Protéines de reconnaissance intra-cellulaire : les voies Nod

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Microbiologie

Protéines de reconnaissance intra-cellulaire : les voies Nod

C. Chaput, I.G. Boneca

Institut Pasteur, Département de Microbiologie, Unité de Pathogénie Bactérienne des Muqueuses, 28 Rue du Dr. Roux, 75724 Paris cedex 15.Correspondance : I.G. B

ONECA

, voir adresse ci-dessus. e-mail : [email protected]

��

Résumé/Abstract

Protéines de reconnaissance intra-cellulaire : les voies Nod


Le peptidoglycane est un composant pariétal essentiel et unique aux bactéries. Lors d’une infec-tion, l’hôte exploite la composition particulière et unique du peptidoglycane pour reconnaîtreles bactéries. Cette reconnaissance est médiée par des récepteurs eucaryotes comme les « pep-tidoglycan recognition proteins » (PGRPs) et les protéines intracellulaires « nucleotide oligome-rization domain » (Nod). Ces protéines sont requises pour induire une réponse immunitaireadéquate aux différents pathogènes. Simultanément, les pathogènes ont mis en place des stra-tégies sophistiquées pour moduler la réponse de l’hôte.

Mots-clés :

Peptidoglycane, PGRPs, eucaryotes, protéines intracellulaires, Nod.

Intracellular sensing: the Nod pathway


Peptidoglycan is an essential cell wall component of bacteria. The host exploits the peptidogly-can particular composition and uniqueness to bacteria for specific bacterial recognition. Pepti-doglycan recognition is accomplished by receptors like the peptidoglycan recognition proteins(PGRPs) and the intracellular “nucleotide oligomerization domain” (Nod) proteins. These pro-teins are required for an adequate immune response to different pathogens. Inversely, patho-gens have developed sophisticated strategies to modulate the host response.

Key words:

Peptidoglycan, PGRPs, eucaryotes, intracellular proteins, Nod pathway.

Antibiotiques

2007 ; 9 : 54-64 © 2007. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés

Pendant très longtemps, le peptidogly-cane (PG) a été négligé pour sa capacitéà induire une réponse immunitaire,malgré de nombreuses activités biologi-ques observées dans différents modèlesanimaux : rôle d’adjuvant, activationdes macrophages, cytotoxicité, induc-tion de l’arthrite (chez le rat) ou modu-lation de l’endormissement. La premièredescription de protéines reconnaissant lePG, les PGRPs (« PG recognition pro-teins »), a été effectuée par Yoshida chezle vers à soie,

Bombyx mori

[1]. Les tra-vaux sur les PGRPs des insectes ont été

Introduction

Liste des abréviations

PG : PeptidoglycanePGRPs : Peptidoglycan

recognitionproteins

Nod : Nucleotide oligomerizationdomain

TLR2 : Toll-like receptor-2mDAP : acide meso-

diaminopiméliqueAnhMurNac : Acide N-acetyl-

anhydromuramicMurNAc : N-acetylmuramoyl-

L-alanyl-γ-D-iglutamyl-meso-diaminopimilyl-D-alanyl-D-alanine

MurNAc-L-Ala- : N-acetylmuramoyl-L-alanyl-γ-D-isoglutaminyl-L-Lysine

GlcNAc- : N-acetyglucosaminyl-N-acetyl-anhydromuramoyl-L-alanyl-γ−D-glutamyl-meso-diaminopimilyl-D-alanine

-pentapeptide

γ-D-iGln-L-Lys

anhMurNAc-L-Ala-γ-D-Glu-mDAP-D-Ala

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surtout approfondis chez

Drosophilamelanogaster

. Par la suite, des PGRPsont été également retrouvées chez lesmammifères, dont les souris et les hom-mes. Les travaux sont moins nombreuxdans ce domaine parce que le modèled’étude est plus difficile à manipuler et/ou parce que les PGRPs n’ont pas lamême importance pour le système im-munitaire que chez la drosophile. Il a étéégalement mis en évidence, chez lesmammifères, la reconnaissance du PGpar les « Toll-like receptor »-2 (TLR2).Cependant, seuls des extraits de paroiscontenant du PG mais également descontaminants pouvaient être reconnuspar TLR-2. Des analyses plus pousséesont permis de montrer que TLR-2 re-connaît le LTA ou la lipoprotéine deBraun mais pas le PG [2]. Enfin, ces der-nières années, il a été mis en évidencel’existence de deux récepteurs intracel-lulaires reconnaissant certains motifs duPG chez les mammifères, nommésNod1 et Nod2 (« nucleotide-bindingoligomerization domain » 1 et 2).

Le PG est effectivement un très boncandidat pour la reconnaissance par lesystème immunitaire inné car il est spé-cifique et présent chez pratiquementtoutes les eubactéries. Sa compositionchimique est unique de par l’alternanced’acides aminés lévogyres et dextrogyreset d’un acide diaminé unique auxeubactéries, l’acide diaminopimélique(mDAP). Lorsque l’on considère lacapacité du PG à être reconnu par lesdifférents récepteurs eucaryotes citésprécédemment, un certain nombre dequestions se posent :

1) Accessibilité du PG au récepteur :le récepteur peut-il reconnaître des frag-ments solubles de PG (muropeptides)ou un PG polymérique, par une liaisondirecte au niveau de la bactérie (possiblepour les bactéries à Gram positif dont lePG n’est pas camouflé par une mem-brane externe), ou par liaison de frag-ments libérés par la bactérie ?

2) Structure de la partie peptidiquedu PG : les récepteurs sont plus oumoins spécifiques de certains motifs duPG ; comment les variations peptidi-ques observées chez les bactéries in-fluencent-elles la reconnaissance ?

3) Nature des sucres du PG : les sac-charides sont-ils nécessaires et, s’ils lesont, peuvent-ils influencer la reconnais-sance du PG ? Les bactéries à Gram néga-

tif ont des chaînes de glycane se termi-nant par un AnhMurNAc et les produitsde dégradation sont des anhydromuro-peptides. Par contre, les bactéries à Grampositif n’ont pas d’anhydrosaccharides.De même que pour la partie peptidique,comment les variations au niveau dessaccharides, observées chez les bactéries,influencent-elles la reconnaissance ?

Les PGRP sont une nouvelle famille de pro-téines bactéricides [3, 4] de reconnaissancedu peptidoglycane : chez l’Homme, il existe4 PGRPs : PGRP-L (Longue, 64 kDa), -I

α

(Intermédiaire, 38 kDa), -I

β

(46 kDa), et -S(courte, 24 kDa). Ces PGRPs présententtoutes un peptide signal pour l’exportationde la protéine. Les PGRP-I

α

et -I

β

se lientfaiblement à des bactéries entières (

Bacillussubtilis

et

Micrococcus luteus

) et au PG de

S. aureus

[3]. Elles sont exprimées principa-lement au niveau de l’œsophage [3] et ontune activité bactéricide [4]. La structureminimale qui lie PGPR-I

α

est le muramyl-tripeptide à Lys ou à l’acide

meso

-diamino-pimélique (mDAP). Le fragment de PGpour une liaison optimale correspond à unN-acetylmuramoyl pentapeptide (Mur-NAc-pentapeptide) à Lys ou à un Mur-NAc-tétrapeptide à mDAP [5]. Cependant,la constante de dissociation pour ces subs-trats est de 62

µ

M ce qui signifie que laPGRP-I

α

présente très peu d’affinité pourles fragments de PG testés.

PGRP-L : ACTIVITÉ AMIDASE

Les PGRP-L humaine et murine sont lesseules à avoir une activité amidase [6,7]. La PGRP-L humaine n’a cependantpas d’activité bactéricide étant activeprincipalement sur des fragments solu-bles du PG [7]. La présence d’activitéamidase dans le sérum humain a été dé-crite et caractérisée [8]. Bien que laPGRP-L soit prédite pour être trans-membranaire, de nombreux argumentssont en faveur du fait que la PGRP-Lsoit l’amidase retrouvée dans le sérum.La PGRP-L et l’amidase sérique ont tou-tes deux :

— la même activité et la même spéci-ficité de reconnaissance du substrat ;

— les mêmes 15 premiers acides aminés(obtenus par séquençage N-terminal) ;

Abréviations (suite)

CARD : Caspase recruitmentdomain

RICK : RIP-like interacting caspase-like apoptosis regulatory protein kinase

RIP2 : Receptor-interacting protein 2

CARDIAK : CARD-containingRIP kinase

NBD, NBS : NucleotidebindingDomain ou Site

LRR : Leucin-rich repeatsNF-κB : nuclear factor-

kappaBGlcNAc- : N-acetyglucosami

nyl-N-acetyl-anhydromuramoyl-L-alanyl-γ-D-glutamyl-meso-diaminopimilate

UDP-MurNAc- : Uridyldiphosphate-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-γ-D-isoglutamyl-meso-diaminopimilate

TCT : Tracheal cytotoxinKC : Keratinocyte-

derived cytokineFK-156 ou D- : D-lactyl-L-alanyl-

γ-D-glutamyl-meso-diaminopimilyl-glycine

GlcNAc-MurNAc- : N-acetylglucosa-minyl-N-acetylmu-ramoyl-L-alanyl-γ-D-isoglutamine

MurNAc- : N-acetylmuramoyl-L-alanyl-γ-D-glutamyl-meso-diaminopimilate

GlcNAc- : N-acetyglucosaminyl-N-acetyl-anhydromuramoyl-L-alanyl-γ−D-glutamyl-meso-diaminopimilyl-D-alanine

TGL : Transglycosylaseslytiques

LTA : Acides lipoteichoïdes

LA-15-PP : Lipide A-type de Escherichia coli

anhMurNAc-tripeptide

tripeptide

lactyl-L-Ala-γ-D-Glu-mDAP-Gly

dipeptide ou Glc-NAc-MurNAc-L-Ala-DiGln

tripeptides

anhMurNAc-tétrapeptide

(agoniste TLR4)

PG et « PG Recognition Proteins » (PGRPs) mammaliennes

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Protéines de reconnaissance intra-cellulaire : les voies Nod C. Chaput, I.G. Boneca

— la même masse molécula ire(64 kDa) (revue [9]).

La PGRP-L murine surproduite dansdes cellules S2 est retrouvée dans le sur-nageant de culture [6]. Il se pourraitdonc que PGRP-L soit sécrétée dans lesang et soit l’amidase du sérum humain.Le gène codant la PGRP-L est expriméprincipalement au niveau du foie, aussibien chez l’Homme que chez la souris[3, 6]. Cette amidase est connue pourannihiler l’activité immunostimulantedu PG après son hydrolyse [9]. Récem-ment, la PGRP-L a été aussi montréepouvant être induite chez les kératino-cytes par des bactéries [10].

La structure minimale du PG pour la-quelle une activité amidase de la PGRP-Lhumaine est observée est le MurNAc – L-Ala-D-iGln-L-Lys [7]. Chez la souris, laPGRP-L est capable d’hydrolyser : 1) trèsefficacement le PG de

E. coli

; 2) moins ef-ficacement celui de

S. aureus

[6] ; 3) et ellea une activité amidase sur le GlcNAc-anh-MurNAc-L-Ala-

γ

-D-Glu-mDAP-D-Ala[6]. Il serait intéressant de déterminer siles PGRP-L murine et humaine ont lamême spécificité de substrat. Récemment,des souris transgéniques dépourvues dePGRP-L ont été construites et leur phéno-type analysé [11]. Ces souris déficientes enPGRP-L montrent une très légère diminu-tion de la mortalité lors de l’injection in-trapéritonéale de

E. coli

, mais ceci unique-ment pour les faibles doses, et une trèslégère diminution de la production de IL-6 sérique. La PGRP-L ne semble donc pasavoir la même importance chez les mam-mifères que chez les insectes.

PGRP-S : ACTIVITÉ BACTÉRIOSTATIQUE

La PGRP-S est présente chez la souris,l’Homme, les bovins, le rat (dans le cer-veau où elle est surexprimée quandl’animal est privé de sommeil) et le cha-meau (PGRP-S dans le lait). La PGRP-Sn’a pas d’activité amidasique mais ellepeut présenter une activité bactériostati-que et/ou bactéricide vis-à-vis des bacté-ries à Gram positif [12, 13]. Le méca-nisme d’action par lequel la PGRP-S estbactériostatique ou bactéricide est en-core inconnu. Cependant, une activitésynergique pour la lyse et/ou l’inhibi-tion de la croissance bactérienne est ob-servée quand la PGRP-S humaine estco-incubée avec le lysozyme humain

[14]. Le gène de la PGRP-S s’exprimedans la moëlle osseuse, et les neutrophi-les bovins et humains [3, 13] où elle estretrouvée en grande quantité dans lesgranules, participant ainsi à la mort desbactéries à Gram positif [3, 15]. LaPGRP-S murine lie fortement le PG po-lymérique (Kd = 13 nM) et faiblementle PG sous forme de monomères [15].La structure minimale reconnue par laPGRP-S humaine correspond à du mura-myl-tripeptide à mDAP [5]. La constantede dissociation de cette liaison est faibleindiquant une liaison forte. Des sourisdéficientes en PGRP-S ont montré unesensibilité accrue à des bactéries à Grampositif non pathogènes, comme

Bacillussubtilis

et

Micrococcus luteus

, lorqu’ellessont injectées par voie intrapéritonéalemais pas pour des pathogènes tels que

S. aureus

et

E. coli

[12]. Les PGRPs nesemblent donc pas jouer un rôle aussiimportant dans la réponse immunitaireinnée chez les mammifères que chez ladrosophile.

NOD1

La première description de Nod1 date de1999 [16]. Ce Nod1 correspond au frag-ment d’ADN complémentaire (ARN ré-tro-transcrits) issu de cellules B d’unhomme ayant un lymphome. Ce transcrita permis de remonter au gène qui est pré-sent sur le chromosome 7. La protéineNod1 est constituée de trois domaines :

1) Le domaine N-terminal CARD(« caspase recruitment domain ») :comme son nom le suggère, ce domainea été initialement impliqué dans l’acti-vation des caspases et de l’apoptose (re-vue [17]). Nod1 est capable d’interagiravec les caspases -1, -2, -4, -8, et -9 maispas avec les caspases 3 et 7 [16]. Les pro-téines possédant ce domaine montrentdes interactions homotypiques soit avecelles-mêmes soit avec des protéines pré-sentant ce domaine. Nod1 est capablede former des oligomères et peut égale-ment interagir avec RICK (aussi appeléRIP2 et CARDIAK) et CLARP.

2) Le domaine central NBD ou NBS(« nucleotide binding domain » ou« site ») : ce domaine est nécessaire avecle domaine CARD pour l’activation dela procaspase 9, favorisant ainsi l’apop-tose [16]. Cependant, il ne semble pasque cela soit le rôle majeur de Nod1. Il

est aussi requis pour l’oligomérisationde Nod1 et l’activation de NF-

κ

B.3) Le domaine C-terminal LRR

(« leucin-rich repeats ») : il est constituéde 10 répétitions riches en leucine cor-respondant à une alternance d’hélices

α

et de feuillets

β

qui forment une struc-ture en forme de fer à cheval. Des do-maines LRRs sont également présentsau niveau des TLRs (« Toll-like recep-tors ») et servent à la reconnaissance deconstituants microbiens.

L’expression du gène Nod1 a été étudiéechez la souris et est retrouvée dans le foie,le thymus et le rein, mais également :

— au niveau du coeur, du placenta, dupoumon, du muscle squelettique, de larate et des ovaires chez la souris adulte ;

— au niveau de certaines zones ducerveau et du système nerveux central,et l’épithélium intestinal chez l’embryonde souris [16].

RÔLE DE LA PROTÉINE NOD1

La protéine Nod1 a été très rapidementreconnue comme jouant un rôle clédans la stimulation de la réponse immu-nitaire par activation de NF-

κ

B. L’auto-association de Nod1 est nécessaire etsuffisante à l’activation de NF-

κ

B enl’absence du domaine LRR [18]. L’in-duction de NF-

κ

B par Nod1 est indé-pendante de la voie TNF

α

et se fait vial’interaction de Nod1 avec RICK [16,18]. La voie Nod1 aboutit à la produc-tion de cytokines proinflammatoires tel-les qu’IL-8 responsable du recrutementdes neutrophiles au site d’infection. Si leLPS a été le premier constituant bacté-rien identifié comme étant reconnu viaNod1 [19, 20], il a été très vite évidentque ce qui était reconnu était le PG,contaminant fréquent des préparationsde LPS commerciales [21-23]. Le motifde PG reconnu par Nod1 est le GlcNA-MurNAc-tripeptide à mDAP et la structureminimale reconnue est le

γ

-D-Glu- mDAP

(figure 1)

; la présence des saccharides n’estdonc pas essentielle à la reconnaissance[23]. De même, la présence d’un UDP àla place du GlcNAc ne modifie pas la ca-pacité à activer NF-

κ

B via Nod1 [23].Or, l’UDP-MurNAc-tripeptide est unprécurseur du PG retrouvé dans le cyto-plasme des bactéries. Ils peuvent doncêtre également des activateurs de NF-

κ

B.Par contre, la moindre modification auniveau du troisième acide aminé, lemDAP, telle qu’une amidation ou le

B. PG et Nods

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remplacement par de la L-Lys ou de laL-Orn, abolit l’activation de NF-

κ

B,Nod1 dépendante [21, 23]. Nod1 estdonc capable de détecter la présence dePG.

MODE D’ACTION DE NOD1 EN INTRACELLULAIRE

Cependant, la position cytoplasmiquede Nod1 nécessite un mécanisme parti-culier pour cette reconnaissance. Ino-hara avait déjà mentionné la probabilitéque la protéine soit cytosolique selondes données de microscopie confocale,mais qu’il n’a pas publiées [16]. Il estpossible que Nod1 ne reconnaisse pas

directement le PG, l’interaction n’ayantjamais été mise en évidence. Mais la né-cessité d’avoir le PG en intracellulairepour pouvoir être senti par la cellule adonné lieu à vérification. Effectivement,l’activation de NF-

κ

B via Nod1 n’a lieuque si le PG est introduit dans la cellulepar : transfection du PG, perméabilisa-tion de la membrane (ex. par la digito-nine), ou micro-injection (revue [24]).Il semble donc que Nod1 soit intracellu-laire et que la reconnaissance du PG(directe ou non) ait également lieu enposition intracellulaire. Donc vraisem-blablement, seules les bactéries intra-cellulaires ou mettant en œuvre desmoyens de transloquer leurs fragments

de PG en intracellulaire peuvent activerNF-

κ

B par la voie Nod1. Ce point seradéveloppé ultérieurement. De façonsurprenante, si le MurNAc-tripeptiden’était pas connu pour avoir une activitébiologique (avant l’ère des Nods), le Gl-cNAc-anhMurNAc-tétrapeptide àmDAP avait déjà été identifié commeétant la cytotoxine de

Bordetella pertus-sis

, appelée TCT (« Tracheal cytotoxin »[25]).

Spécificité humaine et/ou murine ?

Très récemment, il a été démontré quele Nod1 murin était capable de recon-naître cette TCT, mais pas le Nod1 hu-main [26]. La spécificité vis-à-vis du

FIG. 1. — Différents motifs du peptidoglycane (PG) reconnus par les Nod1 humain et murin.

FIG. 1. — Various peptidoglycane fragments (PG) detected by human and murine Nod1.

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m

DAP est toujours conservée chez lasouris. La stimulation des macrophagespéritonéaux de souris avec la TCT, lelactyl-Tétra à mDAP ou le FK-156 en-traîne la production de cytokines : TNF-

α

, IL-6, IL-1

β

, KC (« keratinocyte-deri-ved cytokine » ; analogue murin de l’IL-8) et celle de NO. Ceci est dépendant deNod1, car les souris mutées pour le gèneNod1 ne sont plus stimulées par cesfragments du PG ou par ces analoguesstructuraux [26]. Le FK-156 est un ana-logue structural d’un muropeptide quicorrespond à un D-lactyl-L-Ala-

γ

-D-Glu-mDAP-Gly. De plus, les structuresminimales portant une activité cytotoxi-que (et donc une possible reconnais-sance par Nod1) correspondent au tri-peptide L-Ala-

γ

-D-Glu-mDAP avec unecytotoxicité diminuée, et au lactyl-tétra-peptide pour une activité cytotoxiqueoptimale [27]. Ces deux Nod1 étudiésne sont toutefois issus chacun que d’unseul individu. L’étude d’un plus grandnombre de Nod1 chez l’Homme et lasouris pourra permettre de clarifier laspécificité humaine et murine de la re-connaissance d’un tripeptide et d’un té-trapeptide, respectivement. Une des ac-tivités biologiques connues du PG est sacapacité à induire l’endormissement. Ilest intéressant de souligner que, chez lasouris au stade embryonnaire, l’expres-sion de Nod1 est retrouvée dans le cer-veau et le système nerveux central [16].Le mécanisme du sommeil est une chosecomplexe et le rôle potentiel de Nod1dans ce mécanisme serait intéressant àprospecter.

NOD2

Peu de temps après la première descrip-tion de Nod1, il a été retrouvé un homolo-gue de Nod1, appelé Nod2 [28]. Le gènede Nod2 est présent sur le chromosome16 et la protéine codée par ce gène pré-sente 34 % d’identité avec Nod1. L’ossa-ture protéique en différents domaines estglobalement la même pour Nod2 etNod1, exception faite que Nod2 présentela particularité de posséder deux domai-nes CARD. Contrairement à Nod1 dontl’expression semble pléitropique dans lesdifférents tissus de l’organisme, Nod2 estexprimée sous forme de deux transcrits,principalement dans les leucocytes dusang périphérique, et plus particulière-ment, dans les granulocytes, les monocy-tes et les cellules dendritiques [28, 29]. Des

mutations dans le gène Nod2 ont été asso-ciées à la maladie de Crohn [30-32], quiest une maladie chronique du désordre in-flammatoire au niveau du tractus intesti-nal, et à la maladie de Blau qui correspondà un désordre inflammatoire granuloma-teux [33, 34].

RÔLE ET MODE D’ACTION DE NOD2

Tout comme Nod1, Nod2 est capabled’induire NF-

κ

B via son interactionavec RICK et il est aussi capable de s’oli-gomériser, via l’interaction de ces deuxdomaines CARD. L’interaction de Nod2avec RICK semble très spécifique carNod2 n’interagit pas avec les nombreu-ses molécules testées [28]. En l’absencede son domaine LRR, Nod2 s’oligomé-rise massivement et l’activation de NF-

κ

B est accrue. Comme pour Nod1, lePG est reconnu par la cellule via Nod2[22, 23], bien que les premiers travauxmentionnent la stimulation de la voieNod2 par du LPS commercial. Des tra-vaux utilisant un gène rapporteur placéen aval du promoteur de Nod2 ont per-mis de mettre en évidence que l’expres-sion du gène Nod2 était elle-même in-duite par NF-

κ

B lors de la stimulationde la protéine Nod2 [29]. La stimulationpar du PG induit donc une boucled’amplification du signal. Ce phéno-mène a été observé dans des monocytes,cellules exprimant constitutivement legène Nod2, et également dans d’autrestypes cellulaires bien que la réponse soitplus faible. De plus, la translocation deNF-

κ

B dans le noyau a été observée lorsde la stimulation de Nod2 et ceci uni-quement dans les monocytes, ce quin’est pas le cas pour Nod1 [23]. Dans cesystème, il reste à découvrir le méca-nisme de rétrocontrôle qui permettraune diminution du signal après la pre-mière vague de réponse. L’activation deNF-

κ

B, après reconnaissance du PG viaNod2, entraîne la production de nom-breuses cytokines : IL-1, IL-6 et TNF

α.

Le TNF

α

produit par les macrophagesmurins est dépendant de Nod2 et nonde Nod1 [26], renforçant l’idée de deuxrôles différents pour Nod1 et Nod2.

RÔLES RESPECTIFS DE NOD1 ET NOD2

L’un, Nod1, jouerait un rôle dans la re-connaissance de pathogènes en premièreligne de défense contre les pathogènes

(par exemple, au niveau d’épithéliums),l’autre, Nod2, stimulerait la réponse im-munitaire. Le variant Nod2 retrouvéchez les patients atteints de la maladiede Crohn peut, quand il est surexprimé,activer légèrement NF-

κ

B, mais l’activa-tion massive lors de la stimulation par lePG est abolie [23]. Cependant, le lienentre un défaut de la réponse immuni-taire via Nod2 et la maladie reste à éluci-der. Le motif du PG reconnu par Nod2est le GlcNAc-MurNAc-dipeptide et lemotif minimal correspond au muramyl-dipeptide [23, 35]. L’acide aminé endeuxième position peut être un D-glu-tamate ou de la D-isoglutamine (D-iGln). Le domaine LRR est primordial àla reconnaissance (directe ou indirecte)du muramyl-dipeptide. Effectivement,la modification d’un seul acide aminépeut entraîner la perte de la capacité àinduire NF-

κ

B ou inversement entraî-ner une activation accrue [36]. Il existeégalement d’autres fragments du PGpouvant être reconnus : les MurNActri-peptides à L-Lys, à L-Orn ou à mDAPamidé, ainsi que les précurseurs du PG,tels que les UDP-MurNAc-dipeptides et- tr ipept ides à mDAP ou à L-Lys

(figure 2)

[22]. Nod2 peut donc recon-naître de nombreuses bactéries et pré-sente un spectre de reconnaissanceélargi par rapport à celui de Nod1. Laprésence du MurNAc est, par contre, es-sentielle à la reconnaissance du PG : eneffet, si ces motifs subissent une hydro-lyse par l’amidase du sérum humain ouune réduction du sucre (qui correspondà l’ouverture du sucre cyclique), ou pré-sentent un AnhMurNAc à la place duMurNAc, cela entraîne une perte de lacapacité à activer NF-

κ

B via Nod2 [22].Il est également nécessaire que Nod2 soitrecruté au niveau de la membrane cyto-plasmique pour qu’il y ait activation deNF-

κ

B [37]. Ceci suggère un mécanismecomplexe d’activation de NF-

κ

B parNod2 lors de l’infection bactérienne.

MÉTABOLISME DU PG ET RÉPONSE IMMUNITAIRE

La réponse immunitaire et l’inflammation(générée par la réponse immunitaire) sontdépendantes de plusieurs facteurs. Le pre-mier facteur est la détection d’une bactériepathogène par l’organisme hôte. Le PGpeut être une des molécules reconnues parl’hôte, soit par les protéines Nods chez

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l’homme, soit par les PGRPs chez les in-sectes. Le deuxième facteur est le métabo-lisme du PG chez la bactérie considérée.Ce métabolisme est à l’origine des diffé-rences de composition du PG (générantainsi du PG reconnaissable ou non parl’hôte), et du type et de la quantité de mu-ropeptides libérés par la bactérie. Les en-zymes de synthèses, d’hydrolyse et derecyclage du PG sont donc à prendre encompte lors de la pathogenèse. Pour cha-que bactérie pathogène, il peut donc yavoir ou pas une réponse immunitaire quilui est spécifique.

BACTÉRIES ENTÉROPATHOGÈNES INVASIVES

Rôles de Nod1 et Nod2

De nombreuses bactéries pathogènespeuvent être détectées par Nod1. Chezl’homme, Nod1, dont le gène est ex-primé dans les cellules épithéliales intes-tinales, sert de « détecteur » de bactériesentéropathogènes invasives telles queE. coli et Shigella flexneri [38, 39]. L’ex-pression du gène Nod2 dans ces cellulesest difficilement détectable mais elle estinduite lors de l’infection par différents

FIG. 2. — Motifs du PG reconnus par les Nod2 humain et murin.

FIG. 2. — Fragments of PG recognized by human and murine Nod2.

entéropathogènes, tels que E. coli,S. flexneri et Salmonella serovar Dublin[38]. Ceci suggère une amplification dela détection par Nod2 après une pre-mière détection par Nod1 dont le ni-veau d’expression génique est inchangélors de l’infection (figure 3). Au niveaudu tractus intestinal, la présence de laflore commensale nécessite une détec-tion contrôlée pour distinguer les bacté-ries commensales et les pathogènes. Parexemple, la reconnaissance du LPS parTLR4 n’est pas fonctionnelle dans lescellules épithéliales intestinales. Le ré-cepteur Nod1 joue donc un rôle pri-mordial dans la discrimination desbactéries à Gram négatif pathogènes (PG àmDAP) des bactéries commensales.

Bactéries intracellulaires

Effectivement, seules les bactéries présen-tes au niveau intracellulaire, S. flexneri,peuvent être détectées et entraîner une in-flammation aiguë. Le PG et son métabo-lisme chez E. coli de type K12 (soucheMC1061) ont été caractérisés, même s’ilsubsiste des inconnues. Une souche E. colide laboratoire présente un PG à mDAPmais possède peu de motif GlcNAc-Mur-NAc-tripeptide, élément reconnu parNod1. De plus, le PG pariétal, dégradédans ce type de bactérie, est majoritaire-ment recyclé. Il est admis que seulement 6à 8 % sont réellement libérés par la bacté-rie par génération [40]. Ceci amène à sug-gérer que très peu de GlcNAc-MurNAc-tripeptides sont potentiellement libéréspar la bactérie et donc capables d’induirela voie Nod1. Cependant, la compositiondu PG pariétal des E. coli pathogènes ouS. flexneri et la capacité à libérer des muro-peptides ne sont pas connues. De plus,lors de l’infection de cellules épithéliales, lemétabolisme du PG peut être modifié. Il aété démontré que, lors de l’infection decellules Hela, l’expression du gène de latransglycosylase lytique SltY de S. flexneriest induite [41]. Bartoleschi a aussi ob-servé que le mutant sltY filamente lors del’infection, montrant que la régulation dumétabolisme du PG pouvait être soumiseà variation selon les conditions environne-mentales et se modifier lors d’une infec-tion. La production de cytokines, généréeslors de l’infection par la souche parentaleversus le mutant sltY, n’a pas été analysée.Elle aurait pu être un bon indicateur de laréponse affectée par cette mutation, ré-ponse qui logiquement devrait impli-quer la voie Nod1. En effet, l’hydrolase

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SltY est très probablement responsablede la libération d’anhydromuropeptideset potentiellement de GlcNAc-anhMur-NAc-tripeptide qui pourra être reconnupar Nod1. Le PG pariétal de Salmonella ty-phimurium a été analysé lorsque la bacté-rie était en position intracellulaire, dansdes cellules épithéliales in vitro. Ainsi, il aété constaté que le PG de la bactérie étaiten partie hydrolysé par une amidase de labactérie ou de l’hôte [42]. Par ailleurs, unmutant ampD est moins invasif vis-à-visdes macrophages mais entraîne une pro-duction de NO plus importante que lasouche parentale [43]. La protéine AmpDest une amidase du PG présent dans le cy-toplasme de la bactérie qui permet le recy-clage d’anhydromuropeptides. Le mutantAmpD ne peut donc plus recycler correc-tement le PG pariétal, AmpD étant res-ponsable d’une étape clé dans cette voie[40]. Le mutant ampG a été égalementtesté, AmpG étant responsable de l’importde muropeptides dans la bactérie. Contretoute attente, les résultats montrent que cemutant n’est pas affecté dans sa capacité àenvahir les macrophages, ni dans sa capa-

cité à induire la production de NO [43].Une étude plus approfondie de l’inter-action entre S. typhimurium et des macro-phages est nécessaire pour comprendre lerôle de la voie de recyclage du PG dans lapathogenèse de cette bactérie invasive.

BACTÉRIES À GRAM NÉGATIF PATHOGÈNES DIVERSES

Helicobacter pylori et Nod1

Récemment, il a été mis en évidence queH. pylori pouvait être détectée par des cel-lules épithéliales gastriques. Cette recon-naissance se fait via Nod1 et engendrel’activation de NF-κB et la productiond’IL-8, ceci uniquement si la bactérie pos-sède un appareil de sécrétion de type IVfonctionnel. De plus, nous avons confirméque le PG de H. pylori est transloqué dansla cellule eucaryote grâce à l’appareil de sé-crétion [44]. L’infection chronique parChlamydophila pneumoniae génère des lé-sions vasculaires et de l’athérosclérose.Cette bactérie, pour laquelle l’existence dePG est l’objet de controverse [40], est ca-pable d’induire l’activation de NF-κB et la

production de IL-8, ceci de façon dépen-dante à la fois de Nod1 et de Nod2 [45]. Ilsemble donc que C. pneumoniae possèdeet fabrique du PG, mais son PG n’est pro-bablement pas sous une forme polyméri-que et/ou structurée comme chez les bac-téries capables de vivre en positionextracellulaire, d’où la difficulté à détermi-ner la présence de PG chez cette bactérie.La production de PG chez cette bactérieintracellulaire obligatoire est peut-être unvestige du métabolisme du PG d’un ancê-tre qui s’est simplifié à son strict mini-mum, et/ou une nécessité pour le main-tien d’une réponse immunitaire par l’hôtequi, elle-même, aurait un rôle pour la sur-vie de la bactérie.

BORDETELLA PERTUSSIS ET CYTOXINE TCT

Bordetella pertussis est l’agent responsa-ble de la coqueluche, maladie essentiel-lement enfantine (enfants de moins de7 ans), qui se caractérise entre autres si-gnes par d’intenses quintes de toux.Cette bactérie produit une cytotoxine

FIG. 3. — Hypothèse de reconnaissance du PG par les cellules épithéliales d’une barrière mucosale.

FIG. 3. — Hypothesis of recognition of PG by epithelial cells of a mucosal barrier.

IL-1, IL-6, IL-8

entéropathogèneinvasif

Barrièreépithéliale

PGDétection

Nod1

RICK

pathogèneextracellulaire avec

appareil de sécrétion

Inter-action

activation(via complexe IKK)

NF-kB

Induction expression

Nod2

RICK

PG

Détection secondaire

Activation Primaire

Activation Secondaire

sous-muqueuse

Inter-action

Nod2

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Microbiologie

trachéale, appelée TCT (« Tracheal cy-totoxin »), et qui correspond à du Glc-NAc-anhMurNAc-tétrapept ide àmDAP. Cette TCT engendre des dom-mages sur les cellules ciliées in vivo et invitro sur des explants d’épithélium pul-monaire. La TCT a été décrite commeactivant la production d’IL-6, d’IL-1 etd’oxyde nitrique (NO) [46, 47]. Rappe-lons que la cytokine IL-1 est responsablede la production de NO par l’activationde la NO synthase inductible (iNOS).Comme nous l’avons vu précédem-ment, la TCT est reconnue par le Nod1murin. Les expérimentations sur la TCTont été majoritairement effectuées chezla souris, le hamster, ou sur des cellulesissues de ces animaux. Il est donc néces-saire de déterminer si le PG de B. pertus-sis peut être reconnu par les cellules épi-théliales de poumons humains et doncsi la bactérie est aussi capable de libé-rer du GlcNAc-anhMurNAc-tripeptide.Des mutations dans le gène ptlE, codantune putative hydrolase du peptidogly-cane, entraînent une diminution voireune perte de la toxicité des surnageantsde culture [48]. Les auteurs ont proposéla possibilité d’un lien avec la capacité àsécréter la toxine pertussique via l’appa-reil de sécrétion de type IV, qui nécessi-terait une hydrolase du PG pour pou-voir traverser le PG pariétal. Mais, ilsn’ont pas testé si l’appareil de sécrétionétait présent ou non et s’il était fonc-tionnel ou non. Il se pourrait que cettehydrolase PtlE, putative TGL (selon leshomologies de séquence), soit responsa-ble de la production de muropeptidespouvant être reconnus par la suite par lacellule eucaryote, comme cela a été dé-montré pour H. pylori [44].

NEISSERIA GONORRHOEAE

Neisseria gonorrhoeae infecte l’appareiluro-génital et, plus rarement, la conjonc-tive oculaire. Des complications suite àl’infection peuvent aboutir à une stéri-lité de la femme, à de l’arthrite, à des lé-sions cutanées ou à une septicémie. LaTCT et ses activités biologiques ont éga-lement été décrites pour la bactérieNeisseria gonorrhoeae [49, 50]. Il a étémontré qu’au moins deux transglycosy-lases lytiques (TGL) étaient responsa-bles de la libération de muropeptideschez cette bactérie : AtlA et LtgA. LaTGL AtlA permettrait la libération de40 % du PG retrouvé dans les surna-

geants de culture, mais l’hydrolase LtgAest la principale responsable de la géné-ration d’anhydromuropeptides mono-mériques [51]. L’étude de la réponseimmunitaire, lors de l’infection in vitroet in vivo par un mutant ltgA et/ou atlA,serait intéressante à mener afin de confir-mer la corrélation entre le taux de pro-duction d’anhydromuropeptides et leniveau de réponse immunitaire.

BACTÉRIES PATHOGÈNES OPPORTUNISTES

Pseudomonas aeruginosa est une bactériepathogène opportuniste, affectant lespersonnes immunodéprimées. Cettebactérie est responsable d’infectionscutanées (suppurations), méningées,pulmonaires, intestinales, urinaires etde septicémies. P. aeruginosa possède denombreux constituants reconnus pardes TLRs : la flagelline reconnue parTLR5, le LPS reconnu par TLR4 etl’ADN CpG reconnu par TLR9. Cepen-dant, un mutant fliC, ne produisantplus de flagelles, a la même capacitéd’induire l’activation de NF-κB que lasouche parentale [52]. Ceci suggère queTLR5 reconnaisse préférentiellement laflagelline sous forme monomérique. Deplus, son PG est également reconnu parl’hôte murin via Nod1 et entraîne laproduction de la cytokine KC [52]. Ilreste à déterminer si cette activation dela réponse immunitaire via Nod1 estdue à des bactéries intracellulaires et/ouà des bactéries pouvant transloquer duPG, par exemple grâce à son appareil desécrétion de type III. Streptococcus pneu-moniae est une bactérie pathogèneopportuniste. Elle est responsable depneumonies, de complications broncho-pulmonaires consécutives à une grippe,une rougeole ou une coqueluche et at-teint particulièrement les individusayant une immunité diminuée. Elle estégalement responsable, d’infections plusbénignes (rhinopharyngites, otites, si-nusites), ou très sévères telles que lesméningites pneumococciques chez l’en-fant. S. pneumoniae peut induire NF-κBvia la voie Nod2 mais pas via Nod1 hu-main [53]. D’ailleurs, ce résultat estconforté par l’observation de l’activa-tion de cellules mononucléaires du sangpériphériques lors de la stimulation pardu PG purifié ou par le MurNAc-tripep-tide [54]. Cette non reconnaissance viaNod1 pouvait être prédite de par la pré-

sence de L-Lys en troisième positiondans le PG pariétal de cette bactérie.

Enfin, l’expression des gènes de Nod1et Nod2 a été retrouvée induite aprèsune infection à pneumocoques chez lessouris C57/Black-6, bien que seul Nod2puisse être impliquée dans la reconnais-sance du PG de S. pneumoniae [53].

SYNERGIE ENTRE TLRS ET NODS POUR LA RÉPONSE IMMUNITAIRE

Lors d’une infection, l’hôte est confronté àdes bactéries entières qui sont compo-sées d’autres molécules détectables viad’autres récepteurs comme les TLRs.Par conséquent, il est normal que la re-connaissance d’un pathogène passe parla détection simultanée de différentscomposants bactériens. Effectivement, ila été rapporté une synergie du PG avecles acides lipotéichoïques (LTA), consti-tuants pariétaux des bactéries à Grampositif et ligands de TLR2. L’injectionconcomitante de ces deux composésentraîne, chez le rat, la production d’in-terféron-γ (IFNγ), de TNFα et une pro-duction accrue de NO synthase [55, 56].Plus précisément, le GlcNAc-MurNAc-L-Ala-DiGln en synergie avec LTA estun activateur d’iNOs dans les macropha-ges murin in vitro [56]. Il est égalementobservé des défaillances fonctionnelles auniveau de certains organes. Par exemple,l’augmentation du taux d’urée et decréatinine sérique est observée chez lerat après stimulation par le PG et leLTA, et est un marqueur du dysfonc-tionnement du rein [56]. De plus, il y aaugmentation des transaminases et de labilirubine qui sont, elles, des marqueursd’un dysfonctionnement hépatique[56]. L’augmentation de lipases indiquedes dégâts provoqués au niveau du pan-créas et une hypotension ; une hypo-réactivité vasculaire a été observée suiteà l’injection de ces deux composés pa-riétaux [55]. L’ensemble de ces résultatssuggère que la présence concomitantede ces deux constituants est responsabledu choc septique pouvant être observéchez certains patients infectés, parexemple, par S. aureus [56]. De plus,une activité synergique du LTA et duPG de S. pyogenes est rendue responsa-ble de la défaillance respiratoire et duchoc septique chez le cochon [57]. En-fin, les cellules T et les monocytes dusang humain produisent du TNFα, del’IL-6 et IL-10 lors de leur co-stimula-

62


tion par du LTA et du PG [58]. Le Glc-NAc-MurNAc-L-Ala-DiGln en syner-gie avec le LPS (ligand de TLR4),constituant pariétal des bactéries àGram négatif, peut induire un choc sep-tique, des dysfonctionnements au ni-

veau de certains organes et la produc-tion de TNFα chez le rat de la mêmefaçon que lors de l’injection de PG et deLTA [56]. Des travaux plus récents per-mettent de mieux comprendre la basemoléculaire de ces symptômes observés

FIG. 4. — Modèle de synergie de la double reconnaissance du PG et du LPS, du LTA ou TApar des monocytes.

FIG. 4. — Synergistic model of recognition of PG and LPS, of LTA or TA by monocytes.

NF-kB

PG

Monocyte

Nod2

TLR2 TLR4

LPSLTA,TA

Liaison Liaison

+? +?

PG

hPepT1

NF-kB

Réponseinflammatoire

Réponseinflammatoire

FIG. 5. — Schéma général de l’implication du métabolisme du PG de la bactérie dans l’induc-tion de la réponse immunitaire et la génération de l’inflammation, où un rétrocontrôle seraitpossible par les hydrolases du PG (eucaryotes ou bactériennes).

FIG. 5. — General schema showing implication of bacterial PG metabolism in various systems(immunity, inflammatory response, etc.) and possible regulatory mechanisms.

Composition du PG

Libérationde

muropeptides

Synthétases

Hydrolases

Métabolisme du PG

Réponse inflammatoire

Reconnaissance par Nods

Hydrolases : Lysozyme, amidase...

Hôte

?

?

Autres constituants bactériens

LTA, TA, LPS ...Reconnaissance

par TLRs...

Synergie

chez le rat. Le muramyl-tripeptide àmDAP et le LPS ont une activité conjointeet synergisante pour la production deTNFα, IL-1β et IL-10 [59]. Le mura-myl-dipeptide ou le FK-156 (D-Lac-L-Ala-D-Glu-mDAP-Gly), en synergieavec du Pam3CSSNA (ligand TLR2) oudu LA-15-PP (agoniste TLR4), entraî-nent une production accrue d’IL-8 etceci est dépendant de Nod2 ou Nod1 se-lon le fragment de PG utilisé [60]. Il aété rapporté une activation des monocy-tes et des cellules dendritiques par uneco-stimulation avec du LPS et du mura-myl-dipeptide (agoniste de Nod2) ouM-Tri (agoniste de Nod1) [61]. Pourrésumer, le modèle suivant peut êtreproposé (figure 4). La présence de cons-tituants pariétaux tels que le LPS, le LTAet le TA favorise la reconnaissance duPG par le monocyte. Le PG ou du mura-myl-dipeptide seraient importés dans lemonocyte puis reconnus par Nod2. Letransporteur hPepT1 a été décrit commepermettant le transport de muramyl-dipeptide dans le cytoplasme des celluleseucaryotes [62]. Nod2 a été démontrécomme étant actif uniquement s’il estrecruté au niveau de la membrane cyto-plasmique [37]. Il se peut donc que cerecrutement soit favorisé par la recon-naissance des autres composés bacté-riens par la cellule. Enfin, la doublereconnaissance de constituants bacté-riens aboutit à un accroissement de laréponse immunitaire par le monocyte,ceci mimant plus fidèlement une infec-tion bactérienne.

Selon les données issues des différentesbactéries, il est évident que l’activationde la réponse immunitaire par le PG sefait à de nombreux niveaux (figure 5).Tout d’abord, la bactérie doit présenterune composition chimique du PG quipermettra de générer des fragments so-lubles qui pourront être reconnus par lasuite par Nod1 et/ou Nod2. A undeuxième niveau, il faut que les muro-peptides potentiellement inducteursparviennent au site de reconnaissancedans la cellule eucaryote. Pour cela, il estnécessaire que la bactérie soit invasiveou que le PG rentre dans la cellule viaun appareil de sécrétion. Dans le cas des

Conclusion sur l’implication du métabolisme du PG et l’inflammation

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Microbiologie

monocytes, le PG est importé dans lacellule indépendamment de la présenced’un mécanisme bactérien particulier.Des hydrolases sont présentes égale-ment chez les mammifères et pourraientêtre à l’origine d’un rétrocontrôle del’inflammation et/ou de l’élimination dela bactérie. Enfin, la reconnaissanced’autres constituants par la cellule en-traîne une augmentation de la réponseimmunitaire.

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Protéines de reconnaissance intra-cellulaire : les voies Nod

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