Physiopathologie des syndromes

myélodysplasiques

M. Fontenay, DES, Octobre 2011

Une classification difficile

MDSAAMPN/MDS

CMML

RARS-TFormes frontièresHLA-DR2

Anomalies caryotype Tris 8, Chr 7, 13

Clone HPN

Bases moléculaires et cellulaires

• Anomalie intrinsèque ?

– Facteurs de transcription– Voies de signalisation– Réparation de l’ADN– Régulation du cycle cellulaire

• Altération de la réponse immune et/ou du microenvir onnement ?

→ Etudier l’hématopoïèse

Hématopoïèse MDS

Progéniteur multipotentProgéniteurlymphoïde

CFU-GEMM

Plaquettes EosinophilesNeutrophiles

Monocytes

BFU-E

Hématies

CFU-E

SCFEpo

GM-SCF

IL-3

Megakaryocyte

BasophilesB T

Sang

Moelle

Lymphocytes

Tpo

MEP

CFU-Mk CFU-GM

Dysplasie myéloïde & apoptose

CD34+38-Lin -

LT-HSC

ST-HSC

ProgéniteurLymphoïdeCFU-GEMM

Plaquettes Eosinophiles

Neutrophiles

Monocytes

BFU-E

Hématies

CFU-E

SCFEpo

GM-SCF

IL-3

Megakaryocyte

BasophilesB T

Sang

Moelle

Lymphocytes

Tpo

LTC-IC:Quantité et taillediminuéesNOD-SCID ou NOD-SCID ββββ2-/-

CD34+ CD38- (del5q, tris 8)±±±± IL3/GM-CSF

Nilsson et al, Blood, 2000, 2002Thanopoulou, Eaves et al, Blood 2004Pas de prise de greffe ou expansion préférentielle des granuleux

Progéniteurmultipotent

Cellule souche

LT-HSC

ST-HSC

5q-

5q-

5q-

5q-

5q-

• « Phénotype » MDS– Apoptose

– Dysplasie érythroïde (80%)

Apoptose des précurseurs différenciés

TUNEL

Raza, 1995 50

Hellström, 1997 51

Bouscary, 1997 54

n75 12

56 16

34 12

MDS Control

% cellules TUNEL (+)

BOM

Frottis

MDS Control

Les récepteurs à domaine de mort

Fas

TRAILR1

TRAILR2

TNFR1TRAMP

DR3

DR6

EDAR

Apoptose Fas-dépendante

Bcl-2

Bax/Bakn

Bid

Fas

FADDFADDProCaspProCasp--88

Caspase-8

Apoptose

Cytochrome c Caspase-3Apaf-1Caspase-9

Type II

Type I

+ Fas agonist Ab CH11

0

10

20

30

40

%an

nexi

nV

+/7

-AA

D-ce

lls *

*

VectorWT-Bcl-2

ER-Bcl-2

Gyan et al, 2008

Anémies sidéroblastiques

Tehranchi R et al, 2003

Accumulation de fer pardownregulation du transporteur ABCB7

Trisomie 8

Sloand E M et al. Blood 2002;100:4427-4432

→ Growth advantage and resistance to apoptosis

• >60% des « early MDS » : surexpression de Fas

• Variantes :

– Anémie sidéroblastique : apoptose précoce aggravée en fin de maturation par atteinte mitochondriale

– Trisomie 8 : progéniteurs sensibles à l’apoptose Fas-dépendante résistent par induction de protéines anti-apoptotiques (sélection clonale au cours de l’évolution d’une AA ?)

Take home messages (1)

- Cytologique- MoléculaireDysérythropoïèse

Control MDS

Glycophorin A

Band.3 like1Carbonic anhydrase

Acylphosphatase ery.

Downregulated:

d<5 d7 d10 d140

20

40

60

80

100 Controls

MDS

*

*

% G

PA

-pos

itive

cel

ls

Cultured erythroblasts derived from CD34+ cells

GATA-1

Casp-3

Casp-3

Nucleus

Cytoplasm

Differentiation

Hypothesis

Functional inactivation of GATA-1 in MDS ?

GATA-1

Casp-3

Casp-3

Nucleus

Cytoplasm

Defective differentiation

Casp-3

Casp-3

Casp-3Casp-3

Normal MDS

Hsp70

No nuclear colocalization of Hsp70 and GATA-1

MDS#8Control#2

Hsp70

GATA-1

Merge

MGG

DAPI

Nuclear targeted Hsp70 rescues GATA-1 expression, and erythroid differentiation

mut

Hsp

70

-S4

00

A

Hsp

70

-S4

00

A

Ve

cto

r

Hsp

70

-WT

Ve

cto

r

Hsp

70

-WT

0

20

40

60

80

**

Controls MDSd

iffe

ren

tia

ted

cell

s(%

)

Take home message (2) : la signalisation apoptotique contribue à la dysplasie érythroïde

Cytochrome c

Caspase-3

Apaf-1Caspase-9

GATA-1

FasFasL

Hsp70

X GPA

Délétions 5q

Van den Berghe et al, Nature. 1974; 251:437List A, al. N Engl J Med 2006; 355: 1456-65.Boultwood J, et al. Blood 2002; 99 :4638-41.Fairman J,. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1995;92:7406-10Zhao N, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1997;94:6948-53

Pellagatti et al. Proc Natl AcadSci USA 2007; 104:11406-11.

Ebert et al, Nature, 2008

IL9TGFB1MADH5TRPC7SPOCKHRNPA0TTIDWNTBD CDC23GFRA3CDC25CFAM53CEGR1ETF1HSPA9B CTNNA1MATR3UBE2D2

CSF1R PDGFRBTCOF1CD74RPS14NDST1

TNIP1SPARCATOX1GLRA1

5q5q

q11.2q11.2

q23q23

q13q13

q14q14q15q15q21q21q22q22

q12q12

q31q31

q32q32q33.1q33.1

q34q34q35q35

Liu XT et al, Nature Med, 2007

Joslin JM et al, Blood;110:719, 2007

AML/MDS del(5q)Haploinsuffisance ou

Inactivation bi-allélique (TSG)

5q- syndrome(q32-q33.1)

40 genes entre D5S413et GLRA1

Haploinsuffisance

3.7 Mb

1.5 Mb

ShRNA RPS14 reproduit la dysérythropoïèse

Ebert BL, et al, Nature 2008 ;451 :335-40.

Meg

/ery

ratio

ShRNA screening of the CDR 5q-

5q- Non 5q-

Surexpression de RPS14 restore la différenciationérythroïde des CD34+ 5q-

Biogénèse des ribosomes et érythropoïèse

• RPS14 composant de la sous-unité ribosomale 40S • 5q- : Inhibition de la biogénèse (augmentation du ratio 30S/18S)• Blackfan-Diamond : mutations hétérozygotes de RPS19 (25%)

• Liu JM, Ellis SR. Blood 2006; 107: 4583-88

p53 stabilization and cell cycle arrest

D’après G Thomas Nat Cell Biol, 2010

G0/G1G0/G1

Dutt et al, Blood 2011

Activation of the p53 pathway in 5q- MDS

• Upregulation of 10 genes of the p53 pathway in CD34+ FAS, CD82, WIG1, CASP3, SESN3, TNFRSF10B, MDM4, BAX, DDB2, BID

Pellagatti A, et al. Blood. 2010;115(13):2721-2723Boultwood J, et al. Br J Haematol. 2007;139(4):578-589.Pellagatti A, et al.. Br J Haematol. 2008;142(1):57-64.

Murine model of 5q- syndrome

• Deletion of Cd74-Nid67 regionsyntenic to human CDR chr5q including RPS14

• Erythroid and megakaryocyticphenotype

• Increased apoptosis and expression of p53

• Rescue by backcrossing in p53 -/- mice

Barlow JL, Drynan LF, Hewett DR, et al. A p53-dependent mechanism underlies macrocyticanemia in a mouse model of human 5q- syndrome. Nat Med. 2010;16(1):59-66.

1. Starczynowski DT, Kuchenbauer F, Argiropoulos B, et al. Identification of miR- 145 and miR-146a as mediators of the 5q- syndrome phenotype. Nat Med. 2010;16(1):49-58.

2. Kumar et al, Blood 2011, august 28.

49.0

5q13

.1

5q23

.1

5q31

.1

miR

-886

miR

-874

miR

-584

miR

-143

miR

-145

miR

-146

a

miR

-103

-1

miR

-218

- 2

miR

-585

miR

-340

miR

-378

5q33

.15q

33.2

5q33

.3

5q34

60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180.5

miR-145 & miR146a

miRNA 145 targets TRAF6 and Fli-1.

KO miR-145 in mice: increase TRAF6 induces thrombocytosis & dysplastic MK.

Inhibition of miRNA145 or overexpression of Fli-1 increases the production of MK relative to erythroid cells

Trisomie 8

Chen et al, 2004

Diminution de l’activité NK

Team : E Sloand, NS Young

Restriction du répertoire T

Team : E Sloand, NS YoungSloand Blood Mar 3, 2011

Surexpression de WT1: significant CD4(+) and CD8(+) T-cell responses directedagainst WT1

WT1 is one of the antigens thattriggers T cell-mediatedmyelosuppression in MDS

Réponse à l’immunosuppression

Team : E Sloand, NS Young

– Del(5q) syndrome : ribosomopathie acquise avec hypoplasie érythroïde et thrombocytose

– Trisomie 8 : réponse immune inadéquate (WT1)

Take home messages (3)

→ Multiplicité des phénotypes

• « Génotype » MDS– Pas d’anomalie moléculaire unique pour

expliquer le phénotype dysplasique et apoptotique

Progéniteurmultipotent Progéniteur

lymphoïde

CFU-GEMM

Plaquettes Eosinophiles

Neutrophiles

Monocytes

BFU-E

Hématies

CFU-E

SCFEpo

GM-SCF

IL-3

Megakaryocyte

BasophilesB TSang

Moelle

Lymphocytes

Tpo

Nilsson et al, Blood, 2000 & 2002

CFU-GMCFU-Mk

MEP

CSH clonale

FISH5q-tris 8

HSCCD34+ CD38-

CD34+ CD38+

+8

+8

+8

+8

LT-HSC

ST-HSC 5q-

5q-

5q-

5q-

5q-

5q-

5q-

5q-

5q-

5q-

MDS et altérations géniques

Haploinsuffisance

DeletionCHCH33

Mutation Méthylation

CHCH33

CHCH33

Deletion Deletion

Perte d’hétérozygotie (LOH)

Syndrome 5q-

SNP arrays

Variations du nombre de copies, mais pas les UPD

corrèlent avec pronostic défavorable

Mohamedali et al, Blood 2007

UPD Délétion

Amplification

AML-M4MutationG -> T

R 1917 M

Ex11After BMT

↓↓

↓ ↓

WT

R I

M I

WT

wt/mut

wt/wt

mut/wt

sequences from bacterial clones

MDS42

TET2: potentiel gène suppresseur de tumeur

Mutations somatiquesAcquises

22% des MDS

Anomalies Bi-alléliques fréquentes

Fra

ctio

n of

clo

nes

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

CD34+

CD38-CD34+

CD38+

8

24

18

12

mutated TET2wild-type TET2

MDS09

Mutation présente dans les

progéniteurs immatures – Avantage de croissance

Delhommeau et al, NEJM, 2009

By courtesy Dr. K. GronbaekScience 2009, Nature 2010Cell April 2011

TET epigenetic functions

TET1/2

CH

CH

CH

CN CCCC

CC

CC

CN

CH

CO

CHCH

CH

CN

CC

CH

CH

CH

CN CCCC

CC

CC

CN

CH

CO

CHCH

CH

CN

CC

CH

CH

CN CCCC

CC

CC

CN

CH

CO

CHCH

CH

CN

CC

CH

CH

CN CCCC

CC

CC

CN

CH

CO

CHCH

CH

CN

CC

OH

CN CC

CC

CC

CN

CH

CO

CHCHCN

CC

CN CC

CC

CC

CN

CH

CO

CHCH

CHCH

CN

CC

CHCH

TET1: hmC→ DNA demethylationmTET: no hmC→ DNA hyper or hypomethylation ?

?

Cytosine (C) 5hmC5mCDNMT

TET1/2/3 are methylcytosine hydroxylases depending on 2-oxoglutarate and Fe2+

Catalytic domainConserved regions

1 2002

Ac AcAc

Ac

Ac AcAc

Ac Ac

MBD

MBD

MBD

MBD

HDACHDAC

HMTHMT

HMT

AcH3

H3K4me2

Methylated DNA

H3K9me2

H3K27me3

mememe

meme meme

me

mememe

mememe

mememe

meme me

me

meme

meme

meme

HAT

AcAc

Ac Ac

DNMTs

Regulation of chromatin state

Unmethylated DNA

EZH2 (enhancer of zeste homolog2, H3K27 methylase),ASXL1 (Additional sex combs-like 1, repressor of the Polycomb repressor group), UTX (H3K27 demethylase)

ASXL1UTX↑H3K27me3

TET2DNMT3A↓ 5mC

EZH2↓H3K27me3

Mutations

Bilan des mutations

TET2 are the most frequent,and co-occur with every other type of mutations

TP53 mutations associate with complex karyotype

TK mutations are highly exclusive

Bejar, Ebert, NEJM in press

439

Mutations and survival

Figueroa M, Blood 2009

HELP (14,000 promoteurs) : MDS vs normal CD34+

- méthylésdans les MDS

+ méthylésdans les MDS

HELP (HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR) assayHELP (HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR) assay

Méthylation p15INK4b, FZD9 est corrélée à- la blastose médullaire - un mauvais pronostic

Methylation of the p15INK4b gene in MDS is frequent acquired during disease progressionQuesnel et al. Blood, 1998; 91 : 2985-2990

Jiang et al, Blood 2008

Hyperméthylation de l’ADN

Modified from Feinberg Nat Rev Gen, 2006 and Gronbaek, 2009

TET2*TET2* metC ↓↓↓↓

Expansion of epigeneticallyaltered MDS stem cell or progenitor

Stem cell

Progenitor

metH3 ↑↑↑↑

Apoptosis↑Dysplasia

Apoptosis↓mC ↑↑↑ (p15)

TP53

Low risk MDS

High risk MDS

AML

Take home message (4)

Yoshida et al, Nature 11 sept 2011

Modified from Feinberg Nat Rev Gen, 2006 and Gronbaek, 2009

TET2*TET2* metC ↓↓↓↓

Expansion of MDS stem cellor progenitorwith altered

transcription and/or

translation

Stem cell

Progenitor

metH3 ↑↑↑↑

Apoptosis↑Dysplasia

Apoptosis↓mC ↑↑↑ (p15)

TP53

Low risk MDS

High risk MDS

AML

Take home message (5)

Département d’Hématologie,Institut CochinINSERM U1016, CNRS UMR8401

Olivier KosmiderEmilie FrisanCécile Pierre-EugèneCélia FloquetCatherine LacombePatrick MayeuxFrançois Dreyfus

Service d’Hématologie BiologiqueMartine GuesnuValérie BardetFranck Viguié

Erythropoïèse CNRS UMR8147, NeckerJulie VandekerckoveGenevieve CourtoisJB ArletOlivier Hermine

INSERM CRI866, IFR100, DijonCarmen Garrido

TET2INSERM U985, IGR, VillejuifVéronique DellaValleSeverine Trannoy Olivier Bernard

INSERM U1009, IGR, VillejuifFrançois DelhommeauWilliam Vainchenker,Eric Solary