Régulation hormonale à court terme de la glycémie chez le Rat, mise en évidence par l’action de l’insuline

Compte rendu de TP

En injectant de l’insuline, hormone pancréatique naturelle, à un rat vivant anesthésié par un cathéter, on induit rapidement une hypoglycémie, qui est suivi d’une augmentation de la glycémie jusqu’à sa valeur initiale. On met ici en évidence l’action antagoniste des deux hormones pancréatiques que sont l’insuline et le glucagon sur la régulation de la glycémie (l’effet hypoglycémiant de l’insuline et l’effet hyperglycémiant du glucagon). On peut alors apprécier l’implication de ces deux hormones selon des conditions physiologiques particulières que sont la période postprandiale ou une période de jeûne.

Jean SIMONNETAurélien CHATEIGNER

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1 IntroductionLa glycémie est la concentration de glucose sanguin. Elle varie en fonction de différents paramètres que sont notamment l’alimentation ou l’effort physique. On constate que, chez l’homme, la glycémie normale se situe autour de 1 g/L, et que cette valeur fluctue relativement peu lors d’une journée, alors que les apports glucidiques ne sont pas les mêmes. Après un repas, le glucose est absorbé au niveau du tractus digestif et passe alors dans le sang. A distance des repas, il n’y a plus d’apport glucidique par l’alimentation. Une régulation du taux de glucose sanguin s’effectue et permet un maintient autour d’une valeur fixe.

On sait que cette régulation met en jeu des hormones, et particulièrement l’insuline, dont le rôle va être de diminuer la glycémie lorsque celle-ci est trop élevée.

Après injection de cette hormone à un rat, on va observer les fluctuations de la glycémie et alors déduire les mécanismes physiologiques qui entrent en jeu. Comment et pourquoi l’insuline engendre-t-elle une diminution du taux de glucose sanguin ? Quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires qui entrent en jeu ? On déduira alors l’importance biologique d’une telle hormone.

2 Matériel et méthodeOn utilise des rats adultes, mâles ou femelles. Ils sont anesthésiés par injection intra-péritonéale d’uréthane, un anesthésique couramment utilisé, du fait de son coût peu élevé. C’est un bon anesthésique qui permet une narcose longue (12 heures en théorie), ce qui est très bien pour les manipulations qui ne vont pas durer plus de 3 heures. En fin de manipulation, une dose forte de ce même anesthésique est utilisée pour l’euthanasie de l’animal, étant donné que le réveil de l’animal n’est pas souhaité pour l’expérience. Cependant, il peut occasionner des détresses respiratoires, il faut donc être vigilant pour pourvoir agir vite en cas de problème. Il cause aussi une légère hypothermie, on veille à ce que le rat soit placé assez près de la lampe, ce qui permet de la réchauffer légèrement et de compenser cette perte thermique.

On utilise des techniques chirurgicales : le cathétérisme de la jugulaire et celui de la carotide.

Le cathéter de la jugulaire permet différentes injections. C’est en effet par là que l’on injecte, pour des raisons anatomiques : la jugulaire est la veine qui apporte le sang directement au cœur. En injectant ici, on est sûr que le produit sera rapidement diffusé au travers de tout l’organisme. Dans un premier temps, l’héparine sera injectée. C’est un anticoagulant puissant, elle inhibe un des facteurs de coagulation. Ceci défavorise la formation de caillots dans les cathéters et empêche le sang, que l’on prélèvera par la suite, de coaguler, et donc facilite les manipulations, pas toujours évidentes. On injectera ensuite l’insuline par ce même cathéter, à raison de 0,2 UI pour 100g de poids d’animal. Notre rat pesant 520g, et la solution étant à 1 UI / mL, on injecte 1,1 mL de solution par la jugulaire. On défini le temps t0 à partir de cet instant.

On aura préalablement effectué un prélèvement sanguin par le cathéter carotidien, qui constitue alors le prélèvement t0. On utilise ce cathéter pour le prélèvement car la carotide est l’artère qui fait sortir le sang directement du cœur, et donc la pression y est importante, ce qui permet un bon débit

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sanguin pour le prélèvement. On réalise en tout 6 prélèvements : à t = 0, 10, 25, 40, 60 et 75 min. Le prélèvement à t0 sert à définir la valeur normale de référence de la glycémie chez le rat.

Directement après avoir prélevé, on dilue au 10ème l’échantillon sanguin, pour éviter toute coagulation ou hémolyse. Pour ce faire, on prélève 100µL de sang que l’on place dans 900µl de sérum physiologique. On centrifuge ensuite (3000 t/min à 15°C pendant 5min) pour récupérer un surnageant de plasma sanguin (ici c’est du plasma et non du sérum car c’est du sang non coagulé) dilué 10 fois. C’est dans ce surnageant que le glucose sanguin est présent. On va l’utiliser pour doser le glucose par la méthode de Trinder. On réalise également ce dosage pour une solution de liquide physiologique ainsi que pour une solution de glucose à 1g/L dilué 10 fois (pour que la valeur d’absorbance soit située dans un intervalle lisible). On lit ensuite les absorbances au spectrophotomètre à 505nm. On pourra déduire la concentration en glucose de chaque échantillon par comparaison avec l’absorbance de la solution de glucose à 1 g/L. Les dilutions étant identiques, la valeur de la glycémie est donnée par le simple rapport DOéchantillon/ DOstandard.

3 RésultatsTemps (min)

0 10 15 40 60 75

Rat 1 2,07 1,82 1,43 1,02 1,39Rat 2 2,46 2,77 2,38 2,09 2,47 3,1Rat 3 2,41 2,44 2,34 1,84 2,26 2,51Rat 4 1,2 0,56 0,67 1,003 1,24 0,95Rat 5 1,53 1,27 1,24 1,14 1,34Rat 6 2,78 2,19 1,8 1,84 1,63 1,83Rat 7 2,76 2,4 2,46 1,07 0,64 0,42Rat 8 0,87 1,27 0,7 0,78 0,51Rat 9 1,09 0,36 0,34 0,36 0,36

Rat 10 0,82 1,15 1,21 1,06 0,72Moyenne 1,80 1,83 1,52 1,21 1,28 1,38Ecart type 0,78 0,77 0,72 0,55 0,69 1,11

Tableau 1 : Résultats de la glycémie pour chaque rat en fonction du temps. Les valeurs sont données en g/L. Les résultats personnels sont en italique

Globalement la glycémie chute jusqu’à 40 min, puis remonte ensuite vers la valeur de la glycémie normale (celle mesuré à t0).

On constate des résultats étranges dont les valeurs seront exclues de l’étude :

Rat 7 : la valeur de glycémie ne fait que chuter. Rat 8 : les valeurs ne varient pas logiquement (courbe en dents de scies). Rat 9 : La glycémie chute et reste constante. Rat 10 : Les résultats oscillent autour d’une valeur moyenne de 0,99 g. A noter qu’une légère

hémolyse s’est produite, ce qui a causé une erreur dans la mesure d’absorbance.

Chaque résultat sera expliqué dans la discussion

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Temps (min)

0 10 15 40 60 75

Rat 1 2,07 1,82 1,43 1,02 1,39Rat 2 2,46 2,38 2,09 2,47 3,1Rat 3 2,41 2,44 2,34 1,84 2,26 2,51Rat 4 1,2 0,56 0,67 1,003 1,24 0,95Rat 5 1,53 1,27 1,24 1,14 1,34Rat 6 2,78 2,19 1,8 1,84 1,63 1,83Rat 7

Valeurs excluesRat 8Rat 9

Rat 10Moyenne 2,17 1,92 1,76 1,43 1,57 1,76Ecart type 0,61 0,77 0,68 0,47 0,63 1,10

Tableau 2 : Tableau des résultats, dans lequel ne sont pas présentes les valeurs exclues.

On déduit une valeur moyenne de la glycémie : 2,17 ± 0,61 g / L.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Evolution de la glycémie en fonction du temps écoulé après l'injection d'insuline

Rat 1Rat 2Rat 3Rat 4 Rat 5Rat 6Rat 7Moyenne

Temps après injection (min)

Glyc

émie

(g/L

)

Pour résumer, on constate une diminution de la glycémie après injection de l’insuline, puis une augmentation par la suite.

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4 DiscussionL’insuline étant une hormone hypoglycémiante, l’effet observé au début, c'est-à-dire la diminution du taux de glucose dans le sang, est probablement liée à son action. On constate cependant que la concentration de glucose augmente pour revenir autour de la valeur initiale par la suite, l’organisme répond à l’hypoglycémie engendrée par l’insuline et évite ainsi l’atteinte d’une valeur trop basse de la glycémie.

Lors de l’injection, l’insuline, qui est une hormone peptidique, normalement synthétisée par le pancréas, va induire une diminution de la concentration de glucose sanguin, en influençant d’une part l’entrée du glucose dans les cellules de l’organisme, et d’autre part sa prise en charge cellulaire après son entrée dans la cellule, c'est-à-dire en influençant la voie dans laquelle le glucose est utilisé.

L’insuline influence alors différents métabolismes, en fonction du tissu impliqué, chaque tissu tirant son énergie ou la stockant de différentes manières. Elle peut alors influencer le métabolisme glucidique de base notamment dans les cellules qui comportent les enzymes permettant le métabolisme du glycogène ou encore l’équilibre entre glycolyse et néoglucogenèse (hépatocytes, myocytes…). L’insuline joue également un rôle dans le métabolisme lipidique, notamment en influençant et en permettant la synthèse de triglycérides et de cholestérol (foie, tissu adipeux).

Dans un contexte normal, ceci se produit juste après un repas riche en glucides où les sucres passent du tractus digestif vers le sang, ce qui provoque une hyperglycémie, et où le corps à donc la nécessité de faire baisser cette valeur.

Figure 1 : Molécule d'insuline : composé de 2 chaines peptidiques

liées par des ponts disulfures

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Cette hormone agit par l’intermédiaire de son récepteur, appelé « récepteur à l’insuline ». C’est un récepteur comportant 4 sous-unités : deux chaines α extracellulaires comportant le site de fixation à l’insuline et deux chaines β transmembranaires qui comportent une activité enzymatique « tyrosine kinase du coté cytosolique. L’activation de ce récepteur va conduire à une cascade de transduction cellulaire qui va permettre l’entrée du glucose dans les cellules, ainsi que son stockage : c’est une hormone anabolisante.

L’activation du récepteur à l’insuline passe par son autophosphorylation : des résidus tyrosines de la chaine β sont phosphorylés, ce qui stimule de 10 à 20 fois son activité tyrosine kinase. A noter que ce récepteur peut subir une modulation par phosphorylation de certains résidus thréonine ou sérine, ce qui peut conduire à son inactivation.

Le substrat endogène de ce récepteur est une famille de protéines appelée IRS (Insuline Receptor substrat). Les protéines IRS (1, 2, 3 ou 4) contiennent des séquences particulières, potentiellement phosphorylables : 8 des 21 résidus tyrosines phosphorylables peuvent être phosphorylés par le récepteur à l’insuline. Ces phospho-tyrosines sont ensuite reconnues par des protéines possédant des régions particulières appelées SH (src Homology : des structures découvertes en premier sur des protéines responsables de sarcome (src)). Il faut en général 2 SH qui s’associent chacun avec une phospho-tyrosine pour une stabilisation du complexe et donc une activation de la protéine, qui est soit une protéine d’adaptation, soit une enzyme.

Figure 2 : Récepteur à l'insuline

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Notons l’implication de la PI(3)K (Phosphatidyl inositol kinase) qui, une fois activée par liaison avec IRS, va notamment phosphoryler le phosphatidyl inositol (glycérophospholipide membranaire). Celui-ci sera ensuite reconnu par différentes protéines (comportant un domaine de reconnaissance particulier), telles que la PKB (protein kinase B) et la PDK (phosphatidyl inositol Dependant Kinase), qui vont alors être phosphorylées et activées. Celles-ci vont alors jouer un rôle indirect (nécessite l’activation d’autres facteurs cellulaires intermédiaires) sur le métabolisme du glucose en permettant la translocation vers la membrane plasmique de vésicules contenant dans leur membrane les récepteurs GluT4, protéines membranaires permettant l’entrée du glucose dans la cellule. On permet alors le recrutement du glucose par les cellules, ce qui permet de baisser le taux de glucose sanguin. Une fois dans la cellule le glucose sera utilisé par différentes voies métaboliques activées également par la transduction cellulaire induite par l’activation du récepteur à l’insuline. On note notamment, la protéine Grb2 (Growth factor Recepteur Bound 2) qui sert d’adaptateur entre IRS et le système mSOS (mammal Son Of Sevenless). L’activation de cette voie de transduction aboutit entre autre à l’activation d’une phosphoprotéine phosphatase qui va jouer un rôle dans le métabolisme glucidique, notamment en favorisant la synthèse du glycogène, phénomène appelé glycogénogenèse. Cette enzyme déphosphoryle la glycogène-synthétase, ce qui permet son

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activation et la production du glycogène à partir du glucose ; elle déphosphoryle également la phosphorylase kinase, ce qui l’inactive et celle-ci ne peut donc pas activer la Phosphorylase, enzyme qui dégrade le glycogène. Le glucose qui rentre dans la cellule est alors stocké sous forme de glycogène, ce qui permet de constituer des réserves dans le cas ou le glucose viendrait à manquer.

Ceci est un exemple de l’effet de l’insuline, contribuant à l’utilisation cellulaire du glucose, après son entrée dans la cellule. Il existe d’autres voies métaboliques permettant d’utiliser plus ou moins directement du glucose, pour éviter son accumulation cellulaire, également activées par l’insuline, mais pas forcément par la même voie de transduction que celle décrite précédemment (activation phosphoprotéine phosphatase). On note par exemple l’activation des voies de synthèse des acides gras et du cholestérol, qui sont aussi facilitées par l’augmentation de glucose intracellulaire. En fait le glucose va être utilisé par la cellule pour synthétiser des précurseurs (glycérol, Acétylcoenzyme A) de ces voies métaboliques, ce qui permet donc son utilisation et évite son accumulation.

Dans notre cas, l’insuline injectée provoque une entrée de glucose dans les cellules alors que la glycémie était à un taux normal : une hypoglycémie est ainsi engendrée. L’organisme va donc réagir pour contrecarrer cette baisse de glucose sanguin en dessous du taux normal. Ceci provoque, au niveau du pancréas endocrine deux effets synergiques : un arrêt de la sécrétion d’insuline et une sécrétion de glucagon. L’insuline est en effet une hormone naturellement produite par le pancréas, comme son antagoniste, le glucagon. Ce dernier est également une hormone peptidique, qui est synthétisée dans le cas d’une diminution de la glycémie au dessous de son taux normal. Son rôle va être notamment de remonter le taux de glucose sanguin, de par son rôle cellulaire (métabolique) inverse de celui de l’insuline. Ici, on constate que l’effet est assez long à mettre en place : ceci est dû au fait que l’on a injecté une quantité relativement importante d’insuline, et qu’il faut que la quantité de glucagon synthétisée contrecarre l’effet de la quantité d’insuline encore présente (celle-ci est dégradée progressivement, comme le glucagon d’ailleurs).

Figure 2 : molécule de Glucagon, composée d’une seule chaine, contrairement à l’insuline

Voyons plus en détail le mécanisme d’action du glucose sur les sécrétions pancréatiques d’insuline et de glucagon. L’insuline est sécrétée par les cellules β des Îlots de Langerhans du Pancréas : Le glucose entre dans ces cellules grâce au transporteur GluT2, un transporteur au glucose de la même famille que GluT4 évoqué précédemment. Celui-ci est exprimé constitutivement dans la membrane des cellules. Le glucose qui entre est pris en charge dans la glycolyse, dont le but est une production d’ATP (adénosine tri phosphate) qui est une des sources principales d’énergie de la cellule. Dans ces cellules, on trouve des protéines canaux potassiques, qui laissent naturellement sortir le potassium, qui sont inactivées par une concentration augmentant en ATP. Quand ceux-ci sont activés, le

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Récepteur au glucagon

Glucagon

Prot G AC active

+ ATP

AMPc

PKA active

+

Action sur le métabolisme glucidique dans le but de produire du glucose

Augmentation de la glycémie

potassium ne sort plus de la cellule, ce qui dépolarise la membrane et active des canaux calciques qui, eux, laissent entrer le calcium. L’augmentation de la concentration en calcium permet une exocytose des vésicules contenant l’insuline, ce qui fait augmenter la concentration d’insuline dans le sang, qui va alors engendrer l’effet hypoglycémiant décrit précédemment. Il est évident que c’est la quantité de glucose qui module la cascade de réaction menant à la sécrétion d’insuline et que plus il sera présent en grande quantité, plus la sécrétion d’insuline augmentera. Ici, la quantité de glucose ayant diminué fortement à cause de l’injection préalable d’insuline, la sécrétion d’insuline est alors fortement réduite voir stoppée, et donc tous les effets cellulaires induits par cette hormone sont stoppés (entrée du glucose dans les cellules, fabrication de glycogène…).

Le glucagon est, lui, synthétisé par les cellules α des ilots de Langerhans, alors que la concentration de glucose est en dessous de son taux normal. C’est une hormone catabolisante et hyperglycémiante. Lorsqu’elle est libérée dans le sang, elle va ensuite se fixer au niveau des cellules hépatiques, sur un récepteur à 7 domaines transmembranaires, couplé à une protéine Gs. La protéine Gs va activer l’adénylate-cyclase, ce qui va stimuler la production d’AMPc (Adénosine monophosphate cyclique). La concentration cellulaire en AMPc augmentant, la protéine kinase A (AMPc dépendante) va être activée. Cette enzyme va alors phosphoryler un certain nombre d’enzymes impliquées dans le métabolisme glucidique, et va notamment permettre la dégradation du glycogène en glucose (la PKA a exactement l’effet inverse de la phosphoprotéine phosphatase citée précédemment), appelée glycogénolyse, et va favoriser la néoglucogenèse (à plusieurs niveaux), qui est la synthèse de glucose à partir de composés non glucidiques (protéines, glycérol, et acides gras à nombre impair de carbones), notamment en activant la dégradation des triglycérides ce qui produit du glycérol (et des acides gras). Notons cependant que cette réaction ne se produit que dans le cas d’un jeûne prolongé. Ici, on se situe sur une période très courte, où cette réaction ne sera alors que très minoritaire par rapport à la glycogénolyse.

Figure 3 : Action cellulaire du glucagon

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Tous ces événements engendrés par l’augmentation du glucagon et la baisse de l’insuline vont faire augmenter la concentration intercellulaire en glucose, qui va sortir des hépatocytes vers le sang, ce qui va faire remonter la glycémie, et explique alors la deuxième phase de la courbe, où la valeur de la glycémie augmente.

Pour la courbe du rat 4, on constate que la valeur baisse à nouveau, à la fin. Ceci peut être dû à un problème de dosage ou de prélèvement, mais pourrait s’expliquer aussi par le fait que l’organisme aurait compensé trop fortement la baisse de glucose, en sécrétant trop de glucagon, et qu’il devrait alors compenser avec de l’insuline pour fait descendre la valeur de la glycémie jusqu’à la valeur de base.

5 ConclusionOn a donc montré que l’insuline était une hormone hypoglycémiante, qui intervient normalement en réponse à une hyperglycémie post-prandiale, mais qui ici à été détournée pour provoquer une hypoglycémie chez un individu dont le taux de glucose sanguin était normal. On a donc montré, après l’effet de cette hormone, la réponse opposée de l’organisme qui s’adapte à ce contexte hypoglycémique, typique de la période de jeûne séparant deux repas, en faisant remonter son taux de glucose sanguin par la sécrétion de l’hormone antagoniste à l’insuline qu’est le glucagon. On montre ici l’importance biologique de ces deux hormones, synthétisées et sécrétées par le pancréas, dans la régulation de la glycémie, valeur qui doit rester constante à une valeur permettant la bonne alimentation des cellules de l’organisme, et notamment les structures glucodépendantes comme les hématies, qui ne tirent leur énergie que de la glycolyse ; et le cerveau qui n’utilise que le glucose (ou dans un contexte particulier, dans le cas d’une carence prolongée en glucose, les corps cétoniques que sont l’acétoacétate et le β-hydroxybutyrate) comme source d’énergie.

L’insuline est une hormone assez connue du grand public, à notre époque, car elle est en cause dans une maladie malheureusement assez répandue, le diabète. Le Diabète de type I et le Diabète de type II sont deux maladies qui mettent en cause l’insuline : soit sa synthèse par le pancréas (type I), soit son action cellulaire (type II). Sans traitement, cette maladie ne permettrait pas aux individus atteints de vivre, ce qui montre encore l’importance de l’insuline (et du glucagon) et de son rôle physiologique.

Notons qu’outre son rôle décrit et mis en évidence dans les manipulations, sur la glycémie, l’insuline (le glucagon également) joue un rôle sur d’autres métabolismes, ce qui a été rapidement abordé. Ainsi l’insuline va également faciliter la synthèse de cholestérol et de triglycérides, ce qui va augmenter le taux sanguin en ces molécules.

Remarquons également que l’effet de l’insuline dépend aussi de l’expression du gène responsable de sa synthèse, de l’expression et de l’activité du récepteur à l’insuline. L’entrée du glucose dans les cellules va dépendre lui de l’expression du gène responsable de la synthèse du récepteur au glucose ainsi que de son activité. On comprend alors que la régulation de la glycémie, et que le phénotype lié à cette valeur dépendra des prédispositions génétiques de l’individu.

Par ailleurs, pour vérifier que c’est bien par l’intermédiaire des récepteurs cités que l’insuline joue un rôle, on pourrait utiliser des antagonistes de ceux-ci, pour étudier la réponse de l’individu privé de l’action des récepteurs et alors conforter ou non les hypothèses émises.