Mise en place d’un test de mutation génique pour évaluer la participation de l’environnement à la

survenue de leucémies aigües

Thierry Orsière, Ph D

Institut de Biodiversité et d’Ecologie (IMBE UMR CNRS 7263)Equipe Biogénotoxicologie, Santé Humaine et Environnement

Identification des dangers ↓

Définition des risques ↓

Politique de Prévention de la pollution

des environnements

Exposition de l’Homme aux cancérogènes d’origine naturelle

et anthropiques

Les cancérogènes génotoxiques agissent au niveau des noyaux

de nos cellules….

… et peuvent créerdes mutations de gènes : certaines de ces mutations sont susceptibles d’initier

un processus carcinogénique

Biogénotoxicologie, Santé Humaine et Environnement

BiogénotoxicologieEnvi

ronn

emen

tSa

nté

Hum

aine

Expositionsprofessionnelles

Particules Fines(urbaines, industrielles, trafic routier)

Quantification de lésions de l’ADN ou de mutations

géniques / chromosomiques sur les cellules de ses patientsHAP / Tabagisme

Risque de cancer ou de troubles de la fertilité

Bisphenol A

Leucémies aigües (projet)

Patients consultant pour troubles de la fertilité

Programme Européen

ANR

INERIS – Post-GRENELLE

ANSES

ADEME

DRTE-FP

DIRECCTE

ECCOREV

ARS-PACA / PRSE

NanoparticulesP

Antimutagènes

Equipe Biogénotoxicologie, Santé Humaine et Environnement (IMBE) : de nombreux outils validés

Ovocytes de sourisExposition in vitro au BPDE

Fibroblastes humains Exposition in vitro au

particules fines (PM 2.5)

Test de Mutation génique : Pig-A

Test du Micronoyau

Lymphocytes humains Expositions

professionnelles

Test des Comètes

Immuno-marquage 8-OHdG Immuno-marquage adduits BPDE

Non fumeurs FumeursSpermatozoïdes humains

Cellules épithéliales pulmonaires humaines (A549

Exposition in vitro aux nanoparticules d’argile

Non fumeurs FumeursSpermatozoïdes humains

Mise en place d’un test de mutation génique pour évaluer la participation de l’environnement à la survenue de leucémies aigües

Ce projet est le fruit d’échanges sur les préoccupations scientifiques et médicales entre :

Pr François EisingerPr Patrice Viens

Pr Alain BottaDr Thierry Orsière

Dr Aurélie Bonnefoy

Implication de la participation :- des expositions professionnelles- de l’environnement - de l’hérédité

sur la genèse de cancers

Développement d’outils de toxicologie génétique

applicables à la surveillance des expositions afin

de prévenir les cancers et/ou troubles de la reproduction

Proposition de tester la mutagénicité globale au moyen du test de mutation génique au locus Pig-A

(phosphatidylinositol glycan class A : Pig-A )

Mutations au locus Pig-A : synthèse bibliographique (~50 publications)

Principe Type Cellulaire

Méthodologie

Le gène Pig-A en Toxicologie génétique

D’après Daishiro Miura et al, Mutatio Research 2009

Accumulation et persistance d’érythrocytes Pig-A-

sur une période de 26 semaines (6 mois)

Rats administrés (IP) avec une dose unique de N-ethyl-N-nitrosourée (ENU)

8.9 mg/kg

35.6 mg/kg

142.4 mg/kg

Le gène Pig-A en Clinique

Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne- Trouble hématopoïétique au niveau des cellules souches hématopoïétiques-Expansion de cellules Pig-A-

- Sensibilité anormale des GR Pig-A- à l’action lytique du complément : lyse des GR-Cellules HPN fréquemment retrouvées chez les patients atteints d’anémie aplasique, de syndromes myélodysplasiques, d’autres formes de dysfonctionnement de la moelle osseuse-Fréquence de cellules Pig-A- de l’ordre 0.001 – 0.3

http://www.pnhsource.com

Biosurveillance mutations Pig-A chez l’homme-Une seule étude-Suivi des effets de diverses chimiothérapies sur patients atteints de cancers différents-Nécessité de développer ce test sur des cohortes de sujets plus importantes et plus homogènes-Nécessité d’améliorer les critères méthodologiques (choix du type cellulaire, des protéines liées au GPI, du marquage du GPI, etc…)

V.N. Dobrovolsky et al, Environ. Mol. Mutagen. 2011

Définition de notre stratégie de mise au point du test

Choix des sujets et des types cellulaires analysés

Sujets sains Patients cancéreux

Vessie Lymphome Poumon Leucémie Aigu

Types Cellulaires

GR GR GR GR GR

GB GB GB GB -

Sujets sains Patients cancéreux

Vessie Lymphome Poumon Leucémie Aigue

Types Cellulaires

GR GR GR GR GR

GB GB GB GB -

Choix des protéines marquées et des anticorps:Marqueur cellulaire : GR : CD235a-Alexa 647

GB : CD15-Alexa 647 Protéines liées au GPI : CD55 et CD59 – Alexa 488Marqueur GPI : FLAER-Alexa 488

Partenariat avec plateforme de cytométrie en flux:Plateau FACS/Tri cellulaire – Charles Prevot (IR CNRS) - INSERM UMR_S 911

Premiers Résultats

ErythrocytesMarquage CD 235 (rouge) :

18%Marquage CD 59 (vert) :

20%Co-marquage CD 235 – CD 59 :

94%

Protocole en cours d’optimisation

Je vous remercie de votre intérêt…