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Génétique bactérienne et implications enbactériologie médicale
• Génétique: Etude de l ’hérédité et des variations
- Variations phénotypiques(propriétés observables, comportement de la bactérie, réversibles etnon transmissibles)
- Variations génotypiques(ensemble des déterminants génétiques d ’une cellule,séquence nucléotidique, irréversibles et transmissibles)
CENTRE
HOSPITALIER
UNIVERSITAIR E
BICÊTRE
Première résistance
Evolution de la résistance aux antibiotiques
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A. baumannii et la médiatisation
Décembre 2003
La médiatisation
«« EvolutionEvolution » » bactérienne aux antibiotiques bactérienne aux antibiotiques
AntibiotiquesAntibiotiques
MortMort
SurvieSurvieAcquisition de gèneAcquisition de gèneéchange de matérieléchange de matérielgénétiquegénétiqueMutationMutation
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Evolution de la résistance acquise auxEvolution de la résistance acquise auxantibiotiquesantibiotiques
Modification qualitative du génome bactérien• Mutations
Modification quantitative du gènome bactérien• Transfert d ’information génétique
Modifications quantitative et qualitative du génome bactérien• Mutation dans un gène transféré
Les mutationsLes mutations
Définition: C’est un changement, spontané (ou provoqué par un agentmutagène, héréditaire, brusque, rare, indépendant et affecte laséquence nucléotidique (génome bactérien)
Caractère des mutations: Spontanéité: lié au hasard, besoin de moyen sélectif
100ml culture diluée d’E. coli
50ml culture 16h 50 tubes de 1 ml culture 16h
109 bactéries
109 bactériesGélose contenantde la Streptomycine
Distribution aléatoireNombre constant de colonies Mutation non induite
Test de fluctuation de Luria et Delbrück, 1943
Les mutationsLes mutations
Discontinuité: Une seule étape: loi du tout ou rien(parfois il faut plusieurs mutations successives pour voir l’expressionphénotypique des mutations. Ex: R aux fluoroquinolones (ciprofloxacine)
Stabilité: Transmission à la descendance (possibilité de réversion)
Rareté: fréquences faibles 10-6-10-9
Indépendance: un seul caractère affecté (si opéron ou gènerégulateur => mutation pléiotrope).
La mutation d’un caractère ne modifie pas laprobabilité de mutation d’un autre caractère
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La mutation à l’échelle moléculaire => Changement de la séquence nucléotidique
• Mutations par substitution de base (mutations ponctuelles)- Transition: A-T --> G-C- Inversion: A-T --> T-A- Addition: ATCG --> ATGCG- Délétion: ATGCG--> ATCG
Les mutations ponctuelles sont réversibles et peuvent être:- Silencieuses (ex: TCT (ser) --> TCC (ser))- Létales (ex: TGC (cys) --> TGA (stop))- Intermédiaires (ex: CTT (leu) --> ATT (ile)
•Mutations par cassure des liaisons sucre-phosphateCe type de mutation affecte une séquence de bases, est souvent létale etnon réversible.
Délétion (perte de plusieurs bases)Insertions (gain de plusieurs bases)Inversions (rare)
La famille des La famille des TEMsTEMs: mutations: mutations
Bradford, Clin. Microbiol.Rev. 2001, 14; 933-51
Les transferts dLes transferts d’’informationinformationgénétiquegénétique
• Transduction et Conversion vecteur : phage spectre d’hôte : intra-espèce efficacité : importante distribution : ubiquitaire
• Transformation vecteur : ADN spectre d’hôte : intra- ou inter-espèce efficacité : importante distribution : restreinte
• Conjugaison vecteur : plasmide spectre d’hôte : inter-espèce efficacité : variable distribution : ubiquitaire
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La transformation
Définition: Transfert passif dans une cellule bactérienne d'ADN nu.
On distingue:- Transformation naturelle: exige état de compétence- Transformation artificielle: traitement chimique et/ou
enzymatique de la paroi bactérienne
Mise en évidence de la transformation naturelle chez le pneumocoque.
- 1928 GRIFFITH- 1948 AVERY : le principe transformant = l'ADN.
Expérience de Griffith
+
injectionPneumocoques du typeS3 vivants
Pneumocoques du typeS3 tués
Pneumocoques du typeS3 tués
Pneumocoques du typeR vivants
Pneumocoques du typeR vivants
Septicémie mortelle
Septicémie mortelle
Survie
Survie
Expérience de Avery
+Pneumocoques du typeS3 tués
Pneumocoques du typeR vivants Septicémie mortelle
+
ADNPneumocoque du typeS3
Pneumocoques du typeR vivants Septicémie mortelle
+Pneumocoques du typeR vivants
+
ADNPneumocoque du typeS3
DNaseSurvie
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DO
t1 2 3 4
S. pneumoniaeS. sanguis
B. subtilis,H. influenzae
N. gonorrhoeae
Les bactéries naturellement transformables :ETAT DE COMPÉTENCE
Etat où la bactérie est capable derecevoir de l'ADN exogène.
Sous tendu par des mécanismesdifférents en fonction des espèces.
44 espèces dont;44 espèces dont;StreptococcusStreptococcusEnterococcusEnterococcusStaphylococcusStaphylococcusEnterobacteriaceaeEnterobacteriaceaePseudomonasPseudomonasAcinetobacterAcinetobacterHaemophilusHaemophilusNeisseriaNeisseria
"Transformasome"
Binding
Fragmentation Ds cleavage : B. subtilis S. pneumoniae
Uptake3' : B. subtilis : S. pneumoniae
Les bactéries naturellement transformables :Principales étapes
a. L'ADN : bicaténaire PM > 106 à 107 Mégadaltons origine variable
b. 1ère étape :Fixation covalente à uncomplexe protéique membranaire : le"Transformasome"
c. 2ème étape : Fragmentation de l'ADN(nucléases)
d. 3ème étape : Entrée de l'ADN simplebrin dans la bactérie
e. 4ème étape : Devenir de l'ADN simplebrin transformant dans la bactérie.
Devenir de l'information génétique échangéeDevenir de l'information génétique échangéepar transformation naturellepar transformation naturelle
Processus de transformation durable : nécessité de larges homologiesentre l'ADN exogène et endogène
En règle générale : l'ADN provient de la même espèce bactérienne ou d'uneespèce bactérienne proche
Sur le plan génétique : la transformation correspond à un remplacementallélique
Le résultat : mutations ponctuelles, délétions, insertionsvariation antigénique chez le gonocoquerésistance aux pénicillines et sulfamides chez les Neisseriarésistance aux pénicillines chez le pneumocoque
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Délétion
X X
X X
Insertion
X X
Remplacement
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La transformation artificielleLa transformation artificielle
Principe : rendre les bactéries compétentes(aptes à recevoir de l'ADN).
Importance en génie génétique.
Traitement à froid par des solutions contenant des cationsdivalents (Chlorure de calcium).
E. coli est alors transformable.
L'ADN rentre sous forme double brin et le reste.
Efficace que si l'ADN est capable de réplication autonome(réplicon).
La transduction et la conversion La transduction et la conversion lysogéniquelysogénique
Définition : Transfert d'ADN bactérien d'une bactérie à uneautre par l'intermédiaire d'un bactériophage.
Bactériophages : Transducteurs
Particules transductrices : les particules phagiques qui contiennentde l'ADN bactérien.
Processus essentiellement intra spécifique
Plusieurs types de transductions
1. La transduction généralisée2. La transduction spécialisée.3. La transduction abortive4. La conversion lysogénique
ASSEMBLAGE MULTIPLICATION
LIBÉRATION
PÉNÉTRATION
Cycle de multiplication d'un bactériophageCycle de multiplication d'un bactériophagevirulentvirulent
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La transduction généraliséeLa transduction généralisée Transfert qui concerne n'importe quelle partie du génome bactérien
Infection d ’une bactérie A B
a b c
Injection
a b cA B
Recombinaison
A B c
Transducteurs : Des phages à ADNT4 et P1 chez E. coliP22 chez Salmonella typhimurium
Mécanisme de la transduction généralisée :* Fragmentation du génome bactérien au cours de laréplication virale (nucléases virales ou non spécifiques).
* 1/100 particules encapside de l'ADN bactérien.
* Formation de particules transductrices infectieuses capabled'injecter l'ADN bactérien dans une autre cellule.
* Devenir de l'ADN transduit: remplacement allélique outransfert de plasmides.
Mécanisme de la transduction abortive :Les gènes transférés ne sont pas intégrés dans le chromosome(perte de l ’information génétique au cours des divisionscellulaires)
Infection d ’une bactérie a b
La transduction spécialisée Transfert qui ne concerne qu'une ou des régions bien particulières du
génome bactérien.
Repose sur les propriétés d'intégration et d'excision de certainsbactériophages tempérés comme λ.
Le bactériophage λ ne transfert que :
• Les gènes nécessaires à la fermentation du galactose• ou à la synthèse de la biotine.
Par excision aberrante deux types de particules transductrices: λgal et λ bio.
λgal : perte de l'information génétique nécessaire à la synthèse de la queue + la tête(particule défectueuse).
λbio : perte de gènes xis et int, plus de cycle lysogénique mais potentiel infectieuxnormal.
La transduction a un potentiel limité aux espècesLa transduction a un potentiel limité aux espècestrès proches, mais c'est un processus extrêmementtrès proches, mais c'est un processus extrêmement
efficace :efficace :
Efficacité : - liée, dans un certain nombre de cas, à la protection du DNA dans les particules virales- système de délivrance très performant- les phages sont très abondants, en milieu aquatique on trouve entre 103 et 108 phages / ml.
=> 108 phages / ml ≈ 1/3 populationbactérienne sujette à une attaque virale / 24 h.
Cependant, peu d'évidence quand à l'importance réelle de ce phénomènedans l'acquisition de nouvelles fonctions
- mécanisme impliqué pour l’acquisition de la toxine erythrogène et la variationantigénique chez les Streptocoques de groupe A
Toutefois, bon nombre des «ilots de pathogénicité» des bactéries sont enfait hébergés par des prophages intégrés dans les chromosomesbactériens: c ’est la conversion lysogénique
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La Conversion La Conversion lysogéniquelysogénique Certains bactériophages portent dans leur génome
les nouveaux caractères apportés.
Protein Gene Bactériophage BactérieGènes de Résistancemethicillin-R mecA Staphylococcus spp,erythromycin-R erm S. epidermidis,….
Toxines extracellulairesDiphtérique tox beta-phage Corynebacterium diphteriaeNeurotoxin C1 phage C1 Clostridium botulinumShiga toxins stx1-stx2 H-19B Escherichia coli (EHEC)Enterohemolysin hly2 PhiFC3208 E. coli (EPEC)Enterotoxine sea, b,…, m - Staphylococcus aureusExfoliative toxine A eta phiETA S. aureusToxine A, C, I, … speA, C, I - Streptococcus pyogenesCholérique ctxAB CTX-phi Vibrio cholerae……
Protéines modifiant l ’antigénicité
Protéines impliquées dans l ’invasion
Protéines impliquées dans l ’adhésion
Protéines impliquées dans la survie intracellulaire
Etc….
La conjugaisonLa conjugaison
Définition : Processus spécialisé qui implique un transfert unidirectionneld’ADN d’une cellule donatrice à une cellule réceptrice, par un mécanismerequérant un contact spécifique.
Deux classes de véhicules : - plasmides- transposons
On observe souvent une synergie entre les véhicules, en particulier destransposons portés par des plasmides.
Limites :- pour les plasmides, réplication et expression des fonctions de transfert.- pour les transposons, expression des fonctions de transfert.
De façon générale, le transfert et l’expression des fonctions de transfert sonttrès finement régulées, vraisemblablement pour limiter la charge biosynthétiqueliée à ce processus.
Mise Mise en en évidenceévidence: : Exp. de Exp. de Lederberg Lederberg et Tatum (1946)et Tatum (1946)
A B
T-, L-, M+, B+ T+, L+, M-, B-
Après quelques heures de contact
T+, L+, M+, B+
- Traitement à la DNase =>Pas d’effet
- Expérience du tube en U
A B
Filtre en verre poreux
Pas de recombinaison= > Besoin de contact
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Le plasmide FLe plasmide F
ADN circulaire double brin
Se réplique chez E. coli et Salmonella typhimurium
Habituellement en situation extrachromosomiqueles bactéries males F+
Parfois en situation intrachromosomiqueles bactéries Hfr
Transfert des bactéries F+ : seul F est transféré toutes lesbactéries deviennent F+.
Transfert bactéries Hfr : transfert de l’ADNchromosomique, le facteur étant transféré en dernier.
+Donor cells
Active disaggregation(traS, traT)Recircularization
DNA transfer
Donor conjugalDNA synthesis
Stable mating pair
Stabilization (traG, traN)
Unstablepair mating
Pilusretraction
Triggering ofconjugal DNAmetabolism
+
+ Recipient cell
Nicking andligation at oriT
Donor cell
Pilus binding
Résistance aux antibiotiques etRésistance aux antibiotiques etdéterminisme génétiquedéterminisme génétique
++
Mutation chromosoique Plasmidique
Déterminisme génétique
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Mutation et transfert de plasmidesMutation et transfert de plasmides
E. E. colicoli CAZ CAZ
CTX-M-18CTX-M-18
E. E. colicoli
K. K. pneumoniaepneumoniae
QuinolonesQuinolones
K. K. pneumoniaepneumoniae--
Quinolones Quinolones RR
CTX-M-19CTX-M-19
CTX-M-19CTX-M-19
CTX-M-19CTX-M-19
(Poirel et al., AAC, 2001, 45:3355)
E. E. colicoli (CTX-M-18)(CTX-M-18) K. K. pneumoniaepneumoniae (CTX-M-19)(CTX-M-19)
Mutation et transfert de plasmidesMutation et transfert de plasmides
Systèmes de transfert Systèmes de transfert conjugatif conjugatif à largeà largespectre d'hôtespectre d'hôte
• Gram-négatif
– Plasmides IncP (RP4, RK2, etc)• Bacilles et coques à Gram-négatif (Tra+, Rep+)• Bacilles et coques à Gram-positif bas GC% (Tra+, Rep-)• Sacharomyces cerevisiae (Tra+, Rep-)
– Plasmide IncQ (RSF1010)• Bacilles et coques à Gram-négatif (Mob+, Rep-+)• Bacilles à Gram-positif haut GC% (Mob+, Rep+)
– Plasmide Ti• Plantes (Tra+, Int+)
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Systèmes de transfert Systèmes de transfert conjugatif conjugatif à largeà largespectre dspectre d’’hôtehôte
•Gram-positif à bas GC% pAMß1/pIP501 (ermB)
− Bacilles et coques à Gram-positif (bas GC%)• Tra+, Rep+
− Entérobactéries• Tra+, Rep-
Tn916/Tn 1545 (aphA-3, ermB, tetM)− Bacilles et coques à Gram-positif (bas GC%)
• Tra+, Int+
− Entérobactéries et Pseudomonas fluorescens• Tra+, Int+
Véhicules du transfert génétique : les plasmidesVéhicules du transfert génétique : les plasmides
Classification- Les séquences d'insertion et les transposons
composites
- La famille Tn3
- Les transposons conjugatifs.
La transpositionLa transposition
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IRLIRL IRRIRR
mARNmARN
TransposaseTransposase
ATGCAATGCATACGTTACGT
ATGCAATGCATACGTTACGT
ATGCAATGCATACGTTACGT
Target siteTarget site
ISIS
genegene
ISIS
Séquence d'insertion (Séquence d'insertion (ISsISs))
IS : séquence d'insertionIR : séquence inversée répétéetnp : transposase
Eléments transposables les plus simples, très répanduschez les bacéries à Gram négatif et à Gram positif.Plusieurs copies intégrées dans le chromosome ou dansun plasmide.
tnp
Genetic Genetic support of support of blaSHV genes blaSHV genes ((originatingoriginatingfrom Klebsiella pneumoniaefrom Klebsiella pneumoniae))
Naas Naas et alet al., AAC 1999., AAC 1999
Mobilisation of Mobilisation of resistance genesresistance genes: Composite: Compositetransposonstransposons
ATGCATACGT
ATGCATACGTISACGGA
TGCCT
Target siteTarget site
IS
Resistance geneResistance gene
ATGCATACGT
ATGCATACGTISIS ACGGA
TGCCTACGGATGCCT
ATGCATACGT
ATGCATACGT
ISIS
Resistance geneResistance gene
ACGGATGCCT
ACGGATGCCT
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tnp
IR IRIS
tnp
IR IRIS
Transposons compositesTransposons composites
IS : séquence d'insertionIR : séquence inversée répétéetnp : transposaseFragment d'ADN : gènes de virulence, gènes métabolique
gènes de résistanceTrès nombreux chez les bactéries à Gram négatif :
. Tn5 (5,7 kb, KmR)
. Tn9 (2,6 kb, CmR)
. Tn10 (9,3 kb, TcR)
•• AminoglycosidesAminoglycosides•• ßß-lactamines-lactamines•• TriméthoprimeTriméthoprime•• Macrolides Macrolides•• CyclinesCyclines•• ChloramphenicolChloramphenicol•• GlycopeptidesGlycopeptides•• Sulfamides Sulfamides•• Rifampicine Rifampicine
Bacterial species Bacterial species :: Gram (+), Gram (-)Gram (+), Gram (-)
tnpA tnpR bla
SRIIR IR
Transposons de type Tn3Transposons de type Tn3
IR : séquence inversée répétée tnpA : gène codant pour la transposase
tnpR : gène codant pour la résolvase SRI : site de résolution interne
bla : gène de résistance aux ß-lactamines
Très nombreux chez les bactéries :
- à Gram négatif . Tn3 (4.9 kb, Ap). Tn4 (20 kb, Ap, Sm, Su). Tn1721 (10 kb,Tc)
- à Gram positif . Tn551 (5.3 kb, Em). Tn917 (5.2 kb, Em)
Les systèmes de capture de gènes: lesLes systèmes de capture de gènes: lesintégrons (1)intégrons (1)
intI1
attI
sul1qacE∆
resistance gene cassette (R gene)
integrase
Int
3'- conserved segment
attC
antP
antP
attIintI1 sul1qacE∆R gene attC
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Structure of veb1 containing Structure of veb1 containing integronsintegrons
intI1 cmlA-likearr2aadBveb1IS1999 P. aeruginosa pTh2
intI1In50qacEΔ1
aadBveb1
IRi
sul1 orf5IS1999 IS2000P. aeruginosa JES
intI1In55 oxa10 aadA1qacEΔ1
cmlA5arr2aadBveb1aacA1/orfGqacH aadB
IRi
sul1 orf5
P. mirabilis Lil-1
In53 oxa10 aadA1qacEΔ1
cmlA5arr2aadBveb1aacA1/orfGqacH aadBsul1 orf5IS26 IS26
E. coli MG-1
intI1 qacEΔ1aadBveb1 sul1 orf5 P. aeruginosa Kuwait
Intégrons et transposonsIntégrons et transposons
intI1intI1 qacEqacEΔΔ 11 sul1sul1 orf5orf5
Tn21tnpA tnpR tnpMres urf2 E D A C P T R
aadA1
qacEΔ1
qacH
TSD
IS26 IS26
Tn2000
In53
TraC-2/3/4
TSDintI1Δ sul1 orf5
pNLT-1(160kb)
Intégrons, transposons et plasmidesIntégrons, transposons et plasmides
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Chr (donneur) Chr (réceptrice)
pTra
Tn
Tn
Tn
Gram-positif Gram-négatif
Conjugaison, transposition, capture de gèneConjugaison, transposition, capture de gène
Insertion d’un gène cassette
Les transposons Les transposons conjugatifsconjugatifs
• Em-Tc DOT− spectre d’hôte étroit : Bacteroides fragilis− confère la résistance à la tétracycline (tetQ)− transfert induit par la tétracycline (X 104)
• Tn916− spectre d’hôte large : Bacilles et cocci à Gram positif− E. coli− P. fluorescens
− confère la résistance à la tétracycline (tetM)
− existence de variants contenant des marqueurs additionnels(ermB, aphA-3)
•• Bactérie utilise tous les outils génétiques dont elle dispose Bactérie utilise tous les outils génétiques dont elle disposepour évoluer dans un environnement hostilepour évoluer dans un environnement hostile
•• « « SuperbugsSuperbugs » difficiles à éradiquer. Réversibilité ?» difficiles à éradiquer. Réversibilité ?
•• Nouveaux mécanismes Nouveaux mécanismes dd’’accumulationaccumulation de gènes de de gènes derésistance (gram-négatifs) : intégronsrésistance (gram-négatifs) : intégrons
ConclusionsConclusions