d'eau a fait que

les études de la régulation de la composition de l’ASL ont surtout fait appel à des cultures

cellulaires dont les propriétés de transports ioniques sont similaires à celles des tissus natifs

(Welsh 1987). Afin de mesurer les variations de fluide, Smith et al. ont déposé du milieu de

culture recouvert d'une huile minérale limitant ainsi l'évaporation, à la face apicale de cultures

cellulaires et ont récupéré ce liquide après un temps de latence (2 à 24h). Ces expériences ont

mis en évidence une absorption de fluide à l'état basal dans des cultures de cellules

épithéliales provenant de polypes nasaux. Ils ont également montré que cette absorption peut

57

être inhibée par l'amiloride et qu'une sécrétion peut être initiée par addition de forskoline en

présence d'amiloride (Smith et al. 1993). D'autres études ont montré que l'addition apicale

d'ATP ou d'UTP sur l’épithélium des voies aériennes induit une sécrétion d'ASL à la surface

de l'épithélium des voies aériennes et pouvait participer à l'hydratation du mucus pour faciliter

son transport (Tarran 2004). La stimulation de la sécrétion de fluide par la voie de l'ATP

impliquerait deux voies différentes : 1/ l'ATP est dégradé en adénosine par des ecto-

nucléotidases et des ecto-apyrases, situées dans la membrane apicale des cellules épithéliales

(Lazarowski et al. 2000; Picher et al. 2000) ou présentes dans l'ASL (Picher et al. 2003).

L'adénosine stimule ses récepteurs (A2b-R) couplés à une protéine G activant l'adénylate

cyclase qui entraîne une augmentation locale de l'AMPc aboutissant à une stimulation de

CFTR (Tarran 2004). CFTR est positivement régulé par la voie adenosine/AMPc mais cette

voie régule négativement ENaC permettant ainsi la création d'une "driving force" favorable à

la sécrétion de Cl- et de fluide (figure 16). 2/ L'ATP, en se fixant sur les récepteurs

purinergiques (P2Y2) entraîne une cascade de réactions aboutissant à l'activation des canaux

chlores dépendants du Ca2+ et l'inactivation des canaux ENaC par une diminution de la

concentration en PIP2. Il s'ensuit une sécrétion de Cl- et de fluide qui reste cependant limité

dans le temps, probablement à cause d'une internalisation des récepteurs purinergiques

(Matsui et al. 1998 ; Clarke et al. 1999 ; Schwiebert et al. 2001 ; Tarran 2004).

La capacité de l’épithélium de surface à réguler l’ASL pour maintenir le PCL à une

hauteur d’environ 7µm (soit environ la hauteur des cils en extension) est un élément clé dans

la défense des voies aériennes afin de permettre un battement efficace des cils et l’élimination

des particules étrangères piégées dans le mucus. Les mécanismes qui permettent de maintenir

la hauteur du PCL à cette hauteur sont encore mal connus. Cependant, les cils eux-mêmes ne

semblent pas jouer un rôle prépondérant dans ce processus.

58

Figure 16 : Régulateurs potentiels des transports ioniques actifs. A) L’ATP intracellulaire est sécrété en réponse à divers stimuli. Les ecto-nucléotidases (et autres enzymes) (eNT) dégradent l’ATP en adénosine (ADO), qui active les récepteurs A2b (A2b-R) couplés à des protéines G (Gs) et à l’adénylate cyclase entraînant une augmentation intracellulaire locale de l’AMPc. L’AMPc active la protéine kinase A, qui par phosphorylation active CFTR et inactive ENaC. B) L’ATP stimule de façon autocrine, les récepteurs purinergiques (P2Y2-R) couplés à des protéines Gs et à la PLC. L’activation de la PLC entraîne une augmentation de l’IP3 et du Ca2+. L’augmentation intracellulaire en Ca2+.active les canaux chlorures et ENaC est indirectement inhibé par la diminution de la concentration en PIP2 (d’après Tarran 2004).

59

En effet, le volume du PCL dans des cultures de cellules provenant de patients atteint de

dyskinésie ciliaire primitive, maladie dans laquelle les cils sont immobiles, est normal ainsi

que dans les cultures de cellules normales qui n’ont pas encore réalisé la ciliogénèse (Tarran

et al. 2006a).

Tarran et al. ont simulé une augmentation du volume de l’ASL, par le dépôt d’un

excès de liquide, sur des cultures de cellules des voies aériennes proximales humaines non-

CF. Cette augmentation du volume de l’ASL stimule l’absorption active de Na+. Cette

absorption s’arrête lorsque le volume de l’ASL atteint un certain niveau qui correspond

probablement à la hauteur des cils en extension. Si le niveau de l’ASL diminue au-delà de

cette limite, une sécrétion de Cl- peut être initiée permettant de restaurer le volume de

l’ASL.Ces observations suggèrent que la régulation du volume de l’ASL est en partie sensible

à la concentration de médiateurs solubles contenus dans l’ASL, les variations de volume de

l’ASL faisant varier la concentration de ces médiateurs (Tarran et al. 2006a). Parmi ces

médiateurs solubles, les auteurs ont démontré que la régulation du volume de l’ASL était

sensible aux CAP (protéases activatrices de canaux) et à un inhibiteur des CAP (l’aprotinine).

Nous avons vu précédemment qu’ENaC pouvait être activé par les CAP. Selon Tarran et al.,

l’augmentation du volume de l’ASL diluerait les inhibiteurs solubles des CAP, mais ne

diluerait pas les CAP membranaires, suggérant qu’elles sont proches d’ENaC (Tarran et al.

2006a). Lors d’une augmentation de volume de l’ASL, la dilution des inhibiteurs des CAP

permettrait donc aux CAP d’activer ENaC, l’absoprtion d’ions et d’eau résultante pourrait

ainsi résorber l’excès de volume de l’ASL.

La concentration en adénosine jouerait également un rôle dans la régulation du volume

de l’ASL en induisant une sécrétion de Cl- via CFTR. Tarran et al. ont déposé à la face

60

apicale de cellules épithéliales bronchiques en culture 20µl d’une solution de tampon

phosphate salin (PBS) en présence ou non de bumétamide, qui inhibe l’entrée de Cl- à la face

basolatérale. Dans les conditions standards, les auteurs ont observé que les cultures absorbent

l’excès de liquide en 12h et que l’ASL est maintenu à une hauteur de ~7µm. En présence de

bumétamide, la vitesse d’absorption est significativement supérieure durant les six premières

heures de l’expérience et la hauteur de l’ASL est stabilisée à ~3µm (Tarran et al. 2006a).

Tarran et al. ont estimé que le dépôt de 20µL de PBS à la face apicale des cellules diluait la

concentration de l’adénosine dans l’ASL d’environ 20 fois pour atteindre la concentration

d’environ 5nM, les auteurs ayant estimé le volume de l’ASL dans leur préparation à 1µl.

Selon les auteurs, cette concentration serait insuffisante pour activer les récepteurs A2b dont

l’EC50 dans les voies aériennes serait d’environ 1µM (Tarran et al. 2006a). L’augmentation

du volume de l’ASL stimulerait alors l’absorption active de Na+ entraînant ainsi une

diminution du volume de l’ASL. Lorsque le volume de l’ASL diminue la concentration en

adénosine augmente et pourrait alors activer les récepteurs A2b. Cette activation entraînerait

une augmentation de l’AMPc intracellulaire pouvant activer CFTR et ainsi initier une

sécrétion de Cl- permettant de maintenir l’ASL à une hauteur normale.

Clancy et al. ont observé que, dans une lignée cellulaire (COS-7), l’augmentation de la

concentration en AMPc intracellulaire induite par l’adénosine était inférieure de 20% par

rapport à l’augmentation de la concentration en AMPc induite par la forskoline pour une

augmentation de la sécrétion de Cl- via CFTR identique (Clancy et al. 1999). Les récepteurs

de l’adénosine (A1, A2a, A2b et A3) sont tous associés à des protéines G couplées à

l’adénylate cyclase (AC). Cependant, les récepteurs A2a et A2b régulent positivement l’AC

tandis que les récepteurs A1 et A3 la régulent négativement, entraînant respectivement une

augmentation ou une diminution de l’AMPc intracellulaire (Klinger et al. 2002). Huang et al.

61

ont proposé à partir d’expérience de patch clamp sur une lignée cellulaire (Calu-3), que CFTR

et les récepteurs A2b étaient proches et « séquestrés » à la membrane apicale. La stimulation

des récepteurs A2b par l’adénosine entraînerait une augmentation apicale et très localisée de

l’AMPc suffisante pour activer CFTR mais qui n’entraînerait pas d’activation globale des

autres voies de signalisation cellulaires dépendantes de l’AMPc (Huang et al. 2001).

La concentration ATP jouerait également un rôle dans la régulation du volume de

l’ASL en induisant une sécrétion de Cl- via les CaCC. Les voies aériennes sont soumises à des

forces d’étirements (« shear stress ») provoqués par les flux d’air respiratoires et les

mouvements thoraciques. Des études ont démontré que le shear stress entraînait le relargage

de nucléotides dans de nombreux types cellulaires (Burnstok et al. 2002 ; Guyot et al. 2002).

Tarran et al. ont développé, en partant de ce principe de relargage des nucléotides, un système

de culture cellulaire « dynamique » permettant d’appliquer des forces similaires à celles

observées in vivo aux cellules épithéliales bronchiques en cultures (Tarran et al. 2006b). Par

cette technique, les auteurs ont démontré que dans les conditions de cultures expérimentales

dynamiques, la hauteur du liquide périciliaire est de 14µm contre 7µm en conditions de

culture classique ou « statique » dans les cultures de cellules épithéliales non-CF (figure 17).

Tarran et al. ont observé que les conditions de culture expérimentales dynamiques induisaient

une libération d’ATP dans l’ASL. L’ATP ainsi libéré en se fixant sur ses récepteurs P2Y2

associés à des protéines G couplées à la PLC inhibait l’absorption de Na+ et activait une

sécrétion de Cl- dépendante du Ca2+ (cf régulation de transports de Na+ et de Cl-).

Tarran et al. ont observé que la libération d’ATP était principalement due au

changement d’état de stress des cellules (statique < > dynamique) plutôt qu’à l’intensité du

stress. Cette observation est en accord avec les résultats obtenus par Balcells et al. qui ont

62

démontré que la fréquence de l’étirement est plus importante que l’intensité dans divers tissus

dont l’épithélium pulmonaire de rat (Balcells et al. 2005). Ces résultats suggèrent que les

sécrétions de Cl- et d’ASL, in vivo, sont pulsatiles plutôt que constantes. L’augmentation du

volume de l’ASL qui en résulte est contrebalancée par l’absorption de Na+ permettant de

maintenir un volume constant de l’ASL.

En conclusion, dans les voies aériennes proximales humaines normales la

concentration de nucléosides/nucléotides dans l’ASL module l’absorption active de Na+ (via

ENaC) et les sécrétions de Cl- (via CFTR et CaCC) permettant de maintenir le volume de

l’ASL à un niveau approprié pour un battement ciliaire efficace assurant l’évacuation des

pathogènes piégés par le mucus et protégeant ainsi les voies aériennes des infections.

63

Figure 17 : Schéma décrivant les mécanismes de régulation de la hauteur de l’ASL par les transports ioniques actifs. a) L’épithélium non-CF en conditions de culture statique régule les transports de Na+ et de Cl- pour ajuster le volume du PCL d’une hauteur excessive (25µm) à une hauteur physiologique. La zone bleue représente la hauteur du PCL correspondant à la hauteur des cils en extension. b) En conditions de culture dynamique, l’épithélium non-CF, en réponse à une augmentation des nucléotides/nucléosides relargués dans l'ASL, induit une sécrétion de Cl- via CFTR et les CaCC entraînant une hauteur du PCL plus importante (d’après Tarran 2006).

64

3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE3 LA MUCOVISCIDOSE

65

3.1 La maladie

Les premières observations rapportées de la mucoviscidose datent du Moyen Age. A

cette époque, la tradition prédisait une mort imminente pour les enfants dont la peau laissait

un goût salé. A la fin du XVIème siècle, l'autopsie d'un enfant atteint révéla une atteinte

pancréatique. D'autres études montrèrent des observations similaires couplées à des diarrhées.

En 1936, Fanconi identifie l'association fibrose kystique congénitale du pancréas et

bronchectasies ; deux ans plus tard, Andersen fait une description anatomopathologique de la

fibrose kystique. C'est en 1945 qu'apparaît le terme mucoviscidose (pour « mucus visqueux »)

proposé par Farber qui affirme que la maladie résulte d'un mucus anormalement épais.

L'anomalie électrolytique n’est décelée qu'en 1953 avec les travaux de l'équipe de di

Sant'agnese. Ces travaux mettent en évidence un excès de NaCl dans la sueur des enfants

atteints de mucoviscidose. C'est à partir de cette découverte qu’est mis au point le « test de la

sueur », toujours utilisé de nos jours. Le gène, dont la mutation provoque la maladie, est

identifié en 1989 par Riordan et ses collaborateurs (Riordan et al. 1989).

La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies autosomiques récessives létales

dans les populations d'origine européenne. En France, elle concerne une naissance sur trois

mille en moyenne ; entre cinq et six mille personnes sont affectées par la maladie et environ

une personne sur vingt-cinq est porteuse du gène défectueux. La mucoviscidose est une

maladie qui affecte plusieurs organes : le pancréas, l'intestin grêle, les glandes sudoripares,

l'appareil reproducteur,… cependant, l'atteinte pulmonaire représente la principale cause de

morbidité et de mortalité (figure 18) (Davis et al. 1996).

66

Figure 18 : Principaux organes atteints au cours de la mucoviscidose (d’après http://www.planetegene.com).

67

3.2 L'atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose

Les voies aériennes CF sont morphologiquement normales in utero et durant les

premiers mois de la vie, avec toutefois une discrète dilatation des glandes sous-muqueuses

trachéales (De Rose 2002). Cependant, les voies aériennes distales CF, sites primitifs de

l’atteinte pulmonaire, présentent rapidement des bouchons de mucus épais et visqueux, des

bronchiolectasies, une augmentation de l’épaisseur de la paroi bronchiolaire et une diminution

de leur densité (Hamutcu et al. 2002 ; Long et al. 2004). Les voies aériennes des patients CF,

dont la clairance mucociliaire est altérée, sont infectées et colonisées par des pathogènes

comme Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus et surtout P. aeruginosa, qui colonise

les voies aériennes chez la majorité des patients CF. Certains patients présentent également

des infections à Burkholderia cepacia ou à des mycobactéries non tuberculeuses

(Mycobacterium abscessus) (Koehler et al. 2004).

Les infections bronchopulmonaires à P. aeruginosa marquent un tournant évolutif

péjoratif dans l’évolution de la maladie. En effet, elles entraînent une inflammation locale

intense avec libération de cytokines et d’enzymes destructeurs tels que l’élastase neutrophile.

Ces enzymes protéolytiques destinées à lutter contre les pathogènes lèsent également les

cellules épithéliales bronchiques. Infections et inflammations détruisent les tissus pulmonaires

avec formation de bronchectasies et à un stade ultime, évolution vers l’insuffisance

respiratoire conduisant au décès (Chinet 1999).

68

ANOMALIES PROPOSITIONS THERAPEUTIQUES

Mutation génétique Thérapie génique

Diminution de la quantité de protéine

CFTR fonctionnelle

Drogues s'opposant aux effets de

certaines mutations (phénylbutyrate, …)

Anomalie des transports ioniques Amiloride, nucléotides triphosphates, …

Altération de la clairance mucociliaireKinésithérapie, sérum salé

hypertonique, amiloride, UTP

Altération des défenses anti-

microbiennesPeptides anti-microbiens

Infections bactériennes (P. aeruginosa ,

…)

Antibiothérapie (par cures IV, par

aérosols, …)

Inflammation localeAgents anti-inflammatoires (ibuprofène,

corticoïdes, …)

Hypersécrétion de mucus visqueuxDNase, kinésithérapie respiratoire,

Flutter®, …

Destruction du poumon, insuffisance

respiratoireTransplantation pulmonaire

Tableau 1 : Traitements actuels ou en cours d’évaluation de l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose (d’après Chinet 1999).

69

Les progrès obtenus jusqu’à présent sur les mécanismes de l’atteinte pulmonaire de la

mucoviscidose ont permis de proposer de nouvelles voies thérapeutiques, visant à corriger la

protéine CFTR elle-même, ou à lutter contre les conséquences des mutations de cette protéine

(tableau 1).

3.3 Le gène CF et les mutations

3.3.1 Du gène à la protéine

Le gène codant pour la protéine CFTR a été localisé sur le chromosome 7 au locus q31

en 1989 (figure 19). Ce gène d'environ 250 kilobases est constitué de 27 exons qui codent la

chaîne des 1480 acides aminés constituant la protéine CFTR (Riordan et al. 1989). La

protéine existe tout d'abord sous la forme d'un précurseur qui migre avec un poids moléculaire

(PM) d'environ 130 kDa (bande A) sur un gel de SDS polyacrylamide. Ce précurseur est

ensuite partiellement glycosylé (aux positions 894 et 900) donnant une protéine de 135 kDa

(bande B) sensible aux endoglycosidases H. La maturation se termine par l'ajout de chaînes

oligosaccharides complexes résistantes aux endoglycosidases H. La protéine CFTR mature de

PM de 170 kDa (bande C) peut alors être insérée dans la membrane cellulaire.

70

Figure 19 : La protéine CFTR : de sa localisation chromosomique à sa localisation membranaire (d’après Welsh et Smith 1995).

71

Cette insertion dans la membrane cellulaire résulte de la présence de deux groupes de

6 hélices α hydrophobes. CFTR possède deux domaines hydrophiles intracellulaires capables

de fixer et d’hydrolyser l'ATP : les NBD (« Nucleotide Binding Domain »), ainsi qu'un

domaine R (« régulateur ») qui présente des sérines phosphorylables par les protéines kinases

A et C. Ces caractéristiques structurales ont permis de classer la protéine CFTR parmi le

groupe des transporteurs ABC (« ATP Binding Cassette ») (figure 20).

Le domaine régulateur R de CFTR possède 9 sites consensus de phosphorylation par

la protéine kinase A (PKA) (Becq 2003). La phosphorylation est un processus important dans

le contrôle de l'activité de CFTR. Le rôle supposé du domaine R est de permettre l'ouverture

du canal. Sa phosphorylation entraîne des modifications de conformation de la protéine par

interactions avec les domaines NBD, permettant l'ouverture ou la fermeture du canal (figure

21). Une hypothèse concernant le mécanisme de régulation du domaine R est basée sur le

modèle « ball and chain » du canal K+ de type shaker. Dans ce modèle, le domaine R non

phosphorylé est considéré comme inhibiteur et sa phopshorylation par la PKA lèverait des

interactions inhibitrices (entre le domaine R et d’autres domaines de CFTR). Cependant, dans

une étude récente, Chappe et al. ont étudié, sur une lignée cellulaire (BHK), les interactions

intramoléculaires de la protéine CFTR. Les auteurs émettent une autre hyptothèse. Ils

suggèrent que la phosphorylation du domaine R par la PKA stimulerait les interactions du

domaine R avec d’autres parties de CFTR. Ce changement de conformation de la protéine, du

à ces interactions, permettrait l’activation du canal (figure 22) (Chappe et al. 2005).

Il a été montré que la présence d'ATP est nécessaire pour l'ouverture du canal après la

phosphorylation du domaine R (Tabcharani et al. 1991 ; Sheppard et al. 1999).

72

Figure 20 : La protéine CFTR. La structure de cette protéine comporte les éléments suivants : deux domaines transmembranaires avec 6 régions transmembranaires chacun (TM), 2 sites de fixations de nucléotides (SFN ou NBD) et 1 domaine régulateur (R) phosphorylable (d’après Chinet et al. 2003).

Figure 21 : Régulation de CFTR qui à partir d’un état fermé, non phosphorylé, passe à un état ouvert, phosphorylé sous l’action des protéines kinases (PKA) et de Mg-ATP. L’ouverture du canal permet le transport des ions Cl-. L’ATP va jouer un double rôle dans ce mécanisme, à la fois comme cofacteur de la réaction de phosphorylation par les PKA et comme régulateur au niveau des NBD (hydrolysé en ADP + Pi). P : groupement phosphorylés sur les dix sites consensus pour les PKA de la protéine (d’après Becq 2003).

73

Les deux domaines NBD possèdent des sites de fixation et d'hydrolyse de l'ATP et les

ouvertures/fermetures du canal dépendent de l’hydrolyse de l'ATP (Sheppard et al. 1999 ;

Gadsby et al. 1999) (figure 22). Il est admis que l'hydrolyse d'ATP par le NBD1 permet

l'ouverture du canal tandis que l'hydrolyse de l'ATP par le NBD2 ferme le canal (Becq et al.

2003). Récemment, des études biochimiques (Basso et al. 2003 ; Vergani et al. 2005) et de

cinétiques de CFTR (Vergani et al. 2003) ont suggéré que l’ouverture du canal CFTR était

couplée avec la formation d’un dimère NBD1/NBD2 intramoléculaire. La dissociation de ce

dimère, accélérée par l’hydrolyse de l’ATP sur le NBD2, entraînerait la fermeture du canal

(Vergani et al. 2005) (figure 23). Hanrahan et Wioland ont, pour leur part, proposé un modèle

de régulation de l’ouverture de CFTR reprenant des résultats de récentes études

d’électrophysiologie et de marquage radioactif (figure 24) (Hanrahan et Wioland 2004). Ce

modèle propose deux voies distinctes pouvant entraîner l’ouverture du canal CFTR : la voie

dite « hydrolytique » et la voie dite « non hydrolytique ». Dans la voie « hydrolytique », la

fixation d’ATP sur le NBD1, puis sur le NBD2 permettrait l’ouverture du canal et l’hydrolyse

de l’ATP sur le NBD2 sa fermeture. Cette voie serait dépendante du Mg2+. Dans la voie « non

hydrolytique », la fixation d’ATP sur le NBD1 du canal CFTR phosphorylé pourrait permettre

l’ouverture du canal indépendamment de la concentration en Mg2+ et surtout sans hydrolyse

de l’ATP (Hanrahan et Wioland 2004). Ces deux voies de contrôle de l’activation de CFTR

permettraient selon les auteurs de réconcilier les résultats discordants obtenus par différentes

équipes. En effet, selon les conditions expérimentales, l’une des deux voies pourraient être

prédominantes. La voie hydrolytique pourrait expliquer la dépendance à la température de

CFTR dans des expériences de patch clamp (Mathews et al. 1998) alors que la voie « non

hydrolytique » pourrait expliquer la faible dépendance à la température de l’activation dans

des bicouches lipidiques (Aleksandrov et Riordan 1998).

74

Figure 22 : Schéma résumant les effets de la phosphorylation de CFTR sur les interactions du domaine R. Le domaine R phosphorylé interagit avec l’extrémité NH2-terminale, cependant cette interaction est purement spéculative et le récepteur du domaine reste à identifier (d’après Chappe et al. 2005).

Figure 23 : Schéma illustrant le mécanisme de régulation d’ouverture ATP-dépendant de CFTR proposé par Vergani et al. La fixation d’ATP sur les NBD1 (en gris) et NBD2 (en noir) conduirait à des changements de conformation entraînant la formation de dimère intramoléculaire « tête-bêche » NBD1/NBD2. Ce changement de conformation permettrait l’ouverture du canal. L’hydrolyse d’ATP sur le NBD2 entraînerait la dissociation du dimère et la fermeture du canal (d’après Vergani et al. 2005).

75

Figure 24 : Représentation hypothétique des mécanismes d’ouverture de CFTR proposée par Hanrahan et Wioland. Selon ce modèle, l’ouverture « non hydrolytique » du canal phosphorylé aurait lieu spontanément en présence ou en absence de Mg2+ si de l’ATP se fixe sur le NBD1. Le cycle « hydrolytique » aurait lieu en présence d’ATP/Mg sur le NBD2. Les différentes conformations sont représentées par différentes formes. Le turn-over rapide de l’ATP est prédominant sur le NBD2 (d’après Hanrahan et Wioland 2004).

76

3.3.2 Les différentes classes de mutations de CFTR

Il a été identifié plus de 1500 mutations du gène à l'heure actuelle, ces mutations sont

recensées sur le site : www.genet.sickkids.on.ca/cftr. Bien qu'il existe un nombre très

important de mutations, l'une d'entre elles, la mutation ∆F508, représente près de 70% des

allèles mutés et environ la moitié des patients atteints de mucoviscidose sont homozygotes

pour cette mutation. Tous les domaines de CFTR sont touchés par des mutations. On peut

toutefois observer une forte concentration de mutations entraînant une pathologie sévère dans

le NBD1 (cf chapitre 3.3.3) (figure 25). Le nombre important de mutations a rendu nécessaire

leur classification. La classification proposée par Welsh et Smith en 1993, les avait réparties

en 5 classes. Cependant, 1 nouvelle classe de mutation est apparue dans la littérature (figure

26).

Classe 1 : Les mutants de cette classe sont caractérisés par l'absence de production de

la protéine CFTR. Les mutations de cette classe sont dues à un épissage anormal ou à

l'insertion prématurée d'un codon stop entraînant un ARNm instable qui ne sera pas traduit en

protéine. Les mutations non-sens peuvent réduire les niveaux d'expression des ARNm jusqu'à

5% du niveau d'expression normal (Hamosh et al. 1992). Ces mutations entraînent

habituellement des phénotypes sévères, notamment au niveau pulmonaire (dégénérescence

progressive des poumons) et pancréatique (insuffisance pancréatique).

Exemple de mutations de la classe 1 : G542X, W1282X, R553X

Classe 2 : Les mutants de la classe 2 ont une traduction complète, mais produisent une

protéine malformée qui ne passe pas le système de « contrôle » que constitue le réticulum

endoplasmique où elle est séquestrée puis dégradée. (Cheng et al. 1990 ; Thomas et Pedersen

77

1993 ; Ward et Kopito 1994). C'est à cette classe qu'appartient le mutant ∆F508 (délétion

d'une phénylalanine en position 508) qui représente environ 70% des allèles mutés. Tout

comme les mutants de la classe 1, ces mutants entraînent habituellement des formes sévères

de la mucoviscidose puisque la protéine CFTR est absente de la membrane.

Exemple de mutations de la classe 2 : ∆F508, N1303K

La mutation ∆F508 conduit à la formation d’une protéine anormale qui est dégradée à

99% par le complexe ubiquitine/protéasome (Ward et al. 1995). Du fait d’un repliement

inadéquat, la protéine CFTR mutée reste associée aux protéines de contrôle du reticulum

endoplasmique (RE) : la calnexine, les protéines de choc thermique 70 (hsp et hsc 70) et hsp

90 (Pind et al. 1994 ; Strickland et al. 1997 ; Loo et al. 1998). Par exemple, alors que la

liaison entre la protéine CFTR normale et hsp70 se dissocie pour que CFTR poursuive sa

maturation, le complexe CFTR(∆F508)/hsp70 reste associé dans le réticulum endoplasmique

pour y être dégradé. Une étude récente vient de montrer dans la lignée cellulaire CF d’origine

épithéliale pulmonaire CF15 (∆F508/ ∆F508), que la diminution et le maintien d’un faible

concentration de Ca2+ dans le RE, inhibait l’interaction CFTR/calnexine et restaurait un

transport de Cl- AMPc-dépendant, traduisant la normalisation de la maturation de CFTR

(Norez et al. 2006). La conformation anormale de la protéine mutée n’abolit pas

complètement sa capacité à transporter les ions Cl- (Li et al. 1993 ; Dormer et al. 2005). En

effet, des expériences d’expression hétérologue ont montré que le mutant ∆F508 pouvait

répondre à une stimulation par l’AMPc. Cependant, si la conductance unitaire n’apparaît pas

modifiée, les temps de fermeture semblent trois à quatre fois plus longs par rapport à la

protéine sauvage (Dalemans et al. 1991). Une autre équipe a montré, dans des cellules

nasales, que des patients CF homozygotes ∆F508 pouvaient posséder une activité résiduelle

de CFTR (Sermet-Gaudelus et al. 2002).

78

Ces patients présentaient une atteinte pulmonaire moins sévère que ceux ne possédant

pas cette activité. Le mutant ∆F508 apparaît donc fonctionnel quand il est normalement inséré

dans la membrane, mais la mutation ∆F508 est responsable d’une modification des

caractéristiques biophysiques du canal.

Classe 3 : Les protéines CFTR mutées de cette classe parviennent à la

membrane mais présentent des défauts de régulation notmamment par la protéine kinase A

(PKA). Cette classe de mutation entraîne habituellement des phénotypes sévères associés à

des insuffisances pancréatiques. Les mutations de cette classe peuvent interférer avec la

liaison et l’hydrolyse de l’ATP ainsi qu’avec la phosphorylation du domaine R.

Exemple de mutations de la classe 3 : G551D, G1244E

La protéine CFTR comportant la mutation G551D, la seconde mutation en fréquence,

est correctement adressée à la membrane mais la phosphorylation par la PKA n’entraîne pas

l’ouverture du canal. Des études biochimiques ont montré que le NBD1-G551D avait une

activité ATPase fortement réduite par rapport au CFTR sauvage (Howell et al. 2000). Dans le

cadre de la mutation G551D, c’est uniquement la liaison de l’ATP au NBD1 qui est affectée

puisque le domaine R est normalement phosphorylé (Chang et al. 1993).

Classe 4 : Les protéines CFTR mutées de cette classe sont insérées dans la membrane,

sont régulées normalement par la PKA mais présentent une diminution de la conductance aux

ions Cl- ainsi que des caractéristiques de cinétique altérées (Sheppard et al. 1993). Ces

mutations sont souvent retrouvées dans des régions qui forment le pore, ce qui explique la

modification du flux Cl-. Ces mutations sont généralement associées à des phénotypes moins

sévères.

79

Exemple de mutations de classe 4 : R117H, R234P, R334W

Classe 5 : Les mutations de la classe 5 ont pour conséquence de diminuer le nombre de

protéine CFTR fonctionnelle à la membrane. Elles sont principalement dues à des mutations

dans le promoteur et dans les introns qui contrôlent l'épissage des ARNm. Ces mutations

altèrent la stabilité de l’ARNm ou la maturation protéique. Les mutations de classe 5

entraînent habituellement des phénotypes modérés.

Exemple de mutations de classe 5 : A455E, P574H

Classe 6 : Les mutations de la classe 6 sont caractérisées par une altération des

fonctions régulatrices de CFTR. Ces mutations provoquent habituellement des phénotypes

modérés.

Exemple de mutations de la classe 6 : Q1412X

Si la totalité de la protéine CFTR peut être affectée par des mutations, la présence de

deux mutations en cis a également été observée. Une étude a montré que la présence de deux

mutations en cis, R347H et D979A associées habituellement associées à des phénotypes

modérés, pouvait entraîner un phénotype sévère (Clain et al. 2001). Selon les auteurs, les ces

doubles mutations en cis pourraient contribuer à la variabilité des phénotypes observés dans la

mucoviscidose.

80

Figure 25 : Distribution des mutations en fonction des domaines de CFTR. (DTM1 et 2 : domaine transmembranaire 1 et 2, SFN 1 et 2 : site de fixation des nucléotides 1 et 2, R : domaine régulateur) (d’après http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/resource/fig2.html).

Figure 26 : Différentes classes de mutations de CFTR (d’après http://www.123bio.net).

81

3.3.3 Corrélation génotype/phénotype

Plusieurs études ont montré que l’atteinte pancréatique dans le cadre de la

mucoviscidose, était corrélée au génotype (Merlo et Boyle 2003). Les mutations des classes 1,

2 et 3 sont habituellement associées à des insuffisances pancréatiques tandis que les mutations

de classe 4 et 5 provoquent des atteintes pancréatiques moins sévères (Zielenski 2000).

Cependant, le génotype ne permet généralement pas de prédire le degré de l’atteinte

pulmonaire (Merlo et Boyle 2003). Les mutations des classes 1,2 et 3, qui représentent 90%

des mutations dans la population américaine, sont associées à des atteintes pulmonaires

habituellement sévères mais avec de notables exceptions.

Toutefois, les mutations A455E (mutation de classe 5) et R117H (mutation de classe

4) sont clairement associées à l’état de la fonction pulmonaire. L’analyse de 33 patients

hétérozygotes composites ∆F508 / A455E a révélé une atteinte moins sévère de la fonction

pulmonaire (volume maximal expiré en une seconde, VEMS et capacité vitale forcée, CVF) et

un taux de colonisation par P. aeruginosa réduit par rapport à des homozygotes ∆F508 issus

de la même population (Gan et al. 1995). Une étude similaire portant sur 9 hétérozygotes

composites ∆F508 / A455E et 5 homozygotes ∆F508 canadiens, a abouti aux mêmes

conclusions (DeBraekeleer et al. 1997). Entre 1992 et 2002, De Gracia et al. ont étudié la

CVF et le VEMS chez 120 malades adultes atteints de mucoviscidose (De Gracia et. al 2005).

Les auteurs ont séparé les malades en 2 groupes en fonction de la présence (mutation de

classe 3, 4 ou 5) ou non (mutation de classe 1 ou 2 sur chaque chromosome) de la protéine à

la membrane. Les patients ayant des mutations de classe 1 ou 2 présentaient une baisse

significative de la fonction pulmonaire, des risques accrus de développer une pathologie

pulmonaire sévère et une espérance de vie inférieure par rapport aux patients ayant au moins

82

une mutation de classe 3, 4 ou 5. Cette étude suggère que la sévérité de l’atteinte pulmonaire

est (grossièrement) corrélée à la classe de mutation de CFTR.

Cependant, il a été démontré des variabilités dans la sévérité de l’atteinte pulmonaire

chez des patients mucoviscidosiques présentant le même génotype pour CFTR. Les facteurs

environnementaux ont été soupçonnés d’être responsables de ces variations. Cependant, les

études réalisées sur l’impact de ces facteurs environnementaux comme la nutrition, le statut

tabagique (in utero, actif ou passif), le statut socio-économique ne permettent pas d’expliquer

les variations observées dans l’atteinte pulmonaire chez des patients porteurs de la même

mutation de CFTR (Merlo et Boyle 2003). De plus, des études portant sur des jumeaux

monozygotes et dizygotes, ont révélé une plus grande concordance de l’atteinte pulmonaire

chez les jumeaux monozygotes par rapport aux jumeaux dizygotes (Mekus et al. 2000). Ces

études suggèrent que la sévérité de l’atteinte pulmonaire pourrait être modulée par des

facteurs génétiques secondaires plutôt que par la seule mutation de CFTR. Ces facteurs

génétiques sont appelés « gènes modificateurs ».

3.3.4 Les gènes modificateurs

Dans les maladies monogéniques, comme la mucoviscidose, des « gènes

modificateurs » pourraient jouer un rôle important dans l’expression clinique de la maladie.

Les produits des gènes modificateurs peuvent affecter l’épissage, la transcription, la

traduction, le trafficking, la glycosylation mais aussi, la dégradation ou la sécrétion de la

protéine mutée (Sontag et Accurso 2004). Cependant, les gènes modificateurs peuvent

également réguler d’autres phénomènes, indépendamment de la protéine comme

83

l’inflammation, la fibrose ou les transports ioniques,… L’identification des gènes

modificateurs potentiels repose aujourd’hui sur l’étude des SNP (« single nucleotide

polymorphisms »). Les SNP sont des variations d’une simple paire de base ; elles représentent

les variations les plus fréquentes du génome humain. Des SNP pouvant interférer dans le

phénotype des maladies ont été localisés dans le promoteur (modification de la transcription),

dans un exon (modification de la structure ou de la fonction de la protéine) ou dans un intron

(modification de l’épissage) (Brookes 1999).

Plusieurs gènes modificateurs ont été identifiés par leur influence sur le phénotype de

l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose. La MBL (« mannose binding lectin ») est une

composante importante du système immunitaire inné. La MBL participe au processus de

phagocytose des bactéries en reconnaissant le mannose à la surface des bactéries et en

activant la voie du complément. Quatre études ont montré que les patients homozygotes pour

la forme sauvage du MBL (notée MBL2-A) avaient une fonction pulmonaire

significativement supérieure par rapport aux patients possédant un allèle variant (MBL2-B, C,

D). Chacune de ces formes, conduisant à une diminution de la concentration en MBL, est

notée MBL2-0 (Slieker et al. 2005). Deux études ont montré que les patients MBL2-0 étaient

plus fréquemment colonisés par P. aeruginosa pour l’une (Gabolde et al. 1999) et B. cepacia

pour l’autre (Garred et al. 1999) par rapport aux homozygotes MBL2-A, cependant ces

résultats n’ont pas été confirmés par les deux autres études (Davies et al. 2004 ; Yarden et al.

2004). Néanmoins, ces études suggèrent que la MBL2 est un gène modificateur pouvant

moduler l’atteinte pulmonaire au cours de la mucoviscidose.

Contrairement à d’autres maladies inflammatoires des voies aériennes comme

l’asthme, la concentration en NO (monoxyde d’azote) dans l’air exhalé des patients

84

mucoviscidosiques est inférieure par rapport aux sujets sains contrôles (Thomas et al. 2000 ;

de Winter-de Groot et Van der Ent. 2005). Le NO est produit par les NOS (NO synthase, cf

chapitre 7). Une étude a montré qu’une répétition importante de la séquence nucléotidique

AAT dans le gène de la NOS-1 était corrélée avec une faible concentration en NO dans l’air

exhalé ainsi qu’à une plus forte susceptibilité aux infections par P. aeruginosa et A. fumigatus

(Graseman et al. 2000, Davies 2005). Graseman et al. ont également montré un lien entre le

polymorphisme de la NOS-3 (G847T), une plus forte concentration en NO dans l’air exhalé et

une sensibilité aux infections par P. aeruginosa diminuée, mais cette relation n’a été observée

que chez des sujets de sexe féminin (Graseman et al. 2003). Texereau et al. ont étudié chez 59

patients CF le nombre de répétitions du motif GT sur chacun des allèles de la NOS-1. Cette

équipe a montré que la diminution du VEMS était significativement inférieure chez les

patients qui possèdaient plus de 27 répétitions du motif GT sur les 2 allèles de la NOS-1 par

rapport à ceux qui ne possédaient pas ces répétitions ou seulement sur un seul allèle (Texereau

et al. 2004). D’après ces études, il apparaît donc que le gène de la NOS-1 serait un gène

modificateur (Slieker et al. 2005) alors que le gène de la NOS-3, selon certains auteurs, serait

plus dépendant de gènes modificateurs que directement impliqué comme modificateur lui-

même (Davies et al. 2005).

Les récepteurs β2 adrénergiques (β2AR) activés stimulent l’activité de l’adénylate

cyclase (AC) entraînant la formation d’AMPc pouvant activer par exemple CFTR. Le gène

codant pour le β2AR est hautement polymorphique et l’influence de ces allèles sur l’asthme

nocturne ou l’obésité a été démontrée (Merlo et Boyle 2005). Un variant très répandu (allèle

R16G) favorise la désensibilisation des β2AR après fixation du ligand. Une étude a montré

par PCR que les patients CF qui possédaient au moins une copie de l’allèle R16G,

85

présentaient un VEMS significativement inférieur par rapport aux patients homozygotes pour

l’allèle R16 (Buscher et al. 2002).

Plusieurs études ont tenté de déterminer l’influence de gènes modificateurs sur la

réponse inflammatoire. Le système HLA (human leukocyte antigène) représente un groupe de

gènes qui codent pour des protéines présentatrices d’antigène. L’efficacité de la réponse

immunitaire est dépendante en partie de ce système. La région HLA est l’une des plus

variables du génome humain. Certains allèles semblent associés à des maladies auto-

immunes, à l’asthme ou à des allergies (Davies 2005 ; Slieker et al. 2005). Une étude a

reporté que les patients CF porteurs de l’allèle HLA-DR7 avaient des voies aériennes plus

fréquemment colonisées par P. aeruginosa ainsi qu’une augmentation du niveau d’IgE par

rapport aux patients porteurs de l’allèle HLA-DR4 (Aron et al. 1999).

Le TNF-α et le TGF-β sont des cytokines pro-inflammatoires dont le polymorphisme

des allèles semble également impliqué dans la sévérité de l’atteinte pulmonaire. Le TGF-β

possède également des propriétés anti-inflammatoires et en particulier module dans

l’épithélium des voies aériennes la prolifération des fibroblastes. Une étude a montré chez des

patients CF homozygotes ∆F508, que le polymorphisme TGF-β (T869C) était associé à une

diminution de la production de TGF-β1, et d’un ralentissement de la dégradation de la

fonction pulmonaire (Arkwright et al. 2000). Les études sur le TNF-α, ont montré que le

polymorphisme TNF-α (G308A) dans la région promotrice du gène augmentait la production

de TNF-α. Les patients CF possédant cet allèle ont révélé des fonctions pulmonaires

significativement plus altérées que chez les patients CF non porteur de cet allèle (Hull et al.

1998 ; Slieker et al. 2005).

86

Le polymorphisme d’autres gènes (gluthation-S-transférase, enzyme de conversion de

l’angiotensine 1, α1-anti-trypsine, CLC-2,…) semble également être capable d’influencer la

sévérité de l’atteinte pulmonaire (tableau 2). Des études comprenant un grand nombre de

patients CF sont actuellement menées afin d’identifier de nouveaux gènes modificateurs et

d’étudier les possibles interactions entre les gènes modificateurs et leurs impacts sur

l’expression de la mucoviscidose (Merlo et Boyle 2003). Si les mutations de CFTR de classe

1 et 2 semblent associées à une atteinte pulmonaire plus sévère par rapport aux mutations des

autres classes, le polymorphisme de certains gènes modificateurs semblent également jouer un

rôle important.

87

Gène n Polymorphisme VEMS Radiographie de la poitrine

P.

aeruginosa

B.

cepacia Mortalité

149 A/0 + X/Y - 0 ++ ++ 558 A/0 + X/Y - 0 0 164 A/0 - 0

MBL

179 A/0 + X/Y - 0 75 AAT n>12 0 ++ 40 AAT n>12 0 ++ NOS1 59 GT n>27 + 0 0

NOS3 70 894G/T 0 +a 215 M/S, Z 0 ++ 269 M/S, Z 0 157 M/S, Z + 0 0 0 79 M/S, Z 0

716 M/S, Z 0 + 0 0 716 1237G/A 0 0 0 0

AAT

124 1237G/A + ++ - 98 DR4 -/+ 0 -

HLA-II 98 DR7 -/+ 0 +

TNF-α 53 -308G/A - 0 0 GST M1 53 A, B/0 0 - 0 GST M3 146 A/B + 0 TGF β1 171 869 T/C + 0 0 0

ACE 261 D/I + 0 0 0 β2AR 126 16 R/G - 0

CLC-2 31 variable 0 Tableau 2 : Gènes modificateurs potentiellement impliqués dans l’expression clinique de l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose. N : nombre de patients, VEMS : volume maximal expiré en une seconde ; MBL : mannose binding lectin, NOS1 et 3 : nitric oxide synthase 1 et 3, AAT : α1-antitrypsine, HLA : human leukocyte antigen, TNF-α : tumor necrosis factor α, GST : gluthation S-transférase, TGF- β1 : transforming growth factor β1, ACE : enzyme de conversion de l’angiotensine 1, β2AR : récepteur β2 adrénergique, CLC-2 : canal Cl- 2. Symboles : ++ : association très positive (p<0,01), + : association positive (p<0,05), 0 : pas de relation significative, - : association négative (p<0,05). a chez les sujets féminins seulement (d’après Slieker et al. 2005).

88

3.4 CFTR

3.4.1 Fonctions de CFTR

Canal ionique : Des études menées sur des protéines CFTR recombinantes ont

rapidement montré que la protéine CFTR était un canal Cl-. En effet, l’expression de CFTR

dans des lignées cellulaires (HeLa, CHO, NIH 3T3) ne l’exprimant pas de manière endogène

ont permis de montrer l’apparition d’une conductance Cl- en présence d’agoniste de l’AMPc

(Drumm et al. 1990 ; Rich et al. 1990 ; Rommens et al. 1991 ; Kartner et al. 1991). Des

études similaires réalisées avec le mutant CFTR ∆F508 ont démontré que l’expression de la

protéine mutée n’entraînait pas de conductance Cl- (Rich et al. 1990 ; Anderson et al. 1991a).

Une étude d’Anderson et al. a permis d’affirmer que CFTR était bien un canal Cl- : par

mutagenèse dirigée, les auteurs ont observé qu’en modifiant certains résidus constituant le

pore, la sélectivité du canal pour les ions Cl- était altérée, démontrant ainsi que la conduction

des ions Cl- s’effectuait par le canal CFTR (Anderson et al. 1991b).

Rôle régulateur : Il a été montré qu'en plus de sa fonction de canal Cl-, CFTR exerçait

un rôle régulateur sur d'autres protéines. Bien avant le clonage du gène CF, de nombreuses

anomalies avaient été répertoriées au sein des épithéliums. Parmi celles-ci, figure la régulation

altérée d’un autre type de canal Cl- : le canal ORCC (Egan et al. 1992). Une hyperabsorption

de Na+ a également été démontrée au sein de l'épithélium des voies aériennes (Knowles et al.

1981; Boucher et al. 1986; Chinet et al. 1994). Ces découvertes ont permis de supposer puis

de confirmer le rôle régulateur de CFTR sur d'autres canaux (cf 2.1.1 et 2.1.2) (figure 27).

89

Nous avons vu dans les chapitres 2.1.1 et 2.1.2 que CFTR et ENaC étaient capables de

se réguler mutuellement. La formation de complexes macromoléculaires de signalisation

semble intervenir dans ces mécanismes de régulation. L’extrémité C-terminale de CFTR

contient un domaine PDZ. Les domaines PDZ sont constitués de 80 à 100 acides aminés qui

interviennent notamment dans les interactions protéine-protéine (Guggino et Stanton 2006).

Le domaine PDZ de CFTR interagirait avec le domaine PDZ-1 de la protéine NHERF1

(Na+/H+ exchanger regulatory factor isoform-1). La protéine NHERF1 contient également un

domaine PDZ-2, qui interagirait avec la protéine YAP-65 (Yes associated protein 65kDa).

Celle-ci pourrait interagir par un domaine « WW » (région de 35 à 40 acides aminés

caractérisée par la présence de 4 acides aminés particulièrement conservés dont 2

tryptophanes) avec le domaine « PY » de l’extrémité C-terminale des trois sous-unités de la

proteine ENaC (figure 27) (d’après Guggino et Stanton 2006).

Récemment, une étude incluant 3 laboratoires indépendants ont cependant remis en

cause l’inactivation d’ENaC par CFTR dans des ovocytes de xénope (Nagel et al. 2005). Ces

3 équipes ont obtenus les mêmes résultats indépendamment et expliquent leurs résultats

discordants par les conditions expérimentales d’enregistrement des autres études pouvant

simuler une inhibition d’ENaC par CFTR. Selon les auteurs, les conditions expérimentales de

patch-clamp pourraient également expliquer pourquoi CFTR semble interagir avec les autres

transporteurs électrogéniques, canaux et transporteurs (Nagel et al. 2005). Cependant ces

résultats restent à être confirmés ou infirmés dans d’autres systèmes d’expression que les

ovocytes de Xénope.

90

Figure 27 : NHERF1 permettrait l’interaction CFTR/ENaC et faciliterait la régulation mutuelle de ces deux canaux ioniques. Les interactions entre CFTRet ENaC pourraient impliquer un complexe dynamique de signalisation contenant des protéines à domaine PDZ et des protéines kinases. CFTR se lierait avec le domaine PDZ-1 de NHERF1 (Na+/H+ exchanger regulatory factor isoform-1). YAP-65 (Yes associated protein 65kDa) interagirait avec le domaine PDZ-2 de NHERF1. Le domaine « WW » de YAP-65 interagirait avec le domaine « PY » des trois sous-unités de la protéine ENaC (une seule sous-unité représentée). Le domaine SH3 (Src homology 3) de YAP-65 pourrait interagir avec la tyrosine kinase c-YES (membre de la famille des kinases c-Src). c-SRc étant un inhibiteur puissant d’ENaC, il serait possible que c-YES participe à l’inhibition de l’activité d’ENaC par CFTR (d’après Guggino et Stanton 2006).

91

CFTR pourrait également intervenir dans le métabolisme des lipides (Mehta et al.

2005), dans le contrôle des flux de glutathion dans les cellules épithéliales des voies aériennes

(Kogan et al. 2003 ; Hudson et al. 2004). D’autres fonctions régulatrices de CFTR qui avaient

été suggérées, comme le relargage d’ATP (Reisin et al. 1994 ; Braunstein et al. 2001) ou

l’acidification des organelles intracellulaires (Barasch et al. 1991) ont été remises en

questions par d’autres études (Reddy et al. 1996 ; Bradbury et al. 1999).

3.4.2 Expression de CFTR

La mucoviscidose est une maladie qui affecte plusieurs organes. En effet, les

personnes atteintes de la mucoviscidose souffrent d'atteintes pancréatique, hépatique,

intestinale, des glandes sudoripares, de l'appareil reproducteur et de l'appareil respiratoire. Il a

été démontré que la protéine CFTR était exprimée dans chacun de ces organes.

CFTR est exprimé au niveau du pancréas qui est l'un des sites majeurs de l'expression

de CFTR durant le développement (Foulkes et al. 1993). CFTR apparaît principalement

localisé au niveau des cellules épithéliales des canaux intra- et inter lobulaires (Foulkes et al.

1993). L'absence de CFTR au niveau du pancréas aboutit à la destruction du pancréas dû à

l'accumulation d'enzymes digestives. Lorsque la fibrose atteint les îlots de Langerhans, on

peut observer l'apparition d'un diabète insulinodépendant.

Dans le foie, CFTR est exprimé dans l’épithélium des canaux biliaires et de la vésicule

biliaire où la protéine participe à la formation de la bile.

92

Dans les glandes sudoripares, CFTR est exprimé à la face apicale des cellules

canalaires et participe avec le canal ENaC à la réabsorption de NaCl. Dans la mucoviscidose,

l'absence de CFTR associée à une mauvaise régulation d'ENaC, entraîne une réduction de la

réabsorption canalaire de sodium expliquant ainsi le caractère salé de la sueur chez les

patients CF (Becq et al. 2003).

La protéine CFTR est exprimée dans différents épithéliums où elle participe aux

transports d'ions et d'eau ainsi qu'à leur régulation. Au niveau pulmonaire, les résultats

obtenus sur l'expression de CFTR sont contradictoires notamment au niveau des voies

aériennes distales. Nous discuterons de l'expression de CFTR au niveau pulmonaire dans le

chapitre 5.

Toutefois, la protéine CFTR n’est pas exclusivement exprimée dans les tissus

épithéliaux. Des études récentes ont démontré, par immunolocalisation, la présence de CFTR

dans des cellules musculaires lisses de la trachée chez le rat (Robert et al. 2004 ; Vandebrouck

et al. 2006). Selon Vandebrouck et al., l’augmentation en AMPc intracellulaire due à la

stimulation des récepteurs β2-adrénergiques couplés à l’adénylate cyclase, activerait la

protéine CFTR qui pourrait intervenir dans la bronchodilatation (Vandebrouck et al. 2006).

Une étude a également démontré par RT-PCR que la protéine CFTR était présente et

fonctionnelle au niveau des myocytes cardiaques (Hart et al. 1996). CFTR au niveau

cardiaque pourrait être impliqué dans le contrôle de la durée du potentiel d’action. Il a été

montré des modifications post-traductionnelles dans l’expression de CFTR durant certaines

formes de cardiomyopathies (Davies et al. 2004) Toutefois, le rôle fonctionnel et les

conséquences cliniques de ces modifications ne sont pas clairement définis (Duan et al. 2005).

93

La présence de CFTR a également été observée dans le cerveau (Mulberg et al. 1998 ;

Weyler et al. 1999). Weyler et al. ont démontré, par western blot, que la protéine CFTR était

exprimée dans une lignée cellulaire neuronale provenant de l’hypothalamus humain où elle

pourrait moduler les neurosécrétions, notamment celle de GnRH (gonadolibérine ou

gonadotrophin releasing hormon). Selon les auteurs, l’activation de CFTR stimulerait le

trafficking et la sécrétion des vésicules contenant la GnRH.

La protéine CFTR est exprimée dans de nombreux tissus pouvant ainsi expliquer les

atteintes pluri-organiques observées dans la mucoviscidose. Toutefois, l’atteinte pulmonaire

est à l’origine de 90% de la morbidité et de la mortalité de cette maladie.

3.5 Effets des mutations de CFTR sur les mouvements

d'ions et d'eau au niveau des voies aériennes proximales et

distales

Les mutations du gène CF provoquant l'absence ou le dysfonctionnement de la

protéine CFTR à la membrane apicale des cellules épithéliales des voies aériennes entraînent

une réduction de la perméabilité membranaire de ces cellules aux ions Cl- (Riordan 1993 ;

Kopito 1999). Ajouté à ce phénomène, la levée de l'inhibition tonique qu'exerce CFTR sur

ENaC provoque une hyperabsorption de Na+ dans les voies aériennes. De plus l'absence de

CFTR entraîne également des perturbations dans la régulation du canal ORCC.

94

L'hyperabsorption de Na+ et d'eau à l'état basal associée à un défaut de sécrétion des ions Cl-

en réponse aux β–adrénergiques entraînent une diminution de la hauteur du liquide périciliaire

(Chinet 2003) (figures 28 et 29). L'hyperabsorption de Na+ a été mise en évidence par la

perfusion d'amiloride qui fait chuter la ddp nasale de 75 à 90 % contre seulement environ 55

% chez les personnes non mucoviscidosiques. La mesure de la ddp nasale, significativement

plus élevée chez les personnes mucoviscidosiques (Knowles 1981), peut d'ailleurs constituer

une alternative au test à la sueur pour diagnostiquer la mucoviscidose (Chinet 1994). La

sécrétion de Cl- activée par la voie de l'AMPc est absente ou fortement réduite dans les voies

aériennes mucoviscidosiques tandis que la sécrétion de Cl- Ca2+-dépendante stimulée par

l'ATP est normale ou augmentée (Knowles 1991).

Ces altérations des transports ioniques observées dans les voies aériennes proximales,

provoquent une diminution de la hauteur du liquide de surface, altérant la clairance

mucociliaire et offrent ainsi un terrain favorable aux infections bactériennes. Celles-ci

entraînent une réponse inflammatoire qui devient délétère pour le tissu pulmonaire. Dans une

étude récente, Frizzell et Pilewski ont démontré que la surexpression de la sous-unité β du

canal ENaC provoquait une diminution de la hauteur du liquide de surface chez la souris due

à une augmentation de l’absorption active de Na+. Cette diminution était associée à un état

inflammatoire même en l'absence de toute infection, suggérant que l’inflammation peut

résulter en partie des anomalies des transports d’ions et d’eau (Frizzell et Pilewski, 2004).

95

Figure 28 : Transports d’ions et d’eau dans l’épithélium pulmonaire normal et CF. Voies de transport des ions Na+, Cl- et d’eau dans les voies aériennes normales (A) et mucoviscidosiques (C) et transporteurs impliqués dans les mouvements d’ions. Représentation du liquide de surface des voies aériennes avec la couche de mucus, le liquide péricilaire (PCL) et la vélocité normale du mucus dans les voies aériennes normales (B) et représentation de l’ASL dans les voies aériennes CF avec déplétion du PCL, formation de plaques de mucus adhérentes et statiques (d’après Boucher 2004).

Figure 29 : Dysfonctionnements dans la régulation de la hauteur du liquide périciliaire par l’épithélium CF (a) Images de microscopie confocale 0h, 6h et 48h après addition de 20µl de tampon phosphate coloré au dextran rouge Texas sur des cultures de cellules épithéliales non-CF et CF, (b) hauteur moyenne du PCL en fonction du temps dans les cultures non-CF (carrés) et CF (cercles) (d’après Tarran et al. 2005).

96

3.6 Concepts actuels sur la physiopathologie de

l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose

La mise en culture de cellules épithéliales nasales et bronchiques CF et non CF et plus

récemment de cellules épithéliales bronchiolaires CF et non CF ont permis de mieux

comprendre les transports d'ions et d'eau transépithéliaux et notamment l'implication de

canaux ioniques comme ENaC ou CFTR (Yankaskas et al. 1985 ; Randell et al. 2001 ;

Blouquit et al. 2002 ; Blouquit et al. 2006). Ces études ont permis de réaliser des progrès

considérables dans la compréhension de la pathogenèse de la mucoviscidose. De récentes

études viennent encore d'ouvrir de nouvelles perspectives pour une meilleure compréhension

de la régulation de l'ASL. Tarran et al. ont développé un système de culture cellulaire

dynamique (cf chapitre 2.6) (Tarran et al. 2006). Pour rappel, le système de culture

dynamique est censé mimer les mouvements cycliques (« shear stress ») auxquels est soumise

la muqueuse des voies aériennes durant la respiration, mouvements provoqués par les flux

d’air et les mouvements thoraciques dans les voies aériennes, entraînant la libération de

nucléotides pouvant participer à la régulation des transports ioniques. Les auteurs ont appliqué

ce système de culture à des cellules épithéliales CF.

A l’aide de cette technique, Tarran et al. ont démontré que la hauteur du liquide de

surface est de 7 µm dans les cultures de cellules épithéliales CF en conditions de culture

dynamique contre 3 µm en conditions de culture statique (figure 30). Les auteurs ont observé

que les conditions expérimentales dynamiques induisaient la libération d'ATP dans l'ASL.

97

Figure 30 : Schéma décrivant les mécanismes de régulation de la hauteur de l’ASL par les transports ioniques actifs dans l’épithélium CF (a) Dans l’épithélium CF en condition statique, le défaut de régulation de l’absorption de Na+ et l’incapacité d’induire une sécrétion Cl- conduit à une diminution de la hauteur du liquide péricilaire (PCL), (b) Dans l’épithélium CF en conditions de culture dynamique, le relargage d’ATP dans le PCL est suffisant pour inhiber l’absorption de Na+ et induire une sécrétion de Cl- via les CLCA et restaurer une hauteur du PCL physiologique (d’après Tarran 2006).

98

Ils ont également observé que la libération des nucléotides était peu dépendante de l’intensité

du stress, en revanche elle semblait liée au changement d’état de stress de la cellule (statique

< > dynamique) (Tarran et al. 2006). L'ATP libéré entraîne une activation des canaux CLCA

ainsi qu'une inactivation des canaux ENaC, favorisant ainsi la sécrétion de NaCl et d'eau.

Cependant, sous l’action d’enzymes (ecto-nucléotidases et apyrases), l’ATP, l’ADP et l’AMP

sont dégradés en adénosine. Or dans les cellules CF, et contrairement aux cellules non-CF,

l’adénosine stimule les canaux ENaC (Boucher et al. 1986). D’après Tarran et al., dans les

cellules CF en conditions expérimentales dynamiques, l’inhibition du canal ENaC par l’ATP

« dominerait » l’activation d’ENaC par la voie de l’adénosine, suggérant une possible

hierarchie des récepteurs purinergiques (Tarran et al. 2006). Selon Tarran et al., cette

sécrétion de Cl- induite par l’ATP pourrait expliquer en partie les différences observées in

vitro sur des cultures de cellules épithéliales bronchiques CF (absence totale de transport de

mucus) (Matsui et al. 1998 ; Tarran et al. 2001) et les données in vivo chez de jeunes patients

CF (transport de mucus réduit mais existant) (Robinson et al. 2002).

Outre les altérations des transports ioniques (cf chapitre 3.5), il a été observé que les

voies aériennes des personnes atteintes de mucoviscidose étaient fréquemment infectées par

des pathogènes tel que P. aeruginosa. En effet, plus de 80 % des sujets atteints de

mucoviscidose ont les voies aériennes colonisées par ce pathogène. Deux types de

mécanismes son invoqués. 1/ Des mécanismes non spécifiques à P. aeruginosa et valables

pour toutes les bactéries. La diminution du volume du liquide de surface des voies aériennes

CF entraîne une altération de la clairance mucociliaire, augmentant ainsi le temps de présence

des pathogènes, leur permettant de léser l'épithélium. Les systèmes de défense non spécifiques

(lysozymes, défensines et NO) semblent altérés dans les voies aériennes de patients CF. La

diminution de l’expression de la forme inductible des NO synthases et de la production de NO

99

(cf chapitre 6) chez les patients CF, pourraient altérer le processus d’élimination non

spécifiques des pathogènes (Chmiel et Davis 2003). 2/ Des mécanismes spécifiques pour

l’infection et la colonisation à P. aeruginosa sont également invoqués. Des études ont montré

que P. aeruginosa est capable de se fixer à des cellules en voie de réparation au niveau de

l'épithélium lésé mais pas aux cellules de l'épithélium intact (De Bentzmann et al. 1996 ;

Plotkowski et al. 1999). D'autres travaux, controversés, suggèrent que P. aeruginosa pourrait

se fixer sur CFTR, au niveau du premier segment extracellulaire de la protéine, en entraînant

ainsi une internalisation du germe et sa destruction avec la cellule (Pier et al. 1996 et 1997).

L'absence de CFTR à la membrane, notamment dans le cas de la mutation ∆F508, perturberait

ainsi ce processus. Selon une autre hypothèse, la modification de la composition biochimique

des mucines chez les patients atteints de mucoviscidose permettrait une adhérence

préférentielle des certains germes comme P. aeruginosa (Carnoy et al. 1993 ; Zhang et al.

1995). Des études ont montré une adhérence plus importante sur les mucines salivaires de

sujets mucoviscidosiques que de sujets non mucoviscidosiques (Carnoy et al. 1993).

Entre autre, la diminution de la hauteur du PCL permettrait également au mucus, et

notamment aux mucines sécrétées MUC5AC et MUC5B, d’entrer en contact avec les mucines

présentes à la surface cellulaire, MUC1 et MUC4 (Knowles et Boucher 2002). Ces

interactions « colleraient » la couche muqueuse à l’épithélium des voies aériennes abolissant

la clairance par la toux. Ces interactions seraient renforcées par le pH acide de l’ASL observé

dans les voies aériennes CF (Boucher 2004). Malgré l’inefficacité de la clairance

mucociliaire, les cellules caliciformes et les glandes sous-muqueuses continueraient à sécréter

des mucines qui entraîneraient la formation de plaques de mucus statiques. L’épaississement

du mucus associé à l’augmentation de la consommation d’O2 de cellules épithéliales CF

créeraient des gradients d’O2 à l’intérieur de la couche de mucus (figure 31) entraînant la

100

formation de zones hypoxiques dans le mucus (Worlitzsch et al. 2002). Selon Worlitzsch et

al., des bactéries comme P. aeruginosa peuvent pénétrer dans la couche de mucus et migrer

vers les zones d’hypoxie (Worlitzsch et al. 2002). Dans ces conditions, la croissance

bactérienne serait ralentie par rapport à des conditions de normoxie. Toutefois, le stress

environnemental (milieu hypoxique) entraînerait une augmentation de la production

d’alginate, un facteur de virulence, par P. aeruginosa. Worlitzsch et al. suggèrent que

l’augmentation de la production d’alginate pourrait participer au passage du phénotype non

mucoïde à un phénotype mucoïde de P. aeriginosa (Worlitzsch et al. 2002).

Les infections bactériennes broncho-pulmonaires récurrentes entraînent une

inflammation locale intense, persistante avec un afflux massif de polynucléaires neutrophiles.

De nombreux facteurs chémo-attractants pour les neutrophiles sont retrouvés à des taux très

élevés dans les sécrétions bronchiques des patients atteints de mucoviscidose, au premier rang

desquels se situe l'interleukine-8 (IL-8). Les neutrophiles peuvent contribuer aux lésions

inflammatoires des voies aériennes par plusieurs mécanismes. Les neutrophiles libèrent des

protéinases, telles que l'élastase ou la collagénase. Ce relargage de protéases créerait des

déséquilibres protéases/anti-protéases qui pourraient également être amplifiés par une

diminution de l'efficacité des inhibiteurs (dégradation, inactivation ou diminution de sécrétion

des anti-protéases) (Meyer et al. 1991). Ces déséquilibres seraient responsables d'une

dégradation protéolytique de la matrice extracellulaire. L'intensité du déséquilibre

élastase/anti-élastase serait directement corrélée à la sévérité de l’atteinte pulmonaire (Bruce

et al. 1985).

101

Figure 31 : Schémas hypothétiques des événements menant aux infections chroniques à P. aeruginosa dans les voies aériennes CF (a) Epithélium des voies aériennes normales, une fine couche de mucus (vert clair) repose sur le liquide periciliaire (blanc). Les voies aériennes normales présentent une clairance mucociliaire efficace (représentée par le vecteur) et la consommation d’O2 est normale (QO2). (b-f) voies aériennes CF. (b) l’hyperabsorption de Na+ entraîne une diminution de la hauteur du liquide périciliaire (flèches verticales) et l’adhérence du mucus à l’épithélium de surface stoppe la clairance mucociliaire (flèche bidirectionnelle). (c) l’hypersécrétion constante de mucus (flèches) entraîne une augmentation de la hauteur de la couche de mucus. L’augmentation de la consommation en O2 génère des zones d’hypoxie dans la couche de mucus (zone bleue dans la barre). (d) P. aeruginosa pénètre dans la couche de mucus et gagne les zones d’hypoxie. (e) Les bactéries P. aeruginosa s’adaptent au milieu hypoxique avec une augmentation de la sécrétion d’alginate et la formation d’un biofilm. (f) Les neutrophiles ne sont pas capables d’éliminer le biofilm bactérien. L’augmentation du nombre de bactéries et la présence des neutrophiles entraînent la formation d’un mucus purulent hypoxique (d’après Worlitzsch et al. 2002).

102

Les infections chroniques entraînent donc une inflammation persistante dans les voies

aériennes CF. Toutefois, certains auteurs se sont interrogés sur le moment d’apparition de

l’inflammation bronchopulmonaire dans l’histoire naturelle de la mucoviscidose. Une étude a

retrouvé une augmentation du nombre des polynucléaires neutrophiles, de la concentration

d’IL-8 et des complexes élastase-α1-antiprotéase dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire

(BAL) d’enfants mucoviscidosiques de 1 à 12 mois, même indemnes d’infections

bronchopulmonaires (Khan et al. 1995). Cependant, ce résultat n’a pas été confirmé par un

autre travail portant sur des enfants mucoviscidosiques âgés de moins de 6 mois (Armstrong

et al. 1997). Dans une étude plus récente, Armstrong et al. ont comparé les lavages

bonchoalvéolaires de 70 patients CF âgés de 1,5 à 71 mois infectés ou non. Les auteurs ont

observé une augmentation de la concentration en IL-10 dans les BAL des patients infectés par

rapport aux patients non infectés. Les auteurs en concluent que l’infection précède et

maintient l’inflammation dans les voies aériennes CF (Armstrong et al. 2005). D’autres

travaux ont montré que les glandes sous-muqueuses CF présentaient une production plus

élevée d’IL-8 par rapport aux glandes non-CF en absence d’infection (Tabary et al. 1998).

Cette équipe a également démontré que le fluticasone propionate, un anti-inflammatoire

stéroidien, pouvait entraîner une diminution de la production d’IL-8 dans les glandes sous-

muqueuses CF (Escotte et al. 2003). Les auteurs ont montré que le fluticasone propionate

entraînait une augmentation de la concentration cytosolique de Iκ-Bα, un inhibiteur du facteur

de transcritpion NF-κB ; facteur qui intervient notamment dans la voie de régulation de gènes

codant pour des cytokines pro-inflammatoires. Dans leur étude, Escotte et al. ont également

montré que le fluticasone propionate entraînait une diminution de la concentration des sous-

unités α et β la kinase IKK, qui intervient dans l’activation de NF-κB. Les auteurs ont émis

l’hypothèse que l’augmentation de l’expression de la kinase IKK, et notament de IKK-β,

pourrait constituer un mecanisme possible pour expliquer la réponse inflammatoire dans les

103

voies aériennes CF. Dans une étude récente, Mall et al. ont observé que la surexpression

d’ENaC réduisait le volume du liquide périciliaire chez la souris (Mall et al. 2004). Les

auteurs ont également observé une inflammation (augmentation du nombre de neutrophiles et

de de la sécrétion de cytokines) en absence de toute infection. Ces observations suggèrent que

les altérations des transports ioniques dans les voies aériennes pourraient engendrer un

processus inflammatoire avant toute infection.

L’inflammation primitive et secondaire aux infections bronchopulmonaires joue un

rôle central dans les manifestations de la maladie en participant aux lésions des voies

aériennes.

3.7 Perspectives thérapeutiques

Après la découverte du gène CF, le développement de molécules capables de moduler

l’activité du canal CFTR normal et muté est devenu rapidement un point crucial dans la

compréhension du rôle physiologique de CFTR mais également dans l'optique de développer

des agents thérapeutiques. Une première génération d'activateurs de CFTR a été identifiée à

partir des études sur les voies de signalisation intracellulaire. Cependant, s'il a été démontré

qu'il était possible d'activer le canal CFTR porteur de la mutation ∆F508 à l'aide d'agents

pharmacologiques en 1999, très peu de ces molécules étaient capables de restaurer les

fonctions de CFTR muté en clinique. Avec le développement de nouvelles techniques (« high

throughput screening »), une seconde génération de composés pouvant activer CFTR et

104

potentiellement utilisable en clinique, est apparue (Chappe et al. 1998 ; Galietta et al. 2001 ;

Ma et al. 2002 ; Noel et al. 2006 ; pour revue Becq 2006).

Le screening de composés cycliques de la famille des benzoquinolizinium (MPB) a

permis de trouver des activateurs de la protéine CFTR normale mais également de la protéine

mutée G551D et de corriger le trafficking de CFTR-∆F508 (Becq et al. 1999 ; Dormer et al.

2001 ; Dérand et al. 2001 ; Stratford et al. 2003). Des études sur les relations

structures/activités à partir de ces composés ont permis d’identifier et de localiser des

groupements importants pour l’activation de CFTR : un groupe OH, un atome de chlore, un

groupement alkyl semblent essentiels pour l’activation de CFTR. Les mécanismes d’action

des composés MPB restent encore à déterminer. Cependant, il s’agirait d’une voie

indépendante de l’AMPc, des phosphatases, des kinases, des phosphodiestérases (Becq et al.

1999). Une interaction directe des MPB avec CFTR semble être à l’origine de l’activation ;

cependant la nature de cette interaction et le site de fixation des MPB restent à déterminer

(Becq et al. 2006).

Récemment, une étude a montré qu’une molécule prescrite dans le traitement de la

maladie de Gaucher, le miglustat (ou NB-DNJ), un inhibiteur de l’alpha-1,2-glucosidase,

permettait de restaurer une sécrétion de Cl- dans des lignées cellulaires épithéliales CF ∆F508

d’origine nasale et glandulaire (JME/CF15 et CFKM4). Le NB-DNJ interviendrait au niveau

de l’interaction calnexine/CFTR-∆F508 (Norez et al. 2006). La même équipe vient de

montrer par la technique de patch-clamp et d’efflux d’iodure dans des lignées cellulaires

(Calu-3, CHO), que des dérivés pyrrolo[2,3-b]-pyrazines (dérivés RP) étaient capables

d’activer la protéine CFTR normale et portant les mutations ∆F508 etG551D (Noel et al.

2006). D’après cette étude, les dérivés RP activent CFTR avec une très forte affinité (< 1µM)

105

et par une voie indépendante de l’AMPc. L’activation pharmacologique de la protéine CFTR

mutée semble donc réalisable, toutefois le développement de nouveaux composés mais

surtout la compréhension de la relation structure/activité devront être poursuivis. Ces

molécules peuvent constituer un réservoir important dans l'optique d'un traitement

pharmacologique de la mucoviscidose. Ces composés devront également suivre la voie de

développement en vue d’une application clinique.

Afin d’augmenter le volume de l’ASL, dont la déplétion est à l’origine de l’atteinte

pulmonaire, des études portant sur la restauration du volume du PCL ont été entreprises. La

technique la plus utilisée a été l’inhalation de solutions salines normo ou hypertoniques

devant induire une sécrétion d’eau (Boucher 2004). Si des études ont montré une accélération

de la clairance mucociliaire chez des patients CF (Robinson et al. 1996 ; 1997), l’inhalation

de solutions salines hypertoniques semble avoir des effets limités dans le temps. Récemment,

une équipe a étudié les effets de l’inhalation de 7ml d’une solution hypertonique 2 fois par

jour pendant 48 semaines chez 164 patients CF (Elkins et al. 2006). Cette étude montre que

l’inhalation d’une solution hypertonique sur une longue période améliore la fonction

pulmonaire et diminue la fréquence des exacerbations infectieuses.

Des approches alternatives ont également été développées. Celles-ci consistent à

déposer à la surface des voies aériennes des composés qui ne sont pas activement transportés

et faiblement absorbés (Boucher 2004). Robinson et al. ont montré, in vitro, que le mannitol

pouvait restaurer le volume de l’ASL pendant plusieurs heures. Cependant, la même équipe a

montré que in vivo le mannitol avait une action très limitée dans le temps (environ 20

minutes) sur la clairance mucociliaire (Robinson et al. 1999).

106

Toujours dans l’optique de restaurer le volume de l’ASL, des études ont montré que

l’application de nucléotides triphosphates (par exemple l’UTP ou les dérivés de l’UTP) à la

face apicale de cellules épithéliales nasales en culture, entraînait une inhibition de l’absorption

de Na+ et stimulait une sécrétion de Cl- dépendante du Ca2+ (Knowles et al. 1991 ; Mall et al.

2000 ; Tarran et al. 2006). Le développement d’analogues de ces nucléotides a permis

d’améliorer l’efficacité de ces composés notamment par une meilleure résistance à

l’hydrolyse, comme le composé INS37217 (Yerxa et al. 2002). Ce composé peut être

administré par voie d’inhalation ; lors d’essai de phase I, il a montré qu’il n’était pas toxique.

Des essais de phases III sont en cours testant notamment l’efficacité de ce composé dans

l’amélioration de la fonction pulmonaire chez les malades CF (Boucher 2004).

L’utilisation d’inhibiteur du canal Na+, ENaC, comme l’amiloride, a également

été envisagée. En effet, dans le pseudohypoaldostéronisme (PHA), les canaux ENaC sont

absents et les patients présentent une augmentation du volume de l’ASL qui est compensée

par une accélération de la clairance mucociliaire (Kerem et al. 1999). Cependant, des études

sur les propriétés pharmacodynamiques de l’amiloride ont montré que ce produit avait une

demi-vie relativement courte (20/30 minutes). Une étude clinique a par ailleurs démontré que

l’amiloride n’entraînait pas d’amélioration de la fonction pulmonaire (VEMS, CVF) ou de

diminution de la fréquence des exacerbations chez des patients CF (Graham et al. 1993).

En conclusion, les progrès dans la connaissance de la pathogenèse de la

mucoviscidose ont permis de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Le

développement de nouvelles molécules activatrices de CFTR ou de sécrétions de Cl-

alternatives ainsi que les avancées de la thérapie génique laissent supposer que le traitement

de la mucoviscidose pourrait être amélioré dans les prochaines années. En effet, plus d’une

107

vingtaine d’essais cliniques, portant sur la restauration des transports ioniques, des thérapies

anti-inflammatoire et anti-infectieuse,…, sont actuellement en cours. Ces études sont

recensées sur le site www.cff.org (figure 32).

108

Figure 32 : Etat des lieux des essais cliniques en cours dans le cadre de la mucoviscidose (d’après www.cff.org).

109

4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS4 OBJECTIFS

110

4.1 Etude de l’expression de CFTR dans les voies

aériennes distales humaines

La mucoviscidose est une maladie qui affecte plusieurs organes, cependant c’est

l'atteinte pulmonaire qui est responsable de la grande majorité de la morbidité et de la

mortalité. En effet, les infections bactériennes récurrentes, l'inflammation et l'obstruction des

voies aériennes provoquent à terme la destruction du tissu pulmonaire (cf chapitre 3).

Cependant tous les étages de l'arbre aérien ne sont pas touchés avec la même sévérité,

contrairement aux bronches et aux bronchioles, les alvéoles ne semblent pas jouer un rôle

majeur dans l’évolution de la maladie.

Afin de mieux comprendre la pathogenèse de la mucoviscidose, l’expression et la

distribution de la protéine CFTR dans les voies aériennes ont été étudiées. Dans les voies

aériennes proximales, l’expression de la protéine CFTR est bien renseignée. Des études ont

démontré que les glandes sous-muqueuses constituaient le principal site d’expression de la

protéine CFTR et que les cellules ciliées de l’épithélium de surface bronchique exprimaient la

protéine CFTR à la face apicale. Cependant, les différentes études portant sur l'expression de

CFTR dans les voies aériennes distales (épithéliums de surface bronchiolaire et alvéolaire) ont

produit des résultats discordants. En effet selon les différentes études, l’expression de la

protéine CFTR varie d’une absence de marquage à un marquage prononcé dans les

épithéliums bronchiolaire et alvéolaire.

Le but de ce travail a donc été de décrire l'expression de CFTR dans les épithéliums

bronchiolaires et alvéolaires humain non-CF. Pour réaliser cette étude, nous avons utilisé

111

deux anti-corps anti-CFTR (MAB25031 et MAB1660), dont la spécificité et la sensibilité ont

été démontrées dans des études antérieures.

4.2 Effets du monoxyde d'azote (NO) sur les

transports ioniques transépithéliaux dans les voies

aériennes humaines proximales et distales

mucoviscidosiques et non mucoviscidosiques

Le monoxyde d’azote (NO) a été identifié comme une molécule régulatrice importante

dans la physiologie du poumon humain, intervenant dans la vasodilatation, dans la réponse

inflammatoire, comme neurotransmetteur,… (cf chapitre 6). Le NO, qui est produit par les

NO synthases (NOS) dont les trois isoformes ont été retrouvées dans le poumon, agit

notamment en stimulant la guanylate cyclase soluble (GCs) entraînant la formation d’un

second message, la guanosine 3’, 5’ monophosphate cyclique (GMPc).

Il a été proposé que la concentration en NO dans l’air exhalé reflétait l’état

d’inflammation des voies aériennes. En effet, des études ont montré une augmentation de la

production de NO durant les exacerbations chez des patients asthmatiques, les rhinites

allergiques ou le syndrome de détresse respiratoire aigu. Cependant, il a été démontré que la

concentration de NO dans l’air exhalé était inférieure chez les personnes mucoviscidosiques

par rapport aux sujets normaux. Plus récemment, des études ont montré que le NO pouvait

moduler (effets activateur et/ou inhibiteur) les transports ioniques dans les voies aériennes

112

humaines. Bien que certaines études aient produit des résultats discordants, ces résultats

suggèrent que le NO peut jouer un rôle important dans le contrôle des transports ioniques

transépithéliaux et donc dans la clairance mucociliaire. La diminution de la concentration en

NO dans les voies aériennes CF pourrait en effet participer aux perturbations dans les

transports d’ions et de fluide caractéristiques de la mucoviscidose.

Les effets du NO sur les transports ioniques transépithéliaux dans les voies aériennes

bronchiques et bronchiolaires non-CF et CF restent encore peu connus. Etant donné

l’importance des transports d’ions et de fluide dans les voies aériennes humaines et leurs

implications dans l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose, nous nous sommes intéressés

aux effets du NO sur les transports ioniques dans les voies aériennes proximales et distales

non mucoviscidosiques et mucoviscidosiques. Nous avons donc exposé des cultures primaires

de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires non-CF et CF à un donneur de NO.

Nous avons également exploré le mécanisme d’action du NO en modulant la concentration

intracellulaire du GMPc dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-

CF humaines.

4.3 Détermination du pourcentage de cellules non-CF

permettant de normaliser les fonctions épithéliales d'une

culture primaire de cellules épithéliales bronchiques CF

113

Le clonage du gène CF a suscité des espoirs de thérapie génique pour lutter contre la

mucoviscidose. Des études de transfert de gène ont donc été réalisées afin de tester la

faisabilité de la thérapie génique dans le cadre de cette maladie. Au niveau de l'épithélium

pulmonaire, différents vecteurs (adénovirus, rétrovirus, lentivirus,…), différents supports

(cultures primaires ou lignées cellulaires) et diverses MOI (multiplicity of infection, nombre

de virus par cellules) ont été utilisés (cf chapitre 7). Il ressort de ces différentes études qu'un

pourcentage de cellules relativement faible (<20%) exprimant la protéine CFTR sauvage

permettrait de normaliser les transports de Cl-. Cependant, il semble qu'un pourcentage plus

important de cellules devra être corrigé afin de restaurer les transports de Na+.

Le but de ce travail a donc été de déterminer si un faible pourcentage (10%) de cellule

exprimant une protéine CFTR normale permettait de normaliser à la fois les transports de Na+

et de Cl-. Nous avons donc réalisé trois types de culture primaire de cellules épithéliales

bronchiques humaines : 1/ 100% non-CF, 2/ 100% CF et 3/ cultures mixtes comprenant 90%

de cellules bronchiques CF et 10% de cellules bronchiques non-CF (« co-cultures »). La

prolifération cellulaire ainsi que l'apoptose ont été évaluées au cours du temps de culture afin

de s'assurer que le pourcentage initial était conservé. Les propriétés bioélectriques des trois

types de cultures cellulaires ont été étudiées en chambres dites de Ussing. Nous avons

également entrepris le dosage d'une cytokine pro-inflammatoire, l’IL-8 dont la sécrétion est

exagérée dans la mucoviscidose, dans le surnageant des différents types de cultures afin de

déterminer si d’autres fonctions cellulaires étaient normalisées dans les co-cultures.

114

5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR5 EXPRESSION DE CFTR DANS LES DANS LES DANS LES DANS LES VOIESVOIESVOIESVOIES

AÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNESAÉRIENNES HUMAINHUMAINHUMAINHUMAINESESESES

115

5.1 Introduction

CFTR est une protéine membranaire principalement exprimée dans les tissus

épithéliaux dans lesquels elle régule plusieurs fonctions comme les transports transépithéliaux

d’eau et d’ions. CFTR est un canal chlorure activé par l’AMPc mais cette protéine intervient

également dans la régulation d’autres canaux comme le canal sodique sensible à l’amiloride

(ENaC) ou d’autres canaux chlorures (Hryciw et Guggino 2000 ; Kunzelmann et al. 1999 ;

Schreiber et al. 1997 ; Schwiebert et al. 1999). Les mutations du gène CF qui code pour la

protéine CFTR entraînent la mucoviscidose ce qui démontre le rôle crucial de cette protéine

au niveau des épithéliums (Riordan et al. 1989). Bien que la mucoviscidose affecte plusieurs

organes, l’atteinte pulmonaire est responsable de la majorité de la mortalité observée dans la

mucoviscidose. En effet, des infections bactériennes récurrentes, l’inflammation et

l’obstruction des voies aériennes provoquent la destruction du tissu pulmonaire. Dans les

bronches et les bronchioles CF, le défaut de sécrétion chlore activée par l’AMPc associée à

une hyperabsorption de sodium entraînent une diminution de l’ASL perturbant la clairance

mucociliaire et favorisant ainsi la colonisation bactérienne (Blouquit et al. 2006 ; Boucher et

al. 2004 ; Tarran et al. 2005). Contrairement aux bronches et aux bronchioles, les alvéoles ne

semblent pas jouer un rôle majeur dans l’évolution de la maladie (Boucher et al. 2004 ; Davis

et al. 1996).

Malgré les avancées au niveau génétique, moléculaire ou dans la physiopathologie de

la mucoviscidose et particulièrement au niveau pulmonaire, les études sur l’expression de la

protéine CFTR notamment au niveau du tissu pulmonaire restent discordantes. Selon les

116

différentes études, l’expression de CFTR oscille entre absence et forte présence au niveau de

l’épithélium de surface des bronches, des glandes sous muqueuses, de l’épithélium

bronchiolaire et alvéolaire. Crawford et al. n’ont pas pu détecter de marquage par

immunocytochimie dans les cellules épithéliales dans aucun des différents étages pulmonaires

étudiés (bronches, bronchioles et alvéoles) (Crawford et al. 1991). Dans une autre étude,

Engelhardt et al. ont observé par immunocytochimie, un léger marquage au niveau de

l’épithélium de surface ainsi qu’un intense marquage au niveau des glandes sous-muqueuses

(Engelhardt et al. 1992). Des résultats similaires ont été obtenus par Tizzano et al. par

hybridation in situ dans des poumons de nouveaux-nés (Tizzano et al. 1994a). Jacquot et al.

ont également observé un important marquage de CFTR au niveau des glandes sous

muqueuses de la trachée humaine (Jacquot et al. 1993). Cependant, dans une étude récente,

Kreda et al. n’ont observé qu’un faible voire une absence de marquage dans les glandes sous-

muqueuses aussi bien au niveau de l’ARNm que de la protéine CFTR (Kreda et al. 2005). Au

niveau distal, Tizzano et al. ont démontré une forte expression de CFTR au niveau de

l’épithélium bronchiolaire mais pas au niveau de l’épithélium alvéolaire (Tizzano et al.

1994a). Kreda et al. ont observé une diminution de l’expression de CFTR le long des voies

aériennes jusqu'à une faible voire une absence d’expression au niveau alvéolaire (Kreda et al.

2005). Ces résultats sont discordants avec les travaux d’Engelhardt et al., qui ont démontré la

présence d’ARNm de CFTR ainsi que de la protéine dans une sous population de cellules

épithéliales à la fois au niveau bronchiolaire et au niveau alvéolaire (Engelhardt et al. 1994).

Récemment, Fang et al. ont mis en évidence par RT-PCR l’expression de CFTR au niveau de

pneumocytes de type II humains ; le niveau des transcrits de CFTR est comparable à celui

reporté au niveau des cellules épithéliales bronchiques (Fang et al. 2006). Ces résultats

discordants sur l’expression de CFTR dans les voies aériennes non CF peuvent en partie être

dus au faible niveau d’expression de la protéine (Kartner et al. 1992 ; Trapnell et al. 1991)

117

mais également aux différentes techniques utilisées et notamment aux différents anti-corps

utilisés.

La connaissance de la distribution de la protéine CFTR dans les voies aériennes

demeure importante pour une meilleure appréhension de l’atteinte pulmonaire de la

mucoviscidose mais également pour émettre de nouvelles hypothèses. Le but de cette étude

est de décrire l’expression de CFTR dans les épithéliums bronchique, bronchiolaire et

alvéolaire humain non CF. Pour réaliser cette étude, nous avons utilisé deux anti-corps anti-

CFTR MAB25031 (Mab24-1) et MAB1660 (Mab13-1). Des études antérieures ont démontré

la haute spécificité et sensibilité de ces deux anti-corps pour l’étude de CFTR parmi un panel

d’anti-corps anti-CFTR (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Coucet et al. 2003). Nous avons

également comparé le niveau d’expression de CFTR dans les bronches, les bronchioles et les

alvéoles obtenues à partir d’un même patient.

118

5.2 Matériels et méthodes

5.2.1 Origine des prélèvements pulmonaires

Les échantillons de tissu ont été obtenus à partir des poumons de 27 patients (23

hommes) non CF opérés pour la plupart pour des cancers pulmonaires. Tous ces protocoles

ont été effectués en accord avec la législation française en vigueur. Les échantillons ont été

sélectionnés sur l’absence d’anomalies « grossières ». L’âge des patients de cette étude est

compris entre 46 et 80 ans (moyenne d’âge ± SE : 61,3 ± 2,1 ans). Dix-sept patients étaient

fumeurs, 2 non fumeurs et pour 8 d’entre eux le statut tabagique n’était pas renseigné. Des

échantillons de bronches, de bronchioles et de tissus alvéolaires ont été obtenus pour chaque

patient. Les bronches ont été identifiées sur les bases d’un diamètre compris entre 3 et 7 mm

et sur la présence de cartilage. Les bronchioles ont été identifiées sur les bases d’un diamètre

égal ou inférieur à 2mm et sur l’absence de cartilage. Les échantillons alvéolaires ont été

obtenus à partir de fragments de parenchyme d’environ 1cm3. Vingt-quatre patients sur les 27

ont permis d’obtenir un échantillon de bronches, de bronchioles et d’alvéoles et 3 patients ont

permis d’obtenir 2 échantillons de chaque. Les prélèvements ont été fixés aléatoirement dans

du formol 10 % ou dans du liquide de Bouin puis inclus en bloc de paraffine.

5.2.2 Coloration et analyse histologique des prélèvements

119

Les coupes des prélèvements fixés en paraffine, ont été colorées par l’hémalun de

Mayer et l'éosine dans la coloreuse Autostainer XL (Leica, Rueil Malmaison, France), puis

elles ont été montées automatiquement par une colleuse (RCM 90, Tech-Inter, Maurepas,

France) qui permet de coller les lamelles automatiquement sur les lames. Les lames ont

ensuite été examinées sous microscope optique (Olympus, Le Pecq, France). Nous n'avons

conservé, pour l'étude immunohistochimique, que les prélèvements dont les épithéliums

bronchique, bronchiolaire et alvéolaire étaient conservés, d'aspect histologique normal, et

nous avons éliminé les prélèvements comportant un épithélium érodé, ou hypersécrétant, ou

présentant une métaplasie malpighienne, ou une hyperplasie des cellules basales, ou des

remaniements inflammatoires (Engelhardt et al. 1992).

5.2.3 Anticorps anti-CFTR

MAB 25031 est un anticorps monoclonal de souris de type IgG2a. Il est dirigé contre la

partie C-terminale de CFTR et plus précisément contre les acides aminés 1377-1480,

correspondant aux exons 23 et 24. Il a d’abord été commercialisé par Genzyme (Brezillon et

al. 1995 ; Dupuit et al. 1995 ; Brezillon et al. 1997 ; Dray-Charrier et al. 1999) puis par R&D

Systems Europe (Lille, France) (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Castillon et al. 2002 ; Doucet

et al. 2003 ; Wioland et al. 2000). MAB1660 est un anticorps monoclonal de souris de type

IgG1. Il est dirigé contre le domaine R de CFTR, et plus précisément contre les acides aminés

590-830, correspondant à l'exon 13. Il est commercialisé par R&D Systems Europe (Lille,

France) (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Doucet et al. 2003).

120

5.2.4 Procédures d'immunomarquage

Pour chaque patient, l’étude immunohistochimique a été réalisée dans le même temps

pour les 3 étages. Les prélèvements ont été placés sur des lames Super Frost Plus pré-traitées,

puis séchés durant toute une nuit à 37° dans une étuve. Les lames ont ensuite été

déparaffinées dans 3 bains de toluène pendant 10 minutes chacun puis réhydratées dans 3

bains successifs d’alcool (100 %) pendant 5 minutes par bain, et rincées dans de l’eau

courante pendant 5 minutes. Les lames ont ensuite été placées dans un tampon de citrate

10mM à pH=6, chauffées au bain marie à 95°C, pendant 40 minutes, puis refroidies pendant

20 minutes et rincées au PBS. Pour éliminer l’activité endogène de la peroxydase, quelques

gouttes d’H2O2 à 0,03% (du kit EnvisionTM) ont été appliquées sur les lames pendant 5

minutes à température ambiante pour MAB25031, 30 minutes pour MAB1660. Les lames ont

été rincées au PBS puis au TBS (Tris-Buffered Saline) (50mM TRIS, 150mM NaCl, pH= 7,6)

pendant 5 minutes pour MAB25031 et 10 minutes pour MAB1660.

Sur chaque lame, ont été déposés 200 µl de l’anticorps primaire MAB25031 à

concentration de 1/200ème pendant 1 heure et à température ambiante, ou 200 µl de l’anticorps

primaire MAB1660 à concentration 1/100ème pendant toute une nuit à 4°C. Les lames ont été

ensuite rincées au TBS pendant 10 minutes pour MAB25031, 30 minutes pour MAB1660.

Deux cent µl de l'anticorps secondaire, un anticorps de lapin dirigé contre les anticorps de

souris couplé à un complexe peroxydasique (du kit EnvisionTM) ont ensuite été appliqués

pendant 30 minutes, également à température ambiante. Après avoir été rincées au TBS, les

lames ont été exposées à une solution contenant le chromogène diaminobenzidine

(EnvisionTM+ system, DakoCytomation, Trappes, France) pendant 5 minutes à température

ambiante selon les recommandations du fabricant. Les lames ont été rincées au TBS pendant 5

121

minutes, puis contre-colorées à l’hémalun de Mayer pendant 1 minute. Les lames ont enfin été

montées par la colleuse.

Deux types de contrôles négatifs ont été réalisés pour chaque prélèvement : pour l’un

des contrôles négatifs, l’anticorps primaire n’a pas été appliqué sur la lame; pour l’autre

contrôle négatif, nous avons utilisé, à la place de l’anticorps primaire une immunoglobuline

non spécifique de souris (Ig2a pour MAB25031, et Ig1 pour MAB1660), exactement dans les

mêmes conditions que pour l’anticorps correspondant (même concentration et même temps

d’application) et au même moment.

Nous avons considéré comme témoin positif l’épithélium des glandes séreuses visibles

dans la muqueuse bronchique. En effet, les cellules séreuses, qui forment ces glandes,

expriment très fortement la protéine CFTR (Engelhardt et al. 1992 ; Puchelle et al. 1992 ;

Wioland et al. 2000).

5.2.5 Analyse statistique

Chaque section a été observée par deux observateurs indépendants qui ont évalués

semi-quantativement le niveau d'expression de la protéine dans l'épithélium de surface. La

notation de l'intensité du marquage a varié de 0 à 4 (0 pour une absence de marquage, 1 pour

un marquage léger, 2 pour un marquage modéré, 3 pour un marquage intense et 4 pour un

marquage très intense). Cette valeur a été considérée comme une variable quantitative pour

l’anayse statistique, pour laquelle nous avons utilisé des tests non paramètriques univariés.

Nous avons comparé les scores moyens des mesures entre les observateurs, les anticorps, les

122

fixateurs et la région du poumon. Pour tester l’effet des fixateurs, nous avons utilisé le test de

Mann-Whitney et pour les autres critères (observateurs, anticorps et région du poumon), nous

avons utilisés le test de Wilcoxon. Nous avons considéré comme significatif un p < 0,05.

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel STATA (StataCorp LP, USA).

123

5.3 Résultats

Trente "lots" de bronches, bronchioles et d'alvéoles ont été étudiés au cours de ce

travail, 21 ont été fixés dans le formol et 9 ont été fixés dans le liquide de Bouin. L'analyse

histologique des échantillons sélectionnés n'a pas révélé d'anomalies tissulaires telles qu'une

inflammation, une hyperplasie des cellules basales, une métaplasie malpighienne ou encore

une érosion épithéliale. Les bronches étaient caractérisées par la présence de cartilage, de

glandes sous muqueuses et l'épithélium était composé de cellules ciliées, de cellules

caliciformes et de cellules basales. L'épithélium bronchiolaire était formé de cellules ciliées,

de cellules caliciformes et la hauteur de l'épithélium était inférieure à l'épithélium bronchique.

L'épithélium alvéolaire contenait des pneumocytes de type I (PI) et II (PII).

5.3.1 Expression de CFTR

Nous avons observé un marquage plus fort pour les prélèvements fixés dans le liquide

de Bouin par rapport aux prélèvements fixés dans le formol (p < 0,05) mais cette différence

était faible et constante le long des voies aériennes (Tableau 3). L'anticorps MAB25031 a

marqué les tissus bronchiques et bronchiolaires, principalement au niveau des cellules ciliées

(figure 33). Au niveau bronchique et bronchiolaire, les 2 observateurs ont remarqué que

l'intensité du marquage est variable entre les cellules d'un même prélèvement et que cette

variation se retrouve avec les 2 types de fixateurs utilisés. Nous avons observé un marquage

au niveau des cellules basales et des cellules caliciformes. Dans les glandes séro-muqueuses,

124

les cellules séreuses sont marquées contrairement aux cellules à mucus (figure 33). Au niveau

alvéolaire, les PI et les PII sont clairement marqués (figure 33).

MAB1660 a également marqué les cellules ciliées dans les épithéliums bronchiques et

bronchiolaires ainsi que les cellules séreuses des glandes séro-muqueuses. Contrairement à

MAB25031, MAB1660 a marqué les cellules nerveuses, musculaires et endothéliales (figure

34). Les PI et les PII sont également marqués par l'anticorps MAB1660.

5.3.2 Etude comparative

Le tableau 3 résume les intensités de marquage de CFTR par MAB25031 et

MAB1660 dans les 3 régions du poumon étudiées selon chaque observateur et selon chaque

fixateur. Nous n'avons pas observé de différence significative entre les observateurs et entre

les anticorps. L'évaluation moyenne de l'intensité du marquage de CFTR est similaire dans les

bronches et les bronchioles. Cependant, dans les alvéoles l'évaluation de l'intensité est

inférieure par rapport aux régions bronchiques (p < 0,02) et bronchiolaires (p < 0,01).

125

Observateur 1 Observateur 2

Formol Liquide de Bouin

Formol Liquide de Bouin

Epithélium bronchique 2,0 ± 0,2 2,4 ± 0,5 2,2 ± 0,2 2,7 ± 0,3

Epithélium bronchiolaire 2,2 ± 0,2 2,6 ± 0,4 2,1 ± 0,2 3,0 ± 0,2 MAB25031

Epithélium alvéolaire 2,5 ± 0,1 2,7 ± 0,3 2,3 ± 0,1 3,1 ± 0,3

Epithélium bronchique 2,2 ± 0,2 3,4 ± 0,3 2,1 ± 0,2 3,1 ± 0,2

Epithélium bronchiolaire 2,2 ± 0,2 2,8 ± 0,4 2,2 ± 0,2 2,7 ± 0,3 MAB1660

Epithélium alvéolaire 1,6 ± 0,2 1,1 ± 0,2 1,6 ± 0,2 1,8 ± 0,2

Tableau 3 : Intensité du marquage obtenu avec MAB25031 et MAB1660 pour chaque observateur, chaque étage pulmonaire et chaque fixateur (moyenne ± SEM, n = 21 pour le formol et 9 pour le liquide de Bouin pour chaque étage pulmonaire et pour chaque anticorps).

126

Figure 33 : Détection immunohistochimique de CFTR dans A) épithélium de surface bronchique, B) glandes séro-muqueuses bronchiques, C) épithélium bronchiolaires et D), épithélium alvéolaire, avec l’anticorps MAB25031 sur des prélèvements fixés en formol (barre = 50µm).

D C

B A

127

Figure 34 : Détection immunohistochimique de CFTR dans A) épithélium de surface bronchique, B) glandes séro-muqueuses bronchiques, C) épithélium bronchiolaires et D), épithélium alvéolaire, avec l’anticorps MAB1660 sur des prélèvements fixés en formol (barre = 50µm).

D

B A

C

128

5.4 Discussion

Cette étude apporte de nouvelles informations concernant l’expression de CFTR dans

le poumon humain adulte. Malgré l’apport des études fonctionnelles démontrant l’expression

de CFTR dans les régions bronchiques, bronchiolaires et alvéolaires, il n’existe pas de

consensus sur la localisation de CFTR dans l’épithélium respiratoire (Boucher 1994 ;

Blouquit et al. 2002 ; Blouquit et al. 2006 ; Fang et al. 2006). L’existence d’anticorps anti-

CFTR spécifiques possédant une bonne sensibilité, nous a permis d’étudier l’expression de

CFTR dans le poumon humain des bronches jusqu’aux alvéoles. Chez les personnes non-CF,

nous avons observé une expression de CFTR dans l’épithélium de surface des bronches, des

bronchioles, dans les tissus alvéolaires et dans les glandes bronchiques. Nous avons

également observé que CFTR est exprimé 1) principalement au niveau des cellules ciliées et

des cellules glandulaires séreuses dans l’épithélium bronchique, 2) principalement au niveau

des cellules ciliées dans l’épithélium bronchiolaire ainsi qu’au niveau des tissus alvéolaires

dans les PI et les PII. Nous n’avons pas observé de différence d’intensité de l’expression de

CFTR entre les étages bronchiques et bronchiolaires contrairement aux alvéoles où nous

avons observé une légère diminution de l’intensité.

La qualité d’une étude immunohistochimique dépend largement de la sensibilité et de

la spécificité des anticorps ainsi que du protocole, comme la procédure de fixation. Nous

avons donc effectué des études préliminaires (résultats non montrés) en faisant varier la

dilution de l’anticorps primaire ou le temps d’incubation en partant des recommandations du

fabricant et ceci afin d’optimiser le protocole. L’étape de fixation des tissus constituant un

point clé dans la procédure nous avons utilisé deux types de fixateurs (le formol et le liquide

129

de Bouin). Nous avons obtenu un marquage plus intense sur les tissus fixés dans le liquide de

Bouin par rapport à ceux fixés dans le formol. Nous avons également utilisé deux anticorps

anti-CFTR différents reconnaissant des épitopes différents de CFTR. Ces deux anticorps ont

déjà été utilisés par le passé dans des études qui ont démontré leur spécificité et leur

sensibilité (Carvalho-Oliveira et al. 2004 ; Castillon et al. 2002 ; Dupuit et al. 1995).

Cependant, une étude a révélé que MAB25031 avait une meilleure sensibilité que MAB1660

dans le tissu nasal humain (Doucet et al. 2003). Notre étude, en étant consistante avec les

études fonctionnelles, confirme la haute sensibilité de ces 2 anticorps. Les études

fonctionnelles, plus sensibles que les études immunohistochimiques, ont en effet apporté des

preuves de l’expression de CFTR dans les épithéliums bronchiques, bronchiolaires et

alvéolaires (Blouquit et al. 2002 ; Boucher 1994 ; Boucher 2004 ; Fang et al. 2006). Nous

avons observé que MAB1660 dans les voies aériennes marquait l’épithélium respiratoire mais

également les cellules musculaires, nerveuses et endothéliales. Cependant des études ont

démontré l’expression de CFTR dans les cellules musculaires (Robert et al. 2004), dans les

cellules nerveuses (Mulberg et al. 1995 ; Weyler et al. 1999) et dans les cellules endothéliales

(Tousson et al. 1998).

Plusieurs études ont rapporté le fait que la distribution et l’intensité du marquage de

CFTR était variable entre les individus normaux (Kreda et al. 2005). Nous abondons dans ce

sens également. Les explications d’une telle hétérogénéité demeurent toutefois inconnues.

Cependant, elle pourrait être expliquée par la faible expression de CFTR dans les cellules

épithéliales des voies aériennes (Kartner et al. 1992 ; Trapnell et al. 1991 ; Trezise et

Buchwald 1991), par des facteurs environnementaux ou par le degré de différenciation,

d’inflammation et de remodelage de l’épithélium (Brezillon et al. 1997 ; Dupuit et al. 1995).

Afin de réduire l’impact de ces facteurs, nous avons sélectionné des tissus

130

morphologiquement normaux et pour comparer l’expression de CFTR dans les 3 régions

pulmonaires, nous avons utilisé des échantillons provenant du même patient. La plupart des

patients qui ont fourni les prélèvements permettant cette étude sont fumeurs. Une étude

récente a démontré que l’exposition in vitro à des extraits de fumée de cigarette diminuait

l’expression de CFTR au niveau du gène, de la protéine et au niveau fonctionnel dans une

lignée cellulaire épithéliale respiratoire humaine (Calu-3) (Cantin et al. 2006). De plus, la

mesure in vivo de la différence de potentiel nasal chez les fumeurs est consistante avec des

troubles de CFTR (diminution de la réponse à un milieu sans chlore et à l’isoprotérénol

comparativement à des non fumeurs). Le statut tabagique des patients est peu susceptible

d’avoir affecté nos résultats étant donné que nous avons observé un marquage dans les

épithéliums de chaque patient, cependant nous ne pouvons pas exclure une possible

diminution de l’intensité du marquage de CFTR due au tabagisme des patients ce qui pourrait

participer à la variabilité du marquage.

L'expression de CFTR a clairement été mise en évidence dans l'épithélium bronchique

et principalement au niveau des cellules ciliées, et dans les glandes séromuqueuses,

principalement dans les cellules séreuses. Les 2 anticorps ont donné les mêmes résultats. Ces

profils d'expression sont en accord avec les études fonctionnelles. Les défauts de régulation

du transport de chlore porté par CFTR ont été mis en évidence dans l'épithélium de surface

bronchique ainsi que dans les glandes trachéobronchiques, apportant la preuve du rôle de

CFTR dans ces structures pulmonaires (Boucher 1994 ; Yamaya et al. 1991). Nous avons pu

détecter une expression de CFTR dans les cellules de l'épithélium de surface, même si selon

Trapnell et al. le gène CF est exprimé à un faible niveau dans les cellules épithéliales

bronchiques (1-2 transcrits par cellule) (Trapnell et al. 1991). Ceci indique soit que nos

anticorps sont suffisamment sensibles pour détecter un tel niveau d'expression soit que CFTR

131

est exprimé à un plus fort niveau que précédemment démontré. La plupart des études

précédentes ont démontré que les glandes séromuqueuses étaient le principal site d'expression

de CFTR (ARNm et protéine) chez les personnes non CF (Jacquot et al. 1993 ; Tizzano et al.

1994b). Le marquage de CFTR se retrouvait au niveau des cellules séreuses (Jacquot et al.

1993 ; Tizzano et al. 1994b). Notre étude confirme donc que l'épithélium de surface et que les

glandes séromuqueuses dans les bronches sont les principaux sites d'expression de CFTR dans

le poumon adulte humain.

Nous avons également observé un net marquage au niveau de l'épithélium de surface

bronchiolaire et principalement au niveau des cellules ciliées. L'expression de CFTR au

niveau des bronchioles était attendue étant donné que les bronchioles sont clairement

impliquées dans la pathogenèse pulmonaire dans la mucoviscidose. Chez les enfants, la

mucoviscidose est premièrement une maladie des voies aériennes distales. Les études de

poumon de jeunes patients CF ont démontré que les voies aériennes distales sont caractérisées

par des obstructions causées par du mucus et par des bronchiolectasies (Hamutcu et al. 2002 ;

Long et al. 2004 ; Martinez et al. 2005 ; Wood et al. 1976). De plus, des études ont montré

que les obstructions causées par le mucus affectent plus sévèrement les voies aériennes

distales que les voies aériennes proximales (Mellins 1969 ; Ranganathan et al. 2004). Une

autre étude a montré que les bronchioles non CF sont capables d'une sécrétion de Cl- et de

fluide dépendante de CFTR (Blouquit et al. 2002). Enfin, une autre étude a démontré des

défauts de sécrétion de Cl- et de fluide dans les bronchioles CF dus aux dysfonctionnements

de CFTR (Blouquit et al. 2006).

L'étude comparative réalisée indique que le niveau d'expression de CFTR est similaire

dans les épithéliums bronchiques et bronchiolaires. Les transports d'eau et d'ions ont été

132

étudiés dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires

obtenues à partir du même patient. Les sécrétions de Cl- et de fluide en réponse à l’AMPc

étaient significativement supérieures dans les cultures bronchiolaires par rapport aux cultures

de cellules épithéliales bronchiques (Blouquit et al. 2006). Nous avons donc émis l'hypothèse

que le niveau d'expression de CFTR dans les voies aériennes distales était supérieur au niveau

d'expression dans les voies aériennes proximales. Les résultats de cette étude ne nous

permettent pas de conclure dans ce sens, cependant les études fonctionnelles restent plus

sensibles que les études immunohistochimiques et peuvent donc être plus aptes à détecter de

faibles différences. Une autre explication pourrait être une différence d'expression de CFTR

entre les tissus natifs et les cultures primaires de cellules épithéliales ou bien encore

l'implication d'autres facteurs que CFTR dans la réponse à l'AMPc.

Nous avons également observé un net marquage dans les pneumocytes de type I et de

type II, mais avec une intensité légèrement inférieure à celle notée dans les épithéliums

bronchiques et bronchiolaires. Ce résultat peut apparaître surprenant étant donné que

contrairement aux voies aériennes proximales (bronches) et distales (bronchioles), les alvéoles

apparaissent plutôt préservées au cours de la pathogenèse de la mucoviscidose. De plus dans

une étude récente Kreda et al. n'ont pas retrouvé de marquage de CFTR au niveau des

bronchioles terminales et des alvéoles (Kreda et al. 2005). Cependant, l'expression de CFTR a

été décrite dans les cellules épithéliales alvéolaires fœtales humaines (Engelhardt et al. 1992 ;

McCray et al. 1992). Fang et al. ont récemment montré que CFTR était exprimé dans des

cultures de PII isolées à partir d'un poumon adulte humain. Ils ont montré, par RT-PCR que le

niveau d'expression des transcrits de CFTR était similaire à ceux reportés dans les cellules

épithéliales des voies aériennes et des études fonctionnelles ont apporté la preuve de canaux

Cl- CFTR (Fang et al. 2006). Notre étude abonde dans ce sens en confirmant l'expression de

133

la protéine CFTR dans les cellules épithéliales alvéolaires humaines adultes, à la fois dans les

PI et les PII. Le rôle de CFTR dans les transports d'eau d'ions et de fluide reste à élucider,

notamment au regard de l'absence de pathologie alvéolaire dans la mucoviscidose. Des études

récentes ont suggéré que CFTR pourrait jouer un rôle important dans la régulation AMPc-

dépendante des fluides (Fang et al. 2002 ; Fang et al. 2006 ; Matthay et al. 2005).

Pour résumer, nous avons montré que, dans le poumon humain adulte, CFTR est

fortement exprimé tout le long de l'épithélium de surface des voies aériennes, ainsi que dans

les glandes bronchiques séromuqueuses. Le profil d'expression de CFTR est similaire dans

l'épithélium de surface bronchique et bronchiolaire et diminue légèrement au niveau

alvéolaire. L'importance potentielle de l'expression de CFTR au niveau alvéolaire devra faire

l'objet d’études ultérieures, en particulier dans le cadre de la mucoviscidose.

134

6 6 6 6 EFFETS DU NOEFFETS DU NOEFFETS DU NOEFFETS DU NO SSSSURURURUR LESLESLESLES TRANSPORTSTRANSPORTSTRANSPORTSTRANSPORTS

IONIQUESIONIQUESIONIQUESIONIQUES TRANSTRANSTRANSTRANSÉÉÉÉPITHPITHPITHPITHÉÉÉÉLIAUXLIAUXLIAUXLIAUX DANS LES VOIESDANS LES VOIESDANS LES VOIESDANS LES VOIES

AAAAÉÉÉÉRIENNES HUMAINES PRORIENNES HUMAINES PRORIENNES HUMAINES PRORIENNES HUMAINES PROXIMALESXIMALESXIMALESXIMALES ET ET ET ET

DISTALESDISTALESDISTALESDISTALES NON MUCOVISCIDOSIQUENON MUCOVISCIDOSIQUENON MUCOVISCIDOSIQUENON MUCOVISCIDOSIQUES ET S ET S ET S ET

MUCOVISCIDOSIQUESMUCOVISCIDOSIQUESMUCOVISCIDOSIQUESMUCOVISCIDOSIQUES

135

6.1 Introduction

6.1.1 Historique

Furchgott et Zawadzki ont démontré l'existence d'une substance paracrine ayant une

forte activité vasodilatatrice (Furchgott et Zawadzki 1980). Les auteurs ont baptisé cette

substance EDRF pour "endothelium derived relaxing factor" (ou facteur relaxant dérivé de

l'endothélium). Si plusieurs études avaient démontré que l'action de l'EDRF passait au moins

par la formation de GMPc (Rapoport 1983), la nature chimique de l'EDRF restait sujette à

débats pendant plusieurs années jusqu'à ce que deux équipes indépendantes suggèrent que

cette substance possédait toutes les caractéristiques du monoxyde d'azote (NO) (Palmer 1987 ;

Ignarro 1987). Cette découverte fut d'autant plus surprenante que le NO était surtout reconnu

comme une molécule toxique de l'environnement, notamment contenue dans la fumée de

cigarette, les gaz d'échappement des véhicules et participant à la destruction de la couche

d'ozone et à la formation de pluies acides (Ricciardolo et al. 2004). Des études ultérieures ont

cependant confirmé que l'EDRF et le NO étaient la même molécule (Moncada et al.1991).

Rapidement, d'autres travaux ont démontré que le NO était impliqué dans la régulation de

l'agrégation plaquettaire (Radomski et al. 1990) ou bien pouvait agir comme

neurotransmetteur (Bredt et Snyder 1989). Ces observations sur les fonctions du NO ont mis

en évidence l'importance biologique de cette molécule et dont le rôle dans certaines

conditions physiologiques et/ou pathologiques est tel que la communauté scientifique l'a

désignée comme "molécule de l'année 1992". Furchgott, Ignarro et Murad ont par ailleurs

reçu le prix Nobel de physiologie en 1998 pour l'ensemble de leurs travaux sur le NO.

136

6.1.2 Synthèse du NO

Le NO est formé à partir de l'un des deux atomes d'azote terminal du groupement

guanidine de la L-arginine d'une part et de l'oxygène moléculaire d'autre part (Barnes et

Belvisi 1993 ; Dinh-Xuan 1996) (figure 35). Cette réaction qui produit également de manière

stœchiométrique de la L-citrulline, est catalysée par une famille d'enzyme : les NO synthases

(NOS). Ces enzymes, identifiées en 1990 par Bult et al., existent sous trois isoformes

distinctes : NOS neuronale (NOS I ou nNOS), NOS inductible (NOS II ou iNOS) et NOS

endothéliale (NOS III ou eNOS) (Bult et al.1990). Ces trois isoformes sont situées sur des

gènes distincts, diffèrent entre elles par leurs fonctions, leurs localisations cellulaires ainsi que

par leurs caractéristiques biochimiques (tableau 4). Elles sont ditribuées spécifiquement selon

les tissus (Lamas et Michel 1997) mais les 3 isoformes sont cependant présentent dans les

voies aériennes (Fischer et al. 1996 ; Hamid et al. 1993 ; Kobzik et al. 1993 ; Robbins et

al.1994 ; Shaul et al. 1994).

6.1.2.1 Les NOS constitutives

Les isoformes eNOS et nNOS appartiennent aux NOS dites constitutives, et sont

normalement présentes à l’état physiologique. L’expression de ces NOS permet la synthèse du

NO respectivement en tant que médiateur paracrine de la vasodilatation et neurotransmetteur

du système non adrénergique non cholinergique inhibiteur (iNANC).

137

Figure 35 : La formation du NO par les NO synthases entraîne la formation de L-citrulline à partir de L-arginine. Cette réaction nécessite des co-facteurs tels que les flavones (FAD, FMN) et la tétrahydrobioptérine (BH4). Les NOS sont compétitivement inhibées par des dérivés de l'arginine (L-NMMA, L-NAME, L-NOARG). Le NO peut être oxydé en nitrite (NO2

-), nitrate (NO3-) et peroxynitrite (ONOO-) (d'après Barnes et Belvisi

1993).

Isoformes Endothéliale

(eNOS) Neuronale (nNOS) Inductible (iNOS)

Localisation

chromosomique 7q35-36 12q24.2 17cen-q12

Masse moléculaire

de la portéine 135kDa 150kDa 130kDa

Activité Constitutive Constitutive Inductible

Fonction du produit

NO Vasodilatation Neurotransmission

Bactéricidie

tumoricidie

Cofacteurs

Ca2+/calmoduline Dépendante Dépendante Indépendante

Effecteurs

membranaires

Acétylcholine,

bradykinine, etc.

Acides aminés

neuro-excitateurs

LPS, IL-1, TNF α,

etc.

Tableau 4 : Les trois principales isoformes des NO synthases (d'après Dinh-Xuan 1996).

138

Les NOS constitutives sont dépendantes du Ca2+ et de la calmoduline et, lorsqu'elles sont

activées, produisent de faibles concentrations de NO (de l'ordre du fento ou du picomolaire)

(figure 36) (Ricciardolo et al. 2004). Le clonage de l'isoforme endothéliale des NOS a permis

de préciser ses lieux d'expression (Janssens et al. 1992). Shaul et al. ont démontré que

l’isoforme eNOS est constitutivement exprimée dans la lignée cellulaire épithéliale (Shaul et

al. 1994) ainsi que dans les PII (Pechkovsky et al. 2002). Des études ont également démontré

la présence par immunomarquage d'eNOS dans les cellules épithéliales au niveau de la

muqueuse nasale (Kawamoto et al. 1998).

Plusieurs équipes ont démontré, par immunohistochimie, la présence l'isoforme

neuronale des NOS dans les nerfs au niveau des voies aériennes aussi bien chez l'animal (Dey

et al. 1993 ; Diaz et al. 1993) que chez l'homme (Diaz et al. 1993 ; Fischer et Hoffmann

1996 ; Guembe et Villaro 1999). Ces fibres sont présentes au contact de fibres musculaires

lisses des voies aériennes, le NO est le principal médiateur de la relaxation du muscle lisse

(Ricciardolo 2003 ; Belvisi et Barnes 1992). Une étude a démontré que le nombre des fibres

nerveuses exprimant la nNOS diminuait parallèlement avec le diamètre des voies aériennes

(Fischer et Hoffmann 1996). Cette diminution du nombre de fibres nerveuses serait associée à

une diminution de la bronchodilatation d'origine nerveuse régulée par le système iNANC

(Ellis et Undem 1992 ; Widdicombe 1998).

139

Figure 36 : Représentation simplifiée du transport et du métabolisme de la L-arginine. La L-arginine est transportée dans la cellule par le système CAT (cationic amino acid transport) et peut être métabolisée par 2 types d'enzymes. 1/ Les NOS convertissent la L-arginine en L-citrulline en deux étapes. La L-citrulline peut être recyclée en L-arginine par l'arginosuccinate. Les NOS constitutives sont activées par une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+. 2/ L'arginase métabolise la L-arginine en L-ornithine. Les LPS et plusieurs types de cytokines augmentent le transport de L-arginine et l'activité de l'arginase. Le NG-hydroxy-L-arginine inhibe l'activité de l'arginase. Le NO peut se lier à des groupements thiols entraînant la formation de S-nitrosothiols (R-SNO) (d'après Ricciardolo et al. 2004).

140

6.1.2.2 La NOS inductible

L'isoforme inductible des NOS est normalement absente à l'état physiologique et ne se

manifeste que dans des états pathologiques comme par exemple lors du choc septique induit

par les endotoxines bactériennes. La régulation de la iNOS se fait au niveau pré-traductionnel

et peut être induite par des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l'INF-γ ou l'IL-

1β (Morris et Billiar 1994). Contrairement aux formes constitutives, l'isoforme iNOS est

responsable d'une production en grande quantité de NO (de l'ordre du nanomolaire) qui peut

avoir des effets cytotoxique à des concentrations ainsi atteintes (figure 37).

L'isoforme inductible des NOS a été détectée au niveau des macrophages (Lyons et al.

1992) mais des travaux ont montré que les macrophages n'étaient pas le seul type cellulaire à

exprimer iNOS au niveau des voies aériennes humaines. Les PII, les cellules musculaires

lisses, les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les neutrophiles et les chondrocytes

peuvent exprimer la forme inductible des NOS (Ricciardolo et al. 2004). L'induction de cette

isoforme de NOS dans les voies aériennes peut se faire sous l'action de plusieurs stimuli tels

que : les cytokines, les toxines bactériennes, les infections virales, les allergènes,…

6.1.2.3 Voies de transduction du NO

Du fait de sa nature radicalaire, le NO est extremement instable. En effet, il peut

facilement être capté par des protéines à groupement prosthétique héminique, comme

l’hémoglobine, et par l’oxygène et ses dérivés comme l’anion superoxyde.

141

Figure 37 : Représentation de la voie de signalisation provoquant une augmentation de l'expression de iNOS. Plusieurs types de signaux peuvent entraîner l'activation la tyrosine kinase qui permet par l'inhibition puis dégradation d'IκB, l'activation du facteur de transcription NF-κB. NF-κB est translocalisé dans le noyau entraînant la transcription du gène codant pour iNOS. L'ARNm d'iNOS va ensuite être traduit, puis la protéine iNOS sera synthétisée. La L-arginine sera convertie en L-citrulline et NO sous l'action de l'enzyme nouvellement synthétisée (d'après Ricciardolo et al. 2004).

142

Le NO a de ce fait une durée de vie biologique très faible (de l’ordre de quelques secondes) et

donc une action locale, restreinte au voisinage immédiat de son lieu de synthèse et de

sécrétion. Le NO produit par les NOS peut agir directement sur le fonctionnement d’enzymes

ou sur des facteurs de transcription (Gunther et al 1997 ; Goodwin et al 1998). Cependant la

cible principale du NO, en concentrations physiologiques, est la guanylate cyclase soluble

(GCs) (Hanafy et al 2001). La GCs est une enzyme qui, activée par le NO, catalyse la

transformation du GTP en GMPc (Murad et al. 1986, 1993) (figure 38). Le GMPc, second

médiateur du NO ainsi formé, peut agir sur plusieurs cibles. La principale cible du GMPc

semble être la protéine kinase G1 (PKG-1) qui est à l’origine de la relaxation du muscle lisse

(Hanafy et al. 2001). Le GMPc peut également inhiber l’agrégation plaquettaire, moduler

l’activité de canaux ioniques dépendant des nucléotides cycliques (CNG channel pour cyclic-

nucleotide gated channel) dont on peut retrouver certaines isoformes (CNG-1) dans le

poumon (Qiu et al. 2000).

Le GMPc intervient également dans la régulation des phosphodiestérases (PDE). Ces

enzymes, dont il existe 11 familles (PDE1 à 11), interviennent dans la dégradation des

nucléotides cycliques (GMPc, AMPc) en nucléotide (GMP, AMP). Les PDE jouent un rôle

primordial au niveau de plusieurs organes comme dans le poumon, l’œil, le cerveau,... Les

PDE constituent également les cibles de médicaments. Les propriétés anti-inflammatoires des

inhibiteurs de la PDE-4 ont entrainé l’utilisation de ces inhibteurs dans des maladies comme

l’asthme ou les BPCO (broncho-pneumopathies chroniques obstructives). La PDE-5 est

également la cible d’un inhibiteur spécifique : le sildénafil ou viagra. Cette drogue en inhibant

la PDE-5 permet de conserver un taux de GMPc intracellulaire suffisamment élevé pour

activer la PKG-1 entraînant un relâchement des muscles lisses du corps caverneux permettant

l’érection (Moreland et al. 1998 ; Hanafy et al. 2001).

143

Figure 38: Résumé des voies de transduction du NO (d'après Hanafy 2001).

144

6.1.2.4 Principaux effets du NO

L'action principale du NO est la vasodilatation des vaisseaux sanguins, conférant au

NO un rôle important dans la régulation du flux sanguin. Le NO est aussi connu pour induire

une bronchodilatation (Dinh-Xuan 1996). Cependant, des études ont démontré que le NO

intervenait dans de nombreux autres processus. En effet, des études ont révélé une expression

à la fois spatiale et temporelle au cours du développement du poumon chez le rat (Kawai et al.

1995 ; Xue et al. 1996). Une expression différentielle de l'isoforme eNOS a également été

observée chez le poumon fœtal de mouton. L'expression d'eNOS a été démontrée, chez le

mouton, au niveau des voies aériennes proximales mais pas au niveau des bronchioles

respiratoires ni au niveau alvéolaire (Sherman et al. 1999). Une étude a montré, chez le

babouin, une augmentation de l’expression des NOS durant le troisème trimestre de la

gestation. Cette augmentation de la production NO serait associée à une meilleure compliance

pulmonaire et à une diminution de la résistance expiratoire juste après la naissance (Shaul et

al. 2002).

Le NO intervient également comme neuromédiateur du système iNANC. Dans les

voies aériennes humaines, il assurerait la totalité de la réponse au système iNANC

(Ricciardolo et al. 2004). Des travaux ont montré que les effets du NO dans le système

iNANC semblaient impliquer la voie du GMPc intracellulaire dans la régulation du calibre

des voies aériennes (Ward et al. 1995). L’activation de canaux ioniques K+ dépenants du Ca2+

semblerait également intervenir dans la relaxation du muscle lisse induite par le système

iNANC (Kannan et Johnson 1995). Une étude a montré que les réponses du système iNANC

étaient significativement réduites chez les personnes atteintes de la mucoviscidose. L’état

145

inflammatoire des voies aériennes des patients CF pourrait être à l’origine de cette altération,

cependant le mécanisme reste à déterminer (Barnes et Belvisi 1993).

Le NO joue également un rôle important au niveau des processus inflammatoires. Les

mécanismes de régulation du NO durant un épisode inflammatoire dépendent en partie du

panel de cytokines dans l’environnement. En effet certaines cytokines (TGF-β, l’IL-4 ou l’IL-

10) inhibent l’expression de la NOS inductible (Nijkamp et Folkerts 1994) tandis que d’autres

(TNF-α, IL-1β, INF-γ) stimulent l’expression de cette isoforme des NOS (Robbins et al

1994). Le NO peut agir en tant qu’espèce radicalaire en produisant des peroxynitrites (ONOO-

) par réaction avec l’anion superoxyde (O2.-), les peroxynitrites possédant des propriétés

microbicides vont contribuer à lutter contre l’infection (Muijsers et al. 1997). Dans les voies

aériennes, le NO diminue la contraction induite par l’histamine et pourrait limiter l’infiltration

par les polynucléaires neutrophiles, limitant ainsi la réaction inflammatoire (Meng et al.

2000).

La concentration en NO dans l’air exhalé peut être utilisée comme témoin de

l’inflammation des voies aériennes. Des études ont démontré que cette concentration était plus

élevée en cas de rhinites, de bronchiectasies, de syndrome de détresse respiratoire aiguë et

pendant les exacerbations d’asthme (Kharitonov et al. 1995 ; Ricciardolo et al. 2004).

Cependant, la concentration de NO dans l’air exhalé n’est pas toujours liée à l’état

d’inflammation des voies aériennes. En effet, des études ont rapporté de faibles

concentrations de NO dans l’air exhalé chez des patients atteints de dyskinésie ciliaire

primitive (PCD) et de mucoviscidose (Balfour-Lynn et al. 1996 ; Ricciardolo et al. 2004).

Dans ces pathologies, la faible concentration de NO dans l’air exhalé pourrait être liée à une

diminution de l’expression de la NOS inductible qui semble être la source majeure de NO

146

dans les cellules épithéliales des voies aériennes (Downey et Elborn 2000 ; Meng et al. 2000).

Par ailleurs, Darling et Evans ont démontré que la production de NO diminuait l'adhérence et

stimulait l'élimination par internalisation des bactéries dans des cellules épithéliales

bronchiques humaines. Ces résultats suggèrent que la faible concentration de NO observée

chez les patients mucoviscidosiques pourrait participer à l'infection et à la colonisation par P.

aeruginosa (Darling et Evans 2003).

La motilité ciliaire est un facteur important dans le mécanisme de défense des voies

aériennes. Des équipes se sont intéressées aux effets des cytokines telles que l'IL-1β ou le

TNF-α sur cette motilité ciliaire. Jain et al. ont montré que ces cytokines pouvaient augmenter

la fréquence du battement ciliaire dans des cellules épithéliales de voies aériennes bovines

(Jain et al. 1995). Les effets stimulateurs de l'IL-1β ou du TNF-α sont inhibés par le L-

NMMA, un inhibiteur compétitif de la NOS et restaurés par l'ajout de L-arginine, le substrat

des NOS, ou de SNP, un donneur de NO. Ces résultats suggèrent que le l'IL-1β ou le TNF-α

stimulent le battement ciliaire en augmentant la production de NO endogène par l'activation

de NOS (Jain et al. 1995). Ces données peuvent être mises en relation avec les faibles

concentrations en NO dans l'air exhalé chez les patients atteints de PCD chez lesquels il est

observé un dysfonctionnement du battement ciliaire qui peut être amélioré par un traitement à

la L-arginine (Loukides et al. 1998). De plus, des études ultra-structurelles chez le rat ont

démontré la localisation d’eNOS au niveau des microtubules dans l'épithélium cilié (Xue et

al. 1996) où le NO pourrait donc jouer un rôle dans la régulation du battement ciliaire.

Le NO peut entraîner la formation de SNO (S-nitrosothiol) (figure 36) pouvant

moduler les transports ioniques. En effet, des études ont montré que des niveaux

147

physiologiques de SNO pouvaient augmenter l'expression, la maturation ainsi que la fonction

de la protéine CFTR contenant la mutation ∆F508 (Andersson et al. 2002 ; Howard et al.

2003 ; Zaman et al. 2001). Ce processus passerait par la S-nitrosylation de protéines

impliquées dans l'ubiquitination et la dégradation de CFTR. Une autre étude a montré que les

espèces réactives de l'oxygène issues d'un donneur de NO modifient l'état de nitration de

CFTR, induisant sa dégradation (Bebök et al. 2002).

Lu et al. ont montré que le NO pouvait directement moduler les transports ioniques

épithéliaux d’organes autres que les voies aériennes tels que le rein ou le colon (Lu et al. 1997

et 1998). Cependant, seulement quelques études se sont intéressées aux effets du NO sur les

transports ioniques dans les voies aériennes. Tamaoki et al. ont démontré que le NO pouvait

potentialiser la sécrétion de Cl- induite par les tachykinines dans la trachée de lapin. En effet,

les auteurs ont observé qu'en présence d'amiloride, la ddp trachéale était augmentée après

exposition de la muqueuse aux tachykinines. Cette augmentation était partiellement inhibée

en présence d'un inhibiteur de la formation du NO (L-NAME) et serait probablement due à

une sécrétion de Cl- (Tamaoki et al. 1995). Un autre étude a montré que la production de NO

induite par les macrophages pourrait inhiber le canal Na+ sensible à l’amiloride dans des

cellules alvéolaires fœtales de rat (Ding et al. 1998). Elmer et al. ont également observé dans

l'épithélium nasal murin, que le NO pourrait participer à l’inhibition de l'absorption de Na+ et

à la stimulation d’une sécrétion de Cl- (Elmer et al. 1999). Jain et al. ont observé, dans des

pneumocytes de type II de rat que les effets du NO sur les transports de Na+ et de Cl-

passaient par une variation du taux de GMPc intracellulaire (Jain et al. 1998). Duszyk a

montré que l'exposition au NO entraînait l'activation d'une sécrétion d'anion dépendante de la

voie du GMPc intracellulaire dans une lignée cellulaire pulmonaire (Calu-3) (Duszyk 2001).

Kamosinska et al. ont montré dans la lignée cellulaire pulmonaire humaine A549 que le NO

148

provoquait l'activation d'une sécrétion Cl- non portée par CFTR et dépendante de la voie du

GMPc (Kamosinska et al. 1997). Cependant, une étude plus récente n'a pas retrouvé ces effets

du NO sur les transports de Na+ ou de Cl-. En effet, Rückes-Nilges et al. n'ont pas observé

d'effet inhibiteur sur l'absorption de Na+ ni d'effet activateur sur la sécrétion de Cl- dans des

cultures primaires de cellules épithéliales humaines nasales non-CF et CF (Rückes-Nilges et

al. 2000). Les différences observées entre ces études peuvent provenir d'une régulation

différente dans les types cellulaires utilisés, les effets du NO sur l'épithélium nasal ne reflétant

pas forcément son effet sur les cellules épithéliales des autres étages des voies aériennes. De

plus, les lignées cellulaires et les cellules en cultures primaires peuvent avoir des propriétes

différentes. Cependant, ces différences peuvent également être dues à la différence de

concentration utilisée dans les différentes études. Rückes-Nilges et al. ont utilisé des

concentrations de NO plus élevées que dans les études sur les lignées.

Le NO peut donc moduler les transports ioniques dans les épithéliums. Les 3 types de

NOS sont présentes dans les voies aériennes humaines. Les travaux sur les transports ioniques

transépithéliaux chez l'homme ont principalement été réalisés sur des lignées cellulaires ou

sur des cultures primaires de cellules nasales. Ces différentes études ont produit des résultats

discordants. Le but de ce travail a donc été de déterminer les effets du NO sur les transports

ioniques transépithéliaux dans les voies aériennes humaines. Nous avons donc pour cela

réalisé des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires humaines

non CF que nous avons exposées à un donneur de NO, le SNP. Compte tenu des variations de

concentrations de NO dans l'air exhalé dans certaines pathologies des voies respiratoires

(concentration anormalement élevée dans l'asthme et plus faible dans la mucoviscidose), nous

avons également entrepris d'étudier les effets de ce donneur de NO sur des cultures primaires

de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF. Afin de préciser les effets éventuels

149

du NO sur les transports ioniques, nous avons également modulé la concentration en GMPc

intracellulaire dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF.

150


6.2.1 Origine des prélèvements

6.2.1.1 Tissus non mucoviscidosiques

Les fragments de lobes pulmonaires sont prélevés lors de lobectomie ou de

pneumonectomie indiquées généralement pour des cas de cancer bronchiques. Ils sont

conservés dans une solution dite de « décontamination » à 4°C et parviennent au laboratoire

quelques heures après l'opération. L'obtention de ces prélèvements est conforme à la

législation française et ceux-ci n'ont pas fait l'objet d'études génétiques. Les bronches et les

bronchioles sont isolées pour la mise en culture.

Composition de la solution dite de « décontamination » : DMEM/HAM-F12 supplémenté

avec : pénicilline/streptomycine (1mg/ml), amphotéricine B (100µg/ml) et gentamycine

(0,5mg/ml).

6.2.1.2 Tissus mucoviscidosiques

Ces fragments sont obtenus lors de transplantation et parviennent au laboratoire au

plus tard le lendemain de l'opération. Ils sont conservés dans une solution dite de

« décontamination » supplémentée de deux antibiotiques : la ceftazidime (500 µg/ml) et la

151

ticarciline (500 µg/ml). Les bronches et les bronchioles sont isolées à partir de ces

prélèvements pour être utilisées en culture cellulaire.

La figure 39 illustre les différences d'aspect entre un fragment de poumon non

mucoviscidosique et un fragment de poumon provenant d'un patient atteint de mucoviscidose

homozygote pour la mutation ∆F508.

6.2.2 Culture cellulaire

6.2.2.1 Obtention de cultures primaires de cellules épithéliales

bronchiques et bronchiolaires humaines

6.2.2.1.1 Identification des bronches et des bronchioles

Bronches et bronchioles sont identifiées selon la présence de plaques cartilagineuses

dans leur paroi. Les bronches ont un diamètre externe variant de 3 à 7 mm, ces segments

appartiennent à l'étage des bronches sous segmentaires, c'est à dire de la 4ème à la 7ème

génération (Weibel 1963). Les bronchioles sont dépourvues de cartilage et ont un diamètre

externe inférieur à 2 mm (0,5 mm pour les plus petites). Les bronchioles ont une longueur,

sans embranchement, variable selon le lobe pulmonaire dont elles proviennent, de 4 à 12 mm

(les plus longues provenant des lobes inférieurs).

152

Figure 39 : Fragments de poumon normal (A) et mucoviscidosique (B). Le tissu mucoviscidosique présente des voies aériennes dilatées remplies d’un mucus abondant et infecté (flèche).

A

B

153

Dans les prélèvements mucoviscidosiques, l'identification des étages bronchiolaires se

révèle plus difficile du fait d'’importants remaniements, qui peut cependant être variable d'un

lobe à l'autre. De plus, les bronchioles remplies de mucus présentent un diamètre supérieur

aux bronchioles non-CF ; l'absence de cartilage reste alors un moyen de déterminer si les

prélèvements proviennent de l'étage bronchique ou bronchiolaire.

Les bronches et les bronchioles sont disséquées du parenchyme sous loupe binoculaire

à l'aide de ciseaux de microdissection dans du milieu de décontamination. A cette étape, il est

nécessaire de « nettoyer » les bronches et les bronchioles des tissus avoisinant, afin de limiter

la contamination par d'autres types cellulaires épithéliaux (fibroblastes et hématies), et par le

mucus (ce qui pourrait permettre de limiter les infections dues aux bactéries et aux

champignons).

6.2.2.1.2 Isolement des cellules

Les fragments de bronches ou de bronchioles sont mis en suspension dans un tube

contenant du milieu de culture contenant de la protéase (0,1%) et de la désoxyribonucléase I

(0,01%) pendant environ 24 heures à 4°C. La digestion enzymatique est stoppée par addition

de sérum de veau fœtal (10% du volume). Les segments de bronches ou de bronchioles sont

retirés du tube puis les cellules sont récupérées après centrifugation (600 rotations par minute

pendant 5 minutes) sous forme d'un culot cellulaire.

Composition du milieu de culture : DMEM/HAM-F12 supplémenté avec : insuline (5µg/ml),

transferrine (7,5µg/ml), hydrocortisone (10-6M), ECGS (2µg/ml), EGF (25ηg/ml),

triiodothyronine (3,10-8M), L-glutamine (1mM), pénicilline/streptomycine (100µg/ml). Pour

154

les cultures de cellules épithéliales issues de prélèvements mucoviscidosiques deux

antibiotiques sont ajoutés à ce milieu : la ceftazidime (125µg/ml) et la tobramycine

(100µg/ml). Tous les produits proviennent de chez Sigma Aldrich (St Quentin Fallavier).

6.2.2.1.3 Ensemencement des cellules

Les cellules sont ensemencées sur une membrane de collagène perméable reposant sur

un support en polycarbonate appelé « CMS » pour « Collagen Matrix Support » décrit par

Yankaskas et al. en 1985. Ce support est percé en son centre d'un trou d'un diamètre de 2 mm

ou de 3,5 mm. C'est sur celui-ci qu’est alors disposé la membrane de collagène et ce en

plusieurs couches. Tout d'abord, une couche d'un mélange de collagène de type I (15 mg/ml

dans acide acétique 0,2%) et de glutaraldéhyde (2,5%) est appliquée, puis une couche de

collagène pur, puis, après une étape de solidification par du glutaraldéhyde, une couche de

vitrogène (Interchim, Montluçon, France). Les cellules sont ensemencées à la face supérieure

du CMS n'entrant ainsi en contact avec le milieu de culture que par leur face basolatérale, en

effet aucun liquide, excepté le faible volume déposé en même temps que les cellules lors de

l'ensemencement, n'est rajouté sur leur face apicale. Ce type de culture est donc appelé :

culture en interface air-liquide. Les cellules sont ensuite mises à l'incubateur (37°C, 5% CO2)

pendant 7 à 12 jours, le milieu de culture étant changé tous les deux jours.

155

6.2.3 Mesure des propriétés bioélectriques des cultures

primaires bronchiques et bronchiolaires dans les chambres

dites de Ussing

6.2.3.1 Historique

La technique des chambres de Ussing a été mise au point par Hans Ussing dans les

années 1950 afin d'étudier les transports vectoriels d'ions au travers de la peau de grenouille.

Ussing a démontré l'existence d'un transport actif transépithélial de Na+ à travers la peau de

grenouille qui est à l'origine de la ddp entre les deux faces de la peau de grenouille (Ussing et

Zerhan 1951). Koefoed-Johsen et Ussing ont également démontré que le transport de Na+ est

couplé à une entrée active de K+ par la membrane basale et à un transport passif de Cl- du

milieu extérieur vers le milieu intérieur (Koefoed-Johnsen et Ussing 1958). Depuis cette

époque, les chambres de Ussing ont été utilisées pour étudier les transports ioniques d’un

grand nombre de préparations cellulaires épithéliales.

6.2.3.2 Description du système utilisé dans le laboratoire

Les supports des cultures cellulaires sont montés entre deux hemi-chambres en

plexiglas reliées chacunes à une cuve (figure 40). Celles-ci sont indépendantes et peuvent

donc contenir la même solution expérimentale ou deux solutions différentes.

156

Figure 40 : Installation des chambres de Ussing.

157

Cette séparation permet aussi l’addition de drogues à la face désirée (apicale, basale ou les

deux) de la culture étudiée. Les solutions contenues dans les cuves sont chauffées à 37°C et

un système de bullage par un mélange 95% O2/5% CO2 permet de faire circuler les solutions.

La configuration en U permet d'assurer une pression hydrostatique équivalente sur les deux

faces de la culture, évitant ainsi d'éventuels transports passifs dus à une différence de

pression.

Une électrode de mesure de voltage est située dans chacune des hemi-chambres et au plus

près de la culture étudiée. Ces électrodes, constituées d’agar-KCl 3M, sont reliées à un

voltmètre (DVC 1000, WPI, Aston UK) et permettent de mesurer la différence de potentiel

(ddp) développée par la culture cellulaire en cours d’étude. Deux autres électrodes composées

d’agar-KBR également situées dans chacune des hemi-chambres et elles aussi reliées au DVC

1000 permettent de mesurer le courant de court-circuit (Isc pour short circuit current). Afin de

mesurer cet Isc, la technique de « voltage clamp » peut être utilisée : l’épithélium est « court-

circuité » par l’injection d’un courant permettant de maintenir la ddp transépithéliale à 0mV.

Le courant de court circuit correspond à la valeur du courant nécessaire pour annuler la ddp,

celle-ci est mesurée en continue par le voltmètre (DVC 1000). Périodiquement, un voltage

déterminé par l’expérimentateur et non nul (+2mV lors de nos expériences) est imposé afin

d’obtenir une estimation de la résistance transépithéliale (Rt). Celle-ci pourra être obtenue par

l’équation d’Ohm :

Rt(Ω) = ∆U(mV)/ ∆Isc (µA)

Le DVC 1000 est relié à un enregistreur graphique qui retranscrit l’Isc au cours de

l’expérience (figure 41). Les propriétés électriques des épithéliums sont classiquement

représentées en un circuit électrique décrit figure 42.

158

Figure 41 : Exemple de tracé représentant l’enregistrement de l’Isc d’une culture de cellules épithéliales bronchiques non-CF. Avant chaque expérience, un support contrôle sans cellule est placé dans les chambres de Ussing et sa résistance est mesurée et annulée par le DVC1000. La ddp et l’Isc sont enregistrés en continu, pour obtenir la résistance de la culture cellulaire, on applique la loi d’Ohm en divisant le voltage imposé par le ∆Isc correspondant.

Figure 42 : Modélisation de la barrière épithéliale en un circuit électrique. La membrane apicale est représentée comme une pile au Na+ (ENa) montée en parallèle avec une pile au Cl- (ECl). Ces deux piles sont montées en série avec une résistance (respectivement RNa et RCl). La membrane basolatérale est représentée comme une seule pile (Rb) montée en série avec une résistance (Rb). Rs (Rshunt) représente la somme des résistances dues aux jonctions serrées et aux « espaces latéraux intercellulaires » et est représentée comme une simple résistance car les bains apicaux et basolatéraux ont la même concentration ionique. Le circuit externe est représenté comme un générateur de courant (∞).

159

6.2.3.3 Protocoles

Effets du NO : Les cultures confluentes sont exposées au SNP (sodium nitroprusside,

10-4M) ou à son véhicule (eau distillée) pendant 20 à 30 minutes dans un incubateur (37°C,

5% CO2), puis sont montées en chambre de Ussing comme décrit précédemment. Cent

microlitres de SNP (10-4M) ou de son véhicule sont aussitôt ajoutés dans les cuves apicale et

basolatérale. Après stabilisation du système et mesure des paramètres de base (ddp, Isc et R),

les drogues amiloride (10-5M en apical), forskoline (10-5M en apical et en basolatéral) et ATP

(10-4M en apical) sont ajoutées séquentiellement.

Effets du GMPc : Les cultures confluentes sont montées dans les chambres de Ussing

et après stabilisation du système, le 8-bromo-GMPc (10-4M, analogue perméant du GMPc et

plus résistant à l'hydrolyse des phosphodiestérases) et le Zaprinast (10-4M, un inhibiteur de

phosphodiestérase) sont ajoutés en même temps, et après stabilisation des variables

bioélectriques, suivi de l'amiloride (10-5M en apical), de la forskoline (10-5M en apical et en

basolatéral) et de l'ATP (10-4M en apical).

Inhibition de la voie du GMPc : Les cultures confluentes sont exposées à l'ODQ

(10µM en apical et en basolatéral) ou à son véhicule (DMSO dilué dans du KBR) pendant 15

à 20 minutes en incubateur (37°C, 5% CO2), les cultures sont ensuite exposées au SNP (10-4M

en apical et en basolatéral) pendant 20 à 30 minutes également en incubateur. Les cultures

sont ensuite montées dans les chambres de Ussing comme décrit précédemment. 100µl de

SNP (10-4M) sont aussitôt ajoutés dans les cuves apicale et basolatérale. Après stabilisation du

système et mesure des paramètres de base (ddp, Isc et R), les drogues amiloride (10-5M en

160

apical), forskoline (10-5M en apical et en basolatéral) et ATP (10-4M en apical) sont ajoutées

séquentiellement.

6.2.3.4 Analyses statistiques

Nous avons utilisé un test t de Student pour l’analyse statistique et les résultats sont

considérés comme significativement différents lorsque p < 0,05.

161

6.3 Résultats

6.3.1 Caractéristiques des prélèvements

Les caractéristiques des patients inclus dans les différents protocoles sont résumées

dans le tableau 5. Les 2 patients de l’étude « SNP, bronche CF » étaient homozygotes pour la

mutation ∆F508. Sur les 6 patients CF inclus dans l’étude « SNP, bronchioles CF », 2 étaient

homozygotes ∆F508, 2 hétérozygotes ∆F508/XX, pour 2 patients le génotype et le sexe n’ont

pu être renseignés.

SNP 8-Br-GMPc + Zaprinsat

ODQ

Bronches non-CF

Bronchioles non-CF

Bronches CF

Bronchioles CF

Bronches non-CF

Bronches non-CF

n 4 8 2 6 5 8

Moyenne d’âge ± SE (ans)

62,7 ± 3,7 63,4 ± 3,1 28,5 ± 0,5 22,3 ± 4,8 66,0 ± 6,9 60,6 ± 2,2

Sexe (homme/femme)

3h/1f 8h 2h 3h/1f 4h/1f 8h

Tableau 5 : Tableau récapitulatif des caractéristiques des donneurs (n correspond au nombre de patients).

162

6.3.2 Exposition des cultures bronchiques et bronchiolaires

non-CF à un donneur de NO, le SNP

Cellules épithéliales bronchiques non-CF : Les cultures exposées au SNP (10-4M)

pendant 20 minutes sur les faces apicale et basolatérale présentent un Isc et une ddp de base

significativement inférieures par rapport aux cultures exposées au véhicule du SNP (eau

distillée) (tableau 6). Le SNP inhibe significativement les variations de l’Isc induites par

l’amiloride, par la forskoline et par l’ATP (figure 43).

Véhicule (n = 20) SNP (n = 20) p

ddp basale (mV) -5,2 ± 0,5 -3,5 ± 0,5 < 0,05

Isc basal (µA/cm2) 54,2 ± 6,1 33,2 ± 4,2 < 0,01

Rt basale (Ω.cm2) 106,2 ± 9,1 107,1 ± 7,8 NS

∆Isc amiloride (µA/cm2)

-22,8 ± 3,8 -7,0 ± 1,4 < 0,01

∆Isc forskoline (µA/cm2)

1,9 ± 0,5 0,4 ± 0,1 < 0,01

∆Isc ATP (µA/cm2) 22,2 ± 2,5 16,1 ± 1,2 < 0,05

Tableau 6 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).

Cellules épithéliales bronchiolaires non-CF : Les cultures exposées au SNP (10-4M)

présentent une ddp et un Isc significativement inférieurs comparées aux cellules exposées au

véhicule du SNP (tableau 7). Le SNP inhibe significativement les variations de l’Isc induites

par l’amiloride et par la forskoline (figure 43).

163


ddp basale (mV) -2,7 ± 0,5 -1,5 ± 0,2 < 0,05

Isc basal (µA/cm2) 60,0 ± 7,9 39,1 ± 4,1 < 0,05

Rt basale (Ω.cm2) 45,0 ± 6,7 40,3 ± 7,0 NS


-27,7 ± 5,3 -11,8 ± 1,7 < 0,05


5,0 ± 1,0 0,6 ± 0,2 < 0,01

∆Isc ATP (µA/cm2) 30,9 ± 7,1 24,6 ± 5,2 NS

Tableau 7 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiolaires non-CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).

Le SNP inhibe les transports de Na+ et de Cl- dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires non-CF

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

∆∆ ∆∆Is

c (µ

A/c

m2)

bronches véhicule SNP

bronches SNP

bronchioles véhicule SNP

bronchioles SNP

Figure 43 : Histogramme des variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires non-CF humaines exposées au SNP (barre : différence significative).

Forskoline (10-5M) ATP (10-4M)

Amiloride (10-5M)

164

6.3.3 Exposition des cultures bronchiques et bronchiolaires

CF à un donneur de NO, le SNP

Cellules épithéliales bronchiques CF : Les cultures exposées au SNP (10-4M) pendant

20 minutes sur les faces apicale et basale, présentent un Isc significativement inférieur par

rapport aux cultures exposées au véhicule du SNP (eau distillée) (tableau 8). Le SNP inhibe

significativement les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (figure 44).


ddp basale (mV) -3,8 ± 0,6 -2,4 ± 0,4 NS

Isc basal (µA/cm2) 33,4 ± 4,2 21,2 ± 2,2 < 0,05

Rt basale (Ω.cm2) 122,7 ± 18,4 128,7 ± 27,2 NS


-16,7 ± 3,4 -6,8 ± 0,9 < 0,05


0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1 NS

∆Isc ATP (µA/cm2) 31,9 ± 6,2 23,5 ± 5,3 NS

Tableau 8 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).

Cellules épithéliales bronchiolaires non-CF : Les cultures exposées au SNP présentent

un Isc de base significativement inférieur par rapport aux cultures qui ont été exposées au

véhicule du SNP (tableau 9). Le SNP inhibe significativement les variations de l’Isc induites

par l’amiloride et l’ATP. Les cultures exposées au SNP présentent une Rt significativement

supérieure par rapport aux préparations cellulaires exposées au véhicule du SNP (figure 44).

165


ddp basale (mV) -4,9 ± 0,7 -4,9 ± 0,6 NS

Isc basal (µA/cm2) 41,0 ± 4,3 28,6 ± 2,9 < 0,05

Rt basale (Ω.cm2) 123,2 ± 16,5 173,0 ± 18,2 < 0,05


-27,9 ± 4,1 -17,5 ± 2,6 < 0,05


0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 NS

∆Isc ATP (µA/cm2) 35,1 ± 4,2 22,6 ± 2,3 < 0,05

Tableau 9 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc en réponse à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiolaires CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).

Le SNP inhibe les transports de Na+ dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

∆∆ ∆∆Is

c (µ

A/c

m2)

bronches CF véhicule SNP

bronches CF SNP

bronchioles CF véhicule SNP

bronchioles CF SNP

Figure 44 : Histogramme représentant les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF humaines exposées au SNP (barre : différence significative).

Forskoline (10-5M) ATP (10-4M)

Amiloride (10-5M)

166

6.3.4 Exposition des cultures primaires de cellules épithéliales

bronchiques non-CF au 8-Br-GMPc et au zaprinast

Cellules épithéliales bronchiques non-CF : L’addition du 8-Br-GMPc et du zaprinast

ou de leurs véhicules (eau distillée + DMSO) entraîne une diminution de l'Isc similaire

indiquant que le véhicule est responsable de cet effet (tableau 10). En effet, même si le

DMSO, véhicule du zaprinast, est dilué pour atteindre une concentration finale < 0,1%, il

pourrait être à l'origine de cette diminution de l'Isc. Cependant les valeurs de la résistance

transépithéliale indiquent que l'épithélium conserve son intégrité au cours de l'expérience. Le

« cocktail 8Z » inhibe significativement les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la

forskoline et l’ATP (figure 45).

Véhicule (n = 10) "8Z" (n = 11) p

ddp basale (mV) -3,4 ± 0,7 -2,6 ± 0,4 NS

Isc basal (µA/cm2) 56,3 ± 10,1 42,6 ± 8,6 NS

Rt basale (Ω.cm2) 63,4 ± 7,7 77,6 ± 19,6 NS

∆Isc véhicule ou "8Z"

-15,3 ± 4,1 -9,8 ± 3,6 NS


-18,5 ± 2,7 -9,8 ± 2,5 < 0,05


5,6 ± 1,7 1,7 ± 0,5 < 0,05

∆Isc ATP (µA/cm2) 21,7 ± 2,1 11,9 ± 2,0 < 0,05

Tableau 10 : Effets du "cocktail 8Z" (8-Br-GMPc + zaprinast, 10-4M en apical) sur les variables bioélectriques de base et sur les réactions à l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).

167

Les effets du SNP sont reproduits par le cocktail 8Z dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF

-30

-20

-10

0

10

20

30∆∆ ∆∆

Isc

(µA

/cm

2)

bronches non-CF véhicule8Zbronches non-CF 8Z

Figure 45 : Histogramme représentant les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF humaines exposées au 8-Br-GMPc et au Zaprinast (barre : différence significative).

168

6.3.5 Exposition des cultures primaires de cellules épithéliales

bronchiques non-CF au SNP en présence ou non d'ODQ, un

inhibiteur de la guanylate cyclase soluble

Cellules épithéliales bronchiques non-CF : Les cultures exposées en incubateur au

véhicule de l'ODQ puis au SNP présentent un Isc de base significativement inférieur comparé

aux cultures exposées au SNP en présence d'ODQ (tableau 11). En présence du véhicule de

l'ODQ, le SNP inhibe les variations de l’Isc induites par l’amiloride et la forskoline (figure

46).

ODQ + SNP

(n = 16)

Véhicule ODQ +

SNP (n = 17) p

ddp basale (mV) -3,5 ± 0,4 -3,1 ± 0,4 NS

Isc basal (µA/cm2) 65,5 ± 6,6 46,3 ± 5,0 < 0,05

Rt basale (Ω.cm2) 53,8 ± 5,2 72,3 ± 8,3 NS


-23,8 ± 3,4 -14,5 ± 0,9 < 0,05


2,8 ± 0,4 0,9 ± 0,3 < 0,05

∆Isc ATP (µA/cm2) 35,8 ± 4,8 25,7 ± 4,3 NS

Tableau 11 : Effets du SNP (10-4M en apical et en basolatéral) en présence d'ODQ (10µM en apical et en basolatéral) ou de son véhicule (DMSO) sur les variables bioélectriques de base et sur les variations de l’Isc induites par l’amiloride (10-5M en apical), la forskoline (10-5M en apical et basolatéral) et l’ATP (10-

4M en apical) sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non CF (n correspond au nombre de cultures, résultats ± SE, NS : non significatif).

169

Les effets du SNP sont inhibés par l'ODQ dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50∆∆ ∆∆

Isc

(µ

A/c

m2)

bronches non-CF ODQ + SNP

bronches non-CF véhicule ODQ +SNP

Figure 46 : Histogramme représentant les variations de l’Isc induites par l’amiloride, la forskoline et l’ATP dans des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques non-CF humaines exposées au SNP en présence d’ODQ ou de son véhicule (barre : différence significative).

170

6.4 Discussion

Nous avons observé que, dans les cultures bronchiques et bronchiolaires non-CF,

l'exposition au SNP entraînait une diminution de la ddp de base ainsi que de l'Isc de base.

Dans les deux types de préparations cellulaires non-CF exposées au SNP, nous avons

également observé une diminution significative des variations de l’Isc en réponse à

l’amiloride et à la forskoline. Les effets du SNP, dans des cultures de cellules épithéliales

bronchiques non-CF, sont reproduits par l'exposition au 8-Br-GMPc et au zaprinast et sont

inhibés en présence de l'ODQ. Dans les cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques

et bronchiolaires CF, l'exposition au SNP induit des diminutions significatives de l'Isc de base

et de la variation de l'Isc sensible à l'amiloride.

L'exposition au SNP des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et

bronchiolaires non-CF entraîne une diminution de l'Isc de base. Ce courant étant

majoritairement porté par l'absorption active de Na+, nos résultats suggèrent que le NO inhibe

cette absorption. La variation de l’Isc sensible à l’amiloride qui est significativement plus

faible en présence de SNP va également dans ce sens. Le NO pourrait donc inhiber les canaux

ENaC, sensibles à l'amiloride, ou la pompe Na+/K+/ATPase située à la membrane basolatérale

ou bien encore des canaux K+ basolatéraux qui participent à la création de gradient de

concentration permettant l'entrée de Na+ par les canaux ENaC. L'exposition des préparations

cellulaires bronchiques non-CF au 8-Br-GMPc et au zaprinast entraîne une diminution de la

variation de l’Isc en réponse à l'amiloride. Les effets du SNP sur l'Isc de base et sur la

variation de l’Isc en réponse à l'addition d’amiloride sont abolis par la présence de l'ODQ, un

inhibiteur de la guanylate cyclase soluble. Ces résultats suggèrent que l'action du NO

171

implique la voie du GMPc. Nos résultats sont en accord avec les résultats obtenus par Elmer

et al. sur l'épithélium nasal murin (Elmer et al. 1999). En effet, ces auteurs ont observé que le

NO pouvait participer à l’inhibition de l’absorption active de Na+. Une autre étude réalisée sur

des pneumocytes de type II de rat indique également que le NO inhibe l'absorption de Na+ à la

fois par une action sur ENaC et sur la pompe Na+/K+/ATPase (Guo et al. 1998). Kelley et

Drumm ont également montré, chez la souris, que le NO pouvait entraîner une inhibition de

l'absorption de Na+ et que cet effet impliquait la voie du GMPc (Kelley et Drumm 1998).

L'inhibition de l'absorption de Na+ par le NO et l'implication de la voie du GMPc observées

dans notre étude sur des cultures primaires de cellules épithéliales bronchiques et

bronchiolaires non-CF sont donc en accord avec ces études. Cependant, nos résultats sont

discordants avec les résultats obtenus par Rückes-Nilges et al. sur des cultures primaires de

cellules nasales humaines (Rückes-Nilges et al. 2000). En effet, dans leur étude, Rückes-

Nilges et al n'ont pas observé d'effet du NO sur les transports de Na+ dans des cultures de

cellules nasales provenant de patients non-CF et CF. Ces différences pourraient être

expliquées par un mode d'action différent du NO sur les transports ioniques selon les étages

de l'arbre aérien. Cependant, Schwiebert et al. ont montré que le NO pouvait stimuler les

canaux dépendant des nucléotides cyclique cationiques (cNTP-dépendants) dans les cellules

trachéales de rat (Schwiebert et al. 1997). L'ARNm de ces canaux a été retrouvé dans

l'épithélium nasal humain. Les observations de Rückes-Nilges et al. pourraient donc résulter

d’un effet combiné : activation de ces canaux cNTP-dépendants et inhibition des canaux

ENaC. Lazrak et al. ont observé que l’exposition au NO ou l’augmentation de la

concentration en GMPc intracellulaire inhibait l’absorption de Na+ sensible à l’amiloride dans

la lignée cellulaire alvéolaire humaine A549 (Lazrak et al. 2000). Nos résultats sont donc en

accord avec cette étude.

172

Nous avons également observé dans notre étude une inhibition de la sécrétion de Cl-

AMPc-dépendante dans les cultures de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires

non-CF. Elmer et al. ont observé que le NO provoquait une augmentation de la sécrétion de

Cl- dans l’épithélium nasal murin (Elmer et al. 1999). En revanche, une autre étude montre

que, dans le poumon fœtal de mouton, le NO diminue la production de liquide due à la

sécrétion de Cl- et d'eau, suggérant une inhibition de la sécrétion active de Cl- (Cummings et

Wang 2001). Les auteurs ont également montré que ces effets passeraient par une

augmentation de la concentration du GMPc intracellulaire. Kamosinska et al. ont observé que

le NO pouvait stimuler la sécrétion de Cl- dans la lignée cellulaire pulmonaire A549 par la

voie du GMPc (Kamosinska et al. 1997). Cependant, les auteurs précisent que cette sécrétion

de Cl- est indépendante de CFTR. A l’inverse, Rückes-Nilges et al. n'ont pas observé d'effet

sécrétagogue du NO dans des cultures primaires de cellules nasales (Rückes-Nilges 2000).

Les résultats obtenus par Kamosinska et al. et Elmer et al. ont été obtenus sur des lignées

cellulaires et ne reflètent donc pas forcément les propriétés des tissus correspondants.

Nos résultats montrent que le SNP induit également une diminution de l'Isc de base

ainsi qu'une diminution de la variation de l’Isc sensible à l'amiloride dans les cultures

primaires de cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires humaines CF. Ces résultats

indiquent que le NO inhibe l'absorption active de Na+ sensible à l’amiloride dans les voies

aériennes mucoviscidosiques. Rückes-Nilges et al. n'ont pas observé d’effet inhibiteur du NO

sur l'absorption de Na+ dans des cultures primaires de cellules nasales CF (Rückes-Nilges et

al. 2000). En revanche, Texereau et al. ont récemment montré que chez des patients CF les

valeurs de la ddp nasale et la concentration en NO dans l'air exhalé étaient inversement

corrélées (Texereau et al. 2005). Les auteurs montrent en effet que les plus hautes valeur de

NO dans l'air exhalé sont associées au plus basses valeurs de ddp et inversement avec

173

toutefois une disparition de cette relation pour des valeurs de ddp nasale supérieure à -50mV.

Les auteurs ont suggéré que le NO pouvait inhiber l'absorption de Na+, en partant du fait que

celle-ci est la principale composante de la conductance transépithéliale basale. Par ailleurs,

Kelley et Drumm ont démontré chez des souris knock-out pour CFTR que la perfusion

d'inhibiteur des NOS augmente les valeurs de la différence de potentiel transépithéliale nasale

(Kelley et Drumm 1998). Les résultats que nous avons obtenus au cours de cette étude sur les

cellules épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF sont donc en accord avec ces derniers

résultats.

En conclusion, nous avons observé que le NO inhibe les transports de Na+ et de Cl-

transépithéliaux au niveau des voies aériennes humaines proximales et distales non-CF et CF

et que ces effets semblent passer par la voie du GMPc. Ces résultats peuvent avoir une

implication importante dans le cadre de la mucoviscidose. En effet la diminution de la

concentration en NO dans l'air exhalé observée chez les patients mucoviscidosiques pourrait

participer à l'hyperabsorption de Na+, altérant la clairance mucociliaire et favorisant les

infections bactériennes chroniques. L’administration de NO pourrait donc représenter un

moyen potentiel pour normaliser le transport de Na+ dans les voies aériennes

mucoviscidosiques.

174

7 D7 D7 D7 DÉÉÉÉTERMINATION DUTERMINATION DUTERMINATION DUTERMINATION DU POURCENTAGE DEPOURCENTAGE DEPOURCENTAGE DEPOURCENTAGE DE

CELLULESCELLULESCELLULESCELLULES NONNONNONNON----CF PERMETTANT DECF PERMETTANT DECF PERMETTANT DECF PERMETTANT DE

NORMALISER LESNORMALISER LESNORMALISER LESNORMALISER LES FONCTIONS FONCTIONS FONCTIONS FONCTIONS ÉÉÉÉPITHPITHPITHPITHÉÉÉÉLIALESLIALESLIALESLIALES

D'UNE CULTURE PRIMAID'UNE CULTURE PRIMAID'UNE CULTURE PRIMAID'UNE CULTURE PRIMAIRE DE CELLULES RE DE CELLULES RE DE CELLULES RE DE CELLULES

ÉÉÉÉPITHPITHPITHPITHÉÉÉÉLIALESLIALESLIALESLIALES BRONCHIQUES BRONCHIQUES BRONCHIQUES BRONCHIQUES CFCFCFCF

175

7.1 Introduction

Les maladies génétiques, comme la mucoviscidose, sont dues à des mutations

génétiques entraînant la synthèse de protéine altérée voire l'absence de protéine provoquant

des dysfonctionnements cellulaires et organiques. Afin de restaurer les fonctions

physiologiques, plusieurs stratégies peuvent être envisagées. 1/ L'utilisation d'agents

pharmacologiques. Dans le cadre de la mucoviscidose, la mutation la plus fréquemment

rencontrée est la mutation ∆F508 qui entraîne l'absence de la protéine à la membrane mais la

protéine mutée reste potentiellement fonctionnelle. L'utilisation d'agents pharmacologiques

permettant d'adresser ce mutant à la membrane peut donc constituer une voie thérapeutique.

De tels activateurs sont en cours de développement (Noel et al. 2006; VanGoor et al. 2006).

2/ Le remplacement du gène défectueux par le gène sauvage (non muté) par thérapie génique.

Le succès de la thérapie génique repose sur plusieurs points importants, parmi lesquels

l’incorporation efficace du gène et du promoteur correspondant dans la cellule cible. Après

cette incorporation, la protéine doit être produite à un taux physiologique et doit remplir son

rôle fonctionnel au sein de la cellule. Idéalement, le transfert de gène doit entraîner une

expression permanente ou au moins à long terme dans les cellules malades et prévenir ainsi la

cascade physiopathologique causée par la mutation.

Le principe de la thérapie génique est « simple », il « suffit » de remplacer le gène

muté par le gène normal (figure 47). Cette stratégie thérapeutique concerne essentiellement

les maladies provoquées par le dysfonctionnement d’un seul gène, comme la mucoviscidose

ou le déficit en α1-anti-trypsine. Cependant, des études récentes suggèrent que cette thérapie

pourrait être envisagée dans le traitement des cancers (Cross et Burmester 2006).

176

Figure 47 : Schéma simplifié du principe de la thérapie génique. Le vecteur contenant la copie normale du gène responsable de la maladie reconnaît spécifiquement sa cellule cible. Le vecteur est internalisé dans la cellule cible, la copie du gène normal pénètre dans le noyau dans la cellule et s’intègre dans le génome de la cellule. La protéine normale est alors correctement produite, adressée (à la membrane apicale pour CFTR) et est fonctionnelle (d’après http://www.gensuisse.ch).

177

Si la thérapie génique semble constituer la stratégie idéale pour « guérir » les personnes

atteintes par ces maladies monogéniques, le choix du vecteur et des cellules cibles, le mode

d’administration,… demeurent des facteurs cruciaux dans son efficacité.

7.1.1 Identification des cellules cibles dans les voies aériennes

Le choix de la/les cellule(s) à corriger demeure une des conditions essentielles pour

que la thérapie génique puisse être efficace. Les études portant sur l’expression de CFTR ont

permis de relativement bien définir sa distribution dans les voies aériennes proximales

(Engelhardt et al. 1992 ; Kreda et al. 2005). Kreda et al. ont observé, par immunohistochimie,

que les cellules ciliées étaient les seules cellules exprimant CFTR dans l’épithélium de surface

des voies aériennes, de la trachée aux bronchioles proximales. Kreda et al. n’ont en revanche,

pas détecté de marquage spécifique de la protéine CFTR dans les bronchioles terminales,

respiratoires et dans les alvéoles (Kreda et al. 2005). Cependant, nous avons observé au

laboratoire, un marquage spécifique correspondant à la protéine CFTR au niveau des alvéoles.

Nos données sont en accord avec les résultats de Fang et al. qui ont récemment montré que

CFTR était exprimé dans des cultures de pneumocytes de type II isolées à partir d'un poumon

adulte humain. Ils ont montré, par RT-PCR que le niveau d'expression des transcrits de CFTR

était similaire à ceux reportés dans les cellules épithéliales des voies aériennes et des études

fonctionnelles ont apporté la preuve de canaux chlore CFTR (Fang et al. 2006). Ces données

suggèrent 1/ que la protéine CFTR est exprimée tout le long des voies aériennes humaine et 2/

que les cellules ciliées sont le principal site d’expression dans l’épithélium de surface

bronchique et bronchiolaire. Les cellules ciliées peuvent donc constituer les cellules à corriger

aussi bien dans les voies aériennes proximales que distales.

178

Cependant, les cellules ciliées sont des cellules différenciées dont la durée de vie est

estimée à 3 mois chez l’homme (Anson et al. 2006). Une efficacité à plus long terme de la

thérapie génique impliquerait donc de cibler les cellules progénitrices (cellules avec un

nombre de divisions cellulaire défini, sans capacité d’auto-renouvellement et quelques

caractéristiques de différenciation) ou les cellules souches (cellules avec un nombre de

division cellulaire non défini, des capacités d’auto-renouvellement et des capacités à générer

des cellules progénitrices) à l’origine des cellules ciliées (Hong et al. 2001). Dans les voies

aériennes proximales humaines, les cellules souches n’ont pas encore été clairement

identifiées. Une étude récente a cependant démontré que dans les voies aériennes proximales,

les cellules basales isolées à partir de tissu pulmonaire humain adulte étaient capables de

restaurer un épithélium des voies aériennes bien différencié et fonctionnel (Hajj et al. 2006).

Ces résultats suggèrent que les cellules basales sont progénitrices de l’épithélium de surface

des voies aériennes proximales.

Dans les voies aériennes distales, dans lesquelles les cellules basales sont absentes, les

cellules de Clara ont montré des capacités de renouvellement dans l’épithélium des voies

aériennes de rongeur. Ces résultats suggèrent que les cellules de Clara pourraient constituer

des cellules régénératrices de l’épithélium des voies aériennes de mammifères (Boers et al.

1999). Chez l’homme, une hypothèse suggère qu’elles remplacent les cellules basales

progénitrices absentes des voies aériennes distales. Chez la souris, Reynolds et al., après avoir

détruit les cellules de Clara par exposition au naphtalène ont identifié deux types cellulaires

capables de proliférer : les CE (Clara cell secretory protein Expressing) et les PNEc

(Pulmonary NeuroEndocrine cells) situées dans des corps pulmonaires neuroendocrines

(NEB) (Reynolds et al. 2000). Les PNEc présentent des capacités d’autorenouvellement,

cependant, la présence des cellules CE semble être nécessaire pour induire la régénération de

179

l’épithélium (Hong et al. 2001). Au niveau alvéolaire, il est généralement admis que les PII

possèdent des propriétés de cellules progénitrices (Bishop et al. 2004 ; Anson et al. 2006).

En conclusion, la réparation et la régénération de l’épithélium pulmonaire ne fait

probablement pas appel à un seul type de cellules souches/progénitrices, chaque étage des

voies aériennes semblant en effet posséder son propre réservoir.

7.1.2 Les différents vecteurs utilisés dans les voies aériennes

humaines

Le faible niveau de transfection obtenu avec l’ADN nu a conduit à l’utilisation de

vecteurs afin d’améliorer l’efficacité du transfert et l’expression du gène. L’ADNc du gène

CF, pour la mucoviscidose, est utilisé comme matériel de transfert. Il est intégré dans un

vecteur biologique. Les vecteurs peuvent être divisés en deux groupes : les vecteurs viraux

modifiés et les vecteurs non viraux (tableau 12).

7.1.2.1 Les vecteurs viraux

Les adénovirus ont été fréquemment utilisés lors des premiers essais de thérapie

génique dans le cadre de la mucoviscidose.

180

Viraux

Retrovirus Lentivirus

Adénovirus

AAV

Parainfluenza virus 1

Sendai virus

Non viraux

ADN nu

Liposomes

Cationiques

Vecteurs Avantages Inconvénients

Pas de gènes viraux, pas de protéines

virales, intégration dans les génome hôte

(rétrovirus)

Pas de réaction immunitaire, applications

répétées possibles, sureté

Possible insertion mutagène, division

cellulaire nécessaire pour l'intégration

(rétrovirus), faible concentration

Réponse immunitaire, inefficace lors

d'applications répétées

Taille ADNc limitée, synthèse difficile

Inflammation, réponse immunitaire

Transduction inefficace

Expression transitoire et faible

Efficacité, ne nécessite pas de division

cellulaire, produit en grande

concentration

Pas de gènes viraux, pas de protéines

virales, ne nécessite pas de division

cellulaire

Génome ARN, récepteurs apicaux,

réplication dans le cyoplasme

Simplicité, sureté, faible coût, pas de

réaction immunitaire

Tableau 12 : Avantages et désavantages des vecteurs actuellement utilisés pour le transfert de gène dans les voies aériennes (d’après Kolb et al. 2006).

181

Ces virus sont en effet naturellement capables d’infecter les voies aériennes humaines. Le

transfert de gène s’opère selon le principe d’une infection virale. Le virus, préalablement

rendu non virulent, se fixe sur la cellule cible et libère la copie du nouveau gène.

Malgré plusieurs générations d’adénovirus contenant de moins en moins de séquences

virales et un temps d’expression de la protéine amélioré, l’administration de ce type de

vecteur entraîne une réaction immunitaire dirigée contre les protéines virales (pour la

première génération d’adénovirus) et contre les composants de la capside virale (Flotte et

Laube 2001). De plus, les adénovirus ne permettent pas l’intégration du gène dans le génome

de la cellule et nécessite donc des administrations répétées. L’utilisation des adénovirus a

diminué lors de ces dernières années principalement à cause d’une efficacité insuffisante et du

développement d’une réaction inflammatoire (Griesenbach et al. 2006).

Les virus adéno-associés (AAV) ne semblent pas associés dans leur état sauvage à des

pathologies humaines et sont retrouvés fréquemment dans les voies aériennes et le tractus

gastro-intestinal (Anson et al. 2006). Les vecteurs AAV possèdent plusieurs avantages par

rapport aux adénovirus, ils peuvent en effet s’intégrer dans le génome de la cellule hôte, « ils

ont un assez fort pouvoir « infectieux » et ne sont pas pathogènes. Le principal défaut des

AAV est leur capacité limitée de transport (4,7kb). L’insertion de la protéine CFTR, 4,5kb,

laisse donc une place limitée pour l’insertion d’éléments de contrôle transcritpionnel (Anson

et al. 2006). Des études pré-cliniques ont montré un transfert de gène et une expression sur un

temps relativement long (de 3 à 6 mois) dans les cellules épithéliales bronchiques de lapin ou

de primates (Flotte et al. 2005). Des essais cliniques de phase I puis de phase II ont montré un

transfert de gène efficace jusqu'à 30 jours après l’exposition initiale à l’AAV (rAAV2-CFTR).

Cependant, lors de ces études, des anticorps ont été détectés et la répétition de l’exposition à

182

l’AAV a montré une diminution de l’efficacité du transfert de gène (Flotte et al. 2005). La

génération d’autres AAV (AAV1, 4, 5, 6) qui ont montré une efficacité de transfection

supérieure à l’AAV2 (Zabner et al. 2000 ; Halbert et al. 2001 ; Virella-Lowell et al. 2005) ou

la restauration de transport de Cl- dans un lignée cellulaire CF (Sirninger et al. 2004) en font

des vecteurs de thérapie génique potentiellement intéressants dans le cadre de la

mucoviscidose.

Les lentivirus (Human Immunodeficiency Virus -1, Feline Immunodeficiency Virus,

Eequine Infectious Anaemia Virus, Simian Immunodeficiency Virus (SIV),…) ont également

été utilisés comme vecteurs. Une étude a montré que l’utilisation du SIV permettait une

expression à relativement long terme (200 jours) dans l’épithélium nasal murin (Griesenbach

et al. 2006). Cependant, le type de cellules transfectées n’a pas été déterminé dans cette étude.

La faisabilité de l’administration répétée de vecteurs lentiviraux dans les voies aériennes est

actuellement étudiée par plusieurs groupes.

7.1.2.2 Les vecteurs non-viraux

L’utilisation de vecteurs non viraux est également étudiée dans le cadre de la thérapie

génique. Ces vecteurs sont principalement les liposomes cationiques et les polymères

synthétiques (Montier et al. 2004 ; Davies 2006). Les mécanismes par lesquels les liposomes

cationiques libèrent l’ADNc dans la cellule ne sont pas encore totalement élucidés. Toutefois,

la diminution de la réponse inflammatoire et de la toxicité des vecteurs apparaîssent comme

des points importants en faveur des vecteurs non viraux. Des essais cliniques ont montré que

l’utilisation de liposomes pour transférer le gène CF dans l’épithélium nasal humain

183

permettait des corrections fonctionnelles (amélioration des transports de Cl-, pas d’effet sur

les transports de Na+) (Alton 2004 ; Davies 2006). Ces observations ont conduit à

l’administration de l’ADNc de CFTR dans le poumon de patients CF. Les auteurs ont observé

une amélioration des transports de Cl-, une diminution de l’adhérence bactérienne mais pas

d’amélioration des transports de Na+ (Alton et al. 1999 ; Alton 2004). Selon Davies,

l’administration répétée de vecteurs cationiques non viraux (DC-Chol/DOPE) serait bien

tolérée et resterait efficace (Davies 2006).

Les vecteurs viraux et non viraux possèdent chacun des avantages mais également des

désavantages, il apparaît que le vecteur « idéal » devra tenir compte des avantages de chacun.

Selon Alton et al., le vecteur idéal devrait répondre à 5 critères : 1/ administrable de façon

répétitive, 2/ stable et correspondant aux standards GMP (Good Manufacturing Pratices), 3/

administrable par inhalation, 4/ profil de « sûreté acceptable », 5/ capable d’être utilisé pour

des essais cliniques dans les 5 ans (Alton et al. 2004).

7.1.3 La barrière épithéliale

L’une des fonctions principales de l’épithélium des voies aériennes est de protéger

l’organisme d’agents pathogènes contenus dans l’air inhalé. Mais les systèmes de défense de

l’épithélium (clairance mucociliaire, jonctions serrées, localisation basolatérale des récepteurs

des vecteurs viraux, glycocalyx) limitent également l’efficacité des vecteurs utilisés dans les

essais de thérapie génique (Pickles 2004 ; Anson et al. 2006). Nous avons vu précédemment

que l’escalator mucociliaire permettait d’éliminer efficacement les particules inhalées et que

les complexes jonctionnels assuraient « l’étanchéité » de l’épithélium. Les récepteurs des

184

adénovirus et du virus de Coxsackie (CAR) sont séquestrés dans la partie basolatérale de la

membrane (Pickles et al. 1998). Pickles et al., dans la lignée cellulaire MDCK, ont réussi à

faire exprimer des CAR à la face apicale des cellules. Cependant, l’infection par les

adénovirus était toujours peu efficace. Après un traitement enzymatique permettant d’éliminer

les composants du glycocalyx, l’infection était 30 à 40 fois plus efficace (Pickles et al. 2000).

Des études ont estimé que 70% à 90% des adénovirus étaient séquestrés dans les macrophages

24h après leur administration (Pickles 2004). Selon les auteurs, les composants du glycocalyx

pourraient « présenter » les adénovirus aux macrophages entraînant ainsi leur dégradation par

phagocytose (Pickles 2004). Le développement d’une réponse immunitaire acquise, humorale

ou cellulaire, a montré une diminution de l’efficacité de plusieurs vecteurs lors de leur ré-

administration (Ferrari et al. 2003). Finalement, il existe également des barrières

intracellulaires pouvant limiter l’expression du gène. Le protéasome et les lysosomes

interviendraient entre autres dans l’élimination intracellulaire des vecteurs (Montier et al.

2004, Anson et al. 2006).

Si les études de thérapie génique, dans le cadre du traitement de la mucoviscidose, ont

démontré une certaine efficacité (amélioration des transports de Cl- principalement) et permis

de réaliser de nombreux progrès aussi bien techniques que théoriques, la thérapie génique doit

encore « mûrir » avant de proposer une solution alternative (définitive ?) à celles déjà

existantes. Cependant, l’amélioration de l’efficacité du transfert de gène (électroporation,

ultrason, magnétisme), le développement rapide des vecteurs non viraux (faible toxicité,

immunogénicité, facilité de fabrication,…) font que la thérapie génique reste envisageable.

185

7.1.4 La thérapie génique dans le cadre de la mucoviscidose

Rapidement après la découverte du gène CF, des études de thérapie génique ont été

entreprises avec différents vecteurs (rétrovirus, adénovirus, AAV, lipides cationiques,…) afin

de tester la faisabilité de la thérapie génique dans la mucoviscidose. Johnson et al. ont

transfecté 100 % des cellules d’une lignée cellulaire épithéliale d’origine trachéale humaine

(CFT1) à l’aide d’un rétrovirus contenant l’ADNc normal de CFTR. Les auteurs ont ensuite

mixé les cellules transfectées avec des cellules provenant de la même lignée mais non

transfectées. Par cette méthode, Johnson et al. ont démontré que 6 à 10 % de cellules

transfectées avec l’ADNc de CFTR permettait de restaurer des transports de Cl- dans la lignée

cellulaire CFT1 (Johnson et al. 1992). Cependant, les mêmes auteurs ont suggéré que dans

des cultures primaires de cellules épithéliales nasales CF près de 100 % des cellules

épithéliales CF devaient être corrigées afin d'observer une réduction de l'hyperabsorption de

Na+ caractéristique de la mucoviscidose (Johnson et al. 1995). Zabner et al. ont montré dans

des cultures primaires de cellules épithéliales des voies aériennes que la correction de CFTR,

par transfection avec un adénovirus, dans 20 % des cellules était suffisant pour corriger les

défauts des transports de fluide et d'électrolytes (Zabner et al. 1994). Plus récemment,

Ramalho et al. ont démontré que les patients CF avec les mutations ∆F508/3272-26A>G

possèdent 5 % de l'ARNm de CFTR par rapport aux personnes non CF (Ramalho et al. 2002).

Les auteurs ont suggéré que ce pourcentage pourrait être suffisant pour diminuer la sévérité de

la maladie, en raison du fait que chez ces patients la plupart des symptômes cliniques, dont les

fonctions pulmonaires, étaient moins sévères que chez les patients CF avec 2 mutations

sévères.

Ces études rapportent donc des résultats incomplets et discordants mais suggèrent

cependant qu'un faible niveau d’expression dans l’épithélium des voies aériennes de CFTR

186

pourrait être suffisant afin de corriger les transports de Cl- AMPc-dépendant ; elles suggèrent

également qu'un pourcentage plus important pourrait être nécessaire afin de corriger

l'hyperabsorption de Na+. Le but de notre étude a été de déterminer si 10 % de cellules non-

CF peuvent restaurer les transports de Na+ et de Cl- dans des cultures primaires humaines CF

provenant principalement de patients homozygotes pour la mutation ∆F508. Afin de tester

cette hypothèse, nous avons préparé 3 types de cultures primaires de cellules épithéliales

bronchiques humaines : 100 % CF, 100 % non-CF et 90 % CF et 10 % non CF (le dernier

type de culture sera désigné par la suite « co-cultures »). Nous avons ensuite mesuré les

variables bioélectriques de base (ddp, Isc et Rt) ainsi que les réactions à l'amiloride et à la

forskoline pour chaque type de cultures en chambres dites de Ussing. De plus, plusieurs

études ayant démontré un niveau d'interleukine 8 (IL-8) constitutionnellement plus élevé dans

les voies aériennes CF par rapport aux voies aériennes non CF (Bonfield et al. 1995 ; Tabary

et al. 2000), nous avons également dosé cette cytokine dans le surnageant des trois types de

préparations afin d’observer si d’autres fonctions épithéliales pouvaient être normalisées par

la présence d’un faible pourcentage de cellules de phénotype non-CF.

187


7.2.1 Echantillons

Cf chapitre 6.2.1

7.2.2 Cultures cellulaires

Cf chapitre 6.2.2

7.2.2.1 Co-cultures

Les co-cultures n'ont pu être réalisées que lorsque que nous avons reçu deux

prélèvements (un mucoviscidosique et un non mucoviscidosique) dans un laps de temps

relativement court (de 24h à 48h). Les cellules épithéliales bronchiques CF et non CF ont été

isolées comme décrit précédemment (cf. 6.2.2.1.2). Les cellules ont été ensuite comptées sur

une lame de Malassez : 10µl du culot cellulaire ont été dilués 100 ou 200 fois selon la densité

cellulaire, dans du milieu de culture; puis 15µl de ce mélange ont été déposés sur la lame de

Malassez. Après le comptage des cellules mucoviscidosiques et non mucoviscidosiques,

celles-ci ont été mélangées dans un tube Eppendorf selon les proportions voulues (tableau 13).

Le mélange cellulaire a ensuite été ensemencé comme décrit ci-dessus (cf. 6.2.2.1.3).

188

Cultures CF Co-cultures Cultures non-CF

Cellules

mucoviscidosiques (en %) 100 90 0

Cellules de phénotype

normal (en %) 0 10 100

Tableau 13 : Différentes concentrations de cellules utilisées pour la réalisation des co-cultures.

7.2.3 Evaluation de la prolifération cellulaire durant le temps

de culture

La prolifération cellulaire a été étudiée dans les trois types de préparations cellulaires

par immunomarquage (Ki67) à J0, J3, J5, J6, J10 après l'ensemencement. Les prélèvements

ont été inclus en bloc de paraffine puis coupés en sections de 4 µm d'épaisseur à l'aide d'un

microtome. Ces sections ont été placées sur des lames Super Frost Plus (CML, Nemours,

France), laissées une nuit à 37 °C dans une chambre humide, puis les sections ont été

déparaffinées par immersion dans une série de bains d'alcool. L'activité des peroxydases

endogènes a été réduite par un double chauffage à 95 °C pendant 40 min dans un tampon de

citrate (10 mM) de pH 6. L'activité des peroxydases endogènes a ensuite été bloquée par une

incubation de 10 min dans un bain d'H2O2 à 3 % à température ambiante (TA). Les sections

ont été incubées avec l'anticorps dirigé contre la protéine Ki67 à TA pendant 30 min (dilution

1/50ème). Le marquage a été révélé à l'aide de la méthode HRP (horseradish peroxydase)-

labeled polymer utilisant le kit LSAB2 (DakoCytomation, Trappes, France). Les sections ont

189

été colorées avec le 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride contenant 3% H2O2 dans un

tampon Tris puis légèrement contre-colorées à l’hémalun de Mayer. Après déshydratation par

immersion dans une série de bains d'alcool et de toluène, les sections ont été montées

automatiquement (RCM 90, Tech Inter, Maurepas, France).

Pour l'évaluation du marquage, les cellules ont été considérées comme positives

lorsqu'un marquage nucléaire distinct a été observé. Les lames ont été évaluées par 3

observateurs indépendants qui ont compté au moins 200 cellules sur différentes parties des

lames. Les résultats correspondent à la moyenne des 3 observateurs. Le niveau d'expression

du Ki67 correspond au ratio du nombre de cellules marquées positivement sur le nombre total

de cellules comptées.

7.2.4 Evaluation de l'apoptose au cours du temps de culture

La méthode TUNEL (« terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end

labelling ») a été réalisée à l'aide du kit Apo-Tag-Plus peroxidase in situ apoptosis detection

kit (S7101, Abcys, Paris, France) sur les 3 types de préparations cellulaires. Les cultures ont

été incluses dans un bloc de paraffine puis coupées en sections de 4 µm d'épaisseur à l'aide

d'un microtome. Ces sections ont été déparaffinées puis pré-traitées avec de la protéinase K

(20 µg/ml) pendant 15 min à TA. Après rinçage à l'eau distillée, l'activité peroxydase

endogène a été bloquée par incubation de 5 min dans H2O2 (3 %) pendant 5 min à TA. Après

rinçage, les préparations ont été incubées pendant 1 heure dans une chambre humide à 37°C

dans une solution contenant l’enzyme « terminal deoxytransferase » (TdT). Les sections ont

ensuite été rincées dans une solution « stop », bloquant ainsi la réaction, pendant 10 min à

190

TA, puis incubées avec le conjugué anti-digoxigénine pendant 30 min dans une chambre

humide à TA. La réaction a été révélée par exposition au diaminobenzidine (DAB). Les

sections ont ensuite été contre-colorées au vert de méthyle puis montées sur lames

automatiquement avant observation en microscopie optique.

Les contrôles négatifs ont été effectués en omettant de mettre l’enzyme TdT. Les

contrôles positifs ont été réalisés en exposant préalablement les sections à la DNase I (Sigma,

St Quentin-Fallavier, France) comme indiqué par le fabricant. Nous avons également utilisé la

lame témoin positif contenue dans le kit.

Pour l'évaluation du marquage, les cellules ont été considérées comme positives

lorsqu'un marquage nucléaire distinct et intense a été observé. Les lames ont été évaluées par

3 observateurs indépendants et les résultats correspondent à la moyenne de ces 3 observateurs.

Les résultats sont exprimés en fonction du nombre de cellules marquées par rapport au

nombre total de cellules comptées.

7.2.5 Mesure des propriétés bioélectriques des cultures

primaires bronchiques dans les chambres de Ussing

Cf chapitre 6.2.3.1, 6.2.3.2 et 6.2.3.3

191

7.2.3.4 Protocoles

Les cultures confluentes ont été montées en chambre de Ussing comme décrit

précédemment. Après stabilisation du système et mesure des variables bioélectriques de base

(ddp, Isc et Rt), les drogues amiloride (10-5M en apical), forskoline (10-5M en apical et en

basolatéral) ont été ajoutées séquentiellement.

7.2.6 Dosage des cytokines IL-8 dans le surnageant des

cultures (kit ELISA)

Deux cent cinquante µL de milieu de culture ont été déposés pendant 24h à la face

apicale des 3 types de culture primaire à confluence. Les surnageants ont été récupérés et

stockés à -20°C pour un dosage ultérieur de la cytokine IL-8. La détermination de la

concentration en IL-8 a été réalisée à l’aide d'un kit ELISA (R&D System, Lille, France) en

suivant les recommandations du fabricant. La limite de détection de ce kit est 3,5 pg/ml.

192

7.3 Résultats

7.3.1 Caractéristiques des prélèvements

Les caractéristiques des patients CF et non-CF sont indiquées dans le tableau 14.

n Moyenne d’âge (moyenne ± SE

ans)

Sexe (homme/femme)

Mutations

Patients CF 5 27,4 ± 2,6 5h

4 homozygotes ∆F508, 1

hétérozygote ∆F508/XX

Patients non-CF 4 62,3 ± 3,1 4h

Tableau 14 : Caractéristiques des patients inclus dans cette étude (n = nombre de patients).

7.3.2 Evaluation de la prolifération cellulaire durant le temps

de culture (Ki67)

Les pourcentages des cellules marquées dans les cultures 100 % CF, 100 % non-CF et

dans les co-cultures sont indiqués dans le tableau 15.

193

J0 J3 J5 J6 J10

Cultures 100 %

CF (n=5) 3,0 ± 0,9 0 0,3 ± 0,3 0 0,7 ± 0,7

Cultures 100 %

non-CF (n=9) 5,2 ± 1,0 0,1 ± 0,1 2,1 ± 0,8 3,8 ± 0,8 2,4 ± 1,3

Co-cultures 3,2 ± 0,2

(n=3)

0

(n=3)

0,4 ± 0,3

(n=6)

3,4 ± 1,6

(n=6)

0,3 ± 0,3

(n=6)

Tableau 15 : Résultats de l'évaluation de la prolifération cellulaire par immunomarquage (Ki67) dans les 3 types de préparations cellulaires (100 % CF, 100 % non-CF et co-cultures) au cours de leur temps de culture. Les résultats présentés dans ce tableau correspondent à la moyenne des résultats obtenus par chacun des 3 observateurs pour chaque type de préparations cellulaires et pour chaque date de prélèvement (moyenne ± SEM).

7.3.3 Evaluation de l'apoptose au cours du temps de culture

par la méthode « TUNEL »

Les pourcentages des cellules marquées dans les cultures 100 % CF, 100 % non-CF et

dans les co-cultures sont indiqués dans le tableau 16.

194

J0 J3 J5 J6 J10

Cultures 100 % CF

(n = 6) 2,1 ± 0,8 3,0 ± 0,8 2,0 ± 1,5 2,0 ± 0,5 6,5 ± 1,5

Cultures 100 %

non-CF (n = 8) 2,6 ± 0,7 2,4 ± 0,5 2,4 ± 0,7 2,3 ± 1,0 1,8 ± 0,4

Co-cultures (n = 6) 2,8 ± 1,6 3,0 ± 0,5 1,5 ± 0,5 3,1 ± 1,5 0

Tableau 16 : Résultats de l'évaluation de l'apoptose par la méthode TUNEL dans les 3 types de préparations cellulaires (100 % CF, 100 % non-CF et co-cultures) au cours de leur temps de culture. Les résultats présentés dans ce tableau correspondent à la moyenne des résultats obtenus par chacun des 3 observateurs pour chaque type de préparations cellulaires et pour chaque date de prélèvement (moyenne ± SEM).

7.3.4 Études en chambres de Ussing

Dix-huit cultures de cellules épithéliales bronchiques CF, 12 cultures de cellules

épithéliales bronchiques non-CF et 20 co-cultures ont été étudiées en chambre de Ussing. Les

variables bioélectriques de base des 3 types de préparations sont indiquées dans le tableau 17.

Variables bioélectriques de base

Type de cultures ddp (mV) Isc (µA/cm2) Rt (Ω.cm2)

Cultures 100 % CF (n = 18)

-4,0 ± 0,4 59,2 ± 5,4 71,8 ± 6,6

Cultures 100 % non-CF (n = 12)

-3,0 ± 0,4 42,8 ± 5,7* 76,6 ± 11,3

Co-cultures (n = 20)

-3,4 ± 0,4 43,5 ± 3,4** 90,5 ± 12,4

Tableau 17 : Variables bioélectriques de base des différents types de cultures. Les variables ddp, Isc et Rt ont été mesurés après la stabilisation des cultures. * signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et cultures 100 % non-CF, ** signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et co-cultures. Un p < 0,05 a été considéré comme significatif (n correspond au nombre de cultures cellulaires, moyenne ± SEM).

195

L’addition d’amiloride à la face apicale des cultures a provoqué une diminution

significative de l’Isc dans les trois types de préparations. Cette diminution est cependant

significativement supérieure dans les cultures 100 % CF par rapport aux cultures 100 % non-

CF (p < 0,05) ainsi que par rapport aux co-cultures (p < 0,05). Nous n’avons pas observé de

différence entre les cultures 100 % non-CF et les co-cultures. En présence d’amiloride,

l’addition de forskoline à la face apicale et à la face basolatérale des cultures a entraîné une

augmentation de l’Isc significativement supérieure à la fois dans les cultures 100 % non-CF et

dans les co-cultures par rapport aux cultures 100 % CF (p < 0,05). Ces résultats sont

regroupés dans le tableau 18. Nous n’avons pas observé de différence significative entre les

cultures 100 % non-CF et les co-cultures.

Amiloride Forskoline

Type de cultures

∆Isc (µA/cm2) ∆Isc (%) ∆Isc (µA/cm2) ∆Isc (%)

100 % CF (n = 18)

-38,1 ± 5,1 -60,5 ± 3,8 0,2 ± 0,1 0,6 ± 0,4

100 % non-CF (n = 12)

-12,7 ± 2,7 * -30,4 ± 4,9* 2,4 ± 0,5 * 8,2 ± 1,5*

Co-cultures (n = 20)

-13,1 ± 1,5 ** -30,5 ± 2,8** 2,2 ± 0,7 ** 6,7 ± 1,9**

Tableau 18 : Effets de l’amiloride et de la forskoline sur l’Isc des 3 types de cultures. * signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et cultures 100 % non-CF, ** signifie une différence significative entre cultures 100 % CF et co-cultures. Un p < 0,05 a été considéré comme significatif (n rend compte du nombre de culture et les résultats correspondent à la moyenne de ces cultures ± SEM).

196

Variations de l'Isc des différents types de cultures cellulaires en réponse à l'addition d'amiloride et de forskoline

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

∆∆ ∆∆ I

sc (µ

A/c

m2 )

100% CF

Cocultures

100% non CF

Figure 48 : Variations de l’Isc des différents types de cultures cellulaires en réponse à l’addition d’amiloride (10-5M, bain apical) et de forskoline (10-5M, bains apicaux et basolatéraux) (barre : p < 0,05).

Amiloride (10-5M)

Forskoline (10-5M)

197

7.3.5 Dosage de l’IL-8 dans le surnageant des cultures

La concentration moyenne d’IL-8 dans les surnageants des cultures 100 % CF mesurée

était de 26313 ± 3871 pg/ml/cm2 (n = 14). Cette concentration est significativement

supérieure par rapport aux cultures 100 % non-CF (n = 8, 11322 ± 1922 pg/ml/cm2, p < 0,05)

et aux co-cultures (n = 15, 8135 ± 988 pg/ml/cm2, p < 0,05). Nous n’avons pas observé de

différence entre les cultures 100 % non-CF et les co-cultures (figure 49).

198

[IL-8] dans les surnageants des cultures 100% CF, co-cultures et 100% non CF

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

[IL

-8]

en p

g/m

l/cm

2 Cultures CF

Co-cultures

Cultures non CF

Figure 49 : Concentrations en IL-8 mesurées dans le surnageant des cultures 100% CF, co-cultures et dans les cultures 100% non-CF (barre : p < 0,05).

199

7.4 Discussion

Dans cette étude, nous avons testé l’hypothèse que la présence de 10% de cellules

exprimant CFTR au sein d’une couche de cellules épithéliales bronchiques CF permettrait de

corriger les anomalies fonctionnelles de cette préparation. Nous avons déterminé les taux de

prolifération et d’apoptose au cours du temps de culture afin de nous assurer, respectivement,

de l’absence de prolifération et d’apoptose préférentielle des cellules non-CF ou CF, dans les

co-cultures. Nous avons ensuite étudié les propriétés électrophysiologiques de ces 3 types de

préparations en chambre de Ussing et mesuré la concentration d’une cytokine l’IL-8,

anormalement élevée dans les préparations CF. Nous avons observé que les transports de Na+

sensibles à l’amiloride, de Cl- dépendants de l’AMPc et que la sécrétion d’IL-8 étaient

normalisés dans les co-cultures.

Les résultats des immuno-marquages (Ki67 et TUNEL) montrent que la prolifération

cellulaire ainsi que le taux d’apoptose sont faibles et similaires dans les trois types de

préparations. On peut donc considérer que les co-cultures conservent leur répartition cellulaire

au moment de leur évaluation fonctionnelle. Nous avons évalué l'expression de la protéine Ki-

67 qui est fortement associée à la prolifération cellulaire (Scholzen et Gerdes 2000). La

présence de la protéine Ki-67 durant toutes le phases actives du cycle cellulaire (G1, S, G2 et

mitose) ainsi que son absence durant la phase G0 en fait un excellent outil permettant de

déterminer les cellules en prolifération au sein d’une population de cellules, y compris les

cellules épithéliales bronchiques. Récemment, des études ont également utilisé cette technique

sur des biopsies bronchiques et ont retrouvé un taux de prolifération d’environ 10%

(Benayoun et al. 2001). Cependant, nous n'avons pas retrouvé d'études portant sur la

200

prolifération cellulaire par immunomarquage de la protéine Ki67 sur des cultures primaires ;

notre étude montre que les cellules épithéliales bronchiques CF et non-CF cultivées en

interface air-liquide, selon nos conditions expérimentales, présentent un faible taux de

prolifération (<10%). Ces résultats sont en accord avec l’étude précitée et le faible taux de

prolifération pourrait être en rapport avec la forte densité cellulaire lors de la mise en culture

et résulter d’une inhibition de contact entre les cellules. Parallèlement à l'étude de la

prolifération cellulaire, nous avons également estimé le taux d'apoptose dans les 3 types de

préparations cellulaires par la méthode dite TUNEL. Dans nos préparations, un faible

pourcentage des cellules entre en apoptose et ce pourcentage est comparable entre les 3 types

de culture primaire. L’ensemble de ces résultats indique que nous avons conservé le

pourcentage initial des cellules CF et non-CF dans les co-cultures au moment de leur

évaluation fonctionnelle.

Les études en chambre de Ussing montrent 1) une différence significative entre les Isc

de base des cultures 100 % CF et les cultures 100 % non-CF ainsi qu’entre les cultures 100 %

CF et les co-cultures ; 2) une différence significative de la variation de l’Isc en réponse à

l’addition d’amiloride et de forskoline entre les cultures 100 % CF et les cultures 100 % non-

CF ainsi qu’entre les cultures 100 % CF et les co-cultures ; 3) qu’il n’existe pas de différence

significative entre les cultures 100 % non-CF et les co-cultures dans les variations de l’Isc

induites par l’amiloride et par la forskoline. Les données électrophysiologiques constituent

une évaluation fonctionnelle du phénotype CF et non-CF en terme de transport ionique. Des

études ont montré que l’Isc de base et les variations de l’Isc sensible à l’amiloride dans les

cultures de cellules épithéliales CF étaient significativement supérieurs par rapport à des

cellules non-CF, les variations de l’Isc induites par la forskoline étaient en revanche

significativement inférieures dans les cellules épithéliales CF (Boucher et al. 1986 ; Knowles

201

et al. 1986). Nos données obtenues en chambres de Ussing concernant les cellules épithéliales

CF et non-CF sont en accord avec ces études. Nos données concernant les co-cultures

indiquent clairement qu’elles se comportent comme des cultures non-CF.

Nous avons observé une concentration en IL-8 significativement supérieure dans les

surnageants provenant des cultures 100 % CF par rapport aux cultures 100 % non-CF ainsi

que par rapport aux co-cultures. Cette étude constitue une évaluation fonctionnelle des

phénotypes CF et non-CF en terme de sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire IL-8. Des

études ont montré que la concentration en IL-8 dans les lavages broncho-alvéolaires de

patients CF était supérieure à celle observée chez des patients non-CF sans en déterminer

précisément l'origine (Bonfield et al. 1995 ; Dosanjh et al. 1998). Comme pour les données

électrophysiologiques, nos résultats indiquent clairement que les co-cultures se comportent

comme des cultures non-CF.

Au total, ces deux types d’évaluations permettent de conclure que 10% de cellules de

phénotypes non-CF serait suffisant pour normaliser les transports de Na+, de Cl- et la sécrétion

d’IL-8 dans les voies aériennes bronchiques humaines. Si ce pourcentage s’avère suffisant,

nous n’excluons pas qu’un pourcentage inférieur pourrait également permettre la restauration

des paramètres que nous avons étudié. Johnson et al. ont démontré que 6 à 10% de cellules

CFT1 corrigées par un ADNc de CFTR normal permettaient restaurer des transports de Cl-

normaux (Johnson et al. 1992). Selon les auteurs, l’hypothèse la plus probable pour expliquer

ces résultats serait le passage des ions Cl- via les jonctions communicantes établies entre les

cellules corrigées et non corrigées adjacentes. Les jonctions communicantes permettent en

effet de laisser passer des ions, ce mécanisme pourrait expliquer comment un faible

pourcentage de cellules non-CF peut normaliser les transports de Cl- dans notre modèle de co-

202

culture. Des études d’expression de protéines ENaC mutées dans l’ovocyte de Xénope ont

suggéré qu’il pouvait exister une interaction de charge entre ENaC et les ions Cl-. Cette

interaction serait susceptible d’inhiber ENaC lors d’une augmentation de la concentration

intracellulaire en ions Cl- et/ou par l’apparition d’une conductance Cl- (Kunzelmann 2003).

L’insertion d’une conductance Cl-, via les cellules de phénotype non-CF, dans les co-cultures

pourrait ainsi participer à la normalisation des transports de Na+. Le facteur de transcription

NF-κB intervient dans la régulation de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la

réponse inflammatoire, comme l’IL-8. Weber et al. ont montré que la perte de la conductance

Cl- dans des lignées cellulaires épithéliales (HTE et HBE) pouvait stimuler l’activation de NF-

κB et entraîner une augmentation de l’expression d’IL-8 (Weber et al. 2001). Dans notre

modèle de co-cultures, la restauration d’une conductance Cl- normale pourrait également

participer à la normalisation de la sécrétion d’IL-8.

En conclusion, nous avons montré que 10 % de cellules épithéliales bronchiques non-

CF permettent de normaliser les courants Na+ amiloride-sensibles et Cl- AMPc-dépendants

ainsi que la sécrétion d’IL-8 dans une culture primaire de cellules épithéliales bronchiques

CF. Les mécanismes qui interviennent dans la "normalisation" des propriétés des cultures

100% CF devront faire l'objet d'études ultérieures. Les résultats que nous avons obtenus

peuvent avoir des implications dans le cadre des thérapies cellulaire ou génique. En effet, ces

résultats suggèrent que le remplacement, par thérapie cellulaire, ou la correction, par thérapie

génique, d’environ 10 % des cellules de l’épithélium de surface bronchiques pourrait

permettre de normaliser les transports d’ions et la sécrétion d’IL-8 dans les voies aériennes

humaines CF.

203

8 8 8 8 CONCLUSIONSCONCLUSIONSCONCLUSIONSCONCLUSIONS ETETETET PERSPECTIVESPERSPECTIVESPERSPECTIVESPERSPECTIVES

204

La première partie de ce travail avait pour but d’étudier l’expression de CFTR dans les

voies aériennes distales humaines (épithéliums bronchiolaire et alvéolaire). Nous avons

observé que CFTR était exprimé dans les cellules bronchiolaires et dans les pneumocytes de

type I et II. Ces observations concordent avec les données électrophysiologiques obtenues

dans les cellules épithéliales bronchiolaires et alvéolaires. L'importance du marquage de

CFTR dans l’épithélium alvéolaire est une donnée nouvelle dont les implications devraient

faire l’objet de travaux supplémentaires notamment dans le domaine de la mucoviscidose. Le

marquage de CFTR au niveau bronchiolaire, associé aux études électrophysiologiques qui

indiquent d’une part la présence d’une conductance Cl- portée par CFTR dans les cellules

épithéliales bronchiolaires humaines et d’autre part les différences entre les propriétés

électrophysiologiques des voies aériennes proximales et distales humaines, renforcent l’idée

d’adapter les traitements en fonction de l’étage des voies aériennes.

Dans la seconde partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets du NO

sur les transports ioniques transépithéliaux dans les voies aériennes proximales et distales

non-CF et CF. Nos résultats indiquent que le NO inhibe de manière non sélective les

transports ioniques dans les voies aériennes humaines. Ces effets semblent impliquer la voie

du GMPc dans les voies aériennes proximales non-CF. La diminution de la concentration en

NO dans l'air exhalé chez les personnes mucoviscidosiques pourrait ainsi être un facteur

participant à l'aggravation de l'hyperabsorption de Na+. L'effet inhibiteur du NO sur les

transports de Na+ dans les voies aériennes mucoviscidosiques proximales et distales pourrait

en faire un potentiel agent thérapeutique pouvant participer à la normalisation de l'absorption

de Na+. Les effets du NO sur le battement ciliaire dans des cultures primaires de cellules

épithéliales bronchiques et bronchiolaires CF mériteraient également d'être explorés. La

recherche d'agonistes et d'antagonistes des voies d'actions de cette molécule pourrait

205

permettre d'envisager de nouvelles approches thérapeutiques dans des pathologies comportant

des anomalies des transports d'ions et de fluide comme l'asthme ou la mucoviscidose.

La dernière partie de ce travail avait pour but de déterminer si un faible pourcentage de

cellules épithéliales bronchiques de phénotype non-CF (10%) permettait de normaliser les

propriétés bioélectriques et la sécrétion exagérée d'une cytokine pro-inflammatoire (IL-8)

d’une couche confluente de cellules épithéliales bronchiques CF (co-cultures). Nous avons

observé dans les co-cultures une normalisation de l’absorption de Na+ sensible à l’amiloride,

de la sécrétion de Cl- portée par CFTR mais également de la sécrétion d'IL-8 dans le

surnageant des co-cultures. Ces résultats indiquent que 10% de cellules épithéliales

bronchiques de phénotype non-CF pourrait permettre de normaliser les transports ioniques

transépithéliaux mais également d’autres fonctions épithéliales altérées dans les voies

aériennes mucoviscidosiques. Les cultures primaires que nous avons utilisées dans cette étude

sont principalement constituées de cellules ciliées qui sont les principales cellules exprimant

CFTR in vivo. Ces résultats suggèrent donc que les cellules ciliées pourraient constituer la

cible d’agents pharmacologiques (adresseurs et/ou activateurs de CFTR) ou des thérapies

cellulaire et génique. Des différences entre les voies voies aériennes proximales et distales

ayant été démontrées, notamment au niveau des transports ioniques, la réalisation de co-

cultures de cellules épithéliales bronchiolaires pourra être envisagée afin de déterminer si

dans les voies aériennes distales, la même proportion de cellules corrigées pourrait permettre

de normaliser certaines fonctions épithéliales. Le modèle de co-culture de cellules épithéliales

bronchiques que nous avons établi apparaît comme un outil permettant d’étudier les effets

d’un pourcentage (choisi par l’expérimentateur) de cellules de phénotype non-CF sur les

fonctions épithéliales d’une couche de cellules CF. Ce modèle pourrait permettre l’étude

d’autres fonctions comme la hauteur du liquide périciliaire ou la vitesse du battement ciliaire

206

en conditions de cultures statiques mais l’étude en conditions expérimentales dynamiques

pourra également être envisagée.

207

9 R9 R9 R9 RÉÉÉÉFFFFÉÉÉÉRENCES BIBLIOGRAPHIQRENCES BIBLIOGRAPHIQRENCES BIBLIOGRAPHIQRENCES BIBLIOGRAPHIQUESUESUESUES

208

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