PFE : Recherche et identification d’Escherichia coli dans Leben marocain

DéDicace

Au nom de Dieu clément et miséricordieux

Nous dédions ce modeste travail à :

Nos Chers parents, pour leurs soutiens, patiences et leurs

sacrifices durant nos études et durant ce projet.

A tous nos enseignants, pour leur bienveillance et pour leur

contribution à notre solide formation.

A nos familles et nos amis pour leurs conseils et leurs

encouragements.

A tous ceux qui ont contribué de prés ou de loin à la

réalisation de ce travail, qu’ils trouvent ici la traduction de

notre gratitude et de notre reconnaissance.

RemeRciement

[Génie Bio-Industriel]

Avant d’entamer notre rapport, nous tenons à exprimer notre

gratitude à toutes les personnes qui nous consacrés à leur temps et de

leur énergie afin de faciliter le déroulement de notre projet de fin

d’étude.

Nous tenons à remercier Mr. le Directeur de l’Ecole, ainsi que notre

chef de filière Mr.

Nous exprimons notre respectueux dévouements à notre encadrant à

l’école Mr., qui nous a encadré avec patience durant la réalisation de ce

travail de fin d'études.

Ainsi à Mr. de nous avoir autorisé d’effectuer notre projet dans le

laboratoire qu’il gère.

Nous adressons L’expression de notre haute reconnaissance à

Mr. au et à l’équipe du laboratoire qui n’ont épargné aucun effort

pour mettre à notre disposition la documentation et les explications

nécessaires.

Enfin, nos remerciements vont aux membres de notre Jury pour le

temps et l’attention qu’ils ont bien voulu nous consacrer.

SommaiRe

Remerciement.....................................................................................................................................2

Sommaire.............................................................................................................................................3

LISTE DES ABREVIATIONS ....................................................................................................................6

TBX : Gélose Tryptone Bile X-Glucuronide..........................................................................................6

Liste des tableaux ...............................................................................................................................7

Liste des figures...................................................................................................................................8

Introduction ........................................................................................................................................9

Problématique ..................................................................................................................................10

I. Présentation de l’office national de sécurité sanitaire des produits alimentaires (ONSSA)......12

i. La création de l’ONSSA............................................................................................................12

ii. L’organigramme et les ressources humaines.........................................................................12

II. Présentation du laboratoire régional des analyses et de recherches d’Agadir (LRARA)...........15

1. La création de LRARA ............................................................................................................15

2. Les attributions et missions ...................................................................................................15

iii. L’organigramme du laboratoire (LRARA) .............................................................................15

I. Généralité sur Escherichia coli....................................................................................................18

1. Historique...............................................................................................................................18

2. Taxonomie..............................................................................................................................18

II. Aperçu Sur Lben.........................................................................................................................29

1. Introduction ...........................................................................................................................29

2. Définition du Leben:..............................................................................................................29

iv. Composition du babeurre : ...................................................................................................30

v. Processus de fabrication : ......................................................................................................32


vi. Intérêt nutritionnel et hygiénique.........................................................................................34

vii. Contamination de « Leben » par E. coli................................................................................34

I. Matériels et méthodes................................................................................................................37

1. Matériels................................................................................................................................37

Incubateur, autoclave, balance de précision, broyeur homogénéisateur stomacher, hotte à

flux laminaire, pipettes jetables, tubes à essai, boîtes de Pétri, agitateur vortex, sachets stérile,

baguettes d’étanchéité ..................................................................................................................37

2. Méthodes...............................................................................................................................38

II. Résultats et discussion ..............................................................................................................44

1. Résultats.................................................................................................................................44

Soit en utilise des clés d’identification..........................................................................................47

Soit on utilise la fiche de lecture API20E......................................................................................47

Soit on utilise un catalogue API20E après avoir compléter une petite feuille API20E.................47

Soit on utilise un logiciel dans lequel on entre les résultats obtenus..........................................47

Avec le catalogue analytique : les tests sont regroupes en groupe de 3, et une valeur (1,2 ou 4)

est indiquée pour chacun. Additionner a l’intérieur de chaque groupe les nombres correspondants

aux tests positifs. On obtient un nombre à 7 chiffres qui sert de code d’identification ...................47

Comme ca, on a obtenu les résultats figurant dans la fiche suivante : .......................................51

2. Discussions.............................................................................................................................52

Conclusion :.......................................................................................................................................54

D’autre part, le Leben industriel est conforme à 100% : il est prêt à être consommer grâce à la

pasteurisation qu’il subit. Pour conclure, Nos choix alimentaires doivent consister sur des critères

sages et inoffensifs. Puisqu’on peut consommer les mêmes caractéristiques organoleptiques et

nutritionnelles, consommons donc cette boisson saine industrielle.....................................................54

Bibliographie......................................................................................................................................55

Annexes.............................................................................................................................................57


LiSte DeS aBReViationS

ADH : Arginine Dihydrolase.

Aw : Activité de l’eau.

CIT : Citrate.

°D : Dégréé Dornic.

E. coli : Escherichia coli.

EPT : Eau peptonée tamponnée.

GEL : Gélatinase.

H2S : Sulfure d'hydrogène.

LRARVA : laboratoire régional des analyses et de recherches vétérinaires d’Agadir.

LDC : La lysine décarboxylase.

MRS: La gélose de Man,Ragosa,Sharpe.

ODC : Ornithine Décarboxylase.

ONPG: L'orthonitrophényl-β-galactoside.

ONSSA : Office national de sécurité sanitaire des produits alimentaires.

pH: Potentiel d’hydrogène.

SHU : Syndrome Hémolytique et Urémique.

STEC : Shiga Toxine Escherichia Coli

TBX : Gélose Tryptone Bile X-Glucuronide.

TSA : Gélose Trypto-caséine soja.

UFC : unité formant colonie.

URE : Uréase.

VP : Reaction de Voges Proskaueur.


http://en.wikipedia.org/wiki/PH

LiSte DeS taBLeaux

Tableau 1 : Les personnels de l’ONSSA.............................................................................................15

Tableau 2 : Les caractéristiques biochimiques du Genre Escherichia...............................................20

Tableau 3 : Caractéristiques de croissance d’E. Coli O157:H7..........................................................26

Tableau 4: Résultats des études concernant la recherche des E. coli 0157 (1995-1999)

dans divers matrices alimentaires..........................................................................................................27

Tableau 5 : l'analyse physico-chmique classique du lben marocain.................................................30

Tableau 6: Valeurs nutritives pour Lebn...........................................................................................31

Tableau 7 : Tableau de lecture de la galerie API20E.........................................................................45


LiSte DeS figuReS

Figure 1 : L'organigramme de l’ONSSA à l’échelle national..............................................................14

Figure 2 : L'organigramme de LRARA................................................................................................16

Figure 3 : Morphologie et structure de la bactérie E. coli.................................................................20

Figure 4 : Les modes d'actions des grands pathovars de la bactérie Escherichia coli induisant des

diarrhées.................................................................................................................................................23

Figure 5 : Positionnement des EHEC au sein de l’espèce E. coli.......................................................25

Figure 6: Processus de fabrication traditionnel du Lben...................................................................29

Figure 7: Outre en peau de chèvre et Jarre en terre cuite pour la fermentation et le barattage du

.................................................................................................................................................................33

Figure 8 : Processus de fabrication traditionnel du Lben..................................................................34

Figure 9 : Diagramme causes – effets (5M), établir a la contamination du Leben à E. coli .............35

Figure 10 : première partie du protocole de recherche d’E. Coli......................................................39

Figure 11 : Deuxième partie du protocole de recherche d’E. Coli....................................................41

Figure 12 : L’ensemencement de la galerie API 20E.........................................................................43

Figure 13 : L’aspect de la galerie contenant E. Coli du 5eme échantillon après Incubation............46

Figure 14 : Fiche API20E d’E.coli de l’échantillon 5...........................................................................51


intRoDuction

La sécurité sanitaire des produits alimentaires est devenue l'une, sinon la première

préoccupation des consommateurs, particulièrement dans les pays industriels. C'est pour

cela, des stratégies sont élaborées visant à assurer cette sécurité, par la maitrise de l’hygiène

au cours de la chaine de production. Ces stratégies permettent aussi de réduire le taux des

intoxications alimentaires, notamment celles d'origine microbiologique.

Tout aliment peut provoquer des intoxications et les produits laitiers n’y font pas

exception. Les animaux producteurs de lait véhiculent des germes qui veut être pathogènes

ou offensives, est comme titre d'exemple Escherichia coli qui est recherché dans le cadre des

analyses obligatoire car elle peut être pathogène et elle peut nous amener à des

conséquences graves; Comme il peut être un indicateur de contamination fécale et possible

un index de présence des microorganismes pathogènes.

En outre, la composition des aliments à base de lait comme ‘’Leben’’, constituent un

milieu favorable au développement de micro-organismes pathogènes. Et l'un des effets les

mieux connus de ces bactéries contaminants nos aliments est la dégradation de la qualité

hygiénique et la qualité marchande du produit.

Dans ce cadre précis se situe l’objectif de notre étude où nous avons préalablement fixé

comme but, la recherche et l’identification d’Escherichia coli dans le babeurre traditionnel

appelé communément « Lben ». En Comparant ce dernier au Leben industriel.

Notre présente étude est répartie en deux volumes, dont le premier a été consacré à une

synthèse bibliographique relative à E. coli et au babeurre, tandis que le second a été réservé à

la partie expérimentale qui englobe le matériel utilisé et les méthodes suivies, ainsi que les

résultats qui seront par la suite discutés.


PRoBLématique

Suite à ses valeurs nutritionnels, le Lben est considéré l’une des boissons les plus

consommables au Maroc, soit le Lben traditionnel ou industriel.

Mais le consommateur n’est pas conscient que ce produit agréable donne un

milieu propice à la prolifération de microbes, comme E. coli, qui est recherchée dans le

cadre des analyses obligatoires pour l’autocontrôle dans le cadre d’une production

industriel qui respecte les règles d’hygiène .Car cette bactérie peut impliquer des

intoxications alimentaires mortelles.

Par conséquent, la problématique posée par notre étude peut être résumée par la

question suivante :

• Est ce que Escherichia coli existe dans le Lben étant industriel ou semi

industriel ?


PaRtie i :

PRéSentation De

L’étaBLiSSement

D’accueiL

PaRtie i :

PRéSentation De

L’étaBLiSSement

D’accueiL


I. Présentation de l’office national de sécurité sanitaire

des produits alimentaires (ONSSA)

i. La création de l’ONSSA

Le plan Maroc vert est une stratégie visant l'amélioration de la productivité et de la compétitivité

des produits agricoles et agro- alimentaires.

Parmi les objectifs tracés par cette stratégie :

• Améliorer la qualité des produits agricoles.

•Garantir la sécurité sanitaire des produits alimentaires tout au long de la chaine alimentaire.

• Améliorer la compétitivité des agricoles et agro-alimentaires.

• Consolider la confiance du consommateur dans la fiabilité du système d’inspection et de

contrôle des produits alimentaires.

Pour atteindre ces objectifs, la création de l’office national de sécurité sanitaire des produits

alimentaires (ONSSA) est venue en tant qu’outil de mise en œuvre du plan Maroc vert (lois25-08).

L’ONSSA est une structure d'encadrement, d'inspection et de certification qui permettra de

garantir d'une manière continue la salubrité et la qualité des produits alimentaires et la sécurité du

consommateur.

ii. L’organigramme et les ressources humaines

2.1. L’organigramme :

Le schéma ci-dessous représente l’organigramme de l’ONSSA.


2.2. Les ressources humaines :

Afin d’assurer les missions qui lui sont dévolues, l'ONSSA dispose dans l'ensemble de ses services aussi bien au niveau central, régional que provincial d'un capital humain réparti comme suit :


Catégorie Total

Ingénieurs 289

Médecins vétérinaires 291

Administrateurs et assimilés 83

Agent de maîtrise 926

Agents d'appui 654

Total 2243

Figure 1 : L'organigramme de l’ONSSA à l’échelle national.

Tableau 1 : Les personnels de l’ONSSA

II. Présentation du laboratoire régional des analyses et

de recherches d’Agadir (LRARA)

1. La création de LRARA

Le LRARVA a été crée en 1980 pour couvrir les besoins de la zone de sud du Maroc en matière

d'analyse et contrôle de qualité des produits agro-alimentaires, halieutiques et santé animale. Après

une période de formation du personnel et la mise en place des équipements, le laboratoire a

démarré ses activités techniques en 1985. En 2010 le LRARVA est converti à l’ONSSA(LRARA) . Il fait

partie des laboratoires régionaux qui s’occupent du diagnostic, d’analyses épidémiologiques et de

contrôle des denrées alimentaires animales et végétales.

2. Les attributions et missions

Les principales missions de LRARA sont :

• Contrôle et analyse des produits agro- alimentaire

• Le diagnostic des maladies animales,

• L’analyse des produits animaux et d’origine animale ainsi que l’alimentation du bétail,

• La réalisation d’enquêtes épidémiologiques,

• Le contrôle de l’utilisation des produits pharmaceutiques et biologiques vétérinaire.

iii. L’organigramme du laboratoire (LRARA)

Le laboratoire ONSSA est structuré en plusieurs directions et services qui suivent une

hiérarchisation présentée dans la figure suivante :



Figure 2 : L'organigramme de LRARA

PARTIE II :

ETudE

BIBlIogRAPhIquE

PARTIE II :

ETudE

BIBlIogRAPhIquE


I. Généralité sur Escherichia coli

1. Historique

E. coli ou "colibacille" est une bactérie intestinale des mammifères très commune chez l’Homme.

Découverte en 1885 par Théodore Escherichia, c’est un coliforme fécal généralement commensal,

non pathogène. Plus de 95 % des souches d’E. Coli ne sont pas dangereuses et nous en avons besoin

pour vivre.

Théodore Escherichia, en observant la fréquence des diarrhées néonatales chez l’Homme, avait

déjà posé la question de l’implication du colibacille dans les entérites. Après la seconde guerre

mondiale, les connaissances ont convergé pour établir le concept de virulence de certaines souches

d’E. Coli.

Dans les années 1950, de nombreuses souches d’E. Coli ont été incriminées en tant qu’agent

étiologique de diarrhées infantiles chez l’Homme et des diarrhées, gastro- entérites, infections

urinaires, méningites, septicémies, etc. chez l’animal.

2. Taxonomie

I.1. Les entérobactéries

Les entérobactéries sont une famille très hétérogène pour ce qui est de leur pathogénie et de leur

écologie. Les espèces qui composent cette famille sont en effet soit parasites (Shigella, Yersinia

pestis), soit commensales (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella sp), soit encore saprophytes

(Serratia sp, Enterobacter sp).

La famille des entérobactéries se définit par les caractères suivants :

• Bacilles à Gram négatif.

• Mobiles avec ciliature péritriche ou immobiles.

• Poussant sur milieux de culture ordinaires.

• Aérobies - anaérobies facultatifs.


• Fermentant le glucose avec ou sans production de gaz.

• Réduisant les nitrates en nitrites.

• Oxydase négatif.

Le genre Escherichia regroupe cinq espèces : E. blattae, E. coli, E. fergusonii, E. hermanii et

E. vulneris. Chaque espèce d’Escherichia possède des caractéristiques biochimiques particulières,

permettant de les différencier.

Escherichia coli fait partie de la microflore commensale intestinale de l’homme et de nombreux

animaux à sang chaud. Il représente près de 80% de la microflore intestinale. Pour cette raison

Escherichia coli est recherché dans les aliments comme indicateurs de contamination fécale ; sa

présence fournit ainsi une indication sur une éventuelle contamination de l’aliment par des bactéries

pathogènes d’origine intestinale (e.g.Salmonella thyphimurium, E. coli O157:H7…).

I.2. L’espèce Escherichia coli.

Escherichia coli est un coliforme fécal généralement commensal, non pathogène, vivant sur la

peau et les muqueuses sans nuire l’hôte qui l’héberge.

En outre, bien que la majorité des souches d’E. Coli soient commensales, certaines d’entre elles

sont associées à des pathologies intestinales ou extra-intestinales très diverses chez l’homme.

Comme la plupart des pathogènes des muqueuses, les souches d’E. Coli pathogènes utilisent une

stratégie d'infection dont les points clés sont la colonisation des muqueuses, éventuellement

l’invasion des cellules, la multiplication, l’évasion des défenses de l’hôte et les dommages à l’hôte.

La classification des colibacilles est la suivante :

• Règne : Procaryota• Domaine : Bacteria

• Phylum : Proteobacteria• Classe : Gammaproteobacteria

• Ordre : Enterobacteriales• Famille : Enterobacteriaceae

• Genre : Escherichia• Espèce : Escherichia coli


a. Caractéristique morphologique.

E. coli est un bacille, donc de forme cylindrique (bâtonnets), gram négatif, uniformément coloré,

non sporulé, de 2μm à 3μm de long sur 0.7μm de large. Il se présente soit seul ou groupé le plus

souvent par deux (diplobacilles), très rarement ils sont rencontrés en amas.

Ils sont mobiles grâce à une ciliature péritriche (Figure 4).

Figure 3 : Morphologie et structure de la bactérie E. coli

Source : http://reflexions.ulg.ac.be/cms/c_43025/escherichia-coli

b. Caractères biochimiques.

Tableau 2 : Les caractéristiques biochimiques du Genre Escherichia.


http://reflexions.ulg.ac.be/cms/c_43025/escherichia-coli%20

I.3. Classification d’Escherichia Coli pathogènes.

Il est important de rappeler qu’il n’existe pas de classification standardisée des souches

appartenant à l’espèce E. coli. Les scientifiques utilisent une classification basée sur la pathogénie des

syndromes diarrhéiques comprenant 5 groupes (Figure 5) :


Caractéristique Réaction

Méthyle +désaminase -

VP -

lactose +ONPG +

Mannitol +Uréase -

Indole +Citrate -

Acétoine -

H2S -

saccharose +salicine +

LDC +

Figure 4 : Les modes d'actions des grands pathovars de la bactérie Escherichia coli induisant des diarrhées.

• E. coli entérotoxigéniques (ETEC) :

Les ETEC sont une cause majeure de diarrhée aqueuse aiguë avec déshydratation chez les enfants

de bas âge (moins de 3 ans) dans les pays en voie de développement, et sont aussi responsables de la

« diarrhée des voyageurs » appelée aussi « turista ».

Des ETEC sont également une cause fréquente de diarrhées néonatales souvent fatales chez des

animaux d’élevage (veau, mouton, porcelet).


• E. coli entéroinvasives (EIEC) :

Les EIEC sont responsables de syndromes dysentériques caractérisés par une forte fièvre, des

crampes abdominales et des nausées, accompagnés d’une diarrhée aqueuse qui évolue rapidement

en une dysenterie.

Les EIEC Sont des caractères biochimiques, antigéniques, génétiques et fonctionnels très proches

de ceux des Shigella, et mettent en œuvre un mécanisme de pathogénicité similaire.

• E. coli Entéropathogènes (EPEC) :

Les EPEC sont responsables de diarrhées infantiles. Lors d’infections apparaissent des lésions

histopathologiques particulières, appelées lésions d’attachement et effacement (lésions A/E).

Ce phénotype est caractérisé par l’effacement des microvillosités intestinales et par l’adhérence

intime entre les bactéries et la membrane cytoplasmique des entérocytes.

• E. coli Entéroaggrégatifs (EAEC) :

Elles présentent un phénotype d’adhésion aux cellules Hep-2 proche de celui des EPEC mais

toutefois différent puisqu’il s’agit d’une adhérence non pas localisée mais diffuse.

En revanche, ces souches ne produisent aucune entérotoxine.

Les EAEC sont de plus en plus reconnus comme étant responsables de retards de croissance et de

diarrhées persistantes dans les pays en voie de développement ainsi que les pays industrialisés.

• E. coli Enterohémorragiques (EHEC) :

Ils sont à l’origine de troubles plus ou moins sévères allant d’une « simple » diarrhée peu

hémorragique à des colites hémorragiques, voire à un Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU)

chez l’enfant ou à un Purpura Thrombotique et Thrombocytopénique (PTT) chez l’adulte, pouvant

conduire parfois à la mort du patient.

La transmission à l'homme se fait avant tout par la consommation d'aliments (viande, légumes ou

fruits crus ainsi que produits à base de lait cru), ou d'eau de table contaminée et par le contact avec

de l'eau de baignade contaminée, mais aussi par contact direct avec des sécrétions corporelles

(excréments) provenant d'animaux ou d'humains infectés.

Parmi ces derniers, la souche E. coli O157 : H7, la plus fréquemment rencontrée dans les pathologies.


I.4. La souche d’Escherichia coli O157 : H7

Le sérotype O157:H7 d'E. Coli est une forme mutante qui a acquis une toxine extrêmement

puissante d'une autre bactérie : Shigella dysenteriae.

La classification d’E. Coli O157 :H7 la plus utilisée par les microbiologistes est fondée en grande partie

sur les travaux de Kauffman (1947) et se base sur la détermination :

•Du sérogroupe, identifié par rapport aux antigènes somatiques O.

•Du sérotype, identifié au sein du sérogroupe par rapport aux antigènes d’autres

structures présentes à la surface des bactéries. Il s’agit essentiellement des antigènes H du

flagelle (56 antigènes différents), cette variante est identifié par l’antigène numéro7.

Figure 5 : Positionnement des EHEC au sein de l’espèce E. coli .

I.5. Les sources d’Escherichia Coli O157 : H7

Ce n'est qu'à partir de 1982 que deux épidémies de colites hémorragiques dues à une infection a

E. coli O157:H7 aux Etas Unis dues à la consommation de hamburger qu'on a commencé a s'intéresse

aux E. coli O157:H.

Les Sources d’Escherichia Coli O157 : H7 sont avant tout les produits d'origine animale avec en

premier lieu les steaks haches de bœufs insuffisamment cuit, les produits laitiers, les ovo-produits

mais également les produits d'origine végétale (laitues, pomme de terre, concombre...)


Certains ruminants tels les bovins, les chevreuils, les chèvres et les moutons, sont naturellement

porteurs d’E. Coli O157:H7 dans leur organisme.

Toutefois, les bovins sont considérés, à l’échelle mondiale, comme les sources principales d’E. Coli

O157:H7. En effet, de nombreuses études ont démontré une présence fréquente d’E. Coli O157:H7

chez les bovins laitiers et le bétail de boucherie, et aussi le fait qu’on retrouve ce sérotype chez ces

animaux et dans leur entourage dans la plupart des pays du monde.

E. Coli O157:H7 n’est pas une cause de maladie pour les bovins, de sorte que la plupart des

agriculteurs ignorent si leurs animaux en sont porteurs ou non. Le pathogène vit dans le tractus

intestinal des animaux et contamine l’environnement par l’intermédiaire du fumier. C’est pourquoi le

bétail est considéré comme un réservoir et une source d’infection majeurs, même si différents

aliments (et sources d’eau) ont souvent un rôle à jouer dans les éclosions d’infections par E. coli chez

l’être humain.

Le tableau suivant présente les caractéristiques de croissance de la majeure partie des souches

d’E. coli O157:H7, le sérotype le plus étudié.

Tableau 3 : Caractéristiques de croissance d’ E. Coli O157:H7


Paramètre

Croissance

Optimum extrême

Température (°C) 40 (6 - 45,5)

pH (6 - 7) (4,4 – 9)

aw 0,995 0,95

NaCl (%) 0 8,5

• Lait et produit laitiers :

Les produits laitiers sont à l’ origine de différents foyers épidémiques à E. Coli O157:H7 dans le

monde depuis plusieurs années. La voie de contamination du lait actuellement retenue est celle de la

contamination à partir des matières fécales de bovins lors de la traite, même si certaines études

suggèrent l'existence possible d'une voie de contamination du lait avant la traite.

Depuis 1995, des plans de surveillance ont été mis en place par la Direction générale de

l’alimentation. Ils concernent principalement la recherche d’E. Coli O157:H7 dans des aliments

considérés comme sensibles, comme par exemple, les steaks hachés de bœuf ou les fromages au lait

cru. Dans ce contexte, les méthodes bactériologiques ont été utilisées pour la recherche et

l’identification de colonies d’E. Coli O157:H7.Les résultats de ces plans de surveillance et des

différents travaux publiés sont présentés dans le tableau suivant :

Tableau 4 : Résultats des études concernant la recherche des E. coli 0157 (1995-1999) dans divers matrices alimentaires.

Période

d’étude

Matrice

testes

Nombre

échantillo

n

Méthodes

utilisés

Résultats

obtenus

Juin 1995 Fromage au

lait cru

140 VIDAS Absence

Février à

avril 1997

Steaks hachée

réfrigère

90 VIDAS E.coli O157 :

H7

Février

1998

Fromage lait

cru (brebis,

chèvre, vache)

519 DYNAL ou

VIDAS

14 souches

E.coli O157 :

H7 (7 sans

facteurs de

virulence)


I.6. Interaction entre E. coli et les bactéries lactiques dans le

petit lait :

Les bactéries lactiques regroupent un ensemble d’espèces hétérogènes dont le trait commun est

la production d’acide lactique. Elles appartiennent à divers genres comme Bifidobacterium,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus,

Alloicoccus et Carnobacterium.

Elles interviennent dans l’industrie laitière et dans la fermentation de nombreux autres produits

alimentaires (saumurage des légumes, boulangerie, fabrication du vin…).Elles contribuent à la

texture, à la saveur des aliments et à la production de composés aromatiques.

Elles fermentent les glucides en acide lactique, d’où une diminution du pH favorable à la

conservation des aliments. Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d’une compétition pour les

substrats et, si les conditions de développement sont favorables ; de l’élaboration de bactériocines

comme la nisine.

a. L’activité antagoniste des bactéries lactiques.

L’effet inhibiteur des bactéries lactiques est du a plusieurs mécanismes :

• La production d'acides organiques (acide lactique, acétique), de peroxyde

d'hydrogène, et de bactériocines limitent le développement des entérobactéries.

• les souches peuvent inhiber l'implantation des germes pathogènes par

compétition.

• Ces probiotiques peuvent également produire des métabolites susceptibles de

neutraliser certains toxines bactériennes.

• Certaines souches ont la capacité de déconjuguer les sels biliaires qui sont alors

plus inhibiteurs sur le développement des bactéries pathogènes.


II. Aperçu Sur Lben

1. Introduction

La fermentation du lait est utilisée depuis très longtemps pour prolonger sa conservation. En fait,

toutes les populations humaines pratiquant l'élevage ont su développer des modes traditionnels de

fermentation du lait de leurs troupeaux (vaches ou autres), d'où une panoplie impressionnante de

produits laitiers fermentés, dont certains sont maintenant fabriqués industriellement.

En plus d'être plus faciles à conserver, ces produits sont également plus digestes que le lait d'origine et

leurs qualités organoleptiques sont très appréciés.

L'une des caractéristiques communes à toutes les transformations des produits laitiers, est la

coagulation du lait. Celle-ci provient d'une déstabilisation de la caséine, principale protéine du lait.

Elle peut être obtenue de deux manières: par acidification ou par action enzymatique (présure).

Cette coagulation donne lieu à la formation d'un gel qui peut être consommé directement (laits

fermentes) ou préalablement égoutté afin d'éliminer une partie de l'eau (fromages).

Figure 6 : Processus de fabrication traditionnel du Lben.

2. Définition du Leben:

Le Lben marocain est une boisson préparée par fermentation spontanée du lait cru jusqu'à

coagulation (ou bien par l’ajout des ferments sélectifs dans le processus industriel) , suivie d'un léger


mouillage, puis d'un barattage, permettant de recueillir une part plus ou moins importante de

matière grasse sous forme de beurre dit « beldi »

iv. Composition du babeurre :

3.1. Physico-chimique :

Lebn est une excellente source de riboflavine (Vitamine B2). Il est riche en acide lactique et

pauvre en gras. Il contient du zinc, de l'acide pantothénique, de la niacine ainsi que de la thiamine.

a. Extrait sec :

L’extrait sec ou la matière sèche du babeurre désigne tous ses constituants autres que l’eau. Il doit

être au moins égal à l’extrait sec d’un lait normal.

c. Matière grasse :

Le taux de matière grasse va dépendre du type de lait mis en œuvre pour préparer le babeurre

(leben). En d’autres termes, ce taux varie selon qu’on a utilisé du lait écrémé ou non.

Tableau 5 : l'analyse physico-chmique classique du lben marocain

d. Acidité du Lben :

Cette acidité résulte de la production d’acides organiques, en particulier d’acide lactique par les

bactéries lactiques. La quantité d’acide lactique libre contenue dans le lait fermenté ne doit pas être

supérieure à 0,8g pour 100g de lait fermenté lors de la vente au consommateur.


Tableau 6 : Valeurs nutritives pour Lebn


Composition Valeur nutritionnel en

1000g babeurre

pH 4.4

Acidité 75°D

Eau 908

Protéines, g 34,3

Matière grasse, g 5,78

-Saturés, g 3,60

-Mono-insaturés, g 1,67

-Polyinsaturés, g 0,22

-Cholestérol, mg 69

Glucides, g 49,0

Calcium, mg 1184

Potassium, mg 1592

Phosphore, mg 933

Sodium, mg 517

Magnésium, mg 110

3.2. Microbiologique :

L’évolution des germes du babeurre dépend de la contamination initiale. En effet sous l’action des

microorganismes, l’acidification du lait permettait une protection contre le développement de la

flore pathogène d’une part et l’amélioration de la qualité organoleptique d’autre part.

Il sera nécessaire d’avoir une connaissance de la fermentation lactique pour maîtriser les

bactéries responsables, car elles peuvent entraîner des effets indésirables aboutissant à l’altération

du produit ou le rendant impropre à la consommation.

Les streptocoques lactiques et les Leuconostoc sont les principaux groupes responsables de

l'acidification du lait au cours de sa transformation en Leben. Les espèces les plus importantes sont

Streptococcus lactis, S. diacetylactis, Leuconostoc lactis et L. cremoris. Les lactobacilles, très

faiblement représentés, ne semblent pas jouer un rôle important dans l'élaboration du Leben.

v. Processus de fabrication :

4.1. Le processus traditionnel :

Sa préparation, très simple, est demeurée au stade familial ou artisanal : le lait est abandonné à

lui-même dans une jarre en terre cuite ou une outre en peau de chèvre jusqu'à sa coagulation. Celle-

ci se fait à température ambiante et dure 24 à 48 h suivant la saison.

Le barattage qui lui succède est réalisé soit dans l'outre, qu'un manipulateur doit secouer

énergiquement avec les deux mains, soit dans une jarre, en utilisant un instrument constitué d'un

manche long portant à son extrémité inférieure deux disques en bois de diamètres différents.

Dans un cas comme dans l'autre, cette opération dure 30 à 40 min. A la fin du barattage, on

ajoute généralement un certain volume d'eau (environ 10 % du volume du lait), chaude ou froide,

suivant la température ambiante, de façon à ramener la température de l'ensemble à un niveau

convenable au rassemblement des grains de beurre. Celui-ci est récupéré, généralement à la main,

mais certains fabriquant filtrent le babeurre sur une toile, dans le but de recueillir le maximum de

beurre (beldi), produit de grande valeur marchande.


Figure 7 : Outre en peau de chèvre et Jarre en terre cuite pour la fermentation et le barattage du

Leben.

4.2. Le processus semi-industriel :

C’est une combinaison entre les deux processus : traditionnel et industriel Se base sur l’utilisation

des machines automatique pour le barattage avec une fermentation et coagulation spontanées, par

fois sur un barattage automatique en utilisant des ferments sélections

4.3. Le processus industriel :

En battant le beurre, la matière grasse s’agglomère en une masse compacte et se sépare du

babeurre liquide. Le beurre formé à partir de crème acidifiée par des bactéries lactiques donne du

babeurre acidulé. Si la crème douce est battue en beurre, on obtient du babeurre doux. Ce dernier

est acidifié a posteriori ou réutilisé pour fabriquer des denrées alimentaires. Dans le commerce, on

ne trouve presque que du babeurre acidulé. La pasteurisation permet d’accroître la durée de

conservation du produit. La date limite de consommation figure sur l’emballage.

La figure suivante montre le diagramme de fabrication du Leben Industriel (babeurre)


Figure 8 : Processus de fabrication traditionnel du Lben

vi. Intérêt nutritionnel et hygiénique

Les produits laitiers fermentés ajoutent leurs propriétés aux qualités nutritionnelles du lait utilisé,

il y a probablement un accroissement de la valeur biologique du lait suite à l’hydrolyse des glucides

de lait. En outre le Leben favorise un bon équilibre de la flore intestinale chez l’enfant à bas âge.

L’acidification résultante de l’action d’enzymes hydrolytiques, constitue un atout majeur en point

de vue hygiénique. En effet, elle prévient la croissance de la plupart des germes pathogènes et assure

par des moyens très simples, la conservation du lait.

vii. Contamination de « Leben » par E. coli

L'origine des contaminations par E. coli varie en fonction de la nature du produit et de son mode

de production et de transformation. La contamination du lait et des produits laitiers par les germes

pathogènes peut être d'origine endogène, et elle fait alors suite à une excrétion mammaire de

l'animal malade .Elle peut aussi être d'origine exogène, il s’agit alors d’un manque d'hygiène lors de la

traite du lait. Soit par un contact direct avec des troupeaux infectés, soit d'un apport de

l'environnement (eaux, personnel).

Le diagramme suivant donne les causes possibles de la contamination du babeurre par E. Coli :


Figure 9 : Diagramme causes – effets (5M), établir a la contamination du Leben à E. coli .


PARTIE III :

ETudE

ExPéRImEnTAlE

PARTIE III :

ETudE

ExPéRImEnTAlE


I. Matériels et méthodes.

1. Matériels.

I.1. Matériels de prélèvement.

Il est constitué d’une petite glacière contient trois outres de CO2 congelé pour le transport des

bouteilles des échantillons.

I.2. Matériels de dénombrement.

a. Matériels de laboratoire.

Incubateur, autoclave, balance de précision, broyeur homogénéisateur stomacher, hotte à flux

laminaire, pipettes jetables, tubes à essai, boîtes de Pétri, agitateur vortex, sachets stérile,

baguettes d’étanchéité

b. Matériels biologique.

Milieu TBX, milieu EPT.

I.3. Matériels de L’identification biochimique.

a. Matériels de laboratoire : incubateur pipette pasteur, bec bunsen, boites de pétri,

couvercle.

b. Matériels biologique : Milieu TSA, galerie Api, Eau distille stérile, Huile de paraffine.


2. Méthodes

2.1. Echantillonnage

Notre travail consiste à chercher E.Coli dans le babeurre traditionnel (crémeries) et industriel.

Pour ce fait, nous avons prélevé 7 échantillons comme il est détaillé dans le tableau suivant :

Echantillon Genre Zone/Marque

1

Semi-Industriel

Lbatoire

2 Dcheira

3 Inezgane

4 Ait Melloul

5 Tikiouine

6

Industriel

Silda

7 Jaouda

8 Central laitier

2.2. Dénombrement d’E. Coli.

a. Préparation de l’échantillon.

Dans des sachets stérile et sous la hotte on met 25,5 de

l’échantillon et après on ajoute l’EPT jusqu'à 255 ml.

Après on ferme les sachets par les baguettes et on les mets dans le

stomacher pour bien homogénéiser le mélange.

On utilise L’EPT pour la dilution et en même temps pour activer les

bactéries qui sont en stress.


25,5 de l’échantillon + 229,5 de EPT =255ml

On laisse le mélange dans la température ambiante pendant 30 min.

Les étapes de préparation de l’échantillon sont présentées dans la figure suivante :

Figure 10 : première partie du protocole de recherche d’E. Coli.

b. Préparation des dilutions et le collage des boites.

Après l’incubation on prend 1ml de l’échantillon et on ajoute 9 ml de

EPT (pour avoir la dilution 2)

on prend 1ml du tube de la dilution 2 en on ajoute 9ml(on répète la même chose

jusqu'à la dilution 4).


Echantillon 25,5ml Incubation pendant 30 min à 37°C.

Dilution 10-1

229,5ml (Vt=255 ml)

Première dilution.

EPT

Pour l’ensemencement en masse, on prend 5 boites de Pétris pour chaque

échantillon : une pour la solution mère (SM) et quartes pour les dilutions : 10-1,10-

2,10-3 et 10-4.

Après le marquage des boites, on verse 1 ml de chaque tube des dilutions

et de chaque solution mère ; dans chaque boite correspondante.

On ajoute une quantité du milieu TBX.

Toutes ces manipulations sont faites dans une hotte à flux laminaire.

Après solidification et refroidissement des boites, on les met s’incuber

dans l’étuve à température 44°C pendant 24 heures.

Les étapes de dénombrement sont présentées dans la figure suivante :


1ml 1ml 1ml

Dilution 10-1

d 10-2 d 10-3 d 10-4

1ml 1ml 1ml 1ml

d 10-1 d 10-2 d 10-3 d 10-4

1ml

Gélose TBX (solution mère)

(Incubation pendant 24h a 44°C)

Figure 11 : Deuxième partie du protocole de recherche d’E. Coli.


2.3. Identification Par Galerie API.

a. Ensemencement de la douche test :

• On prend une colonie de la boite TBX dilution 10-4, car les colonies sont très claires et

peu nombreux.

• On fait l’isolement par stries, dans une boite de la gélose TSA.

• Apres On Incube la boite à 44°C pendant 24h.

• Apres Incubation, On préparé 5ml d’un tube d’eau distillée stérile.

• On prélève une colonie bien isolée sur le milieu TSA.

• En fin, on réalise une suspension bactérienne en homogénéisant soigneusement les

bactéries dans le milieu.

b. Préparation de la galerie.

• On met de l’eau distillée sur le fond de la boîte (partie alvéolée), toutes les alvéoles

doivent être remplies, en éliminant l’excès d’eau en renversant la boîte au dessus

de l’évier.

• Placer la galerie sur le fond de la boîte elle doit être manipulée avec la pince.

• Recouvrir la boîte avec son couvercle.

• Inscrire nom, référence souche, date et température d’incubation sur la languette

latérale de la boîte.

c. Inoculation de la galerie

• On Introduit la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette

Pasteur stérile, pointe en appuyant à l’intérieur et sur le côté pour éviter la

formation de bulles.et on distingue 3 types de remplissage:


Pour les tubes qui sont marqués par des caractères ni soulignés, ni

encadrés. On Remplit seulement le tubule.

Pour ceux qui ont marques par caractères soulignés. On Remplit

seulement le tubule et on le fermer avec 3 gouttes d’huile de paraffine

(ADH, LDC, ODC, H2S, URE).

Enfin pour les tubes qui sont marqués par des caractères encadrés. On

Remplit le tubule et La cupule (CIT, VP, GEL).

• On refermer la boîte d’incubation et on la place dans l’étuve à 37° C pendant 24

heures.

Les figures suivantes démontrent le mode de remplissage des tubes, les parties de ces derniers et

l’aspect de la galerie après remplissage.

Figure 12 : L’ensemencement de la galerie API 20E.


II. Résultats et discussion

1. Résultats.

1.1. Dénombrement d’E. Coli.

La formule pour l’expression des résultats est la suivante :

ΣC

N =

V (n1 + 0,1 n2) d

N : Nombre de germes /ml

ΣC: Somme des colonies comptées sur toutes les boîtes retenues de deux dilutions successives

V : volume de l’inoculum appliqué à chaque boîte (en ml)

n1 : Nombre de boîtes retenues à la première dilution

n2 : Nombre de boîtes retenues à la deuxième dilution

d : Taux de dilution de la première boîte retenue.

Donc, les résultats finaux seront comme suite :

Echantillons Nombre d’UFC par ml

1 9.105

2 9.104

3 6.104

4 9.102

5 4.105

6 <1

7 <1


8 <1

1.2. Résultats de L’ensemencement de la galerie.

a. La lecture des résultats :

La détermination de la positivité et la négativité de chaque test consiste sur une lecture ; soit

directe (sans ajouter aucun réactif) soit indirecte (en ajoutant des réactifs spécifiques ) .

La lecture est faite en se basant sur le tableau ci-dessous :

Tableau 7 : Tableau de lecture de la galerie API20E.

b. Interprétation des résultats :


• Détermination du profil numérique :

Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1, 2 ou 4 est

indiquée pour chacun. En additionnant à l'intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des

réactions positives, on obtient 7 chiffres ; la réaction de l'oxydase qui constitue le 21° test est

affectée de la valeur 4 lorsqu'elle est positive.

Les figures suivantes représentent l’aspect final de 2 galeries Api 20 E : l’une montre le résultat

d’ensemencement d’une colonie bien isolée d’une souche pure du 5eme échantillon (Leben traditionnel

de Tikiouine), et l’autre montre le résultat d’ensemencement d’une souche de stéréotype E. Coli

O 157 H : 7.

Figure 13 : L’aspect de la galerie contenant E. Coli du 5 eme échantillon après Incubation.

• Identification.

Il existe plusieurs moyes d’arriver a l’identification d’une souche :


• Soit en utilise des clés d’identification.

• Soit on utilise la fiche de lecture API20E.

• Soit on utilise un catalogue API20E après avoir compléter une petite feuille API20E.

• Soit on utilise un logiciel dans lequel on entre les résultats obtenus.

Avec le catalogue analytique : les tests sont regroupes en groupe de 3, et une valeur (1,2 ou 4)

est indiquée pour chacun. Additionner a l’intérieur de chaque groupe les nombres

correspondants aux tests positifs. On obtient un nombre à 7 chiffres qui sert de code

d’identification .


Comme ca, on a obtenu les résultats figurant dans la fiche suivante :

Figure 14 : Fiche API20E d’E.coli de l’échantillon 5.


2. Discussions.

II.1. Dénombrement

a. Le babeurre traditionnel.

Tous les échantillons ont été contaminés par E. coli, avec des teneurs variant entre 9.102 et 4.104

UFC /ml. Nous notons que l’échantillon 5 est de loin le plus contaminé. Ce micro-organisme est un

témoin de contamination fécale. Et Ce nombre élevé de coliforme s’explique par le fait que les

conditions d’hygiènes ou de stockage qui sont mauvaises et surtout que le leben ne subit aucun

traitement thermique.

b. Le babeurre industriel.

Tous les échantillons ont été sains et exempts d’E. Coli. Ceci témoigne une bonne hygiène des

manipulations. Ainsi que la pasteurisation qui joue un grand rôle dans l’élimination des germes

pathogènes et d’altération y compris E. Coli qui ce mène a la conservation du Leben.

c. Comparaison entre les résultats des

dénombrements.

Les analyses du leben traditionnel montrent que tous les échantillons sont contaminés par E. Coli

à un nombre supérieur au critère qui est de m= 0 dans Lebn. Par contre, les résultats du leben

industriel sont conformes avec la norme.

Pour conclure, Le Leben traditionnel reste non satisfaisant malgré la fermentation à cause de

mauvaises conditions d’hygiène, l’absence de pasteurisation et surtout par le fait que E. Coli sont des

pseudo-lactiques. Ils sont capables de prendre la place des lactobacilles et orienter la fermentation

lorsqu’ils sont initialement nombreux.

II.2. Identification biochimique.

D’après le résultat du test d’E. Coli O157H :7, ce stéréotype n’est pas capable de fermenter le

sorbitol et le saccharose, ce qui le caractérise des autres types d’E. Coli .Outre E. Coli O157 H : 7 se

comporte comme les entérobactéries pathogènes, shigella et salmonella qui ne peuvent pas

fermenter aussi les deux substances mentionnés ci-dessus.


A partir de l’autre test d’E. Coli, on constate que la bactérie isolée du Leben traditionnel fermente

le sorbitol et le saccharose, ce qui implique qu’il ne s’agit pas d’une E. Coli O157 H : 7.

On peut donc conclure que le type d’E.coli trouvé dans l’échantillon, est un type commensal ou un

pathogène opportuniste, qui peut causer des symptômes banals.

Malgré que cette E. Coli soit inoffensive, elle reste un indicateur de contamination fécale et

probablement indicateur d’existence d’autres germes pathogènes.

Pour ce fait, il est obligatoire en suivant les normes ; de rejeter ces produits pour prévenir tous

risques d’infection.


ConClusion :Le Lben marocain est un lait fermenté utilisé surtout comme boisson rafraîchissante

et apprécié pour ses qualités organoleptiques (acidité, arôme ...), mais sa valeur

nutritionnelle est loin d'être négligeable. En effet, Il serait également salutaire de fixer

des normes microbiologiques afin d'assurer au consommateur une qualité suffisante

aux plans nutritionnel, organoleptique et hygiénique.

L’objectif de cette étude était tout d’abord de rechercher E. coli dans Lben et de

l’identifier d’après, notre méthodologie nous a mené à des résultats qui nous ont guidé

à déclencher l’alarme de prévention au consommateur, il ne s’agit non seulement d’un

gout appréciable du produit, mais il s’agit plutôt d’une denrée alimentaire saine,

exempte de germes soient pathogènes ou indicateur d’un manque d’hygiène durant sa

fabrication.

En guise de conclusion, E. Coli trouvée dans le leben traditionnel est un indicateur de

contamination du produit pendant sa fabrication, se qui signifie que la fabrication

manque d’hygiène .C’est pour cela qu’il est déconseiller de boire le Leben traditionnel

d’origine inconnu.

D’autre part, le Leben industriel est conforme à 100% : il est prêt à être consommer

grâce à la pasteurisation qu’il subit. Pour conclure, Nos choix alimentaires

doivent consister sur des critères sages et inoffensifs. Puisqu’on peut

consommer les mêmes caractéristiques organoleptiques et nutritionnelles,

consommons donc cette boisson saine industrielle.


BiBliographie.• Analyse microbiologique dans les industries agroalimentaires.- Paris : Edition de l’usine

nouvelle.-239p.

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http://www.onssa.gov.ma/onssa/index.html

http://www.bio-top.net/Microbio/TP/Api.htm

http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/escherichiacoli_g.htm

annexes

Annexe 1 : La gélose TSALa gélose Trypto-caséine

soja (TSA) est un milieu universel

convenant pour un large éventail

d'emplois. Du fait de son excellente

nutritivité, elle peut être utilisée,

d'une part pour les culture et

isolement des bactéries aérobies et

anaérobies, d'autre part pour favoriser la croissance des germes particulièrement

exigeants.


Annexe 2 : La gélose TBX.

La gélose TBX est un milieu sélectif destiné au

dénombrement des Escherichia coli β-D-glucuronidase

positive dans les produits alimentaires. Le résultat est

obtenu directement par comptage des colonies

caractéristiques après seulement 24 heures d'incubation,

sans qu'il soit nécessaire de pratiquer une étape de

confirmation.

En 1949, Buehler et al. furent les premiers à relever la

présence d'une β-D-glucuronidase chez Escherichia coli.

Depuis cette époque, la plupart des études ont montré que 94 à 97% des Escherichia coli d'origine

humaine ou issues de l'environnement possèdent cette activité enzymatique. Cette dernière a été

également détectée chez les Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella et Yersinia,

mais sa présence ne concerne qu'un nombre réduit de souches dans chacune des espèces citées. La β-

D-glucuronidase peut donc être considérée comme un indicateur valable pour la détection

d'Escherichia coli dans les produits alimentaires et dans les eaux. En 1990, Restaino a utilisé avec

succès un nouveau substrat chromogène : le BCIG. Une fois incorporé dans une gélose au tergitol,

cette dernière permettait d'effectuer la numération en 24 heures des Escherichia coli présents dans

les produits carnés. La gélose TBX ne contient pas de tergitol, ce dernier composé étant remplacé par

des sels biliaires qui assurent des propriétés sélectives similaires.


Annexe 3 : Résultat du comptage des colonies d’E. Coli (colonies

vertes) obtenus après 24h incubation ; donne les résultats suivants :

SM Dilution

10-1

Dilution

10-2

Dilution

10-3

Dilution

10-4

1 >300 >300 >300 101 19

2 >300 >300 107 25 2

3 >300 >300 70 7 1

4 >300 107 20 3 1

5 >300 >300 >300 188 49

6 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

107 : exemple de nombre de colonies gardé qui varie entre 30 <N< 300


Annexe 4 : Critères microbiologique des produits laitiers.


PFE : Recherche et identification d’Escherichia coli dans Leben marocain

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