Module d’ouverture :

« Biotechnologies en 10 leçons »

Les Enzymes

Professeur D. CombesINSA, Toulouse

Les enzymes

Les enzymes

Production des enzymes

Purification des enzymes

Immobilisation des enzymes

1783 Spallanzani, viande "liquéfiée" par le sucgastrique des faucons.1833 première découverte d'une enzyme : Payen etPersoz.1858 à 1871, Pasteur observe les changementschimiques qui se produisent lors de lafermentation.1878 : Kühne propose le mot ENZYME qui signifie"dans la levure".1897, Bertrand : coenzymes.

Historique

fin des années 20 : les enzymes sont des protéinesannées 40 et 50, des centaines de nouvelles enzymes sont découvertes, purifiées, cristallisées : voies métaboliques clefs élucidées, mécanismes d'action et de régulation des enzymes étudiés. 1960 : 1ère enzyme (la Ribonucléase) séquencée1969 : Ribonucléase synthétisée par voie chimique.de 1969 à nos jours : Génie Génétique

Historique

1 - Oxydoréductases : réactions d'oxydo-réduction.

2 - Transférases :transfert d'un groupe d'une molécule àune autre.

3 - Hydrolases : coupure hydrolytique des liaisons C-O, C-N, C-C

4 - Lyases : coupure des liaisons C-C, C-O et C-N par élimination, en formant des = liaisons ou des cycles

5 - Isomérases : changements structuraux dans une molécule

6 - Ligases : liaison entre deux molécules, couplée àl'hydrolyse d'une liaison Phosphate de l'ATP

Classification

Transférasestransfert d'un groupe spécifique d'une molécule à une autre

Dextrane Saccharase = E.C. 2.4.1.5Sacch + Dexn (1,6 Glu) D-fruct. + (Dex)n+1

Lévane Saccharase = E.C. 2.4.1.10Sacch + Levn (2,6 Fruct) D-glu + (Lev)n+1

Saccharose Phosphorylase = E.C. 2.4.1.7Sacch + P D-fructose + G-1P

Hexokinase = E.C. 2.7.1.1ATP + Hexose ADP + Hexose 6-P

Exemples

IsomérasesChangements géométriques ou structuraux dans unemolécule :glucose-isomérase (E.C. 5.3.1.5) Xylose Isomérase

glucose fructose

Exemples

Ligases

liaison entre deux molécules, couplée à l'hydrolyse d'une liaison Phosphate de l'ATP :

E.C. 6.4.1.1 Pyruvate carboxylase

ATP+Pyruvate+HCO3- ADP+ PO4-+Oxaloacétate

Enzymes / Catalyseurs

Site actif

Liaison tridimensionnelle

Flexibilité du site actif

Efficacité catalytique

Notion de Catalyse

Énergie

Avancement de la réaction

Énergie d’activationde la réaction

ΔG < 0Substrats

Produits

S*

Enzymes / Catalyseurs

Il existe un état de transition S*

Comment accélérer la réaction detransformation de S en P ?

-élever la température

- diminuer l'énergie d'activation

Enzymes / Catalyseurs

Énergie

temps

Énergie d’activationde la réaction

ΔG < 0

ΔE

SubstratsProduits

S*

Enzymes / Catalyseurs

Les enzymes diminuent sélectivement l'énergie d'activation d'une réaction donnée.

La température ambiante est alors suffisante pour qu'un nombre important de S P.

Les enzymes sont des catalyseurs qui augmentent la vitesse des réactions chimiques sans être consommées

Enzymes / Catalyseurs

- région complémentaire en taille, forme et nature chimique du substrat

- il y a seulement une douzaine d'acides aminés autour du site actif avec seulement 2 ou 3 qui sont directement impliqués.

Site actif

A B

C

enzyme

Site actif

Site actif

Les enzymes accélèrent les vitesses de réaction en diminuant l'énergie d'activation :

- les réactions enzymatiques se déroulent suivant un mécanisme de réactions organiques (acide-base, nucléophile, électrophile) pour lesquelles l'enzyme fournit les groupes catalytiques

- les facteurs de proximité et d'orientation sont prépondérants. Sans enzyme, les rencontres de deux molécules se font au hasard : ce n'est plus le cas ici

- certaines liaisons du substrat sont tendues par l'enzyme

Efficacité catalytique des enzymes

Observations :

– la vitesse initiale de réaction est directement proportionnelle à la concentration de la préparation enzymatique

– cette vitesse augmente de manière non linéaire avec la concentration du substrat

– elle atteint une vitesse maximale

Cinétique d’enzymes à un substrat : Michaelis-Menten

Hypothèses– 1- L'enzyme est un catalyseur– 2 - L'enzyme et le substrat réagissent

rapidement pour former un complexe enzyme-substrat

– 3 - Un seul substrat et un seul complexe enzyme-substrat sont impliqués et le complexe enzyme-substrat se brise pour donner directement l'enzyme libre et le produit

– 4 - L'enzyme, le substrat et le complexe enzyme-substrat sont en équilibre. De plus la vitesse de dissociation de ES en E + S est beaucoup plus rapide que la vitesse de coupure de ES pour former E + P

Michaelis-Menten

- 5 - La concentration du substrat est beaucoup plus élevée que celle de l'enzyme ; ainsi la formation du complexe ES n'altère pas la valeur de la concentration de S

– 6 - La vitesse globale de la réaction est limitée par la coupure du complexe ES pour former l'enzyme libre et le produit

– 7 - La vitesse est mesurée dans les premiers instants de la réaction de telle manière que la réaction inverse n'est pas significative.

Michaelis-Menten

EQUATION DE MICHAELIS-MENTEN

VM [S]V = KM + [S]

Michaelis-Menten : équation

Vi

[S]

VM

VM/2

KM

Michaelis-Menten : traitement graphique

•Novozyme (Danemark) : 50%

•DSM (Hollande) : 20%

•Genencor International (USA) : 15%

•Solvay-Miles (USA) : 5%

• Amano, Nagase (Japon)

Les producteurs d’enzymes

millions de $

1000

500

250

750

01970 1980 19901966 2000

1250

Evolution des ventesmondiales d’ enzymes

1970 1980 19901966

Réflexe négatif des consommateurs :problème d'allergiecausé par les poudres.

Les enzymes sont incluses dans des granules en fibre de cellulose

Le marché des enzymes dans les détergents

Détergents32 %

Amidon

15 %Textile

10 %

Produits laitiers

14 %

CosmétiqueAlcoolBière jus de fruitsnourriture animalediagnosticschimieboulangeriearômesgraissespapiercuir

Autres 29 %

Répartition des ventes d’enzymes en 1995

Détergents32 %

Amidon

15 %Textile

10 %

Produits laitiers

14 %

Autres 29 %

Détergents

27 %

Amidon12 %

Textile

6 %

Produits laitiers

8 %

Autres

47 %

70 % de la croissance du marchéentre 1985 et 2005 (500 millions de $)

Répartition des ventes d’enzymes en 2005

• 75 % sont des enzymes catalysant des hydrolyses,utilisées pour dépolymériser des substances naturelles.

• 40 % : Protéase (produits laitiers, détergents).• Carbohydrolase (industries de l'amidon et dutextile, boulangerie, alcools).

•Plusieurs milliers d'enzymes ont été identifiées• en 1983 : 30 enzymes produites à grande échelle.• en 1995 : 60 enzymes produites à grande échelle.

Types d’enzymes

Nom de l’enzyme Origine

Lipoxygénase Fève - Sojabéta-amylase Malt - SojaPapaïne Latex de papayerFicine Latex de figuierBromélaïne Ananas

Enzymes d’origine végétale

Nom de l’enzyme Origine

Trypsine Pancréas de porcChymotripsine Pancréas de porcPepsine Estomac de porcChymosine VeauLipase Pancréas de porcLysozyme Blanc d’œuf de poule

Enzymes d’origine animale

1991 1993 1995Native 77 15 8

ADN recombinant 16 71 67

Ingénierie des protéines 7 14 25

Les sources d’enzymes

•indépendance des contraintes saisonnières et géographiques•utilisation de matières premières bon marché•utilisation d’installations industrielles polyvalentes•rendements de production pouvant faire l’objet d’amélioration.•lourdeur des investissements•coût énergétique•nécessité d’un personnel qualifié•risques de contamination, pollution

Production par fermentation

Endo Glucose oxydaseCatalase

Exo alpha-amylaseAmyloglucosidaseMaltaseCellulasePectinaseBéta-glucanaseInulinaseLipaseLactaseProtéase acide

Enzymes produites par A. niger

•Culture dans un milieu induisant la production efficace del'enzyme.•Retrait de la biomasse, extraction et purification del'enzyme, addition de conservateurs, immobilisation.•Isolement d'un micro-organisme naturel sécrétant uneenzyme d'intérêt.•Le plus souvent la fermentation se fait dans une cuveagitée (jusqu’à 200 m3).•Energie d’agitation élevée (5 à 10 CV /m3).• Système de refroidissement important.•Contrôle de la T°, du pH, de la pO2, des mousses.

Technologie de base

• Génie génétique : transfert de gènes entre micro-organismes.Clonage du gène d'une enzyme provenant d'un organismerare chez un organisme permettant une productionindustrielle efficace.

•Ingénierie des protéines : production d'enzymes surmesure.

•Purification : production sous forme de cristaux purs.

Apport des Biotechnologies modernes

Obtenir en quantité suffisante une protéine « pure »tout en préservant ses propriétés physiologiques

(structure et activité).

Purification des enzymes

Source Extraction Purification

•Dosage de la quantité produite

•Contrôle de la pureté

•Contrôle de l’activité

• Stockage

1 - Obtention de la source de la protéine : biopsie d’organes, collecte de plantes, cultures de cellules, ...

2 - Lyse des cellules : lyse mécanique, lyse chimique ou biochimique.

3 - Séparation des composants insolubles : centrifugation ou filtration.

Extraction

Origine de l ’enzyme

animale végétale microbienne

broyage intracellulaire extracellulaire

centrifugation / filtrationbroyage cellulaire

UF / diafiltration

cellules surnageantnon mécaniquemécanique

élimination des acides nucléiques

Techniques basées sur les propriétés de solubilité

Dénaturation thermique

Précipitation par ajout de sels

Ajout de solvant

Procédés membranaires

Les méthodes de chromatographie

Techniques de purification

Procédé Membrane Force motrice

Filtration poreuse gradient de pression

hydrostatique

Ultrafiltration poreuse gradient de pression

hydrostatique

Osmose inverse non poreuse gradient de pression

hydrostatique

Dialyse poreuse gradient de potentiel

chimique

Electrodialyse poreuse différence de potentiel

électrostatique

Les procédés membranaires

Propriétés des protéines

Hydrophobicité ActivitéCharge

échange d’ionshydrophobe

Taille

exclusion affinité

Méthodes de chromatographie

Principales méthodes de purification des protéines par chromatographie

1 - Le gène de la protéine n’est pas cloné : seules les méthodes classiques de purification peuvent être utilisées.

2 - Le gène de la protéine est cloné : les méthodes classiques peuvent être utilisées mais aussi le gène de la protéine peut être modifié de telle sorte que la protéine soit exprimée sous forme de protéine de fusion.

Protéine naturelle et protéine de fusion

Protéine

ATG TGA

Gène de la protéine

Protéine de fusion

TGAATG

Gène de la protéine de fusion

Ajout de la séquence d’ADN codant pour lecomplément de fusion

Protéine de fusion

•Dialyse, diafiltration

•Concentration

•Détermination de la quantité de protéine

•Évaluation de la pureté

•Mesure de l’activité

•Stockage : conserver une protéine tout en préservant son activité (sous forme lyophilisée,conservation à 4°C, à -20°C, à -70°C, ajout dans le tampon de stockage de composés qui stabilisent la protéine (polyols, sels, agents réducteurs, ...)).

Fin de la purification

Introduction

Méthodes d’immobilisation– inclusion– adsorption– liaison covalente– Réticulation

Conséquences de l’immobilisation

Immobilisation des enzymes

Résolution du mélange racémique D-L-méthionine par l’acylase (procédé Tanabe, Japon)

0

100

60

80

40

20

Coût

rel

atif

(%)

Procédé discontinu conventionnel

substrat

enzyme

travailénergie

40 % de gain

support

Procédé continu àenzyme immobilisée

Intérêt d’immobiliser les enzymes

Les enzymes sont retenues à l’intérieur d’une matrice poreuse

EE

E

E E

EE

Inclusion dans un gel

E

E

E

E

Inclusion dans une fibre

EE

E

EE

E

EE

E

Inclusion dans une micro-capsule

L’inclusion

SubstratE E

EEE

EE

Membranes avec seuil de coupure de 500 à300.000 Da choisi tel que...

Produits

Produits

Système intéressant pour hydrolyser des macromolécules (amidon, protéines…)

Membranes semi-perméables

Les réactions de polymérisation ou de gélification sont bien maîtrisées

L’inclusion permet en une seule étape d’immobiliser la totalité de la masse d ’enzyme

Il n’existe aucun lien entre l’enzyme et le polymère : peu de risque de dénaturation

Applications à tout type d’enzymes

Les solvants utilisés et les valeurs de pH extrêmes peuvent s’avérer dénaturant.

Problèmes de diffusion au travers des gels.

Mauvaise tenue mécanique des gels.

Problèmes d’encombrement stérique.

L’inclusion

Les enzymes sont retenues à la surface d’un support insolublepar établissement d’interactions secondaires entre les groupesfonctionnels de l ’enzyme et du support.

+

Immobilisation d’enzymes par adsorption

interactions de Van der Waals :électrostatiques entre atomes ou molécules

interactions hydrophobesliaisons ioniques :

les résidus d’acides aminés basiques et acides sontionisés (+ et -) respectivement au voisinage de pH 7) d’où lapossibilité d’échange d’ions.

liaisons hydrogènes :polarisation des liaisons entre un atome d’hydrogène et

un atome plus électronégatif (O ou N)

Types d’interaction

Très grande facilité de mise en œuvre

Possibilité de régénérer le support par désorption et remplacement de l’enzyme.

- procédé Tanabe pour résolution du mélange racémique D,L méthionine par l’acylase : le support DEAE Sephadex a un prix non négligeable : même support utilisépendant 5 ans.

Risque important de désorption

Problèmes stériques

Mauvaise orientation de l’enzyme : perte d’activité

L’adsorption

X

X

XX

activation

A

A

AA

+

Immobilisation d’enzymes par liaison covalente

Il est nécessaire d’activer soit les groupements de l’enzyme, soit ceux du support :

- activation de l’enzyme : perte d’activité

- il faut donc activer le support.

Très grande solidité de la liaison enzyme-support

Grande variété de supports et de méthodes

Rigidification de la structure tridimensionnelle : meilleure stabilité

Complexité de la méthode.

Modification de la structure de l’enzyme : perte d’activité

Impossible de prévoir le rendement de greffage

Supports présentant de mauvaises propriétés mécaniques

La liaison covalente