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Mémoire en vue de l’obtention d'un diplôme de

MAGISTER en Biologie

Option : Microbiologie Fondamentale et Appliquée

Présenté par :

Soutenu le : 01/06/2015

Président : Mr KIHAL Mebrouk Professeur (Université d’Oran1)

Rapporteur : Mr HEDDADJI Miloud Professeur (Université d’Oran1)

Examinateur : Mr GUESSAS Bettache Professeur (Université d’Oran1)

Examinateur : Mr MAMI Anas MCA (C. U Ain Temouchent)

Année Universitaire : 2014-2015

والـحـيـــــــاة الـطـبيـــــــعة عـلـــوم كـلـيــة

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie (SNV)

الـبـيـــــــولـــوجـيــــــا قـســـــــم

Département de Biologie

Youssef

Avant tout nous remercions "ALLAH" l’Omniscient et l’Omnipotent qui nous a

donné le courage, la volonté et la force pour accomplir ce travail.

Nous exprimons nos sincères remerciements au Professeur KIHAL Mebrouk,

directeur du laboratoire de microbiomogie appliquée (LMA) de nous avoirs honoré de

précider ce jury. Qu’il trouve ici notre gratitude et notre respect.

Nous remercions tout particulièrement le Professeur HEDDADJI Miloud pour

l’honneur qu’il nous a fait en proposant ce sujet et en encadrant ce mémoire. Merci pour

vos conseils scientifiques judicieux et votre suivi permanent durant la période de la

réalisation de ce travail malgré vos occupations professionnelles.

Nos remerciements sont adressés également aux membres du Jury, Professeur

GUESSAS Bettache et Docteur MAMI Anas pour bien vouloir évaluer et examiner ce

travail.

Les mots nous manquent pour exprimer toute notre gratitude et nos sentiments de

respect à Madame BENLAHCEN Kheira. Merci pour votre modesité, gentillesse et votre

soutient inestimable depuis notre inoubliable première rencontre, nous vous serons

reconnaissants pour le reste de notre vie.

Un grand merci à nos collegues du laboratoire de microbiologie appliquée :

Alla Eddine, Hadjer, Khadidja, Nabila, Aicha et Sofien, avec lesquels nous avons

partagé des moments de joie mémorable. Merci nos chers collegues pour votre

généosité et vos encouragements pendant les moments délicats que nous avons vécus

durant la réalisation de ce projet.

Nous n’oublions évidemment pas de remercier toutes les personnes auxquelles

revient le mérite de notre formation, particulièrement Mr LAMRI Mahmoud

Mr GUETOUACHE Mourad et Mr SELLOUM Mounir.

Nos remerciements vont aussi à Mr CHAOUI Ridha, directeur de qualité à la laitière

"Hodna" de la Wilaya de M’sila pour sa contribution appréciable à ce projet.

Finalement, nous remercions tous ceux ou celles qui ont contribué de

près ou de loin à la réalisation de ce travail.

A vous tous, un grand Merci.

Liste des abréviations

Acronymes

ADN : Acide désoxyribonucléique

ARN : Acide ribonucléique

ATP : Adénosine triphosphate

BAL : Bactéries lactiques

C : Cytosine

DDR : DNA-DNA reassociation

EPS : Exopolysaccharides

FAO : Food and agriculture organization

FDA : Food and drug administration

G : Guanine

GRAS : Generally recognised as safe

Gr : Grossissement

HCl : Chlorure d’hydrogène

H2O2 : Péroxyde d’hydrogène

Hsp : Heat shock protein

INRA : Institut national de la recherche

agronomique

j : Jour

LMA : Laboratoire de microbiologie

appliquée

M : Mole/litre

Mb : Million de bases

ml : Millilitre

µg : Microgramme

µl : Microlitre

µmax : Vitesse spécifique maximale de

croissance.

MRS : De Man, Rogosa et Sharpe

OMS : Organisation mondiale de la santé

O2 : Oxygène

Pb : Paire de bases

PBS : Tampon phosphate

PCR : Plymerase chain reaction

pH : Potentiel d'hydrogène

rpm : Rotation par minute

Sig : Niveau de signification

ssp : Sous-espèce

TGI : Tractus gastro-intestinale

TPY : Peptone tryptone levure

UFC : Unité formant colonie

UHT : Ultra haute température

V /V : Volume / volume

Noms des genres

B. : Bifidobacterium

E. : Escherichia

L. : Listeria

Lb. : Lactobacillus

Lc. : Lactococcus

Ln. : Leuconostoc

S. : Staphylococcus

Sc. / St. : Streptococcus

Unités de mesure

°D : Degré dornic

°C : Degré Celsius

% : Pourcentage

g : Gramme

m : Mètre

h : Heure

s : Facteur de sédimentation

oms://Organisation

Liste des figures

Figure 1: Étapes essentielles de transformation du lait en fromage. .................................................................... 5

Figure 2: Diagramme général de fabrication des yaourts et des laits fermentés .............................................. 6

Figure 3: Diagramme simplifié de la production du yaourt .................................................................................. 7

Figure 4: Schéma des compartiments de l’appareil digestif de l’homme et leurs microflores. .................. 9

Figure 5: Implantation du microbiote intestinal. ..................................................................................................... 10

Figure 6: Vue générale sur la microflore du colon humain. ................................................................................ 12

Figure 7: Présentation des effets bénéfiques des probiotiques sur la santé humaine .................................. 16

Figure 8: Formation d'acétate et de lactate à partir de glucose par la voie des bifidobactéries ................ 25

Figure 9: Métabolisme général des bifidobactéries ................................................................................................ 33

Figure 10: Arbre phylogénétique des bifidobactéries............................................................................................ 37

Figure 11: Protocole d’isolement des bifidobactéries à partir du lait fermenté. ........................................... 39

Figure 12: Dispositif utilisé pour la mesure de l’acidité titrable. ...................................................................... 45

Figure 13: Protocole de de détermination de l’effet du pH gastrique simulé ................................................ 47

Figure 14: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium sur milieu MRS. ................................ 51

Figure 15: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium ................................................................. 52

Figure 16: Test de production du gaz à partir du glucose. ................................................................................... 53

Figure 17: Test de citrate perméase sur milieu KMK. .......................................................................................... 54

Figure 18: Mise en évidence de l'uréase. ................................................................................................................... 54

Figure 19: Mise en évidence de la production de l'indole. .................................................................................. 55

Figure 20: Test de la gélatinase. ................................................................................................................................... 55

Figure 21: Profil fermentaire de la souche BN. ........................................................................................................ 57

Figure 22: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en présence de l'oxygène. . 58

Figure 23: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en absence de l'oxygène. .. 59

Figure 24: Cinétique de croissance des souches incubées en 43°C. ................................................................. 60

Figure 25: Cinétique de croissance des souches incubées en 37°C. ................................................................. 60

Figure 26: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours de stockage à 4°C. ........ 61

Figure 27: Variation du pH du lait fermenté par les souches pendant le stockage à 4°C. ......................... 62

Figure 28: Viabilité des souches pendant 21 jours d’entreposage en présence de d’arôme banane. .... 63

Figure 29: Viabilité des souches pendant 21 jours d’entreposage en présence de d’arôme vanille. .... 64

Figure 30: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN dans le lait écrémé. ............. 65

Figure 31: Cinétique d'acidification et variation de pH produites par dans le lait écrémé. ....................... 66

Figure 32: Activité protéolytique des souches dans milieu MRS à 2% de lait écrémé .............................. 67

Figure 33: Activité lipolytique des souches sur milieu agar au tween 80. ...................................................... 68

Figure 34: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN aux pH acides (2 et 3). ............................... 70

Figure 35: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN à 0,5% de sels biliaires. ............................ 71

Figure 36: Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur Staphylococcus aureus........ 72

Figure 37: Activité inhibitrice des surnageants natifs des souches R1, R2 et L1 sur Escherichia coli. ... 73

Figure 38: Antibiogramme de la souche L2 .............................................................................................................. 74

Liste des tableaux

Tableau 1 : Exemples de produits laitiers fermentés et leurs pays d’origine ..................................... 3

Tableau 2 : Composition recommandée et optionnelle des ferments du yaourt. .............................. 5

Tableau 3 : Certaines descriptions et définitions des probiotiques ..........................................................13

Tableau 4 : Critères de sélection utilisés pour le screening des probiotiques. .............................. 14

Tableau 5 : Profile fermentaire des différentes espèces de Bifidobacterium. ................................. 27

Tableau 6 : Les espèces du genre Bifidobacterium et leur écologie. ................................................ 28

Tableau 7 : Exemples de bactériocines synthétisées par les souches de bifidobactéries ............ 34

Tableau 8 : Les antibiotiques utilisés pour évaluer l’antibiorésistance des souches. .................. 50

Tableau 9 : Aspects macroscopique et microscopique des souches de bifidobactéries. ............. 52

Tableau 10 : Mise en évidence des activités enzymatiques des souches de bifidobactéries. .... 53

Tableau 11 : La fermentation des sucres par les souches de Bifidobacterium. .............................. 57

Tableau 12: Activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN………………….68

Tableau 13 : Activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN. ...................................... 69

Tableau 14 : Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2 BB12 et BN .......................................... 71

Tableau 15 : Résultats de l’évaluation de l’antibiorésistance des souches. .................................... 73

Résumé :

Notre étude a pour but d’évaluer les principales aptitudes technologiques et probiotiques

de certaines souches indigènes de bifidobactéries, dont quatre souches (L1, L2, R1 et R2) ont

été étudiées d’une part, sur le plan de leur tolérance à l’oxygène, la cinétique de croissance à

43 °C, la viabilité pendant 21 jours d’entreposage à 4 °C, le comportement envers les arômes

utilisées en industrie laitière , la cinétique de croissance et d’acidification dans le lait et

l’activité protéolytique et lipolytique (propriétés technologiques) ; et d’une autre part, sur le

plan de leur résistance aux conditions gastro-intestinales (pH acide et sels biliaires) et

l’activité antibactérienne envers quelques souches pathogènes. Finalement, les souches ont été

soumises à un antibiogramme afin de déterminer leur comportement envers les différents

types d’antibiotiques (propriétés probiotiques).

Deux souches utilisées en industrie laitière, dont l’une (BN) isolée à partir du lait

fermenté probiotique produit et commercialisé en Algérie (Danone Activia) et l’autre,

Bifidobacterium animalis ssp. lactis (BB12) fournie par la laitière « Hodna » de la Wilaya de

M’sila, ont servi une référence de comparaison des caractères étudiés.

Les résultats des tests d’identification des souches indigènes ont révélé leur appartenance

à deux espèces de bifidobactéries dont, B. longum représentée par les souches L1 et L2 et

B. breve représentée par R1 et R2. Bien que la souche industrielle BN a été classée au sein de

l’espèce B. animalis.

Les résultats de l’évaluation des aptitudes technologiques indiquent que les souches

indigènes présentent des capacités très intéressantes exprimées par le pouvoir de se croitre en

présence de l’oxygène, une vitesse de croissance en 43°C dépassant celles inscrites par les

souches industrielles, une viabilité pendant l’entreposage frigorifique très proche de celle

enregistrée par les souches industrielles, une bonne viabilité lors de l’exposition aux arômes

artificiels, une vitesse de croissance dans le lait meilleure que celles des souches industrielles,

cependant, des faibles activités protéolytique et lipolytique ont été constatées.

Encore, de très bonnes aptitudes probiotiques ont été enregistrées pour l’ensemble des

souches indigènes caractérisées par une notable résistance aux conditions gastro-intestinales,

une bonne activité antibactérienne envers les pathogènes. Finalement les souches étudiées ont

montré une résistance envers certains antibiotiques dont les souches du genre Bifidobacterium

sont connues par leur résistance naturelle à ces antibiotiques.

Mots clefs : souches indigènes, bifidobactéries, aptitudes technologiques, aptitudes

probiotiques.

Abstract:

Our study aims to evaluate the main technological and probiotic abilities of some

indigenous bifidobacteria strains. Four strains (L1, L2, R1 and R2) were studied on the one

hand, in terms of their tolerance to oxygen, kinetics of growth at 43 ° C, viability during 21

days of storage at 4 °C, behavior towards aromas used in the dairy industry, growth kinetics

and acidification in milk and proteolytic and lipolytic activities (technological properties); and

secondly, in terms of their resistance to gastrointestinal conditions (acidic pH and bile salts)

and antibacterial activity against pathogenic strains. Finally, strains were subjected to

susceptibility test to determinate their comportment towards different types of antibiotics

(probiotic properties).

Two strains used in the dairy industry, one (BN) isolated from probiotic fermented milk

produced and sold in Algeria (Danone Activia) and the other Bifidobacterium animalis ssp.

lactis (BB12) provided by "Hodna" dairy company in the province of M'sila, served a

comparison reference of the studied characters.

The results of the indigenous strains identification tests revealed that they belong to two

bifidobacteria species, including B. longum represented by L1 and L2 strains, B. breve

represented by the R1 and R2 strains. While the industrial strain BN was ranked within

B. animalis.

The results of technological abilities evaluation indicate that indigenous strains have very

interesting capacities expressed by the ability to grow in presence of oxygen, a growth rate in

43 °C in over than those registered by industrial strains, viability during cold storage very

close to that obtained by industrial strains, good viability when exposed to artificial aromas, a

growth rate in the milk better than those observed for the industrial strains, however, low

proteolytic and lipolytic activities were noted.

Furthermore, very good probiotic abilities were recorded for all indigenous strains

characterized by a notable resistance to gastrointestinal conditions, good antibacterial activity

against pathogenic strains, finally tested strains showed a resistance to certain antibiotics

including Bifidobacterium strains are known for their natural resistance to these antibiotics.

Key words: indigenous strains, bifidobacteria, technological abilities, probiotic

abilities.

:ملخص

اىتنىىىىجيت و اىبزوبيىتينيت األساسيت ىبؼط اىسالالث اىمحييت مه اىنفاءاث تقييم تهذف إىً دراستىا

bifidobacteria دراست اىخصائص اىبزوبيىتينيت ألربغ سالالث ( حيث تم مه جهتL1, L2, R1, R2(

اىحيىيت خاله اىتخشيه اىحفاظ ػيً، C43°تحمو وجىد األمسجيه، سزػت اىىمى في درجت حزارة واىمتمثيت في

و أيعا اىىشاغيت اىمحييت ف اتجاي اىؼطىر اىصىاػيت، سزػت اىىمى و تنىيه اىحمىظت في اىحييباىبارد، اىتصز

متمثيت ىيبزوتيىاث و اىذهىن. و مه جهت أخزي، تم أيعا دراست اىخصائص اىبزوبيىتينيت ىيسالالث اىمذمىرة، و اى

(اىحمىظت و األمالح اىصفزاويت)، اىىشاغيت اىمعادة ىبؼط اىسالالث اىممزظت، في مقاومت اىظزوف اىمؼىيت

.اىحيىيت اىمعاداثأوىاع ىبؼطاىمقاومت اختبارالالث اىمذروست إىً أخيزا، تم إخعاع اىس

اىمؼشوىت مه اىحييب اىمخمز اىبزوبيىتيني BNمتمثيتان في و اى سالىتان مستؼميتان في صىاػت اىحييب

Bifidobacterium animalis ssp. lactisو اىسالىت (Danone Activia)اىجشائز فياىمصىىع و اىمسىق

(BB12) اىمذروست. ممزجغ ىمقاروت اىخصائص تم استؼماىهما

حيث اىىىع bifidobacteria وتائج اىتشخيص أظهزث أن اىسالالث اىمحييت تىتمي إىً وىػيه مه

B.longum و اىممثو باىسالىتيهL1 وL2 و اىىىعB. breve اىممثو باىسالىتيه R1 وR2 في حيه تم تصىيف ،

. B. animalisفي اىىىع BN اىسالىت

وتائج تقييم اىنفاءاث اىتنىىىىجيت أظهزث امتالك اىسالالث اىمحييت ىقذراث مهمت جذا و اىتً ظهزث مه

أمبز مه اىسزػاث اىمسجيت مه C43°خاله اىقذرة ػيً اىىمى في وجىد األمسجيه، سزػت ومى في درجت حزارة

اىبارد قزيبت مه تيل اىمسجيت مه غزف اىسالالث اىمستؼميت في اىصىاػت، اىحفاظ ػيً حيىيت خاله اىتخشيه

غزف اىسالالث اىمستؼميت في اىصىاػت، اىمحافظت ػيً حيىيت جيذة خاله اىتؼزض ىيؼطىر اىصىاػيت، سزػت

ومى في اىحييب أحسه مه تيل اىمسجيت مه غزف اىسالالث اىمستؼميت في اىصىاػت، في اىمقابو تم تسجيو وشاغيت

ظؼيفت ىتحييو اىبزوتيىاث و اىذهىن.

أيعا تم تسجيو مفاءاث بزوبيىتينيت جيذة جذا مه غزف جميغ اىسالالث اىمحييت اىمذروست و اىتي ظهزث

. في األخيزهمت ظذ اىسالالث اىممزظتمه خاله اىمقاومت اىممتاسة ىيظزوف اىمؼىيت، وشاغيت معادة م

اىسالالث اىمذروست أظهزث مقاومت اتجاي بؼط اىمعاداث اىحيىيت، حيث أن اىسالالث اىمىتميت ىجىس

Bifidobacterium ي اىمعاداث اىحيىيت.ذتميل مقاومت غبيؼيت وحى ه

اىخصائص اىتنىىىىجيت، اىخصائص اىبزوبيىتينيت. ، bifidobacteria اىسالالث اىمحييت، الكلمات المفتاحية:

Table des matières

INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 1

CHAPITRE I : Etude bibliographique

1. Produits laitiers fermentés ......................................................................................................................... 3

1.1. Lait fermenté ................................................................................................................................ 4

1.1.1. L‘ben ..................................................................................................................................... 4

1.1.2. Raïb ....................................................................................................................................... 4

1.2. Fromage ........................................................................................................................................ 4

1.3. Yaourt ........................................................................................................................................... 5

1.4. Laits fermentés aux bifidobactéries .............................................................................................. 7

2. Ecosystème gastro-intestinal ..................................................................................................................... 8

2.1. Anatomie du système digestif ...................................................................................................... 8

2.2. Description générale du système digestif ..................................................................................... 8

2.3. Implantation du microbiote intestinal ........................................................................................... 9

2.4. Le microbiote intestinal .............................................................................................................. 11

3. Probiotiques ............................................................................................................................................. 12

3.1. Historique de la définition des probiotiques ............................................................................... 12

3.2. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques ...................................................... 14

3.2.1. Résistance à l'acidité gastrique ............................................................................................ 14

3.2.2. Résistance aux sels biliaires ................................................................................................ 14

3.2.3. Adhésion aux cellules épithéliales ....................................................................................... 15

3.2.4. Production de substances antimicrobiennes ........................................................................ 15

3.2.5. Résistance aux antibiotiques................................................................................................ 15

3.2.6. Critères technologiques ....................................................................................................... 15

3.3. Effets bénéfiques des probiotiques sur la santé humaine ........................................................... 16

3.3.1. Soulagement de la constipation ........................................................................................... 17

3.3.2. Amélioration de l'utilisation du lactose par l'organisme ...................................................... 17

3.3.3. Prévention ou le raccourcissement de la durée des diarrhées .............................................. 17

3.3.4. Contrôle des infections intestinales par Helicobacter pylori ............................................... 18

3.3.5. Activité antivirale ................................................................................................................ 18

3.3.6. Diminution des allergies alimentaires ................................................................................. 18

3.3.7. Réduction du taux de cholestérol sanguin ........................................................................... 19

3.4. Production et maintenance de la viabilité des bactéries probiotiques ........................................ 19

3.4.1. Emploi des bactéries probiotiques dans les produits laitiers ............................................... 19

3.4.2. Viabilité des bactéries probiotiques ..................................................................................... 20

3.5. Défis technologiques associés au développement des cultures probiotiques ............................. 23

3.5.1. Méthodes de production ...................................................................................................... 23

4. Les bifidobactéries ................................................................................................................................... 24

4.1. Taxonomie .................................................................................................................................. 24

4.2. Les espèces du genre Bifidobacterium ...................................................................................... 26

4.3. Ecologie des bifidobactéries ....................................................................................................... 29

4.4. Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiquesdes bifidobactéries ........... 30

4.4.1. Morphologie ........................................................................................................................ 30

4.4.2. Physiologies des bifidobactéries .......................................................................................... 30

4.4.3. Biochimie des bifidobactéries ............................................................................................. 32

4.5. Génétique des bifidobactéries .................................................................................................... 34

4.5.1. Le chromosome bactérien.................................................................................................... 34

4.5.2. Les plasmides ...................................................................................................................... 35

4.5.3. Identification génotypique des bifidobactéries .................................................................... 35

CHAPITRE II : Matériel et méthodes

1. Provenance des souches .......................................................................................................................... 38

1.1. Les souches industrielles ............................................................................................................ 38

1.2. Les souches indigènes ................................................................................................................ 38

1.3. Les souches pathogènes.............................................................................................................. 38

2. Milieux de culture .................................................................................................................................... 38

2.1. Milieu de culture pour les bifidobactéries .................................................................................. 38

2.2. Milieux de culture pour les souches pathogènes ........................................................................ 38

3. Isolement et purification des bifidobactéries ......................................................................................... 39

A partir du lait fermenté .................................................................................................................... 39

4. Pré identification des bifidobactéries ..................................................................................................... 40

4.1. Etude macroscopique ................................................................................................................. 40

4.2. Etude microscopique .................................................................................................................. 40

5. Identification du genre............................................................................................................................. 40

5.1. Recherche de la catalase ............................................................................................................. 40

5.2. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose ............................................................. 40

5.3. Recherche de citrate perméase ................................................................................................... 40

5.4. Mise en évidence de l‘uréase ...................................................................................................... 40

5.5. Mise en évidence de la production d‘indole ............................................................................... 41

5.6. Protéolyse de la gélatine ............................................................................................................. 41

6. Caractérisation des espèces ..................................................................................................................... 41

7. Conservation des Souches ....................................................................................................................... 41

8. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de bifidobactéries ....................... 42

8.1. Mise en évidence des propriétés technologiques ........................................................................ 42

8.1.1. Croissance en présence de l‘oxygène .................................................................................. 42

8.1.2. Croissance en 43°C ............................................................................................................. 43

8.1.3. Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C ................................................................................. 43

8.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C .......................................... 44

8.1.5. Influence des arômes sur la viabilité ................................................................................... 44

8.1.6. Cinétique de croissance et d‘acidification dans milieu lait ................................................. 44

8.1.7. Activité protéolytique .......................................................................................................... 45

8.1.8. Activité lipolytique .............................................................................................................. 45

8.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques .............................................................. 46

8.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées ....................................................... 46

8.2.3. Mise en évidence de l‘activité antibactérienne .................................................................... 48


8.2.5. Traitement statistique des résultats ...................................................................................... 50

CHAPITRE III : Résultats et discussion

1. Pré-identification des souches ................................................................................................................ 51

1.1. Aspect macroscopique ................................................................................................................ 51

1.2. Aspect microscopique ................................................................................................................ 51

2. Identification du genre............................................................................................................................. 52

2.1. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose ............................................................. 53

2.2. Mise en évidence des autres enzymes ........................................................................................ 53

3. Caractérisation des espèces ..................................................................................................................... 56

4. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de bifidobactéries ....................... 58

4.1. Mise en évidence des propriétés technologiques ........................................................................ 58

4.1.1. Croissance en présence de l‘oxygène .................................................................................. 58

4.1.2. Croissance en 43°C ............................................................................................................. 59

4.1.3. Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C ..................................................................................... 61

4.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C .............................................. 62

4.1.5. Influence des arômes sur la viabilité ................................................................................... 63

4.1.6. Cinétique de croissance et d‘acidification dans milieu lait ................................................. 65

4.1.7. Activité protéolytique .......................................................................................................... 67

4.1.8. Activité lipolytique .............................................................................................................. 68

4.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques ............................................................... 69

4.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées ....................................................... 69

4.2.2. Activité antibactérienne ....................................................................................................... 71


DISCUSSION .............................................................................................................................................. 75

1. Isolement et identification des bifidobactéries ...................................................................................... 75

2. Etudes des propriétés téchnologiques des souches de bifidobactéries ................................................ 76

3. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques des bifidobactéries ......................................... 80

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ....................................................................................................... 83

Références bibliographiques ....................................................................................................................... 85

ANNEXES

Introduction

Page 1

INTRODUCTION

Selon la définition rapportée par la FAO et L‘OMS (2002), les probiotiques sont des

microorganismes vivants qui lorsqu‘ils sont administrés en quantités adéquates, exercent une

action bénéfique sur la santé de l‘hôte qui les ingère.

Parmi les souches connues par leur effet probiotique, les bifidobactéries occupent un

espace très important. Ces bactéries forment le groupe le plus important des bactéries

intestinales pour la santé de l‘homme. Elles s‘installent dans un court temps après la naissance

et deviennent le groupe dominant des bactéries (92%) de la microflore de nouveau-né allaité

au sein.

Parmi les effets bénéfiques des bifidobactéries sur la santé humaine, on note le contrôle

de la flore intestinale, l‘inhibition de la croissance de nombreux pathogènes, la régulation du

transit intestinal, l‘amélioration de l‘intolérance au lactose et des allergies alimentaires

(Isolauri et al., 2000) et la stimulation du système immunitaire ainsi que certaines propriétés

anti-cancérigènes et anti-diarrhéiques (Shah, 2006).

Les produits laitiers fermentés sont connus pour être de bons vecteurs de probiotiques

notamment en raison de leur large consommation. Afin d‘être considérées comme potentiels

probiotiques, les souches sélectionnées doivent montrer une capacité à survivre dans le

produit et surmonter les obstacles rencontrés durant le procédé de fabrication (température de

fermentation, oxygène…) et au cours de l‘entreposage (basse température, oxygène, arômes),

ainsi durant le transit gastro-intestinal (pH bas, bile…), puis avoir de bon pouvoir adhésif à

l‘épithélium intestinal de l‘hôte. La survie des bifidobactéries dans les produits laitiers

fermentés dépend de plusieurs facteurs tels que, les conditions de fermentation, la

température d‘entreposage et notamment la souche utilisée.

Le nombre des espèces de bifidobactéries introduites en industrie laitière est très limité

dont les souches d‘origine animale sont les plus utilisées, cela est dû à leur viabilité

satisfaisante durant la fabrication et l‘entreposage du produit en comparaison à celles

d‘origine humaine, mais ces dernières, ont des meilleurs caractères probiotiques (résistance au

pH bas et aux sels biliaires, bon pouvoir adhésif, activité antibactérienne…). De ce point,

notre étude tire son importance, elle sert à rechercher des souches de bifidobactéries indigènes

d‘origine humaine présentant de bonnes propriétés technologiques caractérisées

essentiellement par une meilleure viabilité au cours de la fabrication et l‘entreposage du

Introduction

Page 2

produit, en plus des propriétés probiotiques (viabilité pendant le transit gastro-intestinale et

activité anti bactérienne envers les souches pathogènes).

Pour atteindre cet objectif, notre travail comporte les étapes suivantes :

Isolement et caractérisation microbiologique et biochimique des bifidobactéries.

Evaluation de leurs propriétés technologiques qui sert à étudier leur

comportement envers les conditions retrouvées dans le produit au cours de la

fabrication et l‘entreposage.

Etude in vitro de certaines propriétés probiotiques de ces souches (résistance au

pH et aux sels biliaires gastriques et même l‘activité anti bactérienne envers les

pathogènes).

Etude statistique servant à comparer les résultats obtenus pour les souches

indigènes avec ceux constatés pour les souches utilisées en industrie laitière.

CHAPITRE I Etude bibliographique

Page 3

1. Produits laitiers fermentés

Une large gamme de produits laitiers fermentés est commercialisée à travers le monde. Il

existe un grand nombre de laits fermentés provenant de plusieurs pays et qui diffèrent par leur

matière première, leur flore microbienne, leur technologie, leur texture, leur goût et leur durée

de conservation (Leksir, 2012).

Le tableau 1 donne une description de différents types de laits fermentés et leurs pays

d‘origine.

Tableau 1: Exemples de produits laitiers fermentés et leurs pays d‘origine Leksir, (2012).

Nom Description Pays présumé

d’origine

Ferment(s) impliqué(s)

Yoghourt/

Yaourt

Produit ferme ou brassé,

arôme caractéristique.

Asie, Balkans St. thermophilus

Lb. bulgaricus

(+Lb. acidophilus,

Bifidobacterium ssp.)

Lait à

l’acidophilus

Produit ferme, brassé ou

liquide, faible arôme.

Etats-Unis Lb. acidophilus

Kéfir

Boisson brassée,

consistance crémeuse,

arôme et gout

caractéristique (CO2).

Caucase Lc. lactis, Lc. cremoris,

Lb. kéfir, Lb. casei, Lb.

acidophilus, Leuconostoc

ssp., levures

Koumis

Boisson pétillante, acide,

gout rafraîchissant et

arôme caractéristique.

Mongolie Lb. bulgaricus,

Lb. acidophilus, levures

Lassi

Boisson laitière aigre

diluée avec de l‘eau,

consommée sale, épicée

ou sucrée.

Inde Lactococcus ssp.,

Lactobacillus ssp.,

Leuconostoc ssp.,levures

Dahi


ou boisson liquide, flaveur

agréable, acide ou

faiblement acide.

Inde St. thermophilus,

Lb. bulgaricus,

Lc. diacétylactis, Leuconostoc ssp.

Leben


gout et arôme agréable.

Moyen orient St. thermophilus,

Lb.bulgaricus,

Lb. acidophilus,

Lc. lactis, levures

Filmjölk

Boisson brassée,

visqueuse, saveur

acidulée.

Suède Lc. lactis, Lc. cremoris,

Lc. diacétylactis,

Ln. cremoris

Villi

Produit brassé visqueux,

acidulé et gout agréable

Finlande Lc. lactis, Lc. cremoris,

Lc. diacétylactis, Lc.

dextranicum, moisissure

(Geotrichum candidum)


Page 4

1.1. Lait fermenté

Les laits fermentés sont des produits laitiers transformés par une fermentation

essentiellement lactique qui aboutit à l‘acidification et à la gélification du lait (Béal et Sodini,

2012). Les laits fermentés algériens sont le L‘ben et le Raïb.

1.1.1. L’ben

L'origine de ce produit remonte à des temps immémoriaux, probablement à l'époque où

l'homme a commencé à domestiquer les espèces laitières et à utiliser leurs laits. Sa

fermentation lactique lui donne son arôme naturel et sa saveur inimitable. Sa préparation

artisanale est simple, le lait est abandonné à lui-même jusqu'à sa coagulation. Celle-ci se fait à

température ambiante et dure 24 à 48 h selon la saison. Le barattage qui lui succède dure 30 à

40 minutes. A la fin du barattage, on ajoute généralement un certain volume d'eau (environ 10

% du volume du lait), chaude ou froide, suivant la température ambiante, de façon à ramener

la température de l'ensemble à un niveau convenable au rassemblement des grains de beurre

(Ouadghiri, 2009 ; Benkerroum et Tamime, 2004).

Le L‘ben est produit également à l‘échelle industrielle. C'est un lait pasteurisé fermenté.

L'acidification est provoquée par ensemencement des ferments lactiques mésophiles. Le

lait qui sert à la préparation du L‘ben est reconstitué. Il subit une pasteurisation à 84°C

pendant 30 secondes, puis refroidi à 22°C et ensemencé de levain lactique (Streptococcus

cremoris ; Streptococcus lactis et Streptococcus diacetylactis ; Leuconostoc dextranicum,

Leuconostoc citrovorum et Leuconostoc mesenteroides) (Benkerroum et Tamime, 2004).

1.1.2. Raïb

Le Raïb fait partie des produits laitiers fermentés populaires en Algérie, en plus du

L‘ben (lait écrémé fermenté). Le Raïb a une très ancienne tradition en Algérie; il est fabriqué

à partir du lait cru de vache ou de chèvre. La fermentation du lait, comme de nombreux

procédés traditionnels de fermentation, est spontanée et incontrôlée et pourrait être une

source précieuse des bactéries lactiques autochtones (Mechai et Kirane, 2008).

Contrairement au L‘ben, le Raïb ne subit pas une opération de barattage et d‘écrémage, il

s‘agit d‘un lait fermenté entier.

1.2. Fromage

Le but est de transformer le lait en un produit d'utilisation prolongée et de goût différent

grâce à diverses actions microbiennes et enzymatiques (Leroy et De Vuyst, 2004; Hui, 1992).

La coagulation du lait et l'égouttage du caillé obtenu, représentent, en effet, une sorte de

concentration, qui constitue un moyen de conservation auquel il faut ajouter l'acidification

provoquée par la fermentation lactique, qui s‘oppose à l'envahissement du fromage par les

bactéries de putréfaction (Yìldìz, 2010; Keohane et al., 2009 ; Parente et Cogan, 2004).

Ce double principe de dessiccation et d'acidification va se retrouver, plus ou moins

prononcé dans la préparation de tous les fromages (Leroy et De Vuyst, 2004).


Page 5

La transformation du lait en fromage comporte quatre étapes essentielles (voir Figure 1).

Dans le cas d'un fromage frais, la fabrication est terminée après l'égouttage (Yìldìz, 2010;

Parente et Cogan, 2004).

Figure 1: Étapes essentielles de transformation du lait en fromage

(Parente et Cogan, 2004).

1.3. Yaourt

Le yaourt est un lait fermenté obtenu exclusivement par la coagulation du lait sous

l'action de deux bactéries : Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus

(Quiberoni et al., 2010 ; Iyer et al., 2009 ; Codex alimentarius. 2003 ) (Tableau 2).

Ces bactéries doivent être vivantes dans le produit et leur nombre doit dépasser dix

millions par gramme de yaourt à la date limite de conservation (Champagne et al., 2009;

Pfeiler et Klaenhammer, 2007).

Tableau 2: Composition recommandée et optionnelle des ferments du yaourt (Hui, 1992).

Composition standard recommandée par la FDA Ferments additionnels du yaourt

Streptococcus salivarius ssp. thermophillus Lactobacillus delbruckii ssp. bulgaricus

Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus casei

Lactobacillus helveticus

Lactobacillus jugurti

Lactobacillus lactis

Bifidobacterium longum

Bifidobacterium bifidum

Bifidobacterium infantis

Les propriétés fermentaires aromatiques et épaississantes des bactéries lactiques du

yaourt confèrent au produit final ses caractéristiques organoleptiques. Les résultats de

recherche ont montré que la production d'acide et la production d'acétaldéhyde de la culture


Page 6

mixte de Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus sont beaucoup plus

importantes que celles des cultures pures, on peut également observer un effet synergique

marqué sur la consistance et la viscosité du produit lorsqu'on emploie des cultures

épaississantes bonnes productrices d‘exopolysaccharides (EPS) (Yìldìz, 2010; Ravin et al.,

2006).

Figure 2: Diagramme général de fabrication des yaourts et des laits fermentés

(Béal et Sodini, 2012).

Les deux principaux types de yaourt sont le yaourt brassé et le yaourt ferme.

Les figures 2 et 3 montrent les différentes étapes de production des yaourts et laits

fermentés et des deux types de yaourt respectivement.


Page 7

Figure 3: Diagramme simplifié de la production du yaourt (Yìldìz, 2010).

1.4. Laits fermentés aux bifidobactéries

Ce sont des laits fermentés à l‘aide de bifidobactéries associées à diverses bactéries. Il

existe plusieurs types des laits fermentés aux bifidobactéries :

-Type levain yaourt + Bifidobacterium + Lactobacillus acidophilus

-Type levain yaourt + Bifidobacterium, soit d‘origine humaine, soit d‘origine animale.

Les laits fermentés avec Bifidobacterium d‘origine animale, essentiellement

Bifidobacterium animalis, sont les plus répandus. Leur technologie est celle du yaourt à la

condition de choisir des souches capables de résister en milieu acide (pH 4,2 à 4,5) et en

anaérobiose relative (Hadadji, 2007)


Page 8

2. Ecosystème gastro-intestinal

2.1. Anatomie du système digestif

Les éléments constitutifs du tube digestif sont les suivants :

L‘œsophage qui se termine par le cardia

L‘estomac, qui inclut l'antre et le canal du pylore

Les intestins :

L‘intestin grêle (6-8 m), comprenant :

- Le duodénum

- Le jéjunum

- L‘iléon qui rejoint le cæcum à la jonction iléo-cæcale

Le gros intestin ou côlon (1,5 m), constitué de 3 parties :

Le cæcum.

L'appendice est un organe rudimentaire, reliquat de l'évolution, attaché au cæcum.

Le côlon qui comprend :

- Le côlon ascendant

- Le côlon transversal

- Le côlon descendant et sigmoïde

- Le rectum qui se termine par l'anus.

2.2. Description générale du système digestif

Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux microorganismes

exogènes. Sa muqueuse étant estimée à 200-300 m2, il représente la plus grande surface du

corps en contact avec l‘environnement. L‘écosystème gastro-intestinal est généré par une

alliance stable entre 1) l‘épithélium gastro-intestinal, 2) le système immunitaire et 3) une

importante flore microbienne. Si l‘un des trois composants de l‘écosystème est défaillant, des

pathologies peuvent survenir. Les interactions entre les microorganismes et l‘hôte peuvent

être de trois types : symbiose, commensalisme ou pathogénicité. L‘hôte est protégé contre la

microflore intestinale pathogène par les barrières chimiques et physiques formées par

l‘épithélium gastro-intestinal (Amrouche, 2005 ; Bäckhed et al. , 2004).

La figure 4 montre les principaux compartiments constituant le tractus gastro-intestinal

de l‘homme.


Page 9

Œsophage: mucus, péristaltisme. Seuls les

microorganismes provenant des aliments ou de la

cavité

orale sont présents.

Estomac: pH acide (pH<2), O2, enzymes, mucus.

Microflore : 104 UFC/g : Candida albicans ,

Helicobacter

pylori, Lactobacillus, Streptococcus.

Duodénum: sécrétions pancréatiques et biliaires,

mucus,

faible O2. Microflore : 103-10

4 UFC/g :

Bacteroides,

Candida albicans , Lactobacillus, Streptococcus.

Jéjunum: sécrétions pancréatiques et biliaires,

mucus,

péristaltisme. Microflore : 105-10

7 UFC/g

:Bacteroides,

Candida albicans , Lactobacillus, Streptococcus.

Iléon: Anaérobiose, sels biliaires, enzymes.

Microflore:

107-10

8 UFC/g : Bacteroides, Clostridium,

Enterobacteriacea , Enterococcus, Lactobacillus,

Veillonella .

Colon: Anaérobiose, motricité, enzymes bactériennes, acides gras volatiles, ammoniaque,… Microflore : 1010

-

1011

UFC/g: Bacteroides, Bacillus, Bifidobacterium, Clostridium, Enterococcus, Eubacterium, Fusobacterium

, Peptostreptococcus ,Ruminococcus , Streptococcus

Figure 4: Schéma simplifié décrivant les compartiments de l‘appareil digestif de l‘homme et

leurs microflores. D'après (Ouwehand and Vesterlund, 2003).

2.3. Implantation du microbiote intestinal

Tout contact entre le corps humain et un microorganisme qu‘il vienne d‘un aliment, de

l‘environnement, d‘un autre humain ou d‘animaux, peut en principe conduire à la

colonisation. Le fœtus des mammifères évolue in utero dans un environnement stérile et la

colonisation microbienne débute durant le processus de la naissance. En l‘absence des

mécanismes immunitaires sophistiqués de l‘adulte, le tube digestif du nouveau-né est un

environnement particulièrement permissif où les niveaux de population atteignent rapidement

1011

bactéries par gramme de selles. La colonisation suit néanmoins un schéma relativement

organisé, sous la dépendance de facteurs exogènes (exposition aux microorganismes d‘origine

maternelle (fécale, vaginale et cutanée) et environnementale, mais aussi l‘alimentation et

parfois l‘antibiothérapie) et endogènes (Bruno 2012).


Page 10

Quelques études indiquent que le lait maternel pourrait être le vecteur de

microorganismes de la mère vers l‘enfant. Ainsi, même collecté aseptiquement, le lait de

femme n‘est pas stérile (Warner, 2003).

Les bactéries qu‘il contient peuvent être transmises à l‘enfant via l‘allaitement. Deux

équipes de chercheurs ont étudié l‘influence de l‘allaitement maternel dans la mise en place

de la flore microbienne intestinale du nouveau-né (Perez et al., 2007).

Elles ont montré que des bactéries ayant pour origine l‘intestin de la mère transitent par

le lait.

La mère transmet donc des éléments qui vont contribuer à la colonisation de l‘intestin de

son enfant et auront un impact sur la mise en place de son immunité. Les bactéries anaérobies

qui dominent le microbiote intestinal de l‘adulte font parties des premiers microbes rencontrés

lors d‘une naissance par voie basse. Elles ne se développeront cependant en dominance dans

l‘intestin que lorsque les aérobies strictes et les anaérobies facultatives auront consommé

l‘oxygène présent. Ce premier relais d‘espèces s‘opère durant les heures qui suivent la

naissance. Des relations antagonistes gouvernent ensuite progressivement le relais d‘espèces

en dominance conduisant vers l‘âge de deux ans à un microbiote stable sur le plan fonctionnel

(figure 5).

Figure 5: Implantation du microbiote intestinal. D‘après (Wilson, 2008).


Page 11

Les bactéries anaérobies strictes dominent les bactéries anaérobies facultatives dans le

côlon distal et les selles par un facteur 1000 environ. L‘hygiène qui entoure la naissance et

les premiers moments de la vie conditionne fortement la dynamique de colonisation. Il

apparaît aujourd‘hui clairement que la colonisation par des espèces commensales habituelles

comme E. coli est retardée dans des pays industrialisés par rapport au passé (de quelques jours

à 6 mois) et par rapport au pays en voie de développement, apparemment du fait des

conditions d‘hygiène appliquées aujourd‘hui (Adlerberth et al., 2006 ; Nowrouzian et al.,

2003).

D'autres facteurs peuvent jouer un rôle dans la mise en place de la microflore intestinale

comme le génotype et le lieu de naissance de l'hôte (Bruno, 2012).

2.4. Le microbiote intestinal

Selon la définition de Isolauri et al. (2002), la flore intestinale normale est une collection

complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement le tractus gastro-

intestinal et remplissant un rôle dans la nutrition, la physiologie et le contrôle du système

immunitaire de l‘hôte

Après une colonisation complète, la microflore intestinale est considérée comme un

organe acquis après la naissance (Bruno, 2012). Il est constitué d‘une grande diversité

d‘espèces microbiennes assurant différentes fonctions pour l‘hôte. La microflore du tractus

gastro-intestinal a été estimée à près de 1013

-1014

cellules microbiennes représentant 400 à

600 espèces et sous espèces (Bäckhed et al., 2004).

Cette microflore représente environ 10 fois le nombre total de cellules du corps humain.

La prévalence des bactéries dans le tractus gastro-intestinal dépend des conditions régnant

dans le compartiment du tractus. Deux catégories de bactéries ont été identifiées : les bactéries

autochtones ou indigènes se trouvant dans des niches particulières, et les bactéries allochtones

ou transitoires (comme les probiotiques) rencontrées dans d‘autres habitats du tractus

(Bäckhed et al., 2004).

La majorité des bactéries pathogènes sont allochtones et vivent normalement en

harmonie avec l‘hôte, excepté lorsque l‘équilibre du système est rompu. Du point de vue

microbiologique, comme le montre la figure 4, l‘environnement gastro-intestinal comprend

trois régions principales qui offrent des conditions très différentes pour la survie des différents

microorganismes. Dans le premier compartiment, l‘estomac, la prolifération microbienne est

fortement réduite par la présence d‘oxygène apporté par la déglutition (29% de la teneur en

oxygène de l‘air) ainsi que par la présence d‘une forte acidité. De ce fait, l‘estomac héberge

sélectivement les microorganismes acidotolérants et anaérobies facultatifs comme les

lactobacilles, streptocoques, levures, etc. Dans le deuxième compartiment qui est le petit

intestin, la microflore est constituée essentiellement de bactéries anaérobies facultatives tels

que les lactobacilles, les streptocoques et les entérobactéries, et anaérobies strictes notamment

les bifidobactéries, les bactéroides et les clostridies. La teneur en oxygène du petit intestin est

de 4.6%. Dans le dernier compartiment qui est le côlon, le transit digestif est plus lent et la


Page 12

flore microbienne est plus abondante, représentant 35 à 50% du volume du contenu du colon

humain (Cummings et al., 1989)

La microflore du colon est très complexe et dominée par les bactéries anaérobies strictes

(Bacteroides spp., Clostridium spp., Bifidobacterium spp., Atopobium spp...). Tandis que

les bactéries anaérobies facultatives sont moins nombreuses et représentées par les

lactobacilles, les entérocoques, les streptocoques et les Enterobacteriaceae. Les levures (ex.

Candida albicans) sont assez faiblement représentées. La charge microbienne dans les

différents compartiments a été estimée à environ : 104, 10

3-4, 10

5-7, 10

7-8 et 10

10-11 (ufc)/g dans

l‘estomac, le duodénum, le jéjunum, l‘iléon et le colon respectivement (Ouwehand and

Vesterlund, 2003).

Les principaux composants de la flore du colon ainsi que leurs effets sur l‘hôte sont

présentés dans la figure 6.

Figure 6: Vue générale sur la microflore du colon humain.

D‘après (Gibson and Roberfroid, 1995).

3. Probiotiques

3.1. Historique de la définition des probiotiques

Le terme probiotique a bénéficié de plusieurs définitions qui ont évolué dans le temps en

fonction des connaissances scientifiques et des avancées technologiques. La notion de

probiotiques a été développée principalement grâce aux travaux de Metchnikoff ayant suggéré

que l‘ingestion de bactéries lactiques vivantes accroît la longévité en réduisant dans le tube

digestif la population de bactéries putréfiantes ou produisant des toxines. Une des premières


Page 13

définitions des probiotiques comme « facteurs promoteurs de croissance produits par des

microorganismes » a été proposé par Lilly et Stillwell en 1965. Depuis ce temps, la définition

du terme probiotique a été modifiée à plusieurs reprises (Ait-Belgnaoui et al., 2005;

Lamoureux, 2000).

En 1989, Roy Fuller a mis l‘accent sur la demande de viabilité des probiotiques et

introduisit l‘idée qu‘ils avaient un effet bénéfique sur l‘hôte (Guarner et al., 2008). La FAO et

l‘OMS (2002), ont établi récemment des lignes directrices pour l‘utilisation du terme

« probiotiques » dans les aliments et formulent la définition suivante : « les probiotiques sont

des microorganismes vivants qui lorsqu‘ils sont administrés en quantités adéquates, exercent

une action bénéfique sur la santé de l‘hôte qui les ingère».

Tableau 3: Certaines descriptions et définitions des probiotiques citées au cours des années

(Vasiljevic et Shah, 2008).

Année Description Source

1953 Probiotics are common in vegetable food as vitamins, aromatic

substances, enzymes and possibly other substances connected with vital

processes

Kollath

1954 Probiotics are opposite of antibiotic Vergin

1955 Deleterious effect of antibiotics can be prevented by probiotics therapy Kolb

1956 A Substance secreted by one microorganism which stimulates the

growth of another

Lilly and

Stillwell

1971 Tissue extracts which stimulate microbial growth Sperti

1973 Compounds that build resistance to infection in the host but do not

inhibit the growth of microorganisms in vitro

Fujii and Cook

1974 Organisms and substances that contribute to intestinal microbial balance Parker

1992 Live microbial feed supplement which beneficially effects the host

animal by improving microbial balance

Fuller

1992 Viable mono- or mixed of live microorganisms which applied to

animals or man have a beneficial effect on the host by improving the

proprieties of the indigenous microflora

Havenaar and

Huis int'veld

1996 Live microbial culture or cultured dairy product which beneficially

influences the health and nutrition of the host

Salminen

1996 Live microorganisms which, upon ingestion exerts benefits beyond

inherent basic nutrition

Schaafsma

1999 Microbial cell preparations or components of microbial cells that have a

beneficial effect on the health and well-being of the host

Salminen,

Ouwehand,

Benno and Lee

2001 A preparation of or a product containing viable, defined microorganisms

in sufficient number which alter the microflora ( by implantation or

colonization) in a compartment of the host and by that exert beneficial

health effect in this host

Scherezenmeir

and de Vrese

2002 Live microorganisms that when administrated in adequate amount

confer health benefit on the host

FAW/WHO


Page 14

3.2. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques

Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l‘espèce ou la souche

microbienne. Il est nécessaire de connaître le genre et l‘espèce de la souche utilisée car les

effets probiotiques sont spécifiques à la souche microbienne.

La non pathogénicité (innocuité) des souches est un critère très important, les souches

ayant le statut GRAS (Generally Regarded As Safe) sont d'ailleurs à favoriser. Toutefois, le

critère de viabilité ou de survie demeure essentiel dans la sélection des probiotiques qui

doivent parvenir vivantes au site de leur action, à savoir l‘intestin, et donc résister aux

différents mécanismes de défense de l‘hôte. Les bactéries étant administrées par voie orale, il

faut qu‘elles franchissent les obstacles majeurs du transit digestif : le pH acide, les sels

biliaires, les enzymes pancréatiques…etc (Millette et al., 2008; Lamoureux, 2000; Percival,

1997).

Le tableau 4 rapporte les critères les plus utilisé pour la sélection des probiotiques.

Tableau 4: Critères de sélection utilisés pour le screening des probiotiques

(Nousiainen et al., 2004).

Critères But cherché

Résistance à l'acidité gastrique Survie pendant le passage par l'estomac et duodénum

Résistance aux sels biliaires Survie pendant le passage par l'intestin grêle

Production d'acide (à partir de glucose et

lactose)

Production (de barrière acide) efficace dans l'intestin

Adhésion au mucus et/ ou aux cellules

épithéliales humaines

Colonisation efficace, réduction des sites d'adhésion des

pathogènes à la surface

Production de substances antimicrobiennes Inhibition du développement des germes pathogènes

Résistance à la chaleur Survie pendant le processus de transformation

Bonnes propriétés technologiques Stabilité, croissance sur une large échelle, survie dans le

produit, résistance aux bactériophages

3.2.1. Résistance à l'acidité gastrique

La survie des bactéries dans le suc gastrique dépend de leur capacité à tolérer les bas pH.

Le temps de passage peut être d‘une heure à quatre heures selon l'individu et son régime. Par

conséquent, quelques auteurs proposent que les souches probiotiques doivent résister à un pH

de 2.5 dans un milieu de culture pendant quatre heures (Ammor et Mayo, 2007).

3.2.2. Résistance aux sels biliaires

Dans l'intestin grêle, la tolérance aux sels biliaires est un facteur important qui contribue

à la survie des probiotiques. Les bactéries qui survivent aux conditions acides de l'estomac

doivent alors faire face à l‘action détergente des sels biliaires libérés dans le duodénum après

ingestion des repas gras.


Page 15

Les bactéries peuvent réduire l‘effet émulsifiant des sels biliaires en les hydrolysant avec des

hydrolases, de ce fait diminuant leur solubilité (Gu et al., 2008; Ammor et Mayo, 2007 ).

3.2.3. Adhésion aux cellules épithéliales

La capacité d‘adhésion à l'épithélium intestinale est un critère de sélection recommandé

pour le choix des probiotiques, car c'est une condition pour la colonisation des entrailles.

L'adhérence constitue le premier mécanisme de défense contre l‘invasion des bactéries

pathogènes. (Reyes-Gavilan et al., 2011; Palomares et al., 2007).

3.2.4. Production de substances antimicrobiennes

Les bactéries lactiques synthétisent des molécules à action bactéricide (ou

bactériostatique) comme les acides organiques, le peroxyde d‘hydrogène, le dioxyde de

carbone, le diacétyle et les bactériocines. Ces mécanismes antimicrobiens ont été exploités

pour améliorer la préservation des aliments (Labioui et al., 2005; Titiek et al., 1996 ).

3.2.5. Résistance aux antibiotiques

Les bactéries lactiques sont naturellement résistantes à beaucoup d‘antibiotiques grâce à

leur structure et physiologie. Les travaux de Temmerman et al. (2003) ont montré que 68.4%

des probiotiques isolés ont une résistance à un antibiotique ou plus. Des souches de

Lactobacillus ont été trouvées résistantes à la kanamycine (81%), à la tétracycline (29.5%), à

l‘érythromycine (12%) et au chloramphénicol (8.5%). 38% des isolats de Enterococcus

faecium ont été trouvés résistants à la vancomycine.

Dans la plus part des cas la résistance n‘est pas transmissible, cependant, il est possible

que le plasmide codant pour la résistance aux antibiotiques soit transféré à d‘autre espèces et

genres. C'est une raison significative pour choisir des souches manquantes du potentiel de

transfert de résistance (Denohue, 2004).

Les autorités européennes ont récemment conclu que quelques bactéries utilisées pour la

production d‘aliment pourraient poser un risque à la santé humaine et animale en raison

d'héberger des souches avec les gènes de résistance transmissibles. Par conséquent, avant de

lancer une culture probiotique, il est important de vérifier que les souches bactériennes

impliquées ne comportent pas de gènes transmissibles de résistance aux antibiotiques (Ammor

et Mayo, 2007).

3.2.6. Critères technologiques

Plusieurs aspects technologiques doivent être pris en compte dans la sélection des

probiotiques tels que :

3.2.6.1. Viabilité et stabilité des microorganismes

Pour exercer leur effet bénéfique sur la santé, les probiotiques doivent survivre en grand

nombre au procédé de fabrication, et à la période d‘entreposage au froid qui s‘ensuit.

Cependant, la stabilité physique et génétique des cellules ainsi que toutes les propriétés

nécessaires pour exercer leurs bienfaits sur la santé doivent également être assurées


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(Izquierdo, 2009). De plus, ces souches devraient être viables sans se multiplier pour ne pas

provoquer d‘effet indésirable sur le goût ou l‘arôme du produit ni augmenter l‘acidité

(Mattila-Sandholm et al., 2002). Par ailleurs, plusieurs études ont démontré que des cellules

en phase stationnaire de croissance, plus tolérantes aux stress environnementaux que des

cellules en phase exponentielle, devraient être privilégiées pour la confection de produits

contenant des probiotiques en grand nombre (Heller, 2001).

3.2.6.2. Propriété acidifiante

La fonction acidifiante est la plus recherchée des bactéries lactiques qui a pour effet une

production importante d‘acide lactique conduisant à une acidification rapide et durable, les

conséquences d‘ordre physicochimique et microbiologique sont récapitulées d‘après

Surta et al., 1998 : coagulation du lait, la synérèse du caillé et la solubilisation du calcium

micellaire, elle participe aux qualités organoleptiques des produits laitiers fermentés et inhibe

la croissance de microorganismes nuisibles.

3.3. Effets bénéfiques des probiotiques sur la santé humaine

Les probiotiques ont pour but d‘aider la flore microbienne naturelle de l‘intestin. De

plusieurs avantages pour la santé sont fournis par l'ingestion des aliments contenant des

cultures probiotiques (Da Cruz et al., 2010). Il est important de mentionner que les effets de

la promotion de la santé dépendent de la souche présente dans la formulation du produit, et

qu'il n'y a pas une souche probiotique en mesure de fournir tous les avantages (Shah, 2007).

Figure 7: Présentation des effets bénéfiques de la consommation des probiotiques sur la santé

humaine (Saarela et al., 2000).


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Les principaux effets bénéfiques sur la santé de l'hôte sont les suivants :

3.3.1. Soulagement de la constipation

Les lactobacilles peuvent avoir des effets sur la constipation (selles difficiles, dureté

excessive des selles, transit intestinal lent) et permettent de réduire l‘utilisation de laxatifs,

qui ont l‘inconvénient majeur d‘éliminer différentes substances essentielles à l‘organisme

comme les acides aminés, les minéraux… (Guarner et al., 2008).

3.3.2. Amélioration de l'utilisation du lactose par l'organisme

L‘un des effets des bactéries lactiques qui a été le plus mis en avant et démontré chez

l‘Homme est celui qui concerne l‘amélioration de l‘intolérance au lactose (De Vrese et al.,

2001). Chez les personnes souffrant d‘intolérance au lactose, un déclin de la production de

β-galactosidase est observé au-delà de la petite enfance.

La deuxième cause d‘intolérance (intolérance secondaire) est représentée par les

maladies comme les résections intestinales, les gastro-entérites, la maladie céliaque ou les

gastrectomies.

Plusieurs études ont montré que la β-galactosidase des bactéries lactiques participait à la

digestion du lactose dans l‘intestin. En principe, le remplacement du lait par du yaourt

conduit à une meilleure absorption et une meilleure tolérance chez les sujets présentant une

intolérance au lactose (primaire et secondaire). Streptococcus thermophilus et Lactobacillus

delbrueckii ssp. bulgaricus améliorent la digestion du lactose et réduisent les symptômes liés

à l‘intolérance au lactose (douleurs abdominales, ballonnements). Plusieurs travaux

explicatifs ont montré que la lactase de bactéries lactiques participe à la digestion du

lactose du yaourt (90%) chez les sujets déficients en lactase (Guarner et al., 2008).

3.3.3. Prévention ou raccourcissement de la durée des diarrhées

Des études cliniques ont démontré que la diarrhée du voyageur, diarrhée aux

rotavirus, diarrhée associée aux antibiotiques comme celle causée par Clostridium difficile,

peuvent être contrecarrées avec succès par l‘utilisation de probiotiques tels que :

L. rhamnosus, B. bifidum, S. thermophilus, L. acidophilus, L. bulgaricus (Wang et al., 2004) .

Les mécanismes potentiellement impliqués incluent la production d‘acide lactique, de

peroxyde d‘hydrogène, d‘autres substances antimicrobiennes telles que les bactériocines, la

compétition pour des nutriments ou des récepteurs d‘adhésion, des actions anti toxines et la

stimulation du système immunitaire (Gill, 2003).

Plusieurs études randomisées contrôlées sur l‘Homme ont montré l‘efficacité des souches

probiotiques pour prévenir ou atténuer les perturbations digestives liées à la prise

d‘antibiotiques (Cremonini et al., 2002 ; Fooks et Gibson, 2002) et les diarrhées

nosocomiales infantiles dues surtout à des rotavirus (Szymanski et al., 2006).


Page 18

3.3.4. Contrôle des infections intestinales par Helicobacter pylori

L‘infection par Helicobacter pylori favorise les risques d‘ulcère du duodénum et de

l‘estomac et de certains cancers et lymphomes gastriques (Dial et Lichtenberges, 2002).

Wang et al. (2004) ont rapporté que la consommation régulière de yaourt additionné de

L. acidophilus La5 ou de Bifidobacterium lactis BB12 induit une suppression effective de

l‘infection due à Helicobacter pylori. La croissance d‘Helicobacter pylori est inhibée par

la production de quantités importantes d‘acide lactique (Zubillaga et al., 2001) et par la

production de bactériocines notamment la lacticine produite par Lactococcus lactis et qui

exerce une activité antimicrobienne contre plusieurs souches d‘Helicobacter pylori.

3.3.5. Activité antivirale

Les probiotiques, comme une partie de la microflore intestinale, sont signalé es à

promouvoir la défense de l‘hôte et à moduler le système immunitaire (Clancy, 2003; Cross,

2002).

Parmi elles, les genres Lactobacillus sp. et Bifidobacterium sp, sont indiqués pour

stimuler l‘immunité systémique à médiation cellulaire (TH1) et sont aujourd‘hui largement

utilisés dans les thérapies probiotiques (Clancy, 2003;Cross, 2002). Ils ont plusieurs

avantages à l‘hôte, y compris le potentiel de stimuler l‘activité antivirale (Kidd, 2003 ; Kaila

et al., 1995).

Les avantages des probiotiques ont été démontrés chez les patients présentant de diarrhée

associée aux rotavirus et au VIH (Goossens et al., 2003; Rosenfeldt et al., 2002; Rolfe, 2000).

Les mécanismes par lesquels elles sont à combattre les infections sont suggérés

d‘inclure l‘exclusion des agents pathogènes par le biais de la concurrence pour la fixation et

la stimulation des défenses immunitaires de la cellule hôte (Isolauri, 2003).

3.3.6. Diminution des allergies alimentaires

L‘allergie alimentaire du nourrisson se traduit souvent par de l‘eczéma atopique. Les

traitements curatif et préventif de cette pathologie par des BAL ont été évalués lors d‘une

étude clinique sur 27 enfants nourris au sein et souffrant d‘eczéma atopique (Arvola et al.,

2000).

Il a été notamment observé qu‘après deux mois de traitement avec une formule

supplémentée en L. rhamnosus GG et B. lactis BB12, il y a eu une amélioration plus rapide

de l‘état atopique en comparaison avec le groupe placebo. Un effet préventif de L. rhamnosus

GG a aussi été observé chez des enfants à risque nés de parents atopiques (Kalliomaki et al.,

2001).

Les mécanismes ainsi que les processus régulateurs de l‘allergie sont loin d‘être tous

connus.

Plusieurs mécanismes touchant à l‘immunité ou à l‘état de la muqueuse ont été suggérés

pour expliquer l‘effet protecteur des BAL. Celles-ci pourraient, en diminuant la perméabilité


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intestinale très augmentée en période de réactivité allergique, participer à la diminution du

passage des protéines alimentaires (Rautava et al., 2002).

3.3.7. Réduction du taux de cholestérol sanguin

Des tests in vitro ont montré une réduction du taux de cholestérol dans un milieu de

culture avec certains Lactobacillus (Zhang et al., 2008). Plusieurs hypothèses ont été émises

pour expliquer ce fait, comme l‘assimilation du cholestérol par les bactéries ou l‘hydrolyse

des sels biliaires conjugués.

Les acides biliaires, synthétisés par le foie à partir du cholestérol, sont "recyclés" et

utilisés en moyenne trois fois pendant un même repas. L‘hydrolyse des sels biliaires

conjugués (les acides biliaires doivent être conjugués à la taurine et à la glycine pour être

solubles) rend nécessaire la synthèse de sels biliaires supplémentaires, ce qui conduirait à une

réduction du cholestérol (Liong et Shah, 2005).

Bien que la déconjugaison des sels biliaires puisse avoir des effets bénéfiques sur l‘hôte,

comme la diminution des niveaux de cholestérol, une déconjugaison excessive ou une

déshydroxylation des acides biliaires par certains microorganismes semble avoir plusieurs

effets néfastes sur l‘hôte. Les bactéries les plus fréquemment désignées comme probiotiques,

telles que les souches des genres Lactobacillus et Bifidobacterium, sont incapables de

déshydroxyler les sels biliaires déconjugués.

Une autre explication évoque une diminution du taux de cholestérol qui serait

uniquement due à la co-précipitation du cholestérol avec les sels biliaires déconjugués,

phénomène qui ne peut pas se produire in vivo car le pH est plus élevé que dans un milieu de

culture acidifié par les BAL.

Des études ont été réalisées sur des humains pour tester l‘influence de la consommation

des produits laitiers fermentés sur le taux de cholestérol sanguin, mais les résultats n‘ont

jamais été confluents (Pereira et Gibson, 2002).

3.4. Production et maintenance de la viabilité des bactéries probiotiques dans les

produits laitiers

3.4.1. Emploi des bactéries probiotiques dans les produits laitiers

Les produits laitiers probiotiques appartiennent à la catégorie des produits laitiers

fonctionnels qui ont montré une croissance impressionnante au cours de la dernière décennie)

(Menrad, 2003). Ainsi, le nombre des produits disponibles et la connaissance du

consommateur du concept probiotique a évolué, et, en conséquence, la recherche sur ces

produits a également augmenté.

Plus de 600 produits alimentaires probiotiques sont commercialisés par l‘industrie laitière

depuis 2006 comprenant : les crèmes glacées, les fromages, le beurre, les laits en poudre, les

desserts glacés et la mayonnaise (Sveje, 2007). Cependant, les exemples les plus connus des

produits laitiers probiotiques sont le lait fermenté et les yaourts, qui sont généralement

consommés après quelques jours ou semaines de leur fabrication (Nagpal et al., 2007).


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Le yaourt a longtemps été reconnu comme un produit avec de nombreuses

caractéristiques appréciées par les consommateurs, ce qui en fait un choix évident en tant que

porteur de souches probiotiques.

Au cours de ces dernières années, la popularité de bio-yaourts, contenant des ferments

S.thermophilus, Lb. bulgaricus, Lb. acidophilus et des espèces de Bifidobacterium a

augmenté de manière significative (Farnworth, 2008).

3.4.2. Viabilité des bactéries probiotiques

Afin d'obtenir les effets souhaités, les bactéries probiotiques doivent être capables de se

croître dans le lait et de survivre à un taux suffisamment élevé (Tamime, 2005).

Dans la littérature scientifique, des concentrations minimale de 106 et 10

7 UFC/g dans le

produit fini sont considérées comme des quantités thérapeutiques de cultures probiotiques

dans les aliments transformés (Talwalkar et al., 2004), atteignant 108

et 109 UFC/g, fournies

par une consommation quotidienne de 100 g ou 100 ml de lait fermenté, d'où un bénéfice

pour la santé de l'Homme (Jayamanne et Adams, 2006).

Ces chiffres élevés ont été proposés pour compenser les pertes possibles des

microorganismes probiotiques pendant la durée de conservation de l‘aliment probiotique,

lors du transit dans les conditions acides de l'estomac, et de résister aux sels biliaires dans

l'intestin grêle (Tamime, 2005).

Au Japon, l‘association des laits fermentés et les boissons lactées a mis au point un

chiffre standard, qui recommande la présence d‘un minimum de 107

UFC/ml de bactéries

lactiques viables dans les produits laitiers (Tamime, 2005).

3.4.2.1. Effet du procédé technologique sur la viabilité des bactéries probiotiques

La viabilité de bactéries probiotiques dans les produits laitiers au cours du procédé

technologique dépend des souches utilisées, l'interaction entre les espèces présentes, la

production de peroxyde d'hydrogène par le métabolisme bactérien, les composants de la

matrice alimentaire et l'acidité finale du produit (Farnworth, 2008).

La viabilité dépend également de la disponibilité des éléments nutritifs, les activateurs et

inhibiteurs de croissance, la concentration des sucres, l'oxygène dissous et de l'oxygène

perméable à travers l‘emballage (en particulier pour les espèces Bifidobacterium), le niveau

d'inoculation et le temps de fermentation (Oliveira et Damin, 2003).

Les principaux facteurs qui affectent la viabilité des probiotiques sont :

La composition du milieu de fermentation

Les bactéries probiotiques sont utilisées dans la fermentation du lait dans une mesure

limitée en raison du ralentissement de leur croissance dans le lait.


Page 21

En général, les bactéries probiotiques se développent mieux dans les milieux

synthétiques riches à savoir, peptone tryptone levure (TPY) et le bouillon De Man, Rogosa

et Sharpe (MRS), que dans le lait.

Toutefois, ces milieux sont complexes et coûteux pour la propagation à grande échelle

des bactéries probiotiques et peuvent également conférer une flaveur avant l'incorporation.

Pour la fabrication d'un produit de qualité, tant en termes de texture et de viabilité de

bactéries probiotiques, un milieu à base de lait est habituellement nécessaire en raison de la

présence de la caséine (Shah, 2007).

L'oxygène

Au cours de la production de yaourt, l'oxygène peut facilement envahir et se dissoudre

dans le lait. L'oxygène peut également pénétrer dans le produit à travers les matériaux

d'emballage pendant le stockage (Dave et Shah, 1998).

L‘oxygène affecte les cultures probiotiques de deux façons :

Premièrement, il est directement toxique pour les cellules ; certaines cultures

probiotiques sont sensibles à l'oxygène et meurent en sa présence.

Deuxièmement, dans la présence d'oxygène, certaines cultures, notamment

Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, produisent le peroxyde. Une inhibition synergique de cultures

probiotiques à cause du peroxyde d'hydrogène et d'acide a été rapportée (Lankaputhra et Shah,

1996)

Les additifs

D‘après le comité FAO–OMS, un additif alimentaire est défini comme une substance

dotée ou non d‘une valeur nutritionnelle, ajoutée intentionnellement à un aliment dans un but

technologique, sanitaire, organoleptique ou nutritionnel. Son emploi doit améliorer les

qualités du produit fini sans présenter de danger pour la santé, aux doses utilisées. Il peut être

d‘origine naturelle, ou artificielle : produits de transformation de substances naturelles

(amidons transformés comme agents de texture etc.) ou encore être un arôme de synthèse.

L‘additif porte la mention« E » (pour « Europe »), suivie d‘un numéro d‘identification. Sa

présence et la dose doivent être précisées sur l‘emballage (Bourrier, 2006).

Les additifs alimentaires sont indispensables dans l'industrie laitière. Cependant, les

effets des additifs sur la croissance des bactéries lactiques probiotiques n‘ont pas été

largement étudiés (Bouchefra, 2012).

3.4.2.2. Méthodes d’améliorations de la viabilité des microorganismes probiotiques

Sélection des souches

Il est important que la viabilité de la souche et la stabilité des caractéristiques

souhaitables soient maintenues pendant la production commerciale, ainsi que dans le produit

fini (Talwalker et Kailasapathy, 2004; Godward et al., 2000).


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La viabilité et le taux de survie lors du passage dans l'estomac sont nécessaires pour

permettre aux probiotiques vivants des produits laitiers fermentés d‘exercer un rôle

biologique dans l'intestin humain. Ainsi, la sélection de souches appropriées sur la base de

leur tolérance à l‘acidité et aux sels biliaires contribuerait à améliorer la viabilité de ces

souches bactériennes probiotiques (Takahashi et al., 2004).

Taux d'inoculation

Les microorganismes probiotiques croissent mal dans le lait, un volume élevé de

l'inoculum (5-10 ml/ 100 ml lait) est nécessaire, par rapport à un petit inoculum (1 ml/ 100

ml de lait) dans le cas des cultures starter du yaourt, ce qui peut entraîner une sur-

acidification du produit et cela se traduit éventuellement par la faible survie des bactéries

probiotiques. Le pH final à la fin de la fermentation est le facteur crucial pour la survie des

microorganismes probiotiques. A ce stade un pH inférieur à 4,4 entraîne une diminution

substantielle des bactéries probiotiques. Par conséquent, le niveau d'inoculum doit être

soigneusement réglé et contrôlé (Tamime, 2005).

L'utilisation des pièges à oxygène

La teneur en oxygène et le potentiel d'oxydoréduction sont des facteurs importants pour

la viabilité pendant le stockage à froid. L'acide ascorbique (vitamine C) agit comme un

capteur d'oxygène et est autorisé comme additif alimentaire. En outre, le lait et les produits

laitiers offrent seulement 10-15% des besoins quotidiens en vitamine C. Ainsi, la fortification

du yaourt avec de l'acide ascorbique pourrait augmenter sa valeur nutritive (Dave et Shah,

1997a).

St. thermophilus est aérobie, et leur nombre devrait rester faible en présence d'acide

ascorbique. La viabilité de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (étant des microaérophiles) devrait

s'améliorer avec une concentration plus importante en acide ascorbique. Bien que l'ajout

d'acide ascorbique contribue à améliorer la survie de Lb. acidophilus, l'effet du piégeage

d'oxygène est insuffisant pour améliorer la viabilité des bifidobactéries anaérobies (Tamime,

2005).

L'ajout de la Cystéine

La cystéine est un acide aminé contenant du soufre, fournit l'azote aminé comme facteur

de croissance tout en réduisant le potentiel d'oxydoréduction. La cystéine à 250 mg L-1

semble à améliorer la survie de Lb. acidophilus et Bifidobacterium spp. Il convient de noter

que la faible concentration en cystéine (50 mg L-1

) améliore la croissance de

St. thermophilus (Dave et Shah, 1997b).

Une légère baisse du potentiel d'oxydoréduction est bénéfique pour la survie de

St. thermophilus, mais lorsque la concentration en cystéine est supérieure à 50 mg L-1

, la

dépression du potentiel d'oxydoréduction affecte la croissance bactérienne.

La croissance de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus serait améliorée grâce à de faibles

niveaux de cystéine, mais elle serait inhibée à des niveaux plus élevés (Tamime, 2005).


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3.5. Défis technologiques associés au développement des cultures probiotiques

La production et la commercialisation des probiotiques à l‘échelle industrielle exposent

les microorganismes à des conditions défavorables qui peuvent tuer une grande partie des

bactéries.

Des nouvelles technologies de séchage, notamment de lyophilisation (freeze drying),

exposent les microorganismes à des conditions plus douces et permettent de conserver la

viabilité des probiotiques. Si les baisses de viabilité sont inacceptables lors de la fermentation,

la lyophilisation, ou la production de cultures concentrées dans des billes de gel d‘alginate

ou de carraghénane est une alternative au processus traditionnel (Macouzet et Champagne,

2007).

3.5.1. Méthodes de production

3.5.1.1. Lyophilisation

La lyophilisation est une méthode pratique pour la préservation et la conservation à long

terme des bactéries probiotiques. Elle consiste à retirer de l'eau de la suspension de cellules

congelées par sublimation sous pression réduite. La sublimation est le processus par lequel

l'eau est éliminée directement à partir de la glace, sans passer par l'état liquide (Malik, 1990).

La lyophilisation est bien adaptée pour la conservation de matériel biologique sensible,

car le gel ralentit ou arrête la plupart des réactions chimiques. Ce processus se déroule sous

vide et en l'absence d'oxygène qui font qu'il est impossible que les réactions d'oxydation se

produisent.

Pour surmonter l'inactivation au cours du séchage et une mauvaise stabilité pendant le

stockage les cryoprotecteurs comme le glycérol, la cystéine ou le sucrose sont ajoutés en

période de lyophilisation des lactobacilles. La lyophilisation est considérée comme l'étalon-or

des méthodes de séchage où la viabilité, la saveur et l‘arôme sont préservés à long terme

durant le stockage, la commercialisation et la consommation (Farnworth, 2008).

3.5.1.2. Microencapsulation

La microencapsulation est un processus par lequel les cellules microbiennes sont

enfermées dans une couche protectrice. L‘encapsulation réduit la perte de la viabilité des

cellules, en séparant les cellules bactériennes de l'environnement défavorable. La couche de

protection permet de réduire la perte de cellules et de blessures en bloquant les composants

actifs tels que l'humidité, l'oxygène atmosphérique et les acides (Sultana et al., 2000).

Il a été constaté que les bactéries lactiques probiotiques utilisées dans les applications

alimentaires enfermées dans des microcapsules de graisse solide conservent toute leur activité

biologique (Krasaekoopt et al., 2003).


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3.5.1.3. L’ajout des prébiotiques

Les probiotiques et les prébiotiques sont des ingrédients qui peuvent être consommés

séparément. Toutefois, lorsqu‘on prépare des aliments fonctionnels avec un mélange de

bactéries probiotiques et de composés prébiotiques, ces produits sont nommés symbiotiques.

Les symbiotiques ont été conçus pour avoir un effet dans le système gastro-intestinal.

Toutefois, on leur découvre de plus en plus de bénéfices secondaires. En effet, une croissance

accrue de probiotiques s‘observe parfois dans les laits fermentés ainsi qu‘une plus grande

stabilité lors de l‘entreposage (Macouzet et Champagne, 2007).

4. Les bifidobactéries

4.1. Taxonomie

Les bifidobactéries ont été découvertes pour la première fois dans les fèces infantiles

nourris au lait maternel par Tissier (1900), qui a isolé une bactérie avec une forme étrange et

caractéristique de Y et l'a appelée Bacillus bifidus. Cette bactérie était anaérobie, Gram

positive et n'a pas développé de gaz pendant sa croissance. Depuis leur première description,

la classification de ces bactéries n'a cessé d'être révisée passant du genre Bacillus, à celui de

Bacteroïdes (Castellani et Chalmers, 1919), Lactobacillus (Hollande ,1920), Bifidobacterium

(Orla-Jensen ,1924), Bacterium (Lehmann et Neumann, 1927), Tissieria (Pribram, 1929),

Nocardia (Vuillemin, 1931), Actimomyces (Nannizzi, 1934), Actinobacterium (Puntoni,

1937) et Corynebacterium (Olsen, 1949).

En raison des similitudes entre les bifidobactéries et les bactéries du genre Lactobacillus,

ils ont été inclus dans ce genre comme classifier dans la 7e édition du manuel de Bergey de la

bactériologie déterminative (Breed et al., 1957).

Dehnert (1957) a décrit l'existence des biotypes multiples des bifidobactéries et a proposé

un arrangement pour la différenciation entre les souches basées sur leurs modèles de

fermentation d'hydrate de carbone.

Durant la même année Cummins et ses collaborateurs ont examiné la composition de la

paroi cellulaire de plusieurs souches de bifidobactéries et ont conclu que ces bactéries sont

différentes de toutes les bactéries Gram positifs précédemment examinées (Cummins et al.,

1957)

La classification taxonomique des bifidobactéries était donc à revoir et le sujet a été

relancé de nouveau à l‘investigation.

En 1963, Reuter a effectué des tests biochimiques et sérologiques sur des souches de

bifidobactéries isolées des fèces d'enfants et d‘adultes et a proposé l'arrangement suivant pour

l'identification de ces bactéries: des bactéries aux formes bacillaires ,anaérobie , Gram positif,

ressemblaient à des lactobacilles, excepté la variabilité morphologique, elles fermentent le

glucose en produisant de l'acide acétique et de l'acide lactique d'un rapport 2:1 et fermentent

11 sucres additionnel des sucres déjà étudiés. Sur cette base il conclut que ces bactéries


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devraient être classées dans la tribu Lactobacilleae, famille Lactobacillaceae dans le genre

Bifidobacterium.

Scardovi et Trovatelli (1965) et De Vries et al. (1967) ont découvert une nouvelle voie de

fermentation des hexoses chez les bifidobactéries, qui ne se trouve pas dans aucune des

espèces du genre Lactobacillus. L'enzyme principale de cette voie est une fructose-6-

phosphate phosphoketolase qui clive le fructose-6-phosphate en érythrose-4-phosphate et en

acétyle phosphate (figure 8).

Figure 8: Formation d'acétate et de lactate à partir de glucose par la voie des bifidobactéries.

D'après Scardovi et Trovatelli,(1965).

1 : hexokinase et glucose-6-phosphateisomérase 2 : fructose-6-phosphate phosphoketolase, 3 : transaldolase, 4 : transketolase, 5 : ribose-5-phosphate isomérase,

6 : ribulose-5-phosphate-3-epimerase, 7 : xylulose-5-phosphoketolase, 8 : acétate kinase, 9 : Les mêmes enzymes appliqués dans la voie homofermentative


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En 1970, Scardovi et ces collaborateurs ont commencés a appliqué intensivement le

procédé d'hybridation ADN-ADN afin d'évaluer la validité des espèces de bifidobactéries

précédemment décrite et pour identifier de nouveaux groupes de séquences ADN

homologique parmi les souches qu'ils isolaient dans des diverses niches écologiques. Cette

technique d‘identification est une avance significative en bactériologie déterminative et a aidé

à résoudre une grande partie de la confusion précédemment rencontré quand a la

différenciation d'espèce de Bifidobacterium qui a été faite principalement sur le profil

fermentaire d'hydrate de carbone.

Dans la 8e édition du manuel de Bergey du déterminatif de la bactériologie (Rogosa,

1974), les bifidobactéries ont été classifiées dans le genre Bifidobacterium en utilisant le

même nom proposé par Orla-Jensen. Le genre a comporté huit espèces; il a été inclus dans la

famille des Actinomycetaceae d'ordre Actinomycetales.

Une autre correction à la classification a été apportée après l'introduction de

l'électrophorèse des protéines cellulaires solubles sur le gel de polyacrylamide comme critère

d'identification d'espèce (Biavati et al., 1982).

La nouvelle description d'espèce et les remises en ordre apportées à la classification

précédente ont contribué à l'identification de 24 espèces rapportées dans la première édition

du manuel de Bergey de la bactériologie systématique (Scardovi, 1986).

Stackebrand et al. (1997), par l'analyse de ARNr16s, ont proposé une structure

hiérarchique rassemblant le genre Bifidobacterium avec le genre Gardnerella dans une seule

famille Bifidobacteriaceae dans l‘ordre de Bifidobacteriales.

De nos jours cette famille comporte 6 genres: Aeriscardovia, Alloscardovia,

Bifidobacterium, Gardnerella, Parascardovia et Scardovia (Euzéby, 2007).

4.2. Les espèces du genre Bifidobacterium

L‘évolution des techniques utilisées à des fins taxonomiques y compris l‘hybridation

ADN-ADN, a permis jusqu‘à 1992 l‘identification de 29 espèces. La plupart de ces espèces se

distinguent d‘un point de vue physiologique par leur profil fermentaire aux différents sucres

(tableau 5) (Scardovi., 1986).


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Tableau 5: Profile fermentaire des différentes espèces de Bifidobacterium (Scardovi, 1986).

Sucres Espèces

Xyl Man Fruc Gal Sucr Sali Inul Malt Mlb Treh

B. bifidum - - + V - - - - -

B. longum V V + + + - + - - -

B. longum ssp. infantis

V + + + - + - -

B. breve V + + + + V + V V +

B. adolescentis - V + + + V + V V +

B. angulatum + - + + + - + - + +

B. catenulatum + - + + + V + V V +

B. pseudocatenulatum + + + + + V + - - +

B. dentium + + + + + + + + - +

B. pseudolongum ssp. globosum

V - + + + - + - - -

B. pseudolongum ssp. pseudolongum

+ + + + + - + - - -

B. cuniculli + - - + + - + - - -

B. choerinum V - - + + - + - - -

B. animalis + V + + + V + - - +

B. thermophilum + - + + + V + - V V

B. boum - - + + + - + - + - B. magnum + - + + + - + - - -

B. pullorum + + + + + + + - + +

B. longum ssp. suis + V V + + - + - - -

B. minimum - - + + + - - - - -

B. subtile - - + + + V + - V V B. coryneforme + + + + + - + - +

B. asteroides + - + + V - + - - +

B. indicum - V + + V - + - - + - : négatif + : positif v : variable

Xyl: Xylose Man : Mannitol Fruc : Fructose Gal : Galactose Sucr: Sucrose Treh: Trehalose Mlb:

Melobiose Malt: Maltose Inul: Inulin Sali: Salicin

Depuis, 1994 trois nouvelles espèces ont été ajoutées à la liste, il s‘agit de

Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium donticolens et Bifidobacterium inopinatum, ce qui fait

de 32 espèces (Kaufmann et al., 1997).

Aujourd‘hui le genre Bifidobacterium compris 48 espèces (tableau 6) (Tsuchida et al.,

2014 ).

Les espèces les plus récemment décrites sont : B. mongoliense, B. stercoris, B. bombi et

B.bohemicum, B. actinocoloniiforme (Killer et al., 2011 ; Kim et al., 2010; Killer et al., 2009 ;

Watanabe et al., 2009).


Page 28

Tableau 6: Les espèces du genre Bifidobacterium et leur écologie.

Ecology References

Sp

ecie

s

B. actinocoloniiforme Digestive tract content of Bombus lucorum Killer et al. (2011)

B. adolescentis Faeces of human adults;bovine rumen; sewage Reuter (1963)

B. angulatum Sewage; faeces of human adult Scardovi & Crociani

(1974)

B. animalis

ssp. animalis

ssp. lactis

Faeces of rats and guinea pigs

Faeces of chickens and rabbits, fermented milk

and sewage

Scardovi & Trovatelli

(1974)

Masco et al.(2004)

Meile et al. (1997);

Masco et al. (2004)

B. asteroides Intestine of Apis mellifera ssp. caucasica,

ligustica, and mellifera


(1969)

B. biavatii Tamarind faeces Bottacini et al. (2014)

B. bohemicum Digestive tract content of Bombus lucorum Killer et al. (2011)

B. bifidum Faeces of human adults,infants, and suckling

calves; human vagina

Orla-Jensen (1924)

B. bombi Digestive tract of bumblebees Killer et al. (2009)

B. boum Bovine rumen; faeces of piglets Scardovi et al. (1979b)

B. breve Faeces of infants and suckling calves Reuter (1963)

B. callitrichos Marmoset faeces Bottacini et al. (2014)

B. catenulatum Faeces of infants and human adults; human

vagina; sewage

Scardovi & Crociani

(1974)

B. choerinum Faeces of piglets; sewage Scardovi et al. (1979b)

B. coryneforme Intestine of Apis mellifera ssp.mellifera


(1969)

Biavati et al. (1982)

B. crudilactis Raw milk cheese Bottacini et al. (2014)

B. cuniculi Faeces of rabbits Scardovi et al. (1979b)

B. dentium Human dental caries and oral cavity, faeces of

human adults; human vagina; abscesses and

appendices

Scardovi & Crociani

(1974)

B. gallicum Human faeces Lauer (1990)

B. gallinarum Chicken caecum Watabe et al. (1983)

B. indicum Intestine of Apis cerana and A. dorsata Scardovi & Trovatelli

(1969)

B. kashiwanohense Infant faeces Bottacini et al. (2014)

B. longum

ssp.longum

ssp.infantis

ssp.suis

Faeces of human adults, infants, and suckling

calves, human vagina,sewage

Faeces of infants and suckling calves, human

vagina

Faeces of piglets

Reuter (1963);

Mattarelli et al. (2008)

Reuter (1963);


Matteuzzi et al.(1971);


B. magnum Faeces of rabbits Scardovi & Zani (1974)

B. merycicum Bovine rumen Biavati & Mattarelli

(1991)

B. minimum Sewage, pig caecum Biavati et al. (1982)

B. mongoliense ermented milk (airag) Watanabe et al. (2009)

B. moukalabense Gorilla faeces Bottacini et al. (2014)

B. pseudocatenulatum Faeces of infants and suckling calves, sewage Scardovi et al. (1979b)

B. pseudolongum

ssp. pseudolongum

Faeces of bulls, calves, chickens, dogs, guinea

pigs, pigs and rats

Mitsuoka (1969)

Yaeshima et al. (1992


Page 29

ssp. globosum

Faeces of lambs, piglets,rabbits, rats and suckling

calves, bovine rumen, sewage

Scardovi et al. (1969)

Biavati et al. (1982)

Yaeshima et al. (1992)

B. psychraerophilum Pig caecum (content and epithelium) Simpson et al. (2004)

B. pullorum Faeces of chickens Trovatelli et al. (1974)

B. reuteri Marmoset faeces Bottacini et al. (2014)

B. ruminantium Bovine rumen Biavati &

Mattarelli(1991)

B. saeculare Faeces of rabbit Biavati et al. (1991)

B. sanguini Tamarind faeces Bottacini et al. (2014)

B. scardovii Human blood Hoyles et al. (2002)

B. stellenboschense Tamarind faeces Bottacini et al. (2014)

B. stercoris Human faeces Kim et al. (2010)

B. subtile Sewage, human carious lesions Biavati et al. (1982)

B. thermacidophilum

ssp thermacidophilum

ssp. porcinum

Waste water, pig faeces

Piglet faeces

Dong et al. (2000)

Zhu et al. (2003)

B. thermophilum Faeces of chickens, pigs, and suckling calves;

bovine rumen; sewage

Mitsuoka (1969)

B. tsurumiense Hamster dental plaque Okamoto et al. (2008)

4.3. Ecologie des bifidobactéries

Les bifidobactéries ont été isolées à partir de trois niches écologiques: l' organisme

humain, l'organisme animal et l'environnement.

Chez les humains, les bifidobactéries se retrouvent majoritairement dans l' intestin

(la partie distale de l'iléon et le colon). Cependant, ces microorganismes ont été identifiés

dans le vagin et la cavité buccale.

La composition de la flore dominante chez l'humain change au cours des

différents stades de vie. Chez un jeune enfant nourri au lait maternel, la flore

intestinale est composée de 85-99 % de bifidobactéries et les principales espèces retrouvées

sont Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium bifidum (Rasic et Kurmann, 1983).

La flore des enfants sevrés représente une transition entre la flore infantile et la flore

adulte. Plusieurs espèces telles que les bactéroïdes, et les clostridies apparaissent dans la

flore fécale. Les bifidobactéries deviennent moins prédominantes (Rasic et Kurmann, 1983).

La flore adulte devient plus complexe et la flore dominante est composée de

bactéroïdes. Bien que les bifidobactéries ne soient plus prédominantes, elles demeurent

un des groupes les plus importants de la flore intestinale.

Les espèces de bifidobactéries les plus retrouvées chez l'adulte sont Bifidobacterium

adolescentis et Bifidobacterium longum (Tamime et al., 1995).

Dans le règne animal, la présence des bifidobactéries a été constatée

majoritairement dans le tube digestif des mammifères (Mitsuoka et Kaneuchi, 1977).


Page 30

Cinq espèces de Bifidobacterium ont été détectées chez la volaille (B. animalis,

B. galinarum, B. pseudolongum, B. pullorum et B. thermophilum) ( Yaeshima et al., 1992 ;

Watabe et al., 1983 Mistuoka et al., 1969).

Scardovi et Trovatelli (1969) et Biavatti et collaborateurs (1982) ont identifié trois

espèces de Bifidobacterium, B. asteroides, B. coryneforme et B. indicum chez les abeilles

(Biavati et al., 1982 ; Sardovi et Trovatelli, 1969).

Trois espèces de bifidobactéries ont été isolées à partir des eaux usées: B. minimum,

B.subtile et B. thermacidophilum (Dong et al.,2000 ; Biavati et al., 1982).

4.4. Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques des bifidobactéries

4.4.1. Morphologie

Les bifidobactéries sont en forme de bâtonnet à morphologie variable, généralement un

peu courbées et plissées, parfois ramifiées. Des souches fraichement isolées peuvent avoir des

formes allant d‘uniformes à ramifiées, en forme de Y ou de V voire en forme de spatule.

Cependant, sur des milieux défavorables notamment en cas d‘une déficience en

N-acétylhexosamines (N-acétylglucosamine et N-acétylgalactosamine) qui sont

indispensables pour la synthèse de la paroi cellulaire., les bifidobactéries présentent des

ramifications et un pléomorphisme, bien qu‘elles soient sous forme de bâtonnet dans leur

habitat naturel (Bruno 2012).

La paroi des bifidobactéries a une structure typique des Gram-positive, constituée d‘une

enveloppe fine de peptidoglycanes contenant des polysaccharides, des protéines et des acides

téichoïques (Gomes and Malcata, 1999). La composition en acides aminées des tétra peptides

des peptidoglycanes peut différer entre les espèces, et également entre les souches ; elle peut

ainsi être utilisée pour leur différentiation (Lauer and Kandler, 1983).

4.4.2. Physiologies des bifidobactéries

Température

Les souches de Bifidobacterium implantées chez l‘Homme présentent un optimum

de croissance pour des valeurs de température comprises entre 36 et 38°C, alors que

pour les souches d‘origine animale, ce palier est plus élevé et peut atteindre 46,5°C ( Iuliana

2004).

L‘espèce B. thermacidophilum pousse à une température plus élevée égale 49.5ºC

(Dong et al., 2000). En dessous de 20°C leur croissance n‘est plus détectable, à l‘exception de

l‘éspèce B.psychroaerophilum qui peut croitre à des basses température allant jusqu‘ à 8ºC

((Hadadji et al., 2005 ; Simpson et al., 2003).


Page 31

Oxygène

Les bifidobactéries sont décrites comme étant strictement anaérobies, bien que certaines

souches tolèrent l‘oxygène (Simpson et al., 2005). La sensibilité à l‘oxygène peut différer

cependant entre les espèces mais également entre les souches d‘une même espèce (Talwalkar

and Kailasapathy, 2003).

Les espèces qui tolèrent l‘oxygène présentent une faible activité catalytique qui

élimine les traces du super oxyde d‘hydrogène formées (H2O2) ou par le fait que le

NADH oxydase de ces souches ne forme pas de H2O2, alors l‘accumulation d‘H2O2

inhibe l‘activité de F6PPK.

Pour les souches extrêmement sensibles à l‘oxygène, n‘accumulent pas l‘H2O2 et

l‘oxygène bloque la multiplication bactérienne par l‘intermédiaire d‘un potentiel d‘oxydo-

réduction trop élevé (Ventura et al., 2004; Romond et al., 1992; Scardovi, 1986).

pH

Les bifidobactéries ont un optimum de croissance compris entre pH 6,5 et 7 (Hadadji et

al., 2005). Les souches de Bifidobacterium lactis et Bifidobacterium animalis peuvent survire

à pH 3,5, tandis que les bifidobactéries dans un environnement supérieur à pH 8,5 ne

survivent pas (Matsumoto et al. , 2004 ; Biavati et al. , 2000).

La production maximale d‘acide lactique et acétique chez les bifidobactéries exige

un pH optimal initial proche de la neutralité qui varie entre 6-7( Scardovi , 1986 ; Collins et

Hall, 1984).

Effets des sels biliaires

Les bifidobactéries possèdent une enzyme, la cholyglycine hydrolase qui hydrolyse les

sels biliaires (glyco- ou taurocholates) en acides aminés (glycine et taurine) et acides

biliaires (acide cholique et acide chénodéoxycholique) (Tanaka et al. 2000). Les produits

obtenus après déconjugaison des sels biliaires constituent une source de nutriments (les

acides aminés) et d' énergie (fournie par la déshydroxylation des acides biliaires) pour

ces microorganismes.

Sensibilité aux antibiotiques

Les bifidobactéries sont généralement sensibles aux antibiotiques du spectre Gram

positif (macrolides, bacitracine, érythromycine, lincomicine, novobicine et vancomycine )

aussi aux beta-lactamines( pénicilline, ampicicilline, amoxicilline, piperacilline et

ticarcilline) (Ammor et al., 2007 ; Masco et al., 2006 ; Hadadji et al., 2005 ; Delagdo et

al.,2005 ).

La sensibilité des bifidobactéries au tétracycline est variables selon les espèces

(Ammor et al., 2007; Masco et al., 2006 ; Delagdo et al.,2005).

Beaucoup d‘espèces des bifidobactéries sont résistantes aux antibiotiques du spectre

Gram négatif (acide fusidique, acide nalidixique et polymixine) et les aminoglycosides


Page 32

(néomycine, gentamicine, kanamycine et streptomycine) ( Ammor et al., 2007 ;Masco et

al., 2006 ; Moubarek et al., 2005).

Besoins nutritionnels des bifidobactéries

En générale les bifidobactéries sont capables d‘utiliser les sels d‘ammonium

comme seul source d‘azote par contre d‘autres espèces comme B. magnum, B. cuniculi

et B. choerinum exigent la présence d‘azote organique (Hassinen et al., 1951).

L‘activité des enzymes comme le glutamate déshydrogénase et le glutamine

synthétase permet l‘assimilation d‘ammonium. Ces deux enzymes sont isolés et

caractérisé à partir de B.breve , B. pseudolongum et B. bifidum (Ballongue,1993). Aussi

la croissance des bifidobactéries est stimulée par la présence d‘ions, vitamines et par

d‘autres facteurs qui sont métabolisés par l‘hôte ou par les microorganismes du tractus

gastro-intestinale comme la thréonine, extrait de levure, cystéine, dextrine, maltose et

β-glycerolphosphate et les facteurs bifidogènes qui sont des substances qui se trouve

dans le laits maternel ces facteurs incluent N- acetyl glucosamine, fructo-

oligosaccharides, lactoferrine, lactulose, lactitol, oligoholosides et les polyholosides (Modler

et al. , 1994).

4.4.3. Biochimie des bifidobactéries

Métabolisme des carbohydrates

La majorité des bifidobactéries utilisent le lactose, le glucose le sucrose, le galactose

comme source de carbone (Hadadji 2007).

Les hexoses sont dégradés par une voie métabolique particulière, la voie de la fructose-

6-phosphate phosphoketolase (F6PPK) ou «bifid shunt ». Il existe également une voie

partielle de la glycolyse ainsi qu‘une voie partielle du cycle d‘acide tricarboxylique (cycle de

Krebs ; les gènes codant pour la fumarase, l‘oxoglutarate déshydrogénase et la malate

déshydrogénase étant absents). Des différences existent entre les espèces dans leur capacité à

fermenter d‘autres glucides ou des alcools.

La fermentation de deux moles de glucose produit approximativement trois moles d'acide

acétique, deux moles d'acide lactique et 2,5 moles d'ATP. L'enzyme clé de cette voie

métabolique, la F6PPK, est considérée comme un identifiant taxinomique pour la famille des

Bifidobacteriaceae (Felis and Dellaglio, 2007; Ventura et al., 2004).

Il est important de souligner que l'acide lactique produit par les bifidobactéries est de

type L(+) (Sébald et al., 1965; Rasic et Kurmann,1983). Ce métabolite est caractéristique du

genre. En effet, les lactobacilles produisent des formes D(-) ou DL qui ne sont que très

lentement dégradées par le nourrisson et peuvent par conséquent entraîne des troubles tels

que: acidose, formation de méthémoglobine, voire des perturbations neurologiques. Ces

raisons font que le yaourt traditionnel est déconseillé chez le nouveau-né. Par contre, la forme

L(+) est totalement assimilée et métabolisée. Les laits fermentés avec une souche de


Page 33

Bifidobacterium apparaissent donc mieux adaptés chez le jeune enfant (Rasic et Kurmann,

1983).

Figure 9: Métabolisme général des bifidobactéries. D‘après Lee et O'Sullivan (2010).

ABC : ATP-binding cassette systems ; GPH : glycoside–pentoside–hexuronide cation symporter family ; MIP :

major intrinsic protein ; MSF : major facilitator superfamily ; PTS : sugar phosphotransferase systems

Métabolisme des vitamines

Les bifidobactéries sont capables de produire des vitamines tels que thiamine (B1),

l‘acide folique (B9) et l‘acide nicotinique (Tamura 1983 ; Deguchi et al., 1985).

Les espèces B. breve et B. infantis excrètent un taux trop élevé de l‘acide

nicotinique et le biotine, de même B. bifidum et B. infantis possèdent une bonne

production des vitamines B1 et B9 (Tamura ,1983).

Production des substances antimicrobiennes

Malgré la grande utilisation des bifidobactéries dans la production des aliments

fonctionnels les études sur leur pouvoir antimicrobien est un peu restreint (Ventura et

al.,2004).


Page 34

L‘activité antimicrobienne du genre Bifidobacterium a été détectée en premier lieu

par Tissier (1900), il a étudié l‘effet antagoniste de B. bifidum contre E. coli. D‘autres

études décrivent l‘activité antagoniste ou l‘activité antimicrobienne spécifique des

bifidobactéries liée à la production des acides lactique et acétique (Bruno and Shah,

2002), ou à la production des bactériocines (Cheikhyoussef et al., 2010 ; Cheikhyoussef

et al. , 2008 ; Cheikhyoussef et al., 2007 ; Abd El-Salam et al ., 2004 ; Bevilacqua et

al., 2003).

Quelques exemples de bactériocines synthétisées par les bifidobactéries sont résumés

dans le tableau suivant :

Tableau 7: Exemples de bactériocines synthétisées par les souches de bifidobactéries et leurs

principales caractéristiques. D‘après Martinez et al. (2013).

Bacteriocin Species and

strain

Inhibitory spectrum Reference

Bifidin

B. bifidum

NCDC 1452

Gram-positive and Gram-negative

bacteria

Anand et al.

(1984, 1985)

Bifidocin B

B. bifidum

NCFB 1454

Bacillus cereus, Enterococcus faecalis,

Listeria monocytogenes, Pediococcus

acidolactici, Streptococcus faecalis, etc.

Yildirim and Johnson

(1998);Yildirim et al.

(1999)

Bifilong B. longum Gram-positive and Gram-negative

bacteria

Kang et al. (1989)

Bifilact Bb-46 B. longum

Bb-46

Staphylococcus aureus, Salmonella

typhimurium, Bacillus cereus, E. coli

Saleh and El-Sayed

(2004)

Bifilact Bb-12 B. lactisBb-12 Staphylococcus aureus, Salmonella

typhimurium, Bacillus cereus, E. coli

Saleh and El-Sayed

(2004)

Thermophilicin

B67

B. thermophilum

RBL67

Listeria sp., Lactobacillus acidophilus Von Ah, (2006)

Bifidin I

B. infantis BCRC

14602

LAB strains, Staphylococcus, Bacillus,

Streptococcus, Salmonella, Shigella, E. coli.

Cheikhyoussef et al.

(2010)

Lantibiotic

(Bisin)

B. longum

DJO10A

Streptococcus thermophilusST403,

Clostridium perfringens, Staphylococcus

epidermidis,Bacillus subtilis, Serratia

marcescens, E. coliDH5a.

Lee et al. (2011)

4.5. Génétique des bifidobactéries

4.5.1. Le chromosome bactérien

Le chromosome des bifidobactéries mesure en moyenne 2 Mb. La taille exacte a été

déterminée pour deux espèces: 2,1 Mb pour B.breve CIP6469 (Bourget et al., 1993) et 2,26

Mb pour B. longum NCC2705 (Schell et al., 2002).

Les bifidobactéries ont un pourcentage en base G+C plus élevé que la plupart des

autres espèces bactériennes ,ce taux est en générale supérieur à 55% (Delcenserie et al.,

2002). Cette caractéristique constitue un critère taxonomique dans la différenciation des

bifidobactéries des espèces à Gram positif et surtout du genre Lactobacillus dont le

pourcentage en G+C est inférieur à 50% (Gasser et Mandel, 1968).


Page 35

4.5.2. Les plasmides

Les plasmides ne sont ubiquitaires chez les bifidobactéries et lorsque sont présents soient

de petite taille (1000 à 1500pb), leur présence chez une éspèce donnée est plutôt considérée

comme facteur de caractérisation que d‘identification de cette éspèce (Mattarelli et Biavati

,2014).

La présence des plasmides a été détectée chez huit espèces et sous-espèces de

Bifidobacterium, à savoir B. bifidum, B.breve, B. catenulatum, B. longum ssp. longum

B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum ssp. globosum, B. asteroides et B. indicum (Ventura

et al., 2007) Ils peuvent encoder pour des bactériocines comme bifidocin B chez B. bifidum

(Yildirim et al., 1999).

4.5.3. Identification génotypique des bifidobactéries

a. Au niveau du genre

Analyse de séquence de l'ARNr 16S

Ce gène est très bien conservé, jusqu‘à 99% dans le genre Bifidobacterium (Hadadji,

2007).

La PCR (plymerase chain reaction) peut être utilisée pour amplifier le gène de l'ARNr

16S, en utilisant des amorces dirigées vers des régions universellement conservées aux deux

extrémités du gène. La séquence résultante de l‘amplification par PCR peut être ensuite

comparée à une base de données (Mattarelli et Biavati ,2014).

Teneur en G + C de l'ADN

La teneur en G + C de l'ADN est un caractère taxonomique très important, les

bifidobactéries ont généralement des pourcentages en G+C assez élevés (55 à 67%), toutefois

certaines espèces récemment décrites ont des pourcentages en G+C plus faibles (B.bombi à

50.5%, B. actinocoloniiforme à 52.7%, B. bohemicum à 51.2% , B. tsurumiense à 53%)

(Mattarelli et Biavati ,2014).

b. Au niveau de l’espèce

Réassociation ADN-ADN

La DDR (DNA-DNA reassociation) a été appliqués à des bifidobactéries pour la

première fois par Scardovi et al. (1970). Lorsque le pourcentage d'homologie est supérieure à

70% entre les souches isolées et la souche de référence, ainsi que les critères phénotypiques

sont d'accord avec la définition des espèces, ces souches peuvent être regroupées dans la

même espèce, mais cette technique doit être associée avec au moins une autre téchnique

génétique pour classer une souche étudiée dans une espèce donnée (Mattarelli et Biavati

,2014).


Page 36

Séquençage du génome entier

Le génome des bifidobactéries varie entre 1,9 et 2,9 Mb de taille et joue un rôle

taxonomique très important. Parmi les 48 espèces du genre Bifidobacterium actuellement

reconnues, 05 espèces sont totalement séquencée au niveau du génome (B. adolescentis, B.

longum ssp. longum, B. longum ssp. infantis, B. dentium, et B. animalis ssp. lactis)

(Mattarelli et Biavati, 2014).

Analyse de séquence de l'ARNr 16S

L‘analyse du gène codant pour l‘ARN ribosomal 16S est un moyen utile pour identifier

des relations phylogéniques entre les espèces (Mangin et al., 1999). En se basant sur l‘analyse

de ce gène ; les bifidobactéries sont classées en six principaux groupes : B. boum, B.

asteroides, B. adolescentis, B. pullorum, B. longum et B. pseudolongum (Bottacini et al.,

2014).

Les espèces du genre Bifidobacterium montrent en général plus de 90% de similarité des

séquences d'ARNr 16S, les espèces très proches peuvent montrer plus de 99% de similarité.


Page 37

Figure 10: Arbre phylogénétique des bifidobactéries obtenue par l‘analyse du gène codant

pour L‘ARN ribosomal 16S (Bottacini et al., 2014).

Etude du gène codant pour la protéine Hsp60

Pour étudier la taxonomie du genre Bifidobacterium Jian et al, 2001 ont déterminés la

séquence partielle du gène codant pour la protéine de choc thermique de 60 KDa (Hsp60) de

30 espèces de Bifidobactéries. Il a été démontré un degré similitude de séquence très élevé

dans une même espèce (99,4 à 100%), et 85% entre les différentes espèces du même genre.

La classification basée sur le gène codant pour la protéine Hsp60 semble être la meilleure car

le dendrogramme obtenu est mieux corrélé avec le contenu en G+C (Delcenserie et al.,

2002).

CHAPITRE II Matériel et méthodes

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Cette étude a été réalisée dans le Laboratoire de Microbiologie Appliquée

(LMA), Département de Biologie, Faculté des Sciences de la Nature

et de la Vie, Université d‘Oran1 Ahmed Benbella

1. Provenance des souches

1.1. Les souches industrielles

La souche BN, isolée à partir du lait fermenté probiotique (Danone Activia), contenant

des bifidobactéries, produit et commercialisé en Algérie.

La souche Bifidobacterium animalis ssp. lactis (BB12), fournie par la laitière " Hodna" de

la Wilaya de M'sila, Algérie.

1.2. Les souches indigènes

Les souches L1, L2, R1 et R2 proviennent de la collection du laboratoire de microbiologie

appliquée (LMA), université d‘Oran1 Ahmed Benbella, où elles ont été isolées à partir des

selles de bébés en bonne santé, ne recevant pas de traitement antibiotique, nourris

exclusivement au sein.

1.3. Les souches pathogènes

La souche Escherichia coli ATCC 25922 provient du laboratoire de microbiologie de

département de biologie université se M'sila, Algérie.

Les souches Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Listeria innocua ATCC 33090

appartiennent à la collection du laboratoire de microbiologie appliquée université d'Oran1

Ahmed Benbella, Algérie.

2. Milieux de culture

2.1. Milieu de culture pour les bifidobactéries

L'isolement des bifidobactéries est une étape minutieuse, il nécessite des conditions assez

spécifiques, qui mettent en jeu des systèmes d‘anaérobiose comme les anaerocults ou les gas-

packs et des milieux très riches additionnés d‘un agent réducteur la cystéine-chlorhydrique

(Scardovi, 1986).

L‘isolement des bifidobactéries à partir du lait fermenté (Danone Activia) a été réalisé

sur le milieu MRS (De Man et al., 1960) additionné de 0,05 % cystéine-chlorhydrique et un

agent sélectif l‘acide nalidixique 2mg/l (annexe).

2.2. Milieux de culture pour les souches pathogènes

La culture des souches pathogènes est réalisée sur la gélose nutritive et pour les

interactions nous avons utilisé le milieu Mueller- Hinton (Mueller et Hinton, 1941) (annexe).


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3. Isolement et purification des bifidobactéries

A partir du lait fermenté

L‘isolement à partir du lait fermenté a été réalisé sur milieu MRS additionné de 0.05%

cystéine chlorhydrique et de 2mg/l d‘acide nalidixique. Nous avons pris un gramme du lait

fermenté, mis dans un tube contenant 9ml de solution saline (0.9% de NaCl et 0.2% de

cystéine chlorhydrique). Après homogénéisation de la suspension pendant 2 min , 0,1ml des

différents dilutions (10-4

, 10-5

, 10-6

) ont été ensemencés sur milieu MRS additionné de 0.05%

cystéine chlorhydrique et de 2mg/l d‘acide nalidixique .Trois boites de chaque dilution sont

incubées dans une jarre d‘anaérobiose avec des gas-pack capable de produire du H2 et du CO2

pendant 72 h à 37°C (Frank et al., 1993; Beerns, 1990 ) (figure 11).

Figure 11: Protocole d‘isolement des bifidobactéries à partir du lait fermenté.


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4. Pré identification des bifidobactéries

Après la purification par repiquage successif dans le milieu sélectif (milieu MRS

additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique), à partir des

boites contenant des colonies bactériennes, nous avons effectué les démarches suivantes :

4.1. Etude macroscopique

Cette étude consiste à noter l‘aspect des colonies bactériennes obtenues après

purification (contour, couleur, viscosité).

4.2. Etude microscopique

Après l‘examen macroscopique des colonies sur gélose (MRS additionné de

0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique), les isolats ont été soumis à la

coloration de Gram (Larpent et Larpent, 1990), puis à l‘observation microscopique.

5. Identification du genre

5.1. Recherche de la catalase (Marchal et al., 1991)

Le test consiste à déposer sur une lame une goutte d‘eau oxygénée à 10 volumes et à y

dissocier directement un peu de la culture prélevée sur milieu solide.

L‘apparition d‘un dégagement gazeux témoigne de la présence de la catalase dans le

métabolisme bactérien.

5.2. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose

Les souches sont repiquées sur milieu MRS additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique

et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) liquide contenant une cloche de Durham. L'incubation

s'effectue en anaérobiose à 37°C pendant 24 h (Garvie, 1984).

La présence du gaz dans la cloche indique que la souche a un caractère fermentaire avec

production de CO2.

5.3. Recherche de citrate perméase sur milieu Kempler et Mc Kay 1980

Ce test permet de mettre en évidence la citrate perméase. Les souches sont ensemencées

sur boite de Pétri contenant le milieu KMK par la méthode des stries et incubées à 37 C°

pendant 24h en anaérobiose. Le résultat positif se traduit par l‘apparition des colonies

bactériennes de couleur bleue et le résultat négatif se traduit par l‘apparition des colonies

blanches.

5.4. Mise en évidence de l’uréase

Une suspension dense de chaque souche est ensemencée dans un tube contenant 0,5 ml

de milieu urée indole. Après incubation à 37°C pendant 24 h,

La présence de l‘uréase se traduit par un virage de l‘indicateur du jaune au rouge.


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5.5. Mise en évidence de la production d’indole

Les souches sont ensemencées sur milieu urée-indole. Après 24 h d‘incubation quelques

gouttes de réactif Kovacs (mélange de para-diméthyl-aminobenzaldehyde et d‘alcool

amylique plus de l‘HCl pure) sont ajoutées.

La réaction positive se traduit par l'apparition d'un anneau rouge en surface.

5.6. Protéolyse de la gélatine

Les souches sont ensemencées par piqûre centrale dans des tubes de milieu gélatine, puis

laissés à la température ambiante du laboratoire (25°C).

La liquéfaction de la gélatine indique que les souches sont gélatinase positive

L‘absence de tout changement permet de conclure que les souches sont gélatinase

négative.

6. Caractérisation des espèces

Les bifidobactéries sont identifiées au niveau de l‘espèce, en déterminant leur profil

fermentaire (Scardovi, 1986). Plusieurs colonies isolées d‘une culture pure ont été repiquées

dans 5ml de milieu (MRS additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide

nalidixique) liquide, incubé à 37°C pendant 24 h.

Après incubation, 4ml de la culture sont centrifugés à 4000 g pendant 10 mn et lavés

deux fois avec de l‘eau physiologique (à 0,05 % de cysteine-HCl).

Le surnageant est éliminé et le culot est suspendues dans 1ml d‘eau physiologique

cystéinée.

Cette suspension sert à inoculer le milieu (MRS additionné de 0.05%cystéine

chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) liquide, dépourvue de sucre et d'extrait de

viande, additionné de 40mg /l de pourpre de bromocrésol (BCP) comme indicateur de pH et

supplémenté de 2 % des sucres suivants: arabinose, amidon céllobiose, fructose, galactose,

lactose, lévulose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose, ribose, sorbitol, tréhalose, xylose.

Les préparations sont recouvertes de 1 ml de l‘huile de paraffine stérile pour obtenir

l‘anaérobiose. L'incubation s‘effectue à 37°C pendant 48 h.

La fermentation d‘un sucre donné par la souche bactérienne testée se traduit par la

formation d‘acide qui se manifeste par le virage de la coloration rouge en jaune.

7. Conservation des Souches

Les souches sont cultivées sur milieu MRS additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et

de 2 mg/l d‘acide nalidixique gélosé inclinés à 37°C pendant 48h.

Ensuite les tubes sont conservés à 4°C. Les cultures sont repiquées toutes les deux

semaines (Scardovi, 1986).

Pour une conservation à long terme les souches sont conservées à –20°C dans du lait

écrémé contenant 30 % de glycérol, 0,1 % d‘extrait de levure et 0,05 % de cysteine-HCl

(Saidi et al ; 2002, Franck et al., 1993).


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8. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de

bifidobactéries

Avant chaque expérience les cultures sont rajeunies par incubation dans un bouillon

MRS (additionné de 0.05% de cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) à

37°C pendant 24 h en anaérobiose pour obtenir des cultures en fin de la phase exponentielle.

En effet, d‘après la littérature scientifique, 18 à 20 h d‘incubation sont nécessaires pour

atteindre la fin de la phase exponentielle, indiquée par l‘apparition des troubles dans le

bouillon qui témoigne de la présence d‘une biomasse bactérienne.

8.1. Mise en évidence des propriétés technologiques

L‘objectif de cette partie de l‘étude est d‘évaluer le comportement des souches étudiées

envers les conditions rencontrées au cours de la fabrication et le l‘entreposage de produit.

8.1.1. Croissance en présence de l’oxygène

Réalisation du test

Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS sans cystéine (agent réducteur) sont inoculés

avec 5% v/v de la culture jeune de chacune des souches étudiées (en général, le taux

d‘inoculation dans l‘industrie laitière varie entre 2 et 7%), les tubes sont incubés à 37°C en

aérobiose pendant 8h (selon Lamoureux (2000), au niveau industriel, une fermentation de 2 à

6 heures à des est généralement suffisante pour obtenir un lait coagulé) .

Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS additionné de 0.05% de cystéine

chlorhydrique, inoculé avec 5% v/v de la culture jeune de chacune des souches étudiées et

incubés à 37°C en anaérobiose sont utilisés comme témoins.

Détermination de la cinétique de croissance

Nous avons procédé à la préparation d‘une série de dilutions décimales jusqu‘à 10-5

à

partir de chacun des tubes contenant les souches étudiées (0h, 4h et 8h), en mettant 1 ml de

chaque tube dans des tubes contenant 9 ml d‘une solution saline (0,9 % de NaCl) et 0,2% de

la cysteine chlorhydrique. Une aliquote de 0,1 ml de la dernière dilution (10-5

) est

ensemencée en masse dans une gélose MRS (additionnée de 0.05% de cystéine chlorhydrique

et de 2 mg/l d‘acide nalidixique). Après incubation à 37°C pendant 48h en anaérobiose, la

quantité de biomasse bactérienne (log UFC/ml) est déterminée et les vitesses spécifiques

maximales de croissance (µmax) de chaque souche en présence et en absence de l‘oxygène sont

calculées.


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8.1.2. Croissance en 43°C


Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS (additionnée de 0.05% de cystéine

chlorhydrique) sont inoculés avec 5% v/v de la de la culture jeune de chacune des souches

étudiées, l‘incubation se fait à 43°C en anaérobiose pendant 8h.

Des tubes contenant 10 ml de bouillon MRS additionné de 0.05% de cystéine

chlorhydrique, inoculé avec 5% v/v de la culture jeune de chacune des souches étudiées et

incubés à 37°C en anaérobiose sont utilisés comme témoins.

Détermination de la cinétique de croissance

Le protocole de détermination de la cinétique de croissance est le même que celui décrit

dans le test précédent (tolérance à l‘oxygène). , la quantité de biomasse bactérienne (Log

UFC/ml) est déterminée et les vitesses spécifiques maximales de croissance (µmax) de chaque

souche sont calculées.

8.1.3. Viabilité pendant l’entreposage à 4°C

Préparation du lait fermenté

Des tubes de 10 ml de lait écrémé stérile sont inoculés avec 5% v/v de la culture

jeune de chacune des souches étudiées, conformément au protocole d‘inoculation utilisé en

industrie (en général, le taux d‘inoculation varie de 2 à 7%). Après 8h d‘incubation à 37°C

en anaérobiose, le lait fermenté est transféré à l‘entreposage à 4°C et conservé à cette

température pour une durée totale de 21 jours. L‘évaluation de la viabilité est effectuée juste

après la fin de la période d‘incubation (nombre initial de cellules) et ensuite à 7 jours

d‘intervalle de stockage frigorifique (après 7, 14 et 21 jours de stockage à 4 °C) (Georgieva

et al., 2009). L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.

Dénombrement des cellules viables

Nous avons procédé à la préparation d‘une série de dilutions décimales jusqu‘à 10-5

à

partir de chacun des tubes contenant le lait fermenté par les souches étudiées (0j, 7j et 21j),

en mettant 1ml de chaque tube dans des tubes contenant 9 ml d‘une solution saline (0,9 % de

NaCl) et 0,2% de la cysteine chlorhydrique. Une aliquote de 0,1 ml de la dernière dilution

(10-5

) est ensemencée en masse dans une gélose MRS (additionnée de 0.05% de cystéine

chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique). Après incubation à 37°C pendant 48h en

anaérobioses, la quantité de biomasse bactérienne (log UFC/ml) est déterminée.

La viabilité est calculée selon l‘équation donnée par Ustunol et Gandhi, (2001)

Viabilité (%) ═ (UFC après n jour (s) de stockage / UFC initial) × 100


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8.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C

La post-acidification du lait fermenté par chacune des souches étudiées entreposé à

4°C est suivie par la mesure du pH pendant 21 jours de stockage frigorifique à 4°C.

L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.

8.1.5. Influence des arômes sur la viabilité


Les arômes utilisés sont : la banane 0,2 % v/v et la vanille 0,2 % v/v. Les concentrations

choisies pour cette étude correspondent à celles utilisées dans l'industrie laitière algérienne.

L‘effet des arômes sur la viabilité des souches est déterminé dans un bouillon MRS

(additionnée de 0.05% de cystéine chlorhydrique) 5% v/v de chaque souche est inoculé

dans des tubes tests contenant 5 ml de milieu de culture en plus des arômes avec les

concentrations mentionnées. Des tubes témoins contenant les cultures microbiennes sans

arôme sont préparés. Après incubation à 37°C en anaérobiose pendant 8h, les tubes sont

transférés à l‘entreposage frigorifique à 4°C pendant 21j. L‘évaluation de la viabilité est

effectuée juste avant la mise au réfrigérateur (nombre initial de cellules) et ensuite à 7 jours

d‘intervalle de stockage frigorifique (après 7, 14 et 21 jours).

Dénombrement des cellules viables

Le protocole appliqué pour le dénombrement des cellules viables est le même utilisé dans

le test précédent (Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C).

8.1.6. Cinétique de croissance et d’acidification dans milieu lait

Préparation du lait fermenté

Les tubes contenant 10 ml de lait écrémé stérile sont ensemencés par les différentes

souches de Bifidobacterium étudiées à la concentration de 2% chacune, puis incubés à 37°C

en anaérobiose. Un échantillon est recueilli avant le démarrage (0 h), puis à chaque 4h

d‘intervalle pendant la fermentation pour la mesure du pH, l‘acidité titrable et la cinétique de

croissance au temps 0 h, 4h, 8h… jusqu'à 48h d‘incubation.

L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.

Etude de la cinétique de croissance

La cinétique de croissance des souches de bifidobactéries étudiées a été réalisée par un

dénombrement sur milieu MRS (additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l

d‘acide nalidixique) solide, au temps 0 h, 4h, 8h… jusqu'à 48h d‘incubation.

Suivi du pH au cours de la croissance

L‘acidité développée dans le lait est suivi par la mesure de pH à l‘aide d‘un pH mètre


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Détermination de l’acidité titrable

Le dosage de l‘acidité au cours de la croissance dans le lait est effectué selon la méthode

décrite par (Accolas et al., 1977), en utilisant le NaOH (N/9) en présence de l‘indicateur

Phénolphtaléine (à 1 % dans l‘alcool).

A partir des tubes incubés contenant les cultures en lait, le contenu d‘un tube est versé

dans un bêcher dans lequel sont ajoutées 5 gouttes de phénolphtaléine. Le titrage s'effectue à

l‘aide d‘une burette avec de la soude dornic sous agitation. On considère que le virage est

atteint, quand la couleur blanche du lait vire au rose pâle et persiste pendant une dizaine de

secondes.

Les résultats sont exprimés en degré Dornic selon la formule suivante :

Acidité (°D)= V NaOH x10

Sachant que 1°D = 0.1g d‘acide lactique par 1 litre de lait (Guiraud, 1998).

Figure 12: Dispositif utilisé pour la mesure de l‘acidité titrable.

8.1.7. Activité protéolytique

Pour mettre en évidence l‘activité protéolytique des souches étudiées ces dernières sont

ensemencées par touche sur milieu MRS (additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2

mg/l d‘acide nalidixique) solide, à différentes concentrations de lait écrémé (1% et 2%).

Après incubation de 24h à 37°C en anaérobiose, les diamètres des halos clairs apparus

autour de chaque colonie sont mesurés.

8.1.8. Activité lipolytique

L‘activité lipolytique de nos souches a été déterminée selon la méthode de Guessas et al.

(2012) sur milieu agar au tween 80. L‘activité lipolytique est indiquée par l‘apparition d‘un

précipitât visible, résultant du dépôt des cristaux du sel de calcium formé par la libération des


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acides gras libérés par l‘enzyme ou un précipitât clair autour de la colonie dû à la dégradation

complète des sels des acides gras. Après incubation de 24h à 37°C en anaérobiose, les

diamètres des zones claires apparues autour des clonies sont mesurés.

8.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques

L‘objectif de cette partie de l‘étude est d‘évaluer le comportement des souches de

bifidobactéries étudiées envers les conditions rencontrées au cours du passage à travers le

tractus gastro-intestinal humain.

8.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées

Tolérance aux conditions acides de l’estomac

Ce test a été réalisé selon la technique décrite par (Izquierdo, 2009; Thirabunyanon et al.,

2009; Kanam et al., 2007 ; Mosilhey, 2003) et qui comporte les étapes suivantes :

Préparation des solutions acides simulées au pH de l’estomac humain

Des solutions d‘eau distillée sont ajustées au pH 2 et 3 avec l‘HCl 1 M. L‘eau

distillée au pH 6,5 est utilisée comme témoin. Les solutions sont préparées dans des tubes de

10ml de, stérilisées et conservées à température ambiante avant leur utilisation. Par la suite,

0,1 ml de chaque culture jeune des souches étudiées est transféré dans les tubes contenant

les solutions acides, l‘incubation est faite à 37oC en anaérobiose pour 180 minutes afin de

simuler la survie des espèces dans les conditions acides de l‗estomac humain. Le

dénombrement des cellules viables est ensuite effectué.


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Figure 13: Protocole de de détermination de l‘effet du pH gastrique simulé sur la viabilité des

souches.

Enumération des cellules viables dans les solutions de pH gastrique simulé

Pour dénombrer les cellules viables dans les solutions acides, nous avons prélevé des

aliquotes de 1 ml de chaque culture après le temps d‘incubation prédéterminé et avons réalisé

des dilutions en cascade jusqu'à 10-6

dans une solution saline (0,9 % de NaCl et 0,2% de

cysteine chlorhydrique). Les dernières dilutions (10-6

) de chaque tube sont ensemencées en

masse sur la gélose MRS (additionnée de 0.05%cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide

nalidixique). Les boîtes de Pétri ainsi préparées sont incubées à 37°C pendant 48h en

anaérobiose. L‘expérience est indépendamment répétée trois fois.

Résistance aux sels biliaires

La technique décrite par (Kotikalapudi, 2009; Thirabunyanon et al., 2009 ; Vijendra et

Prasad, 2005 ; Mosilhey, 2003) a été appliquée :


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Préparation des solutions biliaires

Une concentration de 0,5% de sels biliaires est préparée dans l‘eau distillée. L‘eau

distillée sans sels biliaires est utilisée comme témoin.

Les solutions sont préparées dans des tubes de 10 ml, stérilisées et conservées à

température ambiante avant leur utilisation. Le choix de la concentration de bile pour

(0,5%) était basé sur sa concentration physiologique dans le duodénum

(Brashears et al., 2003). Par la suite, 0,1 ml de la culture jeune de chaque souche testée

est transféré dans les tubes contenant la solution des sels biliaires (0,5%). Nous avons

également préparé des tubes témoins (sans sels biliaires). Les tubes sont incubés à 37oC en

anaérobiose pour 240 minutes, le dénombrement est effectué avant l‘incubation (t0) et après

240 minutes d‘incubation (t240).

Enumération des cellules viables dans les solutions de sels biliaires

Nous avons prélevé 1 ml de chaque tube et préparé des dilutions en cascade jusqu'à 10-6

dans une solution saline (0,9 % de NaCl et 0,2% de cysteine chlorhydrique). Nous avons

ensuite procédé à l‘ensemencement dans une gélose MRS (additionnée de 0.05%cystéine

chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique), suivi d‘incubation à 37°C en anaérobiose

pendant 48h.

8.2.2. Mise en évidence de l’activité antibactérienne

Il s‘agit d‘étudier l‘activité inhibitrice de nos souches vis–à-vis des bactéries pathogènes.

Les souches pathogènes utilisées dans ce test sont Escherichia coli ATCC 25922

Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Listeria innocua ATCC 33090.

Préparation de cultures jeunes de bactéries pathogènes

Les souches pathogènes sont rajeunies dans un bouillon nutritif et incubées à 37°C

pendant 18h.

Réalisation de test

La technique choisie est celle de Fleming et al., (1975), elle consiste à ensemencer les

différentes espèces de Bifidobacterium dites inhibitrices à la surface du milieu MRS

additionné de 0.05%cystéine chlorhydrique) solide à l‘aide d‘un multipoint, après séchage 30

mn à la température ambiante, les boite de Pétri sont incubées à 37 °C pendant 18h sous

conditions d‘anaérobiose.

Les cultures sont ensuite recouvertes de 7 ml de milieu Mueller Hinton inoculé avec

500 µl de culture de la souche pathogène. Après solidification, les boites sont remises à

l‘étuve à 37°C pendant 24h sous condition d‘anaérobiose.

La présence des zones claires autour des souches ensemencées par touche indique

l‘inhibition de la souche indicatrice. Les diamètres des zones d‘inhibition sont mesurés.


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Recherche de l’agent responsable de l’inhibition

D‘après la littérature, l‘effet antagoniste des bifidobactéries est généralement attribué

à la production des acides organiques (acide acétique, acide lactique) (Roy, 2005) , Quelques

souches de bifidobactéries peuvent élaborer des bactériocines (Cheikhyoussef et al., 2010;

Von Ah, 2006).

D‘où vient l‘importance d‘écarter le facteur acidité d‘abord avant de passer aux autres

facteurs.

Dans notre travail nous avons éliminé le facteur de l‘acidité en utilisant le milieu MRS

tamponné à pH 7 (à l‘aide d‘un tampon phosphate 0,1M) contenant 0,25% de glucose pour

minimiser l‘acidification du milieu.

La lecture des résultats consiste à comparer ceux obtenus en milieu tamponné et non

tamponné.


Pour chaque inoculum bactérien a été standardisé dont la DO660 varie entre 0.08 et 0.1

puis ensemencé par inondation (1ml) à la surface de la gélose MRS (additionnée de

0.05%cystéine chlorhydrique), déjà coulée et solidifiée, l‘excès de l‘inoculum a été récupéré

par une micropipette, les boites ont été laissées sécher à température de laboratoire, puis les

disques contenant les antibiotiques testés sont déposés. Après incubation à 37°C pendant 24h

en anaérobiose, les diamètres des zones d‘inhibition ont été mesurés (Leroy et al., 2007).

Les résultats ont été exprimés comme, sensibles (S), intermédiaires (I) , et résistantes (R),

selon les normes recommandés (Comité de l‘antibiogramme de la société française de

microbiologie, 2007).

Les antibiotiques utilisés sont résumés dans le tableau suivant :


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Tableau 8: Les antibiotiques utilisés pour évaluer l‘antibiorésistance des souches.

Antibiotique Charge de disque (µg) Symbole

Vancomycine 30 VA

Cefotaxime 30 CTX

Penicilline 10 P

Oxacilline 5 OX

Ampicilline 10 AM

Acide nalidixique 30 NA

Azithromycine 15 AZM

Amoxicilline 25 AMX

Fosfomycine 50 FOS

Gentamycine 10 GM

Acide fusidique 10 FA

8.2.5. Traitement statistique des résultats

Les données expérimentales de l‘étude sont statistiquement traitées par une analyse de

variance (ANOVA). XLSTAT [version 2014] et Excel 2010 [Microsoft Corporation, USA],

ont été utilisé et le seuil de signification de 0.05 a été retenu.

CHAPITRE III Résultats et discussion

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1. Pré-identification des souches

1.1. Aspect macroscopique

Les colonies de bifidobactéries développées sur le milieu MRS additionné de 0.05% de

cystéine chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique sont d‘apparence variable. Elles sont

punctiformes, luisantes, de coloration blanchâtre et crème, de contour régulier et de diamètre

variable. Cet aspect macroscopique est souvent rencontré chez les bifidobactéries (figure 14).

Figure 14: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium sur milieu MRS.

A: R1 B: R2 C: L1 D: L2 E: BN

1.2. Aspect microscopique

L‘observation microscopique après la coloration de Gram des frottis réalisés à

partir des colonies apparues, révèle la présence des bactéries à Gram positif, des

bacilles en formes Y et V ou incurvés avec des extrémités bifurqués (figure 15). Ce

pléomorphisme est typique aux bifidobactéries, il est généralement pris comme un indice

d‘orientation dans l‘identification du genre.


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Figure 15: Aspect macroscopique des souches de Bifidobacterium. Gr x 1000.

A: R1 B: R2 C: L1 D: L2 E: BN

2. Identification du genre

Les aspects macroscopique et microscopique des souches sont représentés dans le tableau

suivant :

Tableau 9: Aspects macroscopique et microscopique des souches de bifidobactéries.

Souche Aspect macroscopique Aspect Microscopique

L1 Colonies blanchâtres,

visqueuses, à contour régulier

Forme spatulée, extrémité

arrondie, forme bifid (V, Y)

L2 Colonies blanchâtres,

visqueuses, à contour régulier

Forme spatulée, extrémité


R1 Petites colonies, opaques, blanchâtres,

surface lisse, contour régulier

Bâtonnets courts, extrémité


R2 Petites colonies, opaques, blanchâtres,

surface lisse, contour régulier

Bâtonnets courts, extrémité


BN Punctiformes, luisantes,

blanchâtres à crème, contour régulier

Forme spatulée et arrondie,

forme bifid (V)


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2.1. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose

Toutes les souches ensemencées dans le milieu MRS (additionné de 0.05% de cystéine

chlorhydrique et de 2 mg/l d‘acide nalidixique) liquide renfermant la cloche de Durham ont

montré une bonne croissance sans dégagement de gaz dans la cloche (figure 16).

Figure 16: Test de production du gaz à partir du glucose.

A: R1 B: R2 C: L1 D: L2 E: BN

2.2. Mise en évidence des autres enzymes

Les résultats pour la recherche des activités enzymatiques : catalase, uréase, gélatinase et

la production d‘indole sont négatifs tandis que la citrate perméase est positive (tableau 10).

Tableau 10: Mise en évidence des activités enzymatiques des souches de bifidobactéries.

(+) résultat positive (présence) (-) résultat négative (absence)

Enzyme

Souche

Catalase

Citrate

perméase

Uréase

Production

indole

Gélatinase

L1 - + - - -

L2 - + - - -

R1 - + - - -

R2 - + - - -

BN - + - - -


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Figure 17: Test de citrate perméase sur milieu KMK.

A: R1 B: L1 C: BN

Figure 18: Mise en évidence de l'uréase.

A: Témoin B : L1 C : R1


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Figure 19: Mise en évidence de la production de l'indole.

A: Témoin B : L1 C : R1

Figure 20: Test de la gélatinase.

A: R1 B: R2 C: L1 D: L2 E: BN


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3. Caractérisation des espèces

Les résultats de la fermentation des différents sucres après 48 h d‘incubation sont

regroupés dans le tableau 11. Ces résultats montrent que toutes les souches fermentent

certains sucres (glucose, fructose, maltose et le lactose). Les souches L1 et L2 fermentent

l‘arabinose. Cette propriété semble distinguer l‘espèce B. longum des autres espèces. D‘autre

part les souches, R1 et R2 ne fermentent ni l‘arabinose, ni le xylose par contre elles fermentent

le céllobiose et le sorbitol.

La comparaison avec le profil fermentaire décrit par Scardovi, (1986) a conduit à

identifier deux espèces de Bifidobacterium :

L‘espèce B. breve qui regroupe les souches R1 et R2.

L‘espèce B .longum représentée par les souches L1 et L2.

Tandis que la comparaison avec le profil fermentaire obtenu avec la souche

B. animalis ssp. lactis (BB12), nous a orienté à classer la souche BN dans l‘espèce B. animalis.


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Tableau 11: La fermentation des sucres par les souches de Bifidobacterium.

SUCRES Souches

L1 L2 R1 R2 BN BB12

L-Arabinose + + - - - -

Amidon +/- +/- +/- +/- +/- -

Cellobiose - - + + + +

Fructose + + + + + +

Galactose + + + + +/- + /-

Lactose + + + + + +

Lévulose + + - - + +

Maltose + + + + + +

Mannitol + + + + + +

Raffinose + + - - - -

Rhamnose + +/- - - + +

Ribose - + /- + + + +

Sorbitol + + + + + +

Tréhalose + + - - + +

Xylose + + - - - -

(+) fermentation (-) pas de fermentation (+/-) pas de virage franc.

Figure 21: Profil fermentaire de la souche BN.

1: L-Arabinose 2: Amidon 3: Cellobiose 4: Fructose 5: Galactose 6: Lactose 7: Lévulose 8: Maltose 9:

Mannitol 10: Raffinose 11: Rhamnose 12: Ribose 13: Sorbitol 14: Tréhalose 15: Xylose


Page 58

4. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de

bifidobactéries

4.1. Mise en évidence des propriétés technologiques

4.1.1. Croissance en présence de l’oxygène

Parmi les obstacles rencontrés au cours de la fermentation à l‘échelle industrielle,

l‘oxygène se révèle comme facteur majeur influençant la viabilité des bifidobactéries dans le

produit laitier, donc la capacité de se croitre en présence de l‘oxygène constitue un facteur

technologique déterminant pour une telle souche destinée à être utilisée comme probiotique.

Dans notre étude, la capacité des souches étudiées à croitre en présence de l‘oxygène a

été évaluée pour une durée d‘incubation de 8 heures (temps de fermentation appliqué en

industrie laitière), à 37°C en aérobiose.

Figure 22: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en présence de

l'oxygène.

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

8.6

0 2 4 6 8

Log

UFC

/ml

Temps (h)

R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 59

Figure 23: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en absence de

l'oxygène.

D‘après les résultats obtenus (figure 23 et 24), il apparait que les souches R1, R2, L1, L2,

BB12 et BN avaient la capacité de pousser en présence de l‘oxygène, dont on a arrivé à des

charges comprises entre 8,14 Log UFC/ml et 8,25 Log UFC /ml , à partir des charge initiales

variant entre 7,3 Log UFC /ml et 7,5 Log UFC/ml, après 8 h de fermentation, mais ces valeurs

sont plus faibles en comparaison avec celles enregistrées en absence de l‘oxygène (les charge

finales entre 8,41 Log UFC/ml et 8,6 Log UFC/ml à partir des charge initiales entre 7,5 Log

UFC/ml et 7,6 Log UFC/ml , signifiant que l‘oxygène a influencé négativement la croissance

de toutes les souches.

Les résultats du test ANOVA démontrent que la variation de la cinétique de croissance

des souches étudiées en présence de l‘oxygène n‘est pas significativement différente d‘une

souche à une autre (sig = 0,053>0,05).

4.1.2. Croissance en 43°C

Etant donné, la température de fermentation appliquée en industrie laitière est de 43°C,

donc la capacité des souches des bifidobactéries de croitre à cette température représente un

caractère technologique indispensable pour arriver à une concentration adéquate à la fin de

processus de fermentation.

Les figures 25 et 26 comprennent les résultats de l‘évaluation de la cinétique de

croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN lors de l‘incubation à 43°C et à 37°C

respectivement.

Les résultats obtenus indiquent que la croissance de toutes les souches étudiées est

affectée par l‘incubation en 43°C dont on a remarqué la présence d‘une phase d‘adaptation

(de 0 h à 3 h) caractérisée par une augmentation très faible da la charge bactérienne.

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

8.6

8.8

0 2 4 6 8 10

Log

UFC

/ml

Temps (h)

R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 60

Figure 24: Cinétique de croissance des souches R1, R2, L1, L2, BB12

et BN incubées en 43°C.


et BN incubées en 37°C.

Les résultats du test ANOVA démontrent que la cinétique de croissance des souches

incubées en 43°C est significativement différente d‘une souche à une autre (sig=0,031< 0,05).

La meilleure vitesse de croissance a été enregistrée chez les souches L1 et L2 , dont elles

ont arrivé à une charge bactérienne de 8,26 Log UFC/ml et 8 Log UFC/ml respectivement à la

fin de la période d‘incubation (8 h), à partir d‘une charge initiales de 7,285 Log UFC/ml pour

6.5

7

7.5

8

8.5

9

0 2 4 6 8

Log

UFC

/ml

Temps (h)

R1

R2

L1

L2

BB12

BN

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

8.6

8.8

0 2 4 6 8 10

Log

UFC

/ml

Temps (h)

R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 61

la première et 7, 205 Log UFC/ml pour la deuxième, tandis que la souche R2 avait la plus

faible vitesse de croissance avec une charge finale de 7,593 Log UFC/ml à partir d‘une charge

initiale de 7,315 Log UFC/ml.

4.1.3. Viabilité pendant l’entreposage à 4°C

Une propriété très importante des souches destinées à être utilisées comme probiotiques

est qu‘elles doivent demeurer viables pendant l‘entreposage frigorifique avant la

consommation du produit laitier, donc soit présentes en un nombre suffisant de cellules

viables au moment de la consommation.

Dans notre étude, la viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN a été évaluée

pendant une durée de stockage de 21 jours à 4°C. La période de 21 jours est la durée de vie

des produits laitiers fermentés de la date de fabrication jusqu‘à la date de péremption dans

l‘industrie laitière algérienne.

Figure 26: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours de stockage à

4°C.

D‘après les résultats obtenus (figure 27), il apparaît que la viabilité des souches dans le

lait fermenté décroit graduellement durant la période de stockage réfrigéré. Après 7jours de

stockage à 4°C, la souche BB12 enregistre le plus grand pourcentage de cellules viables

(58,1%), en comparaison à R2 (52,8%), L1 (46,8%), BN (45 ,8%) et L2 (38,5%), une chute de

viabilité a été remarquée pour la souche R1 dont seulement 16,22% des cellules ont resté

vivantes. Après 14

jours de stockage, les souches BB12 et R2 gardent les meilleurs

pourcentages de cellules viables parmi les souches étudiées avec 50,9% et 48%

respectivement, Tandis que la souche L1 garde 38,7% de cellules vivantes, les trois autres

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20

Via

bili

té (

%)

Durée d'entreposage (j)

R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 62

souches ont connu un degré très élevé de mortalité des cellules dont le pourcentage de

viabilité s‘arrête à 13,8% pour L2, 11,6% pour BN et 7,14% pour R1 ce dernier est le faible. En

arrivant au dernier jour de stockage frigorifique (21eme

jour), le maximum pourcentage de

viabilité s‘arrête à plus de 27%, cela est enregistré par les deux souches, BB12 (27,7%) et L1

(27,4%), la souche R2 garde un pourcentage de viabilité proche de ceux enregistrés par les

deux premières souches avec 20% de cellules viables, les trois dernières souches ont maintenu

une très faible viabilité à moins de 10% de cellules vivante avec 9 ,16% pour BN , 7,7% pour

L2 et 5,23% pour R1.

Les résultats du test ANOVA démontrent que la viabilité des souches étudiées à 4°C est

significativement différente d‘une souche à une autre, (Sig ═ 0,017 < 0,05) pour 7jours,

(Sig ═ 0,01 < 0,05) pour 14 jours, (Sig ═ 0,012 < 0,05) pour 21jours.

4.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C

La figure 28 comprend les résultats de la variation du pH du lait fermenté par les

souches de bifidobactéries étudiées durant la période de stockage réfrigéré à 4°C.

Figure 27: Variation du pH du lait fermenté par les souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN

pendant le stockage à 4°C.

Le pH initial du lait fermenté par les souches étudiées était compris entre 6 et 6,33. Les

deux souches industrielles étaient les plus post-acidifiantes, dont on a enregistré un pH de

5,08 pour la souche BB12 et 4,98 pour la souche BN à la fin de la période de stockage

4.5

5

5.5

6

6.5

7

0 5 10 15 20 25

pH


R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 63

frigorifique (21 jours), tandis que la souche L2 était la moins post-acidifiante avec un pH

atteignant 6,1. Les autres souches ont enregistré un pH autour de 5,5.

Les résultats du test ANOVA démontrent que la variation du pH entre les souches

étudiées est significativement différente durant toute la période de stockage

(Sig ═ 0,02 < 0,05).

4.1.5. Influence des arômes sur la viabilité

a. Arôme banane

La figure 29 comprend les résultats de l‘évaluation de la viabilité des souches R1, R2 ,

L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage frigorifique en présence de l‘arôme banane

utilisé dans l‘industrie laitière.

Figure 28: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage à

4°C en présence de 0,2% d‘arôme banane.

Les résultats obtenus indiquent que la viabilité des souches étudiées est affectée par la

présence de l‘arôme banane.

Après 07 jours de stockage, les souches R1, BB12 et BN ont gardé un taux viabilité

supérieure à 90% dont les valeurs respectives étant 92,3%, 95% et 93,03%. Une viabilité

moyenne a été enregistrée par les souches R2 et L1 (52,3% et 50,4% respectivement), par

contre la viabilité de la souche L2 était la plus faible avec seulement 35,4% de cellules

vivantes. En arrivant au 14eme

jour de stockage, le taux de viabilité des souches continue sa

régression dont les meilleures valeurs ont été enregistrées par les souches BB12 et BN avec un

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25

Via

bili

té (

%)


R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 64

taux de viabilité de 77,5% et 81,4% respectivement. Par contre le plu faible taux de viabilité

était de 22,2% noté pour la souche R2.

A la fin de la période d‘entreposage (21eme

jour), la souche BB12 a maintenu la plus

grande fraction de cellules vivantes parmi toutes les souches testées (67 ,9%), suivie par les

souches R1 et BN (47% et 43,3% respectivement). Les trois autres souches avaient de très

faibles taux de viabilité aux alentours de 10%.

Les résultats du test ANOVA démontrent que la viabilité des souches étudiées à 4°C en

présence de l‘arôme banane est significativement différente d‘une souche à une autre, (Sig ═

0,015 < 0,05) pour 7jours, (Sig ═ 0,012 < 0,05) pour 14 jours, (Sig ═ 0,027 < 0,05) pour

21jours.

b. Arôme vanille

La Figure 30 comprend les résultats de l‘évaluation de la viabilité des souches R1, R2 ,

L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage frigorifique en présence de l‘arôme banane

utilisé dans l‘industrie laitière.

Figure 29: Viabilité des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN pendant 21 jours d‘entreposage à

4°C en présence de 0,2% d‘arôme vanille.

Les résultats illustrés démontrent que la viabilité des souches étudiées est affectée par la

présence de l‘arôme vanille.

Après 07 jours de stockage, la souche R1 a maintenu un très bon taux de viabilité avec

96% de cellules vivantes, suivie par les souches R2, BB12, L1 et BN avec des valeurs

respectives de 80,3, 86,7, 87,2 et 87,3. Le plus faible taux de viabilité pour cette durée de

stockage a été enregistré par la souche L2 avec 58,4%. Au 14eme

jour, la souche BN avait le

meilleur taux de viabilité (82%), suivie par les souches R1 et R2 (72,65% et 67,9%

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25

Via

bili

té (

%)


R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 65

respectivement), des valeurs moyennes ont été obtenues par les souches L1 (41,9%) et BB12

(37,5%). En revanche, seulement 18,45% de cellules ont maintenu leur viabilité pour la

souche L2. En arrivant à la fin de la période de stockage (21eme

jour), les souches ayant

préservé la plus grande fraction de cellules vivantes étaient BN (67,45%) et R2 (64,45%). Par

contre le plus faible pourcentage de viabilité a été toujours enregistré par la soucheL2 avec

seulement 14,4% de cellules viables, les trois autres souches ont enregistré un taux de

viabilité au voisinage de 30%.

Les résultats du test ANOVA démontrent que la viabilité des souches étudiées à 4°C en

présence de l‘arôme vanille est significativement différente d‘une souche à une autre, (Sig ═

0,012 < 0,05) pour 7jours, (Sig ═ 0,018 < 0,05) pour 14 jours, (Sig ═ 0,016 < 0,05) pour

21jours.

4.1.6. Cinétique de croissance et d’acidification dans milieu lait

a. Cinétique de croissance dans le lait

La figure 31 comprend les résultats de l‘évaluation de la cinétique de croissance des

souches R1, R2 , L1, L2, BB12 et BN dans le lait écrémé pour une incubation à 37°C en

anaérobiose pendant 48 heures.


et BN dans le lait écrémé.

La souche L1 avait le taux de croissance le plus élevé (0 ,133h-1

), dont elle est arrivée à

une charge maximale de 8,3 Log UFC /ml, après 12 heures de fermentation à partir d‘un

nombre initiale de 7,46 Log UFC/ ml. Suivie par les souches BB12, BN, R2 et R1 dont les taux

de croissance sont 0,12h-1

, 0,11h-1

, 0,105h-1

et 0,103h-1

respectivement. Le plus faible taux de

croissance est noté pour la souche L2 (0,095h-1

).

Le résultat du test ANOVA démontrent que la différence entre les taux de croissance des

souches étudiées est significative (Sig ═ 0,017 < 0,05).

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

0 10 20 30 40 50

Log

UFC

/ml

Temps (h)

R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 66

b. Cinétique d’acidification

L‘activité acidifiante des souches lactiques est principalement utilisée pour améliorer la

qualité organoleptique des produits laitiers fermentés, donc cette propriété représente un

paramètre technologique déterminant dans la sélection et l‘utilisation de ces dites souches.

Les résultats de l‘évaluation de la cinétique d‘acidification, ainsi la variation de pH

produites par les souches R1, R2, L1, L2, BB12, et BN dans le lait écrémé ; pour une incubation

de 48 heures à 37°C en anaérobiose sont regroupés dans la figure 32.

Figure 31: Cinétique d'acidification (A) et variation de pH (B) produites par

les souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN dans le lait écrémé.

L‘analyse des courbes de la cinétique d‘acidification (A) et celles de la variation de pH

permet de conclure que la souche R1 était la plus acidifiante dont l‘acidité titrable arrive à une

valeur de 34,4°D à la fin de la période d‘incubation à partir de 19,4°D au départ , donc

12

17

22

27

32

37

0 10 20 30 40 50

Aci

dit

é d

orn

ic (°

D)

Temps (h)

A

R1

R2

L1

L2

BB12

BN

5.8

6

6.2

6.4

6.6

6.8

7

7.2

0 10 20 30 40 50

pH

Temps (h)

B

R1

R2

L1

L2

BB12

BN


Page 67

l‘acidité produite par cette souche est de 15°D , suivie par les souches L1, BN, R2 et BB12

dont les valeurs de l‘acidité élaborée par ces souches sont respectivement, 13,3°D, 12,5°D,

12,1°D et 11,5°D. En revanche la souche la moins acidifiante était L2 avec 8°D. De même, la

variation de pH est proportionnelle à la concentration des acides présente dans le milieu,

Dont le pH enregistré par les souches expérimentée à la fin de la période d‘incubation varie

entre 5,92 et 6,32.

Le résultat du test ANOVA démontrent que la différence entre les valeurs de l‘acidité

dornic enregistrées par les souches testées est significative (Sig ═ 0,0 35 < 0,05).

4.1.7. Activité protéolytique

La protéolyse est l'une des propriétés technologiques les plus importantes, elle permet

l‘hydrolyse des protéines du lait, en fournissant ainsi les acides aminés essentiels pour la

croissance des souches, cette activité contribue aussi au changement de la texture, le goût et

les arômes des produits laitiers fermentés.

Sur milieu MRS à 2% de lait écrémé, les souches L2 et R2 avaient une activité

protéolytique moyenne dont les diamètres des zones d‘hydrolyse étaient environ de 13mm;

tandis que le reste des souches ont montré une faible activité protéolytique dont les

diamètres des zones d‘hydrolyse étaient autour de 6 mm (figure 33).

Figure 32: Activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN

dans milieu MRS à 2% de lait écrémé

Les résultats de l‘évaluation de l‘activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12

et BN sur milieu MRS à 2% de lait écrémé sont mentionnés dans le tableau 12.


Page 68

Tableau 12 : Activité protéolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur milieu

MRS à 2% de lait écrémé.

Souche R1 R2 L1 L2 BB12 BN

Activité

protéolytique + ++ + ++ + +

(+) : faible activité (++) : moyenne activité (+++) : forte activité

4.1.8. Activité lipolytique

La lipolyse fait partie des caractères technologiques très demandés en industrie laitière,

notamment en fromagerie, cette activité induit la libération des acide gras comme résultat de

dégradation des graisses, ce processus est impliqué au développement des flaveurs des

produits laitiers.

Sur milieu agar au tween 80, les souches R1 et R2, avaient une activité lipolytique

moyenne dont les diamètres des zones étaient au voisinage de 12 mm ; une faible activité

lipolytique est notée pour les souches L1, L2 et BB12 avec des diamètres variant entre 7 et 9

mm, la souche BN avaient très faible activité lipolytique dont le diamètre de la zone de

lipolyse n‘a pas dépassé les 4 mm (figure 34).

Figure 33: Activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12, BN

sur milieu agar au tween 80.

Les résultats de l‘évaluation de l‘activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et

BN sur milieu agar au tween 80 sont mentionnés dans le tableau 12.


Page 69

Tableau13: Activité lipolytique des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur milieu agar

au tween 80.

Souche R1 R2 L1 L2 BB12 BN

Activité

lipolytique ++ ++ + + +/- +

(++) : activité moyenne (+) : faible activité (+/-) : très faible activité

4.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques

4.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées

4.2.1.1. Tolérance aux conditions acides de l’estomac

L‘une des conditions principales pour qu‘une souche puisse répondre à la définition de

« probiotique » est qu‘elle doit être viable pendant le transit gastro-intestinal. Avant de

pouvoir adhérer et s‘installer au niveau de l‘intestin, les bactéries probiotiques doivent

survivre au passage par l‘estomac. Afin de déterminer cette capacité de survie chez les

souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN, l‘effet de l‘exposition à un milieu acide sur ces bactéries a

été examiné. Ces dernières ont été exposées à des pH acides 2 et 3 et pH 6,5 comme contrôle

pendant 180 minutes, ensuite la proportion de cellules viables a été évaluée.

D‘après les résultats obtenus, la concentration des cellules viables a diminué pour les

deux pH acides 2 et 3 avec la progression du temps de contact avec les pH acides par

rapport au pH 6,5 (témoin) dont la perte de viabilité était négligeable (figure 35).


Page 70

Figure 34: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN

aux pH acides (2 et 3).

La perte de viabilité à pH 6.5% était négligeable pour la totalité des souches testées, dont

la portion de cellules viables après 180 minutes d‘incubation était de 95% à 99%.

Lors de l‘exposition à pH 2, la souche BN a maintenu la plus grande portion de cellules

viables après 180 minutes d‘exposition à ce pH parmi toutes les souches en sujet (65,5%),

suivie par les souches L1, BB12 , R2 et L2 dont les taux de survie enregistrés sont

respectivement 61,33% , 59,9% , 58,45% et 45,4%. Le plus faible taux de survie pour ce pH

est noté pour la souche R1 (37,33%).

Pour le pH3, la plus grande portion de cellules ayant maintenu leur viabilité à la fin de la

période d‘exposition est enregistrée par la souche BB12 (83,9%), suivie par les souches R1, R2,

L1, BN et L2 avec des taux de survie respectives de 71,7%, 71% , 66,03% , 62,6% et 57,5%, ce

dernier était le plus faible.

Les résultats du test ANOVA ont montré que la différence de viabilité des souches

étudiées est significative pour pH2 (Sig = 0,027<0,05) et pH3 (Sig= 0,023< 0,05).

4.2.1.2. Résistance aux sels biliaires

Les sels biliaires sont l'une des barrières à franchir par les bactéries probiotiques pour

gagner leur site, de ce fait la résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN en présence

de bile a été testée. Ces souches ont été exposées à 0,5% de bile pendant 240 minutes et

ensuite la proportion de cellules viables a été évaluée.

D‘après les résultats présentés dans la figure 36, il apparaît que les souches L2, BB12, BN

et R2 ont montré une excellente résistance aux sels biliaires avec des taux de survie

0

20

40

60

80

100

120

R1 R2 L1 L2 BB12 BN

Tau

x d

e s

urv

ie (

%)

Souches

pH2

pH3

Ph6.5


Page 71

respectives de 85,7% , 85,6% , 84,5% et 83,7% après 240 minutes d‘incubation dans une

solution contenant 0,5% de sels biliaires. Par contre, les souches R1 et L1 ont faiblement

résisté à ces conditions dont les taux de viabilité enregistré par ces deux souches sont de

49,7% pour la première et 35,3% pour la deuxième. En l‘absence de sels biliaires, la

diminution de la viabilité de toutes les souches était négligeable, dont le taux de survie était

compris entre 95,6% et 98, 59%.

Figure 35: Résistance des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN à 0,5% de sels biliaires.

Les résultats du test ANOVA ont montré que la différence de résistance des souches étudiées

à 0,5% de sels biliaires est significative (Sig= 0,0 34< 0,05).

4.2.2. Activité antibactérienne

Ce test permet de mettre en évidence les caractéristiques que possèdent les souches

testées à inhiber la croissance de quelques souches pathogènes.

Les résultats de ce test sont présentés dans le tableau 13.

Tableau 14: Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2 BB12 et BN envers des bactéries

pathogènes.

Diamètre de zone

d’inhibition (mm) Escherichia coli Staphylococcus aureus Listeria innocua

R1 15 16 4

R2 14 18 7.5

L1 12.5 16 4

L2 18 17.5 5

BB12 14 17 5.5

BN 12 14.5 4

0

20

40

60

80

100

120

R1 R2 L1 L2 BB12 BN

Tau

x d

e s

urv

ie (

%)

Souches

0% SB

0.5% SB


Page 72

D‘après les résultats obtenus, il est clair que toutes les souches de bifidobactéries testées

avaient une bonne activité inhibitrice envers les deux germes pathogènes Escherichia coli et

Staphylococcus aureus avec des diamètres de zones d‘inhibition variant entre 12 et 18 mm.

En revanche, une faible inhibition a été notée pour toutes les souches de bifidobactéries en

test sur Listeria innocua dont les diamètres des zones d‘inhibition n‘ont pas dépassé 7,5 mm

dans le meilleur des cas.

Figure 36: Activité inhibitrice des souches R1, R2, L1, L2, BB12 et BN sur Staphylococcus

aureus.

L‘activité inhibitrice a persisté, lors de l‘incubation des souches pathogènes avec les

surnageant natifs issus des cultures des souches de bifidobactéries en test (figure 38), mais

aucune zone d‘inhibition n‘a été observée en cas de l‘incubation avec les surnageants

tamponnés dans la totalité des cas. Ce qui indique que l‘inhibition est due aux acides élaborés

par les souches de bifidobactéries étudiées.


Page 73

Figure 37: Activité inhibitrice des surnageants natifs des souches R1, R2 et L1

sur Escherichia coli.


Les résultats de l‘évaluation de la résistance et la sensibilité des souches de

bifidobactéries aux antibiotiques sont groupés dans le tableau 14. Les souches présentant un

diamètre de zone d‘inhibition supérieur à 15mm sont considérées comme sensibles.

Tableau 15: Résultats de l‘évaluation de l‘antibiorésistance des souches.

Antibiotique Charge de

disque (µg)

Symbole R1 R2 L1 L2 BB

12

BN

Vancomycine 30 VA R R R R R R

Cefotaxime 30 CTX S S S S S S

Penicilline 10 P I I I I I R

Oxacilline 5 OX I S I I R R

Ampicilline 10 AM R R R R R R

Acide nalidixique 30 NA R R R R R R

Azithromycine 15 AZM S S I S S I

Amoxicilline 25 AMX S S S S S S

Fosfomycine 50 FOS R R R R R R

Gentamycine 10 GM R R R R R R

Acide fusidique 10 FA S S S S S S R : Résistante I : Intermédiaire S : Sensible


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Figure 38: Antibiogramme de la souche L2

Toutes les souches ont montré une résistance à 5 parmi 11 antibiotiques testés (la

vancomycine l‘ampicilline, l‘acide nalidixique, la fosfomycine et la gentamycine). Une

sensibilité de toutes les souches étudiées à 4 antibiotiques à savoir : la cefotaxime,

l‘azithromycine, l‘amoxicilline et l‘acide fusidique a été notée, une différence de

comportement des souches testées vis-à-vis la penicilline et l‘oxacilline a été enregistrée. Il

faut signaler que la résistance ou la sensibilité d‘une souche donnée envers un tel antibiotique

peut être liée à l‘antibiotique lui-même, comme peut être liée à la dose utilisée d‘où la

nécessité de tester plusieurs concentrations pour confirmer les résultats obtenues.


Page 75

DISCUSSION

1. Isolement et identification des bifidobactéries

L‘isolement des bifidobactéries nécessite des conditions spécifiques, qui mettent en jeu

des systèmes d‘anaérobiose comme les anaerocults ou les gas-pack et des milieux de cultures

très riches tel que TPY, milieu Beerns, MRS cystéine, milieu Columbia modifié (Hadadji et

al, 2005 ; Scardovi, 1986).

L‘identification des souches est basée sur l‘aspect macroscopique et microscopique.

Les bifidobactéries qui poussent sur le milieu MRS-cysteine forment de petites

colonies à contour régulier et aspect variable, dépourvues de toute activité catalase.

Microscopiquement les cellules formant les colonies sont à Gram positif caractérisées par

des formes variables, mais souvent des formes bifides qui sont typiques au bifidobactéries

(Tabasco et al, 2007 ; Scardovi, 1986).

Le pléomorphisme observé chez les bifidobactéries est souvent associé à la composition

du milieu de culture, des études ont démontré que la morphologie cellulaire des

bifidobactéries est influencée par la nature de la source de carbone présente dans le milieu de

culture (Biavati et Mattarelli., 2001 ; Tamime et al., 1995).

Les souches obtenues ne forment pas d‘indole, ne possèdent pas une activité uréique

et ne liquéfient pas la gélatine, ces caractères biochimiques concordent avec les

caractéristiques spécifiques au genre Bifidobacterium, rapporté par (Mitsuoka, 1984).

La différenciation des espèces de bifidobactéries repose sur la fermentation des

carbohydrates. La souche NCC 2705 de Bifidobacterium longum possède des gènes

codant pour des enzymes ( fumarase, oxoglutarate déhydrogénase et le maltate

déhydrogénase) qui permettent la dégradation de plusieurs sucres comme arabinose,

xylose, ribose, cellobiose, melibiose, maltose, raffinose, et mannose (Schell et al., 2002).

Les souches L1et L2 fermentent l‘arabinose et le xylose. Cette propriété semble distinguer

l‘espèce B. longum des autres espèces. D‘autre part les souches R1, R2 ne fermentent ni

l‘arabinose, ni la xylose par contre elles fermentent le sorbitol.

On se référant au profil fermentaire décrit par Scardovi, 1986, les souches obtenues à

partir de la collection du LMA appartiennent aux deux espèces de Bifidobacterium: l‘espèce

B. breve qui regroupe les souches R1, R2 et l‘espèce B. longum présentée par les souches L1,

L2.

La comparaison avec le profil fermentaire de la souche B. animalis ssp. lactis (BB12)

nous a permis de classer la souche BN isolée à partir du lait fermenté probiotique (Danone

Activia) au sein de l‘éspèce B. animalis, l‘éspèce prédominante dans les produits

probiotiques commercialisés (Fasoli et al; 2003).


Page 76

2. Etudes des propriétés téchnologiques des souches de bifidobactéries

Plusieurs aspects technologiques sont pris en compte lors de la sélection des souches

probiotiques en citant, la viabilité pendant le processus de fabrication, la stabilité dans le

produit au cours de l‘entreposage, le maintien des propriétés organoleptiques et la résistance

au phage, cela a pour but d‘arriver avec des quantités suffisantes de cellules vivantes au

moment de la consommation (Deraz et al ; 2007).

La tolérance à l‘oxygène se révèle un caractère technologique indispensable pour

permettre à une telle souche de surmonter cet obstacle rencontré au cours d‘une fermentation

à l‘échelle industrielle. En général, les bifidobactéries sont considérées comme hautement

sensibles à l‘oxygène. En revanche la tolérance à l‘oxygène se diffère selon l‘éspèce, par

exemple : la souche B. animalis ssp. lactis (BB12) a montré une bonne tolérance a ce facteur

(Roy, 2005).

Les résultats obtenus montrent clairement la capacité de toutes les souches indigènes

étudiées de se croitre en présence de l‘oxygène dont les charges microbiennes enregistrées

étaient très proches de celles inscrites par les deux souches industrielles. La comparaison des

valeurs obtennues avec celles enregistrés en cas de l‘absence d‘oxygène montre l‘effet néfaste

de ce facteur sur la croissance de toutes les souches étudiées caractérisé par la diminution des

charges microbiennes inscrites, en effet, Elizabeth et al. (2011) et Hadadji, (2007) ont

rapporté la capacité de l‘oxygène d‘affecter négativement la croissance des bifidobactéries

dans le lait et la différence de degré de tolérance à ce facteur selon l‘espèce et le milieu de

culture.

D‘après la littérature, la température de fermentation appliquée dans la fabrication des

yaourts et des laits fermentés varie entre 40°C et 46°C, en général autour de 43°C (Béal et

Sodini, 2012 ; Lamoureux, 2000), de ce fait, l‘évaluation du comportement des souches

étudiées envers ce facteur tient une grande importance.

En générale, les espèces de bifidobactéries d‘origine humaine sont des mésophiles dont

la température optimale de croissance se situe entre 36 °C et 38 ºC par contre les espèces

d‘origine animales peuvent se croître a des température plus élevée qui varie entre 41º

et 43°C (Scardovi, 1986).

L‘analyse des courbes de croissance en cas de l‘incubation à 43°C indique la présence

d‘une phase d‘adaptation pour toutes les souches, cette phase dure environ de 3 h, en

revanche, on a remarqué l‘absence de cette phase en cas de l‘incubation à 37°C, dont l‘effet

néfaste de cet température (43 °C) sur la croissance de nos souches est constaté, cet effet

perturbant a été signalé par Hadadji, (2007), dont il a observé un ralentissement de croissance

avec un temps d‘adaptation d‘une heure (1h), pour des souches de bifidobactéries incubées à

42 °C.


Page 77

En dépassant cette dite phase, les souches se multiplient à des vitesses différentes où les

deux souches indigènes L1 et L2 arrivent à des charges de de 8,26 Log UFC/ml et 8 Log

UFC/ml respectivement après 8h d‘incubation, cela dépasse les charges atteintes par les

autres souches y compris les souches industrielles.

Ces observations montrent d‘une part que la température d‘incubation est un paramètre

important qui peut affecter la croissance des bifidobactéries, dont le comportement envers ce

facteur se diffère selon l‘espèce et la souche. D‘autre part, confirment la capacité des souches

de bifidobactéries d‘origine humaine de s‘adapter à des températures élevées (43 °C). De

même, Hadadji, (2007) et Rasic, (1983) ont rapporté que des souches de bifidobactéries

d‘origine humaine peuvent se développer à une température de 42°C.

La survie des bifidobactéries dans un lait fermenté doit être assurée jusqu'à la

consommation du produit puisqu'on doit y dénombrer plus de 105-10

6 cellule par gramme ou

millilitre du lait fermenté pour exercer des effets probiotiques (Shah, 1997).

Les résultats de l‘évaluation de la viabilité des souches durant l‘entreposage à 4 °C ont

montré une perte importante de viabilité de toutes les souches le long de cette période qui a

duré 21 j, cette perte de viabilité se diffère entre les éspèces, et même entre les souches en

sein de la même espèce, cela est observé aussi par Hadadji, (2007) dont il a remarqué une

différence des taux de viabilité entre deux souches appartenant à la même espèce (B. breve),

après 21 jour de stockage frigorifique dans le lait de chèvre.

En arrivant au 21eme

jour du stockage frigorifique, le meilleur taux de viabilité se situe

autour de 27%, enregistré par les souches BB12 (souche industrielle) et L1 (souche indigène),

avec 27,7% et 27,4% de cellule vivantes respectivement, la souche indigène R2 garde un

taux de viabilité proche de ceux inscrits par les deux premières souches avec 20% de cellules

viables. En revanche, les trois autres souches, y compris la souche industrielle BN ont subis

une mortalité notable dépassant 90% du nombre initiales des cellules.

Cette perte importante de viabilité des bifidobactéries durant le stockage frigorifique a

été rapporté par plusieurs auteurs (Hadadji, 2007 ; Gilliland et al., 2002; Shin et al., 2000).

Plusieurs facteurs peuvent influencer la viabilité des bifidobactéries dans le lait fermenté

pendant le stockage à froid y compris, l‘oxygène, l‘épuisement nutritif et les acides

organiques issues de la fermentation (Takahashi et al., 2004).

La suivie de la variation du pH le long de la période de stockage à froid montre que les

souches de bifidobactéries ont continué d‘acidifier le lait pendant le stockage, mais cette

acidification étaient faible dont le pH le plus bas était 4,98 enregistré par la souche

industrielle BN, cela indique que les bifidobactéries n‘influencent pas la qualité du produit

fermenté lors du stockage frigorifique, en effet, certains auteur ont signalé cette faible activité

poste-acidifiante des bifidobactéries (Riazi et Ziar, 2012 ; Hadadji, 2007)


Page 78

Les résultats de l‘évaluation de l‘effet des deux arômes utilisés en industrie (banane et

vanille) ont montré d‘une part l‘impact négatif de ces arômes sur la viabilité des souches

étudiées, ceci pourrait expliquer l‘écart noté entre les concentrations des cellules viables

dénombrées dans les tubes contenant les arômes et les tubes témoins sans arômes, d‘autre

part ils ont indiqué une différence de comportement entre les souches mais aussi selon

l‘arôme utilisé, cela est constaté par une simple comparaison entre le taux de viabilité inscrit

par la souche industrielle R2 et celui enregistré par la souche industrielle BB12 cette dernière a

maintenu un bonne fraction de cellules viables arrivant à 67 ,9% avec l‘arôme banane, et ce

n‘était pas le cas avec l‘arôme vanille, dont une chute de viabilité a été noté en s‘arrêtant à

37,5% de cellules viable. Par contre, la souche R2 a enregistré un très bon taux de cellules

viables atteignant 64,45% avec cet arôme (vanille), contrairement à l‘autre arôme (banane)

dont elle est classée parmi les souches ayant les plus faibles viabilités.

Certaines études ont constaté l‘effet perturbant des arômes ou de mélanges commerciaux

d‘arôme-colorants utilisés en industrie laitière sur la viabilité de quelques souches lactiques

(St. thermophilus, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus et Lb. acidophilus), même aux

concentrations recommandées par les fournisseurs (Bouchefra, 2012 ; Vinderola et al., 2002).

On note qu‘aucune étude spécifiant l‘effet des arômes sur la viabilité des bifidobactéries n‘a

été trouvée.

L‘évaluation du développement de la biomasse produite par les souches étudiées au cours

de la croissance dans le lait écrémé révèle une différence entre les vitesses spécifiques de

croissance, dont le taux de croissance le plus élevé (0,133h-1

) est inscrit par la souche indigène

L1, suivie par les autres souches dont les taux de croissance enregistrés étaient autour de

0,1 h-1

. De même, Martinez-Villaluenga et Gomes, (2007) ont observé que les taux de

croissance et les temps de génération des bifidobactéries dans le lait UHT varient selon les

souches.

Il est à signaler que la croissance des bifidobactéries dans le lait écrémé est lente. En

effet, plusieurs auteurs ont constaté que le lait ne constitue pas un milieu optimal de

croissance pour les bifidobactéries, cela est dû à plusieurs facteurs dont la carence en facteurs

de croissance et en source d‘azote facilement assimilable dans le lait et aussi la faible activité

protéolytique des bifidobactéries (Prasanna et al., 2014 ; Shihata et Shah, 2000 ; Murti et

al.,1992)

Pour stimuler la croissance des bifidobactéries dans le lait, plusieurs sources d‘azote

facilement assimilables sont ajoutées (peptides, l‘hydrolysât de caséine, concentré protéique

de petit lait, ou bien le petit lait) (Dave shah, 1998). Hadadji, (2007) a rapporté que l‘ajout de

0,5 % de l‘extrait de levure et un inoculum à 5% semble avoir un effet stimulateur sur la

croissance des bifidobactéries dans le lait.

Le développement des bifidobactéries dans le lait est accompagné de production d‘une

acidité titrable, le pouvoir acidifiant se diffère entre les souches étudiées dont la souche

indigène R1 était la plus acidifiante avec 15°D d‘acidité dornic produite après 48 h

d‘incubation, dont le pH arrive à une valeur minimale de 5,92, par contre la plus faible valeur


Page 79

était 8°D, inscrite par la souche indigène L2, les autre souches ont enregistré des valeurs

proches variant entre 11,5 °D et 13,3 °D. Cette différence de production d‘acidité est signalé

par plusieurs auteurs (Martinez-Villaluenga and Gomes, 2007; Crittenden et al., 2001; Meile

et al., 1997 )

Le suivi de l‘évolution de l‘acidité titrable produite par les bifidobactéries a montré un

pouvoir acidifiant faible de ces souches, cette faible acidification a été signalée dans

certaines autres études (Hadadji et Bensoltane, 2006 ; Mahi et al., 2006; Samona et al.,1996).

Ceci est un caractère technologique limitant, car une acidification lente a comme

conséquence un temps prolongé de fermentation ; l'industrie laitière fait face à ce problème en

employant des cultures combinées des bifidobactéries et d'autres bactéries lactiques (Roy,

2005).

L‘activité protéolytique est l‘un des caractères technologiques les plus demandés en

industrie laitière, elle permet l‘hydrolyse des protéines du lait, en fournissant ainsi les acides

aminés essentiels pour la croissance des souches, elle contribue aussi à la détermination des

propriétés organoleptique du produit laitier fermenté.

Les souches de bifidobactéries étudiées ont montré une moyenne voir faible activité

protéolytique sur milieu MRS à 2% de lait écrémé dont les diamètres des zones d‘hydrolyse

varient entre 6mm et 13mm. Nos résultats sont en accord avec ceux décrits par Shihata et

Shah, (2000) et Abu -Tarabush et al. (1998).

En effet, Hadadji, (2007) a rapporté que la croissance lente des bifidobactéries en culture

pure dans le lait peut être due à cette faible activité protéolytique.

En industrie laitière, les bifidobactéries sont utilisées en culture mixtes avec des souches

protéolytiques, notamment Lb. acidophilus, et Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (Shihata et

Shah, 2000).

Klaver et al. (1993) ont aussi démontrés que le taux de croissance des bifidobactéries

dans le lait pouvait être augmenté par la présence de souches protéolytiques telles que Lb.

acidophilus, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus ou Lb. casei.

La lipolyse fait partie des caractères technologiques essentiels en industrie laitière,

notamment en fromagerie, cette activité induit la libération des acide gras comme résultat de

dégradation des graisses, ce processus est impliqué au développement des flaveurs des

produits laitiers.

Sur milieu agar au tween 80, les souches de bifidobactéries testées ont montré une

moyenne voir faible activité lipolytique avec des diamètres de zone de lipolyse bouleversant

entre 7mm et 12 mm à l‘exception de la souche industrielle BN qu‘avaient une très faible

activité lipolytique dont le diamètre de la zone de lipolyse n‘a pas dépassé les 4 mm. En effet,

selon De Roissart et Luquet (1994) ; les bactéries lactiques sont considérées comme

faiblement lipolytiques.


Page 80

Une comparaison de nos résultats s‘avère impossible vu l‘indisponibilité d‘une étude

spécifiant l‘activité lipolytique des bifidobactéries.

3. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques des

bifidobactéries

Il est admis que pour que la majorité des probiotiques puissent avoir des rôles bénéfiques

sur la santé humaine, il faut qu‘ils gardent une certaine viabilité lors du transit intestinal. De

ce fait, les probiotiques doivent pouvoir passer sans dommage irréversible la barrière acide de

l‘estomac, puis l‘effet inhibiteur éventuel des sels biliaires. Ainsi, la capacité de survie des

probiotiques dans l‘hôte après leur ingestion, dépend de leur résistance intrinsèque, des

facteurs de l‘hôte et du véhicule par lequel ils ont été ingérés (Marteau and Shanahan, 2003).

Les résultats obtenus montrent clairement la diminution progressive du nombre des

cellules viables pour toutes les souches mises en contact avec les deux pH acides 2 et 3 avec

le temps de contact aux pH acides, en comparaison avec le pH 6,5 (témoin) où la perte de

viabilité était négligeable.

Les souches mises en contact avec le pH 3 ont montré une excellente viabilité après 180

min de contact, dont le plus faible taux de survie inscrit a dépassé 57%, cela est enregistré par

la souche indigène L2, les autre souches indigènes ont maintenu une très bonne portion de

cellules viables arrivant jusqu'à 71,7%; tandis que la meilleure viabilité est réservée pour la

souche industrielle BB12 avec environ de 84% de cellules viables à la fin de la période de

contact avec ce pH acide.

Le contact avec le pH 2 a induit une diminution de la portion des cellules viables pour

toutes les souches, en comparaison avec celles enregistrées avec le pH 3, où le taux de survie

le plus élevé était aux alentours de 66%, noté pour la souche industrielle BN, la souche

indigène L1 a également inscrit une bonne viabilité dont elle a maintenu plus de 61% de sa

charge initiale; par contre, la souche indigène R1 était la moins viable avec seulement 37,33%

de cellule restant vivante après le contact a ce pH.

Les souches étudiées ont montré une différence de comportement selon le pH acide (2 et

3), toutefois les souches industrielles étaient les plus viables pour les deux pH étudié. Les

résultats obtenus sont en accord avec ceux décrits par Sanz (2007).

De même, Matsumoto et al. (2004) et Alander et al. (2001) ont rapporté que la résistance

au pH acide de l‘espèce Bifidobacterium animalis peut être reliée à son excellente survie au

passage du TGI de l‘Homme ; chez cette espèce, une forte induction de l‘activité des ATPases

membranaires a été observée, pouvant ainsi expliquer la résistance élevée au pH acide cette

activité n‘étant pas induite chez les souches moins résistantes aux environnements acides.

Le flux biliaire assure un rôle physiologique très important puisque facilitant la digestion

des composés lipophiles provenant de l‘alimentation. C‘est également un agent antimicrobien

influençant l‘établissement du microbiote intestinal. La tolérance à la bile est un critère


Page 81

déterminant de sélection des bactéries probiotiques, permettant ainsi la survie pendant le

passage à travers le TGI et la colonisation de l‘environnement intestinal.

D‘après les résultats inscrits, il apparait clairement que les souches de bifidobactéries

mises en contact avec une solution de sels biliaires à 0,5% pendant 240 minutes ont maintenu

une remarquable fraction de cellules viables allant jusqu‘à 85,7% (enregistré par la souche

indigène L2), à l‘exception des deux souches indigènes L1 et R1 où le taux de viabilité n‘ a pas

dépassé 50% du nombre initiale des cellules. Bruno, (2012) a affirmé que la résistance à la

bile est une caractéristique souche dépendante et extrêmement variable au sein des espèces et

des genres. D‘après l‘étude de Noriega et al. (2004), Plusieurs souches de Bifidobacterium ont

été adaptées de façon stable aux sels biliaires, à travers une adaptation progressive après une

croissance dans des extraits de sels biliaires en concentration croissante.

Le mécanisme d‘adaptation à la bile chez les bifidobactéries a été corrélé à des

changements stables au niveau du profil de fermentation des sucres, de l‘activité glycosidase,

ainsi qu‘au niveau de la composition en acides gras et du profil protéique membranaire (Ruiz

et al., 2012 ; Ruiz et al., 2007 ; Gueimonde et al., 2005).

En outre, une étude faite par Alp et Aslim, (2010) a mentionné la relation entre la

résistance aux sels biliaires et au pH acide et la production des exopolysaccharides (EPS) par

les bifidobactéries.

La capacité inhibitrice in vitro des bactéries lactiques vis-à-vis des germes pathogènes

semble être une bonne propriété probiotique, comme elle peut jouer un rôle dans la

préservation de la qualité hygiénique des denrées alimentaires (Ammor et al., 2006).

Plusieurs études ont rapporté l‘activité inhibitrice des bifidobactéries envers un grand

nombre de microorganismes pathogènes in vitro et in vivo (Hadadji, 2007., De Vuyst et al.,

2004 ; Sevrin, 2004).

En contact direct avec les germes pathogènes, les souches de bifidobactéries ont présenté

une bonne activité inhibitrice envers Escherichia coli et Staphylococcus aureus où les

diamètres des zones d‘inhibition obtennues varient de 12mm à 18mm, contrairement au

contact avec Listeria innocua dont les diamètres des zones d‘inhibition n‘ont pas dépassé les

7,5 mm.

Cette activité inhibitrice a persisté avec l‘utilisation du surnageant non tamponné issu des

cultures jeunes des souches de bifidobactéries étudiées. Cependant l‘activité inhibitrice a

disparue avec l‘utilisation du surnageant tamponné et cela pour toutes les souches de

bifidobactéries testées. De ce fait, nous avons constaté que l‘activité inhibitrice de nos

souches envers les souches pathogène est due aux acides organiques secrétés dans le milieu.

Ces résultats sont en accord avec ceux trouvés par Hadadji, (2007) et Markas et De Vuyst,

(2006).

Bien que certains rapports ont suggéré que la production d'acides organiques est en partie

responsable de l'activité inhibitrice de bifidobactéries (Bruno and Shah, 2002; Ibrahim and


Page 82

Salameh, 2001). Des travaux récents ont mené à l‘isolement et l‘identification des

bactériocines élaborées par certaines souches de bifidobactéries, comme il est le cas de la

bactériocine nommée « Bifidin I » isolée chez la souche B. infantis BCRC 14602 par

Cheikhyoussef et al. (2010). Cependant, certains rapports ont mentionné des difficultés liées

à l‘élaboration et la purification de ces substances inhibitrices (Cheikhyoussef et al., 2008 ;

Von Ah, 2006 ; Yaldirim and Johnson, 1998).

L‘évaluation de l‘antibiorésistance des souches à usage probiotique a une grande

importance à fin de mettre en évidence une éventuelle multirésistance qui peut être

transformée à la flore intestinale après consommation du produit. Les autorités européennes

ont récemment conclu que quelques bactéries utilisées pour la production d‘aliment pourraient

poser un risque à la santé humaine et animale en raison d'héberger des souches avec les gènes

de résistance transmissibles (Ammor et Mayo, 2007).

Toutes les souches ont montré une résistance à la vancomycine l‘ampicilline, l‘acide

nalidixique, la fosfomycine et la gentamycine, Ces antibiotiques sont utilisés comme agents

sélectifs dans les milieux synthétiques pour l‘isolement et le dénombrement des

bifidobactéries (Ventura et al., 2004).

Une sensibilité de toutes les souches envers la cefotaxime, l‘azithromycine,

l‘amoxicilline et l‘acide fusidique a été enregistré, une différence de comportement vis-à-

vis la penicilline et l‘oxacilline a été enregistrée. Ces résultats sont en concordance avec ceux

décrits par plusieurs auteurs (D‘Aimmo et al.,2007., Masco et al.,2006., Delgado et al.,2005).

Conclusion et perspectives

Page 83

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Si l‘utilisation des bifidobactéries en industrie laitière a connu une énorme évolution

dans les pays technologiquement avancés, l‘exploitation de ce genre est par contre très limitée

dans certains autres pays comme l‘Algérie, cette limitation concerne la diversité des produits

présents sur le marché, mais également le nombre des souches introduites dans les produits

laitiers, cela est liée aux contraintes posées par le genre Bifidobacterium.

L‘objectif de cette étude était d‘évaluer les principales aptitudes technologiques et

probiotiques de quelques souches indigènes de bifidobactéries pour une éventuelle

exploitation industrielle de ces dites souches. Pour atteindre ce but, quatre souches indigènes

ont été obtennues à partir de la collection du laboratoire de microbiologie appliquée (LMA),

dont elles ont été isolées à partir des selles de nourrissons allaités exclusivement au sein et

non subits un traitement antibiotique, une souche industrielle nous a été fournie par la laitière

« Hodna » de la Wilaya de M‘sila, finalement une autre souche industrielle a été isolée à

partir du lait fermenté probiotique « Danone Activia » contenant des bifidobactéries, produit

et commercialisé en Algérie.

L‘identification des souches a été réalisée par la détermination des caractéristiques

morphologiques, physiologiques et biochimiques. Les résultats de ces tests ont indiqué la

présence de trois espèces de bifidobactéries dont les souches indigène appartiennent aux deux

éspèces, B. breve et B. longum; tandis que les souches industrielles font partie de l‘espèce

B. animalis.

Les principales aptitudes technologiques évaluées sont la tolérance à l‘oxygène, la

croissance à une température de 43 °C, la viabilité et l‘évolution de la post-acidification

pendant 21 jours d‘entreposage à 4 °C, l‘effet des arômes utilisées en industrie laitière sur la

viabilité des souches, la cinétique de croissance et d‘acidification dans le lait et finalement

l‘activité protéolytique et lipolytique de ces souches.

Les mêmes souches ont été mises à une évaluation in vitro de leurs propriétés

probiotiques dont nous citons : la résistance aux conditions gastro-intestinales simulées (pH

acide et sels biliaires), l‘activité antibactérienne envers quelques souches pathogènes où nous

avons essayé de mettre en évidence la nature de l‘agent responsable de l‘inhibition,

finalement, un antibiogramme a été réalisé afin de déterminer le comportement de nos

souches envers les différents types d‘antibiotiques.

Les souches indigènes de bifidobactéries étudiées semblent avoir de bonnes aptitudes

téchnologiques en comparaison avec celles des souches utilisées actuellement en industrie

laitière en Algérie, dont :

Toutes les souches indigènes étudiées avaient la capacité de se croitre en présence de

l‘oxygène en arrivant à des charges proches de celles inscrites par les deux souches

industrielles.

De même les deux souches indigènes L1 et L2 ont enregistré des vitesses de croissance

supérieures à celles inscrites par les souches industrielles lors de l‘incubation à 43 °C.

La suivie de la viabilité des souches durant l‘entreposage frigorifique a révélé la présence

d‘une létalité très élevée où le meilleur taux de viabilité inscrit à la fin de la période de

stockage était environ 28% inscrit par la souche industrielle BB12, suivie par les deux souches

indigènes L1 et R2 avec des taux respectives de 27,4 % et 20 %.

Conclusion et perspectives

Page 84

Encore, la poste acidification le long de cette période de stockage était très faible pour

toutes les souches, cela démontre que les bifidobactéries n‘influencent pas la qualité

organoleptique du produit au cours de l‘entreposage frigorifique.

Une différence de comportement des souches étudiées envers les deux arômes

artificielles utilisées a été enregistrée avec une meilleure viabilité de 67 ,9% inscrite par la

souche industrielle BB12 pour l‘arôme banane et de 64,45% noté pour la souche indigène R2

pour l‘arôme vanille.

La suivie du développement de la biomasse produite par les souches étudiées au cours de

la croissance dans le lait écrémé révèle une différence entre les vitesses spécifiques de

croissance, dont le taux de croissance le plus élevé (0,133h-1

) est inscrit par la souche indigène

L1. Ce développement est accompagné de production d‘une acidité titrable, cette dernière se

diffère entre les souches étudiées dont la souche indigène R1 était la plus acidifiante avec

15°D d‘acidité produite après 48 h.

Les souches étudiées ont montré des moyennes voir faibles activités protéolytique et

lipolytique, cela est caractéristique du genre Bifidobacterium.

Dans le même sens, les résultats fournis par l‘étude in vitro des aptitudes probiotiques

des souches de bifidobactéries, sont notamment intéressants. Les souches indigènes ont

montré une résistance remarquable vis-à-vis les conditions acides où elles ont pu préserver un

taux de survie proche de 72% avec un pH de 3 et de 61% avec un pH de 2. Encore une

excellente viabilité des souches indigène dépassant les 85% (enregistré par la souche L2) a été

notée après 240 minutes de contact avec 05% des sels biliaires.

Les résultats de l‘évaluation de l‘activité antibactérienne envers les souches pathogènes

ont désigné l‘existence d‘une bonne activité inhibitrice contre Escherichia coli et

Staphylococcus aureus. En revanche, une faible inhibition a été notée pour toutes les souches

de bifidobactéries contre Listeria innocua.

Cette activité inhibitrice semble à être lié à la production des acides organiques et à un

abaissement de pH du milieu.

Les souches étudiées ont montré une résistance à la vancomycine l‘ampicilline, l‘acide

nalidixique, la fosfomycine et la gentamycine, Ces antibiotiques sont généralement utilisés

comme agents sélectifs pour l‘isolement des bifidobactéries. Par contre, toutes les souches

ont montré une sensibilité envers la cefotaxime, l‘azithromycine, l‘amoxicilline et l‘acide

fusidique.

Notre étude mérite d‘être complétée par la réalisation des démarches suivantes :

Caractérisation génotypique des souches de bifidobactéries.

Etendre l‘étude à un plus grand nombre de souches indigène de bifidobactéries.

Evaluation des interactions des souches de bifidobactéries avec les ferments classiques

utilisés en industrie laitière.

Etude in vivo des propriétés probiotiques de ces souches.

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ANNEXES

ANNEXES

Milieux de culture

A: Milieux solides

Milieu MRS

Extrait de levure 5 g

Extrait de viande 10 g

Peptone 10 g

Acétate de sodium 5 g

Citrate de sodium 2 g

Glucose 20 g

KH2PO4 2 g

MgSO4 0,25 g

MnSO4 0,05 g

Agar-agar 15 g

Cystéine-HCL 0,5 g

Eau distillée 1000 ml

PH = 6,8

Autoclavage à 120°C pendant 20 minutes

Agar Au Tween 80

Peptone 10g

NaCl 5.0g

CaCl2·2H2O 0.1g

Agar –Agar 20 g


pH = 7.4

Autoclavage à 120°C pendant 20 min

2,5 ml de Tween 80 est stérilisé séparément puis ajouté au milieu.

ANNEXES

Milieu KMK

Extrait de levure 3g

Biopolytone 2,5g

Glucose 5g

Agar-Agar 15g


pH = 7.4

Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15 minutes à 121°C.

Au moment de l‘emploi on ajoute :

1 ml d‘une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)

1 ml d‘une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)

Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore 0.22 µm et sont conservées à

l‘obscurité à 4°C.

Milieu Mueller-Hinton

Infusion de viande de bœuf 300 ml

Peptone de caséine 17,5 g

Amidon de mais 1,5 g

Agar-agar 17 g

pH = 7.4

Autoclavage 20 minutes à 120°C

Gélatine nutritive

Extrait de viande 3g

Peptone 5g

Gélatine 13g

pH = 6.8

Autoclavage à 120°C pendant 20 minutes.

ANNEXES

B: Milieux liquides

Milieu MRS BCP

MRS (milieu liquide) 1000 ml

Bromocrésol pourpre 0,025 mg

pH = 7.0

Autoclavage à120 °C pendant 20 minutes

Bouillon nutritif

Extrait de viande 1 g

Extrait de levure 2 g

Peptone 5 g

Chlorure de sodium 5 g


pH = 7,4

Autoclavage à 120 °C pendant 20 minutes

Lait écrémé

Lait en poudre 100g



Milieu urée-indole (I nstitut de pasteur Algérie)

Tryptophane 3g

Phosphate monopotassique 1g

Phosphate dipotassique 1g

Chlorure de sodium 5g

Urée 20g

Alcool à 95° 10 ml

Rouge de phénol 25 mg


ANNEXES

Solutions

Solution de phénolphtaline à 1%

Phénolophtaline déshydraté 1g

Ethanol 95% 100 ml

Tampon phosphate de sodium

Solution (a): 27,8 g NaH2PO4 dans 100ml d'eau distillée

Solution (b): 53,65g Na2HPO4, 7 H2O dans 100ml d'eau distillée

Tampon 0,1 M: 39ml (a) + 61 ml (b) + eau distillée

pH= 7

Autoclavage à 110° pendant 20 min.

Eau physiologique

Chlorure de sodium 8,5 g

Peptone 0,5g


pH = 7


Résumé :

Notre étude a pour but d’évaluer les principales aptitudes technologiques et probiotiques

de certaines souches indigènes de bifidobactéries, dont, les résultats des tests d’identification

des souches indigènes ont révélé leur appartenance à deux espèces de bifidobactéries dont, B.

longum représentée par les souches L1 et L2 etB. breve représentée par R1 et R2. Bien que, la

souche industrielle BN a été classée au sein de l’espèce B. animalis.

Les résultats de l’évaluation des aptitudes technologiques indiquent que les souches

indigènes présentent des capacités très intéressantes exprimées par le pouvoir de se croitre en

présence de l’oxygène, une vitesse de croissance en 43°C dépassant celles inscrites par les

souches industrielles, une viabilité pendant l’entreposage frigorifique très proche de celle

enregistrée par les souches industrielles, une bonne viabilité lors de l’exposition aux arômes

artificiels, une vitesse de croissance dans le lait meilleure que celles des souches industrielles.

Encore, de très bonnes aptitudes probiotiques ont été enregistrées qui se caractérisent par

une notable résistance aux conditions gastro-intestinales, une bonne activité antibactérienne

envers les pathogènes. Finalement les souches étudiées ont montré une résistance envers

certains antibiotiques dont les souches du genre Bifidobacterium sont connues par leur

résistance naturelle à ces antibiotiques.

Mots clés :

Aptitudes Technologiques; Probiotiques; B. Longum; B. Breve B. Animalis; Souches

Indigènes; Viabilité; Entreposage; Bifidobactéries; Industrie Laitière; Danone Activia.

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