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Polytech UEF1

Outils moléculaires

pour l’analyse des génomes

BONCOMPAGNI ÉricMCU - Univ. Nice Sophia Antipolis

Site WEB : sites.unice.fr/EB

Pourquoi la génétique moléculaire?

• La génétique formelle renseigne sur:

Le nombre de loci et d’allèles relatifs à un caractère

héréditaire

Sur le caractère dominant/récessif d’une mutation

• Information manquante: SEQUENCE

Pour quoi code le gène? (nature du gène, fonction)

Nature des mutations?

Quel est son environnement génétique (autres gènes

similaires?)

Quel est son profil d’expression ?

Connaissance de la fonctionApplications : génie génétique

Rappels structure et expression des gènes Eucaryotes

• Les RNA polymérases:

-RNA Pol I : transcrit les gènes codant pour les ARN ribosomiaux 28, 18 et 5,8S

-RNA Pol II : transcrit les gènes codant pour des protéines en ARNm

-RNA Pol III : transcrit les gènes codant pour les ARNr 5S et les ARNt

• Structure d’un gène eucaryote (Pol II)

promoter

Promoteur: séquences nécessaires à la régulation de la transcription du gène

Upstream enhancers: régions régulatrices activatrices de transcription

5’ et 3’UTR: régions transcrites mais non traduites (stabilité ARNm & régulation traduction)

Introns: zones (dans régions codantes ou UTR) excisées après la transcription


• Expression d’un gène Eucaryote (Pol II)


promoter

épissage

traduction

maturation

ww

w-c

las

s.u

nl.e

du

/bio

ch

em

/gp

2/m

_b

iolo

gy

/an

ima

tion

/ge

ne

/ge

ne

_a2

.htm

l

Protéine fonctionnelle

Protéine native

Rappels structure de l’ADN

• Polymère orienté (5’ vers 3’ ) de 4 nucléotides

(phosphates-désoxyribose-bases, A, T, G, C)

• S’associe en double hélice via la complémentarité des bases

Adénine-Thymine (2 liaisons H) , Guanine-Cytosine (3 liaisons H)

• Présence de liaisons hydrogènes

possibilité de séparer les deux brins sous l’effet de la chaleur

= DENATURATION

Tm: t° à laquelle les deux brins se séparent (composition en bases)

Phénomène REVERSIBLE http://www.johnkyrk.com/DNAanatomy.html

Rappels structure de l’ADN

DENATURATION / RENATURATION

•Des molécules d’ADN dénaturées peuvent se réapparier

- Si la température est permissive

- Si le principe de complémentarité des bases est respecté

- toujours brins orientés en sens inverse

• Des brins ayant une complémentarité des bases imparfaite peuvent

s’apparier au delà d’une certaine homologie (> 80%)

•Propriété utilisée pour détecter des séquences complémentaires à

une séquences d’intérêt (PCR/ Southern blot / northern blot)

La PCR : but et principe

But:

Amplifier une séquence d’ADN cible pour:

1- La visualiser sur gel d’agarose

2- Détenir une quantité importante d’une séquence d’intérêt

3- Utiliser la séquence pour des clonages

Principe:

Utiliser une ADN polymérase qui grâce à l’utilisation d’amorces spécifiques et à une

succession de cycles de polymérisation va amplifier un fragment d’ADN recherché

http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/images/PCR1.swfhttp://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

Voir animation:

Détecter un gène: sa présence dans un génome

http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/images/PCR1.swf

http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm

La PCR : éléments de départ

- La séquence des extrémités est connue

Mélange réactionnel:

-ADN matrice

-Amorces complémentaires des deux

brins (5’ vers3 ’)

-dNTP: désoxyribonucléotides, unités

élémentaires de l’ADN

-Taq DNA polymérase (polymérase

résistant aux hautes températures)

-Tampon réactionnel


La PCR : Le premier cycle


La PCR : Le deuxième cycle


La PCR : Le troisième cycleDétecter un gène: sa présence dans un génome

La PCR : 25 à 40 cycles consécutifs

Séquence recherchée Séquence recherchée

Amplification de la séquence cible d’un facteur 2n (avec n= nombre de cycles).

Exemple : Après 30 cycles, la séquence cible est 230, soit 109 x plus

représentée

Cycle n Cycle n + 1


Le Southern Blot: but et principe


But:

Détecter la présence d’une séquence d’intérêt dans l’ADN génomique extrait d’un

organisme

Afin de :

- Rechercher la présence d’une séquence (d’un gène) dans un génome

- Visualiser des différences entre individus/espèces

Principe:

Utiliser des nucléotides marqués pour rendre le fragment d’intérêt repérable

Utiliser les propriétés de dénaturation et de renaturation de l’ADN

Séparer les fragments d’ADN issus de l’organisme étudié sur gel d’agarose afin de les

visualiser

Edward M. Southern en 1975

http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbioch/POLY.Chp.9.9.html

Le Southern Blot: prérequis

•ADN génomique Eucaryote est sous forme de chromosomes = fragments de très

grande taille

•Afin d’individualiser des régions du génome pour les distinguer, il faut fragmenter l’ADN

•Puis, séparer les fragments les uns des autres pour les repérer

Utilisation des ENZYMES DE RESTRICTION (UH1)


Le Southern Blot: digestion enzymatique de l’ADN


Diapo Issue du cours de S. Chauvet



5’sortant 3’sortant




Electrophorèse d’ADN après digestion

ADN génomique

LeSBlot: Marquage du fragment d’intérêt = SONDE

Deux types de marquages :

- radioactif (dCTP*), détection par autoradiographie- non radioactif (digoxygénine), détection par anticorps couplés à une enzyme


Le Southern Blot: Étapes

1- Extraction d’ADN génomique

2- Digestion enzymatique de l’ADN

3- Séparation des fragments sur gel d’agarose

4- Transfert sur membrane de nylon

5- Marquage du fragment d’ADN étudié (sonde)

6- Hybridation de la sonde sur la membrane

7- Détection du fragment marqué


Animation: http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/shockwave/southan.html

Le Southern Blot: Interprétations


• L’enzyme de restriction utilisée ne coupe pas dans la zone de la sonde

1 bande si le gène est en une seule copie

2 bandes si le gène est en deux copies,…. Etc….

A AA

A A

A A

A A

ADN g

Sonde

Frgt étudié1 copie

2 copies séparées

2 copies en tandem

1 2 3

1

2

3

•L’enzyme de restriction utilisée coupe dans la zone de la sonde

2 bandes si le gène est en une seule copie

4 bandes si le gène est en deux copies à des loci différents

mais 3 bandes si les gène est en deux copies au même locus !!!!

Le Southern Blot: Interprétations


A A

1 copie

2 copies séparées

2 copies en tandem

A

A AA

A AA

AA A A

1 2 3

1

2

3


Comparaison PCR / Southern blot

Les deux permettent de détecter la présence d’une fragment d’ADN dans un génome

MAIS

- La PCR ne donne pas le nombre de copies du fragment (gène)

- La PCR ne donne pas d’information sur l’organisation dans le génome

PAR CONTRE

- La PCR est plus rapide (quelques heures contre 48H pour un Southern blot)

- La PCR peut être effectuée en haut débit

Détecter un gène: son expression spatio-temporelle

northern blot: But et Principe

But:

Détecter la présence d’un ARN messager d’intérêt dans l’ARN total issu d’un tissus

Afin de :

- déterminer le profil d’expression d’un gène

- visualiser des différences entre individus/espèces

Principe:

Utiliser des nucléotides marqués pour rendre le fragment d’intérêt repérable

Utiliser les propriétés de dénaturation et de renaturation de l’ADN/ARN

Et la capacité de l’ADN de s’hybrider avec l’ARN pour former un duplex stable

Séparer les ARNm issus de l’organisme étudié sur gel d’agarose afin de les visualiser


northern blot: Les étapes

Photo gel agarose

coloré au BET

Autoradiographie

1- Extraction de l’ARN total

2- Séparation des ARNm sur gel d’agarose

4- Transfert sur membrane de nylon

5- Marquage du fragment d’ADN étudié (sonde)

6- Hybridation de la sonde sur la membrane

7- Détection du fragment marqué

1 2 3 4

1 2 3 4

Contamination ADNg

ARNr 28s

ARNr 18s

ARNr 5,8s

Contamination ADNg

Signal


RT-PCR: But et Principe

But:

Détecter la présence d’un ARN messager d’intérêt dans l’ARN total issu d’un tissus

Afin de :

- déterminer le profil d’expression d’un gène

- visualiser des différences entre individus/espèces

Principe:

Utiliser une ADN polymérase ARN dépendante (réverse transcriptase) pour synthétiser le

brin complémentaire des ARNm

Puis amplifier le fragment obtenu par PCR

Si un gène est exprimé dans le tissus testé : bande visible après migration

Si le gène n’est pas exprimé: pas de bande


RT-PCR: Les étapes

1- Reverse transcription

à partir d’ARN totaux extraits du tissus analysé

à l’aide d’oligo dT

Synthétise le brin ADN complémentaire

2- Amplification spécifique du gène étudié

À l’aide d’amorces spécifique

Par PCR

3- Migration sur gel d’agarose pour visualisation

PCR

Migration sur gel d’agarose


RT-PCR quantitative

1- Reverse transcription

à partir d’ARN totaux extraits du tissus analysé

à l’aide d’oligo dT

Synthétise le brin ADN complémentaire

2- Amplification spécifique du gène étudié

À l’aide d’amorces spécifique

Par PCR

Utilisation d’un agent intercalant (SYBR Green I)

fluorescent

3- Quantification par mesure de la fluorescence


RT-PCR quantitative

Il faut environ 1010 copies d’un fragment de PCR (de taille classique entre 100 et 1000 b) pour atteindre le seuil de détection :En partant de :- 1 000 000 copies initiales, le seuil de 1010 est atteint au bout de 14 cycles- 1 000 copies initiales, le même seuil de 1010 est atteint au bout de 25 cycles- 1 copie initiale, le même seuil de 1010 est atteint au bout de 33 cycles

Quantification dans chaque échantillon évaluée par rapport au Ct (cycle threshold)Plus il y a de copies du fragment cible au début et moins il faudra de cycles pour atteindre le Ct


RT-PCR quantitative

Quantification absolue: on compare le Ct obtenu avec une

Courbe standard issue d’amplification d’échantillons

contenant une quantité connue de cible.

Quantification relative: On compare le niveau d’expression

à celui d’un ou plusieurs gènes de référence considérés

comme exprimés de façon stable dans les différentes

conditions biologiques.Le résultat est exprimé comme un ratio.


RT-PCR quantitative

Ratio d’expression dans une condition: 2 (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt)

= simple CT

http://www.americanbiotechnologist.com/blog/real-time-quantitative-pcr-data-analysis-tutorial/

http://www.americanbiotechnologist.com/blog/real-time-quantitative-pcr-data-analysis-tutorial/


RT-PCR quantitative

Ratio d’expression comparé à une condition contrôle:

2 (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition étudiée2 (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition contrôle= Ct (double delta Ct)

2(15.9-12)

R= = 5.32(16.5-15)

Ratio Tumor/control :


RT-PCR quantitative

NB: cette formule est applicable dans le cas ou l’efficacité d’amplification des deux couples d’amorces est proche de ou est égale à 100%.

Sinon on doit tenir compte des différences d’efficacité d’amplificationet utiliser:

X (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition étudiéeX (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition contrôle

OU X est calculée grâce à la pente de la courbe de Ct obtenue pour des dilution croissantes de matrice pour chaque couple d’amorce.

X= 1+E= 10(-1/pente de la courbe)

Le clonage d’une séquence

But : Disposer à volonté et en quantité d’une séquence d’ADN d’intérêt

En la multipliant dans un système bactérien (Escherichia coli)

Cloner des séquences d’intérêt

Exemple de vecteur de clonage

Nécessite un vecteur de clonage qui comporte:

1- Une origine de réplication

2- Un gène de sélection

4- Un site multiple de clonage

MCS du pBluescript SK-


1- Digérer l’ADN à cloner par une enzyme de

restriction adéquate

2- Digérer le vecteur par la même enzyme

4- Mettre en présence le vecteur et fragment

à cloner: appariement par

complémentarité des bases

5- Ajouter une DNA ligase (referme la

molécule d’ADN)

6- Transformer une souche d’E. coli

7- Sélectionner les bactéries transformées

et les isoler

Fragment d’ADN obtenufacilement par extraction d’ADNplasmidique à partir des bactériestransformée

Le clonage d’une séquence: Les étapes

Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY

Issue des connaissances acquises sur le processus d’intégration du phage

Lambda dans le chromosome d’E. coli


Permet de s’affranchit :

1- des enzymes de restriction

2- des faibles efficacités de clonage

3- élimine les problèmes de site internes d’enzymes

4- contre sélection des clones vides : ccdB

5- multiples vecteurs de destination

Inconvénients :

1- Les sites Att de recombinaison s’intercalent entre les fragments

clones: acides aminés supplémentaires en cas de fusions

traductionnelles

2- Technologie brevetée: chère



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