Présentation des outils du laboratoire: l t hi h t i hles ... · yPrincipe de la CHROMATOGRAPHIE:...

Présentation des outils du laboratoire:

l t h i h t hiles techniques chromatographiques

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)HAUTE PERFORMANCE (HPLC)

&

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (GC)

Emeline Houël – 04/06/2007

RAPPELS THEORIQUESQ

Principe de la CHROMATOGRAPHIE:Principe de la CHROMATOGRAPHIE:

Technique d’analyse pour séparer les constituants d’un mélange en Technique d analyse pour séparer les constituants d un mélange en phase liquide ou gazeuse

L lé l à é t t i é fl id (liq id ) Les molécules à séparer sont entrainées par un fluide (liquide ou gaz) = phase mobile

Elles interagissent (ou pas) avec un support fixe (solide ou liquide fixé) = phase stationnaire

Séparation <-> différence d’affinité des substances à analyser à l’égard des deux phases.

RAPPELS THEORIQUESQ

Mais aussi:CCM & CCM &

Chromatographie sur colonne

GPC / GPCHT: Chromatographie par perméation de gelHPLC: Chromatographie liquide haute performanceCI: Chromatographie ioniqueCI: Chromatographie ioniqueGC: Chromatographie en phase gazeuse

RAPPELS THEORIQUESQ

Ré lt t btRésultats obtenus:

Sous la forme d’un CHROMATOGRAMME

= tracé représentatif de la concentration de chaque constituant en fonction du tempsen fonction du temps

« Un pic = une molécule »« Un pic = une molécule »

Exemple de chromatogramme GC

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC)PERFORMANCE (HPLC)

P i iPrincipe:Exploiter les interactions entre les solutés et deux phases

Pour séparer les solutés en Pour séparer les solutés en

fonction de leurs affinités

Et les identifier et/ou les doser


A illAppareillage:

Injection:

Injecteur =

h i vanne haute pression

(manuelle ou non)

à plusieurs voiesà plusieurs voies

http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/Chaine HPLC semi-preparative: de l’ordre de 45 000 €


Colonnes:

Beaucoup moins rétentif que le C18 (généralement nécessite un plus grand % d’eau en mode phase inverse)Colonnes: p )

Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm (450 €)Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm x 5 µm (2500 €)

Analytique: 15 cm x 4 6 mm x 5 µm Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm (510 €)Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm x 5 µm (2800 €)


Détecteurs:Détecteurs:

UV (détecteur à barrette de diodes)UV (détecteur à barrette de diodes)

Indice de réfraction ( RID)

Diffusion de lumière

Vi i é i d i i é él hi i fl RMNViscosimétrie, conductivité, électrochimique, fluorescence, RMN…


E l d’ li tiExemples d’applicationsEtude d’une tisane de Quassia amara

¤ Profil suivi à 245 nm¤ Phase stationnaire C18

Time (min) flow (mL/min) % water % ACN curve1,00 70 30

10,00 1,00 50 50 612,00 1,00 0 100 11

Bertani, S., Houël, E., Stien, D., Chevolot, L., Jullian, V., Garavito, G., Bourdy, G., Deharo, E.,Simalikalactone D is responsible for the antimalarial properties of an amazonian traditionalremedy made with Quassia amara L. (Simaroubaceae), J. Ethnopharmacol., 108 (2006), 155-157


Dosage d’un composé: exemple de la Simalikalactone DDosage d un composé: exemple de la Simalikalactone D1. Courbe de calibration

Concentration (mg/mL) Aire du pic0 0

0,0061 1372581,22 139336303 05 38926414 84000000

Courbe de calibration3,05 389264146,1 69117131

01400000028000000420000005600000070000000

0 1 2 3 4 5 6 7Aire

du

pic

Concentration (mg/ml)

Droite de régression: Y= 11611021,7856 X

Quassine QuassineSkD SkD

Bertani, S., Houël, E., Bourdy, G., Stien, D., Landau, I., Deharo, E., Quassia amara L. (Simaroubaceae) leaf tea: effect ofthe growing stage and dessication status on the antimalarial activity of a traditional preparation, J.Ethnopharmacol., (2007), 111, 40-42


Etude d’extraits de Vouacapoua americana (Wacapou)Etude d extraits de Vouacapoua americana (Wacapou)

80:20 90:10 95:5 98:2

99:1

¤ Profil suivi à 230 nm¤ Phae mobile Hexane / Isopropanol¤ Phase stationnaire PEG (mode NP)


Mise au point d’un protocole HPLC pour l’étude d’extraits Mise au point d un protocole HPLC pour l étude d extraits méthanoliques d’Eperua falcata (Wapa): influence de la colonne

¤ Profil suivi à 245 nmM d i i ( % ACN)

¤ Profil suivi à 245 nm Ph t ti i PEG ( d NP)

Time (min) flow (mL/min) % hexane % iProp curve1,00 99 1

10,00 1,00 90 10 611 00 1 00 99 1 11

¤Mode isocratique (100 % ACN)¤ Phase stationnaire C18

¤ Phase stationnaire PEG (mode NP)

11,00 1,00 99 1 11


Identification de composés: extraits d’Eperua falcata (Wapa)

Thèse Mariana Royer

Identification de composés: extraits d Eperua falcata (Wapa)

Catéchine = composé j it i d t it

Chromatogramme de l’extrait de Wapa à l’acétate d’éthyle

majoritaire des extraits

Chromatogramme de la catéchine pure. d éthyle.

Chromatogramme de l’extrait d’aubier de Wapa au méthanol

Chromatogramme de l’extrait de duramen externe de Wapa au méthanolau méthanol. Wapa au méthanol.

Chromatographie en phase gazeuse (GC)g p p g ( )

P i iPrincipe:

Technique de séparation basée sur les interaction entre les composés gazeux et la phase stationnaire


A illAppareillage

Phase mobile Colonne

I j t

= gaz vecteur (exemple Hélium)Élution

= tube de silice qui contient la phase stationnaire

InjecteurMass spectrometer detector

Traitement des données

Colonne et détecteurdes données

GC/MS: de l’ordre de 70 000 €


Détection:Détection:Détecteurs universels

Catharomètre (ou détecteur à conductibilité thermique - DTC): tous é ( à )composés (1 à 10 ng)

Détecteur à ionisation de flamme (FID): composés organiques (20 à 100 pg)

L é i 1. Les composés organiques sont ionisés par la flamme

2. Les ions sont collectés d l’él t ddans l’électrode

3. Obtention d’un courant électrique

Détecteurs spécifiques: sensibilité pour certaines familles de composés

Dé à d’él é h l é é ( )Détecteur à capture d’électrons: composés halogénés (0,1 pg)

http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/ http://www.ac-nancy-metz.fr/http://perso.orange.fr/sand4/CPG.htm


Dét tiDétectionDétecteurs donnant des informations structurales

Infra-rouge (IR)

Spectrométrie de masse (MS)

g g

25

30

MCounts AN024.SMS 30:450 30:450

1A

5

10

15

20

10 20 30 40minutes

0

75%

100%

105.1 413708

119.1 367949

161.0 534543

Spectrum 1A19.194 min. Scan: 1011 30:450 Ion: 51 us RIC: 3,471e+6 (BC)BP 161,0 (534543=100%) an024.smsGC/MS : Gas Chromatography/ Mass

SpectrometryGC = séparation des molécules

0%

25%

50%

39.0 103847

41.0 146721

43.1 66568 79.2

42298

81.0 114898

95.1 33195

117.0 60693

120.0 100821 162.0

93300

204.0 193352

205.0 54444

-GC = séparation des molécules volatiles

-MS = analyse des molécules pour leur identification

100 200 300 400m/z

0%pour leur identification


A l d l’ d têt (h d ) GC (HS/GC)Analyse de l’espace de tête (headspace) par GC (HS/GC)

H d iHeadspace statique:

Préconcentration:Préconcentration:

Headspace dynamique (DHS) et méthode « purge & trap » (P&T)

SPME (Solid Phase Microextraction)SPME (Solid Phase Microextraction)Pérès, C., Begnaud, F., Eveleigh, L., Berdagué, J.-L., FastCharacterization of Foodstuff by Headspace Mass Spectrometry(HS-MS), Trends in Analytical Chemistry, 22(11), 2003, 858-866.


SPME/GC/MS SPME/GC/MS (Solid Phase Micro Extraction)

Extraction des composés volatils contenus dans une matrice solide ou liquidedans une matrice solide ou liquide

Fibre qui piège les volatils q p gcontenus dans l’espace de tête (headspace)

FIBREFIBRE

SPME

= EXTRACTION

GC

= SEPARATION

MS

= IDENTIFICATION


I fl d l tité t d t d’ t tiInfluence de la quantité et du temps d’extraction:Analyse de volatils dans des feuilles

Scan Range: 1 - 2796 Time Range: 0.00 - 43.97 min. Date: 05/04/2007 13:26

10.0

MCounts AN115.SMS 30:450 30:450

Scan Range: 1 - 2806 Time Range: 0.00 - 43.98 min. Date: 05/04/2007 17:13

7

MCounts an118.sms 30:450 30:450

Scan Range: 1 - 2841 Time Range: 0.00 - 43.98 min. Date: 05/04/2007 18:13MCounts an119.sms 30:450

30:450

2.5

5.0

7.5

2

3

4

5

6

0.5

1.0

1.5

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 minutes

0.0

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 minutes

0

1

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 minutes

0.0

Seg 1, <no description>, Time: 0.00-44.00, EI-Auto-Full, 30-450 m/z

100 mg - 15 minutes 100 mg - 5 minutes 15/30 mg - 5 minutes

Stage Elodie Courtois, 2007


I fl d h i d l fibInfluence du choix de la fibre:Analyse des volatils d’un même échantillon d’écorce

MCounts an003.sms 30:450 30:450

0

1

2

3

4 Fibre PDMS/DVB

PDMS 100µm

PDMS 30µm

PDMS 7 µm

PA PDMS/DVB

CAR/ DVB

CAR/ PDMS

CAR/ PDMS/0

1

2

3

4

MCounts an008.sms 30:450 30:450

Fibre PDMS

100µm 30µm 7 µm DVB DVB PDMS PDMS/DVB

volatils Semi-volatils apolaires

Com-posésapolaires de haut

Semi-volatils polaires

Volatils, amines, composés arom-

Alcools et composés polaires

Gaz et composésde faible poids

Volatilset semi-volatils : arômes et

0

2

3

4

MCounts an013.sms 30:450 30:450

Fibre CAR/PDMS

PM atiquesnitrés

molé-culaire

odeurs

Pillonel, L., Bosset, J.O., Rapid Preconcentration and Enrichment Techniquesfor the Analysis of Food Volatile. A Review, Lebensmittel Wissenschaft, 35,

10 20 30 40minutes

0

1

Échelles identiques

2002, 1-14.



Influence du choix du programme de température Influence du choix du programme de température Comparaison de la séparation des sesquiterpènes d’un échantillon d’écorce

10

15

20

MCounts an017.sms 30:450 30:450

30°C (1 min) 5°C/min 150°C (5 min) 5°C/min

250°C

0

5

10.0

MCounts an022.sms 30:450 30:450

250 C

30°C (1 min) 5°C/min

0.0

2.5

5.0

7.5

3 ( ) 5 /150°C (7 min) 7,5°C/min

250°C

5.0

7.5

MCounts an029.sms 30:450 30:450

30°C 10°C/min 100°C (3 min) 3°C/min

150°C (4 min)

17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5minutes

0.0

2.5

5 47,5°C/min à 250°C



E l d’ tili ti Exemples d’utilisation: Obtention de signatures chimiques d’écorces de bois par SPME/GC/MSSPME/GC/MS

0

5

10

15

20

25

30

MCoun ts an0 24 .sms 3 0:4 50 30 :45 0

Vouacapoua americana (Caesalpiniaceae)

0

1 00

2 00

3 00

4 00

5 00

6 00

7 00

kCoun ts

15

MCoun ts

an0 37 .sms 3 0:4 50 30 :45 0

an0 49 .sms 3 0:4 50 30 :45 0

Eperua falcata (Caesalpiniaceae)

0

5

10

15

5 00

6 00

7 00

kCoun ts an0 61 .sms 3 0:4 50 30 :45 0

Duguetia surinamensis (Annonaceae)

I th ti (M i ti )

0

1 00

2 00

3 00

4 00

3 00

4 00

5 00

6 00

7 00

8 00kCoun ts an0 68 .sms 3 0:4 50

30 :45 0

Iryanthera sagotiana (Myristicaceae)

Gustavia hexapetala (Lecythidaceae)

1 0 20 30 40m in ute s

0

1 00

2 00


é i d il d l b iPrésentation des outils du laboratoire: les techniques chromatographiques

MERCI DE VOTRE ATTENTION !


P i i d l t ét i d Principe de la spectrométrie de masse- Source d’ions: Bombardement des molécules par des électrons qui vont

y z

-Φ0

Source d'ions

molécules par des électrons qui vont les ioniser

x

+Φ0+Φ0

-Φ0

d

Electrode en anneauy

Electrode en calotte

U+V

y z

Détecteur

Sourced'ions

Quadripôle

Electrode en anneaux

U+V

Ions piègés

x

z

Détecteur

Electrode en calotte

- filtres d’ions:

de type quadripôle ou trappe ionique Détecteurde type quadripôle ou trappe ionique ne vont laisser passer qu’un type d’ions

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