%N OBTENTIONU %0$5035 %& - 6/7&345² ...CONACyT PCP-2006, proyecto 04/06 “Levaduras...

Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)

Mécanique, Energétique, Génie civil et Procédés (MEGeP)

Etude des capacités métaoliques de levures fructophiles isolées du Mezcal :

comparaison cinétique et moléculaire

jeudi 15 novembre 2012

Amanda Alejandra OLIVA HERNANDEZ

Génie des procédés et de l'environnement

Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS

Amparo M. QUEROL SIMON

Alberto MENDOZA HERRERA

Claudia Patricia LARALDE CORONA

Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS

Amparo M. QUEROL SIMON

Patricia TAILLANDIER

Diana RESENDEZ PEREZ

Laboratoire de génie chimique - LGC

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFÍLICAS

AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO

Por

AMANDA ALEJANDRA OLIVA HERNANDEZ

Como requisito parcial para obtener el Grado de

DOCTOR EN CIENCIAS

Noviembre, 2012

1

EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFÍLICAS

AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO

Comité de Tesis

Dra. Diana Reséndez Pérez Director interno de la tesis

Dra. Patricia Taillandier Director externo de la tesis

Dra. Claudia Patricia Larralde Corona Secretario

Dra. Cristina Rodríguez Padilla Vocal

Dr. Jorge A. Verduzco Martínez Vocal

Dr. Pablo Zapata Benavides Vocal

2

El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Industrial

del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional bajo la

asesoría de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona, y en el Laboratorio de

Ingeniería Química del Institut National Polytechnique de Toulouse (Toulouse,

Francia) bajo la dirección de la Dra. Patricia Taillandier, y con el apoyo

económico del proyecto CONACyT-Básica 2006-57576 “Análisis

metagenómico y de levaduras de alta actividad fructofílica durante la

fermentación del mezcal tamaulipeco”, y de los proyectos institucionales

SIP2008-0597 y SIP2009-0613 (Instituto Politécnico Nacional) “Caracterización

cinética y molecular de la capacidad fructofílica de levaduras aisladas del

mezcal tamaulipeco” de Febrero 2008 a Enero del 2010. A.A. Oliva Hernández

agradece el apoyo de la beca nacional (CONACyT) así como el apoyo especial

CONACyT PCP-2006, proyecto 04/06 “Levaduras fructofílicas aisladas de

mezcal: comparación cinética y molecular de los procesos de elaboración del

mezcal y del vino” de Enero del 2007 a Diciembre del 2010, en colaboración

CBG-IPN y el INP-Toulouse (Toulouse, Francia).

3

AGRADECIMIENTOS

Gracias Dios por poner en mi camino todas las cosas bellas que ahora tengo.

Gracias a mi familia querida por respaldarme, soportarme con amor y ser un firme apoyo en

cada una de las decisiones y acciones que emprendo. Gracias mama, Amanda Leticia por

darme tu mano cada vez que lo necesito, con ese incansable amor, estar siempre cerca y

cuidar de mi tesoro más preciado, mis hijos, Arturo, Emiliano y Airam. Gracias a mi esposo

Arturo, a mis hermanos Enrique, Lety y Cynthia por su cariño y apoyo.

Profe Manuel de Jesús Hernández Monreal te quiero entrañablemente y le doy gracias a Dios

por quien eres y porque te tengo, con tú gran cariño, ejemplo y apoyo incondicional has hecho

crecer a los que te rodean. Y en lo personal has sembrado ideales, retos y acciones a seguir,

siempre en el afán de que con un esfuerzo positivo y bien intencionado puedo lograrlo.

Gracias a los Doctores Patricia Larralde, Diana Resendez, Patricia Taillandier, José Narváez

por su trabajo y poner alma de artista en esta noble tarea al dirigir con fuerza misionera y

mano delicada el trabajo que implica el quehacer científico, por contagiarme de ese espíritu de

curiosidad y compromiso en aras de una idea.

Gracias Doctor Felipe Ramón Portugal por tu apoyo y sobre todo tu amistad.

4

TABLA DE CONTENIDO

Sección Página

AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................... 3

LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... 8

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................................... 9

LISTA DE SIMBOLOS .................................................................................................................. 13

RESUMEN ...................................................................................................................................... 16

RÉSUMÉ ......................................................................................................................................... 18

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 20

2 JUSTIFICACION .................................................................................................................... 22

3 HIPOTESIS ............................................................................................................................. 22

4 OBJETIVOS ............................................................................................................................ 22

4.1. Objetivo general ............................................................................................................... 22

4.2. Objetivos particulares ...................................................................................................... 22

5 ANTECEDENTES .................................................................................................................. 23

5.1. Mezcal .............................................................................................................................. 23

5.2. La planta de Agave en Tamaulipas .................................................................................. 25

5.2.1. Tamaulipas región mezcalera, situación geográfica ................................................. 25

5.3. El proceso de elaboración del mezcal .............................................................................. 26

5.3.1. Selección de la planta ................................................................................................ 26

5.3.2. Cocción de las cabezas de agave ............................................................................... 27

5.3.3. Molienda .................................................................................................................... 29

5.3.4. Fermentación ............................................................................................................. 29

5.3.5. Destilación ................................................................................................................. 30

5.3.6. Envasado ................................................................................................................... 32

5

5.4. Microbiología del proceso de fermentación .................................................................... 32

5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae ..................................................................... 34

5.4.2. La fermentación alcohólica por S. cerevisiae. ......................................................... 35

5.4.3. Tolerancia al estrés ambiental de S. cerevisiae y la producción de etanol .............. 37

5.5. Transporte de hexosas a través de la membrana celular en S. cerevisiae ....................... 38

5.5.1. Regulación transcripcional en S. cerevisiae: señalización por glucosa .................... 39

5.5.2. El represor transcripcional RGT1 ............................................................................. 40

5.5.3. Las proteínas Grr1, Hxk2 y Reg1 .............................................................................. 41

5.6. La regulación de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa ..................................... 43

6 MÉTODOS .............................................................................................................................. 48

6.1. Aislamiento de levaduras ................................................................................................. 48

6.1.1. Diseño del estudio y tamaño de la muestra ............................................................... 48

6.1.2. Tratamiento de la muestra ......................................................................................... 48

6.1.3. Clasificación microscópica ....................................................................................... 50

6.2. Identificación molecular .................................................................................................. 50

6.2.1. Extracción de DNA ................................................................................................... 50

6.2.2. Amplificación de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR ............... 52

6.2.3. Digestión enzimática del segmento ribosomal ITS’s ................................................ 52

6.2.4. Amplificación de los genes HXT1 y HXT3 .............................................................. 53

6.2.5. Identificación molecular por secuenciación .............................................................. 54

6.2.6. Construcción de dendogramas .................................................................................. 55

6.3. Fermentaciones ................................................................................................................ 55

6.3.1. Medios de cultivo ...................................................................................................... 55

6.3.2. Cuantificación de la biomasa. ................................................................................... 56

6.3.2.1. Espectrometría .................................................................................................... 56

6.3.2.2. Peso seco .......................................................................................................... 577

6.3.2.3. Cuenta celular ..................................................................................................... 57

6.3.3. Análisis de azúcares .................................................................................................. 57

6.3.3.1. Determinación de glucosa por un método enzimático ....................................... 57

6.3.3.2. Determinación de azucares totales por el método DNS ................................... 588

6.3.3.3. Cromatografía liquida de alta presión (HPLC) .................................................. 58

6.4. Cuantificación del estrés por etanol .............................................................................. 599

6.4.1. Parámetros cinéticos .................................................................................................. 59

6

6.5. Análisis estadístico ........................................................................................................... 60

7 RESULTADOS ....................................................................................................................... 61

7.1. Identificación molecular de las levaduras ....................................................................... 61

7.1.1. Análisis de restricción del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA) ........... 62

7.1.2. Amplificación del segmento ribosomal 26S ............................................................. 63

7.1.3. Identificación molecular por los segmentos ribosomales ITS’s y 26S ..................... 63

7.2. Caracterización de la productividad de las levaduras .................................................. 688

7.2.1. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa

(M1) ..................................................................................................................................... 68

7.2.2. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa

(M2) ................................................................................................................................... 722

7.3. Caracterización cinética de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad

fructofílica ............................................................................................................................. 755

7.4. Caracterización de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica

en medio M3 .......................................................................................................................... 855

7.5. Caracterización de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces

cerevisiae fructofílicos ............................................................................................................ 91

7.6. Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y

HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos ........................................ 91

8 DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 95

8.1 Identificación molecular de las levaduras ........................................................................ 95

8.2 Caracterización de la productividad de las levaduras ..................................................... 95

8.3 Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y

HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos ........................................ 99

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................... 103

10 APÉNDICES ......................................................................................................................... 104

Apéndice 1. Microfotografías de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas

de mosto de mezcal. ............................................................................................................... 104

Apéndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal. ...................... 106

Apéndice 3. Secuencias ITS’s de las levaduras aisladas de mostos de mezcal .................... 110

Apéndice 4. Comparación de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras

seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 115

7

Apéndice 5. Comparación de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras

seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 116

11 LITERATURA CITADA ...................................................................................................... 117

12 RESUMEN BIOGRÁFICO .................................................................................................. 135

PRODUCTIVIDAD ............................................................................................................... 135

8

LISTA DE TABLAS

Tabla Página

I. Especificaciones físicas y químicas para la producción de mezcal 25

II. Composición de medios de cultivo 566

III. Parámetros cinéticos 59

IV. Aislados de levaduras con morfología redonda 61

V. Clasificación e identificación molecular de las levaduras aisladas de mostos

de mezcal 64

VI. Parámetros cinéticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en

glucosa (M1). 71

VII. Parámetros cinéticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en

fructosa (M2) 74

VIII. Evaluación cinética al final de la fermentación de los aislados de S.

cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1) 86

IX. Predicción de de la posición de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para

los aislados de mostos de mezcal 94

9

LISTA DE FIGURAS

Figura Página

Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Piñas de agave 27

Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno natural recubierto de

piedra. (B) Piñas cocidas 28

Figura 3. Molino o “trapiche” metálico adaptado en forma transversal, accionado

por tracción animal 29

Figura 4. Tinajas de fermentación de mostos de agave 30

Figura 5. Serpentín usado en destilación de mezcal 31

Figura 6. HXT1 Inducción de la transcripción solo por alta concentración (Ozcan et

al., 1995) 44

Figura 7. HXT3 Inducción de la trascripción por glucosa independiente de la

concentración de azúcar (Ozcan et al., 1995) 45

Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalería “El Palmar”. A) Piñas en cocción.

B) Trapiche. C) y D) Mostos en fermentación 49

Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold™ 10 X. ADN de aislados de

mostos de mezcal; en la tabla IV se especifica la identificación de las

muestras...18 ADN de cepa control FECHA (Fermichamp) 51

Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb

(Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT1 de aislados de

mostos de mezcal 53

Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb

(Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT3 de aislados de

mostos de mezcal. 1=Oligonucleótidos diseñados por.

10

2=Oligonucleótidos diseñados por el Laboratorio de Biotecnología

Industrial 544

Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con SyberGold™ 10 X. Amplificación de

los segmentos ITS’s aislados con morfología celular redonda. Agua (C-)

control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega, Estados Unidos) 622

Figura 13. ARDRA’s de aislados de mostos de mezcal. Gel de agarosa al 2.5%,

teñido con SyberGold™ 10X, marcador 100 pb (Promega, Estados

Unidos) 622

Figura 14. Amplificación de genes ribosomales 26S. Gel de agarosa al 2.5%,

teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados

Unidos) de las levaduras de morfología redonda aisladas de mostos de

mezcal 633

Figura 15. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia

nucleotídica de la región ribosomal 26S. Este árbol está basado en el

método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La distancia

evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite

Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el

tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis

filogenético se llevo a cabo en MEGA4 666

Figura 16. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia

nucleotídica de la región ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este árbol está

basado en el método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La

distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum

Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio

para el tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El

análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4 677

Figura 17. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae

aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9) 699

Figura 18. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por levaduras S.

cerevisiae aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa

1:9) 70

11

Figura 19. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae

en el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 733

Figura 20. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por S. cerevisiae en

el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 733

Figura 21. Cinética de fermentación a 30°C de 3D4. A) Medio M1

(fructosa:glucosa 9:1). Medio B) M2 (fructosa:glucosa 1:9) 766

Figura 22. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y2 Cinética. A) Medio M1

(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 77

Figura 23. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y3. A) Medio M1








Figura 27. Cinética de fermentación a 30°C de Fermichamp® (FECHA). A) Medio

M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) 84

Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A)

3Y3 y B) 3Y5 durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 100:100) 87

Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C)

3Y8 y D) Fermichamp® (FECHA) durante la fermentación en M3

(fructosa:glucosa 1:1) 88

Figura 30. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la

fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1

(fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa

1:1) 89

Figura 31. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la

fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp®

12

(FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3

(fructosa:glucosa 1:1) 90

Figura 32. Pérdida de viabilidad en células de levaduras Saccharomyces aisladas de

mostos de mezcal a 30°C en 25% v/v de etanol. La viabilidad al 100% la

representa el valor de 2 x 106 cfu/mL 91

Figura 33. Predicción de la conformación de los segmentos transmembranales de

las proteínas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la secuencia de la cepa

Saccharomyces cerevisiae S288c y la posición de los polimorfismos de

aislados de mostos de mezcal y la Fermichamp® 93

Figura 34. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un

microscopio BX-51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video

Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. A) 3D2; B) 3D3;

C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6 104

Figura 35. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un

microscopio BX-51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video

Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3;

H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8 105

Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen HXT1 de

aislados de mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c.

Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el

aminoácido 115

Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen hxt3 de

Aislados de Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c.

Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el

aminoácido 116

13

LISTA DE SIMBOLOS

C Grados centígrados

l Microlitro

M Micromolar

A260 Absorbancia a 260 nm

A280 Absorbancia a 280 nm

ADN Ácido desoxiribonucléico

ACP Análisis de Componentes Principales

ADNg Ácido desoxiribonucléico genómico

Als, A Alanina

AMOVA Análisis de Varianza Molecular

Arg, R Arginina

ARN Ácido ribonucléico

ARNasas Ácido ribonucleasas

ARNm Ácido ribonucléico mensajero

Asn, N Asparragina

Pro, P Prolina

Asp, D Aspártico

C/N Relación carbono-nitrógeno

CFU Unidades formadoras de colonia

Cis, C Cisiteina

CO2 Dióxido de carbono

CV Coeficiente de variación

dNTPs Desoxirribonucleósidos trifosfatados

DO550 Densidad óptica a 550 nm

EDTA Ácido etilendiaminotetracético

G Gramo

Gln, Q Glutamina

14

Glu, E Glutámico

Gly, G Glicina

h Hora

His, H Histidina

HXT Genes transportadores de hexosas

Ile, I Isoleucina

kb Kilobase

L Litro

LB Luria Bertani

Leu, L Leucina

Lys, K Lisina

M Molar

M Marcador de peso molecular.

Mb Megapares de bases

Met, M Metionina

mg Miligramos

min Minuto

ml Mililitro

mM Milimolar

ng μL-1 nanogramos por microlitro

nm Nanómetros

ORF Marco de lectura abierta

pb Pares de bases

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PDA Agar papa dextrosa

pH Potencial de hidrógeno

Phe, F Fenilalanina

rARN Ácido ribonucleico ribosomal

rpm Revoluciones por minuto

s Segundos

Ser, S Serina

Thr, T Treonina

Taq ADN polimerasa de Thermus aquaticus.

TGY Medio de cultivo de Triptona-Glucosa-Extracto de levadura

15

Trp, W Triptófano

Tyr, Y Tirosina

TM Región transmembranal

U Unidades

U μL-1 unidades por microlitro

UPGMA Unweighted paired gropuing method with arithmethic average

UV Ultravioleta

V voltios

v/v Volumen a volumen

Val, V Valina

X Veces de la concentración

g Microgramo

l Microlitro

16

RESUMEN

Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados productores de

mezcal más importantes, este producto mexicano puede contribuir a la economía del campo

tamaulipeco provocando una derrama económica importante comparado con otros destilados

de agave ya que además es una bebida que conserva la tradición de fabricación en empresas

pequeñas con tradición, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades.

A diferencia de la micoflora que interviene en el proceso de producción de otras bebidas

alcohólicas, la micoflora responsable de la fermentación alcohólica del mezcal no ha sido

completamente identificada ni caracterizada metabólicamente, es de gran interés industrial

conocer si las levaduras nativas involucradas en la fermentación de mostos de agave poseen,

en primer lugar, una fuerte naturaleza fructofílica (inducida por a la composición natural del

mosto), y en segundo lugar, caracterizar a nivel cinético y molecular el tipo de transportadores

involucrados en el consumo de la fructosa en estas cepa, ya que los estudios de la utilización

de hexosas por Saccharomyces cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la

glucosa, y no se ha observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la

fructosa.

En este trabajo la población a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente

aislados) obtenidos de la mezcalería “El Palmar” del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos

(Tamaulipas, México). La toma de muestra se efectuó en el horno de cocimiento; el trapiche

(molino) y en las diversas etapas de los mostos en fermentación. Como control se utilizó la

cepa Fermichamp ® (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructofílica. Se

identificaron molecularmente por la secuencia ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 y 26S cinco grupos

de microorganismos, 10 aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces

bailii, tres de Torulaspora delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia

mexicana. Se evaluaron cepas identificadas como S. cerevisiae en tres medios diferentes M1

(fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (glucosa:fructosa 1:1). Las cepas

destacadas en el consumo de azucares en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp®; en M2 los

mejores fueron 3Y2, 3Y4 y 3Y8; en M3 fueron 3Y3, 3Y5 y 3Y8. Además se evaluó la

17

resistencia a etanol encontrándose que la cepa con que presento mayor porcentaje de

viabilidad fue la cepa 3Y8.

El análisis de las secuencias de los trasportadores de hexosas de Hxt1 demostró que los

segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de

mezcal y Fermichamp® con la secuencia de la clona S228c. El análisis de Hxt3 mostro que en

TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S207L (cambio de un aminoácido no

polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. TM7 de Hxt1, los aminoácidos Q275, G279 y

D280 están conservados para todas las cepas, sin embargo en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3,

2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T. En Hxt1 se encontraron entre

la región TM9, en el rizo externo y en la TM10 cambios de aminoácidos en la posición 418-

420 y 431, en Hxt3 se localizaron los polimorfismos en la posición 418 y 419 solo para

Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las sustituciones Y402L y C401S; otro cambio

ocurrió solo en la cepa 3D3 que presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la

región transmembranal 9. En Hxt1 del segmento TM10 está presente el polimorfismo L377F,

para 3Y8 cerca de la posición F380. Por otra parte en la cepa 3D3 se encontraron los

polimorfismos F406S; G408A; G411A en Hxt1. En el transportador Hxt1 está presente el

polimorfismo L439M en el TM12, en la cepa 3D3. Se considera que los polimorfismos que se

presenten en estos segmentos transmembranales pudieran modificar el tamaño del poro y la

forma de señalización de la proteína con el azucar, evidenciando su importancia en la

formación de la cadena. Por lo que se pudiera conisderar que estas modificaciones

distorsionarian la conformacion de la estructural exofacial provocando alteraciones entre los

sitios alostéricos de la proteina, propiciando una diferente afinidad con las moleculas de

hexosas, provocando cambios en la funcionalidad del transportador. Los resultados

obtenidos en este estudio sugieren la necesidad de realizar un análisis integral para determinar

las capacidades fructofílicas y de producción de etanol en una cepa de S. cerevisiae; ya que

los cambios observados en la tasas de consumo de azucares y producción de etanol para estas

cepas no están relacionados solo con la expresión y/o actividad de estos genes.

18

RÉSUMÉ

L’état de Tamaulipas au Mexique a pour objectif de devenir l'un des plus grands

producteurs de mezcal. En effet ce produit mexicain peut contribuer à l'économie rurale et

prendre un essor économique important par rapport à d'autres distillats d'agave. C’est aussi

une boisson qui maintient la tradition de fabrication dans les petites entreprises conformément

à la culture et l'histoire en faisant appel aux racines des communautés.

Contrairement à la mycoflore impliquée dans le processus de production des autres

boissons alcoolisées, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a

pas été pleinement identifiée ou caractérisée métaboliquement. Il est tout d’abord d'un grand

intérêt industriel de savoir si les levures indigènes impliquées dans la fermentation de moûts

agave ont une forte nature fructophilique (induite par la composition naturelle du moût). Par

ailleurs les caractérisations cinétique et niveau moléculaire des transporteurs impliqués dans

la consommation de fructose dans cette flore seraient pertinentes étant donné que des études

sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae ont porté presque exclusivement

sur le glucose, et qu’il n'a pas été observé que ces transporteurs discriminaient le glucose et le

fructose.

Dans ce travail la population étudiée était de 17 isolats sur 103 levures initialement isolés

d’une mezcalerie, la "El Palmar" Lozoya M. Emilio, situé à San Carlos (Tamaulipas,

Mexique). L'échantillonnage a eu lieu dans la cuisson au four, au moulin et à différents stades

de moûts en fermentation. Comme souche de contrôle la Fermichamp ® (DSM) a été utilisée.

Il s’agit d’une souche industrielle de vin à capacité fructophilique. Cinq groupes de micro-

organismes ont été identifiés par la séquence-ribosomiques ITS1 et ITS2 5,8 S-26S : 10

Saccharomyces cerevisiae, 1 Zygosaccharomyces bailii, 3 Torulaspora delbrueckii, 2

Kluyveromyces marxianus et 1 Pichia mexicana. Les souches identifiées comme S. cerevisiae

ont été évaluées dans trois milieux différents : M1 (glucose: fructose 9:1), M2 (glucose:

fructose 1:9) et M3 (glucose: fructose 1:1). Les souches prédominantes pour la consommation

de sucres dans M1 étaient 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8. Dans M2 la meilleure était FECHA

suivie de 3D5, 3Y8, 3D3, 3Y2 et 3Y4; dans M3 c’était 3Y3, 3Y5 et 3Y8. En outre la

19

résistance à l'éthanol a été évaluée et nous avons constaté que la souche témoin Fermichamp

®, conservait la meilleure suivie de 3Y5 et 3Y8.

L'analyse des séquences des transporteurs d'hexoses de Hxt1 ont montré que les segments

transmembranaires TM3, TM5 et TM6 sont conservés dans les isolats du mezcal et dans

Fermichamp ® par rapport à la séquence du S228c cloné. L’analyse Hxt3 montre que dans le

segment transmebranaire TM5, les souches de mezcal présentent un polymorphisme dans

S207L (changement d'un acide aminé non polaire à une autre polaire) par rapport à la souche

S228c. Pour le segment TM7 de Hxt1, les acides aminés Q275, G279 et D280 sont conservés

pour toutes les souches, mais dans Fermichamp ®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 et 3Y8 on

rencontre le polymorphisme K278T. Dans Hxt1 entre TM9, région de la boucle extérieure, et

TM10 des changements d'acides aminés à la position 418 à 420 et 431 ont été trouvés. Dans

Hxt3 les polymorphismes étaient situés à la position 418 et 419 seulement pour Fermichamp ;

les isolats du mezcal présentent les substitutions Y402L et C401S, un autre changement a eu

lieu seulement dans la souche 3D3 qui présentent les polymorphismes Y405A, A406F, S407L

dans la région 9 transmembranaire. Dans Hxt1 dans le segment TM10 le polymorphisme

L377F est présent, à proximité de la position 3Y8 F380. En outre, pour cette souche on trouve

aussi le polymorphismes dans les F406, G408A, G411A dans Hxt1. Sur le trnasporteur Hxt1

le polymorphisme L439M est présent dans le TM12. On considère que les polymorphismes

survenant dans les segments transmembranaires peuvent modifier la taille des pores et la

forme de signalisation de la protéine par du sucre, démontrant son importance dans la

formation de la chaîne. Comme ces changements pourraient modifier la conformation

structurelle exofaciale, provoquant entre des altérations des sites allostériques de la protéine,

ils peuvent conduire à une modification de l’affinité pour les hexoses différents et donc à des

changements dans la fonctionnalité du tranporteur.

Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent la nécessité d'une analyse approfondie afin

de déterminer les capacités à la fructophilie et à la production d'éthanol des souches de S.

cerevisiae. Les changements observés dans les taux de consommation de sucre et de

production d'éthanol pour ces souches ne seraient pas liés uniquement à l'expression et / ou

l'activité de ces gènes.

20

1. INTRODUCCIÓN

La fuente principal de carbono en el mosto de agave está compuesta principalmente de

azúcares fermentables (glucosa y fructosa) aproximadamente en una relación de 1 molécula

de glucosa por 7 moléculas de fructosa, a priori podemos pensar que las levaduras

predominantes durante el proceso de elaboración del mezcal tendrán una tendencia

fructofílica (fuerte capacidad de asimilación de la fructosa). La especie de Agave que se

utilice en el proceso va a determinar el tipo y contenido de azúcares, con lo cual se observan

variaciones en el rendimiento del producto, que generalmente son más bajas que el estimado

teórico, debido a deficiencias en la etapa de cocción, extracción de azúcares, de la

fermentación y de la destilación, dado el poco control que se tiene en cada etapa por lo

artesanal del proceso. El mosto de agave contiene además una baja concentración de

nitrógeno asimilable para la levadura.

Las levaduras son el factor más importante durante el proceso de fermentación, pues

además de etanol, producen alcoholes superiores, enzimas extracelulares, precursores de

aromas y compuestos de alto peso molecular que constituyen o participan en el aroma

característico de los productos refinados.

Dentro de la amplia gama de carbohidratos presentes en la naturaleza, y que son utilizables

en el metabolismo, las hexosas ocupan un lugar predominante de importancia, y entre ellas, la

glucosa es la más importante. Para que las hexosas puedan ser utilizadas deber ser en primer

lugar traslocadas a través de la membrana celular, para lo cual se ha observado que existe todo

una serie de proteínas transportadoras, de afinidad variable y modulable, y las cuales son

reguladas tanto a nivel transcripcional como post-traduccional. Los estudios de la utilización

de hexosas por S. cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la glucosa, y no se ha

observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la fructosa. El que una

levadura posea una naturaleza fructofílica, es decir, que consuma a mayor velocidad la

fructosa que la glucosa a altas concentraciones, le confiere una mayor capacidad de utilizar

21

una fuente de carbono que la mayoría de los microorganismos no utilizan como primera

opción.

Hasta la fecha no se conoce en detalle la micoflora que interviene en el proceso de

conversión del mosto del Agave en mezcal tamaulipeco, así como tampoco se ha

caracterizado cinéticamente el transporte y aprovechamiento de azúcares, que son la materia

prima fundamental del proceso de obtención de mezcal. A nivel científico el conocimiento de

las levaduras nativas del mezcal, así como las características de transporte de azúcares (y otras

actividades bioquímicas en este sistema de fermentación) sería de gran importancia, y en

particular, en lo que se refiere a la utilización de la fructosa, que es el azúcar principal de los

mostos, y sus posibles consecuencias a nivel de la caracterización y mejoramiento de la

producción del mezcal.

22

2 JUSTIFICACION

El conocimiento de las características de transporte de azúcares en las levaduras nativas del

mezcal tamaulipeco, y en particular, en lo que se refiere a la utilización de la fructosa, tendría

un impacto positivo en el conocimiento básico y mejoramiento de la producción del mezcal.

3 HIPOTESIS

Dada la alta concentración de fructosa presente en los mostos de mezcal se pueden aislar

levaduras nativas que expresan transportadores con una alta afinidad hacia este azúcar.

4 OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Caracterizar a nivel cinético y molecular el consumo de la fructosa en cepas productivas de

alcohol aisladas de mostos de mezcal tamaulipeco.

4.2. Objetivos particulares

Aislar y caracterizar cinéticamente las levaduras con una alta actividad fructofílica.

Caracterizar la productividad de etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae

fructofílicas bajo diferentes relaciones fructosa:glucosa.

Caracterizar la tolerancia al etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructofílicas.

Caracterizar genéticamente los genes HXT1 y HXT3 del sistema de transportadores de

azúcares de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructofílicas seleccionadas de la

micoflora nativa del mezcal.

23

5 ANTECEDENTES

5.1. Mezcal

La palabra mezcal tiene su origen en vocablos de la lengua náhuatl, algunos sostienen que

deriva de “mexcalli” (“metl” o “meztl”, maguey, y de “ixcalli”, cocer), la traducción sería

entonces “maguey cocido” (Gómez, 2004; Colunga et al., 2007). La planta del maguey desde

tiempo prehispánico era utilizada por los indígenas en todo Mesoamérica obteniendo de él

aguamiel y pulque (Parsons et al., 1990); pero no fue sino hasta la llegada de los españoles en

el siglo XVIII, quienes controlaron su producción, que se introdujo por a las costas de Colima

y Jalisco el proceso de destilación proveniente originalmente de los filipinos (Parsons et al.,

2000; Colunga et al., 2007; Zizumbo et al., 2008). Ciertamente la fabricación del vino mezcal

tuvo un comienzo modesto, su consumo fue a lo largo de los siglos XVI y XVII estrictamente

local, sin embargo, para fines del siglo XVIII y como consecuencia de su vinculación a los

centros mineros, experimentó un fuerte impulso ya que este emergente mercado vino a

sumarse al tradicional mercado rural y al recién conquistado mercado urbano, articulándose

así una fuerte comercialización del producto. En Tamaulipas, existen registros de que los

indígenas Janambres, en el invierno consumían “mezcal de agave haciendo en barbacoa la

piña del quiote del maguey y la lechuguilla”, fueron de verdad los indios más temidos antes

de y durante la conquista. (Mirafuentes, 1993). Durante la colonia, el auge mezcalero de la

región llegó a su punto máximo gracias a las actividades mineras en la sierra de San Carlos,

pero pasada la corta bonanza minera en la Sierra de Tamaulipa Nueva y empobrecidos sus

habitantes por la grave dislocación económica que generó en todo el Noreste la guerra de

Independencia, las minas fueron abandonadas y sus habitantes obligados a buscar otro medio

de subsistencia (Delay, 2007).

El nombre mezcal se utiliza como genérico para bebidas destiladas a partir de diversas

especies de maguey, fabricadas a partir de variados procesos tradicionales, con una

denominación de origen que emplea el nombre mezcal para agrupar, sin reconocer sus

diferencias, a variadas especies, bebidas, regiones y procesos de siete estados que son los

únicos que ahora pueden usar el nombre en la comercialización de sus productos.

24

Actualmente de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-070-SCFI-1994 Bebidas

Alcohólicas-Mezcal Especificaciones, (Tabla I) el mezcal “es la bebida alcohólica obtenida

por destilación de mostos preparados con los azúcares extraídos del tallo y base de las hojas

de los agaves mencionados, sometidos previamente a fermentación alcohólica con levaduras,

permitiéndose adicionar hasta un 20% de otros azúcares en la preparación de dichos mostos,

siempre y cuando no se eliminen los componentes que le dan las características a este

producto.” (Bebidas Alcohólicas-Mezcal Especificaciones). A petición de los productores de

maguey, el Instituto de la Propiedad Industrial gestionó ante la Organización Mundial de la

Propiedad Intelectual, la denominación de Origen para el Mezcal, misma que obtuvo su

registro en 1994 para los estados de Oaxaca, Guerrero, San Luís Potosí, Durango y Zacatecas;

en 2001 para el municipio de San Felipe, Guanajuato, y en 2003 se incorporaron 11

municipios de Tamaulipas entre los que se encuentran Bustamante, Tula, Miquihuana de

Canales, Palmillas, así como de los de San Carlos Arteaga, San Nicolás de Degollado y

Burgos, existiendo en estos últimos el mayor número de fábricas de elaboración de la bebida

alcohólica denominada “Mezcal” ( Norma Oficial Mexicana 2006). En Tamaulipas el mezcal

se elabora de manera artesanal en pequeñas fábricas en donde los campesinos elaboran la

bebida para su propio consumo, las fiestas comunitarias y familiares y para ayudar su

economía familiar mediante la venta. Actualmente el gobierno de Tamaulipas impulsa la

agroindustria del mezcal en el proceso de fortalecimiento en acciones dirigidas a la

modernización y terminación de las fábricas de mezcal existentes, la certificación de las

mismas, promoción y comercialización del mezcal para así lograr el posicionamiento nacional

e internacional (COMERCAM; Gaceta parlamentaria, 2008).

Considerando la ubicación geográfica, la infraestructura de las vías de comunicación, la

cercanía con el mercado más grande del mundo y gran consumidor del tequila y mezcal, como

lo es Estados Unidos, Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados

productores de mezcal más importantes y este producto mexicano puede tener una derrama

económica muy importante, ya que aunque incipiente, posee amplias perspectivas con

impacto social y económico para las entidades rurales comparado con otros destilados de

agave, este es una bebida que conserva la tradición de fabricación en empresas pequeñas con

tradición, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades.

25

Tabla I.

Especificaciones físicas y químicas para la producción de mezcal

Especificaciones

Mínimo Máximo

Porcentaje de alcohol en el volumen a 20° C. 36.0 55.0

Extracto seco g/l 0.2 10.0

Miligramos por 100 centímetros cúbicos referidos a alcohol anhídrido

Acidez total (como ácido acético) 170.0

Alcoholes superiores mg/100 ml 100.0 400.0

Metanol mg/100 ml 100.0 300.0

Se pueden utilizar los aditivos permitidos y en la dosis que establezcan las disposiciones legales correspondientes. NOM-070-SCFI-1994.

5.2. La planta de Agave en Tamaulipas

En el estado de Tamaulipas la denominación de origen enlista para producción de mezcal a

Agave esperrima jacobi Amarilidáceas (“maguey de cerro, bruto o cenizo”), A. angustifolia

Haw (“maguey espadín”), A. weberi cela, Amarilidáceas (“maguey de mezcal”), A.

potatorum, Amarilidáceas (maguey de mezcal) A. salmiana Otto Ex Salm SSP Cassispina

(Trel) Gentry (“maguey verde” o “mezcalero”); en la literatura menciona también se

menciona a A. americana L subsp. Protamericana Gentry (“mezcal” o “maguey cenizo”), A

lophiana, A univittata Haw., y Agave funkiana K. Koch Bouché (Ambas conocidas como

“lechuguilla” o “amole”); Agave montium-santicaroli (Jarcia) (NOM-070-SCFI-1994;

CONABIO 2002; García, 2003; García-Mendoza et al., 2007).

En Tamaulipas se encuentran establecidas 1600 hectáreas con agaves, sin embargo se

tienen plantas silvestres distribuidas en los 22 mil kilómetros cuadrados de los municipios

protegidos, específicamente en la región de San Carlos conformada por los municipios de San

Carlos, San Nicolás parte de Cruillas y Burgos (Jaques et al., 2003).

5.2.1. Tamaulipas región mezcalera, situación geográfica

El Estado de Tamaulipas se ubica al noreste de la República Mexicana, geográficamente se

ubica entre los paralelos 22° 12’ 31’’ y 27° 40’ 52’’ de latitud norte, y los meridianos 97° 08’

26

38’’ y 100° 08’ 51’’ de longitud oeste. Específicamente la Sierra de San Carlos en donde se

encuentra delimitada la actividad mezcalera, es una unidad orográfica asilada dentro de la

planicie costera del Golfo Norte de México sobre la cota de los 400 metros sobre el nivel del

mar (msnm); se localiza en la porción centro-oeste del estado de Tamaulipas, entre los 24° 07’

y los 24° 45’de latitud norte y los 99° 05’y los 98° 42’de longitud oeste. En esta región se

presentan climas que van de los templados subhúmedo a semicálidos secos con lluvias en

verano y largos periodos de sequía, siendo la precipitación mayor parte de la sierra son del

tipo rendzina, estos presentan una capa superficial rica en materia orgánica que descansa

sobre roca caliza y ocupan un 76 % del área, suelos profundos del grupo Chernozem, ocupan

un 10 % de la superficie; también están presentes suelos como los vertisoles y litosoles en

menor proporción. En cuanto a su orografía la parte norte de la sierra pertenece a las

subcuencas del rio Conchos y de los arroyos Chorreras y Camacho, pertenecientes a la cuenca

del Rio San Fernando y el sur de la sierra a las subcuencas de los ríos Pilón, San Carlos y el

arroyo La Zanja, pertenecientes a la cuenca del Rio Soto la Marina; no existen corrientes

perennes dentro de la sierra (Treviño et al., 2002).

5.3. El proceso de elaboración del mezcal

5.3.1. Selección de la planta

El agave tarda entre 8 y 10 años en madurar y es cuando se cortan o “jiman” las pencas y

las raíces hasta dejar el centro del maguey al descubierto, a esta forma de maguey se le

conoce comúnmente como piña, dependiendo del tipo de Agave y la forma de corte, cada una

llega a pesar cien o más kilos (Figura 1).

Es necesario observar ciertas características tales como coloración verde-amarillenta en la

base de las pencas y parda en la base del Agave, así como la presencia de pencas secas en esta

zona. Desde el punto de vista bioquímico, el estado de madurez apropiado lo marca un alto

contenido de azúcares que puedan ser aprovechados por los microorganismos para la

generación de alcohol (Jaques et al., 2004; Ramales et al., 2002; Salvatierra, 2003).

27

Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Piñas

de agave

5.3.2. Cocción de las cabezas de agave

En Tamaulipas el proceso de elaboración de mezcal es rustico, en la cocción de las piñas

de agave se usan pozos cónicos de piedra y tierra construidos para trabajar 800 kg

aproximadamente (Gómez et al., 2004). El proceso inicia haciendo una oquedad en el suelo,

en donde se coloca leña y se recubre con piedras refractarias al calor, se hacen llegar al rojo

vivo (800 a 1000 °C aproximadamente), después se colocan las piñas, se cubren con costales

y tierra (Figura 2). Es importante cuidar la temperatura y el tiempo de tapado ya que

repercuten en el sabor de mezcal, quemado en caso de estar muy caliente el horno o ahumado

en caso de un mal tapado. La temperatura óptima del horno se define en base a la experiencia

del procesador, apoyada en el tiempo de combustión de la leña. El horneado tiene una

A

B

B

28

duración aproximada de tres días, esto es cuando la piña cambia del color blanco a color

caramelo.

Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno

natural recubierto de piedra. (B) Piñas cocidas.

Con este proceso se logra la hidrólisis de los fructanos, principal producto fotosintético

en la planta de Agave, estos son polímeros solubles de fructosa con generalmente una glucosa

por molécula. Esta reportado que existe más de una estructura en la familia Agavácea (Sims et

al., 2001), en el Agave tequilana y el Agave americana la principal fuente de almacenamiento

de carbohidratos es la inulina (Sánchez et al., 1953). La molécula de inulina es un fructano

con un enlace tipo ß (2 1) compuesta por más de 30 unidades de D-fructosa unidas por

enlaces glucosídicos; su hidrólisis produce además de fructosa (100 a 140 g/L dependiendo de

la especie) 5 a 6 % de moléculas de glucosa; la inulina se hidroliza por los ácidos y por la

B

A

B

29

enzima, es soluble en agua, levógira, no da color con el yodo y no tiene poder reductor.

(Babor and Aznárez, 1977; Gómez et al., 2004; Aguilar et al., 2007).

5.3.3. Molienda

En la siguiente fase los pedazos de cabezas se desmenuzan y pasan a la molienda, usando

un molino o “trapiche” vertical metálico accionados por tracción animal o mecánico (Figura

3). El mosto obtenido se coloca en tinas de fermentación, a través de canaletas ubicadas

generalmente al ras del suelo.

Figura 3. Molino o “trapiche” metálico adaptado en

forma transversal, accionado por tracción animal.

5.3.4. Fermentación

En la fermentación del mosto se usa como inóculo residuos de fermentaciones anteriores,

se lleva a cabo en tinajas de madera o metálicas (Figura 4) donde fermenta en forma natural y

a la intemperie durante cinco a nueve días (dependiendo de la temperatura ambiente, la cual

oscila entre los 25°C y 42°C). Los procesadores dan por terminado el proceso cuando cesa la

generación de espuma. En la fermentación natural del mosto de agave participan e

interaccionan secuencialmente un complejo grupo de microorganismos. En lo que se refiere a

las levaduras, el origen de estos microorganismos puede ser la superficie de los agaves o el

ambiente de las tinajas de fermentación, hasta las moscas que rondan la molienda sin ningún

30

tipo de inoculación externa; esta situación causa que las fermentaciones no sean producto de

una sola especie o cepa de levadura, sino de una biodiversidad de especies y cepas diferentes

a lo largo del proceso. Se tiene la certeza de que en la etapa final invariablemente dominan las

levaduras resistentes a altas concentraciones de alcohol comúnmente Saccharomyces

cerevisiae. Es indudable que la calidad del mezcal está directamente relacionada con la

microflora típica nativa del proceso fermentativo.

Figura 4. Tinajas de fermentación de mostos de agave

5.3.5. Destilación

Al terminar el proceso de fermentación los mostos cocidos se pasan hacia los alambiques

de destilación (Figura 5). Aquí la mezcla se calienta en el alambique evaporándose y

condensándose lentamente a través de un serpentín que deposita su contenido en un

recipiente; el producto de la fermentación es destilado en tres partes, la cabeza y la intermedia

A

B

31

son generalmente redestiladas, obteniéndose así un producto con mayor porcentaje de alcohol

(aproximadamente 55 % en volumen) y una tercera parte llamada “cola” es desechada.

Empíricamente para conocer el grado alcohólico los productores usan un carrizo y una jícara

donde vierten el mezcal, cuando se forman burbujas se entiende que el mezcal es de calidad.

Este proceso ha sido muy poco estudiado, considerando que es el último paso que define la

calidad de la bebida.

La Norma NOM-070-SCFI-1994 para el mezcal establece los límites máximos y mínimos

de concentración permitidos en la bebida (Tabla I), pero en estudios anteriores se observó que

existe una gran variedad de componentes volátiles en el mezcal, sin embargo, solamente

algunos de ellos están bajo regulación oficial. Como es esperado, el etanol es el componente

de mayor abundancia en el mezcal, ya que este compuesto es el resultado de la

biotransformación de la azúcar por los microorganismos durante la fermentación (Salmon,

2005; Suarez et al., 2006; Arrizon et al., 2006).

Figura 5. Serpentín usado en destilación de mezcal

Análisis realizados en mezcal por micro extracción de fase solida- cromatografía de gases-

espectrometría de masas (SPME-GC-MS) mostraron la presencia de alcoholes como metanol,

el cual es producido durante la fermentación alcohólica a por la biodegradación de la pectina

y la lignina de la pared de las células vegetales; asimismo se encontraron etanol, metanol, n-

propanol, 2-butanol, 2-metilpropanol y mezcla de 2/3 metil-1-butanol, producidos por el

catabolismo de los amino ácidos (Lachenmeier et al., 2006; De León-Rodríguez et al 2006).

Del mismo modo fueron identificado nueve clases de terpenos (α-phellandrene, α -terpineno,

p-cimeno, limoneno, α -trans-ocimene, linalool, 4-terpineol, geraniol, and trans-nerolidol) se

32

ha reportado que estos terpenos son liberados por las β-glucosidasas por las levaduras durante

el proceso de la fermentación. Asimismo ha sido detectado furfural y 5-metilfurfuraldehído, al

igual que la presencia de ésteres en su mayoría de etilo, los cuales son los responsables del

aroma afrutado en bebidas alcohólicas, como el caso de hexanoato de etilo y octanoato de

etilo (olor a manzana). Igualmente se observó la presencia de alcoholes aromáticos

importantes como el feniletanol, que confiere un aroma floral (Escalante et al., 2006;

Lachenmeier, 2006, Molina et al., 2007) otro compuesto que también se encuentra en los

mezcales son el acido acético, acetato de etilo y etil-2-hidroxipropanato (León et al., 2006,

Vera et al., 2009). La presencia de componentes minoritarios juega un papel muy importante

en la bebida ya que le confiere propiedades organolépticas específicas que varían

notablemente con la edad de maduración. Cabe mencionar que la concentración de metanol en

conjunto con los alcoholes superiores es un indicativo de que la bebida no se encuentre

diluida o adulterada (Lachenmeier, 2006).

5.3.6. Envasado

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana sobre bebidas alcohólicas, los mezcales se

clasifican en tres tipos basados en el tiempo de maduración después de la destilación. Los

mezcales jóvenes son embotellados justo después de la destilación, los reposados permanecen

de 2 a 6 meses en barricas para su estabilización, mientras que los añejos son sujetos a un

proceso de maduración de por lo menos 1 año. Durante este tiempo el mezcal adquiere color

ámbar y sabor característico.

5.4. Microbiología del proceso de fermentación

Bioquímicamente en la fermentación los azúcares son transformados a etanol y otros

compuestos como alcoholes con tres o más átomos de carbono y ésteres. En general las

propiedades organolépticas de una bebida alcohólica son determinadas por la composición de

una mezcla de alcoholes, ésteres, y otros compuestos como terpenos provenientes de la planta.

Es decir, la variedad de compuestos organolépticos generados en la fermentación, depende del

tipo de microorganismo, de la materia prima y de las condiciones de fermentación (Berry et

al., 1987; Lachenmeier et al., 2006).

33

A diferencia del mezcal, la dinámica de la flora responsable del proceso fermentativo del

mosto en bebidas como el tequila (Arrizon et al., 2002, 2007), pulque (Estrada et al., 2001), y

vinos de mesa ha sido objeto de numerosos estudios (Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). En

tequila la identificación de levaduras nativas se encontró que en el agave fresco la microbiota

estaba dominada por Clavispora lusitaniae y especies endémicas como Merschnikowia

agavaveae, en Drosophila spp encontradas alrededor o dentro de la destilería se identificó

Hanseniaspora spp., Pichia kluyveri y Candida krusei., en melazas Schizosaccharomyces

pombe, en agave cocido y mostos una considerable diversidad de especies incluida

Saccharomyces cerevisiae, en mostos fermentados se encontró baja la heterogeneidad de

especies, encontrando al inicio de la fermentación a Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces

marxianus y Hanseniaspora spp, progresivamente en el tiempo se encontró a S. cerevisiae,

Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri y Brettanomyces spp., concluyendo que la

principal fuente de inóculo para el proceso de fermentación son los tanques de fermentación

(Arrizon et al., 2002).

En pulque, han sido aisladas las levaduras Candida lusitaneae, Kluyveromyces marxianus

var. Bulgaricus, Saccharomyces cerevisiae (capensis), C. valida, S. cerevisiae (chevalieri) y

K. marxianus (lactis) (Estrada et al., 2001).

En la fermentación espontánea del mezcal se han encontrado microorganismos como

Candida spp., C. magnolia, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum, H. vinae, K.

marxianus, P. membranifaciens, T. delbrueckii, Candida parapsilosis, Clavispora lusitaniae,

Debaryomyces hansenii, Pichia caribbica, P. guilliermondii, y S. cerevisiae (Jaques et al.,

2005; Oliva, 2007; Cáceres et al., 2008).

En vino blanco, elaborados a partir de la variedad de uva “Rovello bianco” se encontraron

levaduras nativas del genero de S. cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia spp.,

Candida, Pichia, Torulaspora y especies de Cryptococcus flavescens (Francesca et al., 2009).

En otro estudio, se aislaron levaduras nativas de una fermentación alcohólica se encontraron

microorganismos del genero S. cerevisiae, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum,

Issatchenkia orientalis, Pichia anómala y Kluyveromyces thermotolerans (Clavijo et al.,

2011). En vinos espumosos, se han realizado estudios sobre la influencia de cepas de

Saccharomyces cerevisiae en la formación de compuestos volátiles en la fermentación

(Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). Para optimizar la producción de vino y otras bebidas

34

fermentadas se han manipulado genéticamente cepas de Saccharomyces cerevisiae, se sabe

que esta levadura interviene en la fermentación y calidad; de tal forma que se han introducido

o eliminado características genéticas con la finalidad de que la cepa intervenga en el proceso

de fermentación afectando de manera deseable la producción del vino (influyendo en los

cambios de acidez volátil, sabores y olores agradables), no obstante este tipo de levaduras

están prohibidas en Europa y en Australia, sin embargo, en Canadá o Estados Unidos están

totalmente permitidas (Querol et al., 1990; Pérez et al., 1999; Pretorius, 2001).

5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae

Las levaduras del género Saccharomyces pertenecen al phylum Ascomycota, clase

Hemiascomycetes, orden Saccharomycetales y familia Saccharomycetaceae. El género de

Saccharomyces está compuesto por las especies S. cerevisiae, S. arboricola, S. bayanus, S.

cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus y un hibrido S. pastorianus (Naumov et

al., 2000, 2003; Kurtzman et al., 2003; Wang et al., 2008, Scanell et al., 2011).

Particularmente la especie Saccharomyces cerevisiae constituye el microorganismo

eucariota más estudiado por su importancia en la elaboración de alimentos, como en la

panificación y bebidas como vinos (Barnett, 2000). La palabra Saccharomyces proviene del

latín saccharum (azúcar) y mykes (hongo), mientras que cerevisiae de cerevisia (cerveza) y es

un hongo levaduriforme que presenta células alargadas globosas, elipsoidales con gemación o

blastoconidios multilaterales, con ascos con hasta cuatro ascosporas esféricas o elipsoides y

de pared lisa en su interior. Las colonias crecidas en PDA (Agar papa dextrosa) son cremosas

y blandas (Barnett, 2000). El crecimiento vegetativo es la forma principal de reproducción de

S. cerevisiae, este tipo de reproducción asexual se lleva a cabo por gemación y envuelve la

división mitótica de núcleos haploides. La reproducción sexual es una alternativa de cuando

faltan nutrientes, la levadura es inducida a esporular y finalmente a propagarse por la

segregación de cuatro esporas haploides (Saba et al., 1997).

La levadura S. cerevisiae posee un genoma pequeño, esto simplifica de manera importante

el análisis genético y molecular del mismo (Dujon, 1996). A diferencia de los genomas de

organismos multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado que el 72% de la

secuencia corresponde a secuencias codificantes. El tamaño promedio de los genes de

35

levadura es de 1.45 kb, o 483 codones, y solamente el 3.8% de los ORFs contienen intrones.

Aproximadamente el 30% de los genes se han caracterizado experimentalmente; y del 70%

restante, cuya función no se conoce, aproximadamente la mitad contiene al menos un motivo

de algún tipo de proteínas ya caracterizadas, o corresponden a genes que codifican para

proteínas estructuralmente relacionadas con productos génicos ya caracterizados en levadura

o en otros organismos (Pandey y Mann, 2000). En S. cerevisiae el ARN ribosomal se

encuentra codificado por 120 copias repetidas y arregladas en tándem en el cromosoma, en

tanto que existen 262 genes que codifican para ARNs de transferencia, 80 de los cuales

poseen intrones. Los cromosomas contienen elementos movibles, retrotransposones, que

varían en número y posición en las diferentes cepas de S. cerevisiae, aún cuando la mayoría

de las cepas de laboratorio poseen aproximadamente 30 elementos (Pandey y Mann, 2000).

En el ADN ribosomal tanto en S. cerevisiae, como en las demás especies de levaduras y

hongos, hay cuatro genes, el gen 5S, 5.8S, 18S y 26S, estos se encuentran agrupados en

repeticiones a lo largo del cromosoma XII y son regiones altamente conservadas en todas las

especies de levaduras. Los genes 18S y el 26S se encuentran separados uno de otro por

espacios transcritos internos (ITS) y espacios íntergénicos (IGS). Las secuencias de ITS e IGS

pueden ser fácilmente amplificadas por PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) usando

oligonucleótidos homólogos a estas. En S. cerevisiae al igual que en otras especies de

levaduras, estas secuencias han sido ya obtenidas, de manera tal que estos estudios son en

gran medida útiles para identificación, hacer análisis de filogenia y diversidad genética entre

las especies de levaduras (Montrocher et al., 1998; Esteve et al., 1999; Hauser et al., 2001;

Naumova et al., 2003). La digestión de los segmentos ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 con

enzimas de restricción, es una importante herramienta en la diferenciación de especies de

levaduras S. cerevisiae a otros géneros presentes en una fermentación espontanea, no obstante

la comparación entre un perfil y otro obtenido de la misma especie requiere de análisis

bioquímicos y moleculares más puntuales para diferenciarlas entre sí (Hierro et al., 2005;

Nisiotou et al., 2007).

5.4.2. La fermentación alcohólica por S. cerevisiae.

En la fermentación alcohólica espontanea tradicional, participa un complejo grupo de

microorganismos nativos o autóctonos que interaccionan entre sí a lo largo del proceso, la

levadura S. cerevisiae tiene un rol central dentro de este proceso; generalmente se obtiene una

36

bebida alcohólica con características particulares de los insumos usados, la mano de obra que

lo procesa, las condiciones climáticas y geográficas de la región; atribuyéndole una gran

variabilidad organoléptica y química entre una fermentación y otra.

La levadura Saccharomyces sp. ha sido seleccionada por su habilidad de fermentar rápida

y eficientemente los mostos de uva los cuales contienen altas concentraciones de azúcar, por

su resistencia a alta concentraciones de etanol y al dióxido de sulfuro y la capacidad de

supervivencia a elevadas temperaturas durante las fermentaciones produciendo así

fermentaciones controladas mejorando la calidad y composición química del vino (Puig et al.,

2000; Querol et al., 2001; Serra et al., 2006).

Las levaduras presentan la tendencia a utilizar iones de amonio como única fuente de

nitrógeno por lo que el amoniaco y sales amónicas, parecen ser las fuentes más adecuadas de

nitrógeno por su fácil disponibilidad y bajo precio (Prescott et al., 1962). El (NH4)2SO4 es la

fuente más favorable ya que provee un beneficio nutricional adicional, como una fuente de

azufre (Pinal et al., 1997; Taillander et al., 2006). Sánchez et al., (1953) recomendaron el uso

de sulfato de amonio como una fuente de nitrógeno, en la fermentación del agave para la

producción de tequila para favorecer la producción de alcohol. En otro estudio se observo el

efecto de la concentración del ion amonio en la producción de alcohol, y encontraron que la

producción de etanol fue alta cuando el sulfato de amonio estuvo presente a concentraciones

equivalentes de 750 a 1000 mg N/L (Terán et al., 2002). En agaves o magueyes el contenido

de nitrógeno es bajo, con promedio de 0.02% a 0.03%, en el caso del A. tequilana Weber

variedad azul (Sánchez, et al., 1953), y mayor de 0.37% en el caso del A. angustifolia Haw

(Sánchez, 1985), por lo cual, los niveles de nitrógeno pueden ser críticos durante la

fermentación. La falta de nutrientes para la levadura especialmente, la deficiencia en

nitrógeno, provoca fermentaciones lentas (Casey et al., 1984).

Uno de los factores de mayor impacto en una fermentación espontanea es la alta

variabilidad en las poblaciones de S. cerevisiae (Martínez et al., 1989; Esteve et al., 2001;

Suarez et al., 2006), los resultados genéticos sugieren que las diferentes cepas derivan unas de

otras por mutación, como lo son los rearreglos cromosomales adquiridos por las numerosas

divisiones mitóticas; todo esto tiene lugar debido al proceso gradual de adaptación a las

condiciones de vinificación (Naumov et al., 1996; Polsinelli et al., 1996; Puig et al., 2000;

Fleet et al., 2003).

37

Desde 1930 han sido utilizados los cultivos líquidos de levadura vínica (Instituto Laclaire,

Francia), mientras que las levaduras vínicas secas no se originaron hasta mediados de los años

cincuenta utilizándose como inoculo en fermentaciones dirigidas (Rainieri et al., 1998;

Querol et al., 2001).

5.4.3. Tolerancia al estrés ambiental de S. cerevisiae y la producción de etanol

Las habilidades de las células de levadura para detectar y responder a las condiciones

ambientales de estrés son importantes ya que estas afectan directamente la viabilidad de la

célula, los mecanismos de respuesta al estrés responden a moléculas sensoras y señales en las

rutas de transducción las cuales determinan cambios en los niveles de mRNA para cerca de

900 genes (Bauer y Pretorius, 2000; Estruch, 2000; Gasch et al., 2000; Hohmann y Mager,

2003). Como un factor de estrés para la sobrevivencia y el crecimiento de las levaduras,

pueden considerarse el estrés osmótico debido a las altas concentraciones de azúcar al inicio

de una fermentación (glucosa y fructosa en los mostos de uva varía entre 125 y 250 g/L)

(Carrasco et al., 2001), un pH bajo (3.5 a 3), de acuerdo al progreso de la fermentación la

acumulación en las concentraciones de alcohol y acetaldehídos, la temperatura alta o baja ya

que la tasa de crecimiento en las levaduras decrece rápidamente dañando la membrana celular

y desnaturalizando ciertas enzimas (Beloch, 2008; Cardona et al., 2007; Salvado et al.,

2008), así como la limitación de nutrientes, y el estrés oxidativo debido al metabolismo

respiratorio.

En una fermentación vinícola, el mosto es preparado con uvas maduras, consecuentemente

con una alta concentración de azúcar. Estas concentraciones de azúcar producen vinos con

altos niveles de etanol, algunas veces por encima del 15% (v/v) (De Barros et al., 2003). En

las fermentaciones espontaneas las levaduras que participan presentan un patrón progresivo de

crecimiento hasta el estado estacionario cuando los niveles de etanol son de 3-4% (Fleet el al.,

1993), pero los estados finales de una fermentación natural invariablemente son dominados

por especies de levaduras alcohol tolerantes como la S. cerevisiae (Campbell, 2003;

Zuzuarregui et al., 2004).

38

5.5. Transporte de hexosas a través de la membrana celular en S. cerevisiae

La plasticidad en la expresión de un gen es determinante en la adaptabilidad; una de las

manifestaciones fundamentales de esta capacidad es la habilidad de las células a usar

diferentes fuentes de carbono. Esto es consecuencia de un complejo grupo de sensores y rutas

de señalización que lideran la expresión de transportadores y enzimas metabólicas.

En la naturaleza S. cerevisiae tiene la capacidad de adaptarse un amplio rango de fuentes

fermentables y no fermentables de carbono (L-azucares, etanol, acetato, glicerol, etc.). La

glucosa es la fuente de energía más utilizada en las células; en respuesta a esta fuente de

carbono existe una matriz compleja en las rutas de las señales de transducción coordinadas

con diversas respuestas metabólicas, como por ejemplo la glucólisis, la disminución de la

actividad respiratoria, el incremento de la biogénesis de los ribosomas, además de la

regulación en el crecimiento y desarrollo.

El primer paso en el catabolismo exógeno de la fuente de carbono es usualmente el

transporte de la molécula a través de la membrana celular; los genes HXT (transportadores de

hexosas) son los encargados de la expresión de las proteínas que facilitan la difusión de

glucosa, fructosa y otros azucares a través de la membrana (Yin et al., 2003; Flick et al.,

2003). Las proteínas HXT pertenecen a la súper familia de facilitadores MFS, se ha

encontrado que para S. cerevisiae existen 17 familias potenciales, estas proteínas son capaces

de transportar pequeñas cantidades de solutos a través gradientes quimiostáticos, asimismo de

equilibrar los sustratos a través de la membrana en ambas direcciones (Nelissen et al., 1997;

Saier et al., 2000; Bannam et al., 2004).

La secuencia y los análisis bioquímicas de diversas MFS sugieren que están compuestos de

12 segmentos transmembranales (TMs) de estructura tipo α-hélice, seis hélices están

localizadas fuera de la membrana citoplasmática y 6 hélices dentro, formando un canal que

facilita el transporte bidireccional del sustrato (Hirai et al., 2002). Las proteínas HXT son

similares en su secuencia amino terminal y trabajan independientemente, facilitando los

mecanismos de difusión y exhibiendo diferentes afinidades por los diferentes sustratos

(glucosa, fructosa, manosa y/o galactosa). La modulación de la afinidad de los transportadores

de hexosas HXT por una u otra fuente de carbono y a interacción entre ellos puede contribuir

a la habilidad de adaptación a las diferentes concentraciones del azúcar por las células de

39

levadura (Saloheimo et al., 2007). En S. cerevisiae la expresión de los genes HXT se regula a

través del balance de dos rutas opuestas, represión e inducción las cuales son reguladas o

inhibidas respectivamente por glucosa. Existen 18 genes que codifican para proteínas

transportadoras de hexosas HXT1 a HXT17, GAL2 (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001;

Ferrer et al., 2004). En S. cerevisiae hay dos sistemas de transporte, uno constitutivo que es

un sistema de baja afinidad (Km 15 a 20 mM) y uno represivo de glucosa que es un sistema

de alta afinidad (Km 1 a 2 mM).

En investigaciones realizadas encontraron que una cepa mutada en los genes HXT1 al

HXT7 no fue apta para crecer en glucosa, fructosa ni manosa y no presento flujo glucolítico.

Con estos estudios determinaron que HXT2, HXT6 y HXT7 son genes que expresan proteínas

transportadoras de hexosas de alta afinidad la presencia de cualquiera de estos genes es

suficiente para que la cepa mutante crezca en una baja concentración de glucosa (0.1%). Los

genes HXT1, HXT3 y HXT4 son genes que codifican para transportadores de baja afinidad, y

su presencia es suficiente para que la cepa mutante crezca en altas concentraciones de glucosa

(más del 1%). Los genes HXT8 al HXT17 codifican para proteínas que son incapaces de

transportar glucosa (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001; Yin et al., 2003).

5.5.1. Regulación transcripcional en S. cerevisiae: señalización por glucosa

La regulación de la concentración de hexosas en las células de levadura, es mediante la

expresión de los genes HXT vía señalización desde receptores de baja y alta afinidad de

glucosa (Ozcan et al., 1999, 2002; Flick et al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006). El gen

SNF3 codifica una proteína situada en la membrana citoplasmática (Snf3p) que censa bajas

concentraciones de sustrato, en cuanto a hexosas se refiere, esta activa la inducción de un

grupo de transportadores de hexosas de alta afinidad, la deficiencia de la proteína lleva a una

pérdida de los transportadores. Snf3p es requerida para la inducción de los genes HXT2,

HXT3 Y HXT4 (Flick et al., 2003; Ozcan et al., 1999). El gen RGT2 codifica Rgt2p (proteína

censora de altas concentraciones de glucosa) está situado en la membrana citoplasmática, este

requerido para la expresión máxima de la inducción del gene HXT1 (Ozcan, 1996, 1999).

El alto grado de similitud entre Snf3 y Rgt2 sugiere que ambas proteínas censan glucosa de

una forma similar y pueden actuar sobre las mismas proteínas o similares para transmitir la

señal de glucosa. Tanto Rgt2p como Snf3p, tienen un 70% de homología entre ellos y un 30%

40

con otros miembros de la familia HXT. Como se menciono anteriormente, no transportan

glucosa pero sirven como sensores extracelulares de glucosa, fructosa y manosa generando

una señal intracelular de inducción que no requiere del transporte o metabolismo de la

glucosa para la expresión de HXT (Dietvorst et al., 2009). Ambas proteínas, están

constituidas por dos diferentes dominios: 12 dominios transportadores transmembranales y un

dominio C-terminal la cual se predice esta en el citoplasma; Snf3 tiene dos secuencias de 25

aminoácidos y Rgt2p solo una, aparentemente esta terminación es la responsable en la

generación de la señal de la expresión de los genes HXT. Se ha sugerido que el cambio

conformacional inducido por la unión de la glucosa al dominio transmembranal, afecta el

dominio C-terminal y la forma en cómo interacciona con otros componentes se sugiere que

probablemente sirve como un dominio de señalización que interactúa con los componentes

cercanos en la ruta de la señal de transducción (Ozcan et al., 1996, 1999; Lafuente et al.,

2000).

5.5.2. El represor transcripcional RGT1

El controlador final en la ruta de traducción en la señal de glucosa es RGT1, ruta la cual

inicia con el sensado en la superficie de la membrana y termina en el núcleo, regulando la

expresión de los transportadores de glucosa. RGT1 pertenece a la familia GAL4 de factores

de transcripción, es requerido para la represión transcripcional de HXT1-HXT4 en ausencia

de glucosa; este gen codifica para un represor transcripcional, Rgt1p, una proteína que

contiene un grupo Zn2Cys6 responsable de la unión al ADN, la cual reconoce varios sitios de

unión a los promotores de los genes HXT ya que un solo sitio de unión no es suficiente para

una represión significativa (Ozcan et al., 1999; Kim et al., 2003; Flick et al., 2003). La

función de Rgt1p es regulada por una interacción intramolecular entre la región-N terminal y

la región media de RGT1, se sugiere que esto inhibe la unión al DNA con el dominio de

RGT1 (Dombek et al., 2004). RGT1 sirve también como activador transcripcional y es

requerido para la completa expresión del gen HXT1 cuando los niveles de glucosa son altos,

aunque la forma en cómo se convierte de represor transcripcional a un activador no es clara

aun. Lo cierto es que el nivel de glucosa determina el estado de fosforilación de Rgt1p; esta

hipofosforilado en ausencia de glucosa e hiperfosforilado cuando los niveles de glucosa son

altos (Lafuente et al., 2000; Kim et al., 2006).

41

En ausencia de glucosa Rgt1p, en conjunto con Mth1, un regulador negativo en la

señalización de glucosa y Std1p una proteína involucrada en el control de la regulación de

glucosa, se une a los promotores de los genes HXT y a los correpresores transcripcionales

Ssn6 y Tup1, esto estabiliza el dominio represivo en la cromatina e inhibe directamente a la

RNA polimerasa reprimiendo la expresión de los genes HXT (Lafuente et al., 2000; Flick et

al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006).

En presencia de glucosa, cuando la señal es generada por Snf3 y Rgt2, es transmitida a

Rgt1 a través de Grr1, inhibiendo la represión transcripcional de Rgt1, aunado a la

degradación inducida por glucosa de Mth1 y Std1, permitiendo que los genes HXT se

expresen (Kim et al 2003, 2006; Ramakirshnan et al., 2006). En la activación por glucosa la

PKA (cAMP-proteinquinasa) cataliza la fosforilación de Rgt1 inhibiéndolo, permitiendo la

expresión de los genes HXT. La PKA está involucrada en diversos procesos celulares, entre

los que se encuentra el crecimiento celular, resistencia al estrés y en el metabolismo en

general. Diversos estudios han demostrado que las células de levaduras deficientes en PKA no

son capaces de expresar los genes HXT1 y HXT3 en presencia de glucosa (Lafuente et al.,

2000; Polish et al., 2005; Kim et al., 2006; Belinchon et al., 2006).

5.5.3. Las proteínas Grr1, Hxk2 y Reg1

La represión en la expresión de los genes HXT en presencia de glucosa requiere de la

proteína Grr1p, una proteína que se expresa constitutivamente a muy bajos niveles y

pertenece al complejo SCF (Skp1/cullin/F-box) cada una de las cuales poseen diferentes

componentes F-box. La naturaleza de la proteína F-box determina la especificidad de la

interacción con el complejo de enzimas de ubiquitinación (Ubcs) y su blanco. Grr1 se une a

los sustratos en la proteólisis mediante ubiquitinación, esta incluye un motivo carboxilo

terminal capaz de interaccionar proteína-proteína, unido así Rgt1 con Grr1 se elimina la

interacción con el correpresor dando lugar a una activación transcripcional (Hsiung et al.,

2001; Flick et al., 1991, 2003; Vallier et al., 1994). En ausencia de glucosa, Rgt1 está

presente en la forma no-ubiquinada y actúa como represor al unirse a Ssn6 y Tup1, proteínas

que forman un complejo correpresor que reprime la transcripción de algunos genes

interaccionando directamente con las histonas H3 y H4 (Watson et al., 2000; Davie et al.,

2003; Zhang et al., 2004; Fagerstrom-Billai et al., 2007).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_AbstractPlus&term=%22Zhang+Z%22%5BAuthor%5D

42

La levadura S. cerevisiae es capaz de detectar los niveles extracelulares de glucosa y

generar señales intracelulares que resultan en respuestas adecuadas a las variaciones en la

composición del medio; la mayoría de estas respuestas involucran alteraciones en la expresión

de los genes, una parte de estas alteraciones ocurren por los niveles de trascripción del

mARN, por la represión o activación en la trascripción de diversos genes implicados en la

codificación de enzimas en el metabolismo de carbono; entre estas se encuentra una

isoenzima hexoquinasa 2 (Hxk2). Cuando las células de la levadura están creciendo en un

medio fermentable compuesto por glucosa, fructuosa o manosa como fuente de carbono, el

gen HXK2 codifica la enzima Hxk2p, la cual cataliza la fosforilación de glucosa en el carbón

6 en el citosol. Se encontró que la interrupción del gen HXK2 tuvo un profundo efecto en las

transcripciones de genes relacionados con el ciclo TCA (Ciclo de los ácidos tricarboxílicos o

de Krebs), al igual que en la tasa de respiración, y en la síntesis de ATP. Al realizar la cinética

de producción de etanol con la mutante hxk2-delta presentó una menor producción que la

cepa que no tenía interrumpido el gen HXK2. Hxt2p juega un rol específico durante la

señalización de glucosa ya que es requerida para la represión de algunos genes por glucosa, es

específicamente requerida para una fuerte inducción de HXT1 por altas concentraciones de

glucosa y para HXT4 en bajas concentraciones (Belinchon et al., 2006; Westergaard et al.,

2007). Hxk2 depende de la cantidad de Mig1 presente en el núcleo, Moreno et al. (2005)

analizaron la interacción tanto in vivo como in vitro de Hxk2-Mig1; encontraron que el

complejo es necesario para la translocación de Mig1 al núcleo. Dilucidaron que el mayor

funcionamiento de Mig1 en inhibir la función de la proteinkinasa Snf1 cuando la bloquea por

fosforilación. Mig1 en un factor involucrado en la represión transcripcional de glucosa, que

tiene una secuencia especifica de unión al ADN y es regulado por SNF1 (serinproteína/treonin

quinasa) y GLC7 fosfatasa (Nehlin et al., 1990; Verma et al., 2005). De la Cera et al. (2002)

demostraron que HXK2 Y MED8 están asociados fisiológicamente ya que ambas proteínas

Hxk2p y Med8p se encuentras interaccionando juntas en las uniones con los segmentos de

DNA que contienen los sitios MED8, concluyeron que Hk2p opera a través del sitio MED8

por interacción con Med8p, en la traducción en la ruta de señalización de glucosa en

Saccharomyces cerevisiae. MED8 es una subunidad mediadora del complejo de la ARN

polimerasa II cuando actúa como represor previene que la polimerasa se una al promotor,

cuando actúa como activador se une a la polimerasa e incrementa la afinidad con el promotor

o simula la transición de cerrado a abierto complejo promotor-polimerasa (en la burbuja de

trascripción en la cual la doble hélice de ADN se une para facilitar el inicio de la trascripción)

(Kornberg et al., 2005; Westergaard et al., 2007). Otra proteína que participa en el proceso

43

inhibidor de los genes represivos es Reg1p, una proteína magnesio dependiente serin-treonina

fosfatasa (AMD fosfatasa) contiene una subunidad catalítica de 38 kDa y una subunidad

moduladora de 23KDa, tiene actividad fosfatasa. Reg1p interacciona fuertemente con Glc7p,

una proteinfosfatasa tipo-1 que participa en diferentes procesos que incluyen represión de

glucosa, crecimiento celular y acumulación de glicógeno. Reg1 interacciona a través de Glc7p

con el dominio kinasa de Snf1p resultando la desfosforilación e inactivación de Snf1p y de

algunos genes involucrados en la represión de glucosa. Esta interacción juega un rol

importante en el transporte de Fbp1p (fructosa 1-6 bifosfatasa) como intermediario de

importación y degradación de las vesículas a las vacuolas durante la inducción de glucosa

(Tung et al., 1992; Cui et al., 2004; Kenneth et al., 2004).

5.6. La regulación de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa

La forma en la que los genes HXT son regulados transcripcionalmente, esto es por

proteínas que se unen a secuencias reguladoras de ADN, en respuesta a glucosa es consistente

con su función de alta o baja afinidad. (Ozcan et al., 1999; Reifenberger et al., 1997.). Estos

genes exhiben diferentes tipos de regulación por glucosa: El gen HXT1, localizado en el

cromosoma VIII, (Figura 6) se expresa en concentraciones mayores al 1% de glucosa o

fructosa; la expresión máxima de este gen es durante la fase lag y la fase temprana-

exponencial de crecimiento de la levadura (Ozcan et al., 1995; Greatrix et al., 2006). La

pérdida del gen HXT1 resulta en la disminución del transporte de glucosa y manosa pero no

de fructosa, sugiere que esta proteína puede ser específica para las aldohexosas. Se sabe que

Hxt1p funciona como transportador de baja afinidad para xilosa, cerca de 10 veces más que

para glucosa (Lewis et al., 1991; Saloheimo et al., 2007). La secuencia de HXT1 es de 1,707

nucleótidos, posee un marco de lectura abierto que codifica para 569 aminoácidos y una

proteína de 64,044 Da. La proteína Hxt1 es altamente hidrofóbica (de acuerdo al análisis de

hidrofobicidad de Kyte-Doolittle) contiene dos grupos de seis dominios hidrofóbicos

separados por un giro de 68 aminoácidos hidrofóbicos, una región con 59 aminoácidos

hidrofilicos N-terminal y 58 aminoácidos del dominio C-terminal (Lewis et al., 1991), esta

proteína es la única que tiene 200 sitios de glucosilación, cuatro sitios hipotéticos de

glucosilación están situados en la región N-terminal Asn2,14,36,42 y uno más en TM5 Asn277.

Esta proteína no contiene motivos PEST (sitios potenciales proteolíticos de unión,

Szkutnickaet al., 1989; Lewis et al., 1991). Como se muestra en la figura 6, Rgt1 es represor

de la expresión de HXT1 en ausencia de glucosa. En presencia de glucosa Rgt1 es

44

hiperfosforilado y disociado del complejo represor formado por las proteínas Ssn6p y Tup1p,

esto requiere de la presencia de la proteína Grr1p (Ozcan et al., 1999; Flick et al., 2003;

Ferrer et al., 2004). Igualmente en presencia de glucosa por un mecanismo aun desconocido la

proteína Hxk2 interacciona con la proteína Reg1p produciendo una fuerte inducción del gen

HXT1 (Ozcan et al., 1999; Belinchon et al., 2006; Westergaard et al., 2007). HXT3 es un

gen que induce un transportador de glucosa de baja afinidad Hxt3p inducido por bajas o altas

concentraciones de glucosa. La presencia de glucosa por si sola induce la expresión de HXT3

cerca de 10 veces con un valor de Km de 28.65 a 6.8 mM. Está reportado que la expresión de

HXT3 es máxima cuando las células están en fase estacionaria (Ozcan et al., 1995, 1999;

Maier et al., 2002). HXT3 codifica por una proteína de 567 aminoácidos con una masa

molecular de 62 KDa; tiene cuatro secuencias TATA (-111, -177, -265 y -280); el análisis de

hidrofobicidad de la proteína predice que contiene 12 dominios transmembranales; una región

hidrofílica entre TM6 y TM7 de 68 aminoácidos (Ko et al,. 1993).

Figura 6. HXT1 Inducción de la transcripción solo por

alta concentración (Ozcan et al., 1995).

45

Como se muestra en la Figura 7, Rgt1 inhibe la expresión de los genes HXT en ausencia

de glucosa. La proteína Grr1p es requerida para la inhibición de la función de Rgt1. La señal

de glucosa intracelular generada por Snf3 (alta concentración de glucosa) y Rgt2 (baja

concentración de glucosa) es responsable de la inhibición de Rgt1 por Grr1, además de la

inducción y la expresión de HXT3 (Ozcan et al., 1995, 1999). Ko et al. (1993) encontraron

que al restaurar los genes HXT1 y HXT3 en células mutadas fueron capaces de crecer en

condiciones extracelulares bajas en potasio (7mM). En una fermentación alcohólica por S.

cerevisiae la glucosa tiene una tasa mayor de consumo que la fructosa, como en la mayoría de

las levaduras industriales usadas en vinicultura, quedando una alta discrepancia entre el

consumo de las cantidades de las dos azucares, por lo que la habilidad de la levadura para

fermentar la fructosa es de importancia crítica para mantener la fermentación hasta el final del

proceso (Bertheles et al., 2004; Guillaume et al., 2007).

Figura 7. HXT3 Inducción de la trascripción por

glucosa independiente de la concentración de azúcar

(Ozcan et al., 1995).

46

Luyten et al. (2002) encontraron que Hxtp1 y Hxtp3 tienen un rol predominante en las

condiciones enológicas debido a los altos contenidos de glucosa y fructosa, Hxt1p tiene una

función importante durante el inicio de la fermentación, mientras que ha sido evidenciado que

Hxt3 es el único transportador que asegura el perfil normal de fermentación, a demás se

expresa durante todas las fases y presuntivamente responsable de la capacidad de algunas

levaduras de consumir fructosa. Estudios en la levadura Fermichamp, caracterizada como

fructofílica ya que la diferencia entre el consumo de glucosa y fructosa es mucho más

pequeño, revelaron que en el gen HXT3 existen 38 mutaciones en la región codificante, 10 de

los cuales son resultado de sustituciones, encontrando que estas se encuentran en la región

transmembranal nueve y diez (TM9 y TM10) (Guillaume et al., 2007). El flujo metabólico en

la fermentación de la fructosa es muy similar al de la glucosa como lo hemos mencionado

anteriormente y el transporte del azúcar a través de la membrana es el primer factor en la

diferencia de fermentación entre las dos azucares; la segunda causa de discrepancia son los

pasos de fosforilación ya que la glucosa después del transporte es fosforilada por tres enzimas,

la glucoquinasa, la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2 mientras que la fructosa solo es

fosforilada por la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2; otro factor importante en el transporte

son las propiedades fisicoquímicas de los azucares, la glucosa es transportada en forma de

piranosa y la fructosa en forma de furanosa (Colville et al., 1993; Bertheles et al., 2004).

En conclusión, la habilidad de degradar el azúcar a etanol y dióxido de carbono (CO2) de

la levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada por los humanos desde

hace miles de años en la fermentación de bebidas alcohólicas. A diferencia de la micoflora

que interviene en el proceso de producción de vino, las levaduras responsables de la

fermentación alcohólica del mezcal no han sido completamente identificadas ni caracterizadas

metabólicamente, ya que el proceso es más bien artesanal; sin embargo, se sabe que la especie

S. cerevisiae, al igual que en el proceso de vinificación, es la más productiva. A nivel

científico y genético la complejidad del sistema de transporte de azúcares no ha sido

estudiado durante la obtención de mezcal, por lo tanto tampoco sus consecuencias a nivel del

proceso de elaboración, mejoramiento y optimización de los procesos de producción, para

realizar la búsqueda de cepas de levaduras con capacidades metabólicas interesantes desde el

punto de vista de utilización y aprovechamiento de residuos agroindustriales.

47

El presente trabajo propone analizar en detalle el proceso de fermentación y obtención del

mezcal, poniendo énfasis, en primer lugar, en la caracterización de los perfiles metabólicos de

las levaduras responsables de la producción de alcohol y metabolitos que le confieren sus

características organolépticas singulares a éste producto; y en segundo lugar, se analizaría

desde el punto de vista molecular la expresión y regulación de los transportadores de hexosas

involucrados en la asimilación de la fructosa, que se sabe es el azúcar principal de los mostos

de agave, y cuya utilización completa determina una mayor productividad del proceso.

La importancia de este trabajo es, en primer lugar, la información científica que se

generaría en cuanto al conocimiento microbiológico (metabólico y molecular) de la

producción de mezcal, el cual es casi inexistente. En segundo lugar, la industria mezcalera

tamaulipeca se beneficiaría, en el corto plazo, con la caracterización precisa del componente

biológico presente en sus procesos, lo cual les permitiría tener un mayor control e

implementar esquemas de optimización y seguimiento de sus procesos. A mediano y largo

plazo podrían contar con un inóculo preciso y único que les garantice la calidad de su

producto, además de la posible aplicación de cepas específicas en la utilización del agave y

otros subproductos agrícolas con una alta concentración de fructosa.

48

6 MÉTODOS

6.1. Aislamiento de levaduras

6.1.1. Diseño del estudio y tamaño de la muestra

La población a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente aislados) obtenidos

de la mezcalería “El Palmar” del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos (Tamaulipas,

México), que se ubica a una altitud 609 m y con coordenadas N 24˚ 43.241’ y W 98˚ 52.934’.

La toma de muestra se efectuó en el horno de cocimiento, directamente de la pared del equipo

y agave cocido; el trapiche (molino) al área de molienda, mostos y bagazo de agave; y en las

diversas etapas de los mostos en fermentación (Figura 8). Como control se utilizó la cepa

Fermichamp ® (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructofílica.

6.1.2. Tratamiento de la muestra

En cada punto (Figura 8) las muestras fueron homogeneizadas; en el caso de la muestra de

consistencia solida se suspendieron 10 g en 10 mL de solución salina al 0.9%, en las muestras

liquidas se analizaron 15 mL. En ambos casos se realizaron diluciones seriadas con el mismo

diluyente y fueron sembradas en medio AN (Agar nutritivo, DIFCO, Francia), YEPD

(Extracto de levadura 5 g/L; peptona 3 g/L; glucosa 20 g/L; agar 20 g/L con antibiótico

(Kanamicina de SIGMA, Alemania). Los aislados obtenidos fueron cultivaron en medio

YEPD y conservadas en glicerol al 86% manteniéndose a -70 °C.

49

Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalería “El

Palmar”. A) Piñas en cocción. B) Trapiche. C) y D)

Mostos en fermentación.

50

6.1.3. Clasificación microscópica

Se realizaron frotis en fresco de los aislados de mostos de mezcal con el fin de observar la

morfología celular. La observación se realizo primero con el objetivo 40X y posteriormente se

tomaron imágenes de las células con campo claro con el objetivo ocular 100X, en un

microscopio BX-51 (Olympus, Japón), y se adquirieron con una cámara de video Hitachi

KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. Las células fueron clasificadas y agrupadas por

su morfología redonda u ovalada.

6.2. Identificación molecular

6.2.1. Extracción de DNA

Se utilizó el protocolo modificado de extracción de ADN propuesto por Raeder y Broda

(1985). Se recolectaron 50-80 mg de células de levadura en un tubo Eppendorf® estéril de 1.5

mL, se sumergieron en nitrógeno liquido por 20 min y se maceraron con pistilos plásticos por

5 min. Fueron agregados 500 µL de buffer de extracción (200 mM Tris HCL pH 8.5; 250 mM

NaCl 25 mM EDTA, 0.5 % SDS) se homogeneizó la muestra e incubó por 5 min a

temperatura ambiente. Para la separación de las fases acuosa, interfase y orgánica se le añadió

500 µL de fenol-cloroformo (50:50 v/v a 4 °C) y se mezcló en el vortex a máxima velocidad

por 5 min. La muestra se centrifugó a 13000 rpm por 30 min y la fase acuosa se transfirió a un

tubo Eppendorf® limpio, donde se adicionaron 400 mL de cloroformo (4 °C), se mezcló

minuto en vortex y se centrifugó durante 5 min. Se recuperó el sobrenadante en un tubo

Eppendorf® estéril y se trató con 8µL de RNAasa (PROMEGA, Estados Unidos) se incubó

por 30 minutos a 37 °C en un block caliente. Posteriormente se le adicionaron 500 mL de

isopropanol frío (-20 ºC). Para ayudar a la precipitación de los ácidos nucleicos la muestra se

colocó a -20 ºC durante 1 h. Los ácidos nucleicos se recuperaron centrifugando a 10,000 rpm

durante 10 min y se colocaron en un tubo Eppendorf®, realizando un lavados con etanol 70

%. La pastilla se suspendió en 50 μL de agua mili-Q estéril. El DNA obtenido se visualizó en

un gel de agarosa al 1.0 %, teñido con SyberGold™ 10 X (Figura 9). Este se conservó a -20

°C, para su uso en las amplificaciones de PCR.

51

Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold™

10 X. ADN de aislados de mostos de mezcal; en la tabla

IV se especifica la identificación de las muestras. 18

ADN de cepa control FECHA (Fermichamp®).

La cantidad de ADN obtenida se determinó por su absorbancia a 260 nm en un espectrómetro

GBC (Cintra 10e.), y aplicando la fórmula siguiente:

[ADN] = 50 * A260nm * FD [μg/ml]

Donde el factor de dilución se calculó como:

FD = (Vol. Agua miliQ) + (Vol.de la muestra) / Vol. de la muestra

La calidad del ADN se cuantificó mediante el valor de la relación de absorbancia a 260 y

280 nm de acuerdo a la siguiente fórmula:

Calidad de ADN= A260 / A280

Donde un valor entre 1.8 y 2 indica que la solución está libre de proteína, por lo que se

tiene una buena calidad de ADN. El ADN se visualizó en un gel de agarosa por 1 h. El ADN

obtenido fue suspendido en 100 μl de TE 1X. y fue conservado a 4 °C, para su empleo en las

amplificaciones por PCR.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

52

6.2.2. Amplificación de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR

En la reacción de PCR para la amplificación de los segmentos ITS’s se utilizaron los

oligonucleótidos reportados por White et al. (1990), ITS1 (5´

TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (5´ TCCTCCGCTTATTGATATGC); esta se realizó

en un volumen final de 25 µL, utilizándose 1µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de Buffer (10 X),

1.5 µL de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los oligonucleótidos (10 µM),

0.5 μL de dNTPs (10 mM), 0.5 μL de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/μL) y

completando el volumen a 25 μL con agua MiliQ estéril. El programa en el termociclador

incluyó un ciclo inicial de 5 min a 94 ºC y 35 ciclos con temperaturas de desnaturalización

(94 ºC/ 30 seg), alineación (59 ºC / 30 seg) y alargamiento (72 ºC/ 30 seg). Finalmente se dio

un paso de extensión final de 7 min a 72 ºC. El producto amplificado fue procesado mediante

electroforesis en gel. El segmento ribosomal 26S se amplificó con los oligonucleótidos NL1-

(5´ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) y NL4 (5´ GGTCCGTGTTTCAAGACGG);

esta se realizó en un volumen final de 25 µL, utilizándose 1 µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de

Buffer (10 X), 1.5 µL de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los

oligonucleótidos (10 µM), 0.5 μl de dNTPs (10 mM), 0.5 µL de la enzima Taq DNA

polimerasa (5 U/µL) y completando el volumen a 25 µL con agua MiliQ estéril. El programa

en el termociclador incluyó un ciclo inicial de 5 min a 94 ºC y 35 ciclos con temperaturas de

desnaturalización (94 ºC/ 30 seg), alineación (63 ºC/ 30 seg) y alargamient0 (72 ºC/ 30 seg).

Finalmente se dio un paso de extensión final a 7 min a 72 ºC. El producto amplificado fue

procesado mediante electroforesis en gel.

6.2.3. Digestión enzimática del segmento ribosomal ITS’s

Los segmentos ITS’s amplificados fueron sometidos a un proceso de restricción con las

enzimas EcoRI (Promega). A 10 μL de la reacción de PCR le agregó 12 u de enzima, a lo cual

se le adicionó el buffer 10 x correspondiente a la enzima en una concentración final de 1 x; la

mezcla de reacción fue ajustada a 20 µL con agua MiliQ estéril. Se centrifugó 15 segundos y

se mezcló suavemente. Finalmente se incubó por 6 horas a 37 ºC. El producto de la digestión

se visualizó en un gel de agarosa al 2.5 %. El gel fue fotografiado y los patrones de restricción

comparados entre si. Los productos amplificados fueron procesados mediante una

electroforesis en gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 1 X, en regulador Tris-

borato-EDTA 1% (para un litro, 108 g trizma-base, 55 g ácido bórico, 40 mL EDTA 0.5 M

53

pH 8) a 100 V por 45 min. Los geles se documentaron en fotografías bajo luz UV a 320 nm

con un digitalizador de imágenes Gel Doc (Kodak, Estados Unidos).

6.2.4. Amplificación de los genes HXT1 y HXT3

En la amplificación del gen HXT1 (Figura 10) se usaron oligonucleótidos reportados por

Ramakrishnan et al. (2006), HXT1F (5´ GTGAAAGTCAAGTGCAACCC) y HXT1R (5´

CGGTCAACGGTGTACGAG) además los oligonucleótidos diseñados en nuestro laboratorio

JAHXT1F (5´ ATGAGAGCCGCTGGTACTGCATCT) y JAHXT1R (5´

CTATTTCCTGCTAAACAAACTCTTG).

Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teñido con

SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados

Unidos). Amplificación del gen HXT1 de aislados de

mostos de mezcal.

Para la obtención del gen HXT3 (Figura 11) se utilizaron los oligonucleótidos HXT3F (5´

GATTTCCAAGCTGAGGCCG) y HXT3R (5´ ACATGGCCGGCTTACCAGTG)

(Ramakrishnan et al., 2006); además de un par de oligonucleótidos diseñados en este trabajo,

FHXT3J (5´-ATTTCTGAAGTCGCTCCTAAGG) y RHXT3J (5´ -

ACATAACAGCAGACCATACC).

54

Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teñido con

SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados

Unidos). Amplificación del gen HXT3 de aislados de

mostos de mezcal. 1=Oligonucleótidos diseñados por.

2=Oligonucleótidos diseñados por el Laboratorio de

Biotecnología Industrial.

La reacción de amplificación para los cuatro pares de oligonucleótidos se realizó en un

volumen final de 25 µL, utilizándose 1µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de Buffer (10 X), 1.5 µL

de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los oligonucleótidos (10 µM), 0.5 μl

de dNTPs (10 mM), 0.5 μL de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/μL) y completando el

volumen a 25 μL con agua MiliQ estéril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de 5

min a 94 ºC y 35 ciclos de 30 seg a 94 ºC, 30 seg a 63 ºC y 30 seg a 72 ºC. Finalmente se dio

un paso de extensión final a 7 min a 72 ºC. Los productos de la amplificación fueron

visualizados en gel de agarosa al 1 %.

La reacción de PCR obtenida fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and

PCR for Clean-up System (PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del

fabricante. La secuenciación se realizo con el kit Sequence BigDye® Terminator v3.1 Cycle

Sequencing (Applied Biosystems, Estados Unidos). La reacción de PCR de secuenciación fue

purificada con el kit Big Dye® XTerminatorTM Purification (Applied Biosystems, Estados

Unidos).

6.2.5. Identificación molecular por secuenciación

La reacción de PCR obtenida en la amplificación de los genes ITS’s, 26S, HXT1 y HXT3

fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and PCR for Clean-up System

(PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación se

55

realizó con el kit Sequence BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied

Biosystems, Estados Unidos). La reacción de PCR de secuenciación fue purificada con el kit

Big Dye® XTerminatorTM Purification (Applied Biosystems, Estados Unidos). Se utilizo el

equipo secuenciador ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Estados Unidos). Las

secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa BioEdit Sequence Aligment Editor

(Hall, 1999) y comparadas en la base de datos depositadas en el NCBI usando el BLAST

(Basic local alignment search tool).

6.2.6. Construcción de dendogramas

En el análisis filogenético de las secuencias 26S e ITS’s obtenidas se utilizó el método de

agrupamiento promedio de “Neighbor-Joining” con un “Bootstrap” de 1000 repeticiones y

para las distancias de evolución se utilizó el modelo “Nucleotide Maximum Composite

Likelihood” máxima similitud, con el objeto de ver las relaciones entre aislamientos.

6.3. Fermentaciones

6.3.1. Medios de cultivo

Con el fin de disminuir la fase de adaptación del microorganismo al medio en el inicio de

la fermentación, las levaduras se activaron en un pre-cultivo (Taillander et al., 2006). Esta

etapa se realizó en matraz erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 100 mL de medio (Tabla II), el

pH se ajustó a 5 con una solución de ácido ortofosfórico el medio fue esterilizado en

autoclave a 120 °C durante 20 minutos. El microorganismo se incubó a 250 rpm a 30 °C por

12 horas. Se cuantificó el número de células con el fin de determinar el volumen necesario

para iniciar la cinética a 3x106 células por mililitro.

56

Tabla II.

Composición de medios de cultivo

Reactivo Precultivo Medio 1 Medio 2 Medio 3

(g/L)

Extracto de levadura 1.0 1.0 1.0 1.0

KH2PO4 5.0 5.0 5.0 5.0

MgSO4(H2O)7 0.4 0.4 0.4 0.4

(NH4)2S04 2.0 2.0 2.0 2.0

Glucosa 20.0 90.0 10.0 100.0

Fructosa 0.0 10.0 90.0 100.0

Los aislados fueron evaluadas en los medios uno y dos con la composición indicada en las

Tabla II (Taillander et al 2006). Los aislados con mejores características en consumo de

azúcar y producción de etanol fueron evaluados en el medio 3 (Tabla II). En todos los casos

ajustando el pH a 5.

Las condiciones de la cinética de crecimiento se llevo a cabo en matraz Erlenmeyer® de

500mL conteniendo 300 mL de medio a 30 °C y 125 rpm. La cinética de fermentación se

realizó en matraces de 1 L con 500 mL de medio de cultivo y un inóculo inicial de 3 X106

células /mL, a una temperatura de 30°C.

6.3.2. Cuantificación de la biomasa.

6.3.2.1. Espectrometría

La densidad óptica (DO) fue evaluada a 600 nm en un espectrofotómetro modelo Hitachi*

U-2000TM equipo monocromático Seya-Namioka®. Las medidas se realizaron en cubetas de

2 mm de trayecto óptico; se efectuaran diluciones a partir de DO> 0.8 con el fin de mantener

la tendencia lineal.

57

6.3.2.2. Peso seco

La concentración celular en g/L fue determinada por el método de peso seco, esta técnica

permite la estimación de la biomasa total. Consistió en tomar un volumen conocido de la

muestra para centrifugarlo a 13000 rpm, por 10 minutos a 10 °C. El paquete celular fue

lavado dos veces con agua desionizada para eliminar restos del medio de cultivo,

posteriormente se llevó peso constante utilizando un analizador de humedad (modelo HA60;

Precisa, Zurich, Suiza). Este método se llevó en paralelo con el de espectrometría, con el fin

de obtener la correlación entre DO600nm y concentración en biomasa (peso seco).

6.3.2.3. Cuenta celular

Este método consiste en la determinación de la concentración celular utilizando un

hematocímetro (cámara de Neubauer o d Thoma) visualizando en el objetivo 40X de un

microscópico (BH-2 Olympus, Japón).

6.3.3. Análisis de azúcares

6.3.3.1. Determinación de glucosa por un método enzimático

El método utilizado por el instrumento YSI (YSI Life sciences, Estados Unidos) consiste

en la determinación de glucosa por medio de la enzima glucosa-oxidasa inmovilizada entre

dos membranas, una de policarbonato y otra de celulosa acetato. El sustrato es oxidado al

entrar en contacto con la enzima produciendo peróxido de hidrógeno, el cual pasa a través de

la membrana de celulosa acetato hacia el electrodo de platino. El resultado es la cuantificación

de la concentración en el sustrato de acuerdo a la siguiente reacción:

D-glucosa+O2 glucosa oxidasa D-glucono-δ-lactona+H2O2.

58

6.3.3.2. Determinación de azucares totales por el método DNS

El método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) se realizó comparando los resultados con una

curva patrón de glucosa, con el objeto de obtener la curva correspondiente para determinar los

equivalentes de azucares reductores. La solución DNS fue compuesta por 8 g de sodio; 5 g de

ácido dinitrosalicílico; 150 g de tartrato de sodio y potasio; completando a 500 mL de agua y

evitando su exposición a la luz; el reactivo puede ser utilizado después de 15 horas de su

preparación. El análisis se efectuó en un tubo de ensayo conteniendo 1 mL de reactivo DNS y

1 mL de la muestra a analizar, previamente diluida a la concentración de la gama patrón (A

partir de una gama de soluciones patrón de glucosa y fructosa equivalente a 0-2 g/L), fue

incubada a 100 °C durante 10 minutos; enfriada por 10 minutos en hielo y determinó DO570nm,

se diluyó convenientemente con agua destilada, mientras que si fue demasiado pequeña, se

repitió el ensayo pero con una mayor cantidad de solución de glucosa (por ejemplo 0.2 a 0.3

mL). El método ácido 3,5-dinitrosalicílico se basa en la reducción del DNS (de color

amarillo) por el azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo), cuya

presencia puede detectarse por lectura de absorbancia en la zona de 540-570 nm (Montreuil et

al., 1986).

6.3.3.3. Cromatografía liquida de alta presión (HPLC)

La cromatografía liquida de alta presión es una técnica analítica, utilizada para separar e

identificar compuestos mediante intercambio iónico, basada en la atracción electrostática

entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. El equipo utiliza

una columna de intercambio iónico Aminex HPX-87 C de 30 cm de longitud precedida de una

precolumna con un gradiente de interacción GC 801. Las sustancias resultantes del

metabolismo de la levadura en el proceso de fermentación en glucosa y fructosa, como

glicerol, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico y etanol fueron evaluadas por HPLC.

Para llevar a cabo el análisis por HPLC se utilizó una fase móvil preparada con agua miliQ y

acido sulfúrico (H2SO4 0.005 M). Las muestras a analizar se centrifugaron a 13000 rpm a

10°C y fueron filtradas. La curva de calibración para los análisis fue obtenida utilizando la

ecuación lineal de la recta obtenida con el área contra la concentración del compuesto a

analizar, y para todos ellos el cuadrado de coeficiente de correlación de Person (r2) no fue ser

mayor a 0.98.

59

6.4. Cuantificación del estrés por etanol

Se inocularon 50 mL de medio rico en fructosa (Medio 2) con células precultivadas con a

una DO660nm=1 (aproximadamente a las 12 horas), se incubaron por 24 horas a 125 rpm y 30

°C. De las células cultivadas bajo estas condiciones, 25 mL fueron centrifugados a 3000 rpm

(Allegra 6G Centrifugue Beckman Coulter, Japón) por 10 min., se recolectaron y

suspendieron en 25 mL del medio líquido YM (25% Etanol v/v; y en g/L: extracto de malta 3;

extracto de levadura 3; peptona 5; glucosa 10 y agar 20). Se tomó 1 mL de muestra a los 0.5,

1.5, 3 y 5 min, cada mililitro se diluyo en 9 mL de solución Ringer (cada 100 mL contiene

NaCl 0.85g, KCl2 0.04g, CaCl2 2H2O 0.034 g) las diluciones seriadas de cada muestra se

sembraron por duplicado en YM agar e incubaron por 72 horas a 28 °C. (Pina et al., 2003).

Para el control se tomaron 25 mL de células, estas fueron centrifugadas, recolectadas y

suspendidas en 25 mL del medio líquido YM sin etanol, 1 mL de muestra se diluyo en 9 mL

de solución Ringer, se hicieron diluciones seriadas y se sembraron por duplicado en YM agar

e incubaron por 72 horas a 28 °C. Se usó el conteo de UFC (Unidades Formadoras de

Colonias) como índice de viabilidad.

6.4.1. Parámetros cinéticos

Los valores experimentales obtenidos fueron evaluados en general para cada tratamiento

analizándose los parámetros indicados en la tabla III.

Tabla III.

Parámetros cinéticos

Parámetro Unidades

Velocidades

Velocidades de producción de biomasa (g/L/h): rx dX/dt

Velocidades de consumo de substrato (g/L/h): rs dS/dt

Rendimientos

Rendimientos de producción de biomasa por sustrato consumido Yx/s (g/g)

Rendimiento de sustrato Yp/s (g/g)

60

6.5. Análisis estadístico

Los datos cinéticos obtenidos de los tratamientos fueron evaluados estadísticamente por

ANOVA.

61

7 RESULTADOS

De 103 aislamientos iniciales, y basado en su imagen microscópica y macroscópica se

seleccionaron 17 cepas (Tabla IV) con morfología celular presuntiva de S. cerevisiae.

Tabla IV.

Aislados de levaduras con morfología redonda

Aislado Observaciones

AN2, 1Y1, 1Y9, AN1, 1Y14,

AN5

Aislamiento realizado a los dos días de inicio

de la fermentación. Los mostos presentaron

una concentración de 13.2° Brix.

3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6,

3Y1, 3Y2, 3Y3, 3Y4,3Y5,

3Y8

El aislamiento se realizó al sexto día de

inicio de la fermentación. Los mostos

presentaron una concentración de 10° Brix.

7.1. Identificación molecular de las levaduras

Los aislados se concentraron en cuatro grupos diferentes de acuerdo al patrón de

amplificación de los segmentos ITS’s, A) integrado por 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3,

3Y4, 3Y5, 3Y8 y 1AN5 con 750 pares de bases (pb) aproximadamente; B) grupo compuesto

por 3Y1, 1AN2, y 1AN1 con 700 pb aproximadamente; el C) formado por 1Y1, 1Y9 con 650

pb y D) constituido por 1Y14 con cerca de 600 pb (Fig. 12).

62

Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con

SyberGold™ 10 X. Amplificación de los segmentos

ITS’s aislados con morfología celular redonda. Agua (C-

) control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega,

Estados Unidos).

7.1.1. Análisis de restricción del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA)

Los productos de amplificación ITS’s de todos los aislados fueron sometidos a un proceso

de restricción con la enzima EcoRI; se encontró que los aislados se agruparon en cinco

ARDRA’s diferentes (Fig. 13), constituidos por I) 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4,

3Y5, 3Y8 y FECHA; perfil II) 3Y1; el III) 1AN2, 1AN1, 1AN5; el IV) 1Y1 Y 1Y9; el V)

1Y14.

Figura 13. ARDRA’s de aislados de mostos de mezcal.

Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10X,

marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos).

63

7.1.2. Amplificación del segmento ribosomal 26S

La amplificación del segmento 26S (Figura 14) fue para todos de 750 pb

aproximadamente.

Figura 14. Amplificación de genes ribosomales 26S.

Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10 X,

marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos) de las

levaduras de morfología redonda aisladas de mostos de

mezcal.

7.1.3. Identificación molecular por los segmentos ribosomales ITS’s y 26S

En el análisis de la secuencia se identificaron cinco grupos de microorganismos, 10

aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces bailii, tres de Torulaspora

delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia mexicana (Tabla V); de los

aislados 3D6 y AN1 solo se obtuvo la secuencia del segmento 26S.

64

Tabla V.

Clasificación e identificación molecular de las levaduras aisladas de mostos de mezcal

Aislado Especie Accesión*1 Identidad

(%) Accesión *2

Identidad

(%)

3D2 Saccharomyces cerevisiae JQ824871 100 EF457564.1 99

3D3 Saccharomyces cerevisiae JQ824873 100 AB212257.1 89

3D4 Saccharomyces cerevisiae AB279746 100 AB279746.1 96

3D5 Saccharomyces cerevisiae AF321540 100 AF321540.1 87

3D6 Saccharomyces cerevisiae JQ824876 100 ----------------

3Y2 Saccharomyces cerevisiae JQ824877 100 EF151450.1 98

3Y3 Saccharomyces cerevisiae JQ824872 100 EF457565.1 98

3Y4 Saccharomyces cerevisiae JQ824875 100 AM900396.1 98

3Y5 Saccharomyces cerevisiae JQ824869 100 EU145764.1 97

3Y8 Saccharomyces cerevisiae JQ824874 100 FJ231432.1 99

3Y1 Zygosaccharomyces bailii FM201320.1 99 X84640.1 93

1AN1 Torulaspora delbrueckii FJ468458.1 97 ----------------

1AN5 Torulaspora delbrueckii GQ179981.1 99 FN401197.1 100

1AN2 Torulaspora delbrueckii GQ179981.1 98 AB469378.1 99

1Y1 Kluyveromyces marxianus FJ896140.1 99 FN401197.1 99

1Y9 *3,1Torulaspora delbrueckii

*3,2Kluyveromyces marxianus GQ121696.1 97 AY046214.1 98

1Y14 Pichia mexicana EF042032.1 99 EM199966.1 98

*1. 26S. *2. ITS1-5.8S-ITS2. *3.1 por 26S y *3.2 por ITS1-5.8S-ITS2.

65

Al realizar la comparación por secuencia en el gen 26S el dendrograma (Fig. 15) agrupó

genotipos iguales, es decir organismos del mismo género y especie destacando la similitud

alcanzada para la unión de 99% para los cinco grupos formados, A) S. cerevisiae, B) T.

delbrueckii, C) Z. bailii, D) K. marxianus, F) y G) P. mexicana.

El análisis de comparación por secuencia del segmento ITS1-5-8S-ITS2 (Fig. 16) el

dendrograma agrupó A) con una similitud de unión de 81% a los aislados identificados como S.

cerevisiae; B) con 84% de similitud a los aislados identificados como Z. bailii; C) con un 88%

unió a 1AN2 con T. delbrueckii; D) en un clado separó al aislado 1Y9 y lo colocó en medio de

los grupos “C y E”; E) 91% de similitud agrupó a los aislados identificados como T. delbrueckii

(AN5) y K. marxianus (1Y1); y F) con 97% de similitud a P. mexicana (1Y14).

Cabe mencionar que en el dendrograma se expresan las diferencias entre clases o grupos con

un intervalo de cero a uno, por lo que para la interpretación de los resultados se calculó el

complemento (la similitud) y se expresó en porcentaje, es decir, se analizó la homología

molecular detectada entre y dentro de genotipos.

66

Figura 15. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica

de la región ribosomal 26S. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”, un

bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite

Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los clados. El

grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4.

3D2

3Y4

3Y8

3Y3

3D5

3D4

3D3

3D6

3Y5

3Y2

S. cerevisiae (GU080049)

S. cerevisiae (FJ972215)

S. cerevisiae EF192587)

S. cerevisiae (HM191656)

S. cerevisiae (HM191650)

S. cerevisiae (FN393977)

1AN2

1AN1

1AN5

T. delbrueckii (FN393992)

T. delbrueckii (GU373796)

T. delbrueckii (FR691642)

T. delbrueckii (GQ121628)

3Y1

Z. bailii (GU080052)

Z. bailii (AJ966343)

Z. bailii (FM201320)

Z. bailii (AJ966522)

1Y1

1Y9

K. marxianus (GU565207)

K. marxianus (FJ896140)

K. marxianus (EU439450)


P. mexicana (EF042031)

1Y14

P. mexicana (DQ409143)

P. mexicana (FM180550)

Pichia sp (AM911003)

66

74

99

99

99

93

50

9972

92

99

67

Figura 16. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica

de la región ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”,

un bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum

Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los

clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4.

3D3

S. cerevisiae (FN393995)

S. cerevisiae (GQ376091)

S. cerevisiae (AB279744)

S. cerevisiae (FM199962)

S. cerevisiae (EU145764)

3D5

3D4

3Y2

3Y3

3D2

3Y4

3Y5

3Y8

Z. baili (X84732)

Z. bailii (FJ914883)

Z. bailii (AY796194)

3Y1

Z. bailii (DQ872858)

Z. bailii (X84640.1)

Z. bailii (AY046191)

T. delbrueckii (AB469378)

1AN2

1Y9

T. delbrueckii (DQ249191)

1AN5


1Y1

T. delbrueckii (FM173070)

K. marxianus (AB480229)

K. marxianus (EF568057)

T. delbrueckii (AY939806)

T. delbrueckii (AB480229)


P. mexicana (EF568069)


P. mexicana (AB054110)

1Y14

54

77

97

88

91

74

96

55

69

84

54

81

51

68

7.2. Caracterización de la productividad de las levaduras

En la primera evaluación se seleccionaron y caracterizaron 11 microorganismos de acuerdo a

la imagen micro, macroscópica y perfiles de ARDRA, este análisis se dividió en dos grupos, 1)

aislados no Saccharomyces y 2) aislados Saccharomyces cerevisiae. Se evaluaron los aislados

identificados como S. cerevisiae cinéticamente evaluando crecimiento y consumo de azucares

reductores en dos medios sintéticos, uno rico en glucosa M1 (glucosa:fructosa 9:1) y el otro rico

en fructosa M2 (glucosa:fructosa 1:9). Posteriormente se evaluaron solo al inicio y al final de la

fermentación las características productivas de todos los aislados identificados como S. cerevisiae

con el fin de seleccionar los microorganismos S. cerevisiae con una alta actividad fructofílica.

7.2.1. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa (M1)

Los microorganismos identificados como S. cerevisiae (Fig. 17) fueron caracterizados en el

medio M1 (fructosa:glucosa 1:9), se encontró que los aislamientos 3Y2, 3Y4 y 3Y8 presentaron

mayor crecimiento a las 72 horas, 3D6 y 3D3 fueron las que menor crecimiento tuvieron.

En el consumo de azúcares reductores (Fig. 18) se observaron tres patrones de

comportamiento, los aislamientos 3Y4 y 3Y8 a las 72 horas fueron los que menos azúcar residual

dejaron (5 g/L de azúcar residual en el medio aproximadamente), seguidos por FECHA, 3Y2 y

3Y6 (23 -29 g/L de azúcar residual aproximadamente) y 3Y5, 3D4 y 3D2 (58-059 g/L

aproximadamente). Al final de la fermentación (120 horas) en M1 (Tabla VI), los que mayor

rendimiento presentaron en cuanto a consumo de sustrato fueron Fermichamp®, 3Y2, 3Y8 y

3Y4; las cepas que terminaron la fermentación 3Y8, 3Y4 y Fermichamp® ya que dejaron una

concentración menor a 2 g/L de azúcar residual, el resto de las cepas si fermentaron la glucosa

pero dejaron una alta residualidad (menor del 50%) en el medio.

En cuanto a los parámetros cinéticos (Tabla VI), 3Y4, 3Y8 y FECHA tuvieron la mayor

velocidad de consumo de sustrato en M1; los que mayor velocidad en la producción de biomasa

fueron 3Y4 y 3D2, pero 3D3, 3D6 y 3D5 fueron las que más biomasa produjeron al final de la

fermentación (2.9 a 3.71 g/L). En cuanto a etanol 3D4, 3Y3 y 3Y5 presentaron mayor

69

rendimiento pero 3Y3, 3Y4 y Fermichamp® fueron las que más g/L produjeron. La mayor

producción de acido acético la tuvieron 3Y8 y 3D2; 3D4 y 3D6 mayor concentración de glicerol;

3D4 y Fermichamp® mayor concentración de acido láctico.

Figura 17. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae aisladas de

mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9).

0

2

4

6

0 24 48 72

DO

600 n

m

Tiempo (h)

3D2 3D3 3D6 3Y2 3Y4 3Y8 FCHA

70

Figura 18. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por levaduras S. cerevisiae

aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9).

0

20

40

60

80

100

0 12 24 36 48 60 72

Porc

enta

je (

%)

de

azú

car

resi

du

al

Tiempo (h)

3D2 3D4 3D6 3Y2 3Y3 3Y4 3Y5 3Y8 FCHA

71

Tabla VI.

Parámetros cinéticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en glucosa (M1) a las 120 horas

Aislado

Velocidad de

consumo de

azúcares

Velocidad de

producción de

biomasa

YEtanol/azúcar Biomasa Azúcar residual

Etanol Acido acético Glicerol Acido

láctico

g/L*h g/L*h g/g g/L

3D2 0.67+0.00 0.09+0.00 0.40+0.00 2.78+0.45 19.70+1.60 31.72+0.10 0.83+0.00 5.34+0.24 0.75+0.10

3D3 0.76+0.00 0.01+0.00 0.40+0.00 3.71+0.09 9.10+1.40 36.42+0.90 0.47+0.03 4.86+0.25 0.59+0.01

3D4 0.57+0.00 0.03+0.00 0.48+0.00 2.88+0.29 31.36+1.40 36.89+2.20 0.73+0.15 7.61+2.08 1.39+0.36

3D5 0.64+0.00 0.00+0.00 0.42+0.00 3.30+0.00 22.91+1.20 32.20+1.60 0.46+0.01 4.27+1.22 0.57+0.01

3D6 0.75+0.00 0.02+0.00 0.40+0.00 3.34+0.01 10.00+1.60 35.56+1.30 0.62+0.02 5.82+0.40 0.47+0.06

3Y2 0.70+0.00 0.01+0.00 0.36+0.00 2.89+0.16 15.83+1.20 35.38+0.00 0.70+0.32 4.07+0.48 0.67+0.52

3Y3 0.57+0.01 0.03+0.01 0.46+0.01 2.63+0.03 31.36+3.10 39.86+0.20 0.82+0.01 4.03+1010 0.79+0.18

3Y4 0.82+0.00 0.04+0.00 0.44+0.00 2.80+0.00 1.52+1.40 43.90+5.20 0.74+0.03 3.59+0.32 0.00+0.00

3Y5 0.43+0.01 0.03+0.01 0.45+0.01 2.90+0.03 45.95+1.90 34.64+3.20 0.47+0.00 1.70+0.53 0.76+0.00

3Y8 0.82+0.00 0.03+0.00 0.32+0.00 2.10+0.10 1.41+1.20 31.83+1.90 1.26+0.64 3.50+0.12 0.52+0.06

FECHA 0.81+0.00 0.01+0.00 0.42+0.00 2.89+0.04 1.68+1.20 42.31+0.00 0.46+0.00 3.85+0.00 1.33+0.09

FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®

72

7.2.2. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa (M2)

Los microorganismos identificados como S. cerevisiae fueron caracterizados en el medio M2

(fructosa:glucosa 9:1) De los aislados evaluados los que tuvieron mayor crecimiento fueron 3Y2,

3Y4 y 3Y8 (Fig. 19) y los que tuvieron menor crecimiento en este medio fueron 3D2 y Fecha.

En el consumo del sustrato a las 72 horas (Fig. 20) se observaron tres tipos de

comportamiento, los aislamientos 3Y8, 3Y4 a las 72 horas fueron los que menos azúcar residual

dejaron (5g/L aproximadamente), seguidas por FECHA, 3D6 y 3Y2 (50 g/L aproximadamente)

y las que mayor residualidad dejaron fueron 3Y5, 3D4 y 3D2 (más de 60 g/L).

En M2 (Tabla VII) los aislados con mayor velocidad de consumo de sustrato 3Y8, 3D5 y

3D3; pero las que dejaron menor concentración de azúcar fueron 3D3, 3Y4 y 3Y8 (menos de 2

g/L aproximadamente). El aislado que mayor velocidad en la producción de biomasa tuvo fue

3Y5 y las que más biomasa produjeron al final de la fermentación fueron 3D3, 3D5 y 3Y4 (3.06

a 3.78 g/L). Los aislados que rendimiento en producción de etanol fueron 3Y3, 3Y5 y FECHA y

además fueron los que produjeron la mayor concentración (38.72 a 42.84 g/L). La mayor

producción de acido acético la tuvieron 3D3; 3D5 y 3D6 (5.66 a6.50 g/L); mayor concentración

de glicerol; 3Y5 y 3Y8 (4.21- 4.37g/L) la mayor concentración de acido láctico.3Y5 y FECHA

(1.02-1.32 g/L).

73

Figura 19. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae en el medio

M2 (fructosa:glucosa 9:1).

Figura 20. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por S. cerevisiae en el medio M2

(fructosa:glucosa 9:1).

0

2

4

6

0 24 48 72

DO

600 n

m

Tiempo (h)

3D2 3D3 3D6 3Y2 3Y4 3Y8 FCHA

0

20

40

60

80

100

0 12 24 36 48 60 72

Porc

enta

je (

%)

de

azú

car

resi

du

al

Tiempo (h)

3D2 3D4 3D6 3Y2 3Y3 3Y4 3Y5 3Y8 FCHA

74

Tabla VII.

Parámetros cinéticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en fructosa (M2) a las 120 h

Aislado

Velocidad de

consumo de

azúcares

Velocidad de

producción de

biomasa

YEtanol/azúcar Biomasa Azúcar residual

Etanol Acido acético Glicerol Acido

láctico

g/L*h g/L*h g/g g/L

3D2 0.80+0.01 0.02+0.01 0.2+0.01 2.94+0.14 5.05+2.80 22.47+0.10 3.74+0.01 0.75+0.27 0.75+0.27

3D3 0.82+0.03 0.02+0.00 0.34+0.02 3.78+0.05 1.17+1.80 33.80+0.10 6.14+0.80 0.58+0.08 0.57+0.07

3D4 0.56+0.06 0.01+0.01 0.33+0.02 2.68+0.02 32.01+1.70 31.74+1.30 3.69+0.00 0.98+0.00 0.98+0.00

3D5 0.83+0.00 0.01+0.00 0.34+0.01 3.06+0.31 52.17+1.50 33.38+1.40 5.66+1.05 0.52+0.06 0.52+0.06

3D6 0.74+0.01 0.02+0.00 0.38+0.01 3.34+0.19 11.05+1.50 33.60+0.40 6.50+0.91 0.73+0.11 0.73+0.11

3Y2 0.68+0.03 0.03+0.00 0.29+0.00 2.66+0.19 18.26+1.20 28.58+5.20 0.64+0.03 3.13+0.38 0.00+0.00

3Y3 0.57+0.00 0.03+0.00 0.41+0.01 2.68+0.02 32.01+1.40 39.28+0.10 0.58+0.44 2.96+0.55 0.00+0.00

3Y4 0.82+0.00 0.03+0.00 0.34+0.00 3.30+0.10 1.71+2.10 32.71+0.90 0.70+0.01 3.38+0.06 0.38+0.01

3Y5 0.44+0.04 0.04+0.00 0.49+0.02 2.73+0.03 36.43+1.70 33.65+0.50 1.00+0.02 4.37+0.03 1.02+0.16

3Y8 0.83+0.00 0.01+0.00 0.39+0.15 2.25+0.15 1.00+0.81 38.72+4.41 0.77+0.03 4.21+0.12 0.77+0.00

FECHA 0.68+0.02 0.01+0.00 0.43+0.00 2.35+0.13 18.92+1.30 42.87+4.30 0.54+0.01 3.31+0.12 1.32+0.06

FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®

75

7.3. Caracterización cinética de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad

fructofílica

Fueron evaluadas las características cinéticas de producción de etanol, glicerol biomasa y

consumo de azucares residuales de 3D4, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5 y 3Y8 identificados

molecularmente como S. cerevisiae usando como control la cepa Fermichamp®.

La levadura 3D4 (Figura 21 A y B) tuvo crecimiento similar en M1 y M2 (2.26-2.88 g/L) al

final de la fermentación. En cuanto al comportamiento en la cinética de fermentación se observó

tanto en M1 como en M2 de las 72 a las 100 horas una fase estacionario en el consumo del azúcar

de mayor concentración, al igual se observa como la producción de etanol se encuentra en fase

log hasta las 72 horas en ambos medios. Al final de la fermentación en ambos medios tuvieron un

producción similar de glicerol (2.30 g/L aproximadamente)

La levadura 3Y2 (Fig. 22 A y B) se observo tanto en M1 como en M2 una fase de

crecimiento hasta las 48 horas, la levadura tuvo poca diferencia en la producción de biomasa al

final de la fermentación en ambos medios (2.14- 2.70 g/L). En relación a la producción de

etanol, glicerol y consumo de azucares reductores tanto en glucosa como en fructosa

aproximadamente a 36 horas inicia la etapa estacionaria. En M1 tanto el etanol como el glicerol

tienen una fase log de producción hasta las 36 horas aproximadamente; en M2 el etanol sigue

produciéndose hasta el final de la fermentación, la producción máxima de glicerol se da hacia las

60 horas.

76

Figura 21. Cinética de fermentación a 30°C de 3D4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 9:1). Medio

B) M2 (fructosa:glucosa 1:9).

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l, P

eso

sec

o

(g//

L)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

A

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l , P

eso s

eco (

g//

L)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

B

FRUCTOSA GLUCOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO

77

Figura 22. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y2 Cinética. A) Medio M1 (fructosa:glucosa

1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l, P

eso s

eco

(g//

L)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

A

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

, P

eso s

eco

(g//

L)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

B

FRUCTOSA GLUCOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO

78

La cepa 3Y3 presento un patrón de crecimiento similar en los dos medios (Fig. 23 A y B), la

etapa estacionaria inició aproximadamente a las 32 horas exhibiendo en esta etapa el crecimiento

máximo para la cepa en los dos medios, al final de la fermentación en ambos medios esta cepa

tuvo una producción final de biomasa de 2.44 g/L aproximadamente; en la cinética de

fermentación la cepa dejo una alta concentración del azúcar con mayor concentración, en M1

(glucosa) y M2 (fructosa) al final de la fermentación (mayor a 48g/L aproximadamente), en

cuanto el azúcar de menor concentración en M1 (fructosa) a las 72 h fue totalmente consumida y

en M2 (glucosa) hasta las 120 h fue consumida en su totalidad; 3Y3 tuvo una producción similar

en M1 y M2 (2.5 g/L aproximadamente); en cuanto a la producción de etanol, produjo una

concentración mayor en M1 (40 g/L aproximadamente) que en M2 (28 g/L aproximadamente)

El crecimiento en M1 de 3Y4 (Fig. 24 A y B) la fase estacionaria apareció a las 48 horas,

después de este periodo, aproximadamente a las 72 horas, se observo una nueva fase log de

crecimiento, esto se ve reflejado en el comportamiento del microorganismo (Figura 24 A y B) ya

que en la cinética de fermentación a las 48 horas consumió la mayor parte, de igual forma se

observa que después de las 72 horas se presenta una nueva fase de producción de etanol. En M2

se observa marcadamente una etapa diauxica en el crecimiento del microorganismo hacia las 48

horas, la cual coincide con las últimas etapas de fermentación del sustrato predominante del

sustrato (Figura 24 C) y el cambio a la fermentación del sustrato presente en menor cantidad; en

cuanto a la producción de etanol se observa una producción exponencial de este hasta las 36

horas, observándose que se reactiva la producción después de las 60 horas,

79

Figura 23. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y3. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B)

Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

no

l, G

lice

rol,

Pes

o s

eco

(g

//L

)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

A

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l ,

Pes

o s

eco

(g

//L

)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

B

GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL GLICEROL PESO SECO

80



0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Pes

o s

eco (g

//L

)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

A

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Pes

o s

eco (g

//L

)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

B

GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL PESO SECO

81

En M1 la cepa 3Y5 presentó crecimiento (Figura 25 A) y consumo de azúcar exponencial,

hasta las 36 horas (Figura 25 B) este microorganismo tuvo un paro en la fermentación a las 72

horas y dejo una alta residualidad del azúcar en el medio, la máxima producción de etanol se dio

hacia las 96 horas. En M2 (Figura 25 D) a las 24 horas se observo un punto diauxico, aquí se

observo el máximo crecimiento del microorganismos y un paro en la fermentación del azúcar; en

cuanto a la producción de etanol a las 72 horas se observo una nueva etapa de producción.

Para el aislamiento 3Y8 (Fig. 26A) tanto en M1 como en M2 el microorganismo presentó un

crecimiento exponencial hasta las 12 horas, manteniéndose en fase estacionaria hasta el final de

la fermentación; a las 72 horas el microorganismo termino la fermentación de glucosa y fructosa

dejando una residualidad menor de 5 g/L de ambos (Figura 26 A y B). En ambos medios la

producción de etanol fue exponencial hasta las 60 horas. Este microorganismo tuvo

comportamiento similar en ambos medios.

En la cepa control Fermichamp (Fig. 27 A) presento crecimiento exponencial en ambos

medios; el consumo de glucosa (Figura 27 B) se dio de forma exponencial, a las 72 horas

consumió el 78 % de la glucosa y al final de la fermentación el 99%; en M1 (Figura 27 C) el

consumo de la fructosa se dio de forma exponencial con dos cambios diauxicos, uno a las 4 horas

y otro a las 24 horas aproximadamente, al final de la fermentación se consumió el 83% de esta

azúcar. El etanol se produjo de forma exponencial aproximadamente hasta las 72 horas en ambos

medios encontrándose mayor producción en glucosa (41.4 g/L) que en fructosa (22.01 g/L)

82



0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l, P

eso s

eco

(g//

L)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

A

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l, P

eso s

eco

(g//

L)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

B


83



0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Pes

o s

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//L

)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

A

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

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100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Pes

o s

eco (g

//L

)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

B

GLUCOSA FRUCTOSA ETANOL PESO SECO

84

\

Figura 27. Cinética de fermentación a 30°C de Fermichamp® (FECHA). A) Medio M1

(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l . P

eso s

eco (

g//

L)

Glu

cosa

, F

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osa

(g/L

)

Tiempo (h)

A

0

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120

Eta

nol,

Gli

cero

l, P

eso s

eco

(g//

L)

Glu

cosa

, F

ruct

osa

(g/L

)

Tiempo (h)

B


85

7.4. Caracterización de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica en medio

M3

Los aislados de S. cerevisiae con una alta actividad fructofílica fueron evaluadas en M3 (Tabla

VIII). Las levaduras 3Y3, 3Y5 y 3Y8 consumieron la glucosa al final de la fermentación y no

presentaron diferencia significativa entre ellas. La cepa control Fermichamp consumió la

totalidad de la fructosa presente en el medio, mientras que los aislamientos 3Y8 y 3Y5 tuvieron

un consumo mayor al 86.5% sin diferencia significativa. En cuanto a la producción de etanol no

se presento diferencia significativa entre las mejores 3Y5 y 3Y8.

En el medio M3 (Fig. 28) en general más del 50% de la glucosa es consumido a las 72 h por

las cepas 3Y5 (Figura 28 B) consume la mayoría de la glucosa a las 150 h, dejando en el medio

menos de 6 g/L; 3Y3, y 3Y8 a las 200 h; la cepa testigo deja alta concentración (30 g/L) al final

de la fermentación. En cuanto a fructosa las cepas a las 92 h consumen más del 50% de la

fructosa, 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejan una alta concentración de fructosa en el medio al final de la

fermentación, solo Fermichamp® termina la fermentación a las 150 h dejando menos de 1 g/L de

esta azúcar residual. El proceso inicia con la misma concentración de ambas azucares

observándose que las cuatro cepas en estudio consumen más rápido la glucosa que la fructosa,

dando lugar a una diferencia entre el consumo de estos azucares (Discrepancia GF) en el curso

completo de la fermentación. Al inicio de la fermentación se observa una mayor discrepancia,

cuando la glucosa empieza a ser limitante en el medio esta se reduce notablemente, observándose

que cuando la fermentación cesa las cepas aisladas del proceso de mezcal dejan una alta

concentración de fructosa en el medio, a excepción de la 3Y8 que hacia las 100 horas la relación

G/F tiene un valor de uno, ya que el microorganismo consume de igual forma la glucosa y la

fructosa. El etanol solo se midió al final de la fermentación, 3Y5 y 3Y8 fueron las cepas que

mayor concentración de este produjeron.

86

Tabla VIII.

Evaluación cinética al final (12 días) de la fermentación de los aislados de S. cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1)

Cepa

Glucosa

residual

Fructosa

residual Azúcar residual Etanol YEtanol/azúcar

Velocidad de

consumo

g/L g/g Glucosa

g/L*h

Fructosa

g/L*h

3Y3 0.52+0.34A 15.41+2.10C 15.92+5.62B 68.63+1.05B 0.38+0.01 0.32+0.02 0.31+0.02

3Y5 0.22+0.13A 13.25+3.10B,C 13.47+4.13A,B 78.16+2.59A 0.43+0.01 0.29+0.00 0.32+0.02

3Y8 0.86+0.75A 9.29+4.38B 10.15+2.62A 76.25+4.60A,B 0.42+0.01 0.30+0.00 0.34+0.00

FECHA 31.88+3.73B 0.00+0.00A 31.65+7.67C 61.62+4.56C 0.35+0.00 0.21+0.01 0.36+0.00

FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®. A, B, C agrupados por ANOVA con Prueba de Diferencia Mínima Significativa

87

Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B)

3Y5 durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 100:100).

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (

%)

de

azú

car

Tiempo (horas)

A

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (

%)

de

azú

car

Tiempo (h)

B

FRUCTOSA GLUCOSA

88

Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C) 3Y8 y D)

Fermichamp® (FECHA) durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 1:1).

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

ge

(%)

de

azú

car

Tiempo (h)

C

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (

%)

de

azú

car

Tiempo (h)

D

FRUCTOSA GLUCOSA

89

Figura 30. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación

de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa

9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (

%)

Azu

car

l

Tiempo (h)

A

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (

%)

Azu

car

Tiempo (h)

B

M1 M2 M3

90

Figura 31. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación

de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp® (FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9),

M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (

%)

Azu

car

Tiempo (h)

A

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150 200 250

Porc

enta

je (

%)

Azu

car

Tiempo (h)

B

M1 M2 M3

91

7.5. Caracterización de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces

cerevisiae fructofílicos

De acuerdo a este protocolo, la cepa con mayor resistencia al etanol a los tres minutos fue

3Y8 (5.4 x 105 cfu/ml), seguida por Fermichamp® (1.5 x105 cfu/ml) y 3Y5 (8.1 x 104 cfu/ml);

mientras que la 3Y3 (0% a 3 min) resultó ser el aislado más sensible (Figura 30). A los cinco

minutos la cepa con mayor resistencia al etanol fue la 3Y8 (2.1 x 105 cfu/ml).

Figura 32. Pérdida de viabilidad en células de levaduras Saccharomyces aisladas de mostos

de mezcal a 30°C en 25% v/v de etanol.

7.6. Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de

los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos

Las secuencias de los genes que codifican para la proteínas de los transportadores Hxt1p y

Hxt3p de los aislados identificados como S. cerevisiae fueron comparadas con secuencias de

la clona S228c (publicadas en el Saccharomyces Genome Database) y la cepa de referencia

Fermichamp® (obtenidas de Guillaume et al., 2007). Con la secuencia aminoacídica de S228c

se predijo el modelo conformacional de los 12 dominios de los segmentos transmembranales

(TM) para Hxt1p y hxt3p (Figura 33 A y B) además la posición de los polimorfismos

encontrados en las cepas aisladas de mostos de mezcal (AMM).

1.E+00

1.E+02

1.E+04

1.E+06

0 1 2 3 4 5

Via

bil

idad

(U

FC

/ml)

Tiempo (min)

3Y3 3Y5 3Y8 FECHA

92

El análisis de las secuencias (Tabla IX) de Hxt1p reveló que los segmentos

transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de mezcal y

Fermichamp®. En Hxt3 revelo que en TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en

S207L (cambio de un aminoácido no polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. Para

TM7 de Hxt1p, los aminoácidos Q275, G279 y D280 están conservados en todas las cepas,

pero en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el

polimorfismo K278T.

En Hxt1 se encontraron entre la región TM9, en el lazo externo y en la TM10 cambios de

aminoácidos en la posición 418-420 y 431, en Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la

posición 418 y 419 solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las

sustituciones Y402L y C401S; otro cambio notable que ocurrió solo en la cepa 3D3 que

presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la región transmembranal 9. En

Hxt1 del segmento TM10 está presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posición

F380. En la cepa 3D3 se encontraron los polimorfismos F406S; G408A; G411A en Hxt1. En

se encontró que en Hxt1 está presente el polimorfismo L439M en el TM12, en la cepa 3D3.

Probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos transmembranales

pueden modificar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azúcar,

evidenciando su importancia en la formación de la cadena, es probable que estas

modificaciones puedan distorsionar la conformación de la estructural exofacial ocasionando

alteraciones entre los sitios alostéricos de la proteína propiciando una diferente afinidad con

las moléculas de hexosas, alterando de manera importante la funcionalidad del transportador.

93

Figura 33. Predicción de la conformación de los segmentos transmembranales de las proteínas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la

secuencia de la cepa Saccharomyces cerevisiae S288c y la posición de los polimorfismos de aislados de mostos de mezcal y la

Fermichamp®.

A)

B)

94

Tabla IX.

Predicción de de la posición de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para los aislados de mostos

de mezcal

Sustituciónes

aminoacídicas

Tansportador de hexosas

HXT1

Sustituciónes

aminoacídicas

Tansportador de hexosas

HXT3

S. cerevisiae aislados S. cerevisiae aislados V1A AMMb

L211S AMMb

T4M AMMb

I213V FECHAa

F19I 3Y5

G241C 3D2, 3D6

F19R 3Y8

M328I FECHAa

T34I 3Y4

L392M FECHAa

D34E FECHAa

Y393W FECHAa

F55N FECHAa

I396V FECHAa

P223S 3D6

C401S AMMb

S239G AMMb, FECHAa

Y402L AMMb

F255Y 3D2

Y405A 3D3 G258D 3Y4

A406F 3D3

R264T 3D2

S407L 3D3

T265G 3D2

G409R 3D5, 3Y2

M266K 3D2

V410A 3D2

T278K

FECHAa , 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5,

3Y8

V410L 3Y2

V294L 3Y5

E418Q FECHAa

F300L 3Y2

G419N FECHAa

G307S 3D3

V432C 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8 V308I 3D3

I266L AMMb, FECHAa

V308L 3D2

A555D 3D3 A334T 3D3

M567L AMMb

V349G 3Y8 D358N AMMb, FECHAa Q359N AMMb, FECHAa

P360G AMMb, FECHAa

V371C AMMb, FECHAa I372L 3Y8 E394Q 3Y8 F396G 3Y8 V400I 3Y8 S406F 3D3 A408G 3D3

A411G 3D3

I430F 3Y8 Y433F 3Y8 M439L 3D3 G471S 3D4, FECHAa L473P 3D3 G487S 3Y5, 3Y8 D489E 3D5 FECHA

a (Fermichamp®) = datos tomados de Guillaume et al. (2007).

AMMb =Aislados de mostos de mezcal (3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y2, 3Y4, 3Y5, 3Y8

95

8 DISCUSIÓN

En Tamaulipas, el proceso de elaboración del mezcal es realizado de forma artesanal bajo

condiciones no controladas, en la fermentación alcohólica generalmente se usan levaduras

nativas, originando largos tiempos y una gran variabilidad en la calidad en la fermentación.

8.1 Identificación molecular de las levaduras

La fermentación de los mostos de mezcal es realizada por un complejo grupo de

microorganismos nativos que interaccionan entre sí (Cáceres et al., 2008), pero la levadura

que finalmente predomina en el proceso y produce la mayor concentración de etanol es la

Saccharomyces cerevisiae. En el proceso de fermentación espontanea de los mostos de

mezcal tamaulipeco a los dos y seis días se encontraron 9 cepas de S. cerevisiae, 3 de T.

delbrueckii, 1 de Z. bailii, 2 de K. marxianus y 1 de P. mexicana. El análisis de las secuencias

de los segmentos ribosomales 28S e ITS revelaron la diversidad entre estas, la posición

filogenética con el análisis de la secuencia 28S mostro un alto nivel de relación entre

organismos de la misma especie (99%); a diferencia de el análisis con ITS que las asoció con

un bajo nivel de relación a S. cerevisiae (81%), T. delbrueckii, Z. bailii y K. marxianus (64%)

y separó a P. mexicana (97%), a demás no asoció a 1Y9 con K. marxianus, esto es debido a

que la región ribosomal 5.8S-ITS exhibe una mayor diferencia interespecífica que los

segmentos 26S ribosomales (Kurtzman et al., 1998, 1992) no obstante 26S permite la

diferenciación de especies relativamente cercanas esto es resuelve diversidad interespecífica e

intraespecífica.

8.2 Caracterización de la productividad de las levaduras

El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos y

especies que taxonómicamente están muy cerca, pero que tienen propiedades muy diferentes

en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolépticas dado el complejo grupo de

96

microorganismos que participan en una fermentación alcohólica es necesario el uso un

método de aislamiento rápido y confiable como rutina de laboratorio como lo es el ARDRA

(Baere et al., 2002; Escalante et al., 2006; Pérez et al., 2007). En esta investigación el

ARDRA evidenció un alta similitud en la huella genética de organismos del mismo género y

especie, especialmente en lo que se refiere a S. cerevisiae, con excepción de los identificados

como K. marxianus esto concuerda con el análisis de la secuencia 26S e ITS1-5.8S-ITS2.

En cuanto a la evaluación de crecimiento por DO(600nm) y consumo de azúcar residual las

cepas S. cerevisiae 3Y2, 3Y4 y 3Y8 (DO600=4.5 en promedio) fueron los que mejor se

adaptaron al ambos medios (M1 y M2) y consumieron casi en la totalidad tanto la glucosa

como la fructosa a demás presentaron mayor crecimiento que las levaduras analizadas por

Arroyo y colaboradores 2009, en donde evaluaron la inhibición por efecto del sustrato, ellos

encontraron que en 69.57% de fructosa (v/v) había una D.O600>1.

En la industria es importante encontrar levaduras con una alta preferencia a la fructosa o

tolerancia, ya que las altas concentraciones de esta azúcar incrementan el riesgo de la

contaminación al final de la fermentación causando detrimento en la calidad, al evaluar los

parámetros cinéticos de las levaduras aisladas de mostos de mezcal identificadas como S.

cerevisiae estas tuvieron comportamientos diferentes.

Las cepas destacadas en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp® ya que al final de la

fermentación la concentración en el medio fue menos de 2 g/L de azúcar residual; en M2 los

mejores fueron 3D3, 3Y4, 3Y8 y al final de la fermentación la concentración fue menos de

g/L de azúcar residual; en M3 las tres cepas en evaluación 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de

1 gr/L de glucosa residual; en cuanto a fructosa 3Y8 dejó una concentración menor a 10 g/L y

sólo FCHA consumió en su totalidad esta azúcar. Estos resultados son comparables con los

reportados por Díaz et al (2008) ellos analizaron S. cerevisiae aisladas de mostos para

producción de tequila, encontraron de 8-11 g/L de azúcar residual en el medio al final de la

fermentación en mostos de A. tequilana (a las 72 h y 95±5 g/L azúcares reductores), Cortes et

al (2009) realizaron fermentaciones en mostos de agave (100g/L de azucares reductores) con

S. cerevisiae y encontraron una residualidad de 6+1 g/L, Pinal et al (2009) analizaron

levaduras S. cerevisiae aisladas de mostos de agave encontraron una concentración menor a

los 5 g/L de azucares a las 72h de fermentación en mostos con 10° Brix; en otros estudios

encontraron que una levadura aislada de mostos de vino en fermentaciones de mostos de

97

agave para producción de tequila (108 g/L de azúcares reductores inicial) dejó alrededor de

15 g/L (Pinal et al., 1997). Berovic et al (2007), en mostos de uva (109g/L de glucosa y 103

g/L de fructosa) encontraron al final de la fermentación 6.5 ± 0.23 de azúcar residual. Dumont

et al (2009), analizaron cepas que dejaron menos de 5 g/L de ambos azucares reductores.

Los aislamientos que mayor biomasa produjeron en M1 fueron 3D3, 3D6 y 3D5 (Tabla

VI); en M2 los mejores fueron 3D3, 3D5, 3Y4 (Tabla VII). Las cepas evaluadas en el presente

estudio produjeron una menor cantidad de biomasa que la reportada en estudios realizados por

Díaz et al (2008), en donde encontraron de 4-5 g/L aproximadamente a las 12h.

Para la producción de etanol los aislamientos más destacados en M1 fueron 3Y3, 3Y4 y

Fermichamp® (Tabla VI); para M2 fueron 3Y3, 3Y5 y Fermichamp® (Tabla VII); en M3 fue

3Y5 y 3Y8 (Tabla VIII). Estos resultados concuerdan con los publicados por Díaz et al.,

2008, ellos encontraron en mostos de agave con 12° Brix 39.9-43.5 g/L de etanol, en otros

estudios realizados en fermentaciones de mostos de agave (10° Brix) encontraron 37 g/L al

final de la fermentación (Pinal et al., 2009), en mostos de agave una concentración de etanol

de 45+2 (Cortes et al., 2009), una S. cerevisiae aislada de mostos de vino en fermentaciones

de mostos de agave para producción de tequila (108 g/L de azúcares reductores inicial) tuvo

una producción de de 50 g/L de etanol (Pinal et al., 1997), en fermentaciones en mostos de A.

tequilana Weber variedad azul (100g de azucares reductores) evaluaron 8 aislamientos de S.

cerevisiae encontrando una producción de 35.85 a 46.16 g/L de etanol (Gutiérrez et al.,

2009); en mostos de uva encontraron 84.7+2.18 de etanol (Berovic et al., 2007). Polsinell et

al (1996), encontraron cepas que produjeron 97 g/L de etanol en mostos de uva; Dumont et al

(2009), analizaron cepas que produjeron 120g/L etanol.

En cuanto al acido acético en M1 la menor producción la tuvo FCHA, 3Y5, 3D5 y 3D3 con

concentraciones inferiores a 0.5 g/L. M2 la menor producción la tuvo FCHA, 3Y3, 3Y2, 3Y4

y 3Y8 en concentraciones inferiores a 0.7 g/L. En fermentaciones de mostos de agave para

producción de mezcal al final de la fermentación se han encontrado de .2 a .4 g/L de ácido

acético (Vera et al., 2009). Es importante determinar la concentración final de ácido acético

presente en una fermentación ya que en concentraciones de 1.2 a 4.8 g (20-80 mM) causa

muerte en las células de S. cerevisiae en la etapa exponencial induciendo condensación de la

cromatina a lo largo de la envoltura nuclear, exponiendo la fosfatidilserina sobre la superficie

98

citoplasmática de la membrana con posterior fragmentación de ADN (Loudovico et al.,

2001), a demás de que tiene un severo impacto negativo en el sabor de los vinos.

En la producción de acido láctico de menor producción en M1 fuero 3D6 (0.47+0.06 g/L)

y 3Y4 (0.00+0.00 g/L) (Tabla VI); para M2 los aislamientos 3Y2 (0.00+0.00 g/L), 3Y3

(0.00+0.00 g/L), 3Y4 (0.38+0.01 g/L) (Tabla VII). Díaz et al (2008) encontraron en

fermentaciones de mostos de Agave tequilana Weber una concentración de acido láctico de

0.0752 a 0.110 mg/L; la concentración usual producida por S. cerevisiae en fermentaciones de

vinos es de 0.1 a 0.5 g/L (Vasserot et., al 2010), es importante conocerlo ya que altas

concentraciones de acido láctico (más de 1 g/L) pueden modificar el metabolismo de la

levadura, inhibir el crecimiento, el efecto más obvio es el alargamiento de la fase lag,

(Vasserot et., al 2010); además de que puede provocar paro en la fermentación (Pampulha et

al., 2000).

La mayor concentración de glicerol en M1 la produjeron los aislamientos 3D4 (7.61+2.08

g/L) y 3D6 (5.82+0.40 g/L) (Tabla VI); en M2 fueron los aislamientos 3Y5 (4.37+0.03 g/L) y

3Y8 (4.21+0.12 g/L) (Tabla VII). Nuestros resultados son comparables a los obtenidos en

fermentaciones de mostos de agave en los que se encontró una concentración de 4.3 a 4.7 g/L

(Díaz et al., 2008), Cortes et al (2009) en mostos de agave encontraron 2.8 a 3.9; en mostos

de uva se encontró una concentración de 6.8 (Berovic et al., 2007). Es importante conocer la

concentración de glicerol en una fermentación ya que este compuesto le confiere calidad, en

vinos no es deseable que exceda 6 g/L.

Dado el carácter glucofílico de la levadura Saccharomyces cerevisiae y la importancia que

este microorganismo tiene en la industria vinícola, es necesario contar con levaduras que

fermenten en igual o similar proporción tanto la glucosa como la fructosa ya que

generalmente dejan una alta concentración de fructosa en el medio, causando una

discrepancia entre la cantidad de glucosa y fructosa consumidas durante la fermentación (GF)

(Berthels et al., 2004; Guillaume et al., 2007). Investigaciones realizadas por Berthels et al.

(2004) en mostos de la variedad de uva Colombard mostraron que las levaduras utilizadas

fermentaron más rápido la glucosa, no obstante que al inicio del proceso estaban presentes

cantidades similares de los dos azucares (110 g/L de cada una) la lenta utilización de la

fructosa dejó una diferencia (GF) y que cuando la glucosa es limitante en el medio la relación

GF decrece también, a los doce días estaba presente aproximadamente 5 g/L de glucosa, 30

99

g/L de fructosa y 85 g/L de etanol. En la evaluación de las levaduras en medio sintético tipo

mostos de uva (M3) se observó que solo la cepa control Fermichamp® consumió totalmente a

la fructosa aproximadamente en 180 horas, seguido por el aislamiento 3Y8; en cuanto a la

glucosa los aislamientos 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de 1 g/L de azúcar residual. En este

estudio se observó que las cepas consumen más rápido la glucosa que la fructosa, coincidente

con el carácter glucofílico de las cepas S. cerevisiae empleadas en procesos fermentativos

vinícolas.

Al caracterizar una levadura fermentativa, es importante analizar la resistencia al estrés por

etanol ya que este perturba la homeostasis de las células impactando negativamente a diversas

actividades celulares, por ejemplo el metabolismo de los trasportadores de hexosas puede ser

bloqueado, causando desnutrición en las células y ocasionando por consecuencia un paro en la

fermentación; o bien la reproducción celular puede verse afectada factor importante en las

fermentaciones ya que se necesita que las cepas sean capaces de generar la biomasa requerida

para completar eficientemente la fermentación (Nagodawithana et al., 1975; Thomas et al.,

1978). En esta investigación se usaron niveles de etanol de 25% v/v debido a que causan

estrés en la célula, generando inactivación cinética tan rápida que no puede interferir los

factores debidos al régimen de cultivo, además de que es medible a través de un periodo corto

de tiempo (Pina et al., 2004). Se encontró que la cepa con que presento mayor porcentaje de

viabilidad fue la cepa control Fermichamp®, seguida por 3Y5 y 3Y8. Thomas et al (1978),

analizaron organismos S cerevisiae encontrando cepas que toleraban concentraciones de

etanol arriba del 20% a 30°C. Estrada et al (2001) reportaron cepas de S cerevisiae aisladas de

mostos de agave con una resistencia a más del 10% v/v de etanol considerando un crecimiento

positivo cuando se presentaba una DO (650nm) arriba del 0.020 unidades.

8.3 Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de

los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos

Los genes que codifican para los transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 están

presentes en mamíferos bacterias, plantas y levaduras, estos genes exhiben una estructura

conservada en los Segmentos Transmembranales (TM) 1, 3, 5, 7, 8, regiones que se

caracterizan por formar α-héliceses anfipáticas las cuales hipotéticamente interactúan,

formando un poro acuosos a través del cual pasa la hexosa, se sugiere que el hidroxil y la

amina del aminoácido forman cadenas de estas hélices uniéndose con la hexosa a través de

100

puentes de hidrógeno con los grupos hidroxilos del azúcar (Mueckler et al, 1999; Kasahara et

al., 2007), estudios sugieren que la hexosa es transportada de acuerdo a su polaridad, debido a

la unión estructural entre las fuerzas internas y externas entre el azúcar y el transportador,

iniciando desde el exterior por el C-1 (Carbono 1) siguiendo con C-4 y el C-6 (Hashiramoto et

al, 1992), probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos

transmembranales pueden modificar el tamaño del poro y la forma de señalización de la

proteína con el azúcar.

Las investigaciones han revelado en los FMS (súper familia de los principales

facilitadores, por sus siglas en inglés) el TM5 de levaduras es importante para el

reconocimiento y paso del substrato, específicamente en el transportador HXT2 se encontró

que en esta región el aminoácido Leucina (L201) es esencial para una alta afinidad de

transporte bajo condiciones limitadas de glucosa (Kasahar et al, 2003); igualmente se

encontró que la Glutamina (Q) esta altamente conservada en otros transportadores para

glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y arabinosa (Glut1 Q161, en HXT1 Q149 y HXT3 Q206 )

evidenciando su importancia, estudios previos sugieren la participación de este aminoácido

en la formación exofacial de la cadena, básicamente en el sitio de unión con el sustrato

(Mueckler et al, 1994). En nuestro caso el análisis de las secuencias de Hxt1 reveló que los

segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de

mezcal y Fermichamp® con la secuencia de la clona S228c. El análisis de Hxt3 reveló que en

TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S207L (cambio de un aminoácido no

polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c; Fermichamp® presenta el polimorfismo

V209I; considerando su cercanía al aminoácido conservado Q206 y a las características del

cambio de Leucina por Serina del transportador en las cepas aisladas de mezcal, como en

Fermichamp®, es probable que estas modificaciones puedan distorsionar la conformación

estructural exofacial ocasionando alteraciones entre los sitios alostéricos de la proteína

propiciando una diferente afinidad con las moléculas de hexosas.

El segmento TM7 tiene un alta homología en otros SMF y está situado en la parte superior

de la membrana, probablemente este cumple el papel de reconocimiento del sustrato por parte

de la célula, esto es en la interacción exofacial de la proteína con el azúcar, además de que

participa en el doblamiento de la hélice; Hashiramoto (1992) mostró que en GUT1 el

aminoácido Q282 (HXT1 Q275; HXT3 Q332) se encuentra en una región conservada, es posible

que una modificación en esta zona, altere de manera importante la funcionalidad del

101

transportador; hipotéticamente este aminoácido forma puentes de hidrógeno con el C-1 de la

glucosa (Liang et al., 1977; Mueckler et al., 2009), además de que puede participar en la

unión de la estructura conformacional externa entre TM7 y TM12 propiciando el movimiento

helicoidal ascendente cuando un sustrato es incorporado del exerior hacia el interior; en otros

estudios se encontró que el aminoácido glicina (HXT1 G279 y HXT3 G336) esta altamente

conservado en transportadores de mamíferos y hongos, y es crítico para el transporte de

glucosa (Liang et al., 1997, 1998); Kasahara (2010) encontró que el segmento Hxt7 tiene una

región hidrofílica y que posee el aminoácido D340 (HXT2 D331; HXT1 D280; HXT3 D337) en la

parte central de la cadena, posoción que hipotéticamente afecta la estructura de unión al

sustrato o el papel que tiene de unirse a otros residuos, estos ensayos sugieren que Asp340

interacciona con el C-1 de la D-glucosa (Mueckler et al, 1994; 2004). En este estudio el

análisis, el segmento TM7 de Hxt1, los aminoácidos Q275 (GUT1 Q282; Hxt3 Q332), G279 y

D280 (D340) están conservados para todas las cepas, pero en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3,

2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T, considerando que la Lisina

(K) es un aminoácido positivo mas grande y puede estar sujeto a ubiquitinación/acetilación, se

sugiere que hipotéticamente esta modificación cambia el plegamiento de la región TM7

pudiendo afectar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azúcar

afectando en forma importante la funcionalidad del transportador.

Guillaume et al (2007) encontraron 6 mutaciones situadas entre la región TM9, en el lazo

externo y en la TM10 de Hxt3, esta región no ha sido identificada como crítica en el

transporte del azúcar, no obstante las mutaciones presentes pueden tener un efecto en la

proteína, ya que es se encuentran situadas exofacialmente; en Hxt1 se encontraron en la

misma región cambios de aminoácidos en la posición 418-420 y 431, el análisis de cepas

nativas y comerciales con caracteristicas vinícolas reportaron los mismos polimorfismos en la

misma región, sugiriendo que estos cambios pueden afectar positivamente el desarrollo de la

fermentación (Guillaume et al., 2007; Karpel et al; 2008). Para este trabajo, se encontró en el

transportador Hxt1 de la cepa testigo y en los aislados de mezcal, los polimorfismos

reportados por Karpel (2007) en la misma región (418-420 y 431) (TM9, el rizo medio y la

TM10). En Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la posición 418 y 419 reportados por

Karpel (2007) pero solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las

sustituciones Y402L y C401S; otro cambio notable que ocurrió solo en la cepa 3D3 que

presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la región transmembranal 9. Todos

los cambios mencionados anteriormente pueden afectar considerablemente la conformación

102

estructural de ambas proteínas favoreciendo o disminuyendo el transporte de la hexosa en la

fermentación.

En ensayos realizados con levaduras mutantes (Kasahara et al, 1997; 1998; 2006; Dietvorst

2009), se encontró que en el gen Snf3 el aminoácido conservado Phe462 (Glut1 F379, Hxt1 F380,

Hxt2 F431,Hxt3 F437) situado en la TM10, este aminoácido está relacionado como sitio de

reconocimiento (o punto de unión) en la parte interna de la hélice para los azúcares fructosa,

glucosa y manosa. En las cepas analizadas se encontró que en Hxt1 del segmento TM10 esta

presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posición F380, probablemente esto y

otras características (no evaluadas), favorezca el transporte tanto de la glucosa como la

fructosa a través de la membrana ya que es de las cepas que más consume estos azúcares.

Existen reportes de que en la TM11 el Triptófano se encuentra conservado en Glu1 (W412)

Hxt1 (W413), Hxt3 (W470), Muecler et al (2009) sugieren que este aminoácido aromático se

une al sustrato interaccionando con el C-6 de la piranosa. En la cepa 3D3 los polimorfismos

presentes en Hxt1 (F406S; G408A; G411A) encontrados en la TM11 se localizan cercanos al

aminácido Triptófano (W413). Kasahara (2000), reportó que la posición 504 (Phe) en Gal2 en

TM12 es crítica para el transporte de galactosa, y que este aminoácido aromático está

conservado en un gran número de transportadores de azúcar o proteínas relacionadas, se

reportó que este aminoácido fue remplazado en Hxt3 por (Phe945) y se obsevó una

disminución en el transporte de glucosa, observándose por el crecimiento de la célula sobre la

placa en medio YNB, sugiriendo que este sitio contribuye fuertemente a la discriminación del

reconocimiento en el sustrato, aun que Liang (1997) realizó ensayos con inserción y deleción

en TM12 del transportador Hxt3 encontrando que esta región no es crítica para el transporte

de glucosa. En nuestro estudio se encontró que en Hxt1 esta presente el polimorfismo L439M

en el segmento transmembranal 12, adyacente a la posición F438 (Gal2 F504) en la cepa 3D3,

posiblemente estos cambios interfieren con el sitio de reconocimiento de la glucosa ya que

3D3 es de los aislados que dejó mas de 5 g/L de glucosa residual al final de la fermentación

(dejando menos de 2 g/L de fructosa). Los polimorfismos encontrados en los genes de los

transportadores Hxt1 Y Hxt3 de las cepas aisladas de mostos de mezcal podrían ser cambios

naturales debido al proceso evolutivo incrementado por las condiciones específicas de estos

mostos, con la posibilidad acumulativa de mutaciones neutrales o tal vez negativas y/o

positivas pero es necesario realizar más investigación al respecto.

103

9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El contar con un método rápido de detección y aislamiento para levaduras Saccharomyces

cerevisiae, además que sean candidatas a consumir eficientemente la fructosa es una

herramienta predictiva muy útil en microbiología con fines de uso industrial. Debido a la

fuente fructofílica de los mostos de agave el aislamiento de levaduras con características

fructofílicas y de producción de etanol además de tolerancia a altas concentraciones de etanol,

son susceptibles de ser usadas en otros modelos fermentativos, como lo son los mostos de uva

ya que la composición de estos es aproximadamente 100 g/L de glucosa y 100g/L de fructosa,

siendo esta ultima una azúcar residual de alta concentración al final de la fermentación.

Por lo que es de gran relevancia la evaluación de la cepa 3Y3, 3Y5 3Y8 en mostos de

agave, así como en mostos de uva con un fin productivo para mezcal y vinos de mesa ya que

es necesario encontrar cepas de S. cerevisiae productivas y adaptadas a las diversas

condiciones de fermentación por que la calidad de estas bebidas alcohólicas depende entre

otras cosas al rápido establecimiento y la eficiencia de la levadura durante la fermentación.

Los resultados obtenidos del análisis de las secuencias de los transportadores mostraron

que las cepas con mayor consumo de azúcares reductores presentaron un mayor despliegue de

polimorfismos relacionados con cambios en la región interna del poro y/o en las regiones

regulatorias de acuerdo a la literatura. La cepa 3Y8 presentó el mayor número de cambios

importantes en Hxt1, Para el HXT3 los polimorfismos analizados mostraron en todas las

cepas menores cambios en relación a la Fermichamp y en lo particular para las cepas

analizadas con más detalle (3Y3, 3Y5, 3Y8) se presentó el polimorfismo Val432Cys. Los

resultados obtenidos en el análisis de los HXT1 y HXT3, sugieren la necesidad de realizar

estudios de expresión y mutagénesis en sitio dirigida para determinar las capacidades

fructofílicas de cepas de S. cerevisiae aisladas de mostos de mezcal.

104

10 APÉNDICES

Apéndice 1. Microfotografías de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas de mosto

de mezcal.

Figura 34. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-

51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular

del microscopio. A) 3D2; B) 3D3; C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6.

A B

C D

E

105

Figura 35. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-

51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular

del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3; H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8.

F G

H I

J K

106

Apéndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal.

>3D2 Saccharomyces cerevisiae

CCGGGGTTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG

GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT

GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG

AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT

CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG

AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG

TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC

TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG

TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG

GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT

AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACC


GGGGCATGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG










AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCC


AGGGAATCCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG




107







AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCGCGAACCA


CGGGGAATGCCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG










AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG


GGGGAAAAGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG

TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT

CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA

GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC

TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG






AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACACACGGGACCA

108

>3Y2 Saccharomyces cerevisiae

CGGTATgCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCTAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACC

TTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTcTAT

GTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGC

GGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAG

TGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACA

AGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGT

GAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGC

TCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGC

AGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAA

TACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATG

GTTATATGCCGCCCGTCTTGAAAAACCCGGAACCAAA


CAAAGGGAATGCTTATACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTG










AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCAAAA


CGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGT

ACCTTCGGTGCCCSAgTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGtCT

aTGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTG

CGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAA

GTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAAC

AAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTAC

GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCT

109

GCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTG

GCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGG

AATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAA

TGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAA


ACAGGGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG


CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA

GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC

TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG






AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG


CgGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG


CTATgTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAG

TGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCT

AAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGA

ACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGT

ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCT

CTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGT

GGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGG

GAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATA

ATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACAAACGGACCAA

110

Apéndice 3. Secuencias ITS’s de las levaduras aisladas de mostos de mezcal


ATATTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGCAA

GAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGGGGTCTTGC

TAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTT

GTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTT

TGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAA

AGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAA

ATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAA

GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCG

AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAG

CGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAA

CTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTG

CGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTA

ATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGG

CGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAA


CAAATTTGATAATTTTGAAATGGATTTTTTTATTTTTGGGAATGGAGAGCGAGCTT

TTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTG

CGCGGCCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTGGGCATACAAAACGGGGAGAGTT

TTCGGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAGCACTAGGGGGT

ATTTTCCTATCTTTTCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCAAGAGG

TAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTT

TCGTAACAGGAATTTTGAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC

TCGCATCGATGAAAAACACATCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTC

CKGGAATCATCGAATCTTTGAACGCTAATTGTTCCCTTTGGTATTCCTGGGGGCTT

GGGTGTTGGAGCGAAATTACCTACCCAAAGATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACT

CTTTGTAATAAATTTTAACTAAACGGCCTTTTCATTGAAATTTTTTTTTCTAAAAAT

TGGTTCCACGGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCTTTTTGGGTTTAACCA

CCTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAATAAGAA

AGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAAACGGGKAGGAAGAC

CCCCCTGAACTTAAGCTTCACTAAGAGCGGGGGAAGATAAA

111


CAAAGATTATATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAACAAGAGAGCTTTT

ACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCG

CGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTC

TGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTT

TCAAATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA

CAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG

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112

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113


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114

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115

Apéndice 4. Comparación de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras seleccionadas

por su fructofilia.

Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen HXT1 de aislados de

mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido

idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido.

116

Apéndice 5. Comparación de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras seleccionadas

por su fructofilia.

Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen hxt3 de Aislados de

Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido

idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido

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134

Zhang Z, Reese JC. 2004. Redundant mechanisms are used by Ssn6-Tup1 in repressing

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Biological Chemistry 279(38): 39240-39250.

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origins of mezcal and tequila spirits in west-central Mexico. Genetics Resources and

Crop Evolution 55(4): 493-510.

Zuzuarregui A, Del Olmo M. 2004. Analyses of stress resistance under laboratory conditions

constitute a suitable criterion for wine yeast selection. Antonie van Leeuwenhoek 85,

271–280.

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http://www.springerlink.com/content/0925-9864/55/4/

135

12 RESUMEN BIOGRÁFICO

Amanda Alejandra Oliva Hernández Candidata para el Grado de Doctor en Ciencias

Tesis: EVALUACIÓN CINÉTICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS

FRUCTOFÍLICAS AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO

Campo de Estudio: Biotecnología con acentuación en Microbiología Datos Personales: Nacida en Reynosa, Tamaulipas el 3 de Mayo de 1968, hija de Amanda

Leticia Hernández Monreal y Gerardo Enrique Oliva Guzmán Educación: Egresada del Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey, grado

obtenido Ingeniera Agrónoma en Producción en 1993.

Egresada de la Universidad Autónoma de Tamaulipas, grado obtenido Maestra en Ciencia y Tecnología de Alimentos en 2007.

Experiencia Profesional: Puesto de Profesor Asociado “C” de Tiempo Completo en el

Instituto Politécnico Nacional, desde el 2003, asociada de investigación en el Laboratorio de Biotecnología Industrial (CBG-IPN).

PRODUCTIVIDAD

Presentaciones orales en congresos nacionales e internacionales

De la Torre F. J., Guido N., Oliva-Hernández A., Narváez-Zapata José A. y Larralde-Corona P. (2010) Monitoreo por técnicas moleculares (FISH y ARISA) de un cultivo mixto de levaduras durante la fermentación del mosto de agave. 7 Encuentro Nacional de Biotecnología del IPN. 11 al 13 de Octubre 2010. Mazatlán, Sinaloa.

136

De la Torre- González F, Tarqui-Callejas N., Oliva-Hernández A., Narváez-Zapata J., Larralde-Corona P. 2012. Determinación de la Tolerancia de Tres Especies de Levaduras Aisladas del Mezcal Tamaulipeco. VII Congreso Nacional y XXVIII Internacional de Ingeniería Bioquímica.. 28, 29 y 30 de Marzo. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero, México.

Artículos científicos indexados Amanda A. Oliva Hernández, Patricia Taillandier, Diana Reséndez Pérez, José A.

Narváez Zapata, Claudia Patricia Larralde Corona. The effect of hexose ratios on metabolite production of Saccharomyces cerevisiae strains obtained from the spontaneous fermentation of mezcal. En prensa: Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology, DOI 10.1007/s10482-012-9865-1

Flores-Magallón R., Oliva-Hernández A.A., Narváez-Zapata J.A. (2011).

Characterization of microbial traits involved with the elaboration of the Cotija cheese. Food Science and Biotechnology 20(4): 997-1003.

Larralde-Corona C.P., Ramírez-Gonzalez S., Oliva-Hernández A., Pérez-Sánchez G.

Narváez-Zapata J.A. (2011). Identification of differentially expressed genes in the citrus epiphytic-yeast Pichia guilliermondii during interaction with Penicillium digitatum. Biological Control 57: 208-214.

Reyes-López, M. A., Salazar-Marroquín, E. L., Oliva-Hernández, A. A., Salinas-López,

N., Narváez-Zapata, J. A. (2009) White-spot syndrome virus diagnostic in frozen shrimp stocks imported to Mexico. CyTA Journal of Food 7: 89-94.

Capítulos en libros institucionales Arratia-Mireles J. M., Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernández A. A., Narváez-Zapata

J.A. (2009) Estudio de la diversidad de levaduras asociadas a los mostos de mezcal. En: Avances en el Estudio de la Biotecnología. Narváez Zapata J. A., Villegas-Hernández M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politécnico. 2009. ISBN: 978-607-414-060-6. pp: 42-45.

Oliva-Hernández A. A, Narváez-Zapata J.A., Resendez D., Taillander P., Larralde-

Corona C.P. (2009) Evaluación de levaduras fructofílicas aisladas del mezcal tamaulipeco. En: Avances en el Estudio de la Biotecnología. Narváez Zapata J. A., Villegas-Hernández M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politécnico. 2009. ISBN: 978-607-414-060-6. pp: 191-194.

Posters en congresos nacionales e internacionales

137

Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernández A.A., Narváez-Zapata J.A., Resendez-Pérez D. y

Taillander P. 2009. Caracterización productiva de levaduras fructofílicas aisladas del mezcal Tamaulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnología y Bioingeniería y el VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero, México. Poster

Arratia-Mireles M., Oliva-Hernández A., De la Torre-González F., Trujillo-Negreros E.,

Narváez-Zapata J.A. y Larrralde-Corona C.P. (2009). Diversidad genética y capacidad fermentativa de levaduras involucradas en la producción del mezcal tamulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnología y Bioingeniería y el VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero, México.

Oliva Amanda, Narváez José, Resendez Diana, Strehaiano Pierre, Taillandier Patricia,

Larralde Patricia. 2009. Mezcal fermentation: yeast diversity and their productive characterization on high fructose synthetic medium and Agave must. 27th International Specialised Symposium on Yeasts. Institut Pasteur. Paris, France.

De la Torre-González F. J., Narváez-Zapata José A., Oliva-Hernández A. y Larralde-

Corona C.P. 2010 Caracterización de la cinética de cultivos mixtos de levaduras aisladas del mezcal Tamaulipeco. XXXVII Congreso Nacional de Microbiología. 29 de junio al 2 de Julio. Morelia, Michoacán. México

Oliva-Hernández A., Resendez D., Taillandier P., Narváez-Zapata J., Larralde-Corona

C.P. 2011. Fructose utilization by yeasts isolated from agave must. 29th International Specialised Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. México

Narváez-Zapata J., Segura-Cabrera A., Oliva-Hernández A., Larralde-Corona C.P. 2011.

Predictive homoplasic sites in HXT1 and HXT3 transporters related to fructophilic profiles in yeasts isolated from agave must. 29th International Specialised Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. México..

Estancias de investigación Estancia de Investigación de 3 meses en "Laboratoire de Génie Chimique UMR CNRS

5503" . INP-Toulouse, Francia. 2007. Estancia de Investigación de 3 meses en "Laboratoire de Génie Chimique UMR CNRS

5503". INP-Toulouse, Francia. 2009.

138

Résumé Au Mexique l’état de Tamaulipas est susceptible de devenir l'un des plus grands producteurs de mezcal. Contrairement à d’autres boissons alcoolisées, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a pas été pleinement identifiée ou caractérisée métaboliquement. Il est d'un grand intérêt industriel de savoir si les levures indigènes impliquées dans la fermentation de moûts d’agave ont une forte nature fructophilique qui serait induite par la composition naturelle riche en fructose du moût. De plus, la caractérisation cinétique des levures et au niveau moléculaire des transporteurs impliqués dans la consommation de fructose par cette flore est pertinente étant donné que des études sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae n’ont pas montré que les transporteurs de glucose et de fructose étaient différents. Dans ce travail, la population levurienne étudiée était de 17 isolats, à partir de 103 initialement isolés de la mezcaleria "El Palmar" Emilio Lozoya, situé à San Carlos (Tamaulipas, Mexique) au niveau de différentes étapes. Seules les levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae ont été retenues et étudiées. En particulier de polymorphismes des 2 gènes des transporteurs principaux de sucres associes au fructose consume HXT1 et HXT3, a été évalué en comparaison à une souche de référence. Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent la nécessité d'une analyse approfondie afin de préciser les liens entre la fructophilie et l'expression et / ou la structure des gènes des transporteurs de sucres lors de la fermentation alcoolique. Mots clés: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, transporteurs d’hexoses HXT, fructophile, fermentation alcoolique

Abstract The Mexican state of Tamaulipas has the potential to become one of the main producers of mezcal. But contrary to what is known about other alcoholic beverages, the mycoflora involved in this alcoholic fermentation has not been completely identified nor characterised from the metabolic point of view. There is an increasing industrial interest on knowing if the native yeasts associated to agave must fermentations possess a fructophilic behaviour, favoured by the natural high fructose composition of the agave musts. Moreover, the kinetic characterisation of these yeasts and the molecular analysis carried out on the hexose transporters genes reported to be involved in the glucose and fructose consumption is pertinent, and several studies on Saccharomyces cerevisiae have demonstrated a differential preference for each hexose. In this study, a set of 17 yeast isolates were chosen from an original collection of 103 yeast isolated at the mezcalería El Palmar Emilio Lozoya, which is located at San Carlos (Tamaulipas, Mexico) from different stages of the fermentation. Only those belonging to S. cerevisiae specie were studied, mainly concerning the polymorphisms found on their two main hexose transporter genes associated to a preferential consumption of fructose, HXT1 and HXT3, and results compared to a control strain. The results obtained showed that there is no a direct link between the fructophilic phenotype and/or the structure of these genes and that more studies are needed to establish such relationships. Keywords: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, hexose transporters HXT, fructophilic, alcoholic fermentation

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