Propriétes addititives de la variance et élargissement de...

Propriétes addititives de la variance et élargissement de pic(solution)

232CHM 3102

Quelles sont les variances et déviations standards correspondant aux phenomènes de diffusion associés à l’injection, détection et la colonne si le débit est de 1 mL/min, la largeur de pic à mi-hauteur est de 15 s, le volume d’injection 25 µL et le volume de la cellule du détecteur est de 20 µL?

σ2obs.= σdet.

2 + σinj.2 + σcol.

2

= (W0.5/2.35)2 = (15s/2.35)2 = 40.72 s2

σinj.2 = (∆tinj.)2/12 = [(0.025ml/(1ml/min))*60s/min]2/12 = 0.19 s2

σdet.2 = (∆tdet.)2/12 = [(0.020ml/(1ml/min))*60s/min]2/12 = 0.12 s2

σ2col.= σobs.

2 - σinj.2 - σcol.

2 = 40.72 s2 - 0.19 s2 - 0.12 s2 = 40.41 s2

σcol.= 6.36 s

NB. La contribution a l’élargissement de pic associée a l’injection et la détection estconsiderée acceptable si celle-ci est moins de 5% de la variance observée.

Purification de protéines - stratégies

233CHM 3102

Propriétés des protéines et stratégie de purification

• Instabilité à la température• Stabilité au pH• Stabilité au solvants organiques• Nécessité d’utiliser des détergents• Sel (force ionique)• Co-facteur et stabilité d’activité• Sensibilité aux protéases• Sensibilité aux métaux• Activité redox• Poids moléculaire• Charge• Affinité biospécifiques• Modifications post-traductionelles• Hydrophobicité


234CHM 3102

Définir la pureté nécessaire

99% Utilisation thérapeutique, études in vivo

95-99% Cristallographie, caractérisationphysico-chimiques

< 95 % Antigène pour production d’anticorps, séquençage d’Edman

Minimiser les étapes de purification

Pure

téFinitionHaute pureté

Purif. Interm.Enlever les impuretés

CaptureIsoler, concentreret stabiliser

PréparationExtraction, clarification

Étapes


235CHM 3102

Étapes de purification

Amersham BiosciencesProtein PurificationHandbook18-1132-29

Echange d’ion

Interaction hydrophobique

Affinite

Exclusion

Phaseinverse

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Chromatographie d’affinité

Purification de protéines avec 6xHis

Protéine- 6xHis Metal (Ni 2+) Chelate(tetradentate)

•Lysat cellulaire avec protéine-6xHis en condition native ou dénaturante

•Liaison His-Ni a pH 8 (pI His6 ~5.6)•Capacité ~ 200 uL billes pour 60 ugprotéine 6-His (e.g. dihydrofolatereductase).

•Lavage tampon Tris-Phosphate•Elution par compétition avec 50-500mM imidazole; diminution de pH; EDTA

Chromatographie d’affinité -Exemple

237CHM 3102

Purification 6xHis phosphatase (19 kDa) a partir de 1.2 L lysat de E. coli

Gel SDS-PAGE1: Marqueur moleculaires2: Lysat de protéines montrant la surexpression de la phosphatase3. Proteines non-retenues sur billes Ni-NTA (6 mL)4. Elution 20 mM imidazole5. Elution 100 mM imidazole6-7. Elution 500 mM imidazole

1 2 3 4 5 6 7Non-retenu (3)

20 mM (4)100 mM (5)

500 mM (5)

QIA expressionist 5th Ed., www1.qiagen.com

Chromatographie par échange d’ions

238CHM 3102

Principe de séparation

Concentration de proteines de charge opposee

Gradient de force ionique et déplacementde protéine faiblement associée à la résine

Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique


239CHM 3102

Types de résines

Résine Groupes fonctionnels pH oper.________________________________________________________

Anion

Diethylaminoethyl -O-CH2-CH2-N+H(CH2-CH3)2 3-8

Amino ethyl quaternaire -O-CH2-CH2-N+H(C2H5)2–CH2-CHOH-CH3 3-11

Ammonium quaternaire -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 3-11

Cation

Carboxymethyl -O-CH2-COO- 5-11

Methyl sulfonate -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-SO3- 4-11

Sulfopropyl -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3- 4-11


240CHM 3102

Sélection selon le pI de la protéineChar

ge

net

te

pI

102 4 6 8

Gamme de stabilité

Courbe de titration théorique


241CHM 3102

Sélection du pH et ordre d’élution

pH acide inférieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeusede cation

pH basique supérieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeused’anion.

pH plus basique. Uneprotéine positivementchargée (rouge) interagitavec la résine cationiqueet peut être séparée des autres. Alternativementles autres protéinespeuvent etre séparéesavec une résine anionique, alors que la protéine en rouge n’est pas retenue.

pH moins acide. Uneprotéine negativementchargée(bleu) interagitavec la résine anionique et peut être séparée des autres. Alternativement les autres protéines peuventetre séparées avec unerésine cationique, alorsque la protéine en bleu n’est pas retenue. résine échangeuse d’anion

résine échangeuse de cation


242CHM 3102

Force ionique et facteur de capacité

Ln(k

’)

1/√I

lysosyme α-chymotrypsinogen

Cytochrome C

ou: Ap: Aire du polyelectrolyteσp: Densité de chargeF : Constante de Faradayε0: Cst. Permittivitéεr: Cst dielectrique de la phase mobileI : Force ioniqueΦ: Rapport volume occupé par phase

stationnaire et mobile: Vs/Vm

Anal. Chem, 63, 1867 (1991)


243CHM 3102

Sélectivité et élution

Gradient linéaire

Elution par plateau


244CHM 3102

Diamètre des particules et résolution

Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21


245CHM 3102

Caractéristiques des résines


246CHM 3102

Tampons

Purifying proteins for proteomicsR.J. Simpson, p. 127


247CHM 3102

Exemples de séparation


Anion (faible)

Anion (fort)

Anion (fort)

Anion (faible)


248CHM 3102

Exemples de séparation


Résine échangeuse de cation


249CHM 3102

Chromatographie d’exclusion moléculaire

250CHM 3102

Phase stationnaire : pores de taille contrôléeGels (agarose, dextrane, polyacrylamide)Supports rigides (silice poreuse)

Phase mobileSolubilise l’échantillonGonfle le gelCompatible avec le système de détectionIsocratiqueEx : TRIS, phosphate, NaCl, et detergent neutre

Séparationbasée sur la taille des molécules, et donc leur aptitude à pénétrer dans le réseau de pores


251CHM 3102


252CHM 3102

Gel, structure et porosité

Harris, 6e Ed. p. 652Structure de polyacrylamide


253CHM 3102

Coefficient de distribution et masse moléculaire

ViV0

Vm

VR = V0 + KD Vi KD = VR – V0Vm – V0

Volume mort, V0 est determiné en utilisant le dextran blue 2000 (Mr = 2 x 106 Da). Vmcorrespond au volume de la phase mobile et est la somme du volume mort et du volume interne Vi.


254CHM 3102

Exemple de séparation

L’ordre d’élution est inversementproportionel à la masse moléculaire.

Utilité pour l’observation et le contrôledu repliement et de l’aggrégation de protéines. Frequemment utilisée pour désaler les protéines par exempleaprès digestion ou modification chimique.

Harris, 6e Ed. p. 653


255CHM 3102

Gamme de linéarite

Diamètre des pores de la phase stationnaire de polystyrene

Harris, 6e Ed. p. 653

Pour chaque phase stationnaire il existe un domaine ou le log Mr et le volume d’élution est linéaire. La gamme de masse augmente avec la dimension des pores (Ex: G2000SW, pore 13 nm, separation: 0.5-60 kDa et G5000SW, pore 100 nm, separation > 1.5 MDa)


256CHM 3102

Tampons volatils recommandés

pH Tampons Contre-ion pK-pour tampon

2.0 Formic acid H+ 3.75

2.3-3.5 Pyridine/formic acid HCOO- 3.75; 5.25

3.0-5.0 Trimethylamine/formic acid HCOO- 3.75; 9.25

3.0-6.0 Pyridine/acetic acid CH3COO- 4.76; 5.25

4.0-6.0 Trimethylamine/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25

6.8-8.8 Trimethylamine/HCI CI- 9.25

7.0-8.5 Ammonia/formic acid HCOO- 3.75; 9.25

8.5-10.0 Ammonia/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25

7.0-12.0 Trimethylamine/carbonate CO32- 6.50; 9.25

7.9 Ammonium bicarbonate HCO3- 6.50; 9.25

8.0-9.5 Ammonium carbonate/ammonia CO3

2- 6.50; 9.25

8.5-10.5 Ethanolamine/HCI CI- 10.0

8.5 Ammonium carbonate CO32- 6.50; 9.25

Exercise

257

Dans le but de préparer une colonne d’immunoaffinité vousdevez purifier des anticorps IgG à partir d’épanchement ascitiquede souris, quelle mode de séparation et quel type de colonneutiliserez vous et comment pourriez vous vérifier la pureté de l’échantillon?

1. Mode de séparation: Chromatographie d’exclusionmoléculaire, Ab: ~150 kDa

2. Colonne: Choisir porosité permettantune bonne selectivité

Bio-Gel P-300 60,000-400,000 Da

Exercise

258

Dans le but de préparer une colonne d’immunoaffinité vousdevez purifier des anticorps IgG à partir d’épanchement ascitiquede souris, quelle mode de séparation et quel type de colonneutiliserez vous et comment pourriez vous vérifier la pureté de l’échantillon?

3. Séparation et caractérisation

+ DTT

160 kDa

~27 kDa

~52 kDa

Pont disulfure

Chromatographie par interaction hydrophobique

259CHM 3102

Principe de séparation∆G = ∆H - T∆S

Ligand PH

Protéine

Régionhydrophobe

Ligand

PH

+ +

Support solide

Moléculed’eau

L’échantillon protéique est dissout dans un tampon de sel de haute concentration.

Les molécules d’eau près de la surface du ligand et de la surface hydrophobe de la protéine sontplus ordonnées qu’en solution (effet “protection”).

Le déplacement des molécules d’eau entourant le ligand et la région H de la protéine donne lieu a une augmentation d’entropie rendant ainsi cette interaction thermodynamiquement favorisée.

Interactions de type van der Waals augmentent entre le ligand et la région H avec l’augmentation

de la structure ordonnée de molécule d’eau en présence de sel (“salting out”).

• Fractionation of proteins by hydrophobic interaction chromatography, with reference to serum proteins. Proceedings Intl. Workshop on Technology for Protein Separation & Improvement of Blood Plasma Fractionation. Reston, Virginia, 1977, 410–421, Hjertén, S.

• Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of the lyotropic series. Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.

• Role of physical forces in hydrophobic interaction chromatography. Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.


260CHM 3102

Facteurs affectant la chromatographie par interaction hydrophobique

Type de ligand et degré de substitutionType de support solideConcentration et type de selpHTempératureAdditifs


261CHM 3102

Type de ligand type et degré de substitution

Cap

acité

de

liais

on

(mg p

roté

ine/

ml gel

)

C4 C6 C8µmol ligand/ml gel10 20 30

• La capacité de liaison de l’adsorbant augmenteavec la chaine alkyl et le degré de substitution.

• Un plateau de capacité de liaison est atteintlorsque le degré de substitution est elevémarquant un ancrage multipoint de la protéine et une difficulté d’élution.

• Le degré de substitution est plus faible qu’enchromato. phase inverse (d’environ 30 vs. >100 µmol ligand/ml gel).

Les gels Sepharose sont produits par Amersham Bioscienceset comprennent de l’agarose (3,6-anhydro-L-galactose)“cross-linked” formant des macropores permettant l’accès de biomolecules de 4 MDa (agarose 6%), 27 MDa (agarose 4%). Les gels superose sont des billes de 13 um diam. d’agarose(12%) “cross-linked” pour colonne FPLC.


262CHM 3102

Type de support

Les supports solides sont typiquement hydrophilique et contiennent des gels à base d’hydrate de carbone e.g. agarose ou co-polymères synthétique greffés.

La selectivité sur un support de co-polymère ne sera pas la même que sur un support de type agarose utilisant le mêmetype de ligand.

Pour obtenir le même type de résultats il serait nécessaire de modifier les conditions d’adsorption et d’élution.


263CHM 3102

Concentration et type de sel

Capacité de charge sur unecolonne Phenyl Sepharose en fonction de la concentration de sel initiale (AmershamPharmacia Biotech).

Formationde ppt.

• Protéines sont injectées dans un tampon de sel de haute concentration (sous le point de ppt).

• La colonne est préconditionnée avec le mêmetampon et concentration de sel.

• Les protéines sont eluées avec un gradient de selprogressivement plus dilué (tampon dilué ou avec de l’eau).

Série de Hofmeister et effet sur la ppt

Aug. de la ppt (“salting out”)

Anions: PO43-, SO4

2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4

-, I-, SCN-

Cations: NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+

Aug. de l’effet chaotropique (“salting in”)

Voir: Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.


264CHM 3102

pH Volume d’elution/volume protèines non-retenues

En général les interactions hydrophobiques sont diminuéesavec l’augmentation de pH possiblement avec l’apparitiond’un plus grand nombre de site négativement charge rendant la protéine plus hydrophilique.

La diminution du pH occasionneune augmentation apparentedes interactions hydrophobiquespossiblement dû a un changement de conformation rendant la protéine plus hydrophobe.

1: Soyabean trypsin inhib. 5: Enolase2: Hum. Serum Alb. 6: Ovalbumine3: Lysozyme 7: RNase4: Transferrin 8: Cytochrome C

Hjertén, S., Yao, K., Eriksson, K.-O., Johansson, B. “Gradient and isocratic High Performance Hydrophobic Interaction Chromatography of proteins on agarosecolumns”. J. Chromatog. 359 (1986) 99–109,


265CHM 3102

Température

Généralement les interactions hydrophobiques augmententavec l’accroissement de température dû à l’effet entropique et aux forces d’attractions van der Waals.

Cependant dans certains cas les protéines peuvent êtredénaturées et changer de conformation avec l’augmentation de température donnant lieu à un changement de solubilité en solution


266CHM 3102

Additifs

• De faibles concentrations d’alcools, détergents et d’agents chaotropique(“salting-in”) miscibles dans l’eau affaiblieront les interactions hydrophobiques et occasionneront l’élution des protéines.

• Les groupes non-polaires alkyls des alcools et détergents compétitionnentavec les protéines liées et peuvent déplacer celles-ci du ligand.

• Les effects chaotropiques des sels affectent la structure de la sphèred’hydratation des protéines liées et diminue la tension de surface de l’eau.

• L’utilisation d’additifs ne doit pas compromettre l’activité des protéines ouleur dénaturation.

• Ceux-ci peuvent etre utilisés pour reconditionner les colonnes et dissocierles protéines adsorbées.


267CHM 3102

Exemple de séparation% A

100

80

60

40

20

Colonne: Phenyl Superose PC 1.6/5Echantillon: Fraction active d’un homogénat de cerveau de

boeuf purifié par CEA.Tampon A: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA,

1.7 M (NH4)2SO4.Tampon B: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA.Débit: 50 µl/min.Détection: A280nm ou activité GAP-3 (hydrolyse 32P-GTP)

Nice, E., Fabri, L., Burgess, A., Simpson, R., Hellman, V., Andersson, K., A multidimensional HPLC strategy for the purification of proteins and peptides for micro-sequence analysis: - The role of micropreparative ion exchange columns. 10th International Symposium of Proteins, Peptides and Polynucleotides, Wiesbaden, Germany, October 1990


268CHM 3102

Exemple de séparation% B

100

80

60

40

20

0

Colonne: Alkyl Superose HR 5/5Echantillon: 100 µl ascite de souris contenant anticorps

monoclonal IgG1(a) ou IgG2a (b).Tampon A: 0.1M phosphate, pH 7, 2 M (NH4)2SO4.Tampon B: 0.1M phosphate.Détection: A280nm

Amersham Biosciences

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