Optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l'enfant sous ...

DIPLÔME D’ÉTUDES SUPÉRIEURES SPECIALISÉES EN PHARMACIE HOSPITALIÈRE Session 2001-2003

Travail de diplôme

Optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l’enfant sous ventilation

mécanique

Mise au point d’une méthode de dosage du salbutamol et sa détermination dans l’urine et

le plasma de volontaires sains

Anne-Laure SIDLER-MOIX Pharmacienne

Supervision Pr. André PANNATIER

Pharmacien Chef Pharmacie du CHUV-LAUSANNE

CHUV Service de Pharmacie

Lausanne 2004

Vue d’ensemble

1 Historique de l’aérosolthérapie 11

2 Aspect technique des aérosols 15

3 Les aérosols 26

4 La nébulisation chez les patients sous ventilation mécanique 45

5 La nébulisation chez l'enfant 52

6 Une substance sous la loupe: le salbutamol 70

7 Objectifs du travail 77

8 Matériel et Méthode 85

9 Résultats et discussion 100

10 Conclusion générale 108

11 Bibliographie 110

12 Annexes 119

Table des matières

1 Historique de l’aérosolthérapie 11

2 Aspect technique des aérosols 15 2.1 Rappel morphologique des voies respiratoires 15 2.2 Déposition pulmonaire 17

2.2.1 Transit ou inhalation 18 2.2.2 Captation ou déposition 20 2.2.3 Rétention 21 2.2.4 Absorption 21

2.3 Concepts pharmacocinétiques de la voie pulmonaire 22 2.3.1 Administration systémique 22 2.3.2 Administration par aérosol 22 2.3.3 La clairance mucociliaire 24 2.3.4 Résorption systémique 24 2.3.5 Métabolisme intrapulmonaire 24

3 Les aérosols 26 3.1 Définitions: 26 3.2 Les aérosols-doseurs pressurisés 28

3.2.1 Les pulvérisateurs à gaz comprimé 29 3.2.2 Pulvérisateurs à gaz comprimés insolubles 29 3.2.3 Pulvérisateurs à gaz comprimé soluble 31 3.2.4 Pulvérisateurs à gaz liquéfié: 31

3.3 Les inhalateurs de poudre sèche 33 3.4 Les nébuliseurs 35

3.4.1 La nébulisation pneumatique 36 3.4.1.1 Les systèmes de nébulisation traditionnels 38 3.4.1.2 Les systèmes de nébulisation à double venturi 39 3.4.1.3 Les nébuliseurs intermittents ou dosimétriques 39

3.4.2 La nébulisation piézo-électrique ou ultrasonique 40 3.4.2.1 Les appareils avec circuit de nébulisation intégré 41 3.4.2.2 Les appareils avec circuit de nébulisation indépendant 41

3.4.3 Nouvelles technologies 42 3.4.4 Quelques accessoires liés aux nébuliseurs 43

3.4.4.1 Interface nébuliseur-patient 43 3.4.4.2 Filtre expiratoire 43

4 La nébulisation chez les patients sous ventilation mécanique 45

4.1 Les systèmes de ventilation 45 4.2 Le système de nébulisation 48

4.2.1 Les aérosols-doseurs 49 4.2.2 Les nébuliseurs 49 4.2.3 Nébuliseurs ou aérosol-doseurs ? 50

5 La nébulisation chez l'enfant 52 5.1 Les caractéristiques anatomiques et physiologiques de l'appareil respiratoire de l'enfant 53

5.1.1 Le cycle respiratoire de l'enfant 53 5.1.2 La respiration nasale et les voies aériennes supérieures 54 5.1.3 Les voies aériennes inférieures 54 5.1.4 La déposition pulmonaire d'un aérosol chez l'enfant 55

5.2 Les pathologies respiratoires de l'enfant et leur traitement 56 5.2.1 L'asthme 56

5.2.1.1 Les symptômes de l'asthme chez l'enfant: 59 5.2.1.2 L'asthme aigu 60 5.2.1.3 Le traitement de fond de l'asthme 60

5.2.2 La bronchiolite virale 61 5.2.3 La mucoviscidose 62

5.2.3.1 La rhDNase 63 5.2.3.2 Les antibiotiques 63

5.2.4 L'infection à Pneumocystis carinii (PC) 64 5.2.5 Le bronchospasme postopératoire 64

5.3 Médicaments nébulisés 65 5.3.1 AMM pour la nébulisation pédiatrique 66 5.3.2 Les médicaments nébulisés lors de VM 68

6 Une substance sous la loupe: le salbutamol 70 6.1 Synthèse du salbutamol 70 6.2 Pharmacologie du salbutamol 71

6.2.1 Mécanisme d’action 73 6.2.2 Pharmacocinétique du salbutamol 74

6.2.2.1 Absorption 74 6.2.2.2 Distribution 74 6.2.2.3 Métabolisme 74 6.2.2.4 Elimination 74

6.2.3 Indications du salbutamol 75 6.2.4 Les effets indésirables 75

7 Objectifs du travail 77 7.1 Présentation de l’unité des S.I.P du CHUV 77 7.2 Travaux effectués 78

7.2.1 Revue de l’utilisation du salbutamol 78 7.2.1.1 Résultats de l’étude 78

7.2.2 Etude in vitro 78 7.3 Etude actuelle 81

7.3.1 Les méthodes pharmacocinétiques 81 7.3.1.1 Les études plasmatiques: 81 7.3.1.2 Les études urinaires: 82

7.3.2 Buts de l'étude 83

8 Matériel et Méthode 85

8.1 Préambule 85 8.2 Réactifs 85 8.3 Récolte des échantillons 86 8.4 Préparation des échantillons 87

8.4.1 Les principes de l’extraction SPE 88 8.4.2 Procédure d’extraction en phase solide (SPE): 91

8.4.2.1 Colonne Supelclean® C18 91 8.4.2.2 Colonne Oasis® HLB 91 8.4.2.3 Colonne Oasis® MCX: 92 8.4.2.4 Colonnes SPEC® 92 8.4.2.5 Bon-Elut Certify® I HF 92 8.4.2.6 Colonne Bond-Elut® Si: 92 8.4.2.7 Extraction plasmatique 93 8.4.2.8 Extraction urinaire 93

8.5 Méthodes 93 8.5.1 Détection 93 8.5.2 Choix de l’étalon interne 96

8.6 Procédure de validation 97 8.6.1 Linéarité 97 8.6.2 Spécificité-sélectivité 98

8.6.2.1 Influence de la matrice: 98 8.6.2.2 Influence des produits de dégradation: 98

8.6.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement 99 8.6.4 Rendement d’extraction 99 8.6.5 Limite de détection - Limite de quantification 99 8.6.6 Etude de stabilité 99

8.6.6.1 Etude de stabilité du salbutamol dans le plasma: 99 8.6.6.2 Etude de stabilité du salbutamol dans l’urine: 99

9 Résultats et discussion 100 9.1 Les conditions analytiques 100

9.1.1 Extraction 100 9.1.1.1 Rendement d’extraction 101

9.2 Procédures de validation 101 9.2.1 Linéarité 101

9.2.1.1 Méthode plasmatique 102 9.2.1.2 Méthode urinaire 102

9.2.2 Spécificité-sélectivité 103 9.2.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement 103

9.2.3.1 Méthode plasmatique 103 9.2.3.2 Méthode urinaire 103

9.2.4 Seuils de détection et de quantification 103 9.2.4.1 Méthode plasmatique 103 9.2.4.2 Méthode urinaire 103

9.2.5 Etudes de stabilité 103 9.2.5.1 Stabilité urinaire du salbutamol: 104

9.3 Etude chez les volontaires sains 105 9.4 Conclusion 106

10 Conclusion générale 108

11 Bibliographie 110

12 Annexes 119

Remerciements

Et voilà il est déjà temps d’écrire la ……. première page de ce mémoire !!!

Il est vrai que je ne pensais jamais y arriver, assise seule en face de mon ordinateur. Seule ? Pas vraiment en fait, car durant ces trois années de formation effectuées au sein du service de pharmacie du CHUV, je ne me suis rarement retrouvée seule.

Je voudrais tout d’abord remercier les quatre personnes les plus impliquées dans cette étude :

M. le Professeur André Pannatier, pharmacien chef du service de pharmacie, qui jusqu’il y a peu corrigeait encore ce mémoire. Je le remercie pour l’aide qu’il m’a apportée et la confiance qu’il m’a témoignée.

Le Dr. Jacques Cotting, médecin responsable des Soins Intensifs de Pédiatrie, pour son optimisme, la passion qu’il met dans son travail et qu’il sait si bien transmettre.

Le Dr. Markoulina Berger, pharmacienne responsable du laboratoire de contrôle de qualité de la pharmacie du CHUV, dont l’encadrement a été riche tout autant d’un point de vue scientifique qu’humain. Son immense disponibilité, sa gentillesse et son goût pour le travail bien fait m’ont permis d’apprendre beaucoup durant ces trois ans et j’espère encore pouvoir en profiter dans les années à venir.

Le Dr. Ermindo Di Paolo, pharmacien responsable de l’assistance pharmaceutique pédiatrique du CHUV qui, il y a trois ans, m’a confié son « bébé » et n’a eu de cesse depuis de m’aider à le faire grandir.

Mais ce travail de mémoire représente bien plus qu’une étroite collaboration entre cinq personnes. Et je voudrais profiter de l’occasion qui m’est donnée pour remercier tous mes collègues du CHUV qui de près ou de loin m’ont permis de progresser dans le monde de la pharmacie hospitalière.

Plus spécialement je salue Florence, Marie-Christine, Charles, Stéphane, Nicolas, Bertrand, Valia, Stéphanie, Brigitte, pour leur amitié et leurs rires et tout ce que nous avons déjà partagé ensemble.

Que dire de Greg ou plutôt que lui dire …… et bien il sait déjà ce que je pense de son insupportable caractère, mais une fois n’est pas coutume, je lui dirai simplement merci pour toutes ces soirées passées au CHUV où il n’avait pas grand chose à faire si ce n’est me soutenir dans mes interminables séances d’extractions.

Ce travail a dépassé les frontières du grand bâtiment gris puisque même en Valais le salbutamol n’a plus de secret pour les êtres qui me sont chers.

Je remercie mes parents de m’avoir toujours soutenu dans tous mes périples, d’avoir été là pour partager mes joies et d’avoir toujours su trouver les mots justes quand le moral était au plus bas.

Et puis à mes frères et sœur, je voudrais lancer un grand cri : c’est presque la dernière fois que je vous fais subir mon stress et ma mauvaise humeur et que je vous empêche de goûter au somptueux repas de Nouvel An, promis! Mais surtout merci pour l’exemple que vous me donnez.

Je finirai de remplir cette page de merci en écrivant le plus gros pour Fredo, celui qui partage mon quotidien et qui ne cesse de l’embellir. Son amour et son humour m’ont profondément touché durant ces douze dernières années, mais encore plus, je crois, durant ces derniers mois.

Résumé

Optimisation de nébulisation du salbutamol chez l’enfant: Mise au point d’une méthode de dosage du salbutamol et sa détermination dans l’urine et le plasma de volontaires sains – Anne-Laure SIDLER-MOIX

La voie inhalée est la voie de délivrance privilégiée des traitements à visée respiratoire en raison de la haute concentration du médicament obtenue au site actif et du faible passage systémique permettant de limiter les effets secondaires. Le succès d’un traitement inhalé dépend de l’efficacité du système de délivrance et de son mode d’administration. L’optimisation d’un traitement inhalé passe donc par la connaissance parfaite des techniques d’inhalation.

La nébulisation fait partie des différents systèmes permettant d’amener un médicament au poumon. Si les aérosols-doseurs pressurisés et les inhalateurs de poudre sèche ont l’avantage d’être plus pratiques, moins onéreux et tout autant efficaces, la nébulisation ne nécessite pas une coordination main-poumon. Elle peut être donc être facilement utilisée chez les jeunes enfants et les personnes âgées. De plus une gamme réduite de médicaments, essentiellement les bronchodilatateurs et les corticoïdes, se retrouvent sous forme d’aérosols-doseurs pressurisés ou d’inhalateurs de poudre sèches.

Aux Soins Intensifs de Pédiatrie, les jeunes patients se trouvant sous ventilation mécanique, reçoivent dans plus de 50% des cas des bronchodilatateurs. Si le dépôt pulmonaire résultant de la nébulisation, est de l’ordre de 10% chez une personne respirant spontanément, celui-ci tombe à moins de 5% chez les patients ventilés. Les modalités de la nébulisation sous ventilation mécanique sont peu détaillées dans la littérature et les pratiques hétérogènes. Il apparaît donc utile d’étudier les paramètres physico-chimiques d’une telle administration, ainsi que d’évaluer la délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol. Ceci a été réalisé au moyen d’un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique selon trois modes d’administration différents. Les résultats obtenus contredisant les recommandations internationales, nous avons décidé de les confirmer in vivo, chez l’enfant sous ventilation mécanique.

L’étude se déroule en deux temps : tout d’abord la délivrance pulmonaire du salbutamol est évaluée chez des volontaires sains adultes, ceci afin de justifier l’investigation chez de jeunes patients. Le protocole d’étude a été accepté par la Commission d’Ethique de la Falcuté de Médecine de Lausanne. Dans un deuxième temps, et pour autant que les résultats obtenus confirment l’étude in vitro, une investigation sera faite chez le jeune

patient. En effet, la déposition pulmonaire d’un adulte ne souffrant pas de maladie respiratoire ne peut être extrapolée à un enfant malade.

L’objectif de ce travail de mémoire est donc tout d’abord de se familiariser avec les techniques de nébulisation et de développer une méthode analytique permettant de doser le salbutamol dans les liquides biologiques (plasma et urine). Deux méthodes de dosage ont été validées, une au niveau plasmatique et l'autre au niveau urinaire. Les deux méthodes ont été testées chez 5 volontaires sains. Les résultats obtenus ont montré que la méthode urinaire était suffisamment sensible pour cette application. La méthode plasmatique nécessite encore une amélioration dans sa phase d’extraction dans le but d'atteindre un seuil de détection plus bas, reflétant mieux les concentrations rencontrées dans le sang suite à la nébulisation.

11

Chapitre 1

1 Historique de l’aérosolthérapie

Pour administrer une thérapeutique à visée pulmonaire, la voie la plus simple et la plus naturelle est la voie inhalée.

La pénétration pulmonaire nécessite la génération de particules suffisamment fines pour rester en suspension dans l’air: ce sont les aérosols. Le nom aérosol a été donné, en 1932, par Whytlaw Gray et Patterson à partir de aer (air) et de sol (solution). Avant l’adoption de ce mot, de nombreux termes furent utilisés pour désigner une suspension de gouttelettes dans un gaz formées par condensation ou par dispersion: brouillard, microbrouillard ou brume.

Pedanus Dioscorides, au 1er siècle après J.-C., ère de la pharmacie, prescrivait des fumigations de soufre, alors que Galien (v. 131-v. 201) recommandait à ses malades d’aller respirer sur les pentes du Vésuve les fumérolles chargées de vapeurs sulfureuses. Pendant des millénaires la pipe sera utilisée pour inhaler des substances à visée hallucinogène. Les Indiens fumaient dans leur pipe les feuilles et les racines de Datura ferox pour soigner l’asthme.

En France, des cigarettes médicinales ont été utilisées pour combattre l’asthme. L’Officine dans son édition de 1844, en présente trois variétés: les cigarettes arsenicales de Boudin ou de Trousseau, celles de Raspail au camphre (toux) et les cigarettes mercurielles de Bernard contre les ulcérations spécifiques du nez et de la gorge. Trousseau, célèbre médecin français (1801-1867) proposait aussi des cigarettes antiasthmatiques dont la composition était complexe: feuilles de belladone, de jusquiame, de stramoine, ainsi que de l’extrait gommeux d’opium, sans oublier de l’eau distillée de laurier-cerise !

Chapitre 1 Historique de l’aérosolthérapie 12

Il existait également des poudres ayant la même composition. Il fallait former à l’aide d’une cuillère à café de poudre un tas bien pointu, en allumer le sommet, inspirer normalement la fumée et l’expirer de préférence par le nez.

Au milieu du XIVe siècle, dans les stations thermales, pour répondre à la mode des inhalations d’eau, se développa la technologie de la pulvérisation. On utilisa des appareils à air comprimé, qui produisaient un fin brouillard, pour les malades pulmonaires. Malheureusement on ajouta à ces eaux minérales des substances telles que la térébenthine et le pétrole, produits dangereux pour le poumon (pneumopathies interstitielles). De ce fait, de nombreux médecins mirent en doute l’efficacité de ces thérapeutiques. La nébulisation retomba dans l’oubli.

Cependant, à la fin du XIXe siècle, l’explosion de la tuberculose, comme d’ailleurs celle du SIDA un siècle plus tard, remettra à la mode les inhalations antiseptiques. Devant le peu d’efficacité de ces thérapeutiques, la nébulisation quitta l’arsenal médical à nouveau. La découverte de l’adrénaline et de l’éphédrine redonnera une seconde jeunesse aux aérosols. En 1912, l’adrénaline sera utilisée pour la première fois dans les crises d’asthme. Ces inhalations furent administrées le plus souvent par de petits appareils de type « vaporisateurs à parfum ». La pression nécessaire à la vaporisation était obtenue à l’aide d’une poire en caoutchouc. Ces appareils pulvérisent une faible quantité de produit dont la taille des particules vaporisées est inadéquate pour atteindre l’arbre bronchique et les alvéoles. Celles-ci sont en effet trop grosses et impactent dans les voies aériennes supérieures. L’adrénaline ou l’éphédrine sont absorbées et passent par la voie sanguine avec tous les effets secondaires qui en découlent: tachycardie, hypertension, etc., cependant leurs effets bénéfiques sur l’œdème de Quincke en font un traitement de choix utilisé par les allergologues et les urgentistes.

Si à cette époque le corps médical ignorait l’influence de la taille des particules sur la bonne pénétration pulmonaire, des études sur ce phénomène furent entreprises par des chimistes qui travaillaient sur les aérosols toxiques utilisés comme gaz de combat et des hygiénistes qui étudiaient le rôle des microbrouillards comme transporteurs de microbes.

Le problème crucial de la pénétration des particules jusqu’au fond des alvéoles n’était pas encore résolu dans le monde médical; les préparatifs puis la guerre de 39-45 ont permis de faire avancer les connaissances sur les aérosols par les travaux sur les gaz de combat.

En France le pneumologue Robert Tiffeneau étudie les effets broncho-pulmonaires d’aérosols d’acétylcholine chez des asthmatiques et met au point les tests de provocation bronchique en utilisant d’abord l’air résiduel (volume résiduel) pour apprécier le bronchospasme induit par l’acétylcholine, puis en 1947 il développe le test de la CPUE (Capacité Pulmonaire Utilisable à l’Effort), appelée maintenant le VEMS (Volume Expiratoire Maximum en 1 seconde). Il définit également la DLAC, la Dose Liminaire d’Acétylcholine qui fait chuter le VEMS de 20%.


Aux Etats-Unis les nébuliseurs ultrasoniques font leur apparition en 1949 en tant qu’humidificateurs, mais rapidement les médecins ajouteront des substances médicamenteuses pour produire des aérosols thérapeutiques.

En 1956 apparaît un nouveau type de dispositif permettant de délivrer un aérosol: les aérosol-doseurs. Ces appareils, petits, peu onéreux et faciles théoriquement à mettre en œuvre, ont conquis le monde médical en faisant tomber en désuétude, sauf chez les ORL, les nébuliseurs bruyants et peu efficaces de l’époque.

En 1958, l’anglais B.M. Wright développe un nouveau nébuliseur pneumatique, avant d’inventer un an plus tard son célèbre Peak-Flow Meter permettant de mesurer le Débit Expiratoire de Pointe (DEP) pour le suivi des patients asthmatiques.

Dans les années 1960 et au début des années 70, on constate un net recul de la nébulisation au profit des aérosol-doseurs. Les connaissances sur les dépôts trachéo-bronchiques et pulmonaires s’enrichissent grâce aux traceurs radioactifs, d’abord au moyen d’or 198 et d’indium 111 fixés sur l’hydroxyde de fer, puis avec de l’albumine marquée au technétium radioactif TC99m ou en mélangeant uniformément la solution avec des radionucléotides dans le nébuliseur [1].

En 1975 Rosenthal et French inventent la méthode dosimétrique: nébulisation déclenchée par l’inspiration [1]. A la même époque, Hargreave développe la méthode dite « de nébulisation continue » de bronchoconstricteurs à l’aide du nébuliseur de Wright. Ces deux méthodes donnent des résultats comparables mais la méthode dosimétrique est plus rapide et plus simple [2].

Dans les années 80 le traitement des pneumonies à Pneumocystis carinii associées au SIDA ainsi que celui de la mucoviscidose donnent un nouvel élan à la. nébulisation. Il en résulte une amélioration de l’appareillage et de nouveaux médicaments nébulisables telles que la nébulisation de pentamidine dans les pneumocystoses que la trithérapie anti-HIV a fait quasiment disparaître et la nébulisation de pénicilline dans les infections à Pseudomonas aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose [3]. La gentamicine, la colistine et la tobramycine sont actuellement largement utilisées, ce qui diminue le nombre de cures intraveineuses d’antibiotiques [4].

Dans les années 80 encore, la technologie de la nébulisation s’améliore [5], en particulier pour la nébulisation à domicile. De petits appareils ultrasoniques connaissent un grand succès grâce à leur simplicité et à leur facilité d’utilisation.

En 1994, toujours dans le cadre de la mucoviscidose, la rhDNase [6] commence à être nébulisée dans un but mucolytique.

Une autre maladie bénéficie de l’aérosolthérapie: l’asthme. En 1972, l’Australien Galf nébulise avec succès du cromoglycate chez des patients asthmatiques, et en 1992, la nébulisation de corticoïdes améliore de façon notable la prise en charge des jeunes asthmatiques. 50 ans auparavant, l’hydrocortisone avait été utilisée, mais présentant un faible tropisme pulmonaire, elle agit surtout par le biais d’une absorption systémique,


alors que la béclométhasone et la suspension de budénoside agissent directement sur le poumon. Dans le cas de l’asthme aigu grave, Salmeron a mis en évidence en 1994 que l’adrénaline nébulisée est plus efficace qu’administrée en perfusion [7]. La voie inhalée est largement acceptée comme étant la façon optimale d’administrer des médicaments tels les corticoïdes ou les β2-agonistes pour le traitement des patients souffrant d’obstruction des voies aériennes.

La voie inhalée est une voie millénaire puisque des fumigations étaient pratiquées déjà du temps d'Hippocrate. A l’exception de pathologies telles que l'asthme où une action localisée est recherchée, cette voie fut longtemps négligée. Elle revient aujourd'hui en force, non pas pour une action locale pulmonaire ou bronchique mais pour une action systémique.

Au cours de ces dernières années la recherche a fait des progrès importants dans le domaine de la délivrance des médicaments. Il y a une raison à cela: les médicaments modernes, qui contiennent des substances actives composées de peptides ou de protéines, ne peuvent pas être administrés sous forme de comprimés ou de capsules, au risque d’être dégradés dans l’estomac. La voie pulmonaire présente un certain nombre d'avantages qui ne sont pas négligeables. Tout d'abord, elle représente un accès facile à la circulation sanguine. En effet, au niveau des bronches ou des alvéoles pulmonaires, les membranes physiologiques à traverser pour atteindre le sang sont très fines. De plus, elle permet d'administrer des molécules trop sensibles à l'acidité ou aux enzymes protéolytiques pour être absorbée par voie orale. Avec l'avènement des biotechnologies, un bon nombre de médicaments auront ces caractéristiques, tels certaines hormones et en particulier l'insuline [8], [9] ou encore certains antalgiques majeurs [10]. Enfin, elle est facile d'utilisation, moins contraignante que l'injection sous-cutanée qui est actuellement une des seules alternatives pour les molécules fragiles. Cet avantage est d'autant plus important si le patient doit recevoir une injection quotidienne. La voie inhalée est donc une alternative à la voie sous-cutanée avec l'inconvénient d'être peut-être moins accessible, notamment si les patients souffrent d'une affection pulmonaire, bronchique ou oto-rhino-laryngologique.

Ainsi des thérapies à visée systémique se sont développées ces dernières années, tels l’insuline, l’hormone de croissance, la LH-RH, la calcitonine et l’héparine [11]. De même que la nébulisation d’adénovirus et de liposomes, dans la thérapie génique des patients atteints de mucoviscidose, semblent être une voie d’avenir intéressante [12].

15

Chapitre 2

2 Aspect technique des aérosols

Les muqueuses des voies aériennes permettent d’administrer de relativement petites doses de médicament pour produire des concentrations locales importantes et minimiser dans un même temps l’absorption dans la circulation systémique.

Ces voies peuvent être subdivisées en:

♦ Voies aériennes supérieures pour lesquelles on distingue différents niveaux tels que les fosses nasales et les sinus, la bouche (organe commun aux voies digestives et respiratoires), le pharynx (rhino-pharynx, bucco-pharynx et organes lymphoïdes) et le larynx.

♦ Voie pulmonaire qui comporte la trachée, les bronches et les alvéoles pulmonaires.

Nous allons nous intéresser plus spécifiquement à la voie pulmonaire comme voie d’administration des médicaments.

2.1 Rappel morphologique des voies respiratoires L’appareil respiratoire comprend le nez, la trachée, les bronches et les poumons. Les parois de la trachée et des bronches présentent des anneaux cartilagineux qui maintiennent l’ouverture béante. Les deux bronches supérieures se ramifient en de nombreuses bronches et bronchioles. Ces dernières sont caractérisées par un épithélium dépourvus de cils et les cellules externes deviennent cubiques. Les lobules pulmonaires (cf Figure 1) sont des petits sacs polyédriques de 1 cm3 environ, tassés les uns sur les autres. La bronchiole qui arrive dans un lobule

Chapitre 2 Aspect technique des aérosols 16

pulmonaire se divise en ramifications s’ouvrant dans des cavités dont chacune porte le nom d’acinus. Il y a une trentaine de ces cavités par lobule. Chaque acinus se prolonge par trois à cinq chambres ramifiées partant du même point. Les logettes ultimes de chacune de ces chambres sont les alvéoles pulmonaires. Elles ne mesurent que 0,2 à 0,3 mm. C’est à travers ces alvéoles que se font les échanges gazeux et l’absorption de médicaments. Leur paroi est très mince, avec quelques fines fibres élastiques et des cellules épithéliales aplaties où un réseau de capillaires très fin permet le passage des globules rouges. Les poumons constituent la partie essentielle de l’appareil respiratoire. Chaque poumon est recouvert d’une séreuse, la plèvre, formant un sac à deux feuillets; l’un, viscéral, adhére au poumon, l’autre, pariétal, est adjacent à la paroi thoracique et au diaphragme.

Figure 1 Subdivisions et structure des voies intrapulmonaires

La muqueuse de l’appareil respiratoire est formée d’une couche conjonctive et d’un épithélium à cellules cylindriques ciliées avec des cellules à mucus dont les sécrétions s’ajoutent à celles de nombreuses glandes en grappes.

Le mucus est un gel visco-élastique de pH variant entre 5,5 et 6,5. Il constitue une couche rendue continue par le mouvement ciliaire. La couche de mucus est composée de deux phases, une phase supérieure de viscosité relativement élevée et une phase inférieure de très faible viscosité, où baignent les cils vibratiles. L’épaisseur de la couche de mucus se situe entre 0.5 et 2 mm. Les extrémités des cils vibratiles parviennent au niveau de la couche externe et entraînent ainsi cette dernière d’avant en arrière.

La fonction mucociliaire dépend de la dynamique des cils et de la composition chimique des fluides recouvrant l’épithélium, donc à la fois de la nature du mucus et, lors d’une inhalation, de la préparation médicamenteuse administrée. La fonction ciliaire (cf Figure 2) peut en effet être influencée par la nature chimique du principe actif et des excipients


et les propriétés physiques de la forme galénique (par exemple viscosité). Les cils vibratiles assurant le déplacement du tapis muqueux ont un mouvement biphasique: le cil se dresse, permettant ainsi à sa pointe de pénétrer la couche visqueuse, puis il se plie et se déplace dans la couche fluide pour reprendre sa place initiale.

Figure 2 Représentation du mouvement ciliaire

L’onde de propagation du mouvement de l’ensemble des cils se développe de façon métachrone: le mouvement ciliaire d’ensemble provient du décalage de phase existant entre cils voisins. Chaque cil est légèrement en avance sur celui qui le suit et en retard sur celui qui le précède, créant ainsi un mouvement ondulatoire.

La phase supérieure visqueuse du mucus à laquelle adhèrent les particules étrangères est mise en mouvement. L’intégrité de cette phase est une condition du bon fonctionnement ciliaire. Le temps de clairance mucociliaire est très variable d’un individu à l’autre, mais dépend de nombreux facteurs. On admet qu’une particule à la surface du tapis muqueux se déplace, chez 80% des individus, à une vitesse variant de 1 à 25 mm/min., 20% ayant une clairance lente inférieure à 1-2 mm/min.

2.2 Déposition pulmonaire Le médicament inhalé doit passer par un ensemble de « tuyaux » dont le diamètre est de plus en plus petit, avec un débit d’air qui diminue en proportion. Cette réduction progressive du débit d’air complique la préparation d’une forme médicamenteuse possédant les caractéristiques optimales de déposition (cf Tableau 1). Ceci sera développé par la suite.

Tableau 1 Facteurs affectant la déposition de particules dans l’appareil respiratoire

Caractéristiques des particules Diamètre, densité, forme, charge, solubilité, hygroscopicité

Caractéristiques des aérosols Vitesse, distribution de la taille des particules, évaporation du gaz propulseur


Caractéristique du tractus respiratoire Humidité, anatomie (géométrie), jouant un rôle pour la reproductibilité, états pathologiques

Caractéristique de la respiration Volume d’air inspiré, vitesse de l’air inspiré, respiration par le nez ou par la bouche

Après dispensation de l’aérosol par le dispositif approprié, le devenir des particules dépend du mode d’administration, du transport du principe actif vers son site d’action, de la dose administrée et du temps d’exposition, souvent très court.

Il est courant de distinguer 4 étapes dans ce long trajet:

♦ Transit ou inhalation

♦ Captation ou déposition

♦ Rétention et clairance

♦ Absorption

2.2.1 Transit ou inhalation La pénétration des aérosols dans les voies respiratoires hautes et basses dépend en premier lieu de la taille des particules (cf Figure 3). Seules les particules inférieures à 1,2 μm franchissent les canalisations des bronches sans s’y fixer, alors que seules celles dont le diamètre est inférieur à 0,2 μm parviendront vraiment à l’alvéole.

Figure 3 Transit en fonction de la taille des particules

Ce transit dépend aussi du mode de respiration et de la vitesse du courant gazeux. En sachant que le volume d’air inspiré et expiré est d’environ 500 ml avec une respiration normale de 12 à 15 cycles par minute, le rythme moyen de respiration est donc de 22 à 25


litres/minutes. Une augmentation de cette vitesse d’air inspiré peut amener dans les alvéoles des particules qui n’y seraient pas parvenues normalement. Au contraire, un ralentissement du rythme augmente le temps de séjour et la rétention des aérosols.

La nature de l’écoulement à travers le tractus respiratoire peut être soit laminaire, soit turbulent (cf Figure 4). Selon la loi de Poiseuille, si les dimensions du conduit restent constantes, la vitesse du fluide devient directement proportionnelle à la pression et inversement proportionnelle à la viscosité. L’écoulement est dit laminaire.

Loi de Poiseuille:

lPr

tV

⋅⋅⋅⋅

=η

π8

4

t = temps (sec.) nécessaire au volume V (ml) d’un fluide de viscositéη, pour circuler à travers un tube d’une longueur l (cm), de rayon r (cm), sous une pression P (dyn×cm-2).

Quand un fluide est forcé fortement à travers un tube ou au contact d’un obstacle, l’écoulement laminaire devient turbulent, ce qui signifie que le liquide tourbillonne dans le conduit et que la direction du mouvement moléculaire est en continuel changement. L’écoulement d’un fluide est fonction du nombre de Reynolds (Re):

ηρ⋅⋅

⋅=vdRe

où d = diamètre du tube (en cm), v = vitesse du fluide (en cm x s-1), r = densité (en g ⋅ cm-3) et η = viscosité (en cm2 ⋅ s-1).

Quand le nombre de Reynolds dépasse 2000, le flux est considéré comme turbulent.

Figure 4 Représentation schématique d’un écoulement laminaire et turbulent

L’humidité de l’air dans la profondeur des poumons intervient également dans le processus de transit. Selon leur nature, les particules pourront absorber de l’eau, l’air


expiré étant saturé d’eau (34 g/m3), à 37°C). Il en résulte une augmentation de la taille des particules. La température joue un rôle non négligeable. Le poumon est en principe plus chaud que l’aérosol. Ce dernier point est particulièrement important. En effet, l’aérosol inhalé à une température inférieure à celle du corps devra être réchauffé et humidifié par l’organisme, ce qui risque d’augmenter la taille de ses particules. Au contraire, si l’aérosol est inhalé à une température supérieure à celle du corps, il devra être refroidi et l’eau qu’il contient se condensera sur les bords de l’épithélium.

2.2.2 Captation ou déposition La captation ou déposition constitue la seconde étape: les particules de l’aérosol sont fixées par l’épithélium broncho-alvéolaire. Les études expérimentales sur la dynamique des fluides dans les voies aériennes ont montré que le dépôt des particules était fonction de l’étage trachéo-bronchique. Dans les voies aériennes supérieures, ainsi que dans la trachée et jusqu’aux bronches principales, les grosses particules se déposent par impaction du fait des turbulences. Au-delà, les particules se déposent par sédimentation et par diffusion jusqu’aux alvéoles:

♦ Impaction par inertie. Ceci concerne les particules de 0.5 à 50 μm qui sont sensibles au changement de direction. La probabilité d’impaction par inertie croît avec le diamètre des particules, la vitesse de l’air, le rayon de courbure et la diminution du diamètre bronchique.

♦ Sédimentation par gravité. Elle s’effectue surtout dans les dernières divisions de l’arbre bronchique. Son rôle est prédominant quand le débit s’annule entre inspiration et expiration. La sédimentation est inversement proportionnelle à la vitesse du fluide aérien et proportionnelle à la masse des particules.

♦ Diffusion (mouvement brownien) (cf Figure 5). Ce phénomène se déroule spécialement dans les bronchioles terminales et concerne les particules très fines (0.002 à 0.5 μm). Toutes les particules ayant une densité plus élevée que l’air subissent une force due à la gravité.


Figure 5 Représentation schématique des différents mécanismes de déposition

2.2.3 Rétention La rétention caractérise le temps plus ou moins long où les particules sont retenues à leur lieu de déposition. Elle dépend de la vitesse de dissolution et de diffusion à travers la couche de mucus et du mécanisme d’épuration pulmonaire par l’ascenseur mucociliaire. Celui-ci est le mécanisme d’épuration probablement le plus important après l’action des macrophages alvéolaires.

2.2.4 Absorption La quatrième et dernière phase est celle de l’absorption (ou résorption) de la fraction de principe actif inhalée qui est absorbée par les muqueuses du tractus respiratoire. Cette absorption, mise en évidence par des mesures de taux plasmatiques ou urinaires, est donc réelle. Le taux d’absorption spécifique à chaque segment, du nez et de la bouche aux alvéoles, est difficile à évaluer. Si l’absorption bronchique spécifique est difficile à mettre en évidence, l’absorption alvéolaire est significative. Elle peut être indésirable si les effets systémiques ne sont pas recherchés ou souhaités pour certains principes actifs. En effet, l’alvéole est un site d’absorption privilégié grâce à la grande surface représentée par ces très nombreux petits sacs polyédriques (300×106) et à leur réseau capillaire très dense. L’administration sous forme d’aérosol permet une concentration locale supérieure à celle obtenue par la voie orale. Pour les bronchodilatateurs par exemple, la dose efficace par aérosol se situe dans un rapport de 1/200 en comparaison de la voie orale [13]. Il s’agit de substances dont le dosage est de l’ordre du centigramme ou du milligramme, car il n’est pas possible de pulvériser une quantité de médicament suffisante pour des principes actifs fortement dosés. C’est donc là une des limites au recours de l’aérosolthérapie.


De ce fait on trouve des substances administrées en aérosols pour leur action systémique et d’autres destinées à un traitement local.

L’aérosol suit donc, depuis son administration, un long chemin, tortueux et fortement diversifié du début (nez, bouche) à l’extrémité inférieure (alvéole).

La pénétration et le dépôt des aérosols dans les voies aériennes dépendent de trois facteurs: les caractéristiques aérodynamiques de l’aérosol, la géométrie des voies aériennes et les conditions d’inhalation. Ces notions ont d’abord été établies sur des modèles pulmonaires artificiels ou chez des sujets sains. Elles ne sont pas toujours transposables en pathologie, comme le montrent des études cliniques réalisées ces dernières années. En 1981, Itoh a montré l’implication des anomalies de la fonction respiratoire sur la diffusion des aérosols [14]. Chez les patients atteints de BPCO, la déposition périphérique d’un aérosol de colloïde marqué au technétium est d’autant plus réduite que l’obstruction bronchique est importante. D’autres études ont porté sur des aérosols médicamenteux, dans différentes pathologies, et notamment la mucoviscidose

2.3 Concepts pharmacocinétiques de la voie pulmonaire 2.3.1 Administration systémique Le sort d’un médicament est habituellement décrit en trois phases successives: l’absorption, la distribution et l’élimination. L’absorption décrit le passage du site d’administration (muscle, tube digestif, etc.) à la circulation sanguine. A l’exception de la voie intraveineuse, le passage du médicament dans le sang n’est pas toujours total et l’on désigne par biodisponibilité le pourcentage de médicament administré qui atteint le sérum. La distribution du médicament vers les tissus se réalise généralement par voie sanguine. Elle dépend, en quantité et en vitesse, des caractéristiques physico-chimiques des molécules administrées et des propriétés des tissus eux-mêmes, notamment de leur perfusion sanguine. L’élimination se fait en règle générale à partir du sang, les deux principaux émonctoires étant le rein et le foie. Dans ce dernier cas, la disparition du médicament peut résulter soit de son élimination au sens propre par sécrétion biliaire puis par élimination digestive, soit d'une métabolisation. Certains médicaments sont également métabolisés dans le sérum ou en périphérie dans certains tissus. L'élimination d'un médicament est décrite par sa demi-vie d'élimination, exprimée en heures ou minutes et par la clairance, exprimée en ml/min.

2.3.2 Administration par aérosol Dans le cas de l'administration d'un aérosol, la situation est très différente en raison de la différence de trajet du médicament dans l'organisme (cf Figure 6).


Figure 6 Trajet d’un médicament à visée pulmonaire en cas d’administration systémique (A) ou par nébulisation (B)

En effet, le site d'activité thérapeutique se situe alors en amont d'une éventuelle résorption systémique. Cette particularité entraîne plusieurs conséquences:

♦ la résorption systémique n'est pas une condition sine qua non à l'efficacité thérapeutique. La notion de biodisponibilité ne peut s'appliquer, tout du moins dans son sens classique. Au contraire, dans certains cas, la résorption sanguine du produit n'est responsable que des effets indésirables du médicament;

♦ la notion de dose elle-même diffère de celle utilisable pour d'autres modes d'administration en raison du rendement de la nébulisation et de la variabilité de la topographie de dépôt du médicament. On distingue la dose nébulisée, la dose inhalée, la dose déposée et la dose résorbée;

♦ afin de déterminer l'efficacité clinique d’un médicament, on considère deux paramètres pharmacologiques que sont la concentration initiale au site d'activité et sle temps de présence. La clairance corporelle totale du médicament inhalé doit être distinguée de sa disparition du poumon ou clairance pulmonaire, qui peut résulter de trois voies (cf Figure 7), la clairance mucociliaire, la résorption systémique ou le métabolisme local.


2.3.3 La clairance mucociliaire Elle s’applique aux médicaments en solution ou en suspension dans le tapis de mucosité que l'appareil ciliaire fait remonter vers le carrefour aérodigestif. Le médicament est alors éliminé dans le tube digestif et se comporte pharmacologiquement comme lors d'une administration orale. A ce titre, les médicaments peuvent être absorbés par les muqueuses et ainsi augmenter la partie résorbée systémique.

La cinétique d'élimination par clairance mucociliaire dépend du site de dépôt initial. Les études portant sur des particules marquées par des isotopes radioactifs montrent que si la demi-vie de passage de l'oropharynx vers le tube digestif n'est que de 10 minutes, elle est de 100 minutes pour le transfert des bronches à l'oropharynx et de 8 heures des bronchioles aux bronches. Au-delà des bronchioles, en l'absence de cellules ciliées, les transferts des alvéoles vers les bronchioles se chiffrent en dizaines, voire centaines, de jours [15].

2.3.4 Résorption systémique Les médicaments déposés peuvent quitter la lumière aérienne pour être résorbés directement par le riche réseau de capillaires alvéolaires. La paroi alvéolaire repose sur un réseau très dense de capillaires. La barrière séparant l’air du sang varie entre 0.3 et 0.7 mm, ce qui est nettement inférieur à celle de la paroi intestinale (» 40 mm). Les médicaments peuvent aussi transiter par l'interstitium pulmonaire pour rejoindre secondairement la voie sanguine par voie lymphatique.

2.3.5 Métabolisme intrapulmonaire Si la voie pulmonaire évite l’effet de premier passage hépatique, elle n’est pas pour autant dépourvue d’action enzymatique susceptible d’engendrer un « pseudo-effet » de premier passage. Ces enzymes jouent souvent le rôle de « barrière défensive » contre l’entrée de xénobiotiques qui pourraient pénétrer dans l'organisme lors de la ventilation. Ils sont capables de métaboliser le principe actif avant son arrivée dans le torrent circulatoire, donc avant l’absorption proprement dite. Parmi ces différentes « usines enzymatiques », on compte le cytochrome P450 et aussi d’autres enzymes tels la glycuronyl-tranférase, la sulfo-transférase, la N-acétyl-transférase et la mono-amine-oxydases [15]. Néanmoins, le rôle de ces voies métaboliques sur l'élimination des médicaments administrés par inhalation reste mineur. Pour diminuer ou éviter l’action de ces enzymes, en particulier lors d’administration de molécules peptidiques ou protéiniques, on peut protéger la substance active par une forme galénique appropriée (liposomes, nanoencapsulation, etc.) ou ajouter à la préparation des inhibiteurs enzymatiques. Il est évident que ces substances doivent être bien tolérées et dépourvues d’activités pharmacologiques propres.


Figure 7 Elimination pulmonaire et corporelle totale d’un médicament inhalé

26

Chapitre 3

3 Les aérosols

Le terme aérosol fait l’objet de définitions variées, puisque l’on donne à ce mot une double signification, en désignant soit un système physique, soit le dispositif permettant de l’obtenir.

3.1 Définitions: Ci-dessus sont présentées quelques définitions des dictionnaires classiques:

♦ Petit Robert:

“AEROSOL [aeRɔsɔl]. n.m. (1948; de sol 4). Système réalisant la dispersion, en particules très fines, d’un liquide ou d’une solution dans un gaz. Les aérosols sont employés comme véhicules de certains agents médicamenteux (aérosol-thérapie).”

♦ Grand dictionnaire des lettres (Larousse):

“aérosol [aeRɔsɔl] n.m. (du préf. Aéro-et sol, solution;1950, Larousse). Dispersion, en particules très fines, d’un liquide ou d’une solution dans un gaz (air ou oxygène): Les aérosols constituent un mode d’administration de certains médicaments (pénicilline, atropine, etc.).”

♦ Dictionnaire historique de la langue française:

“Aérosol n.m. (1928), où sol, emprunté à la langue anglaise, représente solution, désigne la suspension de particules dans

8), où sol, emprunté à la langue anglaise, représente solution, désigne la suspension de particules dans

Chapitre 3 Les aérosols 27

un gaz, par métonymie, le système qui projette cette suspension.”

D’un point de vue galénique, l’aérosol est un système dispersé, dont la phase externe est un gaz (ou un mélange de gaz) et la phase interne ou dispersée peut être solide ou liquide [16].

♦ Pharmacopée:

La Pharmacopée Européenne (4ème édition, addendum 2000) n’utilise pas le terme d’aérosol mais celui de préparations pharmaceutiques pressurisées (en latin Praeparationes pharmaceuticae in vasis cum pressu) pour désigner à la fois le contenant et le contenu:

« Les préparations pharmaceutiques pressurisées sont des préparations conditionnées dans des récipients spéciaux, sous la pression d’un gaz. Elles contiennent un ou plusieurs principes actifs. Elles sont libérées du récipient à l’aide d’une valve appropriée, sous forme d’un aérosol (dispersion de particules solides ou liquides dans un gaz, la taille des particules étant adaptée à l’usage prévu) ou d’un jet liquide ou semi-solide, par exemple une mousse. La pression nécessaire pur assurer la projection de la préparation est produite par des gaz propulseurs appropriés.

Les préparations pharmaceutiques pressurisées se présentent sous forme de solution, d’émulsion ou de suspension. Elles sont destinées soit à l’application locale sur la peau ou les muqueuses des divers orifices corporels soit à l’inhalation. »

La Pharmacopée réserve une définition spéciale pour les préparations pour inhalation ou Inhalanda:

« Les préparations pour inhalation sont des préparations liquides ou solides destinées à être administrées dans les poumons sous forme de vapeurs ou d’aérosols, en vue d’une action locale ou systémique. Elles contiennent un ou plusieurs principes actifs qui peuvent être dissous ou dispersés dans un excipent approprié.

Les préparations pour inhalation peuvent, suivant leur type, contenir des gaz propulseurs, des co-solvants, des diluants, des conservateurs antimicrobiens, des solubilisants, des stabilisants, etc. Ces excipients n’exercent aucun effet notable sur les fonctions de la muqueuse de tractus respiratoire et de ses cils. »

Les aérosols médicamenteux sont utilisés pour différentes voies d’application, principalement les voies respiratoires supérieure et inférieure, mais aussi la peau ou l’orifice buccal.

Dans ce travail de mémoire, nous nous intéresserons principalement aux aérosols amenant un principe médicamenteux au niveau des voies respiratoires, prévus pour une application ou une absorption pulmonaire, donc plu précisément aux Inhalanda.


Trois types de systèmes d’administration sont documentés dans la Pharmacopée, deux liquides et un solide:

♦ Les aérosols-doseurs pressurisés

♦ Les inhalateurs à poudre sèche

♦ Les nébuliseurs

3.2 Les aérosols-doseurs pressurisés Ils sont aussi appelés inhalateurs pressurisés à valve doseuse et, en anglais, Metered-Dose Inhalers abrégé MDIs. Ce sont des préparations délivrées dans des récipients spéciaux sous la pression d’un gaz (cf Figure 8). Ce gaz comprimé ou liquéfié fonctionne comme un piston, exerçant sur le contenu une pression supérieure à la pression atmosphérique et permettant son expulsion par une valve. On réalise ainsi une dispersion plus ou moins grossière de particules médicamenteuses dans un mélange de gaz propulseur et d’air atmosphérique. La préparation, contenant un ou plusieurs principes actifs, se présente sous forme d’une solution, d’une émulsion ou d’une suspension.

Figure 8 Aérosol-doseur pressurisé

Les pulvérisateurs sont de deux types (cf Figure 9):


♦ à gaz comprimé (gaz insoluble: azote, argon ou soluble: CO2, N2O)

♦ à gaz liquéfié (butane ou hydrocarbures fluorés)

Figure 9 Schéma d’un pulvérisateur à gaz comprimé (gauche) et d’un pulvérisateur à gaz liquéfié (droite)

3.2.1 Les pulvérisateurs à gaz comprimé La dispersion du liquide en fines gouttelettes dans l’air atmosphérique est uniquement assurée, dans le cas du gaz comprimé, par son passage sous pression à travers l’orifice supérieur du gicleur. Il s’agit donc d’une dispersion mécanique. La pression est due au gaz comprimé. Elle s’exerce à la surface du liquide et se transmet au sein du liquide jusqu’à l’orifice du gicleur.

3.2.2 Pulvérisateurs à gaz comprimés insolubles Ils forment avec la phase liquide un système biphasique. Un tel système est caractérisé par:

♦ Un récipient étanche contenant:

♦ une phase liquide à disperser qui est soit un principe actif liquide, soit un principe actif en solution, en émulsion ou en suspension

♦ une phase gazeuse: le gaz propulseur


♦ Une valve assurant le bouchage et comprenant le dispositif de pulvérisation. La valve comporte:

♦ Un tube plongeur amenant le liquide vers un gicleur dont l’orifice débouche sur l’extérieur.

♦ Un clapet ou soupape qui permet ou non, selon sa position, la communication entre le tube plongeur et le gicleur.

♦ Un ressort qui assure la fermeture du clapet en période de non-utilisation.

♦ Un bouton-poussoir qui, actionné par l’utilisateur, permet l’ouverture du clapet.

Les valves doseuses caractérisent pratiquement toutes les préparations destinées au traitement des affections respiratoires avec administration d’une dose précise de principe actif (cf Figure 10). A chaque pression sur la tête de la valve, il se dégage une quantité déterminée, fixée à l’avance et constante de produit. Pour cela, il existe une chambre intermédiaire entre l’intérieur du flacon et l’air ambiant. Cette mini-chambre est donc en relation soit avec l’intérieur, soit avec l’extérieur du flacon, mais jamais avec les deux.

Figure 10 Principe d’émission avec valve doseuse


Ces gaz, qui sont inertes vis-à-vis du principe actif et très bon marché, se situent au-dessus du produit actif, assurant la pression nécessaire à l’expulsion et à la vaporisation.

3.2.3 Pulvérisateurs à gaz comprimé soluble Ces aérosols ont les mêmes caractéristiques que les pulvérisateurs à gaz comprimé insoluble, à la différence qu’une réserve de gaz est dissoute dans la phase liquide, ce qui permet un taux de remplissage plus élevé qu’avec les gaz insolubles, soit environ 80% de la capacité du récipient.

Les pulvérisateurs à gaz comprimé ont l’avantage d’avoir une pression variant très peu en fonction de la température. Les risques d’explosion sont faibles lorsque l’appareil est placé dans un endroit à température assez élevée. Malheureusement la dispersion, uniquement mécanique, est moins efficace. L’obtention d’une pression importante nécessite la présence d’un volume de gaz important, environ 50% du volume total du récipient. En effet la pression à l’intérieur du récipient diminue au cours de l’utilisation, lorsque le volume occupé par le gaz augmente (PV = constante).

3.2.4 Pulvérisateurs à gaz liquéfié: Dans ce cas, la phase liquide est constituée par un mélange de principe actif et de gaz liquéfié: le principe actif peut être en solution, en suspension ou en émulsion dans le gaz liquéfié. La phase gazeuse est formée par la vapeur du gaz liquéfié. L’action de ce type de gaz est double. La dispersion ici n’est pas uniquement mécanique. La pression gazeuse y joue un rôle mais n’est pas seule à intervenir. En effet, en plus de leur rôle de propulseur, les gaz éiquéfiés participent au processus d’aérosolisation, c’est-à-dire à l’obtention de très fines gouttelettes. Cette aérosolisation est obtenue par l’effet physique d’évaporation. Le gicleur propulse un mélange de principe actif et de gaz liquéfié. Ce dernier se trouve brutalement à la pression atmosphérique et passe instantanément de l’état liquide à l’état de vapeur en dispersant le principe actif auquel il se trouvait mêlé.

Les pulvérisateurs à gaz liquéfié ont un mécanisme de dispersion plus efficace avec un volume occupé par la phase gazeuse plus faible (environ 25%), ce qui assure une pression constante pendant toute la durée de l’utilisation du fait qu’il y a vaporisation de gaz liquéfié au fur et à mesure que le volume disponible pour la phase gazeuse augmente. Par contre il faut noter une importante modification de la tension de vapeur, soit de la pression, avec les changements de température. Les pulvérisateurs à gaz liquéfié ne doivent jamais être stockés à une température supérieure à 50°C, car il y a risque d’explosion. De plus ces gaz, dont le coût est élevé, ne sont pas inertes et ne sont donc pas compatibles avec tous les principes actifs ou autres substances à disperser.

Il est à noter que les premiers gaz liquéfiés utilisés étaient des hydrocarbures fluorés ou chlorofluorés, contestés en raison de leur action perturbante sur la couche d’ozone. Le protocole de Montréal de 1987 a stipulé l’arrêt de leur utilisation pour l’an 2000. Les CFC ont été substitués par des hydrocarbures hydrofluorés, ou HFC, non toxiques. Depuis 1998, la société Glaxo-Wellcome a commercialisé en Suisse le Ventolin® (salbutamol) et


l’Axotide® (fluticasone) sans CFC. A ce jour neuf aérosols-doseurs pressurisés commercialisés en Suisse (Axotide® (0.05 mg), Becloforte®, Becotide®, Bricanyl®, Dospir®, Ecovent®, Foradil®, Pulmicort® et Serevent®) contiennent toujours du CFC.

Si les aérosols-doseurs pressurisés sont très pratiques pour les traitements ambulatoires, en raison de leur petite taille, de leur prix de revient faible, de leur emballage multidoses, d’une bonne stabilité à l’oxydation, à la lumière et à l’humidité et de la possibilité d’une administration rapide sans besoin de maintenance. Leurs principaux inconvénients sont un dépôt dans l’oropharynx important (80%), responsable d’un accroissement des effets secondaires locaux (par exemple: dysphonie, candidoses bucco-pharyngées avec les corticoïdes inhalés) et la nécessité d’une bonne coordination main-poumons qui est difficilement réalisable surtout chez les enfants avant 7-8 ans et les personnes âgées [17], [18].

Cet inconvénient majeur a conduit aux développements suivants:

♦ Des dispositifs à déclenchement automatique pendant l’inspiration. Cette innovation est coûteuse et reste orpheline puisqu’une seule spécialité est disponible sur le marché: Maxair® Autohaler de Synthélabo véhiculant le pirbutérol, un β2-stimulant peu utilisé, de plus elle exige un effort inspiratoire important.

♦ La chambre d’inhalation (cf Figure 11): il s’agit d’un réservoir de 130 à 750ml en plastique ou en métal (non électrostatique). Le flacon d’aérosol est fixé en communication à une des extrémités de cette chambre et le patient respire par un orifice situé à l’autre extrémité à travers une valve unidirectionnelle inspiratoire ou des valves bidirectionnelles inspiratoire et expiratoire [19]. Des chambres d’inhalation dotées d’un masque facial conçues pour le nourrisson sont disponibles. Ces chambres ont l’avantage d’augmenter la distance entre la sortie de l’aérosol-doseur et la bouche. Ceci conduit à une diminution de la taille des particules et donc à une meilleure pénétration pulmonaire, ainsi qu’à une diminution de la sensation de froid (« cold freon effect ») qui peut produire, dans certains cas, une toux réflexe. De plus les grosses particules sont impactées dans la chambre, ce qui diminue le dépôt oropharyngien. Elles sont également une aide à l’inhalation lors de problèmes de coordination main-poumons. L’inconvénient majeur des chambres en plastique est leur charge en électricité statique, qui provoque l’adsorption des particules d’aérosol sur leurs parois. Pour y remédier, on peut appliquer un détergent ou une peinture antistatiques, saturer les sites d’adsorption en actionnant plusieurs fois l’aérosol-doseur ou, le plus simplement, tremper la chambre dans de l’eau contenant du liquide à vaisselle et de la laisser sécher telle quelle à l’air sans la frotter avec un chiffon. L’appareillage reste somme toute assez encombrant [19].


Figure 11 Chambre d’inhalation en métal

Différentes études ont montré que les MDIs additionnés d’une chambre d’inhalation étaient aussi performants que les nébuliseurs pour administrer des médicaments au niveau pulmonaire et ceci même chez des enfants âgés de 2 ans et moins [20], [21], [22], [23]

3.3 Les inhalateurs de poudre sèche Ils sont également appelés en anglais Dry Powder Inhalers ou DPIs. Le principe actif se trouve sous forme de poudre micronisée et conditionnée dans des gélules, des blisters ou dans un réservoir de poudre et est généralement additionné de diluants inertes (par exemple le lactose) [24]. Les doses de poudre pharmacologiquement actives sont généralement petites, variant de 50 mg à environ 20 mg [24]. Le passage des particules dans le tractus respiratoire se fait par inhalation d’une dose de poudre lors de l’inspiration par le patient. La dispersion pulvérulente n’est donc pas propulsée par le dispositif, comme c’est le cas avec les récipients pressurisés.

Il faut différencier:

♦ Les inhalateurs de poudre sèche unidoses

♦ Les inhalateurs de poudre sèche à doses unitaires multiples

♦ Les inhalateurs de poudre sèche multidoses

Ces trois types d’inhalateurs sont représentés à la Figure 12.

Dans les deux premiers systèmes, après ouverture de la gélule ou du blister par des pointes qui les perforent, une désagrégation mécanique est obtenue par passage à travers les pales d’une hélice d’un ventilateur mis en marche par une inspiration rapide de la part


du malade. L’appareil doit être rechargé chaque fois, ce qui constitue un inconvénient non négligeable d’un point de vue pratique et de l’observance.

Les inhalateurs de poudre sèche multidoses sont plus simples d’emploi. Ils ont un réservoir de poudre qui permet, grâce à un système particulier de délivrer par simple rotation une dose fixe de principe actif. Elle est alors inhalée par le patient après inspiration d’air qui, en traversant le dispositif, entraîne la poudre. Les inhalateurs de poudre sèche multidoses sont les plus agréables pour les patients, mais ils n’atteignent pas la précision des systèmes unidoses.

Quel que soit le système, il prépare et délivre l’aérosol en même temps que le patient inhale, ce qui évite le problème de coordination main-poumon. Il faut cependant relever que, en dépit d’une micronisation poussée des poudres, la dose unitaire d’un principe actif ainsi administré est habituellement au moins le double de celle nécessaire dans une préparation pharmaceutique pressurisée. De plus Ranade [24] relève que pour atteindre les poumons les particules de principes médicamenteux doivent se situer de préférence entre 2 et 3 μm. Cette taille est atteinte par micronisation de la poudre, mais ce processus peut provoquer des agglomérats de poudre, en changeant certaines propriétés de la poudre, l’adhésion et la cohésion par exemple. Ce problème ne se pose pas avec les MDIs ou les nébuliseurs, le principe actif étant en suspension dans un véhicule liquide.

Ces dispositifs sont somme toute écologiques, puisqu’ils n’utilisent pas de gaz propulseurs, très pratiques du point de vue de leur petite taille pour le traitement ambulatoire et parce qu’ils ne demandent pas de coordination main-poumons. Toutefois ils demandent une inhalation rapide et un flux de 60 L/min pour une administration correcte du médicament; leur coût est relativement élevé et la poudre inhalée peut provoquer des bronchospasmes.

Des études in vivo [25], [26] ont été réalisées en pratiquant des inhalations de molécules radiomarquées, détectées par scintigraphie gamma. Elles ont montré ainsi clairement la distribution du produit radiomarqué dans la bouche, la gorge, les poumons et l’estomac et permettent sa quantification. Les résultats obtenus montrent que seul 10 à 15% de la dose inhalée à l’aide d’un MDI est déposée dans les poumons. Les résultats sont plus variables avec les DPIs, allant de 10 à 30% Avec les systèmes DPIs le dépôt pulmonaire est plus dépendant du design de l’appareil et de sa construction.


Figure 12 Les différents types d’inhalateurs de poudre sèche

3.4 Les nébuliseurs L'appareil de nébulisation comporte un réservoir dans lequel est introduit le liquide à nébuliser, une chambre de nébulisation, lieu de production de l'aérosol, d’un raccord permettant l’aspiration (pièce en T seule, avec masque facial ou embout buccal) et une source d'énergie - pneumatique ou piézo-électrique - utilisée pour créer l'aérosol.

Les appareils de nébulisation sont soumis aux exigences de la directive européenne relative aux dispositifs médicaux au sein de laquelle ils sont rattachés à la classe IIa.

L'appareil de nébulisation se distingue de l'aérosol-doseur et se caractérise par les propriétés suivantes:

♦ il peut délivrer une quantité importante d'aérosol;

♦ il ne nécessite généralement pas de coordination main-inspiration;

♦ il peut nébuliser tout médicament liquide choisi par le prescripteur.

Ces trois caractéristiques distinguent avantageusement, dans certaines circonstances, les appareils de nébulisation des aérosol-doseurs pressurisés et des inhalateurs de poudre sèche [27].

Deux principes de nébulisation sont utilisés pour produire un aérosol médicamenteux [28]. La nébulisation pneumatique et la nébulisation piézo-électrique ou ultrasonique.


3.4.1 La nébulisation pneumatique Chronologiquement, c'est le premier mode de production d'un aérosol et le plus répandu. Il utilise une source de gaz comprimé, air ou oxygène, qui est connectée au nébuliseur par un fin gicleur. En pratique, la source de gaz comprimé est généralement un compresseur d'air. Ce peut être aussi une bouteille d'oxygène ou une installation centrale hospitalière de gaz comprimé.

Les nébuliseurs pneumatiques fonctionnent selon le principe de Bernoulli (1700-1782):

Lorsqu’un fluide circule à grande vitesse dans un tube, sa pression est basse, alors qu’à faible vitesse, elle est élevée. D’où l’équation:

P + ½ rv2 + rgh = constante

où P = pression dans le tube, r = masse volumique du fluide, v = vitesse du fluide, g = accélération gravitationnelle et h = hauteur au-dessus d’une valeur de référence.

Cette équation suppose que l’écoulement est régulier et laminaire et que la viscosité est négligeable.

Pratiquement, le jet d'air traverse le nébuliseur par un venturi (endroit où le gaz propulseur rentre en contact avec la préparation pour inhalation) et aspire le liquide à travers un fin conduit capillaire. Le liquide est expulsé à vitesse élevée sous forme d'un jet composé de petites gouttelettes, c'est la génération primaire. Ce jet de gouttelettes est ensuite brisé sur un déflecteur et une fraction de gouttelettes très fines est constituée et forme l'aérosol, c'est la génération secondaire. L'aérosol produit est directement acheminé à l'extérieur du nébuliseur par le courant d'air provenant de la source de gaz comprimé (cf Figure 13).


Figure 13 Principe de nébulisation d'un générateur pneumatique

Dans ce processus, une part importante du jet est recyclée en continu sous forme de grosses gouttelettes qui retombent au fond de la cuve. La détente de l'air comprimé dans le nébuliseur et l'évaporation liée au recyclage continu du liquide provoquent une baisse importante de la température (entre 9 et 12°C)[29].

Une concentration du principe actif peut également se produire dans le nébuliseur au cours de la nébulisation en raison du phénomène d'évaporation [30], [31]. Ceci s’explique de la manière suivante: le gaz propulseur utilisé (air comprimé ou oxygène) est pratiquement anhydre. Durant la nébulisation, il est saturé par la vapeur d’eau provenant de la solution pour aérosol. Suite à cette évaporation d’eau, la solution restant dans le nébuliseur se concentre. Plus le volume de la solution de départ est réduit, plus le phénomène de concentration est rapide. Il est donc important de nébuliser la totalité du contenu du nébuliseur. Une étude réalisée au CHUV à mis en évidence ces deux phénomènes en comparant différents nébuliseurs [29]; nous y reviendrons plus tard. Une fraction du volume de liquide placé dans le nébuliseur reste piégée dans le système de nébulisation sous forme de gouttes fixées dans les gicleurs, sur les parois de la cuve et de la chambre de nébulisation et dans les raccords, tuyaux, embouts du circuit de délivrance. Cette fraction est appelée le volume résiduel. Il est important d'en connaître la valeur pour introduire dans le nébuliseur un volume au moins égal à la somme: volume résiduel + volume que l'on souhaite nébuliser.

La pression d'alimentation en air comprimé du nébuliseur varie selon les appareils de 0.4 bar à 3.5 bar (pression des gaz muraux utilisés en milieu hospitalier). Pour un nébuliseur


donné, l'augmentation de la pression d'alimentation diminue la taille des gouttelettes et ainsi la granulométrie de l'aérosol. C'est un moyen simple de produire un aérosol composé de petites particules. Les nébuliseurs peu élaborés nécessitent une pression élevée pour produire un aérosol respirable (< 2 μm). En revanche, les nébuliseurs de conception élaborée produisent un aérosol respirable composé de très fines particules avec une faible pression. Les avantages d’une faible pression de fonctionnement sont un refroidissement moindre de l'aérosol par détente de l'air comprimé, donc un meilleur confort, une meilleure protection des molécules fragiles, et une grande fiabilité des compresseurs.

Parmi les appareils de nébulisation pneumatique, on distingue trois types principaux (cf Tableau 2):

Tableau 2 Principaux types de nébuliseurs

Les nébuliseurs: -pneumatiques (cf Figure 15): traditionnels à double venturi intermittents ou dosimétriques -ultrasoniques - nouvelles technologies

Les différents nébuliseurs pneumatiques et leur délivrance médicamenteuse durant le cycle respiratoire sont illustrés à la Figure 15.

3.4.1.1 Les systèmes de nébulisation traditionnels Les systèmes de nébulisation pneumatique standard utilisent un nébuliseur dont le débit d'aérosol est fixe et identique au débit de la source d'air comprimé, par exemple 6 L/min. Si le patient inspire à un débit plus élevé (10 L/min), l'air supplémentaire nécessaire (4 L/min) sera de l'air de dilution pénétrant dans le circuit par un orifice placé sur le chemin de sortie de l'aérosol. La quantité de liquide délivrée sous forme d'aérosol sera relativement limitée, souvent à une valeur comprise entre 0.1 et 0.2 ml de solution par minute, et sera identique en phase inspiratoire et en phase expiratoire. Le médicament est donc rejeté vers l’extérieur en phase expiratoire, d'où un gaspillage du médicament.

Les inconvénients de ce type de nébuliseurs sont une durée de nébulisation longue, entièrement fixée par le débit de la source d'air comprimé, et un gaspillage important de l'aérosol en phase d'expiration.

Exemples: Microneb® (Europe Medical), Cirrus® (Intersurgical), où le gaz est introduit par le bas et Upmist® (Hospitak), par le haut.


3.4.1.2 Les systèmes de nébulisation à double venturi Les systèmes de nébulisation pneumatique de conception élaborée utilisent un nébuliseur à double venturi.

Dans ce cas, le débit inspiratoire du patient, lorsqu'il est supérieur à celui du compresseur, active un deuxième venturi constitué par un orifice d'appel d'air placé à l'entrée du nébuliseur et par un circuit qui achemine cet air additionnel au niveau des gicleurs où se produit la génération primaire de l'aérosol. Ce débit liquide est d'autant plus élevé que le débit inspiratoire est important et peut atteindre la valeur de 0.4 ml/min.

En revanche, pendant la phase expiratoire, ce double venturi sera inactivé par arrêt de l'appel d'air supplémentaire et la quantité de médicament gaspillée sera limitée à la valeur minimale liée au débit du compresseur.

Les nébuliseurs à double venturi présentent ainsi le double avantage d’une nébulisation accrue durant l’inspiration, et d’une réduction des pertes de médicament pendant l'expiration [32]. Exemples: Sidestream® et Ventstream (Medic-Aid), Pari LC® Plus (Pari).

Il sont toutefois déconseillés aux enfants de moins de 3 ans, ceux-ci ayant un débit inspiratoire trop faible, de l’ordre de 100 ml/min.

3.4.1.3 Les nébuliseurs intermittents ou dosimétriques Les nébuliseurs pneumatiques dosimétriques permettent de délivrer l’aérosol uniquement pendant la phase inspiratoire. Outre la nébulisation en seule phase inspiratoire, le système peut délivrer à chaque inspiration des bouffées calibrées, indépendantes du débit inspiratoire du patient. L'objectif est de délivrer une quantité d'aérosol parfaitement connue par séance. Le temps de nébulisation en est allongé, mais là encore on évite une perte du principe actif.

Ces appareils sophistiqués et onéreux sont conçus pour l'administration de médicaments à visée systémique et de produits coûteux pour lesquels la dose effectivement inhalée doit être contrôlée très précisément. Exemples: Pari LL® (Pari) (cf Figure 14)

Figure 14 Le nébuliseur Pari LL


Figure 15 Les nébuliseurs pneumatiques et leur délivrance médicamenteuse durant le cycle respiratoire. A. Traditionnel; B. A double Venturi (breath-enhanced); C. Intermittent ou dosimétrique

3.4.2 La nébulisation piézo-électrique ou ultrasonique Un élément piézo-électrique communément appelé quartz génère une vibration à haute fréquence (entre 1.2 et 2.4 MHz selon les appareils). Cette vibration transmise au liquide (solution médicamenteuse) crée une colonne en surface appelée fontaine de cavitation d'où vont se détacher les particules formant l'aérosol.

Ce mode de production d'un aérosol se caractérise par des débits généralement élevés (jusqu'à 1 ml/min).

La vitesse de production des particules est modulable sur de nombreux appareils en fonction de l'intensité de la vibration qui est transmise au liquide, permettant d'adapter la délivrance de l'aérosol au patient. Ainsi, pour des nourrissons et des jeunes enfants, on privilégiera des débits moins élevés que pour des adultes.

Les particules ainsi générées sont alors stockées dans la chambre de nébulisation. Ces dernières sont véhiculées vers le patient de deux manières:


♦ soit au moyen de l'air mobilisé par le patient: un système de valves intégrées au circuit de nébulisation permet une délivrance des particules uniquement en phase inspiratoire du patient;

♦ soit par une ventilation intégrée à l'appareil qui autorise une délivrance en continu de l'aérosol.

On distingue généralement deux types d’appareils ultrasoniques: les appareils avec circuit de nébulisation intégré et ceux avec circuit indépendant.

3.4.2.1 Les appareils avec circuit de nébulisation intégré La nébulisation de la solution médicamenteuse se fait directement au contact du quartz. De conception assez ancienne, ces appareils présentent deux inconvénients majeurs:

♦ l'élévation de température que produit le quartz peut dégrader certaines molécules fragiles;

♦ Ces appareils sont très difficiles à désinfecter et. les éléments du circuit de délivrance ne sont pas démontables. Ils ne peuvent donc être utilisés par plusieurs patients.

Exemples: Nebutur® (Tur), Atomisor Megahertz (Atomisor)

3.4.2.2 Les appareils avec circuit de nébulisation indépendant La nébulisation de la solution médicamenteuse se produit dans un circuit séparé du quartz (cf Figure 16). Dans cette architecture, tous les éléments en contact avec la solution médicamenteuse sont à usage patient unique. Une interface d'eau est présente entre le quartz et le circuit de nébulisation. De ce fait, la solution médicamenteuse n'étant pas en contact avec le quartz, il ne se produit aucune élévation de température au cours de la séance [33]. De plus, l'utilisation de l'appareil par plusieurs patients ne pose pas de problèmes, dans la mesure où un circuit de délivrance neuf est attribué à chaque nouveau patient.

L’engouement pur les nébuliseurs ultrasoniques a été important au début de leur commercialisation. Par la suite, on a constaté que les gouttelettes d’aérosols produites étaient relativement grossières et que les suspensions ne pouvaient être nébulisées (par exemples Pulmicort®). Du fait de ces deux inconvénients majeurs, les nébuliseurs ultrasoniques sont moins utilisés de nos jours [29].


Figure 16 Nébulisateur ultrasonique

3.4.3 Nouvelles technologies De nouveaux types de nébuliseurs ont été développés comme le eFlow® de Pari (cf Figure 17), l ‘Aeroneb® d’Aerogen ou le Respimat Soft Mist® de Boehringer Ingelheim.

Figure 17 Nébuliseur eFlow®de Pari

Le nébuliseur eFlow® permet l’inhalation de nombreux médicaments liquides à l’aide d’une membrane vibrante actionnée par un système électronique. L’Aeroneb fonctionne selon un principe similaire.

Le Respimat® est un nébuliseur multi-doses qui génère un aérosol durant 1.2 secondes, soit environ six fois plus longtemps qu’un aérosol-doseur pressurisé conventionnel.


Ces nouveaux dispositifs semblent prometteurs et nous verrons ces prochaines années s’ils remplaceront les dispositifs actuellement utilisés.

3.4.4 Quelques accessoires liés aux nébuliseurs 3.4.4.1 Interface nébuliseur-patient L'interface entre l'appareil et le patient peut être de différents types: masque, embout buccal, embout nasal, embout narinaire, raccord trachéal, tuyau ouvert.

♦ Le masque bucco-nasal est destiné aux patients ayant des difficultés à n'inspirer que par la bouche ou que par le nez (nourrisson, personne âgée) et au traitement des laryngites chez l'enfant.

♦ L'embout buccal est préféré pour tous les traitements broncho-pulmonaires et de la laryngite de l'adulte, car il évite le dépôt d'aérosol dans les fosses nasales et favorise la pénétration trachéo-bronchique et pulmonaire.

♦ L'embout nasal est utilisé pour tous les traitements naso-sinusiens, car il optimise le dépôt d'aérosol dans les fosses nasales.

♦ L'embout narinaire se distingue de l'embout nasal par le fait qu'il s'applique sur les narines sans pénétrer dans le nez. Il réalise ainsi une étanchéité au niveau des narines.

3.4.4.2 Filtre expiratoire Lorsque le médicament nébulisé peut être toxique pour l'entourage du patient (cas de la pentamidine par exemple), on utilise un circuit double auquel on ajoute un filtre à très haut pouvoir de rétention sur le circuit expiratoire du nébuliseur (cf Figure 18). Le patient doit alors expirer dans le nébuliseur et l'aérosol non fixé dans l’organisme est piégé dans le filtre [34]. Selon les recommandations de la SUVA (site internet http://www.suva.ch), lors de nébulisation d’iséthionate de pentamidine, le nébuliseur doit être muni d’un filtre expiratoire, l’embout buccal anatomiquement bien conformé, avec un interrupteur de pause ou déclenchement automatique lors du retrait de l’embout buccal. Un exemple de ces filtres inspiratoires est le Respirgard® II de Marquest Medical (cf Figure 18).


Figure 18 Filtre Respirgard II

45

Chapitre 4

4 La nébulisation chez les patients sous ventilation mécanique

4.1 Les systèmes de ventilation La ventilation mécanique (VM) ou artificielle a pris une place de plus en plus importante dans le traitement des patients en défaillance respiratoire (hypoventilation alvéolaire, hypoxémie). Les ventilateurs sont raccordés aux voies aériennes au moyen d’un tube endotrachéal par le nez ou par la bouche ou, plus rarement, d’une canule de trachéotomie. En plus de leur rôle de branchement aux ventilateurs, ces tubes permettent l’aspiration des sécrétions à l’aide d’une sonde.

Il existe plusieurs types de ventilateurs:

♦ Les ventilateurs à volume constant (volumétriques): ils délivrent au patient un volume de gaz préréglé, avec l’avantage d’être constant en dépit des modifications des propriétés mécaniques des poumons, assurant une bonne ventilation des poumons.

♦ Les ventilateurs à pression constante (barométriques): Ils délivrent le gaz à une pression préréglée, avec un système de valve coupant l’apport de gaz lorsque la pression est atteinte. Le pic de pression ne pouvant dépasser la pression maximale réglée, ils diminuent les risques de barotraumatismes. Ces ventilateurs sont couramment utilisés en néonatologie.

Chapitre 4 La nébulisation chez les patients sous ventilation mécanique 46

Les ventilateurs modernes (Exemples: Galileo®) (cf Figure 19) peuvent combiner les deux modes de fonctionnement.

Figure 19 Le ventilateur Galileo®

♦ Les ventilateurs-caissons: une pression négative est appliquée à l’extérieur du thorax et du reste du corps (à l’exception de la tête). Ils étaient employés couramment autrefois lors de poliomyélite bulbaire et le sont encore occasionnellement dans le cas de maladies neuro-musculaires.

Dans la nébulisation de médicaments chez le patient ventilé mécaniquement, Il faut signaler quelques aspects contraignant supplémentaires par rapport à la nébulisation classique.

♦ le circuit de ventilation et le tube endotrachéal sont susceptibles d'influencer le dépôt pulmonaire du médicament. Mais inversement, sous réserve d'une bonne adaptation du patient à son ventilateur, la possibilité de contrôler chaque aspect de la ventilation (fréquence, volume courant, débit d'insufflation, rapport I/E) peut permettre d'optimiser les conditions de nébulisation. Cela suppose bien sûr que des données soit disponibles et permettent de définir précisément quelles sont ces conditions optimales;

♦ une faible fraction des études cliniques réalisées en matière de nébulisation concerne des patients sous VM. La plupart de ces études se sont intéressées à la nébulisation de bronchodilatateurs. Seule la nébulisation de β2-agonistes ou d'anticholinergiques en cas de bronchospasme montre une utilité «probable». En effet, chez les patients sous ventilation mécanique, les traitements par aérosol sont importants, permettant le soulagement des bronchospasmes avant que l’arrêt de la ventilation mécanique ne soit possible [35]. Différentes études [36] ont démontré l’efficacité de l’utilisation des bronchodilatateurs chez ces patients. En effet, la résistance aérienne, le peak pressure et l’auto-PEEP (persistance en fin d’expirium d’une pression alvéolaire supérieur à zéro) diminuent lors d’une thérapie efficace


avec ces substances. Les autres indications à la nébulisation en VM ne reposent que sur des opinions d'experts [37] (cf Tableau 3).

Tableau 3 Niveaux de preuve justifiant la nébulisation de médicaments chez les patients en ventilation mécanique -D'après O'Doherty, [37]

Indications Médicaments

Utilité probable

Bronchospasme/asthme β2-agonistes, anticholinergiques

Utilité possible

Infection à VRS de l'enfant

Dysplasie broncho-pulmonaire de l'enfant Cortisoniques

SDRA Surfactants

Infection broncho-pulmonaire Antibiotiques

HTAP Prostacycline

SDRA: syndrome de détresse respiratoire aiguë; VRS: virus respiratoire syncytial; HTAP: hypertension artérielle pulmonaire

♦ La nébulisation en VM est globalement peu utilisée et de pratique très hétérogène [15], résultat probable d’une connaissance imparfaite de ses modalités techniques et des limites des études cliniques.

Le dépôt pulmonaire des aérosols administrés durant une ventilation mécanique est inférieur à 5% (1-3%), alors qu’il est de 10% chez les patients respirant spontanément. Ceci est dû à la rétention de l’aérosol sur les parois des tubes du ventilateur, l’humidité du circuit, la respiration suboptimale, à la marque de nébuliseur et à la taille du tube endotrachéal, facteurs ne pouvant souvent être modifiés ou contrôlés. Afin d’optimiser la nébulisation, le volume nébulisé devrait être de 5.0 ml au moins et le flux de nébulisation entre 6 et 10 L/min [35]. De plus les nébuliseurs pneumatiques devraient être placés, selon les recommandations américaines [38], sur le tuyau inspiratoire du circuit de ventilation à une distance variant entre 10 et 30 cm du tube endotrachéal et être actionnés uniquement durant l’inspiration.

Tableau 4 Facteurs influençant le dépôt pulmonaire de médicaments lors de la nébulisation en ventilation mécanique -D'après Manthous, 1994 [39]; Dhand, 1996[40]

Facteurs liés au ventilateur

Mode de ventilation Volume courant


Fréquence respiratoire Rapport I/E Forme du débit inspiratoire Pression expiratoire positive Mode de déclenchement de l'insufflation Insufflation manuelle surajoutée Gaz alimentant le ventilateur (densité, viscosité)

Facteurs liés au système de nébulisation

Pour les nébuliseurs: - volume de remplissage - débit de gaz pour les nébuliseurs pneumatiques - amplitude de vibration pour les nébuliseurs ultrasoniques - caractéristiques intrinsèques, notamment granulométrie - masse de médicament délivrée Pour les aérosol-doseurs: - moment du déclenchement - type de chambre ou d'adaptateur - utilisation d'un cathéter intratrachéal - granulométrie de l'aérosol - masse de médicament délivrée

Facteurs liés au circuit

Position du système de nébulisation dans le circuit Humidification des gaz inspirés Diamètre et longueur du circuit Diamètre de la prothèse endotrachéale

Facteurs liés au patient

Degré du syndrome obstructif Eventuelles sécrétions trachéo-bronchiques Adaptation au ventilateur Existence de cycles de ventilation spontanée ou assistée Présence d'une hyperinflation dynamique

4.2 Le système de nébulisation Les aérosols peuvent être administrés chez les patients sous VM à l’aide de trois types de dispositifs: les aérosols-doseurs pressurisés, les nébuliseurs pneumatiques ou les nébuliseurs ultrasoniques. Un débit inspiratoire insuffisant et l’agrégation de la poudre dans les tuyaux de ventilation empêchent l’utilisation des inhalateurs de poudre.


4.2.1 Les aérosols-doseurs Ils doivent être actionnés pendant la phase inspiratoire et ré-actionnés toutes les 20-30 secondes, jusqu’à ce que la dose totale soit administrée [36]. Leur évaluation pendant la VM est encore incomplète et les produits disponibles se limitent aux bronchodilatateurs (β2-mimétiques et anticholinergiques) et aux cortisoniques, utilisés notamment en anesthésiologie [41]. L'utilisation d'une chambre d'inhalation placée sur le circuit inspiratoire du ventilateur augmente considérablement la masse de médicament délivrée [42], [43]. Il est également possible de connecter l'embout de l'aérosol-doseur à un fin cathéter glissé dans la prothèse endotrachéale, ce qui in vitro augmente considérablement la masse de médicament arrivant dans la trachée [44], [45]. Une étude chez un modèle animal a montré des lésions sévères de la muqueuse trachéale à l'extrémité du cathéter. Celles-ci étaient sans doute liées à la toxicité des Fréons [46], qui ne devraient plus se trouver dans les aérosols-doseurs. Il est possible que l'adjonction d'une chambre d'inhalation au circuit augmente également cette masse délivrée Des études ont démontré que l’utilisation des MDIs doit se faire avec une chambre d’inhalation qui augmente le dépôt pulmonaire de 4 à 6 fois [47], [36].

4.2.2 Les nébuliseurs Certains ventilateurs incluent, souvent en option, un système de nébulisation reposant habituellement sur un nébuliseur pneumatique (exemple: Draeger Babylog), plus rarement sur un nébuliseur ultrasonique (exemple: Siemens Servo 300A). Il est également possible d'intercaler sur le circuit inspiratoire un nébuliseur non spécifiquement dédié à la ventilation mécanique.

Selon les recommandations américaines [38], [48], les nébuliseurs pneumatiques doivent être placés sur le tuyau inspiratoire du circuit de ventilation à une distance de 10 à 30 cm du tube endotrachéal, une localisation plus rapprochée diminuant la masse de médicament délivrée; le circuit ne doit pas être humidifié [49], [47], [50] et être actionné uniquement durant l’inspiration, évitant ainsi la perte de médicament en phase expiratoire [15]. Car si le nébuliseur pneumatique fonctionne en continu, l'aérosol produit et propulsé en phase expiratoire est perdu pour le patient [15]. Les paramètres du ventilateur doivent, si nécessaire, être modifiés en fonction du flux additionnel provenant du nébuliseur.

Certains auteurs parlent plutôt en faveur des nébuliseurs ultrasoniques, car l'aérosol est initialement statique dans la cuve de nébulisation et sa mobilisation nécessite un débit gazeux, en pratique celui du ventilateur. L'aérosol n'est donc délivré qu'en phase inspiratoire sans nécessiter de système externe de synchronisation, même si le nébuliseur n'est pas spécifiquement dédié à la VM [51], [52]. Les nébuliseurs ultrasoniques offrent l'avantage de ne pas avoir à intégrer dans les réglages du ventilateur le débit de gaz nécessaire pour générer l'aérosol.

Quel que soit le type de nébuliseur, il convient de porter attention au volume de remplissage de la chambre de nébulisation, en règle générale de 2 à 6 ml, selon les


recommandations du constructeur, sachant qu'un volume plutôt élevé tend à augmenter la masse de médicament délivrée [47]., [52]. Dans le cas des nébuliseurs pneumatiques, un débit gazeux élevé (8 L/min versus 5 L/min) pour générer l'aérosol tend à augmenter la masse délivrée. La synchronisation sur l'insufflation produit le même effet, cependant au prix d'une augmentation de la durée de nébulisation [49].

Du fait de son faible diamètre comparativement à la trachée, la prothèse endotrachéale est responsable de turbulences et donc de phénomènes d'impaction. Il ne semble cependant pas y avoir de différence notable en terme de nébulisation entre des sondes de 7 et 9 mm de diamètre [49]. Chez l'enfant, par contre, les sondes d'un diamètre inférieur à 4 mm diminuent nettement la masse délivrée [46]. Bien que peu de données sur la nébulisation en VM chez des patients trachéotomisés ont été publiées, celle-ci ne semble pas poser de problème spécifique [53], [54]. Il est également possible de réaliser une nébulisation de bronchodilatateurs chez des patients en ventilation non invasive avec un masque facial [55]. Les données publiées restent cependant très fragmentaires.

Le Tableau 5 résume les recommandations portant sur le bon usage de la nébulisation en VM.

Tableau 5 Optimisation de l'utilisation des nébuliseurs en ventilation mécanique[40], [47], [36], [53]

Placer le nébuliseur en série sur la ligne inspiratoire et entre 10 et 30 cm du raccord en Y Ne pas utiliser d'humidificateur chauffant: ni pendant la nébulisation ni dans les minutes précédentes Ne pas utiliser d'échangeur de chaleur et d'humidité Placer un filtre de basse résistance sur la ligne expiratoire (pour éviter de noyer le capteur de débit) Utiliser le volume de remplissage de la cuve indiqué par le fabricant, en règle générale entre 2 et 6 ml (en l'absence de précision, choisir 5 ml) Si le débit de gaz du nébuliseur pneumatique est réglable, choisir 8 L/min Adapter la ventilation-minute pour compenser

Si possible, choisir un volume courant ≥ 500 ml (adulte) Ti/Ttot doit être > 0,3 Surveiller très attentivement l'état clinique, la saturation transcutanée en O2 et les paramètres de ventilation pendant la nébulisation En fin de nébulisation, revenir au circuit et aux réglages de ventilateur antérieurs

4.2.3 Nébuliseurs ou aérosol-doseurs ? Le choix ne se pose en pratique que pour l'administration de bronchodilatateurs, ou plus rarement de cortisoniques. Il est vraisemblable que le respect des règles énoncées ci-dessus est plus important que le choix du système de nébulisation per se [50]. L'efficacité


des deux systèmes semble globalement identique, sous réserve d'une utilisation adéquate, quand bien même la masse de médicament délivrée in vitro est plus élevée avec le nébuliseur [56]. Cela souligne au passage la nécessité d'une validation clinique des données expérimentales. Le coût et la charge de travail infirmier sont souvent considérés comme plus élevés avec les nébuliseurs, mais cela mériterait d'être évalué plus précisément. Il existe un risque de contamination bactérienne des nébuliseurs, source potentielle de pneumopathies nosocomiales [57].

Un des avantages des nébuliseurs est la possibilité de nébuliser une plus large gamme de médicaments, et même des médicaments développés pour une utilisation parentérale. Cependant, il s'agit là d'une utilisation hors AMM, sous l'entière responsabilité du praticien. Dans ces conditions, certaines règles de prudence s'imposent afin de limiter le risque d'intolérance locale. Il convient notamment de se renseigner sur l'osmolarité et le pH de la solution. Une solution hypo- ou hyperosmotique peut être responsable de bronchospasmes. Une solution acide peut également entraîner une réaction bronchique. La vancomycine, par exemple, ne peut être utilisée en nébulisation à cause de son pH acide. Certaines formes parentérales, notamment les solutions d'aminoglycosides, à l'exception de l'amikacine et de la tobramycine, contiennent des sulfites dont le risque bronchoconstricteur est bien documenté.

Les MDIs sont aussi utilisés pour délivrer des bronchodilatateurs ou des stéroïdes chez des patients sous ventilation mécanique. Différentes études ont montré que les nébuliseurs autant que les MDIs sont des systèmes efficaces lors de ventilation mécanique [36].

52

Chapitre 5

5 La nébulisation chez l'enfant

La nébulisation est largement utilisée en pédiatrie, mais elle garde encore actuellement un caractère empirique.

L'enfant présente des particularités anatomiques et physiologiques qui le distinguent de l'adulte.

Chez le nourrisson, les principales différences de structure des voies aériennes pouvant entraîner des conséquences dans certaines circonstances sont [58]:

♦ l’étroitesse relative des voies aériennes par rapport au tissu pulmonaire;

♦ la contribution beaucoup plus importante des petites voies aériennes (bronchioles) à la résistance totale des voies aériennes, 85% de la résistance totale chez le nourrisson, alors qu’elles ne contribuent que pour 20% chez l’adulte. Ceci explique les mauvaises valeurs respiratoires des nourrissons lors d’atteinte des petites voies aériennes (la bronchiolite par exemple);

♦ le fait que la trachée et les bronches sont plus facilement compressibles.

De plus, le réflexe de toux, très peu présent à la naissance, augmente graduellement avec l’âge. La toux est essentielle non seulement pour évacuer le mucus constamment produit dans l’arbre bronchique, mais aussi comme mécanisme protecteur des voies aériennes inférieures. Le nourrisson utilise comme mécanisme protecteur des ses voies aériennes l’apnée plutôt que la toux, ce qui l’expose plus fortement à

uellement avec l’âge. La toux est essentielle non seulement pour évacuer le mucus constamment produit dans l’arbre bronchique, mais aussi comme mécanisme protecteur des voies aériennes inférieures. Le nourrisson utilise comme mécanisme protecteur des ses voies aériennes l’apnée plutôt que la toux, ce qui l’expose plus fortement à

Chapitre 5 La nébulisation chez l'enfant 53

des complications graves dans l’hypothèsse de sécrétions abondantes ou de liquide dans la région laryngée.

5.1 Les caractéristiques anatomiques et physiologiques de l'appareil respiratoire de l'enfant La particularité principale du poumon du nouveau-né réside dans sa capacité à continuer à se développer après la naissance [59]. Le nombre d’alvéoles présentes dans le parenchyme pulmonaire continue d’augmenter par division jusqu’à l’âge de 18 à 24 mois environ. On en trouve 50 x 106 chez le nouveau-né à terme et 300 x 106 chez l’adulte. Ainsi, d’après de multiples données expérimentales chez l’animal et des études cliniques chez l’homme, il semble que des lésions du parenchyme pulmonaire ou une résection pulmonaire apparaissant à un stade précoce peuvent être en grande partie compensées par la croissance et la division des alvéoles. Par contre les bronches et les bronchioles ne se divisent plus après la naissance.

Une des différences majeures entre le nourrisson et l’adulte se manifeste dans les propriétés mécaniques et élastiques non seulement du poumon lui-même, mais aussi de la cage thoracique et de l’interaction entre les deux structures. La cage thoracique du nouveau-né est particulièrement susceptible de se déformer. Par contre son poumon est plus rigide que le poumon adulte. Chez le nourrisson, il y a une tendance prononcée au collapsus du poumon, car la force qui favorise la rétraction du poumon est plus grande que celle qui favorise la rétraction de la cage thoracique. Le stade auquel ces forces contraires s’équilibrent (capacité résiduelle fonctionnelle: CRF), soit à la fin de l’expiration normale, se situe chez l’adulte sain vers 20% de la capacité pulmonaire totale, alors qu’il est nettement plus bas chez le nourrisson (15% de la capacité pulmonaire totale). Pour compenser ce phénomène, les nourrissons utilisent une sorte de frein pendant l’expiration, une activité caractérisée par un début d’inspiration avant l’exhalation complète. En respirant rapidement les nourrissons maintiennent artificiellement une CRF plus élevée, qui se rapproche de celle de l’adulte. Le nouveau-né touché par une maladie pulmonaire (p.ex. pneumonie) ne peut plus maintenir une fréquence respiratoire accélérée pour conserver une CRF proche de celle de l’adulte sans se fatiguer rapidement.

5.1.1 Le cycle respiratoire de l'enfant La déposition pulmonaire dépend du cycle respiratoire. Une respiration à débit inspiratoire lent et à grand volume courant (Vt) augmente le dépôt pulmonaire périphérique. Au contraire, un débit inspiratoire élevé favorise l'impaction des particules au niveau des voies aériennes supérieures et des bronches proximales. Aucune coopération n'est possible chez le jeune enfant qui a souvent une respiration très irrégulière. Cette irrégularité des cycles respiratoires peut encore s'accentuer par les cris de l’enfant pendant les séances de nébulisation. Le cycle respiratoire physiologique du jeune enfant se compose d'un faible Vt et d'une fréquence rapide. Cela explique pourquoi celui-ci


inhale finalement une quantité importante d'aérosol rapporté à son poids. Un nourrisson inhale à chaque inspiration un aérosol «pur». Lorsque l'enfant grandit, son Vt augmente et dépasse le volume de l'aérosol généré par le nébuliseur. Il inhale à chaque inspiration un volume supplémentaire d'air. Au-delà d'un certain Vt, la même quantité d'aérosol va être inhalée par l'enfant et l'adulte. Mais la quantité d'aérosol inhalée, rapportée au poids du sujet, est ainsi la plus importante chez le nourrisson et diminue ensuite avec l'âge à partir de 6 mois environ [60]. Les tests de provocation bronchique ont permis de mettre en évidence ce phénomène [61]. Des nourrissons âgés de 1 mois avaient une réactivité bronchique à l'histamine beaucoup plus importante que des enfants âgés de 10 ans [62]. Mais lorsqu'on rapporte la réactivité bronchique à la quantité d'histamine effectivement inhalée, elle est la même dans les deux groupes. Il est donc important de tenir compte, dans l'analyse du seuil de réactivité bronchique, de la quantité de bronchoconstricteur inhalée rapportée à l'âge ou à la taille du sujet.

5.1.2 La respiration nasale et les voies aériennes supérieures Le jeune enfant a une respiration nasale au repos. Ce phénomène est encore amplifié chez le nouveau-né, qui ne sait pas respirer par la bouche. Lorsqu'un adulte respire par le nez, le dépôt pulmonaire d'un aérosol est diminué de 50 % [63]. Peu de données comparant la respiration nasale et buccale sont disponibles chez l'enfant. On peut penser qu'une respiration nasale entrave moins le dépôt pulmonaire d'un aérosol chez l'enfant que chez l'adulte, car ses voies aériennes supérieures sont proportionnellement plus larges. Par ailleurs, la pilosité nasale ne se développe pas avant l'adolescence. Pourtant, l'obstruction nasale liée à l'hypertrophie adénoïdienne et aux rhinites, fréquentes à cet âge, limite la déposition d'une substance nébulisée. Cela souligne l'importance de désobstruer les voies aériennes supérieures du nourrisson avant une séance de nébulisation. Il arrive qu'un grand enfant conserve une respiration nasale, lorsqu’il reçoit un aérosol par un embout buccal. Cela diminue également l'efficacité de la nébulisation. Lorsqu'un masque est utilisé chez le nouveau-né ou le nourrisson, celui-ci doit être appliqué de manière hermétique sur le visage de l'enfant. En effet, une diminution de 85 % du dépôt s'observe lorsque le masque facial est éloigné du visage de 2 cm [64].

5.1.3 Les voies aériennes inférieures Les voies aériennes inférieures sont proportionnellement plus étroites chez l'enfant que chez l'adulte. La résistance d'un conduit est inversement proportionnelle au rayon. Une réduction de calibre des voies aériennes due à une bronchoconstriction, une inflammation ou une hypersécrétion augmente donc considérablement les résistances des voies aériennes, ce qui favorise un dépôt central. Lors d’une administration médicamenteuse, le diamètre optimal des particules est ainsi plus petit chez l'enfant que chez l’adulte et plus encore en cas d’obstruction des voies aériennes.


5.1.4 La déposition pulmonaire d'un aérosol chez l'enfant Plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour calculer le dépôt d'un aérosol dans les voies aériennes de l'enfant. Ces modèles sont fondés sur les particularités physiologiques du cycle respiratoire et les caractéristiques anatomiques des voies aériennes de l'enfant. Thomas et coll., estimant les dimensions des voies aériennes supérieures à partir du diamètre trachéal, stipulent que la déposition d'un aérosol dans les fosses nasales augmente avec l'âge, passant de 0,2 % avec des particules ayant un diamètre inférieur à 2 μm chez le nourrisson de 1 mois à 37,8 % chez un enfant de 10 ans [65]. Avec un calcul différent, Xu et coll. estiment que 6 % des particules de 2 μm de diamètre ont une déposition buccale chez l'enfant âgé de 1 mois, alors que celle-ci est de 0 % chez l’enfant de 10 ans [66]. Mais ces calculs demandent à être confirmés in vivo.

En clinique, la déposition pulmonaire peut être estimée directement par le marquage radioactif d'une substance nébulisée, plus rarement par son dosage dans les sécrétions bronchiques, le lavage broncho-alvéolaire (LBA), ou indirectement par le dosage de la substance dans le sérum ou les urines, ce qui reflète l'absorption systémique. D'une manière générale, les quantités déposées effectivement au niveau des poumons sont très faibles, entre 1 et 10 % de la dose initiale présente dans le nébuliseur. Plusieurs études ont évalué le dépôt pulmonaire d'un aérosol chez des enfants atteints de mucoviscidose. Une solution de 120 mg de tobramycine radiomarquée a été nébulisée chez 27 enfants et jeunes adultes atteints de mucoviscidose [67]. La dose moyenne déposée au niveau du poumon représentait 6.7 % de la dose initiale présente dans la cuve de nébulisation. Les variations interindividuelles étaient cependant très importantes. Aucune corrélation entre l'âge et la déposition pulmonaire n'a pu être mise en évidence.

O'Doherty a évalué le dépôt pulmonaire d'une solution de pentamidine radiomarquée chez 8 enfants âgés de 8 à 13 ans [68]. Seulement 2.5 % de la dose initiale était retrouvée au niveau du poumon, ce qui correspond à la dose retrouvée chez l'adulte. La taille des particules semble surtout jouer un rôle important chez le nourrisson; une déposition deux fois plus importante a été observée avec un aérosol ayant des particules de 3.6 μm par rapport à un aérosol donnant des particules de 7.7 μm [69]. Au-delà de 4 ans, l'effet de l'âge diminue.

En pratique, la réalisation d'études de déposition pulmonaire chez l'enfant est difficile. Aucune coopération n'est en effet possible chez le jeune enfant. Pour des raisons éthiques, des études de dépôt chez l'enfant sain utilisant des produits radiomarqués ne sont pas possibles. Les études sont donc faites sur un faible nombre de patients ayant souvent une atteinte respiratoire plus ou moins sévère. Ces études chez l'enfant sont toutefois indispensables pour

♦ vérifier l'efficacité in vivo d'un nébuliseur;

♦ optimiser le dépôt d'une substance au lieu souhaité;


♦ déterminer la dose à administrer et l'intervalle entre deux doses.

5.2 Les pathologies respiratoires de l'enfant et leur traitement 5.2.1 L'asthme L’asthme est une maladie chronique des voies respiratoires caractérisée par une inflammation persistante des voies respiratoires, qui entraîne des difficultés à respirer, des quintes de toux et une respiration sifflante. La crise d'asthme est liée à un rétrécissement brutal du diamètre des bronches, c'est le bronchospasme, et d'une inflammation de la paroi des bronches. Cette maladie démarre la plupart du temps dans l’enfance. Elle est en augmentation pratiquement partout dans le monde. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS) il s’agit de la maladie chronique la plus répandue chez les enfants et sa prévalence et sa sévérité ne cessent de croître.

L’augmentation rapide des cas d’asthme dans le monde est un des plus grands mystères de la médecine moderne. Dans certaines régions du monde 20 à 36 % des enfants sont touchés, notamment en Amérique du Sud et en Australie. Mais partout, l’accroissement du nombre de jeunes asthmatiques est signalé. En trente ans, les progrès du traitement de l’asthme bronchial ont progressé au point de laisser espérer aux enfants correctement pris en charge, une vie tout à fait normale. Mais cela n’est pas le lot de tous puisque l’asthme cause le décès de 25 000 enfants chaque année.

L'asthme est une maladie complexe qui associe plusieurs types d'anomalies:

♦ un spasme du muscle lisse bronchique

♦ une inflammation, caractérisée par une infiltration cellulaire, où dominent les polynucléaires éosinophiles (l'asthme est considéré comme une bronchite chronique à éosinophiles) au côté desquels on trouve des polynucléaires neutrophiles, des lymphocytes et des monocytes.

♦ une hypersécrétion de mucus et une hypertrophie des glandes à mucus. Cette hypersécrétion participe à la formation des bouchons muqueux obstruant les bronches

On insiste aujourd'hui aussi sur l'importance des lésions de l'épithélium bronchique conduisant à une mise à nu de la membrane basale et des terminaisons nerveuses sensibles à l'irritation et à une facilitation de la pénétration des allergènes et des agents irritants nocifs.

Outre l'éosinophile et les cellules inflammatoires et immunocompétentes, le mastocyte joue un rôle essentiel dans la physiopathologie de l'asthme puisqu'il est la cible de la réaction antigène-anticorps, spécifique de l'asthme allergique, et qu'il libère les médiateurs


à l'origine de la crise initiale. L'asthme met donc en jeu toute une série de médiateurs dont les effets vont se succéder, s'associer ou s'inhiber. L'importance de ces phénomènes physiopathologiques de base évolue dans le temps et on peut en effet distinguer chronologiquement trois étapes:

♦ Une réaction initiale, qui survient immédiatement après l'inhalation de l'antigène, caractérisée surtout par une bronchoconstriction,

♦ Une phase dite tardive qui survient 6 à 12 heures après la réaction initiale et où la réaction cellulaire et inflammatoire est importante;

♦ Un passage à la chronicité lorsque les crises se succèdent ([70] (cf Figure 20): l'inflammation s'installe et on assiste à la mise en place d'une hyperréactivité bronchique, caractéristique de la maladie asthmatique. Cette phase est marquée par la détérioration des fonctions respiratoires en dehors des épisodes critiques; elle est dominée par l'inflammation chronique et l'installation d'un processus de fibrose bronchique. L'hyperréactivité bronchique est explorée par le test à la métacholine.

L’asthme se caractérise par les modifications pathologiques suivantes[70]:

♦ Bronchospasme

♦ Congestion vasculaire

♦ Oedème de la muqueuse

♦ Hypertrophie des glandes à mucus

♦ Hypersécrétion de mucus

♦ Desquamation épithéliale

♦ Epaississement de la membrane basale

♦ Infiltration de cellules inflammatoires


Figure 20 Succession d'événements aboutissant au passage à la chronicité de la maladie asthmatique

La sévérité de l’asthme d’un patient peut être évaluée selon les critères présentés dans le tableau suivant:

Tableau 6 Les différents paliers de l’asthme et leurs caractéristiques

Palier 1 Intermittent léger

2 Persistant léger

3 Persistant modéré

4 Persistant sévère

Symptômes ≤ 2 / semaine Asymptomatique entre les crises

> 2 / semaine < 1 / jour

Tous les jours Continus


Crises Brèves (de qq heures à qq jours)

Peuvent retentir sur le sommeil et l’activité

Retentissent sur le sommeil et l’activité Peuvent durer plusieurs jours Utilisation quot. d’un β2-agoniste

Fréquentes Retentissent sur le sommeil et l’activité

Symptômes nocturnes

≤ 2 / mois > 2 / mois > 1 / semaine Fréquents

DEP ou VEMS ≥ 80% prédits ≥ 80% prédits 60-80% prédits < 60% prédits

Variabilité du DEP

< 20% 20-30% > 30% > 30%

La présence d’un élément de sévérité suffit pour classer un patient dans une des catégories. L’évaluation de la sévérité d’un asthme conditionne la prise en charge médicamenteuse du patient.

L'asthme infantile est la maladie chronique la plus fréquente. Il touche 10% des enfants et 50% des asthmes débutent dans l'enfance avant l'âge de 5 ans. L'asthme touche deux fois plus de garçons que de filles [71]. Un second pic d’apparition de l’asthme se situe aux environs de 50 ans (asthme tardif, pas forcément allergique).

5.2.1.1 Les symptômes de l'asthme chez l'enfant: On parle d'asthme chez le nourrisson quand l'enfant fait une bronchiolite et trois épisodes successifs de bronchite sifflante [72]. La bronchiolite est une infection respiratoire aiguë qui prédomine sur les petites bronches ou bronchioles. Ce virus infecte généralement l'enfant de moins de 2 ans, et surtout de moins de 6 mois. Cette infection concerne environ 30% des enfants de cette tranche d'âge. Cependant, la maladie est très rarement mortelle, et la plupart des enfants guérissent totalement sans complications.

Chez le petit enfant, les tableaux cliniques peuvent être très variables:

♦ Une véritable crise d’asthme avec un sifflement audible à l'expiration de l'air, un ralentissement de la fréquence respiratoire avec une gêne à l'expiration de l'air.

♦ Une toux chronique diurne et nocturne qui réveille l'enfant.

Facteur déclenchant d’une crise d'asthme chez l'enfant:

♦ Les infections virales: surtout chez le nourrisson (bronchiolite à VRS, virus respiratoire syncytial).


♦ Les allergènes, nombreux, d'origine respiratoire, alimentaire ou médicamenteuse: acariens, pollens, poussières, polluants atmosphériques, poils d'animaux (chat et chien), champignons, arachides, lait, œufs, aspirine.

♦ Le froid et le rhume.

♦ Les efforts physiques, le sport et même le rire.

5.2.1.2 L'asthme aigu L’asthme aigu grave peut être défini comme une crise d’asthme aiguë persistant malgré l’administration de trois doses successives d’un β2-mimétique, habituellement donné en nébulisation.

L’événement essentiel dans la physiopathologie de la crise grave est l’obstruction bronchique liée au bronchospasme, à l’œdème et aux bouchons muqueux de l’hypersécrétion.

Les bronchodilatateurs sont le traitement de choix de l'asthme aigu. Leur administration par nébulisation a depuis longtemps fait la preuve de son efficacité. Dans la crise d'asthme, ils doivent être administrés avec de l'oxygène, à la fois pour maintenir un niveau d'oxygénation suffisant et éviter l'hypoxie. L'administration continue ou répétée à court terme des bronchodilatateurs est plus efficace [73], [74], [75]. Les effets secondaires de la nébulisation continue de bronchodilatateurs sont comparables à ceux de l'administration intermittente [76].

L'adjonction d'un anticholinergique à un bronchodilatateur lors d'une crise d'asthme sévère potentialise l'effet bronchodilatateur [77]. Par contre, aucun bénéfice n'est actuellement démontré dans la crise modérée [78].

Certains auteurs ont constaté une efficacité comparable des β2-mimétiques administrés en nébulisation et en spray avec une chambre d'inhalation. Toutefois, l'expérience clinique plaide en faveur de la nébulisation en première intention lors d'une crise sévère. Comme nous l'avons souligné, une administration continue d'un bronchodilatateur est très efficace et impossible à obtenir avec un spray et une chambre d'inhalation.

5.2.1.3 Le traitement de fond de l'asthme Selon le document de consensus international du NHLBI [79], le traitement au long cours est basé sur quatre paliers thérapeutiques en fonction de la sévérité de l’asthme. Il repose sur l’utilisation de bronchodilatateurs associés ou non aux corticoïdes. Ces derniers sont introduits précocement dès le deuxième palier.

Les médicaments sont classés en deux categories:


♦ Ceux pour le soulagement immédiat (« quick-relief medications »): il s’agit des β2-agonistes à courte durée d’action (salbutamol, terbutaline) et des anticholinergiques (ipratropium).

♦ Ceux pour le contrôle à long terme (« long-term control medications »: il s’agit de corticoïdes inhalés, d’anti-inflammatoires (cromoglycate, nédocromil), β2-agonistes de longue durée d’action (salméterol, formotérol) et antileucotriènes.

Le document de consensus distingue le traitement de fond de l’enfant de 5 ans et de l’adulte de celui de l’enfant de moins de 5 ans. Chez ce dernier, on notera l’utilisation en première intention du cromoglycate et du nédocromil comme anti-inflammatoire. Les β2-agonistes de longue durée d’action n’ayant pas été étudiés dans cette catégorie d’âge, ils ne figurent pas comme traitement de base, contrairement au consensus britannique où ils sont introduits au palier 3 [80].

L’évaluation du traitement doit être effectuée régulièrement (chaque 1-6 mois). Une diminution de la thérapie est effectuée progressivement, lorsque les symptômes de l’asthme sont bien contrôlés. La posologie des corticoïdes inhalés est réduite à la dose minimale efficace, l’innocuité de ces médicaments étant inconnue chez l’enfant de moins de 5 ans pour le traitement au long cours.

5.2.2 La bronchiolite virale Avec un pic entre le 4ème et 6ème mois de vie, la bronchiolite virale aiguë est la maladie infectieuse des voies respiratoires inférieures la plus fréquente durant la première année de vie. La grande majorité des bronchiolites aiguës sont dues au virus respiratoire syncitial (VRS), mais d'autres virus respiratoires peuvent également se présenter avec le même tableau clinique[81].

La bronchiolite aiguë est en principe la première manifestation d'une maladie pulmonaire obstructive du nourrisson, mais peut occasionnellement aussi être récidivante. Lors de récidives, on devrait toujours penser à un asthme bronchique du petit enfant, tout particulièrement en présence d'atopie ou d'une anamnèse familiale positive. Le diagnostic différentiel comprend la mucoviscidose, la broncho-aspiration, une malformation cardiaque, de rares anomalies congénitales de la trachée ou des bronches ainsi que le syndrome des cils immobiles.

Bien que la majorité des nourrissons soient traités ambulatoirement, la bronchiolite aiguë est toujours l’une des causes d'hospitalisation les plus fréquentes pendant les mois d'hiver.

Le diagnostic de la bronchiolite aiguë est clinique: après un premier stade caractérisé d’une rhinorrhée et d’une toux sèche, irritative, la bronchiolite aiguë se présente avec un tableau clinique caractéristique de râles crépitants, sibilances, hyperinflation, tachypnée et tirage ainsi que, selon sa gravité, des difficultés alimentaires et une cyanose. Chez de petits nourrissons, la survenue d’apnées peut en être le premier signe.


Le diagnostic du VRS est rapide et se fait dans les sécrétions nasopharyngées. Lorsque la clinique n'est pas claire et la recherche de VRS négative, il faut envisager la recherche d'autres virus (parainfluenza, influenza, rhinovirus, adénovirus et métapneumovirus humain) dans les sécrétions nasopharyngées pour assurer le diagnostic.

La décision d’hospitaliser ou non un nourrisson dépend de la gravité de la bronchiolite. Plusieurs facteurs jouent un rôle: une détresse respiratoire débutante, une saturation en oxygène insuffisante, une incapacité de boire, l'apparition de signes de déshydratation ainsi que les conditions sociales. Les nourrissons avec une bronchiolite de gravité moyenne ou sévère devraient être soignés en milieu hospitalier; l'observation d'une apnée est également une indication à l'hospitalisation. L’indication à une hospitalisation est renforcée chez les nourrissons avec des maladies sous-jacentes comme une mucoviscidose, une dysplasie broncho-pulmonaire, une malformation cardiaque congénitale. La ventilation mécanique est instaurée chez moins de 2% des nourrissons hospitalisés.

L’utilisation de bronchodilatateurs est controversée [82], [83], [84]. Ce traitement est largement utilisé en Amérique du Nord, alors qu’il est remis en question en Grande-Bretagne et en Australie. Bien que l'inflammation des muqueuses soit un élément important de la bronchiolite aiguë, l'utilisation des corticoïdes ne s'est pas avérée efficace. Les études faites jusqu'ici n'ont pas pu prouver un effet des stéroïdes inhalés ou systémiques [82]. L’utilisation de la ribavirine est également sujette à controverse, cet antiviral étant réservé aux formes graves chez les enfants à risque (maladie cardio-pulmonaire ou immuno-déficience) [85]. L’immunisation passive au moyen d’immunoglobulines anti-VRS est recommandée aux USA chez les enfants de moins de 2 ans atteints de maladie pulmonaire chronique [86]. L'administration thérapeutique du paliviziumab, une immunoglobuline anti-VRS, n'influence pas le décours de la bronchiolite aiguë.

5.2.3 La mucoviscidose La mucoviscidose, ou fibrose kystique selon la terminologie anglo-saxonne, est la maladie génétique récessive, autosomale, léthale, la plus répandue dans les populations européennes et nord-américaines. La mucoviscidose est caractérisée par un dysfonctionnement généralisé des glandes exocrines, ce qui provoque un épaississement des sécrétions muqueuses et une exceptionnelle richesse de la sueur en chlore et en sodium. Cette affection est liée à des mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator), situé sur le chromosome 7, qui code pour la synthèse d'une protéine appelée Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.

Environ une personne sur 50 est porteuse du gène muté et un enfant sur 2500 naît atteint de cette maladie. Les progrès médicaux réalisés dans le traitement de cette pathologie ont fait évoluer l'espérance de vie des patients atteints de mucoviscidose, suivant les pays, de la petite enfance à 35-45 ans, avec une importante réduction de la mortalité infantile.


Cependant, on ne dispose pas à l'heure actuelle de traitements efficaces pour ralentir la destruction des tissus pulmonaires et pancréatiques.

L'atteinte respiratoire est responsable de plus de 90% des décès. Les traitements consistent en l’administration de rhDNase et d’antibiotiques.

5.2.3.1 La rhDNase La rhDNase est une DNase recombinante humaine qui clive le DNA extracellulaire pro-venant des cellules inflammatoires, et des polynucléaires neutrophiles en particulier. Ce DNA extracellulaire est en effet le déterminant majeur de l'hyperviscosité des sécrétions bronchiques dans la mucoviscidose. La nébulisation quotidienne de 2,5 mg de rhDNase chez des patients âgés de plus de 5 ans et ayant une atteinte respiratoire modérée (capacité vitale > 40 % de la valeur attendue) améliore modestement la fonction pulmo-naire (avec une amélioration moyenne du VEMS de 6 %) et diminue le risque relatif d'un traitement antibiotique intraveineux pour une surinfection bronchique chez un tiers des patients [6]. La prescription de la rhDNase obéit à des règles strictes: elle doit être protégée de la lumière et de la chaleur (utilisation de nébuliseurs pneumatiques et non ultrasoniques); elle doit être utilisée seule, car la protéine peut être altérée si elle est mélangée à d'autres molécules; son administration doit être suivie d’une kinésithérapie respiratoire.

A l'heure actuelle, en conclusion des nombreuses études réalisées avec ce produit, on peut dire que la rhDNase a un effet significatif chez un tiers des patients, nul chez un tiers et elle est associée à une dégradation de l'état clinique et/ou fonctionnel chez le tiers restant.

5.2.3.2 Les antibiotiques Bien que les antibiotiques soient largement prescrits dans la mucoviscidose, seuls deux, la tobramycine et la colistine, ont actuellement l'autorisation de mise sur le marché (AMM) pour la nébulisation. Pseudomonas aeruginosa (PA) est un germe spécifique de cette maladie. Il apparaît généralement au cours de l'adolescence et constitue un tournant évolutif dans l'atteinte respiratoire. Après une première infection, ce germe va réapparaître de manière inéluctable, après un délai variable, pour ensuite persister de manière permanente au niveau des voies aériennes. La colonisation est définie par la présence de PA sur au moins trois examens cytobactériologiques de crachats (ECBC) sur une période de 6 mois et/ou par la présence de précipitines antipyocyaniques positives.

Les aérosols d'antibiotiques ont pour but de diminuer la charge bactérienne locale au décours ou entre les cures intraveineuses, pour éviter ou retarder la réapparition du PA, mais aucun bénéfice n'est actuellement démontré en ce qui concerne leur emploi au moment d'une cure intraveineuse. L'avantage de la voie nébulisée est qu'elle permet l'utilisation de molécules inactives par d'autres voies, comme la colistine, et qu'elle permet d'obtenir des concentrations locales élevées et systémiques faibles. Sur le plan pratique, la nébulisation est moins contraignante que la voie intraveineuse et peut être faite au long cours. Les antibiotiques utilisés pour la nébulisation sont les aminosides (tobramycine, amikacine, gentamicine), la colistine et certaines bêtalactamines (ceftazidime, carbénicilline). En pratique, la colistine et la tobramycine sont les molécules les plus


utilisées. La colistine peut diminuer et retarder la colonisation par PA après une première infection à ce germe [87]. Une étude contrôlée et prospective a montré que l'association de la ciprofloxacine et de la colistine nébulisée pouvait prévenir ou retarder la réapparition du PA sur une période de 18 mois [88].

Les effets secondaires des antibiotiques nébulisés sont l'induction d'un bronchospasme et l'apparition de mutants résistants. Il est conseillé de réaliser une spirométrie avant et après la première nébulisation, afin de rechercher une bronchoconstriction induite par l'antibiotique, liée le plus souvent à une hyperosmolarité excessive de la solution nébulisée. Le risque environnemental pour le personnel médical et la famille du patient a été soulevé. L'emploi d'un filtre expiratoire est conseillé.

5.2.4 L'infection à Pneumocystis carinii (PC) Les nébulisations de pentamidine sont indiquées dans la prévention de l'infection à PC. La pentamidine est indiquée en première intention en cas de contre-indication au cotrimoxazole (hypersensibilité, résistance thérapeutique). Elle est utilisée en prophylaxie secondaire après une première infection à PC. En pratique, elle est peu employée dans le traitement de l'infection à PC, car le cotrimoxazole, l'association clindamycine et primaquine, ou l'atovaquone sont beaucoup plus efficaces. La pentamidine doit être déposée au niveau des alvéoles. Elle doit être administrée avec un nébuliseur produisant des particules de petite taille. Les effets secondaires de la pentamidine sont liés au dépôt dans les voies aériennes supérieures et se résument à une hypersialorrhée, un goût métallique dans la bouche, des nausées, une toux, une dyspnée et un bronchospasme.

L'emploi d'un filtre expiratoire est nécessaire pour éviter les effets secondaires pour l'entourage (cf 3.4.4.2), et les séances doivent se faire dans une pièce isolée, séparée des autres patients immunodéprimés pour éviter la transmission d'infections opportunistes comme la tuberculose.

5.2.5 Le bronchospasme postopératoire La phase de réveil anesthésique est marquée par la disparition progressive des effets résiduels de l'anesthésie, alors qu'apparaissent les conséquences de l'acte chirurgical. Les particularités physiologiques et la dépendance environnementale de l'enfant ou du nourrisson, rendent cette période à haut risque d'incidents ou d'accidents. La plupart des études portant sur la morbidité péri-opératoire montrent que c'est au cours de la période de réveil que surviennent la majorité des accidents d'anesthésie [89], [90]. En effet la plupart des anesthésiques généraux possèdent des propriétés bronchodilatatrices et l’incidence du bronchospasme au cours de l’opération est faible. Les complications lors du réveil chez l'enfant sont essentiellement respiratoires [91], [91]. Le bronchospasme apparaît surtout chez les enfants ayant une pathologie bronchique préexistante ou lors d'un stimulus, alors que l'anesthésie s'allège. L'irritation mécanique des voies aériennes ou la présence de sécrétions dans l'arbre bronchique sont des facteurs favorisants. Le traitement de choix consiste à administrer par nébulisation des β2-mimétiques.


Les nébulisations sont largement employées en pédiatrie et constituent une voie d'administration indispensable pour certains médicaments. L'évolution des thérapeutiques avec l'apparition de nouvelles molécules disponibles pour cette voie est également observée en pédiatrie. Toutefois, l'optimisation de la nébulisation chez l'enfant passe par des études analysant le dépôt pulmonaire des aérosols et évaluant l'efficacité clinique de ces traitements.

5.3 Médicaments nébulisés Seules vingt-deux substances actives ont une autorisation de mise sur le marché (AMM) en Suisse pour la nébulisation en pneumologie [92] (cf Tableau 7). Lors de l’administration, il importe également de ne pas mélanger ces produits sans s'être assuré de leur compatibilité. La rhDNase, par exemple, doit être employée seule, alors que le budésonide peut être mélangé aux différents bronchodilatateurs.

Tableau 7 Liste des médicaments ayant l'autorisation de mise sur le marché (AMM) en Suisse pour la nébulisation en pneumologie

Classe pharmacologique DCI Spécialité

Bronchodilatateurs Anticholinergiques Ipratropium Atrovent®, Berodual®, Dospir® Tiotropium Spiriva® β2-sympathomimétiques

Salbutamol Buventol®, Ecovent®, Ventolin®, Ventodisk®, Dospir®

Fénoterol Berotec®, Berodual® Terbutaline Bricanyl® Formoterol Foradil®, Oxis®, Symbicort® Salmeterol Serevent®, Seretide® Réproterol Aarane® Antiallergiques

Cromoglicate de sodium

Cromosol® UD, Glicinal®, Lomudal®, Aarane®

Nédocromil disodique Tilade®

Corticoïdes Fluticasone Axotide®, Seretide®

Béclométhasone Becloforte®, Beclomet Easyhaler, Becodisk®, Becotide

Budénoside Mifloride®, Pulicort, Symbicort®, Mucolytiques


Acéthylcystéine Ecomucyl®, Fluimucil®, Solmucol® Ambroxol Mucabrox® Bromhexine Bisolvon® Mesna Mistabron® rhDNase Pulmozyme® Anti-viral Zanemivir Relenza® Anti-parasitaire Pentamidine Pentacarinat® Anti-infectieux

Colistiméthate de sodium Colistin®

Tobramycine Tobi®

5.3.1 AMM pour la nébulisation pédiatrique Le nombre de médicaments se restreint encore lorsque l’on prend en considération dans cette même catégorie ceux ayant une autorisation de mise sur le marché pédiatrique (cf tableau 7).

Tableau 8 Liste des médicaments ayant l'autorisation de mise sur le marché (AMM) pédiatrique en Suisse pour la nébulisation en pneumologie

Classe pharmacologique et DCI Médicaments avec AMM Limitation d’âge

Bronchodilatateurs Anticholinergiques

Ipratropium Atrovent®, Berodual®, Dospir®

> 6 ans > 12 ans

Tiotropium Spiriva® Pas d’AMM pédiatrique

β2-sympathomimétiques

Salbutamol Buventol®, Ventolin®, Ecovent®, Ventodisk®,

> 6 ans > 18 mois > 3 ans

Fénoterol Berotec®, Berodual®

> 1 mois > 6 ans

Terbutaline Bricanyl® > 3 ans Formoterol Foradil®, Oxis®, Symbicort® > 6 ans

Salmeterol Serevent®, Seretide®

> 18 mois > 4 ans

Réproterol Aarane® > 2 ans


Antiallergiques

Cromoglicate de sodium Cromosol® UD, Glicinal®, Lomudal®, Aarane® > 2 ans

Nédocromil disodique Tilade® > 2 ans Corticoïdes Fluticasone Axotide®, Seretide® > 4 ans

Béclométhasone Becloforte®, Beclomet Easyhaler, Becodisk®, Becotide

> 12 ans > 3 ans > 4 ans

Budénoside Mifloride®, Pulmicort®, Symbicort®,

> 12 ans nourrissons > 6 ans

Mucolytiques

Acéthycystéine Ecomucyl®, Solmucol®, Fluimucil®

> 1 an nourrissons

Ambroxol Mucabrox® > 5 ans Bromhexine Bisolvon® > 2 ans

Mesna Mistabon® Pas d’AMM pédiatrique

rhDNase Pulmozyme® > 5 ans Anti-viral Zanemivir Relenza® > 5 ans Anti-parasitaire

Pentamidine Pentacarinat® Pas d’AMM pédiatrique

Anti-infectieux Colistiméthate de sodium Colistin® > 12 ans Tobramycine Tobi® > 6 ans

Les limitations d’âge signalées dans le Tableau 8 correspondent aux solutions pour inhalation et non aux aérosols-doseurs pressurisés ou aux inhalateurs de poudre sèche. Pour ces derniers, elle est encore plus élevée. Ce tableau montre bien que même pour une indication courante en pédiatrie, l’asthme, les AMM concernent peu les nourrissons et les petits enfants.

En pédiatrie, en milieu hospitalier comme en ambulatoire, les médicaments se prescrivent couramment hors AMM, ou ont une AMM dans une autre indication, une autre posologie, une autre forme galénique ou un autre âge. Ceci résulte d'un défaut d'évaluation des médicaments chez l'enfant avant leur commercialisation. Cette situation prive l’enfant d’éventuelles avancées thérapeutiques ou l'expose à des risques accrus et notamment aux erreurs d'administration.


L’absence de posologie pédiatrique oblige le prescripteur à « choisir » la posologie admise par la communauté scientifique pédiatrique et implique une surveillance particulière de la tolérance. En l'absence de dose validée par l’AMM, la dose initialement choisie est le plus souvent extrapolée à partir de la dose adulte (rapportée au poids ou à la surface corporelle), modulée par le niveau de maturation théorique, hépatique et rénal prévisible sur l’âge et les pathologies associées.

La prescription hors AMM est importante en pédiatrie. Elle concerne 90% des patients à l’hôpital et 39% des médicaments prescrits selon une étude-pilote réalisée au CHUV dans les six unités du Département médico-chirurgical de Pédiatrie (Néonatologie, Soins Intensifs, Soins Continus, Médecine et Chirurgie pédiatrique) entre 2001 et 2002 [93]. Ces résultats montrent que l’enfant est bien « l’orphelin » de l’industrie pharmaceutique pour des raisons essentiellement économiques. Depuis 2002, l’Institut Suisse des Produits Thérapeutiques ou (Swissmedic), qui enregistre les médicaments et délivre les autorisations de mise sur le marché en Suisse, a annoncé son intention d’accorder une prolongation de la durée de la protection du brevet de cinq ans pour les nouveaux développements destinés aux enfants et de revoir l’information du Compendium Suisse des Médicaments [94].

5.3.2 Les médicaments nébulisés lors de VM Chez les patients ventilés peu de médicaments ont été évalués. Les plus étudiés sont les bronchodilatateurs, utilisés chez des patients ayant un syndrome obstructif ou un SDRA (Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë). Paradoxalement, on ne dispose pas d'étude concernant des patients ventilés pour asthme grave. Ces études concordent pour montrer une diminution de la résistance des voies aériennes sous l'effet des bronchodilatateurs inhalés. Il ne s'agit que d'études à court terme, et aucune n'a eu comme critère de jugement une diminution du risque barotraumatique, une facilitation du sevrage ou une réduction de la durée de VM. Une relation dose-réponse a pu être établie pour le salbutamol administré avec un nébuliseur, avec un effet plateau obtenu pour une masse placée dans la cuve de nébulisation de 7.5 mg [95], une posologie plus élevée entraînant des effets systémiques (nausées, tremblements, arythmies) sans bénéfice supplémentaire. Une relation dose-réponse a également pu être établie avec un aérosol-doseur de salbutamol, montrant un effet en plateau pour 4 bouffées, soit 360 pg, l'effet sur les résistances persistant au bout de 1 heure [96]. La différence entre les deux valeurs n'est qu'apparente: en effet, avec les aérosols-doseurs, un pourcentage plus important du médicament administré arrive réellement à son site d'action [56]. Une étude à court terme chez des patients ventilés pour SDRA a montré qu'une nébulisation de salbutamol permettait d'obtenir une diminution de la résistance mais aussi des pressions des voies aériennes [97]. L'effet des anticholinergiques a été beaucoup moins étudié que celui des 12-mimétiques.

Bien que la nébulisation d'antibiotiques semble pratiquée assez régulièrement en réanimation [15], très peu de travaux cliniques lui ont été consacrés. La place de la nébulisation d'antibiotiques dans le traitement curatif des pneumopathies est restreinte,


entre autre par le fait nécessaire fait appel à des molécules diffusant bien dans le parenchyme pulmonaire et présentant un index thérapeutique large (β-lactamines) ou une toxicité maîtrisable (aminoglycosides en cure courte avec surveillance des concentrations plasmatiques). La place de la nébulisation de colimycine mériterait sans doute d'être évaluée pour le traitement de certaines pneumopathies à sérotypes multirésistants. Un essai randomisé en double insu, ayant inclus 41 patients, a conclu à l'absence de bénéfice de la nébulisation de ribavirine chez des enfants ventilés pour une bronchiolite due au virus respiratoire syncytial [98], pratique courante dans les unités de réanimation pédiatrique [15].

Les bronchodilatateurs ont été évalués au bloc opératoire chez des patients ventilés ayant un bronchospasme peranesthésique et chez des patients en réanimation ayant un syndrome obstructif chronique ou un SDRA. Paradoxalement, on ne dispose pas d'étude concernant des patients ventilés pour asthme grave. Toutes les études concordent pour montrer une diminution de la résistance des voies aériennes sous l'effet des bronchodilatateurs inhalés. Il ne s'agit que d'études à court terme, et aucune n'a eu comme critère de jugement une diminution du risque barotraumatique, une facilitation du sevrage ou une réduction de la durée de VM. Une relation dose-réponse a pu être établie pour le salbutamol administré avec un nébuliseur, avec un effet plateau obtenu pour une dose de 7,5 mg placée dans la cuve de nébulisation [95], une posologie plus élevée entraînant des effets systémiques, (nausées, tremblements, arythmies) sans bénéfice supplémentaire. Une relation dose/réponse a également pu être établie avec un aérosol-doseur de salbutamol, montrant un effet en plateau pour 4 bouffées, soit 360 pg, l'effet sur les résistances persistant au bout de 1 heure [96]. La différence entre les deux valeurs n'est qu'apparente: en effet, avec les aérosol-doseurs, un pourcentage plus important du médicament administré arrive réellement à son site d'action [56]. Une étude à court terme chez des patients ventilés pour SDRA a montré qu'une nébulisation de salbutamol permettait d'obtenir une diminution de la résistance mais aussi des pressions des voies aériennes [97]. L'effet des anticholinergiques a été beaucoup moins étudié que celui des β2-mimétiques.

L’administration de prostacycline par aérosol chez des patients ventilés pour SDRA a montré un effet bénéfique sur l'oxygénation artérielle

L'administration de corticoïdes, possible par aérosols-doseurs ou nébuliseurs, a été proposée dans la dysplasie broncho-pulmonaire de l'enfant, mais son intérêt et son innocuité restent mal évalués. L'effet du furosémide nébulisé sur la mécanique ventilatoire d'enfants atteints de dysplasie est diversement apprécié.

L'administration de rhDNase a été ponctuellement utilisée chez une patiente ayant une atélectasie persistante sous VM [99].

70

Chapitre 6

6 Une substance sous la loupe: le salbutamol

6.1 Synthèse du salbutamol Le salbutamol (cf Figure 21) a été développé à partir d’un transmetteur naturel, la noradrénaline.

Figure 21 Molécule chimique de la noradrénaline

Les substances adrénergiques sont utilisées dans le traitement de l’asthme depuis le début du siècle. La noradrénaline stimulant les récepteurs α et β, une molécule se liant plus spécifiquement aux récepteurs β est recherchée afin de diminuer les effets indésirables. En 1941, le remplacement d’un hydrogène sur l’amine par un groupe isopropyl, permet la création du premier β2–agoniste synthétique, l’isoprénaline (cf Figure 22).

Figure 22 Molécule chimique de l’isoprénaline

Chapitre 6 Une substance sous la loupe: le salbutamol 71

Toutefois l’isoprénaline est inactivée trop rapidement par l’enzyme Catéchol-O-méthyltransférase pour être utilisée efficacement dans le traitement de l’asthme. De plus, dans les années 50, la reconnaissance de récepteurs β1 et β2 conduit au développement d’agonistes β2-sélectifs, tels que la terbutaline (classe des résorcinols) et le salbutamol (classe des saligénines). Le salbutamol (cf Figure 23) a été développé dans les années 60, en remplaçant le groupement isopropyl par un groupement t-butyl et l’alcool du noyau aromatique par un méthanol [100]. Le salbutamol est un agoniste β2-sélectif et est de plus métaboliquement stable.

Figure 23 Molécule chimique du salbutamol

Le salbutamol possède un carbone asymétrique et a été commercialisé jusqu’à ces dernières années sous forme de mélange racémique (-)R et (+)S (cf Figure 24). Comme pour la majorité des β-sympathomimétiques, l’activité thérapeutique est due principalement à l’énantiomère (-)R, l’énantiomère (+)S provoquant une hyperactivité bronchique. La FDA a accepté la commercialisation de cet isomère, le levoalbuterol HCL (XopenexUSA et SepracorUSA, solutions pour nébulisation). Les premières revues publiées montrent que l’énantiomère a une activité tout aussi efficace que le mélange racémique, mais les effets indésirables, notamment cardiaques, semblent tout autant importants et son prix est nettement plus élevé[101], [102].

(-)R-salbutamol (+)S-Salbutamol

Figure 24 Molécules chimiques du (-)R-salbutamol et du (+)-Salbutamol

6.2 Pharmacologie du salbutamol Le salbutamol appartient à la classe des agonistes β2-adrénergiques. L’essentiel de l’action des β2-stimulants repose sur la relaxation du muscle lisse bronchique, des grosses bronches aux bronchioles (la sous-classe des récepteurs β2 est la plus représentée dans le muscle lisse bronchique). Lorsque le médicament arrive dans les voies aériennes pulmonaires l’effet s’installe très rapidement (80% de l’effet après moins de 5 minutes avec les β2 à action rapide et de courte durée d’action). L’effet est intense dans la mesure


où les β2-stimulants peuvent relâcher le muscle lisse bronchique préalablement contracté. De plus il s’agit d’un antagonisme fonctionnel capable d’induire une relaxation des muscles lisses bronchiques, quel que soit le médiateur ayant provoqué la contraction.

Les autres propriétés des β2-stimulants sont présentées dans le Tableau 9. Leur rôle respectif dans l’effet thérapeutique n’est pas démontré à ce jour. En aucun cas, ils ne peuvent être considérés comme des anti-inflammatoires.

Tableau 9 Principaux effets bronchopulmonaires des β2-stimulants

Type cellulaire Effets

Bronches/parenchyme

muscle lisse Relaxation +++ innervation cholinergique Inhibition de la libération d’acétylcholine innervation NANCe Inhibition de la libération des neuropeptides cellules épithéliales Augmentation du battement ciliaire glandes à mucus Augmentation de la sécrétion de mucus cellules de Clara Augmentation de la sécrétion de lipides pneumocytes de type II Augmentation de la sécrétion de surfactant vaisseaux Vasodilatation, inhibition de l’extravasation des

protéines plasmatiques

Cellules de l’inflammation

mastocytes Inhibition de la dégranulation et de la libération des médiateurs néoformés

éosinophiles Inhibition du recrutement et de l’activation (explosion oxydative, libération des médiateurs néoformés)

Le Tableau 10 montre que les β2-stimulants sont regroupés en fonction de leur latence et durée d’action. Les agonistes β2 à longue latence et longue durée d’action ne sont pas un traitement de la crise d’asthme, leur action bronchodilatatrice étant plus longue à s’établir que celle d’un β2 stimulant d’action rapide.

Tableau 10 Délai et durée d’action des principaux bêta-2-agonistes à des doses équiactives

Doses délivrées par une bouffée d’aérosol

[μg]

Délai d’action

[min]

Durée de la bronchodilatation

[heure]

Salbutamol 100 0.8 3-5 Terbutaline 250 1.1 3-6 Fénotérol 100 1.1 3-6


Salmétérol 25-50 17 12 Formotérol 6-12 17 12

6.2.1 Mécanisme d’action La liaison du salbutamol aux récepteurs β2, suivie de leur stimulation, provoque la stimulation d’AMP cyclique. L’augmentation d’AMPc va induire l’activation de protéines kinases qui vont déclencher une cascade de réactions de phosphorylation de protéines régulatrices du tonus musculaire lisse. Les principaux événements biochimiques sous-jacents à la stimulation du récepteur β2-adrénergique sont résumés dans la Figure 25. Les β2-agonistes à longue latence et longue durée d’action se dissolvent dans les lipides de la membrane cellulaire d’où ils migrent pour agir sur le récepteur β2-adrénergique où ils se fixent au niveau d’un site d’ancrage et exercent une bronchodilatation prolongée.

Figure 25 Principaux événements biochimiques sous-jacents du récepteur β2-adrénergique AC: adényl cyclase; DAG: diacylglycérol; IP3 inositol triphosphate; IP4: inositol tétraphosphate; PKA et PKG: protéines kinases A et G; PLC: Phopholipase C; KCLM; Kinase des chaînes légères de la myosine; PCLM: phophatase des chaînes légères de la myosine.

Les autres propriétés des β2-stimulants liées à la stimulation des récepteurs β1 et/ou β2 extra-pulmonaires sont:

♦ Effets cardiovasculaires: tachycardie sinusale, hypotension par vasodilatation

♦ Transfert intracellulaire de potassium facilitant les contractions (présence de récepteurs β2 au niveau des muscles striés).

♦ Baisse de la motilité intestinale

♦ Augmentation de la sécrétion de rénine


♦ Relaxation de l’utérus gravide

♦ Effets métaboliques observés à doses élevées: hypokaliémie, hyperglycémie ...

6.2.2 Pharmacocinétique du salbutamol Les caractéristiques pharmacocinétiques du salbutamol déterminées chez l’adulte sont les suivantes:

6.2.2.1 Absorption Le salbutamol est bien absorbé par le tractus gastro-intestinal et suite à l’administration de 4 mg po, un pic plasmatique apparaît après 1-4 h (Cmax = 10-17 μg/L). La biodisponibilité est d’environ 50%. Lors d’administrations répétées de 4 x 4 mg/j, le plateau est atteint au troisième jour. Après administration pulmonaire, le pic plasmatique apparaît dans les 10 à 40 mn.

6.2.2.2 Distribution Le modèle pharmacocinétique qui convient le mieux au salbutamol est un modèle bi-compartimental avec cinétique d’absorption de premier ordre. Le volume de distribution est de 1,6 à 3,5 L/kg (bonne distribution tissulaire) et la liaison aux protéines est relativement faible (< 20%). Le rapport [sanguine] / [plasmatique] est d’environ 1.

6.2.2.3 Métabolisme Le salbutamol est métabolisé essentiellement par conjugaison au niveau hépatique (réaction de phase II), le métabolite principal étant le dérivé 4’-O-sulfate (inactif). La réaction est énantiosélective, l’énantiomère (-)R ayant plus d’affinité pour l’enzyme sulfotransférase. Cette enzyme se trouve également au niveau de la muqueuse intestinale et du tissu pulmonaire. Après administration par voie orale ou pulmonaire, les taux de métabolite sulfaté sont plus importants qu’après administration intraveineuse, ce qui suppose un métabolisme pré-systémique et expliquerait la biodisponibilité orale moyenne du salbutamol.

6.2.2.4 Elimination La demi-vie d’élimination (t1/2) est de 2,4 à 5,4 h. L'excrétion urinaire du salbutamol et de son métabolite principal est rapide (70% éliminés après 24 h.) et varie selon le mode d'administration: 64 ± 7% de salbutamol et 12 ± 3% de dérivé sulfaté sont excrétés après administration iv, versus 32 ± 2% et 48 ± 7%, respectivement après administration orale. La clairance rénale du salbutamol après administration orale est de 272 ± 38 ml/min. et celle de son métabolite sulfaté de 98 ± 24 ml/min. Etant donné le métabolisme énantiosélectif, la quantité de (+)S-salbutamol libre retrouvé dans les urines est plus grande que celle du dérivé (-)R.

Très peu d’études pharmacocinétiques (ou mesure des taux plasmatiques du salbutamol) ont été réalisées chez des patients pédiatriques. Une étude a été faite après administration rectale et pulmonaire chez 10 enfants de 5 à 14 ans [103]; une autre après nébulisation


chez 10 adolescents atteints de mucoviscidose [104]; une troisième après perfusion intraveineuse sur 30 min chez 6 nourrissons atteints de dysplasie bronchopulmonaire [105]. Dans cette étude, les auteurs ont déterminé une tl/2 de 118 ±14 min, un Vd de 1291 ± 397 ml/kg et une clairance de 7,5 ± 2,6 ml/kg-min . Une quatrième étude a été réalisée après perfusion sous-cutanée continue; les taux plasmatiques se situaient entre 12 et 23 ng/ml [106]. Une dernière étude a été faite après nébulisation [107].

6.2.3 Indications du salbutamol En aérosol: prévention et traitement des bronchospasmes dans l’asthme, y compris l’asthme d’effort, et la bronchite chronique.

Par voie intraveineuse: bronchospasme sévère et comme tocolytique lors de menaces d’accouchement prématuré non compliqué (dernier trimestre de la grossesse).

Par voie orale (utilisation rare): traitement et prévention des bronchospasmes dans l'asthme bronchique, la bronchite chronique et l'emphysème pulmonaire.

6.2.4 Les effets indésirables Avec la voie inhalée, certains effets indésirables sont liés au passage systémique. Ils sont observés surtout avec les doses fortes.

♦ tremblement des extrémités et crampes musculaires dues à une stimulation directe des récepteurs β2 au niveau des muscles squelettiques;

♦ tachycardie sinusale, palpitations (effets directs et indirects sur le muscle cardiaque);

♦ troubles du rythme cardiaque;

♦ excitation, nervosité, anxiété;

♦ céphalées;

♦ sueurs;

♦ glycogénolyse avec hyperglycémie et hyperlactatémie (stimulation des récepteurs β2 du muscle squelettique);

♦ hypokaliémie par transfert de potassium dans les cellules par stimulation de la pompe Na-K du muscle squelettique;

♦ toux et parfois bronchospasme à la suite de l’inhalation.


Une tolérance par désensibilisation des récepteurs (down-regulaiton) peut se développer après quelques semaines de traitement, mais est sans conséquence au niveau clinique. Les corticoïdes inhiberaient d’ailleurs cet effet.

Les contre-indications sont rarissimes: troubles du rythme non contrôlés, insuffisance cardiaque décompensée. La prudence est de rigueur chez les patients avec pathologie cardiaque, spécialement chez les personnes âgées.

77

Chapitre 7

7 Objectifs du travail

Ce travail de diplôme, qui se poursuivra par un travail de thèse, prolonge une étude in vitro conduite de 1996 à 2000 à la pharmacie du CHUV et intitulée: l’optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l’enfant sous ventilation mécanique.

7.1 Présentation de l’unité des S.I.P du CHUV L’unité de Soins Intensifs de Pédiatrie (SIP) du CHUV est une unité composée de 9 lits accueillant tous les enfants, de la naissance à l’âge de 16 ans, qui nécessitent un soutien vital pour des raisons médicales ou chirurgicales. L’équipe médicale est composée d’un médecin-chef (Dr. Jacques Cotting, PD et MER), d’un médecin-associé (Dr. Stücki Pascal), de deux chefs de clinique, travaillant à 50 et 100%, et de 4 médecins-assistants en formation en pédiatrie ou en chirurgie pédiatrique (engagés pour 3 ou 4 mois). L’unité se trouve également renforcée par les différents spécialistes en charge des patients hospitalisés: chirurgiens, anesthésistes, médecins consultants de cardiologie, d’infectiologie, …

L’équipe infirmière est composée d’une infirmière cheffe de service ou ICS (Mme Anna-Maria Gonzalez), d’une infirmière cheffe d’unité de soins ou ICUS (Mme Claire-Lise Chollet), de 26 infirmières diplômées (EPT) et d’infirmiers-enseignants. D’autres professionnels travaillent dans l’unité comme un responsable du matériel, des aides-soignants, des physiothérapeutes, des assistantes sociales, un aumônier, un éthicien, du personnel administratif, etc. Parmi les consultants on peut également signaler la présence d’un pharmacien qui chaque semaine s’entretient

Chapitre 7 Objectifs du travail 78

avec l’ICUS des problèmes rencontrés lors de l’administration des médicaments et qui chaque mois participe à la visite médicale. Le pharmacien est disponible le reste du temps sur appel.

Cela fait maintenant plus de 10 ans (dès 1991) que les SIP effectuent un contrôle de qualité par l’évaluation de la mortalité(score PRISM [108]), des complications iatrogènes évitables, de l’utilisation des médicaments et du matériel, de la pertinence des admissions et des journées de séjour et de l’état neurologique des patients à la sortie des SIP.

7.2 Travaux effectués 7.2.1 Revue de l’utilisation du salbutamol En 1997, dans l’étude citée ci-dessus, une revue de l’utilisation du salbutamol chez les enfants hospitalisés dans l’unité des Soins Intensifs médico-chirurgicaux de Pédiatrie du CHUV (SIP) avait été faite. Le but de cette étude était de connaître l’emploi du salbutamol dans l’unité des SIP en réalisant:

♦ Une statistique de la consommation et de l’utilisation du salbutamol de 1996 à 1998,

♦ Une observation des pratiques dans l’unité et une revue rétrospective de dix cas d’enfants hospitalisés en 1997

7.2.1.1 Résultats de l’étude La revue de l’utilisation du salbutamol dans cette unité a monté que les bronchospasmes chez les enfants hospitalisés aux SIP sont relativement fréquents. Ils peuvent résulter d’une crise d’asthme sévère, d’une bronchiolite à VRS ou des suites d’opérations chirurgicales au niveau ORL, thoracique ou abdominal. Pour les traiter, on utilise notamment le salbutamol en aérosol. Ainsi, de 1996 à 1998, 30 à 50% des enfants sous ventilation mécanique ont reçu des bronchodilatateurs. Des trois marques de nébuliseurs pneumatiques utilisés dans l’unité chez les patients intubés, le Microneb NA420, le Sidestream Durable et le Babylog, seul ce dernier est prévu pour une utilisation avec le ventilateur du même nom. Les deux autres sont commercialisés pour des thérapies par inhalation chez des patients en ventilation spontanée et ne sont pas prévus pour une propulsion au moyen d’un ventilateur. Il était donc tout à fait légitime de s’interroger sur le rendement de la nébulisation et l’efficacité de tels traitements chez les enfants intubés.

7.2.2 Etude in vitro Cette étude qui avait pour buts, à travers la comparaison de six modèles de nébuliseurs pneumatiques, de:

♦ tester différents paramètres physico-chimiques, comme les variations d’osmolalité, de taille de particules, de concentration en principe actif, de température et de pH des solutions de salbutamol au cours de la nébulisation [109];


♦ évaluer la délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique selon trois modes d’administration différents: durant l’inspiration, l’expiration ou en continu (cf Figure 26).

Les résultats obtenus contredisent les recommandations américaines [38], puisque le mode standard (nébulisation pendant l’inspiration) est le moins efficace. Le mode de nébulisation durant l’expirium (activité durant la phase inspiratoire du cycle ventilatoire) est celui ayant donné les meilleurs résultats (environ 300x plus efficace suivant le modèle de nébulisateur). Ceci peut s’expliquer par le fait que durant l’expiration, le nébuliseur est activé et le tuyau inspiratoire se remplit d’aérosol (effet spacer). Ensuite, pendant l’inspiration suivante, l’aérosol atteint le bout du tube endotrachéal.

Figure 26

Le tableau suivant (cf Tableau 9) résume quelques résultats obtenus lors de cette étude qui montrent clairement la supériorité de la distribution de l’aérosol en mode expirium:

Tableau 11 Délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle pédiatrique in vitro

Nébuliseur Mode de Nébulisation

Proportion de PA

Proportion de PA

Proportion de PA

Proportion de PA

inhalé (%)a b expiré (%)a b restant dans déposé ailleurs


le nébuliseur (%)a b

ds le circuit (%)a b

Microneb A Intermittent/Inspirium b

0.3 ± 0.1 7.2 ± 0.8 85.3 ± 0.7 7.2 ± 0.9

B Continu b 1.5 ± 0.2 19.1 ± 2.4 71.3 ± 3.5 8.1 ± 1.8 C Intermittent/

Expirium c 2.7 ± 0.9 10.0 ± 2.8 81.6 ± 3.3 5.7 ± 3.5

D Continu/ Externe b

1.9 ± 0.2 11.9 ± 1.6 77.6 ± 2.4 8.6 ± 3.0

Sidestream A Intermittent/Inspirium b

2.7 ± 0.6 31.8 ± 4.1 50.0 ± 7.8 15.5 ± 3.3


Expirium c 9.0 ± 1.9 39.8 ± 4.7 32.3 ± 2.5 18.9 ± 6.4


5.4 ± 0.5 46.5 ± 1.2 31.9 ± 2.5 16.2 ± 2.9

Acorn II A Intermittent/Inspirium b

0.8 ± 0.1 17.4 ± 1.5 72.4 ± 5.2 9.4 ± 3.8


Expirium c 7.2 ± 2.0 28.7 ± 7.9 37.3 ± 5.0 26.8 ± 12.7


4.6 ± 0.8 35.8 ± 6.9 36.0 ± 6.1 23.6 ± 12.7

Cirrus A Intermittent/Inspirium b

1.8 ± 0.3 29.1 ± 5.0 55.3 ± 7.1 13.8 ± 5.0


Expirium c 4.7 ± 1.2 23.6 ± 10.9 42.6 ± 9.8 29.1 ± 16.7


3.4 ± 0.7 30.4 ± 9.3 30.9 ± 3.7 35.3 ± 7.8

Upmist A Intermittent/Inspirium b

3.4 ± 0.6 30.4 ± 3.0 51.4 ± 8.1 14.8 ± 4.8


Expirium c 7.1 ± 1.3 30.1 ± 7.4 43.2 ± 8.0 19.6 ± 10.0


4.0 ± 0.5 37.5 ± 2.2 43.0 ± 2.2 15.5 ± 2.3

Micro Mist A Intermittent/Inspirium b

2.6 ± 0.3 31.7 ± 2.4 51.4 ± 3.2 14.3 ± 2.5


Expirium c 8.3 ± 0.6 34.9 ± 2.6 43.1 ± 3.7 13.7 ± 1.7

D Continu/ 5.6 ± 0.4 45.6 ± 3.6 33.9 ± 3.0 14.9 ± 1.6


Externe b

a. Moyenne ± écart-type (n = 5 ), exprimée en % de la dose initiale de salbutamol sulfate.

b. Nébuliseurs à une distance de10 cm de la pièce en Y.

c. Nébuliseurs à une distance de120 cm de la pièce en Y.

Suite à cette étude, seul le nébuliseur Sidestream Durable est utilisé aux SIP. De plus on observe également une forte diminution de la consomation de Ventolin®, les résultats de l’étude in vitro montrant le faible rendement d’une telle nébulisation.

Le modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique, développé pour déterminer la quantité inhalée d'aérosol, représente un moyen simple, sûr et économique. Il présente néanmoins les limites d'une étude in vitro où les conditions d'expérience sont contrôlées et idéalisées, ne correspondant pas forcément à la situation clinique. Par conséquent, il est fondamental de confirmer ces résultats par une étude in vivo.

7.3 Etude actuelle 7.3.1 Les méthodes pharmacocinétiques La littérature fait part de différents travaux utilisant des études pharmacocinétiques pour caractériser la déposition pulmonaire des substances médicamenteuses après nébulisation. On trouve des études plasmatiques et urinaires:

7.3.1.1 Les études plasmatiques: La mesure de l’aire sous la courbe (AUC) suivant l’inhalation donne une indication de la quantité totale de médicament délivré dans le corps. Ceci a permis de comparer différents dispositifs pour inhalation. Newnham [110] a montré que l’AUC suivant l’inhalation de salbutamol via un aérosol-doseur pressurisé modifié était augmenté de 24,5% par rapport à un type standard. De même une comparaison entre une dose de budénoside administré à l’aide d’un aérosol-doseur contenant du CFC a donné une AUC 13,4% plus petite que lors d’une administration avec un aérosol sans CFC [111]. L’analyse par scintigraphie gamma a montré que cette différence était due à un dépôt pulmonaire augmenté [112].

Lors de l’inhalation, seul 6-10% de la dose inhalée atteint les poumons [113], le reste étant avalé et/ou nébulisé dans l’air ambiant. Si l’on se trouve en présence de substances ayant une absorption gastro-intestinale négligeable, tel le cromoglycate de sodium ou le propionate de fluticasone, les concentrations plasmatiques de ces médicaments reflètent entièrement leur absorption pulmonaire, permettant de caractériser de façon précise leur biodisponibilité pulmonaire[113]. Dans le cas contraire, afin de différencier la proportion de médicament qui atteint la circulation systémique après un passage transpulmonaire, de celle qui y parvient par la voie gastro-intestinale[113], deux approches sont utilisées:


♦ Certaines études préconisent l’administration de charbon actif avant et après la nébulisation. Cette méthode a été utilisée lors d’une étude sur l’absorption pulmonaire de la terbutaline, celle-ci passant de 10% à 0.3% lors de l’emploi de charbon actif [114]. Cette technique a été reprise afin de déterminer le dépôt pulmonaire de la terbutaline toujours, à partir de différents dispositifs (MDI, DPI) et pour d’autres substances tel le budénoside [115]. Le charbon actif est gargarisé puis avalé 5 minutes avant et 5 minutes après l’administration du médicament nébulisé, sa dose est de 5 grammes dilués dans 20 ml d’eau [114].

♦ Une autre méthode pour différencier l’absorption orale de l’absorption pulmonaire est d’exploiter l’intervalle de temps séparant ces deux voies. Les échantillons de plasma prélevés aux temps 5, 10 et 20 minutes post inhalation ont permis de comparer la déposition pulmonaire de différents types de nébuliseurs et de différentes techniques de nébulisation [116], [117], [118], [119], [120], [121], [122]. En effet après administration orale du salbutamol seul 0.18% de la dose est excrétée dans les trente premières minutes. Plus précisément ces trente premières minutes représentent le décalage entre l’administration du médicament et son absorption orale. Si l’on transpose ces résultats à une technique d’inhalation, on peut admettre qu’un dosage sanguin ou urinaire du salbutamol durant ce laps de temps est représentatif de la quantité de médicaments ayant atteint sa cible, c’est-à-dire les poumons.

7.3.1.2 Les études urinaires: Les substances polaires sont aisément excrétées dans l’urine avec une faible variabilité causée par une réabsorption tubulaire passive lorsque le pH urinaire change. Le dosage des médicaments dans des prélèvements urinaires a donc aussi été réalisé.

Une première étude, mesurant la quantité totale de terbutaline inchangée excrétée dans les urines après inhalation a été menée par Borgström et Nilsson [114]. L’inhalation a été précédée de la prise de charbon actif, celui-ci diminuant de 10% à 0.3% la biodisponibilité orale de la terbutaline selon une étude préalable. Cette méthode utilisée pour quantifier la déposition pulmonaire a été comparée avec la scintigraphie gamma chez six volontaires. L’analyse montre une excrétion urinaire de 21.1 ± 3.2% de la dose terbutaline, alors que la scintigraphie indiqua une déposition pulmonaire de 26.9 ± 3.8%. La différence entre les deux méthodes est due principalement à la clairance mucociliaire d’une partie de la dose déposée dans la zone centrale des poumons, ne se retrouvant forcément pas lors de l’analyse urinaire.

Hindle et Chrystyn [123] ont montré que la quantité de salbutamol excrété dans les 30 premières minutes suivant l’inhalation représente la biodisponibilité pulmonaire du médicament. En effet, après administration orale de salbutamol, les récoltes urinaires faites dans la première demi-heure indiquent que seul 0.18 ± 0.14 % de la dose est excrétée, alors que suite à la nébulisation on trouve une excrétion de 2.06 ± 0.8% de la dose. Cette méthode permet d’éviter l’administration de charbon actif [124].


Il faut être très prudent lorsque l’on veut extrapoler des données obtenues chez des volontaires sains à des patients asthmatiques. En effet des études [113] montrent que les données plasmatiques obtenues après inhalation de propionate de fluticasone sont significativement plus basses chez les patients asthmatiques que chez les volontaires sains autant du point de vue du pic de concentration plasmatique que de l’aire sous la courbe concentration-temps. Ces différences semblent indiquer un dépôt pulmonaire moins important chez les personnes asthmatiques, probablement dû à un rétrécissement des voies aériennes, ainsi qu’à une capacité réduite à inhaler efficacement, empêchant le salbutamol d’atteindre le poumon.. Ces résultats concordent avec les changements de taux de cortisol observés chez des personnes avec un asthme sévère après un traitement chronique de propionate de fluticasone [Chrystyn, 2000 #232]. En effet suite à un traitement journalier de 1 mg de propionate de fluticasone durant 6 semaines aucune diminution des taux de cortisol matinaux dans le sérum n’a été observée. A une posologie journalière de 2 mg sur une même période, la diminution moyenne est de 12%, nettement inférieure à celle attendue au regard des résultats obtenus chez les volontaires sains. Ce même phénomène a été observé avec d’autres glucocorticoïdes inhalés, tels le budénoside ou le propionate de béclométhasone. Il en va de même pour le salbutamol à une posologie de 40 μg/kg.[Chrystyn, 2000 #232], [120].

Cette revue de littérature montre que les méthodes pharmacocinétiques utilisant les dosages urinaires et plasmatiques peuvent être utilisées pour caractériser la déposition pulmonaire totale.

Si une étude pharmacocinétique est faite pour confirmer les résultats obtenus in vitro, il sera indispensable, lors de l'étude chez les patients, de tenir compte de critères cliniques pour déterminer si in vivo un mode de ventilation est effectivement plus efficace que l'autre. En effet, si une différence de concentration est obtenue entre les deux modes de nébulisation, il faudra prouver qu’elle a une signification clinique (augmentation du volume respiratoire par exemple et qu’elle n’est pas limitéequ’à un bénéfice technique.

7.3.2 Buts de l'étude ♦ Développer une méthode analytique permettant l'utilisation d'une quantité

minimale de sang pour le dosage du salbutamol administré par nébulisation.

♦ Montrer une corrélation possible entre le dosage urinaire et le dosage sanguin du salbutamol dans les mêmes conditions.

♦ Démontrer que la délivrance pulmonaire de la nébulisation en mode expirium est plus efficace qu'en mode inspirium en déterminant les taux sériques de salbutamol chez des volontaires sains dans un premier temps puis chez des enfants sous ventilation mécanique.

♦ Confirmer la différence entre le nébuliseur ayant la délivrance la plus faible dans l'étude in vitro et celui considéré comme le plus efficace.


Un protocole de recherche a été soumis à la commission d’éthique de la recherche clinique de la faculté de médecine de Lausanne (cf Annexe 1). Ce protocole, qui concerne l’étude préalable chez le volontaire sain, a été accepté au mois de septembre 2002.

L'absorption des médicaments chez les patients atteints de pathologies respiratoires étant différente de celle observée chez les volontaires sains, il sera indispensable de confirmer les résultats de ce premier travail par une étude portant directement sur la population concernée. Ceci est d'autant plus important, que l'étude préliminaire sera faite sur une population adulte, car il n’est paséthiquement défendable de mener celle-ci chez des enfants.Toutefois cette première étude est indispensable afin de confirmer les résultats obtenus in vitro, justifiant celle chez les patients. De plus, elle permettra de développer une méthode de dosage la moins invasive possible. Une comparaison des dosages plasmatique et urinaire sera faite dans le but de réaliser par la suite uniquement des prélèvements urinaires, si une équivalence peut être établie entre les deux méthodes.

Ce travail de mémoire, qui représente la première partie du travail de thèse a pour but de mettre au point les méthodes de dosage sanguin et urinaire du salbutamol, ainsi que leur validation pharmaceutique. Cinq volontaires sains, qui n’étaient pas sous ventilation mécanique, ont également reçu une nébulisation de salbutamol, afin de préparer l’étude clinique chez les volontaires sains proprement dite et de contrôler la sensibilité suffisante des méthodes analytiques. Les buts de ce travail de mémoire sont donc de:

♦ mettre au point une méhode de dosage plasmatique et urinaire du salbutamol et valider ces dosage .

♦ appliquer ces méthodes sur des échantillons prélevés chez des volontaires sains afin de les valider et de les comparer aux données obtenues dans la littérature.

85

Chapitre 8

8 Matériel et Méthode

8.1 Préambule Ce travail de mémoire représente une étape intermédiaire du projet de recherche décrit ci-dessus. Il décrit le développement et la validation des deux méthodes analytiques développées pour doser dans le plasma et dans l’urine le salbutamol administré par inhalation. En effet afin de pouvoir émettre des recommandations sur la manière la plus efficace d’administrer des médicaments par nébulisation, il est essentiel de pouvoir s’appuyer sur des méthodes de dosages sûres et performantes, donnant des résultats solides. La particularité de ces méthodes analytiques est que les taux plasmatiques de salbutamol attendus après nébulisation sont faibles, de l’ordre du ng par ml. De plus la plupart des études ne tiennent pas compte de l’absorption gastrique du salbutamol et se font sans l’ingestion de charbon actif. On peut donc s’attendre en lisant ces travaux à des taux plasmatiques supérieurs à ceux que nous rencontrerons.

8.2 Réactifs Les substances pures utilisées pour la mise au point de la méthode de dosage sont le salbutamol sulfate et le baméthane utilisé comme étalon interne.

Une solution stock de salbutamol [1 mg/ml] a été préparée à partir de 48.2 mg de salbutamol sulfate (Synopharm, Barsbüttel, Allemagne, art. 701154) dissous ad 20 ml de MeOH. Un bain à ultrason Branson 5200 a été utilisé pour faciliter la mise en solution du salbutamol.

Chapitre 8 Matériel et Méthode 86

A partir de ces solutions, les solutions de travail ont été préparées par dilution dans du H3PO4 0.01M.

Les solutions stock de salbutamol ont été aliquotées et conservées à –20°C, où elles sont stables durant 6 mois [125].

Les solutions stock d’étalon interne [0.2 g/ml] ont été préparées à partir de 24.6 mg de baméthane sulfate (Sigma Chemical, St Louis, Mo, USA,art. B-0382) dissous ad 100.0 ml d’eau.

Les solutions stock d’étalon interne ont été aliquotées et conservées au frigo où elles sont stables durant 1 mois [125].

Les solutions de travail de baméthane [0,5 ng/ml] ont été préparées en diluant extemporanément la solution stock avec une solution de KHCO3 1%.

La solution de bicarbonate de potassium (KHCO3) à 1% a été préparée par dissolution de 1.0 g de KHCO3 (Hänseler, Herisau, Suisse, art. 6-4704-2) ad 100 ml avec de l’eau.

La solution d’acide phosphorique (H3PO4) 0.01 M a été préparée en diluant 2.3 g de H3PO4 85% (Merck, Darmstadt, Allemagne, art. 1.00552) ad 1.0 L avec de l’eau.

L’eau de qualité HPLC (H2O), le méthanol de qualité gradient (MeOH) et l’acétonitrile (ACN) proviennent de Merck (Darmstadt, Allemagne, art. 1.15333, 1.06007 et 1.80030 respectivement), l’acide acétique glacial (CH3COOH) de Merck (Darmstadt, Allemagne, art. 1.00066), le tampon de phosphate BPS (NaCl 6.8 g, Na2HPO4 1.48 g, KH2PO4 0.43 g, H2O ad 1L, pH 7.1-7.3) de Bichsel (Interlaken,Suisse, art. 100 0 324), le Low UV Pic B7 (acide heptano-sulfonique) de Waters (Milford, USA, art. Wat084282), les solutions d’ammoniaque ont été diluées à partir de l’ammoniaque (NH4OH) 25%( Merck, Darmstadt, Allemagne art. 1.05432). L’acide chlorhydrique (HCl) 5N provient de Merck, (Darmstadt, Allemagne, Art. 1.09911), ainsi que l’hydroxyde de sodium (NaOH) 5N (Merck, Darmstadt, Allemagne, Art. 1.09913).

Les solutions de nébulisation ont été préparées avec la solution concentrée de Ventolin® 0.05% (GlaxoSmithKline, Münchenbuchsee, Suisse, lot 0087675) diluée avec du NaCl 0,9% de B. Braun (B.Braun Medical, Emmenbrücke, Suisse, art. 534534): la concentration des solutions de salbutamol était de 10 mg/4 ml, pour 2 volontaires sains et de 5 mg/4ml pour les 3 trois autres.

Les pesées ont été réalisées à l’aide d’une balance analytique Mettler AT 250, reliée à une imprimante Mettler-Toledo LC-P45 Printer.

8.3 Récolte des échantillons Cinq volontaires sains ont reçu un aérosol de 10 ou 5 mg de salbutamol durant 15 minutes. La nébulisation s’est faite à l’aide d’un nébuliseur pneumatique à double venturi,


le Sidestream® (Medic-Aid Ltd, West Sussex, Royaume-Uni, art. 44455U) connecté à un embout buccal adapté au nébuliseur fourni par Homedica (Hürenberg, Suisse, art. 1605A), à un débit de 8 L/mn. Les volontaires avaient le nez bouché par un pince-nez. Durant la nébulisation et l’heure suivante, leur rythme cardiaque a été contrôlé. Une perfusion de 1000 ml de NaCl 0.9% (B. Braun Medical, Emmenbrücke, Suisse, charge 3362H42) leur a été posée sur 2 heures, assurant une bonne perfusion et permettant des prélèvements urinaires réguliers.

Les récoltes plasmatiques et urinaires ont été faites de la manière suivante:

Les échantillons sanguins ont été prélevés aux temps t=0, 15, 30, 45, 60 minutes, puis toutes les heures jusqu’à t= 8 heures.

Les S-Monovettes CPDA1 de 8.5ml (Sarstetdt, Sevelen, Switzerland, art. 04.1910.001) ont été utilisées pour la récolte du sang. Suite au prélèvement, les échantillons ont été centrifugés pendant 15 minutes à 4000 g. La centrifugeuse utilisée pour récolter le plasma des échantillons sanguins est un modèle Hettich Rotanta/RP. Le volume de plasma récolté se situe entre 4 et 5 ml suivant les prélèvements. Le plasma a été analysé directement après centrifugation et le surplus congelé à –20°C.

Les urines ont été récoltées aux temps t=0, 30 et 60 minutes, toutes les heures jusqu’à t= 6 heures, puis à t= 10 heures et à t= 24 heures dans des pots en matière plastique de 500 ml, 1L ou 2L.

Ces pots tarés ont été pesés suite à la récolte. Une mesure de la densité et de la masse volumique des échantillons urinaires a été faite. Avant analyse, l’urine a été centrifugée avec le même appareil que ci-dessus pendant 15 minutes à 4000 g. Les échantillons ont été stockés au frigo pendant 24 heures avant d’être analysés, un échantillon de chaque prélèvement a également été stocké au congélateur à –20°C.

Pour la mise au point de la méthode, 15 plasmas différents ont été utilisés, obtenus auprès du Centre de Transfusion Sanguine (Lausanne, Suisse)

Les échantillons urinaires pour la mise au point de la méthode proviennent de 5 donneurs adultes non-asthmatiques.

8.4 Préparation des échantillons Les échantillons plasmatiques et urinaires ont été acidifiés (200 μl d’H3PO4 0.01M), afin de libérer le salbutamol des protéines plasmatiques, puis soumis à une extraction en phase solide (SPE).

L’extraction est la première étape de l’analyse qui permet d’isoler une substance de la matrice complexe, ici le plasma ou l’urine, dans laquelle elle se trouve et d’éliminer un maximum de substances parasites contenues dans celle-ci.


Il existe différents types d’extraction de milieux biologiques dont les plus courants sont:

♦ L’extraction liquide-liquide: le principe est fondé sur la distribution d’un soluté donné entre deux solvants non miscibles en fonction de sa solubilité dans chacun d’eux. Toutefois ces procédures sont longues et fastidieuses.

♦ L'extraction liquide/solide ou en phase solide ou encore SPE (pour Solid Phase Extraction) est une alternative élégante à l'extraction liquide/liquide. L’extraction en phase solide permet une procédure d’extraction plus rapide, une utilisation d’un volume moins important de solvant polluant et une élimination simple des interférents (par lavage) par rapport à une extraction liquide-liquide. De plus elle permet dans certains cas une préconcentration ou un enrichissement de l’échantillon à analyser et peut être facilement automatisée.

8.4.1 Les principes de l’extraction SPE L’extraction en phase solide ou sur un support solide (SPE = Solid Phase Extraction) consiste à percoler l’échantillon aqueux sur un support solide pour piéger les analytes recherchés. La séparation d’un composé n'est pas la seule application possible de la SPE, puisque celle-ci est utilisée à des fins de concentration et parfois pour le dessalage de solutions, un changement de solvant ou encore une dérivation en ligne.

Le principe de base de la SPE est celui de la chromatographie en phase liquide poussé à l'extrême, où l’on freine la migration des diverses familles de molécules en les retenant sélectivement sur un adsorbant. En SPE on bloque ces mêmes molécules sur cet adsorbant, puis on les élue brutalement et sélectivement en les décrochant du support par un solvant spécifique.

Les adsorbants utilisés sont de diverses natures: les plus répandus sont à base de silice greffée. En SPE la majorité des silices encore utilisées sont de type irrégulières de 45µm environ. La nature des greffons détermine le mode d'interaction mis en œuvre. Ainsi un greffage C18 sera foncièrement apolaire et ne retiendra les diverses molécules que par interactions de type Van Der Waals. La silice activée ne permet que des interactions de type polaire par pontage hydrogène. Un greffon aminopropyl (NH2) sera tantôt polaire, tantôt échangeur d'ions (en fonction du pH). Les interactions secondaires dues aux silanols libres de la silice sont malgré tout à prendre en compte dans le comportement général de l'adsorbant. Pour minimiser ces interactions secondaires on a souvent recours au End Capping qui bloque une partie des OH libres à la surface de la silice par une substitution de l'hydrogène par un Si(CH3)3.Un greffage de type polymérique permet également de mieux protéger l'accès à ces sites actifs. L'échange d'ions est la technique de choix lorsque l'on recherche une extrême sélectivité.

Les résines, souvent à base de Styrène Divinyl Benzène, offrent un plus large spectre d'adsorption en terme de polarités. Pour des applications plus spécifiques, on rencontre des adsorbants moins courants comme le Florisil®, l'alumine, le carbone graphitisé ou


encore des terres de diatomées fossiles (pour l'extraction liquide/liquide sur support solide).

Une extraction SPE se décompose en un certain nombre d'étapes plus ou moins nombreuses en fonction de l'adsorbant utilisé et de la complexité de l'échantillon. Le principe fondamental est le fameux triangle d'équilibre entre le composé d'intérêt, la matrice et l'adsorbant. En général, la procédure est la suivante (cf Figure 27):

♦ Conditionnement: (ou solvatation) Cette étape sert à conditionner la cartouche en mouillant la phase solide avec un solvant organique (souvent du méthanol) et, dans le cas de greffons longs (C18, C8 ...), à les redresser sur la silice, ceci afin que les interactions puissent avoir lieu.

♦ Equilibration: Il faut éliminer l'excédent de solvant de conditionnement en rinçant la cartouche avec le solvant de l'échantillon (de l'eau distillée par exemple dans le cas d'un échantillon aqueux).

♦ Dépôt de l'échantillon

♦ Lavage: il est réalisé avec un solvant permettant d’éliminer certains composés indésirables de la cartouche tout en maintenant les composés d'intérêt adsorbés. Cette phase peut être répétée avec divers solvants mais elle est parfois shuntée pour extraire directement les composés d'intérêt en laissant les interférents bloqués sur l'adsorbant.

♦ Elution: on récupère les composés d'intérêt avec le solvant approprié.

♦ Concentration: on procède le plus souvent par évaporation, d'où l'intérêt des cartouches à disque qui nécessitent moins de solvants.

Certaines étapes intermédiaires viennent parfois s’ajouter comme par exemple, un séchage de la cartouche avant élution pour éviter de récupérer de l'eau dans l'échantillon pur. L'un des points les plus délicats est probablement le pré-traitement de l'échantillon quant il s'avère nécessaire: ajuster un pH pour que les composés d'intérêt soient libres ou diluer pour ramener l'échantillon à une viscosité raisonnable, précipiter ou filtrer les molécules en suspension.


Figure 27 Les différentes étapes d’une extraction SPE

Le salbutamol, appelé aussi 2 –tert-Butylamino-1-(4-hydroxy-3-hydroxymethphenyl) ethanol, est une base avec deux constantes de dissociation : pKa : 9.3, 10.3

La molécule de salbutamol contient des groupements polaires et non polaires, ainsi qu’une fonction amine ionisable. Sa structure chimique lui permet donc d’interagir avec différents types de phases solides. Les mécanismes d’extraction comprennent des interactions polaires (silice) et non polaires (C18), des interactions avec des polymères avec des capacités de double rétention des produits polaires et non polaire (Oasis®), ainsi que des interactions avec une phase combinée permettant des liaisons hydrophobes et des échanges de cations (Bond-Elut Certify®).

Constante de dissociation : pKa : 9.3, 10.3

Le salbutamol ne se trouve sous forme neutre à aucune valeur de pH.. Cette molécule est ionisée et donc hydrophile à des valeurs de pH basses et très hautes et relativement hydrophobe à un pH de 8.5. Cependant même à ce pH seul le 60% du salbutamol se retrouve sous forme neutre. Par exemple. à pH acide, la fonction phénolique du salbutamol se trouve sous forme non ionisée, tandis que la fonction amine est protonée. Lors de l’extraction on cherche à travailler à un pH où la molécule à séparer se trouve en majorité sous forme neutre. En travaillant avec une phase stationnaire de silice, nous avons utilisé un tampon phosphate à pH 7.1-7.3, afin d’augmenter la rétention de la molécule et par là la reproductibilité de nos extractions.


8.4.2 Procédure d’extraction en phase solide (SPE): Les extractions ont été faites avec un système Visy-prep® de 24 positions (Supelco, Bellefonte, PA, USA, art. 5-7265). Sept différentes cartouches d’extraction SPE ont été testées (Supelclean® LC-18 1 ml (Supelco, Bellefonte, PA, USA, art. 504270), Oasis® HLB 1 cc (Waters, Milford, MA, USA, art. Wat094225), Oasis® MCX 60mg/3cc (Waters, Milford, MA, USA, art. 186000254), SPEC® Si 15 mg/3cc (art. A5320820), SPEC C18 15 mg/ cc (,art.), Bond Elut Certify I HF (130 mg/10 ml) (Varian, Lake Forest, CA, USA, art. 1411-3050), Bond-Elut®-Si (100mg/ml et 500mg/3 ml) (Varian, Lake Forest, CA, USA, art. 12102010 et art. 12102037).

Les tests ont été réalisés avec des blancs d’urine et de plasma ainsi que du plasma et de l’urine spikés avec respectivement 6.25 ng/ml et 20 ng/ml.

Les résultats des différents tests réalisés se tourvent dans l’annexe 2.

8.4.2.1 Colonne Supelclean® C18 C’est une colonne greffée C18 "end-capped". Il s’agit donc d’une phase apolaire (octadecyl), avec des interactions secondaires polaires faibles. Cette colonne peut être utilisée pour des échantillons aqueux, fluides biologiques, avec une large gamme de polarité des composés retenus. C’est la plus utilisée des phases SPE à cause de son "universalité" (interactions de types Van der Waals).

L’extraction du plasma avec les colonnes Supelclean® (cf Annexe 2.1) a permis d’effectuer une prévalidation et une validation de méthode. Cependant le seuil de quantification déterminé, se situant vers 20 ng/ml, était trop élevé par rapport aux concentrations plasmatiques attendues après nébulisation du salbutamol. De plus lors d’un test avec trois volontaires sains, malgré les différents plasmas testés préalablement, un pic apparaissait au temps t=0 (donc avant la nébulisation), avec le même temps de rétention que le salbutamol chez l’une des personnes testées.

Les tests réalisés avec l’urine n’ont pas été satisfaisants, ils n’ont pas permis d’obtenir une chromatogramme propre (cf Annexe 2.1)

8.4.2.2 Colonne Oasis® HLB Le support copolymérique de phase inverse, Oasis® HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance) basé sur un équilibre hydrophile-hydrophobe dû à l’association du N-Vinylpyrrolidone et du Divinylbenzene permet d’éviter tous les désagréments des supports à base silice: assèchement, limites de pH, interaction silanolique, capacité et rétention faible des produits polaires.

Les essais réalisés avec ces colonnes ne nous ont pas permis d’obtenir un chromatogramme propre lors de l’extraction de plasma et d’urine exempts de salbutamol (cf Annexe 2.2).


8.4.2.3 Colonne Oasis® MCX: Il s’agit d’un nouveau support en mode mixte, qui utilise les propriétés de l’association du copolymère de phase inverse HLB et de sites échangeurs de cations. Ce support offre une plus grande sélectivité pour les extractions de molécules basiques.

Les essais réalisés avec ces colonnes ne nous ont pas permis d’obtenir un chromatogramme propre lors de l’extraction de plasma et d’urine exempts de salbutamol (cf Annexe 2.3).

8.4.2.4 Colonnes SPEC® SPEC® est une nouvelle technologie d’extraction liquide/solide. La phase stationnaire est fixée sur un disque en fibre de verre. Cette conception permet l’utilisation de faibles volumes d’élution, de réduire le nombre et la durée des étapes de la procédure d’extraction. Les phases stationnaires greffées sont de même type que pour les autres colonnes, parmi lesquelles nous avons testé la silice, un mode mixte et une C18. Les différentes colonnes SPEC® ont été testées uniquement avec l’urine.

Lors de l’extraction urinaire avec la colonne SPEC®-Si ni le salbutamol ni l’étalon interne ne sont retenus sur la colonne avant l’élution (cf Annexe 2.4.1).

Avec la colonne SPEC®-C18, c’est l’extraction du baméthane qui n’est pas concluante(cf Annexe 2.4.2).

8.4.2.5 Bon-Elut Certify® I HF Dans la littérature, la colonne la plus utilisée pour l’extraction urinaire du salbutamol est la Bon-Elut Certify®.

La colonne Bond-Elut Certify® est de mode mixte C8 non ″endcapped″ et SCX (acide benzenesulfonique: échangeur de cations forts). Mise au point pour l'extraction de drogues et médicaments acides des fluides biologiques, elle convient également à un grand nombre d'extractions de matrices aqueuses. Les conditions de travail sont résumées à l’Annexe 2.5.

Les résultats obtenus avec cette colonne pourtant souvent citée dans la littérature, ne se sont pas avérés satisfaisants.

8.4.2.6 Colonne Bond-Elut® Si: Il s’agit d’une phase polaire à caractère acide. C’est l’adsorbant le plus polaire et le plus utilisé pour l'extraction de composés plus ou moins polaires dans un solvant apolaire.

Cette colonne a donné les résultats les plus satisfaisant et la meilleure séparation du pic de salbutamol par rapport aux autres pics présentes dans les deux matrices. Elle a donc été retenue pour l’extraction plasmatique et urinaire


Les tests d’extraction effectués avec les différents types de colonnes, ainsi que les résultats obtenus se trouve à l’Annexe 2.6.

Après les essais préliminaires, les deux méthodes d’extraction retenues sont les suivantes:

8.4.2.7 Extraction plasmatique La procédure d’extraction utilisée est celle mise au point par Gupta [125] pour le plasma avec des cartouches Bond-Elut® Si (100 mg/ml).

Le passage des solutions se fait sans appliquer de vide d’air, les cartouches sont séchées après le lavage et après l’élution pendant 5 minutes avec un vide de 5 mmHg .

Les cartouches sont conditionnées avec 1 ml de MeOH et 1 ml d’H2O, après le passage des 2 ml de plasma acidifié, on ajoute 200 μl de solution de travail de l’étalon interne, puis les cartouches d’extraction sont lavées avec 1 ml d’H2O et 1 ml d’ACN. Le salbutamol et le baméthane sont élués avec 1 ml de MeOH. Les tubes récoltant l’éluat sont rincés avec 200 μl de MeOH afin de récolter le salbutamol déposé sur les bords supérieurs. L’éluat est évaporé à sec sous flux d’azote à température ambiante. L’extrait sec est reconstitué avec 200 μl de phase mobile sans Pic B7 (phase aqueuse: phase organique (85: 15)) et passé pendant 1 minute au vortex.

8.4.2.8 Extraction urinaire L’extraction urinaire se fait à l’aide de cartouches Bond-Elut® Si (500 mg/ml). Préalablement, 2 ml d’urine acidifiée sont mélangés (1: 1) avec le tampon PBS.

Les cartouches sont conditionnées avec 2 ml de MeOH et 2 ml d’H2O, après le passage des 4 ml du mélange urine-tampon PBS, on ajoute 200 μl de solution de travail de l’étalon interne. Les cartouches d’extraction sont ensuite lavées avec 2 ml d’H2O et 2 ml d’ACN. Le salbutamol et l’étalon interne sont élués avec 2 ml de phase mobile organique. Les tubes récoltant l’éluat sont rincés avec 200 μl de MeOH afin de récolter le salbutamol déposé sur les bords supérieurs. L’éluat est évaporé à sec sous flux d’azote à température ambiante. L’extrait sec est reconstitué avec 200 μl de phase mobile entière sans Pic B7 (phase aqueuse: phase organique (83: 17)) et passé pendant 1 minute au vortex.

8.5 Méthodes Toutes les mesures et analyses ont été réalisées dans le Laboratoire de Contrôle de Qualité du service de Pharmacie du CHUV, qui est un local climatisé (20 à 22°C).

8.5.1 Détection Dans la littérature le salbutamol est dosé par différentes méthodes analytiques, telles l’HPLC à détection UV, l’HPLC à détection fluorimétrique, l’HPLC à détection électrochimique , l’HPLC couplée à la MS.


L’HPLC (high pressure liquid chromatography) est un procédé de séparation et de quantification de composés présents dans une phase liquide. La chromatographie liquide est fondée sur des phénomènes d’adsorption, de partage, d’échange d’ions ou d’exclusion.La séparation est basée sur les équilibres successifs apparaissant entre deux phases mobile et stationnaire. La phase stationnaire est contenue dans une colonne et constituée soit d’un support de fine granulométrie. L’appareillage est constitué généralement par un système de pompe, un injecteur, un détecteur et un enregistreur. Le système de détection utilisé doit permettre de déterminer les quantités des substances présentes dans l’effluent.

La méthode de détection retenue, suffisamment sensible et à disposition dans le laboratoire d’Assurance Qualité du CHUV, est la fluorimétrie.

Dans la détection à fluorescence ou fluorimétrie, l’analyte est excité par des rayons ultraviolets et émet des radiations à une certaine longueur d’onde. Le fluorimètre Jasco 920 permet de sélectionner la longueur d’onde d’excitation et celle d’émission par la présence d’un filtre approprié. La fluorescence est un moyen de détection assurant une sélectivité intéressante. En effet les longueurs d’ondes d’excitation et de détection retenues donnent une information supplémentaire au temps de rétention. Il n’y a que quelques substances ayant une fluorescence naturelle forte (par exemple les alcaloïdes de l’ergot de seigle). Le salbutamol est naturellement fluorescent et nous avons donc pu l’analyser selon cette méthode. Toutefois on trouve dans la littérature des groupes ayant eu recours à la dérivatisation pour pouvoir atteindre un seuil de quantification plus bas. En effet beaucoup de substances peuvent être transformées en dérivés fluorescents. Cette approche représente cependant une étape supplémentaire lors de la préparation de l’échantillon et les seuils de quantification mesurés dans la littérature ne sont guère plus satifaisants que ceux obtenus.

Il est encore à signaler que lors de l’utilisation d’un fluorimètre, les éluents ne doivent pas être fluorescents ni absorber aux longueurs d’ondes choisies. Le pH est aussi très important, certaines molécules n’étant fluorescentes que sous forme ionique particulière.

Dans un deuxième temps, il serait possible d’utiliser une LC/MS, cet appareil permettant d’améliorer la sensibilité de la méthode analytique (750 pg/ml versus 1.0 ng/ml avec notre méthode fluorimétrique).

Suite a une revue de littérature, Gupta[125]a testé différentes longueurs d’ondes d’excitation et d’émission il a considéré qu’une excitation à 275 nm et une émission à 310 nm sont les plus performantes, tout en donnant une ligne de base suffisamment stable. Nous avons donc repris ces mêmes valeurs. Nous avons confirmé ce résultat après avoir testé les différentes longueurs d’onde proposées dans la littérature.

Les concentrations plasmatiques et urinaires de salbutamol ont été mesurées par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L’appareil utilisé est un Varian (Harbor City, CA, USA) (Varian Solvent Delivery System 9012, Autosampler ProStar


model 410 Varian LTd, couplé à un fluorimètre Jasco 920 (Jasco, Tokyo, Japon). Cet appareillage est piloté par le logiciel Star LC Workstation 5.0, installé sur un ordinateur Compaq Deskpro sous Windows 98.

La colonne utilisée est de type Chromolith® Performance RP-18e (100 x 4.6 mm) (Merck, Darmstadt, Allemagne, art. 1.02129.0001) et est munie d’un système de pré-colonne Chromolith® (10 x 4.6 mm) (Merck, Darmstadt, Allemagne, art. 1.51471.0001). La composition de cette colonne est basée sur une technologie sol-gel possédant une structure de pore bimodale. On trouve d’abord une structure macroporeuse, où chaque macropore possède un diamètre moyen de 2 μm. L’ensemble forme un réseau dense de pores à travers lequel chaque éluent peut rapidement s’écouler, ce qui réduit significativement le temps d’analyse. Le deuxième est une structure mésoporeuse, dont les mésopores forment une structure supplémentaire de fine porosité (13 nm) et créent une très large surface de contact sur laquelle l’adsorption des composés peut se produire. De part la grande porosité, les colonnes Chromolith® permettent de travailler à haut débit tout en conservant des pressions basses.

De type RP-18e, cette colonne est constituée d’une phase de silices greffées avec des chaînes organiques à 18 atomes de carbone.

Pour l’analyse urinaire, une deuxième colonne a été couplée, la Chromolith Performance RP-8e (100 x 4.6 mm) (Merck, Darmstadt, Allemagne, art. 1.51468), afin de permettre une meilleure séparation du pic de salbutamol des autres substances présentes dans l’urine. Il s’agit d’une colonne de type Chromolith Performance RP-8e. Basée sur la même technologie que la précédente, cette colonne est constituée d’une phase de silices greffées avec des chaînes organiques à 8 atomes de carbone.

Les autres paramètres de l’analyse par chromatographie sont décrit dans le tableau ci-dessous (cf Tableau 12):

Tableau 12 Paramètres de l’analyse chromatographique

Paramètres Analyse plasmatique Analyse urinaire

HPLC Colonne Chromolith PerformanceRP-

18e Chromolith Performance RP-18e couplée à une Chromolith

Performance RP-8e Phase aqueuse CH3COOH 1%, Pic B-7 5mM ds H2O Phase organique CH3COOH 1% ds MeOH Phase mobile phase aqueuse: phase organique

85:15 phase aqueuse: phase organique

83:17 Débit 2,0 ml/mn 2,5ml/mn Temps de rétention 3.8 mn 8.7 mn


du salbutamol Temps de rétention

de l’étalon interne 9.3 mn 20.6 mn

Volume d’injection 50 μl 50 μl Fluorimètre Excitation 275 nm 275 nm Emission 310 nm 310 nm Slit position 40 nm 40 nm Gain 100 100

La phase mobile organique à été dégazée pendant 20 minutes dans un bain à ultrason Branson 5200.

Les mesures de pH ont été réalisées au moyen d’un pH-mètre 713 Metrohm® muni d’une électrode Solitrode (Metrohm, art. 6.028.000), contenant une solution C(KCL) 3M (KCL 3M: Merck, Darmstadt, Allemagne art. 1.04817.0250) et d’un agitateur magnétique: Metrohm, art. 2.728.002). Cet appareil est vérifié avant chaque utilisation au moyen de solution tampon de calibration (solution étalon de pH=4, pH=7 et de pH=9 (Metrohm, art. 6.2307.100, art. 6.2307.110, art. 6.2307.120, si la valeur indiquée s’éloigne de plus de 0,05 unités pH, l’appareil est recalibré à l’aide des solutions tampons. Le rinçage de l’électrode est réalisé avec de l’eau purifiée (qualité Pharmacopée) fournie par le service technique du CHUV.

8.5.2 Choix de l’étalon interne La notion d'étalon interne est très répandue en analyse chimique. Elle consiste à ajouter une quantité connue d'un produit d’une structure chimique proche de celle de l’analyte à doser, qui subira le même traitement que celui-ci lors de l’extraction; les effets de matrice seront donc les mêmes sur les deux molécules. Ainsi le rapport des surfaces entre les deux sera proportionnel à la concentration en salbutamol. Cette notion d’étalon interne permet de pondérer des différences de rendement lors de l’extraction. En effet si une extraction est faible pour l’analyte, elle sera également faible pour l’étalon interne et le rapport des surfaces des deux substances restera le même. Ceci est particulièrement important lorsque l’on veut déterminer précisément de basses concentrations de produits.

Certains auteurs n’utilisent pas d’étalon interne [126], [127], [128]. On trouve dans la littérature différents étalons internes utilisés: ethenzamide, fenoterol, atenolol, qui sont de structure chimique relativement différente du salbutamol. Le fenoterol par exemple possède deux groupes phénoliques et est donc plus électroattractif que le salbutamol. La pholedrine [129] et le baméthane [123], [130], [131], utilisés par de nombreux investigateurs, ont des structures similaires à celles du salbutamol (cf Figure 28). Nous avons donc retenu le baméthane comme étalon interne.


Figure 28 Structure chimique du baméthane

8.6 Procédure de validation La validation dans le plasma et dans l’urine a été réalisée sur la base du guide publié par la SFSTP [132] concernant les méthodes de dosage chromatographiques dans les milieux biologiques. La structure statistique de la validation des deux méthodes a été réalisée à l’aide de ce document sur un tableur Excel par la responsable du laboratoire d’Assurance Qualité de la Pharmacie du CHUV, Dr. Lina Berger.

La validation a été faite selon différents critères: spécificité-sélectivité, fonction de réponse (courbe d’étalonnage), linéarité, fidélité (répétabilité et fidélité intermédiaire), exactitude, seuil de détection, seuil de quantification, intervalle de dosage, rendement d’extraction.

8.6.1 Linéarité La linéarité d’une procédure d’analyse est sa capacité à l’intérieur d’un certain intervalle de concentration d’obtenir des résultats directement proportionnels à la quantité en analyte dans l’échantillon.

La linéarité de la méthode a été étudiée sur trois jours. Le rapport entre la surface des pics salbutamol / étalon interne a été reporté en fonction de la concentration théorique des solutions de salbutamol.

Huit solutions standards de plasma spiké, préparées en triplicat à partir d’une solution stock de salbutamol à des concentrations en salbutamol de 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.75, 5.0 et 7.5 ng/ml, ont été analysées

Huit solutions standards d’urine spikée, préparées en triplicat à partir d’une solution stock de salbutamol à des concentrations en salbutamol de 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 100.0 ng/ml, ont été analysées

L’homogénéité des variances a été vérifiée en utilisant le test de Cochran et de Levene selon les rapports obtenus chaque jour, ainsi que sur le total des trois jours. En fonction des résultats obtenus, une analyse de régression linéaire a pu être appliquée. Les valeurs de la pente, ainsi que de l’ordonnée à l’origine ont été déterminées, un test-t de Student (la méthode des moindres carrés) avec un intervalle de confiance de 95% les donnant comme significative.


8.6.2 Spécificité-sélectivité La spécificité d’une procédure analytique est sa capacité à établir de manière univoque l’existence de la substance à analyser en présence d’autres composants potentiellement présents. Ces composés comprennent classiquement d’autres substances médicamenteuses présentes dans la matrice, les produits de dégradation, les impuretés et la matrice.

8.6.2.1 Influence de la matrice: Afin d’éliminer au maximum les pics parasites provenant de la matrice, une extraction de type SPE a été réalisée comme décrit précédemment (8.4.2.7,8.4.2.8). Durant la prévalidation et la validation 15 plasmas de donneurs anonymes différents ont été utilisés. Nous n’avions aucune donnée sur l’éventuelle consommation médicamenteuse de ces personnes.

8.6.2.2 Influence des produits de dégradation: Afin de mettre en évidence d’éventuelles interférences entre le salbutamol et ses produits de dégradation, nous avons comparé les chromatogrammes obtenus avec des solutions contenant uniquement l’analyte et ceux obtenus avec des solutions tests. Les produits de dégradation ont été générés en soumettant une solution de salbutamol à différentes conditions de stress.

Quatre conditions différentes ont été testées: milieu acide, milieu basique, chaleur et oxydation:

♦ Dégradation en milieu acide: la solution de salbutamol est agitée pendant 1 heure avec une solution d’HCl 5N; une partie de la solution a par la suite encore été chauffée à reflux pendant 1 heure.

♦ Dégradation en milieu basique: la solution de salbutamol est agitée pendant 1 heure avec une solution de NaOH 5N, une partie de la solution a part la suite encore été chauffée à reflux pendant 1 heure.

♦ Dégradation par la chaleur: la solution a été chauffée à reflux pendant 1 heure

♦ Dégradation par oxydation: la solution de salbutamol est agitée pendant 1 heure en présence d’une solution d’eau oxygénée.

Les échantillons soumis aux stress basiques et acides ont été neutralisés avant d’être analysés.

Les solutions ont été analysées selon les conditions urinaires et plasmatiques, ainsi qu’avec un gradient allant de 10 à 90%.


8.6.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement Chaque jour, quatre contrôles de qualité, préparés en quatre exemplaires à partir d’une solution de 0.5 μg/ml de salbutamol à des concentrations de 1.0, 2.0, 3.75, 6.25 ng/ml pour la méthode plasmatique et des concentrations de 5, 10.0, 25.0, 40.0, 100.0 ng/ml pour la méthode urinaire, ont été analysés. Chaque valeur obtenue a été recalculée avec la régression linéaire du jour correspondant.

Le recouvrement est obtenu en divisant le rapport des surfaces salbutamol/étalon interne recalculé par le rapport théorique des mêmes surfaces et en le multipliant par 100.

8.6.4 Rendement d’extraction Les rapports de surface salbutamol/étalon interne de la gamme de calibration obtenus après extraction ont été comparés à ceux obtenus dans les mêmes concentrations directement dans la phase mobile.

Les analyses ont été réalisées des jours différents avec des opérateurs différents permettant d’analyser la fidélité intermédiaire

8.6.5 Limite de détection - Limite de quantification La limite de détection d’une procédure d’analyse est la plus petite quantité de l’analyte dans un échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée comme une valeur exacte dans les conditions expérimentales décrites de la procédure.

La limite de quantification est la plus petite quantité de l’analyte dans un échantillon pouvant être dosée dans les conditions expérimentales décrites avec une exactitude définie.

Ces critères ont été détermnés durant la prévalidation des deux méthodes.

8.6.6 Etude de stabilité 8.6.6.1 Etude de stabilité du salbutamol dans le plasma: Des solutions plasmatiques spikées de salbutamol 3.5 ng/ml ont été aliquotées et conservées à température ambiante, au frigo et au congélateur à –20°C. Des analyses en triplicat à J0, J1, J3 et J7 ont été réalisées pour déterminer la stabilité de telles solutions.

8.6.6.2 Etude de stabilité du salbutamol dans l’urine: Des solutions urinaires spikées de salbutamol à 40 ng/ml ont été aliquotées et conservées au frigo et au congélateur à –20°C. Des analyses en triplicat à J0, J3 et J13 ont été réalisées pour déterminer la stabilité de telles solutions.

100

Chapitre 9

9 Résultats et discussion

9.1 Les conditions analytiques 9.1.1 Extraction Comme présenté auparavant la colonne Bond-Elut®-Si a été retenue pour l’extraction du plasma et de l’urine et nous a permis de valider les méthodes analytiques.

Toutefois les caractéristiques de la colonne d’extraction Bond Elut®-Si ne la désignent pas comme étant la plus favorable pour l’extraction d’échantillons aqueux (plasma et urine). En effet avec ce type de colonne l’interaction avec l’analyte est polaire, la silice étant chargée négativement et l’analyte positivement, l’ajout d’eau perturbe donc l’interaction.

Peu de problèmes ont été rencontrés lors de l’extraction plasmatique, les chromatogrammes obtenus étant très épurés. Par contre lors des essais réalisés avec l’urine, si les chromatogrammes obtenus étaient propres, le rendement d’extraction était plus faible, mais surtout fluctuant. Les premiers tests ayant été réalisés avec des colonnes Bond-Elut®- Si 100mg, nous avons augmenté la capacité de la cartouche, afin d’améliorer la rétention du salbutamol. Nous arrivions en effet à une linéarité acceptable pour les concentrations allant jusqu’à 25 ng/ml, les concentrations plus hautes nous donnant des résultats peu reproductibles. Cependant ce changement n’a pas permis d’améliorer de façon satisfaisante l’extraction.

L’ajout d’acide phosphorique aux échantilllons plasmatiques

Chapitre 9 Résultats et discussion 101

et urinaires a permis d’épurer nettement les chromatogrammes et libère le salbutamol de sa liaison aux protéines. Cet ajout n’a pas perturbé l’extraction plasmatique. Par contre lors de l’extraction la matrice urinaire, il a fait chuter le pH aux environs de 3. A ce pH la fonction phénolique du salbutamol se trouve sous forme non ionisée, tandis que la fonction amine est protonée., ces conditions ne sont pas optimales pour l’extraction. C’est pourquoi nous avons tamponné les échantillons avec le tampon de PBS CHUV. Ainsi nous obtenons un rendement d’extraction régulier de plus de 90% également.

Afin d’améliorer l’extraction et de travailler dans des conditions optimales, des tests d’extraction seront encore faits prochainement avec des colonnes du type Focus® (Varian, Harbor City, CA, USA, art. ), Extrelut® NT3 (Merck, Darmstadt, Allemagne art.), et Chromabond XTR (Macerey-Nagel, Düren, Germany, art.)

9.1.1.1 Rendement d’extraction Les deux méthodes plasmatique et urinaire ont donné un rendement d’extraction supérieur à 90%, les résultats détaillés se trouvent dans les Annexes 3.2.7 et 4.2.7

9.2 Procédures de validation Une prévalidation a été effectuée préalablement selon le guide SFSTP. L’homogénéité des variances a été déterminée selon les tests de Cochane et Levene:

Plasma: test de Cochane: 0.5209 (doit être inférieur à 0.3726)

Test de Levene: 2.92 (doit être inférieur à 2.27)

Urine: test de Cochane: 0.3487 (doit être inférieur à 0.3726)

Test de Levene: 4.77 (doit être inférieur à 2.27)

Les valeurs trouvées sont légèrement supérieures aux valeurs théoriques, mais nous avons considéré ces valeurs comme acceptables pour valider nos deux méthodes selon le modèle de regression linéaire.

Les résulats de ces deux validations se trouvent dans les Annexes 3.2.8 et 4.2.8.

9.2.1 Linéarité La linéarité de la méthode plasmatique a été testée entre 0.8 ng/ml et 100 ng/ml, mais la validation s’est portée sur un intervalle allant de 1.0 ng/ml à 7.5 ng/ml. La limite inférieure n’a pu être validée. Un test préliminaire chez trois volontaires sains nous a montré que les concentrations de salbutamol se trouvaient autour de 1ng/ml et nous avons donc resserré botre intervalle de dosage.

Afin d’essayer d’abaisser le seuil de quantification, les transformations suivantes ont été

envisagées après pondération: z’ = z , z’ = 1/z, z’ = ln(z). Bien que le modèle z’ = z


permette d’abaisser légèrement notre seuil de quantification (0.9 ng/ml), nous avons retenu pour des raisons pratiques le modèle de régression linéaire.

L’adéquation du modèle de regression est ensuite évaluée sur la base du test de manque d’ajustement (cf Annexes 3.2.2 et 4.2.2).

La régression linéaire calculée donne les équations suivantes:

9.2.1.1 Méthode plasmatique Courbe de validation: Vérification de la linéarité (faite à partir

des standards de validation) (cf Figure 29):

Jour 1: y = 0.047 x – 0.003 y = 0.988 x + 0.052

Jour 2: y = 0.043 x +0.008 y= 1.032 x + 0.072

Jour 3: y = 0.044 x + 0.004 y = 0.992 x - 0.03

Figure 29 Vérification de la linéarité de la méthode plasmatique

Les valeurs recalculées donnent un RSD inférieur à 10.9% à chaque niveau de concentration (cf Annexe 3.2.4).

9.2.1.2 Méthode urinaire Courbe de validation: Vérification de la linéarité (faite à partir

des standards de validation) (cf Figure 30):

Jour 1: y = 0.044x + 0.017 y = 0.985 x + 0.491

Jour 2: y = 0.043 x + 0.034 y = 1.009 x – 0.413

Jour 3: y = 0.045 x + 0.01974 y = 0.979 x + 0.304

Figure 30 Vérification de la linéarité de la méthode urinaire

Les valeurs recalculées donnent un RSD inférieur à 5.5% à chaque niveau de concentration (cf Annexe 4.2.4).

En ce qui concerne la linéarité de la méthode, c’est-à-dire de la relation existant entre les concentrations calculées avec les standards de validation et les concentratkions introduites, nous avons vérifié pour les deux méthodes que les limites de confiance de la pente sont comprises entre 0.85 et 1.15.


9.2.2 Spécificité-sélectivité Après comparaison des chromatogrammes des tests de dégradation et ceux des analyses plasmatique ou urinaire du salbutamol, aucune interférence générée par les produits de dégradation ou les différentes matrices pouvant prétériter la qualité des dosages n’a été mise en évidence.

9.2.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement 9.2.3.1 Méthode plasmatique Le coefficient de répétabilité varie par niveau de concentration entre 2.5% et 10.9 %

L’exactitude de procédure obtenue à partir des standards de validation varie entre 77% et 117%. (cf Figures 9)

Les résultats détaillés se trouvent dans l’Annexe 3.2.5

9.2.3.2 Méthode urinaire Le coefficient de répétabilité varie par niveau de concentration entre 2.9% et 5.5 %

L’exactitude de procédure obtenue à partir des standards de validation varie entre 90% et 111%( cf Figures 11).

Les résultats détaillés se trouvent dans l’Annexe 4.2.5.

9.2.4 Seuils de détection et de quantification 9.2.4.1 Méthode plasmatique Seuil de détection: 0.25 ng/ml

Seuil de quantification: 1.0 ng/ml

9.2.4.2 Méthode urinaire Seuil de détection: 0.4 ng/ml

Seuil de quantification: 5.0 ng/ml

Le critère d’exactitude n’a pas permis d’atteindre des valeurs plus basses. La prévalidation des méthodes plasmatique et urinaire nous a donné un seuil de détection de 0.25 ng/ml, respectivement de 0.4 ng/ml et comme seuil de quantification 0.7 ng/ml, respectivement 3.4 ng/ml. Cependant nous n’avons pu confirmer ces résultats lors de la validaiton.

9.2.5 Etudes de stabilité Les études de satbilité ont été réalisées à une seule concentration de salbutamol. Ces résultats sont donc indicatifs, mais demandent confirmation par une étude plus complète, intégrant le seuil de quantification et la concentration maximale de l’intervalle de dosage.

Stabilité plasmatique du salbutamol:


Les résultats obtenus sont détaillés dans le Tableau 13.

Tableau 13 Données de stabilité du salbutamol dans le plasma.

J0 J1 J3 J7

Conc.

[ng/ml]

% Conc.

[ng/ml]

% Conc.

[ng/ml]

% Conc.

[ng/ml]

%

T° ambiante 3.5 100 3.2 91.9 4.1 116.5 / / Frigo 3.5 100 3.2 91.4 4.2 118.9 3.4 96.3 Congélateur 3.5 100 3.3 95.1 3.4 97.5 3.3 95.2

L’analyse des échantillons plasmatiques a été réalisée directement après les prélèvements. Nous n’avons donc sains pas tenu compte lors du test chez les volontaires des données de stabilité obtenues(cf Tableau 13).

9.2.5.1 Stabilité urinaire du salbutamol: Les données dans la littérature sont controversées quant à la stabilité du salbutamol dans l’urine. En effet la plupart des auteurs récoltent l’urine et la congèlent à –20°C pour l’analyser plus tard, sans spécifier s’ils ont effectué une étude de stabilité prouvant la stabilité du salbutamol dans de telles conditions. D’autres études montrent une stabilité de 45 jours que ce soit à température ambiante, au frigo ou au congélateur. Cependant, dans le milieu du dopage, où le salbutamol est utilisé afin d’augmenter la masse musculaire, beaucoup de questions se posent quant à sa stabilité. Les analyses réalisées dans le milieu sportif doivent permettre de différencier l’administration du salbutamol par aérosol, utilisation permise en cas d’asthme dû à l’effort, de celle orale, prohibée car utilisée en vue d’obtenir un effet anabolisant. Lors du 19ème congrès de Cologne sur les analyses des produits dopants, Henze [133] traitant des réactions du salbutamol et du reproterol avec la matrice urinaire a étudié la stabilité du salbutamol. Cette étude a montré (cf Tableau 14) qu’après un mois de conservation à +4°C et –18°C, on ne retrouve dans les urines que 15% de la dose de départ.

Tableau 14 Données de stabilité du salbutamol dans l’urine.

Jo J3 J13

Concentration % Concentration % Concentration % Frigo 40.0 ng/ml 100 38.8 ng/ml 96.97 39.2 ng/ml 97.92 Congélateur 40.0 ng/ml 100 39.8 ng/ml 99.58 34.8 ng/ml 87.10

Nous avons analysé les échantillons urinaires des volontaires sains 1 jour après les avoir conservés au frigo. L’étude de stabilité réalisée nous permettait de le faire tout en restant dans des valeurs acceptables.


L’étude de stabilité urinaire sera poursuivie sur une durée d’un mois.

9.3 Etude chez les volontaires sains Le but de cette étude était de tester les méthodes mises au point afin de s’assurer que leur sensibilité soit suffisante et que les valeurs obtenues correspondent à celles trouvées dans la littérature.

Le protocole soumis à la commission d’éthique concernait la nébulisation mécanique. Dans ce test nous avons simplement nébulisé le salbutamol à l’aide d’un nébuliseur pneumatique à double venturi avec embout buccal sans essayer de simuler la ventilation mécanique.

Nous n’avons effectué aucun calcul de pharmacocinétique sur ces résultats, cette étude n’y étant pas destinée.

Les résultats obtenus lors du dosage plasmatique du salbutamol sont présentés dans le dans la Figure 31:

Figure 31 Dosage plasmatique du salbutamol chez cinq volontaires sains

Chez les deux volontaires sains ayant reçu 10 mg de salbutamol, le dosage plasmatique montre que nous sommes dans l’intervalle de linéarité jusqu’à 4 heures, puis les taux descendent en dessous de 1 ng/ml. Chez les trois autres volontaires sains, la limite de quantification de notre méthode ne nous permet d’effectuer des dosages validés que jusqu’à 60 minutes post inhalation. La dose de 10 mg de salbutamol n’étant pas la dose recommandée de traitement (2.5 et 5 mg), elle ne sera par conséquent pas utilisée lors des travaux ultérieurs chez les volontaires sains.


Il est à relever que cette étude porte sur la nébulisation avec respiration spontanée. Lors de ventilation mécanique, le dépôt pulmonaire sera certainement inférieur. La méthode de dosage plasmatique doit donc encore être affinée, surtout son extraction afin d’obtenir un seuil de quantification plus bas.

Les résultats obtenus lors du dosage plasmatique du salbutamol sont présentés dans la Figure 32

Figure 32 Dosage urinaire du salbutamol chez cinq volontaires sains

Les concentrations urinaires obtenues, sont dans le domaine de linéarité de la méthode développée. En effet, seul le t = 24 h est légèrment inférieur à 5 ng/ml chez les patients ayant reçu 5 mg de salbutamol. Cette méthode semble donc appropriée pour une étude pharmacocinétique de nébulisation du salbutamol. Cependant la stabilité controversée du salbutamol dans l’urine implique un dosage dans les 3 jours suivant la récolte urinaire selon les résultats de notre étude de stabilité. Ceci est une contrainte quant à l’utilisation de cette méthode pour déterminer les taux de salbutamol après nébulisation.

Les résultats obtenus concordent avec ceux de la littérature dans les mêmes conditions.

Le résultat de l’analyse pharmacocinétique des données obtenues chez les volontaires sains sera également très important pour faire un choix entre la méthode urinaire et la méthode plasmatique.

9.4 Conclusion Ce mémoire consittuanttant la première partie du travail de thèse, il nous a permis de nous familiariser avec les extractions de matrices biologiques et de nous plonger dans la


problèmatique plus particulière du salbutamol. Nous avons pu valider deux méthodes, l’une pour l’analyse plasmatique du salbutamol et l’autre pour son analyse urinaire. Cette validation a été réalisée selon les recommandations de la SFSTP dans le but de travailler avec une méthode fiable donnant des résultats sûrs.

L’étude réalisée sur un nombre restreint de volontaires sains servant à tester ces deux méthodes d’analyse a montré que si la méthode urinaire pouvait être utilisée, la méthode plasmatique doit encore être améliorée afin de mieux rendre compte des concentrations obtenues lors de la nébulisation. L’amélioration touchera principalement le mode d’extraction. En effet la matrice utilisée pour l’extraction SPE du plasma et de l’urine, ne fait pas partie des matrices recommandées. Elle serait même plutôt déconseillée pour les matrices aqueuses. Les prochains mois seront consacrés encore certaienemt à compléter ces essais d’extraction afin de consolider la méthode de dosage.

Ce travail a également permis de tester le protocole qui sera appliqué chez les volontaires sains sous ventilation mécanique et d’en optimiser son déroulement. Ceci sera utilisé pour confirmer les résultats obtenus dans l’étude préliminaire in vitro sur la nébulisation du salbutamol lors de ventilation mécanique réalisée par Ermindo Di Paolo [29].

108

Chapitre 10

10 Conclusion générale

La ventilation mécanique (VM) ou artificielle a pris une place de plus en plus importante dans le traitement des patients en défaillance respiratoire. Il est possible d’administrer des aérosols médicamenteux chez les patients sous ventilation mécanique. Cependant il y a encore peu de recommandations concernant ce mode d’administration des médicaments. Le pharmacien, responsable de la bonne administration des médicaments, a un rôle à jouer dans l’investigation d’une telle pratique.

Nous nous sommes tout d’abord attachés à analyser l’influence de la nébulisation sur les paramètres physico-chimiques des solutions de salbutamol durant la nébulisation, ainsi qu’à évaluer la délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique selon trois modes d’administration différents. Les résultats obtenus contredisant les recommandations américaines, il était important de passer à des études in vivo, afin de confirmer ces résultats.

Il faut souligner que cette première étude in vitro a déjà fait évoluer les pratiques aux Soins I(ntensifs de Pédiatrie puisque l’utilisation de salbutamol, largement répandu auparavant chez les jeunes patients sous ventilation mécanique, a sensiblement diminué.

Ce travail de mémoire constitue la première étape d’un travail de thèse dont le but est de confirmer que l’administration en mode inspirium est plus efficace qu’en mode expirium chez des enfants sous ventilation mécanique. Cette première phase a permis de se familiariser avec l’administraton des aérosols en général et sous ventilation

Chapitre 10 Conclusion générale 109

mécanique en particulier.

Après l’acceptation par la commission d’éthique du CHUV d’un protocole d’étude chez les volontaires sains, dont les résultats ont pour but de justifier une étude chez l’enfant malade, deux méthodes d’analyse du salbutamol dans le plasma et l’urine ont été développées et validées. Ces deux méthodes ont également été testées in vivo chez cinq volontaires sains afin de s’assurer de leur adéquation au but recherché. Si la méthode urinaire peut être utilisée telle quelle, la méthode plasmatique devra encore être améliorée notamment dans son étape d’extraction, amélioration qu constituera l’objectif prioritaire ces prochains mois.

110

Chapitre 11

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132. SFSTP, C., N. Présidents: Chapuzet, and N. Mercier, Méthodes chromatographiques de dosage dans les milieux biologiques: stratégie de validaition. Rapport d'une commission SFSTP. S.T.P. Pharma Pratiques, 1997. 7(3): p. 169-194.

133. Henze, M.K., H. Spanh-Langguth, and W. Schanzer, Reactions of Salbutamol and Reproterol with urine matrix components-preliminary results. 19th Cologne Workshop on Dope Analysis 18th to23rd march 2001, 2001: p. 29-33.

119

Chapitre 12

12 Annexes

Annexe 1

1 Protocole volontaires sains Protocole de recherche soumis à la commission d'éthique de la recherche clinique de la faculté de médecine

Optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l'enfant sous ventilation mécanique :

Etude préalable chez le volontaire sain

Après correction selon la Commission d’Ethique de la recherche clinique du 9 septembre 2002

Annexe 1 Protocole volontaires sains 2

1.1 Date de l'envoi du protocole à la commission d'éthique 19 août 2002

1.2 Date prévue pour le début de l'étude Dès acceptation du protocole

1.3 Investigateurs 1.3.1 Investigateurs responsables :

♦ Dr. J. Cotting, médecin associé, Unité des Soins intensifs de Pédiatrie, CHUV.

♦ Pr. A. Pannatier, pharmacien chef, Service de Pharmacie, CHUV.

1.3.2 Investigateur principal : ♦ A.-L. Sidler-Moix, pharmacienne, Service de Pharmacie, CHUV.

1.3.3 Co-investigateurs : ♦ Dr. M. Berger, pharmacienne, Service de Pharmacie, CHUV.

♦ Dr. E. Di Paolo, pharmacien d'hôpital FPH, Service de Pharmacie, CHUV.

1.3.4 Lieu de l'étude : ♦ Soins intensifs médico-chirurgicaux de Pédiatrie, CHUV, Lausanne

1.4 Mise en perspective de l'étude : 1.4.1 Etat des connaissances : 1.4.1.1 La nébulisation Les nébulisateurs pneumatiques sont des dispositifs médicaux souvent utilisés pour l’administration de médicaments en inhalation chez des patients hospitalisés dans les unités de soins intensifs1-3.

En Suisse différentes molécules sont commercialisées pour la nébulisation en pneumologie : six β2-sympathomimétiques, un anticholinergique, deux antiallergiques, quatre corticoïdes, quatre mucolytiques, la DNase recombinante humaine (rhDNase) pour les complications respiratoires de la mucoviscidose, un antibiotique polypeptidique utilisé en cas d’infection à Pseudomonas aeruginosa chez les patients mucoviscidosiques, un inhibiteur de la neuraminidase utilisé dans le traitement de la grippe A ou B et finalement la pentamidine un agent chimiothérapeutique utilisé lors d’infections causées par le Pneumocystis carinii4.


Peu de données concernant la posologie de ces médicaments chez l’enfant sont disponibles. De plus les données précises concernant le dépôt pulmonaire chez l’enfant sont rares5. En clinique, la déposition pulmonaire peut être estimée directement par le marquage radioactif d’une substance nébulisée, plus rarement par son dosage dans les sécrétions bronchiques, le lavage broncho-alvéolaire, ou indirectement par le dosage de la substance dans le sérum ou les urines, reflétant l’absorption systémique5.

Actuellement les nébulisateurs pneumatiques sont encore les dispositifs les plus couramment utilisés pour l’administration de β2-adrénergiques lors de bronchospasmes sévères. Le problème de leur utilisation chez les enfants est essentiellement liée à l’incoordination due à l’âge entre la phase de déclenchement et celle de l’inspiration6. Chez les adultes, la littérature promeut de plus en plus l’utilisation des aérosols-doseurs pressurisés7-9 et des inhalateurs de poudre multidoseurs10 ; leur utilisation chez les enfants est sujette à controverse dans le traitement des bronchospasmes sévères pour la raison évoquée précédemment.

Chez les enfants comme chez les adultes, le succès d’une thérapie par aérosols dépend de la capacité à délivrer une dose suffisante de médicament au niveau du site actif avec le moins d’effets secondaires possible. Les avantages de l’utilisation d’aérosols en comparaison à d’autres formes de thérapie sont la facilité d’utilisation, l’efficacité avec des doses plus petites que celles nécessaires lors de l’administration intraveineuse et la rapidité de réponse au traitement6.

Il est à noter cependant que chez l’enfant en bas âge et le jeune enfant, les paramètres respiratoires sont de première importance pour déterminer la quantité d’aérosol inhalé au niveau des poumons. Les enfants ayant des volumes inspiratoires plus bas, ceci se traduit par une délivrance réduite des principes actifs6,11,12. Aujourd’hui, l’aérosolisation des médicaments est encore effectuée de manière relativement empirique, car de nombreux facteurs, susceptibles d’influencer l’efficacité du traitement, sont mal maîtrisés4.

1.4.1.2 Le salbutamol Parmi les bronchodilatateurs nébulisés, le salbutamol est le plus utilisé13 pour traiter les adultes ainsi que les enfants ventilés artificiellement et atteints d’asthme aigu grave ou de bronchospasme post-opératoire sévère. Un traitement bronchodilatateur par voie pulmonaire permet d’améliorer rapidement la fonction respiratoire des enfants et d’éviter, la plupart du temps, le recours à la voie parentérale, dont le rapport risque/bénéfice est moins favorable14,15.

Le salbutamol est un agoniste des récepteurs β2-adrénergiques. Via le complexe des protéines G, il active une enzyme membranaire, l'adénylate cyclase, qui augmente le taux intracellulaire d'AMP cyclique. Ceci conduit à une stimulation de la protéine kinase A, qui catalyse la phosphorylation, à partir de l'ATP, de différents substrats et enzymes propres aux cellules du tissu-cible14,16-18. Son action principale est la relaxation des muscles lisses bronchiques14. Le salbutamol semble également exercer un effet inhibiteur sur la libération des médiateurs de l'inflammation, stimuler la fonction mucociliaire, diminuer la perméabilité microvasculaire et probablement inhiber la phospholipase A214,16.


Le salbutamol, qui est un agoniste de courte durée d'action (4 à 6 heures), atteint son effet maximum en 60 minutes, dont 80% après 5 minutes19. Les effets indésirables sont essentiellement liés à l'absorption systémique. Ils s'observent donc principalement lors d'inhalation de doses importantes ou lors d'utilisation par voie orale : tremor (surtout des mains), tachyphylaxie, tachycardie, arythmie. Maux de gorge, enrouement, céphalées, nausées se manifestent parfois lors de l'inhalation de doses normales14,20. L'utilisation à long terme pourrait induire une tolérance et aboutir à une diminution de l'intensité et de la durée de l'effet21,22.

1.4.1.3 La ventilation mécanique Un petit nombre des études cliniques réalisées en matière de nébulisation concerne des patients sous ventilation mécanique. Les études réalisées dans ce domaine se sont principalement intéressées à la nébulisation de bronchodilatateurs. Toutefois il n’existe que peu de données montrant un bénéfice des traitements par inhalation chez des patients sous ventilation mécanique en terme de morbidité ou de mortalité. Dans une étude évaluant le niveau de pertinence scientifique des recommandations sur la nébulisation lors de ventilation mécanique23, seule la nébulisation de β2–agonistes ou d’anticholinergiques en cas de bronchospasme atteint le niveau d’utilité probable, les autres indications que sont l’infection à VRS (virus respiratoire syncytial et la dysplasie broncho-pulmonaire de l’enfant, l’ARDS (syndrome de détresse respiratoire aiguë), l’infection broncho-pulmonaire et l’HTAP (hypertension artérielle pulmonaire) n’obtiennent que le grade d’utilité possible, c’est-à-dire qu’elles ne reposent que sur des opinions d’experts.

Alors que l’utilisation thérapeutique de l’aérosol est largement pratiquée en pneumologie, la nébulisation sous ventilation mécanique est globalement peu utilisée et de façon très hétérogène24, du fait sans doute d’une connaissance imparfaite de ses modalités techniques, et des limites des études cliniques.

La nébulisation, qu’elle soit en ventilation mécanique ou non, a pour objectif de déposer une grande quantité de principe actif au site à traiter en minimisant sa diffusion systémique et donc ses effets secondaires. De nombreux facteurs peuvent influencer ce dépôt pulmonaire lors de la ventilation mécanique25,26, liés au ventilateur, au système de nébulisation, au circuit et au patient. La ventilation mécanique a pour but de corriger l’acidose respiratoire et l’hypoxémie de l’enfant intubé2. Les pressions produites doivent être suffisantes pour assurer une entrée d’air acceptable. Le mode de ventilation peut être volumétrique ou barométrique selon l’âge du patient et les écoles. Aucun mode ventilatoire n’a fait la preuve de sa supériorité sur un autre3. Chez l’adulte, le mode volumétrique est recommandé1, tandis que chez le nouveau-né, les ventilateurs sont barométriques27, car des changements de pression peuvent être délétères chez des nourrissons de 1 an avec bronchospasme très sévère (risque de barotraumatisme). Chez un enfant intubé, un aérosol peut être administré en utilisant soit le mode de propulsion du ventilateur lui-même, soit un flux de gaz continu externe pour actionner le nébuliseur pneumatique. Selon les dernières recommandations américaines28,29 les nébuliseurs doivent être placés sur le tuyau inspiratoire du circuit de ventilation à une distance de 10 à 30 cm du tube endotrachéal et être actionnés uniquement durant l’inspiration.


Une étude sur un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique30-32 conduite dernièrement au CHUV, a abouti à des résultats opposés aux recommandations américaines et britanniques. Réalisée entre 1996 et 2000, cette étude poursuivait les buts suivants, comparant in vitro les performances de six modèles de nébulisateurs pneumatiques : 1) tester différents paramètres physico-chimiques, comme les variations d’osmolalité, de taille des particules, de concentration en principe actif, de température et de pH de solutions de salbutamol au cours de la nébulisation32; 2) évaluer la délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique selon trois modes d’administration différents : durant l’inspiration, l’expiration ou en continu (figure 1). Les résultats obtenus contredisent les recommandations citées précédemment, puisque le mode standard (nébulisation pendant l’inspiration) est le moins efficace. Le mode de nébulisation durant l’expirium (activité durant la phase inspiratoire du cycle ventilatoire) est celui ayant donné les meilleurs résultats (environ 300x plus efficace suivant le modèle de nébulisateur). Ceci peut s’expliquer par le fait que durant l’expiration, le nébuliseur est activé et le tuyau inspiratoire se remplit de l’aérosol. Ensuite, pendant l’inspiration suivante, l’aérosol atteint le bout du tube endotrachéal.

Figure 1


Tableau 1 Le tableau suivant résume quelques résultats obtenus lors de cette étude, montrant clairement la supériorité de la distribution de l’aérosol en mode expirium : Délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle pédiatrique in vitro

Nébuliseur Mode de Nébulisation Proportion de PA

Proportion de PA

Proportion de PA

Proportion de PA

inhalé (%)a b expiré (%)a b restant dans

le nébuliseur (%)a b

déposé ailleurs ds le circuit (%)a b

Microneb A Intermittent/Inspirium b 0.3 ± 0.1 7.2 ± 0.8 85.3 ± 0.7 7.2 ± 0.9 B Continu b 1.5 ± 0.2 19.1 ± 2.4 71.3 ± 3.5 8.1 ± 1.8 C Intermittent/Expirium c 2.7 ± 0.9 10.0 ± 2.8 81.6 ± 3.3 5.7 ± 3.5 D Continu/Externe b 1.9 ± 0.2 11.9 ± 1.6 77.6 ± 2.4 8.6 ± 3.0 Sidestream A Intermittent/Inspirium b 2.7 ± 0.6 31.8 ± 4.1 50.0 ± 7.8 15.5 ± 3.3 B Continu b 5.0 ± 0.7 44.2 ± 0.7 32.4 ± 1.6 18.4 ± 2.5 C Intermittent/Expirium c 9.0 ± 1.9 39.8 ± 4.7 32.3 ± 2.5 18.9 ± 6.4 D Continu/Externe b 5.4 ± 0.5 46.5 ± 1.2 31.9 ± 2.5 16.2 ± 2.9 Acorn II A Intermittent/Inspirium b 0.8 ± 0.1 17.4 ± 1.5 72.4 ± 5.2 9.4 ± 3.8 B Continu b 5.8 ± 0.6 47.4 ± 2.9 28.9 ± 2.9 17.9 ± 0.9 C Intermittent/Expirium c 7.2 ± 2.0 28.7 ± 7.9 37.3 ± 5.0 26.8 ± 12.7 D Continu/Externe b 4.6 ± 0.8 35.8 ± 6.9 36.0 ± 6.1 23.6 ± 12.7 Cirrus A Intermittent/Inspirium b 1.8 ± 0.3 29.1 ± 5.0 55.3 ± 7.1 13.8 ± 5.0 B Continu b 3.5 ± 0.7 28.9 ± 7.8 26.8 ± 7.4 40.8 ± 14.5 C Intermittent/Expirium c 4.7 ± 1.2 23.6 ± 10.9 42.6 ± 9.8 29.1 ± 16.7 D Continu/Externe b 3.4 ± 0.7 30.4 ± 9.3 30.9 ± 3.7 35.3 ± 7.8 Upmist A Intermittent/Inspirium b 3.4 ± 0.6 30.4 ± 3.0 51.4 ± 8.1 14.8 ± 4.8 B Continu b 3.8 ± 0.7 33.7 ± 4.7 46.6 ± 7.0 15.9 ± 3.5 C Intermittent/Expirium c 7.1 ± 1.3 30.1 ± 7.4 43.2 ± 8.0 19.6 ± 10.0 D Continu/Externe b 4.0 ± 0.5 37.5 ± 2.2 43.0 ± 2.2 15.5 ± 2.3 Micro Mist A Intermittent/Inspirium b 2.6 ± 0.3 31.7 ± 2.4 51.4 ± 3.2 14.3 ± 2.5 B Continu b 4.7 ± 0.2 39.1 ± 2.4 41.9 ± 2.1 14.3 ± 1.7 C Intermittent/Expirium c 8.3 ± 0.6 34.9 ± 2.6 43.1 ± 3.7 13.7 ± 1.7 D Continu/Externe b 5.6 ± 0.4 45.6 ± 3.6 33.9 ± 3.0 14.9 ± 1.6

a. Moyenne ± écart-type (n = 5 ), exprimée en % de la dose initiale de salbutamol sulfate.

b. Nébuliseurs à une distance de10 cm de la pièce en Y.

c. Nébuliseurs à une distance de120 cm de la pièce en Y.


1.4.2 Buts de l'étude : ♦ Démontrer que la délivrance pulmonaire de la nébulisation en mode expirium est

plus efficace qu’en mode inspirium en déterminant les taux sériques de salbutamol chez des volontaires sains dans un premier temps (objet de ce protocole), puis chez des enfants sous ventilation mécanique. Pour cette seconde phase, un nouveau protocole sera soumis.

♦ Confirmer la différence entre le nébulisateur ayant la délivrance la plus faible dans l’étude in vitro et celui considéré comme le plus efficace.

♦ Développer une méthode analytique permettant l’utilisation d’une quantité minimale de sang pour le dosage du salbutamol administré par nébulisation.

♦ Montrer une corrélation possible entre le dosage urinaire et le dosage sanguin du salbutamol dans les mêmes conditions.

1.4.3 Justification : Nous avons réalisé une étude in vitro sur l'optimisation de la nébulisation entre 1996 et l’année 2000. Dans cette étude un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique a été développé permettant de déterminer la délivrance d'aérosols de salbutamol dans des conditions standardisées. Trois modes d'administration des aérosols avec propulsion des nébulisateurs par le ventilateur ont été étudiés : nébulisation durant l'inspirium, continue et durant l'expirium. Le quatrième mode décrit est une simulation des anciens ventilateurs n’ayant pas de modalité de ventilation et dont le flux d’air provenait d’une bouteille de gaz. Cette étude a montré que le mode standard de nébulisation (nébulisation pendant l'inspiration) est le moins efficace. Ces résultats contredisent les dernières recommandations américaines28,29.

Le modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique, développé pour déterminer la quantité inhalée d'aérosol, représente un moyen simple, sûr et économique. Il présente néanmoins les limites d'une étude in vitro où les conditions d’expérience sont contrôlées et idéalisées, ne correspondant pas forcément à la situation clinique. Par conséquent, il est fondamental de confirmer ces résultats par une étude in vivo.

L’absorption des médicaments chez les patients atteints de pathologies respiratoires étant différente de celle observée chez les volontaires sains, il sera indispensable de confirmer les résultats de ce premier travail par une étude portant directement sur la population concernée. Cette première étude est indispensable en vue de celle à effectuer sur les patients qui ne sera initiée que si les résultats obtenus chez les volontaires sains le justifient. De plus, elle permettra de développer une méthode de dosage la moins invasive possible. Une comparaison des dosages plasmatique et urinaire sera ainsi faite dans le but de réaliser par la suite, si une équivalence peut être établie entre les deux méthodes, uniquement des prélèvements urinaires.


1.4.4 Méthodes Pour l’analyse des prélèvements sanguins deux techniques seront utilisées :

HPLC (high pressure liquid chromatography) : c’est un procédé de séparation avec une phase mobile liquide et une phase stationnaire, contenue dans une colonne, constituée par un solide de fine granulométrie ou par un solide imprégné d’un liquide ou par un solide sur lequel des groupes organiques ont été greffés. La chromatographie liquide est fondée sur des phénomènes d’adsorption, de partage, d’échange d’ions ou d’exclusion. L’appareillage est constitué généralement par un système de pompe, un injecteur, un détecteur et un enregistreur. Le système de détection utilisé doit permettre de déterminer les quantités des substances présentes dans l’effluent. Dans notre étude nous utiliserons un détecteur UV-visible, détecteur le plus utilisé en HPLC.

LC-MS : il s’agit d’un procédé de séparation qui couple la spectrométrie de masse (voir ci-dessous) et la chromatographie en phase liquide (voir ci-dessus).

La spectrométrie de masse (MS) est une méthode permettant de déterminer la composition, la structure et la masse moléculaire des composés. Son principe repose sur l’ionisation des molécules et leur déplacement dans un champ électrique et/ou magnétique, puis de leur détection au moyen d’un analyseur approprié. La grande quantité d’énergie fournie à la molécule lors de l’ionisation peut provoquer la rupture des liaisons inter-atomiques et donner ainsi naissance à des fragments chargés caractérisés par le rapport de leur masse sur leur charge. Les fragments sont ensuite séparés puis détectés pour donner le spectre de masse de l’élément. Cette fragmentation étant caractéristique d’un composé et reproductible, il sera alors possible, par comparaison avec les spectres de masse de composés de référence, de déterminer la structure de la molécule analysée. En résumé, cette technique suit un processus en chaîne composé des étapes suivantes : ionisation des molécules, accélération des ions chargés, séparation des ions suivant leur rapport masse/charge, détection des ions, puis interprétation du spectre de masse obtenu.

Lors d’une analyse par LC-MS, la chromatographie permet de séparer un mélange de substances, avant leur analyse par spectrométrie de masse. Il est de plus en plus courant de coupler ces deux techniques pour les déterminations quantitatives de substances pharmaceutiques.

L’analyse par LC-MS a pour but de confirmer les résultats obtenus par HPLC. Etant une méthode très sensible, elle devrait permettre de diminuer le volume des échantillons sanguins au cas où les résultats des dosages urinaires n’étaient pas interprétables.

1.5 Plan général : Il s'agit d'une étude clinique, prospective, monocentrique, de type cross-over, stratifiée en 2 groupes, avec randomisation du mode d'administration (mode inspirium versus expirium), chez des adultes volontaires sains.

Durée estimée :


1 an

1.6 Sélection des sujets : 1.6.1 Nombre de sujets :

♦ 16 sujets sains : 8 volontaires testeront un modèle de nébuliseur selon les deux modes d’administration (inspirium, expirium) et les 8 autres le deuxième modèle de nébuliseur selon les deux mêmes modes

1.6.2 Critères de sélection : ♦ Sujets masculins/féminins, âgés de 18 à 40 ans et capables de donner un

consentement éclairé

♦ Ils recevront une information complète et objective par l’un des investigateurs et un formulaire de consentement éclairé leur sera alors remis, qu’ils devront signer.

1.6.3 Critères d'exclusion : ♦ Personne traitée pour un asthme ou recevant quotidiennement du salbutamol.

♦ Personne présentant une pathologie cardiaque à risque d'arythmie.

♦ Femme enceinte.

♦ Personne ayant participé à une étude clinique dans les 2 mois précédents le début de l’étude.

♦ Personne ayant fait un don de sang dans les 2 mois précédents le début de l’étude.

♦ Personne souffrant d’une insuffisance rénale

Les volontaires seront recrutés suite à un interview réalisé par l’investigateur principal.

1.7 Méthode d’investigation Les volontaires sains seront accueillis dans un box d’isolement aux Soins Intensifs de Pédiatrie (SIP) à 7h45 du matin. Ils seront à jeun. Une légère collation leur sera donnée le matin et à midi.

Avant de débuter la nébulisation, les volontaires seront équipés d’un cathéter veineux périphérique dans l’avant-bras permettant les différents prélèvements sanguins. Une perfusion de NaCl leur sera administrée pour permettre une hydratation suffisante en vue des prélèvements urinaires.


1.7.1 Nébulisation La nébulisation sera effectuée à l’aide d’un ventilateur Galiléo, Hamilton Medical LTD, Rhäzuns, Suisse, utilisé régulièrement aux SIP, qui sera programmé en mode de ventilation par pression contrôlée et adaptée au sujet.

Chaque volontaire testera deux modes d’administration des aérosols : la nébulisation durant l’inspirium et celle durant l’expirium. Ces 2 tests se feront avec un intervalle d’au moins 48 heures.

Durant ces nébulisations chaque volontaire testera 1 type de nébuliseur : soit le Sidestream Durable, Medic-Aid Ltd, Royaume-Uni, ayant montré la meilleure efficacité lors de l’étude in vitro, soit le Microneb NA420, Europe Medical, France, ayant la délivrance la plus faible lors de cette étude. Chaque volontaire utilisera le même nébuliseur durant les différentes phases de l’étude. Les différents nébuliseurs de même marque seront issus d’un même lot. La marque de nébuliseur testé par chaque volontaire sera déterminée par randomisation.

La solution nébulisée sera une solution contenant 5 mg de salbutamol préparée avec du Ventolin® 0.5% (Glaxo-Wellcome, Suisse) et du NaCl 0.9% (Braun, Suisse)15. Le volume de départ sera de 4 ml33. La solution de nébulisation sera pesée avant et après nébulisation.

La durée de la nébulisation est de 15 minutes.

1.7.2 Embout buccal Le volontaire sera connecté au ventilateur grâce à un embout buccal (du même type que ceux utilisés pour les fonctions pulmonaires) avec un pince-nez pour éviter une respiration nasale.

1.7.3 Suspension de charbon Afin d’éviter une absorption gastro-intestinale du salbutamol, 5 g de charbon activé sous forme de suspension (Carbomix® 40 ml) seront pris par le volontaire 5 minutes avant et 5 minutes après la nébulisation34-36.

1.7.4 Hydratation Chaque volontaire sain recevra une perfusion de 1L de NaCl isotonique sur une période de 2 heures, afin de procurer une hydratation suffisante en vue des prélèvements urinaires.

1.7.5 Analyses sanguines Une courbe d'évolution des concentrations plasmatiques sera réalisée. Dans ce but des prélèvements sanguins de 10 ml seront effectués aux temps t = 0, 15, 30, 45, 60 minutes pendant la première heure, puis chaque heure pendant 8 heures37.


Chez chaque volontaire, le volume total du prélèvement sanguin pour les deux jours d’étude sera de 360 ml (2 fois 180 ml : 120 ml de prélèvement et 60 ml de rinçage).

1.7.6 Analyses urinaires En parallèle, dans le but d’établir une corrélation possible entre les concentrations urinaire et plasmatique, les urines seront récoltées aux temps t = 0, 30, 60 minutes durant la première heure puis chaque heure jusqu’à la sixième heure, puis à t = 10 heures et à t = 24 heures38.

1.7.7 Analytique Les différents prélèvements seront aliquotés de façon à permettre une première analyse conventionnelle par HPLC, puis une analyse par LC-MS pour tester la fiabilité de la première méthode analytique et pour déterminer le volume de prélèvement minimal possible.

1.8 Surveillance médicale : Les volontaires sains seront pris en charge aux SIP pendant le période de la nébulisation et les deux heures suivantes. Ils seront monitorés et suivis par l’un des médecins cadres de l’unité ainsi que par l’investigateur principal.

A la fin de l’hydratation, c’est-à-dire 2 heures après la nébulisation, les volontaires pourront quitter les SIP. Ils devront cependant y retourner chaque heure pour les différents prélèvements (sanguin et urinaire).

1.9 Rôle du personnel infirmier Aucun

1.10 Médicaments 1.10.1 Salbutamol Chaque volontaire sain recevra 5 mg de salbutamol par nébulisation durant 15 minutes. Le salbutamol est un sympathomimétique d'action relativement sélective sur les récepteurs β2. Il provoque une bronchodilatation plus prononcée avec moins d'effets cardiovasculaires que les autres sympathomimétiques. Le salbutamol est le principe actif le plus utilisé aux SIP et pour lequel il existe une solide expérience clinique. Son métabolisme est bien connu : le salbutamol est métabolisé essentiellement par conjugaison au niveau hépatique, le métabolite principal étant le dérivé 4’-O-sulfate18, qui est facilement dosable.

1.10.2 Charbon activé Chaque volontaire sain recevra 5 g de charbon activé par voie orale sous forme de suspension (40 ml) 5 minutes avant la nébulisation et 5 minutes après, dans le but d’éviter


la résorption gastro-intestinale d’une partie du salbutamol qui serait avalé et non inhalé34-

36.

1.10.3 Solution de NaCl isotonique Chaque volontaire sain recevra une perfusion d’1 litre de NaCl isotonique sur 2 heures lui fournissant une hydratation suffisante pour les prélèvements urinaires. L’administration parentérale de NaCl se fera via le cathéter veineux périphérique déjà en place pour les prélèvements sanguins.

1.11 Evaluation des risques 1.11.1 Salbutamol Les effets indésirables du salbutamol sont essentiellement liés à l'absorption systémique. Il s'observent donc principalement lors d'inhalation de doses importantes ou lors d’utilisation par voie orale : tremor (surtout des mains), tachyphylaxie, tachycardie, arythmies. Maux de gorge, enrouement, céphalées, nausées se manifestent parfois lors de l'inhalation de doses normales. L'utilisation à long terme peut induire une tolérance et aboutir à une diminution de l'intensité et de la durée de l'effet14. Dans notre étude une seule dose étant administrée et celle-ci étant faible, les risques d’arythmie sont minimes. De plus chaque volontaire sera monitoré durant la nébulisation et les deux heures qui suivent.

1.11.2 Charbon activé Le seul risque lié à l’administration du charbon activé est la constipation. Dans le but de réduire au maximum ce désagrément, les volontaires recevront une hydratation durant 2 heures, et par la suite la recommandation de bien boire durant la journée leur sera donnée.

1.11.3 La ventilation artificielle Durant les 15 minutes que dure la nébulisation, un médecin sera présent au côté du volontaire et ce dernier pourra à tout moment se déconnecter du ventilateur, s’il en ressent le besoin.

1.11.4 Prise de sang Le volume total de sang prélevé durant toute l’étude pour chaque volontaire sera de 360 ml, soit environ 100 ml de moins que le volume prélevé en une demi-heure par le Centre de Transfusion lors d’un don de sang.

1.12 Information et consentement Cf annexes


1.13 Financement Aucune rétribution ne sera accordée aux volontaires sains. Les frais liés à l’utilisation des médicaments et aux analyses sont à la charge des services de Pharmacie et des Soins Intensifs de Pédiatrie.

1.14 Confidentialité des données Les sujets seront anonymisés et les investigateurs assurent la confidentialité des données recueillies pour l’étude. Seules les données scientifiques recueillies pourront être publiées dans un journal médical et de manière à ne pas permettre une quelconque identification des sujets.

1.15 Informations au personnel soignant médical et paramédical Avant le début de l’étude le personnel infirmier sera informé lors du colloque régulier des Soins Intensifs de Pédiatrie. Cette information se fera par oral et permettra au personnel soignant de poser toutes les questions qu’il souhaite.

1.16 Assurance Pour les volontaires participant à cet essai clinique, les dommages éventuels en relation avec l’étude sont couverts par l’assurance en responsabilité civile du CHUV. La copie de l’attestation se trouve en annexe.

1.17 Références 1. Diehl JL & Brochard L. Asthme aigu grave. Laaban,J.P. (ed.), pp. 113-126

(Masson, Paris,1996).

2. Laberge S, Gauthier M, Lapierre G & Girouard GR. Etat de mal asthmatique. Lacroix,j., Gauthier,M. & Beaufils,F. (eds.), pp. 427-446 (Les Presses de l'Université de Montréal-Doin, Paris,1994).

3. Leteurtre S, Deschildre A, Cremer R & et al. Asthme aigu grave de l'enfant : évaluation de la gravité et traitement. Réanim. Urgences 8, 661-671 (1999).

4. Compendium Suisse des Médicaments 2002. Documed SA, Bâle (2002).

5. Dautzenberg B & Diot P. L'aérosolthérapie par nébulisation. Margaux orange, Paris (2000).

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Annexe 2

2 Essais d’extraction

2.1 Colonne Supelclean® C18 Tableau 2 Tests d’extraction réalisés avec la colonne Supelclean® C18 dans le plasma et dans l’urine

Plasma

1 2 3 4 5

Conditionnement 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml

H3PO40.01M

2 ml H2O 2 ml H2O 2 ml Pic B-7 2 ml H3PO40.01M

Echantillon 2 ml de

plasma 2 ml de plasma

2 ml de plasma

2 ml de plasma

2 ml de plasma

Lavage 1 ml H20 1 ml H20 1 ml de

MeOH 5% ds H2O

1 ml Pic B-7 1 ml H20

1 ml ACN 1 ml ACN 1 ml ACN 1 ml ACN 5% ds H2O

Elution 1 ml MeOH 1 ml MeOH 1 ml MeOH 1 ml MeOH 1 ml MeOH

Urine

6

Conditionnement 2 ml MeOH 2 ml H3PO40.01M Echantillon 1 ml d’urine Lavage 1 ml H20 1 ml ACN Elution 1 ml MeOH

Annexe 2 Essais d’extraction 18

Figure 2 Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Supelclean® C18 de plasma (en haut) et d’urine (en bas) avec des blancs et des matrices spikées

2.2 Colonne Oasis® HLB Tableau 3 Tests d’extraction réalisés avec la colonne Oasis® HLB dans le plasma et dans l’urine

Plasma Urine

1 2 3 4

Conditionnement 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml H20 2 ml H20 2 ml H20 2 ml H20 1 ml tampon

ammoniacal RS pH 10

Echantillon 1 ml de plasma 1 ml de plasma 1 ml d’urine 1 ml d’urine Lavage


1 ml H20 1 ml de MeOH 5% ds H20

1 ml de MeOH 5% ds H20

1 ml de MeOH 5% ds H20 avec 2% ac. acétique

1 ml de MeOH 5% ds H20 avec 2% NH4OH

1 ml de MeOH 65% ds H20 avec 2% NH4OH

Elution 1 ml MeOH 1 ml MeOH 1 ml MeOH 1 ml MeOH

65% ds H20 avec 2% d’ac. acétique

Plasma

5 6 7

Conditionnement 1 ml MeOH 1 ml MeOH 1 ml MeOH 1 ml ACN 1 ml ACN 1 ml tampon

phosphate 0.1 M pH 7.2

2 ml H20 2 ml H20 2 ml H20 Echantillon 2 ml de plasma 2 ml de plasma 2 ml de plasma Lavage 2 ml de MeOH 5% ds

H20 2 ml de MeOH 5% ds H20





Elution 1 ml MeOH 10% ds

CH3CN 1 ml MeOH 20% ds CH3CN

1 ml MeOH 20% ds CH3CN


Figure 3 Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Oasis® HLB de plasma (figure p. 94) et d’urine (en haut) avec des blancs et des matrices spikées.

2.3 Colonne Oasis® MCX Tableau 4 Tests d’extraction réalisés avec la colonne Oasis® MCX dans le plasma et dans l’urine

Plasma

1 2 3 4 5

Conditionnement 2 ml

MeOH 2 ml MeOH

2 ml MeOH

2 ml MeOH 2 ml MeOH

2 ml H2O 2 ml H2O 2 ml H2O 2 ml H3PO40.01M

2 ml H3PO40.01M

Echantillon 1 ml de

plasma 1 ml de plasma

1 ml de plasma

1 ml de plasma

1 ml de plasma

Lavage 2 ml

H3PO4 2 ml H3PO4

2 ml H3PO4

2 ml H3PO4 0.01M

2 ml H2O


0.01M 0.01M 0.01M 2 ml ACN

5% ds H2O

2 ml MeOH

2 ml MeOH 5% ds H2O

2 ml ACN

Elution 2 ml

NH4OH 5% ds MeOH

2 ml NH4OH 5% ds MeOH



2 ml MeOH

Urine

6

Conditionnement 2 ml MeOH 2 ml H3PO40.01M Echantillon 1 ml d’urine Lavage 2 ml HCl 0.1N 2 ml MeOH Elution 2 ml NH4OH 5% ds MeOH


Figure 4 Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Oasis® MCX de plasma (en haut) et d’urine (en bas) avec des blancs et des matrices spikées.

2.4 Colonne SPEC 2.4.1 Colonne SPEC® Si Tableau 5 Tests d’extraction réalisés avec la colonne SPEC® Si dans l’urine

Urine

1 2

Conditionnement 250 μl MeOH 250 μl MeOH 250 μl H3PO4

0.01M 250 μl d’ac. acétique 0.1M

Echantillon 2 ml de plasma 1 ml d’urine diluée 1 :1 avec ac acétique 0.1M Lavage 250 μl H2O 250 μl d’ac. acétique 0.1M 50% ds MeOH 250 μl ACN 1 ml MeOH

Elution 1 ml MeOH 1 ml NH4OH 2% ds MeOH


Figure 5 Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne SPEC® Si d’urine avec des blancs et des matrices spikées.

2.4.2 Colonne SPEC® C18 Tableau 6 Tests d’extraction réalisés avec la colonne SPEC® C18 dans l’urine

Urine

1 2

Conditionnement 250 μl MeOH 250 μl MeOH 250 μl H3PO4 0.01M 250 μl H2O Echantillon 2 ml de plasma 1 ml d’urine diluée 1 :1 avec H2O Lavage 250 μl H2O 250 μl d’ac. acétique 0.1M 50% ds

MeOH 250 μl ACN

Elution 1 ml MeOH 1 ml NH4OH 2% ds MeOH


Figure 6 Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne SPEC® C18 d’urine avec des blancs et des matrices spikées.

2.5 Bon-Elut Certify® I HF Tableau 7 Tests d’extraction réalisés avec la colonne Bond ELut Certify® dans l’urine

Urine

1 2

Conditionnement 2 ml MeOH 2 ml MeOH 2 ml H3PO4 0.01M 2 ml H3PO40.01M Echantillon 2 ml de plasma 1 ml d’urine + 1 ml d’ACN Lavage 1 ml H2O 1 ml H2O 1 ml ACN 1 ml ACN Elution 1 ml MeOH 1 ml NH4OH 5% ds MeOH


Figure 7 Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Bond ELut Certify® I HF d’urine (gauche) avec des blancs et des matrices spikées.

2.6 Colonne Bond-Elut® Si Tableau 8 Tests d’extraction réalisés avec la colonne Bond-Elut®-Si dans le plasma et l’urine

Plasma Urine

1 2 3

Conditionnement 2 ml MeOH 2 ml MeOH 3 ml MeOH 2 ml H3PO4 0.01M 2 ml H3PO40.01M 2 ml H2O Echantillon 2 ml de plasma 1 ml d’urine + 1 ml

d’ACN 2 ml de plasma + 2 ml de tampon PBS

Lavage 1 ml H2O 1 ml H2O 2 ml H2O 1 ml ACN 1 ml ACN 2 ml ACN Elution 1 ml MeOH 1 ml NH4OH 5% ds

MeOH 2 ml de phase mobile organique


Figure 8 Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Bond Elut® Si de plasma (en haut) et d’urine (en bas) avec des blancs et des matrices spikées.

Annexe 3

3 Validation du dosage du salbutamol dans le plasma

3.1 Protocole expérimental 3.1.1 Points de la gamme de calibration Les six points de la gamme de calibration qui ont été retenus pour la phase de validation sont présentés dans le Tableau 9. Chaque point de gamme a été traité à deux reprises durant trois jours consécutifs.

3.1.2 Standards de validation Quatre standards de validation (cf Tableau 9) ont également été choisis et chacun a été traité à quatre reprises durant les trois jours consacrés à la phase de validation afin de déterminer la fidélité intermédiaire et de connaître l’exactitude de la méthode.

Tableau 9 Concentration des points de la gamme de calibration et des standards de validation

Type d’échantillon Niveau de concentration

Concentration sélectionnée

(ng/ml)

Points de gamme 1 0.75 2 0.75 3 1 4 1 5 2 6 2 Standards de validation 1 1 2 2 3 3.75 4 6.25

Annexe 3 Validation du dosage du salbutamol dans le plasma 28

3.2 Analyse des résultats 3.2.1 Ensemble des réponses obtenues lors de l'étape de validation Les réponses générées lors de la validation sont des rapports de surface de pics correspondant au salbutamol et à son étalon interne, la baméthane

Tableau 10 Ensemble des réponses obtenues à partir des points de la gamme

0.75 0.0353 0.03530 0.04150 0.75 0.0352 0.04020 0.04110 1 0.0430 0.53200 0.04840 1 0.0465 0.05720 0.04440 2 0.0916 0.09330 0.09260 2 0.0909 0.08900 0.08790 3.75 0.1745 0.17800 0.17650 3.75 0.1616 0.15610 0.16890 5 0.2373 0.23660 0.22070 5 0.2397 0.22550 0.22850 7.5 0.3446 0.31850 0.34040 7.5 0.3591 0.33730 0.33380

Tableau 11 Ensemble des réponses obtenues à partir des standards de validation

Concentration (xijk; ng/ml)

Rapport des surfaces (yijk)

Série 1 Série 2 Série 3

1 0.04850 0.04300 0.04330 0.04720 0.04610 0.04510 0.04830 0.04870 0.04630 0.04930 0.04540 0.05160 2 0.09780 0.08620 0.08790 0.09560 0.09030 0.09430 0.08870 0.08760 0.08650 0.09170 0.09190 0.09080 3.75 0.16570 0.16800 0.16650 0.17890 0.17260 0.17460 0.17320 0.17360 0.16620 0.16570 0.16630 0.17540 6.25 0.29910 0.27420 0.27820


0.29450 0.27700 0.28830 0.29830 0.28100 0.27700 0.29560 0.28290 0.26290

3.2.2 Ajustement des courbes de calibration L’estimation des paramètres de la régression pour chaque série d’analyse est présentée dans les tableaux suivants:

3.2.2.1 Pour la série 1 Tableau 12 Estimation des paramètres de la régression de la série 1

xijk yi xiyi xi2 yi2 n yimoy yi prédit 0.75 0.0353 0.0265 0.5625 0.0012 1 0.032874 0.75 0.0352 0.0264 0.5625 0.0012 1 0.0353 0.032874 1 0.0430 0.0430 1.0000 0.0018 1 0.044687 1 0.0465 0.0465 1.0000 0.0022 1 0.0448 0.044687 2 0.0916 0.1832 4.0000 0.0084 1 0.091939 2 0.0909 0.1818 4.0000 0.0083 1 0.0913 0.091939 3.75 0.1745 0.6544 14.0625 0.0305 1 0.174630 3.75 0.1616 0.6060 14.0625 0.0261 1 0.1681 0.174630 5 0.2373 1.1865 25.0000 0.0563 1 0.233695 5 0.2397 1.1985 25.0000 0.0575 1 0.2385 0.233695 7.5 0.3446 2.5845 56.2500 0.1187 1 0.351826 7.5 0.3591 2.6933 56.2500 0.1290 1 0.3519 0.351826 40 1.8593 9.4305 201.75 0.44 12

3.3333 0.1549

1600 3.456996

∑xi ∑xi2 ∑yi ∑yi

2 ∑xy SSPE1 njk 40.00 201.75 1.85930 1.8593 9.4305 0.0001976 12

b1:pente a1:ordonée SSE1 ddl1 MSE1 SSTot1 r12

0.047252 -0.002565 0.00034 10 3.426E-05 0.1531 0.9978 3.2.2.2 Pour la série 2 Tableau 13 Estimation des paramètres de la régression de la série 2

xijk yij2 xiyi xi2 yi2 ni yimoy yi prédit

0.75 0.03530 0.026475 0.56 0.0012 1 0.04044 0.75 0.04020 0.030150 0.56 0.0016 1 0.03775 0.04044 1 0.05320 0.053200 1.00 0.0028 1 0.05121


1 0.05720 0.057200 1.00 0.0033 1 0.05520 0.05121 2 0.09330 0.186600 4.00 0.0087 1 0.09427 2 0.08900 0.178000 4.00 0.0079 1 0.09115 0.09427 3.75 0.17800 0.667500 14.06 0.0317 1 0.16963 3.75 0.15610 0.585375 14.06 0.0244 1 0.16705 0.16963 5 0.23660 1.183000 25.00 0.056 1 0.22345 5 0.22550 1.127500 25.00 0.0509 1 0.23105 0.22345 7.5 0.31850 2.388750 56.25 0.1014 1 0.33111 7.5 0.33730 2.529750 56.25 0.1138 1 0.32790 0.33111 40 1.8202 9.013500 201.75 0.4037 12 1.8202

3.33333 0.1517 0.751125

∑xi ∑ixi2 ∑yi ∑yi2 ∑xy SSPE2 njk

40.00 201.75 1.82020 0.403685 9.0135 0.0005074 12


0.043062 0.00814 0.00072 10 7E-05 0.1276 0.9943 3.2.2.3 Pour la série 3 Tableau 14 Estimation des paramètres de la régression de la série 3


0.8 0.04150 0.031125 0.56 0.0017 1 0.03761 0.8 0.04110 0.030825 0.56 0.0017 1 0.04130 0.03761 1 0.04840 0.048400 1.00 0.0023 1 0.04868 1 0.04440 0.044400 1.00 0.002 1 0.04640 0.04868 2 0.09260 0.185200 4.00 0.0086 1 0.09299 2 0.08790 0.175800 4.00 0.0077 1 0.09025 0.09299 3.8 0.17650 0.661875 14.06 0.0312 1 0.17052 3.8 0.16890 0.633375 14.06 0.0285 1 0.17270 0.17052 5 0.22070 1.103500 25.00 0.0487 1 0.2259 5 0.22850 1.142500 25.00 0.0522 1 0.22460 0.2259 7.5 0.34040 2.553000 56.25 0.1159 1 0.33666 7.5 0.33380 2.503500 56.25 0.1114 1 0.33710 0.33666 40 1.8247 9.113500 201.75 0.4119 12 1.8247

3.33 0.1521 0.759458

∑xi ∑xi2 ∑yi ∑yi2 ∑xy SSPE3 njk

40.00 201.75 1.82470 0.4119 9.1135 0.0001002 12



0.044305 0.00438 0.00017 10 2E-05 0.1345 0.9988

3.2.3 Estimation des concentrations Après l’établissement des courbes de calibration, les concentrations des standards de validation ont été calculées sur la base des réponses obtenues

Tableau 15 Estimation des concentrations des standards de validation

xijk série rapport des surfaces u*ijk

1 1 0.04850 1.0807 0.04720 1.0532 0.04830 1.0765 0.04930 1.0976 2 0.04545 0.8664 0.04610 0.8814 0.04870 0.9418 0.04540 0.8652 3 0.04330 0.8785 0.04510 0.9192 0.04630 0.9463 0.05160 1.0659

2 1 0.09780 2.1240 0.09560 2.0775 0.08870 1.9315 0.09170 1.9949 2 0.08620 1.8127 0.09030 1.9079

0.08760 1.8452 0.09190 1.9450 3 0.08790 1.8852 0.09430 2.0297 0.08650 1.8536 0.09080 1.9507

3.75 1 0.16570 3.5610 0.17890 3.8404 0.17320 3.7197 0.16570 3.5610 2 0.16800 3.6097


0.17260 3.8191 0.17360 3.8423 0.16630 3.6728 3 0.16650 3.6593 0.17460 3.8421 0.16620 3.6525 0.17540 3.8602

6.25 1 0.29910 6.3842 0.29450 6.2868 0.28900 6.1704 0.29240 6.2424 2 0.27420 6.1784 0.27700 6.2435 0.28100 6.3364 0.28290 6.3805 3 0.27820 6.1805 0.28830 6.4085 0.27700 6.1534 0.26290 5.8351

3.2.4 Vérification de la linéarité La linéarité de la relation existant entre les concentrations estimées et les concentrations introduite a été vérifiée. Sur la base des résultats obtenus, l’application d’un modèle de régression linéaire a abouti pour chaque série aux équations suivantes, où x représente les concentrations introduites et y, les concentrations estimées pour les standards de validation:

Série 1 : y = 0.988 x + 0.052

Série 2 : y= 1.032 x + 0.072

Série 3 : y = 0.992 x - 0.03

Calcul de la variance de la pente moyenne pour les séries ainsi que les limites de confiance à 90% de ce paramètre:

Tableau 16 Vérification de la linéarité

b1 b2 b3 moyenne Var(b) LCIb LCSb p

0.988024 1.032326 0.992416 1.004255 5.95793E-04 0.932981 1.075529 3

Les limites d'acceptation au seuil d’incertitude de 5 % sont comprises entre 0.85 à 1.15


3.2.5 Détermination de la fidélité à partir des standards de validation Tableau 17 Fidélité de la procédure

xijk (conc.)

U moy*

Variance de répétabilitéS2r

CVr (%)

S2(g)Variance inter-série

S2(FI)Variance de fidélité CVFI(%)

1 1.0 0.003 5.4 0.0085 0.011 10.9

2 1.9 0.006 3.9 0.0047 0.010 5.2

3.75 3.7 0.015 3.3 0.0 0.013 3.1

6.25 6.2 0.024 2.5 0.00 0.024 2.5

Figure 9 Profil de linéarité

3.2.6 Détermination de l’exactitude Tableau 18 Calcul des pourcentages de recouvrement, des biais absolus et des biais relatifs

xijk (conc.) Série u*ijk R%ijk Bijk Pbijk

1 1 1.1 108.07 0.1 8.1 1.1 105.32 0.1 5.3 1.1 107.65 0.1 7.6 1.1 109.76 0.1 9.8 2 0.9 86.64 -0.1 -13.4 0.9 88.14 -0.1 -11.9


0.9 94.18 -0.1 -5.8 0.9 86.52 -0.1 -13.5 3 0.9 87.85 -0.1 -12.1 0.9 91.92 -0.1 -8.1 0.9 94.63 -0.1 -5.4 1.1 106.59 0.1 6.6 2 1 2.1 106.20 0.1 6.2 2.1 103.87 0.1 3.9 1.9 96.57 -0.1 -3.4 2.0 99.75 0.0 -0.3 2 1.8 90.63 -0.2 -9.4 1.9 95.39 -0.1 -4.6 1.8 92.26 -0.2 -7.7 1.9 97.25 -0.1 -2.7 3 1.9 94.26 -0.1 -5.7 2.0 101.48 0.0 1.5 1.9 92.68 -0.1 -7.3 2.0 97.53 0.0 -2.5 3.75 1 3.6 94.96 -0.2 -5.0 3.8 102.41 0.1 2.4 3.7 99.19 0.0 -0.8 3.6 94.96 -0.2 -5.0 2 3.7 98.99 0.0 -1.0 3.8 101.84 0.1 1.8 3.8 102.46 0.1 2.5 3.7 97.94 -0.1 -2.1 3 3.7 97.58 -0.1 -2.4 3.8 102.46 0.1 2.5 3.7 97.40 -0.1 -2.6 3.9 102.94 0.1 2.9 6.25 1 6.4 102.15 0.1 2.1 6.3 100.59 0.0 0.6 6.2 98.73 -0.1 -1.3 6.2 99.88 0.0 -0.1 2 6.2 98.86 -0.1 -1.1 6.2 99.90 0.0 -0.1 6.3 101.38 0.1 1.4 6.4 102.09 0.1 2.1 3 6.2 98.89 -0.1 -1.1 6.4 102.54 0.2 2.5


6.2 98.45 -0.1 -1.5 5.8 93.36 -0.4 -6.6

Tableau 19 Exactitude de la procédure

xijk (conc.) umoyijk R%j S(FI) LCI(R%) LCS(R%)

1.0 1.0 97.3 0.106 77.86 116.68 2.0 1.9 97.3 0.102 87.97 106.67 3.75 3.73 99.4 0.114 93.88 104.98 6.25 6.23 99.7 0.155 95.19 104.27

Les limites de confiance unilatérales à 95% du pourcentage de recouvrement sont comprises entre les limites fixées à 80% et 120%.

Figure 10 Profil d’exactitude

3.2.7 Détermination du rendement d’extraction Tableau 20 Détermination du rendement d'extraction (voir p. Commission SFSTP Methodes Chromatoghraphiques de dosage dans les milieux biologiques:Exemple d'application de la stratégie de la validation

xijk yijk (gamme biologique) ymoy* (gamme aqueuse)

Rendement d'extraction %

2 190983


187500 171421 164711 200406 162532 195074 167288 188686 142329 5 336690 339833 340884 339984 364465 358464 363813 367911 356275 360927 10 747260 683494 697734 680772 706734 688854 717765 643909 616754 706107 20 1E+06 1E+06 1E+06 1E+06 1E+06 1E+06 1E+06 1E+06 1E+06 1414866 30 2E+06 2E+06 2E+06 2E+06 2E+06


2E+06 2E+06 2E+06 2E+06 2153162 40 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 2856842 50 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3E+06 3528997 moyenne 102.6 ecart-type 11.12

3.2.8 Estimation statistique de l’homogénéité des variances 3.2.8.1 Test de Cochane Tableau 21 Estimation de la variance par niveau de concentration

xijk série k yijk rapport des surfaces

∑yijk yijk2 ∑yijk2 (∑yijk)2/nj

k ∑yijk2-

(∑yijk)2/nj

k

Sj2

1 1 0.0549 0.00301 0.0555 0.00308 0.0507 0.1611 0.00257 0.00866 0.00865 0.00001 2 0.0473 0.00224 0.0562 0.00315 0.0546 0.1581 0.00298 0.00838 0.00834 0.00004


3 0.0503 0.00253 0.0497 0.00247 0.0494 0.1494 0.00244 0.00744 0.00744 0.00000 Sj2 0.00006 9.712E-061.5 1 0.0828 0.00686 0.0799 0.00638 0.0720 0.2347 0.00518 0.01842 0.01836 0.00006 2 0.0735 0.00540 0.0706 0.00499 0.0819 0.2260 0.00671 0.01709 0.01703 0.00007 3 0.0732 0.00536 0.0738 0.00545 0.0696 0.2166 0.00484 0.01565 0.01564 0.00001 Sj2 0.00014 2.3655E-052 1 0.0976 0.00952 0.1007 0.01014 0.0968 0.2951 0.00937 0.02903 0.02903 0.00001 2 0.1031 0.01063 0.0959 0.00920 0.0893 0.2883 0.00798 0.02781 0.02771 0.00009 3 0.0996 0.00992 0.0903 0.00815 0.0935 0.2834 0.00874 0.02682 0.02677 0.00004 Sj2 0.00015 2.4616E-052.5 1 0.1255 0.01575 0.1164 0.01354 0.1233 0.3652 0.01521 0.04450 0.04446 0.00005 2 0.1172 0.01373 0.1185 0.01405 0.1178 0.3535 0.01388 0.04166 0.04166 0.00000 3 0.1208 0.01459 0.1217 0.01481 0.1139 0.3564 0.01297 0.04238 0.04234 0.00004 Sj2 0.00008 1.3821E-053 1 0.1424 0.02027 0.1423 0.02025 0.1550 0.4397 0.02403 0.06455 0.06445 0.00011 2 0.1435 0.02058 0.1427 0.02035 0.1369 0.4230 0.01873 0.05966 0.05964 0.00003


3 0.1376 0.01893 0.1350 0.01823 0.1358 0.4084 0.01844 0.05560 0.05560 0.00000 Sj2 0.00014 2.2786E-055 1 0.2272 0.05161 0.2276 0.05182 0.2270 0.6818 0.05152 0.15495 0.15495 0.00000 2 0.2258 0.05099 0.2368 0.05607 0.2302 0.6928 0.05297 0.16003 0.15997 0.00006 3 0.2230 0.04973 0.2193 0.04809 0.2275 0.6698 0.05176 0.14958 0.14954 0.00003 Sj2 0.00010 1.5846E-05

Tableau 22 Test de Cochrane

Test de Cochrane

Sj2max ΣSj2 Ccalc C(0.05;m,(p(n-1))

0.00012007 0.000230505 0.5209 0.3726 Si C≤C[(0.05,m,p(n-1)]

3.2.8.2 Test de Levene Tableau 23 Test de Levene: calcul des déviations absolues des réponses

xijk série yijk rapport des surfaces yimoy dijk=¦yijk-yimoy¦ dijk2

1 1 0.0549 0.00119 1.417E-06 0.0555 0.00179 3.201E-06 0.0507 0.05369 0.00298 8.877E-06 2 0.0473 0.00537 2.879E-05 0.0562 0.00345 1.189E-05 0.0546 0.05271 0.00192 3.677E-06 3 0.0503 0.00050 2.5E-07 0.0497 0.00010 1E-08 0.0494 0.04980 0.00040 1.6E-07 1.5 1 0.0828 0.00459 2.11E-05 0.0799 0.00166 2.766E-06 0.0720 0.07822 0.00626 3.915E-05 2 0.0735 0.00184 3.379E-06 0.0706 0.00472 2.224E-05


0.0819 0.07534 0.00655 4.297E-05 3 0.0732 0.00100 0.000001 0.0738 0.00160 2.56E-06 0.0696 0.07220 0.00260 6.76E-06 2 1 0.0976 0.00081 6.494E-07 0.1007 0.00236 5.555E-06 0.0968 0.09836 0.00155 2.405E-06 2 0.1031 0.00697 4.862E-05 0.0959 0.00021 4.277E-08 0.0893 0.09611 0.00677 4.578E-05 3 0.0996 0.00513 2.635E-05 0.0903 0.00417 1.736E-05 0.0935 0.09447 0.00097 9.344E-07 2.5 1 0.1255 0.00377 1.422E-05 0.1164 0.00537 2.881E-05 0.1233 0.12173 0.00160 2.55E-06 2 0.1172 0.00066 4.356E-07 0.1185 0.00070 4.856E-07 0.1178 0.11785 0.00004 1.356E-09 3 0.1208 0.00200 4E-06 0.1217 0.00290 8.41E-06 0.1139 0.11880 0.00490 2.401E-05 3 1 0.1424 0.00419 1.754E-05 0.1423 0.00427 1.824E-05 0.1550 0.14657 0.00846 7.154E-05 2 0.1435 0.00246 6.046E-06 0.1427 0.00167 2.781E-06 0.1369 0.14099 0.00413 1.703E-05 3 0.1376 0.00147 2.151E-06 0.1350 0.00113 1.284E-06 0.1358 0.13613 0.00033 1.111E-07 5 1 0.2272 0.00008 7.128E-09 0.2276 0.00037 1.359E-07 0.2270 0.22726 0.00028 8.08E-08 2 0.2258 0.00511 2.607E-05 0.2368 0.00587 3.447E-05 0.2302 0.23092 0.00077 5.868E-07 3 0.2230 0.00027 7.111E-08 0.2193 0.00397 1.573E-05 0.2275 0.22327 0.00423 1.792E-05


7.5 1 0.3497 0.00863 7.452E-05 0.3603 0.00194 3.758E-06 0.3651 0.35837 0.00669 4.481E-05 2 0.3641 0.01935 0.0003745 0.3327 0.01201 0.0001443 0.3374 0.34474 0.00734 5.385E-05 3 0.3465 0.00383 1.469E-05 0.3419 0.00077 5.878E-07 0.3396 0.34267 0.00307 9.404E-06

Tableau 24 Test de Levene: table d'analyse de variance

Xijk (conc) Σ(dijk2) Σ(dijk)=d.j. d.j.2 d.j.2/(Σnjk) N=k*m*ni

1 5.83E-05 0.01769 0.000313 3.477E-05 63 1.5 1.42E-04 0.03082 0.000950 1.056E-04 2 1.48E-04 0.02893 0.000837 9.297E-05 2.5 0.000083 0.02193 0.000481 5.343E-05 3 0.000137 0.02810 0.000790 8.775E-05 5 0.000095 0.02095 0.000439 4.875E-05 7.5 0.000720 0.06363 0.004049 4.499E-04 Total 1.38E-03 0.2121 0.0079 8.732E-04

SS(1): 1.38E-03 SS(2) 8.732E-04 SS(3) 0.00071

Source SSinter ddl inter((m-1)), intra ([Σmj(Σpknjk-1)] MS Fcalc F(0.05,m-1:Σμϕ(Σπκnjk-1))

Conc. 0.00016 6 0.000027 SSintra Erreur 0.00051 56 0.0000091 2.92 2.27

Annexe 4

4 Validation du dosage du salbutamol dans l’urine

4.1 Protocole expérimental 4.1.1 Points de la gamme de calibration Les six points de la gamme de calibration qui ont été retenus pour la phase de validation sont présentés dans le Tableau 9. Chaque point de gamme a été traité à deux reprises durant trois jours consécutifs.

4.1.2 Standards de validation Quatre standards de validation (cf Tableau 9) ont également été choisis et chacun a été traité à quatre reprises durant les trois jours consacrés à la phase de validation afin de déterminer la fidélité intermédiaire et de connaître l’exactitude de la méthode.

Tableau 25 Concentration des points de la gamme de calibration et des standards de validation

Type d’échantillon Niveau de concentration Concentration sélectionnée

(ng/ml)

Points de gamme 1 5 2 10 3 20 4 30 5 50 6 100 Standards de validation 1 5 2 25 3 40 4 100

Annexe 4 Validation du dosage du salbutamol dans l’urine 43

4.2 Analyse des résultats 4.2.1 Ensemble des réponses obtenues lors de l'étape de validation Les réponses générées lors de la validation sont des rapports de surface de pics correspondant au salbutamol et à son étalon interne, la baméthane

Tableau 26 Ensemble des réponses obtenues à partir des points de la gamme

Concentration (xijk; ng/ml)

Rapport des surfaces (yijk)


5 0.2514 0.24200 0.25600 5 0.2561 0.25040 0.26480 10 0.4671 0.46430 0.51560 10 0.4588 0.44410 0.49990 20 0.9433 0.91280 0.94010 20 0.9023 0.92350 0.90150 30 1.2772 1.34480 1.41420 30 1.3384 1.32310 1.37560 50 2.1260 2.21440 2.13800 50 2.1057 2.16250 2.12840 100 4.3534 4.49820 4.56240 100 4.4821 4.21840 4.58630

Tableau 27 Ensemble des réponses obtenues à partir des standards de validation

Concentration (xijk; ng/ml) Rapport des surfaces (yijk)


5 0.2420 0.2561 0.2560 0.2504 0.2457 0.2468 0.2547 0.2571 0.2520 0.2538 0.2462 0.2604 25 1.1396 1.0915 1.1365 1.1992 1.0938 1.1364 1.1631 1.0759 1.0951 1.2073 1.0699 1.1135 40 1.708 1.82150 1.8611 1.6702 1.7321 1.8292 1.664 1.6967 1.8121


1.6872 1.8072 1.7422 100 4.5102 4.4771 4.5013 4.2004 4.4864 4.2930 4.2447 4.2282 4.4019 4.4538 4.3457 4.5347

4.2.2 Ajustement des courbes de calibration L’estimation des paramètres de la régression pour chaque série d’analyse est présentée dans les tableaux suivants:

4.2.2.1 Pour la série 1 Tableau 28 Estimation des paramètres de la régression de la série 1

xijk yi xiyi xi2 yi2 n yimoy yi prédit 5 0.2514 1.2570 25.0000 0.0632 1 0.234843 5 0.2561 1.2805 25.0000 0.0656 1 0.2538 0.234843 10 0.4671 4.6710 100.0000 0.2182 1 0.453000 10 0.4588 4.5880 100.0000 0.2105 1 0.4630 0.453000 20 0.9433 18.8660 400.0000 0.8898 1 0.889315 20 0.9023 18.0450 400.0000 0.8141 1 0.9228 0.889315 30 1.2772 38.3160 900.0000 1.6312 1 1.325629 30 1.3384 40.1520 900.0000 1.7913 1 1.3078 1.325629 50 2.1260 106.3000 2500.0000 4.5199 1 2.198258 50 2.1057 105.2850 2500.0000 4.4340 1 2.1159 2.198258 100 4.3534 435.3400 10000.0000 18.9521 1 4.379830 100 4.4821 448.2100 10000.0000 20.0892 1 4.4178 4.379830 430 18.9618 1222.3105 27850.00 53.68 12

35.8333 1.5801

184900 359.548


2 ∑xy SSPE1 njk 430.00 27850.00 18.96175 18.9618 1222.3105 0.0112487 12


0.043631 0.016686 0.03149 10 0.003149451 23.7167 0.9987 4.2.2.2 Pour la série 2 Tableau 29 Estimation des paramètres de la régression de la série 2


5 0.24200 1.210000 25.00 0.058564 1 0.2498344


5 0.25040 1.252000 25.00 0.06270016 1 0.24620 0.2498344 10 0.46430 4.643000 100.00 0.21557449 1 0.4660572 10 0.44410 4.441000 100.00 0.19722481 1 0.45420 0.4660572 20 0.91280 18.256000 400.00 0.83320384 1 0.8985028 20 0.92350 18.470000 400.00 0.85285225 1 0.91815 0.8985028 30 1.34480 40.344000 900.00 1.80848704 1 1.3309484 30 1.32310 39.693000 900.00 1.75059361 1 1.33395 1.3309484 50 2.21440 110.720000 2500.00 4.90356736 1 2.1958396 50 2.16250 108.125000 2500.00 4.67640625 1 2.18845 2.1958396 100 4.49820 449.820000 10000.00 20.2338032 1 4.3580677 100 4.21840 421.840000 10000.00 17.7948986 1 4.35830 4.3580677 430 18.9985 1218.814000 27850.00 53.3878756 12 18.9985

35.83333 1.5832 101.567833 184900 360.943

∑xi ∑ixi2 ∑yi ∑yi

2 ∑xy SSPE2 njk 430.00 27850.00 18.99850 53.387876 1218.8140 0.0410228 12

b2:pente a2:ordonnée SSE2 ddl2 MSE2 SSTot2 r22

0.043245 0.03361 0.04223 10 0.00422298 23.3093 0.9982 4.2.2.3 Pour la série 3 Tableau 30 Estimation des paramètres de la régression de la série 3

Série 3


5 0.25600 1.280000 25.00 0.065536 1 0.24469 5 0.26480 1.324000 25.00 0.07011904 1 0.26040 0.24469 10 0.51560 5.156000 100.00 0.26584336 1 0.4696429 10 0.49990 4.999000 100.00 0.24990001 1 0.50775 0.4696429 20 0.94010 18.802000 400.00 0.88378801 1 0.9195489 20 0.90150 18.030000 400.00 0.81270225 1 0.92080 0.9195489 30 1.41420 42.426000 900.00 1.99996164 1 1.3694549 30 1.37560 41.268000 900.00 1.89227536 1 1.39490 1.3694549 50 2.13800 106.900000 2500.00 4.571044 1 2.2692668 50 2.12840 106.420000 2500.00 4.53008656 1 2.13320 2.2692668 100 4.56240 456.240000 10000.00 20.8154938 1 4.5187966 100 4.58630 458.630000 10000.00 21.0341477 1 4.57435 4.5187966 430 19.5828 1261.475000 27850.00 57.1908977 12 19.5828

35.83 1.6319 105.122917 184900 383.4861



2 ∑xy SSPE3 njk 430.00 27850.00 19.58280 57.190898 1261.4750 0.0019836 12


0.044991 0.01974 0.04988 10 0.00498803 25.2337 0.9980 4.2.3 Estimation des concentrations Après l’établissement des courbes de calibration, les concentrations des standards de validation ont été calculées sur la base des réponses obtenues

Tableau 31 Estimation des concentrations des standards de validation

xijk série rapport des surfaces u*ijk

5 1 0.2420 5.1640 0.2504 5.3566 0.2547 5.4551 0.2538 5.4345 2 0.2561 5.1449 0.2457 4.9044 0.2571 5.1680 0.2462 4.9160 3 0.2560 5.2514 0.2468 5.0469 0.2520 5.1625 0.2604 5.3492 25 1 1.1396 25.7364 1.19920 27.1023 1.1631 26.2750 1.2073 27.2880 2 1.0915 24.4629 1.09380 24.5161 1.0759 24.1022 1.0699 23.9634 3 1.1365 24.8221 1.1364 24.8199 1.0951 23.9020 1.1135 24.3109 40 1 1.708 38.7637 1.6702 37.8973 1.664 37.7552


1.6872 38.2869 2 1.8215 41.3650 1.7321 39.2763 1.6967 38.4577 1.8072 41.0130 3 1.8611 40.9277 1.8292 40.2187 1.8121 39.8386 1.7422 38.2850 100 1 4.5102 102.9880 4.2004 95.8876 4.2447 96.9029 4.4538 101.6953 2 4.4771 102.7525 4.4864 102.9676 4.2282 96.9969 4.3457 99.7140 3 4.5013 99.6111 4.2930 94.9812 4.4019 97.4018 4.5347 100.3535

4.2.4 Vérification de la linéarité La linéarité de la relation existant entre les concentrations estimées et les concentrations introduite a été vérifiée. Sur la base des résultats obtenus, l’application d’un modèle de régression linéaire a abouti pour chaque série aux équations suivantes, où x représente les concentrations introduites et y, les concentrations estimées pour les standards de validation:

Série 1 : y = 0.985 x + 0.491

Série 2 : y = 1.009 x – 0.413

Série 3 : y = 0.979 x + 0.304

Calcul de la variance de la pente moyenne pour les séries ainsi que les limites de confiance à 90% de ce paramètre:

Tableau 32 Vérification de la linéarité

b1 b2 b3 moyenne Var(b) LCIb LCSb

0.985477 1.009268 0.978556 0.991100 2.59518E-04 0.944060 1.038140


Les limites d'acceptation au seuil d’incertitude de 5 % sont comprises entre 0.85 à 1.15

4.2.5 Détermination de la fidélité à partir des standards de validation Tableau 33 Fidélité de la procédure

xijk (conc.)

umoy* Variance de répétabilité S2r

CVr (%) Variance inter-série S2g

Variance de fidélité intermédiaire S2FI

CVFI(%)

5 5.2 0.018 2.6 0.0210 0.039 3.8

25 25.1 0.266 2.1 1.6133 1.879 5.5

40 39.3 1.127 2.7 0.7 1.874 3.5

100 99.4 8.699 3.0 -0.59 8.113 2.9

Figure 11 Profil de fidélité

4.2.6 Détermination de l’exactitude Tableau 34 Calcul des pourcentages de recouvrement, des biais absolus et des biais relatifs

xijk (conc.) Série u*ijk R%ijk Bijk Pbijk

5 1 5.2 103.28 0.2 3.3 5.4 107.13 0.4 7.1


5.5 109.10 0.5 9.1 5.4 108.69 0.4 8.7 2 5.1 102.90 0.1 2.9 4.9 98.09 -0.1 -1.9 5.2 103.36 0.2 3.4 4.9 98.32 -0.1 -1.7 3 5.3 105.03 0.3 5.0 5.0 100.94 0.0 0.9 5.2 103.25 0.2 3.2 5.3 106.98 0.3 7.0 25 1 25.7 102.95 0.7 2.9 27.1 108.41 2.1 8.4 26.3 105.10 1.3 5.1 27.3 109.15 2.3 9.2 2 24.5 97.85 -0.5 -2.1 24.5 98.06 -0.5 -1.9 24.1 96.41 -0.9 -3.6 24.0 95.85 -1.0 -4.1 3 24.8 99.29 -0.2 -0.7 24.8 99.28 -0.2 -0.7 23.9 95.61 -1.1 -4.4 24.3 97.24 -0.7 -2.8 40 1 38.8 96.91 -1.2 -3.1 37.9 94.74 -2.1 -5.3 37.8 94.39 -2.2 -5.6 38.3 95.72 -1.7 -4.3 2 41.3 103.36 1.3 3.4 39.3 98.19 -0.7 -1.8 38.5 96.14 -1.5 -3.9 41.0 102.53 1.0 2.5 3 40.9 102.32 0.9 2.3 40.2 100.55 0.2 0.5 39.8 99.60 -0.2 -0.4 38.3 95.71 -1.7 -4.3 100 1 103.0 102.99 3.0 3.0 95.9 95.89 -4.1 -4.1 96.9 96.90 -3.1 -3.1 101.7 101.70 1.7 1.7 2 102.8 102.75 2.8 2.8 103.0 102.97 3.0 3.0


97.0 97.00 -3.0 -3.0 99.7 99.71 -0.3 -0.3 3 99.6 99.61 -0.4 -0.4 95.0 94.98 -5.0 -5.0 97.4 97.40 -2.6 -2.6 100.4 100.35 0.4 0.4

Tableau 35 Exactitude de la procédure

xijk (conc.) umoyijk R%j S(FI) LCI(R%) LCS(R%)

5.0 5.2 103.9 0.198 96.67 111.18 25.0 25.1 100.4 1.371 90.38 110.48 40.0 39.34 98.3 1.369 92.07 104.62 100.00 99.35 99.4 2.848 94.13 104.58

Figure 12 Profil d’exactitude

Les limites de confiance unilatérales à 95% du pourcentage de recouvrement sont comprises entre les limites fixées à 80% et 120%.


4.2.7 Rendement d’extraction Tableau 36

xijk yijk (gamme biologique) ymoy* (gamme aqueuse) Rendement d'extraction %

2 190983 187500 171421 164711 200406 162532 195074 167288 188686 142329 127.1394

5 336690 339833 340884 339984 364465 358464 363813 367911 356275 360927 99.3236

10 747260 683494 697734 680772 706734 688854 717765 643909 616754 706107 97.2984

20 1499886 1495744 1445872 1406690 1467077 1447886 1499886 1495744 1445872 1414866 103.6977


30 2117397 2150624 2100527 2075482 2139454 2132158 2117397 2150624 2100527 2153162 98.4815

40 2745761 2766066 2757360 2700906 2767674 2748144 2702026 2859493 2741981 2856842 96.4134

50 3395439 3378142 3380276 3322088 3473246 3425024 3395439 3378142 3322088 3528997 95.9350

moyenne 102.6

ecart-type 11.12

CF% 10.84

4.2.8 Evaluation statistique de l’homogénéité des variances 4.2.8.1 Test de Cochran Tableau 37 Estimation de la variance par niveau de concentration

xijk série k yijk rapport des surfaces

∑yijk yijk2 ∑yijk2 ∑(yijk)2/njk ∑yijk2-

(∑yijk)2/njk

Sj2

5 1 0.2420 0.05856


0.2504 0.06270 0.2547 0.7471 0.06487 0.18614 0.18605 0.00008 2 0.2561 0.06559 0.2457 0.06037 0.2571 0.7589 0.06610 0.19206 0.19198 0.00008 3 0.2560 0.06554 0.2648 0.07012 0.2520 0.7728 0.06350 0.19916 0.19907 0.00009 Sj2 0.00025 4.149E-05 10 1 0.4493 0.20187 0.4728 0.22354 0.4485 1.3706 0.20115 0.62656 0.62618 0.00038 2 0.4582 0.20995 0.4536 0.20575 0.4531 1.3649 0.20530 0.62100 0.62098 0.00002 3 0.4641 0.21539 0.4441 0.19722 0.4671 1.3753 0.21818 0.63080 0.63048 0.00031 Sj2 0.00071 0.000118 20 1 0.9128 0.83320 0.9235 0.85285 0.9225 2.7588 0.85101 2.53706 2.53699 0.00007 2 0.9401 0.88379 0.9015 0.81270 0.9182 2.7598 0.84309 2.53958 2.53883 0.00075 3 0.9433 0.88981 0.9025 0.81451 0.9768 2.8226 0.95414 2.65846 2.65569 0.00277 Sj2 0.00359 0.000598 30 1 1.3448 1.80849 1.3231 1.75059 1.3321 4.0000 1.77449 5.33357 5.33333 0.00024 2 1.3384 1.79131 1.3137 1.72581 1.3216 3.9737 1.74663 5.26375 5.26343 0.00032 3 1.2772 1.63124 1.3059 1.70537 1.3414 3.9245 1.79935 5.13597 5.13390 0.00207 Sj2 0.00262 0.000437 40 1 1.7721 3.14034


1.7090 2.92068 1.7160 5.1971 2.94466 9.00568 9.00328 0.00239 2 1.7398 3.02690 1.7647 3.11417 1.7406 5.2451 3.02969 9.17076 9.17036 0.00040 3 1.7008 2.89272 1.7311 2.99671 1.7523 5.1842 3.07056 8.95998 8.95864 0.00134 Sj2 0.00413 0.000689 50 1 2.2144 4.90357 2.1625 4.67641 2.1260 6.5029 4.51988 14.09985 14.09590 0.00395 2 2.1380 4.57104 2.1284 4.53009 2.1687 6.4351 4.70326 13.80439 13.80350 0.00089 3 2.2139 4.90135 2.1057 4.43397 2.2924 6.6120 5.25510 14.59042 14.57285 0.01758 Sj2 0.02241 0.003735 100 1 4.3534 18.95209 4.4821 20.08922 4.4982 13.3337 20.23380 59.27512 59.26252 0.01260 2 4.5013 20.26170 4.5624 20.81549 4.5863 13.6500 21.03415 62.11134 62.10750 0.00384 3 4.5102 20.34190 4.4538 19.83633 4.4771 13.4411 20.04442 60.22266 60.22106 0.00161 Sj2 0.01805 0.003008

Test de Cochran

Sj2max ΣSj2 Ccalc C(0.05;m,(p(n-1))

0.003 0.008627 0.3487 0.3726 Si C≤C[(0.05,m,p(n-1)]

4.2.8.2 Test de Levene Tableau 38 Test de Levene: calcul des déviations absolues des réponses

xijk série yijk rapport des surfaces yimoy dijk=¦yijk-yimoy¦ dijk2

5 1 0.2420 0.00703 4.95E-05 0.2504 0.00137 1.87E-06


0.2547 0.24903 0.00567 3.21E-05 2 0.2561 0.00313 9.82E-06 0.2457 0.00727 5.28E-05 0.2571 0.25297 0.00413 1.71E-05 3 0.2560 0.00160 2.56E-06 0.2648 0.00720 5.18E-05 0.2520 0.25760 0.00560 3.14E-05 10 1 0.4493 0.00757 5.73E-05 0.4728 0.01593 0.000254 0.4485 0.45687 0.00837 7E-05 2 0.4582 0.00323 1.05E-05 0.4536 0.00137 1.87E-06 0.4531 0.45497 0.00187 3.48E-06 3 0.4641 0.00567 3.21E-05 0.4441 0.01433 0.000205 0.4671 0.45843 0.00867 7.51E-05 20 1 0.9128 0.00680 4.62E-05 0.9235 0.00390 1.52E-05 0.9225 0.91960 0.00290 8.41E-06 2 0.9401 0.02017 0.000407 0.9015 0.01843 0.00034 0.9182 0.91993 0.00173 3E-06 3 0.9433 0.00243 5.92E-06 0.9025 0.03837 0.001472 0.9768 0.94087 0.03593 0.001291 30 1 1.3448 0.01147 0.000131 1.3231 0.01023 0.000105 1.3321 1.33333 0.00123 1.52E-06 2 1.3384 0.01383 0.000191 1.3137 0.01087 0.000118 1.3216 1.32457 0.00297 8.8E-06 3 1.2772 0.03097 0.000959 1.3059 0.00227 5.14E-06 1.3414 1.30817 0.03323 0.001104 40 1 1.7721 0.03973 0.001579 1.7090 0.02337 0.000546 1.7160 1.73237 0.01637 0.000268 2 1.7398 0.00857 7.34E-05 1.7647 0.01633 0.000267 1.7406 1.74837 0.00777 6.03E-05


3 1.7008 0.02727 0.000743 1.7311 0.00303 9.2E-06 1.7523 1.72807 0.02423 0.000587 50 1 2.2144 0.04677 2.1625 0.00513 2.1260 2.16763 0.04163 2 2.1380 0.00703 4.95E-05 2.1284 0.01663 0.000277 2.1687 2.14503 0.02367 0.00056 3 2.2139 0.00990 9.8E-05 2.1057 0.09830 0.009663 2.2924 2.20400 0.08840 0.007815 100 1 4.3534 0.09117 0.008311 4.4821 0.03753 0.001409 4.4982 4.44457 0.05363 0.002877 2 4.5013 0.04870 0.002372 4.5624 0.01240 0.000154 4.5863 4.55000 0.03630 0.001318 3 4.5102 0.02983 0.00089 4.4538 0.02657 0.000706 4.4771 4.48037 0.00327 1.07E-05

Tableau 39 Test de Levene: table d'analyse de variance

Xijk (conc) Σ(dijk2) Σ(dijk)=d.j. d.j.2 d.j.2/(Σnjk) N=k*m*ni

5 2.49E-04 0.04300 0.001849 2.054E-04 63 15 7.10E-04 0.06700 0.004489 4.988E-04 20 3.59E-03 0.13067 0.017074 1.897E-03 30 0.002625 0.11707 0.013705 1.523E-03 40 0.004133 0.16667 0.027778 3.086E-03 50 0.022409 0.33747 0.113884 1.265E-02 100 0.018046 0.33940 0.115192 1.280E-02 Total 5.18E-02 1.2013 0.2940 3.266E-02 SS(1): 5.18E-02 SS(2) SS(3) 0.02291

Source SSinter ddl inter((m-1)), intra ([Σmj(Σpknjk-1)] MS Fcalc F(0.05,m-1:Σμϕ(Σπκnjk-1)) Conc. 0.00976 6 0.001626 SSintra Erreur 0.01910 56 4.77 2.27

Optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l'enfant sous ...

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