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Mise en évidence de mort cellulaire

I. Test de Bleu de TrypanII. Test de Rouge NeutreIII. Test MTTIV. Dosage d’ATPV. Test Lactate Deshydrogénase

Tests de Cytotoxicité

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I . Test de Bleu de TrypanCe colorant d’exclusion pénètre dans toutes les cellules mais seules les cellules mortes le retiennent et se colorent en bleu, les cellules vivantes apparaissent brillantes.Comptage des cellules après coloration

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II. Test de Rouge NeutreColorant vital rouge neutre s’accumule au niveau des lysosomes. Les cellules mortes ne retiennent pas le colorant et ne seront pas coloriées.

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III . Test de MTTTest basé sur la mesure l’activité d’une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase.

Dans les cellules vivantes, la succinate déshydrogénase transforme le succinate en fumarate. Cette réaction d’oxydation peut être couplée à une réduction du MTT (jaune) en formazan (bleu-violet) dont la couleur est appréciée par spectrophotométrie à 560 nm.

L’intensité de la couleur est proportionnelle à l’activité de la succinate déshydrogénase, elle-même proportionnelle à la viabilité cellulaire

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IV . Test ATPCe test est basé sur le dosage de la quantité d’ATP des cellules qui est proportionnelle

au nombre des cellules vivantes. Les cellules traitées et lysées sont incubées en

présence le luciférase et luciférine. La mono-oxydation de cette dernière par la

luciférase, en présence d’ATP et d’oxygène moléculaire produit un signal lumineux

proportionnel à la quantité d’ATP présentes dans les lysats cellulaires.

ATP + D-Luciferin + O2 Oxyluciferin +Mg2+ + AMP + PPi + CO2 + LightLUCIFERASE

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V . Test Lacatate DeshysdrogénaseLa LDH est en une enzyme cytosolique catalysant en présence de NADH, la

réduction de l’acide pyruvique en acide lactique. Lors d’une atteinte membranaire,

l’enzyme est relarguée dans le milieu extracellulaire.

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La comparaison de l’activité de cette enzyme dans le milieu extracellulaire par

rapport à celle mesurée dans le compartiment intracellulaire, reflète le degré de

cytolyse d’une culture cellulaire.

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Mise en évidence de mort cellulaire

I. Observation microscopique de corps apoptotiqueII. Fragmentation de l’ADN sur gel d’agaroseIII. Technique TUNELIV. Test Annexin VV. Mesure de l’activité des caspase 3VI. Technique d’immunofluorescenceV. Cytométrie en flux

Mise en évidence de l’apoptose

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1 . Détection des anomalies de la morphologie cellulaire : Microscopie

photonique optique

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I . Détection des Anomalies de la morphologie cellulaire : microscopie de fluorescence

Exemple de fluorochrome

Le DAPI (4',6-Diamidine-2'-

phenylindole dihydrochloride) qui

se fixe spécifiquement à l'ADN

permet l’observation de corps

apoptotiques dans une préparation

cellulaire .

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II.Détection de la fragmentation de l’ADN par électrophorèse

Puits 1 : Marqueur de poids

moléculaire

Puits 2 : Des cellules sans

stimulus apoptotique;

Puits 3 : Des cellules avec un

stimulus apoptotique

Puits 4 : contrôle positif.

Source "Roche Diagnostics".

L’apoptose est caractérisée par:

Une fragmentation déterminée de l’ADN

M Norm Apop Nec

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III. Détection de la fragmentation de l’Adn : méthode TUNEL

Principe

C’est une méthode de repérage in situ des coupures de l'ADN par l'utilisation de la déoxynucléotidyltransférase ( Tdt, pour Terminal déoxynucléotidyltransférase).

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2.Détection de la fragmentation de l’Adn : Méthode TUNEL

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IV. Détection de l’ Activation des protéases

Principe :

L'identification des

protéines présentes dans

une préparation cellulaire

ou tissulaire selon leur

poids moléculaire peut se

faire à l'aide "western

blot"

Analyse par "western blot" du précurseur de

caspase-3 dans des "lysats" de cellules de A)

Jurkat B) HUT 78 C) CCRF-HSB-2

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IV. Détection des phosphatidyl-sérines par l’Annexine-V: Analyse par cytométrie en flux

Principe

Détection des « flip-flop » des phosphatidyl sérines de la

membrane plasmique par l’Annexine-V couplée au

fluorochrome FITC .

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V. Technique d’immunofluorescence

La cytométrie en flux est une technique permettant de faire défiler des particules,

molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser.

V. Cytométrie en flux

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Elle permet de caractériser divers états de la cellule: son état d’activation, de maturation, de prolifération, ou de mort.

Elle permet l’analyse de 100 000 cellules ou plus en moins d’une minute

Les particules sont isolées et entrainées dans un liquide

Elle permet de séparer des informations concernant des cellules différentes, présentes dans la même suspension 

Elle permet de trier les cellules, de les séparer physiquement pour pouvoir obtenir des populations pures à partir d'un mélange

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