Approfondissement des

connaissances en biologie

moléculaire

nicolas.glaichenhaus@unice.fr

Master IADE – Année 2013-2014

Plan du cours

• Rappels de biologie moléculaire et de biologie

cellulaire

– Les molécules du vivant

– Le support de l’information génétique et son

décodage

– L’organisation de la cellule animale

• Les outils et les approches expérimentales

utilisées par les chercheurs

• Les mécanismes qui permettent aux cellules

de communiquer entre elles

Les outils et approches

expérimentales utilisées par les

chercheurs

Master IADE – Année 2013-2014

Les outils et les approches

expérimentales

• Les méthodes de purification et d’analyse des

molécules présentes dans les cellules

• Les cultures bactériennes

• Clonage et manipulation de l’ADN dans des bactéries

• Les cultures de cellules eucaryotes

• Les techniques de biologie cellulaire

• Souris transgéniques et souris porteuses de

mutations génétiques ciblées

Les méthodes de purification et d’analyse des

molécules présentes dans les cellules (1)

• Lyse de cellules en absence ou en présence de

détergents

• Selon les cas :

– Purification des organelles, des membranes et du cytosol

par centrifugation

– Fractionnement par chromatographie d’exclusion,

chromatographie sur couche mince ou chromatographie en

phase gazeuse

– Purification des acides nucléiques par extraction

phénol/chloroforme et précipitation en présence d’éthanol

• Séparation et visualisation des protéines par

électrophorèse à travers un gel de polyacrylamide

• Séparation et visualisation de fragments d’ADN par

électrophorèse à travers un gel d’agarose

• Détermination de la séquence nucléotidique d’un

gène

• Détermination de la séquence d’acides aminés d’une

protéine

Les méthodes de purification et d’analyse des

molécules présentes dans les cellules (2)

Centrifugation

Chromatographie d’exclusion

Séparation de protéines par

électrophorèse

Séparation de fragments d’ADN

par électrophorèse

Les cultures de bactéries

• Boites de Pétri, fioles de culture, pipettes

• Milieux de culture liquides (tubes,

Erlenmeyer) ou gélosés (Boites de Pétri)

• Centrifugeuse

• Microscope

• Incubateur à 37°C

Les cultures bactériennes

Les plasmides bactériens

• Molécules d'ADN

surnuméraires et circulaires

distinctes de l'ADN

chromosomique

• Non essentielle à la survie de

cellule

• Capables de réplication

autonome

• Peuvent contenir des gènes qui

permettent à une bactérie

d’être résistante à une

antibiotique

• Peuvent être modifiés par des

Les plasmides bactériens

• Molécules d'ADN surnuméraires et

circulaires distinctes de l'ADN

chromosomique

• Non essentiels à la survie de cellule

• Capables de réplication autonome

• Peuvent contenir des gènes qui

permettent à une bactérie d’être

résistante à une antibiotique

• Peuvent être modifiés par des

techniques de recombinaison

génétique in vitro

• Peuvent être réintroduits dans des

bactéries par transfection

Le clonage

d’un gène

dans un

plasmide

Les principales enzymes utilisées pour

modifier des plasmides

• Enzymes des restriction : protéines qui peut couper un

fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides

caractéristique appelée « site de restriction ». Chaque

enzyme de restriction reconnaît ainsi un site spécifique. Il en

existe plusieurs centaines qui reconnaissent chacune une

séquence différente.

• ADN ligase : protéine qui répare les brins cassés d'ADN et qui

peut former des liaisons phospho-diester covalentes, et donc

lier ou connecter des brins d'ADN entre eux.

Exemples d’enzyme de restriction

Exemple de ligation

Les cultures de cellules eucaryotes

• Boites de Petri, fioles de culture, pipettes

• Milieu de culture (isotonique, pH neutre)

– Acides aminés, glucose, vitamines, ions (chlorure

de calcium, chlorure de magnesium,...)

• Hotte à flux laminaire

• Centrifugeuse

• Microscope

• Incubateur (37°C, CO2)

Fibroblastes de souris en culture Cellules issues d’une tumeur cérébrale

Lymphocytes de souris Neurones en culture

Le dénombrement direct des cellules permet de déterminer un nombre absolu de cellules dans un volume déterminé. Ce type de numération est bien adapté aux cellules eucaryotes.

Les méthodes d’analyse et de modification

génétique des cellules eucaryotes (1)

• Identification et quantification d’ARN messagers

– Hybridation moléculaire avec une sonde spécifique (Northern)

– Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) avec des amorces

spécifiques

– Analyse globale du transcriptome par hybridation sur des puces

à ADN

• Identification et quantification des protéines exprimées

– Immunofluorescence

– Electrophorèse à travers un gel de polyacrylamide et détection

de la protéine d’intérêt avec un anticorps spécifique

– Analyse globale du protéome

Réaction de polymérisation en chaîne

Hybridation moléculaire

Les méthodes d’analyse et de modification

génétique des cellules eucaryotes (2)

• Transfert de gènes

– Transfection au phosphate

de calcium

– Electroporation

– Lipofection

– Infection avec un virus

recombinant

• Invalidation d’un gène par

transfert d’ARN interférents

Production de souris transgéniques

par micro-injection dans un oocyte

Production de souris transgéniques

par micro-injection dans un oocyte

Production de souris transgéniques par

injection de cellules ES modifiées génétique

dans un blastocyste

Les mécanismes qui permettent aux

cellules de communiquer entre elles

Master IADE – Année 2013-2014

Deux grands modes de communication

• Contacts directs entre cellules adjacentes

– Via des jonctions communicantes « gap » entre cytoplasmes de

cellules adjacentes

– Via des molécules d’adhérence présentes à la surface cellulaire

• Communication à distance via la sécrétion et la capture de

molécules solubles

– Radicaux libres et gazeux: CO, NO

– Molécules hydrophobes: hormones stéroïdes, hormones

thyroïdiennes, rétinoïdes, vitamine D

– Molécules hydrosolubles: acides aminés et leurs dérivés (glutamate,

GABA), peptides et protéines (cytokines, facteurs de croissance,…)

Les jonctions communicantes (gap)

• Mise en relation des cytoplasmes de deux cellules

adjacentes et échanges de métabolites et d’ions

entre cellules adjacentes

• Permettent

– le maintien de l'homéostasie tissulaire

– le maintien des concentrations et du pH intracellulaire,

– le comportement synchronisé des cellules

– l'amplification de la réponse hormonale (couplage

métabolique)

– la transmission de signaux (couplage électrique)

Les molécules d’adhérence

Rôle des molécules d’adhérence

• Adhésion avec les cellules adjacentes ou la matrice

extracellulaire (ECM)

• Impliquées dans des interactions homophiliques ou

hétérophiliques

• Réparties en 4 classes

– Membres de la superfamille des immunoglobulines

– Intégrines

– Cadhérines

– Sélectines

Sécrétion et capture de molécules

hydrosolubles

• Radicaux libres et gazeux

– CO

– NO

• Molécules hydrophobes

– Hormones stéroïdes ou thyroïdiennes

– Rétinoïdes

– Vitamine D

• Molécules hydrosolubles

– Acides aminés et leurs dérivés : glutamate, GABA, …

– Peptides: ocytocine, vasopressine, hypocrétine,…

– Protéines : lipoprotéines, glycoprotéines,…

Sécrétion

autocrine,

paracrine

et

endocrine

Monoxide d’azote (NO)• Caractéristiques

– Radical libre gazeux instable (5 à 10 secondes) : NO > NO2 > NO3-

– Diffusion libre à travers les membranes cellulaires

– Synthèse et libération simultanée

• Fonctions physiologiques affectées

– Pression artérielle

– Mémorisation

– Sommeil

– Angiogenèse

– Inflammation

– Métabolisme du fer

• Mode d’action moléculaire

– Activation de l’enzyme guanidylate cyclase

– Interactions avec plusieurs molécules : 02, hémoglobine

– Inhibition de l’activité de plusieurs enzymes

Molécules hydrophobes (1)Exemples

• Hormones stéroïdes : lipides dérivant de lipides à 30 atomes de carbones

– Oestrogènes

– Androgènes

– Gluco-corticoïdes et minéralo-corticoïdes

– Progestérone

• Hormones thyroïdiennes : produites par la thyroïde

– Thyroxine

– Tri-iodothyronine

• Rétinoïdes : dérivés de la vitamine A, utilisés en médecine notamment pour leur

activité de régulation de la croissance et de la différenciation des cellules

épithéliales

• Vitamine D: synthétisée dans l'organisme à partir d'un dérivé du cholestérol sous

l'action des rayonnements UVB1 de la lumière. Intervient dans l'absorption du

calcium et du phosphore par l’intestin, et dans leur réabsorption par les reins

Molécules hydrophobes (2)caractéristiques et mode d’action

• Caractéristiques moléculaires

– Hydrophobes …. et donc capables de diffuser à travers les

membranes cellulaires

– Durée de vie longue : plusieurs heures / jours

– Jouent un rôle dans le développement, le métabolisme et

l’homéostasie

– Agissent via la fixation à des récepteurs nucléaires qui ont

la capacité de se lier à l’ADN de contrôler la transcription

des gènes

Structure des récepteurs

nucléaires

Les domaines des récepteurs nucléaires

• Région A/B: région amino-terminale très variable

selon le récepteur

• Région C: très conservée, contient deux domaines dit

« doigts Zinc » qui permettent la fixation à des

séquences d’ADN appelées HRE « Hormone

Responsive Element »

• Région D: charnière

• Région E: domaine de fixation du ligand

• Région F: région carboxy-terminale très variable

selon le récepteur

Mécanismes d’action

• Deux mécanismes d’action selon la

localisation subcellulaire du récepteur en

absence de ligand

– Type I: Localisation cytoplasmique

• Récepteurs des androgènes, récepteur

des oestrogènes, récepteur des

glucocorticoïdes, récepteur de la progestérone

– Type II: Localisation nucléaire

• Récepteur de l’acide rétinoïque, récepteur des

enzymes thyroïdiennes

Récepteurs nucléaires de type 1

HSP :protéine de choc thermique HRE: élément de réponse aux hormonesNR: récepteur nucléaire

Récepteurs nucléaires de type 1

• L’hormone traverse la membrane plasmique

• L’hormone se lie au récepteur qui est localisé dans le cytoplasme

• Le récepteur change de conformation et se dissocie des protéines de choc

thermique auxquelles il était associé

• Le récepteur s’associe à lui même (dimérisation) et migre dans le noyau

via des pores nucléaires

• Le récepteur se fixe à l’ADN de la cellule sur des séquences appelées

« HRE » qui sont localisées en amont de certains gènes

• Le récepteur recrute d’autres protéines (coactivateur, ARN polymérase)

qui vont permettre la transcription des gènes cibles

Récepteurs nucléaires de type 2

LBD : domaine de fixation du ligandHRE: élément de réponse aux hormonesTR: récepteur de l’hormone thyroïdienne

Récepteurs nucléaires de type 2

• L’hormone traverse la membrane plasmique

• L’hormone se lie au récepteur qui est localisé dans le noyau

• Le récepteur change de conformation et se dissocie des

protéines co-répresseur auxquelles il était associé

• Le récepteur s’associe à la protéine RXR et cet hétérodimère

se fixe à l’ADN de la cellule sur des séquences appelées

« HRE » qui sont localisées en amont de certains gènes

• Le récepteur recrute d’autres protéines (coactivateur, ARN

polymérase) qui vont permettre la transcription des gènes

cibles

Agonistes et antagonistes des récepteurs

nucléaires

• Agonistes : Molécules qui miment l’effet d’hormones endogènes et

activent la transcription de gènes cellulaires via la fixation à des

récepteurs nucléaires

– La dexaméthasone est un agoniste du récepteur des glucocorticoïdes

• Antagonistes : Molécules qui bloquent l’action des hormones endogènes

en se fixant au récepteur nucléaire sur le même site (fixation

compétitive). La fixation d’un antagoniste à un récepteur nucléaire induit

une modification conformationnelle durécepteur qui empêche la fixation

des co-activateurs et facilite la fixation des co-répresseurs

– La mifépristone est un antagoniste du récepteur des glucocorticoïdes et de

celui de la progestérone

• Représentation

schématique

du mode

d’action des

agonistes et

antagonistes

du récepteur

des

oestrogènes

Sécrétion et capture de molécules

hyodrosolubles• Les différents types de ligands

– Acides aminés et leurs dérivés : glutamate, GABA

– Peptides: ocytocine, vasopressine, hypocrétine…

– Protéines : lipoprotéines, glycoprotéines,…

• Les différents types de récepteurs

– Récepteurs couplés aux protéines G

• Récepteurs de l’adrénaline, de l’hormone lutéinisante (LH), du peptide vasoactif

intestinal (VIP),….

– Récepteurs enzyme

• Récepteurs du facteur de croissance épithélial (FGF), de l’insuline, de l’IGF-1, du

TGF-beta,...

– Récepteurs couplés à un enzyme

• Récepteurs des cytokines, des interleukines, de l’hormone de croissance (GH)

– Récepteurs canaux

• Récepteurs du GABA, de l’acétylcholine, de l’inositol tri-phosphate (IP3)

Récepteurs couplés aux protéines G

Récepteurs “enzyme”

Mécanismes moléculaires

• Le segment cytoplasmique contient un domaine à activité

« kinase » qui appartient soit à la classe des sérine/thréonine

kinases soit à la classe des tyrosine kinases

• Les récepteurs forment des dimères après fixation du ligand

(à l'exception du récepteur de l'insuline qui est déjà sous

forme de dimère) et subissent une trans-sphosphorylation qui

rend leur domaine catalytique « compétent »

• Cette activation est à l'origine de nombreuses autres

phosphorylations du segment intracellulaire du récepteur, ce

qui entraîne la liaison de plusieurs molécules effectrices et

forme ainsi le complexe récepteur de signalisation (”receptor

signalling complex”)

Récepteurs couplés à un enzyme

Récepteurs canaux