microbiologie yaourt

8/2/2019 microbiologie yaourt

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I E PR EUVE PRAT IQUE D E M IC ROBIO LOGIES uje t p ro pos e p ar M esd ames 1. ETIENNE , B . SAlL ENet M essieurs F. D UC AN CEl, F. G OM El, D . lO NC lE

Les bacteries du yaourt

Cadre de l'Studele yaourt est un produit la itie r ferments dont l'e laboratlon met en jeu deux bacteriesLadobac illu s d e/b ru eckii su bs p. b u/g aric us (denomrne lB par la su ite) e t Streptococcussa/ivarius , subsp. thermoph i/us (denomme S T par la su ite).Ces deux bacterles homofermenta ires effectuent une fermentation du lac tose en ac idelactique, ce qui abaisse Ie pH du lait au pH lsoelec trique (4,6) de la caselne, de fac;on aform er un gel ou coagulum .Outre Ie gout acldu le qu 'ils donnent au gel, ces ferm ents lac tiques lu i assurent une saveurc ara cte ns tiq ue due a la p ro du ctio n d e c omp os es a romatiq ue s.les deux bactenes, surtout les lac tobacilles, ont une aeroto lerance llm itee et sont tresauxotrophes. E n particulier, elles couvrent leurs besoins nutrition nels en utilisant des ac idesam ln es Iib re s e t d es pe ptid es.C eux-c i sont presents en fa ib le quantlte dans Ie la it. les deux especes possedent cependantdes proteases de surface qui leur perm ettent d 'en Iiberer a p artir d e la ca se ln e.lors de la transformation du la it en yaourt, il ex iste un phenomena de protocooperatlonentre les deux especes : chacune stim ule la croissance de I'autre .Apres ensemencement, Ie pH du la it e tant favorable au streptocoque, ce lui-c i assure Iedepart de la ferm entation lactique en consomm ant les peptides presents.II produit entre autres de I'ac ide form ique qui stim ule Ie developpernent du lactobac ille .Ce dern ier se developpe plus lentem ent et, par son activ ite proteo lvtlque plus im portante,libere des peptides, ce qui perm et au streptocoque de poursu ivre sa croissance.Enfin, l'addlte du m ilieu devenant defavorable au streptocoque, ce lu i-c i est re laye par Iela cto ba cille q ui p ou rs uit s on a ctiv lte fe rme nta ire .

D ans la partie A , on se propose de suivre et de com parer differentes cu ltures en lait dans Iebut de predser certa ins aspects de la physiologie de ces deux bactertes et de leurprotocooperation.Dans la partie B , on prec isera quantitativem ent I'evo lution des popula tions m icrob ienneslo rs d e l 'elaboratton d 'u n yaourt.E nfin , dans la partie C , on e tu dle ra diffe ren ts p arametre s ph ysico ch im iq ue s de la c ro is sa ncedans Ie but de cultiver selectlvernent chacune des deux especes,

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I TRAVAIL DU PREM IER JO URA- SuM s de differentes cultures en la it

Dans Ie but de m ettre en evidence une protocooperatlon entre les deux especes ST et LB au cours dela croissance en lait, on se propose de com parer une culture m ixte ensem encee avec ST et LB a descultu res p ures de s memes so uch es .On slnteresse egalement a un mutant de la souche ST, note STPR, dont Ie gene codant la proteaseparie tale PrtS a ete inactive par recom binaison hom ologue. On com parera la cu lture de la souchesauvage ST en la it a celles de la souche mutante, d'une part en lait, notee STPR , et d 'autre part enlait su pp lem en te en hy dro lys at acide d e ca sein e (cas am ino acide s), no tee S TPR-A A.Les differentes cultures pures ont ete inoculees avec la rnerne q ua ntite de bactertes. Dans Ie cas de laculture m ixte, la concentration totale en bactenes est identique a celie des cultures pures, chaquee sp ec e e ta nt p re se nts e n p ro po rtio ns id en tiq ue s.T outes les cultures ont ete ensem encees a llhO O (to) et incubees a 42C en bain therm ostate. E llesdoivent etre repartles des Ie debut des m anipulations en plusieurs volum es aliquotes correspondantsaux differents tem ps de "prelevernents" des e tu de s.Le s crois san ce s de s differen te s cu ltu re s so nt s uiv ie s pa r :- m esure du pH : Ie pH est evalue en utilisant deux ind icateurs colores en m ilieu liqu ide. Les te inteso bte nu es s on t comparees a 2 gammes de pH fournies.- mesure de I'activ ite proteo lvtlque : les peptides non addopredpltables sont doses para bs orptlorne trie ap re s re action a ve c Ie re acnf de F olin .- exam en m icroscopique : les varia tions m orpholog iques des bactenes sont observees apres co lo rat iona u b leu de methy len e.- un denom brernent se lectif de chaque espece est etfectue pour Ie tem ps t=Sh30 de la culture m ixte :cette m an ipu latio n s era decrlte en partie B .L e ta ble au s yn op sis ci-de ss ous pres en te de manie re s vn the nq ue le s d iffe re nte s op eration s a realiser,Cultures Mixte LB ST STPR STPR-AAMilie u d e c ultu re lait la it lait la it lait+casaminoacidesPrelevementst=Oh ( =to ) QUI (fourni) / / / /

Repartir en volumes aliquotes les cultures foumiest=2h QUI QU I QU I QU I QU It=3h QUI / / I It=3h30 QUI / I I It=4h QUI QU I QU I QU I QU It=4h30 QUI / I I /t=Sh QUI / I / It=Sh30 QUI QU I QU I QU I QU ITestsM esure du pH QUI QU I QU I QU I QU IAc tiv ite p roteo ly t ique QUI QU I QU I QU I /Examen mi croscop ique QUI I I I IDenornbrement a t=Sh30 QUI I I I ILe lait est du la it ecrem e a 1 0% s terile; les ca samin oa cid es s on t e jou te s a 0,3%.

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Cultures- Un tube de 15 mL contenant 12 mL de culture "Mixtl!!' ensernence a to et place a 42C- U n m icrotube contenant 1,2 m L de prelevernent to d e c ultu re m ix te "Mixte to" (d an s la g la ce )- 4 tubes de 15 m L contenant 4 m L de cultures pures respectivem ent : "ST" , "LB", et "STPR" et "STPR-AA"Reactifs- 1 flacon de 20 mL de rouge de methyle : "RMmesure"- 1 flacon de 20 mL de vert de bromocresol : ' 'VBC mesure"- gammes de pH avec RM e t a ve c VBC en seml-mkrocuves- 1 flacon de 15 mL d'acide tncnloracettque a 0,5 rno l/t, : "ATC A 0,5 M "- 1 flacon de 15 mL de NaOH a 0,5 rno l/; : "NaOH 0,5 M "- 1 m icrotube jaune contenant 1,2 mL de reactif de Folin : "Folin"- 1 flacon de 20 m L d'eau disti l lee sterile-1flacon de bleu de m ethyleneMateriels spkifiques- 1 flotteur en polystyrene avec des microtubes steriles de 1,5mL : 8 bleus, 3 jaunes, 3 rouges,3 verts et 3 incolores- 1 b ain tn errn os ta te a 42C- tu be s a hemolvse- 4 0 sem i-mic ro cu ve s- pa ra fi lm

ManipulationsAl Organisation des prelevementsAll Repartitions des cultures fourniesCulture "Mixte" : Homoqenelser en limitant au maximum l'aeration de la culture. Distribuer 1,2 mL (2 fots 600 IJL a I'aide d'une P1000) de culture fournie dans 8 microtubes

stenles bJeus. Incuber a 42C au bain thermostats sur Ie flotteur fourni.(Le microtube de prelevernent to est fourni dans la glace. II contient 1,2 mL de culture prelevee at=Oh.)Cultures pures : "LB", "ST", "STPR", "STPR-AA" : Hornoqenetser en limitant au maximum l'aeration de la culture. Distribuer 1,2 mL de chaque culture fournie dans 3 microtubes stenles, Choisir une couleur de

microtubes par culture. Incuber au bain tnermostate a 42C sur Ie flotteur fourni.A12 Realisation et traitement des prelevements A chacun des temps definis dans Ie tableau synopsis precedent, placer dans la glace un microtube

contenant 1,2 mL de culture. Noter I'aspect et la consistance de la culture. Doubler Ie prelevement au temps t=5h30 de la culture mixte. Realiser pour chaque prelevernent les tests indiques dans Ie tableau synopsis en mettant en

oeuvre les protocoles indiques en A2.A2 ProtocolesA2l Mesure du pHGammesVous disposez de deux gammes de pH realisees en milieu tarnponne et couvrant les pH suivants :4,6 - 4,8 - 5,0 - 5,2 - 5,4 - 5,6 - 5,8 - 6,0 - 6,2 - 6,4.L'une a ete obtenue par ajout de rouge de methyle (RM), I'autre par ajout de vert de bromocresol(VBC) .Les concentrations finales en indicateurs colores sont identiques a celles utili sees pour les mesures.


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Mesures Hornoqenelser v ig o ur eu semen t Ie p re le vement. Deposer dans deux sem i-m icrocuves 700 IJL de "RM mesure" d 'une part e t 700 IJL de "VBC

mes ure " d 'a utre p art. A jouter 50 IJL de pre levement de culture dans chaque cuve. Obtu re r avec du parafilm ethornoqenetser pa r r et ou rnemen t. Evaluer la va leur du pH de la culture en com parant la co lora tion obtenue a celles de la gam me depH co rrespondante.A22 Examen microscopique:/(Montrer a un examinateur les examens microscopiques effectues aux temps t4 t2h,t3h3D, et t5h30, ainsi que les compte-rendus correspondants. H ornoqenelser vigoureusem ent Ie prelevernent, Dessiner au dos d 'une lame de m icroscope 1 carre de 1 cm 2 de su rf ac e. E ffec tuer les d ilu tions su ivan tes en tube a hem olys e en ea u d istillee s terile :

- 1 /10 eme a p artir d e t= 2h ,- 1 /20 eme a p artir d e t= 5h .

Deposer 10 IJL d e suspens ion et eta le r a I'a ide du cone sur la su rface de 1 cm 2 secher Ie fro ttis en Ie chau ffant au de ssus du bec ele ctriqu e. Colo re r au bleu de m ethylene pendant 2 m inu tes. R ince r doucem ent a I 'eau disti llee. secher Ie fro ttis co lore en Ie chau ffant au dessus du bee electnque. O bserver a I'o b je ctif 1 00 a immersion. Pour 5 cham ps m icroscopiques, estim er les nom bres m oyens de cellu les par cha 'inette , pour les

c oq ue s e t p ou r le s b acille s. O bs erv er la m o rp ho lo gie d es c ellu le s.A23 Mesure de I'activit!! proteolvtique.Toutes les centrifugations seront effectuees a vitesse maximale et a temperatureambiante. Hom oqenelser vigoureusem ent Ie prelevement, S i Ie m ilieu est coaqule, cen trifuge r pendant 1 m inute et effec tuer la su ite des operations sur Ie

surnageant . Dans un m icrotube, deposer : - 500 IJL de pre levement (ou de son surnageant)- 5 00 IJL d 'A TC A a 0 ,5 m o l/L

Centrifuger 2 m inutes. P re leve r 2 00 IJL d e surnagean t et les deposer dans une sem i-m icrocuve. A jouter 500 IJL de NaOH a 0,5 m ol/L , pu is 50 IJL d e reactlf de Folin . O bturer la sem i-m icrocuve avec du parafilm e t hom oqene lser par retournem ent. Incuber 5 m inutes a tem perature am biante et lire imm edia tem en t I'a bsorba nce a 750 nm centred e I'e au .:/(Effectuer la lecture des absorbances en presence d'un examinateur.Compte-rendu1. P our chaque culture, fourn ir les resulta ts des d ifferen ts tes ts au cours du tem ps sous form e d 'un

tableau.2 . Pour les observa tions m icroscopiques de la culture m ixte, p resen ter dans un tableau, sur unes eu le p ag e, le s s ch emes d 'o bs erv atio n le ge nd es e t commentes,3. Tracer sur un rne rne graphe l'evo lu tion du pH en fonction du tem ps pour les 5 cultures.4. D 'apres vos resulta ts , la m esure du pH constitue-t-e lle un bon ind icateu r de la cro issance?5 . T racer sur un rnem e graphe l'evo lu tion de I'activ ite p roteo lytique en fonction du tem ps pour les 4

cultures.6 . E xp lic ite r Ie p rin cip e d e la d ete rm in atio n d e l'a ctlv lte p ro te olv nq ue .

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7. Pour la cu lture m ixte , a que l temps et pour queUe va leur de pH observe-t-on Ie debut deco ag ula tio n d u la it? C ommen te r.8. P our la cultu re m ixte, ana lyser les resu ltats obtenus :

- en m etta nt e n re la tio n le s diffe re nts te sts,- en les com parant avec ceux des deux cu ltures pures en lait des souches non rnutees.L es d isc ute r d an s u ne p ers pe ctiv e d e protocooperatlon,9. C om parer et analyser les resu lta ts des cu ltu res ST , S TP R e t ST PR -M .10. L 'acide lactique est un acide fa ib le de pK a ega l a 3,86 et de m asse m ola ire egale a 90 g/m ol.L e re su ltat o bten u p ou r Ie pH ap re s coa gu latio n e st-il co here nt a ve c la ten eur en acide lactiq ue

exigee pour un yaourt : au moins 0 ,8% (m /v) ?L e pH dune so lu tio n d'acide faib le p eot e tre a ppro xim e pa r la fo rm ule p H = Y2x (pKa -log c).8- Quantification de populations bacteriennesOn s e p ro po se d e s uiv re l'e vo lu tlo n d es p op ula tio ns bactertennes dans la cu lture m ixte :

- d 'u ne pa rt en qu antifian t les pre cultu re s a yan t se rv i a I'in ocu la tio n de cette cu ltu re ,- d 'a utre pa rt e n d eterm in an t les po pu latio ns d e ch aq ue e sp ece a pres 5 h3 0 de cultu re.Dans ce but, on rea lise des denom brem ents se lectifs sur m ilieu M 17-Lac et sur m ilieu M RS-Lac-pH 5 ,2 , dont les com positions sont donnees en Annexe 1. Ces denornbrements s on t re alis es se lo n latechn ique "en goutte " qu i perm et de com pter jusqu 'a environ 70 colon ies par goutte de 10 !J,L .Cultures- Un tube de 15 mL contena nt 4 mL de preculture "starter ST" (dans la glace)- Un tube de 15 mL contena nt 4 mL de preculture "starter LB" (dans la glace)Milieux etreactifs- 3 geloses M RS -lac-pH 5 .2 secnes n otees"M RS "- 3 geloses M 17-lac seches notees "M17"- 18 tubes de 13,5 mL d 'eau phys io log ique s te ril eMateriels specJflques- 18 pipettes graduees de 2 mL- 1 svsteme d'aspiration- 2 e nve lo pp es p la stiq ue s G EN ba g- 2 sa chets g ene ra te urs G EN bag a naer- 2 b an de le tte s in dic atric es d 'a na ero blo se

Manipulations81 Protocole de denombrementPour c ha qu e denombrernent, 3 dilu tion s son t testees en d ou ble essa i. C es d ilutio ns so nt rea lisee s au1/10 em e en sene sous un vo lum e fina l de 15 m L, en utilisan t des p ipettes sternes de 2 mL.

*Realiser une dilution devant un examinateur.S ix depO ts en gouttes de 10 !J,L sont rea lises sur une boite , se lon Ie schema de depot fourni enA nne xe 2 . Deposer les 10!J,L dellcaternent a la surface de la ge lose en pra tiquant un pipe tage en modein ve rs e, d on t la te ch niq ue e st rappelee en Annexe 3 . Faire secher les bo ites apres depO t. P lacer 3 bo ites dans chacune des 2 enveloppes p lastiques G ENbag fourn ies. EUes devront etretmperativernent in cubes a I'e n ve rs . A jou ter dans chaque enveloppe un sachet genera teur GENbag anaer et un indicateurd 'a na ero blo se ; fe rme r immedia temen t I'e nv elo pp e h erme tlq ue rn en t, P lacer I'ensem ble des bo ites dans I'etuve a 42C pendant 48 heures.

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B2 Denombrements realisesB21 Precultures ST et LBR ealiser pour chacune des precultures concernees Ie denom brernent en anaeroblose sur les 2 m ilieuxselecnts M 17-lac et M RS-lac-pH 5,2, sachant que les resultats attend us sont :

109 bac tenes /mt , pour S T,10 8 bacterles /mL pour LB,99% d'inhib ition de la croissance de LB sur m ilieu M 17-lac,99% d'inhib ition de la croissance de S T sur m ilieu MRS -lac-pH 5,2.

B22 Prelevement t=5h30 de la culture mixteD enom brer la cu lture m ixte apres 5h30 de croissance sur les m ilieux M 17-lac et M RS-Lac-pH 5,2 enanaeroblose, e n u tilis ant les dilution s su iva ntes :

- d il ut ions 10 .3, 10-4, 10 -5 pour Ie m ilieu MRS -lac-pH 5,2- d il ut ions 10 -4, 10 -5, 10 -6p ou r Ie m ilie u M17-la c.Compte-renduIn diq ue r e t ju stifie r le s d ilu tio ns realisees pour Ie denombrernent des p recu ttu res r ea li sees en B21.c- Etude de la selectivite des conditions de cultureLa methode officielle d'analyse de la flore specltique du yaourt (JO du 4 janvier 1978) precoruseI 'u tilisa tion en anaeroblose d es m ilie ux s ele ctifs s uiv ants :

- M 17 po ur Ie d enombre rn ent d es stre ptocoq ues the rm ophile s,- M RS acidifie pour Ie denornbrement de Lactobaci ll us bu lgari cus .On s e prop os e d e p red se r les con ditions d e Ja s ele ctivite d e ces den ombrements,CulturesP reculture s fournies pour la partie BMilieux et reactifs- 2 geloses M RS -La c pH 5,2 seches "MRS"- 2 geloses M 17-lac seches "M17"- 3 flacons de 10 m L des bouillons: "MRS-Lac-pHS,2", "MRS-Lac-pH6,2" et "MRS-Lac-pH6,9"- 1 flacon de 50 m L de base de m ilieu M17 lactose double concentration: "M17-Lac 2X "- 1 flacon de 10 mL solution de 0 g ly ce ro ph os ph ate d e s od ium ste rile a 80 giL: " 1 3 glycero 80 gIL"- 1 flacon de 20 m L d'eau distillee sterileMateriels specifiques18 t ubes a hemo lv se s te r il esManipulationsCl Etude de I'effet du pHLe m ilieu M RS peut etre utilise ajuste a un pH de 6,2 . Pour Ie m ilieu M RS aCidifle, Ie pH est a juste a5,2.O n se propose de determ iner I'influence du pH sur la croissance de LB et ST en utilisant les bouillonsMRS la cto se s d e pH in itia ux a ju ste s re sp ec tiv eme nt a 5,2 ; 6,2 et 6,9. Transferer 2 mL de chaque bouillon dans 2 series de 3 tubes a hernolvse, Ensem encer chaque sene de tubes avec 50 I.lL d e dilu tion 1/100eme de preculture LB ou ST. Incuber a l 'etuve a 42C pendant 24 heures.


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C2 Etude de I'effet de la concentration en ~ glycerophosphate de sodiumLe m ilieu M 17-lac (com position donnee en A nnexe 1) contient du ~ glycerophosphate de sodium , quiest decrlt com me jouant un ro le m ajeur dans la selectlvlte de ce m ilieu. On se propose de Ie verifier etde Ie predser.Pour ce la, une base de m ilieu M17-lac a double concentration ne contenant pas de~ glycerophosphate de sodium (M 17-Lac 2X ) sera completee avec differentes concentrations en~ gly ce ro ph os ph ate d e s od ium . Realiser 2 fo is la gam me suivante en tubes a hem olvse :volum e en tJL d e m ilieu M 17-Lac 2X 1000 1000 1000 1000 1000 1000v olu me e n tJL de s olu tio n 0 125 250 500 750 1000de ~ glycerophosphate de sodium a 80 gILvolume en tJL d'eau distillee 1000 87 5 750 500 250 0 Ensem encer chaque gam me de tubes avec 50 tJL d e dilu tion 1/100em e d e c ha cu ne d es p re cu ltu re s

LB ou ST. Incuber a l 'etuve a 42C pendant 24 heures.C3 Etude de la tolerance a I'oxygeneOn se p ro po se d'etudier I'effe t du dioxygene sur la cro issance de ST et de LB.R ealis er p ou r ch acu ne d es preceltures Ie denombrernent en aeroblose s ur le s m ilie ux selecnts M17- lacet M RS -lac-pH 5,2 . U tiliser les m em es protocoles et d ilu tions que dans la partie B21. Incuber 48 heures a 42C en aeroblose.Compte-rendu1. Quels resultats attend-on en C 1 pour Ie streptocoque ? A rgum enter.2. Cakuler les concentrations en ~ glycerophosphate de sodium dans chacun des tubes prepares en

C2.3. Q uels sont les ro les possib les du ~ glycerophosphate de sodium dans un m ilieu de culture?

Le sujet dujour1st a remettre avec la copie.

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Composition des mi lieuxANNEXE 1

M17-LacTryptonePeptone de sojaInfusion de viandeExtrait de levuref 3 glycerophosphate de sodiumLactose

5g5g5g

2,5 g19 g25 gAcide ascorbique

Sulfate de magnesium(agar

0,5 g0,25 g

11g pour une gelose)pH 6,9eau qsp 1 L

MRS-Lac-pH 6,2Peptones 10 gExtraits de viande 8 gExtrait de levure 4 gGlucose 20 gLactose 20 gAcetate de sodium tnhvdrate 5 gCitrate d'ammonium 2 gTween 80 1cm3Hydrogenophosphate de potassium 2 gSulfate de magnesium heptahydrate 0,2 gSulfate de magnesium tetra hydrate 0,05 g(agar 10 g pour une gelose) eau qsp 1 L

pH 6,2MRS-Lac-pH 5,2Meme composition pH 5,2MRS-Lac-pH 6,9Meme composition pH 6,9


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ANNEXE 2Schema des depOtsdes denombrements "en goutte"

ANNEXE 3Pipetage en mode inverse

E nfoncer Ie p isto n de la p ipette ju squ 'a la d euxierne bu tee.Aspirer.D istribue r Ie vo lum e desire en entoncant Ie p iston jusqu 'a la prem iere bu tee,Le volume exC {iden ta ire reste dans Ie cone.

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I TRAVAIL OU O EUXIEM E JO URB- Quantification de populations bacteriennesVerifier avant l'ouverture des enveloppes GENbaga>que la bandelette indicatriced'anaerobiose est blanche.B21 Denombrement des precultures ST et LB- O bs erve r e t d Ek rire la m o rp ho lo gie d es co lo nie s.- C om pter le s co lo nies sur cha qu e b oite.1. P re se nte r I'e ns emb le d es re su lta ts d an s u n ta ble au .2. Cakuler l a concentra tion bactertenne p ou r c ha qu e preculture, Justifier.3 . C om parer les resultats obtenus pour une m e me souche. C ondure .4 . La cu ltu re m ixte fourn ie en Jour 1 (12 m L) a ete ensernencee ave c 6 0 IJL d e p recu ltu re de Sf et0,6 m L de precultu re de LB .D ed uire d es re su lta ts d u denornbrernent p re ce de nt le s c on ce ntra tio ns in itia le s d e c ha cu ne d es

deux especes.Ces concen tr atio n s sont -e lle s egale s ? Discuter.B22 Denombrement du prelevement t=5h30 de la culture mixte- O bserve r e t d ecn re la m orph olog ie de s co lo nies.- C om pter le s co lo nies sur cha que b oite.1. P re se nte r I'e ns emb le d es re su lta ts d an s u n ta ble au .2. En prenant en com pte I'aspect macroscop ique des co lonies sur chaque m ilieu et les resu lte tso bte nu s e n B 21 , p re os er le (s ) m ic ro -o rg an ism e (s) d en om bre (s ) su r c ha qu e m ilie u.3. Estim er les concentra tions en Sf et LB dans la cultu re m ixte apres 5h30 de culture. Justifie r.Comparer aux concen tr atio n s in itia le s4. Ces resu ltats sont-ils com patib les avec la specifica tion exigeant la presence d'au mom s 107b acte ne s la ctiq ue s v iv an te s p ar g ramme d e ya ou rt ?5. D iscuter les correspondances entre UFC (Unite Form ant C olon ie), co lonie e t bactene, en vous

a id an t d es o bs erva tio ns m icro sco piq ue s re alise es Ie p rem ie r jo ur s ur Ie p re le veme nt t= 5h 30 .c- Etude de la selectivite des conditions de cultureMilieux et reactifs- gamm es de pH en RM et en VBC en sem i-m icrocuves- 2 flacons de 20 mL des ind icateurs de pH : "RM mesure" et "VBC mesure"- 3 flacons de 10 m L des bouillons: "MRS-Lac-pH5,2", "MRS-Lac-pH6,2" et "MRS-Lac-pH6,9"- 1 flacon de 50 m L de base de m ilieu M 171actose double concentra tion "M17-Lac 2X"- 1 flacon de 20 m L d 'eau distillee sterileMateriels speciliques- 60 seml -m lc rocuves- pa ra fi lm

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C1 Etude de I'effet du pH- L ir e I'a bsor ba nc e a 600 nm de chaque tube de culture contre un blanc adequat,L a va le ur lim ite d e lin ea rite de l'a bso rb an ce e st d 'e nviron ~6.:/(Effectuer la lecture des absorbances en presence d'un examinateur.1. P redser la com position du blanc de lecture et du diluant utilise.2. P resenter les resultats sous form e d'un tableau.3. Compa re r le s d iffe re nte s v ale urs o bte nu es et co nd ure.C2 Etude de I'effet de la concentration en p glycerophosphate de sodium- Lire I'absorbance a 600 nm de chaque tube de culture contre un blanc adequat,L a va le ur lim ite d e lin ea rite de l'a bso rb an ce e st d'e nviro n 0 ,6 .:/(Effectuer la lecture des absorbances en presence d'un examinateur.- M esurer Ie pH de fin de culture selon Ie protocole utilise en Jour 1 et rappele ci-dessous :A jo ute r 50 p L d 't ch an tillon d an s u ne semi-m icro cu ve co nte na nt 7 00 p L d 1n dica te ur. E va lu er la

va leu r d u pH d e l't ch an tillo n e n compa ra nt la co lo ra tio n o bte nu e a celles de la gamme de pHcorrespondante.

1. D onner les resulta ts sous form e d'un tableau. Les representee graphiquem ent. Les discuter.2 . Condure Quant a I'effet de la con cen tratio n en p glycerophosphate de sodium sur la cro issance de

chaque mi croo rganisme .Justifie r la teneur en ce com pose dans Ie m ilieu M 17-Lac.

C3 Etude de la tolerance a I'oxygene- O bs erve r et d ecrire la m orph olo gie de s colon ies .- C om pter les colonies sur chaque boite.1. P res enter I'e ns emble de s res ulta ts d an s un ta ble au .2. Estim er les concentrations en ST e t e n L B. J us tifie r.3 . Com parer les resulta ts obtenus pour une m e m e souche. C onclure.4. En prenant en com pte I'aspect m acroscopique des colonies obtenues sur chaque m ilieu ainsi que

les resultats obtenus en B21, condure sur Ie ou les effets du dioxygene sur la cro issance dechaque mi croo rganisme .

Conclusion generaleA partir des resultats obtenus, quelles conditions de culture pourralt-on envisager pour obtenir uneselectlvite a bs olue vis -a-vis d e cha cu ne d es d eu x especes p resen tes d an s Ie y ao urt ? Argumenter.

Bibliographie Courtin , P ., Monnet, V. and R ul, F . (2 00 2) C ell-w all proteinases P rtS and P rtB have a different role

in S tre pto co cc us th erm ophilu s / L ad obac illu s b ulg aric us m ixed cultures in m ilk , Microbiology, 148,3413-3421.

Shankar, P . A . and Davies, F. L . (1977) A note on the suppression of Ladobac il lus bu lga ricus inmedia containing 0 glycerophosphate and application of such media to selective isolation ofStreptococcus thermophi lus from yogurt, J. Soc. Dairy T ech , 30,28-30.

www.fao.org/docrep/: d oc ume nta tio n s ur le s la its fe rme nte s,

Nos remerciements a Fran~oise R ul et V eronique M onnet, Strudure et B iochim ie des P roteines,IN RA de Jouy en Josas.
http://www.fao.org/docrep/:http://www.fao.org/docrep/:


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RAPPORT SUR L'EPREUVE DE TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIERapport etabli par Mesdames I. ETIENNE, B. SALLENetMessieurs F. DUCANCEL, F. GOMELetD. LONCLELe suje t po rta it su r deux them es princ ipaux , d 'une part I'e tude de certa ins param etres aucours de la c ro issance des souches St rep tococcus sa li va rius subsp. thermophilus (ST) etLac tobac illu s de lb ruecki subsp. bulgaricus (LB ) en la it, e t d 'au tre part I'in fluence desco nd ition s de cu lture su r la se le ctlv lte de s denornbrernents de ces souches presentes dans Ieyaour t .C e TP m etta it en oeuvre des techniques dasslques e t ne presenta lt n i d ifficu lte m ajeure n ilongueur excessive . M algre ce la , il a e te note des lacunes e t des approxim ations concernan tles gestes techniques et les in te rp re ta tions des resu lta ts obtenus. Les candidats, ca lm es e tconcentres, se sont g loba lem ent b ien cornportes au cours de l'ep reuve , b ien que Ie ju ry a itreq re tte une certa ine lenteur et un m anque de recul par rapport aux manipu la tions aeffectuer.Partie A : Etude de quelques parametres au cours de la croissance en lait.La prem iere e tape de la m anipu la tion consista it en une repartition de cultu res ensernenceesavant Ie debut de l'epreuve, qu i devait e tre rea lisee en pertu rban t Ie mo ins poss ib le lescro issa nce s en cou rs. D e tro p n om breu x c an did ats n 'on t p as p rls co nsc ien ce e n p articu lier d eI'im portance de la lim ita tion de l'ae ra tion (pourtant s igna lee c la irem en t dans Ie su je t) e t durespect d 'une incuba tion con tinue a 42 C (im posan t une reduction m ax ima le du tem psd'exposit ion a tem perature am bian te ). C es im prec is ions on t condu it a un decalaqe descro issances dans Ie tem ps, variab le d 'un cand ida t a I 'autre . Par la su ite , I'ensem ble desp re le vem en ts a e te c orre ctem en t e ffe ctu e.La cro issance de chaque espece dans la cu lture m ixte devait e tre su iv ie d irec tem ent par desexam ens m icroscop iques . II est decevan t que ces exam ens techn iquem ent s im ples a ien t e teneg liges par une m ajo rite de candidats n 'ayant pas percu I'im portance de ces observa tions :e lles perm etta ient en effe t de visua llser d irec tem ent la cro issance de chacune des souchesdans la cu ltu re m ixte , en consta tan t un a llongem ent des cha 'lnettes de coques et de bad lles.Ces observations perm etta ien t de corre le r la m ultip lica tion bacte rienne avec les autresp aram etre s su iv is Ie p rem ie r jou r (pH , ac tiv ite prote oly tiqu e), m ais au ssi d e discu te r la no tio nd 'U FC (Unite Form an t C olon ie ) Ie deuxlerne jou r. Par a illeu rs , des difficu ltes de m ise aupoin t, de d istinc tion entre coques et bac illes (certa ins cand ida ts ne s'e tonnan t pas de netrouver qu 'une des deux souches ensem encees dans la cu lture m ixte !) on t re fle te unm an qu e d 'a isa nce fa ce a u ne te chn iqu e m ic ro bio log iqu e d e b ase .II e ta it eg ale men t p ro po se de su ivre I'a cid ifica tion a cco mp ag na nt la cro is san ce bactertennepar compara ison avec une gamme de pH rea lisee avec deux ind icateu rs colores, Cettem ethode, ce rtes peu sensib le ma is neanmolns suffisan te pour eva luer les varia tionsattendues, n 'a pas pose de problerne au x c and id a ts .E nfin , I'ac tiv ite p ro teo lvtique des souches e ta it estirnee par Ie dosage des pep tides nonacido-predpltables fo rm es en cours de cro issance. Le taux de pep tides p resen ts dans Iem ilieu d e c ultu re a un tem ps donne refle ta it l'equ llib re entre la p roduction de peptides parproteo lvse e t leu r consomm ation par les bac terles en div is ion . C ette partie a insp ire une tresgrande rnajorlte de c and id a ts , a te l p oin t q ue certa ins on t rnerne re alis e les de term in ation s,non dem andees, pour la cu lture pure S TP R-A A.C ette partie com porta it un certa in nom bre de questions don t p lusieurs (tab leaux, graphes)pouvaient etre antldpees e t p reparees para lle lem en t aux m an ipu la tions . En particu lier, iIe ta it jud ic ieux de re leve r les va leurs d 'absorbance d irec tem ent sur Ie cornpte-rendu, afin delim ite r les pertes de tem ps e t les e rreurs liees au recopiage u lterleu r de ce lles-c i. O n peu t

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egalement deplorer que dans de trop nombreux cas I'echelle choisie pour tracer les courbesait ete mal adaptee, ce qui rendait par la suite leur interpretation difficile, voire impossible.Dans I'ensemble, les candidats n'ont pas su inteqrer I'ensemble des donnees pour comparerles resultats de la culture mixte avec chacune des cultures pures correspondantes, et ainsimettre en evidence la cooperation metabollque entre ces deux especes,Les courbes d'acidification montraient que la croissance des souches ST et LB en culturespures etalt plus lente qu'en culture mixte.La souche rnutee STPR ne presentalt de croissance detectable par acidification que si Ie laitetalt supplements en casaminoacides, ce qui montrait I'importance de la disponlbnlte enpeptides pour la croissance de ST. Avec STPR, aucune production de peptides n'etaitobserves, ce qui permettait d'expliquer I'absence d'acidification.Le taux de peptides augmentait fortement dans la culture LB, confirmant la forte actlvlteproteolytlque de cette souche, contrairement a celie de ST.Enfin, la culture mixte montrait la plus forte augmentation du taux de peptides, et ce malqreleur utilisation par les deux souches, traduisant une proteolvse importante, superleure a celiede la culture pure LB.Parties B et C : Denombrements en milieu solide.Les denornbrements etalent realises par la technique en goutte , technique peu habituellequi n'a cependant pas decontenance les candidats. L'avantage de cette technique etalt dereduire Ie nombre de boites a incuber, tout en permettant une estimation suffisante desconcentrations bacteriennes, Le choix des dilutions a ensemencer etait lalsse a la Iibreappreciation des candidats, qui ont dans I'ensemble su mener a bien Ie calcul pretlmlnalrenecessalre (avec parfois des raisonnements bien compliques I).En revanche, la realisation pratique des dilutions en sene est mal maitrlsee par uneecrasante majorlte de candidats, en particulier au niveau de l'nomoqeneisatlon dessuspensions (mauvaise utilisation du vortex ). Cette operation etait particuherernentdelicate pour la premiere dilution, puisque Ie lait formait un catlle, Les depots en pipetageinverse, necessalres pour eviter la projection de micro-gouttelettes en penpherte des depots,ont ete correctement realises. Enfin, la gestion des boites ensernencees a ete parfoischaotique, que ce soit au niveau du reperaqe des boites, du sechaqe sous PSM (oubli desboites), ou de la mise en anaeroblose. Cette condition d'incubation devait etre geree par lescandidats eux-mernes avant la fin du temps d'epreuve et quelques candidats ont etesanctionnes pour cet oubli.Les descriptions macroscopiques des colonies ont ete dans I'ensemble correctementreahsees, rneme si elles n'ont pas toujours ete rattachees au contexte (milieu et soucheensemences), En revanche, Ie concept d'UFC, pourtant tres dasslque, est souvent malconnu et dtscute, L'observation des chainettes de coques (de 10 cellules en moyenne) et debacilles (de 3 cellules en moyenne) Ie premier jour devait permettre de comprendre que Ienombre de colonies etait sous-estirne par rapport au nombre de cellules viables. C'estd'ailleurs egalement ce qui expliquait l'ecart (un peu moins d'un facteur 10) entre lesresultats attendus et ceux obtenus pour les denombrernents des precultures de ST et LB. Lesresultats des calculs de concentrations bactenennes devaient donc etre presentes enUFCjmL, et avec un nombre de chiffres significatifs en rapport avec I'imprecision liee a latechnique de denombrernent,La notion de selectivlte des milieux de culture ne semble pas ou mal comprise, puisque laplupart des candidats, etonnes par I'absence de culture de ST sur Ie milieu MRS-Lac-pH5,2,condualent a une erreur de manipulation plutot qu'a une selectivlte plus forte que celieattendue. A I'inverse, la culture partielle de LB sur milieu M17-Lac prouvait que ce milieun'est pas totalement selecrff de ST, ce qui posait un problema lors du denornbrernent de LBdans la culture mixte apres 5h30 de culture. Les candidats auraient pu estimer d'apres leurs

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propres resu lta ts de denom brernents sur les precu ltures Ie pourcentage d 'inh ib ition decro issance pour la souche LB sur Ie m ilieu M 17-Lac. P ar la su ite , il e ta lt possib le de discuterla va lld lte du denornbrement de ST sur Ie m ilieu M17-Lac apres Sh30 de cro issance enc ult ure m ix te .Parties B et C : 5electivite des conditions de culture.On peut regretter que Ie deuxleme jour, face a des cultures vis ib lem ent tres denses, lad ilu tion des suspensions n 'a it pas ete antldpee, ce qui a genere une perte de tempsim po rtante. D 'autre pa rt, lo rsque ces dilu tions eta ient rea I isees, de trop nom breux candidatsn 'ont pas correctem ent corre le Ie b lanc de lecture chois i e t Ie d iluant utilise , surtout pour lagamme en 1 3 glycerophosphate. En effe t, la lec ture d irec te de la gam me contre du m ilieuM1 7-L ac d ou ble c on ce ntra tio n c on du is ait a la le cture d 'absorbances negatives, ce qui a genep lu s d 'u n c an did at.L 'e tude de I'in fluence du pH devait m ener a la conc lusion que seul Ie m ilieu MRS -Lac-pH S,2permetta it une culture to ta lement se lec tive de LB, puisque ST eta it encore capable decultiver a pH 6,2 . D e nom breux cand idats n 'ont pas d lscute leurs resu lta ts en term e d'analysede conditions se lec tlves m ais ont p lu to t recherche un pH optim al de culture pour chacunedes sou ches .L 'e tude de I'in fluence de la concentra tion en I3g lycerophosphate m ontra it que les deuxsouches eta lent inh ibees par de fortes concentra tions (10 g IL pour LB, et 20 gIL pour ST).Les m esures de pH apres culture avaient pour but de m ettre en evidence I'e ffe t tam pon dece tte molecu le pour permettre la cro issance de ST. La concentra tion de 19 gIL de1 3 glycerophosphate, va leur re tenue dans la com position du m ilieu M 17-Lac rna is non testeedans la gam me de concentra tion, inh ibe la cro issance de LB, incapable de supporter unete lle force ion ique, m ais perm et encore ce lie de S T.L 'e ffe t d e la to le ra nc e a I'oxygene a ete g lob alem ent m al in terprete . A I'exception de la ta illedes colon ie s, aucune difference n 'e ta it observee entre les denom brernents en anaerob lo se eten aerob lose rea lises sur m ilieu M 17-Lac pour ST et sur m ilieu M RS-Lac-pH S,2 pour LB. Enrevanche, la souche LB eta lt capable de cultiver sur Ie m ilieu M 17-Lac en anaeroblose, m aispas en aeroblose, E nfin , la souche ST eta lt incapable de cultiver sur m ilieu M RS- Lac-pH S,2que ce soit en presence ou en absence d 'oxygene.Tres peu de candidats sont arrives a la con clusion que des conditions de selecnvlte absolueeta lent possib les en somm ant les fac teurs selecnts, A insi, seu l LB est capable de cultiver enanaerob lose sur m ilieu MRS-Lac-pHS ,2 , et ST cultive seul su r m ilieu M17-Lac , rna is ena ero blo se c ette fo is .


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La moyenne de I'epreuve est de 09,9/20, avec 17 notes superleures ou egales a 10/20(soit 48,6%).La note la plus faible est de 05,4/20 et la plus eleveede 14,3/20.La repartition des notes est la suivante :

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