NUM6 UNIVERSITE NANGUI 060318 093630 1

République de Côte d'Ivoire Union - Discipline - Travail

------------ Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche

Scientifique

ll'l!VCB,1 rt, NANGUIABROGOUA

L C B 0 s N

Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UFR-SFA)

Laboratoire de Chimie Bio-Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN)

Année Académique : 2016-2017

MEMOIRE DE MASTER DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUEES

MENTION : CHIMIE

Option : Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles

SUJET

CONTRIBUTION À L'ÉTUDE PHYTOCHIMIQUE D'UNE

Présenté par YEBOUE Koffi Apollinaire Soutenu le 08 Janvier 2018

Devant le jury d'examen composé de :

M. BENIE Anoubilé, MC (UNA) Mme MAMYRBEKOVA J. Epse BEKRO, PT (UNA) M. OUATTARA Zana Adama, MA (UNA) M. KONAN Koffi Marcel, MA (UNA)

Président

Directeur scientifique

Examinateur

Encadrant

République de Côte d'Ivoire Union - Discipline - Travail

------------ Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche

Scientifique

u~1v1.1c.,11 E NA:'1/GUI AlfüüGOUA

• '

L C B 0 s N

Unité de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées (UFR-SFA)

Laboratoire de Chimie Bio-Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN)

Année Académique: 2016-2017

MEMOIRE DE MASTER DES SCIENCES FON DAMENT ALES ET APPLIQUEES

MENTION : CHIMIE

Option : Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles

SUJET

CONTRIBUTION À L'ÉTUDE PHYTOCHIMIQUE D'UNE

NELUMB,ONACEAE· : Ne/umbo nucifera de Côte d'Ivoire

Présenté par YEBOUE Koffi Apollinaire

Soutenu le 08 Janvier 2018

Devant le jury d'examen composé de :

M. BENIE Anoubilé, MC (UNA)

Mme MAMYRBEKOVA J. Epse BEKRO, PT (UNA)

M. OUATTARA Zana Adama, MA (UNA)

M. KONAN Koffi Marcel, MA (UNA)

Président

Directeur scientifique·

Examinateur

Encadrant

TABLE DE MATIERE

TABLE DE MATIERE 1

AVANT-PROPOS 111

DEDICACE IV

REMERCIEMENTS V

LISTE DES ABREVIATIONS ET FORMULES CHIMIQUES VI

LISTE DES FIGURES VII

LISTE DES TABLEAUX IX

INTRODUCTION 1

CHAPITRE 1: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 2

1.1. Généralités sur la plante 2

1.1.1. Position systématique 2

1.1.2. Description botanique 2

1.1.3. Répartition géographique 3

1.1.4. Utilisation traditionnelle de la plante 3

1.1.5. Propriétés pharmacologiques 4

1.1.6. Composition chimique 4

1.2. Métabolites secondaires 7

1.2.1. Terpènes et stérols 7

1.2.2. Alcaloïdes 8

1.2.3.Composés phénoliques 9

1.3. Stress oxydatif 19

1.3.1. Définition 19

1.3.2. Antioxydants 19

CHAPITRE Il: MATERIEL ET METHODES 22

11.1 . Matériel 22

11.1.1. Matériel végétal. 22

11.1.2. Matériel chimique et technique 22

11.2. Méthodes 22

Il. 2.1. Préparation des extraits 22

11.2.1.1. Macération 22

11.2.1.2. Extraction liquide-liquide 23

11.2.2. Tri phytochimique sur CCM 24

11.2.3. Etude quantitative 25

11.2.3.1. Dosage des polyphénols totaux par spectrophotométrie 25

11.2.3.2. Dosage des tatins par permanganométrie 25

11.2.3.3. Dosages des flavonoïdes totaux 27

11.3. Evaluation du pouvoir antioxydant.. 27

11.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM 27

11.3.2. Evaluation du pouvoir anti oxydant par spectrophotométrie 28

CHAPITRE Ill: RESULTATS ET DISCUSSION 28

111.1. Tri phytochimique par CCM 28

111.1.1. Extrait hexanique 29

111.1.2. Extrait chloroformique 31

111.1.3. Extrait acétate éthylique 32

111.1.4. Extrait n-butanolique 34

111.1.5. Bilan du criblage phytochimique 35

111.2. Etudes quantitatives 36

111.2.1. Teneurs en phénols totaux 37

111.2.2. Teneur en tanins totaux 37

111.2.3. Dosage des flavonoïdes totaux 37

111.3. Evaluation du pouvoir antioxydant.. 38

111.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM 38

111.3.1.1. Pouvoir antioxydant de l'extrait hexanique 38

111.3.1.2. Pouvoir antioxydant de l'extrait chloroformique 39

111.3.1.3. Pouvoir antioxydant de l'extrait d'acétate d'éthyle 39

111.3.1.4. Pouvoir antioxydant de l'extrait n-butanolique 40

111.3.2. Evaluation du pouvoir antioxydant par spectrophotométrie 41

CONCLUSION 44 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 46

ANNEXES 56

Il

AVANT-PROPOS

Le présent mémoire a été réalisé au Laboratoire de Chimie Bio

Organique et de Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Université Nangui

Abrogoua (UNA), sous la direction scientifique du Professeur

MAMYRBEKOVA Janat Akhanovna épouse BEKRO, sous l'encadrement de

Docteur KONAN Koffi Marcel, Maître-Assistant avec l'assistance technique

du Docteur KABRAN Guy Roger Mida, Assistant. Ces travaux ont été

effectués dans le cadre de l'obtention du Master des Sciences Fondamentales

et Appliquées, option Chimie et Physico-Chimie des Substances Naturelles.

Ill

DEDICACE

Je dédie ce travail à mon père Yeboué Kouadio Jacques, à ma mère

Konan Ahou Jeannette, et particulièrement à ma fille Yeboué Ange Mienmoh Alvira Serena.

IV

REMERCIEMENTS

- Au Professeur MAMYRBEKOVA Janat Akhanovna épouse BEKRO,

mon directeur scientifique, Professeur Titulaire, sous-directeur du Laboratoire

de Chimie Bio-Organique et des Substances Naturelles (LCBOSN) de l'Unité

de Formation et de Recherche des Sciences Fondamentales et Appliquées

(UFR-SFA) de l'Université Nangui Abrogoua (UNA). Il m'est difficile de trouver

les mots justes pour vous exprimer toute ma gratitude. Merci Maman BEKRO!

- Au Professeur BEKRO YVES-Alain, Directeur du LCBOSN pour

m'avoir accepté dans son laboratoire; j'y ai pu bénéficier de ses

enseignements, sa rigueur dans le travail.

- Aux Maîtres de Conférences BENIE Anoubilé, KODJO Charles

Guilhaume, KOUAME Bosson Antoine, BOUA Boua Benson pour leur

enseignement.

- Aux Docteurs KONAN Koffi Marcel et KABRAN Mida Guy Roger;

qu'ils trouvent ici l'expression de ma profonde reconnaissance pour leur

dévouement exemplaire, leur encadrement et leurs conseils ainsi que leur avis

judicieux durant la réalisation de ce mémoire.

- Aux Docteurs Ouattara Adama Zana, N'GUESSAN Alain Hugues, KADJA Amani Brice et N'GAMAN Kohué Christelle Epouse Kouassi pour leur enseignement, leur disponibilité, leur aide et conseils lors des

manipulations.

- Au doctorant Tano Modeste Bosson, qui a bien voulu suivre toutes les

étapes de mon travail. Je voudrais lui exprimer ma profonde reconnaissance.

- A tous les doctorants du laboratoire LCBOSN, merci de votre

collaboration.

Mes remerciements vont aussi à l'endroit de tous mes frères et sœurs et

de ma chérie Konan Ahou Charlotte, et également de mes collègues et amis

de Master de la promotion 2016 - 2017 qui ont, chacun à leur façon, et ce, à différentes étapes de notre cheminement, contribué à la réalisation de ce

travail.

V

LISTE DES ABREVIATIONS ET FORMULES CHIMIQUES

DPPH: 2, 2-Diphényl-1 '-picrylhydrazyle

ABTS: Acide 2, 2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline)-6-sulfonique

CCM : Chromatographie sur Couche Mince

IR: Infra Rouge

Rf: Rapport frontal

UV: Ultra-Violet

EAG: Equivalent en acide gallique

RMN: Résonance Magnétique Nucléaire

CLHP: Chromatographie Liquide Haute Performance

VI

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Nelumbo nucifera (Photo prise par Yeboué en Septembre 2017) 3

Figure 2: Quelques structures de flavonoïdes isolés de Nelumbo nucifera 5

Figure 3: Quelques structures d'alcaloïdes isolés de Nelumbo nucifera 6

Figure 4: Structure chimique de l'isoprène 7

Figure 5: Structures chimiques de quelques stérols 8

Figure 6: Structures chimiques de quelques alcaloïdes 9

Figure 7: Formule générale de l'acide benzoïque et ses dérivés hydroxylés .. 10

Figure 8: Formule générale de l'acide cinnamique et ses dérivés hydroxylés 11

Figure 9: Structures chimiques de quelques coumarines 12

Figure 10: Structures de quelques classes des flavonoïdes 13

Figure 11: Structures chimiques de l'acide digallique (a) et de l'acide ellagique

(b) 14

Figure 12: Structure moléculaire du pentagalloylglucose 14

Figure 13: Squelette de base des monomères des proanthocyanidines 15

Figure 14: Exemple d'un polymère de flavan-3-ol 15

Figure 15: Structure moléculaire de base du flavan-3-ol (monomère) 16

Figure 16: Représentation des voies de biosynthèse des composés

phénoliques 17

Figure 17: Stabilisation de radicaux par l'hydroxytyrosol 20

Figure 18:Schéma synoptique de préparation des extraits 23

Figure 19: Principe du test de DPPH" 28

Figure 20: CCM de l'extrait hexanique 30

Figure 21: CCM de l'extrait chloroformique 32

Figure 22: CCM de l'extrait d'acétate d'éthyle 34

Figure 23: CCM de l'extrait n-butanolique 35

Figure 24: Chromatogramme de l'extrait hexanique de Nelumbo nucifera vis-à-

vis du DPPH· 38

Figure 25: Chromatogramme de l'extrait chloroformique de Nelumbo nucifera

vis-à-vis du DPPH" 39

VII

Figure 26: Chromatogramme de l'extrait d'acétate éthylique de Nelumbo

nucifera vis-à-vis du DPPH· 40

Figure 27: Chromatogramme de l'extrait n-butanolique de Nelumbo nucifera

vis-à-vis du DPPH' 41

Figure 28: Pourcentages d'inhibition du radical DPPH· par extraits sélectifs de

Ne/umbo nucifera et Vitamine C 41

VIII

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Principales classes de composés phénoliques 10 Tableau Il: Propriétés biologiques de quelques composés phénoliques 18

Tableau Ill: Récapitulatif de la CCM dans les feuilles de Nelumbo nucifera 35

Tableau IV: Clso des extraits sélectifs et de la vitamine C 42

IX

INTRODUCTION

'

Depuis l'antiquité, bon nombre de remèdes utilisés par l'homme sont

d'origine végétale [1]. Les plantes constituent de ce fait une source majeure

de médicaments, au vu de leur richesse en métabolites secondaires [2]. En

effet, ces composés avec leurs structures variées permettent aux plantes de

contrôler leur environnement animal, végétal et de résister contre diverses

pathologies [2]. Ainsi, ceux-ci constituent pour l'homme un réservoir de

médicaments pour lutter contre les agressions des organismes vivants

pathogènes (champignons, bactéries, virus ... ). Partant de ce fait, la recherche

de molécules thérapeutiques au sein de la biodiversité végétale s'impose à la

communauté scientifique et ce dans le but de concevoir des panacées pour

lutter contre les agents pathogènes résistants de l'organisme. C'est dans ce

contexte que le Laboratoire de Chimie Bio Organique et des Substances

Naturelles (LCBOSN) de l'Université de Nangui Abrogoua (UNA) a axé ses

thématiques de recherche sur la valorisation des substances naturelles afin

d'apporter une caution scientifique à la phytomédecine qui enregistre de plus

en plus des résultats probants.

Le présent travail est une contribution à la valorisation de Ne/umbo

nucifera, une plante aquatique largement utilisée en médecine traditionnelle

contre diverses pathologies. Pour mener à bien cette étude, les priorités

suivantes ont été définies :

../ préparer l'extrait hydrométhanolique par macération;

../ préparer les extraits sélectifs par l'épuisement aux solvants à polarité

croissante;

../ identifier les grands groupes de composés chimiques contenus dans les

extraits sélectifs par CCM;

../ déterminer les teneurs des grands groupes de métabolites secondaires

contenus dans la plante étudiée;

../ évaluer le pouvoir antioxydant.

1

1

CHAPITRE 1: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1.1. Généralités sur la plante

Nelumbo nucifera est une plante aquatique pérenne de la famille des

Nelumbonaceae. Elle est connue sous diverses appellations: lotus ou lotus

sacré en français, lian en chinois. Elle possède également plusieurs

synonymes. Ce sont: Nelumbium nelumbo, Nelumbo speciosa, Nelumbo

speciosum et Nymphaea nelumbo [3;4].

1.1.1. Position systématique

La position systématique de Nelumbo nucifera Gaertn se présente

comme suit:

Règne

Embrachement Sous-embrachement

Classe Sous classe

Ordre Famille

Genre Espèce

Végétal

Spermaphytes

Angiospermes

Magnoliopsida

Magnoliidae

Nymphaeales

Nelumbonaceae

Ne/umbo

nucifera

1.1.2. Description botanique

Le lotus sacré est une plante aquatique, vivace grâce à sa tige en

rhizome spongieux, épais, ramifié, portant des tubercules fixés dans le fond de

l'étang [5]. Les feuilles membranées, grandes de 60 cm de diamètre sont

portées par de longs pétioles, rugueux comportant de petites épines distinctes.

Les fleurs sont blanches à rosées douces, hermaphrodites, solitaires avec un

diamètre de 10 à 25 cm. Elles possèdent de longues carpelles ovoïdes et

glabres allant jusqu'à 12 mm de long. Les fruits ayant l'aspect d'une pomme

d'arrosoir, ils renferment plusieurs graines noires et dures [6].

2

Figure 1: Nelumbo nucifera (Photo prise par Yeboué en Septembre 2017)

1.1.3. Répartition géographique

Nelumbo nucifera est originaire de l'Inde [4; 6- 9]. Elle est cultivée de nos jours dans tout le monde entier [10]. En Côte d'Ivoire, N. nucifera se trouve

dans la Vallée du Bandama (Région du Gbèkè, Département de Botro) et

dans 3 lacs d'embellissement de la ville de Yamoussoukro (Région des lacs,

Département de Yamoussoukro) [11 ; 12].

1.1.4. Utilisation traditionnelle de la plante

Nelumbo nucifera est une plante largement utilisée en médecine

traditionnelle. Elle est utile dans le cadre du traitement de la strangurie, des

vomissements, de la lèpre, des maladies de la peau, de l'épuisement nerveux

[13 - 15], de l'inflammation tissulaire et du cancer [16 ; 17]. Les rhizomes sont

prescrits pour soulager les hémorroïdes et la dysenterie [18 ; 19]. Aussi sont ils utilisés pour traiter la spermatorrhée, la leucodermie, la variole,

l'hyperlipidémie, la fièvre, le choléra, l'hépatopathie et l'hyperdipsie [3]. Par

ailleurs, les rhizomes de N. nucifera sont consommés comme légumes dans

de nombreuses cuisines au Cachemire [8], en raison de leur contenu minéral

[20]. Les feuilles de lotus sont un remède populaire pour le traitement de

l'obésité, l'insomnie, les troubles mentaux, la fièvre et l'hématémèse [20 ; 21].

Quant aux fleurs, elles sont utiles dans le traitement de la diarrhée, du choléra,

3

de la fièvre et des ulcères. [16]. Enfin, les graines et les fruits sont utilisés pour

traiter de nombreux maux, y compris les maladies cardiovasculaires [22].

1.1.5. Propriétés pharmacologiques

Plusieurs propriétés pharmacologiques ont été concédées à Nelumbo

nucifera, au nombre desquelles nous comptons les pouvoirs diurétiques,

anthelminthiques, antioxydants, anticancéreux, antiviraux, anti-obésités,

antipyrétiques, hépatoprotecteurs, antiulcéreux , hypoglycémiques,

antidiarrhéiques, antifongiques, antibactériennes et antiinflammatoires [6].

Une étude a rapporté l'activité antiplaquettaire de l'extrait hydro-éthanolique

des fleurs, laquelle activité est due à son contenu phytochimique [21]. En

outre, les effets anti spermatorrhée et anti fertilité de l'extrait éthanolique des

graines de N. nucifera ont été évalués sur les rats albinos mâles et femelles.

Une diminution significative du nombre de spermatozoïdes a été remarquée

après un traitement de 60 jours pour les rats mâles [23]. Par ailleurs, une

réduction notable du poids de l'ovaire a été constatée pendant 41 jours chez

les rats femelles [24].

1.1.6. Composition chimique

Nelumbo nucifera, du fait de ses nombreux usages a fait l'objet de

nombreuses études phytochimiques. La présence des flavonoïdes, des

alcaloïdes, des phénols, des tanins, des phytostérols, des glycosides et des

saponines ont été indiqués dans tous les organes de cette plante. Une étude

menée sur les feuilles de N. nucifera a permis d'isoler quatorze flavonoïdes,

dont quatre ont été identifiés pour la première fois sur cette espèce. Ce sont :

la quercétine 3-0-rhamnopyranosyl-(1-2)-glucopyranoside (1 ), la quercétine-

3-0-arabinoside (2), la diosmetine-7-0-hexose et l'isorhamnetin-3-0-

arabinopyranosyl-(1-2)-glucopyranoside (3) [25] (Figure 2).

4

OH

HO

î HO:o= 0 0 OH OH

HO' . ·,,,,111/0y\ .. ,,,,,OH OH 6~

~ OH

ëH3

Quercétine 3-0-rham nopyranosyl- (1-2)-glucopyranoside (1)

HO 0 ~, ~-o

½OH OH

HO ~ OH

OH

OH

r (î···''''''OH

O ,~OH

0

OH

HO

OH

Quercétine 3-0-arabinoside (2)

OH

lsorhamnetin 3-0-arabinopyranosyl- (1-2) -glucopyranoside (3)

Figure 2: Quelques structures de flavonoïdes isolés de Nelumbo nucifera

En outre, quinze autres composés ont été extraits et purifiés des feuilles

de N. nucifera, dont treize alcaloïdes (liriodénine (4), lysicamine (5), anonaine (6), asimilobine (7), caaverine (8), N-méthylasimilobine (9), nuciferine (10), nornuciferine, roemérine (11 ), 7-hydroxydehydronuciférine, cépharadione B, ~

sitosténone, 4-stigmasta-22-dièn-3-one) et deux chlorophylles (pheophytin-A

et aristophyll-C) [26,27] (Figure 3). Par ailleurs, l'analyse par chromatographie

en phase gazeuse des cires des feuilles a révélé la présence d'un acide (acide

octadécanoïque (0, 7 ± 0,0%) et de plusieurs alcools, à savoir, le nonacosan-

10-ol (16,2 ± 1,1%), le triacontan-7-ol (2,4 ± 0,4%), le nonacosane-4,10-diol

(18,6 ± 0,5%), le nonacosine-5,10-diol (34,1 ± 1,9%), le nonacosane-10,13-

diol (12,0 ± 0,7%) et le triacontane-9,10-diol (0,7 ± 0,0 %) [28].

5

Liriodenine ( 4)

0 /

H3C

HO

0) 0

0

Lysicamine (5)

1 0

Anonaine (6)

H i Caaverine (8) N-méthylasimilobine (9) Nuciferine (10)

H Asimilobine (7)

)

Roemerine (11)

Figure 3: Quelques structures d'alcaloïdes isolés de Nelumbo nucifera

Les travaux menés sur l'extrait méthanolique des étamines de N. nucifera

ont permis d'élucider les structures de treize flavonoïdes (dérivées du

kaempférol et de l'isorhamnétine) et de quatre autres composés (adénine,

myo-inositol, arbutine et bêtasitostérol glucopyranoside) [29]. Quant aux graines, une étude a rapporté leur richesse en protéines,

acides aminés et acides gras insaturés [30]. Certains auteurs ont indiqué

également la présence notable de certains micronutriments dans les graines

de N. nucifera. Il s'agit: du potassium (28.5%), du calcium (22.10%) et du

magnésium (9.20%) [31]. En outre, trois alcaloïdes (bisbenzylisoquinoléine,

nelumboferine et nelumborines A et B) isolés pour la première fois et quatre

autres composés connus (néferine, liensinine, isoliensinine et acide anisique)

ont été isolés des graines de N. nucifera [22-28]. Enfin, les investigations biochimiques menées sur les rhizomes de N.

nucifera ont indiqué l'existence de terpénoïdes, de stéroïdes et de l'acide

bétulinique [32]. Les rhizomes sont composés de l'eau (83,80%), de la matière

grasse (0,11%), des sucres réducteurs (1,56%), des sucrases (0,41%)

protéines (2,70%), de l'amidon (9,25%), des fibres (0,80%), des cendres 6

(1,10%) et du calcium (0,06%). Ensuite, la présence de certaines vitamines

telles que la thiamine (0,22 mg/100 g), la riboflavine (0,6 mg/100 g), la niacine

(2, 10 mg/100 g) et l'acide ascorbique (1,5 mg/100 g) a été révélée dans les

rhizomes de Nelumbo nucifera [33].

1.2. Métabolites secondaires

Les métabolites secondaires se retrouvent dans toutes les parties des

plantes, mais leur répartition n'y est pas équitable. Cela dépend de la fonction

qu'ils assurent au sein de la plante. Aussi, la distribution varie-t-elle d'une

plante à une autre [34].

1.2.1. Terpènes et stérols

• Terpènes

Les terpènes constituent un ensemble connu et très vaste de métabolites

secondaires des végétaux. Ce sont des molécules polyéthyléniques qui

peuvent être considérées comme des dérivés des oligomères de l'isoprène de

formule brute (CsHe) n (Figure 4) [35].

Figure 4: Structure chimique de !'isoprène

Les terpènes sont classés en fonction du nombre n ( entier) d'unités de

carbone, ainsi on a les monoterpènes (n = 2, C10), les sesquiterpènes (n = 3,

C15), les diterpènes (n = 4, C20), les sesterpènes (n = 5, C25), les triterpènes (n = 6, C30), les tétraterpènes (n = 8, C40) et les polyterpènes. Les terpènes

ont des effets d'inhibition microbienne, parasitaire [36 ; 37] et antifongiques [38; 39].

7

• Stérols

Les stérols végétaux, également connus sous le nom de phytostérols,

sont des graisses communes à toutes les plantes supérieures [40]. Leur

structure est apparentée à celle du cholestérol, qui est présent notamment

chez les animaux mais aussi les accompagne dans la plupart des plantes

supérieures. Les principaux phytostérols sont le ~-sitostérol, le campestérol et

le stigmastérol (Figure 5).

cholestérol

17 campestérol

6 ~-sitostérol ,,~

17 stigmastérol

Figure 5: Structures chimiques de quelques stérols

Les phytostérols sont des produits naturels avec un intérêt

pharmacologique important, ils constituent les composés principaux dans un

certain nombre de plantes médicinales. Ces derniers sont étudiés en raison de

leur diversité structurale, de leurs activités pharmacologiques

(anticholestérolémique, antitumorale, antidiabétique et anti-inflammatoire et

également en raison de leur faible toxicité). [41]

1.2.2. Alcaloïdes

Les alcaloïdes figurent parmi les principes actifs les plus importants en

pharmacologie et en médecine [42]. Ce sont des substances organiques

naturelles azotées ayant un caractère basique, et de structures moléculaires

très diverses (Figure 6). Ils dérivent de différents acides aminés ou de l'acide

mévalonique en passant par différentes voies biosynthétiques [43]. Ils sont

toxiques avec le goût amer. Cependant, dans les doses minimes, ils

possèdent des propriétés pharmacologiques [44]. Par exemple, l'atropine,

substance extraite à partir d'une plante médicinale (Atropa bel/adonna) est un

8

poison dangereux, mais à faible dose est utilisée comme un médicament

antispasmodique. Les alcaloïdes sont également utilisés comme

anticancéreux, sédatifs pour traiter les troubles nerveux (maladie de

Parkinson) [45].

/ CON\ '\ N H

Quinine Morphine Gramine

Figure 6: Structures chimiques de quelques alcaloïdes

1.2.3.Composés phénoliques

Ce sont de petites molécules constituées d'un noyau benzénique et au

moins d'un groupe hydroxyle. Elles peuvent être également estérifiées,

éthérifiées et liées à des sucres sous forme d'hétérosides. Leur biosynthèse

dérive de l'acide benzoïque et de l'acide cinnamique. Ayant tendance à

s'isomériser et à se polymériser, ces phénols sont solubles dans les solvants

polaires. Ce sont surtout des antiseptiques (arbutoside de la busserole), des

antalgiques (dérivés salicylés de la reine des prés et du saule) et des anti

inflammatoires [46]. On suppose que les plantes, en les produisant, cherchent

à se prémunir contre les infections et les insectes phytophages. Il existe une

très grande variété de phénols, de composés simples à des substances plus

complexes. Les phénols sont anti-inflammatoires et antiseptiques. Les acides

phénoliques (comme l'acide rosmarinique), sont fortement antioxydants et

anti-inflammatoires et peuvent avoir des propriétés antivirales [47]. En s'appuyant sur la structure carbonée de base, on peut dégager les

principales classes de composés phénoliques [48] présentées dans le tableau

1:

9

Tableau 1: Principales classes de composés phénoliques

Squelette Classes Exemples carboné

Cs Phénols simeles Catéchol

Cs-C1 Acides p-hydroxybenzoïque htd roxtbenzoïg ues

Acides Acide p-coumarique Cs-C3 htdroxtcinnamigues

Coumarines Ombelliférone Cs-C4 Naphtoquinones Juglone

Cs-C2-Cs Stilbènes Resvératrol Flavonoïdes :

- Flavonols Kaemeférol

Cs-C3-Cs - Flavanols Catéchine - Flavanones Naringénine

Anthoctanes Ctanidine lsoflavonoïdes Daidzéine

{Cs-C3}2 Lignanes Entérodiol {Cs-CJ}n Lignines (C1s)n Tanins

• Acides phénoliques

Origines

Epices, fraise

Tomates

Carottes Noix Vigne

Fruits, légumes Pomme Citrus

Fruits rouges Soja

Bactéries intestinales Noyaux des fruits

Raisins

On distingue deux principales classes d'acide phénolique: les dérivés de

l'acide hydroxybenzoïque (Figure 7) et ceux de l'acide cinnamique (Figure 8).

Ils sont présents dans de nombreuses plantes agricoles et médicinales [49].

HO 0

R1 R2 R3 R4 Acide benzoïque H H H H Acide salicylique OH H H H

R4 Acide p-hydroxybenzoïque H H OH H Acide protocatéchique H OH OH H

Acide gallique H OH OH OH

Figure 7: Formule générale de l'acide benzoïque et ses dérivés hydroxylés

10

R1 R2 R3 R4 Acide cinnamique H H H H

Acide o-coumarique OH H H H Acide m-coumarique H OH H H Acide p-coumarique H H OH H

Acide caféique H OH OH H

Figure 8: Formule générale de l'acide cinnamique et ses dérivés hydroxylés

• Coumarines

Pour la première fois, la coumarine fut isolée de la fève tonka

(Coumarouna odorata) à laquelle elle confère son odeur caractéristique de

foin coupé [46]. Les coumarines, de différents types, se trouvent dans de

nombreuses espèces végétales et possèdent des propriétés très diverses.

Elles sont capables de prévenir la peroxydation des lipides membranaires et

de capter les radicaux hydroxyles, superoxydes et peroxyles [48]. Les

coumarines du mélilot (Me/ilotus officinalis) et du marronnier d'Inde (Aesculus

hippocastanum) contribuent à fluidifier le sang alors que les furanocoumarines

comme le bergaptène, contenu dans le céleri (Apium graveolens), soignent les

affections cutanées et la khelline de la khella (Amrni visaga) est un puissant

vasodilatateur coronanien [47]. Du point de vue structurale, les coumarines

sont des composés à base de benzo-2-pyrone (1) (Figure 9), qui sont classés en coumarines simples (2, 3) avec des substituants sur le cycle du benzène,

les furanocoumarines (4), les pyranocoumarines (5), les coumarines

substitués en position 3 et/ou 4 (6). Le dernier groupe est celui des dimères

[43].

11

5 4 6CC(~3 7 1 ,# 2

0 0 8 1

(1) Benzo-2-pyrone

0

(2) Peucédanol

1

HO~

~O~OAO (3) Prenyletine

(4) Psoralène (5) Xanthylétine

(6) Mammea B/AC

Figure 9: Structures chimiques de quelques coumarines

• Flavonoïdes

Les flavonoïdes constituent chez les plantes un groupe très diversifié de

métabolites secondaires qui se produisent naturellement sous leurs formes

conjuguées. Ils sont des composés phénoliques et interviennent probablement

pour protéger les plantes des herbivores et contrôler le transport des auxines

[43]. Les flavonoïdes hétérosidiques sont hydrosolubles et solubles dans les alcools. Les flavonoïdes lipophiliques des tissus superficiels des feuilles sont

solubles dans les solvants polaires et dans les solvants moyennement polaires

(comme par exemple le dichlorométhane) [35]. Ils possèdent de nombreuses

vertus thérapeutiques. Ils sont particulièrement actifs dans le maintien d'une

bonne circulation. Certains ont aussi des propriétés anti-inflammatoire,

antioxydante anti-enzymatique et hépatoprotectrice; ils jouent un rôle

important dans le système de défense et antivirales [50]. En fonction de leur 12

degré d'oxydation et de leur insaturation du cycle C, les flavonoïdes se

présentent sous différentes classes (Figure 10). R R

OH

HO HO

OH 0

Flavones: R=H Apigénine R=OH Lutéoline

Flavonols: R=H Kampférol R=OH Quercétine

OH

HO

~OH

, .. ,)~,~) H

ÔH 0

Flavanones: R=H Naringénine R=OH Eriodictyol

HO

Anthocyanidine

OH C(OH OH

1 HOyC(O .,,,,,, HO 1 H R

~ OH

OH

Flavanols: R=H Catéchine R=OH Gallocatéchine

R

OH

Chalcones: R=H lsoliquiritigenine R=OH Butéine

OH

HO

OH

OH

HO

OH 0

Aurore: Hispidol OH

lsoflavone: Génistéine

Figure 10: Structures de quelques classes des flavonoïdes

• Tanins

Le terme tanin dérive de la capacité de tannage de la peau animale en la

transformant en cuir par le dit composé. Ce sont des métabolites secondaires

de certaines plantes supérieures. Ils se retrouvent dans toutes les parties du

végétal (racine, écorce, feuilles, etc.). Ce sont des polyphénols qui protègent

les plantes de l'infestation par certains prédateurs. Leur structure chimique

leur confère une capacité à fixer et à précipiter des molécules telles que les

alcaloïdes, la gélatine, les polysaccharides et essentiellement les protéines

[51]. Les tanins peuvent se diviser en:

13

./ Pyrogalliques ou hydrolysables. Ils donnent après

hydrolyse à chaud dans des solutions acides étendues, une fraction glucidique

(glucose) et une fraction polyphénolique (acide gallique, acide digallique ou

ellagique ). (Figure 11)

0

HO

OH

HO

011

OH

OH HO

OH

(a) (b)

Figure 11: Structures chimiques de l'acide digallique (a) et de l'acide ellagique (b)

Les tanins hydrolysables possèdent un noyau polyol (dans la plupart des

cas le 0-glucopyranose) dont les fonctions hydroxyles sont estérifiées par des

unités d'acide gallique. Une forme simple de ce type de tanin est le

pentagalloylglucose (Figure 12) qui est très réactif et qui est à l'origine de la

plupart des formes plus complexes (par exemple la castalagine chez le

châtaignier) ;

OH HO, A ,,.OH

1

HOx\HO "-~ ~ o- "'O \ ' ~

HO' ~ 0 ;f\ /- OH HO--( ) \ (OH

HO OH HO OH

Figure 12: Structure moléculaire du pentagalloylglucose

14

../ Catéchiques (ou condensés non hydrolysables). Ils

font partie de la famille des flavonoïdes qui possède un squelette carbonique

en C5-C3-C5 comprenant deux cycles aromatiques (A et B) et un hétérocycle

(C) (Figure 13).

8

605· 4'

tl'~ 1,. 2'

J

5 4

Figure 13: Squelette de base des monomères des proanthocyanidines. Ce sont des composés polyphénoliques hétérogènes qui sont des

dimères, oligomères ou des polymères (Figure 14) de flavanes, flavan-3-ols,

flavan-5-ols, 5-deoxy-3-flavanols et flavan-3,4-diols [52]. Les tanins

condensés se divisent ainsi en plusieurs classes. Parmi eux, sont citées les

prodelphinidines, constituées de ( épi) gallocatéchine et des procyanidines

(dérivés de l'épicatéchine) (Figure 15).

HO

HO~ Ra):j,,,,, R, ,,,~

OH

OH OH

Figure 14: Exemple d'un polymère de flavan-3-ol

15

Monomère R1 R2 R3 R3

catéchine OH H H dxOH 6' ' épicatéchine H OH H

HO- _A. ~0- I' ,,,,, :;'' 2, OH

épigallocatechine H OH OH R1

épicatéchine gallate H G H OH

épigallocatéchine gallate H G OH

Figure 15: Structure moléculaire de base du flavan-3-ol (monomère)

• Biosynthèse des composés phénoliques

La biosynthèse des polyphénols se fait par deux principales voies qui

sont:

../ Voie de l'acide shikimique

La voie de l'acide shikimique permet de produire l'érythrose 4-phosphate

et le phosphoénol pyruvate à partir des hydrates de carbone, lors de leur

dégradation à travers des pentoses phosphates et de la glycolyse

respectivement (Figure 16). Ces derniers sont à l'origine des composés

phénoliques C5-C1, qui forment les tanins hydrolysables et de la chalcone

(molécule de base de tous les flavonoïdes et tanins condensés) [53]. Aussi,

est-il intéressant de préciser que la tyrosine et la phénylalanine dérivent de

cette voie métabolique. En effet, ces deux acides aminés sont des

intermédiaires métaboliques entre l'acide shikimique et l'acide cinnamique.

../ Voie de l'acide malonique

La glycolyse et la ~-oxydation aboutissent à la formation de l'acétyl-CoA

donnant le malonate. C'est à travers cette voie que s'effectue la cyclisation

16

des chaînes polycétoniques, obtenues par condensation répétée d'unités

«Acétate» qui se fait par carboxylation de l'acétyl-CoA. Cette réaction est

catalysée par l'enzyme acétyl-CoA carboxylase [54-55] (Figure 16).

Hydrates de carbone

~ Voie des

PentosesPhosohat

! Glycolyse

l Lipides

l I

ACIDE DE LA SERIE BENZOÏQUE

(Gallique,

l TANINS

HYDROLYSABLES

Erythrose Phosphoénol 4 - Phosphate Pyruvate

~/

Tvrosine

Acide shikimique

~NH,

Phénylalanine TA~/AL

Acides gras

! 13-oxydation

i Acétyl-CoA

+ Malonyl-CoA

i 3 Malonyl-CoA

/ / Cvclisation

ACIDE CINNAMIQUE Polyéthylcétone

~/ COUMARINES CHALCONES

! FLAVONOÏDES

i ANTHOCYANES

! TANINS CONDENSES

PAL: phénylalanine ammonialyase; TAL : tyrosine ammonialyase

Figure 16: Représentation des voies de biosynthèse des composés phénoliques.

17

• Importance des composés phénoliques pour la santé

humaine

Le rôle des composés phénoliques est largement connu dans la

protection contre certaines maladies en raison de leur interaction possible

avec de nombreuses enzymes et de leurs propriétés antioxydantes [56]. Ainsi,

les propriétés biologiques des composés phénoliques sont résumées dans le

tableau Il. Tableau Il: Propriétés biologiques de quelques composés phénoliques

PolY.ehénols Activités biolog!gues Acides phénols (cinnamiques et benzoïques)

Antibactérienne, antiulcéreuse, Antiparasitaire, antifongique,

Anticancéreuse et antioxydante

[57] [58] [59]

Coumarines

Protectrice vasculaire, Anti-inflammatoire, antiparasitaire, Analgésique et antiœdémateuse, anticoagulante et antioxydante

[60-61] [62] [63]

Flavonoïdes

Antitumorale, antiparasitaire, Vasodilatoire, antibactérienne, Anticarcinogène, analgésique, Antiinflammatoire, antivirale,

Diurétique, ostéogène, Antioxydante, antimicrobienne,

Antiallergique et antithrombotique

[64] [65] [66] [67] [68] [62] [69]

Anthocyanes Protectrice capillaro-veineux, antiox_ydante [70]

Proanthocyanidines Stabilisante sur le collagène, antioxydant, antiinflammatoire, antifong.lgue et antitumoral

[71]

Tanins

Antibactérienne, antivirale, Astringente, hémostatique

Antimutagène, antitumorale, Vasoconstrictrice et antiox_ydante

[70] [72] [73] [74]

Lignanes Antiinflammatoire, a~nalgésique [75] Sa2_onines Antitumorale, anticancérigène [76]

18

1.3. Stress oxydatif

1.3.1. Définition

Le stress oxydatif est différent du stress psychique que nous connaissons

tous. Le stress oxydatif correspond à une oxydation des différents constituants

de l'organisme. Les molécules responsables de cette oxydation sont les

radicaux libres. Ils proviennent de l'oxygène contenu dans l'air que nous

respirons. Les radicaux libres ont tendance à dénaturer les constituants

contenus dans notre corps. Ce sont:

• Les protéines, lipides et sucres;

• l'ADN;

• les cellules et leurs membranes.

Ainsi, sous l'action des radicaux libres, nos cellules et leurs constituants

subissent l'action de la «rouille» comme un morceau de métal laissé à l'air

libre. Le stress oxydatif est donc la cause essentielle du vieillissement du

corps. A long terme, l'augmentation anormale de la production des espèces

oxygénées activées (EOA) dans notre organisme peut contribuer à l'apparition

de diverses pathologies telles que les cancers, les maladies cardiovasculaires

etc ... Dans un souci de prévention, il conviendra donc de disposer d'outils

performants permettant d'évaluer correctement le statut de stress oxydant

chez un individu afin d'apporter les corrections nécessaires pour optimaliser

ses défenses antioxydantes et diminuer les dommages oxydatifs induits par

les EOA au niveau de l'ADN, des protéines et des lipides [77-78].

1.3.2. Antioxydants

Les antioxydants sont toutes substances qui lorsqu'elles sont présentes

en faible concentration, retardent ou préviennent de manière significative

l'oxydation du substrat. Les antioxydants sont également des substances qui

protègent les cellules contre les dommages causés par les radicaux libres

[79;80]. Il existe différentes classes d'antioxydants. Nous comptons les

19

1

antioxydants primaires ou radicalaires, les antioxydants secondaires ou

préventifs et les antioxydants naturels .

./ Antioxydants primaires ou radicalaires

Les antioxydants primaires jouent le rôle de piégeurs des radicaux libres.

Ils inhibent les réactions d'initiation et de la propagation d'oxydation en

participant au processus d'oxydation et en convertissant les radicaux libres en

leurs formes inactives. Ils sont généralement des composés phénoliques (AH)

capables de donner un atome d'hydrogène au radical libre et de le convertir en

un composé stable non radicalaire. Ils réagissent de façon prédominante avec

les radicaux peroxydés, pour deux raisons : la concentration élevée de ces

radicaux et la faible énergie du groupement (ROO•). La Figure 17 montre une

stabilisation d'un radical hydroperoxyle (ROO•) par un phénol qui est

I' hydroxytyrosol.

OH

OH 0

OH OH OH

Figure 17: Stabilisation de radicaux par l'hydroxytyrosol

./ Antioxydants secondaires ou préventifs

Ils fonctionnent en décomposant des hydroperoxydes en produits inertes,

et ralentir le taux d'initiation de la chaîne. Pour cette raison, on fait parfois

référence aux antioxydants secondaires sous le nom d'antioxydants

préventifs. Les antioxydants secondaires sont presque toujours utilisés en

conjonction avec les antioxydants primaires, ils sont connus également sous le

nom d'agents synergiques. Les phosphites et les thioesters constituent les

deux types chimiques les plus importants au sein de cette catégorie [81].

20

.../ Antioxydants naturels

Les antioxydants naturels sont présents dans presque toutes les plantes,

tous les micro-organismes, les champignons et même dans les tissus

animaux. Le groupe le plus important d'antioxydants naturels comprend la

vitamine E (tocophérol), les flavonoïdes, les polyphénols, les anthocyanosides,

les OPC (oligomères procyanidoliques), les caroténoïdes et les autres

composés végétaux [80]. La vitamine E est abondante dans les germes de

blé, les légumes verts, les corps gras. Les flavones et flavonoïdes sont

retrouvées dans les fruits, le vin, le thé. Les caroténoïdes sont présents dans

les carottes, les fruits rouges et jaunes, les légumes verts (B-carotène ), les

tomates (lycopène). La vitamine C est abondante dans les agrumes, les fruits

rouges, les pommes de terre primeur, les brocolis.

.../ Efficacité des antioxydants

Les antioxydants les plus efficaces sont ceux qui ont les énergies de

liaison les plus faibles au niveau du groupe donneur d'hydrogène. L'efficacité

des antioxydants phénoliques est due en particulier à la stabilisation des

radicaux phénoxyliques par la délocalisation des électrons autour du cycle

aromatique. L'efficacité d'un composé phénolique dépend également du

nombre de fonction OH à hydrogène labile [81].

.../ Evaluation de la capacité des antioxydants par des tests in

vitro

Les antioxydants peuvent réduire les radicaux par deux mécanismes : par

transfert d'un électron singulet ou par transfert d'atome d'hydrogène. Les

méthodes ABTs·+ (Acide 2, 2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline)-6-sulfonique)

(ou TEAC) et DPPH' (2, 2-diphényl-1'-picrylhydrazine) jouent sur le transfert

d'un électron singulet. Les méthodes ABTs·+ et DPPH' sont couramment

utilisés pour analyser les extraits de plantes et de fruits. Ce sont des méthodes

anciennes qui une fois standardisées permettent des comparaisons de

résultats.

21

CHAPITRE Il: MATERIEL ET METHODES

11.1. Matériel

11.1.1. Matériel végétal

Le matériel végétal est composé essentiellement des feuilles de Nelumbo

nucifera. Elles ont été récoltées au centre de la Côte d'Ivoire, précisément à

Yamoussoukro (Région des lacs), en février 2016 puis identifiées au Centre

national de Floristique (CNF) sise à l'Université Felix Houphouët Boigny

(Abidjan Cocody). Les feuilles ont été nettoyées, séchées dans une salle

climatisée (18°C0) pendant 14 jours, puis pulvérisées à l'aide d'un broyeur

électrique.

11.1.2. Matériel chimique et technique

Tous les produits chimiques utilisés sont de qualité analytique. Les

solvants et les réactifs employés ont été achetés dans le commerce au près

d'une société ivoirienne « Polychimie ».

11.2. Méthodes

Il. 2.1. Préparation des extraits

11.2.1.1. Macération

30,01 g de poudre des feuilles de Ne/umbo nucifera ont été macérées

dans 150 ml de MeOH 80% (v/v) à température ambiante sous agitation

permanente pendant 24h. Cette opération a été répétée une seule fois avec le

marc résiduel obtenu après filtration. Les filtrats résultants ont été réunis puis

concentrés à 40°C à l'aide d'un évaporateur rotatif de marque BUCH!. L'extrait

aqueux obtenu est conservé pendant 24h au réfrigérateur afin de précipiter les

composés lipophiles. Après séparation par décantation, l'extrait brut

hydrométhanolique des feuilles de Nelumbo nucifera a été utilisé pour la

préparation des extraits sélectifs et dosages.

22

11.2.1.2. Extraction liquide-liquide

30 ml de l'extrait brut ont été épuisés successivement avec 10 ml x3

de l'hexane, chloroforme, acétate d'éthyle et du n-butanol. Les différentes

fractions obtenues (hexanique, chloroformique, acétate éthylique et n

butanolique) sont concentrées à l'évaporateur rotatif à 40°C, puis conservées

au réfrigérateur afin d'être utilisés pour des investigations (criblage

phytochimique sur CCM et l'évaluation de l'activité antioxydante) (Figure 18).

30 g de poudre de Nelumbo nucifera Macération dans MeOH 80%

(150ml x 2 oendant 24H)

Marc Concentration au Rotavapor

Extrait aqueux Extraction liquide-liquide ---------- Hexane (10ml x 3)

1 Phase aqueuse I Concentration '--· _,,,__ __ _,_ au Rotavapor

......,. Concentration au Rotavapor

Extraction liquide liquide • •I Chloroforme (10ml x 3) • 7 •

Phase aqueuse

Extrait hexanique

Extraction liquide liquide Acétate d'éthyle (10ml x 3)

Extrait chloroformique

Concentration au Rotavapor

Phase aqueuse

Extraction liquide liquide n-butanol ..,

(10ml X 3)

Extrait acétate d'éthyle

Concentration au Rotavaoor

Phase aqueuse

./ CCM

./ Tests d'activité antioxydante (DPPH)

Figure 18:Schéma synoptique de préparation des extraits

23

11.2.2. Tri phytochimique sur CCM

La plaque chromatographique est découpée aux dimensions (10 cm x 3

cm). Deux points distants de 1 cm sont repérés sur un trait tracé au crayon à 1

cm de bas de la plaque. 5-10 gouttes de l'extrait sélectif sont déposées à

l'aide d'un capillaire sur chaque point sous forme des taches. Les plaques

sont introduites dans une cuve contenant un mélange de solvants

(développant) :

•!• Pour l'extrait hexanique : Hexane / acétate d'éthyle (5 : 2 ; v/v);

•!• Pour l'extrait chloroformique : Chloroforme/ acétate d'éthyle/ Hexane

(5 : 6 : 2,5 ; v/v/v) ;

•!• Pour l'extrait acétate éthylique : acétate d'éthyle / méthanol /eau /

hexane (5 : 1 : 0,5 : 0,5 ; v/v/v/v); •!• Pour l'extrait n-butanolique : acétate d'éthyle / éthanol / acide

acétique/ eau (5,5 : 1,4 : 0,6 : 1,5 ; v/v/v/v).

La diffusion est arrêtée lorsque le front du développement est arrivé à 1 cm du

haut de la plaque, laquelle est retirée de la cuve et séchée à l'air libre. Après

l'enregistrement des composés colorés, ceux incolores sont visualisés sous

l'UV ou révélés avec les réactifs chimiques suivants:

};> Le réactif Liebermann-Bürchard (stérols et polyterpènes);

};> Le réactif universel de Godin (stérols, polyterpènes et flavonoïdes) ;

};> Le KOH (coumarines);

};> Le réactif de Neu, AICb (flavonoïdes) ;

};> Le réactif de Dragendorff (alcaloïdes)

};> FeCb (polyphénols, tanins)

};> Vanille sulfurique (terpénoides, phénols)

};> SbCb (saponines)

Les colorations des spots observés sur les chromatogrammes soit dans

le visible, soit sous l'UV, ou après révélation, sont enregistrées et leurs

rapports frontaux (Rf) sont calculés.

24

11.2.3. Etude quantitative

11.2.3.1. Dosage des polyphénols totaux par spectrophotométrie

La teneur en polyphénols totaux a été déterminée suivant la méthode

colorimétrique de Singleton et Collaborateurs [82] modifiée par Konan

[83]. A 1 ml de l'extrait hydrométhanolique dilué au 1/20ème avec de l'eau

distillée, sont ajoutés 1,5 ml de Na2C03 (17%, m/v) et 0,5 ml de réactif de

Folin-Ciocalteu (0,5N). L'ensemble est incubé à 37°C pendant 30 min.

L'absorbance est lue à 720 nm contre un blanc sans extrait pris comme

référence. La quantification des polyphénols totaux est faite en fonction d'une

droite d'étalonnage linéaire (y= ax + b) réalisée par un extrait d'étalon d'acide

gallique à différentes concentrations (0 à 1000 µg/ml) préparé dans les

mêmes conditions que l'échantillon. Les résultats sont exprimés en

microgramme d'équivalent d'acide gallique par gramme de la matière sèche

(µg EAG/g MS) de la plante en poudre. La teneur en polyphénols totaux (Q)

est calculée selon la formule suivante :

Q = (V x C x d) / m (en µg EAG/g matière sèche)

Avec V : volume final de l'extrait (ml) ; C : concentration de l'extrait

(µg/ml) ; d : dilution ; m : masse de matière sèche du matériel végétal

hydrolysé (g)

11.2.3.2. Dosage des tatins par permanganométrie

La teneur en tanins (Y) a été calculée en pourcentage par la formule ci

dessous:

Où X : teneur des polyphénols totaux et X1 : teneur des polyphénols

excepté les tanins

25

• Teneur des polyphénols totaux

A 1 g de matériel végétal sec broyé et tamisé est ajouté 100 ml d'eau

bouillante. Le mélange est ensuite chauffé au bain marie pendant 30 min sous

agitation permanente. Après refroidissement et filtration, le volume du décocté,

désigné A, est réajusté à 100 ml avec de l'eau distillée. Dans une fiole de 1 L

contenant 10 ml de décocté sont ajoutés respectivement 750 ml d'eau

distillée et 25 ml d'acide indigo sulfurique. La solution obtenue est titrée avec

du permanganate de potassium (K2Mn04) de 0, 1 N jusqu'à obtention de la

couleur jaune doré sous agitation constante. La teneur en polyphénols totaux

(X) a été calculée en pourcentage suivant la formule ci-dessous :

X = (V - V1))< 0, 004157 X 100 .x 100 .X 100 MX 10 X'(100 -w)

Avec V: volume de la solution de K2MnQ4 (0,02 mol/L) utilisée pour la

titration de l'extrait brut en ml; V1: volume de la solution de K2Mn04 (0,02

mol/L) utilisée pour la titration de l'essai à blanc en ml ; M : masse de la

matière première pesée en g; 0,004157: nombre de tanins correspondant à

1 ml de solution de K2Mn04 (0,02mol/L) en g (en termes de tanin standard);

w: perte au séchage de la matière première en %.

• Teneur des phénols excepté des tanins

A 10 ml du décocté A sont ajoutés 5 ml d'une solution constituée d'un

mélange volume-volume de gélatine à 1% et de NaCI (10%). Le mélange

résultant est laissé au repos pendant 24h. Ensuite, la solution est filtrée afin de

la débarrasser des tanins précipités par la gélatine. 10 ml du filtrat sont

prélevés et titrés par la même méthode décrite ci-dessus.

La teneur des polyphénols (X1) autres que les tanins totaux a été calculée en pourcentage selon l'expression suivante :

. (V - v1) x o,.004157 x 100 x 100 x 100 X= . . MX 10 X{100 -w)

26

Avec : V: volume de la solution de K2Mn04 (0,02 mol/L) utilisée pour la

titration de l'extrait brut en ml; V1: volume de la solution de K2Mn04 (0,02

mol/L) utilisée pour la titration de l'essai à blanc en ml ; M : masse de la

matière première pesée en g; 0,004157: nombre de tanins correspondant à

1 ml de solution de K2Mn04 (0,02mol/L) (en termes de tanin standard) en g ; w: perte au séchage de la matière première en%.

11.2.3.3. Dosages des flavonoïdes totaux

Le dosage des flavonoïdes totaux a été réalisé selon la méthode de

Hariri et ses collaborateurs [84] modifiée par Konan [83]. 2 ml de l'extrait sont dilués au 1/20ème et mélangés à 100 µL de réactif de Neu. L'absorbance

est lue à 404 nm et comparée à celle du quercétol pris comme standard (0,05

mg/ml), diluée dans les mêmes conditions et traitée avec la même quantité de

réactif. Le pourcentage des flavonoïdes totaux est calculé en équivalent

quercétol selon la formule suivante :

F = (0,05 x Aext / Aq) x 100 x d / Cext (en%)

Avec Aext : absorption de l'extrait ; Aq : absorption du quercétol ; Cext :

concentration de l'extrait (mg/ml) ; d : dilution

11.3. Evaluation du pouvoir antioxydant

11.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM

Le dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM est celui mis au point par la

méthode décrite par Takao et collaborateurs [85]. 5-10 gouttes de l'extrait sélectif sont déposées à l'aide d'un capillaire sur une chromatoplaque, qui est

ensuite placée dans une cuve à chromatographier saturée de solvant de

migration. Après développement, les chromatogrammes sont séchés puis

révélés à l'aide d'une solution éthanolique de DPPH" (2 mg/ml). Après 30 min

de temps optimal, les constituants de l'extrait présentant une activité

antiradicalaire potentielle sont révélés sous forme de spots de couleur Jaune

pâle sur fond violet, selon la réaction présentée dans la Figure 19. 27

N02 ~ _ + RH ••.. R +ü~ ~-N-o~ Donneur # \\ Il de H 02N N02

DPPH-H (Red) Jaune-pâle

Figure 19: Principe du test de DPPH·

11.3.2. Evaluation du pouvoir anti oxydant par spectrophotométrie

L'évaluation du potentiel antioxydant des extraits sélectifs s'est faite

suivant la méthode de Blois (1958). Le DPPH" est solubilisé dans l'éthanol

absolu, pour obtenir une solution de concentration 0,3 mg/ml. Différentes

gammes de concentrations (0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0, 1 mg/ml, 0,05 mg/ml,

0,025 mg/ml et 0,0125 mg/ml) de chaque extrait sélectif sont préparées dans

l'éthanol absolu. Dans des tubes secs et stériles, sont introduits 2 ml d'extrait

et 2 ml de solution éthanolique de DPPH". Après agitation, les tubes sont

placés à I' abri de la lumière pendant 30 min. L'absorbance du mélange est

ensuite mesurée à 517 nm contre un blanc formé de 2 ml d'éthanol pur et 2

ml de solution de DPPH". Le témoin positif de référence est l'acide ascorbique

(vitamine C). Les pourcentages d'inhibition du DPPH" sont calculés suivant la

formule:

1 = [(Ab - Ae) / Ab] x 100

Avec 1 : pourcentage d'inhibition ; Ab: absorbance du blanc; Ae: absorbance de l'échantillon

Les concentrations nécessaires pour piéger 50% (Clso) du DPPH" ont été

déterminées avec le logiciel Graph pad prism. CHAPITRE Ill: RESULTATS ET DISCUSSION

111.1. Tri phytochimique par CCM

28

Les figures 20-23 présentent les chromatogrammes des extraits sélectifs.

Les interprétations de ces résultats sont données dans les tableaux 1-IV en

Annexe.

111.1.1. Extrait hexanique

L'hexane étant un solvant apolaire, il extrait les stérols, terpènes et

certaines coumarines. Pour les faire migrer, nous avons eu recours au

mélange de solvants : hexane - acétate d'éthyle dans les proportions 5:2 (v/v).

Les réactifs employés pour révéler les stérols et terpènes y sont spécifiques,

tels que les réactifs de Liebermann-Bürchard, de Godin et la vanilline

sulfurique. En ce qui concerne les coumarines, elles sont mises en évidence

par la solution méthanolique de KOH à 5% (m/v). En effet, les stérols se

révèlent avec le réactif de Liebermann-Bürchard dans le visible en brun et en

vert, en jaune et jaune-vert sous UV à 365 nm [86-87]. Ce qui a été observé

dans les extraits de feuilles de N. nucifera aux Rf suivants: 0,07; 0, 11; 0, 15; 0,27; 0,35; 0,49; 0,58; 0,86; 0,89 (Figure 20, et tableau I en ANNEXE). Certains terpènes apparaissant avec le réactif de Liebermann-Bürchard dans

le visible sous forme de taches bleues et violettes et sous observation UV/365

nm en spots jaune orangé [88] ont été mis en évidence comme étant des

triterpènes de type lupane. Il s'agit des tâches de Rf = 0,55; 0,94. Le réactif de Godin et la vanilline sulfurique mettent en évidence

également les stérols en spots bleus sous UV à 365 nm et en spots violet et

violet gris dans le visible (Rf = 0, 15; 0,20; 0,38; 0,49; 0,80; 0,89). Quant aux polyterpènes, avec le réactif de Liebermann-Bürchard dans le

visible, ils apparaissent en bleu ou violet, sous UV/365 nm en spots rouge ou

jaune orangée [88] (Rf = 0,62; 0,66). Les polyterpènes sont observables

également avec la vanilline sulfurique, dans le visible en violet, rose et orange

et ces couleurs peuvent aussi s'observer sous UV/365 nm [86]. C'est ce que

nous avons constaté au Rf = 0,52. Enfin, les coumarines ont été mises en

évidence par le KOH à 5% (m/v). En effet, elles se révèlent en jaune dans le

visible et leurs couleurs changent ou s'intensifient sous l'action de ce

29

révélateur sous UV à 365 nm [88] et ceci concerne les spots suivants : Rf =

0,09; 0, 11; 0, 15; 0,20; 0,27; 0,35; 0,45; 0,68; 0,74; 0,86. Aussi, le KOH

permet-il l'identification de certains composés anthracéniques. Ces derniers

apparaissant sous forme de taches violettes (Rf = 0, 15; 0,35) ont été

identifiés comme les 1,2-dioxyanthracènes [89 ; 90].

0,55

0,27

o. 11 0,07

0,58 0,52

0,94

0,86 0,66 0,62 0,55

0,49

0,66 0,62

0,52

0,20

Avec Liebermann Bürchard au visible

0,89 0,80

Avec Godin au visible

Avec Liebermann Bürchard à l'UV 365

0,35 '.:!;I 0,27 .;;•· 0,20

0,15

Avec vanilline sulfurique au visible

0.45

o. 11 0,09

Avec KOH au visible

Figure 20: CCM de l'extrait hexanique

0,86 0,74 0,68

0,27 0,20 o. 15

Avec KOH à l'UV 365nm

En somme, l'extrait hexanique renferme les stérols, terpènes,

anthracènes et les coumarines.

30

111.1.2. Extrait chloroformique

Le gradient de solvants chloroforme/acétate d'éthyle/hexane dans les

proportions 5/6/2,5 (v/v/v) a été choisi comme développant pour déceler les

composants de l'extrait chloroformique. Les grands groupes de composés

chimiques identifiés sont: alcaloïdes, terpènes, stérols, flavonoïdes,

coumarines et saponines. La Figure 21 et tableau Il (ANNEXE) présentent

les phytocomposés identifiés dans l'extrait chloroformique.

La vanilline sulfurique a révélé des tâches correspondant à deux terpènes

dans le visible en violet (Rf = 0,35; 0,86) et deux en orange (Rf= 0, 16 et 0,56), puis des stérols en brun (Rf = 0,05; 0, 18; 0,21 ; 0,44; 0,65) [86]. Le

réactif de Godin a relevé les stérols en violet, brun ou marron dans le visible.

C'est le cas des spots suivants (Rf= 0,02; 0,05; 0, 13; 0, 16; 0,21; 0,32; 0,44; 0,48; 0,65; 0,86 et 0,89) puis des terpènes en vert (Rf = 0,09; 0, 72).

Les coumarines ont été visualisées par le biais de KOH sous UV/365 nm

avec les Rf suivants : 0,05; 0,32; 0,35; 0,60; 0,68; 0, 72. Ensuite, certaines

coumarines ont été révélées par le Dragendorff en marron (Rf = 0,08; 0, 13;

0, 72 ; 0, 75).

La solution de KOH met également en évidence les dérivés 1,2-

anthracéniques sous forme des spots violets [89] aux Rf = 0,28; 0,60. Il est à noter que l'extrait chloroformique est riche en alcaloïdes, lesquels

ont été décelés sous forme des taches en orange par le réactif de Dragendorff

(Rf = 0,05; 0,24; 0,28; 0,35; 0,46; 0,53; 0,62). Par ailleurs, le réactif de Neu a servi à mettre en évidence des

flavonoïdes. Ces derniers ont été révélés dans le visible sous forme de taches

jaunes et marron sous UV/365 nm, ces couleurs s'intensifient et se diversifient

(Rf = 0,02; 0,05; 0,07; 0, 12; 0, 16; 0,21; 0,24; 0,28; 0,44; 0,48; 0,60;

0,65; 0, 72 et 0, 75). Enfin, la présence des saponines a été indiquée par la solution

méthanolique 1 % de chlorure d'antimoine (SbC'3) [89]. Les saponines de type stéroïdiques ont été révélées en spots jaunes (Rf = 0,26; 0,32; 0,48; 0,60) et

celles de type triterpéniques en taches rose-violet (Rf = 0,08 ; 0, 16). 31

Nous pouvons dire finalement que l'extrait chloroformique contient les

métabolites secondaires suivants: les alcaloïdes, les terpènes, les flavonoïdes,

les coumarines et les saponines. Toutefois, nous notons une présence notable

de coumarines, d'alcaloïdes et de flavonoïdes.

Avec Vanilline sulfurique dans le

visible

0,32

0,16

0,09

Avec Godin au visible

0,13 0,05 0,02

Avec KOH dans le visible

0,72

0,60

0,41

0,32 0,32

0,05

Avec KOH à 365 nm

0,75----.

0,53___.

0,05

0,86

-- 0,72--- 0,72 0,72 0,65

I. +--0,68

0,60 +--0,60 0,62

0,48-- -- -- li __ 0,48 0,44

0,46 •. ,. =-·28 l 0,32

0,35 0,24 0,26 0,28 0,21 0,16 0,24 0,07 0 05 0,08 0,13 0 07 0,08 o.~2

Avec Dragendorff au visible

Avec Neu au visible

Avec Neu à l'UV 365nm

Avec SbCbau visible

Figure 21: CCM de l'extrait chloroformique

111.1.3. Extrait acétate éthylique

L'extrait acétate éthylique a servi à mettre en évidence la présence des

flavonoïdes, coumarines et des tanins. Les profils chromatographiques

32

obtenus sont présentés dans la Figure 22 et leurs interprétations sont

consignées dans le tableau Ill en ANNEXE. Le mélange de solvants : acétate

d'éthyle / méthanol / eau / hexane dans les proportions 5/1/0,5/0,5 (v/v/v/v) a

servi pour la migration des différents phytocomposés. Le KOH a mis en

évidence des coumarines (Rf = 0, 10; 0, 14; 0,29; 0,45; 0,51 ; 0,56; 0,64;

0,69; 0, 78; 0,84; 0,93). Les flavonoïdes ont été révélés avec le réactif de

Neu aux Rf = 0,04; 0, 10; 0, 16; 0, 18; 0,33; 0,36; 0,41; 0,45; 0,50; 0,61;

0, 78 ; 0,86 ; 0,89.

Le chlorure de fer (FeCb à 2%) a été utilisé pour mettre en évidence des

tanins en gris ou en brun dans le visible et les acides phénols en rouge, bleu

ou virant sur le vert [88]. Les acides phénols révélés dans l'extrait d'acétate

d'éthyle sont aux Rf = 0, 10; 0, 16; 0,29; 0,39; 0,43; 0,48; 0,54; 0,58;

0,69), et un spot gris indique la présence de tanin (Rf = 0,04).

Au terme de cette analyse, nous pouvons dire que l'extrait acétate

éthylique est riche en composés phénoliques, notamment en flavonoïdes,

acides phénoliques et en coumarines.

0,69 r - +----0,69

+-----0,64 ,.54-=IIF. 1 fT='~ · .. · 0 48 0,51 o,43 ·. ·.·.· t o',39

,. ~ '·' D,29 I +-----0,29

0, 16 +--0,14 0,10 t: +--0,10 0,04

FeCb au visible KOH au visible

0,93

0,84

0,69

0,64

0,45

KOH à 365 nm

33

0,50

0,36

0,18

0,04

0,89 0,86 0,78

0,61

0,45 0,41--- W ••

0,36 0,33 0,18 0, 10

Neu dans le visible Neu à 366nm

Figure 22: CCM de l'extrait d'acétate d'éthyle

111.1.4. Extrait n-butanolique

Le n-butanol est susceptible d'extraire des flavonoïdes, tanins et des

acides phénoliques. Le développant choisi pour les faire migrer est le mélange

de solvants acétate d'éthyle / éthanol / acide acétique /eau dans les

proportions 5,5/1,4/0,6/1,5 (v/v/v/v). Au regard des résultats obtenus (Figure 23, et tableau IV en ANNEXE), nous constatons que l'extrait n-butanolique

contient des flavonoïdes décelés par le réactif de Neu en jaune et marron (Rf

= 0,06; 0,09; 0, 15; 0,21; 0,25; 0,29; 0,36; 0,38; 0,41 ; 0,48; 0,50; 0,54;

0, 76 ; 0,94 ; 0,99) et les tanins révélés par FeCb en gris dans le visible (Rf =

0,29; 0,36; 0,46; 0,54; 0,74; 0,96). Au terme de cette analyse, nous pouvons conclure que l'extrait n

butanolique est riche en flavonoïdes et en tanins

34

- + "'U -, CD, (/) CD :::J () CD

)> O" (/) CD :::J () CD

::J 1- )> n • -n :::::r C" :::::r - - C "'' 0 - =sir ., S),) - 0 ::J C et) o' 0 et) .,

3 .c C et)

+

+

+

+

+

+

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+

+

+

+

+

+

+

:::::r et) >< S),) ::J .c C et)

+

+

+

+

m >< - Dl ;:;: VI

Stérols

Terpènes

Acides phénoliques

Coumarines

Flavonoïdes

Tanins

Saponines

Alcaloïdes

Anthracènes

G) a C

"C

et) VI Q. et) n 0 3

"C

0 VI et), VI

o. CD (/)

CD ~ -, D> ;:;.: (/)

-, CD, () D>

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r CD

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S),) D> C" "'O - -, et> CD• S),) (/) C

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CD

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~ (l'I

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~ (1)

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D) ::::,

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0 0 s:: Q. et)

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3 C: D)•

)> < (1) (')

~- z "' (1) o= C: - C. (1) D)

::::,

"' CD

0 0 °N ...,,. 0, (X)

i i

oo 0 ww 01 0) (X) 0

~ _o <D <D .i,. <D

Le tableau Ill montre la présence des stérols, coumarines, anthracènes

et les terpènes dans l'extrait hexanique des feuilles de Nelumbo nucifera.

L'existence des flavonoïdes, stérols, alcaloïdes, terpènes, coumarines et des

anthracènes dans l'extrait chloroformique avec une présence notable de

coumarines, alcaloïdes et de flavonoïdes. Quant à l'extrait acétate éthylique, il

est riche en flavonoïdes, coumarines et en acides phénoliques. Enfin, l'extrait

n-butanolique contient majoritairement les flavonoïdes et les tanins. Les

résultats obtenus dans le cadre de cette étude sont en conformité avec ceux

des travaux de certains auteurs [6 ; 25].

Plusieurs activités pharmacologiques conférées à N. nucifera pourraient

trouver leur justification par sa richesse en métabolites secondaires. En effet,

certains composés phénoliques (flavonoïdes, coumarines, tanins, et acides

phénoliques) sont dotés de bon nombre d'activités biologiques à savoir:

antioxydante, hepatoprotectrice, antifongique, antiinflammatoire,

antibactérienne, diurétique, anticancéreuse, antivirale et antiulcéreuse [6].

Partant de ce fait, la présence significative de ces derniers dans les feuilles de

N. nucifera justifierait ses propriétés [6] qui lui sont attribuées. Ensuite, la

présence de stérols et de terpènes pourrait expliquer les activités

antibactériennes et anti spermatorrhée des feuilles de cette espèce [23].

Egalement, l'usage du lotus sacré contre les troubles mentaux et la fièvre [14; 22] pourrait se justifier par sa teneur en alcaloïdes. En effet, certains

alcaloïdes ont des propriétés antipyrétiques et ont la capacité de renforcer

l'activité cardiaque, d'exciter le système nerveux central et les nerfs

symptomatiques et de stimuler la circulation sanguine [91]. Enfin, l'existence

des saponines pourrait expliquer l'emploi de N. nucifera dans le traitement des

maladies de la peau, des hémorroïdes et de la métrorragie [92].

111.2. Etudes quantitatives

Une analyse quantitative a été effectuée sur l'extrait brut

hydrométhanolique de N. nucifera afin de mettre en relief les teneurs en

polyphénols totaux, tanins et flavonoïdes totaux.

36

111.2.1. Teneurs en phénols totaux

La teneur en phénols totaux a été déterminée par la spectrophotométrie.

La teneur en phénols totaux obtenue dans les feuilles de N. nucifera est de

3530,83 µgEAG/g. Ce taux significatif enregistré fait de N. nucifera une source

potentielle de polyphénols. Ces résultats sont soutenus par les travaux de Zhu

et collaborateurs et Lim et collaborateurs qui ont isolés respectivement 14

flavonoïdes [25] et 13 flavonoïdes [29] à partir des feuilles de N. nucifera.

Toutefois, en comparant ce taux obtenu à celui d'autre plante aquatique, à

savoir Nympheae lotus (6686,302 µgEAG/g) [91], nous notons que les feuilles

de N. nucifera sont moins riches en composés phénoliques que celles de

Nympheae lotus. Ce résultat confirme le constat fait lors du criblage

phytochimique, concernant de la présence des composés phénoliques

(Figures 22, 23).

111.2.2. Teneur en tanins totaux

La méthode employée pour quantifier les tanins totaux est la méthode

permanganométrique de Leventhal adaptée. Le pourcentage en tanins totaux

enregistré est de 0,994%.

Le taux obtenu montre que Nelumbo nucifera n'est pas une plante riche en

tanins. Selon la littérature, les plantes à tanins à savoir Anacardium

occidentale, Mangifera indica et Acacia nilotica contiennent respectivement

13,2% ; 9,2% et 8,5% des tanins. [93]

111.2.3. Dosage des flavonoïdes totaux

La teneur en flavonoïdes totaux enregistrée dans les feuilles de Nelumbo

nucifera est de 5,478 %, ce qui est inférieure à celle des feuilles de Nymphaea

lotus (plante aquatique) (13,984%). Toutefois ce taux est comparable à ceux

des feuilles de Baphia. nitida (4,487%) et A. djalonensis (6,358%), considérées riches en flavonoïdes [91]. Cette richesse en flavonoïdes des feuilles de Nelumbo nucifera a été déjà montrée lors des tests qualitatifs sur

CCM (Figures 21-23). Ainsi, cette profusion en flavonoïdes justifierait les

nombreux usages de N. nucifera en médecine traditionnelle [15-21]. 37

111.3. Evaluation du pouvoir antioxydant

111.3.1. Dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM

La méthode décrite par Takao [85] a été utilisée pour dépister le pouvoir

antioxydant sur CCM. Selon cette méthode, les composés manifestant une

activité anti radicalaire ont la capacité de réduire le radical DPPH" et cela se

matérialise par l'apparition sur le chromatogramme sous forme de spots jaune

pâle sur fond violet.

111.3.1.1. Pouvoir antioxydant de l'extrait hexanique

La Figure 24 présente le profil chromatographique de l'activité

antioxydante de l'extrait hexanique.

:c 0.89 •........ -0.80

r; o.55 r, 0.49

~- 0.45

,. ~:~~ 1, 0.15 1' 0.07

Figure 24: Chromatogramme de l'extrait hexanique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH·

Vu l'apparition des spots jaune sur la plaque, nous constatons que parmi

les constituants de l'extrait hexanique, il existe des composés possédant une

activité anti radicalaire, dont les types sont définis par la comparaison de leurs

Rf avec ceux du criblage (Figure 20). Ce sont des stérols (Rf = 0,07 ; 0, 15;

0,20; 0,27; 0,49; 0,89), terpènes (Rf = 0,07; 0,49; 0,55; 0,58; 0,62;

0,74; 0,80; 0,89) et les coumarines (Rf = 0, 15; 0,20; 0,27; 0,45).

38

111.3.1.2. Pouvoir antioxydant de l'extrait chloroformique

L'activité antioxydante de l'extrait chloroformique décelée au moyen de la

CCM est notable (Figure 25), laquelle est due à la synergie des

phytocomposés suivants: les stérols (Rf = 0,02; 0,05; 0, 13; 0,21; 0,89),les

terpènes (Rf = 0,07; 0,09; 0, 16; 0,35; 0,89), coumarines (Rf = 0, 13; 0,41;

0,68), saponines (Rf = 0, 16; 0,21; 0,41), alcaloïdes (Rf = 0,02; 0,28; 0,35;

0,46; 0,53) et les flavonoïdes (Rf = 0,02; 0,07; 0, 16; 0,21; 0,28; 0,35; 0,68).

0.41

0.21

0.07

~- 0.89

E0.68 0.53 0.46

--- 0.35 --- 0.28

E0.16 0.13 0.09

...,__ 0.02

Figure 25: Chromatogramme de l'extrait chloroformique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH·

111.3.1.3. Pouvoir antioxydant de l'extrait d'acétate d'éthyle

L'extrait de l'acétate d'éthyle a révélé un pouvoir antioxydant remarquable

(Figure 28). En comparant les Rf des zones d'activités à ceux obtenus lors du

tri phytochimique (Figure 22), nous pouvons noter la présence des

antioxydants comme les flavonoïdes (Rf = 0,04; 0, 14; 0, 18; 0,36),

coumarines (Rf = 0, 14; 0,64), acides phénols (Rf = 0,29; 0,43; 0,48; 0,54; 0,58) et les tanins (Rf = 0,04).

39

0,64 0,58 ~~11 0,54

0,48 0,43

0,36~-,. 0,29 0,18

0,14 0,04

Figure 26: Chromatogramme de l'extrait d'acétate éthylique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH"

111.3.1.4. Pouvoir antioxydant de l'extrait n-butanolique

Au regard du profil chromatographique du dépistage de l'activité anti

radicalaire à l'aide du DPPH' (Figure 27), nous remarquons que l'extrait n

butanolique manifeste une activité significative. La plupart de ces constituants

se sont montré antioxydants. L'appartenance des spots actifs jaune a été

affirmée par la comparaison de leurs Rf avec ceux des composés identifiés

lors du criblage (Figure 23). Ainsi, les flavonoïdes (Rf = 0,06; 0,09; 0, 15; 0,21 ; 0,25; 0,29; 0,38; 0,41 ; 0,50; 0,54; 0,99) et les tanins (Rf = 0,29;

0,54; 0,72) sont responsables à l'activité anti oxydant de l'extrait n

butanolique des feuilles de Nelumbo nucifera.

40

0,99

0,72

0,54 0,50

0,38 __... Ill~, • 0,41 0,29

0,21 0,25 0,15

0,09

Figure 27: Chromatogramme de l'extrait n-butanolique de Nelumbo nucifera vis-à-vis du DPPH·

En somme, l'activité anti radicalaire a été décelée dans tous les extraits

testés. Par ailleurs, les extraits d'acétate éthylique et n-butanolique ont signé

l'activité antioxydante notable, laquelle est liée à la présence des composés

phénoliques identifiés dans lesdits extraits.

111.3.2. Evaluation du pouvoir antioxydant par spectrophotométrie

La Figure 30 montre les résultats de mesure de pourcentage d'inhibition

du radical DPPH' en fonction de concentration des extraits sélectifs. 100

90 ~ 0

C: 80 ~ ;ë 70

•0.4mg/ml ~ .!: :i:, 60

1 ~I •0.2mg/ml

(1) Cl 0.1mg/ml !! 50 C: (1) •0.0Smg/ml ~ 40

1 :,

~ • 0.02Smg/ml 0 o. 30 •0,0125

20 ••r 1 Il i 1 10 ···11 0 ••.... 1

HEX CHLORO AcOEt n-BUTA VIT C

Figure 28: Pourcentages d'inhibition du radical DPPH· par extraits sélectifs de Nelumbo nucifera et Vitamine C

41

Nous constatons que les pourcentages d'inhibition de l'acide ascorbique

sont supérieurs à ceux des extraits sélectifs pour toutes les concentrations.

Toutefois, les capacités inhibitrices des extraits hexanique, acétate d'éthyle et

n-butanolique à la concentration 0,4 mg/ml sont proches à celle de la vitamine

C. Aussi, observe-t-on une activité antioxydante considérable des extraits

acétate éthylique et n-butanolique de N. nucifera comparativement à la

vitamine C à toutes concentrations. Ainsi, ces résultats viennent confirmer

ceux obtenus lors du dépistage du pouvoir antioxydant sur CCM. (Figures 24- 27).

Au terme de cette étude, nous pouvons établir une relation entre les

compositions chimiques des extraits de N. nucifera et leur pouvoir antioxydant.

En effet, l'activité antioxydante des extraits acétate éthylique et n-butanolique

est tributaire de la mobilité de l'atome d'hydrogène du groupement hydroxyle

des composés phénoliques qu'ils contiennent (Figures 21-23) [94]. Ainsi, les

nombreux potentiels pharmacologiques conférés aux feuilles de Nelumbo

nucifera pourraient être le fait de son pouvoir antiradicalaire considérable.

Détermination des Clso

La Clso exprime la quantité d'antioxydant requise pour diminuer la

concentration du radical DPPH" de 50%. Plus la valeur de la Clso est petite,

plus l'activité antioxydante d'un composé est grande [95]. Elle a été

déterminée graphiquement par le logiciel GRAPHPAD PRISM (Figure 5

(Annexe)) et ce, en référence à la vitamine C. Les valeurs de la Clso des

extraits des feuilles de Nelumbo nucifera sont représentées dans le tableau

IV. Tableau IV: Clso des extraits sélectifs et de la vitamine C

Extraits Olso (µçi/mL) Hexanique 0, 110

Chloroformique 0,0517 Acétate éthylique <0,0125 N-butanolique <0,0125 Vitamine C <<0,0125

42

Au regard de ces résultats, nous constatons que les extraits acétate

d'éthyle et n-butanolique inhibent le radical DPPH· avec Clso de 0,0125 µg/ml

montrant une activité très importante qui est égale à celle de la vitamine C.

Ce qui justifierait de facto l'utilisation fréquente des feuilles Nelumbo nucifera

en médecine traditionnelle [20 ; 21].

43

CONCLUSION

Le présent mémoire avait pour objectif de contribuer à la valorisation de

Nelumbo nucifera, une plante aquatique utilisée en médecine traditionnelle

contre diverses affections. Pour cela, nous avons réalisé dans un premier

temps le criblage phytochimique sur CCM de quatre extraits sélectifs issus de

Nelumbo nucifera, qui a permis de révéler de plusieurs familles chimiques tels

que les flavonoïdes, coumarines, tanins, stérols, terpènes, alcaloïdes,

saponines et les acides phénols. Toutefois, la présence significative des

stérols et les terpènes a été constaté dans l'extrait hexanique ; les alcaloïdes,

coumarines et les flavonoïdes sont majoritaires dans l'extrait chloroformique.

L'extrait n-butanolique manifeste la présence des composés phénoliques,

notamment des flavonoïdes et coumarines.

La quantification des polyphénols, des flavonoïdes totaux et tanins a été

réalisée par deux méthodes de dosage. Les résultats du dosage des

composés phénoliques montrent que l'extrait méthanolique des feuilles de

Nelumbo nucifera est riche en polyphénols. Les teneurs en phénols totaux

enregistrées sont de 3530,83 µgEAG/g et 2,015% respectivement pour les

méthodes de spectrophotométrie et de permanganométrie. Ces valeurs

indiquent une prédominance en composés phénoliques due à la présence des

flavonoïdes, coumarines, acides phénoliques et tanins. Quant à la teneur des

tanins, nous avons obtenu des taux de 83,33 µgEAG/g et 0,994%

respectivement par spectrophotométrie et permanganométrie. Avec une

proportion en flavonoïdes de 5,478 %, Nelumbo nucifera demeure une source

de flavonoïdes. Enfin, les résultats obtenus montrent que cet extrait a une

activité antioxydante très importante. Cette activité semble être liée à la

présence des composés phénoliques. L'étude du pouvoir antioxydant a

indiqué une activité significative des extraits acétate éthylique et n-butanolique

vis-à-vis du radical DPPH·, comparativement à la vitamine C. Par ailleurs, une

activité non négligeable a été décelée dans les extraits hexanique (ICso = 0, 11

µg/mL) et chloroformique (ICso = 0,0517 µg/mL).

44

Ultérieurement, nous entrevoyons réaliser des études chimiques approfondies

( doser les métabolites secondaires dans les extraits étudiés, de les isoler et

d'établir leurs structures en utilisant les méthodes d'analyse plus

performantes, notamment la SM-HPLC, RMN, l'IR. .. ) sur l'espèce Nelumbo

nucifera de Côte d'Ivoire qui demeure à notre connaissance une plante peu

étudiée.

45

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55

ANNEXES

LISTE DES ABREVIATIONS

a : composés révélés sous UV/365 nm sans révélateur

b : composés révélés avec LIEBERMANN Bürchard

c : composés révélés avec la vanilline sulfurique

d : composés révélés avec l'hydroxyde de potassium (KOH) à 5% au MeOH

e: composés révélés avec le réactif de GODIN

f : composés révélés avec le DPPH

g : composés révélés avec le réactif de Neu

h : composés révélés avec le réactif de Dragendorff

i : composés révélés avec le chlorure d'antimoine (SbCb) à 1 %

j : composés révélés avec le chlorure de fer (FeCb).

NI : composés non identifiés

Te : terpènes, FI : flavonoïdes, APh : acide phénol, Ster : stérol, Cou :

coumarines, Sa : saponines, Al : alcaloïdes, Tan : tanins, Tr : terpènes, Anth

: anthracènes, Lup : Lupane, 0 : orange, J : jaune, B : bleu, V : vert, R :

rouge, Ro : rose, Vt : violet ou violacé, M : marron, Br : brun, G : gris, cl :

clair, J V : jaune vert, J F ; jaune fluorescent

56

- Tableau 1 : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait hexanique des feuilles de Nelumbo nucifera

EXTRAIT HEXANIQUE (Hex/AcOEt : 5/2 (v/v))

SANS REVELATEUR(•) LIEBERMANN Bürchard(b) VANILLINE KOH(d) GODIN(•) DPPH(' TYPE DE SULFURIQUE( C) VISIBLE UV 365 VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE

COMPOSES

Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co 0,07 G 0,07 J 0,07 J 0,07 G O,Q? JP Ster', Tr"

0,09 G 0,09 B 0,09 G 0,09 0 Coud 0, 11 G 0, 11 0 0, 11 J 0, 11 0 Ster', Coud, 0,15 G 0,15 V 0,15 J 0,15 G 0,15 J 0,15 B 0,15 Vt 0,15 J p Ster'·0, Coud

0,20 Br 0,20 B 0,20 VtG 0,20 J 0,20 0 0,20 J 0,20 J p Ster',c, Coud, Fl8

0,22 Vt Coud 0,23 0 0,23 J Fie 0,27 0 0,27 Br 0,27 G 0,27 G 0,27 G 0,27 0 0,27 J p Ster', Coud, Fl8

0,32 G 0,32 J Ster',Anthd, Fl0 0,35 G 0,35 J 0,35 G 0,35 J 0,35 Vt Ster', Coud

0,38 0 0,38 Vt ster' 0,41 J 0,41 G 0,41 B 0,41 G Coud

0,45 G 0,45 J 0,45 J 0,45 J p Coud, Fie 0,49 0 0,49 J 0,49 J 0,49 G 0,49 V 0,49 JP Ster', Tr"

0,52 Ro polyfr", Coud 0,55 Vt 0,55 V 0,55 JP Lupb,e

0,58 J 0,58 G 0,58 JO Polyîr', Coud 0,62 J 0,62 JO Polyîr'

0,66 0 0,66 B 0,66 G 0,66 G Polyîr" 0,68 G 0,68 J 0,68 J 0,68 B Ster', Coud

0,74 V 0,74 J 0,74 B 0,74 G Coud, Tr" 0,80 Vt 0,80 JP Tr"

0,86 B-F 0,86 G 0,86 B-F Coud 0,89 G 0,89 J 0,89 B 0,89 Vt 0,89 J p Ster', Polyîr"

0,94 Vt Lupb

- Tableau Il : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait chloroformique des feuilles de Nelumbo nucifera

EXTRAIT CHLOROFORMIQUE: CHCb / AcOEt / Hex (5/6/2,5 : v/v/v) SANS REVELATEUR(•! VANILLINE KOH(dl GODIN(•! NEU(gJ DRAGEN SbCIJ(I) DDPH(fl SULFURIQUE(cl D'ORFF(hl VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE UV365 VISIBLE VISIBLE UV365 VISIBLE VISIBLE VISIBLE TYPE DE COMPOSES Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co 0,02 M 0,02 J 0,02 M 0,02 J 0,02 J 0,02 0 0,02 JP Ster', Fl9, Alh 0,05 J 0,05 J 0,05 G 0,05 J 0,05 Vt 0,05 Br 0,05 J-F 0,05 0 Anth", Ster6, Fl9, Alh

0,07 G 0,07 V 0,07 R 0,07 0 0,07 JP Tr6, Fl9 0,08 V 0,08 0 0,08 V 0,08 M 0,08 Ro Couh,Sa1 0,09 G 0,09 V 0,09 JP Tr6,

0,12 J 0,12 J 0,12 J-F Flg,e 0,13 J 0, 13 B 0,13 M 0,13 M 0,13 JP Ster', Cou"

0,16 0 0,16 M 0,16 J-F 0,16 Vt 0,16 JP Tr°, Ster6, Fl9, Sa1

0,18 J 0,18 Br Ster° 0,21 J 0,21 Br 0,21 M 0,21 M 0,21 JP Stert·•, Fl9, Sa1

0,24 Vt 0,24 0 Alh 0,26 J 0,26 V 0,26 J Sa1

0,28 V 0,28 J 0,28 Vt 0,28 J-F 0,28 J 0,28 J-F 0,28 0 0,28 JP Anth'', F1°·9, Alh 0,32 J 0,32 J 0,32 J 0,32 M 0,32 J Coud, Ster', Sa1

0,35 Vt 0,35 0 0,35 0 0,35 J p r-, Fl9, Alh 0,38 J 0,38 J 0,38 J 0,38 J Coud

0,41 BF 0,41 M 0,41 J p Coud, Sai 0,44 J 0,44 B 0,44 Br 0,44 Vt 0,44 B Stert·•, Fl9

0,46 J 0,46 J 0,46 J p Alh 0,48 M 0,48 J 0,48 J Ster6, Fl9, Sa1

0,53 J 0,53 J 0,53 J p Alh 0,56 J 0,56 0 0,56 J-F Tr'·0, Alh

0,60 Vt 0,60 JV 0,60 J Anth", Fl9, Sa1 0,62 J 0,62 V 0,62 J Alh

0,65 Br 0,65 J 0,65 Br 0,65 B Coud, Stert·•, Fl9 0,68 J 0,68 0 0,68 B 0,68 J 0,68 J p Coud, Fl9

0,72 J 0,72 V 0,72 0 0,72 V 0,72 V 0,72 R 0,72 M 0,72 V Tr6, Coud,h Fl9 0,75 0 0,75 M Couh 0,86 V 0,86 Vt 0,86 Vt r-. Ster'

0,89 Vt 0,89 J p Ster6

Il

Tableau Ill : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait acétate d'éthyle des feuilles de Nelumbo nucifera

EXTRAIT ACETATE D'ETHYLE (AcOEt/ MeOH/ H20/ Hex :(5/1/0,5/0,5 v/v/v SANS REVELATEUR<•> KOH(dl NEU(9l FeCbUl DDPH<fl VISIBLE UV 365 VISIBLE UV 365 VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE TYPE DE COMPOSES Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co 0,04 M 0,04 M 0,04 J 0,04 0 0,04 G 0,04 JP Fl9, Tani 0,10 M 0,10 J 0,10 J 0,10 JO 0,10 Ofl 0,10 JV Coud, Fl9, APhi

0.14 J 0,14 M 0,14 JO 0.14 JP Coud, Fl9 0,16 Ofl 0,16 JV Fl9,APhi

0,18 M 0,18 JO 0,18 Ofl 0,18 J p Fl9 0,26 M 0,26 M 0,25 JO Fl9 0,29 J 0,29 J 0,29 JV 0,29 J p APhi

0,33 J 0,33 M 0,33 Ofl Fl9 0,35 J 0.35 M 0,36 0 0,36 JP Fl9

0,38 M 0,39 JV APhi 0,41 J 0,41 M 0,41 JO Fld

0,43 JV 0,43 JP APhi 0,45 J 0,45 J 0,45 0 Coub, fld

0,48 JV 0,48 JP APhi 0,50 0 Fl9

0,51 J 0,51 M 0,51 J Coub 0,54 J 0,54 JV 0,54 JP APhi

0,56 M 0,56 J Coud 0,58 JV 0,58 JP APhi

0,61 J 0,61 V Fl9 0,64 J 0,64 J 0,64 M 0,64 J 0,64 JP Coud

0,66 J Fl9 0,69 J 0,69 0 0,69 JO 0,69 JV Coud, APhi

0,72 M 0,72 M 0,72 J 0,72 JP Fl9 0,78 J 0,78 M 0,78 J Fl9

0,81 0 Fl9 0,84 J 0,84 J Coud

0,86 J 0,86 JF Fl9 0,89 V Fl9

0,93 J 0,93 J Coud

111

- Tableau IV : Métabolites secondaires détectés dans l'extrait n-butanol des feuilles de Nelumbo nucifera

EXTRAIT n-BUTANOL (AcOEt/EtOH/MeCOOH/H20 : (5,5/1,4/0,6/1,5 v/v/v) SANS REVELATEUR<•> NEU<gl FeCbUl DPPH<fJ

VISIBLE UV365 VISIBLE UV 365 VISIBLE VISIBLE TYPE DE COMPOSES Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co Rf Co

0.06 B 0,06 B 0,06 J p Fl9, 0,09 V 0,09 B 0,09 JP Fig 0, 15 V 0,15 V 0,15 JP Fig

0,21 J 0,21 V 0,21 BF 0,21 JP Fl9 0,25 J 0,25 0 0,25 J 0,25 JP Fig

0,29 J 0,29 BF 0,29 G 0,29 JP Fl9, Tan' 0,36 B 0,36 0 0,36 G Fl9, Tani

0,38 0 0,38 JP Fl9 0,41 BF 0,41 JP Fl9

0,46 M 0,46 VtG Tani 0,48 J 0,48 0 Fl9

0,50 0 0,50 JP Fl9 0,54 BF 0,54 J 0,54 G 0,54 JP Fl9, Tani

0,72 G 0,72 JP Tan' 0,76 J 0,76 0 0,76 0 Fl9

0,79 M 0,79 JP 0,94 V Fl9

0,96 G Tani 0,99 0 0,99 0 0,99 JP Fl9

IV

Figure 5: DETERMINATION GRAPHIQUE DE L'IC50 A L'AIDE DU LOGICIEL GRAPH PAD PRISM

150, 150 Hexanique

100 100

50 50

0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 _J 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

-50J concentrations concentrations

Chloroforme

150

100

0.....----,,---.....,..---,..----,,-----,

-50

n-butanol

0.1 0.2 0.3 concentrations

0.4 0.5

150- Ethylacétate

100- 1

~t( 0.1

1 -50-

.... 0.2

..... 0.3

.... 0.4

~ 0.5

concentrations

V

Résumé

Ce travail de recherche s'inscrit dans le cadre de la valorisation de Nelumbo nucifera,

une plante aquatique utilisée en Côte d'Ivoire pour traiter diverses affections. A cet effet,

un criblage phytochimique au moyen de la CCM a été réalisé. Ensuite, des dosages de

phytocomposés (polyphénols, flavonoïdes totaux et tanins) ont été effectués à partir de

différentes méthodes. Enfin, l'évaluation du pouvoir antioxydant vis-à-vis du radical DPPH

a été exécutée sur les différents extraits de N. nucifera.

Le criblage phytochimique a mentionné au sein de Nelumbo nucifera, la présence de

plusieurs métabolites secondaires à savoir : les flavonoïdes, coumarines, tanins, stérols,

terpènes, alcaloïdes, saponines et les acides phénols. Quant à l'évaluation de la teneur de

quelques phytocomposés par différentes méthodes, nous avons enregistré comme teneur

en phénols totaux 3500 µgEAG/g et 2,015% pour respectivement les méthodes de

spectrophotométrie et de permanganométrie. La teneur en tanins est de 83,33 µgEAG/g

pour la méthode de spectrophotométrie et de 0,994% pour la méthode de

permanganométrie. Enfin, un taux de 5,478% a été enregistré pour les flavonoïdes. Les

résultats de cette étude indiquent une richesse en composés phénoliques avec une

prédominance en flavonoïdes. Enfin, l'investigation du pouvoir antioxydant de Nelumbo

nucifera a indiqué une activité notable de la part des différents extraits, laquelle activité est

tributaire de sa composition chimique.

NUM6 UNIVERSITE NANGUI 060318 093630 1

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