Physicochimie de Macromolécules - lism.cnrs-mrs.fr · Evolution dirigée. But du programme ... –...

Physicochimie de Macromolécules

Evolution et physicochimie

James SturgisJean-Pierre Duneau

Sommaire

But du programme Organization des

enseignements L'examen Les resources

Rappels– L'évolution– La génétique– Les mutations

Evolution dirigée

But du programme

Donner une introduction– A la physicochimie des

protéines– A l'analyse de fonction– Aux relations structure-

fonction

Voir comment mettre en evidence les liens structure-fonction.

Renforcer votre anglais scientifique.

Organisation des Enseignements

Les Cours (JS) Essentiellement une

seule exemple (hémoglobine) dans les cours...

Les TD (JPD) Analyse des données

– Pratiquer la conversion des mesures experimentales en valeurs utiles.

– Comment lire un article scientifique.

Sommaire des cours

Chapitre 1 : Introduction et rappels. Chapitre 2 : Les hémoglobines. Chapitre 3 : Variations entre éspèces :

des oies et des poissons Chapitre 4 : Variations intra-éspèce :

hémoglobines humaines Chapitre 5 : Découverte de fonction :

l'hémoglobine d'ascaris. Chapitre 6 : Hémoglobines de signalisation

Organisation de l'examen

Deux parties... Exercise d'analyse

– Une serie de questions basées sur un extrait d'article.

Sujet plus rédactionelle– Souvent un choix– Souvent demandant une

synthèse.

Les deux parties sont important et peuvent porter sur...– le contenu des cours– le contenu des TD.

Resources

Les transparents – Site web du

département.

Les TD– Site web du

département.

Les articles pour approfondissement.

http://biologie.univmrs.fr/

Rappels sur l'évolution

Introduction

Rappels sur...– L'évolution– La génétique– Les mutations et la

variation.– La sélection et l'absence

de la sélection.– Quelques nouvautés!

Une exemple d'évolution dirigée.

Variants du papillon Biston betularia

Evolution

Variabilité individuelle Transmission de cette

variabilité aux enfants Sélection des individus

les plus adaptés à l'environnement

Darwin avait 31 ans quand il élaborait sa théorie.

Aujourd'hui nous pouvons examiner les bases moléculaires de ces trois points.

Variabilité – les mutations

Changements des séquences d'ADN – Codants et – Non-codants

Réorganisations d'ADN– Délétion– Transposition– Insertion Erreurs de reproduction,

mutations pontuelles.

Plus facile a comprendre au niveau de la protéine.





Changements des séquences d'ADN – Codants et – Non-codants

Réorganisations d'ADN– Délétion– Transposition– Insertion Transposons et virus,

systèmes de réparation





Les mutations ponctuelles peuvent etre prédites

Vitesse de mutation:– Jukes Cantor (1969)

– Kimura (K2P-1980)

– Plus complexe – notamment dépendant de contexte.

GA

C T

GA

C T


Si les probabilités de différentes mutations peuvent être prédites leurs conséquences physiologiques ne peuvent pas facilement ...

Transmission – la génétique

Les procaryotes sont simples...– Une copie d'un simple

chromosomeparfois deux parfois des plasmides

– Qui est répliqué – et une copie distribuée à

chaque cellule fille.Transmission d'une seule copie de l'ensemble du patrimoine génétique par l'unique cellule génitrice aux deux cellules filles.







Transmission – la génétique

Transmission d'une copie (ou plusieurs copies) du patrimoine génétique par chaqun de deux progenitors aux enfants.

La reproduction sexué chez les eukaryotes est plus complexe...– Plusieurs copies de

plusieurs chromosomes– Qui sont répliqués– Réorganisés (linkage)– La moitié des

chromosomes hérités de chaque parent.




Sélection

Une fois qu'une mutation est introduite le nouvel allèle peut être:– Perdu– Fixé (transmis dans la

population).

On parle de la penetration d'une allèle dans la population.




Sélection

Le sort d'une allèle dans la population dépend de– La pression de sélection – La dérive génétique

(chance)

Nota:– On considère ici des

allèles dans la population et pas

– les mutations dans une génome.

– Une changement d'échelle.

Même dans l'absence de sélection la pénétration d'un allèle dans la population varie de generation en generation.

Avec une petite population c'est parfois très rapide

F(0): p(bleu) = 0,5

Dérive génétique et sélection

La moitié de la population ont des enfants

F(0): p = 0,5

F(1): p = 0,7






La probabilité de l'allèle (p) change avec chaque génération. Il n'y a aucune tendance à retourner à la distribution initiale.

F(0): p = 0,5

F(1): p = 0,7

F(2): p = 0,9F(3): p = 0,8F(4): p = 0,9F(5): p = 1,0


La mutation (bleu) est fixé en absence de selection.


Dans une population la dérive génétique s'assure que même dans l'absence de toute sélection une nouvelle allele sera eventuellement fixée (p = 1) ouperdue (p = 0)

et l'allele initialeperdue (p=0) oufixée (p=1).

Dans une population stable en moyenne cela prend 4N generations

Probabilité environ 1/N

Une derive plus vite dans des petites populations.


La dérive génétique accumule avec le temps.– Elle cause une perte de

variabilité dans une population

– Elle augmente la variabilité entre deux populations

La vitesse de la dérive est plus grande pour des petites populations.

Les mutations accumule avec les temps– Elles augmentent la

variabilité entre populations et dans une population.


La selection :– modifie le temps pour la

fixation d'une mutation – modifie le probabilité de

fixation d'une mutation.

Une pression de sélection peut augmenter la vitesse d'une dérive génétique– en diminuant la population

– sans que l'allèle ait la moindre influence sur la survie!!

– a cause des liens génétiques

Nota: fixation en depit d'une sélection négative est possible, seulement moins probable que 1/N et moins rapide que ~4N génerations en moyenne


les mutations augmentent la variabilité génique

la sélection et la dérive génétique diminuent la variabilité génétique.

Tous les deux modifient les séquences des gènes et des protéines.

Quelle est l'importance rélative de la sélection et de la dérive génétique dans la détermination de la séquence d'une protéine?

Tous les différences ne sont pas dû a la sélection.

Le Paradigme (Biologie Moléculaire)

Séquence du Géne

Séquence de la Protéine

Structure de la Protéine

Fonction de la Protéine


variabilité aux enfants Séléction des individus


Le Paradigme (Evolution Moléculaire)

Séquence du Génome

ARN messagerSéquence, Quantité et Patron d'expression

ProtéineSéquence, Quantité et Patron d'expression

Structure

FonctionBiochimique Cellulaire Physiologique

Résistance à la séléction

Le Paradigme (Evolution Moléculaire)

Pour le comprendre il faut examiner des systèmes modeles un peu plus simples...

Les plus grandes difficultés sont d'établir les liens en structure – fonction et ecologie.

Séquence du Génome

ARN messagerSéquence, Quantité et Patron d'expression

ProtéineSéquence, Quantité et Patron d'expression

Structure

FonctionBiochimique Cellulaire Physiologique

Résistance à la séléction

Etude de l'evolution moléculaire

Comment éclaircir les liens entre séquence et niche écologique?

Manipuler d'une façon expérimentale la variabilité et la pression de sélection.

– Evolution dirigée...

– Mutagénèse dirigée...

Etudier la variation naturelle.

Facile a comprendre les resultats... difficile d'en avoir beaucoup.

Maintenant!

Facile d'avoir beaucoup de resultats... dificle de les comprendre!

Les autres cours!

Evolution dirigée

Comment éclaircir les liens entre séquence et niche écologique?

Manipuler d'une façon expérimentale la variabilité et la pression de sélection.

– Evolution dirigée...

– Mutagénèse dirigée...

Etudier la variation naturelle.

Evolution d'une fucosidase à partir d'une glucosidase.

Protocol de DNAshuffling et sélection un exemple d'évolution dirigée.

Zhang JH, Dawes G. and Stemmer W.P. 1997. Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 45044509.

DNA–shuffling

Fragmentation aléatoire

Réassemblage par PCR (mutagénique et recombinogénique)

Criblage (hydrolyse du nouveau substrate)

Plusieurs génomes

DNA–shuffling

Fragmentation aléatoire Réassemblage par

PCR:– mutagène et– recombinatoire

Criblage

Population de fragmentsavec mutations

DNA–shuffling



Criblage

Nouvelle sequence différente des originals

DNA–shuffling



Criblage

Nouvelle sequence différente des originals

De plus introduction de mutations

DNA–shuffling



Criblage

DNA–shuffling

Ce protocol est capable après 8 cycles de convertir une glucosidase en fucosidase (presque)...

Comment savoir?– k

cat = vitesse maximale de la réaction (plus c'est grande

mieux c'est).

– KM = affinité pour le substrat (plus c'est basse mieux

c'est).

– kcat

/KM = mesure d'efficacité (grande est mieux).

– specificité = rapport de kcat

/KM pour différentes substrats.

DNA–shuffling

Glucosidase FucosidasePNPG k

cat (s1) 268 31

KM

(mM) 0,04 0,18

kcat

/KM

6700 172

PNPF kcat

(s1) 209 97K

M (mM) 31 1,5

kcat

/KM

6,7 64,4

Specificity 1000 2,7

DNA–shuffling

Quelles sont les modifications de séquence...

t/cg/a g/a

t/c

c/t a/g a/g a/g a/g a/g

g/a

g/ac/t

D908

NN604

S

Q573

R

P511

SQ135

RV9IV/P

G/S

13 mutations ponctuelles – 6 changements dans la séquence protéique de la glucosidase – 5 changements silencieux

DNA–shuffling

Quelles sont les modifications de la structure...

Quatre changements sur la surface:V

9I, Q

135R P

511S D

908N

Un changement proche de la site active:Q

573R

et un changement dans la site de liaison de substrat: N

604S

DNA–shuffling

Quelles sont les modifications de séquence...

t/cg/a g/a

t/c

c/t a/g a/g a/g a/g a/g

g/a

g/ac/t

D908

NN604

S

Q573

R

P511

SQ135

RV9IV/P

G/S

Résidu dans la site actif

1 à 3 sur 13 (723%) mutations probablement important – résultat de sélection positive et les autres 11 d'une dérive génétique.

Modification du niveau d'expression?

Evolution dirigée

Il est possible à diriger l'évolution moléculaire et construire des nouvelles protéines.

Avec un contrôle précise sur– la variabilié et – la sélection.

Le plupart des modifications selectionés ne donnent pas une sélection positive.

Rôle important de – la petite population et – la forte taux de mutation.

Liens séquence – ecologie

Nous arrivons souvent, avec l'aide de la structure d'une protéine, – A comprendre les liens entre séquence et fonction

biochimique.Mutation N

604S et activité et affinité pour substrat

– Meme si nous pouvons pas toujours les prédire avec précision.

Nos connaissances ne suffisent pas normalement a voir les relations entre une séquence protéique et la niche écologique d'une espèce.

Evolution moléculaire

Un bon modèle: l'hémoglobine.

Evolution Moléculaire

Trouver un système modele simple:– Facile a étudier– Beaucoup

d'information– Possible à voir les

liens entre fonction et écologie.

L'Hémoglobine

Evolution Moléculaire

Rôle physiologique important (transport d'oxygène)

Patron d'expression simple (erythrocytes)

Structure et fonction biochimique bien établies.

La famile des hémoglobines

Nous allons parler de toute la famille des hémoglobines et pas uniquement l'hémoglobine du sang humain.

La structure de la famille La diversité de la famille L'hémoglobine sanguine

– Cooperativité et structure.

Hémoglobine – sa structure

Une protéine a une structure complexe difficile a comprendre.

Plusieurs niveau de structure

L'hémoglobine humaine est un tétramère avec deux chaînes de deux chaînes .

Monomère d'hémoglobine

A

BC

D

EFG

H


Chaque monomère a une structure très semblable

Comme ceux des hémoglobines monomérique comme la myoglobine

Une hème entouré de protéine.

Monomère d'hémoglobine

A

BC

D

EFG

H


La proteine se plie en 8 hélices . A...H

Ses hélices sont organisé en deux couches– A – E – F (superieur)– B – G – H (inferieur)

L'héme se trouve entre E et F.

HF8HE6


Le Fer de hème est firmement lié a : – une histidine dite

proximale– proche a une histidine

dite distale.

– le ligand O2 se lie entre

l'histidine distale et le fer.


Difficile à comparer plusieurs structures– nomenclature structurale

– HisF8

– Organisation des nomsRésidueElement de structure

secondairePosition dans l'élement.

HF8HE6

Evolution archaique

On pense que ces protéines ont une origine achaique avant l'accumulation d'O

2 vers -2GYa.

Plusieurs protéines ont une repliement similaire comme:– phycocyanines, colicines, la toxine dipthérique,

hémocyanine ou le cytochrome b2.

Avec l'accumulation d'oxygène elles ont prise un rôle important dans le liaison d'oxygène.

Les cousines distantes

Cytochrome c

Phycocyanine

BH

Cyanobilin

Une famille diverse

Hémoglobines – à basse affinité– à haute affinité

Dissociation lenteAssociation rapide

Fusions

Hémoglobines – d'animale, – de plante, – de bactérie

Hémoglobines– monomérique, – dimérique et plus.

Flavoprotéine

Hémoglobine

Flavohémoglobine de E. coli

Une famille diverse

Flavohémoglobine– monomérique fusion

avec une flavoprotéine.

Une famille diverse

Hémoglobine dimérique de Vitreoscilla stercoraria

Une protéine bacteriène dimérique.

Une famille diverse

Une hémoglobine tronqué de plante...

Moins de 8 hélices, et certaines tres courtes.

Une famille diverse

Comment comparé cette famille tres diverse?

Il faut aligner des séquences très disparates– <5% identité!

Alginement structurale– Nomenclature

structurale

Construction d'un arbre

Un “gabarit”– Il faut aligner des

séquences très disparates.

Evolution de fonction.

C'est quoi un gabarit?– Un patron qui donne les

différentes possibilites aux differentes positions...

Il existe depuis longtemps un gabarit basé sur l'alignement de protéines des vertebrés (Bashford, Chothia et Lesk) mais il est mal adapté aux hémoglobines des non-vertebrés....

Moens et al. (1996) Mol. Biol. Evol. 13: 324333


Alignement structural...– Il faut aligner les

structures plutot que simplement les séquences.

– Il faut definir les possibilités

C'est quoi un gabarit?– Un patron qui donne les

differentes possibilites aux differentes positions...

Il existe depuis longtemps un gabarit basé sur l'alignement de protéines des vertebrés (Bashford, Chothia et Lesk) mais il est mal adapté aux hémoglobines des non-vertebrés....


Le gabarit– Il n'est pas tres exigeant,

beaucoup de possibilites a certains positions.

– Seulement deux positions requises CD1 = F et F8 = H.

– S = surface, i = interne et req = requis.


Le gabarit– Les listes et penalties ne

renforcent pas toujours nos conceptions des groupes d'acide amines.

– C2 – P – G – ST – AQ– E7 – HQ – VL– G12 – VILMF – T– (RKDENQHGASCT)P


Hemoglobins

Plantes et metazoaires

Ciliates, Chlamydomonas et Nostoc

Levures et Bactéries


Hemoglobins 16/18S ARNDeux transferts horizontaux...Ciliate/Chlamy ancetre vers NotocFlavoHem de S.cerveisiae vers protéobactéries

La forme de la courbe de saturation– Myoglobine est

hyperbolique– Hémoglobine est

sigmoïde

C'est dû à la coopérativité.

Hémoglobine – les essentiels


Explication moléculaire de la cooperativité...

Il faut plusieurs sites de fixation– L'hémoglobine est un

tétramère.



Il faut plusieurs sites de fixation

Les différentes sites qui interagissent– A courte distance ou– à longue distance

(changements de structure)



Il faut plusieurs sites de fixation

Les différentes sites qui interagissent

Deux structures– Tendue (T) et – Relachée (R)

Liaison de l'oxygène facilite une changement de conformation.– L'information est transduit de l'interieur de la protéine

vers l'exterieur.

Les deux conformations ont une affinité pour l'oxygène differente– T (basse affinité) / R (haute affinité)


La courbe de saturation refléte la conversion entre la forme T et la forme R.


Des importants modifications de conformation des C-terminaux...

Une liaison hydrogène entre le tyrosine HC2 et la chaine peptidique (F8) est brisée.

Helice F

YHC2

HF8HE6


H146

pont salin avec D94

pont salinavec

Que font les C-terminaux des sous-unitées?


Mécanique

Que font les C-terminaux des sous-unitées? R141

pont salin pont salin D126


T RL

0

c4L0

Les oxygènes destabilisent les ponts salins et ainsi rendent la transition TR plus facile.

c=K R

KT KT

4 KR

4

Donc: c > 1K

R > K

T, comme ils sont des

constants d'association ca veut dire que la transition TR (L0) augment l'affinité.


T R

Energie

On peut regarder en termes d'énergie libre également...


Plusieurs modulateurs changent l'affinité.– H+

– CO2

– 23BPG

Ils modifient l'equilibre TR.


TR

C'est important dans l'aclimatisation

Avec BPG

Sans BPG

Le 2,3bisphosphoglycerate diminu l'affinité de l'hémoglobine



– CO2

– 23BPG


Il se lie entre les deux sousunités dans la forme T – il n'y a pas d'espace dans la

forme R



– CO2

– 23BPG



TRUne forme T de basse affinité et

une forme R de haute affinité. Le P

50 est déterminé par la facilité

d'échange entre ces deux formes.

Ponts salins23BPG


La structure générale de l'hémoglobine

La variabilité de l'hémoglobine

Deux formes T et R et l'origine de la cooperativité.– Différences de structure– Différences d'affinité

Rôle des modulateurs

Variation de séquence I

Variations entres espèces et les liens entre séquence physicochimie et ecologie

Les exemples

Deux espèces d’oies apparentées, l’une qui vol d’Inde vers le Tibet à 7-9000m.

L'effet Root des hémoglobines de poisson.

Les oies indiennes

Les oies Anser anser (oie cendrée) habite à basse altitude, mais Anser indicus (oie à tête barrée) fait une migration annuelle à travers l’Himalaya (volant jusqu ’à 9000m).

Les oies indiennes

Les oies Anser anser (oie cendrée) habitent a basse altitude, mais les oies Anser indicus (oie à tête barrée) font une migration annuelle à travers l'Himalaya (volant jusqu'à 9000m)

Le sang d'Anser indicus a une très haute affinité pour l'oxygène, et l'animale est résistante à une stress hypoxique (une nécessité pour la migration).

Les oies indiennes

Quelles sont les origines de cette difference? Il y à que 4 différences de séquence entre les

séquences d’hémoglobine des deux espèces.

Gly18α →SerAla63α →ValPro119α →AlaGlu125β →Asp

Lesquelles de ses mutations sont responsables de la haute affinité et comment?

Certaines de ces mutations sont elles neutres?

Les oies indiennes

Quelles sont les origines de cette difference?

Il y à que 4 différences de séquence entre les séquences d’hémoglobine des deux espèces.


Les oies indiennes

Quelles sont les origines de cette difference? Il y à que 4 différences de séquence entre les

séquences d’hémoglobine des deux espèces.


Les oies indiennes

Quelles sont les origines de cette difference?

Il y à que 4 différences de séquence entre les séquences d’hémoglobine des deux espèces.


Gly18α est externe sur le surface.

Ala63α est également à l’extérieur.

Glu125β a sa chaîne latérale dans le solvant.

Pro119α est dans le région de contact α

1β

1 et touche la Leu55β

Les oies indiennes

Quelles sont les origines de cette difference?– Résidues de surface

probablement peu important (pourquoi?)

– Aucune modification dans la site de liaison, pourtant modification de l'affinité.

Les oies indiennes

Suppression de deux CH2

Proline

CCH

O

N

H2C

CH2 CH2

Alanine

CCH

O

N

CH3

H

La mutation Pro119

Ala

crée un trou entre les sous-unités et .

Pas très bon pour la stabilité!

Quelle effect sur l'affinité?

Les oies indiennes

La mutation Pro119

Ala





Pro119

Leu55

DesoxyHémoglobine

Les oies indiennes

La mutation Pro119

Ala





Hb P50 mmHg Log P50 log(P50)HbA 5,8 0,76HbA Pro119A 3,3 0,53 0,23Anser anser 2,8 0,45Anser indica 2,0 0,30 0,15

Nota: G = RT ln(Keq)G ∝ ln(Keq) ∝ log(Keq/Keq)

Les oies indiennes

TR

G° ≈ 150 J/mol

Pourquoi un trou augment l'affinité?– La forme T (de basse

affinité) est destabilisé.– La forme R (de haute

affininté) est peu affecté (le contact n'existe pas)

– La transition T-R est favorisée ce qui augment l'affinité.

Les oies indiennes

TR

G° ≈ 150 J/mol

La taille de l'effet est petit!– L'energie d'interaction de

deux CH2 est de

150J/mol– environ 25% d'une

liaison H.– mais cela modifie

l'affinité

Les oies indiennes

Une augmentation de l'affinité de l'hémoglobine de 0,8 mmHg (2,8 contre 2,0) est elle suffisante pour expliquer la modification d'habitat?

pas vraiment mais...

Dans le sang (grace aux modulateurs) les chiffres sont differentes:

Les oies indiennes

Anser anser 50mM Hg 8 000m

Anser indica 35mM Hg 12 000m

Meme effet energetique 150 J/mol ( 2*1,4 = 2,8 et 35 * 1,4 = 49 )

Dans le sang (grace aux modulateurs) les chiffres sont differentes:

Les oies andiennes

Dans une autre oie, l'oie andienne (Chloephaga melanoptera) une example frappante!

Cette oie qui vit a altitude a 16 modifications dans sa hémoglobine contre cela de l'oie cendrée.

Hiebl I, Braunitzer G, Schneeganss D.(1987)Biol Chem Hoppe Seyler. 368:15591569.

Les oies andiennes

Parmi les modifications il y a une qui touche le contact Leu

55-Pro

119

Cette fois c'est une mutation Leu

55Ser

Les oies andiennes


Leucine Serine

CCH

O

N

CH2

H

OH

CCH

O

N

H3CCH

CH2

CH3

H

Encore 2 groupements methyl perdus.

Encore le même effet sur l'affinité d'oxygène!

Encore le même effet sur l'ecologie.

Les oies indiennes

L'étude de proches cousins peut donner des informations sur les liens séquence – écologie.

Un petit effet energétique (150J/mol) peut avoir des conséquences importants.

La majorité (75%-90%) des modifications ne sont pas important– ni pour la fonction de la

protéine – ni pour l'ecologie de

l'espèce.– ils sont neutres.

L'effet de Root

Les poissons téléosténiens ont une vessie natatoire - qu’ils remplissent avec l’oxygène.

Cet oxygène vient des globules rouges et de l’hémoglobine.

Comment les poissons des profondeurs peuvent remplir leur vessie natatoire contre une pression hydrostatique qui arrive à des centaines de atmosphères.

L’effet Root (variant de l’effet de Bohr).

L'effet de Bohr

L'affinité de l'hémoglobine est sensible au pH.– Addition de l'acide

diminue l'affinité pour l'oxygène.

Les protons diminus l'affinité de l'hémoglobine

.pH 8

.pH 7,4

L'effet de Bohr.

les protons diminue l'affinité pour l'oxygène

reciproquement l'oxygène diminue l'affinité pour des protons.

Deux équilibres couplées. Pour Hb humaine 0,3H+

par O2.

Hb + 4O2

Hb1,24O2 + 1,2H+

L'effet de Bohr

Au niveau moleculaire– La forme T (basse

affinité) peut former un pont salin entre His

146

et Asp94

.

– La protonation de l'histidine diminue l'affinité (si l'aspatate est ionisé).

– Deux équilibres couplées.

pont salinavec Lys

His146

pont salin avec Asp

94.

L'effet de Root

3 4 5 6 7 8 9 100

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

Effet de Root

HbATuna

PH

Pro

ton

s

Plus grande que l'effet de Bohr.– 3,6 protons maximale

contre 1,2 pour Hb humaine.

– Une tres basse affinité a pH acide

L'effet de Root

Plus grande que l'effet de Bohr.– Une basse affinité a pH acide

L'effet de Root

Plus grande que l'effet de Bohr.– Evolution vers 300 MYa

L'effet de Root

Les poissons pompent de l’oxygène avec de l’acide lactique.

Ils ont une structure spéciale (la rete) à côté de leur vessie natatoire ou ils accumulent suffisamment d’acide lactique pour remplir leur vessie!

Hb + 4 O2 ⇔ Hb.4O

2 + 3,6 H+

L'effet de Root

Quelles différences de séquence sont importantes pour l’effet Root?

Entre l’Hb de tuna et l’Hb humaine il-y a 140 (/287 - dans une dimère) différences.

L'effet de Root

Quels residus sont important pour l'effet de Root?

1ère idée : la substitution Cβ F9S (Pourquoi?)

L'effet de Root

Serine

CCH

O

N

CH2

H

OH

Cysteine

CCH

O

N

CH2

H

SH



Modification d'une atome S – O.

L'effet de Root

Serine

CCH

O

N

CH2

H

O

Cysteine

CCH

O

N

CH2

H

S

H H

NO

H

CH

His146 CH2

CO⊖

O

H

CH

His146 CH2

CO⊖

N

Différences entre S et O...– Angle optimale CSH

~180° et COH ~104°– O plus acide que S– Ser plus de liaisons H

qui sont plus forts.

Ces différences font que His

146 mieux lié à

la structure avec Ser.

L'effet de Root

Pourquoi cela modifie l'affinité et l'effet des protons?– Dans la forme T (basse

affinité) His146

peut faire une

pont salin avec Asp94

.

– Trois réactions liées:conformation T/R et affinité

protonation His146

et le pont

salin.

liaisons H His146

et Ser/CysF9

.

pont salinavec Lys

His146

pont salin avec Asp

94.

L'effet de Root

Pourquoi cela modifie l'affinité et l'effet des protons?– Dans la forme T (basse

affinité) His146

peut faire une

pont salin avec Asp94

.

– Trois réactions liées:conformation T/R et affinité

protonation His146

et le pont

salin.

liaisons H His146

et Ser/CysF9

.

A pH acide le His146

protoné

peut plus facilement trouver l'Asp

94 et basculer

l'oxyhémoglobine en forme T qui est de basse affinité et perd l'oxygène.

L'effet de Root

Test Ser/Cys modification

L'effet de Root

Un échange très conservateur (C→S) d’acide aminé dans une site clé peut changer, d'une façon importante, le comportement physico-chimique d’une protéine.

Malheureusement il n'est pas suffisant pour donner un effet de root a l'hemoglobine humaine.

L'effet de Root



2ème idée : un pont salin additionelle en forme T.– His

69-Asp

72.

– Encore plus d'effet de pH.

L'effet de Root

Test extra salt bridge His-Asp


1ère idée : la substitution Cβ F9S

2ème idée : un pont salin additionelle en forme T.

L'effet de Root

3ème idée : peut-être en plus des changements subtils dans la site de liaison d'oxygène.

4ème idée : plusieurs mechanismes avec roles variables selon l'espece.

Stabilisation de la position de His

146 dans la forme T.

Diminution du nombre d'histidines de surface.

Destabilisation de la forme R (groupes de charge).

Liaison H additionnelles dans la forme T.– Asp de surface .

L'effet de Root

Conclusions

L'effet de Root moins claire que l'histoire des oies.– 140 modifications à

analyser.

Des petits changements peuvent être importants– Ser/Cys– Residus similaires

Souvent plusieurs modifications synergiques sont impliquées.

Variation de séquence II

Les variations au sein d'une espèce

Variations au sein d'une espèce

L'espèce humaine, car plus d'information.

Deux types de variation...– Les variations au cours

du développement.– Les differentes alleles

des gènes et la variabilité naturelle.

Variations dans l'espèce

22

22

22

22

22

22

Au cour du développement normal 6 différentes hémoglobines sont fabriquées

chaqu'une a un moment différent dans le développement.

Hémoglobine foetale

P50 Nom chaines 4 Torr Gower I 22

12 Torr Gower II 22

6 Torr Portland 22

20 Torr Foetal 22

26 Torr Adult 22

Les différentes formes ont des propriétés différentes.

L'embryon et le foetus ont une grande besoin en oxygène.


VHLTPEEKSA VTALWGKVNV DEVGGEALGR GHFTEEDKAT ITSLWGKVNV EDAGGETLGR

LLVVYPWTQR FFESFGDLST PDAVMGNPKV LLVVYPWTQR FFDSFGNLSS ASAIMGNPKV

KAHGKKVLGA FSDGLAHLDN LKGTFATLSE KAHGKKVLTS LGDAIKHLDD LKGTFAQLSE

LHCDKLHVDP ENFRLLGNVL VCVLAHHFGK LHCDKLHVDP ENFKLLGNVL VTVLAIHFGK

EFTPPVQAAY QKVVAGVANA LAHKYH EFTPEVQASW QKMVTAVASA LSSRYH

Entre les chaines et il y a 40 différences de séquence.


Entre les chaines et il y a 40 différences de séquence.– la moitié sont des

modifications sur la surface (peu important?)







Entre les chaines et il y a 40 différences de séquence.– la moitié sont des

modifications sur la surface (peu important?)

– deux mutations dans les 4 résidus qui interagissent avec le modulateur 2,3-BPG V

1

et H143

.







La liaison de 2,3-BPG dépend des interactions ioniques avec:– NH

3

+-Val1

– His2

+

– Lys82

+

– His143

+ - Ser


Normalement le 2,3-BPG lie à l'hémoglobine et diminue sa affinité pour l'oxygène.

La HbF lie le 2,3-BPG moins bien.

Ce qui stabilise la forme R (haute affinité).

Il se lie entre les deux sousunités dans la forme T (basse affinité) mais

pas dans la forme R


Stegink, Meyer et Brumel (1971) J. Biol. Chem. 246: 30013007

Chromatographie, electrophorèse digestion et sequencage...

Chromatographie (purification), spectroscopie de masse et digestion.

L'effet de Gly1 est plus

subtil! 15% des chaines sont

acylées, les chaines n'y sont pas.


Acetyl-Gly1 n'est plus

chargé. Val est moins flexible et

évite l'acetylation. Exemple d'une

différence qui agisse par les modifications post-translationelles


Normalement 3% de hemoglobine (HbA) en forme CO et specificity (CO/O2) environ 250.Pour hème sans protéine specificité est vers 10,000Pour HbF la spécicitité est diminuée vers 80 et malgré ca +10% en forme CO.

Polarité de poche de liaisonLiaison H avec Histidine

Variations dans l'espèce

Environ 400 mutations ponctuelles

HbS (β G6→V)

Hb Rayleigh (β V1→A)

Hb Hiroshima (β H146

→D)

Hb Rouen (α Y140

→H)

Une grand nombre de mutations ponctuelles sont connues.

Hb S

Peut-etre la premiere maladie associé avec une protéine mutante.

Une allele avec une grande pénetration grace aux avantages de la mutation.

Associé avec une résistance au paludisme

Maladié génétique

Décrite par James Herrick en 1904.

Les globules rouges d'une forme particulière “falciformes”.

Cause le “drépanocytose”

Maladie génétique

Les malades (homozygotes) peuvent avoir environ 50% d'erythrocytes falciformes dans leur sang veineux, mais pas arterial.

Pour les porteurs (heterozygotes) seulement environ 1% d'erythrocytes falciformes dans leur sang veineux.

Grande pénétration du gène dans certains populations, environ 11%.– 1% homozygotes et 10% héterozygotes.

Distribution d'HbS

Paludisme et HbS

Le paludisme est peut-être le plus grande influence sur l'évolution humaine!

Les liens entre HbS, la physicochimie et le paludisme.

D'autres mutations.

Paludisme

Le paludisme tue encore plus de 1M personnes par an, essentiellement les enfants.

Très important dans l'évolution de l'espece humaine.

Ils existent plusieurs mutations qui protègent partiellement– Thallesimies– Drepanocytose et autres

mutations ponctuelles– Glucose-6-phosphate

deshydrogenase.

Paludisme

La cycle d'inféction– D'abord dans le foie– Ensuite une cycle dans les

erythrocytes– Des crises de paludisme

associés avec la libération de mérozooites

– Les mérozooites colonise a nouveau des erythrocytes.

Paludisme

La maturation des mérozooites dans les erythrocytes se passent dans les tissus pour eviter l'immunosurveillance de la rate.

Hb S

Quelle est la mutation? Comment la mutation

engendre t'elle le phénotype?

Quelle est l'origine de l'avantage contre le paludisme?

Hb S

Quelle est la mutation?– Ca change la charge de

la protéine.– Les deux gènes sont

exprimés dans des héterozygote.

Origine

HbS

HbA+

Norm

ale

Porteur

Malade

Linus Pauling en 1949 à trouvé une différence de pI entre l ’HbA et l ’HbS

Hb S




– Glu6Val

HbA ValHisLeuThrProGluGluLysHbS ValHisLeuThrProValGluLys

Glutamate Valine

CCH

O

N

H3CCH

CH3

HC

CH

O

N

O

CH2

CH2

C

H

O⊖

Hb S




– Glu6Val

Dépistage par génotypage

La mutation détruit un site de restriction MstII

PCR et digéstion a MstII

Hb S




– Glu6Val

– Sur la surface de la protéine.

Une mutation de surface (peu importante)

HbS

Comment la mutation cause les erythrocytes falciformes?– L'Hb est tres concenté dans

des globules rouges. (5mM ou 320mg/ml)

– L'HbS est beaucoup moins soluble en particulier en forme desoxygène (35mg/ml)

– La solubilité dépend de la surface de la protéine.

HbS

Comment la mutation cause les erythrocytes falciformes?– Problème de solubilité

de la forme desoxy.– Formation de fibres.

From G. Rykes, R.H. Crepeau, and S.J. Edelstein. Nature 272(1978):509.

HbS


de la forme desoxy.– Formation de fibres.– Les fibres déforment les

cellules dans la circulation veineux.

HbS


de la forme desoxy.– Formation de fibres.– Les fibres déforment les

cellules dans la circulation veineux.

– La formation de fibres est complèxe.

HbS

Comment la mutation cause les erythrocytes falciformes?– Val

6 interagisse avec

Leu88

et Phe85

d'une

autre tetramère.– Ces deux résidues sont

accessible que dans la conformation T.

HbS

Comment la mutation cause les erythrocytes falciformes?– Val

6 interagisse avec

Leu88

et Phe85

d'une

autre tetramère.– Ces deux résidues sont

accessible que dans la conformation T

– Il exist des revertants partiels...

Hb S

Quelle est la mutation?– Glu

6Val

Comment la mutation engendre t'elle le phénotype?– Polymerisation

Quelle est l'origine de l'avantage contre le paludisme?

Hb S

Quelle est l'origine de l'avantage contre le paludisme?– A une basse

concentration d'oxygène l'HbS empeche la survie de la parasite.

Hb S

Quelle est l'origine de l'avantage contre le paludisme?– l'HbS empeche la survie

de la parasite à 3% O2.

– La parasite modifie la surface de l'erythrocyte pour une maturation dans les tissus ou ils s'acrochent dans les capillaires.

Image (c) 2003 WHO/MAP/TDR

Plasmodium falciparum trophozoites

HbS

Une erythrocyte infectée s'accroche dans une tissue.

La basse concentration d'O2 cause l'hémoglobine à

se desoxygèner. L'HbS n'est plus soluble et elle forme des fibres

– ce qui entraine encore plus de desoxygèneation et polymerisation (equilibres couplées)

La deformation des membranes cause une perte de K+ intracellulaire

Ce qui tue les parasites.

HbS

Dans homozygote la deformation est rapide et donc est visible dans le sang.

Dans l'héterozygote, le processus est plus lente et donc est limité SAUF dans les ertythrocytes accrochés dans les tissus.

HbC

Un different mutation dans le meme endroit.– Glu

6Lys

Donne également une avantage contre le paludisme.

Par une méchanisme différente.

Fairhurst et al. 2005. Nature 435: 11171121

Les erythrocytes infectés ne collent plus dans les tissus...

HbC

Un different mutation dans le meme endroit.– Glu

6Lys

Donne également une avantage contre le paludisme.

Par une méchanisme différente.


Les erythrocytesinfectés n'ont plus PfEMP1 sur la surface

HbC

Donne également une avantage contre le paludisme.– Les erythrocytes ne

montrent plus PfEMP-1 correctement sur la surface.

– Ils ne peuvent plus s'accrocher dans les tissus.


Les erythrocytesinfectés n'ont plus PfEMP1 sur la surface...

et les heterozygotes ont une morphologie différente.

HbC

Par une méchanisme différente.– Les erythrocytes viellissent plus vite, parceque

l'hémoglobine est moins stable.– L'hémoglobine dénaturé largue son héme qui

s'accrochent sous le membane.– Ce qui

diminue le temps de vie des erythrocytes.modifie l'organisation de PfEMP-1 en diminuant son efficacité et

augmentant son antigénicité.

Conclusions

Effets de mutation parfois indirecte (modification).

Multiplicité de fonctions d'une protéine O

2 et

CO. Les modifications de

surface ne sont pas tous anodin.

Divers aspets de la physicochimie sont important pour lié la séquence et la physiologie.– solubilité/precipitation– stabilité/denaturation– flexibilité/rigidité– charge et polarité

Variations de séquence III

Le hémoglobine d'Ascaris suum

Ascaris suum

Hémoglobine P50

(mmHg)

Ascaris suum 0,0072Hbα 0,82HbA 21,4Mb 15,5

Certaines hémoglobines ont une énorme affinité pour l'oxygène.– Quelles sont les origines

moléculaires?– Pourquoi une telle

affinité?

Ascaris suum

Hémoglobine P50

(mmHg)

Ascaris suum (O2) 0,0072

Ascaris suum (CO) 0,35Mb (O

2) 15,5

Mb (CO) 0,55

La haute affinité est spécifique à l'O

2

– L'affinité pour CO n'est guerre changée.

Ascaris suum

La haute affinité est spécifique à l'O

2

– L'affinité pour CO n'est guerre changée.

– Elle est du en grande partie a une dissociation très lente (1000x)

Hémoglobine kon

(M1s1) koff

(s1)

Ascaris suum 2,8 0,013Mb 15,0 14,0HbA 40 50

Ascaris suum

Myoglobin GLSDGEWQLVLNVWGKVEA-Ascaris ---MATACVKSLESVQCGTC

Myoglobin ---DIPGHGQEVLIRLFKGHAscaris EKTIANGTEFYALLFDKHPD

Myoglobin PETLEKFDKFKHLKSEDEMKAscaris LRHYFKGNENLTGADVKKSD

Myoglobin ASEDLKKHGATVLTALGGILAscaris HFKKQGQRLLLACHVLAHLE

Myoglobin KKKGH---HEAEIKPLAQSHAscaris NDPASFKAYAREI---VDPH

Myoglobin AT-KHKIPVKYLEFISECIIAscaris LRMSVHLEPKLWSEFWPIWL

Myoglobin QVLQSKHPGDFGADAQGAMNAscaris DYLSTKES-V-DDATKNAWL

Myoglobin KALELFRKDMASNYKELGFQGAscaris ALGKKFSDECLDHLKNLGQPH

Une chaîne unique (comme Mb - myoglobine)

Tellement de différences de séquence que :– une alignement tres

difficile (8% d'identité)– l'algnement nous aide

peu.

Ascaris suum

Comme monomérique pas de problème d'allostérie...– Il faut regarder dans la

site de liaison pour l'explication moléculaire de la haute affinité.

Une approche biophysique

Le spectra d'absorption de l'hémoglobine– Bandes Soret, et – Formes oxy (Fe2+),

desoxy et oxydée (Fe3+)– Formes haut-spin et bas

spin.

Le spectre d'absorption des hémoglobines contient plusieurs pics. La forme du spectre nous renseigne sur le Fer et son environnement.




spin.

Le hémoglobine peut exister dans deux états d'oxydation chacun avec diverses ligands.




spin.

Selon les ligands le fer peut se trouver dans une état basse spin (ligands forts doublet) ou haut spin (ligands faibles singlet).

Haut spin 4/2 Bas spin (0)Eg

Tg

Approche Biophysique

Le spectre de la Met-Hb

Ascaris (a) est typique

d'une hème oxydé de bas spin celui de la Met-Hb

Equus (b) est haut

spin. Les ligands sont donc

exceptionellement forts.

Une hypothèse

Il faut chercher des différences autour de la site de liaison qui vont augmenter la force de liaison du ligand axiale...

Myoglobin GLSDGEWQLVLNVWGKVEA-Ascaris ---MATACVKSLESVQCGTC

Myoglobin ---DIPGHGQEVLIRLFKGHAscaris EKTIANGTEFYALLFDKHPD

Myoglobin PETLEKFDKFKHLKSEDEMKAscaris LRHYFKGNENLTGADVKKSD

Myoglobin ASEDLKKHGATVLTALGGILAscaris HFKKQGQRLLLACHVLAHLE

Myoglobin KKKGH---HEAEIKPLAQSHAscaris NDPASFKAYAREI---VDPH

Myoglobin AT-KHKIPVKYLEFISECIIAscaris LRMSVHLEPKLWSEFWPIWL

Myoglobin QVLQSKHPGDFGADAQGAMNAscaris DYLSTKES-V-DDATKNAWL

Myoglobin KALELFRKDMASNYKELGFQGAscaris ALGKKFSDECLDHLKNLGQPH

Une hypothèse

HisE7 GlnE7TyrB10

Oxymyoglobine Ascaris oxyhémoglobine

Une hypothèse

Le résidu TyrB10 estil important?Mutagenèse dirigée:

Hémoglobine P50

(mmHg) kon

(M1s1) koff

(s1)

Ascaris suum 0,0072 2,8 0,013B10 YL 8,2 9,0 5,0B10 YF 0,6 40,3 2

Oui, ce résidu est très important pour l'affinité.

Cristallographie– Très haute resolution

avec Rayons X ou neutron crysallographie.

– Tres longue et souvent couteux (difficile d'avoir des cristaux adequate et des neutrons)

– Peu d'information– Interpretation facile.

Liaisons Hydrogènes

Comment voir des liaisons hydrogène et éstimer leur importance?– Cristallographie– Spectroscopie

vibrationelle– Echange H/D ou H/T

Spectroscopie vibrationelle– La frèquence des

vibrations dépend des liaisons H.

– Spectres compliques– Interpretation difficile– Information sur la force

des liaisons.




Echange H/D (rmn)– Les liaisons hydrogène

ralentissent l'échange H/D.

– Information structurale simple

– Calibration difficile en force.

– Assignation des resonances difficile.




Spectroscopie vibrationelle

Mesures les fréquences de vibration d'une molécule.– Depend de la masse des

atomesplus lourde plus lente

– Depend de la force du liaison.plus forte plus rapide

C O


Mesures les fréquences de vibration d'une molécule.– Beaucoup de frequences

3n6 fréquences ou n = nombre d'atomes dans la molécule (H inclus) pour une haemoglobine monomerique environ 8000!


Mesures les fréquences de vibration d'une molécule.– Beaucoup de frequences– Simplification

Spéctoscopie differentielleMarquage IsotopiqueSpectroscopies Raman

– CARRS ou– Raman de résonance.

Compare deux spectres similaires par exemple une enzyme sans et avec substrat.

Seul les choses qui changent sont visibles par exemple la site active.





Mettre une ou des atomes de masse different dans des endroits clés : D; O18 ou N14. Ce qui donneront des fréquences specifiques

On peut coupler ca avec la spectroscopie differentielle (compare O16 et O18).





Spectroscopie Raman (prix Nobel 1930)





Spectroscopie Raman diffusion inélastique des photons

Absorption IR

Diffusion Raman

ExcitationDiffusion





Spectroscopie Raman Sélection possible...

Absorption IR

Diffusion Raman

ExcitationDiffusion

Exhaltation de l'effet (106x) si :●proche d'une surface●excitation correspond à une absorption●ou certains autres conditions

Methode choisie

Dans les exemples qui suit les auteurs ont utilisé de la spectroscopie Raman de résonance différentielle avec marquage isotopique!!! Pour regarder l'importance des liaisons H dans l'hemoglobine d'Ascaris suum.

Une spectroscopie vibrationelle qui permet d'observer la fréquence de vibration de certaines liaisons.

Une méthode de sélection qui permet de ne regarder que les vibrations associées avec un chromophore (hème ou tyrosine)

Une méthode de sélection qui permet de ne regarder que les vibrations sensibles à un changement (par exemple de ligand)

Une méthode de sélection qui permet d'attribuer des vibrations à certains atomes ou groupes

Ascaris suum – Raman spectroscopy

Avec une laser UV on peut regarder spécifiquement les tyrosines et tryptophanes.– Les différentes bandes W16 ou

Y9a sont attribué a des vibrations spécifique de chaque résidue

– Les spectres avec “rien”, O2 et

CO sont comparés

Ascaris suum – Raman spectroscopy

Avec une laser UV on peut regarder spécifiquement les tyrosines et tryptophanes.– Les spectres de différence

indiquent une interaction spécifique entre O2 et une tyrosine dans la région Y8a/Y8b

– Cette alteration de spectre est typique de la formation d'une liaison hydrogène.

Ascaris suum – Raman spectoscopie

Avec une laser Krypton (413nm) on peut regarder l'héme...– Nous pouvons se

concentrer sur la liaison Fe-LigandBasse fréquence (Fe lourd)Sensible a une marquage

isotopique (12C16O ou 13C180)Double band 515 et 543 cm-1

se déplace à 500 et 531 cm-1.

12C16O 13C180


Avec une laser Krypton (413nm) on peut regarder l'héme...– Nous pouvons se

concentrer sur la liaison Fe-LigandSensible a la mutation B

10Y/F

Sensible a une marquage isotopique (12C16O ou 13C180)

Simple band 520 cm-1 se déplace à 504 cm-1.


Nous pouvons se concentrer sur la liaison Fe-Ligand– Dans le mutant B

10Y/F une

seule site de liaison CO.– Dans la type sauvage deux

modes de liaison liaison forte ou liaison faible.


Nous pouvons se concentrer sur la liaison CO...– Dans le mutant B

10Y/F une

seule site de liaison CO1928/1840

– Dans la type sauvage deux modes de liaison1909/18231948/1863.


Les fréquences CO et FeC montent normalement une correlation...– Dans le mutant B

10Y/F une

seule type de liaison COavec des liaison H “moyenne”

– Dans la type sauvage deux modes de liaisonLiaisons H “forte”Liaisons H “faibles” (quasi

absents)

Modèle II

Liaison en deux étapes: La deuxième étape spécifique pour l'oxygène, et implique la tyrosine 10

Modèle II

Liaison en deux étapes: La deuxième étape spécifique pour l'oxygène, et implique la tyrosine 10

Situation avec CO et mutant

Liaisons pas stable avec CO

Ascaris suum

Hémoglobine P50

(mmHg)

Ascaris suum 0,0072Hbα 0,82HbA 21,4Mb 15,5

Certaines hémoglobines ont une énorme affinité pour l'oxygène.– Quelles sont les origines

moléculaires?Liaisons H de B

10Y

specifique à O2

– Pourquoi une telle affinité?

Ascaris suum

Avec une telle affinité et k

off si lente une fois une

oxygène accroche elle reste!– Pas une système

dynamique– C'est une enzyme! une

desoxygènase

O2 + NO + e

NO3

Ascaris suum

Avec une telle affinité et k

off si lente une fois une

oxygène accroche elle reste!– C'est une enzyme! une

desoxygènase– Les réactions sont un

peu complexes

– Le E15

Cys joue un rôle

important.

Hb(FeIII)CysS

Hb(FeIII)NOCysS

Hb(FeII)CysSNO

NO°

Hb(FeII)O2

CysSNO

Hb(FeIII)CysS°

O2

NO3

e

Conclusions

Les liaisons H sont important en biologie pas facile a étudier.

Les très fortes affinités indiquent un système statique et peu interessant biologiquement!

Nouveux membres de la famille

Hemoglobines et signalisation.

Nouveaux membres

Les efforts de séquencage ont mise en evidence des nouveux hémoglobines:– Neuroglobine (humain et

autres)– Cytoglobine (humain et

autres)– HemAT (bacterien)

Changement de paradigme– Anterieurement “cherche

la protéine résponsable d'une fonction observé”.

– Aujourdhui “cherche la fonction d'une ORF identifiée”

Neuroglobine et Cytoglobine

Récemment deux nouveaux hémoglobines ont été découvertes: la neuroglobine et la cytoglobine

Identification du patron d'expression par immunohistochimie.

La cytoglobuline est ubiquitaireLa neuroglobine se trouve dans les neurones mais aussi dans des cellules β des islets de pancreas.

Neuroglobine

Les possibles fonctions de la neuroglobine.– Transport intracellulaire

d'oxygène– Oxydation de NADH– Destruction d'ROS– Destruction d'NO°– Sensor d'oxygène.

Neuroglobine

Alignement des hemoglobines humaines : NGB, neuroglobine; CYGB, cytoglobine; MB, myoglobine; HBA, HBB, HBD, HBE, HBG, and HBZ, chaînes d'hemoglobine.Des résidus de Cys pourraient jouer une rôle important.

Neuroglobine

Les Cys pourraient agir comme dans l'hémoglobine d'Ascaris

L'hémoglobine pourrait etre une oxygènase.

Les Cys peuvent réagir avec NO°

Aucune evidence d'activité.

Aucune interêt connue pour la cellule.

Neuroglobine

Si elle est une enzyme ou un senseur elle doit réagir avec O

2.

– Cys-SH prêt de GH4

– Pont disulfure supposé entre CD

7 et D

5.

Neuroglobine


2.


Réagis très bien avec DNTB.

– Pont disulfure entre CD7

et D5.

Protégé contre DNTB

Neuroglobine


2.


Réagis avec Iodoacetamide.

– Pont disulfure entre CD7

et D5.

Réagis avec DTTRéagis avec Iodoacetamide

après DTT.

Neuroglobine

La Neuroglobine contient– un pont SS.– une SH libre.

Neuroglobine

Examination des cinétiques de réassociation de CO.

Methode classique pour les hémoglobines...

HbCO Hb + COint

Hb + COext

Lumière

Neuroglobine

Examination des cinétiques de réassociation de CO.– Utilisation de representation log-

log.– Réassociation bi-phasique

deux phases relativement lents.

– Réassociation sensible au pont SS.Phase rapide accelerée et plus grandePhase lente retardée.

Neuroglobine

Examination des cinétiques de réassociation de CO.– Utilisation de representation

log-log.– Réassociation bi-phasique– Typique des hemoglobines

hexa-coordinéVitesse limité par ouverture.Ce qui est sensible au SS

HisFeHis+ CO

int

HisFeCOHis

Neuroglobine

Ces resultats cinétiques petmettent a envisager.– Lien entre oxygenation

et état redox.– Possible d'envisager

dans une cycle catalytique ou de signalisation.

– Peu commun de garder une bonne affinité pour oxygène.

Neuroglobine

Aucune evidence

Un peu d'evidenceLie l'oxygène, important pour la survie de cellules en anoxie ou avec ROS.

Les possibles fonctions de la neuroglobine.– Transport intracellulaire

d'oxygène– Oxydation de NADH– Destruction d'ROS– Destruction d'NO°– Sensor d'oxygène.

Neuroglobine

Une rôle comme senseur...– Similitude à la

myoglobine– Similitude a des

domaines RGSRégulateurs de la

Signalisation par des protéines G.

– Similitude sur la surface.

Neuroglobine

Mesures de liaison par SPR.

La neuroglobine se lie à la protéine G

α i mais uniquement

quand elle est oxydée Fe(III).

Neuroglobine

Modèle d'une rôle de signalsation dans la protéction de neurones...

Neuroglobine

Après 7 ans...– Peut-etre signalisation

Pas une bonne demonstation dans une cellule encore.

– Peut-etre ROS destruction.Pareil....

Peut liée Gi

Structure connue Hexacoodoné en

absence d'O2.

Bonne affinité pour oxygène et CO.

Protége contre ROS et anoxie in vivo.

HemAT

Protéines d'aerotaxie des bactéries et d'archea

Hou et al. (2000) Nature 403: 540-544.

Hou et al. (2001) PNAS 98: 9353-9358

Zhang & Phillips (2003) Structure 11: 1097-1110

Deux protéines HemATHs et HemATBs.

Identifié en Halobacterium salinarum (un archae) et Bacilus subtilis (un bactérie).

Des protéines de 489 (et 423) résidus avec deux parties....

HemAT

1 184 222 489

Domaine 1: 16% identité avec la myoglobine.

Domaine 2: 30% identité avec les domaines de signalisation de certains MCP. (Protéines de chemotaxie acceptant des methyls).

Protéine bacterien a deux domains.

Lie t'elle des ligands? Quelle est sa rôle

physiologique?

HemAT

Expression des protéines dans E.coli et purification– tag 6xHis (2) ou– echangeuse d'ions (1&3)

Deux sources– HS = Halobacterium

salinarum (1&2)– BS = Bacilus subtilis (3)

HemAT

Après expression hétérologue et purification examination du spectre d'absorption

Similaire a l'oxymyoglobine.– Elle lie l'héme et– l'héme lie l'oxygène.

HemAT

De plus– Spectres de la forme

desoxy HemAT semblable a desoxyMb.

– Spectre de la forme CO-HemAT semblable a CO-Mb.

– Liaison reversible d'Oxygène et CO.

HemAT

Mesure de l'affinité et cinétique de liaison d'oxygène

Affinité et cinétiques semblable à d'autres hémoglobines

Cohérent avec une rôle dans la detection d'oxygène.

HemAT

Pense a une rôle dans la signalisation– Une domaine detecteur

d'O2

– Une domaine de chimiotaxie.

– Peut-etre une senseur pour l'aerotaxie?

Comment le demontré?

HemAT

Pense a une rôle dans la signalisation– Une domaine detecteur

d'O2

– Une domaine de chimiotaxie.

– Peut-etre une senseur pour l'aerotaxie?

Comment le demontré? Génétique moléculaire

– Construire des mutants de déletion

– Complementation héterologue

– Analyse de mutants

HemAT

Comment le demontré? Génétique moléculaire

– Construire des mutants de déletion

– Complementation héterologue

– Analyse de mutants

Un peu complexe comme plusieurs systèmes.

HemAT

Crystallographie– Que une seule domaine

(la domaine hemoglobine) visible dans la structure!

– Une dimère...Es vrai pour la molecule

entière?Quelle role?

HemAT

Structure de la domaine hémoglobine typique. mais avec une hélice N terminale de plus - Z

HemAT

Les deux molécules dans le dimère sont différentes!

Notamment au niveau de leur site de liaison– Une seule monomère

avec ligand (CN-)– Une rotation de Y70.

HemAT

C'est une dimère très assymétrique!

Quelle rôle pour le dimère?

Quelle rôle pour l'assymètrie?

Comment la signalisation se passent?

HemAT

Deux sites de liaison differentes– Haute affinité– Basse affinité (anormal)– Cooperativité négative!

– vu également avec domain sensor uniquement.

HemAT

Reste à éclaircir entre autre...– Comment liaison du

ligand est transmis a la domaine MCP?

– Pourquoi une cooperativité negative?

Cooperativité negative et deux sites est vu dans plusieurs senseurs...– Tar / Tsr– HemAT

Probablement important! pourquoi?

Conclusions

Deux facons de gagner une fonction de signalisation.– Evolution convergente

(Neuroglobuline)– Ajoute de domaines

(HemAT)

Démontré une fonction cellulaire et biochimique n'est pas toujours simple.

Physicochimie de Macromolécules - lism.cnrs-mrs.fr · Evolution dirigée. But du programme ... –...

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