Les enzymes « outils » du génie génétique

Complément de cours de Génie Génétique 2019/2020 L2biotech

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Le Génie Génétique

Définition

Le génie génétique est un ensemble de méthodes et de techniques permettant

• d'identifier

• d'isoler

• de cloner

• de transférer

• de modifier de manière contrôlée le matériel génétique.

I- Les outils du génie génétique

Définition du génie génétique

Les outils de base du génie génétique

Les enzymes agissant sur les acides nucléiques

Les vecteurs II- Techniques de base en génie génétique

I. Les outils du Génie Génétique

Ils permettent de travailler avec les acides nucléiques, de les modifier, de les couper, de les associer etc...

1. les nucléases (DNases et RNases)

1-1. Les DNases

Leur fonction consiste à couper l’ADN au niveau de la liaison phosphodiester, libérant deux fragments un se

terminant, généralement, par un 3’OH et l’autre par un 5’ phosphate(Toutes les DNases ont besoin d'ions

divalent. Pour les inhiber, on peut donc utiliser un chélateur d'ion divalent tel que l'EDTA. Une solution d’ADN

comportant de l’EDTA sera donc stable). On distingue les exonucléases qui digèrent l'ADN en retirant les

nucléotides à partir de l'extrémité et les endonucléases qui coupent au milieu de l’ADN.

1-1-1. Les exonucléases

exonucléase III est une 3'→5’ exonucléase, elle retire les nucléotides

d'une manière séquentielle à partir de l'extrémité 3' (à la condition

qu'elle ne soit simple brin).

T7Gene exonucléase est une 5’→ 3’ exonucléase qui a comme substrat de l’ADN double brin avec un 5’

phosphate ou un 5’OH.

T7Gene exonucléase


2

1-1-2. Les endonucléases

Les endonucléases ont diverses spécificités de substrat, certaines coupent l'ADN double brin d'autre l'ADN

simple brin enfin certaines reconnaissent et coupent au niveau de

séquences caractéristiques.

DNase I : endonucléase qui coupe l’ADN double ou simple brin.

Nucléase S1 : hydrolyse l’ADN et l’ARN simple brin.

Les endonucléases de restriction (ou enzyme de restriction) :

Les endonucléases de restriction sont des enzymes bactériennes participant à un mécanisme de défense des

bactéries vis-à-vis des virus. Pour détruire l’ADN du parasite, la bactérie exprime des gènes de restriction et de

méthylation. Les gènes de restriction permettent la synthèse d’endonucléases coupant l’ADN en des sites très

spécifiques. Afin de protéger l’ADN bactérien de l’hydrolyse par l’enzyme, une méthylase, codée par le gène de

méthylation, va modifier les nucléotides de l’ADN bactérien en les méthylant pour qu’ils ne soient plus reconnus

par l’enzyme de restriction.

L’ensemble du gène de restriction et du gène de méthylation constitue un système de défense de la bactérie vis-

à-vis des phages.

Il y a trois types d’enzymes de retriction : Le type I reconnaît une séquence d'ADN, puis se déplace, s'arrête

1000 à 5000 paires de bases plus loin et libère quelques dizaines de nucléotides

Le type II, coupe l'ADN au niveau de la séquence reconnue,

Le type III coupe une vingtaine de nucléotides plus loin que le site de reconnaissance.

Seuls les Enzymes de restriction de classe II sont utilisés en génie génétique : clivant spécifiquement les deux

brins de l' ADN au niveau d'une séquence, en général palindromique, parfaitement définie (de 4 à 8 nucléotides).

Le nom de chaque enzyme est dérivé du nom d’espèce ou de variété de la Bactérie qui la produit. On écrit

l’initiale du nom du genre, les deux initiales du nom de l’espèce, 1 lettre ou 1 nombre pour désigner la variété

(ou souche) et après un espace un chiffre romain pour désigner

l’ordre de découverte de l’enzyme chez cette souche, exemple :

EcoR I

Les enzymes de restriction sont des hydrolases, agissant sur des

liaisons esters, c’est-à-dire des estérases. Elles catalysent la

coupure de l’ADN, non méthylé en des endroits caractérisés

par une séquence spécifique de nucléotides (site de restriction formé de 4 à 8 nucléotides).

Les extrémités des fragments de restriction peuvent être formées de deux brins d’égale longueur (bouts francs)

ou bien présenter un brin plus long que l’autre de quelques nucléotides (bouts collants).

On appelle isoschizomères des enzymes qui reconnaissent et coupent la même séquence mais qui proviennent de

deux bactéries différentes.


3

EcoRV G A T A T C

EcoRI

G A A T T C

PstI C T G C A G

C T A T A G

C T T A A G

G A C G T C

5 ’ 5 ’ 3 ’

3 ’ G A T

C T A 5 ’ 3 ’ 5 ’

3 ’

A T C

T A G 5 ’

5 ’ 3 ’

3 ’

5 ’

3 ’

3 ’

5 ’ G C T T A A

5 ’

3 ’ 5 ’

3 ’ A A T T C

G

5 ’

3 ’

3 ’

5 ’

5 ’ 3 ’

3 ’ 5 ’

C T G C A

G 5 ’ 3 ’

3 ’

5 ’

G

A C G T C

5 ’

3 ’

3 ’

5 ’

5’ GCGC3’ 3’ CGCG5’

Bouts cohésifs 5’ sortant


Haemophilus aegytius HaeIII 5’GGCC3’ 3’CCGG5’

4 nucléotides Bouts francs

Thermus aquaticus TaqI 5’ TCGA3’ 3’ AGCT5’

4 nucléotides

Haemophilus haemolyticus

HhaI 4 nucléotides

Escherichia coli EcoRV 5’ GATATC3’ 3’ CTATAG5’

6 nucléotides Bouts francs

Escherichia coli EcoRI 5’ GAATTC3’ 3’ CTTAAG5’

6 nucléotides Bouts

cohésif

s 5’ sortant

Providencia stuarti PstI 5’ CTGCAG3’ 3’ GACGTC5’

6 nucléotides


Organisme d’origine Enzyme Site de restriction

Nature des extrémités

Taille du site


4

1-2. Les RNases

Ces nucléases coupent l’ARN. Quelques RNases sont utilisées en biologie moléculaire :

-RNAse A : coupe après (en 3') les résidus pyrimidiques (C, U).

-RNAse H : digère l'ARN dans un complexe ARN-ADN. On s’en sert pour éliminer l’ARN après avoir fabriqué

un premier brin de cDNA à l’aide de la reverse transcriptase.

2. Les polymérases

Toutes les polymérases synthétisent les acides nucléiques de 5' vers 3' en utilisant des nucléotides triphosphates.

2-1. Les ADN polymérases

On distingue les ADN polymérases, les reverse transcriptases et les terminal transférases

2-1-1. ADN polymérase

Elles synthétisent de l'ADN en prenant comme matrice de l'ADN. Les ADN polymérases ont besoin d'une base

déjà hybridée ou amorce.

Certaines DNA polymérase ont une activité exonucléase. L’activité 3’ → 5’ est souvent appelée activité de

correction. En effet si la polymérase fait une erreur, le dernier nucléotide n’est plus hybridé, la polymérisation

est bloquée. L’activité 3’→5’exonucléase retire le nucléotide non hybridé, la polymérisation peut continuer.

L’ADN

polymérase I de E. coli : c'est une enzyme de 109 kDa qui a une activité 5'-3' polymérase, une activité 3'-5'

exonucléase (activité de correction) et une activité 5'-3' exonucléase. Cette activité 5'-3' exonucléase de l’ADN

polymérase I est souvent gênante en biologie moléculaire. En 1970, Klenow et Henningsen ont enlevé cette

activité par protéolyse (en utilisant la subtilisine et donnant deux fragments). Le grand fragment protéique

obtenu (76 kDa) est dépourvu d'activité exonucléase 5'-3' mais garde l'activité polymérase et l'activité 3'-5'

exonuléase. Depuis le grand fragment est obtenu par expression d'un gène tronqué. C'est le fragment « Klenow »

de l’ADN polymérase I.

T4 et T7 ADN polymérases :

Elles ont les mêmes activités que la Klenow (5’-3’ polymérase et 3’-5’ exonucléase). L’activité exonucléase de

la T4 ADN polymérase est plus importante que l’activité exonucléase de la Klenow, elle sera donc préférée à la

Klenow lorsque cette activité est requise.

Les ADN polymérases thermostables

Les ADN pol thermostable ont permis l’automatisation de la réaction de polymérisation en chaine (PCR)

La Taq ADN polymérase

Elle a l’activités 5'-3' exonucléase. Son avantage est d'être thermostable. Comme elle est dépourvue d'activité 3'-

5' exonucléase, le taux d'erreurs est d'environ 10-4

par base dupliquée.

L'activité 5'-3' exonucléase a été enlevée en délétant l'extrémité N-terminal de la Taq pol.

La Taq pol possède une activité Adényl terminal transférase : elle ajoute à la de chaque élongation un seul A.

La Taq pol permet d’amplifier par PCR des frangments d’ADN jusqu’à une taille de 3000pb.

La Pfu et la Pwo DNA polymérase :Elles proviennent de Pyrococcus furiosus, bactérie découverte dans des

sources géothermiques en Italie et de Pyrococcus woesei. Elles ont les mêmes séquences et ont donc des activités

identiques. Activité 5'-3' polymérase et 3'-5' exonucléase mais pas d'activité 5'-3' exonucléase. L’activité 3'-5'

exonucléase dite correctrice permet de diminuer le taux d’erreurs à 10-6

par base dupliquée.

La Vent ADN polymérase Elle provient de Thermococcus littoralis et a les activités 5’-3’ polymérase et 3’-5’

exonucléase. Un mélange des ces dernières enzymes permet d’amplifier par PCR des fragments d’ADN de taille

allant jusqu’à 50kb.


5

2-1-2 . Les reverses transcriptases

Cette enzyme a la même activité que l’ADN polymérase ADN dépendante, mais elle fabrique un ADN à partir

d’un ARN. Elle a donc une activité 5’→3’ ADN polymérase à la suite d'une amorce hybridée sur un ARN.

L’utilisation principale de cette enzyme est la synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) à partir des ARN

messagers de cellules eucaryotes afin d’obtenir un ADNc ne comprenant que les exons.

2-1-3. Terminal transférase: Cette polymérase n'a pas besoin de matrice comme les autres polymérases, elle

ajoute des nucléotides en 3' à l'extrémité du brin d'ADN. Elle ajoute des nucléotides en 3' en présence de dNTP.

Si on veut en ajouter qu'un seul, on ajoute un ddNTP.

Utilisation : Fabrication d'une queue homopolymére pour les clonages Fabrication d'une extrémité cohésive en 3'

Enzyme Template Primer Other activities Other features

E. coli DNA pol I DNA DNA/RNA 3'-5' exo, 5'-3' exo monomeric

E. coli DNA pol

I (Klenow fragment) DNA DNA/RNA 3'-5' exo C-terminal fragment

E. coli DNA pol III DNA DNA/RNA 3'-5' exo (on a

separate subunit) multimeric structure

Taq pol DNA DNA/RNA extendase (adds 3'-A

overhangs) thermostable, used in PCR

reverse transcriptase DNA/RNA DNA/RNA (ribonuclease H) used to make cDNA

terminal transferase none required DNA will synthesize DNA in non-

templated reaction

2-2. Les ARN polymérase

L’ARN polymérase reconnaît un promoteur et synthétise un ARN complémentaire au brin en aval de ce

promoteur. La synthèse s'effectue dans le sens 5'-3' en présence de ribonucléotides.

Le gène d’intérêt cloné dans un vecteur d’expression doit donc être cloné après un promoteur spécifique pour

l’ARN polymérase présente dans la cellule hôte. On utilise trois principales ARN polymérases, la T7 ARN

polymérase, la T3 ARN polymérase et la SP6 ARN polymérase. Ces trois polymérases sont issues des phages

T7, T3 ou SP6 (exprimées chez certaines souches de E.coli qui servent de cellules hôtes) et reconnaissent

chacune un promoteur spécifique, ainsi la T7 ARN polymérase reconnaît le promoteur T7 mais pas les

promoteurs T3 ou SP6.

3) Les ligases

Elle catalyse la formation d'un pont phosphodiester entre une

extrémité 3' OH et une extrémité 5' P. Elle a besoin d'ATP et ions

divalents

T4 ADN ligase

. Elle joint de l’ADN double brin.

Utilisation : ligation d'extrémités cohésives ou d'extrémités franches. Si les deux extrémités sont

déphosphorylés, la ligation ne peut avoir lieu, par contre si une seule

est déphosphorylée, la ligation a lieu sur un des deux brins.

ADN ligase d’E. coli

Ligue des extrémités cohésives double brin d’ADN. L’ADN ligase

d’E.coli est inefficace pour joindre des extrémités franches ou pour

liguer de l’ARN. Elle utilise du NAD comme cofacteur.

T4 ARN ligase

Catalyse la jonction entre un 5' phosphate d'un ARN ou d'un ADN

simple brin avec un 3' OH (ions divalents et ATP)


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4) Les phosphatases et kinases

Phosphatases alcalines

La plus utilisée est la phosphatase alcaline bovine. Elle catalyse le retrait du phosphate en 5'. Elle a besoin de

zinc et d’un pH entre 9 et 10 pour fonctionner et est stimulée par le magnésium. Elle est thermolabile, elle peut

être inactivée par incubation à 65°C pendant une heure.

Les phosphatases alcalines sont utilisées par exemple pour déphosphoryler les vecteurs avant de liguer un insert

pour éviter sa recircularisation.

T4 polynucléotide kinase

Transfert le phosphate en γ de l'ATP sur le 5'OH de l'ADN (double ou simple brin) ou sur l'ARN. Utilisation :

marquage de l'extrémité 5' de l'ADN, marquage des oligonucléotides

5) Les méthylases

Les enzymes de restriction sont produites par des bactéries pour se protéger des phages. Pour que l’ADN

bactérien ne soit pas lui-même digéré, la bactérie produit aussi des méthylases spécifiques qui inhibent la

digestion. Ainsi EcoR I ne coupe pas GAm6

ATTC. On pourra utiliser ces méthylases pour inhiber la digestion

d’un fragment.


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II Les vecteurs de clonage & les stratégies de clonage

Un vecteur est une structure biologique capable de complexer une macromolécule et de l’intégrer spécifiquement dans une cellule vivante. C’est un transporteur capable de conduire une molécule à pénétrer dans une

cellule alors qu’elle n’est pas captée spontanément par cette cellule.

En biologie moléculaire et génie génétique, certains vecteurs sont étudiés pour faire entrer un acide

nucléique dans une cellule et permettre la réplication ou l’expression de cet acide nucléique dans la cellule qui le

reçoit.

Vecteur de clonage Taille de l'insert

Plasmide bactérien <10 Kb

Bactériophage à insertion <10 Kb

Bactériophage à remplacement 9-23 Kb

cosmides 35-45 Kb

BAC (chromosome bactérien artificiel) jusqu'à 300 Kb

YAC (chromosome artificial de levure) 0.2-2.0 Mb

Les plasmides bactériens, les bactériophages et de nombreux virus sont des vecteurs naturels permettant la

transformation de différents types de cellules hôtes. D’autres vecteurs encore plus performants ont été obtenus

artificiellement à partir de ceux-là grâce à des manipulations génétiques.

Les cellules qui sont habituellement transformées par des vecteurs contenant des fragments d’ADN, sont

destinées à permettre d’amplifier ce vecteur en même temps que leur croissance.

Caractéristiques des vecteurs:

1. réplication indépendante de l'ADN de la cellule hôte.

2. petite taille: facilité de manipulation et pour permettre l'insertion de grand fragment d'ADN étranger

3. présence de gènes de sélection: sélection des cellules hôtes qui ont intégré un vecteur.

4. présence de sites de restriction uniques localisés dans les gènes de sélection: permet de sélectionner les cellules

hôtes qui ont intégré un vecteur recombinant.

5. stabilité: maintient sans modification dans la cellule hôte, quel que soit le nombre de division.

1-Les plasmides

Ce sont des molécules d'ADN extra chromosomiques présentes naturellement dans les bactéries ainsi que chez

certains Eucaryotes inférieurs. L'ADN plasmidique est circulaire, double brin et super enroulé. La taille de ces plasmides peut varier de 2 à 200 kb. Le plasmide porte très souvent un ou plusieurs gènes de résistance à un

antibiotique (ou à une drogue), ce qui permet de repérer leur présence. Il possède une origine de réplication

indépendante de celle du/des chromosome(s) de l'hôte. Ces origines de réplication déterminent le nombre de copies

d'un même plasmide dans une cellule (peut varier de 1 à 700 copies/cellule). Les plasmides permettent de cloner des

fragments d’ADN d’une longuer maximale de 10Kb. Plasmides (naturels)

1ère génération Tailles (Kb)

Intervenant dans la conjugaison

Nombres de copies par cellules

phénotypes

R1 110 + 1 - 3 Résistance à des

antibiotiques

R6 110 + 1 - 3 Résistance à des

antibiotiques

ColE1 7 - 15 -20 Production de

colchicine

RSF1030 9,4 - 20 – 40 Résistance à l’ampicilline

Plasmides améliorés

Tailles (Kb) Intervenant dans la

conjugaison Nombres de copies par

cellules phénotypes

pBR322 (2ème génération)

4 ,36 - 15 -20 Résistance à

l’ampicilline et la tétracycline

pUC18 (3ème génération)

2,69 - 500 – 700 Résistance à

l’ampicilline+ gène de la -galactosidase

Limite des vecteurs plasmidiques:

- faible taille de l'insert: max 8 à 10 kb

- Pénétration du plasmide non-spontanée.


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1-1. Le pBR322

Le plasmide pBR322 est un ADN circulaire

double brin de 4361 paires de bases. Par convention le

nucléotide n°1 est situé au milieu du site de restriction

EcoR I en direction du gène tetr

.

Il contient une origine de réplication (2535),

un gène de résistance à la tétracycline (tetr

861276) et

un gène de résistance à l’ampicilline (ampr

4153-3293).

Le gène ampr

code pour une protéine (β-lactamase) de

286 acides aminés capable de cataboliser cet

antibiotique.

Le plasmide contient de nombreux sites de

restriction répartis sur toute la séquence. Beaucoup de

ces sites sont uniques, permettant de transformer l’ADN circulaire en ADN linéaire. Exemple, le site

BamH I (position 375) au début du gène tetr

.

1-2. Les pUC

Les plasmides pUC18 et pUC19 sont des ADN circulaires double brin de 2686 paires de bases (pb). Ils ont

été construits par recombinaison d’un fragment de pBR322

(2250 pb) et d’un fragment du phage M13 double brin (446

pb).

L’ADN issu de pBR322 contient le gène ampr

qui

permet la sélection par la résistance à l’ampicilline.

L’ADN issu de M13 contient le promoteur du gène lacZ

suivi d’une séquence modifiée comprenant un polylinker

(site multiple de clonage) et la séquence de la partie NH2 terminale du gène de la β-galactosidase. Cette séquence est

indispensable pour que la bactérie hôte puisse avoir

l’activité -galactosidase (phénomène d’α-

complémentation).

1-3 Les plasmides d’expression procaryote:

Comprend :

• Promoteur (constitutif ou inductible)

• Site de fixation des ribosomes

• Polylinker / Multiple cloning site (MCS)

• Signal de terminaison de transcription

• Séquence Tag (pour la purification)

• Codon Stop

• Origine de réplication dans les bactéries

• Gène de résistance à un antibiotique (marqueur de

sélection)


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Stratégie de clonage pour les plasmides pBR322 et pUC18


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2- Les virus

Le bactériophage lambda

Le bactériophage lambda, virus infectant E.coli,

(48,5 kb pour le bactériophage λ sauvage)

présente un génome sous la forme ADN double

brin linéaire avec à ses deux extrémités 12

nucléotides simple brin complémentaires

(extrémité cohésives ou cos).

A l'entrée dans la bactérie, les extrémités cohésives s'hybrident et l'ADN est lié par une ligase d'E. coli. Là,

il y a deux possibilités soit un cycle lysogénique avec intégration de l'ADN du phage dans le génome soit un cycle

lytique.

Dans les bactériophages utilisés comme vecteur de clonage, seul le cycle lytique est important. La

partie centrale du génome, contenant les gènes nécessaires au cycle lysogène sera donc délétée et remplacée par

l'ADN à cloner, qui pourra alors être amplifié lors du cycle lytique du bactériophage.

La seule limitation de ce système réside dans la longueur du fragment qui peut être introduit dans le phage. La taille

totale de l'ADN recombinant obtenu doit être comprise entre 85% et 105 % de la taille du génome originel afin que

l'encapsidation (assemblage du génome et de l'enveloppe du phage ou "capside") de cet ADN soit possible et que le

cycle lytique puisse se produire. Les bactériophages peuvent ainsi porter des fragments de 13 à 23kb environ.


11

Stratégie de clonage moyennant le phage lambda comme vecteur


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3. Systèmes hybrides

Parmi les 2 types de vecteurs étudiés, les plasmides sont faciles à manipuler et le phage λ permet une transformation efficace des bactéries. Des systèmes hybrides ont été réalisés à partir de ces 2 vecteurs :

3-1. Plasmide + phage λ = cosmide : Ce sont

des vecteurs hybrides portant à la fois :

-> des séquences d'origine phagique permettant

leur encapsidation in vitro (séquences cos)

-> des séquences d'origine plasmidique : gène

de résistance à un antibiotique et une origine de

réplication permettant au plasmide de se

répliquer dans une bactérie comme un simple

plasmide (séquence ori). Ceci permet de se dispenser des régions

essentielles de l'ADN du phage et de construire

des ADN recombinants portant jusqu'à 45 kb

d'ADN étranger. Cet ADN pourra être

encapsidé in vitro dans le phage λ. Il pourra

donc être introduit avec une grande efficacité

dans la bactérie. Par contre une fois à l'intérieur,

il se répliquera comme un plasmide. Les

extrémités cos permettent donc de sélectionner

les recombinants avec de grands inserts (45 kb)

et à introduire le plasmide dans la bactérie.

Stratégie de clonage moyennant le cosmide comme vecteur


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4. les chromosomes artificiels

4-1. Les YAC (Yeast Artificial Chromosome)

Le YAC ou chromosome artificiel de levure

(Yeast Artificial Chromosome).

Les YAC permettent de cloner de 150 à 1 000 kb

de fragments d’ADN. Le génome de la levure

Saccharomyces cerevisiae est constitué de 16

chromosomes de taille comprise entre 250 et 2

000 kb. Chez la levure, trois régions

chromosomiques sont importantes pour sa

réplication. Les séquences télomériques (Tel),

centromériques (CEN), et une séquence ARS

(Autonomous Replicating Sequence). On a donc construit des chromosomes artificiels

contenant ces régions essentielles et du DNA que

l’on désire cloner. La taille du DNA cloné peut

donc atteindre de 1 000 à 2 000 kb. Les YAC

n'exigent que les cellules de levures comme hôtes.

4-2 Les BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

ont pour base le facteur sexuel F de Escherichia

coli. Ce facteur peut contenir de grands fragments

d'ADN. Les BAC peuvent incorporer des inserts

d'ADN étranger pouvant atteindre 300 kb. Le

plasmide F porte des gènes qui sont essentiels pour réguler sa propre réplication et pour contrôler aussi

le nombre

de copies du plasmide F. Le plasmide F a aussi la

capacité de s'intégrer dans le chromosome

bactérien et de s'en exciser. Un plasmide qui a

cette capacité est appelé un épisome.

Les gènes oriS et repE régissent la réplication

unidirectionnelle du plasmide tandis

que les gènes parA et parB maintiennent le

nombre de copies de celui-ci à 1 à 2

copies par cellule. Le vecteur BAC11 porte ces gènes essentiels ainsi

qu'un gène de résistance au chloramphénicol et

la portion lacZa du gène b-galactosidase avec 2 sites de

restriction HindIII et BamHI qui permettent le

clonage de fragments d'ADN étranger

4-3. Les PAC (P1 Artificial Chromosome)

Mise au point dans les années 1990 un vecteur

dérivé du bactériophage P1. Le vecteur PAC1

permet de cloner des fragments qui ont une taille

de 75 à 100 kb avec une efficacité qui est intermédiaire entre celle des cosmides et celle

des YACs.


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LES BANQUES GÉNOMIQUES

La restrictionde l’ADN tout entier d’une cellule et son introduction dans des vecteurs

Construire une banque génomique consiste à fragmenter l’ADN tout entier d’une cellule et à introduire chaque fragment dans un vecteur, puis dans un hôte approprié. Si la banque est correctement établie, elle contiendra, sous

une forme morcelée, l’ensemble de l’information d’un individu telle qu’elle existe dans son génome, d’où le terme

de banque génomique.

Une banque génomique ne sera représentative que si elle contient, au moins une fois, l’ensemble des séquences du

génome. Il est donc évident que plus les inserts seront longs, plus faible sera le nombre des clones nécessaires. Une

formule statistique permettant de déterminer le nombre de clones nécessaires, compte tenu de la longueur des inserts.

Cette formule, qui dérive de la loi de Poisson est :

log ( 1-P )

N =- --------------

log ( 1-1/n)

P = Probabilité de présence d’une séquence donnée n = ( longueur du génome ) / ( longueur moyenne des fragments insérés ).

Probabilité de présence Longueur de l’insert en(kb)

d’une séquence donnée 15 20 30 35 40

0,99 860 640 430 370 320

0,95 560 415 280 240 210

0,90 430 320 215 185 160

0,80 300 225 150 130 115

Nombre de clones (en milliers) que doit contenir une banque génomique pour être représentative d’un génome

Humain.

Etablissement d’une banque génomique.

Les différentes étapes principales sont les suivantes :

· Extraction de l’ADN nucléaire

· Digestion du génome avec des enzymes de restriction

· Insertion des fragments d’ADN dans des vecteurs.

· Ligature avec l’ADN ligase

· Transformation (avec des plasmides) ou infection (avec phages) des bactéries

· Culture des bactéries sur des milieux sélectifs

LES BANQUES D’ADNc

L’ADN complémentaire (ADNc) est la copie sous forme d’ADN d’un ARN messager (ARNm). Un banque de cDNA doit contenir au moins une copie de tous les ARNm présents dans la cellule. Ces banques sont essentiellement

tissulaires puisqu’une cellule d’un tissu donné ne possède pas tous les ARN messagers de l’individu, mais ceux dont

l’état de différentiation cellulaire permet la transcription. Le processus de formation de l’ADNc comprend deux

étapes:

1 - L’isolement de l’ARN poly A+ (poly adénine):

2 - Le passage de l’ARN à l’ADN

Cette étape est toujours réalisée grâce à la transcriptase reverse isolée d’un

rétrovirus. Plusieurs techniques sont utilisées pour la préparation de l’ADNc :

La technique « copie entière » par addition de queues uniformes « tailing»

Après la synthèse du premier brin de cDNA par la reverse transcriptase en présence d’un oligod(T), une queue poly

d© est créée à l’extrémité 3’ par la terminal transférase en présence dedCTP. Un poly d(G) synthétique est alors

utilisé pour s’hybrider à la queue poly dC et servir d’amorce pour la synthèse du brin complémentaire. La technique « copie entière » par cassure à la RNase H.

Le début de l’opération est identique aux techniques précédentes. Après la synthèse du premier brin par la reverse

transcriptase, le brin de RNA est coupé en plusieurs endroits par la RNase H. Les courts fragment d’ARN servent

alors

d’amorce pour la DNA polymérase I qui synthétise le brin d’ADN par son activité polymérasique 5’ → 3’ et détruit

les restes d’ARN par son activité exonucléasique 3’→ 5’.

La technique du multi-amorçage au hasard : Cette méthode utilise la technique

de synthèse de l’ADNc utilisant un multi-amorçage au hasard avec des oligonucléotides de 6 à 10 nucléotides de

long : « Random primer ». la suite est identique à la méthode par la RNase H. La PCR : Cette technique permet

d’amplifier par la suite l’ADNc.


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III LES TECHNIQUES DE MANIPULATION DES ACIDES NUCLEIQUES

I - Purification des acides nucléiques

Les méthodes d'extraction des acides nucléiques peuvent se classer en trois principales classes en fonction du

principe auquel elles font appel : les méthodes utilisant des solvants organiques, les méthodes utilisant des solvants

non organiques, les méthodes basées sur l'utilisation de microcolonnes de résines échangeuses d'ions.

Nous détaillerons la méthode de base la plus utilisée à savoir celle utilisant l’extraction au phénol chloroforme après

un traitement avec un détergeant / protéinase K

Préparation de l’échantillon suivie par un traitement détergeant/protéinase K

Pour l’extraction d’ADN à partir du sang, les globules rouges du sang (anucléés) sont lysés par choc osmotique en le

mélangeant à une solution hypotonique. Les globules blancs nucléés sont récupérés par centrifugation.

Pour les extractions d’ADN à partir des tissus, une étape préliminaire de broyage suivie d’une homogénéisation est

nécessaire.

Les globules blancs pour l’extraction d’ADN à partir du sang et L’homogénat pour l’extraction d’ADN à partir de

tissus sont resuspendus dans une solution de lyse contenant du détergent : laurylsulfate de Sodium (SDS) avec la

protéinase K, pour détruire les protéines et en présence d’EDTA qui inhibent les nucléases.

Extraction au phénol chloroforme

La solution d’acides nucléiques et de protéines issues des préparations précédentes sont purifiées par addition d’un

même volume de phénol saturé de tampon Tris-EDTA afin d’extraire les protéines. Après agitation douce du

mélange, on sépare les phases par une centrifugation de 10 min sous 10000 g à la température de 4°C. A la sortie, on

distingue une phase aqueuse surnageante contenant les acides nucléiques en solution, une phase organique au fond

du tube : phénol + lipides et à l’interface un « gateau » de protéines précipitées.

On recueille la phase aqueuse avant de la laver par un mélange de chloroforme (CHCl3) etd’alcool isoamylique dans

un rapport 24:1 (v:v). Après, agitation douce du mélange et une centrifugation de 10 min sous 10000 g à la

température de 4°C, on obtient une phase aqueuse contenant l’ADN en solution et une phase organique (24:1)

contenant des restes de phénol, de protéines et de lipides. On recueille à nouveau la phase aqueuse.

Précipitation et lavage de l’ADN

La purification d’une solution d’ADN se fait le plus souvent par précipitations répétées dansl’alcool.• Une solution

d’ADN, portée à haute force ionique par addition de NaCl 3 M (1/10 du volume), est additionnée d’un large excès

d’éthanol absolu (2V) à -20°C. Au bout de quelques minutes, on voit apparaître un précipité blanchâtre, translucide

et filamenteux (la méduse d’ADN) constitué de longs filaments d’ADN précipité. On recueille ce précipité par

centrifugation à 10000 g pendant un quart d’heure environ. Pour laver l’ADN on resuspend le précipité dans de

l’éthanol à 70 % toujours à -20°C. Puis on centrifuge à nouveau. Le culot de cette dernière centrifugation est égoutté,

puis séché sous vide.

Redissolution et conservation de l’ADN

L’ADN est dissout immédiatement soit dans de l’eau pure stérile pour une utilisation immédiate, soit dans un tampon

Tris-EDTA 10 :1mM et conserver au froid -20°C, -80°C voire -173°C.


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II - Détection et dosage des acides nucléiques

On peut doser des solutions d'acides nucléiques purs en mesurant leur absorbance en UV à 260nm. Une DO

de 1 correspond approximativement à 50µg/ml d'ADN double brin et 40µg/ml d'ARN et 33 µg/ml d'ADN simple

brin.

On peut également avoir une information quant à la pureté de l'échantillon testé. En effet, l'ADN absorbe environ 1,8

fois moins à 280nm qu'à 260nm (A260/A280=1,8). La présence de protéines (les acides aminés aromatiques

absorbent à 280nm) dans l'échantillon entraîne une diminution de ce rapport.

Il est également possible de détecter les acides nucléiques par marquage radioactif ou par incorporation de

Bromure d'Ethidium après électrophorèse.

III - Electrophorèse des acides nucléiques

Comme pour les protéines, il est possible de séparer en fonction de leur taille et leur forme les acides

nucléiques par électrophorèse. Le principe consiste à faire migrer les molécules dans un gel sous l'action d'un champ

électrique. A pH neutre ou basique, les acides nucléiques sont chargés négativement et migrent vers l'anode.

Deux types de gels sont utilisés en fonction de la taille relative des molécules que l'on veut séparer : gel

d'agarose et gel de polyacrylamide. La résolution des gels d'acrylamide est nettement supérieure à celle des gels

d'agarose On utilisera par exemple un gel d'acrylamide pour séparer deux molécules de tailles très proche. Par contre,

si l'on veut analyser un ensemble de molécules très différentes en tailles on choisira un gel d'agarose.

Les acides nucléiques peuvent être détectés à l'intérieur du gel par incorporation de BET (Bromure

d'Ethidium). Cette molécule est un intercalant des acides nucléiques qui émet une fluorescence sous UV. Le

rendement e fluorescence augmente lorsqu'ils sont intercalés entre les plateaux de bases de l'ADN. L'intensité de la

fluorescence est

proportionnelle à la quantité

d'ADN. Cette technique

permet de détecter jusqu'à

1ng d'ADN. Pour des

quantités plus faibles, on

utilise le marquage à la

radioactivité.


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PCR (Polymerase Chain Reaction)

DEFINITION

C’est une réaction enzymatique qui permet d’amplifier sélectivement en une très grande quantité un fragment

d’ADN spécifique, qui peut être présent en très faible quantité au départ, parmi des millions d’autres fragments.

PRINCIPE

La PCR est une suite de cycles, qui se répètent en boucle, comportant chacun trois paliers de température. De plus,

chacun de ces paliers est caractérisé pas une réaction chimique distincte. En moyenne une PCR comporte entre 20 et

40 cycles.

Chaque cycle est donc constitué de trois étapes différentes:

1 Dénaturation

2 Hybridation

3 Elongation

1° La dénaturation:

Se fait à 95°C (92°C à 98°C) durant 15 s à 30 s. l’ADN se

dénature.

En effet, l’ADN perd sa structure caractéristique en double

hélice, les liaisons hydrogène reliant les bases de chaque brin

d’ADN étant instables à cette température. L’ADN double-

brin (2 brins) est dénaturé en ADN simple brin (1 brin).

2° L’hybridation:

La température d’hybridation est généralement comprise entre 40°C et 70°C et elle est fonction de la composition en

désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces.

Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences

complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On dit que les

amorces s’hybrident au brin d’ADN.

3° L’élongation:

Puis la température est réglée à 72°C, température idéale pour l’activité de la Taq polymérase.

Cette étape permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin

complémentaire à l’ADN matrice, grâce aux dNTPs libres présents dans

le milieu réactionnel.

Au cycle suivant, les nouveaux fragments synthétisés servent à leur tour

de matrice pour la synthèse de nouveaux fragments d’ADN.

En théorie, à la fin de chaque cycle le nombre d’ADN cible est doublée. Le premier cycle est fini et voilà qu’un nouveau cycle recommence. Cela se reproduira 30 fois (en fonction du

protocole de PCR) comme vous pouvez le voir sur le schéma.

A partir d’une copie d’ADN cible, on pourra donc obtenir 1 milliard de copie d’ADN cible.

Les enzymes « outils » du génie génétique

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