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1857 C A N . . I . ROT. VOL.. 57. 1979

TABLEAU 1. Schema des optrations pour l'extraction des 400 mg de materiel vegetal Sent broyes dans 5 mL d'eth;lnol acides aminks par le mCthanol<h[oroforme-eau (MCE) 95%. s ~ ~ i v i de trois rinpges et lavages avec 5 mL d'ethanol7076

chaque fois. Des surnageants combines (environ 20 mL), on prelkve 5 mL auxquels on ztjoute 7 mL de chloroforme et 3 mL

Matiriel V6g6tal (200 B 400 mg) d'eau. On laisse reposer toute la n ~ ~ i t comme pour I'extlaction avec MCE.

L>'ethanol 21 I'nvantage sur le MCE de pe1.mettl.e sur le meme + MCE, 4 mL (A) extrait le dosage des sucres. des acides organiques et d'autres

composes solubles. Broynge - PT20 rinct avec MCE

Cetrtrifi~gnt ion

1 l- Dosojie rlc It1 p/.olir~c,

Surnageant Po/ , / ( / r,rc;rhotlr tit, Sitrglr cr ( 1 1 . (1973) t~rorli/ic;c Dans unc eprouvette de 25 mm x 150 mm. munie d ' ~ ~ n

bouchon. on prelkve B 121 pipette une partie aliquote de 0.2 I Culot 4- Eprouvette (B) 1.0 mL de 121 phase superieure provenant de I'Cpl.ouvette C

(Tableau I ) . selon la concent~ttion de la proline. cn cvitant de touchel. b la phase inferieu1.c. On ajoutc alors I0 mL t i ' e a ~ ~ s ~ ~ i v i .

Resusparsio~z +MCE, aprks agitation. de 5 mLa dc ninhydrine (0.125 g dans 2 mL de

Y Cetrtrifi~gntiotz 4 1nL H,PO,. 6 M. plus 3 mL de CH,COOH glacial) et de 5 mL de Surnageant CH,COOH glacial. Apres agitation et chaufhtge sur bain-marie 5

Eprouvette (C) 100°C pendant 45 min. le melange est refroidi et le chromato- RitlCrlge phorc forme estlait avec 5 b I5 mL de benzkne suivant I'inten-

site dc la colol-ation. On agite vigourcusernent et laisse reposer dc 25 b 30 min. La densite optique de la solution lue ~ L I moyen d'un spectrophotom6tre ou colorim&tre, i~ 515 nm, est lineaire

Resrrspetzsiotr pourdes concent~.ations de proline de 0 :I 0.04 pmol/mL.

Cetrtrfigntiorr P ~ I I . c . l r ~ ~ o ~ ~ ~ a / o g r t ~ p I ~ i c ~ . S I I I . col t~tr t~c~ c;e.lltit~fit,~~~' t1'iotr.s Surnageant =A Culot: stcht ou rejet6 aminis. toanalyseul. Ions Pour ont fins la ete proline d'acides de separes. verificc~tions, comprise. amines doses contcn~ls et de dans identifies marque plusieurs dans Technicon au les moyen mEmes cas. Ics d'un echantil- (TSM-I) acides au-

1.cli6 it un 01-dinateur (Nova 1210) proglxmme pour I'integfittion tlcs pies et le calc~11 des qu:tntites (St-Pierrc et Paquin 1978).

t\.lrrrc./iot~ t.1 p t /r j / ic~~/iotr tics trc~itIc.s o~~rirlc;.~ Resultats et discussion A 1'c'c' I? l l l ~ / / l ~ l l O / - ~ ~ / l / ~ ~ ~ ~ , f ' t ~ ~ ~ ~ l ~ ' - ~ ' ( / l l

Envil-on 700 400 mg tlc materiel vegetal sont peses 1.apide- ment et plonges inimediatement dans 4 ml. tle methanol- chloroforme-eau (MCE. 12:s: 1 . vlv) pre;tlablemcnt refroidi i~ 0°C et contenu dans Llne iprouvette de 18 mm x I50 mm (A. Tublegu~ I ) . Dans le cas de segments de tiges et d'autres organes. la partie centrale est prelevle en rejetant les extremites. Le materiel vkgkt:~l peut Ptre garde quelques hcul.es dans le MCE it O"C. rnais i l est preferable de proceder b I'hornogeneisation le plus t6t possible.

Le materiel vegetal est :tlors broye dans I'eprouvette (A) maintenue sur glace avec un homogeneiseur polytron (PT70 de Brinkmann Instruments Ltd.). pendant 30 B 60 s selon le genre de tissus. ct centrifilge pendant 5 rnin B 2000-2500 x g . Le sulmageant est alors dkcantc dans une eprouvette dc 25 mm x 100 rnrn rnunic tl'un bouchon (C. Tableau 1 ) et le culot est resuspcndu dans 4 m L de MCE provenant du I-incage de I'homogeneiseur dans I'eprouvette B. Apres centrifugation ct decant:ttion. I'operation est repetee avec 4 mL de MCE prove- nant ~ L I rinc;age de I'epro~~vette B. Le culot est alors rnis B secher ou rcjete.

Aux surnageants combines. on 2tjoute I mL de chloroforme et 3.5 mL d ' e a ~ ~ . L'eprouvette est alors bo~lchee et agitee. On I , . ' ' 'rlsse reposer . toute la nuit b 0°C P O L I ~ ~ l n e rneilleure separation. La phase inferieure, soit 4.5 rnL, contient surtout Ics lipides, la chlorophyllc et d'autres pigments; la phase superieure. soit 11.5 rnL, conticnt les acides arnints. les sucres, les acides or- ganiqucs et d'autres composes solubles.

Ejyi.t cles rc;sincs dr type Foli~l c~t Po.17llrtitc Hf Slrr I N I . ( ; ( . [ I~?L; I .CI~~OIT dl. 111 p1.oli11e ALI cours de dosages de la t e n e u ~ en proline des

fe~lilles et collets de luzerne suivnnt la methode de Singh et al. (1973) nous avons constate qile I'emploi d'une !-&sine de type Folin telle que Ionac C-I01 (Matheson, Coleman et Bell) ou DeCalso (Sargent & Co.) causait des pertes de 20 ;I 22% dans le contenu en proline des collets et de 30 B 35% dans celui des feuilles (Tableau 2). Ce type de resine est generalement iltilise pour In purification des ex- traits et I'elimination des acides amines basiques,

TABLEAU 2. Effets des resines sur l'extraction et la purification de la proline dans les feuilles et les collets de luzerne

Mode d'extraction Dosage" Feuilles Collets

Ethanol + Perrnutite Q" TSM-I 100' 100 Ethanol + CHCI3 + Ionac

C-101 Benzene 71 80 MCE TSM-1 94 97 MCE + Perrnutite Q TSM-I 96 100 MCE + Ionac C-I01 Benzene 64 78

Ar.c,c. /'c;//ltltlo/ .Dosage avec un autoanalyseur d'acides arnines (TSM-I d e Technicon L'ethanol peut i tre substitue h MCE pour I'extl'action suivnnt lnc.) ou par In mi thode de Singh et ol. (1973) avec le benzene.

la de I ~ A , O , A , C , ( ~ ~ ~ ~ ~ i ~ ~ i ~ ~ of official ~ ~ ~ l ~ ~ i ~ ~ l *,,;M">l,yle adaptkc par Nguyen et Filquin (1971) Ct utilisee comme ,U,U,.,,LU.

Chemists) modifiee par Nguyen et Paquin (1971). Environ CEII pourecntage. Moycnne d e quatre repetitions.

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PAQUIN ET LECHASSEUR 1853

surtout de l'ornithine et de la lysine, qui inte~ferent dans le dosage de la proline. De fait, les extraits ;I

I'ethanol suivant la methode de Nguyen et Paquin (1971) subissent egalement des pel-tes lors d'un passage s u r une resine de type Folin, alors que I'emploi d'une resine de type H+ telle que la Per- mutite Q (Permutit Co., U.S.A.) permet une recuperation de 100% des acides aminks.

Si nous augmentons la q ~ ~ a n t i t e de p~al ine de 0.25 ;I 1.25 k~mol, une quantite proportionnelle de pro- line est absorbee pal- la resine Ionac C-101 et la recuperation de I'acide amine p i ~ r du commerce se situe aux environs de 90% (Tableau 3). Si la quan- tite d'Ionac C-iOl est doublee ou mEme triplee, les pertes sont egalement doublkes OLI triplees laissant un pourcentage de 1.ecuperation de 78 et de 62% respectivement.

Des lavages ;I I'eau et :I l'acide chlorhydrique 0.01 N n'ont pas augmente le pourcentage de 1.6cupCration de la proline demontmnt que I'acide amink est fortement lie :I la resine.

Slrr It1 r~;c.rrpP~.trriot~ dcs trlrtrrs trc,itles t11?7in Ps Sachant ~ L I ' L I ~ certain pourcentage de la proline

etait retenu par les resines de type Folin, nous avons determine au moyen d'un autoanalyseur (B 570nm) le pourcentage de recuperation d'un melange d'acides amines purs du commerce et des acides amines libres contenus dans des extraits de collets de luzerme aprts leur passage sill 1'Ionac C-101 (Tableau 4). Si les acides amines de type acide et neutre ne sont pas retenus pal. 375 mg d'Ionac C- 101, quantite generalement utilisee dans la methode de Singh, les basiques par ailleurs ne sont pas completement I-etenus; ils sont recuperes h 40% environ, 2 I'exception du y-aminobutyrique. MEme en quadruplant la quantite d'Ionac C-101, environ 90% des basiques sont retenus par la resine qui I-etient egalement iln pourcentage important des acides amines de type acide (colonne B, Tableau 4). Quant aux acides amines libres contenus dans les collets de luzerne (colonne C), la recuperation, apres leur passage sur 375 mg de resine, est moindre que ceux du melange d'acides purs pour ceux du type acide et equivalente pour les basiques, soit environ 40%. B l'exception de I'ornithine qui est completement retenue par la resine (colonne D, Tableau 4).

Afin de mieux connaitre le degre d'inte~ference des acides amines dans le dosage de la proline selon la methode de Singh et al. (1973), nous avons dose separement chacun des acides amines suivant la mEme methode, avec et sans passage sur I'Ionac C-101, B 5 15 nm. En l'absence de la resine, seuls les acides amines basiques ont reagi h la methode, les autres de type acide ou neutre, h I'exception de la

TABLEAU 3. Effet d'une resine de type Folin (Ionac C-101) sur la recuperation de la proline

Ionac C-101, mg Proline ( ~ m o l ) o 375 750

0.25 0.25 (100)" 0.22(89) 0.18(74) 0.50 0.52 (104) 0.43 (87) 0.37 (75) 0.75 0.78 (104) 0.70 (93) 0.58 (77) 1 .OO 1.07 (107) 0.91 (91) 0.81 (81) 1.25 1.34 (107) I . l l (89) 1 .Ol (81)

Moyenne (104 k 3) (89 k 3) (78 k 3)

'En micromoles. Entre parenlhi.scs, pourcentage de recuptration. M o - yenne de deux repetitions.

TABLEAU 4. Effet d'une resine de type Folin (Ionac C-101) sur la recuperation d'acides amines purs du commerce ou contenus

dans des collets de luzerne"

Du commerceh Collets de luzernec --

Acide anlint A B C D -

Aspartique 94 65 1.13 92 Threonine 99 79 0.89 93 Strine 96 74 1.39 85 Asparagine 102 84 27.38 8 8 Glutamique 97 78 6.46 87 Glycine 95 80 0.33 82 Alanine 98 9 1 3.99 86 Valine 99 95 1.08 9 1 Cystine 99 92 0 Trace Methionine 103 100 Trace Trace Isoleucine 102 99 1 .Ol 87 Leucine 100 100 0.77 96 Tyrosine 100 100 0.29 100 Phenylalanine 100 100 0.31 100 y-aminobutyrique 84 60 2.20 78 Ornithine 40 12 0.18 0 Lysine 40 11 0.44 38 Histidine 36 10 4.37 45 Arginine 43 14 14.21 45

"Dosage avec un autoanalyseur (TSM-I de Technicon) i 570 nm. bPo~~rcen tage recupere apr2s passage sur 375 nlg (A) el 1.5 g (B) d ' lonac

C-101. Concentrat~on originale des acides arnines: 0.1 ~lniol . CEchanlillo~is de Saranac preleve le 10 octobre i~ St-Vallier; micromoles

d'acides anlines (C) et pourcentage recupere apres passage sur 375 mg d'lonac C-101 (Dl. Moyenne de quatre repetitions.

methionine, n'ont pas donne de solution coloree detectable (Tableau 5). Parmi les basiques, I'ar- ginine, I'histidine et la methionine ont reagi tres faiblement, alors que la reaction avec la lysine equivaut B 8% de celle de la proline et celle de I'ornithine B 120%. Seule, I'ornithine reagit plus for'tement que la proline, selon la methode de Singh et al. (1973) en I'absence de I'Ionac C-101. Apres le passage sur 375 mg d'Ionac C-101 on constate que la resine a retenu 52% de la lysine et 73% de I'or- nithine. De plus, elle a retenu egalement 24% de la proline originale. Or les quantites de lysine et d'or- nithine presentes dans les collets et les feuilles de luzerne, soit moins de 0.5 pmol (Tableau 4), sont

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1854 C A N . J . BOT. VOL. 57. 1979

TABLEAU 5. Effet de I'Ionac C-I01 sur la recuperation d'acides amines doses selon la methode de Singh et al. (1973)

Acide arnine Sans Ionac Avec Ionac" - Retention,

Nom QuantitC,pM TrouvC 7 2 Trouve % %

Arginine 4 .0 0.001'' 0.04 Oh 0 100 Histidine 4 .0 0.018 0.45 0.002 0.05 89 Lysine 4 .0 0.32 8 .0 0.151 3.8 5 2 Methionine 4 .0 0.014 0.34 0.011 0.27 2 1 Ornithine 4 .0 4.82 120.0 1.32 33.0 73 Proline 2.0 2.00 100.0 1.52 76.0 24

"Trois cent soixante-quinze milligrammes d'lonac C-101 de Matlieson, Coleman et Bell. hEquivalent en micromoles de proline. Moyenne de deux repetitions.

TABLEAU 6. Extraction I'tthnnol de la proline contenue dans des feuilles ct des collets de luzerne comparee a celle utilisant

le methanol-chloroforme-eau (MCE)"

VariCtC de Ethanol/ luzerne Organe MCE Ethanol MCE, 2

Saranac Feuilles 1.28" 1.66 130 Collets 4.27 4.19 98

Titan Feuilles 0.47 0.60 128 Col lets 0.59 0.59 100

"Dosage de In proline par la mftliode de Sing11 modifife. bEn micromoles par gramme de mari&re fraiclie. Moyenne de qualre

repetilions.

plut6t faibles par comparaison B la proline qui peut atteindre 100 pmol/g matikre fraiche 101-s d'un stress parle froid ou la secheresse (Paquin 1977).

Snuf en presence de quantites importantes d'or- nithine dans les tissus vegetaux, i l vaut mieux sup- PI-iniel I'emploi d'une resine de type Folin dans la purification des extraits pour le dosage de la pro- line. Dans le cas contraire, il faut apportel' une correction ii la fois pour la quantite de proline re- tenue pal. la resine (environ 24%) et pour les quan- tites de lysine et surtout d'ornithine non I-etenues par la resine (soit 48 et 27% respectivernent).

Cortlpcr/~cri.sorl tles c.rtrcrit.s ir I'ithcrnol crucJt. MCE titrrrs Ic tloscrgr tic Itr pr.olir7c

Le Tableau 6 montre que I'extrnction i I'ethanol suivant la methode decrite plus haut se compare favorablement ;I celle utilisant le methanol- chloroforme-eau (MCE, 12:5: I, v/v). Le dosage de la proline ;I 515 nm dans les collets donne des resultats identiques pour les deux types d'extrac- tion et de 30% superieur pour I'extl-action h I'ethanol dans le cas des feuilles.

La dilution des extraits n'affecte pas le dosage quantitatif de la proline avec le benzene 5 15 nm et la proline ajoutee aux extraits est recuperee B 100%.

Conclusions ( I ) I1 h u t eviter le plus possible I'eniploi de

resines de type Folin pour la purification des ex- traits destines i I'analyse des acides amines i cause d'une mauvaise retention pour certains et d'une mauvaise recuperation pour d'autres. (2) S'il est necessaire d'utiliser une resine de type Folin en presence de quantites trop elevees d'ornithine ou de lysine, il faut introduire un facteurde co~.rection pour les m2mes raisons invoqi~ees precedemment. (3) Pour le dosage de la proline (voir Materiel et methodes). il vaut mieux preleve~. une partie aliquote de la phase superieure que de decanter cette derniere suivunt la methode originale; on evite de cette nia11ie1-e la contamination par le chloroforme q ~ ~ i g2ne en plus le chauffage ail bnin-marie. (4) La methode d'extl-nction avec le methanol-chloroforme-eau est plus rapide que celle de I'ethanol. Cependant, cette derniere niethode permet le dosage des sucres. des acides 01-ganiques et d'autres composes.

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