Propriétés thérapeutiques de la cystamine pour la maladie ...€¦ · Résumé Les traitements...

CLAIRE GIBRAT

PROPRIETES THERAPEUTIQUES DE LA

CYSTAMINE POUR LA MALADIE DE PARKINSON:

ETUDE CHEZ DIVERS MODELES ANIMAUX DE LA

MALADIE

Thèse présentée

à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l‟Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en Neurobiologie

pour l‟obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

FACULTE DE MEDECINE

UNIVERSITE LAVAL

QUEBEC

2013

© Claire Gibrat, 2013

I

Résumé

Les traitements actuels de la maladie de Parkinson (MP) sont des traitements dits

symptomatiques, c'est-à-dire qu'ils soulagent les symptômes de la maladie sans intervenir

sur ses troubles fonctionnels sous-jacents et ne peuvent donc pas empêcher la progression

neurodégénérative de la MP. L'intérêt est donc grand de pouvoir développer des moyens

pour prévenir la perte des neurones qui caractérise cette maladie ou encore modifier le

cours évolutif de la pathologie lorsque celle-ci est déjà initiée. De cet intérêt, nous est venu

le choix d‟axer nos recherches sur un composé soupçonné de posséder des propriétés

neuroprotectrices chez des modèles animaux atteints de désordres neurodégénératifs. Ce

composé est la cystamine. Cette molécule a déjà été reconnue comme agent

neuroprotecteur dans des modèles animaux de la maladie de Huntington (MH), une autre

maladie neurodégénérative se traduisant par des troubles moteurs. C‟est dans ce contexte

que s‟est inscrit mon sujet de thèse qui vise à aborder la question des effets et mécanismes

thérapeutiques de la cystamine pour la MP. Mon travail s‟est tout d‟abord focalisé sur

l‟étude des propriétés neuroprotectrices et l‟identification de certains mécanismes d‟action

à l‟origine des effets bénéfiques observés dans un modèle murin pré-symptomatique de

parkinsonisme induit par la toxine 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP).

Par la suite nous avons étudié l‟impact d‟un traitement de cystamine, initié pendant le

processus de dégénérescence, sur les changements comportementaux, biochimiques et

pathologiques observés dans deux modèles neurotoxiques murins de la MP. Enfin, nous

avons précisé les doses optimales d‟efficacité de la cystamine, abordé l‟identification de

molécules intermédiaires impliquées dans l‟action de la cystamine et vérifié leur transport

au cerveau. Brièvement, nos investigations confirment non seulement le pouvoir

neuroprotecteur de la cystamine lorsqu‟administrée avant l‟induction de la pathologie mais

démontrent également ses capacités à stopper un processus neurodégénératif en cours

(neurorescue) et même à renverser partiellement des déficiences motrices. Nous avons

montré que ces effets bénéfiques sont associés, notamment, à une fine régulation du facteur

neurotrophique brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ainsi qu‟à une modulation de

certains facteurs apoptotiques et composés cytotoxiques pro-inflammatoires. Ces approches

nous ont également permis d‟identifier les cellules gliales comme médiateurs importants

II

des effets bénéfiques de la cystamine et l‟étendue des doses testées a permis l‟identification

des doses optimales d‟efficacité de ce composé. Nos travaux pointent enfin la cystéamine

comme l‟intermédiaire majeur impliqué dans l‟action thérapeutique de la cystamine et

démontrent sa capacité à traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) in vivo. Nos

dernières publications ainsi que nos résultats préliminaires sur le pouvoir thérapeutique de

la cystamine démontrent la pertinence des études proposées et offrent une base solide pour

la poursuite de la recherche translationnelle sur cette molécule.

III

Abstract

Current treatments for Parkinson disease (PD) are only symptomatic, that means that they

relieve symptoms of the disease without intervening in its underlying functional disorders

and therefore cannot prevent the neurodegenerative progression of PD. There is therefore a

huge interest in developing ways to prevent the loss of neurons that characterizes this

disease or otherwise change the pathology‟s evolutionary course when it is already

initiated. From this interest, we have chosen to focus our research on a compound

suspected to possess neuroprotective properties in animal models of neurodegenerative

disorders. This compound is the cystamine. This molecule has already been recognized as a

neuroprotective agent in animal models of Huntington disease (HD), another

neurodegenerative disease resulting in motor problems. It is in this context that fits my

thesis, which aims to address the issue of cystamine‟s therapeutic effects and mechanisms

for PD. First, my work focused on the study of neuroprotective properties of cystamine and

the identification of some mechanisms of action responsible for the beneficial effects

observed in an MPTP-induced presymptomatic murine model of parkinsonism.

Subsequently we studied the impact of cystamine, when the treatment was administered

during an ongoing DA-neuronal degeneration, on behavioural, biochemical and

pathological changes observed in two distinct neurotoxic mouse models of PD. Finally we

stated the optimal efficient doses of cystamine, addressed the identification of intermediate

molecules involved in the cystamine‟s action and checked their transport to the brain.

Briefly, our investigations confirm not only the neuroprotective aptitudes of cystamine

when administered before the induction of the pathology but also demonstrate its capacity

to stop an ongoing neurodegenerative process (neurorescue) and even partly reverse motor

deficiencies. We have shown that these beneficial effects are associated, in particular, to a

fine regulation of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) as well as a modulation of

apoptotic factors and pro-inflammatory cytotoxic compounds. These approaches have also

enabled us to highlight the glial cells as important mediators of the cystamine‟s beneficial

effects and the extent of the doses tested allowed the identification of the optimal doses for

this compound‟s efficiency. Our work finally points the cysteamine as the major

intermediate involved in the cystamine‟s therapeutic action and demonstrates its ability to

IV

cross the blood-brain-barrier (BBB) in vivo. Our latest publications as well as our

preliminary results on the therapeutic power of cystamine demonstrate the relevance of the

proposed studies and offer a sound basis for the continuation on the translational research

on this molecule.

V

Avant-propos

Contributions

Le Chapitre I de cette thèse fait le survol de la littérature pertinente sur le sujet.

L‟hypothèse générale et les objectifs de recherche y sont aussi présentés à la fin du

Chapitre. Le Chapitre II est la version intégrale d'un article scientifique publié dans le

journal Progress in Neuro-psychopharmacology and Biological Psychiatry. Le Chapitre III

présente une série de données dont le recueil a commencé à la fin de ma première année de

doctorat et qui s‟est achevé très récemment. Ces résultats sont actuellement en cours de

révision par le Journal of Neuroscience. Le Chapitre IV est la version intégrale d'un article

scientifique publié dans le Journal of Neurochemistry. Le dernier Chapitre (V) remet en

contexte les résultats obtenus au cours de mes études doctorales et discute des résultats sous

un angle plus général.

Outre les travaux présentés dans cette thèse, mon travail de doctorat m‟a permis de publier,

en tant que première auteure, un article de résultats originaux sous le titre «Differences

between subacute and chronic MPTP mice models: investigation of dopaminergic neuronal

degeneration and alpha-synuclein inclusions » dans le Journal of experimental medicine

ainsi qu‟une revue de littérature scientifique sous le titre «Potential of cystamine and

cysteamine in the treatment of neurodegenerative diseases» dans le journal Progress in

Neuro-psychopharmacology and Biological Psychiatry. J‟ai aussi participé à l‟étude des

mécanismes d‟action à l‟origine des effets neuroprotecteurs des acides gras omega-3 dans

un modèle de la MP. Les résultats de cette études ont été publiés en 2009 dans Progress in

Neuro-psychopharmacology and Biological Psychiatry sous l‟intitulé «Modulation of

brain-derived neurotrophic factor as a potential neuroprotective mechanism of action of

omega-3 fatty acids in a parkinsonian animal model». En continuité avec ce projet, j‟ai

également participé à l‟élaboration et au démarrage expérimental de l‟étude des propriétés

neurorestauratrice des acides gras oméga-3 dans un autre modèle parkinsonien. Les

analyses post mortem sont actuellement en cours. Finalement, j‟ai également contribué à

l‟avancement d‟un autre projet qui visait l‟étude du rôle de la voie MyD88 dans la

pathologie parkinsonienne. Cela m‟a permis d‟être coauteure sur une publication

VI

scientifique intitulée «The role of the MyD88-dependent pathway in MPTP-induced brain

dopaminergic degeneration» et publiée en 2011 dans le Journal of Neuroinflammation.

Remerciements

Le cheminement d‟un doctorant est un parcours long, tout à la fois fabuleux et fastidieux,

exaltant et décourageant, semé d‟embûches comme de trouvailles. Toutes les personnes qui

ont eu peu ou prou l‟occasion de m‟encourager dans cette entreprise méritent d‟être

remerciées. Je pense notamment aux parents et amis que je ne peux tous citer ici mais qui

savent combien leur soutien m‟a été précieux.

En premier lieu, j‟adresse mes sincères remerciements au Dr Francesca Cicchetti, ma

directrice de thèse, qui m‟a accueilli dans son laboratoire, confié un projet de thèse

passionnant et m‟a supervisé tout en préservant mon autonomie. J'apprécie énormément

tout le temps qu'elle a investi dans ma formation. Qu‟elle soit assurée de mon estime et de

ma sincère reconnaissance.

Je souhaite remercier tout particulièrement le Dr Maria-Grazia Martinoli pour avoir accepté

de consacrer son précieux temps à l‟évaluation de ce travail et de siéger à ce jury de thèse.

Je remercie profondément le Dr Jasna Kriz et Dr Martin Parent qui, par l‟intérêt soutenu

qu‟ils ont manifesté tout au long du cheminement de ma thèse, ont largement contribué à

lui donner vie. Je vous exprime ici toute ma gratitude pour l‟intérêt que vous avez consenti

à porter à ce travail et pour avoir accepté de faire parti de mon jury de thèse.

Je tiens à remercier les gens qui ont collaborés aux différents projets et publications de cette

thèse. Les Drs Frédéric Calon, Claude Rouillard, Daniel Lévesque et Francesca Cicchetti

pour leurs inspirantes collaborations, leurs précieux conseils et le support matériel

indispensable à la complétion de mes expérimentations. Mes collègues et compagnonnes de

route : Mélanie Bousquet, Giulia Cisbani, Janelle Drouin-Ouellet, Manon Lebel et Melissa

Ouellet ainsi que les stagiaires Marie-Hélène Lavallée-Bourget et Laurie Boivin qui ont

grandement contribué à la réussite de ce travail. Merci également à notre irremplaçable

professionnelle de recherche Martine St-Pierre dont je tiens à souligner le travail

exemplaire et la patience. Merci de m‟avoir guidée pendant toutes ces années, je

VII

n‟oublierais jamais nos folles journées d‟injections, de sacrifices et de chirurgies.

Je veux aussi souligner l'apport des organismes subventionnaires pour leur appui financier.

Grâce au travail continuel de Dr Cicchetti, le projet a été financé tout au long de mes études

par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). J'aimerais aussi remercier le

Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), le Fonds de

recherche en santé du Québec (FRSQ) de même que les IRSC pour l‟octroi de bourses qui

m‟ont supportées financièrement tout au long de mes études de maîtrise et de doctorat.

Un gros merci à tous mes collègues de laboratoire et stagiaires, aux voisins de paillasse et

amis, à tous mes compagnons de vie au sein de l‟Unité de neurosciences du CRCHUL,

pour votre collaboration et votre amicale bienveillance.

Pour terminer, je dédie des remerciements permanents à mes parents, Elisabeth et Jean,

sans qui je ne serais pas là aujourd‟hui. Je rends un hommage tout particulier à Papa, qui

malgré son départ trop précoce, a eut le temps de m‟inculquer le goût du travail bien fait et

la volonté de me dépasser. Merci à mon frère Nicolas, qui à sa manière, a de tout temps été

mon plus fidèle et mon plus inconditionnel supporteur. Je rends aussi grâce à Pascal, mon

époux, pour avoir enduré au quotidien les sinusoïdales alternances de découragement et

d‟exaltation propres au cheminement d‟une thèse; fort de sa propre expérience en la matière

et de son exemplaire patience, il a su m‟aider à en réduire l‟amplitude pour rendre le tout un

peu plus aisé. Merci pour ton support et ton affection au quotidien. Enfin, je dédie cette

thèse à mes proches disparus : Papa, Papy, Françoise, Mamie, Tata et Tonton. Où que vous

soyez vous voyagez dans mon cœur à tout jamais.

IX

À ma fille Emma : mon soleil, ma joie, ma vie

Table des matières

Résumé .................................................................................................................................... I Abstract ................................................................................................................................. III Avant-propos ......................................................................................................................... V Table des matières ............................................................................................................... XI Liste des publications .......................................................................................................... XV Liste des tableaux ............................................................................................................. XVII Liste des figures ................................................................................................................. XIX Liste des abréviations ......................................................................................................... XXI 1 Chapitre I. Contexte scientifique ...................................................................................... 1

1.1 La maladie de Parkinson ............................................................................................ 1 1.1.1 Définition et historique ....................................................................................... 1 1.1.2 Epidémiologie et symptomatologie .................................................................... 2 1.1.3 Anatomopathologie ............................................................................................. 5 1.1.4 Etiologie de la maladie de Parkinson ................................................................ 11 1.1.5 La pathogénèse ................................................................................................. 14

1.2 Stratégies thérapeutiques actuelles pour les troubles moteurs de la maladie de

Parkinson .......................................................................................................................... 29 1.2.1 Les principales classes de l‟arsenal pharmacologique dans le traitement de la

maladie de Parkinson .................................................................................................... 29 1.2.2 La prise en charge chirurgicale ......................................................................... 34

1.3 Les axes de recherche thérapeutique ....................................................................... 36 1.3.1 Les modèles animaux de la maladie de Parkinson ........................................... 36 1.3.2 Combattre la progression de la maladie (vs une approche symptomatique) .... 40

1.4 La cystamine ............................................................................................................ 53 1.4.1 Propriétés générales .......................................................................................... 53 1.4.2 Applications thérapeutiques passées et actuelles .............................................. 56 1.4.3 Applicabilité de la cystamine pour le traitement des maladies

neurodégénératives ....................................................................................................... 58 1.5 Thématique de recherche ......................................................................................... 62 1.6 Hypothèse et objectifs .............................................................................................. 63

2 Chapitre II. Cystamine prevents MPTP-induced toxicity in young adult mice via the up-

regulation of brain-derived neurotrophic factor .................................................................... 65 2.1 Résumé ..................................................................................................................... 66 2.2 Abstract .................................................................................................................... 67 2.3 Contributions ........................................................................................................... 68 2.4 Introduction .............................................................................................................. 69 2.5 Materials and methods ............................................................................................. 71

2.5.1 Animals ............................................................................................................. 71 2.5.2 Experiment no. 1. Cystamine doseŔresponse studies ....................................... 71 2.5.3 Experiment no. 2. Neuroprotective effects of cystamine in young adult MPTP-

treated mice ................................................................................................................... 71 2.5.4 21-day chronic cystamine treatment ................................................................. 72 2.5.5 Post mortem histological evaluation ................................................................. 72 2.5.6 TH immunohistochemistry ............................................................................... 73

XII

2.5.7 In situ hybridization for Nurr1, BDNF, TrkB and Hsp70 ................................ 73 2.5.8 Densitometric quantification of TH immunostaining ...................................... 75 2.5.9 Densitometric measurements of Nurr1, BDNF, TrkB and Hsp70 mRNA levels

75 2.5.10 Stereological quantification of TH-immunoreactive neurons ........................ 76 2.5.11 Statistical analyses and image preparation ..................................................... 76

2.6 Results ..................................................................................................................... 78 2.6.1 Health-related effects of cystamine treatments and MPTP lesion ................... 78 2.6.2 Up-regulation of BDNF as a mechanism of action for the neuroprotective

effects of cystamine ...................................................................................................... 78 2.6.3 Lack of evidence for the implication for Hsp70 in cystamine's neuroprotective

effects 79 2.6.4 The effects of cystamine on the DAergic system ............................................. 79 2.6.5 DoseŔresponse profile of cystamine ................................................................ 80 2.6.6 Neuroprotective properties of cystamine in young adult mice treated with

MPTP 80 2.7 Discussion ............................................................................................................... 82 2.8 Acknowledgments ................................................................................................... 87 2.9 Figures ..................................................................................................................... 88

3 Chapitre III. Cystamine rescues neuronal degeneration and promotes behavioral

recovery in animal models of Parkinson‟s disease ............................................................... 99 3.1 Résumé .................................................................................................................. 100 3.2 Abstract ................................................................................................................. 101 3.3 Contributions ......................................................................................................... 102 3.4 Introduction ........................................................................................................... 103 3.5 Materials and methods .......................................................................................... 105

3.5.1 In vivo experiments ........................................................................................ 105 3.5.2 Post mortem analyses ..................................................................................... 107 3.5.3 In vitro experiments ....................................................................................... 113

3.6 Results ................................................................................................................... 117 3.6.1 Cystamine halts MPTP-induced nigral dopaminergic neuronal degeneration117 3.6.2 Cystamine rescues 6-OHDA-induced nigral dopaminergic neuronal

degeneration and behavioral impairment ................................................................... 117 3.6.3 Post-lesion treatment with cystamine modulates cytotoxic/inflammatory

effectors in microglial cells ........................................................................................ 118 3.7 Discussion ............................................................................................................. 122

3.7.1 BDNF stimulation .......................................................................................... 123 3.7.2 Anti-apoptotic properties ................................................................................ 123 3.7.3 Anti-oxidative properties ................................................................................ 124 3.7.4 Conclusions .................................................................................................... 125

3.8 Acknowledgments ................................................................................................. 127 3.9 Figures ................................................................................................................... 128

4 Chapitre IV. Cystamine metabolism and brain transport properties: clinical implications

for neurodegenerative diseases ........................................................................................... 139 4.1 Résumé .................................................................................................................. 140 4.2 Abstract ................................................................................................................. 141

XIII

4.3 Contributions ......................................................................................................... 142 4.4 Introduction ............................................................................................................ 143 4.5 Materials and methods ........................................................................................... 146

4.5.1 Animals and cystamine administration ........................................................... 146 4.5.2 Cysteine and cysteamine HPLC measurements .............................................. 146 4.5.3 Taurine and hypotaurine HPLC measurements .............................................. 147 4.5.4 In situ cerebral perfusion ................................................................................ 147 4.5.5 Data and statistical analyses ........................................................................... 148

4.6 Results .................................................................................................................... 150 4.6.1 General effect of cystamine administration .................................................... 150 4.6.2 Plasma and brain cysteine and cysteamine levels following cystamine

administration ............................................................................................................. 150 4.6.3 Plasma and brain hypotaurine and taurine levels following cystamine

administration ............................................................................................................. 150 4.6.4 Cysteine facilitates cysteamine brain transport .............................................. 151

4.7 Discussion .............................................................................................................. 152 4.8 Acknowledgments ................................................................................................. 155 4.9 Figures ................................................................................................................... 156

5 Chapitre V. Discussion ................................................................................................. 163 5.1 Synthèse des résultats et objectifs de ce chapitre .................................................. 163 5.2 Effets thérapeutiques de la cystamine dans divers modèles de la MP ................... 165

5.2.1 Choix et validité des modèles employés dans nos études ............................... 165 5.2.2 Etudes précliniques des effets neuroprotecteurs de la cystamine dans la MP 173

5.3 Mécanismes d‟action de la cystamine dans la MP ................................................ 176 5.3.1 Agrégation protéique ...................................................................................... 178 5.3.2 Activité apoptotique ........................................................................................ 180 5.3.3 Stress oxydatif et dysfonction mitochondriale ................................................ 181 5.3.4 Le BDNF ......................................................................................................... 182 5.3.5 L‟inflammation ............................................................................................... 184

5.4 La cystamine comme outil thérapeutique pour la MP ........................................... 187 5.4.1 Au delà de la neuroprotection ......................................................................... 187 5.4.2 Stratégies thérapeutiques potentielles ............................................................. 190 5.4.3 Avenir clinique de la cystamine pour la MP ................................................... 191

6 Chapitre VI. Conclusions .............................................................................................. 197 6.1 Contributions au domaine d'étude.......................................................................... 197 6.2 Perspectives ........................................................................................................... 198

Bibliographie ...................................................................................................................... 201

XV

Liste des publications

Drouin-Ouellet J, Gibrat C, Bousquet M, Calon F, Kriz J and Cicchetti F. The role of the

MyD88-dependent pathway in MPTP-induced brain dopaminergic degeneration. J

Neuroinflammation. 2011; 8:137.

Gibrat C, Cicchetti F. Potential of cystamine and cysteamine in the treatment of

neurodegenerative diseases. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2011 Mar 30;

35(2):380-9.

Bousquet M, Gibrat C, Ouellet M, Rouillard C, Calon F, Cicchetti F. Cystamine

metabolism and brain transport properties: clinical implications for neurodegenerative

diseases. J Neurochem. 2010 Sep;114(6):1651-8.

Gibrat C, Bousquet M, Saint-Pierre M, Lévesque D, Calon F, Rouillard C, Cicchetti F.

Cystamine prevents MPTP-induced toxicity in young adult mice via the upregulation of the

brain-derived neurotrophic factor. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2010 Feb

1; 34(1):193-203.

Bousquet M, Gibrat C, Saint-Pierre M, Julien C, Calon F, Cicchetti F. Modulation of

brain-derived neurotrophic factor as a potential neuroprotective mechanism of action of

omega-3 fatty acids in a parkinsonian animal model. Prog Neuropsychopharmacol Biol

Psychiatry. 2009 Nov 13; 33(8):1401-8.

Gibrat C, Saint-Pierre M, Bousquet M, Lévesque D, Rouillard C, Cicchetti F. Differences

between subacute and chronic MPTP mice models: investigation of dopaminergic neuronal

degeneration and alpha-synuclein inclusions. J Neurochem. 2009 Jun; 109(5):1469-82.

XVII

Liste des tableaux

Tableau 1. Signes cliniques de la maladie de Parkinson ........................................................ 5 Tableau 2. Gènes impliqués dans la maladie de Parkinson .................................................. 12 Tableau 3. Les anticholinergiques ........................................................................................ 30 Tableau 4. L'amantadine ....................................................................................................... 30 Tableau 5. La lévodopa (L-dopa) ......................................................................................... 31 Tableau 6. Les agonistes dopaminergiques .......................................................................... 32 Tableau 7. Les IMAO-B ....................................................................................................... 33 Taleau 8. Les ICOMT ........................................................................................................... 33 Tableau 9. Caractéristiques des principaux modèles animaux de la maladie de Parkinson . 37

XIX

Liste des figures

Figure 1-1. Posture parkinsonienne typique ........................................................................... 4 Figure 1-2. Anatomie des ganglions de la base chez l'humain ............................................... 5 Figure 1-3. Représentation schématique des voies dites «directe» et «indirecte» dans un

cerveau normal et parkinsonien ...................................................................................... 7 Figure 1-4. Représentation schématique de la voie nigrostriée chez les patients normaux et

chez les patients atteints de la maladie de Parkinson .................................................... 10 Figure 1-5. Cascade de réactions impliquées dans l'apoptose .............................................. 16 Figure 1-6. Les principaux mécanismes d'action des traitements symptomatiques de la

maladie de Parkinson .................................................................................................... 34 Figure 1-7. Fenêtres et types d'interventions pour la maladie de Parkinson......................... 42 Figure 1-8. Voies métaboliques potentielles à l‟origine de la production de cystéamine et

d‟autres dérivés de la cystamine ................................................................................... 55 Figure 2-1. Effects of cystamine on nigral and cortical BDNF mRNA levels ..................... 88 Figure 2-2. Effects of cystamine on striatal, nigral and cortical TrkB mRNA levels .......... 90 Figure 2-3. Effects of cystamine on nigral and cortical Hsp70 mRNA levels ..................... 92 Figure 2-4. Effects of cystamine on TH striatal fibers ......................................................... 94 Figure 2-5. Effects of cystamine on nigral DAergic expression ........................................... 96 Figure 3-1. Effects of pre- and post-cystamine treatments on the nigrostriatal dopaminergic

system in the subacute MPTP mouse model .............................................................. 129 Figure 3-2. Effects of pre- and post-cystamine treatments on the nigrostriatal dopaminergic

system in the 6-OHDA mouse model ......................................................................... 130 Figure 3-3. Beneficial effects of cystamine on motor impairments induced by a 6-OHDA-

lesion ........................................................................................................................... 132 Figure 3-4. Cystamine pre- and post-treatments modulate BDNF both in vitro and in vivo

using an MPTP or 6-OHDA challenge ....................................................................... 133 Figure 3-5. Anti-apoptotic action of cystamine in N2a cells challenged with MPTP and 6-

OHDA ......................................................................................................................... 135 Figure 3-6. Effects of cystamine on the glial response ....................................................... 137 Figure 4-1. Increased levels of brain cysteamine ............................................................... 156 Figure 4-2. Constant levels of brain hypotaurine and taurine............................................. 158 Figure 4-3. Increased cysteamine brain uptake in the presence of cysteine ....................... 159 Figure 4-4. Hypothetical cystamine routing following a single i.p. injection .................... 160 Figure 5-1. Comparaison de divers modes d‟administration de la toxine MPTP ............... 167 Figure 5-2. Mécanismes potentiellement à l'origine des effets thérapeutiques de la

cystamine .................................................................................................................... 177

XXI

Liste des abréviations

3-NP : acide 3-nitropropionique

3-OMD : 3-Ométhyldopa

6-OHDA : 6-hydroxydopamine

AAV : adeno-associated virus

AINS : anti-inflammatoires non stéroïdiens

AMPA : acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazol-propionique

BBB : blood-brain barrier

BDNF : brain-derived neurotrophic factor

BHE : barrière hémato-encéphalique

CatD : cathepsine D

CHU : Centre Hospitalier Universitaire

CM : centromedian nucleus

CMA : cingulate motor area

CMH : complexe majeur d‟histocompatibilité

CoA : coenzyme A

COMT : cathécol-o-méthyl-transférase

CoQ10 : coenzyme Q10

COX : cyclo-oxygénase

cRNA : complementary RNA

DAB : 3,3‟ diaminobenzidine

DA : dopamine

DAT : transporteur de la dopamine

DBS : deep brain stimulation

DL : dorsolateral

DM : dorsomedial

DOPA : dihydroxyphénylalanine

DDT : dichlorodiphényltrichloroéthane

DOPAC : acide 3, 4-dihydroxyphenylacétique

FDA : Food and Drug Administration

FNTs : facteurs neurotrophiques

GABA : acide y-aminobutyrique

GDNF : glial cell-line derived neurotrophic factor

GFAP : glial fibrillary acidic protein

GMP : guanosine monophosphate

GPe : globus pallidus externe

GPi : globus pallidus interne

GSH : glutation

H2O2 : peroxyde d‟hydrogène

HD : Huntington‟s disease

HOCl : acide hypochloreux

HPLC : high-performance liquid chromatography

HSJ1b : DnaJ-containing protein 1b

Hsp : heat shock protein

XXII

HVA: acide homovanillique

i.p. : intrapéritonéal

IL : interleukines

iNOS : inductible nitric oxide synthase

iPS : induced pluripotent stem cell

L-dopa : Lévodopa

LAMP1 : lysosomal-associated membrane protein 1

LPS : lipopolysaccharide

MAO-B : monoamine oxydase B

MDA : malondialdehyde

MFB : medial forebrain bundle

MH : maladie de Huntington

MMPs : métalloprotéinases matricielles

MP : maladie de Parkinson

MPDP+ : 1-méthyl-4-phényl-2,3-dihydropyridinium

MPP+ : 1-méthyl-4-phénylpyridinium

MPTP : 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine

NeuN : neuronal nuclei

NFκB : facteur nucléaire kappa B

NGF : nerve growth factor

NMDA : N-methyl-D-aspartate

NO : oxyde nitrique

NST : noyau sous thalamique

O2- : anions superoxyde

.OH : radical hydroxyle

ONOO- : peroxynitrite

p.o . : per os

PBS : phosphate-buffered saline

PD : Parkinson‟s disease

PFA : paraformaldehyde

PPN : pedunculopontine nucleus

RNS : reactive nitrogen species

ROS : reactive oxygen species

s.c. : sous-cutané

SMA: supplementary motor area

SNl : substantia nigra pars lateralis

SNpc : substantia nigra pars compacta

SNr : substantia nigra pars reticulata

STN : subthalamic nucleus

Tgase : transglutaminase

TH : tyrosine hydroxylase

Tlr2 : toll-like receptor 2

TNF-α : tumor Necrosis Factor α

TrkB : tropomyosin-related kinase B

UPDRS : Unified Parkinson's Disease Rating Scale

UPS : système ubiquitine-protéasome

XXIII

VIH : virus de l‟immunodéficience humaine

VIM : noyau ventral intermédiaire du thalamus

VTA : ventral tegmental area

1

1 Chapitre I. Contexte scientifique

1.1 La maladie de Parkinson

1.1.1 Définition et historique

La maladie de Parkinson (MP) et ses manifestations sont connues depuis longtemps. Elle

était déjà référée au système médical indien antique de l'Ayurveda sous le nom de

Kampavata. Elle était alors traitée par une plante, la mucuna pruriens, aujourd‟hui connue

comme source de Lévodopa (L-dopa) (Katzenschlager et al., 2004). En ce qui concerne la

littérature médicale occidentale, la MP fut pour la première fois décrite par le physicien

Galen dans des écrits sur ce qu‟il appela la « paralysie agitante » (shaking palsy) en l'an 175

après J.-C. Ce n'est qu'en 1817 que le médecin londonien James Parkinson publia un essai

médical détaillé sur la « paralysie agitante »: "An Essay on the Shaking Palsy". Cette

analyse remarquable des symptômes et de l‟évolution de la maladie chez six patients sera

complétée en 1862 par le travail de Jean Martin Charcot, qui ajoutera la rigidité musculaire

au tableau clinique. Peu de travaux furent consacrés à cette maladie jusqu‟à la survenue en

Europe de l‟épidémie d‟encéphalite léthargique car un grand nombre de survivants

développèrent un syndrome parkinsonien séquellaire. A partir des années 1920, les travaux

se multiplièrent et le concept de bradykinésie fut défini (Wilson, 1925). Une approche plus

tardive mais qui allait être essentielle dans l‟établissement de critères cliniques fut celle de

Purdon Martin qui contribua de façon notable à la description des troubles de la marche

(Martin and Cofer, 1967). Les données cliniques furent complétées par les études

anatomopathologiques montrant que le processus lésionnel se situait dans la partie profonde

du cerveau, au niveau du tronc cérébral, dans une région du mésencéphale appelée locus

niger ou substance noire (SN) mais aussi dans d‟autres formations pigmentées du tronc

cérébral (locus coeruleus, noyau dorsal du vague), avec perte neuronale, dépigmentation et

réaction gliale. D‟autre part, un marqueur spécifique de la maladie fut mis en évidence en

1912 par Frédéric Lewy: les corps de Lewy, inclusions éosinophiles intraneuronales

arrondies avec une zone centrale dense acidophile, entourée d‟un halo périphérique,

présentes dans les formations pigmentées de façon prédominante mais aussi dans d‟autres

2

structures telles que le noyau basal de Meynert, l‟hypothalamus, le tractus

intermediolateralis de la moelle, la substance réticulée mésencéphalicopontique (Harrower

et al., 2005). L‟importante découverte en 1958 par Arvid Carlsson, prix Nobel de médecine

en 2000, de la dopamine permettra la mise en évidence de son déficit dans le striatum des

patients parkinsoniens (Barbeau, 1960). En 1979, le premier cas de syndrome parkinsonien

juvénile sera observé chez un étudiant californien après une injection d‟héroïne contaminée

par une neurotoxine, la 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) (Langston et

al., 1983).

A l‟heure actuelle, la MP se définit comme une affection neurodegenerative invalidante,

d‟étiologie mal connue, touchant l‟ensemble des systèmes mono-aminergiques

(dopaminergique, noradrénergique et sérotoninergique) au niveau intracérébral et au niveau

du système nerveux autonome périphérique. Outre les perturbations motrices engendrées

par la maladie, le patient parkinsonien est affecté par des troubles non-moteurs davantage

pris en considération de nos jours.

1.1.2 Epidémiologie et symptomatologie

La MP est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente après la maladie

d‟Alzheimer, et la deuxième cause de handicap moteur d‟origine neurologique chez le sujet

âgé après les accidents vasculaires cérébraux (Schapira, 1999). Dans la population générale

des pays industrialisés, la prévalence moyenne de la MP est de 100 à 200/100 000 et son

incidence de 10 à 15/100 000 personnes par an (de Lau and Breteler, 2006) et ne cesse de

croître étant donné le vieillissement de la population. On estime que le nombre de patients

parkinsoniens atteindra entre 8,7 et 9,3 millions en 2030 (Elbaz and Moisan, 2008).

L'incidence et la prévalence de cette maladie sont plus élevées chez les hommes que chez

les femmes (55 pour 45) et augmentent avec l‟âge (Lees et al., 2009). La MP touche

environ 1% des personnes de 65 ans et plus, débutant le plus souvent après 50 ans (57 ans

en moyenne) (Lees et al., 2009) et, dans moins de 10% des cas, avant 40 ans (Dawson,

2000). Selon les pays, on constate cependant de grandes variations de la prévalence et de

l‟incidence qui pourraient s‟expliquer par des différences d‟exposition à des facteurs

environnementaux ainsi qu‟à des susceptibilités génétiques différentes selon les populations

3

(de Lau and Breteler, 2006). La durée moyenne d‟évolution de l‟affection est estimée

depuis la découverte de la L-dopa, à 17-18 ans, modifiant ainsi peu l‟espérance de vie des

patients mais conditionnant de façon importante la morbidité.

La principale perturbation physiopathologique qui survient lors de la maladie est la perte

massive et progressive des neurones dopaminergiques de la SN pars compacta (SNpc),

provoquant alors une désafférentation dopaminergique du striatum (Albin et al., 1989;

DeLong, 1990). La baisse du taux de dopamine dans le striatum est responsable des

symptômes moteurs caractéristiques (Tableau 1) en général asymétriques, que sont

l‟akinésie (inhibition de l‟initiation des mouvements), le tremblement de repos, la rigidité

(hypertonie) et l‟instabilité posturale (Lee et al., 2002). Ces troubles moteurs se manifestent

quand 70 à 80% des neurones dopaminergiques de la SNpc ont dégénérés (Schapira, 1999).

Ainsi, l‟ensemble de ces perturbations motrices affecte la statique et la marche du patient

parkinsonien (Figure 1-1). Ces manifestations cliniques se combinent entre elles selon les

patients et ces symptômes sont variables dans le temps. Ces derniers peuvent également

être influencés par l‟état émotionnel du patient ainsi que par des stimuli visuels et auditifs.

4

Figure 1-1. Posture parkinsonienne typique

Illustration de Paul Richer (1888)

Il est reconnu depuis longtemps que la MP n‟est pas réductible à la seule symptomatologie

motrice et au seul déficit dopaminergique dans le striatum. Il semblerait en effet que

d‟autres aires, non directement impliquées dans le contrôle moteur, soient également

altérées, expliquant le fait que la majorité, si ce n‟est la totalité des malades, présente une

constellation d‟autres symptômes dits non moteurs au cours de la maladie (Braak et al.,

2003; Goetz et al., 1986). De plus, dans certains cas, il semblerait que ces symptômes

(Tableau 1) (troubles olfactifs, constipation, dépression, et troubles du sommeil) puissent

survenir très précocement et précéder l‟apparition des signes moteurs de quelques années

(Chaudhuri et al., 2006; Jankovic et al., 2000).

Depuis ces derniers temps, les recherches sur les symptômes non moteurs de la MP se sont

développées et ont été encouragées car plusieurs études ont montré que ces signes présents

au cours de la MP influencent de manière significative l‟altération de la qualité de vie des

malades, leur institutionnalisation et les coûts en matière de dépense en santé (Hely et al.,

2005).

5

Tableau 1. Signes cliniques de la maladie de Parkinson

Signes précliniques

(inconstants)

Signes moteurs classiques

(plus marqués d‟un côté)

Signes tardifs (variables)

Troubles olfactifs

Anomalies du sommeil

Constipation

Dépression

Tremblement de repos

Bradykinésie

Rigidité

Instabilité posturale

Dysautonomie

Démence

Freezing

1.1.3 Anatomopathologie

1.1.3.1 Physiologie des ganglions de la base : emphase sur la voie nigro-striée

Le coeur lésionnel de la MP se caractérise principalement par la perte des neurones

dopaminergiques situés dans une structure des ganglions de la base: la pars compacta du

locus niger ou SNpc. Les ganglions de la base, également appelés noyaux gris centraux,

forment un ensemble de structures sous-corticales anatomiquement interconnectées.

Figure 1-2. Anatomie des ganglions de la base chez l'humain

Tiré de http://www.colorado.edu/intphys /Class/ IPHY3430-200/image/basalnuclei.jpg

6

Ils constituent un système majeur d‟intégration, et sont impliqués dans l‟initiation et la

régulation de certains paramètres du mouvement (direction et amplitude) mais également

dans l‟apprentissage, l‟exécution et la mémorisation de séquences motrices (Boraud et al.,

2002; Mink, 1996). Les ganglions de la base sont constitués de multiples structures: le

striatum formé du noyau caudé et du putamen; le pallidum formé du globus pallidus interne

(GPi) et du globus pallidus externe (GPe); le noyau sous-thalamique; la SN: compacte

(SNpc, substantia nigra pars compacta), réticulée (SNr, substantia nigra pars reticulata) et

latérale (SNl, pars lateralis). La SN est une structure qui comprend les corps cellulaires des

neurones dopaminergiques. Ces neurones transmettent l‟influx nerveux le long d‟axones se

distribuant au niveau du striatum (noyau caudé et putamen) et qui libèrent de la dopamine

dans la fente synaptique. Dans la MP, la perte des neurones dopaminergiques dans la SNpc

entraîne un dérèglement du contrôle dopaminergique au niveau du striatum et, par voie de

conséquence, des projections extra striatales vers le pallidum et le noyau sous thalamique,

au niveau des circuits moteurs et limbiques des ganglions de la base. Les ganglions de la

base régulent les mouvements en particulier automatiques et ont pour rôle essentiel de

réaliser (phase de préparation) et de contrôler (phase d'exécution) une succession d'actions

motrices planifiées (volontaires). Les ganglions de la base ne fonctionnent pas de manière

autonome, mais en relation avec d‟autres structures du système nerveux central et

constituent, avec le cortex cérébral et le thalamus, un circuit sensori-moteur « cortico-

striato-thalamo-cortical » en boucle qui joue un rôle fondamental dans la régulation du

mouvement volontaire et dont le fonctionnement est modulé, entre autres, par les afférences

dopaminergiques issues de la SNpc (Parent and Hazrati, 1995a; Parent and Hazrati, 1995b).

Les informations en provenance des aires frontales, préfrontales et pariétales du cortex,

traversent les ganglions de la base et retournent à l‟aire motrice via le thalamus. Les

ganglions de la base exerceraient ainsi une action facilitatrice sur le mouvement en

focalisant les informations en provenance de différentes régions corticales. Ils sont aussi

susceptibles d‟agir comme un filtre bloquant la réalisation des mouvements lorsque ceux-ci

sont inadaptés. La boucle motrice que nous venons de décrire ne résume pas à elle seule le

rôle des ganglions de la base. En effet, plusieurs études démontrent également l‟implication

des ganglions de la base dans des processus cognitifs, émotionnels et motivationnels,

7

essentiels au contrôle adaptatif du comportement (Boussaoud and Kermadi, 1997;

Redgrave et al., 1999).

Au cours de ces deux dernières décennies, les connaissances acquises sur l‟anatomie et les

propriétés physiologiques des ganglions de la base ont permis d‟élaborer un certain nombre

de modèles d‟organisation anatomo-fonctionnelle de ce système. Un modèle de

fonctionnement normal et pathologique a été initialement élaboré par Alexander et Crutcher

en 1986 avec leur modèle des voies striatales directes et indirectes, puis a été repris par

Albin et al. (1989) et par DeLong (1990) dans un cadre pathologique pour expliquer

l‟akinésie parkinsonienne et les syndromes dyskinétiques par un déséquilibre entre ces deux

voies.

Figure 1-3. Représentation schématique des voies dites «directe» et «indirecte» dans un

cerveau normal et parkinsonien

Les flèches rouges indiquent les projections inhibitrices et les flèchent bleues les projections excitatrices.

L‟épaisseur des flèches dans l‟état parkinsonien indique l‟augmentation (plus épaisse) ou la diminution (plus

fine) dans l‟activité des connexions spécifiques. Les flèches interrompues indiquent une lésion partielle des

connexions entre SNc et putamen à l‟état parkinsonien. Abréviations : CM, centromedian nucleus; CMA,

cingulate motor area; GPe, globus pallidus, external segment; GPi, globus pallidus, internal segment; M1,

primary motor cortex; PMC, pre-motor cortex; PPN, pedunculopontine nucleus; SMA, supplementary motor

area; SNc, substantia nigra pars compacta; SNr, substantia nigra pars reticulata; STN, subthalamic nucleus;

VA/VL, ventral anterior/ventral lateral nucleus. Tiré de Smith et al. (2012).

8

Actuellement, malgré de nombreuses critiques, ce modèle d‟organisation fonctionnelle

reste le plus utilisé. De façon très schématique, en condition physiologique normale, le

thalamus sélectionnerait les programmes moteurs et serait freiné dans cette tâche par le

striatum. Les neurones dopaminergiques de la SN projetant vers le striatum activeraient les

neurones striataux porteurs de récepteurs dopaminergiques D1 et inhiberaient les cellules

striatales porteuses de récepteurs dopaminergiques D2. Les neurones cholinergiques

striataux seraient également sous l‟influence inhibitrice de la voie nigro-striée. Les

neurones porteurs de récepteurs D1 projetteraient vers le pallidum interne qu‟ils

inhiberaient (voie directe). Les cellules striatales porteuses de récepteurs D2 feraient, quant

à elles, relais dans le pallidum externe puis le noyau sous thalamique pour atteindre le

pallidum interne sur lequel elles exercent un contrôle excitateur (voie indirecte). Au cours

de la MP, la dégénérescence des neurones de la SN produisant la dopamine entraînerait une

perturbation de la transmission des influx au striatum. Le pallidum interne serait à la fois

désinhibé par la réduction du tonus dopaminergique D1 et activé par la réduction du tonus

dopaminergique D2. Le résultat final engendrerait une activité anormalement élevée des

neurones du pallidum interne dont les projections GABAergiques inhiberaient de façon

accrue et inappropriée le thalamus moteur. Ce phénomène serait à l‟origine de la

symptomatologie parkinsonienne.

1.1.3.2 Altérations cytopathologiques

Comme nous l‟avons déjà mentionné, les symptômes moteurs de la MP sont

essentiellement la conséquence d‟une dégénérescence de la voie dopaminergique nigro-

striée. Ceux-ci apparaissent lorsque au moins 50% des neurones dopaminergiques de la

SNpc ont disparu et que la dénervation dopaminergique de leur région cible, le striatum, a

dépassé 75% (Damier et al., 1999). Néanmoins, au cours de la MP, toutes les voies

dopaminergiques cérébrales sont atteintes. La plus touchée reste la voie nigro-striée, mais le

déficit concerne également les voies méso-limbique et méso-corticale qui peuvent jouer un

rôle dans la genèse des troubles cognitifs et certains aspects de l‟akinésie (Javoy-Agid and

Agid, 1980; Scatton et al., 1982). Par ailleurs, les neurones dopaminergiques de la voie

nigro-striée qui projettent sur les parties « motrices » dorsolatérales du striatum sont

9

davantage affectés que ceux qui projettent sur les zones plus « cognitives » ventrales

(Hirsch et al., 1988).

Du point de vue macroscopique, l‟atteinte de la voie dopaminergique est mise en évidence

par une dépigmentation progressive principalement de la SN, mais aussi d‟autres régions

(e.g. locus coeruleus, noyau dorsal du vague). En effet, les neurones producteurs de

dopamine dans ces régions contiennent un pigment, la neuromélanine, qui confère à celles-

ci leur coloration sombre. Microscopiquement parlant, la quantité de neurones

dopaminergiques est fortement diminuée. La dégénérescence cellulaire n‟est jamais totale,

même dans les structures les plus vulnérables comme la SN, mais diverses études laissent à

penser que le processus de neurodégénerescence est continu. Dans la SN des patients

affectés par la MP, la perte des neurones dopaminergiques est d‟environ 1% par an, alors

que chez le sujet normal la dégénérescence est deux fois moins rapide (Riederer and

Wuketich, 1976; Scherman et al., 1989). Les neurones restants sont atrophiques et

contiennent des agrégats d‟-synucléine, formant des inclusions neuronales éosinophiles

cytoplasmiques caractéristiques : les corps de Lewy (Spillantini et al., 1998).

10

Figure 1-4. Représentation schématique de la voie nigrostriée chez les patients normaux

et chez les patients atteints de la maladie de Parkinson

Les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriée possèdent leur corps cellulaire dans la SNpc et projettent

vers le caudate/putamen. Les patients atteints de la MP présentent des inclusions intraneuronales (Corps de

Lewy) au niveau de la SNpc. Tiré de Dauer and Przedborski (2003).

Les corps de Lewy constituent un marqueur histopathologique de la MP. Il s‟agit

d‟inclusions cytoplasmiques neuronales éosinophiles, sphériques, de 5 à 25 µm de

diamètre. Différentes protéines comme l‟ubiquitine, la synphiline-1, la tubuline se trouvent

accumulées et agrégées dans ces corps de Lewy mais la protéine majoritaire de ces

inclusions est l‟-synucléine (Braak et al., 2004; Branco et al., 2010; Spillantini et al.,

1997). De la même manière que les corps de Lewy, les neurites de Lewy, qui représentent

aussi un marqueur histopathologique de la MP, sont composés d‟agrégats protéiques qui

sont eux aussi composés d‟-synucléine. L‟-synucléine physiologique se présente sous la

forme d‟un monomère auto-inhibé partiellement reployé (Bertoncini et al., 2005a) et

11

possède une plasticité de conformation dépendant de l‟environnement (Uversky, 2003). Les

mutations ponctuelles, mais aussi les polyamines et les ions cuivre, déstabilisent le

monomère et en modifient la structure pour mettre la protéine dans un état non replié

(Bertoncini et al., 2005b; Fernandez et al., 2004; Rasia et al., 2005). Dans cet état, l‟-

synucléine forme un feuillet β puis des oligomères et enfin des fibrilles qui se déposent

pour former les corps de Lewy (Schulz and Falkenburger, 2004). D‟autres facteurs comme

un stress oxydatif, une dysfonction mitochondriale, une altération du système ubiquitine-

protéasome (UPS) et des lysosomes sont associés à une augmentation d‟agrégation d‟-

synucléine dans les modèles d‟étude de la MP. Cependant, les mécanismes conduisant à la

formation progressive de la forme insoluble d‟-synucléine présente dans les corps de

Lewy et les neurites de Lewy sont encore inconnus (Branco et al., 2010). Par ailleurs,

l‟agrégation d‟-synucléine est interprétée selon certaines équipes comme étant un

mécanisme toxique alors que d‟autres y voient un mécanisme de protection cellulaire contre

les formes les plus toxiques (oligomeriques) d‟-synucléine (Branco et al., 2010; Halliday

and McCann, 2008). Enfin, si les corps de Lewy sont un argument important au diagnostic

de la MP, ils ne sont pas spécifiques de cette maladie et sont parfois détectés dans la

maladie d‟Alzheimer et même au cours du vieillissement normal (Fearnley and Lees,

1991).

1.1.4 Etiologie de la maladie de Parkinson

Les causes de la mort des neurones dans la MP ainsi que les mécanismes impliqués restent

encore mal compris. La majorité des cas de MP (environ 90%) ont probablement pour

origine une susceptibilité génétique associée à des facteurs environnementaux (Dick, 2006;

Mouradian, 2002). Par ailleurs, contrairement à ces formes dites sporadiques, plusieurs

formes génétiques de MP ont été mises en évidence (Biskup et al., 2008; Saiki et al., 2012).

1.1.4.1 Les facteurs génétiques

Bien que l'origine de cette maladie ait été longtemps considérée comme purement

environnementale, l'identification, durant ces 10 dernières années, d'au moins 18 loci et 11

gènes (Parkine, PINK1, DJ-1, ATP13A2, SNCA, UCHL1, LRRK2, GIGYF2,

Omi/HTRA2, PLA2G6, FBXO7) impliqués dans des formes rares monogéniques de la MP,

12

ont permis de montrer l'importance des facteurs génétiques dans la survenue de ce désordre

complexe (Corti et al., 2011; Martin et al., 2011). De manière intéressante, certains des

gènes impliqués dans les formes monogéniques de la MP, tels que SNCA et LRRK2, sont

aussi des facteurs de risque dans des cas sporadiques, formes les plus communes de la

maladie. Les loci des gènes mis en cause sont regroupés sous le terme PARK (PARK 1 à

PARK 18 à ce jour) (Corti et al., 2011; Fujioka and Wszolek, 2012). Certains de ces gènes

codent pour une maladie autosomique dominante alors que d‟autres sont responsables de

formes autosomiques récessives. Cliniquement, les formes dominantes se rapprochent

fortement de la MP idiopathique alors que les formes récessives peuvent êtres divisées en

deux catégories. L‟une renfermant une MP d‟expression proche de la forme idiopathique et

l‟autre renfermant des MP cliniquement et pathologiquement assez différentes de la forme

idiopathique avec par exemple une spasticité et une dystonie. Le tableau 2 présente

l‟ensemble des gènes impliqués à ce jour dans la MP (Alberio et al., 2012; Fujioka and

Wszolek, 2012; Martin et al., 2011).

Tableau 2. Gènes impliqués dans la maladie de Parkinson

Locus Position

Gène Produit du gène Phénotype clinique

PARK1/4 4q21

SNCA -synucléine Parkinsonisme avec démence, début

précoce et progression rapide

PARK2 6q25-q27

parkin E3 ubiquitine ligase Parkinsonisme précoce à progression

lente

PARK3 2p13

? ? Parkinsonisme tardif

PARK5 4p14

UCHL1 Ubiquitine carboxyl-terminal

hydrolase isozyme L1

Parkinsonisme tardif

PARK6 1p35-p36

PINK1 Sérine ⁄ thréonine-protéine kinase Parkinsonisme précoce à progression

lente

PARK7 1p36

DJ-1 Protéine DJ-1 Parkinsonisme précoce

PARK8 12q12

LRRK2 Leucine-rich repeat serine ⁄

thréonine-protéine kinase 2


PARK9 1p36

ATP13A2 Probable cation-transporting ATPase

13A2

Parkinsonisme précoce avec syndrome

de KuforŔRakeb

PARK10 1p32

? ? Peu clair

PARK11 2q36-q37

GIGYF2 PERQ amino acid-rich with GYF

domain-containing protein 2


PARK12 Xq

? ? Peu clair

PARK13 2p13

Omi/HTRA

2

Sérine protéase HTRA2 (HtrA2) Peu clair

13

PARK14 22q13.1

PLA2G6 85 kDa calcium-independent

phospholipase A2 (IPLA2)

Parkinsonisme avec d‟autres

caractéristiques

PARK15 22q12-q13

FBX07 F-box only protein 7 Parkinsonisme précoce

PARK16 1q32

RAB7 Ras-related protein Rab-7a Parkinsonisme tardif

PARK17 4P16

GAK Vacuolar protein sorting-associated

protein 35 (hVPS35)


PARK18 GP21.3

HIA-DRA Eukaryotic translation initiation

factor 4 gamma 1 (EIF-4G1)


Informations résumées et adaptées de Martin et al. (2012), Alberio et al. (2012) et Fujioka et Wszolek (2012).

Bien que touchant peu de patients, les formes familiales de la MP on permis l‟ouverture de

nouveaux champs de recherche sur la compréhension des mécanismes responsables de sa

pathogénèse (ces mécanismes seront plus particulièrement décrits dans le chapitres 1.1.5).

1.1.4.2 Les facteurs environnementaux

De nombreuses études épidémiologiques ont permis de mettre en évidence l‟implication de

certains facteurs environnementaux dans l‟augmentation du risque de développer la MP. La

preuve la plus tangible de l‟implication de facteurs environnementaux dans l‟étiologie de la

maladie fut apportée après que de jeunes toxicomanes californiens aient développé des

troubles moteurs de type parkinsonien (akinésie et rigidité) à la suite d‟injections d‟héroïne

de synthèse contaminée par du 1 méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Ces

patients ont développé une forme stable mais irréversible de la MP (Langston et al., 1999).

Les symptômes étaient corrigés par la Lévodopa (ou L-dopa), un précurseur de la dopamine

pouvant traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE), et l‟étude anatomopathologique

a révélé une perte quasi exclusive des neurones dopaminergiques de la SNpc (Langston et

al., 1983; Langston et al., 1984). Il existe actuellement des modèles animaux de la MP

utilisant le MPTP (Jackson-Lewis et al., 2012; Sedelis et al., 2001), le mécanisme d‟action

sera abordé dans la section des modèles animaux (chapitre 1.3.1). A la suite de ces

observations, ont suivi des publications faisant état de syndromes parkinsoniens après

expositions plus ou moins prolongées à des dérivés du MPTP comme le diquat (Sechi et al.,

1992) ou le paraquat (Sanchez-Ramos et al., 1987) ou divers pesticides comme la roténone

ou les composés organophosphorés (Bhatt et al., 1999), le diphényle, les dithiocarbamates

(ex : Maneb) ou encore des agents organochlorés comme le dichlorodiphényl-

14

trichloroéthane (DDT) (Dick, 2006). Le risque relatif associé à une telle exposition varie

entre 3,7 et 12,0 suivant les études (Costello et al., 2009; Lai et al., 2002). Bien qu‟une telle

association entre MP et pesticides soit controversée dans la littérature (Drouin-Ouellet and

Cicchetti, 2011), plusieurs études épidémiologiques ont corrélé la MP à certains facteurs de

risque comme vivre en milieu rural, exercer une activité agricole, s‟exposer à des produits

chimiques agricoles, et boire de l‟eau de puits (Costello et al., 2009; Di Monte et al., 2002;

Greenamyre et al., 2003). La MP est d‟ailleurs décrétée depuis cette année, par l‟Etat

français, comme maladie professionnelle chez les agriculteurs. Il est cependant illusoire, en

l‟absence d‟études toxicologiques poussées, de mettre en cause une ou plusieurs molécules

par le biais de ces travaux, les produits utilisés étant multiples, leurs compositions exactes

très variables et souvent mal ou pas connues des utilisateurs.

Outre l‟exposition à des pesticides ou dérivés, d‟autres hypothèses d‟étiologies toxiques

environnementales ont été rapportées: l‟exposition professionnelle chronique à certains

métaux comme le manganèse, pendant plus de 20 ans, pourrait être un facteur de risque

pour voir se développer un syndrome parkinsonien (Migliore and Coppede, 2009); la

consommation de certains fruits exotiques sous forme de fruit ou d‟infusion de leurs

feuilles, tels que le corossol ou « pomme cannelle » présent en Guadeloupe (Caparros-

Lefebvre and Elbaz, 1999; Lannuzel et al., 2006) et la noix de cycade présent dans de l‟île

de Guam (Cox and Sacks, 2002), provoquent un syndrome parkinsonien. Dans ces derniers

cas, les symptômes régressent à l‟arrêt de la consommation du produit.

L‟apparition de la MP pourrait donc être partiellement expliquée par la combinaison de

prédispositions génétiques à une hypersensibilité à certains composés chimiques et par une

exposition à certains produits à risque.

1.1.5 La pathogénèse

Comme susmentionné, on considère que les causes de la MP idiopathique sont

multifactorielles et que des prédispositions génétiques, l‟exposition à des toxines

environnementales et l‟âge sont des facteurs susceptibles d‟influencer le déclenchement et

l‟évolution de la maladie (Nagatsu and Sawada, 2006). On ne connaît pas précisément les

mécanismes entraînant la mort cellulaire dans les neurones dopaminergiques. Néanmoins,

15

les études post mortem de cerveaux de patients de même que l‟étude des différents gènes

impliqués dans les formes familiales de la MP ont permis de dégager différents mécanismes

impliqués dans la dégénérescence au niveau cellulaire.

1.1.5.1 Apoptose et maladie de Parkinson

Depuis 1995, différentes équipes se sont posées la question du mode de disparition des

neurones dopaminergiques lors du processus dégénératif. Mochizuki et al. ont mis les

premiers en évidence la présence de neurones apoptotiques au sein de la SNpc sur des

coupes post mortem de patients parkinsoniens via une technique de marquage en 3‟-

terminal de l‟ADN (Mochizuki et al., 1996). Ces résultats furent confirmés en montrant que

les neurones ainsi mis en évidence présentaient des signes morphologiques caractéristiques

de l‟apoptose telle une condensation de la chromatine, une irrégularité de la membrane

nucléaire ainsi qu‟une diminution du volume cellulaire. La microscopie électronique fut un

atout de plus pour confirmer ces données (Anglade et al., 1997).

Il existe deux voies principales qui conduisent à l‟initiation des événements moléculaires

provoquant une mort cellulaire programmée: la voie intrinsèque et la voie extrinsèque

(Figure 1-5). Ces deux voies tendent à l‟activation des caspases effectrices et en particulier

la caspase-3. Plusieurs études post mortem menées sur des cerveaux de patients

parkinsoniens suggèrent l‟implication de ces voies dans la dégénérescence neuronale qui

caractérise la pathologie. En effet, il a été démontré que les formes actives des caspases-8,-

9, -1 et -3 sont présentes en forte quantité au niveau de la SN (Andersen, 2001; Mogi et al.,

2000). Plusieurs études montrent également une augmentation du niveau d‟expression de la

protéine pro-apoptotique Bax, mais également de GAPDH et de la caspase-3 ce qui suggère

l‟implication de la voie mitochondriale (Hartmann et al., 2001; Tatton, 2000). Cependant,

d‟autres proposent aussi l‟implication de FAS, FADD (deux composants des récepteurs de

mort donc impliqués dans la voie extrinsèque) et de la caspase-8, le taux de ces trois

protéines étant élevé dans les cerveaux des patients. Tout ceci suggère l‟implication des

voies intrinsèque et extrinsèque dans l‟initiation de l‟apoptose dans les mécanismes

physiopathologiques de la MP. Enfin, chez l‟humain, l‟apoptose semble concerner

également d‟autres neurones en dehors de la SNpc, notamment dans le pons et le colliculus

16

supérieur de même qu‟un certain nombre de cellules gliales (Kingsbury et al., 1998). Or il

est intéressant de noter que, suite à une activation inflammatoire, il est fréquent d‟observer

l‟apoptose de cellules immunitaires à la fin du cycle de l‟inflammation (Ekert and Vaux,

1997).

Bien entendu ces résultats n‟excluent pas la présence de neurones dopaminergiques

nécrotiques. Cependant, les différentes pistes étiologiques actuelles sont pour la plupart des

potentiels inducteurs de l‟apoptose. Ainsi, aujourd‟hui, l‟apoptose reste l‟hypothèse la plus

sérieuse quant à la dégénérescence des neurones dopaminergiques. De plus, la plupart des

modèles animaux ou cellulaires de la MP induits par des toxines telles le MPTP ou la 6-

hydroxydopamine (6-OHDA), impliquent une mort neuronale par apoptose (Chun et al.,

2001; He et al., 2000). Voici présenté ci-dessous les principales hypothèses de l‟induction

de l‟apoptose dans la MP.

Figure 1-5. Cascade de réactions impliquées dans l'apoptose

Il existe deux voies principales du déclenchement de l'apoptose: 1) la voie "extrinsèque" qui passe par la

détection de ligands (TNFa, FAS-ligand, etc) par les récepteurs correspondants (TNFR, FAS, etc), qui

17

activent à leur tour, via des molécules adaptatrices, certaines protéases de la famille des caspases. La caspase

8 clive la protéine Bid pour fournir le fragment "T-bid", qui interagit avec la mitochondrie et induit la

libération du cytochrome c. Celui-ci, via la protéine APAF-1, active d'autres caspases ("caspases effectrices"

Ŕ p. Ex. caspases 3 et 9) qui conduisent à la segmentation du contenu cellulaire et à la dégradation d'une série

de protéines. L'ADN est dégradé par une nucléase, au niveau des nucléosomes. Le noyau est segmenté, puis la

cellule elle-même est segmentée en "corps apoptotiques", temporairement délimités par des segments de

membrane plasmique. La membrane plasmique des cellules apoptotiques subit des réarrangements qui mènent

à l'exposition extracellulaires de certains phospholipides comme la phosphatidyl-sérine (détectable par

l'annexine V), qui sont habituellement confinés du côté intracellulaire. 2) la voie "intrinsèque" est activée par

un stress cellulaire comme l'altération du génome ou une infection virale. Cette voie passe également par la

mitochondrie et la libération de cytochrome c. Les étapes suivantes sont semblables à celles de la voie

extrinsèque. L'apoptose est régulée par l'équilibre existant entre protéines "pro-apoptotiques" (comme Bax,

Bak, ...) et protéines "anti-apoptotiques" (comme Bcl-2, Bcl-XL,...), qui agissent au niveau de la

mitochondrie. NB. Dans certains cas, il existe des voies variantes n'impliquant pas la mitochondrie. Tiré de

UCLOUVAIN FDP Virologie.

1.1.5.2 Altération du système ubiquitine-protéasome (UPS) et des lysosomes

Les protéines bénéficient naturellement d‟un renouvellement physiologique et continu

appelé turn over, qui correspond à une destruction compensée par la synthèse équilibrée de

nouvelles protéines. Ce mécanisme permet ainsi l‟élimination des protéines défectueuses,

mal repliées ou obsolètes et le maintien des fonctions exercées par ces protéines grâce au

renouvellement. Cette élimination sélective de protéines est assurée par l‟UPS. En règle

générale, un dysfonctionnement du protéasome induit l‟apoptose de la cellule (Wojcik,

2002). La première preuve de l‟implication de l‟UPS dans la neurodégénérescence

émergeât suite à la découverte de mutations touchant le gène de la parkine et UCHL1, deux

gènes codant pour des protéines impliquées dans le fonctionnement du protéasome

(McNaught et al., 2002). Outre l‟altération de l‟UPS engendrée par des mutations sur ces

gènes dans les formes génétiques de la MP, des sous-unités des protéasomes colocalisées

avec les corps de Lewy et la présence de protéines ubiquitinylées dans les corps de Lewy

sont des indicateurs d‟une défaillance du système UPS dans la MP, même sporadique. En

effet, il a également été montré que l‟expression d‟-synucléine mutée réduit

significativement différentes activités lytiques du protéasome (Stefanis et al., 2001).

Il est important de prendre en compte l‟interconnexion qui existe entre le fonctionnement

mitochondrial et l‟UPS puisque la défaillance de l‟un peut entrainer des conséquences sur

l‟autre. En effet, une inhibition du protéasome dans des neurones dopaminergiques

mésencéphaliques entraine une dysfonction mitochondriale, une réduction du taux de

18

glutathion et une augmentation du taux de radicaux libres (Branco et al., 2010).

Outre l‟UPS, un autre système de dégradation protéique comme l‟autophagie peut

également être affecté dans la MP. En effet Chu et al. ont montré que l‟immunoréactivité

des marqueurs lysosomiaux Lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1) et

cathepsine D (CatD) est significativement diminuée dans les neurones dopaminergiques

nigraux restants chez les patients parkinsoniens décédés en comparaison avec des

personnes de mêmes âges sans atteinte neurodégénérative. De plus, cette diminution est

davantage prononcée dans les neurones contenant des inclusions d‟-synucléine (Chu et al.,

2009). En effet, alors que les formes solubles d‟-synucléine peuvent être dégradées via

l'autophagie médiée par une protéine chaperon, la version mutée pathologique de la

protéine n'est pas transloquée à l'intérieur du lysosome (Cuervo et al., 2004). De surcroît,

par sa capacité à lier le lysosome avec une grande affinité, l‟-synucléine peut entraver la

dégradation d'autres types de protéines (Cuervo et al., 2004). Ainsi, l‟ensemble de ces

données indique qu‟il existe bien une défaillance dans les systèmes d‟élimination protéique

pouvant participer au processus conduisant à la mort des neurones dopaminergiques et au

final à la MP.

1.1.5.3 L’excitotoxicité et l’homéostasie du calcium

L‟excitotoxicité et les déséquilibres dans l‟homéostasie intracellulaire du calcium sont

considérés depuis longtemps comme des mécanismes pouvant entraîner la mort neuronale

par apoptose (Mattson, 2007). Le glutamate, principal neurotransmetteur excitateur dans le

cerveau, induit l‟augmentation de la concentration cytoplasmique en calcium via

l‟activation directe des récepteurs-canaux N-methyl-D-aspartate (NMDA) et acide α-

amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazol-propionique (AMPA) ainsi qu‟en activant

indirectement les canaux calciques dépendants du voltage. En cas de stress énergétique

(niveaux d‟ATP bas), les neurones peinent à maintenir leur potentiel de membrane ce qui

peut entraîner une activation persistante des récepteurs par le glutamate ambiant (Novelli

and Tasker, 2000). Une moindre disponibilité en énergie cellulaire a aussi une influence sur

l‟homéostasie intracellulaire du calcium. Une augmentation de la concentration cytosolique

de calcium peut déclencher de nombreux processus délétères y compris l‟activation de

19

l‟oxyde nitrique synthétase et la génération d‟oxyde nitrique (NO) mais aussi l‟activation

des calpaïnes. Le stress oxydatif peut donc entraîner, par diminution de l‟énergie

intracellulaire, une excitotoxicité et une homéostasie calcique perturbée qui peuvent mener

à l‟apoptose. Les neurones dopaminergiques de la SNpc sont particulièrement sensibles au

phénomène d‟excitotoxicité et aux problèmes d‟homéostasie calcique. En effet,

contrairement aux autres neurones du cerveau, les neurones dopaminergiques de la SNpc

génèrent un potentiel d‟action de manière autonome, en absence de connections

synaptiques, un peu à la manière des cellules cardiaques pacemaker (Mereu et al., 1997).

Alors que la plupart des neurones permettent un passage d‟ions sodium à travers leur

membrane, les neurones dopaminergiques de la SNpc dépendent de canaux calciques de

type L. Le fonctionnement des neurones dopaminergiques de la SNpc dépend alors

fortement des influx calciques ce qui les rend plus vulnérables aux phénomènes

d‟excitotoxicité (Schierle and Brundin, 1999). Plusieurs études post mortem sur des

cerveaux de patients atteints de la MP confirment l‟hypothèse de l‟implication du calcium

dans la mort des neurones dopaminergiques (Mouatt-Prigent et al., 1996; Yamada et al.,

1990).

1.1.5.4 Implication des facteurs neurotrophiques

Les facteurs neurotrophiques (FNTs) sont des protéines impliquées dans la survie

neuronale, la stimulation de la croissance axonale et la formation des contacts synaptiques

lors du développement (Siegel and Chauhan, 2000). Au stade adulte, les facteurs

neurotrophiques sont requis pour soutenir les fonctions et le phénotype neuronal (Siegel

and Chauhan, 2000) de même que pour assurer une plasticité morphologique et synaptique

(Schinder and Poo, 2000). Une diminution dans les niveaux de FNTs est généralement

observée chez les patients qui souffrent de la MP. En effet, une mesure quantitative en post

mortem des niveaux du brain-derived neurotrophic factor (BDNF) confirme que la

production de ce FNT est diminué dans le cerveaux des patients parkinsoniens et plus

particulièrement dans la SNpc (Murer et al., 2001). Or, en conditions pathologiques, les

facteurs neurotrophiques peuvent moduler les dysfonctions neuronales, l‟activation des

astrocytes et les réactions inflammatoires (Siegel and Chauhan, 2000). De plus, une

absence ou une diminution de FNT comme le BDNF est à l‟origine du déclenchement du

20

processus apoptotique pour certaines cellules dont les neurones dopaminergiques (Yu et al.,

2008). Finalement, il est intéressant de noter que la modulation du BDNF est non

seulement impliquée dans la survie neuronale et la plasticité axonale, mais qu‟elle influence

aussi fortement la neurogenèse adulte (Benraiss et al., 2001; Pencea et al., 2001).

Neurogenèse qui semble être fortement affectée lors de maladies neurodégénératives

comme la MP (Geraerts et al., 2007; Hoglinger et al., 2004). Au regard de ces informations,

on comprend donc aisément qu‟un changement dans la régulation du BDNF puisse être un

facteur critique dans la cascade pathologique d‟une maladie neurodégénérative telle la MP.

1.1.5.5 Stress oxydatif et dysfonction mitochondriale

On appelle stress oxydatif les conditions dans lesquelles les défenses antioxydantes

cellulaires sont insuffisantes pour maintenir les niveaux de dérivés réactifs de l'oxygène ou

reactive oxygen species (ROS) et de dérivés réactifs de l'azote ou reactive nitrogen species

(RNS) en dessous du seuil toxique. Ces conditions peuvent être dues à une production

excessive de ROS ou à une perte des mécanismes de détoxification. Le stress oxydant

présente de nombreux effets néfastes. Il peut induire un phénomène apoptotique des

cellules saines en activant divers gènes codant pour l‟expression de cytokines pro-

inflammatoires, des ruptures au sein de l‟ADN ou altérer la membrane cellulaire via le

phénomène de peroxydation lipidique. Stress oxydant et phénomènes inflammatoires sont

étroitement liés. En effet, le stress oxydant est souvent accompagné de la formation de

nombreuses cytokines pro-inflammatoires, de chimiokines qui sont généralement sécrétées

au cours d‟un processus inflammatoire et/ou immunitaire (Godbout et al., 2004).

Plusieurs études rapportent la présence de stress oxydatif dans le cerveau de parkinsoniens,

en particulier la présence de protéines nitrées et de marqueurs de peroxydation lipidique, la

réduction des taux de glutathion et de glutathion oxydé et la chute de 30% de l‟activité du

complexe I mitochondrial dans le cerveau et différents tissus de malades (Parker et al.,

1989; Schapira et al., 1990; Sian et al., 1994). En effet, les patients présentent une

augmentation des métabolites issus de l‟oxydation des nucléotides (Alam et al., 1997), des

protéines (Danielson and Andersen, 2008; Floor and Wetzel, 1998) et des lipides (Dexter et

al., 1989; Jenner, 2003). Le cerveau est considéré comme particulièrement sensible au

21

stress oxydatif car il a une consommation en oxygène correspondant à 20% de la

consommation totale du corps. De plus, il est enrichi en acides gras sensibles à la

peroxydation alors que les défenses anti-oxydantes (comme la catalase, la super-oxyde

dismutase, le glutathion et la glutathion peroxydase) ne sont pas particulièrement élevées

(Floyd, 1999). Au sein du cerveau, la SNpc est une zone particulièrement vulnérable car

elle combine un métabolisme élevé, un contenu élevé en oxydants et une faible

concentration en antioxydants, en particulier le glutathion (Marshall et al., 1999). Il est à

noter que la dopamine elle-même peut jouer un rôle dans la génération de ROS. En effet, la

dopamine peut être dégradée enzymatiquement ou s‟auto-oxyder pour former des

semiquinones potentiellement toxiques (Graham, 1978; Stokes et al., 1999). La dégradation

enzymatique est réalisée par la monoamine oxydase-B (MAO-B) et génère de l‟acide 3, 4-

dihydroxyphenylacétique (DOPAC) avec une production du peroxyde d‟hydrogène (H2O2)

comme sous-produit (Asanuma et al., 2003; Cadet and Brannock, 1998). L‟H2O2 est

normalement relativement stable dans la cellule et il est transformé en eau par la glutathion

peroxydase qui utilise le glutathion comme substrat réducteur. Or seuls les astrocytes

possèdent cette enzyme dans le parenchyme cérébral et la SNpc est une des régions

cérébrales les plus pauvres en astrocytes (Damier et al., 1993), limitant ainsi les

coopérations cellulaires de détoxification. Par ailleurs, les voies cataboliques de la

dopamine sont aussi accélérées en présence d‟éléments redox actifs comme le fer, le cuivre

ou le manganèse (Pezzella et al., 1997). Or la SNpc contient une haute concentration en fer

comparée aux autres régions du cerveau, suggérant qu‟une augmentation du niveau de fer

puisse catalyser la conversion de l‟H2O2 produit lors de la dégradation de la dopamine en

radicaux hydroxyles hautement réactifs, entraînant une augmentation des dommages

oxydatifs dans cette région (Jellinger et al., 1990). Il est à noter qu‟un stress oxydatif et

nitrosatif a été corrélé au changement conformationnel de l‟-synucléine (Branco et al.,

2010).

La mitochondrie est au centre des mécanismes de stress oxydatif car lors du métabolisme

respiratoire, des intermédiaires ROS sont générés. Si un dysfonctionnement mitochondrial

apparaît, ces ROS sont susceptibles d‟être libérés dans le cytoplasme. De plus, un

dysfonctionnement de la mitochondrie peut entraîner une baisse de production d‟ATP et

22

donc une diminution de l‟énergie disponible pour les processus de détoxification. Par

ailleurs, la mitochondrie est sensible aux conditions de stress oxydatif qui peuvent induire

un fonctionnement métabolique anormal (Schapira, 1995; Thomas et al., 1993). Lorsque

dysfonctionnelle, la mitochondrie va activer une voie apoptotique qui consiste en la relâche

de cytochrome c qui va à son tour activer la famille des caspases, la caspase-3 étant le

dernier exécuteur de cette cascade de mort cellulaire (Cf Figure 1-5). Plusieurs études

menées chez la souris et l‟homme, rapportent un rôle important du cytochrome c dans la

mort neuronale parkinsonienne (Hartmann et al., 2000; Viswanath et al., 2001). En effet,

quelques gènes dont la mutation est connue pour induire des formes familiales de la MP,

ont démontrés leur implication dans la régulation de la relâche du cytochrome c. Ainsi la

protéine « PTEN-induced putative kinase 1 » PINK1, une kinase mitochondriale, jouerait

un rôle protecteur contre les dysfonctions mitochondriales induites par le stress oxydatif en

bloquant la relâche du cytochrome c et conséquemment l'apoptose (Pridgeon et al., 2007;

Valente et al., 2004). Des mutations sur ce gène sont associées à la MP héréditaire précoce

(Kumazawa et al., 2008; Valente et al., 2004). Egalement, la protéine parkine peut favoriser

la dégradation de substrats localisés dans les mitochondries et qui jouent un rôle dans la

régulation du volume mitochondrial et la libération du cytochrome c. L'absence de parkine

fonctionnelle pourrait donc rendre les neurones dopaminergiques plus sensibles à des stress

oxydatifs, et pourrait de ce fait expliquer la perte de ces neurones chez les patients. Enfin,

la voie de relargage du cytochrome c par le pore membranaire mitochondrial implique

l'activation de la protéine pro-apoptotique Bax. Cette voie d'activation de l'apoptose est

intéressante pour la MP, car des études montrent que des souris déficientes en Bax sont

résistantes au MPP+ (Vila et al, 2001). L'activation de ce pore à l‟origine du relargage de

cytochrome c dans le cytoplasme est reconnue pour être accomplie en présence d'agents

excitotoxiques comme le MPTP/MPP+ (Cassarino et al., 1999; Gomez et al., 2001;

Kakimura et al., 2001) ou la 6-OHDA (Gorman et al., 2005), alors qu'en présence d'agents

neuroprotecteurs l'ouverture de ce pore semble être inhibée (Korsmeyer et al., 2000;

Kuwana et al., 2002; Maruyama et al., 2000; Readnower et al., 2011; Youdim et al.,

2005b).

Dans la MP, certaines mutations génétiques impliquées dans des dysfonctionnements

23

mitochondriaux, incluant notamment les gènes PINK1, LRRK2 et parkin, ainsi que

certaines substances toxiques exogènes, comme le MPTP ou la roténone, sont susceptibles

d‟inhiber la chaine respiratoire mitochondriale aboutissant alors à son dysfonctionnement et

à une augmentation de production de ROS (Branco et al., 2010; Lin et al., 2009). Ainsi,

différentes données nous montrent qu‟un dysfonctionnement progressif mitochondrial

pourrait conduire à une diminution de synthèse d‟ATP, à une moindre régulation calcique,

et à une augmentation du stress oxydatif promouvant la mort des neurones

dopaminergiques.

1.1.5.6 Inflammation

1.1.5.6.1 Les médiateurs cellulaires de la réponse inflammatoire cérébrale

Les microgliocytes. Les cellules microgliales constituent 5 à 20% des cellules gliales de la

substance cérébrale. Elles présentent au repos une morphologie ramifiée avec de nombreux

prolongements qui sondent continuellement le milieu environnant. Les cellules microgliales

en conditions physiologiques sont abusivement appelées quiescentes, alors qu‟elles sont

loin d‟être inactives. En effet, elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes

physiologiques tels que la surveillance du système nerveux central, le déclenchement de la

réponse immunitaire, l‟homéostasie, l‟élimination des débris cellulaires et la neuroplasticité

(Aloisi, 2001). Les microgliocytes sont très sensibles aux variations biochimiques du

parenchyme cérébral et sont rapidement activés à la suite d‟atteintes des cellules neuronales

(Hailer, 2008). Du point de vue phénotypique, les cellules microgliales quiescentes se

caractérisent par une expression très limitée des molécules du complexe majeur

d‟histocompatibilité (CMH) de classe I ou II ainsi qu‟une expression faible du CD11b et du

marqueur leucocytaire CD45 (Yu et al., 2002). En effet, dans un système nerveux sain, les

neurones abaissent l‟expression des molécules de classe I et II sur les cellules gliales

environnantes. Cependant, au cours de pathologies du système nerveux, la mort neuronale

va inhiber cette répression (Corriveau et al., 1998). Aussi, la glie environnante, plus

particulièrement la microglie, va exprimer des molécules présentatrices d‟antigènes du

CMH de classe II ainsi que des molécules d‟adhésion. Cette activation microgliale se

traduit par des changements morphologiques et fonctionnels. Les cellules microgliales

activées sont caractérisées par un gonflement de leur corps cellulaire et le rétrécissement de

24

leurs prolongements. Elles produisent, notamment via l‟activation de la voie du facteur

nucléaire kappa B ou nuclear factor kappa B (NFκB), un grand nombre de médiateurs de

l‟inflammation parmi lesquels on trouve des cytokines proinflammatoires ainsi que leurs

récepteurs membranaires ou des espèces réactives de l‟oxygène ou de l‟azote (Tian et al.,

2012). Plus précisément, les cytokines sont des protéines impliquées dans la régulation des

fonctions immunitaires et, par conséquent, des phénomènes inflammatoires. Elles

représentent le stimulus majeur permettant de contrôler la migration des microgliocytes

vers le site de lésion (Hemmer et al., 2001). Parmi ces protéines figurent la famille des

interleukines (IL) ainsi que des facteurs de nécrose comme le Tumor Necrosis Factor α

(TNF-α). Ces protéines sont capables de stimuler la prolifération des cellules microgliales

et d‟anticorps ainsi que l‟activation des macrophages (Hemmer et al., 2001). Comme nous

venons de le mentionner, la microglie activée sécrète également une certaine quantité

d‟agents microbicides, le plus souvent des métabolites réactifs de l‟oxygène qui peuvent

provoquer un stress oxydant (Boje and Arora, 1992; Brown and Neher, 2010; McGeer and

McGeer, 2008). Ces métabolites peuvent initier ou amplifier une réaction inflammatoire ou

immunitaire (McGeer and McGeer, 2008). L‟activation microgliale s‟accompagne d‟une

production massive de monoxyde d‟azote ou oxyde nitrique (NO), des anions superoxyde

(O2-) et de peroxynitrite (ONOO-) toxiques pour les cellules voisines et qui interviennent

dans le processus de phagocytose (Brown and Neher, 2010). Le NO, à faibles

concentrations, joue un rôle physiologique primordial dans la régulation de la pression

sanguine mais également dans la communication neuronale ainsi que dans la réponse

immunitaire non-spécifique (Hemmer et al., 2001; Mirzoeva et al., 2002). Chez les

mammifères, le NO est exclusivement synthétisé par les Nitric Oxide Synthases (NOS). La

NOS inductible (iNOS) est généralement induite par le biais de cytokines dans des cellules

immunocompétentes (Murphy et al., 1993). La microglie activée peut exprimer la iNOS et

ainsi produire du NO en grande quantité. La production massive de NO est un mécanisme

de défense qui est en grande partie responsable des activités antivirales et antimicrobiennes

des macrophages (Murphy et al., 1993). Cependant, cette surproduction de NO peut être

néfaste pour les cellules saines voisines puisqu‟elle peut entraîner leur mort par apoptose

(Leist et al., 1997; Moriya et al., 2000; Tamatani et al., 1998). On comprend donc la forte

implication de la cascade du NO dans le processus de mort neuronale au cours des réactions

25

inflammatoires du système nerveux.

Finalement, ces données nous indiquent que la production de médiateurs inflammatoires

par la microglie active est généralement néfaste pour l‟intégrité tissulaire cérébrale. En

effet, les données expérimentales existantes semblent plutôt indiquer un effet

neuroprotecteur du contrôle de l‟activation microgliale par un certain nombre de

traitements pharmacologiques immunosuppresseurs (Tokime et al., 1996; Zawadzka and

Kaminska, 2005) ou par l‟administration de minocycline (Filipovic and Zecevic, 2008;

Wang et al., 2007). Mais il est important de noter que, inversement, la microglie activée est

aussi une source de facteurs neurotrophiques d‟action protectrice tels que le Nerve Growth

Factor (NGF), le BDNF ou le Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor (GDNF)

(Madinier et al., 2009; Yang et al., 2012).

Les astrocytes. Les astrocytes sont des cellules gliales caractérisées par des prolongements

cytoplasmiques leur donnant une forme étoilée. Après les oligodendrocytes, il s‟agit des

cellules les plus nombreuses du système nerveux central dont il existe différents types

assurant des fonctions multiples. Elles constituent une population cellulaire hétérogène dont

une des caractéristiques communes est l‟expression constitutive de la Glial Fibrillary

Acidic Protein (GFAP) (Anderl et al., 2009). Les astrocytes jouent un rôle essentiel dans

l‟homéostasie cérébrale et la fonction neuronale, ainsi qu‟un rôle structural par la formation

d‟un réseau tridimensionnel. En effet, ils sont le seul lieu de stockage de glucose dans le

cerveau et représentent ainsi l‟unique source énergétique des neurones. De plus ces cellules

agissent sur la recapture des différents neurotransmetteurs, influant ainsi sur l'intensité d'un

signal et sa durée (Sofroniew and Vinters, 2010). Les astrocytes sont également reliés les

uns aux autres par des jonctions serrées communicantes de type gap leur permettant

d‟effectuer des échanges simultanés avec plusieurs neurones et de synchroniser l‟activité

synaptique de ces derniers. En recouvrant complètement la surface des capillaires, les pieds

vasculaires des astrocytes participent aussi à la BHE, régulant l‟accès des cellules

immunocompétentes sanguines au parenchyme cérébral (Bechmann et al., 2007). Parmi les

nombreuses propriétés des astrocytes on retrouve également leur implication dans la

neurogenèse et leur participation au contrôle de l‟environnement du système nerveux en

26

réagissant, au même titre que la microglie, à l‟infiltration des lymphocytes et des

macrophages dans le cerveau (Morga et al., 2000). En effet, lorsqu‟activés, les astrocytes

migrent au site de lésion et développent une morphologie hypertrophique. Les astrocytes

activés produisent également des cytokines pro-inflammatoires, des radicaux libres comme

le NO ainsi que des dérivés de l‟acide arachidonique entraînant des effets neurotoxiques.

Ces cellules sont alors capables de stimuler la microglie (Sofroniew and Vinters, 2010). Par

ailleurs, les astrocytes activés sont capables de sécréter des agents protecteurs tels que les

facteurs neurotrophiques (Markiewicz and Lukomska, 2006). Les astrocytes sont aussi

connus pour produire des facteurs tant pro-inflammatoires qu‟anti-inflammatoires.

1.1.5.6.2 Inflammation dans la maladie de Parkinson

Il est maintenant communément admis que la neuroinflammation, dont les principaux

acteurs incluent les microglies et les astrocytes, fait partie des processus pathologiques de

la MP (Glass et al., 2010; Roodveldt et al., 2008). Des études post mortem sur des cerveaux

parkinsoniens révèlent, en effet, la présence de cellules microgliales activées (Banati et al.,

1998; Hunot et al., 1999; McGeer et al., 1988) et d‟une réaction astrocytaire massive

(Damier et al., 1993; Hirsch et al., 2003). La présence de cellules microgliales activées a été

notamment observé autour des neurones dopaminergiques (Banati et al., 1998; Bronstein et

al., 1995; McGeer and McGeer, 1998). L‟existence d‟un processus inflammatoire dans la

MP

est, d‟un point de vue moléculaire, aussi caractérisée par l‟accumulation de cytokines

tel que l‟interleukine-1 (IL-1), IL-6, IL-2 ou TNF-α, l‟activation du NFκB et la présence

de dommages oxydatifs sur les protéines du fluide cérébro-spinal (cerebro-spinal fluid,

CSF) et du cerveau des patients (Banati et al., 1998; Hunot et al., 1999; McGeer et al.,

1988; McGeer and McGeer, 2004; Mogi et al., 1996a; Mogi et al., 1995a; Mogi et al.,

1994a; Mogi et al., 1995b; Mogi et al., 1996b; Mogi et al., 1994b; Nagatsu and Sawada,

2006). De plus, plusieurs enzymes associées à l'inflammation sont anormalement élevées

dans la MP, incluant iNOS, la cyclooxygénase COX-2 ainsi que la NADPH-oxydase (Choi

et al., 2005; Wu, 2003). In vivo, des analyses en imagerie par tomographie d'émission de

positron avec le PK-11195, un ligand des récepteurs benzodiazépines principalement

localisés sur la microglie activée, ont révélé la présence d'une réponse microgliale dans le

pons, les ganglions de la base, le striatum et les régions frontales et temporales du cortex

27

d'individus atteints de la MP (Gerhard et al., 2006; Ouchi et al., 2005).

Les études menées sur les patients parkinsoniens, in vivo ou post mortem, nous donnent

ainsi un indice clair quant à la présence d‟une réaction neuroinflammatoire chez les patients

affectés par la maladie. Aussi, outre la constatation de son expression, il existe également

plusieurs indices de la contribution de l‟inflammation à la neurodégénérescence de type

parkinsonienne. En effet, des polymorphismes dans des gènes codant pour les molécules

immunitaires TNF-α, IL-1 et HLA (human leukocyte antigen) sont associés à un risque plus

élevé de développer la MP (Ahmed et al., 2012; Bialecka et al., 2008; Hamza et al., 2010;

Wahner et al., 2007). Egalement, des infections par certains virus ou bactéries ainsi que

l'exposition à des pesticides semblent accroître le risque de développer la MP (Brown et al.,

2006; Jang et al., 2009; Nielsen et al., 2012; Reid et al., 2001; van der Mark et al., 2012).

En outre, l‟utilisation régulière de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens

(AINS), en particulier l‟ibuprofène, est associée à un risque significativement plus faible de

développer la maladie (Gagne and Power, 2010; Gao et al., 2011; Rees et al., 2011b), bien

que certaines études présentent des résultats contradictoires (Becker et al., 2011; Driver et

al., 2011). Cet effet pourrait être dû à l‟action des AINS sur les COX ou d‟autres cibles

comme le NF-κB ou la NO synthase (Asanuma and Miyazaki, 2007).

Parallèlement aux études menées chez l‟homme, un effet bénéfique de l‟inhibition de

l‟activation microgliale a également a été suggéré chez l‟animal. En effet, l‟utilisation de

divers immunosuppresseurs ou l‟administration de minocycline (analogue semi-synthétique

des antibiotiques tetracyclines), dans différents modèles animaux parkinsoniens présentant

une neuroinflammation dont le modèle MPTP (Liberatore et al., 1999), 6-OHDA

(Marinova-Mutafchieva et al., 2009), paraquat (Purisai et al., 2007) et rotenone (Sherer et

al., 2003), a démontré un effet protecteur sur les neurones dopaminergiques (Wu et al.,

2002; Wu, 2003). Toutes ces observations, effectuées aussi bien chez l‟homme que chez

l‟animal, suggèrent un rôle néfaste de l‟inflammation dans l‟étiologie de la MP et indiquent

clairement que réduire l‟inflammation peut avoir un effet positif sur l‟évolution de ce

trouble progressif (Long-Smith et al., 2009; Phani et al., 2012).

Du point de vue mécanistique, l‟origine des effets néfastes de l‟inflammation dans le

28

contexte de la MP implique vraisemblablement une neurotoxicité dopaminergique induite

par la synthèse et sécrétion gliale de différentes cytokines pro-inflammatoires impliquant

un stress oxydatif local et une installation chronique de la réponse inflammatoire. En effet,

lors du processus neuroinflammatoire, les cellules microgliales changent de morphologie,

deviennent phagocytaires et commencent à sécréter des cytokines qui amplifient la réponse

inflammatoire initiale en activant et en recrutant d‟autres cellules. Comme décrit

précédemment, les cellules microgliales peuvent aussi sécréter des molécules cytotoxiques

comme par exemple du NO (Roodveldt et al., 2008). De plus, les neurones

dopaminergiques relâchent des agents chimioattractants en mourant (Aloisi, 2001; Kim and

de Vellis, 2005; Sriram et al., 2006). Ce phénomène est susceptible d‟augmenter encore

l‟infiltration de la région par de la microglie activée qui élimine les débris cellulaires et qui

peut être un facteur contribuant à la progression de la maladie car le burst respiratoire

accompagnant la phagocytose peut amplifier le stress oxydatif des neurones

dopaminergiques survivants (Glass et al., 2010). Il est important de noter que la fonction

des astrocytes, dans ce contexte pathologique, est bien moins comprise que celle des

microglies mais pas nécessairement moins importante dans le processus de pathogénèse. En

effet, il a été montré que la quantité d'astrocytes GFAP-positifs est inversement

proportionnelle à la perte de cellules dopaminergiques (Damier et al., 1993) et que les

astrocytes répondent particulièrement aux cytokines proinflammatoires, telles l‟IL-1 et le

TNF-α. Néanmoins, comme nous l‟avons décrit précédemment, l‟activation astrocytaire

peut avoir des conséquences antagonistes sur les populations neuronales environnantes

puisque, une fois activés, les astrocytes peuvent produire simultanément des facteurs aussi

bien neuroprotecteur que neurotoxiques (Farina et al., 2007).

29

1.2 Stratégies thérapeutiques actuelles pour les troubles

moteurs de la maladie de Parkinson

Comme pour son origine, les mécanismes et l‟évolution de la MP semblent plurifactoriels.

Néanmoins, la MP étant aujourd‟hui aussi bien définie cliniquement que

anatomopathologiquement, des traitements symptomatiques efficaces ont pu voir le jour.

1.2.1 Les principales classes de l’arsenal pharmacologique dans le traitement de la

maladie de Parkinson

La compréhension des mécanismes physiopathologiques de la MP, et notamment du

fonctionnement des ganglions de la base, a largement fait progresser, au cours de ces

dernières années, les thérapeutiques anti-parkinsoniennes. Le traitement médicamenteux de

la MP reste toujours strictement symptomatique. De surcroît, même si les troubles de la

maladie ne peuvent être résumés par l‟unique dégénérescence de la voie dopaminergique

nigrostriée, l‟approche pharmacologique actuelle vise, pour l‟essentiel, à restaurer le déficit

dopaminergique striatal responsable des symptômes moteurs de la maladie.

Historiquement, le premier traitement pharmacologique proposé (l'extrait de belladonne)

visait à abaisser l'hyperactivité cholinergique striatale. Après la découverte de la L-dopa à

la fin des années 1960, l'objectif principal des traitements pharmacologiques est devenu la

restauration du tonus dopaminergique. La dopathérapie a ainsi inauguré le concept du

remplacement d'un neuromédiateur déficient dans une maladie neurodégénérative, suivi

rapidement par la commercialisation d‟autres médicaments susceptibles de potentialiser la

transmission dopaminergique striatale déficiente.

Les stratégies thérapeutiques actuelles reposent sur 5 grands mécanismes pharmacologiques

et ne sont pas exclusives les unes des autres :

1.2.1.1 Blocage antagoniste des récepteurs cholinergiques muscariniques du striatum

(médicaments anticholinergiques)

Historiquement, le premier traitement pharmacologique anticholinergique avant

l‟avènement de la L-dopa fût introduit dès 1867 par Charcot qui avait observé l‟effet

30

bénéfique de la prise d‟atropine, extrait de la belladone dans la MP, en particulier sur la

rigidité et les tremblements (Fahn, 1998). Les anti-cholinergiques visent à réduire

l‟hyperactivité cholinergique striatale résultant de la réduction du tonus inhibiteur

dopaminergique.

Tableau 3. Les anticholinergiques

Avantages

Efficace pour les tremblements

Inconvénients

Inefficace sur les autres manifestations cliniques de la MP

Nombreux effets indésirables dont sécheresse buccale, troubles de l‟accommodation,

rétention urinaire, constipation, glaucome, troubles mnésiques, confusion et hallucinations

1.2.1.2 Blocage antagoniste des récepteurs au glutamate (amantadine)

L‟amantadine, qui est un composé antiviral, a également des propriétés pharmacologiques

antiparkinsoniennes. Son mécanisme d‟action n‟est pas encore bien établi. Il est

actuellement admis que l‟amantadine augmente la libération de dopamine, bloque la

recapture de la dopamine et stimule les récepteurs dopaminergiques. L‟amantadine est aussi

un antagoniste des récepteurs NMDA (Olanow et al., 2009b). L‟amantadine agit sur

l‟ensemble des fonctions motrices, même si l‟akinésie et l‟hypertonie sont principalement

améliorées (Olanow et al., 2009b).

Tableau 4. L'amantadine

Avantages

Efficace dans les formes débutantes et légères, et chez les malades qui ne tolèrent pas les

doses optimales de L-dopa en raison d‟effets indésirables

Chez ces malades, peut permettre une meilleure maitrise du syndrome parkinsonien

Inconvénients

Présente une action symptomatique modeste

Présente des effets secondaires tous réversibles : vertiges, insomnies et nervosité,

dépression, anxiété, hallucinations, confusion, nausées, anorexie, sécheresse buccale,

constipation, hypotension orthostatique et céphalées

31

1.2.1.3 Apport d’un précurseur de la dopamine: la L-dopa exogène

Dans les années 1960, la découverte de la L-dopa a révolutionné le traitement de la MP

(Carlsson et al., 1958; Cotzias et al., 1969): une administration par voie orale de la L-dopa

se révélait avoir des effets spectaculaires à court terme et à long terme sur la

symptomatologie parkinsonienne. Actuellement, le traitement par la L-dopa est toujours le

traitement de référence de la MP. Il s‟agit d‟un précurseur de la dopamine qui,

contrairement à cette dernière, est capable de traverser la BHE. La L-dopa, qui pénètre dans

le système nerveux central, est métabolisée en dopamine dans les terminaisons restantes des

neurones à dopamine, dans les neurones sérotoninergiques, dans l‟endothélium des

capillaires cérébraux riches en DOPA décarboxylase, dans les cellules gliales (Carta et al.,

2007; Navailles et al., 2010; Schwarting and Huston, 1996a). La décarboxylation

périphérique limitant la disponibilité du médicament au niveau cérébral et provoquant des

effets indésirables (hypotension artérielle, nausées et vomissements), la L-dopa est

fréquemment associée à des inhibiteurs de la décarboxylase périphérique (Olanow et al.,

2001). Cette association permet de réduire considérablement les doses de L-dopa et

d‟améliorer la tolérance au traitement.

Tableau 5. La lévodopa (L-dopa)

Avantages

Médication antiparkinsonienne la plus efficace

Réponse pour la quasi totalité des patients

Réduit le handicape et prolonge la capacité à rester actif

Augmente l‟espérance de vie

Inconvénients

Fluctuation motrice

Dyskinésies

Troubles neuropsychiatriques, confusion

Sédation

Inefficace sur les symptômes non dopaminergiques : freezing, instabilité posturale,

dysautonomie, démence

32

1.2.1.4 Stimulation directe des récepteurs dopaminergiques (agonistes

dopaminergiques)

C‟est à partir de la description moléculaire des différents sous-types de récepteurs

dopaminergiques cérébraux que la recherche sur les propriétés anti-parkinsoniennes des

agonistes dopaminergiques s‟est développée dans les années 80-90 (Rascol et al., 2007).

Ces molécules vont stimuler directement les récepteurs D2, initialement considérés comme

étant seuls impliqués dans les effets moteurs de la dopamine. A l'inverse de la L-dopa, leur

activité pharmacologique est indépendante du stock de neurones dopaminergiques

puisqu'ils agissent directement sur les récepteurs post-synaptiques qui restent, au moins en

partie, préservés au cours de la maladie (Playford and Brooks, 1992).

Tableau 6. Les agonistes dopaminergiques

Avantages

Effets antiparkinsoniens en monothérapie ou associées à la L-dopa

Réduisent le risque de développer des fluctuations motrices

Ne sont pas métabolisés par la voie oxydative

Effet d‟épargne de la L-dopa

Possibles effets neuroprotecteurs

Inconvénients

Effets secondaires digestifs, hypotension

Effets secondaires psychiatriques

Somnolence diurne

Œdème, prise de poids

Sans effet sur les symptômes non dopaminergiques

1.2.1.5 Réduction du catabolisme de la dopamine (inhibiteurs enzymatiques IMAO-

B et ICOMT)

Le concept sous-jacent au développement des inhibiteurs des enzymes de dégradation de la

dopamine (la monoamine oxydase, MAO, et la cathécol-o-méthyl-transférase COMT)

consiste à prolonger l'effet thérapeutique de la L-dopa et de la dopamine en améliorant sa

biodisponibilité. La sélégiline et la rasagiline sont des inhibiteurs spécifiques de la MAO-B,

enzyme impliquée dans le catabolisme de la dopamine dans les neurones dopaminergiques.

Son inhibition permet d‟augmenter le taux de dopamine libérée dans la fente synaptique et

contribue ainsi à pallier le déficit de dopamine dans le striatum (Olanow et al., 2009b).

33

L‟inhibition de la MAO-B par ces inhibiteurs est irréversible et permet donc une action

prolongée. L‟effet disparaît quand des quantités suffisantes de MAO-B ont été à nouveau

synthétisées (Olanow et al., 2009b).

Tableau 7. Les IMAO-B

Avantages

Efficace en monothérapie dans les formes débutantes

Réduction des fluctuations motrices

Epargne de la L-dopa

Une prise quotidienne, bonne tolérance

Possible effet neuroprotecteur

Inconvénients

Effet symptomatique modeste

Possibilité théorique de syndrome sérotoninergique

Les inhibiteurs de la COMT, l‟entacopone et la tolcapone sont des inhibiteurs compétitifs

sélectifs. La première ne traverse pas la BHE, la seconde la traverse bien, agissant donc

aussi dans le striatum au niveau présynaptique. Leur objectif est d‟augmenter la

biodisponibilité de la L-dopa et sa demi-vie plasmatique. L‟entacapone agit essentiellement

au niveau périphérique (tube digestif, foie et plasma), en inhibant la transformation par la

COMT de la L-dopa en 3-O-méthyldopa (3-OMD), un métabolite inactif présumé bloquer

la pénétration de la L-dopa dans le cerveau.

Taleau 8. Les ICOMT

Avantages

Pas de période de titration

Réduction des périodes d‟akinésie et de fluctuation motrices

Inconvénients

Inefficace sans L-dopa

Peuvent augmenter les dyskinésies

Possible toxicité hépatique de la tolcapone

Diarrhées rebelles

34

Figure 1-6. Les principaux mécanismes d'action des traitements symptomatiques de la

maladie de Parkinson

Tiré de http://www.edimark.fr/phototheque/galerie_detail.php?id _galerie=1107

1.2.2 La prise en charge chirurgicale

Au début du vingtième siècle le seul traitement neurochirurgical de la MP consistait à

réaliser des lésions du faisceau corticospinal permettant de supprimer le tremblement de

repos, parallèlement à la survenue d‟un risque de dysphagie, de dysarthrie et d‟altération

cognitive (Meyers, 1955). Dès les années 1950, la réalisation de lésions plus ciblées dans

l‟anse lenticulaire et le globus pallidum (GP) fut proposée (Cooper, 1953), alors que

parallèlement l‟effet bénéfique des lésions du noyau ventrolatéral du thalamus sur le

tremblement de repos et la rigidité était démontré (Meyers, 1955). Avec l‟avènement de la

dopathérapie, l‟approche chirurgicale connut un fort déclin entre les années 1970-1980.

Le renouveau de la chirurgie fonctionnelle des troubles du mouvement débuta dans les

années 80 avec les progrès de la neuroimagerie, des techniques de chirurgie stéréotaxique,

et l‟amélioration des connaissances sur le fonctionnement des ganglions de la base. Ces

avancées permirent de développer la technique de stimulation haute fréquence à l‟aide

http://www.edimark.fr/phototheque/galerie_detail.php?id

35

d‟électrodes implantées

dans des régions cérébrales stratégiques, aussi appelée stimulation

profonde du cerveau ou deep brain stimulation (DBS) (Benabid, 2003; Benabid et al.,

1987). A ce jour, le noyau sous thalamique (NST) demeure la structure de choix à stimulée

en raison des effets bénéfiques apportés sur le contrôle des tremblements et des

dyskinésies, mais aussi de la rigidité, des troubles de la posture et de la démarche (Deuschl

et al., 2006; Kleiner-Fisman et al., 2006; Krack et al., 2003).

Ces traitements permettent

alors une baisse de la dose quotidienne d‟équivalent de L-dopa d‟environ 67 % après un an,

réduisant ainsi les risques de dyskinésies (Krack et al., 2003).

Comme on le voit, le DBS peut offrir une réelle amélioration de la qualité de vie des

patients. La technique de DBS ne s‟adresse néanmoins qu‟à un nombre très limité, estimé à

20%, de patients atteint de la MP (Okun et al., 2004). En effet, le DBS ne s‟adresse qu‟aux

patients atteints de MP idiopathique qui répondent bien à la L-dopa et elle est contre

indiquée si il y a présence de démence ou de déficits cognitifs (Charles et al., 2002). Outre

son accessibilité limité pour les patients parkinsoniens, la technique de DBS ne permet pas

d‟altérer la progression de la maladie et les dégénérescences se poursuivent à un rythme

inchangé (Hilker et al., 2005). Enfin, même si la stimulation cérébrale profonde manifeste

des avantages cliniques importants, elle présente l‟inconvénient de nécessiter l‟implantation

d‟appareils de stimulation à demeure, sollicitant des réglages fréquents pour une utilisation

optimale et amenant un certain risque infectieux parmi d‟autres effets secondaires propre à

une intervention chirurgicale (Benabid et al., 2009; Olanow et al., 2009b).

36

1.3 Les axes de recherche thérapeutique

Comme décrit au chapitre ci-dessus, les stratégies pharmacologiques et chirurgicales

actuelles présentent des effets bénéfiques dans l‟amélioration de certains symptômes

moteurs, néanmoins, elles peuvent être à l‟origine de complications importantes. Les

traitements symptomatiques devenant inefficaces, notamment dans les formes avancées de

la maladie, de nouvelles stratégies thérapeutiques se développent. Ces axes de recherche

comprennent notamment la thérapie cellulaire et la thérapie génique, ou des approches

moins invasives comme la neuroprotection pharmacologique. Ces recherches nécessitent le

développement de modèles animaux afin de reproduire au mieux et selon les objectifs,

certains critères physiopathologiques de la MP.

1.3.1 Les modèles animaux de la maladie de Parkinson

La MP est une pathologie qui affecte sélectivement les neurones dopaminergiques de la

SNpc. Cette spécificité d‟atteinte a rendu possible la réalisation de modèles expérimentaux

chez l‟animal. Ils doivent reproduire au mieux l‟ensemble des caractéristiques de la maladie

humaine. Leur emploi au cours de ces 30 dernières années a contribué à mieux comprendre

la physiopathologie de la MP et demeure indispensable pour le développement de nouvelles

stratégies à visée thérapeutique. Pour étudier la MP, les chercheurs utilisent différents

modèles animaux. Parmi ceux-ci, on distingue les modèles neurotoxiques dont les plus

classiques sont basés soit sur l‟utilisation systémique du MPTP, soit sur l‟injection

stéréotaxique de 6-OHDA (Bove et al., 2005). Ces deux toxines tuent sélectivement les

neurones dopaminergiques de la SNpc. Certains pesticides comme la roténone ou le

paraquat, qui affectent négativement la fonction mitochondriale, peuvent également être

utilisés pour modéliser des formes environnementales de la MP (Cicchetti et al., 2009). Il

existe aussi des modèles transgéniques basés sur la surexpression de protéines impliquées

dans des formes familiales de la MP comme l‟α-synucléine (Fleming et al., 2005)

et des

modèles utilisant des virus recombinants pour surexprimer des protéines impliquées dans la

pathogenèse de la MP (Kirik and Bjorklund, 2003; Lauwers et al., 2003).

37

Tableau 9. Caractéristiques des principaux modèles animaux de la maladie de Parkinson

Modèles Symptômes Histologie Pertinence

pathogénique

Applications Désavantages

6-OHDA

Rat, Souris

Injections stéréotaxiq

ues dans

SN, MFB, striatum

Unilatéral: comportement

rotatoire

Bilatéral : akinésie

Perte innervations et neurones DA

Stress oxydatif Thérapies pouvant améliorer les

symptômes de la

MP

Étude des

mécanismes de mort

cellulaire

Neuroprotection

Requière une injection

intracérébrale

Faible implication de la synucléine

Pas d‟inclusions

Modèle aigu (sauf lésion intrastriatale)

MPTP

Singes

i.p, i.m,

carotide

Souris

aigu,

subaigu (i.p.)

Chronique

Déficits moteurs

chez les primates

Déficits moteurs plus subtils pour

les modèles aigus

de rongeurs

Perte innervation et

neurones DA

Quelques cas d‟inclusions non LB-like chez le

primate et LB-like chez la

souris MPTP-probenecide

Augmentation de

l‟immunoréactivité

synucléine chez certains modèles de rongeurs

Toxine

environnementale ;

inhibition du complexe I

mitochondrial

Thérapies pouvant

améliorer les

symptômes de la MP

Étude des

mécanismes de mort cellulaire

Neuroptotection

Modèle souvent

aigu ; non

progressif ou réversible

Inclusions rares

Rotenone

Rat Pompes

osmotiques

Injections i.p.

Diminution d‟activité motrice

chez le rongeur

Perte innervation et neurones DA

Agrégation d‟alpha-synucléine dans les

neurones DA

Modèle chronique : Toxine

environnementale

Stress oxydatif

Inhibition du

complex I mitochondrial

Neuroprotection Importante morbidité et

mortalité

Paraquat

–Maneb

Souris i.p.

Pas de déficits

moteurs clairs

Diminution de

l‟immunoréactivité TH

Pas d‟inclusion mais augmentation de

l‟immunoréactivité

Exposition

environnementale

multiple toxines/pesticides

Stress oxydatif

Neuroprotection Non largement testé

Effets dans d‟autres

systèmes de neurotransmetteurs

-

synucléine

Souris (WT, A30P,

A53T)

RAT AAV (WT, A53T)

Singe

AAV (WT, A53T)

Drosophile (WT, A30P,

A53T)

Déficits moteurs

plus ou moins sévères dépendant

du promoteur (ex :

PDGF-, mThy-1, Prp, Rat-TH,

CamKIItT) et du

transgène (WT,

A30P ou A53T -

syn)

Généralement pas de perte

de neurones DA chez la souris

Dégénérescence chez la

drosophile, rat et singe AAV

Parfois agrégation d‟alpha-

synucléine dans les neurones DA sous forme

d‟inclusions ou agrégations

fibrillaires

Mutations

pathogéniques connues

Étude du rôle de

l‟agrégation de synucléine dans la

MP

Étude du rôle normale de la

synucléine

Neuroprotection

Ne présente pas les

caractéristiques pathologiques ou

phénotype de la

MP : (pas de dégénérescence DA

ou pas d‟agrégation

d‟-synucléine dans les neurones

DA)

LRRK2

Souris (KO,

R1441G,

G21019S)

RAT (G21019S)

Quelques déficits comportementaux

dans le modèle

muté de drosophile

Pas d‟effet sur le développement DA chez

les KO

Dégénérescence DA minime dans les modèles

mutés (transmission DA

altérée, augmentation de p-

Mutations pathogéniques

connues

Étude du rôle de la mutation LRRK2

reliée à la MP

Généralement pas de dégénérescence

Pas d‟agrégation de

synucléine

38

Drosophile (KO, WT,

I1122V,

Y1699C,

G2019S,

I2020T,

G2385R)

Tau)

Parkin

Souris (KO,

Q311X)

Drosophile (KO,

Q311X)

Déclin dans les

mouvements

volontaires et activité induite par

l‟amphétamine

chez les souris KO


de neurones DA mais

altération de la transmission DA et de la

fonction mitochondriale

dans modèles de souris KO

Dégénérescence des

neurones DA chez la

drosophile et souris mutée

Mutations

pathogéniques

connues

Étude du rôle de la

mutation Parkin

reliée à la MP

Étude du rôle

normale de la Parkin

Neuroprotection

Généralement pas

de dégénérescence

Pas d‟agrégation de synucléine

DJ-1

Souris (KO)

Drosophile (KO)

Déclin âge-dépendant de

l‟activité

locomotrice générale

Généralement pas de perte de neurones DA chez la

souris mais altération de la

transmission DA et de la fonction mitochondriale

Dégénérescence DA dans

modèles de drosophile KO

Mutations pathogéniques

connues

Étude du rôle de la mutation DJ-1 reliée

à la MP

Neuroprotection

Pas de dégénérescence


synucléine

PINK1

Souris (KO,

G309D)

Drosophile (KO)

Déclin âge-

dépendant de l‟activité

spontanée


de neurones DA chez la souris mais altération de la

transmission DA et de la

fonction mitochondriale

Dégénérescence DA dans

modèles de drosophile KO

Mutations

pathogéniques connues

Étude du rôle de la

mutation PINK1 reliée à la MP

Neuroprotection

Pas de

dégénérescence


synucléine

Informations résumées et adaptées de Betarbet et al. (2002), Dawson et al. (2010), Tieu (2011), Chesselet et

al. (2011), Bezard et al. (2012) et Blesa et al. (2012).

Nous mettrons ici l‟emphase sur la description des modèles neurotoxiques les plus usités

induits par les toxines MPTP et 6-OHDA, puisque les différentes études décrites dans cette

thèse se basent sur l‟une ou l‟autre de ces toxines pour modéliser la MP.

1.3.1.1 Lésions à la 6-hydroxydopamine

La 6-OHDA, analogue hydroxylé de la dopamine, est l‟une des neurotoxines les plus

anciennement utilisées pour générer des modèles d‟étude de la MP in vivo. Cette

neurotoxine est utilisée chez le rat, la souris et le primate non-humain. En raison de son

incapacité à traverser la BHE, la 6-OHDA est classiquement injectée unilatéralement, par

stéréotaxie, directement dans le parenchyme cérébral au niveau de la SNpc, du striatum ou

dans le faisceau médian du télencéphale ou medial forebrain bundle (MFB) ce qui va

entrainer la mort des neurones dopaminergiques de la zone ciblée de manière relativement

spécifique (Francardo et al., 2011). En effet, la 6-OHDA est recapturée de façon sélective

39

par les cellules pourvues d‟un système de transport membranaire des catécholamines (DAT

concernant la dopamine), la 6-OHDA s‟accumule alors dans le cytosol et subit une rapide

auto-oxydation ce qui engendre un taux élevé de radicaux libres (Soto-Otero et al., 2000).

De plus, la 6-OHDA va entrainer l‟inhibition du complexe I mitochondrial (Glinka et al.,

1996; Glinka and Youdim, 1995). L‟association de ces deux mécanismes provoque la mort

du neurone dopaminergique par apoptose. Par ailleurs, suite à l‟injection de la 6-OHDA, on

constate une augmentation de la réponse inflammatoire (comme observée dans d‟autres

modèles toxiques) avec une astrogliose et une activation de la microglie dans la voie

nigrostriée (Blandini et al., 2010). Ce type de lésions, lorsque effectuée unilatéralement,

entraîne une asymétrie posturale jointe à une akinésie unilatérale qui peuvent être mesurées

par des tests de comportements moteurs spontanés ou induits (Ungerstedt and Arbuthnott,

1970; Zetterstrom et al., 1983). Alors que l'injection intranigrale ou dans le MFB produit

une dégénérescence rapide (trois à quatre jours post-lésion) (Faull and Laverty, 1969), celle

induite par l'administration intrastriatale est plus progressive et peut requérir jusqu'à trois

semaines avant d'être entièrement stable (Przedborski et al., 1995). Le modèle d‟injection

striatale reproduisant plus fidèlement la dégénérescence progressive observée dans la MP, il

est le plus couramment utilisé dans les thérapies expérimentales de protection et

régénération (Bjorklund et al., 1997).

1.3.1.2 Intoxications au 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine

Alors que le rat lésé à la 6-OHDA a été largement étudié, le MPTP a été peu utilisé chez le

rat. En effet, le rat présente une résistance au MPTP qui se manifeste par une absence de

perte de neurones dopaminergiques. Cette résistance serait probablement due au fort taux

de MAO-B présent dans la BHE des rats (Jossan et al., 1989). Cependant, il est possible de

réaliser des injections stéréotaxiques de 1-méthyl-4-phénylpyridinium (MPP+), directement

dans la voie dopaminergique nigrostriatale de manière unilatérale (Bellissimo et al., 2004)

ou de manière bilatérale (Braga et al., 2005), pour étudier les troubles cognitifs (Bellissimo

et al., 2004; Braga et al., 2005; Da Cunha et al., 2001; Da Cunha et al., 2003) et ainsi

induire une lésion partielle de la SNpc et du striatum.

L‟un des avantages du MPTP est qu‟il peut être administré par voie systémique et non

40

obligatoirement par chirurgie stéréotaxique intracérébrale. Chez la souris, le MPTP

administré de manière systémique le plus souvent en s.c. ou i.p., provoque des lésions

bilatérale de la SNpc ainsi qu‟une déplétion massive en dopamine striatale (Heikkila et al.,

1984a). Cette perte neuronale s‟explique par le mode d‟action spécifique du MPTP. En

effet, après son administration systémique, le MPTP va passer la BHE et va être métabolisé

en 1-méthyl-4-phényl-2,3-dihydropyridinium (MPDP+) par la MAO-B dans les cellules

gliales (astrocytes). Une oxydation probablement spontanée engendre le MPP+ qui est le

composé toxique. Le MPP+ qui a une forte affinité pour le transporteur de la dopamine

(DAT) est alors capté par les neurones dopaminergiques. Une fois dans le neurone, le

MPP+ est concentré activement dans la mitochondrie et va inhiber le complexe I de la

chaine respiratoire mitochondriale. Il en résulte une augmentation de la production de

radicaux libres qui entraine un stress oxydatif important et l‟activation des voies de mort

cellulaire (Vila and Przedborski, 2003). Sa spécificité au système dopaminergique de même

que sa reproductibilité en font un bon modèle pour la recherche dans le domaine de la MP.

1.3.2 Combattre la progression de la maladie (vs une approche symptomatique)

Bien que la thérapeutique antiparkinsonienne ait beaucoup progressée durant ces 40

dernières années, à l‟heure actuelle, elle ne s‟axe que sur une approche symptomatique.

L‟arsenal médicamenteux permet une bonne prise en charge des stades initiaux de la

maladie et d‟en contrôler les signes durant quelques années. Malheureusement, le

développement de résistances au traitement est inéluctable ainsi que la dégradation de l‟état

du patient à la suite de l‟avancée du processus neurodégénératif. Des solutions, comme la

stimulation profonde cérébrale, peuvent encore être apportées à des stades très avancés,

mais là aussi, l‟approche est symptomatique sans pouvoir tenter une quelconque

préservation ou réparation des systèmes neuronaux touchés par la maladie.

Pour être efficace, le traitement de la MP doit donc reposer à la fois sur une approche

symptomatique mais également sur une modification du cours évolutif de la maladie.

1.3.2.1 Les fenêtres d’intervention thérapeutique pour la MP

La MP est caractérisée par l‟existence d‟une phase précoce de dégénérescence au cours de

laquelle aucun symptôme clinique n‟est observable. La durée de la phase pré-

41

symptomatique reste imprécise et varie selon les auteurs, de quelques années (Fearnley and

Lees, 1991; Morrish et al., 1996) à plus de vingt ans (Hoehn and Yahr, 1967). Même si la

cinétique de la dégénérescence chez l‟homme n‟est pas aisément exploitable, on estime que

les premiers symptômes moteurs n‟apparaissent qu‟après une dégénérescence de 70 à 80%

des terminaisons dopaminergiques qui projettent dans le striatum et 50 à 60% des neurones

dopaminergiques de la SNpc (Bernheimer et al., 1973; Bezard et al., 2001; Riederer and

Wuketich, 1976). L‟existence de cette phase est liée à la mise en place de mécanismes de

compensation visant à pallier la perte des neurones dopaminergiques de la SNpc (Lloyd,

1977).

L'échec de ce mécanisme, c'est-à-dire la décompensation, signe la fin du stade pré-moteur

(ou pré-symptomatique) et le début des symptômes moteurs (Brotchie and Fitzer-Attas,

2009). C‟est fréquemment au début de cette phase symptomatique que le diagnostic de la

MP est posé. Cette situation particulière pose donc la question du diagnostic précoce de la

MP dans sa phase asymptomatique, aujourd'hui impossible à réaliser malgré plusieurs

tentatives de mise au point d‟outils de dépistage (marqueurs biochimiques, tests cognitif,

neuroimagerie). Une fois le diagnostic posé, les différentes options thérapeutiques qui

s‟offrent au patient parkinsonien, en pratique courante, s‟axent sur un traitement

symptomatique des déficits cérébraux. La thérapeutique, quelle soit médicamenteuse ou

chirurgicale, cherche à contenir les symptômes moteurs pour permettre au patient de mener

une vie moins handicapante, à défaut de maîtriser totalement les signes cliniques dont il est

frappé. Ces deux approches sont totalement inefficaces sur l‟évolution de la maladie et ne

permettent pas une guérison de la MP. Aucun des traitements actuels n'a en réalité montré

un effet significatif sur la perte neuronale, qui est un des attributs les plus marquant de la

signature clinique de la MP. De récents efforts ont été investis pour pallier l'inefficacité des

thérapies actuellement disponibles et un énorme travail a été entrepris pour identifier des

techniques ou molécules capables de modifier le cours évolutif de la pathologie (disease-

modifying approach). Bon nombre d‟agents neuroprotecteurs ont déjà été identifiés par

l‟expérimentation animale (Olanow et al., 2008b). Le concept de neuroprotection a été

popularisé au milieu des années 80 avec la sélégiline (LŔdeprenyl) qui a pour effet de

protéger les neurones dopaminergiques des dommages que peuvent engendrer les radicaux

42

libres et les neurotoxines exogènes (Presthus and Hajba, 1983). Les agents

pharmacologiques capables de « sauvegarder » les éléments des systèmes ciblés par la

maladie (fonction de neurorescue) ou encore de restaurer ces éléments (fonction de

neurorestauration) sont beaucoup plus rares, voire inexistants. La sémantique de ces

fonctions est particulièrement importante car ces termes impliquent que l‟application de ces

interventions, à un moment précis du décours temporel de la maladie, pourrait interférer

dans l‟évolution de la pathologie (Figure 1-6).

Figure 1-7. Fenêtres et types d'interventions pour la maladie de Parkinson

La ligne rouge interrompue en filigrane représente le décours temporel de la dégénérescence normale des

neurones dopaminergiques d‟un individu sain. La ligne rouge pleine représente le décours temporel

hypothétique de dégénérescence neuronale qui caractérise la maladie de Parkinson. La ligne verte illustre la

dégénérescence anticipée suite à une intervention de type neuroprotectrice. La ligne violette illustre la

dégénérescence suite à une intervention dite “neurorescue”. La ligne turquoise représente la dégénérescence

hypothétique suivant une intervention neurorestauratrice. Figure adaptée de Gibrat et Cicchetti (2011).

100

30

0

0Absence de

symptômes cliniques

Fenêtre d’interventionNeuroprotection-Neurorescue

Fenêtre d’interventionNeurorescue-Neurorestauration

Symptômes cliniquesAnnées

Po

urc

en

tage

de

ne

uro

ne

s

Diagnostic

Neuroprotection

Lésionou

mutationgénétique

Neurorestauration

Neurorescue

43

Une intervention neuroprotectrice est unanimement acceptée comme une approche capable

de prévenir ou retarder le processus neurodégénératif (Clarke, 2004). Pour empêcher la

perte neuronale, une thérapie neuroprotectrice doit être, par définition, administrée avant le

début du processus de mort neuronale (Mandel et al., 2003; Schapira, 2002). Étant donné la

difficulté à prévoir le début de la pathologie, une stratégie neuroprotectrice est en réalité le

scénario le moins envisageable à l‟heure actuelle pour la MP, mais deviendra intéressante

lorsque des marqueurs diagnostiques pré-symptomatiques fiables existeront. Une action de

neurorescue peut arrêter les processus neurodégénératifs par une activité potentiellement

anti-apoptotique sur les neurones déjà ciblés, et ce, avec ou sans répercussions

fonctionnelles. Ce type d‟intervention serait plus efficaces lorsqu‟administré tôt dans le

processus neurodégénératif mais démontrerait une certaine efficacité post-diagnostic. Les

approches neurorestauratrices, quant à elles, peuvent rétablir la fonctionnalité des processus

neuronaux déjà touchés par la maladie via l‟expression de facteurs neurotrophiques ou

encore, par exemple, par neurogenèse (Gibrat and Cicchetti, 2011). Un tel traitement

pourrait être administré plus tard dans le cours évolutif de la maladie et serait

théoriquement efficace même en phase symptomatique de la MP.

1.3.2.2 Les thérapies génique et cellulaire

Parmi les approches expérimentales en cours de développement deux voies chirurgicales

autres que le DBS suscitent des espoirs: les thérapies géniques et les thérapies cellulaires.

1.3.2.2.1 La thérapie génique

De par la nature chronique et progressive de la MP, une libération continue de facteurs

améliorant la capacité de survie et de sécrétion des neurones dopaminergiques via une

thérapie génique pourrait constituer un moyen de ralentir significativement la progression

de la maladie. La thérapie génique consiste à greffer des cellules modifiées ou à modifier

les neurones in situ pour supplémenter une fonction déficiente (synthèse de dopamine) ou

apporter une nouvelle fonction (synthèse de facteurs neurotrophiques). Du fait des

mécanismes complexes qui sont à l‟origine de la dégénérescence des neurones

dopaminergiques et de la variété des effets causés par cette perte neuronale, il existe de très

nombreux gènes d‟intérêt qui peuvent être transférés (le GDNF, la neurturine, la tyrosine-

44

hydroxylase, la L-amino-acide aromatique décarboxylase ou dopa-décarboxylase, la GTP-

cyclohydrolase-1, l‟acide glutamique décarboxylase), différents types de virus qui peuvent

être utilisés (des adénovirus, des virus associés aux adénovirus, des lentivirus) et différentes

structures cérébrales qui peuvent être ciblées (la SNpc, le striatum, le putamen, le noyau

sous-thalamique) (Kaplitt, 2010; Lu et al., 2005a; Lu et al., 2005b; Ye et al., 2007). Suite à

la réalisation d‟essais prometteurs chez l‟animal (Wakeman et al., 2011), des essais

cliniques sont actuellement en cours (Bartus et al., 2011; Marks et al., 2010; Wakeman et

al., 2011). Par ailleurs, le développement de la thérapie génique ex vivo (greffe de cellules

modifiées par génie génétique) offre actuellement une alternative intéressante à la thérapie

génique classique, en combinant les effets potentiellement bénéfiques des cellules greffées

et du transgène (Deierborg et al., 2008).

1.3.2.2.2 La thérapie cellulaire

Alors que les approches thérapeutiques actuelles se focalisent sur la régulation de la

symptomatologie invalidante de la MP, les voies ouvertes par la thérapie cellulaire s‟axent

sur une thérapeutique restauratrice par la régénération des circuits nigrostriataux

dopaminergiques lésés. Pour se faire, différents types cellulaires (neuroblastes fœtaux,

cellules souches mésenchymateuses, cellules souches neurales, par exemple) peuvent être

utilisés et montrent des effets bénéfiques chez les animaux (Ganz et al., 2011). Bien que

plusieurs essais cliniques randomisés de thérapie cellulaire aient été réalisés, les résultats et

conclusions issues de ces études sont variables. Ceci incombant notamment aux différentes

stratégies et méthodologies de transplantation utilisées. En effet, une première série d‟essais

en « open label », réalisés sur de petites séries de patient, a apporté la preuve du bien fondé

de la transplantation cellulaire allogénique pour le remplacement des neurones

dopaminergiques dans la MP, en mettant en évidence l‟intégration d‟un greffon fonctionnel

à l‟origine de l‟amélioration de certains symptômes parkinsoniens (Freeman et al., 1995;

Kordower et al., 1995; Piccini et al., 1999; Wenning et al., 1997; Widner et al., 1992). Par

la suite, deux essais en double aveugle ont été conduit chez 40 patients afin de comparer les

effets de la transplantation versus une opération placebo chez des patients parkinsoniens et

de déterminer l‟efficacité et la sécurité d‟une telle techniques. La première étude n'a

démontré aucun effet bénéfique malgré une tendance chez les patients de 60 ans et moins

45

(Freed et al., 2001). La deuxième étude, menée avec un autre protocole de greffe, n‟a pas

montré de différence du score UPDRS entre les patients greffés et les patients placebo après

24 mois. De plus, comme pour la première étude, certains patients ont développés des

dyskinésies suite à la greffe (Olanow et al., 2003). Par ailleurs, une analyse post mortem de

patients ayant été transplantés a mis en évidence le transfert de la pathologie -synucléine

aux nouveaux des neurones greffés (Kordower et al., 2008). Ainsi, un questionnement

important persiste encore quant à l‟efficacité et l‟innocuité de la transplantation cellulaire

pour la MP. Néanmoins, les études menées chez l‟homme auront contribué à faire

progresser les procédures de transplantation et améliorer la sélection des patients. De plus,

les xénogreffes, les autogreffes, les cellules souches dites induced pluripotent stem cell

(iPS) (Hwang et al., 2010) ou encore l‟administration intranasale de cellules (Danielyan et

al., 2009), pourraient devenir des stratégies alternatives intéressantes pour paliers certains

problèmes éthiques et pratiques des techniques actuelles de transplantation cellulaire. Cela

permettra peut-être d‟asseoir un jour la thérapie cellulaire à titre de traitement pour la MP.

1.3.2.3 L’approche pharmacologique ‘disease modifier’

Afin d'identifier une thérapie non invasive (non chirurgicale) capable de modifier le cours

évolutif de la MP (disease modifier), la recherche s'est concentrée sur le développement de

composés pharmacologiques capables de cibler les mécanismes pathogéniques qui

semblent responsables de la neurodégénérescence et des dysfonctions observées dans la

MP. Sont uniquement décrits dans ce chapitre les composés ayant démontré des propriétés

suffisantes pour faire l‟objet d‟études cliniques.

1.3.2.3.1 Cibler les dysfonctions mitochondriales

Les dysfonctions mitochondriales participent à la pathogénèse de la MP. En effet, une

dysfonction mitochondriale conduit à un stress oxydatif, à des altérations de l‟ADN

mitochondrial, à une modification de la morphologie de la mitochondrie, à des altérations

dans les mécanismes de fusion et de fission mitochondriales, et au final à des dommages

neuronaux. Plusieurs molécules sont en cours d‟évaluation, nous prendrons comme

exemples les plus probants : le coenzyme Q10 (CoQ10) et la créatine.

46

La créatine. Découverte en 1832 par le chimiste français Eugène Chevreul, est un dérivé

d‟acide aminé naturel, qui représente une source énergétique pour le fonctionnement

musculaire et neural (Beal, 2009). La créatine exerce son activité neuroprotectrice aussi

bien dans des modèles cellulaires qu‟animaux. In vitro, une administration continue de

créatine permet d‟améliorer significativement la survie de neurones dopaminergiques après

une administration de MPTP (Matthews et al., 1999). De la même manière, la créatine

protège les cellules de l‟effet toxique de la 6-OHDA. Dans des modèles animaux de la MP,

la créatine entraine une réduction de la perte de neurones dopaminergiques de la SNpc

(Matthews et al., 1999). L‟effet neuroprotecteur a également été montré vis-à-vis de

l‟excitotoxicité induite par le NMDA, ainsi que dans des modèles animaux de la maladie de

Huntington (MH) ou d‟Alzheimer (Malcon et al., 2000). Les effets bénéfiques de la

créatine dans les modèles animaux de différentes pathologies neurologiques ont conduit à

la réalisation d‟essais cliniques pour la maladie d‟Alzheimer, de Huntington et de

Parkinson. Dans un premier essai clinique de la MP, la créatine a amélioré l‟humeur des

patients alors qu‟aucune variation de score à l‟échelle clinique motrice Unified Parkinson's

Disease Rating Scale (UPDRS) n‟était observée (Bender et al., 2006). Dans un autre essai

clinique, le score UPDRS a été amélioré et la progression de la maladie des patients traités

à la créatine a diminuée de 50% en un an (NINDS NET-PD Investigators (2006)). D‟autres

essais cliniques sont annoncés, notamment de phase III dans la MP et dans la MH (Beal,

2009).

Le coenzyme Q10. Egalement connue sous le nom de CoQ10 ou ubiquinone, le coenzyme

Q10 est un composé biologique essentiel dans la chaine respiratoire mitochondriale qui

assure la production d'énergie utilisable par la cellule sous forme d'ATP. En outre, le

CoQ10 joue aussi un rôle antioxydant important dans la membrane lipidique

mitochondriale et exerce une activité anti-apoptotique en bloquant la fixation de Bax à la

mitochondrie (Beal, 2009). Plusieurs travaux in vitro et in vivo ont montré l‟effet

neuroprotecteur du CoQ10. In vitro, il atténue les dysfonctions mitochondriales induites par

les pesticides roténone et paraquat (McCarthy et al., 2004; Menke et al., 2003). Un pré-

traitement des neurones avec le CoQ10 permet de maintenir l‟intégrité fonctionnelle de la

mitochondrie et diminue le taux de ROS (McCarthy et al., 2004). Chez les souris âgées

47

traitées au MPTP, le CoQ10 exerce un effet protecteur en diminuant la perte de neurones

dopaminergiques de la SNpc (Beal, 1998; Beal et al., 1998; Matthews et al., 1998). De

plus, la créatine donnée en combinaison avec du CoQ10 présente un effet neuroprotecteur

majoré chez des animaux traité au MPTP ou dans des modèles animaux de la MH (Beal,

2011). Plusieurs essais cliniques pour le CoQ10 dans la MP ont montré une réduction dose

dépendante du score UPDRS et un essai clinique de phase III associant le CoQ10 (1200 mg

ou 2400 mg/24 h) à la vitamine E (1200 mg/24 h) est actuellement en phase d‟exécution

(numéro NCT00740714, clinicaltrials.gov) (Beal, 2009; Littarru and Tiano, 2010).

1.3.2.3.2 Diminuer le stress oxydatif et l’apoptose

La sélégiline. On considère depuis plus de 25 ans, le stress oxydatif comme un acteur

important dans la neurodégénérescence parkinsonienne. Le premier essai clinique mené

pour l‟évaluation d‟agents neuroprotecteurs dans la MP fût l‟étude „Deprenyl and

Tocopherol Antioxidative Therapy of Parkinsonism‟ (DATATOP) (Trial, 1989). Le

Deprenyl (sélégiline) est un inhibiteur irréversible de la MAO-B et est connu pour

empêcher la conversion du MPTP en MPP+ et ainsi protège les animaux de la toxicité du

MPTP. Comme inhibiteur de la MAO-B, il réduit la déamination oxydative de la dopamine

en DOPAC et peroxyde d‟hydrogène et diminue ainsi la formation de radicaux libres. L‟-

tocopherol (la vitamine E) est reconnu depuis longtemps pour son pouvoir antioxydant. Les

résultats obtenus par l‟étude DATATOP ont montré qu'un traitement de sélégiline en

monothérapie retarde le début du traitement symptomatique à la L-dopa tandis qu'un

traitement à la vitamine E ou une combinaison des deux composés antioxydants ne

semblent pas présenter d'effets bénéfiques (Trial, 1989). Un traitement par la sélégiline

permet aussi de réduire les scores UPDRS des patients de moitié. Tandis que les sujets dans

l‟étude DATATOP étaient suivis en essai ouvert et ont finalement tous reçu de la sélégiline

et de la L-dopa, 368 d'entre eux ont consenti à être re-randomisés en traitement sélégiline

ou placebo, en restant sur la L-dopa („BLIND-DATE study‟). Ils ont été étudiés dans un

essai en double aveugle pendant 21 mois et évalués pour la progression clinique de la MP.

Dans cette étude, les sujets assignés à la sélégiline ont exigé un dosage inférieur de L-dopa

et ont présenté un ralentissement de dégradation des symptômes liés à la MP en

comparaison avec les patients assignés au placebo (Shoulson et al., 2002). Bien que l‟étude

48

DATATOP ait démontré un retard significatif dans le besoin d‟un traitement

symptomatique à la L-dopa chez les patients traités avec du deprenyl versus placebo, cette

étude illustre aussi qu‟un effet symptomatique modéré de la sélégiline dans un essai

clinique ainsi conçu, peut confondre n'importe quelle interprétation neuroprotectrice. Le

débat d‟un effet neuroprotecteur de la sélégiline dans cette étude et d‟autres essais cliniques

ultérieurs, est donc toujours en cours. L‟étude DATATOP a cependant fourni un stimulus

fort pour développer et étudier d‟autres composés pour leur potentiel disease modifier et

pour de surcroît, raffiner la méthodologie d'essai clinique afin de mieux évaluer l‟effet de

ces composés sur la progression de la MP.

La rasagiline. Tout comme la sélégiline, la rasagiline (Azilyect) est un puissant inhibiteur

irréversible de la MAO-B. En plus de ses effets symptomatiques chez les patients

parkinsoniens, la Rasagiline pourrait, d‟après les résultats de l‟étude clinique TEMPO

(Rasagiline in Early Monotherapy for Parkinson's Disease Outpatients), également limiter

la progression de la maladie (Trial, 2004). Afin d‟explorer un peu plus en profondeur cette

possibilité, une plus grande étude comparative (avec placebo) multicentrique, à répartition

aléatoire, à double insu fût menée en utilisant un plan expérimental de type „delayed-start‟

(Olanow et al., 2008a). Il s‟agit de l‟étude ADAGIO (The Attenuation of Disease

Progression with Azilect Given Once-daily). Cette étude a révélé que les patients

parkinsoniens traités par AZILECTMD (rasagiline), administré une fois par jour, en

comprimé dosé à 1 mg, dès le début de l‟essai, montrent une amélioration marquée

comparativement aux patients traités en mode différé, neuf mois plus tard (Chu et al., 2009;

Olanow et al., 2009a; Olanow et al., 2009b). Les mécanismes à l‟origine de cet effet

bénéfique sont encore difficiles à cerner : effet neuroprotecteur/ neurorescue/ amélioration

de la plasticité cérébrale compensatoire. Néanmoins, ces résultats corroborent une possible

capacité de la rasagiline à influencer le cours évolutif de la maladie. En préclinique, des

études in vivo ont déjà décrit l'effet protecteur de la rasagiline chez des souris et des singes

traités au MPTP (Heikkila et al., 1985; Tabakman et al., 2004) et dans des modèles de rats

6-OHDA (Blandini et al., 2004). L‟activité neuroprotectrice de la rasagiline pourrait être

attribuée à l‟inhibition de la MAO-B dans le modèle MPTP (Heikkila et al., 1984b), mais

également à des mécanismes moléculaires indépendants (Youdim et al., 2005a). Par

49

exemple, la rasagiline est capable d‟induire la production des protéines de la famille des

Bcl-2 (Weinreb et al., 2004) ainsi que de moduler la disponibilité de facteurs

neurotrophiques comme le BDNF (Bar-Am et al., 2005).

Remarquons que outre des inhibiteurs de la MOA-B, des agonistes dopaminergiques ont

également été testé chez des patients pour leur propriétés neuroprotectrice tels le ropinirol

dans l‟étude REAL-PET (Ropinirole as Early Therapy versus L-dopa Positron Emission

Tomography) (Whone et al., 2003) et le pramipexole dans l‟étude CALM-PD (comparison

of the Agonist Pramipexole versus Levodopa on Motor Complications of Parkinson‟s

Disease‟) (Trial, 2002). Ces deux études ont utilisé l‟imagerie du système nigo-striatal

comme marqueur de la progression de la MP, et ont démontré une diminution de 35% dans

la perte de marqueurs au cours de 2 à 4 années. Cependant l‟interprétation de ces résultats

fut largement discutée. Pour préciser par la suite le rôle disease modifier du Pramipexole

l‟étude PROUD (PRamipexole On Underlying Disease) a été élaborée sur un modèle

proche de l‟étude ADAGIO soit une „delayed start study‟. L'étude PROUD à confirmé

l'efficacité symptomatique du pramipexole, mais n‟a pas démontré d‟effet disease modifier

de l'agoniste dopaminergique (Schapira et al., 2010)

1.3.2.3.3 Diminuer la neuro-inflammation

L‟inflammation, qu‟elle soit la conséquence du dysfonctionnement neuronal, ou l‟une des

causes, participe à la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques de la SNpc.

Ainsi, diminuer les mécanismes immunitaires associés à la neuroinflammation pourrait

permettre de ralentir la progression de la maladie. Plusieurs approches sont possibles, et

certaines d‟entre-elles sont en cours d‟évaluation dans d‟autres pathologies

neurodégénératives et inflammatoires comme la sclérose latérale amyotrophique ou la

maladie d‟Alzheimer.

La minocycline. Cette molécule antibiotique possède des propriétés immunomodulatrices et

anti-apoptotiques en plus de ses propriétés anti-oxydantes (Chtarto et al., 2003; Kraus et al.,

2005). Différentes expérimentations dans des modèles animaux de maladies

neurodégénératives comme la sclérose latérale amyotrophique, la maladie d‟Alzheimer, de

Huntington et de Parkinson ont mis en évidence l‟effet neuroprotecteur de la minocycline

50

(Hwang et al., 2010; Kim and Suh, 2009). D‟autres études ont montré une exacerbation de

la neurodégénérescence selon la dose et la voie d‟administration de la minocycline dans des

modèles primates non-humains et rongeurs de la MP (Fernandez-Gomez et al., 2005). Les

résultats d‟un essai de phase II associant la minocycline et la créatine (numéro

NCT00063193) chez des patients nouvellement diagnostiqués parkinsoniens encouragent la

réalisation d‟un essai de phase III (Hirsch and Hunot, 2009).

Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et les inhibiteurs de la cyclo-oxygénase 2

(COX). Les AINS préviennent l‟activation des cyclo-oxygénases et entrainent alors une

diminution de la synthèse des prostaglandines qui sont des molécules pro-inflammatoires.

Les AINS sont aussi de puissants neutralisants des espèces réactives à l‟oxygène et des

espèces réactives nitrogénées. Certains AINS, comme l‟indométacine et l‟ibuprofène,

peuvent également activer la voie anti inflammatoire des PPARγ (peroxisome proliferator-

activated receptor gamma) (Hirsch and Hunot, 2009). Bien que des études précliniques

montrent l‟effet bénéfique des AINS et de l‟inhibition des COX2 dans la MP, aucune de

ces molécules n‟a fait l‟objet d‟essais cliniques pour cette pathologie. L‟ibuprofène, le

naproxène et le rofécoxib en association ou non, ont toutefois fait l‟objet d‟essais cliniques

dans la maladie d‟Alzheimer (numéros NCT00004845, NCT00046358). Ces essais ne

montrent cependant pas d‟amélioration des scores cliniques. Ces anti-inflammatoires

pourraient avoir un effet bénéfique en traitement préventif ou dans les phases débutantes

des pathologies neurodégénératives mais pas dans des états pathologiques avancés. De plus,

il est important de considérer les effets secondaires d‟une prise chronique de ces

médicaments (Hirsch and Hunot, 2009). Les AINS actuels ne constituent donc pas une

stratégie thérapeutique neuroprotectrice vraisemblablement envisageable pour la MP

(Hirsch and Hunot, 2009).

1.3.2.3.4 Combattre l’excitotoxicité et bloquer les canaux calciques

Un exemple de composés qui pourrait être utilisé pour palier un problème d‟excitotoxicité

est le Riluzole, un composé déjà utilisé dans le contexte de la sclérose latérale

amyotrophique. Le Riluzole détériore la neurotransmission glutamatergique en bloquant les

courants des canaux sodium voltage-dépendants et a démontré, dans les modèles animaux

51

expérimentaux de la MP, des effets neuroprotecteurs (Barneoud et al., 1996 ; Benazzouz et

al., 1995 ; Boireau et al., 2000 ; Obinu et al., 2002). Cependant, le Riluzole n‟a pu

démontrer de tels effets dans des essais cliniques qui impliquaient pourtant des patients en

phase précoce de la MP (Jankovic and Hunter, 2002).

Diminuer l‟entrée de calcium dans les neurones dopaminergiques de la SNpc pourrait

également avoir une action neuroprotectrice et ralentir la progression de la pathologie. En

effet, il a été démontré que des souris traitées avec de la dihydropyridine (un inhibiteur des

canaux calciques L-Cav1.3) deviennent résistantes à l‟action délétère des toxines utilisées

dans les modèles animaux de la MP (Surmeier, 2007). Les inhibiteurs calciques sont

couramment utilisés pour traiter l‟hypertension artérielle ou prévenir des crises d‟angor.

Les plus couramment utilisés sont le vérapamil et le diltiazem. Une étude épidémiologique

sur l‟effet potentiel de ces inhibiteurs calciques dans l‟évolution de la MP, ne montre pas de

relation positive alors que deux-tiers des patients étaient traités avec l‟un de ces deux

médicaments (Ton et al., 2007). A contrario, une étude rétrospective chez des patients

hypertendus traités par une autre dihydropyridine, l‟israpidine, révèle une incidence de la

MP nettement plus faible (Rees et al., 2011a). Actuellement, afin d‟évaluer l‟effet

neuroprotecteur de l‟isradipine dans la MP, deux essais cliniques de phase II ont débuté

(numéros NCT00753636 et NCT00909545, clinicaltrials.gov).

1.3.2.3.5 Promouvoir l’apport de facteurs neurotrophiques

Le GDNF et le BDNF sont largement reconnus comme de puissants facteurs de survie pour

les neurones dopaminergiques de la voie nigrostriée qui dégénère dans la MP. Bien que les

propriétés neuroprotectrices ou de neurorescue de ces FNTs aient été démontrées dans

diverses expériences in vitro et in vivo de la MP (Peterson and Nutt, 2008), leur application

comme agents thérapeutiques pour la MP est entravée par leur difficultés d‟administration

au niveau du cerveau. En effet, ces macromolécules ne peuvent traverser la BHE. Ainsi,

plusieurs essais cliniques ont évalué l‟utilisation de FNTs comme traitement de la MP en

faisant appel à la chirurgie, cette technique permettant d‟administrer directement dans la

zone cérébrale endommagée les FNTs eux-mêmes ou des cellules génétiquement modifiées

capables de les produire. Ces techniques n‟ont malheureusement pas encore prouvé leur

52

efficacité dans la sphère clinique puisque subside encore le problème d‟une administration

efficace et d‟une expression adéquate des FNTs dans la zone cible (Dietz et al., 2006). De

surcroît, ces techniques sont associées à de nombreux risques pour le patient qui incombent,

pour la plupart, aux effets secondaires associés à la chirurgie.

Une alternative à ces approches invasives serait une stratégie qui vise, suite à

l‟administration systémique d‟un composer, à stimuler l'expression endogène de FNTs.

Récemment, le XIB4035 et le PYM50028 (cogane), deux inducteurs non-peptidiques de

FNTs, ont démontré une capacité à atténuer la perte neuronale dopaminergique et

pourraient avoir des effets intéressant pour le traitement de la MP (Tokugawa et al., 2003;

Visanji et al., 2008). Une étude de phase II est d‟ailleurs en cours (NCT01060878) pour

tester le PYM50028 chez des patients parkinsoniens pris à un stade précoce de la maladie.

Le lithium est également en cours d‟expérimentation clinique pour des patients qui

souffrent de sclérose latérale amyotrophique et de la maladie d‟Alzheimer, d‟autres

maladies neurodégénératives (NCT00790582 et NCT00088387). Des composés comme le

cogane ou le lithium peuvent être administrés de manière systémique, et permettent ainsi de

surmonter la plupart des problèmes associés à l'efficacité et à la sécurité d‟une délivrance

cérébrale directe par chirurgie des FNTs. Ainsi, les molécules qui stimulent l'expression

endogène de FNTs ou améliorent leur signalisation sont de plus en plus envisagées comme

des options thérapeutiques alternatives ou complémentaires pour la MP.

A l‟heure actuelle, aucun composé qui se revendique neuroprotecteur n'a été approuvé par

la Food and Drug Administration (FDA) pour le traitement de la MP, y compris certaines

molécules déjà utilisées pour le soulagement symptomatique de cette pathologie. Outre

l‟aspect méthodologique des études cliniques menées et le manque de biomarqueurs pré-

symptomatiques, la complexité des processus impliqués dans la mort cellulaire neuronale,

sont également parmi les éléments clés qui ont gêné le succès de nouveaux développements

médicamenteux pour la MP. En effet, la diversité des paramètres biochimiques impliqués

dans la mort neuronale, comme le stress oxydatif, le dysfonctionnement mitochondrial,

l'accumulation de protéines, la diminution de facteurs neurotrophiques, l'inflammation et

l'activation d'enzymes apoptotiques comme la caspase-3 implique qu'un agent

53

thérapeutique efficace devrait inhiber plus qu'un paramètre pathologique ou présenter une

gamme de propriétés différentes pour faire face aux caractéristiques pathologiques diverses

de la maladie (Chu et al., 2009; Harris et al., 2009). Notre laboratoire a consacré une partie

de ses recherches en quête de ce type de molécules. Dans ce contexte, mon travail de

doctorat a consisté en l‟étude d‟un composé pléiotropique particulièrement prometteur pour

le traitement de la MP : la cystamine.

1.4 La cystamine

1.4.1 Propriétés générales

La cystamine (2,2‟-dithio-bis[éthylamine]) est un diamine linéaire aliphatique composé

d‟un pont disulfure, ce dernier étant généré par l‟oxydation de deux résidus cystéamine (2-

mercaptoéthylamine ou 2-aminoéthanethiol). La cystéamine libre est un aminothiol soluble

essentiel, de faible poids moléculaire. La décarboxylation in situ de la cystéine pourrait

constituer la source de cystéamine mais aucune activité de ce type n‟a été détectée in vivo.

Chez les mammifères, la cystéamine serait plutôt issue du métabolisme de la pantéthéine,

un composant du coenzyme A (CoA), par l‟action de la pantéthéinase (Pitari et al., 2000;

Pitari et al., 1992). In vivo, la cystéamine libre est présente en très faibles concentrations

(de l‟ordre du nanomolaire) et son temps de demi-vie est très court dans les tissus (Ricci et

al., 1983). Dans les conditions physiologiques, elle est en équilibre avec sa forme disulfure

oxydée, la cystamine, un inhibiteur de l‟activité pantéthéinase. Cet équilibre

sulfure/disulfure est contrôlé par l‟état redox, la cystéamine étant sensible à l‟auto-

oxydation dans les milieux contenant des ions métalliques: les conditions redox

intracellulaires favorisent la forme réduite sulfhydryle, tandis que dans le plasma ou dans

les fluides extracellulaires la forme oxydée disulfure est majoritaire. La forte solubilité de la

cystéamine lui permet de traverser rapidement les membranes biologiques, mais son

absorption par les cellules de mammifères dépend des conditions d‟incubation (une

concentration, un pH et températures élevés favorisent une absorption plus importante). Par

contre, il a été montré que les composés mixtes disulfures cystéine-cystéamine utiliseraient

un processus actif, le système « L », pour entrer dans les cellules puis seraient réduits à

l‟intérieur de la cellule pour « libérer » leurs thiols (Jeitner and Lawrence, 2001; Zwenk et

54

al., 1967). Bien qu‟elle soit rapidement convertie en cystéamine une fois dans l‟organisme,

la cystamine peut aussi être métabolisée en cystéine, hypotaurine et taurine (Demarco et al.,

1965; Pinto et al., 2005; Sharma et al., 1995), qui sont tous des composés cellulaires

endogènes. Comme composante commune de la plupart des protéines, la cystéine se

retrouve généralement dans divers produits alimentaires. La cystéine réduite est le composé

sulfhydryl de faible poids moléculaire le plus abondant dans le plasma (Ueland et al.,

1996). L‟hypotaurine est métabolisée en taurine, un abondant acide aminé qui est

majoritairement apporté par la prise alimentaire de viande ou de fruits de mer (Huxtable,

1992). La taurine et l‟hypotaurine présentent certes des fonctions périphériques multiples,

comme entrer dans la composition de la bile, mais elles sont également impliquées dans la

physiologie cérébrale comme la neurotransmission ou la potentialisation à long terme

(Muramatsu et al., 1978; Pasantes-Morales et al., 1981). Comme la cystéamine, la taurine

est également un dérivé de la cystéine. Brièvement, chez les mammifères, la voie principale

de synthèse fait intervenir la cystéine et un intermédiaire, l‟acide cystéine sulfinique. Il

existe cependant une voie alternative de synthèse de la taurine à partir de la cystéamine : in

vivo, la cystéamine, générée par l‟activité pantéthéinase dans la voie de dégradation du

CoA, serait oxydée en hypotaurine par la cystéamine oxygénase puis en taurine par une

activité enzymatique observée in vivo, mais non identifiée (Cavallini et al., 1976).

55

Figure 1-8. Voies métaboliques potentielles à l’origine de la production de cystéamine et

d’autres dérivés de la cystamine

Figure inspirée et adaptée de Besouw et al. (2013), Liang et al. (2010) et Stipanuk et al. (2006).

Les thiols de faible poids moléculaire incluant la cystéamine sont possiblement impliqués

dans la régulation de processus métaboliques via des réactions d‟échange thiol/disulfure

intervenant entre les groupements thiols de certaines enzymes et des composés disulfures.

Le couple cystéamine/cystamine régule de nombreuses activités enzymatiques dont les

glycogène phosphorylases a et b, glycogène synthétase D (Ernest and Kim, 1973); la

fructose-1,6-diphosphatase (Pontremoli et al., 1967) (synthèse du glycogène); l‟acétyl-CoA

hydrolase (Namboodiri et al., 1980) (synthèse de la N-acétylsérotonine et mélatonine); la

guanylate cyclase (production de cGMP suite à l‟activation de NO); la transglutaminase

(Tgase) (Karpuj et al., 2002b) et potentiellement la caspase-3 (Lesort et al., 2003).

56

1.4.2 Applications thérapeutiques passées et actuelles

Dans la littérature, de très nombreuses publications relatent les propriétés physiologiques

de la cystamine. Ces données sont parfois contradictoires mais, dans la plupart des cas, les

effets observés sont dépendants des doses utilisées. Il est néanmoins possible de dresser un

bilan concis des connaissances et indications thérapeutiques les plus représentatives de la

cystamine.

La cystamine et ses dérivés (cystéamine, hypotaurine, taurine et dérivés artificiels : WR

1065, WR 2721, etc.) sont utilisés depuis longtemps comme de puissants agents

radioprotecteurs (Bacq et al., 1965; Newton et al., 1997; Smoluk et al., 1986; Stuart and

Stannard, 1966; Zheng et al., 1988). Ces composés possèdent un groupement thiol libre qui

leur confèrerait la capacité de réduire les oxydants induits par les radiations. Ils agiraient en

puissants agents antioxydants; en particulier, la cystéamine qui est un excellent piégeur

d‟OH. et HOCl et qui est également capable de neutraliser H2O2 in vitro, mais pas O2.-

(Aruoma et al., 1988). Toutefois, ses propriétés antioxydantes seules n‟expliqueraient pas

son effet radioprotecteur. En effet, sa concentration intracellulaire n‟est pas suffisante pour

permettre l‟élimination de tous les radicaux hydroxyles OH. hautement réactifs produits par

l‟irradiation, suggérant que d‟autres modes d‟action doivent intervenir. Une hypothèse

avancée par Brown serait que, à certaines doses, la cystéamine pourrait, par exemple,

inhiber la prolifération cellulaire, protégeant ainsi les cellules en limitant la propagation des

dommages sur les molécules d‟ADN et en augmentant la fidélité de réparation de l‟ADN

(Brown, 1967). Il a été montré que la cystéamine peut également accroitre la production de

glutathion (GSH) en augmentant la concentration intracellulaire d‟un de ses précurseurs; la

cystéine. La cystéamine extracellulaire se combine à la cystéine pour former un disulfure

mixte cystéine/cystéamine. Ce composé disulfure pénètre dans la cellule via le système de

transport « L », est réduit à l‟intérieur de la cellule et re-libère les deux thiols. La cystéine

est alors utilisée pour la synthèse du GSH (Meier and Issels, 1995), le cofacteur des GPX et

GST qui protègent les cellules contre le peroxyde d‟hydrogène issu de l‟oxydation de la

cystéamine. De Matos et al. ont vérifié ces données dans des expériences de maturation

d‟oocytes in vitro: l‟addition de cystéamine (dose optimale : 200 μM) au milieu de culture

stimulait la synthèse de GSH intracellulaire. Cette augmentation en GSH était possiblement

57

due à une diminution des taux de peroxydes intracellulaires dans les oocytes; favorisant

ainsi le développement de l‟embryon, chez différentes espèces (de Matos et al., 2002;

Jeitner and Lawrence, 2001). D‟un point de vue clinique, la capacité de la cystamine à

majorer le système antioxydant de la GSH, permet de protéger le foie d‟une surdose

d‟acétaminophène, (Peterson and Brown, 1992; Prescott et al., 1976).

D‟autres applications thérapeutiques potentielles de la cystamine ont également été

étudiées. En effet, la cystamine ainsi que la cystéamine ont été reconnues pour leur activité

antivirale in vitro. Ces composés influenceraient négativement la réplication du virus de

l‟influenza A et de l‟hépatite A (Biziagos et al., 1987; Hamzehei and Ledinko, 1980), ainsi

que le virus de l‟immunodéficience humaine (VIH)-1 (Toohey, 2009). Cette activité anti-

réplicative de la cystamine pourrait être expliquée par sa capacité à lier l‟ADN. Ce lien

pourrait être important dans la condensation et stabilisation de la chromatine et pourrait

donc empêcher la réplication du virus mais également expliquer une partie de l‟effet

radioprotecteur observé par plusieurs auteurs. La cystamine (ainsi que la cystéamine), via

sa capacité à inhiber la transglutaminase 2 (Tgase 2) ou à inhiber les métalloprotéinases

matricielles (MMPs) pourrait également avoir un impact important pour contrecarrer le

développement de certains cancers (Caccamo et al., 2010; Fujisawa et al., 2012).

La cystéamine (10-90 mg/kg/jour, voie orale) est actuellement utilisée pour traiter la

cystinose néphropathique, une maladie métabolique héritée de façon autosomique et

caractérisée par l‟accumulation anormale de L-cystine libre dans le compartiment

lysosomial de la plupart des cellules de l‟organisme. Il a été montré que l‟accumulation

progressive de la cystine, due à un défaut de transport des lysosomes à la membrane, induit

la mort des cellules concernées, principalement dans le rein, créant une déficience rénale

sévère. L‟addition in vitro de cystéamine à des cultures de fibroblastes atteints ou

l‟administration in vivo à des patients atteints de cystinose a montré une réduction de la

cystine en cystéine soluble dans le lysosome des fibroblastes ou leucocytes. Dans ce

modèle, la cystéamine agirait comme un porteur d‟hydrogène entre le GSH réduit

cytoplasmique et la cystine intra lysosomiale (Gahl et al., 2002; Orloff et al., 1981).

58

1.4.3 Applicabilité de la cystamine pour le traitement des maladies

neurodégénératives

Plusieurs aspects communs ont été identifiés dans le déclin cognitif lié à l'âge et l'étiologie

de la MH, de Parkinson, d'Alzheimer et d'autre maladies neuropathiques du système

nerveux central (Droge and Schipper, 2007). Ceux-ci incluent le stress oxydatif, le

dysfonctionnement mitochondrial, l‟agrégation protéique et l‟apoptose. En raison de

possibles mécanismes sous-jacents communs à la progression de ces pathologies, la

cystamine/cystéamine apparait comme un agent cliniquement pertinent pour beaucoup de

maladies neurodégénératives. Ses propriétés thérapeutiques pouvant être attribuées de

prime abord à son pouvoir antioxydant et/ou à ses capacités à inhiber l‟activité d‟enzymes

telles les caspases et les Tgases. La cystamine (au même titre la cystéamine) a d‟ailleurs

déjà démontré son pouvoir neuroprotecteur dans des modèles animaux de la MH (Borrell-

Pages et al., 2006), une autre maladie neurodégénérative se traduisant par des troubles

moteurs.

En effet, comme nous l‟avons déjà précisé, l‟une des principales propriétés physiologiques

de la cystamine est sa capacité à inhiber l‟activité de l‟enzyme Tgase. Or, l‟enzyme Tgase-2

a été proposé comme un acteur important dans le mécanisme d‟agrégation protéique que

l‟on rencontre dans les maladies neurodégénératives. En effet la Tgase est une enzyme

thiol-dépendante qui catalyse la formation de liens -glutamyl isopeptide entre la

polyglutamine dérivée de la protéine huntingtine et des protéines contenant de la lysine

(Greenberg et al., 1991). Dans la MH, il y a mutation du gène chargé de la synthèse de la

protéine huntingtine causant alors l'agrégation de celle-ci. Le rôle pathologique de la Tgase

dans la MH est soutenu par les résultats obtenus à la suite de la délétion génétique de Tgase

chez des souris R6/2 qui entraîne des dysfonctions motrices et la mort (Bailey and Johnson,

2006; Mastroberardino et al., 2002). En inhibant la Tgase, la cystamine prévient la

formation d'agrégats protéiques -glutamyl-L-lysine insolubles (ou inclusions neuronales)

en compétitionnant avec la huntingtine pour le site actif de la Tgase et empêche ainsi

l'évolution de la maladie. Dans la MP, la protéine -synycléine est une des principales

composantes des inclusions neuronales. Le mécanisme proposé pour cette maladie est une

compétition entre la cystamine et la protéine -synucléine pour le site actif de la Tgase qui

59

empêcherait alors la formation d'inclusions neuronales et protégerait les neurones contre la

dégénérescence, tel que suggéré dans la MH (Wang et al., 2005).

Pour la MH, les effets bénéfiques de la cystamine ont été, en première instance, établi par

des études dans lesquelles le traitement était initié avant la phase symptomatique de la

maladie (Bailey and Johnson, 2006; Borrell-Pages et al., 2006; Dedeoglu et al., 2002; Fox

et al., 2004). Tout d‟abord, évaluée dans le modèle de souris transgénique R6/2, qui

développe un phénotype neurologique progressif semblable à celui de la MH humaine,

diverses doses et modes d'administration de cystamine (112, 224, 400 mg/kg/jour i.p. vs

225 mg/kg/jour p.o.) ont montré des effets bénéfiques sur la survie et les performances

motrices (Dedeoglu et al., 2002). La cystamine a également montré un effet

neuroprotecteur au niveau striatal et a permis une diminution des inclusions de huntingtine

en concomitance avec une réduction de l‟activité Tgase. Cependant, l‟utilisation de doses

plus élevées de cystamine (225 et 400 mg/kg) se sont avérées toxiques et mortelles chez ces

même souris (Dedeoglu et al., 2002). Un traitement chronique de cystamine (112

mg/kg/jour i.p.) administré avant la phase symptomatique de la maladie augmente aussi la

concentration cérébrale de la L-cystéine (Fox et al., 2004). Ces mêmes auteurs ont donc

formulé l‟hypothèse selon laquelle les effets de la cystamine incombent non seulement à sa

capacité d‟inhibiteur de la Tgase, mais aussi, en partie, à sa faculté d'agir comme

antioxydant. Dans cette optique, la cystamine a été également évalué dans le modèle

huntingtonien toxique à l‟acide 3-nitropropionique (3-NP), et, comme dans le modèle de

souris R6/2, a démontré un effet neuroprotecteur (Fox et al., 2004). Cette propriété

neuroprotectrice de la cystamine a été récemment confirmé tant in vitro qu'in vivo, en

révélant la participation dans ce processus bénéfique du NF-E2, un facteur de transcription

leucine zipper qui joue un rôle dans la protection des cellules contre les dommages

oxydatifs (Calkins et al., 2010). La cystamine et la cystéamine ont aussi prouvé leur

propriété neuroprotectrice dans le modèle de souris R6/1, via l'augmentation du BDNF et la

régulation indirecte de la protéine de choc thermique DnaJ-containing protein 1b (HSJ1b)

(Borrell-Pages et al., 2006).

Ce qui est particulièrement attrayant dans l'utilisation de la cystamine comme stratégie

60

thérapeutique, est sa capacité non seulement à prévenir la neurodégénérescence, mais aussi

à sauver des neurones déjà initiés dans le processus de dégénérescence chez des animaux

affectés par une mutation génétique huntingtonienne, comme observé dans le modèle

classique R6/2 (Dedeoglu et al., 2002; Fox et al., 2004; Karpuj et al., 2002b; Wang et al.,

2005) et les modèles de souris YAC128 (Van Raamsdonk et al., 2005). Karpuj et ses

collègues ont été les premier à dévoiler les effets bénéfiques d‟un traitement post-

symptomatique à la cystamine sur la survie et les performances motrices des souris R6/2

(Karpuj et al., 2002b). Dans une autre étude où le traitement était initié pendant la phase

symptomatique, la cystamine a renversé l'apparition d'inclusions cellulaires d'une façon

dose dépendante et a induit une neuroprotection/rescue sur les neurones striataux et

corticaux de souris huntigtoniennes, comme confirmé par imagerie PET et par des

approches histologiques (Wang et al., 2005). Enfin, chez les souris symptomatiques

YAC128, la cystamine a diminué la perte neuronale striatale, mais sans rétablir les

fonctions motrices (Van Raamsdonk et al., 2005).

La capacité de la cystamine et de la cystéamine à réduire la mort neuronale et améliorer les

symptômes de la MH dans divers modèles murins de la MH, a propulsé la cystéamine, déjà

approuvée par la FDA pour le traitement de la cystinose, vers un essai clinique pour des

patients huntingtoniens. Un essai préliminaire avec le cystéamine bitartrate

(CYSTAGON®) a récemment été conduit chez des patients souffrant de la MH afin

d‟établir une dose thérapeutique sécuritaire (Dubinsky and Gray, 2006). Neuf patients

huntingtoniens ont été recrutés dans cet essai clinique de phase I. Les sujets recevaient un

traitement de cystéamine de 10 mg/kg/jour avec, chaque semaine, une dose additionnelle de

10 mg/kg/jour jusqu‟à un maximum de 70 mg/kg ou lorsque des effets secondaires

indésirables survenaient (nausées ou désordres moteurs). Cet essai a conclu qu‟une dose de

20 mg/kg/jour de cystéamine est tolérable chez les personnes souffrant de la MH

(Dubinsky and Gray, 2006). Le travail de Borrell-Pages et et al. suggère d‟utiliser les

niveaux de BDNF comme biomarqueur pour quantifier l‟efficacité de la cystéamine chez

les patients huntingtoniens (Borrell-Pages et al., 2006). Récemment, Raptor Pharmaceutical

Corp. a initié une collaboration avec le Centre Hospitalier Universitaire (CHU) d‟Angers en

France pour supporter une étude clinique de phase II avec une forme exclusive de bitartrate

61

de cystéamine à action retardée: le DR Cystéamine. Les chercheurs cliniques du CHU

d‟Angers, en collaboration avec l‟Institue Curie à Paris, ont élaboré un protocole visant

l‟investigation de l‟efficacité de cette nouvelle formulation de cystéamine. Le BDNF sera

dans ce cas utilisé comme marqueur d‟efficacité. L'essai clinique de phase 2 recrutera 96

patients pour une étude de 18 mois contrôlée contre placebo. Celle-ci sera suivie par une

étude de prolongation ouverte, dans laquelle tous les patients du groupe placebo passeront à

DR Cystéamine et tous les autres patients poursuivront DR Cystéamine durant un

maximum de 18 mois supplémentaires. Après l‟essai clinique de phase I conduit par

Dubinsky et Gray, essai limité à l‟étude de la tolérance du produit, l‟étude plus élaborée de

phase II proposée par Raptor Pharmaceutical Corp. sera primordiale pour déterminer le réel

potentiel clinique de la cystéamine pour la MH.

En 2006, notre laboratoire mettait pour la première fois en exergue l‟activité

neuroprotectrice de la cystamine chez des souris parkinsoniennes âgées (16 mois). Cette

étude a montré qu‟un pré-traitement d'une faible dose de cystamine (10 mg/kg/jour) permet

de protéger, de façon significative, le système dopaminergique de souris parkinsoniennes

générées par la toxine MPTP (Tremblay et al., 2006). A cette époque, les mécanismes

d‟action impliqués dans l‟effet thérapeutique de la cystamine dans le contexte de la MP

étaient encore inexplorés.

62

1.5 Thématique de recherche

Tel que présenté ci-haut, lors de l‟initiation de mon doctorat, les connaissances sur l'effet de

la cystamine dans le contexte de la MP ne se limitaient qu‟à une seule étude menée dans

notre laboratoire. Mon projet visait donc à approfondir cet aspect en déterminant la nature

du potentiel thérapeutique de la cystamine dans des modèles animaux de la MP.

L‟ensemble de nos études s‟inscrit dans une démarche de recherche translationnelle menée

depuis plusieurs années au laboratoire avec pour but de transposer la compréhension des

données expérimentales concernant les propriétés intrinsèques de la cystamine en stratégies

thérapeutiques pour les patients parkinsoniens.

63

1.6 Hypothèse et objectifs

Nos études s‟inscrivent dans l‟hypothèse générale selon laquelle la cystamine est bénéfique

dans le contexte de la MP.

Mon projet de doctorat comptait 3 objectifs spécifiques afin de répondre à notre hypothèse

générale:

1- Confirmer les propriétés neuroprotectrices de la cystamine chez des souris

parkinsoniennes induites par la toxine MPTP et disséquer les mécanismes qui sous-tendent

ses effets tout en déterminant sa dose optimale d‟efficacité (chapitre II).

2- Investiguer les propriétés de la cystamine au-delà de la neuroprotection (e.g. capacités

de neurorescue et recouvrement de déficits comportementaux) dans deux modèles toxiques

de la MP. De plus, élucider les mécanismes d‟action contributoires aux effets observés

(Chapitre III).

3- Identifier les molécules intermédiaires impliquées dans l‟action de la cystamine et

démontrer leur transport au cerveau (Chapitre IV).

65

2 Chapitre II. Cystamine prevents MPTP-induced

toxicity in young adult mice via the up-regulation of

brain-derived neurotrophic factor

Auteurs : Claire Gibrat

1, Mélanie Bousquet

1, Martine Saint-Pierre

1, Daniel Lévesque

2,

Frédéric Calon1,3

, Claude Rouillard1,4

, Francesca Cicchetti1,4*

Affiliations :

1Centre de Recherche du CHUL (CHUQ), Axe Neurosciences, Québec, Québec, Canada

2Département de Pharmacie, Université de Montréal, Montréal, QC, Canada

3Faculté de Pharmacie, Université Laval, Québec, Québec, Canada

4Département de Psychiatrie et Neurosciences, Université Laval, Québec, Québec, Canada

66

2.1 Résumé

Des données précliniques suggèrent la cystamine comme un agent neuroprotecteur

prometteur contre les maladies de Huntington et de Parkinson. Afin de disséquer les

mécanismes d'action de la cystamine, nous avons étudié les effets de diverses doses de

cystamine (10, 50 et 200 mg/kg), en relation avec le temps d‟administration, sur la

régulation de l‟expression cérébrale de l‟ARNm du brain-derived neurotrophic factor

(BDNF), de son récepteur la tropomyosine kinase B (TrkB) et de la protéine de choc

thermique 70 (Hsp70). Nous avons déterminé que la plus faible dose de cystamine est la

plus efficace pour promouvoir de potentiels effets neuroprotecteurs. En effet, une

administration aiguë de 10 mg/kg de cystamine a augmenté l'expression de l'ARNm du

BDNF dans la substantia nigra compacta (SNc), bien qu'elle n'ait pas influencé

significativement l‟ARNm de TrkB ou de Hsp70. Des doses plus élevées de cystamine ont

entraîné l'absence d'activation de l'un de ces marqueurs ou conduit à des effets non

spécifiques. Nous avons également confirmé l'effet neuroprotecteur d'un traitement de 10

mg/kg/jour pendant 21 jours de cystamine chez la souris parkinsonienne. Dans ces

conditions, la cystamine a contré l‟effet délétère du MPTP illustré par une diminution de

densité des fibres striatales exprimant la tyrosine hydroxylase, une perte de cellules

dopaminergiques et de l‟expression de l'ARNm Nurr1 dans la SNc. L'action

neuroprotectrice de la cystamine chez les mêmes animaux était associée à une régulation du

BDNF dans la SNc. Pris ensemble, ces résultats renforcent le potentiel neuroprotecteur de

la cystamine dans le traitement de la maladie de Parkinson et pointent le BDNF comme un

mécanisme d'action important.

67

2.2 Abstract

Preclinical data suggest that cystamine stands as a promising neuroprotective agent against

Huntington's and Parkinson's diseases. To decipher the mechanisms of action of cystamine,

we investigated the effects of various doses of cystamine (10, 50, and 200 mg/kg) on the

regulation of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF), its receptor tropomyosin-

receptor-kinase B (TrkB) and on the heat shock protein 70 (Hsp70) brain mRNA

expression in relation to the time after administration. We have determined that the lower

cystamine dose is the most efficient to promote putative neuroprotective effects. Indeed, an

acute administration of 10 mg/kg of cystamine increased the expression of BDNF mRNA

in the substantia nigra compacta (SNc), although it did not significantly influence TrkB or

Hsp70 mRNA. Higher cystamine doses resulted in the absence of activation of any of these

markers or led to non-specific effects. We have also substantiated the neuroprotective effect

of a 21-day treatment of 10 mg/kg/day of cystamine in young adult mice against MPTP-

induced loss of tyrosine hydroxylase-striatal fiber density, nigral dopamine cells and nigral

Nurr1 mRNA expression. The neuroprotective action of cystamine in the same animals was

associated with an up-regulation of BDNF in the SNc. Taken together, these results

strengthen the neuroprotective potential of cystamine in the treatment of Parkinson's

disease and point towards the up-regulation of BDNF as an important mechanism of action.

68

2.3 Contributions

La conceptualisation, l'élaboration et la demande de financement du projet ont été

effectuées via la collaboration de Dre Cicchetti et Dr Claude Rouillard. Étudiante à la

maîtrise, j'ai, en 2006, pris la tête du projet en débutant l'administration du traitement

MPTP avec la collaboration de Martine Saint-Pierre, assistante de recherche dans le

laboratoire de Dre Cicchetti avec qui j'ai aussi procédé aux soins puis aux perfusions des

animaux. Par la suite, j'ai exécuté la majorité des expérimentations, coupe des cerveaux

(microtome et cryostat), immunohistochimie TH et décompte cellulaire en double insu avec

Martine Saint-Pierre et Mélanie Bousquet (étudiante à la maîtrise), hybridation in situ des

marqueurs Nurrl, Hsp70, Trk-B, BDNF et mesures de densitométrie. Toutes les sondes

utilisées ont été produites par le Dr Lévesque. Finalement, j'ai fait les statistiques en

collaboration avec Dr Rouillard, j'ai effectué le montage des figures et écrit la première

version de l'article qui a ensuite été corrigée et améliorée par Dre Cicchetti.

69

2.4 Introduction

Cysteamine, a by-product of cystamine, is a promising candidate agent currently

undergoing clinical testing for the treatment of Huntington's disease (HD) in humans

(Dubinsky and Gray, 2006). The initiation of this trial was based largely on the findings

that transgenic HD mice treated with cystamine show weight gain, increased longevity and

are characterized by the absence of HD pathology (Karpuj et al., 2002). From a mechanistic

perspective, the therapeutic effects of cystamine were first suggested to occur via the

transglutaminase (TGase) inhibition (Dedeoglu et al., 2002). Cystamine and cysteamine,

the reduced form of cystamine, have also been found to be neuroprotective in the R6/1

mouse model of the disease by increasing brain-derived neurotrophic factor (BDNF),

indirectly via the up-regulation of the heat shock DnaJ-containing protein 1b (HSJ1b)

(Borrell-Pages et al., 2006). Transcripts of the general heat shock protein (Hsp), Dnaj, have

also shown elevation upon cystamine treatment (Karpuj et al., 2002).

Other experiments carried out in either neurodegenerative or in various forms of cognitive

disorders, strongly suggest that cystamine may act by different and complementary

mechanisms of action, some of them converging towards BDNF, a crucial factor for

neuronal maintenance and survival (Huang and Reichardt, 2001; Lu et al., 2005a;

Sofroniew and Vinters, 2010). Interestingly, antidepressant-like effects of cysteamine were

found to act by means of increased BDNF hippocampal levels (Shieh et al., 2008).

Moreover, Pillai et al. found that cystamine administered to mice via drinking water

increases BDNF protein levels in the frontal cortex for at least 7 days after treatment (Pillai

et al., 2008). They also demonstrated that the same cystamine treatment protects cortical

neurons against haloperidol-induced decrease of BDNF protein levels, glutathione and the

anti-apoptotic marker Bcl-xl. Among other potential mechanisms, up-regulation of Hsps

has been suggested to account for some of the therapeutic effects of cystamine in

neuropsychiatric conditions. More specifically, cerebral levels of Hsp70 and 27 have shown

a significant increase in a murine systemic lupus erythematosus model treated with

cystamine. Cystamine also induced a reduction of different components of mitochondrial

dependant apoptotic pathway, such as the caspase-3 and -9 activity, and the protein

expression of Bad and Apaf-1 in lupus pathology, that is largely characterized by

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278584609003911#ref_bib11







70

neuropsychiatric and neurologic impairments (Hsu et al., 2008).

Recently, our group provided the first evidence that cystamine also displays

neuroprotective effects in a parkinsonian mouse model generated by a subacute treatment

of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) in aged mice (Tremblay et al.,

2006 and Gibrat et al., 2007). Although a recent study proposed that cystamine's

neuroprotective effects in MPTP-treated mice occurred through the decrease of oxidative

stress and the prevention of mitochondrial impairment (Stack et al., 2008), the mechanisms

involved in the neuroprotective role of cystamine in Parkinson's disease (PD) remain

largely unexplored. Here, we studied the doseŔresponse profile of cystamine on the mRNA

expression of the neurotrophic factor BDNF, its receptor tropomyosin-receptor-kinase B

(TrkB) and Hsp70 in various brain structures associated to PD pathology. We subsequently

examined the neuroprotective action of cystamine in young adult mice treated with MPTP,

and investigated the identified mechanisms of action via single doses on various

components of the DAergic system.






71

2.5 Materials and methods

2.5.1 Animals

Young adult (2-month old, 25 grams) male C57BL/6 mice were purchased from Charles

River Laboratories (Montréal, QC, Canada). Animals were housed 4 per cage under

standard conditions with free access to food and water, randomized and handled under the

same conditions by one investigator. All experiments were performed in accordance with

the Canadian Council on Animal Care and were approved by the Institutional Committee of

the Centre Hospitalier de l'Université Laval (CHUL). Throughout the experiment, the

health status of all mice included in the study was closely monitored for weight loss or

other signs of health-related issues. All efforts were made to minimize animal pain and

discomfort. This study was divided into 2 distinct experiments.

2.5.2 Experiment no. 1. Cystamine dose–response studies

To clearly identify the potential mechanisms of action of cystamine as well as the most

efficient dose, a single i.p. injection of cystamine was administered to normal C57BL/6

male mice using three different doses: 10, 50, and 200 mg/kg which were ultimately

compared to saline injections. Cystamine was dissolved in sterile saline (0.9%) and injected

1, 3, 12, 24 and 48 h before sacrifice. A total of 200 mice were assigned to this study (n =

10 per group).

2.5.3 Experiment no. 2. Neuroprotective effects of cystamine in young adult MPTP-

treated mice

The second experimental protocol aimed to demonstrate the neuroprotective effects of

cystamine in young MPTP-treated mice and investigate its mechanisms of action. Two-

month old C57BL/6 male mice assigned to this protocol received 7 i.p. injections, twice on

the first 2 days of the experimental protocol at an interval of 12 h and once a day on 3

subsequent days, of either saline 0.9% or MPTP-HCl (20 mg/kg free base; Sigma, St.

Louis, MO) dissolved in saline 0.9% prepared fresh (Tremblay et al., 2006 and Gibrat et al.,

2007). In total, 40 mice (n = 20 MPTP and n = 20 saline) were used, monitored daily for

weight variation, and ultimately sacrificed 14 days after the last MPTP injection. The

MPTP regimen utilized in this study was selected to produce a mild DAergic denervation




72

suitable for neuroprotection study (Tremblay et al., 2006 ; Bousquet et al., 2008 and Gibrat

et al., 2009).

2.5.4 21-day chronic cystamine treatment

Neuroprotective effects of cystamine in young adult mice (cystamine dihydrochloride,

Sigma, St. Louis, MO) were evaluated with a dose of 10 mg/kg dissolved in sterile saline

0.9% and prepared fresh for daily i.p. injection 1 h before MPTP administration. The

choice of dose and regime of administration was based on our previous findings (Tremblay

et al., 2006). Cystamine treatment started 2 days prior, and lasted until 14 days after MPTP

lesion. Overall, group assignment was as followed: 1) saline treatment with saline lesion (n

= 10), 2) cystamine treatment with saline lesion (n = 10), 3) saline treatment with MPTP

lesion (n = 10) or, 4) cystamine treatment with MPTP lesion (n = 10). Two main

mechanisms of action were targeted for investigation: 1) the modulation of BDNF mRNA

and its receptor TrkB; and 2) the modulation of Hsp70 mRNA expression.

2.5.5 Post mortem histological evaluation

Animals were sacrificed under deep anesthesia with ketamine/xylazine (Vetalar, Bioniche,

Belleville, ON/Rompun, Bayer, Toronto, ON) and perfused according to two methods at

the completion of each experimental protocol in RNAse free conditions:

1) Intracardiac perfusion with RNAse free 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS). After

intracardiac perfusion, brains were collected, the two hemispheres were separated and

assigned to experiment 1. The left hemisphere was post-fixed in 4% paraformaldehyde

(PFA) for 48 h and transferred to 20% sucrose in 0.1 M PBS for cryoprotection. Coronal

brain sections of 25 µm thickness were cut onto a freezing microtome (Leica

Microsystems, Montreal, QC) and serially collected in anti-freeze solution (monophosphate

sodium monobasic 0.2 M, monophosphate sodium dibasic 0.2 M, ethylene glycol 30%,

glycerol 20%) and kept at − 20 °C until use. The left hemisphere sections were utilized for

additional immunohistochemistry and in situ hybridization protocols.

2) Intracardiac perfusion with RNAse free saline (0.9%) followed by 4% PFA, pH 7.4.

After intracardiac perfusion, brains were collected and post-fixed in 4% PFA for 24 h and







73

transferred to 20% sucrose in 0.1 M PBS for cryoprotection. Brains were cut into coronal

sections of 25 µm thickness. These sections were used for immunohistochemistry and in

situ hybridization required for the completion of experiment 2.

2.5.6 TH immunohistochemistry

For assessment of DAergic neuronal-loss, immunohistochemistry against the enzyme

tyrosine hydroxylase (TH) was performed as previously described (Tremblay et al., 2006

and Gibrat et al., 2009). Briefly, free-floating sections, after several washes and blocking

preincubation, were incubated overnight at 4 °C with a rabbit anti-TH (Pel-Freez, Rogers,

AR; 1:5000). Sections were then incubated for 1 h at room temperature (RT) in a solution

containing biotinylated goat anti-rabbit IgG (Vector Laboratories, Burlington, ON; 1:1500)

and subsequently placed in a solution containing avidinŔbiotin peroxidase complex (ABC

Elite kit; Vector Laboratories, Burlington, ON) for 1 h at RT. Finally, the reaction was

developed in 3,3′ diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) solution (Sigma, St. Louis,

MO) and 0.1% of 30% hydrogen peroxide (Sigma, St. Louis, MO) at RT. Other sections

were treated as above except that the primary antibody was omitted from the incubation

medium. These sections remained virtually free of immunostaining and served as negative

controls. Following the DAB reaction, sections were mounted on gelatin-coated slides and

counterstained with cresyl violet (Sigma, St. Louis, MO). All sections were finally air-

dried, dehydrated in ascending grades of ethanol, cleaned in xylene, and coverslipped with

DPX mounting media (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA).

2.5.7 In situ hybridization for Nurr1, BDNF, TrkB and Hsp70

A specific [35S]UTP-labeled complementary RNA (cRNA) probe was used to assess tissue

mRNA levels of Nurr1, a nuclear receptor associated with the DAergic system (Zetterstrom

et al., 1997). The cRNA probe for Nurr1 stems from a 403 bp (gene bank accession

number: 1504Ŕ1907 NM_013613) EcoRIŔBamHI fragment of a full-length mouse Nurr1

cDNA subcloned into pBluescript SK+ and linearized with XbaI. The cRNA probe for

TrkB stems from a 284 bp (2597Ŕ2880 NM_008745) EcoRIŔBamHI fragment of a full-

length mouse TrkB cDNA subcloned into pBluescript SK+ and linearized with XbaI. Both

cRNA probes were synthesized and labeled by using Promega riboprobe kit, [35S]UTP and




http://www.sciencedirect.com/science?_ob=RedirectURL&_method=externObjLink&_locator=ncbi-n&_issn=02785846&_origin=article&_zone=art_page&_plusSign=%2B&_targetURL=http%253A%252F%252Fwww.ncbi.nlm.nih.gov%252Fentrez%252Fquery.fcgi%253Fcmd%253Dsearch%2526db%253Dnucleotide%2526doptcmdl%253Dgenbank%2526term%253DNM_013613


74

the RNA polymerase T7. The cDNA of BDNF was subcloned into pCR 2.1 and linearized

with Xho and corresponded to a 284 bp (99Ŕ448 NM_007540). The cDNA of Hsp70 was

subcloned into pGEM-4Z and linearized with KpnI and corresponded to a 665 bp (1274Ŕ

1939 NM_010479). Both cRNA probes were synthesized and labeled by using Promega

riboprobe kit, [35S]UTP and the RNA polymerase SP6. Sense probes were also generated

for all of these markers and no specific signal was obtained (data not shown). Brain

sections were hybridized following the procedures described below and previously

published protocols (Beaudry et al., 2000 ; Cossette et al., 2004 and Lapointe et al., 2004).

Autoradiograms were developed following either a 72 h (Nurr1 and Hsp70), 4-day (TrkB)

or 9-day (BDNF) exposure.

All in situ protocols ultimately underwent the same preparation and were conducted in

RNAse free conditions. Slices were mounted onto Snowcoat X-tra™ slides (Surgipath,

Winnipeg, Canada) and stored under vacuum overnight before use. Brain sections were

fixed in 4% PFA pH 7.4 at RT for 20 min. Pre-treatment was made with various

consecutive baths (PBS 0.1 M twice 5 min, proteinase K 0.1 µg/ml 10 min at 37 °C,

acetylation bath (0.25% acetic anhydride, triethanolamine 0.1 M) 10 min, twice for 5 min

in standard saline citrate (SSC) (0.3 M NaCl, 30 mM sodium citrate)). Successive baths of

ethanol solutions (30%, 60%, 100%, and 100%; 3 min each) were performed for

dehydration. In situ hybridization of the riboprobes on tissue sections was performed at 58

°C overnight in a standard hybridization buffer (deionised formamide 50%, sodium

chloride 5 M, Tris 1 M, EDTA 0.5 M, Denhart's solution 50×, dextran sulfate 50%, tRNA

10 mg/ml, DTT 1 M, and 35S coupled 2 × 106 cpm/µl probe). Post-treatment was conducted

using different successive baths: SSC 4× (30 min), removing coverslips, SSC 2× twice (5

min), RNase A 20 µg/ml (1 h) at 37 °C, milliQ water twice (15 s), SSC 2× (15 min), SSC

0.5× (30 min) at 60 °C, SSC 0.1× (30 min) at 60 °C, and SSC 0.1× (5 min) at RT.

Repetitive baths of ethanol solutions (30%, 60%, 100%, and 100%; 3 min each) were used

for further dehydration. Tissue sections were then placed against BiomaxMR (Kodak, New

Haven, CT) radioactive sensitive films.







75

2.5.8 Densitometric quantification of TH immunostaining

Digitized brain images of the striatum were obtained with a CCD camera model XC-77

(Sony Electronics Inc, NY) equipped with a 60 mm f/2.8D magnification lens (Nikon

Canada Inc., Mississauga, ON). The density of striatal DAergic fibers was analyzed on a

MacIntosh computer using the ImageJ software (Image 10.2). The average labeling for each

area was calculated from 3 adjacent brain sections of the same animal (antero-posterior

levels: + 0.845, + 0.445 and + 0.020 mm of the Allen brain atlas (Lein et al., 2007 and

Allen, 2008). All rostro-caudal levels of analyses were comparable across animals. All

images were acquired at the same magnification (10×) to allow the visualization of the

entire striatum in a single field. Images converted to gray scale were then delineated and the

intensity of staining was assessed for the striatum which was further divided into four

distinct quadrants labeled as dorsomedial (DM), dorsolateral (DL), ventromedial (VM),

ventrolateral (VL). This quantification was performed in three striatal sections,

subsequently averaged for each animal (see Fig. 4 for illustration of the section levels

used). Background intensities taken from the corpus callosum devoid of TH staining were

subtracted from every measurement.

2.5.9 Densitometric measurements of Nurr1, BDNF, TrkB and Hsp70 mRNA levels

Levels of autoradiographic labeling were quantified by computerized densitometry.

Digitized brain images and their analyses were made with the same equipment as

mentioned above. Optical density of the autoradiograms was translated in µCi/g of tissue

using 14C radioactivity standards (ARC 146-14C standards, American Radiolabeled

Chemicals Inc., St. Louis, MO). Nurr1, BDNF, TrkB and Hsp70 mRNA levels were

measured in the substantia nigra compacta (SNc) using similar antero-posterior levels for

all sections. The average labeling for each SNc level was calculated from 3 adjacent brain

sections of the same mouse. Background intensities taken from white areas of the

substantia nigra reticulata (SNr) devoid of Nurr1, BDNF, TrkB and Hsp70 mRNA levels

were subtracted from every measurement. TrkB, BDNF and Hsp70 mRNA levels were also

measured in the motor cortex from 3 adjacent brain sections of the same animal (antero-

posterior levels: + 0.845, + 0.445 and + 0.020 mm of the Allen brain atlas (Lein et al., 2007

and Allen, 2008). In addition, TrkB mRNA levels were measured in the striatum using the



http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0278584609003911#ref_fig4




76

same approach as described above. Minimal BDNF and Hsp70 striatal mRNA expression

in the animals comprised in this study precluded the quantification of these markers.

2.5.10 Stereological quantification of TH-immunoreactive neurons

The loss of DAergic neurons was determined by stereological counts of TH-

immunoreactive cells (identifiable somas) under bright-field illumination. Every 10th

section through the SNc was analyzed using Stereo investigator software (MicroBrightfield,

Colchester, VT, USA) attached to an E800 Nikon microscope (Nikon Canada Inc.,

Mississauga, ON, Canada). After delineation of the SNc at low magnification (4×

objective), a point grid was overlaid onto each section. For the most rostral level of SNc

analyzed (bregma − 3.08 mm), the SNc was delineated by the visible boundaries with the

medial terminal nucleus. For the intermediate (bregma − 3.28 mm) and most caudal levels

of SNc analyzed (bregma − 3.58 mm), the structure was demarcated by the exit of the 3rd

cranial nerve. Immunostained cells were counted by the optical fractionator method at

higher magnification (20× objective). The counting variables were as follows: distance

between counting frames (150 µm × 150 µm), counting frame size (75 µm) and guard zone

thickness (1 µm). Cells were counted only if they did not intersect forbidden lines. The

optical fractionator (Glaser and Glaser, 2000) method was used to count TH-positive (TH-

and cresyl violet-positive) and TH-negative (cresyl violet-positive only) expressing cells.

Stereological cell counts were performed blindly by two independent investigators. Note

that the analyses of the TH-immunoreactive profiles were restricted to the SNc and thus

excluded the ventral tegmental area (VTA).

2.5.11 Statistical analyses and image preparation

All analyses are expressed as group mean ± S.E.M. Data related to experiment no. 1 were

assessed by two-way ANOVA. When the two-way ANOVA yielded non-significant

interaction terms the data were further analyzed for significance using one-way ANOVA

for each time point incorporating all concentrations, followed by the Tukey post-hoc

multiple comparison test using GraphPad Prism 4.0. In experiment no. 1, data were

expressed in percentage of control. For each time point, the control group refers to the 0

mg/kg group. Data pertaining to experiment no. 2 were assessed by two-way ANOVA


77

followed by the Tukey post-hoc multiple comparison tests. In all cases, a p value of less

than 0.05 was considered to be significant. Photomicrographs were taken by Picture Frame

software (Microbrightfield) attached to a E800 Nikon microscope (Nikon Instruments,

Toronto, ON). Images were finalized for illustration using Adobe Photoshop CS3.

78

2.6 Results

2.6.1 Health-related effects of cystamine treatments and MPTP lesion

Throughout all cystamine and MPTP treatments and up to the time of sacrifice, no deaths

were reported and all mice displayed good health except in the protocol pertaining to the

doseŔresponse of cystamine, for the 200 mg/kg cystamine group exclusively. Mice that

received 200 mg/kg of cystamine displayed signs of hypothermia (shivering) and

drowsiness (closing of the eyes) for a period of approximately 2 h. Overall, the weight

curves between control and MPTP groups were not significantly different on any given day

(data not shown).

Two distinct protocols of either various single doses of cystamine given to naive mice or a

21-day chronic cystamine treatment administered to MPTP-lesioned mice were undertaken.

The goal was to determine: 1) the mechanisms of action for the neuroprotective properties

of cystamine and 2) the optimal dose of cystamine needed to obtain neuroprotection in an

animal model of PD.

2.6.2 Up-regulation of BDNF as a mechanism of action for the neuroprotective

effects of cystamine

The mechanisms underlying the neuroprotective effects of cystamine were primarily

investigated via BDNF growth factor mRNA expression and the modulation of its receptor

TrkB.

When given to normal mice via a single administration of 10 mg/kg, cystamine induced a

BDNF mRNA increase at 24 h and 48 h post-injection in the SNc (Fig. 2-1a; p < 0.05).

This phenomenon was observable at earlier time points (1 h and 3 h post-injection) for the

200 mg/kg cystamine dose (Fig. 2-1a; 1 h: p < 0.05; 3 h: p < 0.001). No significant

variation of the motor cortical BDNF mRNA expression was observed for 10 mg/kg,

however the 200 mg/kg cystamine dose significantly increased BDNF mRNA levels at 1 h

and 3 h post-injection (Fig. 2-1c; 1 h: p < 0.001; 3 h: p < 0.01). Of note, the 50 mg/kg

cystamine single dose did not induce any significant changes. In the 21-day cystamine

treatment experiment, the MPTP or cystamine treatment alone had no significant effect on




79

BDNF mRNA levels as compared to the saline groups (Fig. 2-1b, d). Cystamine injections,

given concurrently with MPTP, increased BDNF expression significantly in the SNc

compared to the MPTP group treated with saline (Fig. 2-1b; p < 0.05). Cortical expression

of BDNF mRNA was not affected in this context (Fig. 2-1d).

TrkB mRNA levels were increased in the SNc by a single 200 mg/kg of cystamine in the

first hour post-injection (Fig. 2-2c; p < 0.001). This phenomenon appeared in the motor

cortex and the striatum, and slightly later than in the SNc, that is within the first 12 h post-

injection with a maximum peak at 3 h (Fig. 2-2a, e; p < 0.001). The smaller single

cystamine doses (10 or 50 mg/kg) were not sufficient to induce TrkB mRNA variation in

any of the structures analyzed (Fig. 2-2). When investigating the response of TrkB to 21-

day cystamine treatment in the context of MPTP lesion, we observed no significant

differences in striatal, nigral or cortical TrkB mRNA levels among any groups in spite of an

increased tendency for the salineŔcystamine treated animals (Fig. 2-2b, d, f).

2.6.3 Lack of evidence for the implication for Hsp70 in cystamine's neuroprotective

effects

A second putative mechanism of action for cystamine's neuroprotection was investigated

via the expression of Hsp70 mRNA. We observed that neither a single dose of cystamine in

normal mice (10, 50 or 200 mg/kg) nor the 21-day chronic treatment with daily doses of 10

mg/kg of cystamine in the MPTP mouse model of PD had a significant effect on Hsp70

mRNA levels in the SNc or in the motor cortex as compared to saline groups (Fig. 2-3aŔd).

Unexpectedly, we observed a significant difference in nigral Hsp70 mRNA expression

between saline and MPTP-lesioned mice treated with cystamine (Fig. 2-3b; p < 0.05).

2.6.4 The effects of cystamine on the DAergic system

A single injection of cystamine induced a transient increase of TH striatal expression

(Fig. 2-4a) only at the 10 and the 200 mg/kg doses tested. A single injection of 10 mg/kg of

cystamine induced an increase of TH expression that was only significant in the DL (p <

0.05), VM (p < 0.01) and VL (p < 0.05) striatum in the first hour post-injection. This

increase was followed by a vacillating TH expression over time. For the 200 mg/kg dose,

we observed a significant increase (p < 0.05) of TH immunostaining in the first hour post-











80

injection in the entire striatum and within the first 3 h post-injection for the DL and VM

striatum. A single injection of 10 mg/kg of cystamine also induced a transient up-regulation

of Nurr1 in the SNc 1 h post-injection while the 50 mg/kg dose significantly down-

regulated Nurr1 3 h post-injection (Fig. 2-5b; p < 0.05). This is the only time point where

the 50 mg/kg dose had any effect.

2.6.5 Dose–response profile of cystamine

The use of three distinct doses of cystamine administered to naive mice also allowed to

identify the optimal dosing capable of inducing neuroprotective effects in a depleted

DAergic brain, as provided by the MPTP-injured mouse. Aside from a perceivable effect of

the 50 mg/kg dose on Nurr1 mRNA expression, this dose consistently failed to trigger any

changes of the markers measured. On the contrary, the highest dose of 200 mg/kg

precipitated some effects on almost all the markers evaluated and at early time points.

These effects were accompanied by observable health-related issues (shivering and

drowsiness). Finally, the 10 mg/kg dose, as previously reported (Tremblay et al., 2006),

induced beneficial effects of the DA system (see below).

2.6.6 Neuroprotective properties of cystamine in young adult mice treated with

MPTP

Subacute MPTP treatment in young adult mice caused a significant decrease in the density

of striatal TH-positive fibers (Fig. 2-4b; for medial striatum p < 0.01; for lateral striatum p

< 0.001). This treatment concurrently induced nigral cell loss, as documented by a

significant decrease in the number of TH-positive neurons with a concomitant loss of cresyl

violet stained SNc neurons, consistent with a degeneration of DAergic neurons, as opposed

to a down-regulation of TH expression (Fig. 2-5a; p < 0.001). This was accompanied by a

significant decrease in nigral Nurr1 mRNA levels in the SNc (Fig. 2-5c; p < 0.001).

Consistent with the data pertaining to a single dose of cystamine in naive animals,

administration of 10 mg/kg/day of cystamine before, during and following the MPTP

lesioning procedure (total of 21 days) in young adult mice revealed an increase in the

density of striatal TH fibers as compared to MPTP animals not treated with cystamine

(Fig. 2-4b). Indeed, the MPTP group treated with cystamine was not significantly different







81

from the control group (saline/saline) for any of the striatal quadrants quantified but was

significantly different from the MPTP group treated with saline in the lateral striatum

(Fig. 2-4b; for VL p < 0.01; for DL p < 0.001). Note that similar to the one injection of 10

mg/kg of cystamine, the 21-day cystamine treatment in saline-injected mice also induced an

increase in TH striatal expression as compared with the control group. This increase was

only significant in the dorsal striatum (Fig. 2-4b; for DM p < 0.05; for DL p < 0.01). Post

mortem analyses also revealed normalization of TH cell counts and Nurr1 mRNA levels in

the SNc of MPTP-lesioned mice treated with cystamine at a dose of 10 mg/kg (Fig. 2-5a,

c). Overall, evaluation of these specific markers of the DAergic system yielded similar

patterns and underlined the beneficial effects of cystamine in 2-month old MPTP mice.

Importantly, the neuroprotective effects of cystamine in young adult mice were more

prominent and showed less variability among individual animals than previously observed

in 16-month old mice (Tremblay et al., 2006).





82

2.7 Discussion

The molecule cystamine has recently been recognized for its therapeutic potential in HD

(Dubinsky and Gray, 2006). In the present study, we established that cystamine exerts

neuroprotective effects on the DAergic system in a murine model of PD via an up-

regulation of BDNF mRNA levels in structures related to parkinsonism, without any effect

on the mRNA of its high affinity receptor TrkB. Other mechanisms investigated, such as

the modulation of the mRNA for Hsp70, did not provide sufficient evidence to suggest the

implication of this pathway in the neuroprotection observed with cystamine in the MPTP

subacute animal model of PD utilized here.

Several studies have demonstrated the specific role for BDNF in neuronal degeneration

observed in PD (for review, see (Fumagalli et al., 2006)). Among current evidence, it is

known that DAergic neurons from the ventral midbrain express BDNF (Seroogy et al.,

1994), a trophic factor required for the establishment of the proper number of SN DAergic

neurons (Baquet et al., 2005). Notably, partial deletion of TrkB leads to a reduced number

of DAergic neurons, a diminished expression of TH and a marked formation of α-synuclein

deposits in older mice (von Bohlen und Halbach et al., 2005). The role of BDNF is

substantiated by the fact that cell-mediated delivery of BDNF also augments DA levels in

the MPP+ rat model of PD (Galpern et al., 1996). One of the key advancement in

understanding the neuroprotective role of cystamine has been the recent demonstration that

this molecule reduces neuronal death and improves HD symptoms in a mouse model of the

disease by increasing brain levels of BDNF, via an increase expression of HSJ1b (Borrell-

Pages et al., 2006).

Our strategy to introduce normal mice to various single doses of cystamine allowed to more

specifically dissect the mechanisms of action of cystamine. When administered via a single

injection of 10 mg/kg, cystamine led to a significant nigral BDNF up-regulation at 24 h and

48 h following the administration. This observation is concordant with the cystamine-

induced increase of BDNF protein levels previously reported in neuronal cells transfected

with an abnormal CAG expansion (Borrell-Pages et al., 2006), in the brain of R6/1 murine

HD model (Borrell-Pages et al., 2006) as well as in the frontal cortex of normal mice







83

treated with cystamine (Pillai et al., 2008). The significant increase in BDNF mRNA levels

quantified in our study did not coincide with an up-regulation of TrkB mRNA expression at

either of the lower doses of cystamine tested (10 mg/kg and 50 mg/kg). In accordance,

Pillai et al. (2008) have previously shown that the increased BDNF protein levels in the

cortex and striatum following cystamine treatment matched an increase in TrkB

phosphorylation but not TrkB protein levels. In our study, nigral and cortical BDNF mRNA

up-regulation were also observed within the first 3 h following the 200 mg/kg cystamine,

and an up-regulation of TrkB mRNA expression in the striatum, the SNc and the motor

cortex at 2 h. The rapid and numerous effects seen at a dose of 200 mg/kg combined with

the side effects induced by this dose in animals, lead us to suspect that 200 mg/kg of

cystamine may have generated non-specific effects.

In the 21-day cystamine treatment, a subacute MPTP intoxication protocol was used to

induce parkinsonism in 2-month old mice. The MPTP regimen and age of mice were

specifically chosen for this experiment. The mild (around 30%), yet irreversible and

significant (p < 0.001) DAergic cell loss induced by this MPTP treatment is reminiscent of

early PD and especially suited to investigate neuroprotective strategies. The 2-month old

C57BL/6 mouse is often the animal of choice to generate parkinsonism (Nass and

Przedborski, 2008). In this study paradigm, we observed an increase in the expression of

BDNF in the SNc only when cystamine was given to MPTP-treated animals while

cystamine treatment alone had no effect. Moreover, a chronic 21-day administration of 10

mg/kg of cystamine in saline-treated animals did not induce a significant change in the

expression of BDNF in contrast to a single injection. Our observations show that the BDNF

expression was increased 24 to 48 h following the injection of 10 mg/kg of cystamine as

well as after the sacrifice of MPTP-treated animal exposed to 21-day chronic cystamine

administration. Perhaps, the first doses of cystamine are responsible for activating a

transient BDNF mRNA up-regulation and, once this neuroprotective cascade has been

initiated, the consecutive injections of cystamine are no longer effective to modulate BDNF

expression. The chronic cystamine treatment in concomitance with a MPTP insult probably

induced a more prolonged up-regulation of BDNF mRNA levels in the SNc to compensate

from those generated by the MPTP treatment alone.



84

Based on evidence from the literature, we tackled the possibilities that Hsps' are also part of

the underlying mechanisms of the neuroprotective actions of cystamine and that they may

sustain a potential relationship to growth factor expression observed in this study as well.

Hsps are small proteins which belong to a sub-family of stress-induced proteins thought to

be involved in protective strategies rendering cells more resistant to lethal levels of a range

of toxic insults (for review, see Rokutan et al., 1998). Several studies have suggested that

various Hsps might protect against DAergic-related neurotoxins. For example, it has

recently been reported that Hsp70 gene transfer by adeno-associated virus inhibits MPTP-

induced nigrostriatal degeneration in a mouse model of PD (Dong et al., 2005). Transcripts

of the Hsps Dnaj have been shown to be elevated upon cystamine treatment (Karpuj et al.,

2002). Hsps Dnaj and more specifically HSJ1b are also known to stimulate the BDNF

release (Borrell-Pages et al., 2006). We report that in spite of the cystamine-dependant up-

regulation of BDNF, there is no up-regulation of Hsp70 mRNA in the SNc and motor

cortex even for the highest 200 mg/kg dose of cystamine utilized. This finding corroborates

the non-detectable cerebral variation in Hsp70 protein in normal mice treated with 10 mM

cystamine daily during 14 days (Hsu et al., 2008).

The effects of different doses of cystamine on the DAergic system were also investigated.

We detected a rapid and significant increase of TH striatal expression and the up-regulation

of Nurr1 mRNA levels following the administration of the lower dose of cystamine.

Interestingly, it has recently been suggested that Nurr1 regulates TH and BDNF expression

in DAergic neurons and that BDNF gene is a direct target of Nurr1 protein (Volpicelli et

al., 2007). Low-dose cystamine may have up-regulated Nurr1 mRNA and consecutively

BDNF expression to promote potential neuroprotective effects. However, the fluctuation of

TH striatal immunostaining in a 48 h period, consecutive to a single injection of 10 mg/kg

of cystamine, remains difficult to explain at this point. On the other hand, no significant TH

variation was observed following a single 50 mg/kg injection of cystamine while the same

dose induced a significant nigral down-regulation of Nurr1 at 3 h. In contrast, the 200

mg/kg cystamine injection did not affect nigral Nurr1 expression despite the fact that it

promoted a transient increase of TH, BDNF and TrkB at this dose. It is unclear at this

stage, whether these isolated events provoked by the 200 mg/kg cystamine dose correspond









85

to a true effect of cystamine on the DAergic system.

The first experiment of this study, pertaining to the doseŔresponse of cystamine in naive

animals, led to two important findings: 1) the identification of the potential mechanisms of

action of this molecule and 2) the establishment of the optimal dose of cystamine capable

of consistently promoting neuroprotective effects. Overall, the 10 mg/kg low dose was the

only dose showing the capacity to induce putative neuroprotective effects. Importantly, the

persistent absence of 50 mg/kg cystamine effects on any of the markers evaluated in this

study is probably at the origin of the non-protective property of this dose previously

reported by our group in aged mice (Tremblay et al., 2006). In contrast, the 200 mg/kg

cystamine promoted a transient increase of TH, BDNF and TrkB mRNA levels. The 200

mg/kg dose repeatedly elicited an effect on any of these markers, some of which could not

be observed in the context of the chronic cystamine treatment (e.g. TrkB). A likely

explanation is that all the observations collected with the 200 mg/kg cystamine dose reflect

non-specific responses, as the mice treated with this dose showed visible side effects,

including shivering which may be an indication of hypothermia. Of consideration,

hypothermia potentiates the increase in BDNF levels of hippocampal rat tissue and

phosphorylation of TrkB following brain ischemia (D'Cruz et al., 2002). Similarly to what

we observed with the 200 mg/kg cystamine dose in our study, the expression of TrkB

mRNA is enhanced and occurs concomitantly with the elevation of BDNF mRNA in the

hippocampus of hypothermic rats (Boris-Moller et al., 1998). It is clear that the 10 and 200

mg/kg doses had an effect and not the 50 mg/kg. This particular phenomenon has been

characterized by Vom Saal et al. (1997) as a Non-Monotonic DoseŔResponse Curve

(NMDRC). Some NMDRCs are shaped in inverted U's, with a greater response in

intermediate ranges. Others are shaped like U's with high responses at lower and higher

drug levels. These observations also suggested that low doses may actually have greater

impacts than high doses for a given response (vom Saal et al., 1997). Several examples of

NMDRCs have been reported. In the context of schizophrenia, for example, the atypical

antipsychotic clozapine exhibits a U shape doseŔresponse curve, reversing the

apomorphine-induced loss of prepulse inhibition at low but not at high doses (Swerdlow et

al., 1991). Both insecticides, chlorpyrifos and diazinon, display a non-monotonic doseŔ



86

effect relationship, with cognitive deficits evident at a low dose, reverted at higher dose

(Levin et al., 2002; Timofeeva et al., 2008). Our observation of U-shaped response of

cystamine in a PD animal model provides another example of such phenomenon.

In addition to the single dose study, the 10 mg/kg cystamine dose was administrated

chronically for 21 days in 2-month old MPTP-treated mice and led to the activation of the

same pathway solicited for one injection of 10 mg/kg cystamine in naive animals. Indeed,

BDNF mRNA levels increased in the SNc of MPTP-lesioned mice after a 10 mg/kg

cystamine chronic treatment. Furthermore, the cystamine treatment alone also increased the

TH expression in the striatum, more particularly in the dorsal part of this structure that is

mainly innervated by DAergic axons arising from the SNc. The TrkB and Hsp70 mRNA

levels were not influenced by this cystamine treatment. As demonstrated in a previous

study carried out in aged mice (Tremblay et al., 2006), we substantiate that low-dose

cystamine, given before, during and after a subacute treatment of MPTP for a total period

of 21 days, reestablishes TH striatal fiber density, TH nigral cell counts and nigral Nurr1

mRNA expression in young adult mice afflicted by pathological signs of early stage PD.

Taken together, cystamine is likely to promote neuroprotection via several routes including

by means of a decrease in oxidative stress and the prevention of mitochondrial impairment

as previously reported (Stack et al., 2008). The robust and consistent effect of cystamine on

BDNF expression reported here combined with data supporting a protective role of BDNF

in PD, strongly suggest that the induction of BDNF expression is an important mechanism

of action of cystamine. Independently of its putative mechanisms of action, cystamine

shows to be a promising candidate in the intervention of early PD.




87

2.8 Acknowledgments

This study was supported by the Fondation Canadienne pour l'innovation to Francesca

Cicchetti and the Canadian Institutes of Health Research to Francesca Cicchetti, Claude

Rouillard and Daniel Lévesque. Claire Gibrat was initially supported by studentships from

the Fonds de la recherche en santé du Québec and Natural Sciences and Engineering

Research Council of Canada and is now supported by a Frederick Banting and Charles

Best Canada Graduate Scholarship from the Canadian Institutes of Health Research.

Mélanie Bousquet was initially supported by a student scholarship from the Fonds de la

Recherche en Santé du Québec and subsequently by a Vanier Canada Graduate Scholarship

from the Canadian Institutes of Health Research.

88

2.9 Figures

Figure 2-1. Effects of cystamine on nigral and cortical BDNF mRNA levels

A single dose of saline or 10, 50 or 200 mg/kg of cystamine in normal adult mice sacrificed

at 1, 3, 12, 24 and 48 h post-injection revealed the effect of cystamine on BDNF mRNA

levels in the SNc (a) and motor cortex (c) as expressed in percentage of control, where the

control corresponds to the 0 mg/kg groups for each time point. BDNF mRNA levels were

significantly (p < 0.05) increased after the administration of 10 mg/kg of cystamine at 24

and 48 h post-injection in the SNc (a) and for 200 mg/kg dose at 1 h (p < 0.05) and 3 h

post-injection for both the SNc (p < 0.001, a) and motor cortex (1 h: p < 0.001; 3 h: p <

0.01, c). A 21-day cystamine treatment (10 mg/kg/day) significantly increased (p < 0.05)

nigral BDNF mRNA levels only following the MPTP lesion (see bar graph b) but did not

induce any significant change in the motor cortex (d). Low power photomicrographs that

accompany bar graphs illustrate the left side of the SNc and motor cortex of an animal

belonging to the saline/saline group portraying baseline levels of BDNF mRNA. The area

used for cortical quantification has been delineated in gray (d). These images are matched

to schematic frontal sections derived from the Allen brain atlas (Lein et al., 2007 and

Bregma 0.845 mm

ACB

STR

CTXm

STR

Gibrat et al. 2009

c) d)

Figure 1.

% o

f co

ntr

ol

in the motor cortex

Bregma -2.88 mm

b)

SNr

CTX

CA2

CA1

CA1

VTA

SNc

% o

f co

ntr

ol

Expression of BDNF mRNAin the substantia nigra

a)

Expression of BDNF mRNAin the motor cortex

0.00

0.06

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.07B

DN

F m

RN

A l

ev

els

(µC

i/g

of

tis

su

e)

Saline MPTP Saline MPTP

Saline Cystamine

BD

NF

mR

NA

lev

els

(S

Nc)

(µC

i/g

of

tis

su

e)

*

Expression of BDNF mRNAin the substantia nigra

0.00

0.02

0.01

0.04

0.03

0.05


Saline Cystamine

250

100

50

150

200

0

10 50 200

12

**

***

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

300

100

200

0

10 50 200

12

***

** *

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48 Hours

Cystamine

(mg/kg)

Hours

Cystamine

(mg/kg)

Expression of BDNF mRNA

89

Allen., 2008). Values are means ± S.E.M. Data were assessed by two-way ANOVA (no

significant interaction terms revealed) and subsequently analyzed for significance using

one-way ANOVA for each time point regrouping all concentrations and followed by the

Tukey post-hoc multiple comparison test. Significant difference with the control (0 mg/kg)

group * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001 (a and c). Data were assessed by two-

way ANOVA followed by the Tukey post-hoc multiple comparison test. * = p < 0.05 (b

and d). Abbreviations: SNc: substantia nigra compacta; SNr: substantia nigra reticulata;

VTA: ventral tegmental area; CA1, 2: Ammon's horn fields, hippocampus; STR: striatum;

CTXm: motor cortex; ACB: accumbens nucleus.

Figure 2-2. Effects of cystamine on striatal, nigral and cortical TrkB mRNA levels

Striatal TrkB mRNA levels were significantly increased at 3 h (p < 0.001) and 12 h (p <

0.01) following a single injection of cystamine at 200 mg/kg (a). Nigral TrkB mRNA levels

were significantly increased at 1 h (p < 0.001) post-injection only (c). Cortical TrkB mRNA

levels were increased at both 1 h (p < 0.001) and 3 h (p < 0.001) following the single

injection of 200 mg/kg of cystamine (e). A 21-day treatment of cystamine (10 mg/kg/day)

did not have any significant effect on striatal (b), nigral (d) and cortical (f) TrkB mRNA

levels compared with control groups, nor did the MPTP treatment. Low power

photomicrographs that accompany the bar graphs illustrate the left side of the striatum, SNc

and motor cortex of an animal belonging to the saline/saline group depicting baseline levels

of TrkB mRNA. These images are matched to schematic frontal section derived from the

Allen brain (Lein et al., 2007 and Allen., 2008). Values are means ± S.E.M. Data were

Bregma 0.845 mm

a) Expression of TrkB mRNA in the striatum

b)%

of

co

ntr

ol

200

100

0

10 50 200

121 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

***

**

Hours

Cystamine(mg/kg)

Figure 2.

0.0

0.4

0.5

0.6

0.1

0.2

0.3

0.7

Trk

B m

RN

A l

ev

els

(µC

i/g

of

tis

su

e)


Saline Cystamine

ACB

STR

e) Expression of TrkB mRNAin the motor cortex

0.00

0.75

0.50

0.25

1.00

1.25

Trk

B m

RN

A le

ve

ls(µ

Ci/

g o

f ti

ss

ue

)


Saline Cystamine

f)

Bregma 0.845 mm

ACB

STR

CTXm

% o

f co

ntr

ol

*

***

***

200

100

0

10 50 200

12 Hours1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

Cystamine(mg/kg)

CTX

CA1

CA2

CA1

SNc

SNrVTA

Bregma -2.88 mm

c) Expression of TrkB mRNAin the substantia nigra

Expression of TrkB mRNA in the striatum

Expression of TrkB mRNA in the motor cortex

Expression of TrkB mRNA in the substantia nigra

0.00

0.15

0.25

0.20

0.05

0.10

0.30

0.35

Trk

B m

RN

A le

ve

ls (

SN

c)

(µC

i/g

of

tis

su

e)


Saline Cystamine

% o

f co

ntr

ol

Hours

Cystamine(mg/kg)

200

100

0

10 50 200

12

***

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

d)

Gibrat et al. 2009

91

assessed by two-way ANOVA (no significant interaction terms revealed) and subsequently

analyzed for significance using one-way ANOVA for each time point regrouping all

concentrations and followed by the Tukey post-hoc multiple comparison test. Significant

difference with the control (0 mg/kg) group * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001

(a, c and e). Data were assessed by two-way ANOVA followed by the Tukey post-hoc

multiple comparison test (b, d and f). Abbreviations: SNc: substantia nigra compacta; SNr:

substantia nigra reticulata; VTA: ventral tegmental area; CA1, 2: Ammon's horn fields,

hippocampus; STR: striatum; CTXm: motor cortex; ACB: accumbens nucleus.

92

Figure 2-3. Effects of cystamine on nigral and cortical Hsp70 mRNA levels

Neither a single injection (10 mg/kg) nor the 21-day cystamine treatment induced

significant changes in nigral or cortical Hsp70 mRNA levels compared with control groups

(aŔd) in spite of a tendency for an increase in the cystamine/saline group (see bar graph b).

In fact, MPTP treatment did not affect nigral (b) or cortical (d) Hsp70 mRNA expression as

compared to the saline/saline group. Low power photomicrographs that accompany the bar

graphs illustrate the left side of the SNc and the motor cortex of an animal belonging to the

saline/saline group to illustrate basal levels of Hsp70 mRNA. These images are matched to

schematic frontal sections of the striatum/cortex and nigra derived from the Allen brain

atlas (Allen, 2008; Lein et al., 2007). Values are means ± S.E.M. Data were assessed by

two-way ANOVA (no significant interaction terms revealed) and subsequently analyzed for

significance using one-way ANOVA for each time point regrouping all concentrations and

followed by the Tukey post-hoc multiple comparison test (a and c). Data were assessed by

two-way ANOVA followed by the Tukey post-hoc multiple comparison test (b an d). ⁎ = p

< 0.05. Abbreviations: SNc: substantia nigra compacta; SNr: substantia nigra reticulata;

Hs

p7

0 m

RN

A le

ve

ls(µ

Ci/

g o

f ti

ss

ue)

Expression of Hsp70 mRNAin the motor cortex

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

c)

% o

f c

on

tro

l

Expression of Hsp70 mRNAin the motor cortex

Gibrat et al. 2009

Figure 3.

d)


Saline Cystamine

Bregma 0.845 mm

ACB

STR

CTXm

STR

Expression of Hsp70 mRNAin the substantia nigra

0.0

0.1

0.2

Hs

p70

mR

NA

lev

els

(S

Nc

)(µ

Ci/

g o

f ti

ssu

e)

Bregma -2.88 mm

a)

SNr

CTX

CA2

CA1

CA1

VTA

SNc

% o

f c

on

tro

lExpression of Hsp70 mRNA

in the substantia nigra

b)


Saline Cystamine

*

200

100

0

10 50 200

121 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

150

100

50

0

10 50 200

121 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48 Hours

Cystamine

(mg/kg)

Hours

Cystamine

(mg/kg)

93

VTA: ventral tegmental area; CA1, 2: Ammon's horn fields, hippocampus; STR: striatum;

CTXm: motor cortex; ACB: accumbens nucleus.

94

Figure 2-4. Effects of cystamine on TH striatal fibers

A single dose of saline or 10, 50 or 200 mg/kg of cystamine in normal adult mice sacrificed

at 1, 3, 12, 24, or 48 h post-injection revealed the effect of cystamine on TH striatal fibers

(a) as assessed by immunohistochemistry. Quantification was performed by dividing the

200

100

0

% o

f c

on

tro

l

10 50

TH striatal fibers (DM)

200

12

***

*

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

200

100

0

10 50

TH striatal fibers (DL)

200

12

*

*

*

*

Hours

Cystamine(mg/kg)

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

200

100

0

% o

f c

on

tro

l

10 50

TH striatal fibers (VM)

200

12

**

**

**

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

200

100

0

10 50

TH striatal fibers (VL)

200

12

*

*

**

Hours

Cystamine(mg/kg)

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

TH striatal fibers (DL)

0

20

10

30

40

50

60

*****

***

De

ns

ity

of

TH

str

iata

l fi

be

rs(O

D)

TH striatal fibers (DM)

0

40

50

60

10

20

30

70


Saline Cystamine

TH striatal fibers (VL)

0

30

40

10

20

50

60

70

***

*

TH striatal fibers (VM)

0

20

10

30

40

50

60

**

*

b)

a)

Figure 4.

Gibrat et al. 2009

Bregma 0.845 mm

Bregma 0.445 mm

Bregma 0.020 mm

ACB

STR

CTX

DL

VL

DM

VM

A

P

STR

STR

STR

*** **


Saline Cystamine


Saline Cystamine


Saline Cystamine

95

striatum into four distinct quadrants labeled as dorsomedial (DM), dorsolateral (DL),

ventromedial (VM), and ventrolateral (VL) (see schematic drawing bottom panel). All

measurements are expressed in percentage of control, where the control refers to the 0

mg/kg group for each time point. A single injection of cystamine induced a transient

increase of TH striatal expression only at the 10 and the 200 mg/kg doses tested (see bar

graph a). Post mortem histological evaluation revealed a significant decrease in TH striatal

fiber density in MPTP- as compared to saline-treated mice (see bar graph b). MPTP

animals treated for 21 days with a low dose of cystamine (10 mg/kg/day) demonstrate

comparable levels obtained for the saline/saline-treated animals (b) for the entire striatum

and demonstrated a significantly (p < 0.01) higher TH striatal density compared to MPTP

mice treated with saline in the lateral striatum. Animals treated with cystamine showed a

significantly (p < 0.01) higher TH striatal density compared to control mice (saline treated

with saline) in the dorsal striatum. Low power photomicrographs, which accompany the bar

graph (b), illustrate the left side of the striatum of an animal belonging to the saline/saline

group showing baseline density of TH fibers. This image is coupled to schematic frontal

sections of 3 levels (antero-posterior, AP) derived from the Allen brain atlas (Lein et al.,

2007 and Allen., 2008) corresponding to anatomical levels utilized for the striatal density

quantifications (see inset for sagittal localizations of each section throughout the brain).

Values are means ± S.E.M. Data were assessed by two-way ANOVA (no significant

interaction terms revealed) and subsequently analyzed for significance using one-way

ANOVA for each time point regrouping all concentrations and followed by the Tukey post-

hoc multiple comparison test. Significant difference with the control (0 mg/kg) group * = p

< 0.05; ** = p < 0.01 (a). Data were assessed by two-way ANOVA followed by the Tukey

post-hoc multiple comparison test * = p < 0.05; ** = p < 0.01; *** = p < 0.001 (b).

Abbreviations: A: anterior; P: posterior; OD: optical density; STR: striatum; CTX: cortex;

ACB: accumbens nucleus.

96

Figure 2-5. Effects of cystamine on nigral DAergic expression

Post mortem histological evaluation revealed a significant decrease (p < 0.001) in the

average number of nigral TH-positive cells (see bar graph a) and nigral Nurr1 mRNA

levels (see bar graph c) in MPTP- as compared to saline-treated mice. Lesioned animals

pre-treated with a low dose of cystamine (10 mg/kg/day) demonstrated a significantly

improved nigral TH cell number (a) as well as nigral Nurr1 mRNA levels (c) compared

with MPTP-lesioned mice alone, which were comparable to levels quantified in saline-

treated animals. Nurr1 mRNA levels were significantly (p < 0.05) increased after the

administration of 10 mg/kg of cystamine 1 h post-injection in the SNc and significantly

decreased (p < 0.05) for 50 mg/kg dose at 3 h post-injection (see bar graph b). Low power

photomicrographs that accompany each bar graph illustrate the left side of the SNc of an

animal belonging to the saline/saline group portraying baseline levels of double TH and

cresyl violet staining of the SNc (a) and nigral Nurr1 mRNA levels (c). These images are

coupled to schematic frontal sections of 3 levels (a) or a single level (c) of the SN derived

Hours

Cystamine

(mg/kg)

Gibrat et al. 2009

0

2500

5000

7500

***

Av

era

ge

nu

mb

er

of

TH

-po

sit

ive

ce

lls

(S

Nc

)


Saline Cystamine

stnuoc llec lacigoloeretS NTreatments per groupe Cresyl Violet+ TH+

Bregma -3.28 mm Bregma -3.58 mm

SNc

SNrSNc

SNr

A

P

Nigral TH neuronsa)

***


Saline Cystamine

b) Expression of Nurr1 mRNAin the substantia nigra

0.2

0.4

0.6

Nu

rr1

mR

NA

le

ve

ls (

SN

c)

(µC

i/g

of

tiss

ue

)

0.0

0.5

0.3

0.1

Figure 5.

Bregma -3.08 mm

SNc

SNr

CA2

CA1

CTX

CA1

VTA

Saline + Saline 9 8563 ± 248 6769 ± 311Saline + MPTP 9 6923 ± 488** 4744 ± 378***Cystamine + Saline 8 8703 ± 229 6777 ± 252 Cystamine + MPTP 10 8563 ± 248 7047 ± 180

Bregma -3.08 mm

SNr

CA2

CA1

CTX

CA1

VTA

SNc

200

100

0

% o

f c

on

tro

l

10 50

Expression of Nurr1 mRNAin the substantia nigra

200

12

*

*

1 3 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

c)

97

from the Allen brain (Lein et al., 2007 and Allen., 2008). These levels correspond to

anatomical levels utilized for all the various SNc quantifications assessed in this study. A

summary table depicting values obtained for the cresyl violet cell counts, to confirm TH

cell degeneration, has been added in (a). Values are means ± S.E.M. Data were assessed by

two-way ANOVA (no significant interaction terms revealed) and subsequently analyzed for

significance using one-way ANOVA for each time point regrouping all concentrations,

followed by the Tukey post-hoc multiple comparison test. Significant difference with the

control (0 mg/kg) group * = p < 0.05 (b). Data were assessed by two-way ANOVA

followed by the Tukey post-hoc multiple comparison test. Significant difference with the

saline/saline group *** = p < 0.001 (a and c). Abbreviations: A: anterior; P: posterior;

CTX: cortex; SNc: substantia nigra compacta; SNr: substantia nigra reticulata; VTA:

ventral tegmental area; CA1, 2: CA fields, hippocampus.

99

3 Chapitre III. Cystamine rescues neuronal

degeneration and promotes behavioral recovery in

animal models of Parkinson’s disease

Auteurs:

*1Cisbani G,

*1Drouin-Ouellet J,

*1Gibrat C,

1Bousquet M,

1Saint-Pierre M,

1Lavallée-Bourget MH,

1Boivin L,

1Lebel M,

*1,2Cicchetti F

* Authors have contributed equally to this work

Under review in Journal of Neuroscience (submitted June 8th

, 2013)

Affiliations: 1Centre de Recherche du CHU (CHUL), Axe Neurosciences, 2705 Boulevard Laurier,

Québec, QC, Canada, G1V 4G2 2Département de Psychiatrie & Neurosciences, Université Laval, Québec, QC, Canada,

G1K 0A6

100

3.1 Résumé

Nous avons précédemment témoigné des propriétés neuroprotectrices de la cystamine dans

un modèle murin de la maladie de Parkinson induit par la toxine 1-methyl-4-phenyl-

1,2,3,6-tetrahydropyridine. Dans cette étude, nous démontrons que la cystamine peut non

seulement empêcher le processus neurodégénératif lorsqu‟administrée après exposition au

1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine ou après lésion striatale par la 6-

hydroxydopamine, mais peut également renverser les déficiences motrices engendrées par

une lésion de 6-hydroxydopamine. Nous avons également cherché à identifier les

mécanismes potentiels par lesquels la cystamine peut soutenir ce système après lésion. In

vitro, les neurones prétraités avec la cystamine sont protégés contre la baisse des niveaux

de brain-derived neurotrophic factor induite par la toxine. De même, l‟apoptose neuronale

ainsi que la production de inducible nitric oxide synthase et de nitrite par les cellules gliales

sont contrecarées. Ainsi, comparé à un médicament anti-inflammatoire puissant comme la

dexaméthasone, un prétraitement de cystamine semble tout aussi efficace à contrer les

changements morphologiques ainsi que la production de inducible nitric oxide synthase ou

de nitrite par des microglies exposées au lipopolysaccharide. In vitro, l‟administration de

cystamine 24 heures après une exposition de 6-hydroxydopamine permet d‟atténuer la

réponse microgliale et d‟induire la production neuronale de brain-derived neurotrophic

factor de manière semblable à ce qui est observé avec le prétraitement. Malgré cela, un post

traitement de cystamine ne promeut pas la survie cellulaire. Nos résultats in vivo montrent

néanmoins que la cystamine est capable de protéger les neurones en cours de

dégénérescence induite par le 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine ou la 6-

hydroxydopamine, et peut générer une récupération fonctionnelle significative chez les

animaux lésés.

101

3.2 Abstract

We have previously demonstrated that cystamine is neuroprotective in an 1-methyl-4-

phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson‟s disease. Here, we now

show that cystamine administration can not only prevent the neurodegenerative process

following exposure to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine or a striatal 6-

hydroxydopamine lesion, but can even reverse motor impairments created by a 6-

hydroxydopamine lesion. We also sought to identify potential mechanisms by which

cystamine rescues this system after lesioning. In vitro, neurons primed with cystamine were

protected against toxin-induced brain-derived neurotrophic factor decrease and neuronal

apoptosis, as well as inducible nitric oxide synthase and nitrite production in glial cells.

Treatment of microglial cells with cystamine prior to lipopolysaccharide exposure was as

effective as treatment with the potent anti-inflammatory drug dexamethasone in inhibiting

the microglial response, both in terms of morphological changes, as well as inducible nitric

oxide synthase and nitrite production. However, while in vitro administration of cystamine

24 hours following 6-hydroxydopamine exposure attenuated the microglial response and

promoted the neuronal production of brain-derived neurotrophic factor, similar to that seen

pre-treatment, it failed to promote cell survival. Our in vivo results nevertheless show that

cystamine is able to rescue neurons undergoing 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-

tetrahydropyridine and 6-hydroxydopamine-induced neuronal degeneration and generate

significant functional recovery in lesioned animals

102

3.3 Contributions

La conceptualisation du projet a été faite par Dre Cicchetti et son élaboration a été effectuée

par moi-même, Giulia Cisbani et Janelle Drouin-Ouellet, supervisée et approuvée par Dre

Cicchetti. Toutes les expérimentations in vitro (mise en culture des cellules, traitements,

Griess Assay, extraction protéiques et immuno-fluorescences) ont été menées par Giulia

Cisbani. Concernant la section in vitro de l‟étude, j‟ai effectué une partie des western-blot

et des dosages de protéines ainsi que quantifié et analysé la totalité des immunoblots. J‟ai

également élaboré et effectué la technique de concentrations de milieux de culture et les

quantifications par ELISA du BDNF. Une bonne partie des expérimentations in vitro ont

été effectuées avec l‟aide des stagiaires Marie-Hélène Lavalée-Bourget et Laurie Boivin.

Les expérimentations in vivo ont été menées par moi-même: injections de MPTP, de

cystamine, chirurgies stéréotaxiques, soins aux animaux pendant toute la durée des

expérimentations, comportements (avec l‟aide de Martine Saint-Pierre pour les tests à

l‟apomorphine ; Stepping test et test du cylindre effectués par Manon Lebel), sacrifices

avec le concours de Martine Saint-Pierre. J‟ai également effectué toutes les analyses post

mortem (coupes et préparations des échantillons, immunohistochimies, décomptes

stéréologiques en double insu avec Giulia Cisbani, Martine Saint-Pierre et Laurie Boivin,

hybridations in situ, western-blots, immunoblots, ELISAs) excepté les analyses HPLC de

catécholamines qui ont été effectuées par Mélanie Bousquet de l‟équipe du Dr Calon et

Martine Saint-Pierre. J‟ai effectué le montage des premières figures et écrit la première

version de l'article. Giulia Cisbani a contribué à la finalisation des statistiques effectuées

par le service de statistique de l‟Université Laval et au montage des figures. Janelle Drouin-

Ouellet a par la suite finalisé toutes les figures, réinterpreter toutes les données, refais

certaines statistiques, réécrit le manuscrit et fais toutes les corrections subséquentes aux

commentaires de Dre Cicchetti.

Ces études ont été soumises récemment dans le Journal of Neuroscience et sont en cours de

révision par un comité de pairs.

103

3.4 Introduction

Parkinson‟s disease (PD) is a neurodegenerative disorder for which existing therapies are

restricted to symptom management. The development of novel treatments to prevent or halt

the progressive dopaminergic neuronal degeneration, which largely underlies this

pathology, is still awaited. Considerable efforts have been committed to the identification

and development of such disease-modifying strategies however, most candidate compounds

exhibiting neuroprotective properties in pre-clinical studies have failed to demonstrate

disease-modifying effects when tested in the clinical setting (de la Fuente-Fernandez et al.,

2010). The multitude of cellular and molecular mechanisms involved in PD pathogenesis

and the significant proportion of dopaminergic neurons already lost at the time of disease

diagnosis (Schapira, 1999) are elements that significantly hinder our efforts to identify a

single compound capable of acting on a number of pathways simultaneously.

Amongst the neuroprotective agents emerging from experimental work, we and others have

identified that cystamine, a small disulfide-containing chemical, holds such properties. The

neuroprotective potential of cystamine was first demonstrated in animal models of

Huntington‟s disease (HD) including the R6/2 (Dedeoglu et al., 2002; Karpuj et al., 2002;

Fox et al., 2004; Wang et al., 2005) and the YAC128 mice (Van Raamsdonk et al., 2005).

In these models, cystamine was shown to prevent brain atrophy, neuronal loss and improve

neuropathological features. Prolonged life span and improvements in motor behaviours

were further reported in R6/2 mice (Dedeoglu et al., 2002). Given the significant benefits

observed in HD models, the reduced form of cystamine, cysteamine, quickly moved to

clinical trials (Dubinsky and Gray, 2006). The results in a small number of HD patients

confirmed drug tolerability (Dubinsky and Gray, 2006) and phase II clinical trials are now

ongoing. More recent studies conducted in animal models of parkinsonism, such as those

induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) (Gibrat et al., 2010) and

6-hydroxydopamine (6-OHDA) (Stack et al., 2008) have provided evidence that cystamine

can also be neuroprotective in PD.

Cystamine has pleiotropic effects on biological processes, but was first proposed as a

potential therapeutic strategy for neurodegenerative disorders because of its inhibitory

104

effects on transglutaminase (Lorand and Conrad, 1984; Karpuj et al., 2002; Junn et al.,

2003), an enzyme contributing to protein aggregate formation (Wang et al., 2005). What

further renders cystamine appealing is its antioxidant activity, which improves

mitochondrial functions (Fox et al., 2004; Stack et al., 2008); its modulation of brain-

derived neurotrophic factor production (BDNF) (Borrell-Pagès et al., 2006; Gibrat et al.,

2010) and its capacity to inhibit apoptosis through its action on active caspase-3 (Jokay et

al., 1998; Lesort et al., 2003). While the pathophysiology leading to nigral dopamine

neuronal loss remains to be fully elucidated, it is believed to result from oxidative stress,

mitochondrial dysfunction, diminished trophic factor support, inflammation, apoptosis, as

well as impairments in the ubiquitine-proteasome and autophagic systems (for review:

(Dauer and Przedborski, 2003)).

Because a number of mechanisms of action of cystamine thus far identified match those

driving the pathophysiology of dopaminergic neuronal loss, we assessed whether cystamine

could prevent and even reverse ongoing dopaminergic degeneration in animal models of

PD.

105


3.5.1 In vivo experiments

3.5.1.1 Animals

Adult male C57BL/6 mice (9-week old, 25 g) were purchased from Charles River

Laboratories. The animals were housed in a temperature and light-controlled room (22 °C,

a 12 h cycle) and were fed and allowed to drink water ad libitum. The health status of all

mice was monitored throughout the experimental protocol primarily via weight loss and

close observations for signs of any health-related issues. All experiments were performed in

accordance with the Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory animals and all

procedures were approved by the Institutional Policy of the Centre Hospitalier de

l‟Université Laval (CHUL).

3.5.1.2 Subacute MPTP lesion and cystamine treatment

In a first set of experiments, mice received 7 intra-peritoneal (i.p.) injections, twice on the

first 2 days of the experimental protocol at an interval of 12 h and once a day for 3

subsequent days, of either MPTP-HCl (20 mg/kg; Sigma-Aldrich) dissolved in saline 0.9%

prepared fresh or saline 0.9% (Tremblay et al., 2006; Bousquet et al., 2008; Gibrat et al.,

2010; Drouin-Ouellet et al., 2011). Cystamine (cystamine dihydrochloride, Sigma-Aldrich)

was administered as a single 10mg/kg i.p. dose daily and was dissolved in sterile saline

0.9% and used only in the freshly prepared form. The choice of dose and regime of

administration is based on our previous findings (Tremblay et al., 2006; Gibrat et al., 2010).

The choice to use cystamine instead of cysteamine, the form currently being tested in the

clinic, was for two main reasons: 1) it allows direct and easy comparisons with our

previous work all conducted with cystamine (Tremblay et al., 2006; Gibrat et al., 2010) and

2) we have additionally shown that cystamine is quickly metabolised into two cysteamine

molecules in the liver (Bousquet et al., 2010).

To confirm the neuroprotective properties of cystamine, the treatment begun 2 days before

the first MPTP injection and continued for 14 days post-MPTP treatment giving a total of

21 days of cystamine treatment (Gibrat et al., 2010). To investigate the properties of

106

cystamine when neurodegeneration has been initiated and is ongoing, a separate group of

animals received cystamine 24 h after the MPTP protocol was completed. The cystamine

treatment was given daily for 14 consecutive days. In total, 96 mice (n=16 per group) were

used and the experimental groups were as follow: Saline + Cystamine pre-treatment; Saline

+ Cystamine post-treatment; Saline + Saline; MPTP + Cystamine pre-treatment; MPTP +

Cystamine post-treatment; MPTP + Saline.

3.5.1.3 Unilateral striatal 6-OHDA lesion and cystamine treatment

Animals were anaesthetized using isoflurane (Sigma-Aldrich) and placed onto a mouse

stereotactic frame (Kopf Instruments). 6-OHDA (Sigma-Aldrich) was dissolved at a

concentration of 2 g/μl in 0.9% saline and 0.02% ascorbic acid and a volume of 2 μl was

injected unilaterally into the right striatum at a rate of 0.5 μl/min. The injection was

performed using a Hamilton syringe at the following co-ordinates: AP: +0.04 cm, ML: -

0.18 cm, DV: -0.31 cm (corresponding to the Allen Brain Atlas (Allen, 2008)) The needle

was left in place for 3 min after the injection before complete retraction. Sham mice were

subjected to the same surgical procedures but were injected with 2 μl of a vehicle solution

(0.9% saline and 0.02% ascorbic acid).

The effects of cystamine in 6-OHDA-lesioned mice were evaluated using the 10 mg/kg

dose, as for the MPTP model. Cystamine was administered i.p. commencing 3 weeks post-

surgery and continued daily for 6 weeks. Experimental groups were as follow: 6-OHDA +

Saline; Sham + Saline; 6-OHDA + Cystamine; Sham + Cystamine. A total of 72 mice were

used: 36 mice (n=9 per group) underwent apomorphine-induced rotation. In parallel, an

additional 36 mice were assigned to non drug-induced behavioural measurements (stepping

and cylinder tests) to avoid the potential influence of apomorphine on DA levels.

3.5.1.4 Behavioral measures

Two distinct groups of mice were lesioned one week apart. The first group was assigned to

the cylinder and stepping tests, while the second group was assigned to the apomorphine-

induced rotational test. The cylinder test was performed first followed by the stepping test

the following day and all tests were performed in the morning. All mice were tested at 3, 6

107

and 9 weeks post-lesion.

Apomorphine-induced rotation. A subgroup of 36 mice was challenged with apomorphine

(0.5 mg/kg, Sigma-Aldrich) and rotation assessed for 45 min using an automated

rotometer system (San Diego Instruments). Results were averaged and expressed as net

rotation (number of contralateral rotations Ŕ number of ipsilateral rotations) (Metz and

Whishaw, 2002; Moore et al., 2001). Animals were allowed to habituate to their

environment for 5 min after the injection before the rotations were recorded.

Cylinder test. To examine side bias in spontaneous forelimb use during explorative activity,

mice were placed individually in a glass cylinder (10 cm diameter, 14 cm height) facing

two vertical mirrors which allowed movement evaluation from all angles. Mice were

concomitantly video-recorded during the 3 min testing phase. Video-recordings were

subsequently examined to count the number of wall contacts made with the forepaws. A

measure of forelimb use asymmetry was obtained by expressing the touches performed by

the paw contralateral to the lesion (left paw) as a percentage of the total number of touches

recorded for each session.

Stepping test. Mice were held by the base of the tail with their hindlimbs suspended above

the table and moved backwards at a steady rate so that they traversed 1 meter over 5 sec

(Blume et al., 2009). All mice were tested three times and video-recorded. Videos were

subsequently analysed to count the number of touches performed by the paw contralateral

to the lesion (left paw) so as to obtain a measure of forelimb use asymmetry.

3.5.2 Post mortem analyses

3.5.2.1 Perfusion and tissue processing

Animals were sacrificed under deep anaesthesia with ketamine/xylazine (Vetalar,/Rompun)

and intracardiacally perfused in RNAse free conditions at the completion of each

experimental protocol.

MPTP lesioned animals. All mice were subjected to intracardiac perfusion with RNAse

free 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS). Brains were collected and the two

108

hemispheres separated. The left hemisphere was post-fixed in 4% paraformaldehyde (PFA)

for 48 h and transferred to 20% sucrose in 0.1 M PBS for cryoprotection. Coronal brain

sections of 25 μm thickness were obtained using a freezing microtome (Leica

Microsystems), serially collected in anti-freeze solution (monophosphate sodium

monobasic 0.2 M, monophosphate sodium dibasic 0.2 M, ethylene glycol 30%, glycerol

20%) and kept at -20°C until use for immunohistochemistry and in situ hybridization. The

right hemispheres were snap-frozen in 2-methyl-butane and stored at -80°C. The frozen

samples were prepared from cryostat dissection for high-performance liquid

chromatography (HPLC) and western-blot analyses.

6-OHDA lesioned animals. The brains of the mice lesioned with 6-OHDA were similarly

processed except that the most posterior area comprising the entire midbrain (AP -1.155

mm to -7.755 mm) was post-fixed in 4% PFA for additional immunohistochemistry and in

situ hybridization protocols and the anterior brain (AP + 3.245 mm to -1.055 mm),

comprising the right and left striata, was snap-frozen for HPLC and western-blot analyses.

3.5.2.2 Catecholamine quantification by HPLC

Striatal dopamine (DA) concentration was measured by HPLC coupled with

electrochemical detection (Bousquet et al., 2008). Each striatal sample comprised ten 20

µm thick cryostat sections ranging between AP +0.945 mm and +0.020 mm for both the

MPTP and 6-OHDA lesion animals (Allen, 2008). Two hundred μl of perchloric acid (0.1

N; J. T. Baker) was added to each sample, which were homogenized and centrifuged

(13,000 g) to generate a supernatant. Fifty μl of the supernatant from striatal tissues were

directly injected into the chromatograph system consisting of a Waters 717 plus

autosampler automatic injector, a Waters 1525 binary pump equipped with an Atlantis

dC18 (3 μl) column, a Waters 2465 electrochemical detector, and a glass carbon electrode

(Waters Limited). Electrochemical potential was set at 10 nA. The mobile phase consisted

of 47.8 mM NaH2PO4, 0.9 mM sodium octyl sulfate (J. T. Baker), 0.4 mM EDTA, 2 mM

NaCl, and 8% methanol (J. T. Baker) at pH 2.9 and was delivered at 1.0 ml/min. Peaks

were identified using Breeze software (Waters Limited). HPLC quantifications were

normalized to protein concentrations, as determined with a bicinchoninic acid (BCA)

109

protein assay kit (Pierce) using the manufacturer‟s protocol.

3.5.2.3 TH and NeuN immunohistochemistry

To assess total neuronal, and more specifically dopaminergic neuronal loss,

immunohistochemistry against the enzyme tyrosine hydroxylase (TH) and the neuronal

nuclear antigen (NeuN) was performed. Sections of the substantia nigra (SN) were

incubated for 30 min in 3% H2O2 and blocked in a 0.1 M PBS solution containing 0.1%

Triton X-100 (Sigma-Aldrich) and 5% normal goat serum (NGS; Wisent) for 30 min. Free-

floating sections were subsequently incubated overnight at 4ºC with a rabbit anti-TH (Pel-

Freez, 1:5,000) or a mouse anti-NeuN antibody (Millipore, 1:2,500). Sections were then

incubated for 1 h at room temperature (RT) in a solution containing biotinylated goat anti-

rabbit or anti-mouse IgG (Vector Laboratories, 1:1,500) and subsequently placed in a

solution containing avidin-biotin peroxidase complex (ABC Elite kit; Vector Laboratories)

for 1 h at RT. The reaction was obtained with 3,3‟ diaminobenzidine tetrahydrochloride

(DAB) solution (Sigma-Aldrich) and 0.1% of 30% hydrogen peroxide (Sigma-Aldrich) at

RT. Other sections were treated as above except that the primary antibody was omitted

from the incubation medium. These sections remained free of immunostaining and served

as negative controls. Following the DAB reaction, sections were mounted on gelatin-coated

slides. For the TH staining, slides were further counterstained with cresyl-violet (Sigma-

Aldrich). All sections were finally air-dried, dehydrated in ascending grades of ethanol,

cleaned in xylene, and coverslipped with DPX mounting media (Electron Microscopy

Science).

3.5.2.4 In situ hybridization for Nurr1, DAT and BDNF

A specific [35

S]UTP-labeled complementary RNA (cRNA) probe was used to assess tissue

mRNA levels of Nurr1, a nuclear receptor associated with the dopaminergic system

(Zetterstrom et al., 1997). The cRNA probe for Nurr1 stems from a 403 bp (gene bank

accession number: 1504-1907 NM_013613) EcoRI-BamHI fragment of a full-length mouse

Nurr1 cDNA subcloned into pBluescript SK+ and linearized with Xba I (Cossette et al.,

2004). The dopamine transporter (DAT) probe, a 2238 bp length fragment, was cloned into

a pBluescript II SK+ plasmid. Linearization was made with NotI enzyme. The antisense

110

probe was synthesized with [35

S]UTP and T7 RNA polymerase (Tremblay et al., 2006).

The cDNA of BDNF was subcloned into pCR 2.1 and linearized with Xho and

corresponded to a 284 bp (99-448 NM_007540). The cRNA probe was synthesized and

labeled by using Promega riboprobe kit, [35

S]UTP and the RNA polymerase SP6 (Bousquet

et al., 2009).

Sense probes were also generated for these markers and no specific signal was obtained

(data not shown). Brain sections were hybridized following the procedures previously

published (Beaudry et al., 2000; Cossette et al., 2004; Lapointe et al., 2004; Bousquet et al.,

2009; Gibrat et al., 2010). All in situ protocols underwent the same preparation and were

conducted in RNAse free conditions. After hybridization, tissue sections were placed

against BiomaxMR (Kodak) radioactive sensitive films. Autoradiograms were developed

following a 72 h exposure for Nurr1, 5 h exposure for DAT and a 9-day exposure for

BDNF. Argentic emulsion was further performed for DAT to allow for stereological counts

of DAT positive cells in the substantia nigra pars compacta (SNpc). Deffating was

performed with 4 baths of ethanol, 2 baths of xylene and 3 baths of ethanol. Following

these steps, slides were dipped in NTB emulsion (Kodak) melted at 42°C, air-dried for 4 h

and stored in the dark for 5 days at 4°C. The emulsion was then developed (3.5 min) in D-

19 developer (Kodak), rinsed in deionised water and fixed (5 min) in Rapid Fixer solution

from Kodak. Slides were rinsed in deionised water for 1 h and then coloured using thionine

(1 min), followed by water and ethanol dips then 3 ethanol (1 min) and 3 xylene baths (3

min). Slides were coverslipped with DPX mounting media.

3.5.2.5 GFAP and Iba1 immunofluorescence

For nigral microglial and astroglial cell density assessment, immunofluorescence was

performed using antibodies against Iba1 and GFAP. After overnight incubation at 4°C with

a rabbit anti-Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; Waco Pure Chemicals

Industries, 1:1,000) or mouse anti-GFAP (glial fibrillary acidic protein; Sigma-Aldrich,

1:1,000), sections were washed in PBS and incubated for 2 h at RT in a PBS solution

containing the secondary antibody goat Alexa 488-conjugated anti-rabbit (Invitrogen,

Eugene, 1:1,000) or goat Rodamine Red anti-mouse (Jackson Immunoresearch, 1:1,000).

111

Following three washes in PBS, sections were placed in a solution containing 0.022% 4',6-

diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 7 min at RT and washed again twice before being

mounted on slides which were coverslipped using fluoromount (Southern Biotech) and

sealed with nail polish.

3.5.2.6 Western-blot analyses

Samples were homogenized in 8 volumes of lysis buffer (150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4,

1% (v/v) Triton X-100, 0.5% SDS, and 0.5% sodium deoxycholate) containing a cocktail of

protease (Roche) and phosphatase inhibitors (Sigma-Aldrich). Samples were sonicated (3 ×

10 sec) and centrifuged at 100,000 g for 20 min at 4°C. The supernatant was collected and

stored at -80°C. Total protein concentration was determined using a BCA protein assay.

Twenty µg of total protein per sample was added to Laemmli buffer and heated to 95°C for

5 min. Samples were then loaded and subjected to SDS-polyacrylamide (12%) gel

electrophoresis. Proteins were electroblotted onto 0.45 μm Immobilon PVDF membranes

(Millipore) and blocked in 5% nonfat dry milk and 1% BSA in 1X PBS for 1 h. Membranes

were immunoblotted with the following primary antibodies: rabbit anti-TH (Pel-Freez,

1:1,000) and mouse anti-actin (ABM Inc, 1:10,000), and with appropriate secondary

antibodies, goat anti-rabbit or anti-mouse (Jackson Immunoresearch, 1:100,000) followed

by the addition of chemiluminescence reagents (KPL, Mandel Scientific). Band intensities

were quantified using a KODAK Image Station 4000 Digital Imaging System (Molecular

Imaging Software version 4.0.5f7, Eastman Kodak).

3.5.2.7 Stereological quantifications

The number of nigral TH+, NeuN+ and DAT mRNA+ neurons was determined by

stereological counts under bright-field illumination, while GFAP and IbaI were quantified

using a fluorescence light microscope. Every fifth section (for TH, NeuN, GFAP and IbaI)

and every tenth section (for DAT) through the SNpc (AP levels of −2.75 mm to −3.58 mm

(Allen, 2008)) was analysed using the Stereo investigator software (MicroBrightfield)

integrated to a E800 Nikon microscope (Nikon Canada Inc.). After delineation of the SNpc

at low magnification (4X objective), a point grid was overlaid onto each section.

Immunostained cells were counted by the optical fractionator method at higher

112

magnification (20X objective). The counting variables were as follow: distance between

counting frames (150 µm X 150 µm), counting frame size (75 µm) and guard zone

thickness (1 μm). Cells were counted only if they did not intersect forbidden lines.

Stereological cell counts were performed blindly by two independent investigators (except

for GFAP and Iba1 to avoid bleaching of the immunofluorescent staining). Note that the

analyses of immunoreactive profiles were restricted to the SNpc and thus excluded the

ventral tegmental area (VTA).

3.5.2.8 Densitometric measurements of Nurr1, DAT and BDNF mRNA levels

Levels of autoradiographic labeling were quantified by computerized densitometry.

Digitized brain images and their analyses were made with the same equipment as

mentioned above. Optical density of the autoradiograms was translated into µCi/g of tissue

using 14

C radioactivity standards (ARC 146-14

C standards, American Radiolabeled

Chemicals Inc.). Nurr1, DAT and BDNF mRNA levels were measured in the SNpc using

similar antero-posterior levels for all sections. The average labeling for each SNpc level

was calculated from 3 adjacent brain sections of the same mouse. Background intensities

taken from white areas of the substantia nigra reticulata devoid of Nurr1, DAT or BDNF

mRNA levels were subtracted from every measurement.

3.5.2.9 BDNF immunoassay

The level of BDNF protein from tissue extracts was determined with the BDNF Emax®

ImmunoAssay System (Promega) as per manufacturer's instruction. The samples were ran

in duplicates and a Synergy™ HT multi-detection microplate reader (Biotek) was used to

measure signal intensity from the wells at 450 nm. A standard curve was generated using

the curve fitting function of the Biotek software. The total amount of BDNF per well was

calculated based on the standard curve. The relative BDNF value was then calculated by

normalizing the amount of BDNF against the total amount of protein.

113

3.5.3 In vitro experiments

3.5.3.1 Cell lines and culture conditions

The cell line BV2 (murine microglia) and N2a (murine neuroblastoma) were chosen as

being good representative of murine cerebral cell types. BV2 cells are commonly used as

substitutes of primary microglial cells (Henn et al., 2009). N2a cells are also well

established as a murine cell line, characterized by rapid growth and easy differentiation into

neuronal phenotypes (Evangelopoulos et al., 2005; Mao et al., 2000). For astrocytes, we

chose to use primary cultures since adequate murine astrocytic cell lines were not

commercially available. The two cell lines were cultured in DMEM (Sigma-Aldrich)

supplemented with 10% heat inactivated FBS (Sigma-Aldrich), 2 mM L-glutamine

(Invitrogen) and 1X Penicillin/Streptomycin solution (Sigma-Aldrich). N2a cells were

differentiated into dopaminergic neurons (Tremblay et al., 2010) by culturing them in

media containing 0.5% FBS supplemented with 0.5mM dibutyryl cyclic adenosine

monophosphate (dbcAMP) (Sigma-Aldrich) for 3 days (Tremblay et al., 2010).

For primary cultures, a total of 8 mouse pups at post-natal day 1 were sacrificed by ice

immersion. The heads were sectioned and placed in cold DMEM-F12 (Invitrogen).

Following the removal of the meninges, brains were incubated in 0.25% trypsin-EDTA

solution (Sigma-Aldrich) with gentle agitation for 30 min at 37°C. The reaction was

terminated by adding complete media (Sigma-Aldrich) and the tissue triturated by passing

it through a 70 μm nylon mesh cell strainer. The cells were then cultured in complete

DMEM-F12 media supplemented with 10% heat inactivated FBS, 0.5 X

Penicillin/Streptomycin solution, 2 mM L-glutamine, 100 μM non-essential amino acids

(Invitrogen) and 2 mM sodium pyruvate (Invitrogen) at 37°C in an H2O-saturated and 5%

CO2 atmosphere. The media was changed after 4 days and the cells were allowed to reach

confluence for an additional 10 days. Flasks was placed on an orbital shaker at 160 rpm for

3 h at 37°C to allow microglia to detach (Michaud et al., 2012).

The BV2, N2a and astrocytic cells were plated in 96-well plates for assays; 24-well plates

for immunofluorescence and 6-well plates for protein extraction. The cells were plated at

concentrations varying from 103

to 5x105 for 24 h before toxin/compound treatment. After

114

determining the optimal concentrations, cells were treated with DMEM alone, DMEM +

250 M cystamine and/or DMEM + MPP+ (1.5 mM for N2a cells and 50 M for the other

cell types) and/or DMEM + 100 M 6-OHDA (Sigma-Aldrich) for 24 h. To evaluate the

effects of cystamine on microglia, BV2 cells were treated with DMEM alone, DMEM +

250 M cystamine and/or DMEM + LPS 1 g/ml (Sigma-Aldrich) and further compared to

the anti-inflammatory drug dexamethasone (1M; Sigma-Aldrich) 24 h. Cystamine was

administered 6 h prior to (Pre-treatment) or following (Post-treatment) MPP+, 6-OHDA or

LPS challenge.

3.5.3.2 Cell viability assays

Cell viability was assessed by Trypan blue (Sigma-Aldrich) exclusion using a

hemocytometer.

3.5.3.3 Promega Griess assay

Production of NO was determined by measuring the accumulated level of nitrite (an

indicator of NO) in the cell culture supernatant using the Griess assay (Promega) according

to manufacturer‟s instructions. Total nitrites were measured with a microplate reader at 520

nm. Results were obtained from 6 separate measurements for each experimental condition.

3.5.3.4 Protein extraction and quantification

Each well of a 6-well plate was washed twice with cold PBS 1x and detached in PBS 1X

using a cell scraper. After centrifugation for 5 min at 13,000 g, the cells were resuspended

in RIPA buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, and 0.5% sodium deoxycholate,

1% (v/v) Triton X-100) supplemented with proteases (Roche) and phosphatase inhibitors

(Sigma-Aldrich). The cell suspension was then spun for 10 sec, agitated for 10 min at 4°C

and spun again for 30 sec. Finally, the samples were centrifuged at 4°C for 20 min at

13,000 g. The supernatant was collected and quantified using a BCA protein assay kit.

3.5.3.5 Western-blot analyses

Proteins were loaded in 4-15% agarose precast gels (Biorad) and electroblotted onto 0.45

m Immobilon PVDF membranes. Membranes were immunoblotted with rabbit anti-iNOS

115

(Sigma-Aldrich, 1:1,000), rabbit anti-BAX (Cell signaling, 1:1,000), rabbit anti-Bcl2 (Cell

signaling, 1:1,000), rabbit anti-cleaved caspase-3 (Cell signaling, 1:1,000), anti-actin

(ABM Inc, 1:10,000) and GADPH (ABM Inc, 1:1000) primary antibodies as described in

the post mortem western-blot analyses section. Anti-GADPH measurements were used as a

loading control in the LPS challenge experiments, since this toxin alters the cellular

cytoskeleton, which further affects actin levels.

3.5.3.6 BDNF immunoassay

The BDNF ELISA assay was performed on the extracted proteins derived from the cells as

well as on cell media using the BDNF Emax® ImmunoAssay System (Promega) as

described in the previous section (see post mortem BDNF immunoassay). Secreted BDNF

was concentrated using Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters for protein purification and

concentration (Millipore) prior to performing the assay.

3.5.3.7 Protrusion length analysis

BV2 cells were grown on a coverslip and fixed for 10 min with 4% PFA pH 7.4. Following

3 additional washes in PBS 1x, the cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 30

min at RT and actin filaments were stained with 10 μg/ml Phalloidin-Alexa546 (Sigma) for

1 h at RT. The cells were then washed and processed as described above. The total

protrusion length of 100 BV2 cells per group was measured using ImageJ (version 1.45s,

NIH).

3.5.3.8 Image preparation and statistical analyses

Photomicrographs were taken by Picture Frame software (Microbrightfield) linked to an

E800 Nikon microscope (Nikon Instruments). Pictures of Immunofluorescence were taken

with Simple PCI version 5.0 (Hamamatsu) software linked to a Nikon eclipse 90i

microscope (Nikon Instruments). Images were finalized for illustration using Adobe

Photoshop and Illustrator CS5. Two-way ANOVAs, either crossed (Fig. 3-1: Nigral TH+

neurons, Nigral Nurr1 mRNA, Nigral DAT+ neurons: Striatal DA level and Striatal TH

protein level; Fig. 3-2 Nigral NeuN+ cells, TH+ neurons; Nigral Nurr1 mRNA, Nigral

DAT+ neurons, Striatal DA level and Striatal TH protein level; Fig. 3-4: BDNF protein

116

level in ventral mesencephalon and BDNF mRNA expression in SNpc; Fig. 3-6: IbaI and

GFAP cell count) or nested (Fig. 3-4: Intra-cellular BDNF levels in N2a cells and BDNF

levels in N2a cell media for both MPP+ and 6-OHDA treatments; Fig. 3-5: BAX/Bcl2 ratio

and cleaved caspase-3 for both N2a cells treated with MPP+ and 6-OHDA; Fig. 3-6: BV2

protrusion length, -actin protein levels, iNOS protein levels and Nitrite concentration) was

used to compare either 6-OHDA or MPTP to the saline groups and the different treatments.

For behavioural analyses (Fig. 3-3), a repeated measures ANOVA was used to compared

the toxin (6-OHDA vs. Sham-operated), the treatment (Cystamine vs. Saline) and the time

effect (baseline, 3 and 6 weeks). For some outcomes, a different variance was estimated for

each treatment to correct for the heterogeneity of the variances (Fig. 3-1: Nigral TH+

neurons, Striatal DA level; Fig. 3-2: Nigral TH+ neurons, Nigral Nurr1 mRNA, Nigral

DAT+ neurons, Striatal TH protein level, Striatal DA level; Fig. 3-3: Apomorphine-

induced rotations and adjusting steps; Fig. 3-4: BDNF protein level in ventral

mesencephalon; Fig. 3-5: BAX/Bcl2 ratio and cleaved caspase-3 in N2a cells treated with

MPP+, N2a cell count; Fig. 3-6: GFAP cell count). Step-down Bonferonni correction was

used to ensure that the overall significance level of the multiple comparisons tests was 0.05.

All statistical analyses were performed by the Service de Consultation Statistique of

Université Laval using the MIXED procedure of SAS (version 9.2, SAS).

117

3.6 Results

3.6.1 Cystamine halts MPTP-induced nigral dopaminergic neuronal degeneration

We first assessed if cystamine could preserve the dopaminergic system once the

degeneration had been initiated. Daily administration of cystamine (10 mg/kg) one day

following the end of the MPTP protocol (Fig. 3-1A) indeed halted nigral dopaminergic

neuronal degeneration as demonstrated by 3 distinct markers of the nigral dopaminergic

system including the number of TH+ cells (p< 0.01), Nurr1 mRNA expression (p< 0.01)

and DAT mRNA expressing cells (p< 0.05) (Fig. 3-1B, C and D). The neuroprotective

action of cystamine on nigral dopaminergic cell bodies (TH, Nurr1 and DAT expression)

was further confirmed in the group of mice who received cystamine 2 days prior to the

MPTP lesion, as demonstrated previously (Gibrat et al., 2010). Dopaminergic striatal

terminals were not protected against MPTP toxicity in cystamine-treated mice as revealed

by lower dopamine contents (p< 0.0001) and TH protein expression (p<0.05), quantified by

HPLC and western blots, regardless of the time when the cystamine treatment was initiated

(Fig. 3-1E and F).

3.6.2 Cystamine rescues 6-OHDA-induced nigral dopaminergic neuronal

degeneration and behavioral impairments

Using the unilateral striatal 6-OHDA lesioned mouse model of PD, which generates

quantifiable motor impairments (Alvarez-Fischer et al., 2008a), we further investigated

whether cystamine could promote behavioural recovery. Cystamine (10 mg/kg) was thus

administered daily 3 weeks following the 6-OHDA lesion for a period of 6 weeks (Fig. 3-

3A). While the number of nigral NeuN+ neurons in the 6-OHDA lesioned mice treated with

cystamine was similar to sham-operated controls (p< 0.05; Fig. 3-2A), the loss of

dopaminergic neurons was partially prevented by cystamine, as revealed both by TH+ cell

counts and Nurr1 mRNA expression (p< 0.01, p< 0.05; Fig. 3-2B, C). A trend towards a

partial protection could also be observed for the number of nigral DAT+ cells (p=0.1031;

Fig. 3-2D). Contrary to the absence of a significant effect of cystamine on striatal dopamine

levels in the MPTP model, a 6-week cystamine treatment in 6-OHDA lesioned animals

partially preserved striatal dopamine levels measured by HPLC (p< 0.05; Fig. 3-2E).

118

However, striatal TH expression, as quantified by western blots, was similar to levels

obtained in the saline-injected group (Fig. 3-2F).

The most striking effects of cystamine were observable on behaviour. Indeed, 6-OHDA-

lesioned mice treated with cystamine exhibited significant functional motor improvements

when tested on apomorphine-induced rotations 6 and 9 weeks post-lesion, as compared to

baseline measures (prior to the initiation of the cystamine treatment) and sham-operated

animals at these time-points (p< 0.05; Fig. 3-3B). Cystamine also induced functional

benefits in the stepping test which measures forelimb akinesia. The percentage of adjusting

steps - performed by the forepaw contralateral to the lesion - was re-established to normal

levels 6 and 9 weeks post-lesion in the cystamine group when compared to baseline (p<

0.05) which was similar to sham-operated animals (Fig. 3-3C). At 6 weeks post-lesion, a

significant difference (p< 0.05) was also observed between the cystamine and saline treated

6-OHDA lesioned groups, suggesting a full recovery in the 6-OHDA lesioned group treated

with cystamine at this time point. The assessment of limb-use asymmetry, as measured by

the cylinder test, further revealed a positive effect of cystamine on this motor component 9

weeks post-lesion, as opposed to the saline-injected 6-OHDA lesioned mice which

demonstrated sustained impairments over time (p< 0.05; Fig. 3-3D).

3.6.3 Post-lesion treatment with cystamine modulates cytotoxic/inflammatory

effectors in microglial cells

Several mechanisms of action by which cystamine could protect neurons in PD models

have been suggested (Gibrat and Cicchetti, 2011), including the increase in BDNF

expression (Gibrat et al., 2010). We thus undertook a series of in vitro studies to dissect the

mechanisms of action underlying the beneficial effects of cystamine. While cystamine pre-

treatment increased both intra- and extra-cellular BDNF levels in N2a cells (differentiated

into dopaminergic neurons) challenged with MPP+ (Fig. 3-4A for time-line), the compound

had no effect on BDNF expression when administered after MPP+ (p< 0.05; Fig. 3-4B). In

contrast, intra- and extra-cellular BDNF levels were significantly increased when cystamine

was administered after the 6-OHDA challenge in N2a cell culture (p< 0.05; Fig. 3-4C).

We further investigated whether the beneficial effects of cystamine observed while the

119

degenerative process is ongoing could be explained by similar mechanisms of action.

Animals treated with cystamine, both before and after MPTP, showed similar BDNF

protein levels in the ventral mesencephalon as compared to their respective controls (Fig. 3-

4D). Similarly, BDNF mRNA levels in the SNpc of 6-OHDA lesioned animals treated with

cystamine resembled those in the 6-OHDA lesioned mice that received saline treatments

(p< 0.05; Fig. 3-4E).

Cystamine has also been demonstrated to inhibit the apoptotic pathway via caspase-3 in

models of Huntington‟s disease (Dedeoglu et al., 2002; Van Raamsdonk et al., 2005;

Alvarez-Fischer et al., 2008b; Gibrat and Cicchetti, 2011) and systemic lupus

erythematosus (SLE) (Hsu et al., 2007). Here, cystamine pre-treatment induced a decrease

in Bax/Bcl2 ratio and cleaved caspase-3 levels in MPP+ challenged N2a dopaminergic

cells, which were similar to controls values. However, cystamine post-treatment did not

have any effects on these apoptotic markers. This was further reflected by the fact that

comparable cell death was observed in MPP+ stressed cells alone and cells that received

cystamine 24h post toxin challenge (p<0.05; Fig. 3-5A). The same results were also

obtained when N2a cells were challenged with 6-OHDA, except that the pre-treatment with

cystamine only partially decreased the Bax/Bcl2 ratio and cell death (p<0.05; Fig. 3-5B).

Thus, cystamine inhibits apoptosis induced by MPP+ and 6-OHDA in vitro only when

administered prior to toxin exposure, suggesting that additional mechanisms of action are

responsible for the beneficial effects of cystamine observed on the dopaminergic system

and motor behaviours in vivo.

Both the MPTP and the 6-OHDA lesioned mouse models are characterized by an

inflammatory response within the nigrostriatal pathway (Ambrosi et al., 2010; Cicchetti et

al., 2002; Depino et al., 2003; Drouin-Ouellet and Cicchetti, 2011; Henning et al., 2008;

Rodrigues et al., 2001; Rodrigues et al., 2004), a phenomenon reminiscent of the

neuroinflammation observed in PD pathophysiology (Drouin-Ouellet and Cicchetti, 2012;

Hirsch et al., 2012; McGeer et al., 1988; McGeer and McGeer, 1998). The subacute MPTP

model employed in our study induces a transient glial response that peaks on the 3rd

injection of the toxin and falls back to normal before the end of MPTP protocol (Drouin-

120

Ouellet et al., 2011). Therefore, the effects of cystamine on the glial response could not be

assessed in this model given the time points at which animals were sacrificed. Nonetheless,

we observed that both microgliosis and astrogliosis are still detectable 9 weeks following

the 6-OHDA lesion (Fig. 3-6C and D). However, a 6-week cystamine treatment failed to

decrease the number of nigral activated microglia (Fig. 3-6C), although a trend towards a

reduction in the number of nigral astrocytes could be observed in the 6-OHDA lesioned

group treated with cystamine when compared to the untreated lesioned group (p = 0.0577;

Fig. 3-6D).

Despite the fact that the total number of glial cells was not decreased with cystamine

treatment in vivo, this compound has been reported to reduce iNOS levels in an animal

model of SLE (Wang et al., 2009) and could thus reduce glial cell activation. We therefore

investigated whether cystamine could decrease the production of neurotoxic factors in

microglia and astrocytes in vitro. The effects of cystamine pre- and post-treatments were

thus assessed in glial cells challenged with 6-OHDA. iNOS dimers and nitrite oxide (NO)

are produced by glial cells when in a pro-inflammatory state (Galea et al., 1992; Murphy,

2000) and are often associated with tissue damage (Koprowski et al., 1993; Murphy, 2000).

Both the 6-OHDA-induced production of iNOS dimers and NO were partially dampened

by cystamine pre- and post-treatment in BV2 microglial cells (p<0.05; Fig. 3-6A). In

astrocytes, cystamine pre-treatment completely reduced iNOS dimer expression and

partially nitric oxide formation. The inhibition of iNOS and NO production in microglia

could be a mechanism by which cystamine has a positive effect on the dopaminergic

system and on behavioural impairments in the 6-OHDA mouse model when administered

after lesion initiation.

We then investigated the effects of cystamine on the microglial response using

lipopolysaccharide (LPS) and compared its effect with the potent anti-inflammatory drug

dexamethasone. Both cystamine pre- and post-treatments reduced the LPS-induced

protrusion length increase in microglial cells and demonstrated corresponding efficacy to

dexamethasone (p<0.05; Fig. 3-6B). The morphological changes induced by LPS were also

accompanied by an increase in -actin protein levels, which was prevented both by

121

cystamine and dexamethasone pre-treatments. Importantly, cystamine post-treatment

further reduced -actin expression, in contrast to the dexamethasone post-treatment, which

failed to generate such effects. Both pre- and post-treatments of cystamine or

dexamethasone reduced iNOS dimer levels, which matched control values. However,

cystamine was more potent at inhibiting LPS-induced nitric production in BV2 cells as

compared to dexamethasone when administered before and after the toxin challenge

(p<0.05; Fig. 3-6B). These results suggest that the mechanisms of action by which

cystamine promote neuronal survival may actually differ according to the stage of

degeneration and the time-window of treatment.

122

3.7 Discussion

Despite efforts made to find early biomarkers, most PD patients fail to be diagnosed before

50Ŕ75% of their dopaminergic neurons have degenerated (Morrish et al., 1998; Tanner and

Goldman, 1996). Current therapeutic strategies do not act on the underlying disease

processes and thus only provide symptomatic relief. There is thus a significant need for

treatment strategies that would modify the disease course and restore functionality lost by

the degeneration of the nigrostriatal neuronal pathway. This study was designed to

determine whether cystamine is effective in counteracting behavioural, biochemical and

pathological changes observed in two distinct neurotoxic mouse models of PD when the

treatment is administered during an ongoing DA-neuronal degeneration.

To assess the neurorescuing properties of cystamine, we used the subacute MPTP mouse

model which has been used in several comparable studies. The mild (∼ 30%) dopaminergic

cell loss induced by this MPTP treatment is reminiscent of early PD and well suited to

investigate neuroprotective and neurorescuing therapeutic strategies. While cystamine was

given as a pre-treatment to assess its neuroprotective capacities, the treatment began 24 h

after the last MPTP injection in the neurorescue paradigm. We designed the experiment

like this so that the treatment would only commence after the MPTP toxin was cleared, thus

avoiding direct interaction between the toxin and cystamine (Meredith et al., 2008). Using a

similar subacute MPTP regimen (1 injection/day for 5 days), it has been shown that

apoptotic pathways are activated as early as 3 days before the end of the MPTP injections,

with a peak on the last day of the injection protocol, which gradually decreases until 20

days post-MPTP (Tatton and Kish, 1997). Our observations also suggests that the MPTP

protocol used in our study increases the Bax/Bcl-2 protein ratio between 24 h and 14 days

post-MPTP (unpublished observations), which we chose as the time for the cystamine

administration period. This suggests that our cystamine treatment began when degeneration

was taking place, providing further evidence for the neurorescue properties of cystamine.

Despite the suitability of this model to assess the potential of cystamine to rescue the

dopaminergic system, the subacute MPTP lesion does not induce sufficient dopaminergic

cell loss to provoke DA-related behavioural impairments. We thus investigated the

123

therapeutic potential of cystamine in the 6-OHDA striatal lesioned mouse model. The

striatal 6-OHDA injections provoke nigral cell death by retrograde transport, which leads to

deficits in motor function reminiscent of PD (Meredith et al., 2008). Importantly, our

results indicate that cystamine has neurorescuing properties in this model. Indeed, a

continuous 6-week administration of cystamine following a 6-OHDA lesion (initiated 3

weeks post-surgery) can rescue the remaining neurons within the SNpc as well as part of

the striatal DA content. These observations were accompanied with a complete recovery of

behavioural impairments characteristic of the 6-OHDA lesioned model. A possible

mechanism for cystamine-induced behavioural improvements could be the increase of

striatal DA levels.

By tackling the neurorescuing potential of cystamine on the dopaminergic system using

distinct but complementary dopaminergic toxin-induced animal models, we have shown

that this molecule not only halts ongoing dopaminergic neuronal degeneration, but can also

induce functional recovery. Additionally, in vitro studies revealed a number of potential

mechanisms of actions by which cystamine could generate these beneficial effects.

3.7.1 BDNF stimulation

Increases in BDNF expression have been observed both in vitro and in vivo in the brain and

plasma of HD animal models (Borrell-Pagès et al., 2006). We also previously reported an

increase in nigral BDNF mRNA and protein expression in vivo when cystamine was given

concomitantly with MPTP (Gibrat et al., 2010). Our in vitro data revealed that cystamine

increases BDNF levels both in cells and media only when administered prior to MPP+.

However in the context of 6-OHDA challenge, the post-treatment also increased the

production and release of BDNF. The failure of cystamine to increase BDNF levels when

administered after MPTP in vivo may be due to the fact that cystamine does not act solely

on neurons but also on glial cells.

3.7.2 Anti-apoptotic properties

Cystamine can also be anti-apoptotic. This is not only due to its anti-oxidative properties

but also to its ability to protect against toxin-induced mitochondrial impairment (Stack et

al., 2008) and to act directly on caspases (Lesort et al., 2003; Hsu et al., 2008; Gibrat and

124

Cicchetti, 2011). In our study, we assessed the potential of cystamine to counteract

apoptosis by looking at the Bax/Bcl-2 ratio and through inhibition of caspase-3 activation.

In MPTP and 6-OHDA-challenged neuronal cells, we observed reduced apoptotic markers

only when cystamine was given prior to the toxins. Cystamine decreases pro-apoptotic

markers such as Bax and cleaved caspase-3 and increases the levels of the anti-apoptotic

protein Bcl-2. Interestingly, BDNF has been shown to promote neuronal survival through

the activation of the transcription factor cAMP-response element binding protein (CREB),

which drives the expression of the pro-survival gene Bcl-2 (Riccio et al., 1999). The

capacity of cystamine to increase Bcl-2 protein levels could be an indirect consequence of

its influence on BDNF expression, but also a direct influence on apoptotic pathways.

3.7.3 Anti-oxidative properties

Toxin-induced animal models of parkinsonism such as MPTP and 6-OHDA reproduce, to

some extent, oxidative stress-induced neuronal damage observed in PD (Zhou et al., 2008).

Intrastriatal injections of 6-OHDA results in higher expression of iNOS and NO (Gomes et

al., 2008; Singh et al., 2005) and increased NO production is also observed in the acute

MPTP mouse model (Muramatsu et al., 2002). In fact, it has been suggested that NO plays

a role in the initial phases of nigral degeneration, as pharmacological inhibition of iNOS

protects against neuronal loss in both animal models (Singh et al., 2005; Muramatsu et al.,

2002). Glial cells are important players in the modulation of the cerebral environment.

Indeed, astrocytes are able to take up 6-OHDA in vitro, which leads to oxidative stress

(Raicevic et al., 2005). The tendency of cystamine to reduce the number of astrocytes in the

SNpc observed in our study suggest that cystamine could play a protective role on

astrocytes by reducing the release of detrimental factors for the neurons, an hypothesis

which requires further attention.

In this study, we also investigated whether cystamine could modulate NO in glial cells. To

date, only one study reported the capacity of cystamine to reduce the activation of iNOS

and neuronal NOS (nNOS) in the brain of animal models of SLE (Wang et al., 2009). We

thus studied this mechanism in vitro using microglia and astrocytes cells challenged with 6-

OHDA. The toxin promotes both the intra-cellular activation of iNOS and the release of

125

nitrite in the media. Importantly, cystamine pre-treatment, but not post-treatment, was able

to modulate and significantly reduce both iNOS and NO levels. The effects observed could,

to some extent, be related to the anti-oxidative properties of cystamine (Fox et al., 2004),

considering that 6-OHDA promotes oxidative stress(Hanrott et al., 2006). To confirm the

ability of cystamine to reduce cell activation, we then evaluated the effects of cystamine on

microglia primed by LPS which activates the toll-like receptor 4 inflammatory pathway,

leading to pro-inflammatory mediator production. We further compared these effects with

the anti-inflammatory drug dexamethasone. Both cystamine and dexamethasone modulated

cell morphology and reduced microglial activation by regulating iNOS and nitrite release

(Huo et al., 2011). In this specific paradigm, cystamine was more effective than

dexamethasone when administered after LPS-induced microglial activation had been

triggered. This is likely due to its important anti-oxidative properties. The ability of

cystamine to modulate glial activation as observed in vitro might constitute one of the

mechanisms by which the dopaminergic system is protected in vivo (L'Episcopo et al.,

2010; Ousman and Kubes, 2012; Saavedra et al., 2006; Swanson et al., 2004).

In vitro and in vivo models may differ significantly in their capacity to mimic the

pathophysiology of PD. Here in vivo effects of cystamine on cell survival were observed

following repeated administration for 14 to 42 days, as opposed to a single cystamine

exposure in vitro. This could contribute to the discrepancy in the effect of the compound

observed in the two models studied. Nonetheless, the in vitro work provided insights on

how cystamine could impact on central nervous system cell types including neurons,

microglia and astrocytes. While it is currently unclear how these cells are interacting in vivo

upon cystamine treatment, the treatment could generate beneficial effects by acting on the

main pathways of neuronal degeneration, namely apoptosis/cell survival and

inflammation/oxidative stress.

3.7.4 Conclusions

We have demonstrated that cystamine can rescue dying dopaminergic neurons and restore

motor functions in two animal models of PD. The beneficial effects of cystamine in the

context of an ongoing degeneration is most probably multifactorial and could act at least in

126

part, through, the modulation of BDNF, apoptosis and glial toxic factors. Taken together,

these results reveal a beneficial effect of cystamine on pathological features and deficits

created in two different toxin-induced mouse models of PD. Importantly, our results

suggest that the effects of cystamine go beyond neuroprotection, putting forward the idea

that cystamine could be a good candidate for clinical trials in newly diagnosed PD patients.

127

3.8 Acknowledgments

This study was funded by a grant from Raptor Pharmaceuticals to Francesca Cicchetti.

Giulia Cisbani was supported by Parkinson Society Canada scholarship. Janelle Drouin-

Ouellet is supported by post-doctoral fellowship from the Fonds de la Recherche en Santé

du Québec. Claire Gibrat was supported by a Frederic Banting and Charles Best Canadian

Institutes of Health Research doctoral award. Manon Lebel was supported by the Canadian

Institutes of Health Research scholarship. Marie-Hélène Lavallée-Bourget and Laurie

Boivin were supported by recruitment scholarships from the Université Laval.

128

3.9 Figures

129

Figure 3-1. Effects of pre- and post-cystamine treatments on the nigrostriatal

dopaminergic system in the subacute MPTP mouse model

(A) Time lines of experimentation. (B-D) Pre- and post-treatment effects of cystamine on

the number of TH+ neurons (B), the densitometric levels of Nurr1 mRNA (C) and DAT+

cells (D) in the SNpc of MPTP-lesioned mice with corresponding photomicrographs in the

control (Saline + Saline), MPTP + Saline and post-MPTP Cystamine treated mice. Scale

bars: B: 100 µm; C: 1 mm; D: 270 m; inset = 500 μm. (E, F) HPLC quantification of

striatal dopamine content (E) and western-blot quantification of striatal TH protein levels

(F) in MPTP-lesioned mice. Values are expressed as means ± S.E.M. Statistical analyses

were performed using Step-down Bonferroni correction method. * = p < 0.05, significant

difference compared to Saline-Saline group. DA: dopamine; DAT: Dopamine transporter;

Nurr1: Nuclear Receptor related-1; OD: optical density; Pre: Cystamine Pre-treatment;

Post: Cystamine Post-treatment; SNpc: substantia nigra pars compacta; TH: tyrosine

hydroxylase.

130

Figure 3-2. Effects of pre- and post-cystamine treatments on the nigrostriatal

dopaminergic system in the 6-OHDA mouse model

(A-D) Cystamine pre- and post-treatment effects on the number of nigral NeuN+ cells (A),

TH+ neurons (B), the densitometric levels of Nurr1 (C) and DAT+ cells (D) in 6-OHDA-

lesioned mice. (E and F) HPLC quantification of the striatal dopamine content (E) and

131

western-blot analysis of striatal TH level (F) revealed that cystamine partially rescues the

striatal DA levels observed 9 weeks following the 6-OHDA lesion. Values are expressed as

means ± S.E.M. Statistical analyses were performed using Step-down Bonferroni correction

method. * = p < 0.05 significant difference compared to sham, # = p < 0.05, significant

difference compared to 6-OHDA/Cystamine group. DA: dopamine; DAT: Dopamine

transporter; NeuN: Neuronal Nuclei; Nurr1: Nuclear Receptor related-1; TH: Tyrosine

hydroxylase.

132

Figure 3-3. Beneficial effects of cystamine on motor impairments induced by a 6-OHDA-

lesion

(A) Time line of experimentation. (B-D) Throughout the experiment, mice were evaluated

using 3 different behavioural tests including apomorphine-induced rotations (B), adjusting

steps (C), limb-use asymmetry (D)) at 3 distinct time points: prior to the commencement of

the cystamine treatment (3 weeks post-surgery), 6 weeks and 9 weeks post-lesion.

Cystamine was shown to reverse behavioural nigro-striatal-related impairments induced by

a unilateral injection of 6-OHDA (apomorphine-induced rotations, stepping test and

cylinder test). (B) * = p < 0.05 significant difference compared to shams, # = p < 0.05,

significant difference compared to the 6-OHDA/Cystamine group; (C) * = p < 0.05,

significant difference compared to the sham group, # = p < 0.05, significant difference

compared to 6-OHDA/Cystamine group at 3 and 6 weeks post-lesion, & = p < 0.05,

significant difference compared to 6-OHDA/Cystamine group at baseline; + = p < 0.05

significant difference compared to 6-OHDA/Cystamine group.

133

Figure 3-4. Cystamine pre- and post-treatments modulate BDNF both in vitro and in

vivo using an MPTP or 6-OHDA challenge

(A) Time line of in vitro studies. (B, C) ELISA quantification of both BDNF N2a cell

extracts and media after 1.5 mM MPP+ or 100 M 6-OHDA and/or 250 µM cystamine

treatment. (D) ELISA quantification of BDNF in ventral midbrain in MPTP mice after

Cystamine or Saline pre- and post-treatments. (E) Densitometric levels of BDNF mRNA in

the SNpc of 6-OHDA lesioned mice. (B and C) * = p < 0.05, significant difference

compared to the cystamine group; # = p < 0.05, significant difference compared to

cystamine pre-treatment groups; & = p < 0.05, significant difference compared to the

control group; (D) * = p < 0.05, significant difference compared to the MPTP/Cystamine

134

pre-treatment group; (E) * = p < 0.05, significant difference compared to the 6-

OHDA/Cystamine treated group. Post = post-treatment; Pre = pre-treatment.

135

Figure 3-5. Anti-apoptotic action of cystamine in N2a cells challenged with MPTP and

6-OHDA

(A and B) Effects of cystamine on BAX/Bcl2 ratio, cleaved caspase-3 levels and cell

survival on N2a cells (differentiated into dopaminergic neurons) receiving either saline or

an MPP+/6-OHDA challenge. Values are expressed as means ± S.E.M. Statistical analyses

were performed using Step-down Bonferroni correction method. (A) * = p < 0.05,

significant difference compared to MPP+ treated N2a cells; (B) * = p < 0.05, significant

difference compared to 6-OHDA treated N2a cells; # = p < 0.05, significant difference

compared to control and cystamine groups; & = p < 0.05, significant difference compared

136

to Cystamine Post-treatment. C-caspase-3: Cleaved caspase-3; OD = optical density; Post =

post-treatment; Pre = pre-treatment.

137

Figure 3-6. Effects of cystamine on the glial response

(A) Effect of Pre- and Post-treatments of cystamine on iNOS and nitric levels in BV2 cells

138

and primary astrocytes. (B) Photomicrographs of BV2 cells stained with Phalloidin (red)

and depicting morphological changes following LPS (1 g/ml) challenge and/or cystamine

(250 M) treatment. Quantification of BV2 cell protrusions, actin and iNOS levels as well

as nitrite release following LPS (1 g/ml) challenge and/or cystamine (250 M) or

dexamethasone (1 M) treatment. Values are expressed as means ± S.E.M. Statistical

analyses were performed using Step-down Bonferroni correction method. Scale bar: 50 m.

(C, D) Stereological counts of microglia (Iba1+ cells) (C) and astrocytes (GFAP+ cells) (D)

in the SNpc revealed that cystamine does not attenuate the microgliosis and astrogliosis

caused by the 6-OHDA lesion. Scale bars: B: 400 µm (A) iNOS protein levels BV2 cells: *

= p < 0.05, significant difference compared to 6-OHDA group; # = p < 0.05, significant

difference compared to control group; $= p < 0.05 significant difference compared to

cystamine post-treatment group; &= p < 0.05 significant compared to cystamine pre-

treatment group (B) * = p < 0.05, significant difference compared to LPS group; # = p <

0.05, significant difference compared to cystamine pre-treatment; & = p < 0.05, significant

difference compared to cystamine post-treatment; + = p< 0.05, significant difference

compared to dexamethasone; % = p < 0.05, significant difference compared to

dexamethasone post-treatment; $ = p < 0.05 significant difference compared to

dexamethasone pre-treatment. Cys = Cystamine; DEX = dexamethasone; iNOS = inducible

nitric oxide synthase (iNOS); LPS = lipopolysaccharide; Post = Cystamine post-treatment;

Pre = cystamine pre-treatment.

139

4 Chapitre IV. Cystamine metabolism and brain

transport properties: clinical implications for

neurodegenerative diseases

Auteurs: Mélanie Bousquet

1,3, Claire Gibrat

1, Mélissa Ouellet

1,3, Claude Rouillard

1,2,

Frédéric Calon1,3

, Francesca Cicchetti1,2*

Affiliations: 1Centre de Recherche du CHUL (CHUQ), Axe Neurosciences, Québec, Québec, Canada

2Département de Psychiatrie et Neurosciences, Université Laval, Québec, Québec, Canada

3Faculté de Pharmacie, Université Laval, Québec, Québec, Canada

140

4.1 Résumé

La cystamine a montré des propriétés neuroprotectrices significatives dans des études

précliniques de la maladie de Parkinson (MP) et de Huntington (MH). La cystéamine, sa

forme réduite, est déjà approuvée par la FDA et devrait être bientôt testée pour vérifier son

efficacité clinique chez des patients huntingtoniens. Ici, nous avons étudié les métabolites

principaux de la cystamine, nommément la cystéamine, l‟hypotaurine et la taurine, ainsi

que la cystéine, afin d'identifier lequel de ces composés est plus spécifiquement chargé de

l'action neuroprotectrice de la cystamine. Après une seule administration de cystamine (10,

50 ou 200 mg/kg), les souris naïves ont été perfusées avec une solution saline tamponnée

au phosphate (PBS) à 1, 3, 12, 24 ou 48 h après l'injection et des échantillons cérébraux et

plasmatiques ont été analysés par deux méthodes HPLC distinctes. Bien que les

concentrations plasmatiques soient restées sous le seuil de détection, une augmentation

significative des niveaux de cystéamine a été détectée au cerveau avec les doses de 50 et

200 mg/kg chez les souris perfusées 1 et 3 h après l'injection de cystamine. Afin d'évaluer

davantage la cystéamine comme molécule candidate pour des essais précliniques et

cliniques dans la MP, nous avons évalué sa capacité à traverser la barrière hémato-

encéphalique (BHE). À l'aide d'une technique de perfusion cérébrale in situ, nous avons

déterminé que le coefficient de transport du cerveau (Clup) de la cystéamine (259 μM) était

de 0,15 ± 0.02 μL/g/s et a été augmenté jusqu'à 0,34 ± 0,07 μL/g/s lorsque la cystéamine

était co-perfusée avec la cystéine. Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que la

cystéamine est le métabolite neuroactif de la cystamine et soutiennent davantage son

utilisation thérapeutique dans les maladies neurodégénératives, en particulier la MH et MP.

141

4.2 Abstract

Cystamine has shown significant neuroprotective properties in preclinical studies of

Parkinson‟s disease (PD) and Huntington‟s disease (HD). Cysteamine, its FDA-approved

reduced form, is scheduled to be tested for clinical efficacy in HD patients. Here, we

studied the key cystamine metabolites, namely cysteamine, hypotaurine and taurine, as well

as cysteine, in order to identify which one is more distinctively responsible for the

neuroprotective action of cystamine. After a single administration of cystamine (10, 50 or

200 mg/kg), naïve mice were perfused with phosphate-buffered saline (PBS) at 1, 3, 12, 24

or 48 h post-injection and brain and plasma samples were analyzed by two distinct HPLC

methods. Although plasma levels remained under the detection threshold, significant

increases in cysteamine brain levels were detected with the 50 and 200 mg/kg doses in mice

perfused 1 and 3 h following cystamine injection. To further assess cysteamine as the

candidate molecule for pre-clinical and clinical trials in PD, we evaluated its capacity to

cross the blood brain barrier (BBB). Using an in situ cerebral perfusion technique, we

determined that the brain transport coefficient (Clup) of cysteamine (259 μM) was

0.15 ± 0.02 μL/g/s and was increased up to 0.34 ± 0.07 μL/g/s when co-perfused in the

presence of cysteine. Taken together, these results strongly suggest that cysteamine is the

neuroactive metabolite of cystamine and may further support its therapeutic use in

neurodegenerative diseases, particularly in HD and PD.

142

4.3 Contributions

La conceptualisation, l'élaboration et la demande de financement du projet ont été

effectuées via la collaboration de Dre Cicchetti, Dr Calon et Dr Claude Rouillard. Cet

article est, excepté pour la section perfusion cérébrale in situ, la continuité du protocole de

cinétique de la cystamine présenté au chapitre II. Nous avons ainsi utilisé le matériel post

mortem tel que précédemment décrit et poussé plus loin les analyses afin de préciser les

doses optimales d‟efficacité de la cystamine et d‟aborder l‟identification de molécules

intermédiaires impliquées dans l‟action de la cystamine. Cette partie de l‟étude fut donc

menée par moi-même jusqu‟à l‟étape de préparation des échantillons à analyser. Toute la

mise au point de la méthode et les analyses de détection par HPLC pour les différents

composés testés a été effectuée par Mélanie Bousquet qui est premier auteur du manuscrit.

La deuxième partie de cette étude, concernant le passage de la cystamine au travers la BHE,

faisait appel à la technique de perfusion cérébral in situ, méthode mise au point dans le

laboratoire de Dr Calon. Toutes les perfusions cérébrales in situ ont été effectuées par

Mélissa Ouellet (étudiante du Dr Calon) avec l‟assistance de moi-même et Mélanie

Bousquet. La préparation des échantillons a été faite par moi-même et les analyses HPLC

en découlant ont été faites par Mélanie Bousquet. Finalement, j‟ai effectué une partie du

montage des figures et Mélanie Bousquet a monté le reste des figures et écrit la première

version de l'article qui a ensuite été corrigée et améliorée par Dre Cicchetti et Dr Calon.

143

4.4 Introduction

Current treatments for Parkinson‟s disease (PD) are largely symptomatic and do not

prevent neuronal degeneration characteristic of the pathology. A growing body of evidence

lends support to protective properties of cystamine against neuronal degeneration observed

in subacute animal models of PD (Tremblay et al. 2006; Stack et al. 2008; Gibrat et al.

2010). These studies more specifically revealed that systemic cystamine administration

blunts the deleterious effects of MPTP, a toxin used to produce Parkinsonism in rodents,

such as the loss of dopaminergic neurons, the diminished dopamine-related gene Nurr1, as

well as the dopamine transporter mRNA levels within the substantia nigra (Tremblay et al.

2006; Gibrat et al. 2010). While some of the mechanisms of action underlying the

neuroprotective effects of these compounds have been unveiled, they remain largely

unexplored. Increased levels of neurotrophic factors, such as the brain-derived neurotrophic

factor (BDNF), have been identified as being, in part, responsible for the neuroprotective

effects of cystamine in animal models of PD (Gibrat et al. 2010). In high dose cystamine

delivery through drinking water, both attenuation of oxidative stress and deleterious effect

of MPTP on mitochondrial functions have been reported (Stack et al. 2008).

In animal models of Huntington‟s disease (HD), cystamine also has neuroprotective effects

by prolonging life span and decreasing motor symptoms of mice carrying the HD gene

(Dedeoglu et al. 2002; Karpuj et al. 2002). In vitro and in vivo evidence have shown the

capacity of cystamine to inhibit transglutaminase, an enzyme implicated in protein

aggregates such as the mutated form of huntingtin (Green, 1993; Jeitner et al., 2005; Wang

et al., 2005). The increase in brain levels of BDNF have also been pinpointed as one of the

key elements of this neuronal protective effect (Borrell-Pages et al. 2006).

Cysteamine, the reduced form of cystamine (2-aminoethanethiol) is already FDA-approved

for the treatment of cystinosis, a childhood disorder which causes renal failure through

cystine intracellular accumulation (Dohil et al., 2010). Because cysteamine has shown

significant efficacy in mice models of HD (Borrell-Pages et al. 2006) and its safety has

been documented, the molecule has already leaped to clinical trial for patients suffering

from this disorder (Dubinsky and Gray 2006). In addition, the beneficial effects of

144

cysteamine have recently been reported in a MPTP mouse model of PD (Sun et al. 2010).

To this day, the clinical efficacy in neurodegenerative diseases of either compounds,

cystamine and cysteamine, as well as their brain transport properties are unknown. It has

been hypothesized that when administered systemically, cystamine is rapidly cleaved into

two distinct cysteamine molecules. This contention is based on the molecular structure of

cystamine which, through a very unstable disulfide bound, can lead to the generation of two

cysteamine molecules. This theory is also based on the observations that cystamine remains

undetectable in brain, liver or kidney tissue homogenates after immediate cystamine

exposure (Pinto et al. 2005). The metabolism of cystamine actually generates several

intermediates including not only cysteamine, but also hypotaurine and taurine. Cystamine

and cysteamine are both organic compounds and were initially described as strong

radioprotectants against DNA irradiations (Bacq and Beaumariage 1965). Although

cysteamine is the decarboxylated form of cysteine, the main source results from its

constitutive production by all tissues via the degradation of coenzyme A (Pitari et al. 1992),

which is involved in metabolic processes notably in the generation of ATP through the

Krebs cycle (Leonardi et al., 2005). Although cysteine is a common constituent of most

proteins (Lee et al., 2004), basal cysteine plasma levels are usually low because its thiol is

susceptible to oxidation and leads to the disulfide derivative cystine.

Hypotaurine is synthesized from cysteine and cysteamine through the catalytic action of

cysteine and cysteamine oxygenase, respectively. Cysteine also requires a decarboxylation

to undergo conversion into hypotaurine (Cavallini et al., 1976; Ewetz and Sorbo, 1966).

Hypotaurine is then oxidized into taurine (2-aminoethanesulfonate), an abundant free

amino acid mainly acquired through seafood and meat consumption (Huxtable 1992). In

addition to having multiple peripheral functions such as being the major bile salt, under the

form of taurocholate (Bouckenooghe et al., 2006), taurine crosses the blood brain barrier

(BBB) and is involved in brain physiological activities such as inhibitory neurotransmission

and long-term potentiation (Muramatsu et al. 1978; Pasantes-Morales et al. 1981).

Although no evidence concerning the ability of cysteamine to cross the BBB are available,

some mechanisms for cysteine brain uptake have been proposed (Wade and Brady 1981)

and involve a neutral amino acid carrier system. The leucine-preferring system is more

145

specifically required for cysteine brain uptake (Oldendorf and Szabo, 1976; Wade and

Brady, 1981).

Despite strong evidence for the beneficial effects of cystamine and cysteamine in PD and

HD animal models and the launch of a small open-labeled trial in HD patients in 2006

(Dubinsky and Gray 2006), it remains unclear whether cystamine or its metabolites exert

the neuropharmacological action underlying their therapeutic effects. The objectives of the

present study were two-fold: (i) determine the plasma and brain concentrations of

cystamine and its metabolites cysteamine, hypotaurine and taurine after a single injection of

increasing doses of cystamine as well as cysteine, given that cystamine was shown to

increase brain l-cysteine levels in mice (Fox et al. 2004), (ii) determine the capacity of

cysteamine and cysteine to cross the BBB.

146


4.5.1 Animals and cystamine administration

Young adult (9-week old, 25 g) male C57BL/6 mice were purchased from Charles River

Laboratories (Montréal, QC, Canada). Animals were housed four per cage under standard

conditions with free access to food and water, randomized and handled under the same

conditions by one investigator. All experiments were performed in accordance with the

Canadian Council on Animal Care and were approved by the Institutional Committee of the

Centre Hospitalier de l‟Université Laval (CHUL). Throughout the experiment, the health

status of all mice included in the study was closely monitored. To clearly identify the active

intermediate following cystamine injection, as well as to understand its systemic and

cerebral metabolism, a single intraperitoneal (i.p.) injection of cystamine was administered

to normal adult C57BL/6 male mice using three different doses: 10, 50, and 200 mg/kg, as

determined in prior publications (Tremblay et al. 2006; Gibrat et al. 2010). These doses

were ultimately compared with saline injections. Cystamine was dissolved in sterile saline

(0.9%) and injected 1, 3, 12, 24 and 48 h before killing. Animals were killed under deep

anesthesia with ketamine/xylazine and perfused via intracardiac infusion with 0.1 M

phosphate-buffered saline. After intracardiac perfusion, brains were collected, snap-frozen

in 2-methyl-butane and then stored at −80°C until cryostat dissection for HPLC analyses. A

total of 200 mice were assigned to this study (n = 10 per group).

4.5.2 Cysteine and cysteamine HPLC measurements

HPLC coupled to fluorescence detection was used in cysteine and cysteamine

quantification of both sets of experiments: the dose-response study and in situ cerebral

perfusion (ISCP) procedures. Frontal cortex were homogenized in 200 μL of NaHCO3 and

then centrifuged at 15 700 g (4°C) for 20 min. Fifty μl of supernatant were directly

derivatized with 30 μL of 4-fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan (ABD-F) reagent. The

alkylation reaction was completed at 55°C for 15 min and stopped with 4.9 μL HCl 12 N.

After a 10-min centrifugation at 7500 g (4°C), the supernatant were immediately injected

into the chromatograph consisting of a Waters 717 plus autosampler automatic injector set

at 4°C, a Waters 1525 binary pump equipped with an Atlantis dC18 (3 μL; 3.9 × 150 mm)

147

column, and a Waters 2487 Dual Absorbance detector (Waters limited, Lachine, QC,

Canada). The excitation was set at 385 nm and emission at 515 nm. The mobile phase,

which consisted in 2.5% methanol and 0.1 M ammonium acetate adjusted at pH 4.0, was

delivered at 1 mL/min (Santa et al., 2006). Peaks were identified and quantified using

Breeze software (Waters limited). HPLC quantifications were normalized to protein

concentrations. Protein measurements were determined with a bicinchoninic acid protein

assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA) as described by the manufacturer‟s protocol.

4.5.3 Taurine and hypotaurine HPLC measurements

Taurine and hypotaurine were measured by HPLC coupled with UV detection. Supernatant

from NaHCO3 brain (bregma 1.54 to −0.58 mm) extracts (see section above for details)

were directly derivatized with the reagent dansyl chloride (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,

USA) based on modified published methods (Calon et al., 1999; Saller and Czupryna,

1989). Briefly, 50 μL of dansyl chloride (1.2 mg/mL) and 50 μL of sample or standard

solution were mixed and then incubated for 30 min at 90°C. After a 10-min centrifugation

at 7500 g (4°C), supernatants were immediately injected into the chromatograph described

above. Absorbance was set at 337 nm and the sensitivity at 0.5 absorbance unit full scale.

The mobile phase consisted of a water-acetonitrile mixture (88.5Ŕ11.35% v/v) containing

0.15% (v/v) of phosphoric acid and was delivered at a rate of 0.8 mL/min. Results were

obtained using the same method as described above.

4.5.4 In situ cerebral perfusion

In situ cerebral perfusion (ISCP) was performed under deep anesthesia prompted by i.p.

injection of a mixture of ketamine/xylazine (140/8 mg/kg) and as previously described

(Dagenais et al., 2000; Ouellet et al., 2009). To ensure that 100% of the perfusate reached

the BBB, the right common carotid artery was catheterized following ligation of the

external branch (see Fig. 4-3a for schematic representation). The thorax was then opened,

the heart removed and the perfusion immediately initiated at a flow rate of 2.5 mL/min. The

perfusion solution consisted of bicarbonate buffered physiological saline: 128 mM NaCl,

24 mM NaHCO3, 4.2 mM KCl, 2.4 mM NaH2PO4, 1.5 mM CaCl2, 0.9 mM MgCl2 and 9

mM d-glucose. The solution was gassed with 95% O2 and 5% CO2 to obtain a pH of 7.4

148

and subsequently heated at 37°C. In all experiments, a radiolabeled tracer (14C-sucrose 0.3

μCi/mL) was co-perfused with cysteamine (259 μM) and cysteine (165 μM), as a marker of

BBB integrity and of the vascular volume. Four distinct groups of naïve mice (n = 3) were

assessed in this study and were perfused with cysteine, cysteamine, both molecules or with

the 14C-sucrose alone which served as the control.

The procedure was terminated by decapitation of the mouse after 60 s of perfusion. The

right cerebral hemisphere was collected and the frontal cortex was dissected and rapidly

frozen on dry ice for HPLC measurements of cysteine and cysteamine. The remaining brain

tissue of this hemisphere was digested in 2 mL of Solvable (Perkin-Elmer Life Sciences,

Waltham, MA, USA) at 50°C for 48 h and mixed with 9 mL of Hisafe scintillation cocktail

(Perkin-Elmer Life Sciences). Aliquots of the perfusion fluid were taken before adding the

radiolabeled marker for HPLC quantification and after its passage through the syringe and

catheter for scintillation counting, at the end of each experiment, for the calculation of the

brain transport coefficient (see equation below). 14C isotope was counted in brain digest

and in perfusate in a Wallac scintillation counter (Perkin-Elmer Life Sciences). The

cysteine and cysteamine uptake clearance coefficients (Clup; μL/g/s) were calculated from

the measured volume of distribution of cysteine or cysteamine, corrected with the vascular

space determined with the 14C-sucrose. The vascular space was constant and under 20

μL/g. The following equation was used for final calculations, as previously described

(Dagenais et al. 2000).

Clup (ml g-1

s-1

) = Vd, in which Vd = Xcysteine - Xsucrose

T Ccysteine perf Csucrose perf

Vd (μL/g) represents the volume of distribution of the study compound, T (s) is time of

perfusion, Xcysteine (ng/mg of tissue) or Xsucrose (dpm/g) is the quantity of cysteine or

sucrose found in the frontal cortex or in the remaining tissue of the hemisphere,

respectively. C is the concentration (ng/μL; dpm/mL) in the perfusion solution (cysteine

serving as an example in the above equation).

4.5.5 Data and statistical analyses

All data are expressed as group mean ± S.E.M. Data were assessed by two-way ANOVAs

149

and analyzed for significance using student‟s t-test. Each group was compared with the 0

mg/kg group of the associated time point (1, 3, 12, 24 or 48 h). For ISCP experiments,

student‟s t-test was used to analyze significance. In all cases, a p value of less than 0.05

was considered to be significant.

150

4.6 Results

4.6.1 General effect of cystamine administration

Throughout the dose-response study, no death was reported and all mice displayed good

health except for the 200 mg/kg cystamine group where mice displayed signs of

hypothermia (shivering) and somnolence (closing of eyelids) for a period of approximately

2 h, as previously reported (Gibrat et al. 2010).

4.6.2 Plasma and brain cysteine and cysteamine levels following cystamine

administration

To investigate the metabolites found in the plasma and brain of mice injected with a single

cystamine i.p. dose, a highly sensitive HPLC method was utilized and allowed us to

specifically measure cysteamine and cysteine through a thiol (-SH) derivatization using

ABD-F compound prior to fluorescence detection (Fig. 4-1a). Cysteamine was undetectable

in the plasma of cystamine-treated mice. Contrary to bodily expression, cerebral analyses of

cysteamine and cysteine concentrations revealed a marked increased in brain cysteamine

(Fig. 4-1b). This increase was observed for all three doses of cystamine administered and at

each time point targeted by this dose-response study. Two-way ANOVA revealed

significant differences for both factors; doses and time as well as a significant interaction

between those two factors (p < 0.0001). Post hoc analyses revealed significant increases

specifically at 1 h post-injection for the 50 mg/kg (p < 0.05) and 200 mg/kg (p < 0.01)

doses. Cysteamine levels remained significantly elevated 3 h following cystamine

administration (p < 0.01) and progressively diminished through 48 h, when compared with

the saline group. Cystamine administration did not affect cysteine plasma (data not shown)

or brain levels, even at the highest dose of 200 mg/kg (Fig. 4-1c). There were no

indications of any significant changes in cysteine plasma and/or brain levels for any of the

doses or time points studied.

4.6.3 Plasma and brain hypotaurine and taurine levels following cystamine

administration

Hypotaurine is a major metabolite of cysteamine, which can, in part, generate taurine. To

determine the concentration of these two molecules, a primary amino group derivatization

151

with dansyl chloride prior to UV detection was utilized (Fig. 4-2a). This reaction takes

place in both aromatic and aliphatic amine, producing stable sulfonamide adducts and

allowing the detection of both hypotaurine (Fig. 4-2a; compound 2) and taurine (Fig. 4-2a;

compound 1) within the same method. Despite some variation between groups, no

significant alteration of brain hypotaurine and taurine was observed for any of the three

doses (10, 50 or 200 mg/kg) and as compared with control groups (Fig. 4-2b and c). There

were no signs of brain accumulation of hypotaurine and taurine at any of the time points of

killing (1, 3, 12, 24 and 48 h). Plasma levels remained under or close to the detection

threshold (data not shown).

4.6.4 Cysteine facilitates cysteamine brain transport

As a vast majority of endogenous and exogenous compounds are inactive in the CNS

because they do not cross the BBB, we investigated cysteamine and cysteine brain uptake.

Using ISCP, we measured cysteamine and cysteine blood-brain transport parameters by

directly infusing the brain via the carotid artery (Dagenais et al. 2000; Ouellet et al. 2009)

(Fig. 4-3a). Both cysteine and cysteamine crossed the BBB, as observed by their brain

transport coefficient (Clup), which corresponded to 4.39 ± 0.47 and 0.15 ± 0.02 μL/g/s,

respectively (Fig. 4-3b and c). In comparison, a routinely used CNS drug, like morphine,

displays a Clup of 0.3 μL/g/s, whereas highly diffusible drugs like diazepam or fatty acids

display a Clup which reaches up to 40 μL/g/s (Bourasset et al., 2003; Ouellet et al., 2009).

Interestingly, co-perfusion of cysteine and cysteamine potentiated their brain uptake.

Indeed, significant increase of the Clup of cysteamine (+133%; p < 0.05) and of cysteine

(+59%; p < 0.05) were measured when both compounds were injected simultaneously (Figs

4-3b, c and 4-4). Hypotaurine and taurine, which have been shown to cross the BBB, were

not re-evaluated (Benrabh et al., 1995).

152

4.7 Discussion

Results from the present work strongly suggest that cysteamine is the key neuroactive

compound following systemic administration of cystamine. Among the molecules

investigated through HPLC measurements, which included cysteamine, cysteine,

hypotaurine and taurine, cysteamine was found to be the only one significantly increased in

brains of naïve mice following a single i.p. injection of 50 mg/kg and 200 mg/kg. In

contrast, cysteine, hypotaurine and taurine levels remained unchanged or under the

threshold of detection. In addition, we demonstrated that cysteamine crosses the BBB in

significant amount in vivo. These observations provide important information pertaining to

the neuropharmacology of cysteamine and further support its clinical relevance.

The neuroprotective effects of cystamine have been evidenced by the attenuation of

subacute MPTP neurotoxicity (Tremblay et al. 2006) and the modulation of BDNF was

identified as one of the underlying mechanisms in PD (Gibrat et al. 2010) and HD mice

models (Borrell-Pages et al. 2006). Other potential mechanisms, such as the increase in

Nurr1 mRNA and tyrosine hydroxylase protein expression, central players of the

dopaminergic system, were also suggested to participate to the protective effects of

cystamine in the MPTP model of Parkinsonism (see Fig. 4 for schematic representation of

mechanistic pathways in PD) (Gibrat et al. 2010).

Previous reports have provided indirect evidence that each cystamine molecule is rapidly

metabolized into two molecules of cysteamine following cleavage of its disulfide bond

(Pinto et al. 2005). Our observations for the absence of detectable cystamine in plasma

corroborate earlier reports performed in mice receiving doses of 225 mg/kg per day during

a 5 or 8-month period (Pinto et al. 2005). Administration of cystamine to naïve mice in our

study did not impact plasma or brain levels of cysteine, contrasting with previous studies

which reported higher cysteine cerebral concentrations after a 14-day (drinking water) or a

28-day (i.p. injections) cystamine treatment in two mice models of HD (Fox et al. 2004;

Pinto et al. 2005). This suggests that repeated cystamine administration is necessary to

increase cerebral cysteine concentrations. However, HPLC analyses shown here clearly

reveal an important increase in cysteamine brain concentrations following a single i.p.

153

injection of cystamine, inconsistent with observations in HD mice models using a different

route of administration (Pinto et al., 2005) but comparable to results obtained in rats with

cysteamine provided in a short-term diet or by gavage treatments (Coloso et al., 2006; Pinto

et al., 2009).

Hypotaurine and taurine are two important putative metabolites of cystamine with

documented CNS effects. Taurine is known to play critical cerebral roles such as

osmoregulation (Oja and Saransaari, 1996) and has neuroprotective functions against

glutamate-induced excitotoxicity (French et al., 1986). Because brain levels of the enzyme

cysteine dioxygenase are relatively low (Dominy et al., 2004), it has been hypothesized that

most of the brain hypotaurine, and consequently taurine, originate from cysteamine

dioxygenase, an enzyme present in mouse and rat cerebral tissues (Dominy et al., 2007).

Although taurine is largely acquired through certain types of food (seafood and meat),

cysteamine could be a significant precursor of taurine (Coloso et al. 2006). In our study,

cerebral hypotaurine and taurine levels remained stable after cystamine administration, in

accordance with previous observations in HD mice chronically treated with cystamine

(Pinto et al. 2005). However, cysteamine-enriched diet (7.2 g/kg of diet) was shown to

increase hypotaurine levels, while leaving brain taurine concentrations unaffected in the rat

(Coloso et al. 2006). This effect of cysteamine on brain hypotaurine, which differs from our

observations, may be explained by the total administered dose, and/or be attributable to

significant interspecies variations (Martignoni et al., 2006).

The BBB is a major obstacle to the clinical application of a vast majority of potentially

neuroactive compounds and must be taken into account when determining which

metabolite of cystamine exerts its therapeutic effect. Amino acid transporters are well-

studied BBB components and comprise leucine, alanine, serine, or cysteine-preferring

systems (Sershen and Lajtha, 1979; Wade and Katzman, 1975). Cysteine has been

recognized to use the leucine-preferring system to cross the BBB (Wade and Brady 1981).

The capacity of taurine to cross the BBB has also been described in rats utilizing ISCP and

seemingly involves an endothelial cell sodium and chloride-dependant influx system

(Benrabh et al. 1995). The mechanism by which cysteamine, on the other hand, can cross

154

the BBB requires further investigations. Here, a quantitative and highly sensitive technique

was employed to study BBB transport of cysteamine and cysteine. This was performed

without compromising the physical or functional integrity of the BBB and by bypassing

peripheral metabolism processes associated with systemic administration. We demonstrated

the capacity of cysteamine and cysteine to reach the brain in significant amount.

Cysteamine brain uptake was further facilitated by the addition of cysteine in the perfusate.

This suggests that cysteamine and cysteine form a mixed disulfide more readily transported

through the BBB, as hypothesized previously by Pinto et al. (Pinto et al. 2009). As cysteine

is present in the blood, the formation of this mixed disulfide may occur spontaneously in

vivo and contribute to the brain bioavailability of cysteamine.

Cystamine has shown neuroprotective properties and has proven benefits in PD and HD,

two pathologies without any curative treatments. Animal studies have granted to

cysteamine similar beneficial properties in the context of HD (Borrell-Pages et al. 2006)

and very recently in PD (Sun et al. 2010), which have led to clinical trials in HD patients

(Dubinsky and Gray 2006). Taken together, our data suggest that cysteamine is the major

intermediate involved in the therapeutic action of cystamine. The ability of cysteamine to

cross the BBB also reinforces the use of this medication for PD as well.

155

4.8 Acknowledgments

This study was supported by the Fondation Canadienne pour l’Innovation (HPLC system),

the Canadian Institutes of Health Research to Francesca Cicchetti and Claude Rouillard.

Mélanie Bousquet was initially supported by a student scholarship from the Fonds de la

Recherche en Santé du Québec and subsequently by a Vanier Canada Graduate Scholarship

from Canadian Institutes of Health Research. Claire Gibrat was initially supported by

studentships from the Fonds de la recherche en santé du Québec and Natural Sciences and

Engineering Research Council of Canada and is now supported by a Frederick Banting and

Charles Best Canada Graduate Scholarship from the Canadian Institutes of Health

Research.

The authors declare no conflict of interest.

156

4.9 Figures

Figure 4-1. Increased levels of brain cysteamine

Cerebral cysteamine (b) and cysteine (c) levels measured by HPLC coupled with

fluorescence detection. Molecular structures and HPLC elution profiles of a standard

solution of cysteamine (2) and cysteine (1) are represented in (a). Cysteamine was

significantly increased in response to a single cystamine i.p. injection of 50 mg/kg in mice

killed 1 h following the injection, as compared with vehicle mice killed at the same time

157

point (p < 0.05) (b). The 200 mg/kg dose also provoked a significant increase of cysteamine

1 h and 3 h following the cystamine injection (p < 0.01) (b). Cysteine cerebral levels were

stable regardless of doses and perfusion times (c). Data are expressed as means (nmol/mg

of protein) ± S.E.M. *p < 0.05; **p < 0.01.

158

Figure 4-2. Constant levels of brain hypotaurine and taurine

Cerebral hypotaurine (b) and taurine (c) concentrations measured by HPLC coupled with

UV detection. Molecular structures and HPLC elution profiles of a standard solution

containing 1 ng/mL of taurine (1) and hypotaurine (2) are represented in (a). Stable brain

measures of hypotaurine (b) and taurine (c) were observed. Data are expressed as means

(nmol/mg of protein) ± S.E.M.

Tau

rin

e ce

reb

ral

level

1 3 12 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

0 5010 200

Sacrifice timeCystamine(mg/kg)

(nm

ol/

mg o

f p

rote

in)

Figure 2

Bousquet et al., 2010

(nm

ol/

mg

of

pro

tein

)

Time

AU

FS

(1)

(2)

A

B

C

1 3 12 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48 1 3 12 24 48

0 5010 200

Sacrifice timeCystamine(mg/kg)

NH2S

O

HO

Hypotaurine (2)

NH2S

O

HO

Taurine (1)

O

0

0.3

0.5

0.8

Hy

po

tauri

ne

cere

bra

l le

vel

0

0.3

0.5

0.8

1.0

1.3

*

159

Figure 4-3. Increased cysteamine brain uptake in the presence of cysteine

Demonstration of cysteamine and cysteine brain uptake using in situ cerebral perfusion

technique and quantification by HPLC method. Schematic illustration of in situ cerebral

perfusion method (a). A catheter is directly inserted into the right internal carotid artery to

ensure 100% of the perfusate to reach the right hemisphere after proper ligatures (blue

vessels) (a). Both cysteine (b) and cysteamine (c) can cross the blood brain barrier as

demonstrated by the high clearance coefficient of each molecules (μL/g/s). When co-

perfused, cysteine and cysteamine clearance coefficients increase significantly. Data are

expressed as means ± S.E.M. (μL/g/s) *p < 0.05.

Figure 3

Bousquet et al., 2010

Cysteamine brain uptake

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45* L-Cysteine

L-Cysteine and

cysteamine co-perfusion

Cysteamine

Clu

p (m

lg-1

s-1)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Cysteine brain uptake

*

A

B C

PerfusateCatheter

Brain

Righthemisphere

Lefthemisphere

Right commoncarotid artery

Right externalcarotid artery

Right internalcarotid artery

160

Figure 4-4. Hypothetical cystamine routing following a single i.p. injection

Elaboration of the potential pathways involved in cystamine‟s effects following i.p.

administration. Cystamine reaches the blood stream through absorption into capillaries of

the abdominal cavity. It then enters the systemic circulation via the portal vein, which

drains the gastrointestinal tract, before being metabolized in the liver, where it is processed

into two molecules of cysteamine which subsequently circulate under this reduced form to

reach the brain. In situ cerebral perfusion assessment confirmed the ability of cysteamine to

161

cross the blood brain barrier and that cysteamine brain uptake can be up-regulated by the

addition of cysteine. Once in the brain, cysteamine acts within various structures such as

the striatum and substantia nigra as we previously reported (Gibrat et al. 2010). Cystamine

acts directly onto the dopaminergic system by enhancing tyrosine hydroxylase (TH) protein

expression in the striatum and increasing the gene expression of Nurr1, a key player in the

development and maintenance of the dopaminergic phenotype. The up-regulation of the

expression of the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has also been recognized as a

mechanism of action of the neuroprotective effects of cystamine and cysteamine in

Parkinson‟s disease (Gibrat et al. 2010; Sun et al. 2010) and Huntington‟s disease (Borrell-

Pages et al. 2006).

163

5 Chapitre V. Discussion

5.1 Synthèse des résultats et objectifs de ce chapitre

Les résultats obtenus au cours de mon doctorat convergent vers la conclusion d‟un réel

potentiel thérapeutique de la cystamine dans le contexte de la MP. En effet, nos

investigations confirment non seulement le pouvoir neuroprotecteur de la cystamine

lorsqu‟administrée avant l‟induction de la pathologie par la toxine MPTP, mais démontrent

également des capacités à stopper un processus neurodégénératif déjà initié dans le même

modèle. De surcroit, la cystamine présente en contexte symptomatique, un effet bénéfique

sur les déficiences motrices induites par une lésion à la 6-OHDA. Cet effet comportemental

s‟accompagne d‟une modulation de la perte neuronale dans la SNpc. La combinaison

d‟approches in vivo et in vitro nous a permis d‟associer ces effets bénéfiques à une fine

régulation du facteur neurotrophique BDNF ainsi qu‟à une modulation de certains facteurs

apoptotiques et composés cytotoxiques pro-inflammatoires. Ces approches nous ont

également permis de souligner les cellules gliales comme médiateurs importants des effets

bénéfiques de la cystamine. L‟étendue des doses testées a également permis, en contexte

pré-clinique, l‟identification des doses optimales d‟efficacité de la cystamine dans des

modèles animaux; une faible dose produisant des effets bénéfiques alors qu‟une dose plus

élevée n‟induit pas d‟effets thérapeutiques ou, pour les plus hautes doses, engendre des

effets secondaires. Nos travaux pointent enfin la cystéamine comme l‟intermédiaire majeur

impliqué dans l‟action thérapeutique de la cystamine et démontrent sa capacité à traverser

la BHE in vivo.

Les résultats contenus dans cette thèse ont déjà été discutés dans les articles insérés aux

chapitres II, III et IV. Le présent chapitre a donc pour objectif la discussion des résultats

sous un angle plus général de même que la mise en relation et en perspective des études

réalisées au cours mon doctorat. En première instance, nous parlerons des effets

thérapeutiques de la cystamine observés par différentes équipes de recherche incluant la

nôtre dans le contexte de la MP. Cette première partie nous permettra également de discuter

des modèles parkinsoniens utilisés dans nos études pour la démonstration des propriétés de

164

la cystamine. En deuxième lieu, nous discuterons les mécanismes d‟action de la cystamine

qui sous-tendent ses effets bénéfiques. Enfin, l'avenir de la cystamine, à titre de traitement

de la MP sera aussi discuté dans un objectif de recherche translationnelle.

165

5.2 Effets thérapeutiques de la cystamine dans divers modèles

de la MP

5.2.1 Choix et validité des modèles employés dans nos études

5.2.1.1 Le modèle murin MPTP subaigu

Le MPTP peut être administré selon de multiples paradigmes en fonction des

caractéristiques biochimiques et neuropathologiques recherchées. Chez la souris, le MPTP

administré de manière systémique, le plus souvent en s.c. ou i.p., provoque des lésions

bilatérales de la SNpc. La cinétique et l‟intensité de la perte neuronale sont influencées par

la souche utilisée, l‟âge, le sexe, la dose cumulée et le rythme d‟administration (Gerlach

and Riederer, 1996). Les doses et les fréquences d‟injections du MPTP vont donc

déterminer le degré et l‟évolution de la dénervation dopaminergique mais également la voie

de mort cellulaire enclenchée par la cellule (nécrotique ou apoptotique) (Schmidt and

Ferger, 2001). Ainsi, selon le protocole expérimental utilisé, l‟expérimentateur peut

reproduire des stades différents de la maladie (Schober, 2004). Il n‟existe donc pas un

modèle MPTP mais des modèles MPTP développés par les équipes de recherche selon leurs

besoins pour étudier les différents aspects de la neurodégénérescence dopaminergique.

Parmi les différents régimes d‟administration du MPTP les plus souvent utilisés, on

rencontre une faible dose unique de 10-20 mg/kg (Aubin et al., 1998), quatre doses de 20

mg/kg à intervalle de deux heures (Jackson-Lewis et al., 1995), une ou deux doses

quotidiennes de 20 mg/kg durant cinq jours (Tatton and Kish, 1997; Vila et al., 2001). C‟est

ce dernier traitement, dit subaigu (7 injections i.p. de MPTP-HCl (20 mg/kg) à raison de 2

injections/jour à 12 heures d‟intervalle les 2 premiers jours, puis 1 injection/jour pour les 3

jours suivants), que nous avons choisi d‟utiliser dans nos études puisque, a l‟encontre des

deux modèles précédemment cités, ce modèle induit une dégénérescence modérée du

système dopaminergique nigro-strié selon un mode apoptotique (Tatton and Kish, 1997;

Vila et al., 2001). En effet, 24 heures suivant la dernière injection de MPTP, nous

observons une hausse significative de la protéine pro-apoptotique BAX ainsi qu'une

diminution de Bcl-2 chez les souris MPTP traitées avec le régime d'administration subaigu

(chapitre III) suggérant un mode de mort neuronale qui implique des mécanismes

166

apoptotiques tel qu'observé chez les patients parkinsoniens (Simunovic et al., 2009).

Plusieurs données physiopathologiques relatives au protocole d'injection subaigu appliqué

dans nos études sont disponibles dans la littérature (Bousquet et al., 2009; Bousquet et al.,

2008; Costantini et al., 2001; Gibrat et al., 2010; Gibrat et al., 2009; Sun et al., 2010; Tatton

and Kish, 1997; Tremblay et al., 2006; Vila et al., 2001). Ces études ont évalué de façon

constante à environ 30% la dégénérescence des neurones dopaminergiques dans la SNpc et

à 50-70% la diminution des niveaux de dopamine striatale. Ainsi, ce modèle se rapproche

du schéma de la neurodégénérescence observé chez les patients parkinsoniens en phase

précoce pré-symptomatique. Le modèle ici employé constitue donc un modèle fiable et

reproductible pour investiguer une approche neuroprotectrice de même qu‟une approche

visant les mécanismes précoces de la dégénérescence impliquant l'apoptose (neurorescue).

Le modèle subaigu fut donc le modèle de choix pour la plupart des études de notre

laboratoire qui visaient la neuroprotection/neurorescue dans un contexte parkinsonien. Il

est important de mentionner que ce choix fût également grandement guidé par la première

étude qu‟il me fut donné d‟entreprendre (publication non insérée dans ce manuscrit). En

effet, en quête d‟un modèle animal pouvant répliquer le plus fidèlement possible tous les

aspects pathologiques de la MP, dont sa progressivité, nous avons testé différents modes

d‟administration chronique basée sur l‟infusion continue du MPTP i.p. ou s.c. via une

minipompe osmotique et les avons comparé au modèle subaigu. Les résultats de cette étude

ont démontré que le modèle le plus efficace, juste avant le modèle subaigu, est une infusion

chronique de MPTP pendant 14 jours (46 mg/kg/jour). Ce modèle provoque une

dégénérescence nigrale significative de 45% et, contrairement aux modèles MPTP aigu ou

subaigu, induit la formation d‟agrégats d‟-synucléine dans les neurones dopaminergiques

de la SNpc (Gibrat et al., 2009).

167

Figure 5-1. Comparaison de divers modes d’administration de la toxine MPTP

(A). Le mode d'administration i.p. produit une dégénérescence modérée au niveau striatal et importante au

niveau nigral (D). L‟administration du MPTP par une pompe de 14 jours induit une dégénérescence nigrale

sévère, mais une faible perte de fibres striatales. Quant aux modes d‟administration chronique de 28 jours

(voies i.p. et s.c.), ils ont peu ou pas d‟effets sur le système DA (D). (B). Illustration des mécanismes d‟action

du MPTP. (C). Pharmacocinétique hypothétique des divers régimes MPTP testés. Figure tirée de Gibrat et al.,

2009.

Cependant, outre le fait que ce modèle implique un coût très important (pompes

168

osmotiques) et demande l‟utilisation de techniques chirurgicales invasives, il présente

également beaucoup de variabilités interindividuelles et est difficile à reproduire de

manière constante. La fiabilité des pompes osmotiques est une composante à vérifier

systématiquement ce qui ajoute à la technicité du modèle. Le modèle MPTP subaigu, plus

simple et plus constant, fut donc naturellement choisi pour nos expérimentations.

Le modèle MPTP subaigu présente toutefois quelques lacunes lorsque l‟on souhaite

investiguer certains mécanismes d‟action de la cystamine. En effet, ce modèle ne permet

pas la visualisation post mortem de l‟activation microgliale puisque ces phénomènes ne se

manifestent que transitoirement, au début de la dégénérescences dopaminergique engendrée

par la toxine. En effet, nous avons mis en évidence une faible augmentation de la densité

microgliale dans la SNpc de souris MPTP, 24 heures suivant un traitement subaigu. Le

nombre de cellules microgliales revient toutefois à des niveaux semblables aux contrôles, 7

et 14 jours post-MPTP. Cette activation microgliale transitoire a été confirmée dans notre

laboratoire de manière plus précise à l‟aide de l‟imagerie en bioluminescence en temps réel

via la lignée de souris transgéniques Tlr2-fluc-GFP qui expriment le gène de luciférase sous

le contrôle du promoteur Tlr2 murin (Lalancette-Hebert et al., 2009). En effet, une

augmentation cérébrale significative du signal du récepteur toll-like 2 (Tlr2), qui reflète

l‟activation des microglies, est notée à la suite de la troisième injection de MPTP et ces

niveaux significativement élevés reviennent à l'état basal avant la fin du protocole

d'administration de la toxine (Drouin-Ouellet et al., 2011). Nos études nous ont permis

également d‟observer une augmentation significative de l‟expression striatale de GFAP, 14

jours post-traitement MPTP. Un traitement MPTP subaigu semble donc induire un

processus inflammatoire qui se traduit par une prolifération précoce des microglies dans la

SNpc, mais une activation plus durable de la population astrocytaire striatale.

Une autre faiblesse importante à souligner pour le modèle subaigu et la plupart des modèles

MPTP, est l‟absence d‟affectation motrice cohérente avec la déplétion dopaminergique

produite. La dégénérescence modérée rencontrée dans le modèle MPTP subaigu utilisé dans

nos études, bien que souhaitable pour investiguer une approche neuroprotectrice, est

probablement à l‟origine de l‟absence de déficit comportemental rencontrée par notre

169

équipe en test «open-field» (Gibrat et al., 2009). Ceci est en accord avec les observations

chez l'humain, où lors de la manifestation des premiers symptômes moteurs de la MP, de

60-70% des neurones sont déjà dégénérés (Lang and Lozano, 1998). D‟autres tests plus

sensibles auraient pu être en mesure de mettre en évidence des déficits moteurs chez ces

souris. Cependant, dans de nombreux modèles MPTP, les effets observés à moyen et à long

terme sur le comportement moteur sont parfois contradictoires (Arai et al., 1990; Chia et

al., 1996; Nishi et al., 1991). Ceci incombe notamment au fait que les doses, le régime de

même que la voie d'administration du MPTP varient parmi les laboratoires en plus de la

souche de souris utilisée et des analyses comportementales effectuées (Sedelis et al., 2001).

Afin d‟aborder les propriétés de la cystamine sous un nouvel angle tout en palliant certaines

faiblesses du modèle MPTP subaigu, nous avons choisi d‟étudier les effets de la cystamine

dans un autre modèle : le modèle murin 6-OHDA. Ce modèle de dégénérescence

dopaminergique plus agressif, qui mime une phase symptomatique de la MP, devait

permettre d‟investiguer les répercussions de la molécule sur la récupération fonctionnelle.

5.2.1.2 Le modèle murin de lésion intrastriatale unilatérale de 6-OHDA

Pour tester l‟efficacité de restauration comportementale de la cystamine, nous avons opté

pour un modèle de souris parkinsonienne basé sur l‟injection intrastriatale unilatérale de 6-

OHDA. Comme décrit dans l‟introduction, l‟injection intrastriatale de la toxine permet

d‟obtenir une dégénérescence des neurones dopaminergiques de la SNpc rétrograde et

progressive (Przedborski et al., 1995). Ce modèle simple à mettre en œuvre et reproductible

permet de tester aisément les traitements expérimentaux et leur aptitude à modifier ou

restaurer certains comportements moteurs supposés représenter un phénotype parkinsonien

(Bernheimer et al., 1973).

L‟avantage majeur de la lésion unilatérale de 6-OHDA, complète ou partielle, réside en ce

qu‟elle entraîne une asymétrie posturale jointe à une akinésie unilatérale. Ces

manifestations peuvent être mesurées par des tests de comportements moteurs spontanés ou

induits (Ungerstedt and Arbuthnott, 1970; Zetterstrom et al., 1983). Dans nos études nous

avons tout d‟abord effectué le test du rotomètre pour évaluer la perte dopaminergique.

Cependant, ces mouvements rotatoires sont assez éloignés de ce qui est observé chez

170

l‟humain où des anomalies motrices existent en l‟absence de tout traitement

pharmacologique. De plus, l‟apomorphine utilisée pour induire le mouvement rotatoire peut

influencer le contenu en catécholamines et par le fait même biaisé l‟interprétation d‟un effet

fonctionnel de la cystamine. Pour toutes ces raisons, les facultés motrices des souris ont été

évaluées dans un groupe supplémentaire d‟animaux, avec d‟autres tests comportementaux

basés sur des réactions innées et involontaires ne nécessitant pas l‟utilisation de substances

pharmacologiques (stepping-test, test du cylindre). Les tests utilisés sont présentés dans le

chapitre III.

Même si des phénomènes de compensations par le côté intact peuvent exister dans une

lésion unilatérale, l‟injection bilatérale de 6-OHDA est habituellement évitée en raison d‟un

taux de mortalité animale élevé et de la nécessité de soins post-chirurgicaux intensifs

(Blandini et al., 2008). L‟injection massive de 6-OHDA dans le MFB ou directement dans

la SNpc a été intensivement utilisée pour des études comportementales, pharmacologiques

et de thérapies expérimentales (Francardo et al., 2011). Cependant, la lésion induite résulte

en une perte très rapide de plus de 98% des neurones dopaminergiques de la SNpc. Ce

modèle n‟est donc pas adapté pour les études de neuroprotection, neurorescue ou de

régénération qui nécessitent un modèle dans lequel la mort neuronale est progressive. Il est

possible d‟obtenir une lésion partielle par injection de quantités plus faibles de 6-OHDA

dans la SNpc ou MFB, mais le ciblage de ces structures de petite taille ne permet pas

d‟obtenir une reproductibilité satisfaisante. Au vue de ces informations, l‟approche la plus

logique permettant de palier aux problèmes de dégénérescence progressive et de ciblage de

structures, nous est apparue comme étant l‟injection unilatérale de la toxine 6-OHDA au

niveau de la partie dorsomédiane du striatum. Ce modèle d‟injection striatale étant, de

surcroit, le plus couramment utilisé dans les thérapies expérimentales de protection et

régénération (Bjorklund et al., 1997).

Au début des années 1990, Ichitani (Ichitani et al., 1991) et Berger (Berger et al., 1991)

furent les premiers à rapporter que l‟injection de la 6-OHDA dans le striatum de rat pouvait

induire une dégénérescence neuronale rétrograde et progressive dans la SNpc qui

conduisait, deux à quatre semaines après injection de la toxine, à la perte des neurones

171

exprimant la TH et des sites de recapture de la dopamine. Sauer et Oertel ont ensuite

caractérisé plus finement ce modèle en démontrant qu‟une injection de 6-OHDA dans le

striatum de rat induisait des dommages sur les terminaisons striatales dès 1 jour après

l‟injection, une perte minimale de neurones dopaminergiques dans la SNpc à 1 semaine et

une perte maximum de neurones entre 2 à 3 semaines (Blandini et al., 2007; Przedborski et

al., 1995; Sauer and Oertel, 1994). Par ailleurs, il a été montré que l‟étendue et la spécificité

de la perte neuronale est dépendante de la quantité de toxine injectée et du nombre de sites

ciblés (Lee et al., 1996; Przedborski et al., 1995). Les effets fonctionnels consécutifs sont

eux dépendants de la zone du striatum ciblé : la dénervation de la partie dorsomédiane

entraîne des effets sur la locomotion alors que la dénervation de la partie ventrolaterale

affecte plus particulièrement l‟initiation du mouvement, l‟orientation sensorimotrice et le

comportement moteur spécialisé (Cousins and Salamone, 1996; Cousins et al., 1993;

Dunnett and Iversen, 1982a; Dunnett and Iversen, 1982b; Sabol et al., 1985).

Notons que, bien que le rat soit depuis longtemps l‟animal de prédilection pour les lésions à

la 6-OHDA, il existe également, chez la souris, des modèles de lésions unilatérales par

injection de 6-OHDA dans le MFB, dans la SN ou dans le striatum (Lundblad et al., 2005).

Nous avons choisi d‟induire le modèle 6-OHDA striatal chez la souris et non chez le rat

pour différentes raisons pratiques. Nous souhaitions premièrement utiliser les mêmes

animaux (souris de même souche et même âge) que celles utilisées dans notre modèle

MPTP subaigu, afin de pouvoir comparer les résultats obtenus pour chaque étude. De plus,

étant donné la grandeur des cohortes utilisées pour chaque expérimentations, un aspect non

négligeable de l‟utilisation de souris par rapport aux rats est la facilité d‟entreposage et le

plus faible coût d‟utilisation. Tous les avantages énoncés ci-avant en plus de ces aspects

pratiques ont fait de la lésion intrastriatale unilatérale de 6-OHDA chez la souris, notre

modèle de choix pour l‟étude des effets comportementaux et mécanismes d‟action de la

cystamine.

Malgré les avantages ci-haut énoncés de la lésion intrastriatale unilatérale de 6-OHDA, une

caractéristique importante de ce modèle à prendre en considération est la survenue d‟une

récupération spontanée de certaines composantes comportementales à long terme lorsque la

172

lésion n‟est pas assez prononcée (inférieure à 70%). En effet, ce phénomène est observé au

delà de 12 semaines post 6-OHDA pour la souris (Francardo et al., 2011) et à 16 semaines

pour des études conduites chez le rat pour des tests comportementaux mesurant l‟asymétrie

tel le test du cylindre, les rotations spontanées ou induites par amphétamine (Stanic et al.,

2003a; Stanic et al., 2003b). Une récupération partielle des performances au rotarod a aussi

été rapportée chez la souris après une période de 2 mois (Alvarez-Fischer et al., 2008).

Dans le modèle 6-OHDA striatal, l'occurrence d‟un bourgeonnement ou «sprouting»

d‟axones dopaminergiques dans le striatum pourrait être à l‟origine de ce phénomène dans

des études évaluant des traitements neuroprotecteurs ou neurorestaurateurs (Biju et al.,

2010; Schwarting and Huston, 1996b). Le même phénomène peut cependant représenter

une variable confondante dans des études mesurant les effets de traitements

symptomatiques chroniques. Nos études évaluent l‟état du système dopaminergique 9

semaines après la lésion à la 6-OHDA ce qui nous place avant les phénomènes de

récupération pré-mentionnés. De plus, nous n‟avons pas observé aux différentes étapes

d‟évaluations comportementales (3, 6 et 9 semaines post lésion), de récupération

significative des comportements chez nos animaux 6-OHDA non traités à la cystamine. Le

choix d‟achever notre traitement de cystamine avant la 9e semaine après la lésion 6-OHDA

nous a donc permis de nous affranchir d‟éventuels facteurs confondants liés à la

récupération fonctionnelle spontanée à long terme.

5.2.1.3 Limites communes des modèles MPTP et 6-OHDA utilisés dans nos études

Bien que les modèles MPTP et 6-OHDA utilisés dans nos études soient tout à fait adéquats

pour répondre aux hypothèses et objectifs de recherche exposés dans cette thèse, comme

tous les modèles disponibles à l‟heure actuelle, ils ne présentent pas tous les traits

pathologiques et biochimiques de la MP. En premier lieu, les injections de MPTP ou 6-

OHDA n'engendrent pas de symptômes non moteurs, une caractéristique importante de

l'expression clinique de la maladie. Néanmoins, il a récemment été montré que le modèle

MPTP subaigu peut induire une diminution d'environ 50% des neurones dopaminergiques

du plexus myentérique de l'intestin suggérant une affectation induite par le MPTP du

système nerveux entérique (Cote et al., 2011) qui est également fortement touché chez les

patients parkinsoniens (Pfeiffer, 2011). Les effets de la cystamine sur cet aspect de la

173

maladie pourraient être une voie intéressante à explorer. Une autre caractéristique de la MP

est la formation de corps de Lewy. Malheureusement, les modèles MPTP et 6-OHDA ici

employés n‟induisent pas d'augmentation de la protéine -synucléine ni la formation de

corps de Lewy. L'effet de la cystamine sur cette caractéristique histopathologique n'a donc

pu être évalué.

Enfin, d‟un point de vue plus global, il est important de mentionner que malgré l‟utilité

démontrée des modèles utilisés dans cette étude, il demeure hasardeux de comparer une

dégénérescence réalisée en quelques semaines à celle obtenue au cours de plusieurs années

chez l‟homme. Comme nous venons de le mentionner, les mécanismes de dégénérescence

induits par l‟action du MPTP ou de la 6-OHDA ne reproduisent que partiellement ceux

impliqués dans la MP. Il sera donc important de vérifier nos données dans d‟autres

modèles, exprimant certaines caractéristiques manquantes des modèles MPTP et 6-OHDA

utilisés, comme par exemple des modèles plus chroniques ou basés sur une mutation

génétique ou un transgène particulier.

5.2.2 Etudes précliniques des effets neuroprotecteurs de la cystamine dans la MP

Comme nous l‟avons exhaustivement précisé dans l‟introduction, la cystamine a déjà

démontré des propriétés très intéressantes dans le contexte de la MH ce qui l‟a récemment

conduite vers un essai clinique de phase II. La mise en évidence d‟une action bénéfique de

la cystamine dans la MP est, quant à elle, plus restreinte. Jusqu'à présent, quatre études

indépendantes conduites dans des modèles murins MPTP subaigus ont fourni la preuve

d‟une capacité neuroprotectrice de la cystamine pour la MP. Notre laboratoire fut le

premier à démontrer qu‟un traitement i.p. d‟une faible dose de cystamine (10 mg/kg/jour),

amorcé 2 jours avant la lésion et donné en continu durant et après le protocole MPTP

subaigu (soit pendant 21 jours au total), bloque la dégénérescence dopaminergique

normalement causée par la toxine (Gibrat et al., 2010; Tremblay et al., 2006). Les effets

neuroprotecteurs de la cystamine sont d‟ailleurs observables sur plusieurs paramètres du

système dopaminergique, en particulier sur les neurones nigraux qui expriment la tyrosine

hydroxylase (TH, enzyme de conversion de la dopamine), le gène Nurr1 (responsable de

l‟expression et du maintien du phénotype dopaminergique), et le transporteur de la

174

dopamine (DAT), ainsi que sur les terminaisons dopaminergiques du striatum qui

expriment la TH (Gibrat et al., 2010; Tremblay et al., 2006). Un travail plus récent avec le

même modèle parkinsonien, a corroboré les mêmes effets neuroprotecteurs pour la

cystéamine, le dérivé réduit de la cystamine (Sun et al., 2010). Lorsque administrée en pré-

traitement à faible dose i.p. (20 mg/kg/jour) mais non à forte dose (75 mg/kg/jour), comme

précédemment décrit pour la cystamine, la cystéamine atténue la dégénérescence des

neurones dopaminergiques de la SNpc et préserve les concentrations de dopamines

striatales. Toujours dans un modèle MPTP subaigu, un effet neuroprotecteur similaire a été

observé, mais cette fois-ci la cystamine était administrée dans l‟eau de boisson des souris à

des concentrations allant de 120 à 750 mg/kg/jour. Contrairement aux 2 études précédentes,

ces auteurs ont révélé un effet dose dépendant de la cystamine dans le modèle MPTP: les

plus fortes doses étant plus efficaces pour atténuer la perte neuronale, préserver les

projections striatales ainsi que les concentrations de dopamine et ses métabolites. Nos

travaux de recherche décrits dans le chapitre III confirment les effets neuroprotecteurs de la

cystamine dans le modèle MPTP subaigu, néanmoins, le dosage HPLC de la dopamine et

de ses métabolites dans le striatum des souris MPTP traitées à la cystamine ne démontre

pas un effet aussi spectaculaire que pour les études menées par Stack et Sun (Stack et al.,

2008; Sun et al., 2010). Bien que les fibres TH soient partiellement préservées par la

cystamine dans nos études, les taux de dopamine ne semblent pas améliorés, ou de manière

très discrète. Nos études démontrent en effet que 10 mg/kg/jour de cystamine i.p. est

bénéfique alors que 50 mg/kg/jour est inefficace. L‟obtention d‟un effet neuroprotecteur

accompagné d‟une amélioration de la relâche de dopamine au niveau du striatum, pourrait

être induit par une dose intermédiaire se trouvant entre 10 et 50 mg/kg/jour de cystamine.

De surcroit, notre modèle MPTP subaigu diffère légèrement de celui utilisé par les autres

équipes mentionnées qui utilisent 5 (vs 7) injections de 20 mg/kg de MPTP en 5 jours. Leur

modèle étant un peu moins agressif que le notre, la cystamine ou cystéamine pourrait avoir

eu un effet plus important sur la dopamine striatale. Enfin, notre traitement de cystamine ne

commence que 2 jours avant la première injection de MPTP alors que le traitement est

débuté 4 voir 7 jours avant l‟injection de la toxine dans les études de Sun et de Stack. Un

pré-traitement de cystamine plus long pourrait avoir un impact plus important sur la

protection des terminaisons du striatum.

175

Un autre modèle murin plus agressif que le modèle MPTP subaigu, a aussi été employé afin

de vérifier les effets neuroprotecteurs de la cystamine dans un contexte de dégénérescence

neuronale parkinsonienne. Il s‟agit du modèle murin induit par lésion unilatérale de 6-

OHDA injectée au niveau du striatum. Dans ce modèle, un pré-traitement de 750 mg/kg/jour

de cystamine permet de protéger les neurones nigraux et fibres striatales dopaminergiques

chez la souris (Stack et al., 2008).

Les 4 études décrites dans ce chapitre sont les seuls travaux publiés qui confirment l'effet

bénéfique de la cystamine et cystéamine dans le contexte de la MP. Elle ne démontrent

toutefois qu‟une action neuroprotectrice du composé puisque le traitement de cystamine a

toujours débuté plusieurs jours avant l‟induction de la pathologie par les neurotoxines

MPTP ou 6-OHDA. Par ailleurs, l‟effet de la cystamine sur la composante

comportementale n‟a été évalué dans aucune des études mentionnées. Nos travaux exposés

dans le chapitre III évaluent ces 2 composantes et démontrent que la cystamine est non

seulement bénéfique lorsque administrée 24 heures après le traitement MPTP mais

également 3 semaines après une lésion à la 6-OHDA. Ses effets thérapeutiques se

traduisant, entre autre, par une amélioration des déficiences motrices induites par la 6-

OHDA.

176

5.3 Mécanismes d’action de la cystamine dans la MP

Une des lacunes du modèle MPTP subaigu pour investiguer les mécanismes d‟action de la

cystamine, est qu‟il ne permet pas la visualisation post mortem de certains phénomènes

transitoires, qui se manifestent en début de protocole, comme l‟inflammation (Drouin-

Ouellet et al., 2011). De plus, il ne permet pas d‟évaluation comportementale puisque ce

modèle ne reflète que des phénomènes pathologiques précoces asymptomatiques de la MP.

Afin de palier certains de ces problèmes, le modèle 6-OHDA a été utilisé. Celui-ci,

produisant une réponse microgliale et astrocytaire significative et persistante dans le temps

ainsi qu‟une dégénérescence dopaminergique accrue à l‟origine de désordres moteurs, nous

a permis de regarder l‟impact de la cystamine sur une partie de la composante

inflammatoire et comportementale. L‟exploration mécanistique post mortem étant limitée,

la caractérisation plus fine de certains mécanismes de la cystamine a requis l‟utilisation

d‟une approche in vitro dans nos études. Bien que les mécanismes moléculaires précis de la

cystamine ne soient pas encore complètement connus, on sait que ce composé peut agir à

plusieurs niveaux (Figure 5-2).

177

Figure 5-2. Mécanismes potentiellement à l'origine des effets thérapeutiques de la

cystamine

(1). Inhibition de l‟activité de la transglutaminase (TGase) Ŕ qui contribue à la formation des inclusions neuronales Ŕ par

blocage du site actif de l‟enzyme qui permet d‟assurer la liaison entre des protéines contenant d‟une part des résidus

glutamines et, d‟autre part, une lysine

(2). Activité anti-apoptotique par inhibition directe de l‟activité caspase-3

(3). Inhibition des dysfonctions mitochondriales qui contribuent au stress oxydatif et à l‟apoptose

(4). Inhibition du stress oxydatif par l‟augmentation des niveaux cérébraux de glutathion (GSH)

(5). Inhibition du stress oxydatif par l‟augmentation des niveaux cérébraux de cystéine

(6). Surexpression cérébrale du facteur neurotrophique BDNF (brain derived neurotrophic factor) Ŕ qui contribue à la

survie neuronale et à l‟inhibition de l‟apoptose et de l‟inflammation

(6′). Stimulation de la sécrétion cérébrale de BDNF via une augmentation de l‟expression de DnaJ-containing protein 1b

(HSJ1b) et par l‟inhibition de la TGase

(7). Surexpression cérébrale des heat shock proteins (Hsps) Ŕ protéines chaperons qui facilitent, entre autres, la

dégradation des protéines aberrantes en les transférant au ubiquitin proteasome system (UPS)

178

(8). Régulation de TH et Nurr1 Ŕ Nurr1 qui peut inhiber l‟inflammation et mener à une surexpression de BDNF.

(9). Diminution de la réponse inflammatoire (démonstration en périphérie Ŕ hypothétique au niveau du cerveau).

5.3.1 Agrégation protéique

Si on assume que la neurodégénérescence est induite par la formation d‟inclusions

cellulaires, une stratégie potentielle contre la MP pourrait ainsi viser à identifier des

molécules capables d‟empêcher l'accumulation de protéines pathogènes comme l‟-

synucléine.

Une voie, ayant démontré son importance dans la prévention de la formation d‟inclusions

neuronales, est celle des protéines de choc thermique ou Heat shock proteins (Hsps). Ces

petites protéines, qui appartiennent à une sous-famille de protéines de stress, sont connues

pour rendre les cellules plus résistantes à diverses atteintes toxiques (Gorman et al., 2005)

(Dong et al., 2005). En plus de leur activité chaperonne, les Hsps sont capables de

promouvoir la dégradation de protéines mal conformées ou défectueuses en facilitant leur

transport à l‟UPS (Shin et al., 2005). Il a été montré qu‟une exposition de cellules PC12 à la

toxine 6-OHDA, induit une réponse de Hsps, à savoir Hsp25 and Hsp70. De plus, induire

l‟expression de Hsps comme Hsp27 (l‟analogue humain de Hsp25), avant l‟administration

de 6-OHDA, retarde la relâche de cytochrome c, l‟activation de caspases, et réduit les

niveaux d‟apoptose induits par la toxine (Gorman et al., 2005), ce qui suggère un pouvoir

protecteur des Hsps contre les toxines dopaminergiques. En appui de cette hypothèse, il a été

récemment rapporté que le transfert du gène Hsp70 associé à un adénovirus inhibe la

dégénérescence dopaminergique causée par la toxine MPTP dans un modèle murin de la MP

(Dong et al., 2005). La surexpression de la protéine chaperonne Hsp70 prévient aussi la

perte neuronale dopaminergique induite par l‟-synucléine chez la Drosophile (Auluck and

Bonini, 2002 ), prévient l‟accumulation d‟-synucléine insoluble chez des souris

transgéniques qui surexpriment l‟-synucléine (Klucken et al., 2004), module la formation

d‟oligomères extracellulaires et prévient la cytotoxicité médiée par l‟-synucléine

oligomérique in vitro (Danzer et al., 2011).

Karpuj et ses collègues démontrèrent en 2002 que la transcription du gène HSJ1b, qui est

une Hsp, est spécifiquement influencé par la cystamine dans les souris MH (Karpuj et al.,

179

2002a). HSJ1b appartient à une large famille de protéines Dna-J-like qui contient les

protéines chaperonnes typiques Hsp40, HDJ1/Hsp40 et HDJ2/HSdj. Dans la plupart des cas

ces protéines chaperonnes sont capables de réduire l‟agrégation et la toxicité polyQ dans

plusieurs modèles (Muchowski and Wacker, 2005). Toutefois, il n‟a jamais été rapporté un

quelconque effet de HSJ1b sur l‟agrégation et la formation d‟inclusions neuronales. Dans les

cellules de mammifères, les propriétés neuroprotectrices de HSJ1b proviennent

vraisemblablement de sa capacité à augmenter le support trophique (Borrell-Pages et al.,

2006). Au regard de toutes ces données, nous avons souhaité explorer l‟impact d‟un

traitement de cystamine sur l‟expression du gène Hsp70. Les données obtenues et présentées

aux chapitre II nous montrent que la cystamine n‟induit pas de changement au niveau de

l‟expression de l‟ARNm Hsp70 quelque soit la dose ou la structure cérébrale étudiée. Ces

résultats furent corroborés par l‟absence de variation de la protéine Hsp70 dans le cerveau de

souris traitées avec 10 mM/jour de cystamine pendant 14 jours (Hsu et al., 2008). La

protéine Hsp70 semble donc, fort probablement, ne pas être impliquée dans les effets

thérapeutiques de la cystamine.

D‟un point de vue mécanistique, même si la cystamine n‟influence pas l‟expression de la

Hsp70, elle pourrait toutefois contrer la formation d‟inclusions protéiques via sa capacité à

inhiber la Tgase (Lorand, 1998; Lorand and Conrad, 1984). En effet, la Tgase catalyse la

formation de liaisons covalentes entre des résidus glutamines de certaines protéines et,

d‟autre part, l‟amine primaire ( ) de la lysine ou d‟autres d‟amines biogéniques.

Plusieurs études ont démontré le lien entre la Tgase et la formation d‟agrégats protéiques

insolubles caractéristiques de maladies neurodégénératives telles la MH ou la MP (Jeitner

et al., 2005; Junn et al., 2003). Comme expliqué dans l‟introduction, dans le contexte de la

MH, la cystamine préviendrait la formation d‟inclusions neuronales en entrant en

compétition avec la protéine huntingtine - dont la forme mutée est responsable de la

pathologie - pour le site actif de la Tgase (Borrell-Pages et al., 2006; Wang et al., 2005). De

la même manière, en contexte parkinsonien, la cystamine pourrait également entrer en

compétition avec l‟-synucléine au site actif de la Tgase ce qui empêcherait alors la

formation d‟agrégats pathologiques et protègerait les neurones contre la dégénérescence

(Gibrat and Cicchetti, 2011; Tremblay et al., 2006). Bien que la cystamine ait déjà


180

démontré un impact sur la formation d‟agrégats de huntingtine mutée dans des modèles

animaux de la MH, aucune étude n‟a encore démontré de telles propriétés en ce qui a trait à

l‟-synucléine. Or, la démonstration d‟un impact significatif de la cystamine sur la

formation d‟agrégats d‟-synucléine pourrait suggérer un effet bénéfique de ce composé à

des stades avancés de la maladie, les inclusions neuronales représentant une caractéristique

prédominante, bien que tardive de la pathologie. Comme précédemment discuté au chapitre

5.1, les modèles utilisés dans nos études ne nous ont pas donné l‟opportunité d‟investiguer

les effets de la cystamine sur la synucléopathie.

5.3.2 Activité apoptotique

Outre sa capacité à réduire indirectement l‟apoptose via son action inhibitrice sur le stress

oxydatif et sa faculté à protéger les mitochondries (Stack et al., 2008), la composition

chimique unique de la cystamine (i.e. sa capacité à former des ponts disulfure) lui permet

d‟inhiber l‟apoptose via son effet direct sur l‟activité de l‟enzyme pro-apoptotique caspase-

3. En effet, il a été montré in vitro que la cystamine inhibe l‟activité caspase-3 de manière

incompétitive à faibles concentrations et non compétitive à concentrations élevées (Lesort et

al., 2003). L‟effet anti-apoptotique de la cystamine a été plus spécifiquement étudié en

conditions parkinsoniennes dans l‟étude présentée au chapitre III. En effet, la capacité

d‟inhibition de l‟activité caspase-3 par la cystamine a été confirmée sur des neurones

dopaminergiques en culture traités avec de la 6-OHDA ou du MPP+. Nous avons également

démontré dans ces conditions que la cystamine peut inhiber l‟apoptose via sa capacité à

moduler le ratio entre BAX et Bcl-2, deux protéines respectivement pro et anti-apoptotiques.

Ces différents effets de la cystamine sur l‟apoptose sont également observables dans un

modèle murin de lupus érythémateux. Cette étude rapporte que la cystamine agit contre

l‟apoptose induite par le modèle pathologique en augmentant Bcl-2 et en réduisant

l‟expression de la caspase-9, Bad, et Apaf-1 ainsi que l‟activité caspase-3 (Hsu et al.,

2008a). Cependant, toutes les études ne confirment pas cette dernière action de la cystamine

sur la caspase-3, du moins dans le contexte de la MH (Karpuj et al., 2002a). Des différences

entre les modèles animaux utilisés, la dose, la voie d‟administration (i.p. vs. p.o.), le moment

choisi pour donner le traitement (pré- vs. post-agrégation ou pré- vs. post-symptomatique)

181

ou la méthode de quantification sont quelques uns des facteurs potentiellement à l‟origine de

ces contradictions.

5.3.3 Stress oxydatif et dysfonction mitochondriale

Certains piégeurs de radicaux libres ou antioxydants pourraient atténuer le stress oxydatif et

les dysfonctions mitochondriales, des facteurs impliqués dans la pathogénèse de la MP et

d‟autres désordres neurodégénératifs. La cystamine (comme sa forme réduite la

cystéamine) est connu depuis longtemps comme un puissant piégeur de radicaux libres, ce

qui est en partie à l‟origine de son effet radioprotecteur sur l‟irradiation de l‟ADN

(Kollmann et al., 1970; Vasilescu and Rix-Montel, 1980; Zheng et al., 1988). Cette capacité

anti-oxydante pourrait être liée à sa capacité à accroitre, in vitro et chez un modèle de la

MH: les souris YAC128, la production de cystéine, une molécule anti-oxydante puissante

(Fox et al., 2004; Pinto et al., 2005). Cette aptitude de la cystamine à réduire le stress

oxydatif pourrait aussi incomber à sa faculté d‟augmenter les niveaux cellulaires de GSH,

propriétés déjà démontrées dans des cellules SH-SY5Y (Lesort et al., 2003). Cependant, il

existe des données contradictoires quant à la capacité de la cystamine à augmenter les

niveaux de GSH in vivo (Jeitner et al., 2005). En effet, la cystamine augmente la GSH in

vivo, mais cet effet est très modeste dans les organes qui affichent un fort taux de

production de ce peptide et, par conséquent, ne devrait pas être important dans le cerveau

qui présente un faible taux de roulement (turnover) de GSH (Jeitner et al., 2005). En

comparaison avec le foie, le cerveau possède une capacité modeste de production de GSH

(Chang et al., 1997), conséquemment, la cystamine devrait avoir peu d‟effet sur les niveaux

de GSH cérébrales. Toutefois, dans des conditions de stress oxydatif élevé, tel que celui

généré par l'administration de MPTP, la mesure des effets de la cystamine sur le turnover

de GSH pourrait être réalisable. À cet égard, Sun et al. ont été capables de démontrer chez

la souris, qu‟un pré-traitement de cystéamine permet d‟atténuer la réduction de GSH

engendrée par une exposition au MPTP (Sun et al., 2010). Dans un contexte non

parkinsonien, la cystamine a également montré sa capacité à empêcher la diminution

cérébrale du GSH induite par l‟administration d‟halopéridol chez la souris (Pillai et al.,

2008). De plus, dans un modèle de souris déficientes en Vanin, dont les tissus sont

182

dépourvus de cystéamine libre, les niveaux de la protéine glutathion S-transférase (GST)

sont restaurés dans le foie par l'administration de cystamine (Di Leandro et al., 2008).

Outre sa capacité à augmenter un facteur antioxydant comme la GSH, la cystamine est

également capable de diminuer la production de facteurs pro-oxydants induits par des

toxines comme le MPTP ou la 6-OHDA. Ainsi, une faible dose de cystéamine administrée

à des souris traitées avec du MPTP, permet une réduction de l‟expression de ROS et de

malondialdehyde (MDA) cérébrale (Sun et al., 2010). La cystamine, lorsqu‟administrée à

forte concentration par l‟eau de boisson, permet également, chez des souris traitées au

MPTP ou à la 6-OHDA, la normalisation des niveaux striataux de 8-hydroxy-2′-

deoxyguanosine et ATP, compatible avec une diminution du stress oxydatif et d‟une

amélioration de la fonction mitochondriale. Dans cette même étude, la cystamine prévient

la perte mitochondriale induite par le MPTP, perte identifiée par un marquage de la

protéine Hsp70 mitochondriale et la superoxyde dismutase 2. Cet effet „mitoprotecteur‟ est

concomitant avec une réduction des activités du cytochrome c et de la caspase-3 (Stack et

al., 2008). Ensemble, ces études montrent que la cystamine est apte à réduire la perte des

neurones dopaminergiques grâce à l'atténuation du stress oxydatif et du dysfonctionnement

mitochondrial.

5.3.4 Le BDNF

Il a été démontré dans des modèles murins et de singes parkinsoniens, que les facteurs

BDNF, GDNF et neurturine peuvent jouer un rôle neuroprotecteur (Altar et al., 1994; Beck

et al., 1995; Gash et al., 1996; Jiang et al., 2006; Kordower et al., 2000; Kordower et al.,

2006). Le facteur trophique neurturine, administré dans le striatum via un vecteur viral, a

d'ailleurs fait l‟objet d‟un test en clinique et s'est avéré bénéfique 18 mois post-chirurgie

(Marks et al., 2010). Tel que présenté au chapitre II et III, un traitement à la cystamine

induit une augmentation de l'ARNm du BDNF aussi bien chez des souris ayant reçu du

MPTP que de la 6-OHDA (Gibrat et al., 2010). Cet effet de la cystamine sur l‟ARNm du

BDNF est jumelé à une augmentation de sa protéine dans la SNpc et à une action bénéfique

sur la population dopaminergique nigrale. Un autre groupe s'est intéressé à l'effet de la

cystéamine sur le BDNF dans un modèle murin MPTP et a noté une augmentation de ce

183

facteur dans la SNpc par méthode immuno-enzymatique ELISA (Sun et al., 2010). La

cystamine et la cystéamine ont aussi montré leur capacité à augmenter les niveaux

cérébraux de BDNF dans un modèle animal huntingtonien (Borrell-Pages et al., 2006;

Gibrat et al., 2010). Une avenue intéressante pour expliquer cette augmentation est que la

cystamine, en réduisant l‟activité Tgase, promeut la sécrétion par les cellules neuronales de

BDNF dans les vésicules cytosoliques, où l‟on observe la colocalisation de Tgase2 avec

BDNF dans l‟appareil de Golgi (Borrell-Pages et al., 2006).

Dans la SNpc et plus globalement dans le parenchyme cérébral, coexistent plusieurs

populations cellulaires aptes à produire le BDNF, dont les neurones eux mêmes, les

astrocytes et aussi les microglies. La cystamine est donc susceptible d‟agir sur une ou

plusieurs de ces populations pour augmenter le taux de BDNF au niveau nigral dans les

modèles parkinsoniens utilisés. Nos données exposées au chapitre III révèlent qu‟un

traitement de cystamine, donné sur une période de 24 heures, induit une augmentation des

niveaux cellulaires et de la sécrétion de BDNF dans des cultures de neurones

dopaminergiques affectées ou non par les toxines MPP+ ou 6-OHDA. D‟autres

expérimentations in vitro menées en parrallèle dans le laboratoire (données non présentées

ici), démontrent que les cellules microgliales et astrocytaires murines voient également leur

production et sécrétion de BDNF stimulées par la cystamine. Nos données confirment donc

que les neurones dopaminergiques représentent une source importante de BDNF mais

suggèrent également que les cellules microgliales et les astrocytes prennent part de manière

significative à la production de cette neurotrophine, suggérant que les stratégies ciblant ces

cellules peuvent se révéler efficaces avec, pour les astrocytes (activés sur une période plus

longue que les microglies), l‟avantage d‟offrir une fenêtre thérapeutique plus étendue.

Bien que les facteurs neurotrophiques comme le GDNF et le BDNF aient fait montre d‟un

réel potentiel thérapeutique, ces composés présentent toutefois une difficulté thérapeutique

de taille puisqu‟ils sont rapidement dégradés dans l‟organisme et ne traversent pas la BHE.

L‟avantage non négligeable de la cystamine et de la cystéamine est qu‟elles sont

administrées de façon systémique par voie i.p. ou orale, 2 modes d‟administration très peu

invasifs par rapport aux méthodes d‟injections intracérébrales. Ces composés, qui

184

indirectement engendrent l‟expression des facteurs trophiques dans le cerveau, pourraient

faire l‟objet d‟une alternative thérapeutique extrêmement intéressante, ou à tout le moins

être un supplément à la thérapie principale recommandée.

5.3.5 L’inflammation

Bien que le rôle de la cystamine/cystéamine sur la réponse neuroinflammatoire soit peu

connu, certains effets ont été observés dans des modèles d‟inflammation périphérique. En

effet, l‟injection systémique de cystéamine montre un impact anti-inflammatoire à long

terme et une capacité a moduler les effets anti-inflammatoires des inhibiteurs de cyclo-

oxygénase chez le rat dans un modèle d‟oedem de la patte (Salam, 2002). L'effet anti-

inflammatoire de la cystamine a été aussi confirmé par les diminutions des taux muqueux

de TNF- α et sérologiques d'IL-6, associés à la normalisation de l'activité de la Tgase dans

un modèle d‟inflammation intestinale (Elli et al., 2011). La cystamine réduit également

l‟inflammation qui survient dans le foie et les macrophages d‟un modèle de souris souffrant

de lupus érythémateux (NZB/W F1) en réduisant notamment la protéine COX-2, l‟activité

MMP-9 et Tgase2, l‟ARNm TNF-α, et TGF-β (Hsu et al., 2007; Hsu et al., 2008b). Nous

observons nous même que la cystamine est capable d‟induire, dans des monocytes en

culture, une réduction très marquée de l‟activation NF-κB induite par du LPS, toxine qui

active spécifiquement la voie inflammatoire (données non publiées). Tel que décrit au

chapitre II et III, mon travail sur les mécanismes d‟action de la cystamine donne pour la

première fois un indice quant au potentiel anti-inflammatoire de cette molécule au niveau

cérébral en contexte parkinsonien. Tout d‟abord, nous rapportons au chapitre III que la

cystamine n‟est pas capable de diminuer significativement l‟astrogliose ou la microgliose

nigrale engendrées par la toxine 6-OHDA. Cependant, même si la cystamine ne semble pas

agir sur le nombre de cellules gliales, elle présente un effet marqué sur l‟activation de

celles-ci. En effet, la cystamine diminue l‟activation du iNOS et subséquemment la relâche

de NO, un facteur majeur issu du stress oxydatif impliqué dans l‟activation et la toxicité

gliale, par les astrocytes et les microglies en contexte neurotoxique (MPP+ ou 6-OHDA).

Nous observons également que la cystamine, au même titre qu‟un composé anti-

inflammatoire reconnue : la dexamethasone, diminue la formation de protrusions et la

production de NO microgliale engendrées par la toxine LPS. Même si il est difficile de

185

discriminer les effets observés d‟une action simplement antioxydante de la cystamine, ces

résultats tendent à démontrer les capacités de la cystamine à réduire l‟activation et la toxicié

des cellules gliales.

Un autre indice des capacités potentielles de la cystamine à moduler la neuro-inflammation

est apporté par le fait que ce composé est capable d‟augmenter l‟expression de Nurr1 dans

la SNpc de souris (Chapitre II). Or Nurr1, outre son rôle dans le maintien du phénotype

dopaminergique et son implication dans quelques rares MP familiales, a récemment été

désigné comme un facteur capable de moduler l‟activité des cellules inflammatoires du

cerveau (Glass et al., 2010; (Bensinger and Tontonoz, 2009; Saijo et al., 2009). Plus

précisément, Nurr1 exerce un effet anti-inflammatoire en se fixant sur la molécule NF-κB-

p65. Par la suite, le recrutement du complexe CoREST (régulateur d'expression des gènes

neuronaux) par Nurr1 aboutit à l‟élimination du facteur NF-κB-p65 et donc à une

répression transcriptionnelle. Ainsi, Nurr1 exerce un effet protecteur sur la perte des

neurones dopaminergiques dans la MP en limitant la production de facteurs neurotoxiques

comme TNF, iNOS et IL-1 par la microglie et les astrocytes (Saijo et al., 2009). Il est

également intéressant de noter qu‟une diminution de l‟expression de Nurr1 est suivie par la

régulation négative de la TH et de BDNF dans des cultures primaires de mésencéphale

(Volpicelli et al., 2007). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que Nurr1, par son action

régulatrice sur l‟expression de BDNF et sur l‟inflammation, pourrait indirectement

influencer le développement et la fonction des cellules dopaminergiques du mésencéphale.

La capacité de la cystamine à augmenter l‟expression nigrale de Nurr1 et BDNF et par

conséquent, à moduler l‟activité inflammatoire, pourrait expliquer son habileté à diminuer

la perte neuronale.

En conclusion, les données recueillies dans nos études et par d‟autres sur les mécanismes

d‟action de la cystamine, nous amènent à penser que l‟administration de cystamine pourrait

agir sur 2 fronts: d‟un côté, la cystamine active, au niveau neuronal, des protéines

possédant une action trophique (anti-apoptotique) comme le BDNF et Bcl-2 tout en

inactivant des protéines pro-apoptotiques comme la caspase-3 ; d‟un autre côté, la

cystamine module l‟expression du BDNF et de facteurs pro-inflammatoires/toxiques par les

186

cellules gliales créant un environnement favorable aux neurones voisins. Cette double

action de la cystamine, à la fois neuronale et gliale, est vraisemblablement promulguée par

une régulation directe ou indirecte de nombreux messagers intracellulaires, et peut amener

au final à une augmentation de la résistance neuronale et probablement à une certaine

neuroplasticité.

187

5.4 La cystamine comme outil thérapeutique pour la MP

5.4.1 Au delà de la neuroprotection

Ce qui est particulièrement attrayant dans l'utilisation de la cystamine comme stratégie

thérapeutique, est sa capacité non seulement à prévenir la neurodégénérescence, mais aussi

à sauver des neurones déjà initiés dans le processus de dégénérescence chez des animaux

affectés par la MP. En effet, nous avons montré dans un modèle représentatif d‟un stade

précoce asymptomatique de parkinsonisme, que la cystamine, administrée 24 heures après

le traitement MPTP, induit une récupération de différents marqueurs du système

dopaminergique couplé à un effet anti-apoptotique de la molécule in vivo et in vitro. Outre

la démonstration des capacités de neuroprotection et neurorescue de la cystamine, nous

avons également observé un effet thérapeutique de ce composé lorsqu‟administré pendant

la phase symptomatique de la maladie, soit beaucoup plus tardivement dans le processus

neurodégénératif. En effet, nous avons constaté que la cystamine permet une récupération

des déficiences comportementales induites par la 6-OHDA et ce, lorsque le traitement est

initié 3 semaines après la lésion, donc au moment où le système dopaminergique est

suffisamment atteint pour induire un phénotype comportemental mesurable. Cette

récupération fonctionnelle est associée à une augmentation de la dopamine striatale mais

aussi du nombre de cellules qui expriment la TH (cellules cathécolaminergiques) et NeuN

(cellules neuronales) au niveau de la SNpc. Cependant, bien qu‟on puisse désigner

l‟augmentation des niveaux striataux de dopamine ou envisager des phénomènes de

plasticité comme le sprouting pour expliquer l‟amélioration du phénotype comportemental,

l‟origine de la récupération observée reste encore à déterminer. De plus, même si la

cystamine permet une récupération fonctionnelle et promeut une amélioration du nombre

de neurones dopaminergiques, les conditions expérimentales utilisées dans l‟étude du

chapitre III ne nous permettent pas de conclure sur un effet réellement neurorestaurateur de

la cystamine. En effet, entre nos mains, nous avons observé qu‟une lésion unilatérale du

striatum par la 6-OHDA chez la souris, entraine une perte de 80% des neurones

dopaminergiques dans la SNpc, une perte de plus de 90% des niveaux de protéine TH dans

le striatum et une diminution de 75% de la dopamine striatale 9 semaines après la chirurgie.

Ce degré de dégénérescence concorde avec plusieurs études qui utilisent ce modèle chez la

188

souris et qui suggèrent que la neurodégénérescence nigrale atteint son maximum (soit

environs 70-80%) avant la 3e semaine post-injection (au moment où nous avons choisi de

commencer le traitement de cystamine) (Alvarez-Fischer et al., 2008; Iwata et al., 2004;

Kim et al., 2011; Lundblad et al., 2004).

Nonobstant les nombreuses évidences de la littérature quant à la stabilité du système avant

la 3e semaine post lésion chez la souris, nous avons établit, dans les conditions

expérimentales utilisées dans notre laboratoire, que le système dopaminergique atteint son

maximum de dégénérescence APRÈS la 3e semaine dans notre modèle 6-OHDA (données

non présentées) et que le système dopaminergique est donc encore en processus de

dégénérescence au moment où l‟on injecte notre première dose de cystamine. En effet, au

stade précis de 3 semaines post 6-OHDA, le degré de dégénérescence dopaminergique est

inférieur aux 80% de dégénérescence observés 9 semaines post chirurgie, cela indique que

la SNpc des souris lésées à la 6-OHDA, même après 3 semaines post chirurgie, contient

encore des cellules sur le point de mourir mais pas encore perdues. Dans ces conditions, la

cystamine les empêcherait alors de franchir le seuil de la cascade apoptotique et

améliorerait leur fonctionnalité grâce à ses propriétés de neurorescue. Nous pouvons donc

statuer, au vue du travail effectué au chapitre III, que l‟effet de la cystamine observé sur les

neurones dopaminergiques est un effet de neurorescue et pas nécessairement

neurorestaurateur.

Toutefois l‟hypothèse d‟une certaine capacité restauratrice de la cystamine, au sens

neurogénique du terme, sur la population nigrale dopaminergique n‟est pas à exclure et

serait une voie thérapeutique extrêmement intéressante à explorer. En effet, la neurogenèse

du cerveau adulte est connue pour se produire dans 3 régions du cerveau : le bulbe olfactif,

la zone rostrale sub-ventriculaire du prosencéphale près du striatum ainsi que la zone sub-

granulaire du gyrus denté de l‟hippocampe. La neurogenèse dans ces régions du cerveau se

produit suite à des lésions diverses (y compris induites par les toxines 6-OHDA et MPTP)

et en réponse aux facteurs de croissance (Faiz et al., 2005; Keilhoff et al., 2006; Lagace et

al., 2007; Tonchev et al., 2007; Van Kampen and Eckman, 2006; Yoshimi et al., 2005).

Bien que la survenue du phénomène de neurogenèse dans la SNpc demeure controversée

189

(Frielingsdorf et al., 2004; Peng et al., 2008), certains rapports ont montré de la

neurogenèse dans la SNpc et la migration de cellules vers le SNpc, dans laquelle ils se

différencient en neurones (Lie et al., 2002; Zhao et al., 2003). La présence d'un turnover

physiologique lent des neurones dans la SNpc de la souris adulte, qui pointe le rôle

fonctionnel des cellules souches neurales dans le mésencéphale, a été démontré en réponse

à une lésion nigrale partielle induite par le MPTP. Cette lésion a abouti à un remplacement

neuronale accru ce qui indique l‟existence d‟un phénomène de régulation du taux de la

neurogenèse dans la SN adulte (Kay and Blum, 2000; Yoshimi et al., 2005; Zhao et al.,

2003). Aussi, plusieurs travaux montrent qu‟une déplétion dopaminergique complète de la

voie nigro-striée produite par la 6-OHDA (Lie et al., 2002; Stromberg et al., 1986) ou le

MPTP (Kay and Blum, 2000; Mao et al., 2001; Stromberg et al., 1986) mène à une

augmentation de la prolifération cellulaire dans le striatum et la SNpc (Frielingsdorf et al.,

2004). Cependant, d‟autres études employant ces modèles montrent une diminution de la

prolifération cellulaire au niveau des zones sous-ventriculaire et sous-granulaire (Baker et

al., 2004; Hoglinger et al., 2004). Néanmoins, la neurogenèse est augmentée dans la SNpc

du modèle murin parkinsonien MPTP (Zhao et al., 2003). Plus récemment, il a été rapporté

que l‟augmentation de la prolifération cellulaire dans le striatum appauvri en dopamine

serait de prédominance astrocytaire, une répercussion possible de la réaction gliale

observée dans la pathologie (Aponso et al., 2008).

Notons que la cystamine a déjà montré des capacités prolifératives in vitro dans les cellules

pulmonaires humaines WI-38 par ses propriétés d'inhibiteur de la Tgase (Birckbichler et al.,

1981). En outre, en augmentant la production de BDNF, la cystamine pourrait également

promouvoir la neurogenèse. En effet, les facteurs trophiques comme le BDNF, lorsque

administrés dans les ventricules cérébraux d‟animaux de laboratoire, peuvent favoriser une

augmentation de l'activité mitotique des cellules progénitrices, la migration de cellules

progénitrices dans des régions voisines (y compris le striatum) ainsi que la différenciation

en cellules de lignée à la fois neuronale et gliale (Mohapel et al., 2005; Pencea et al., 2001;

Winner et al., 2008; Zigova et al., 1998). La cystamine pourrait ainsi promouvoir le

remplacement cellulaire de la SNpc lésée par la 6-OHDA via l‟induction de la neurogenèse.

Ces cellules pourraient provenir directement de la SNpc elle-même par multiplication de

190

progéniteurs neuronaux locaux et différentiation en neurones dopaminergiques ou encore

des progéniteurs pourraient migrer de la zone sous ventriculaire ou du gyrus denté jusqu‟à

la SNpc, en se déplaçant éventuellement le long de gros vaisseaux sanguins. Même si le

BDNF est considéré comme efficace dans la promotion de la neurogenèse dans des

modèles animaux de la MP, cette avenue doit toutefois être poursuivie afin d'élucider les

mécanismes de la cystamine à l‟origine d‟un éventuel processus neurogénique dans le

contexte de la MP (Mohapel et al., 2005).

5.4.2 Stratégies thérapeutiques potentielles

Comme nous venons de le discuter plus haut, l‟injection de cystamine chez des animaux

préalablement lésés, montre des effets significatifs vis à vis de la récupération

fonctionnelle, toutefois les mécanismes d‟action à l‟origine de ces effets restent encore à

définir. Ainsi, la question du potentiel thérapeutique du traitement par la cystamine chez les

individus en phase avancée symptomatique de la MP reste encore en suspens. En revanche,

l‟existence d‟une phase pré-symptomatique rend particulièrement attrayante l‟utilisation de

la cystamine. En effet, agir au cours de cette période permettrait non seulement une action

trophique de la cystamine via la modulation du BDNF, mais surtout une action protectrice

ou de rescue efficace des neurones dopaminergiques en dégénérescence ou encore intacts.

Ainsi, deux stratégies utilisant la cystamine semblent réellement envisageables pour

observer un effet thérapeutique en clinique:

(1) L‟administration de cystamine lors de la survenue des symptômes. Les effets

antioxydant, anti-apoptotique et trophique de la cystamine sur les neurones

dopaminergiques de la SNpc ainsi que son effet modulateur sur la production et sécrétion

de BDNF et NO par les cellules gliales environnantes, permettront de protéger les neurones

et les fibres restants ainsi que de favoriser le métabolisme dopaminergique ce qui pourrait

stopper, voire inverser, la progression de la maladie.

(2) L‟administration de la cystamine durant la phase pré-symptomatique. En

protégeant les neurones de la SNpc, alors que leur nombre est encore suffisant pour obtenir

une synthèse satisfaisante de dopamine, on pourrait théoriquement empêcher la survenue

des symptômes. Cette approche constitue la thérapie idéale de la MP. Cependant, elle

nécessite la mise au point de méthodes de diagnostic pré-symptomatique extrêmement

191

fiables et pouvant être mis en place à grande échelle. La compréhension des mécanismes de

compensation lors de cette phase est donc une voie de recherche primordiale afin de

disposer prochainement de marqueurs biochimiques permettant d‟étudier l‟évolution de la

MP.

5.4.3 Avenir clinique de la cystamine pour la MP

Pour qu‟une molécule, visant un désordre cérébral, puisse être testée en clinique, il existe

plusieurs obstacles à franchir. La démonstration de son efficacité au stade préclinique, dans

des modèles animaux de la pathologie, est l‟étape principale du processus. La

démonstration de son innocuité chez l‟homme, de sa capacité à rejoindre la zone ciblée (le

parenchyme cérébral), la caractérisation de ses doses thérapeutiques ainsi que ses

mécanismes d‟action sont autant de facteurs qui permettent de faciliter l‟élaboration d‟un

test chez l‟homme pour une molécule donnée. La cystamine, en partie grâce à nos études, a

su franchir bon nombre de ces obstacles pour la MP.

5.4.3.1 Avantages thérapeutiques de la cystamine

Un des avantages de la cystamine est qu‟elle peut être utilisée rapidement en clinique. La

cystéamine, un de ses dérivés, est déjà approuvée pour sa mise sur le marché et de

nombreuses études cliniques ont déjà montré son innocuité chez l‟homme (Gahl et al.,

2002). En effet, la cystéamine est utilisée depuis plusieurs années pour le traitement de la

cystinose néphropatique. Très récemment, une étude clinique menée chez des patients

souffrant de la MH a démontré que le bitartrate de cystéamine est sécuritaire à une dose de

20 mg/kg/jour (Dubinsky and Gray, 2006). Une étude de phase II proposée par Raptor

Pharmaceutical Corp. est actuellement engagée pour déterminer le réel potentiel clinique de

la cystéamine pour la MH. La pharmacocinétique de la cystamine et de la cystéamine chez

l‟homme au niveau périphérique est assez bien connue puisque ces composés sont utilisés

depuis longtemps comme thérapies dans divers contextes pathologiques (Cf introduction).

En revanche, jusqu‟à récemment, très peu d‟informations existaient sur la biodisponibilité

de la cystamine au niveau cérébral, posant la question de son efficacité et son mode

d‟action thérapeutique dans le contexte de maladies neurodégénératives telle la MP. En

effet, la BHE est un obstacle majeur pour l'application clinique d‟une vaste majorité de

192

composés potentiellement neuroactifs et doit être prise en considération quand vient le

temps de déterminer quel(s) métabolite(s) de la cystamine est(sont) à l‟origine de ses effets

thérapeutiques. Une de nos récentes études (chapitre IV de cette thèse) suggère que la

cystéamine est le métabolite clé neuroactif après administration systémique de cystamine.

En effet, une administration p.o. chronique ou i.p. aiguë de cystamine mène à une

augmentation significative des concentrations cérébrales de cystéamine (Bousquet et al.,

2010; Pinto et al., 2005). De plus, nous avons démontré grâce à l‟utilisation de la perfusion

cérébrale in situ, une technique de pointe dans le domaine de l‟étude biochimique de la

BHE, que la cystéamine peut traverser la BHE in vivo (Bousquet et al., 2010). Bien qu‟il

reste à définir les mécanismes exacts de transport de la cystéamine au travers la BHE, ses

observations nous procurent une information importante sur la neuropharmacologie de la

cystamine/cystéamine et ainsi supportent la pertinence de son utilisation en clinique pour la

MP.

5.4.3.2 Effets thérapeutiques ou toxicité: répercussions de la dose utilisée

In vitro, on remarque en condition pathologique, un effet globalement cytoprotecteur de la

cystamine dans plusieurs expérimentations, dont les nôtres, pour des doses allant de 100 à

250 M (Borrell-Pages et al., 2006). Les dérivés de la cystamine démontrent toutefois une

certaine toxicité. En effet, il a été montré que les métaux peuvent oxyder les thiols (R-SH) à

des concentrations inférieures à 10-3

M en leur forme disulfure (R-SS-R). Cette oxydation

est concomitante à la production d‟H2O2 qui, réagissant avec les métaux réduits, produit des

radicaux hydroxyles très réactifs. La cystéamine, qui est un thiol, peut donc exercer un tel

effet cytotoxique: une concentration de 10-4

M induit l‟apoptose par la production de

peroxyde d‟hydrogène in vitro. Cette toxicité est restreinte aux concentrations inférieures à

10-3

M : entre 10-4

et 10-3

M la cystéamine peut produire des quantités toxiques d‟H2O2 (de

l‟ordre du μM), tandis qu‟à une concentration de l‟ordre du mM, la cystéamine (et les thiols

en général) peut réagir suffisamment vite pour éliminer le peroxyde d‟hydrogène généré.

Cependant, même si il est établit que les thiols peuvent générer de l‟H2O2, aucune étude n‟a

démontré si cet apport est suffisant pour générer la mort de cellules neuronales (Jeitner and

Lawrence, 2001). La cystamine quant à elle est une forme disulfure (R-SS-R) et non un

thiol comme la cystéamine. A l‟heure actuelle, aucune étude ne rapporte d‟effet

193

neurotoxique de la cystamine in vitro pour les doses mentionnées ci-avant.

Chez la souris parkinsonienne, nous observons dans nos études un effet thérapeutique de la

cystamine uniquement à faible dose (10 mg/kg/jours). Une autre étude observe pour la

cystéamine également un effet bénéfique pour une faible dose (20 mg/kg/jour) et peu

d‟effet pour des doses supérieures. Cette faible dose est jugée sécuritaire chez l‟homme

dans une étude menée chez des patients souffrants de la MH. Cependant, l‟efficacité

clinique d‟une dose de 20 mg/kg/jour n‟a pas encore été démontrée dans cette maladie

neurodégénérative. Même si elles ne sont pas entièrement transposables à l‟homme, les

études menées dans des modèles animaux de la MH montrent que des doses supérieures (50

à 100 mg/kg) de cystamine et cystéamine sont requises pour obtenir un effet thérapeutique.

De surcroit, même si nous avons montré que la cystéamine peut traverser la BHE, cela

requière des doses élevées de cystamine ou de cystéamine (i.p. et p.o.), qui engendrent des

effets secondaires chez les souris, pour détecter une variation de la cystéamine ou de ses

métabolites dans le cerveau (Bousquet et al 2010). Notons toutefois que la méthode de

quantification (par HPLC) de ces métabolites est souvent un facteur limitant dans la

détection de faibles variations de concentration d‟un composé. Enfin, un travail mené par

Stack et al. démontre par ailleurs, dans des modèles de souris parkinsoniennes, un effet

thérapeutique de la cystamine pour des doses p.o. allant jusqu‟à 750 mg/kg/jour. Bien que

la démonstration d‟une action neuroprotectrice de la cystamine dans un modèle plus

drastique de la MP soit très intéressante, la dose de cystamine utilisée ici pour engendrer

cet effet semble démesurément importante. Effectivement, nous observons dans nos études

une toxicité de la cystamine lorsque administrée i.p. à une dose de 200 mg/kg qui se traduit

par une hypothermie et une somnolence accrue des souris (Gibrat et al., 2010), ces

symptômes étant rencontrés chez l‟humain lors d‟un surdosage de cystéamine (Dubinsky

and Gray, 2006). De plus, ces mêmes effets ont été rencontrés dans notre laboratoire pour

des doses inférieures de 100 mg/kg/jour sur une base chronique forçant l‟arrêt du protocole

(données non présentées). Il est également démontré qu‟un effet toxique ulcérogène gastro-

intestinal se manifeste rapidement (sous 24-48 heures) dès l‟utilisation (p.o., s.c. ou i.p.)

d‟une dose supérieure à 250 mg/kg/jour de cystéamine chez l‟homme et chez le rongeur

(Szabo, 1978) ce qui est largement au dessus des doses thérapeutiques usuelles chez

194

l‟homme. Le processus en cause est multiple : augmentation de l‟acidité et de la pepsine,

stase par retard de la vidange gastrique, augmentation de l‟histamine dans les muqueuses

gastriques et duodénales, diminution du flux sanguin duodénale, de l‟activité de la

somatostatine ou encore via l‟activité vagale. Une seule dose de 625 mg/kg p.o. de

cystéamine s‟est avérée létale chez le rat par induction d‟une léthargie, dépression

pulmonaire et hémorragie gastro-intestinale généralisée (Jeitner and Lawrence, 2001).

Malgré l‟emploi de doses importantes de cystamine dans l‟étude de Stack, pendant une

durée de plus de 14 jours (750 mg/kg ; 7 jours avant et 7 jours après lésion), les auteurs ne

rapportent aucun effet secondaire. Les doses de cystamine calculées dans l‟eau par les

expérimentateurs de cette étude ne reflètent peut-être pas la dose réellement ingérée par les

souris ce qui rend difficile l‟extrapolation des résultats obtenues ici avec les nôtres en

matière de dose d‟efficacité.

Des effets embryo-foetotoxiques ont été aussi rapportés chez le rat à la dose de 100

mg/kg/jour de cystéamine ainsi que des effets tératogènes (Assadi et al., 1999). Cependant

aucun risque mutagène ou carcinogène n‟a été rapporté. Des études comportementales

menées chez le rat ont montré que l‟injection s.c. de cystéamine (1.95 mM/kg) réduit

nettement plusieurs types de comportements (locomotion, toilettage, défécation, etc.) liés à

la fonction locomotrice de la somatostatine (Vecsei et al., 1989; Vecsei and Widerlov,

1990). La somatostatine est un peptide anti-inflammatoire inhibant la libération de

substance P dans les exsudats inflammatoires. La cystéamine réduit les taux de

somatostatine dans le cerveau et les tissus périphériques (mais également de prolactine et

de noradrénaline). Salam et al. ont examiné le rôle de la somatostatine endogène dans des

modèles d‟inflammation périphérique aiguë induisant la formation d‟oedèmes de la patte

postérieure chez le rat, en inhibant la somatostatine endogène par l‟administration de doses

variables de cystéamine (0 à 300 mg/kg). Ils ont montré que la cystéamine exerce des effets

pro- ou anti-inflammatoires selon la dose et le mode d‟administration (systémique ou local)

utilisés (Salam, 2002).

Bien que d‟elle dépend grandement l‟effet thérapeutique recherché ou la survenue d‟un

effet toxique, la recommandation d‟une dose précise de cystamine ou de cystéamine pour

195

les patients souffrant de la MP est difficile à prédire pour le moment. Cependant, au regard

des expérimentations précliniques et des études menées chez l‟homme, si l‟on souhaite une

dose efficace et sécuritaire pour la MP, il serait pertinent d‟utiliser des doses équivalentes à

celles déjà utilisées en clinique pour traiter d‟autres pathologies. Les résultats attendus pour

l‟étude de phase II menée chez les patients souffrants de la MH pourront peut-être nous

donner un indice plus précis quant à la dose de cystamine (ou cystéamine) à préconiser

pour la MP.

197

6 Chapitre VI. Conclusions

6.1 Contributions au domaine d'étude

Les recherches effectuées au cours de mon doctorat ont permis de souligner l‟influence

majeure de la cystamine sur le cours évolutif d‟une dégénérescence de type parkinsonienne

chez la souris. Nous avons, non seulement, observé un robuste effet bénéfique préventif de

la cystamine dans un modèle pré-symptomatique de la MP, mais également constaté son

action au delà de la neuroprotection, dans des phases plus avancées de la dégénérescence

dopaminergique. Nos études ont également permis l'identification de certains mécanismes

d'action potentiellement à l‟origine des effets bénéfiques de la cystamine, dont la régulation

du facteur neurotrophique BDNF ainsi que la modulation de certains facteurs apoptotiques

et composés cytotoxiques pro-inflammatoires. Ces observations ouvrent la voie à des

études supplémentaires chez l‟animal afin de confirmer et caractériser plus finement

l‟implication de la cystamine dans la modulation de certaines voies pathologiques

esquissées dans nos études, telle la neuro-inflammation ou la neurogenèse. L‟étendue des

doses de cystamine testées a également conduit à l‟identification des doses optimales

d‟efficacité de la cystamine dans un modèle murin de la MP. Enfin, nos études ont permis

d‟identifier la cystéamine comme l‟intermédiaire majeur impliqué dans l‟action

thérapeutique de la cystamine et démontrent sa capacité à traverser la BHE in vivo.

L‟ensemble des travaux effectués au cours de mon doctorat sur le pouvoir thérapeutique de

la cystamine dans le contexte de la MP pourrait offrir une base solide pour la poursuite de

la recherche translationnelle sur cette molécule. La suite de ce projet fait d‟ailleurs déjà

partie d'un partenariat avec une compagnie pharmaceutique qui devrait mener à l'initiation

d'un essai clinique chez des patients parkinsoniens en 2013-2014.

198

6.2 Perspectives

Toujours dans l‟optique de déterminer la nature du potentiel thérapeutique de la cystamine

dans la MP, plusieurs autres voies expérimentales seraient intéressantes à poursuivre,

notamment l‟investigation de potentiels effets neurorestaurateurs. Ainsi, l‟utilisation

d‟agents antimitotiques ou de marqueurs de prolifération cellulaire comme la

bromodéoxyuridine (Brdu) et de marqueurs phénotypiques lors d‟un prochain protocole

animal pourrait s'avérer utile afin de statuer sur le pouvoir et les mécanismes neurogéniques

de la cystamine. Aussi, l‟utilisation de souris Tlr2-fluc-GFP, lignée transgénique qui

exprime le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur Tlr2 (expression lors de la

réaction microgliale) murin, serait un bon moyen de suivre in vivo, via imagerie en

biophotonique et bioluminescence en temps réel, l‟impacte de la cystamine sur l‟activation

gliale en condition pathologique. Parallèlement, il faudrait aussi vérifier l‟effet de la

cystamine sur le phénotype et la relâche d‟autres facteurs inflammatoires (mis à part le NO)

par les cellules gliales après activation par le LPS, pour statuer sur le réel pouvoir anti-

inflammatoire de la cystamine. Est actuellement en cours d'investigation dans le

laboratoire, l‟influence de la cystamine sur la synucléinopathie chez des souris

transgéniques Thy1-αSyn qui surexpriment la protéine α-synucléine humaine sous le

contrôle du promoteur neuronal spécifique Thy1. Enfin, les mécanismes exacts de transport

au travers la BHE de la cystamine, cystéamine et cystéine demandent à être précisés. Leur

caractérisation pourrait avoir un impact significatif sur l‟amélioration du transport de la

cystamine (et ses métabolites) au cerveau. Pour des raisons de constance et de connaissance

de sa dose optimale d‟efficacité, nous avons choisi d‟administrer en i.p. la molécule de

cystamine dans toutes nos expérimentations. Or nous avons également démontré que c‟est

son dérivé réduit, la cystéamine, l‟intermédiaire majeur impliqué dans son action

thérapeutique. À plus long terme, et dans les phases translationnelles plus avancées, des

études comparant l‟efficacité de la cystamine par rapport à celle de la cystéamine p.o.

devraient être réalisées (ainsi que les aspects toxicologiques respectifs de ces 2 formes)

dans le but de déterminer laquelle des 2 formes est la plus optimale. Les nouvelles données

qui résulteront de ces diverses expérimentations seront critiques dans l'expansion du panel

d'applicabilité clinique de la cystamine. Pour l‟heure, si on se plonge dans la perspective

199

d‟une étude clinique en contexte parkinsonien, la cystamine devrait être testée chez des

patients nouvellement diagnostiqués afin d'investiguer la potentielle modification du cours

évolutif de la maladie.

201

Bibliographie

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