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MENIER Camille / VIOLAS Maëlle 25/09/2017 Yoann AUGAGNEUR Biochimie

PROTÉINES : RELATION STRUCTURE / ACTIVITÉ

(suite)

L’hémoglobine

Elle transporte l'O2 dans le sang sous sa structure quaternaire. (≠myoglobine qui transporte l’oxygène dans le muscle et n’a pas de structure IV)

Elle est différente de la myoglobine qui elle n’a pas de structure quaternaire, juste une structure tertiaire et qui transporte de l’O2 dans le muscle.

L’hémoglobine est présente dans les érythrocytes (globules rouges). Elle est constituée de 4 sous-unités polypeptidiques : 2 α-globines et 2 β-globines.

Chaque sous-unité possède un site de reconnaissance des sous-unités α et β.

Elle présente une cavité centrale qui joue un rôle important dans la régulation et dans la fixation de l’O2.

Chaque sous-unité est liée à un cofacteur, l’hème, un groupement prosthétique qui est constitué d’un anneau porphyrine et d’un atome de fer.

L’O2 se fixe sur le fer, il y a donc fixation de 4 atomes d’O2 par hémoglobine.

Fonctionnement de l’hémoglobine :

La forme R relâchée se trouve au niveau du poumon, et la forme T tendue ou réduite se trouve au niveau des tissus en activité, formant du CO2 et ayant un bas pH.

(Forme tendue ou relâchée fonction du pH)

→ expulser CO2 et pouvoir partager de l’O2 à l’organisme

La chaîne α a plus d’affinité pour l’O2 et passe en premier à la forme oxygénée. Il y a un effet coopératif, la fixation d’un O2 conduit à une augmentation de l’affinité des autres sous-unités pour l’O2 ce qui provoque le changement de conformation des protomères, c’est ce qu’on appelle l’allostérie (autre forme).

On a libération de l’O2 à pH bas : l’hémoglobine entre donc sous la forme tendue puis le CO2 se fixe sur le groupement NH2 de certains acides aminés formant des composés carbaminés. désoxyhémoglobine

Au retour dans les poumons le pH est élevé, la température faible et il y a une forte teneur en O2, ce qui fait que l’hémoglobine passe sous la forme relâchée, il y a alors libération du CO2 et fixation de l’O2 Oxyhémoglobine

Le site de fixation chargé en oxygène et en CO2 ne sont pas les mêmes

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Fixation qui est séquentielle, elle entraine une meilleure affinité pour la liaison suivante (nouvelle molécule O2)

Maladie associée à l’hémoglobine :

Le changement d’un seul acide aminé dans la séquence peut avoir des conséquences graves.

Un résidu valine remplace un résidu glycine : On a l'exemple de l’hémoglobine drépanocytaire HbS qui diffère de l’HbA au niveau d’un seul acide aminé en position 6 de la chaîne β, où il y a une valine à la place du glutamate (mutation au niveau du 6ème codon)

Pas trop de soucis à l’état hétérozygote, contrairement à l’état homozygote qd les 2 allèles sont mutées

→ Ceci entraîne une mutation sur la sous-unité β, il y a alors diminution de la quantité de O2 et polymérisation, ce qui déforme le globule rouge qui prend alors une forme de faucille.

Caractéristiques des homozygotes atteints de drépanocytose : Moins bonne affinité pour l’hémoglobine S, polymérisation des hémoglobines, déformation des érythrocytes

Les symptômes sont :

● Des crises vaso-occlusives, dues à la forme de faucille des globules rouges (les érythrocytes vont se coincer dans les vaisseaux)

● Anémie hémolytique. Elle est due à la fragilisation des membranes des hématies, qui explosent, et à la dégradation de ces dernières dans la rate qui les détecte comme étant des cellules étrangères.

● Sensibilité aux infections aux pneumocoques et méningocoques, les malades sont donc en permanence sous antibiotiques.

Mais il y a un paradoxe, en effet les malades développent une résistance accrue au paludisme (individus hétérozygotes surtout) d’où la prévalence élevée de la drépanocytose dans les pays d’Afrique.

Palu = parasite qui aime se répliquer au sein de l’érythrocyte, pour justement récupérer les AA de l’Hg, pour pouvoir récupérer des nutriments. Chez un individu drépanocytaire, avec des érythrocytes qui sont plus fragiles, le parasite n’arrive pas à se répliquer correctement, ducoup on est plus ou moins protégé pour le paludisme lorsqu’on est hétérozygote pour la drépanocytose.

L'activité d'une protéine est étroitement liée à l'intégrité de sa structure dans l'espace, sa conformation native.

Quand la protéine est fonctionnelle on parle d’état natif

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La dénaturation des protéines correspond à la désorganisation de la structure spatiale sans rupture des liaisons peptidiques (sauf ponts SS qui peuvent être présents dans certaines protéines), ce qui provoque le dépliement de la chaîne protéique. Surtout liaisons H qui vont être rompues

La conséquence est la perte de l'activité biologique, perte de la solubilité et changement de l'activité optique.

Les facteurs conduisant à une dénaturation des protéines sont :

→ les radiations ultraviolettes (qui attaquent l'ADN en plus de détruire les protéines)

→ les ultrasons

→ la température qui brise les liaisons H, c'est pour ça que chez les êtres vivants une température élevée qui modifie les protéines est mortelle

→ le pH et la concentration en électrolytes,

→ les agents chimiques tels que le SDS, le sodium dodécyl sulfate qui brise les liaisons ioniques et les liaisons H (détergent), l'urée et le β-mercaptoéthanol, le dithiothréitol.

Toutes les dénaturations ne sont pas réversibles, on a l'exemple du blanc de l'œuf.

Conséquences :

- Perte de l’activité biologique

- Changement de la propriété optique

- Perte de la solubilité

GILOT Maël / PAINAUD Thomas 25/09/2018 Yoann AUGAGNEUR - Biochimie

Les 2 techniques présentées en cours seront à mettre en œuvre lors des TP.

Il faudra venir aux TP avec l’ensemble du polycopié car on ne saura pas par lequel on commencera.

Il y aura aussi des TD et il faudra amener son cours entier durant la séance.

Pour les TP:

TP d’enzymologie de 3h

TP : Fractionnement protéique échangeuse d’ion + filtration sur gel dure 6h (2x3h le MÊME jour → matin puis après-midi).

TP du mois de Novembre: Résine échangeuse d’ions

2 parties de TP résine échangeuse et filtrations sur gel

Il faut faire attention à déposer le bon volume ! Il peut y avoir des petits pièges mais si on lit bien le poly et qu’on connait la règle de 3 on a presque tous 18/20 → noté sur le rendement mais ça fait pas tout, tout n’est pas basé sur le rendement, compréhension très importante !

Pour les TP :

- Ne jamais laisser sécher la résine

- Se souvenir qu’on a dilué au centième

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- Ne pas oublier de tube sur la paillasse

- Faire les calculs : prendre papier millimétré, rapporter les absorbances et la quantité en mg, PAS LES CONCENTRATIONS

- Calculer la concentration (passer de qté à concentration) et repasser en quantité

- Rendement = ration entre ce qu’on avait au début et ce qu’on a à la fin x 100

PROTÉINES : RELATION STRUCTURE/ACTIVITÉ

Méthodes de fractionnement

Fractionnement (on sépare les protéines) ≠ couper les protéines

I - Introduction : purification des protéines

Définition : séparation d'une protéine des autres constituants de la cellule ou de constituants tout court (hors de la cellule). Pour étudier une protéine il faut d’abord la purifier.

L’objectif d’un fractionnement est d'obtenir une protéine purifiée/enrichie (au départ on a une protéine intéressante parmi d’autre, il faut donc l’isoler), il faut savoir que lorsque l’on purifie quelque chose on en perd quand même donc il faut que l’on perde les protéines dont on ne veut pas et essayer d’avoir le maximum de la protéine que l’on veut purifiée.

On n’aura pas le même degré d'exigence en fonction de ce que l’on veut faire après.

On a besoin de différents degrés de pureté selon l'utilisation de la protéine :

Sachant que le 100% de pureté est impossible à atteindre.

• 99% : Utilisation thérapeutique, études in vivo (important d’avoir un grand degré de pureté de la protéine)

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• 95-99% : Cristallographie (détermination de la tridimensionnelle structure de la protéines), caractérisation physico-chimique

• < 95 % : Antigène pour production d'anticorps, séquençage d'Edman (permet de séquencer la partie N-ter d’une protéine pour avoir une connaissance des résidus d’acides aminés qui la composent, pour identifier la séquence d’une protéine)

La purification de protéine nécessite en général plusieurs étapes mais celles-ci doivent être minimisées. En effet, ce nombre doit être faible car on perd de la protéine au fur et à mesure des étapes. Au plus on rajoute des étapes, au plus on perd des protéines. Le but c’est que cela soit pur, donc d’en perdre le moins.

Objectif : perdre plus de contaminants que de protéine.

75% de rendement → on en perd 25% à chaque fois avec 8 étapes Il nous reste 10% de notre protéine de départ

On est assez limité au niveau des outils dans les laboratoires. Il faut donc sélectionner les étapes à faire ainsi que les techniques les plus appropriées. Il est impossible en 1 seule étape de récupérer la protéine. On va donc utiliser différentes techniques, procédures au cours desquelles on va perdre à chaque fois un peu de notre protéine d'intérêt, le but étant d’être le plus efficace possible à chaque étape et à limiter leur durée dans le temps.

Il faut respecter l’intégrité de la protéine.

Il est très important de bien choisir ces étapes de purification ainsi que les techniques, les plus efficaces et adaptées dans le but d'avoir la protéine la plus pure et en récupérer une quantité maximale.

Avec toujours une idée en tête : “Est ce que je vais avoir besoin de conserver l'intégrité de la protéine ou non ?” (Si on a un changement de structure, l’activité sera différente ; mais on n’est pas obligé de conserver l’intégrité de la protéine, il faut juste qu’elle soit entière).

Si cristallographie la structure doit être conservée mais pas forcément l’activité biologique → donc pas besoin de conserver l’intégrité ?

(Dans une cristallographie : On obtient un cristal, puis une structure tridimensionnelle.)

Exemple du prof :

« Quand on parle de dégradation d’Edman pour séquencer la partie N-Terminale si la protéine n’est plus active avec une structure tridimensionnelle qui ne ressemble à rien.

→ Ce n’est pas grave on va juste séquencer et connaître la nature de la protéine en termes de l'enchaînement de structure primaire. Si par contre, on purifie la protéine et derrière on bousille son activité enzymatique, on a tout perdu ça ne sert à rien de purifier davantage.

Il faut se poser aussi la question de : Est-ce que la technique que je vais utiliser est optimale pour conserver ou non cette intégrité (structurelle ou enzymatique) ».

A- Extraction des protéines

La protéine doit être accessible pour être purifiée : la première étape est d'effectuer une lyse des cellules (cas des protéines non sécrétées, car si elles sont sécrétées elles sont directement disponibles à l'extérieur de la cellule). Il faut choisir la façon dont on va extraire nos protéines.

Pour lyser une cellule, il nous faut un tampon d’extraction (CF DIAPO) qui soit avec un pH adapté pour pouvoir conserver l'intégrité potentiel de la protéine. On a le choix des différents tampons (cf liste ci-dessous). En fonction du pH, on va utiliser un tampon différent.

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Phosphatase alcaline → pH alcalin → tampon TRIS ou HEPES car les gammes de pH se superposent

Vous avez la notion de Pka, la notion de gamme de pH. Pour prendre un tampon d’extraction adapté il faut que son Pka soit compris dans cette gamme de pH. Au-delà d’une unité de pH par rapport au Pka on considéra qu’il n’a plus son pouvoir de tampon.

Ex : En plus du tampon d'extraction on a besoin d'ajouter :

• des agents réducteurs tels que : acide ascorbique, β-mercaptophénol, dithiothreitol (DTT) qui permettent de limiter l'oxydation des protéines une fois la cellule lysée car on est en contact avec l’air ambiant et donc une oxydation des protéines est possible (impact sur les ponts SS)

• des inhibiteurs de protéases : PMSF, Pepstatin A, EDTA et EGTA

Pendant la lyse des cellules, on brise les lysosomes qui libèrent de grande quantité de protéases qui peuvent abîmer les protéines d'intérêt. Tant qu’on est dans la cellule, on a un équilibre en synthèse de novo et production de protéines. Les protéases étant les enzymes qui découpent les protéines en petit morceaux. Les protéases coupent les protéines sans en faire des nouvelles. On peut aussi utiliser des chélateurs d’ions divalents qui vont inhiber les protéases pour empêcher la digestion de ces protéines qu’on cherche à purifier.

• du glycérol : stabilisation des interactions protéines-protéines et protection de l'activité des protéines, favorise leur conservation.

• des enzymes lytiques : qui vont être utile pour fragiliser la paroi de bactéries, de levures ou de plantes cela dépend de la cellule en question. Elles sont utilisées pour des cellules à parois épaisses dont on a du mal à lyser.

1- Techniques d'extractions des protéines (douces)

Les extractions dites douces sont utilisées pour lyser des cellules fragiles (cellules eucaryotes et lignées cellulaires)

Il existe différentes méthodes dont :

a- Choc osmotique :

On se retrouve dans un milieu osmotique, les molécules H2O veulent rétablir l’équilibre, elles gonflent → lyse de la cellule

On peut le compléter par un détergent (ex : triton) qui facilite la déstructuration de la membrane de la cellule.

Elle consiste à mettre une cellule dans un erlenmeyer contenant une solution hypo-osmotique (très peu de sel). On va avoir un échange entre extérieur et intérieur. On va avoir beaucoup d’eau à l'extérieur comme cette concentration va avoir besoin de rétablir l'équilibre osmotique entre la cellule et le milieu extra-cellulaire, on a une entrée de cette solution hypo-osmotique dans la cellule qui va la faire gonflée et qui va finir par éclater. Libération du matériel intra-cellulaire

La membrane se rompt (trous dans la membrane) en plusieurs parties ce qui permet aux différents sels de s'échanger entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule.

→ on a lyser nos cellules, on récupère les protéines dans la solution.

b- Homogénéisateur / broyeur :

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On reste dans une solution hypo-osmotique

Ce sont des extractions de type mécanique :

• type Dounce (manuelle)

• type Potter-Elvehjem (mécanisée)

Homogénéisateur type Dounce = tube/cylindre en verre qu'on remplit de notre culture cellulaire et dans lequel on introduit un piston (≈ même diamètre que le tube). En rentrant le piston on fait passer la solution de cellules entre la paroi (on écrase, étire, brise les membranes) et le piston, ce qui brise les cellules qui sont fragiles. On a donc une lyse mécanique de nos cellules. Normalement les noyaux doivent être intact → augmentation de la viscosité dans l’échantillon du fait de la libération de l’ADN.

Type Potter : même principe avec comme différence que la tige utilisée est métallique et on utilise une boule de téflon. Les systèmes sont souvent motorisés. Petit moteur et de tps en tps on doit regarder prendre une petite goutte regarder au microscope et voir si on a réussi à casser

En fait le principe c’est qu’on a un espace entre la boule de téflon et la base du tube qui est très faible qui va permettre la lyse des cellules.

On réalise cette méthode puis on prélève une goutte qu’on regarde avec le microscope pour voir si oui ou non la cellule est bien lysée. On fait cette expérience entre les périodes d’actions et de non action.

L’objectif est de lyser la cellule sans lyser les noyaux.

Dans les 2 cas il y a un dégagement de chaleur donc l'idéal est de réfrigérer pour limiter l'augmentation de température qui dénature les protéines.

2- Techniques d'extractions des protéines (brutales)

Les techniques brutales sont utilisées pour des cellules plus coriaces à lyser, ces techniques sont rapides mais ont des inconvénients majeurs.

a- La presse de Aminco-French: un peu plus brutale, lyse mécanique

On a une structure qui va descendre et appuyer sur les modules qui sont placés au milieu. L’échantillon est dans la cellule, on accroche le piston et on tourne la manette (ou on appuit sur le bouton selon le modèle). Ces modules sont en 2 parties, une cellule avec un trou à l'intérieur par lequel on va pouvoir faire rentrer du liquide à la base de la cellule, il y a un petit orifice qui permet la sortie du liquide avec une bille de téflon qui empêche la sortie du liquide et puis une vis, le tout est fermé.

On a un piston, le mécanisme va appuyer encore et encore rien ne sort car la vis est fermée et donc la pression va monter à l'intérieur. Lorsque l’on a atteint une pression importante, on ouvre le robinet et là le passage du liquide en contact de la bille de téflon qui est très étroit, on a donc une surpression et cela va faire que les cellules vont être déchiquetées en 1 fraction de seconde, les cellules sont explosées et on récupère dans un tube le lysat. On a un orifice qui va s’ouvrir et se fermer permettant le passage des liquides. La bille de téflon “bloque” le passage.

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L’avantage de cette technique est que l’on peut travailler à froid à 4°C pour maintenir l’intégrité des protéines ou on met la cellule et le piston dans un bain d’éthanol puis un bac à -20°C. On récupère ce qui est dans le tube, puis on le met directement dans de la glace.

b- Cassage aux billes de verres : (à l'aide d'un beadbeater)

Lyse mécanique par des billes de verres : → très utilisée en labo

On a un récipient contenant l’extrait cellulaire dans lequel on introduit des billes de verre avec un diamètre prédéfini/adapté en fonction de ce que l’on veut casser qui par leur côté abrasif permettent de casser les cellules. On peut traiter ces billes à l’acide pour éliminer les protéases, DNAses par exemple.

Le mécanisme ressemble à celui du Vortex. “On secoue comme si on faisait un cocktail”

Un gros inconvénient de cette technique est le risque de dénaturation car ça chauffe énormément (largement supérieur à 37°C), on doit donc travailler dans la glace ou faire en sorte de maintenir l’appareil à froid dans des chambres froides. (50-60° au bout d’une minute !)

On a le tube avec les cellules dedans, le tampon d’extraction, des billes ; on fait secouer le tube → On passe de 4°C à 40°C en 30 sec.

La chaleur dénature les protéines et elles perdent donc leurs propriétés biologiques.

c- Sonication :brutale

C’est l’utilisation des fréquences ultrasons dans la solution via une sonde métallique.

La sonde est plongée dans la solution, suspension de cellule, qui délivre des ultrasons. Cela crée des petites bulles qui seront de plus en plus grosses à l'extérieur mais aussi à l'intérieur de la cellule ce qui provoque la lyse de celle-ci. De même que la lyse avec les billes de verre on va avoir une augmentation de température qui est encore plus importante. On doit donc réaliser des temps de pause c'est à dire qu'on donne de petites impulsions, brèves et intenses.

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Il y a toujours un risque de dénaturer les protéines puisque cette explosion a lieu à l'intérieur de la cellule. De plus, si on utilise cette technique il est nécessaire de porter un casque du fait du bruit désagréable produit dans l’eau. Cela peut entraîner des problèmes d’audition.

- Formation de bulles par cavitation o Croissance et explosion des bulles o Augmentation locale de pression et température

- Risque de dénaturation des protéines en cas d’élévation de la température

- Nécessité de refroidir régulièrement l’échantillon et réaliser des temps de pause

- Mettre un casque antibruit

Pulse qui s’arrête et recommence toutes les minutes puis remettre dans la glace, et on recommence si on n’a pas la possibilité de mettre de la glace en dessous. Si la machine ne permet pas de faire de pulse il faut arrêter manuellement toutes les 5 secondes par ex.

B- Élimination rapide des contaminants par centrifugation différentielle :

On a obtenu un lysat contenant nos protéines d'intérêt et des contaminants que l'on cherche à éliminer.

Centrifugation différentielle : séparation des protéines selon le compartiment dans lesquels elles se trouvent. On pourra alors récupérer le culot, et re-centrifuger pour affiner la séparation (cf schéma ci-contre)

Ex :

1ère Centrifugation à faible vitesse (600 G pendant 10min) :

• surnageant = fraction soluble contenant les protéines d’intérêt, les mitochondries, les ribosomes, les microsomes, les lysosomes…

• récupérer dans le culot = noyaux

2ème Centrifugation à vitesse moyenne (10 000 G, 10min) :

• surnageant = microsomes, ribosomes, fraction soluble

• culot = mitochondries, lysosomes

3ème Centrifugation à grande vitesse (100 000 G = ultracentrifugation, 10min) :

• surnageant = fraction soluble

• culot = microsomes, ribosomes

La 3ème se réalise avec une ultracentrifugeuse, c’est du matériel que l’on ne trouve pas partout (seulement dans certains laboratoires).

C'est une étape simple et rapide mais apportant un faible degré de pureté.

Il faut toujours maintenir la température à +4°C afin de conserver l'intégrité des protéines.

C- Vérification de l'efficacité de purification

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On vérifie le degré de pureté en dosant les protéines. Pour cela on réalise des dosages, à l’aide de plusieurs méthodes :

Absorption dans l’UV : exemple des acides aminés qui absorbent dans les UV.

Méthodes colorimétriques :

• Méthode de Bradford : bleu de Coomassie (595nm) : méthode la plus utilisée

C'est une méthode colorimétrique qui utilise le bleu de coomassie (se lie à certains résidus d’AA et plus particulièrement l’arginine). L’intensité de la coloration varie avec la quantité de protéine. Coloration à la base brune et devient bleue.

(les protéines absorbent dans l’UV mais les acides nucléiques aussi donc on peut avoir du mal à faire la distinction)

Il existe d’autres méthodes moins utilisées comme :

• Réaction de Biuret : basée sur la réduction du cuivre cuivrique Cu2+ en cuivre cuivreux Cu+

(550nm)

• Méthode de Lowry : amélioration de la réaction de Biuret + réduction du réactif de Folin (750 nm)

Méthode d’activité enzymatique (phosphatase alcaline par exemple) : En dosant les protéines, on dose toutes les protéines, du coup on ne sait pas si on a la protéine voulue pour tester l'efficacité de la purification, on peut réaliser une mesure de l’activité enzymatique.

Si c’est une enzyme on ne va pas utiliser cette méthode mais on va plutôt réaliser une méthode immuno-enzymatique.

Méthode immuno-enzymatique : On va utiliser un anticorps primaire qui va se lier à la protéine puis on va prendre un AC secondaire qui va lui se lier au 1er Ac et cet Ac secondaire est généralement couplé à quelque chose qui va émettre un signal (couleur…). Dosage colorimétrique pour pouvoir quantifier notre protéine d’intérêt.

Si on a un Ac on peut faire test ELISA mais si ce n’est pas un Ac et que c’est un enzyme, on essaye de voir si on a le substrat et si on l’a, on va pouvoir suivre notre activité enzymatique on fait plutôt un test colorimétrique comme pour la phosphatase alcaline, soit du fait que c’est une réductase ou une oxydase (et donc on va par exemple avoir le NADH qui est utilisé soit oxydé soit réduit à 340nm)

D- Propriétés des protéines et stratégies de purification

Protéines caractérisées par :

• Masse moléculaire / taille de la protéine

• Forme (globulaire, fibreuse)

• Structure (I, II, III, IV → IV : bien veiller à ce que les sous unités soient bien ensembles sinon perte de l’activité biologique)

• Charge (car les protéines sont chargées : du côté Nter → fonction amine qui peut être chargée positivement et du côté Cter → fonction carboxylique qui peut être chargée négativement).

• Densité (ne dépend pas forcément de la taille)

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• Hydrophobicité / solubilité (ex : protéines globulaires : amphiphile / protéines membranaires : hydrophobe)

• Étiquetage : quand on crée par génie génétique, ajout d'une étiquette sur la protéine qui permet de la purifier spécifiquement, on fait appel à la biologie moléculaire. Interaction ligand-R, on peut faire modification génétique sur notre protéine pour par exemple la surexprimer dans une bactérie

On est capable de cloner un gène : on amplifie l’ADN et on ajoute une étiquette (= séquence nucléotidique qui comprend des codons qui seront traduits). On va pouvoir suivre la protéine et par la suite la purifier.

En fonction de ces caractéristiques/paramètres on va avoir des techniques qui vont être appropriées ou non.

Le choix d’une technique dépend des caractéristiques que l’on connaît de la protéine.

Ex : si on connaît la solubilité : on pourra faire une précipitation séquentielle….

Exemple simulé d'une purification : arbitraire, juste pour avoir un ordre d’idée

On part du matériel brut on a 4000 unités de notre protéine, sa proportion étant de 1 pour 2 millions. Si on a une purification de 5 étapes où à chaque fois on en perd au fur et à mesure la proportion de protéine diminue. Avec des stats qui peuvent être plus ou moins efficace en fonction de la quantité que l’on perd et du facteur que l’on gagne.

Exemple :

Ici de l’étape 1 à 2 on en perd 500 pour passer de 1:500 000 à 1:100 000

Or de l’étape de 2 à 3 on en perd seulement 300 pour passer de 1:100 000 à 1:1000

Il y un meilleur ratio au fur et à mesure des étapes.

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1- Séparation en fonction de la solubilité

a- Méthodes violentes

On peut séparer à l’aide de la solubilité qui est fonction de la température, des conditions ioniques, du pH.

b- Précipitation différentielle

Précipitation différentielle : précipitation en fonction du pH

La solubilité va être moins bonne lorsque l’on va voir un pH qui s’approche du point isoélectrique, où la charge nette de la protéine est égale à 0.

C’est une approche assez grossière qui ne permet pas une purification très poussée VS méthode rapide.

Exemple :

On peut faire une précipitation différentielle par les sels : au sulfate d’ammonium (très soluble dans l’eau), technique très souvent utilisé, pas très efficace mais facile à mettre en œuvre et pas chère :

→ généralement cette technique permet de préserver l'activité de la protéine

→ sel très soluble dans l'eau → rentre très vite en compétition avec la protéine pour faire des liaisons avec l'eau donc rend la protéine insoluble. On va mettre du sel dans l’échantillon et plus il y en aura autour de la protéine = solvatation de la protéine.

→ le fait de faire précipiter/faire sortir la protéine de la fraction soluble à l'aide de la concentration croissante des sels (force ionique) on modifie la solubilité de la protéine de manière générale

En général on travaille avec différentes fractions du sel, ex :

- on utilise 20% de sulfate d'ammonium dans le mélange, on précipite une fraction de protéine, on centrifuge, on récupère le surnageant

- dans le surnageant on augmente la fraction de sel, par exemple à 40%, on centrifuge à nouveau, de façon à récupérer un autre surnageant

- on augmente également la fraction de sel dans ce dernier surnageant, et ainsi de suite (60, 80 jusqu'à 100%)

→ Notre protéine se trouve dans une de ces fractions.

Le tableau permet de calculer la quantité de sulfate d'ammonium pour connaître la concentration de la solution (20, 40, 60%, …)

Avantage : on peut connaître la quantité de sel à ajouter dans une solution déjà concentré en sulfate d’ammonium.

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2- Séparation en fonction de la densité : Gradient de sucrose, CsCl, percoll

Coefficient de sédimentation : défini par la taille, forme et densité

On utilise l'Ultracentrifugation sur gradient de densité afin de pouvoir séparer les protéines (sur gradient continu ou discontinu). Ces gradients peuvent être différentes molécules comme le sucrose, chlorure de césium, le percoll.

On va avoir des gradients continus et discontinus avec des centrifugations dites isopycnique ou zonales :

- Isopycnique : centrifugation avec gradient de densité

- Zonale : centrifugation en fonction du coefficient de sédimentation (densité au fond du tube moins importante que les protéines → toutes les protéines vont toucher le fond au bout d’un moment)

Gradient de densité continu et discontinu (on fait des “coussins”)

2 grands types de gradient de densité :

• Le gradient de densité est dit isopycnique lorsque la protéine va s'arrêter à un endroit donné : la sédimentation fait que les protéines vont tomber et que la centrifugation n’est pas stoppée elles iront toutes au fond du culot, qu’elles soient denses ou non.

(Comme si on prenait 2 pierres, l’une lourde l’autre légère et qu’on les lâche dans l’eau, la lourde arrivera certes en première au fond, mais la légère atteindra quand même le fond au bout d’un certain temps)

• Le gradient de densité est par contre dit zonale lorsque que l’on stoppe la centrifugation à un moment donné on s'arrête et on observe différentes couches qui correspondent aux différentes sortes de protéines → Gradient en fonction du coefficient de sédimentation.

Pour un temps indéfini, après la centrifugation tout se retrouve au fond du tube (ex : si on l’a fait tourner toute la nuit) : il faut choisir le bon temps de centrifugation. Cependant pour une centrifugation isopycnique, peu importe le temps de centrifugation cela ne change rien. C’est la différence entre ces 2 centrifugations.

Sucrose ou percole ça se fait bien mais pas l’autre truc

Le gradient peut être continu (autoformant en CsCl et préformé en sucrose) ou bien discontinu :

- Le gradient autoformant (tube A) en CsCl va se former au cours de la centrifugation donc les protéines sont au départ mélangées dans le tube puis au cours de la centrifugation vont se retrouver au bon endroit. On aura des couches différentes.

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- Le gradient préformé (tube B) de sucrose lui est formé via une pompe péristaltique avec de l’eau d’un côté et une solution concentré en sucrose et donc l’apport varie avec une solution plus concentrée en saccharose au niveau de la base et moins au début du tube ce qui forme un gradient. On joue sur le débit d’arrivé d’eau pour avoir un gradient préformé.

On dépose l’échantillon au niveau du bouchon puis on centrifuge.

- Le gradient discontinu nécessite l’utilisation du percoll : on prépare en différentes solutions (40%, 30%, 20% …), on les place dans un tube et on dépose les protéines au-dessus, on centrifuge et lorsque cela s’arrête (l’échantillon arrête de migrer), on aura différentes interfaces.

3- Séparation en fonction de la charge

La charge nette d’une protéine varie en fonction du pH : soit protéine chargée positivement ou négativement.

La charge est liée aux fonctions carboxyliques et amines des acides aminés ainsi que de leurs chaînes latérales qui vont être ionisables pour certaines d’entre elles.

Attention : on dit pH bas et non pH acide car c’est la solution qui présente un caractère acido-basique

A pH bas, les fonctions acides sont protonées (donc COOH) et lorsque pH monte, on perd un proton (COO).

Pour les fonctions basiques, on a NH3+ à pH faible et NH2 à pH élevé.

Lorsque la charge Z de la protéine est de 0, c’est que le pH correspond au point isoélectrique (pI) de la protéine.

Ainsi, si on applique un courant avec des protéines chargées (que ça soit + ou -), on va pouvoir les séparer :

• pH < pI : protéines chargées plutôt positivement (NH3+)

• pH > pI : protéines chargées plutôt négativement (COO-)

Exemple :

• lactoglobuline : pI = 5,2

• hémoglobuline : pI = 6,8

On observe sur la figure que si le pH est inférieur à 5.2, alors les 2 protéines seront positives.

Si on se place entre 5.2 et 6.8, alors on aura l’hémoglobine chargée positivement et la lactoglobuline chargée négativement et là, dans cette gamme de pH il sera possible de les séparer.

Si le pH est supérieur à 6.8, les 2 seront négatives = on s’est trompé de tampon d’extraction !!

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a- Colonne échangeuse d'ions

(Une des 2 techniques que l'on utilisera en TP, pas avec des prot mais avec des AA)

Dans ces colonnes, on retrouve une résine qui est soit chargée positivement soit négativement en fonction de la charge de l’ion que l’on recherche.

Principe : On met notre mélange sur la colonne avec une résine chargée +, on élue dans un tampon et ainsi les protéines chargées négativement restent accrochées à la colonne et les protéines chargées positivement vont descendre.

Si on veut récupérer les protéines chargées négativement accroché à la résine, il faut les éluer.

Afin de les éluer, on peut utiliser un compétiteur avec une meilleure affinité pour la résine qui permet de libérer les charges négatives prises dans celle-ci ou encore en changeant le pH car cela va changer la charge de la protéine et elle va tomber.

Colonne échangeuse d’anion : résine chargée positivement interagissant avec les fonctions acides (anioniques d’une protéine) ⇒ résine qui s’échange avec des anions donc elle est cationique

Colonne échangeuse de cations : résine chargée négativement interagissant avec les fonctions basiques (cationiques d’une protéine)

Outre les colonnes échangeuses, on peut utiliser la technique de l’électrophorèse afin de séparer les protéines selon leurs charges.

b- Électrophorèse

Cela consiste à faire passer un courant électrique pour séparer les protéines. C'est une technique très utilisée pour le diagnostic en biologie clinique. Ici, la séparation n’a pas un but de purification mais plutôt un usage diagnostic donc par exemple pour la définition d’une pathologie (ex : drépanocytose).

On dépose sur un gel nos protéines, on applique un courant et les protéines vont se déplacer en fonction de leur charge donc soit vers le bas soit vers le haut.

Sur le schéma, on a une bande avec des taches colorées au bleu de coomassie qui permet de visualiser le produit correspondant à l’albumine et aux différentes immunoglobulines.

N.B. Cathode ⇨ borne moins et anode ⇨ borne plus

Ici, résultat de l’électrophorèse de différents patients pour détecter une pathologie.

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En 1 et 5 il s’agit de témoins et 4 à un contrôle sur les γ globulines.

On compare donc les pistes 2 et 3 avec le témoin en 1 (avec le sérum normal) et le contrôle en teneur de gamma globuline en 4.

Au niveau de la piste 2, on voit une intensité plus importante sur le bas de la bande vis à vis de la piste 3 où il y a une absence de couleur et qui correspond donc aux Gammaglobulines.

Il s’agit donc d’une hypergammaglobulinémie pour le patient 2 et d’une agammaglobulinémie (=pas de gamma globuline) pour le patient 3.

Donc cette technique d’électrophorèse peut être utilisée de manière rapide et fiable pour un profil comparatif entre 2 patients et permet de détecter des maladies auto-immunes, des myélomes et différentes maladies hépatiques.

On peut aussi faire l’électrophorèse de l’Hémoglobine et détecter la drépanocytose notamment (HbS)

c- Électrophorèse type immuno-électrophorégramme

Couplage de l’électrophorèse avec une solution contenant des anticorps spécifiques.

Technique utilisée en biologie clinique pour le diagnostic et pour la recherche de maladies immunoprolifératives. Comparaison de la position et forme des arcs de cercle du sérum du patient P

On part de différents anticorps (anti IgA , anti IgG …). On a P qui correspond à l’échantillon du patient et C pour contrôle et on va comparer l’intensité et la forme des arcs de cercles entre les 2 échantillons (plus ça se rapproche plus on a une production importante de ces facteurs)

⇨ on va pouvoir dénicher les anomalies

• Gammapathie • Production anormalement élevée d’IgG possédant des chaines légères kappa • Maladies immunoproliférative

Pour le patient on a une courbe bcp plus intense pour IgG.

Par exemple, on observe une différence sur la ligne 2 (au niveau de l’anti IgG) où les arcs de cercles du patient sont très intenses et incurvées → dans cet exemple on a donc une gammapathie = production anormalement élevée de IgG (possédant des chaînes légères kappa). C’est une maladie immunoproliférative

→ Examen utilisé notamment pour la recherche de :

• Myélome multiples (à IgG et IgA)

• Maladie de Waldenström (IgM)

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5- Séparation en fonction de la taille : Chromatographie d’exclusion-diffusion

a- Filtration sur Gel = Tamis moléculaire

(Technique que l’on utilisera aussi en TP donc à bien apprendre)

On a un tamis (gel) s’on hydrate avec de l’eau, il y a des trous. Au début mélange, ce sont les grosses protéines qui vont sortir en premier (elles sont faire un trajet plus court parce qu’elles ne rentrent pas)

Attention : Si on a 2 protéines différentes mais qu’y a un gel qui permet de séparer, elles sortent ensemble car dans tous les cas elles ne rentrent pas dans les billes

On peut séparer que ce qui est séparable dans la gamme de séparation du gel qu’on nous fournit

Dès que la protéine est plus grosse que les trous

On parle aussi de tamis moléculaire (on fait passer les grains à travers le tamis) ou de filtration sur gel (car c’est un gel dans la colonne).

Notion d’exclusion - diffusion : on a une colonne avec pleins de petites billes poreuses en fonction de ce que l’on veut purifier.

Exclusion : la protéine ne peut pas entrer dans les billes - elle va passer autour des billes et donc sortir en première.

Diffusion : elle pourra rentrer dans les billes.

Dans cette technique, on a une colonne avec des sortes de “billes” qui sont hydratés, poreuses, ce qui augmente leur volume.

Il faut avoir un gel adapté au PM des protéines étudiées pour éviter que les protéines hors de la gamme (plus petites ou plus grandes) ne sortent en même temps de la colonne malgré des tailles différentes.

Ensuite, on met notre suspension à purifier (ou lysat cellulaire) en haut de la colonne avec de l’eau ou un tampon pour pousser le tout.

Les protéines vont être éluer, descendre et sortir de la colonne.

Au final, ce sont les grosses protéines qui vont sortir en première car elles vont passer plus facilement dans le gel que les petites. Les grosses molécules auront donc un trajet direct. Les petites molécules vont sortir en dernières car elles vont rentrer dans la bille, dans les pores et avoir un trajet beaucoup plus long.

Cela est dû au fait que les billes sont poreuses avec à l’intérieur des cavités que les petites vont traverser mais pas les grosses. Cependant, ces cavités ne sont pas droites mais plutôt labyrinthique ce qui rallonge le trajet pendant que les grosses longent les billes avec un trajet rectiligne.

Ainsi, les protéines de fort poids moléculaire sortent en premières, elles passent à l’extérieur des billes et les protéines de faible poids moléculaire en dernières car elles pénètrent dans les billes. Les protéines sont éluées en fonction de leurs tailles. On colore les protéines afin de bien pouvoir les distinguer pour la récupération.

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3 types de colorants : rouge migrent plus vite (en bas) que le jaune (au milieu) et que le bleu qui ne sont toujours pas rentrer dans le gel (en haut) ⇒ on récupère des petites fractions (< 1 mL) en TP

On peut modéliser cette purification par la mesure de l'absorbance (DO) en fonction du volume d'élution.

Graphique :

• V0 = volume mort, qui correspond au volume autour des grains donc il faut mesurer à partir du moment on a commencé car toutes les protéines qui ne rentrent pas dans les grains sortiront en même temps, quel que soit leur taille donc les trop grosses protéines ne seront pas différenciées.

(Donc il faut bien utiliser cette technique quand on est sûr que l’on aura des protéines avec des tailles bien distinctes)

• Vt= volume total, qui correspond au volume à l'intérieur des grains. Là aussi il faudra faire attention car certaines protéines peuvent entrer dans tous les grains et donc on ne pourra pas différencier les protéines les plus petites.

• Ve = volume d'élution, protéines de taille intermédiaire, différents pics d’élution.

→ 0 < Kav < 1

On peut réaliser un graphique du volume d’élution (Ve) en fonction du logarithme de la Masse moléculaire apparente et on distingue une zone efficace située entre V0 et Vt où l'on séparera correctement les protéines.

Formule pour illustrer pas importante en P2

A partir de ceci on peut définir un coefficient de distribution appelé Kav qui renseigne sur la taille des protéines :

→ 0 <Kav< 1

• Kav ≈ 0 : protéines très grosses

• kav ≈ 1 : petite protéine

En fonction du Kav on a une idée de la répartition de notre protéine.

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b- Électrophorèse SDS-PAGE

(électrophorèse sur gel d’acrylamide)

Ici, on réutilise la technique de l’électrophorèse pour effectuer une séparation en fonction de la taille /masse, poids moléculaire en ajoutant notamment du SDS (laurylsulfate ou dodécylsulfate de sodium) qui est un détergent sur un gel de polyacrylamide (PAGE)

Via cette technique, on va effectuer une dénaturation en présence de SDS (détergent → il va charger les protéines négativement) et β-mercaptoéthanol.

Toutes les protéines sont chargées négativement donc en fonction du maillage (Gel polyacrylamide) on va réussir à les retarder. On va jouer sur le pH : gel qui contient des ions chlorures et qui contient des ions glycines (qui sont très peu mobiles car pH très proche de leur PI). Les protéines qui ont été lâchées par les ions chlorure vont avancer au rythme des ions glycine

Electrophorèse en condition dénaturante en présence de SDS : malgré que ce soit de l’électrophorèse on arrive à séparer les protéines grâce à leur PM, cependant elles sont dénaturées

Pour qu’elles soient toutes ensembles on les fait rentrer avec un gel pas très concentré et on met le SDS tout autour des protéines pour avoir une charge uniforme et donc indifférenciable en fonction de celle-ci. Toutes les protéines seront chargées négativement.

On ajoute aussi du β-mercaptoéthanol pour bien dénaturer (réduction des ponts disulfure) puis séparation en fonction de la taille.

La concentration du gel en polyacrylamide va dépendre des caractéristiques de notre protéine.

Le gel est divisé en 2 parties = discontinu : au-dessus le gel de concentration et en dessous le gel de séparation.

Dans le gel de concentration, on concentre la protéine dans un espace restreint donc ici la concentration sera moindre par rapport à l’autre partie. (Au début on le dépose dans le puit et on a des protéines qui ne sont pas forcément proches les unes des autres). Nos protéines sont en présence de SDS dans un tampon glycine.

Cette technique repose surtout sur le pH : la concentration du gel à certes un impact sur la séparation des petites et des grosses protéines (on diminue la concentration du gel de concentration si on veut récupérer les grosses protéines et on l’augmente si on veut récupérer les petites protéines) cependant c’est la différence de pH entre les 2 compartiments qui est très importante.

Le gel de concentration a un pH proche de la neutralité, légèrement acide (environ 6.8) avec un tampon qui contient des ions chlorures et des ions glycines qui seront des électrolytes. À ce pH là, les ions chlorure

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sont très mobiles donc avancent très vite lorsque le courant est appliqué donc ils vont pénétrer dans le gel de séparation et s’échapper.

Quant aux ions glycine, ils avancent très lentement et nos protéines n’ont pas le temps de suivre les ions chlorures, ce qui créer un vide électrophorétique entre les 2 ions.

Cependant, du fait de ce vide électrophorétique, il n’y aura pas assez de charge pour pousser les protéines et donc elles avancent toutes à la même vitesse.

On arrive dans le gel de séparation et ici changement de pH qui devient basique (environ 9) et les ions glycines vont cette fois gagner en vitesse et pouvoir pousser les protéines et comme le gel est peu concentré, toutes les protéines n’arriveront pas à passer correctement. Si on n'arrête pas la migration, tout va sortir du gel.

Ainsi, les petites protéines vont pouvoir avancer et les grosses seront bloquées par le maillage du gel peu concentré et rester en haut. Donc à l’inverse de l’exclusion-diffusion, ce sont les petites protéines qui ressortent en premier (on assimile cette technique à une toile d’araignée).

Ensuite, on colore au bleu de Coomassie pour avoir des profils différents et retrouver notre protéine d’intérêt.

6- Séparation en fonction de la charge et de la taille : l'électrophorèse 2D

1ère étape : séparation en fonction de la charge.

2ème étape : séparation en fonction de la masse.

On met nos protéines sur une petite bandelette avec un gradient de pH qui diffère le long de la bandelette et les protéines vont donc se répartir tout le long via leur point isoélectrique ce qui les sépare en fonction de leur charge.

Ensuite on met la bandelette sur un gel SDS PAGE et on fait la migration en fonction du PM.

→ Cette double séparation permet une meilleure démarcation des protéines car dans le gel 2D on a 6 gels (on est quasi sûr d’avoir une bande pure).

(Sur une même ligne, les protéines ont le même PM mais un point isoélectrique différent)

Sur le schéma, on observe ainsi plusieurs protéines avec des pI identiques mais de tailles différentes ou des protéines de tailles identiques et de pI différents.

Cet électrophorèse 2D permet donc de connaître les différences selon la charge et la masse.

→ Très utilisé pour l’étude des protéomiques, et le marquage fluorescent avec marqueurs de fluorescence pour mesurer l’intensité

Conditions dénaturantes

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7- Séparation en fonction de l'hydrophobicité

Rappel : protéines globulaires plutôt hydrophobes à l’intérieur

On part d’une colonne et on met nos protéines sur des résines portant des groupements hydrophobes (cycliques ou aliphatiques) :

• on stabilise les interactions hydrophobes à forte concentration ionique (généralement dans un tampon qui contient pas mal de sels → plus beaucoup de molécules d’eau qui pourraient hydrater la protéine donc on favorise l’association des régions hydrophobes de la protéine avec la résine hydrophobe)

• lorsqu'on diminue la concentration en sels (la force ionique) on élimine les protéines les moins hydrophobes au fur et à mesure

C’est une technique peu utilisée et elle peut parfois être utilisée juste après une résine échangeuse d’ions.

8- Séparation en fonction du marqueur : colonne d'affinité

Cette méthode joue sur l’interaction Ligand-Récepteur.

On a une colonne avec un support immobilisé qui contient le ligand avec une affinité sélective et spécifique pour une protéine d’intérêt donnée. On va piéger la protéine dans la colonne.

Ainsi, le ligand va accrocher notre protéine et les autres vont passer au travers de la colonne. Ensuite on ajoute un compétiteur du ligand pour éluer qui va avoir donc une meilleure affinité pour le ligand et permettre de décrocher la protéine d'intérêt.

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On peut avoir soit des ligands naturels ou soit l’utilisation du génie génétique pour obtenir un ligand non naturel (exemple du Ni-NTA).

Exemple colonne d'affinité Ni-NTA :(dans le cadre de protéines modifiées avec étiquette)

Le nickel va coordonner des résidus histidine et lorsque l’on utilise les colonnes Ni-NTA, c’est que l’on a rajouté une queue de poly-histidine (souvent 6 codons soit en Nter ou Cter) dans la séquence de la protéine ce qui nous permet d’avoir directement la protéine sur la colonne de Ni-NTA. On colle tous les résidus histidine dans notre colonne et on va pouvoir purifier (risque de changer la conformation de la protéine et donc l’activité)

Cependant, cela peut avoir un impact sur la protéine car c’est une séquence qui n’y est pas présente initialement.

Sur le schéma, on voit des ligands de fournisseurs différents et les protéines colorées au bleu de coomassie.

Attention, une seule bande sur le bleu de coomassie ne correspond pas forcément à une seule protéine donc on ne considère pas cette technique comme très sensible.

Le nitrate d’argent permet d’être plus sensible que le bleu de coomassie.

Donc si on ne voit pas de tâche cela ne veut pas dire qu’il n’y a rien mais qu’il y a peu.

III- Récapitulatif

L’ordre de la purification des protéines n’est pas anodin : certaines techniques s'utilisent plutôt pour commencer, d’autres à la fin et d'autres à n'importe quel moment.

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TP du mois d’Octobre : Résine Echangeuse d’ions

- Solution de concentration inconnue contenant 2 acides aminés

- Séparation de 2 acides aminés : Pro et asp

- Dépôt d’un volume X (mL)

- Recueil de n fractions de volume Y (mL)

- Ajout d’HCl

- Recueil de n fractions de volume Y (mL)

- Doser la proline dans l’éluat et la solution primitive (inconnue)

- Dilution au 1/100ème de la solution inconnue

- Rassembler les fractions contenant la proline et compléter le volume jusque. Z (mL)

- Dosage avec des prises d’essai de Z1, Z2 et Z3 (mL)

- Faire un schéma du dispositif expérimental

- Calcul de la concentration (mg/mL) pour chaque prise d’essai

- Déterminer la quantité totale de proline récupérée

- Déterminer la quantité de proline déposée

- Calculer le rendement (en pourcentage de récupération)

TP du mois de novembre : filtration sur gel

- Solution de concentration inconnue contenant un sucre et une protéine

- Dépôt d’un volume X (mL)

- Recueil de n fractions de volume Y (mL)

- Méthode du bleu de coomassie pour identifier les fractions contenant la protéine

- Prélever un volume Y/2 (mL) de chaque fraction positive, mélanger et ajuster le volume à 10 mL

- Doser la BSA inconnue diluée au 1/100ème et déterminer. La quantité de protéine déposée

- Effectuer un pré-dosage puis n dosage précis avec un volume de prise d’essai Z défini (mL)

- Reporter les 3 valeurs d’absorbance et déterminer les quantités

- Faire la moyenne

- Faire un schéma du dispositif expérimental

- Déterminer la quantité présente dans l’échantillon dosée (ce n’est pas l’échantillon de départ, mais.

Ce que. Vous avez récupéré après filtration)

- En déduire la quantité réelle récupérée (mL)

- Calculer le rendement (en pourcentage de récupération)