DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE

R.I.A

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INTRODUCTION La radio-immunologie fait appel la physique nuclaire

radioactivit et l'immunologie, pour le dveloppement de la mthode de dosage radio-immunologique. Technique trs sensible qui permet de mesurer des quantits infimes de substances biologiquement actives. Avec la collaboration du mdecin amricain Solomon Berson, Rosalyn Yalow commence utiliser les radio-isotopes pour explorer et diagnostiquer diverses maladies. Leurs tudes sur les mcanismes du diabte de type 2 les conduisent dvelopper la mthode de dosage radioimmunologique : RIA Le premier dosage radio immunologique : Dosage de linsuline par Yalow et Berson en 1959 Point de dpart dun ensemble de mthodes dimmuno-dosages faisant appel un traceur.

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En effet, on marque les molcules avec un radionuclide, qui est gnralement de l'iode 131 ou 125 ou du Trium H3

Le DRI repose sur lutilisation : Raction Ag-Ac Mthodes radioactives Cette combinaison est responsable de la spcificit et de la sensibilit du DRI

Les DRI peuvent tre classes en deux groupes selon les proportions relatives danticorps et dantignes prsentent dans la raction.On distingue : -Le dosage R.I. classique : RIA ou dosage par comptition, en dfaut dAC -Le dosage immuno-radiometrique : IRMA, en excs dAC

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Dosage par comptition (dfaut dAc) Mthodes faisant appel des Ac ou des Ag marqus

Immuno-dosages des Ag ou des Ac par des techniques en phase htrogne

La phase est htrogne parce qu'il faut isoler les complexes

Ag-Ac forms des Ac ou Ag rests en solution. L'Ac non marqu (Aco) et l'Ac marqu (Ac*) se fixent l'Ag dans les proportions de leur mlange. La quantit du complexe Ac*-Ag diminue au fur et mesure qu'augmente la quantit d'Aco dans le milieu. La mesure de la radio-activit du complexe Ac*-Ag ne peut tre faite qu'aprs limination de la fraction Ac* libre

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A lquilibre, une partie de lantigne est lie lanticorps (Bound) le reste

est libre (Free) En utilisant un systme de sparation on peut sparer B et F

Grce au signal dlivr par le marqueur on peut mesurer la concentration de

lantigne marqu libre F* et du complexe B* Ces concentrations sont, lquilibre dans les mmes proportions que les

concentrations des fractions F et B de lAg non marqu On a donc pour toutes les concentrations de lAg :

B / F = B*/ F* Le signal dlivr par le marqueur est inversement proportionnel la concentration en antigne.

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Les mthodes pour sparer le constituant libre et le constituant li dans le complexe Ag-Ac sont nombreuses et font appel diffrentes techniques -Prcipitations * soit immunologique (mthode du double Ac) : le complexe Ag-Ac est prcipit par un srum anti-gammaglobuline; * soit physico-chimique : par les solvants organiques (alcools...), le sulfate d'ammonium demi-saturation (Test de Farr), la protine A du staphylocoque; * soit fixation de l'Ag sur un support solide : c'est la mthode la plus dveloppe actuellement de par sa simplicit et sa rapidit de mise en uvre. Les dosages immunologiques par comptition sont raliss principalement avec les isotopes radioactifs et les enzymes comme marqueurs.9

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Avantages et inconvnients des dosages par comptition

Sappliquent tous les antignes, en particulier aux haptnes Ncessitent une constante daffinit leve

Possibilit de ractions croises TSH, FSH-LH, HCG possdent en commun une sous unit Tout Ac qui reconnat un pitope reconnat les 4 hormones

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Dosage Immuno-Radiomtrique : IRMA Immuno Radiomtrique Assay Depuis lavnement des Ac monoclonaux, lIRMA a remplac la

mthode par comptition. Elle se distingue par :

prsence dun excs dAc utilisation dun 2eme Ac marqu 2 Ac dirigs contre 2 pitopes suffisamment loigns sur la molcule dAg

La molcule tester est prise en sandwich entre les deux Ac La radioactivit lie est proportionnelle la quantit dAg

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Dans ces tests, l'Ag (ou l'Ac) est fix un support solide (billes,

tubes, plaques de microtitration en polystyrne. Dans le premier temps de la raction, le liquide biologique tester, contenant les Ac (ou les Ag), est mis en contact avec le support "sensibilis" qui est ensuite lav. Dans un deuxime temps, les Ac (ou les Ag) qui se sont fixs, sont rvls par l'addition d'un second Ac marqu : soit par un isotope radioactif pour les radio-immuno-assays (RIA), (soit par une enzyme pour l'enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) ou pour l'immunoblot, soit par un fluorochrome pour la fluorimtrie). Aprs lavage, l'activit rsiduelle est mesure par un systme adquat spcifique du marqueur (compteur de dsintgration, substrat de l'enzyme et spectrophotomtre, fluorimtre...)13

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Avantages et inconvnients : IRMA Spcificit Lutilisation de deux Ac amliore la reconnaissance

Sensibilit Toute molcule(trace) dAg mise en prsence de lAc liant est susceptible dtre capte Gamme de concentrations plus tendues(dtections en exces)

Inconvnients

Ractions croises : Epitope semblablePrsence dauto Ac Effet crochet, peut apparatre pour des concentrations leves dAg ; lAg ne ralise plus de pont entre les deux Ac ce qui entrane une baisse du signal.15

Pour liminer ce phnomne ; addition squentielle des ractifs spare par une tape de lavage.

Test de Farr est une technique de dosage radio-immunologique : elle utilise de lADN double brin marqu par un radio-isotope (125I). Elle se droule en 4 tapes :

Incubation du srum du patient(Ac anti ADN) avec lADN double brin marqu Sparation des complexes immuns par prcipitation et centrifugation Elimination de lADN double brin marqu non li l Ac Mesure de la radioactivit (proportionnalit entre la radioactivit mesure et la quantit danticorps prsents dans le srum)

Une courbe talon tablie avec des quantits connues et

croissantes d'Aco pour une mme quantit connue et constante d'Ac*, permet par simple report de connatre une quantit inconnue d'Aco contenue dans un liquide biologique16

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Marqueurs

Elment

Radioactivit (Ci/mmol)

Demi-vie

Rayonnement

C14 H3

0.062 29

5568 ans 12.3 ans

I125I131

220016100

59.7 j8.1 j

,

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Principe du dosage

Le RIA-gnost hTSH permet de doser in vitro la thyrotrophine dans le srum (ou le plasma) humain daprs le principe du test sandwich 1 tape.Au cours de ce test, il se forme un complexe entre lanticorps anti-hTSH (monoclonal, souris) fix sur la paroi du tube, la TSH contenue dans lchantillon et lanticorps anti-hTSH marqu l125I (monoclonal, souris). Une fois la raction effectue, la partie libre du traceur est limine par dcantation (ou aspiration) et rinage. La fraction de traceur spcifiquement fixe sur les tubes revtus danticorps est mesure laide dun compteur gamma. Lvaluation des rsultats fournis par les chantillons inconnus se fait laide dune courbe dtalonnage tablie dans des conditions identiques. En cas de dosages effectus en double, on peut traiter au maximum 42 chantillons de patients avec une seule courbe dtalonnage. Les anticorps monoclonaux contenus dans la trousse sont hautement spcifiques de la TSH. Une raction croise avec hLH, hFSH et hCG, dans les plages de concentrations importantes sur le plan physiologique est pratiquement exclue.

Les chantillons dpassant la plage de mesure sont dilus avec le tampon de lavage.La standardisation t ralise par rapport au standard hTSH WHO 80/558.

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Lecture des rsultats Porter sur du papier millimtr dune part les coups par minute :

cpm des standards S1 S6 dautre part la concentration de TSH correspondante (UI/ml). Construire la courbe talon Marquer les valeurs du srum de contrle et des chantillons doser, puis lire sur la courbe dtalonnage la concentration en TSH.

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Standards (ml) Srum de contrle (ml) Echantillons (ml) N des tubes S1 S2 S3 S4 S5 S6 C, 1, 2..... Standards 200/200 l Srum de contrle / Echantillons Traceur antihTSH ------------------------------------------ 100 l ------------------------------------ 21

--- Agiter pendant 2 h (300 50 tr/min) Tampon de lavage -------------------------------------------- 1 ml ---------------------------------------- Dcanter (aspirer) ; laver avec 1 ml Compter( cpm)

CONTRLE DE QUALITE Dfinir les caractristiques de la mthode employe Rsultat doit tre prcis , reproductible Deux sortes derreurs

- erreur systmatique - erreur alatoire

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Erreur systmatique Ecart toujours de mme signe entre un rsultat et la valeur vraie Paramtres entrainant une erreur systmatique

- Etalon : conservation - Ac : utilisation dAc peu spcifique ( rsultats plus levs) - Matriel : pipettes non calibres - Echantillon : prsence dauto anticorps

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Erreur alatoire Ecart de signe et de grandeur imprvisible entre un rsultat et la

valeur vraie. Facteurs responsables

- Distribution des diffrents ractifs - Mthode de sparation - Erreurs de mesure du signal Lerreur alatoire estime la prcision de la technique

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CRITERES DE QUALITE Exactitude : valeur vraie ou estime au mieux ( dilution) Prcision : mesures rptes sur le mme chantillon Sensibilit : variation minimale imposer la concentration

pour obtenir une variation significative de la rponse Spcificit : mesurer lanalyte dsir et seulement celui-ci , elle

est lie la nature des Ac

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