Qu’est-ce que le clonage ? Quel objectif dans le cas...

Clonage de fragments d’ADN

• Qu’est-ce que le clonage ? Quel objectif dans le cas

d’une séquence d’ADN ?

• La technique de l’ADN recombinant

30

Polycopié p.2

Polycopié p.2

Principe de l’établissement d’une carte de restriction

Polycopié p.2

Polycopié p.3

Clonage par fabrication d’un adn recombinant

VECTEURS DE CLONAGE ET CELLULES HÔTES

Type de ve cteur Taille de l'ADN exogène insérable Cellule-hôte

Plasmide 8 à 9 kb bactérie ou levure (selon le plasmide)

Bactériophage :

- insertion simple

- insertion par délétion/remplacement

1 à 12 kb

8 à 22 kb

bactérie

bactérie

Cosmide 45 kb bactérie et/ou levure (selon le cosmide)

Chromosome artificiel de bactéries BAC 50 à 300 kb (en moyennne : 150 kb) bactérie

Chromosome artificiel dér ivé du phage P1 PAC 50 à 300 kb (en moyennne : 150 kb) bactérie

Chromosome artificiel de levure YAC 150 à 1 000 kb levure

Plan du premier Chapitre

I-Organisation des génomes et structure des gènes

A-Définition et organisation générale des génomes eucaryotes et procaryotes

B- Les différents types de séquences présentes dans les génomes

C-Principes de quelques techniques de manipulation des génomes

1. Amplification de l'ADN: PCR et clonage

2. Banque d'ADN génomique et banque d'ADNc

3. Utilisation de l'hybridation moléculaire pour identifier une séquence

particulière

4. Principales méthodes de séquençage des génomes

5. Annotation des génomes

D- Etat des lieux des projets de séquençage

E- Notion de gène et structure des gènes

35

CONSTRUCTION D’UNE BANQUE GENOMIQUE …

Découpage de l'ADN en fragments (digestion enzymatique ménagée

ou fragmentation mécanique)

Gène b-lactamase résistance à l’ampicilline

Gène lacZ

Site de clonage (polylinker)

Origine de réplication

Promoteur-opérateur lacZ

Plasmide pUC18 (2 686 pdb)

Ì Ouverture du vecteur de clonage (ici un plasmide) au niveau d'un site uniquedu polylinker

(flèche noire)

Isolement et purification de l'ADN génomique (très grand nombre de cellules)

3 gènes différents

Insertion de chaque fragment dans un vecteur = LIGATION obtention de vecteurs recombinés et non recombinés

Polycopié p. 4

… CONSTRUCTION D’UNE BANQUE GENOMIQUE

Î Intégration de chaque vecteur dans une cellule-hôte adaptée = TRANSFORMATION

obtention de cellules transformées et non transformées

Ï Sélection des cellules transformées avec un vecteur par un crible adapté

ici, résistance à l’ampicilline

Ñ Culture des cellules sélectionnées : formation de clones cellulaires

l'ensemble des clones forme une banque d'ADN génomique, représentative de toutes les séquences de ce génome

…

Clone A

…

Clone D

…

Clone C

…

Clone B

…

Clone E

Sélection des cellules transformées avec un vecteur recombiné par un crible adapté

ici, crible "blanc-bleu »

b-galactosidase

X-gal produit bleu

Polycopié p. 4









particulière





Détection d’un ARNm

particulier dans des

méristèmes axillaires chez le

maÏs (sonde ADN dénaturée)

40

Polycopié p. 5



B-Principes de quelques techniques de manipulation des génomes



3. Utilisation de l'hybridation moléculaire pour identifier une séquence particulière



C- Etat des lieux des projets de séquençage

D- Les différents types de séquences présentes dans les génomes


Mélange réactionnel:

- le fragment qui doit être séquencé

- un petit morceau d'ADN dont la séquence est complémentaire à

l'extrémité 3' du fragment à séquencer = amorce

- les 4 dNTP's (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)

- Une ADN polymérase

PROTOCOLE INITIAL

(ce peut être le vecteur)

Méthode de

Sanger

5’P 3’OH

ADN

Didésoxynucléotides

(1%)

45

SEQUENÇAGE DES GENOMES : METHODE DE SANGER

5'P

C T C G A G T A C C A G A C G C G………………………… 5'P 3'OH

Amorce marquée (32P ou fluorochrome) 5'P

+ ADN polymérase

+ 4 dNTP, dont dTTP

+ 1 ddNTP (ici, ddTTP)

C T C G A G T A C C A G A C G C G………………………… 5'P

3'OH

G A G C T3‘H

Séquence complémentaire à celle de l’amorce (primer)

sur le brin matrice

permettra la

détection

visuelle ou

par détection

de la

fluorescence,

de chaque

fragment

d’ADN

synthétisé)

didésoxynucléotide


G A G C T C A T3'H 5'P



+ ADN polymérase

+ 4 dNTP, dont dTTP



3'OH

G A G C T3'H 5'P

ou



G A G C T C A T G G T3'H


+ ADN polymérase

+ 4 dNTP, dont dTTP



3'OH

5'P


G A G C T3'H 5'P

ou

ou

SEQUENÇAGE DES GENOMES OU DE RÉGIONS

PARTICULIÈRES : METHODE DE SANGER



+ ADN polymérase

+ 4 dNTP, dont dTTP



3'OH

5'P G A G C T C A T G G T C T3'H

G A G C T C A T G G T3'H 5'P


G A G C T3'H 5'P

ou

ou

ou

SEQUENÇAGE DES GENOMES OU DE RÉGIONS

PARTICULIÈRES : METHODE DE SANGER



+ ADN polymérase

+ 4 dNTP, dont dTTP



3'OH

5'P G A G C T C A T G G T C T3'H

G A G C T C A T G G T3'H 5'P


G A G C T3'H 5'P

ou

ou

ou

Electrophorèse sur gel d‘acrylamide (pour la photo ci-dessous) mais sur tubes capillaires dans gel polymère maintenant

C G C G T C T G G T A C T C G A G

3’OH

+ ddATP

+ ddCTP

+ ddGTP

+ ddTTP

5’P

Polycopié p. 6

METHODE AUTOMATIQUE DE SEQUENÇAGE permettra la

détection

visuelle ou

par détection

de la

fluorescence,

de chaque

fragment

d’ADN

synthétisé)

5’ 3’

A C

T

A

G

? ?

Polycopié p. 6

50

STRATEGIE DE SEQUENÇAGE GENOMIQUE ALEATOIRE

("SHOT-GUN")

d’après Klug W. et al. "Génétique" (Eds. Pearson Education, 8eme édition, 2006)

Fragmentation ménagée mécanique ou enzymatique

Obtention de fragments d’ADN partiellement chevauchants

Construction d’une banque génomique

Extraction de l’ADN (très grande nombre de copies)

Séquençage de clones pris au hasard dans la banque

Assemblage des séquences par bio-informatique

(algorithmes d’assemblage)

d’où l’importance d’obtenir des fragments d’ADN

chevauchants lors de la construction de la banque génomique.

Séquences

réellément

Obtenues

(parmi des

millions) de

séquences

Séquence

reconstituée par

assemblage

= contig

Pour en savoir plus : cf.

Précis de génomique,

Gibson et Muse, De

Boek Editions



B-Principes de quelques techniques de manipulation des génomes






C- Etat des lieux des projets de séquençage

D- Les différents types de séquences présentes dans les génomes


ET UNE FOIS QU’ON A LA SEQUENCE?

5'...GCAACAGCGATCTTTCCGTCGCACAAGTTAAAAGAAATTGTTGAAAAATACAAATAATCGCGAACAATACGTTGTTGCTATTTAACGCTTTTGGTCTGACA

GTAAGTGTGCCTTTCCCAATCACCGAAAAGTGTTGAACGATTCACTGCGACAATAATCAGAGATTACAGTCGGCATTTTGGCATTTTTGGCATACTTTTTATCGAT

TGAACCATCTTCTCCAAACACTTTTCCTTTTTCCTTCTATTCTGCAGGACCAACTAAAACTGGGTATATATATCATTATCTATATATATAAACGGCTTTCAACAAA

GTTATAGGGGAAAACTAAAAATATAAGAAAAAAAAAGGTATTGATTGATAAGGAAAAAGAACCAAGGGAAAAATATAAAAAAGTACATTGGGCCTTTTCATACTTG

TTATCACTTACATTACAAAGAAGAACAAACAACTTTTTTAAACGAATTTTCTTTCTTCCTTTTTCAATTTATTAATTCTTTTTTTCCATACAATTCAAGGTCAAAT

ATATTCTTATATGCTCTTTGAATATTTCTGAAAAATATATAAAGAAAAGAAACTACAAGAACATCATCCGGAAAATCAGATTATAGACTAGGATTCCGCTCTTTTT

AGTATATTTATTCGCCACACCTAACTGCTCTATTATTCGCTCATTATGGACGCTTACTCCACAAGACCATTAACCCTATCTCACGGTTCTTTAGAGCACGTGCTTC

TGGTACCAACCGCTTCATTTTTCATTGCTTCGCAATTACAAGAACAATTTAATAAAATTTTGCCCGAACCCACTGAAGGGTTTGCTGCAGATGACGAGCCTACCAC

ACCTGCTGAACTAGTGGGGAAATTCCTTGGCTACGTATCTTCTCTAGTCGAACCTTCCAAGGTCGGTCAATTCGATCAGGTCTTGAACCTTTGCTTAACAGAATTT

GAAAACTGTTATTTAGAAGGCAATGACATTCACGCCTTGGCTGCTAAACTATTACAGGAAAACGACACAACTTTAGTGAAGACTAAAGAACTAATTAAAAATTATA

TTACCGCCAGAATAATGGCTAAGAGACCATTTGACAAAAAATCCAACTCTGCTCTTTTTAGGGCCGTCGGCGAGGGTAACGCACAATTGGTAGCCATTTTCGGTGG

TCAAGGTAACACCGACGACTACTTTGAAGAATTGCGTGATCTATATCAAACTTATCATGTCTTAGTGGGAGATTTAATCAAGTTCTCCGCTGAAACTTTAAGTGAA

CTGATTAGAACTACTTTAGATGCTGAAAAAGTCTTTACTCAAGGTTTAAACATATTGGAATGGTTGGAGAACCCTTCAAATACCCCAGACAAGGACTATTTACTTT

CCATTCCAATTTCATGCCCCTTAATTGGTGTCATTCAATTGGCTCACTACGTAGTTACTGCCAAGCTTTTGGGTTTCACTCCAGGTGAGTTAAGATCTTACTTAAA

AGGTGCTACAGGTCACTCTCAAGGTTTGGTTACTGCTGTCGCCATAGCTGAGACGGATTCCTGGGAATCCTTCTTCGTCTCCGTAAGAAAAGCAATTACTGTATTA

TTCTTCATCGGTGTTCGTTGTTACGAAGCATACCCAAACACTTCCCTACCACCATCCATCTTGGAAGATTCCTTGGAAAACAATGAAGGTGTTCCATCTCCAATGT

TGTCCATTTCCAATCTAACTCAAGAACAAGTTCAAGACTATGTAAATAAGACTAACTCTCATTTGCCAGCTGGTAAACAAGTTGAAATTTCTCTAGTCAATGGTGC

GAAGAATCTAGTCGTATCGGGCCCACCACAATCATTATATGGTTTAAACTTGACTTTAAGAAAGGCCAAGGCCCCATCTGGACTGGATCAATCAAGAATCCCATTC

AGCGAAAGAAAATTGAAGTTCTCCAATAGGTTCTTACCTGTTGCATCACCATTCCATTCCCATCTATTGGTTCCAGCTTCAGATTTGATTAACAAAGACTTAGTCA

AAAACAATGTCAGCTTTAACGCTAAAGATATTCAAATCCCCGTTTACGACACTTTTGATGGTTCAGATCTAAGAGTCCTTTCAGGTTCCATTTCCGAGAGAATCGT

CGACTGCATCATTAGATTACCTGTCAAATGGGAAACTACTACACAATTCAAAGCCACCCACATATTAGACTTTGGTCCAGGTGGAGCTTCCGGTTTAGGTGTTTTA

ACCCATCGTAATAAAGATGGTACTGGTGTTCGTGTTATCGTTGCCGGTACTCTCGACATTAACCCAGATGATGATTACGGATTCAAGCAAGAAATCTTTGATGTTA

CTAGTAATGGTTTGAAGAAAAATCCAAACTGGTTGGAAGAATACCATCCAAAATTAATTAAGAACAAATCAGGCAAAATTTTTGTCGAAACAAAATTTTCTAAATT

AATCGGTAGACCACCTTTATTGGTTCCTGGTATGACACCATGTACTGTTTCTCCAGATTTCGTAGCTGCTACCACAAATGCTGGTTATACCATTGAGTTGGCCGGT

GGTGGTTACTTTTCCGCAGCAGGTATGACCGCCGCTATTGATTCTGTGGTTTCTCAGATAGAAAAGGGTAGTACCTTCGGTATCAACTTGATCTACGTCAATCCAT

TTATGTTACAATGGGGTATTCCATTAATCAAGGAACTAAGAAGCAAAGGTTATCCAATTCAATTCTTGACCATTGGTGCTGGTGTCCCATCATTGGAAGTTGCTAG

TGAATACATAGAGACATTAGGTTTGAAGTACTTGGGTTTGAAACCAGGTTCCATTGATGCTATTTCGCAAGTTATAAACATTGCTAAAGCACATCCAAACTTCCCA

ATAGCTTTACAATGGACCGGTGGTAGAGGTGGTGGTCATCATTCTTTCGAAGATGCCCACACTCCAATGTTACAAATGTACTCCAAGATTAGAAGACATCCAAACA

TTATGTTGATATTCGGTTCTGGTTTCGGTTCTGCTGATGACACTTACCCATACTTAACCGGTGAATGGTCCACAAAATTCGATTATCCACCAATGCCATTC...3'

Séquence très partielle (environ 3 000 nucléotides) du chromosome XI (longueur totale 666 454 pdb)

de la levure Saccharomyces cerevisiae

(Par convention, la séquence d’un seul brin est indiquée en orientation 5’-3’)

L’ANNOTATION DES GENOMES

L’annotation des génomes est l’identification des séquences qui composent un génome :

• gènes codant des protéines et leurs séquences de régulation

• gènes permettant la synthèse d’ARN (ARNr, ARNt, ARNmi, …)

• séquences répétées (éléments mobiles, minisatellites, microsatellites, …)

Pour cela, il faut disposer d’outils adaptés.

EXEMPLE : IDENTIFICATION DE SEQUENCES CODANTES (CDS)

PAR LE LOGICIEL DNA STRIDER (il existe d’autres logiciels, tel que ORF-Finder

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/…..)

Taille du fragment analysé en nombre de nucléotides

Les petits traits verticaux correspondent au codon AUG et les grands traits verticaux aux codons de terminaison de la traduction.

500

500

1000

1000

1500

1500

2000

2000

2500

2500

3000

3000

3> 3>

2> 2>

1> 1>

<1 <1

<2 <2

<3 <3

5' 3'

cf. TD2 55

C:/Users/Public/Desktop/Mozilla Firefox.lnk

C:/Users/Public/Desktop/Mozilla Firefox.lnk

Tiré de : Biologie Moléculaire de la Cellule, Alberts

Polycopié p. 7

Tiré de Biologie

Moléculaire de la

cellule, Alberts

4,6.106 pdb

Mais peut aller jusqu’à 5,7 Mpb pour certaines souches. D’autres ont un génome < 3 Mpb

Certaines souches d’E.Coli possèdent moins 50% de gènes en commun;

“Sixty-one publically available E. coli and Shigella spp. sequenced genomes are

compared to identify the pan- and core genomes of this set of sequenced strains.

The predicted pan-genome comprises 15,741 gene families, and only 993 (6%) of the

families are represented in every genome (entre 4000 et 6000 gènes environ par

souche), comprising the core genome. The variable or ‘accessory’ genes thus make

up more than 90% of the pan-genome and about 80% of a typical genome; some of

these variable genes tend to be co-localized on genomic islands.

The diversity within the species E. coli, and the overlap in gene content between this

and related species, suggests a continuum rather than sharp species borders in this

group of Enterobacteriaceae”.

Lukjancenko, O., Wassenaar, T. M., & Ussery, D. W. (2010). Comparison of 61 sequenced Escherichia coli

genomes. Microbial ecology, 60(4), 708-720.

GENOMIQUE COMPARATIVE ET EVOLUTIVE

chez les procaryotes

Lukjancenko, O., Wassenaar, T. M., & Ussery, D. W. (2010). Comparison of 61 sequenced Escherichia coli

genomes. Microbial ecology, 60(4), 708-720.

60

GENOMIQUE COMPARATIVE ET EVOLUTIVE

Quel est le pourcentage d’identité de séquences de votre génome avec celui de :

La mouche du vinaigre

(Drosophila melanogaster)

36%

L’arabette des dames

(Arabidopsis thaliana)

26%

Une levure

(Saccharomyces cerevisiae)

23%

Une bactérie

(Escherichia coli)

7%

Un ver rond

(Caenorhabditis elegans)

21%

Georges Clooney

(Homo sapiens)

99,9% (et 99,5% avec

Neanderthal*)

La souris

(Mus musculus)

90%

Le poisson zèbre

(Danio rerio)

85%

Le chimpanzé

(Pan troglodytes)

99%

* : Noonan, et al., (2006). Sequencing and analysis of Neanderthal genomic DNA. science,

314 : 1113-1118









particulière





Genes X, Lewin

G. Mendel, mais le terme « gène » est crée

par W. Johannsen en 1909

T. Morgan (premières cartes génétiques)

Sharp et Roberts

W. Sutton

Avery, Mc Leod et Mc Carty

Watson, Crick et Wilkins

Beadle et Tatum : un gène, une enzyme

Meselson et Stahl

Crick , Barnett , Brenner S et Watts-Tobin

2

LE CODE GENETIQUE

U C A G

U

Phe F

Phe F

Leu L

Leu L

Ser S

Ser S

Ser S

Ser S

Tyr Y

Tyr Y

STOP

STOP

Cys C

Cys C

STOP

Trp W

U

C

A

G

C

Leu L

Leu L

Leu L

Leu L

Pro P

Pro P

Pro P

Pro P

His H

His H

Gln Q

Gln Q

Arg R

Arg R

Arg R

Arg R

U

C

A

G

A

Ile I

Ile I

Ile I

Met M

Thr T

Thr T

Thr T

Thr T

Asn N

Asn N

Lys K

Lys K

Ser S

Ser S

Arg R

Arg R

U

C

A

G

G

Val V

Val V

Val V

Val V

Ala A

Ala A

Ala A

Ala A

Asp D

Asp D

Glu E

Glu E

Gly G

Gly G

Gly G

Gly G

U

C

A

G

1ere base du codon

(5')

2eme base du codon

3eme base du codon

(3')

Propriétés du code génétique

• redondant (ou dégénéré)

• non ambigü

• universel (ou quasi)

• un codon initiateur de la

traduction

5’AUG3’

• trois codons STOP

5’UAG3’, 5’UAA3’, 5’UGA3’

Séquence codante de l’ARNm (celle qui est traduite)

QU’EST-CE QU’UN GENE?

Genome Research, septembre 2007

Polycopié p. 8

Brin ADN codant = brin sens

= brin non transcript = brin (+)

Brin ADN anti-sens = brin

négatif = brin transcript en

ARN = brin (-)

Sens de transcription

From genes to genomes, Dale

Séquence consensus = version de la séquence considérée qui

présente à chaque position dans la séquence le nucléotide (ou

l’a.a) qui est le plus fréquemment trouvé à ce site

REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES

d’après Klug W. et al. "Génétique" (Eds. Pearson Education, 8eme édition, 2006)

• chez les Eucaryotes : gène régulé codant une protéine

• chez les Procaryotes : opéron lactose d’Escherichia coli

Chez Eucaryotes:

Les ARN polymérases sont incapables

de se fixer par elles mêmes aux

promoteurs. Elles doivent être recrutés

par des facteurs de transcription

Biologie Moléculaire du gène, Watson

STRUCTURE ET EXPRESSION D’UN GENE EUCARYOTE

3’OH

5’P

Promoteur

CAAT TATA

Séquences de

régulation

ATG STOP

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Intron 1 Intron 2

T

Signal de

polyAdénylation

TSS Sens de transcription

Région transcrite du gène

C

5’P 3’OH Exon 1 Exon 2 Exon 3 Intron 1 Intron 2

Ct Nt

Nt Ct

3’ UTR

AAAAAAAAA... 3’OH Exon 3 OHGP Exon 1 Exon 2

5’ UTR CDS

AUG STOP

Brin codant (sens)

Brin matrice de la

transcriptio, (antisens)

5’P

3’OH

Précurseur protéique

Protéine mature

ARN messager mature

Excision/épissage nucléaires

Transcription nucléaire

Traduction cytoplasmique

Maturation cytoplasmique

ARN pré-messager

avec coiffe et queue poly A

GENE

(ADN chromosomique)

OHGP Exon 1 Intron 1 Intron 2 AAAAAAAAA... 3’OH Exon 3 Exon 2

AUG STOP

SD SA PB SD SA PB

Polycopié p. 9

Maturation des ARNm chez les Eucaryotes :

- Ajout de la coiffe en 5’

- Polyadénylation en 3’ (un des signaux = AAUAAA entre

10 et 30 nt en amont du site de coupure du pré-messager)

-Epissage (pour les gènes avec introns (pour

« intervening sequences »)

La coiffe joue trois fonctions :

-Protection de l’ARN pré-mature (puis de

l’ARNm) vis-à-vis des exonucléases

-Exportation de l’ARNm vers le cytoplasme

- Reconnaissance par le ribosome

Biologie Moléculaire du gène, Watson

Tiré de : Genes X,

Lewin

MAIS TOUT N’EST PAS SI SIMPLE....! 1

L’intron 26 (40 kb) du gène de la neurofibromateuse humaine de type I (NF1) contient 3

gènes internes composés chacun de 2 exons et d’1 intron. Ces gènes sont :

• OGMP : oligodendrocyte myelin glycoprotein

• EV12A et EV12B : homologues de gènes murins impliqués dans la leucémogenèse

Il faut noter que ces 3 gènes internes sont transcrits sur le brin complémentaire à celui qui

est utilisé pour la transcription du gène NF1.


AAAAAAAAA... 3’OH

Ct Nt

Nt Ct

3’ UTR


5’ UTR CDS

AUG STOP

Précurseur protéique 1

Protéine mature 1

ARN messager mature 1




ARN pré-messager

avec coiffe et queue poly A OHGP Exon 1 Intron 1 Intron 2 Exon 3 Exon 2

AUG STOP

SD SA PB SD SA PB


AAAAAAAAA... 3’OH

Ct Nt

Nt Ct

3’ UTR


5’ UTR CDS

AUG STOP

Précurseur protéique 1

Protéine mature 1





ARN pré-messager

avec coiffe et queue poly A OHGP Exon 1 Intron 1 Intron 2 Exon 3 Exon 2

AUG STOP

SD SA PB SD SA PB

Protéine mature 2




ARN pré-messager

avec coiffe et queue poly A AAAAAAAAA... 3’OH

Ct Nt

OHGP Exon 1

5’ UTR

AUG

3’ UTR

AAAAAAAAA... 3’OH Exon 3

CDS

STOP

OHGP Exon 1 Intron 1 Intron 2 Exon 3 Exon 2

AUG STOP

SD SA PB

Et aussi, par épissage alternatif :

QU’EST-CE QU’UN GENE?

Genome Research, septembre 2007

Une définition possible...

Un gène est une séquence nucléotidique permettant la synthèse d’un (ou plusieurs)

produits diffusibles (ARN ou protéine), ayant une fonction précise dans la cellule. Un gène

est constitué d’une région transcrite, associée à des séquences permettant la régulation

de sa transcription.

Qu’est-ce que le clonage ? Quel objectif dans le cas...

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