MESURES PAR RMN DES INTERACTIONS, SUCRES ET...

MESURES PAR RMN DES INTERACTIONS, SUCRES ET PROTÉINES.

Examples d’applicationExamples d’application

UMR CNRS 6226 - ENSCRInstitut des Sciences Chimiques de Rennes« Chimie Organique et Supramoléculaire »

Laurent Legentil,

RMN STD (Saturation Transfer Difference )

HcHc

HbHb

Hc

Hb

Ligand

Irradiation

RMN STD : Cartographie d’RMN STD : Cartographie d’épitopesépitopes

1.00 1.00 2.00

Hb

HcHa

Spectre du ligand (référence)

Hc

Ha

Hb

Ligand

HaSpectre après

European Young Investigator Workshop Mai 2011

0.30 0.90

Hb

HcSpectre STD

Hc

Ha

Hb

LigandHc

Ha

Hb

Ligand_

Protéine HaHaHa

HcHc

HaHa

HbHb

Hc

Ha

Hb

Ligand

1.00 0.70 1.10

Hb

HcSpectre après

irradiation

Hc

Ha

Hb

Ligand

100%33%

Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1784-1788.

RMN STD : Application aux systèmes biologiquesRMN STD : Application aux systèmes biologiques

• Interaction Récepteur-Ligand

• Interaction Enzyme– Ligand

• Compétition – Meilleur Ligand

• STD sur Cellule entière


Carbohydr. Res. 2004 339, 907-928.

Drug Discovery Today 2012, 17, 505-513

• STD sur Cellule entière

• STD - HRMas

Caractérisation par RMN STD

des interactions

ββββ-Glucanes/Récepteurs


ββββ-Glucanes/Récepteurs

Récepteurs Scavenger

Lactosylcéramide

CR3Dectin-1

β-Glucanes


Effecteurs engagés

Phagocytose

INNEACQUIS

Evaluation des interactions par RMN STD

Cibles Moléculaires


6

Structure caractérisée par RMN 900 MHz

Caractérisation du Laminarihexaose RMN 900 MHz H-1aαJ1aα,2aα = 3,6 Hz

H-1aβJ1aβ,2aβ = 8,1 Hz

H-1b

J1b,2b = 8,0 Hz

H-1c

J1c,2c = 8,0 HzH-1d

J1d,2d = 8,0 Hz

H-1e

J1e,2e = 7,8 Hz

H-1f

J1ef2ef = 8,1 Hz



7

H-1aαH-1aβ

H-1(b,c, d,e, f)


Interaction oligoglucane/CR3, Dectin-1 avec une cryo-sonde 900 MHz

� Avec le Laminarihexaose

Spectre STD

D2O[S] 3.7 mmol

Ratio proteine/ligand 1:25


8

Spectre de la

laminarihexaose

�Les observations de Feizi semblent être confirmées

Evaluation des interactions par RMN STDInteraction polymère/CR3 avec une cryo-sonde 900 MHz

� Avec la Laminarine

Spectre STD


9

Spectre de la

laminarine

�Faibles effets observables : Confirme CR3 n’est pas le récepteur principal

Evaluation des interactions par RMN STDInteraction polymère/Dectin1 avec une cryo-sonde 900 MHz

STD laminarine/Dectin-1


Carbohydr. Res.2011, 346,490-1494.

Laminarihexaose

Forte réponse


Dectin-1

Face interactive

Forte reconnaissance protons anomère α/βdu sucre réducteur

Reconnaissance probable au niveau d’une poche hydrophobe de Dectine 1 : Interaction avec la face hydrophobe du polysaccharide

Conclusions

� Effets STD observés avec le polysaccharide

Pas d’interaction in vitro entre le laminarihexaose et les

récepteurs

Pas d’interaction in vitro entre le laminarihexaose et les

récepteurs


12

� Ces études préliminaires n’ont pas permis d’établir

les paramètres structuraux pour une meilleur efficacité


des interactions

enzyme/ligand


enzyme/ligand

Furanosyl-1-PGalp-1-P

Nucléotidyltransférases

Interaction Enzyme– Ligand : Vérification de la ver satilité d’une enzyme ; La nucléotidyltransférase


Nuclétotides-sucresUDP-αααα-D-Galp

Uridyltransférases

Utilisation de Utilisation de nucléotidyltransférasesnucléotidyltransférases

(N-acétyl-D-glucosamine)(2-azido-2-désoxy-D-galactose)

(D-xylose)


Obtention d’une gamme d’UDP-sucres

� de configurations variées

� de conformations (1C4 or 4C1) variées

Chem. Commun. 2004, 2706-2707.

(L-fucose)(D-mannose)

Système pluri-enzymatiques

Uridyltransférases

UDP-Glcp2Pi

Pyrophosphataseinorganique

PPi

mélange αααα,ββββ

VerstalitéVerstalité d’une d’une nucléotidyltransférasenucléotidyltransférase


Glc-1-PUTP

UDP-glucose pyrophosphorylase

Galactose-1-phosphateuridyltransférase

�� Reconnaissance de furanosyl 1-phosphates variés ?

- Encombrement- Electronégativité- Sélectivité αααα/β β β β ? R= H, CH3, CH2OH, CH2F

RMN STD (Saturation Transfer Difference)

H3 (Gal)

100%

100%

61%

87%

34%

32%27%

35%

65%

UDP-Galp

nd

nd

nd

H6/6’(Gal)

100%

78%

90%

31%23%

27%UDP-αααα-D-Galf

Criblage de substrat par STDTampon Tris deutéré pH 6,8

[S] 1,5 µmolRation proteine/ligand : 1:100


H6’ (Uri)H1’(Rib)H

5’(Uri)H1(Gal)

H2’/3’

(Rib)

H4’(Rib)

H5’(Rib)

H5 (Gal)

32%27%

H6/6’(Gal)

H2’/3’

(Rib)

H4’(Rib)

H5’(Rib)

31%23%

H6’ (Uri)

H1’(Rib)H

5’(Uri)

UDP-ββββ-D-Galf

100%

82%10%

90%

15%

21%

90%26%

90%

25%

28%

100%

10%UDP-6F-ββββ-D-Galf

Utilisation d’une uridyltransférase : Conclusion


UDP-αααα-L-Araf

28%

100%

77%22%

75%

21%

30%9%

UDP-6F-αααα-D-Galf86%20%

90%

18%

34%

100%

�Interactions avec l’enzyme par la partie nucléosidiq ue�� Effets STD similaires pour les composés 1,2- cis et 1,2-trans

�� Substrat de l’enzyme

mélange αααα,ββββ

3 enzymes

UDP-Glcp (cat.)UTP (1 équiv.)

R= H, CH3, CH2OH, CH2F

Uridyltransférases

Utilisation d’une uridyltransférase : Conclusion


R Série Conversion (%) Sélectivité

CH2OH D-Gal 40 1,2-cis (αααα)H L-Ara 22 1,2-cis (ββββ)CH3 D-Fuc 12 1,2-cis (αααα)CH2F 6F-D-Gal 42 1,2-cis (αααα)

Eur. J. Org. Chem. 2008, 5988-5994.

RMN STD compétitive :

Criblage ligands pour un

récepteur


récepteur

Criblage d’une bibliothèque combinatoire dynamique pour l’inhibition de la β-Galactosidase

Liaison hemithioacetal reversible : formation (ou l’hydrolyse) plus rapide que le temps de

relaxation


Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.

β-Galactosidase

Système dynamique



Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.


Interaction spécifique Interaction non spécifique


Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.



Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.

Reconnaissance spécifique antigène - anticorps

• Processus de réinnervation• Action sur l’activité synaptique et la plasticité des cellules nerveuse

Trisaccharide antigénique présenté par HNK-1 (Human natural killer-1)


J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.

nerveuse

Cible de l’anticorps anti-HNK-1

Maladie autoimmune



J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.

Elucidation de la topologie du complexe épitope -anticorps

STD-TOCSY



On-resonance

STD

Anticorps HNK-1 412 : 30 µMLigand : 600 µM

Zone claire d’intéraction :Interactions forte au niveau du GlcAPeu d’’interaction sur la partie lactose


J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.

Off-resonance

On-resonance

Superposition des signaux :Identification des protons proches du récepteur difficile



STD - TOCSYTOCSY


J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.


des interactions

Inhibiteurs/Recepteurs


Inhibiteurs/Recepteurs

membranaires

RMN STD sur cellule entière


De brevet WO 2012/077087

Récepteur inconnu ou difficile à isoler

Arabinogalactane AG 30 monomers of Galf

β-(1,5) and β-(1,6) bonds

Galactane fragment of AG :

Mycobacterial membrane :

Galactofuranose in Mycobacterium

Crucial component of mycobacterial membraneEssential for survivance


http://www.birmingham.ac.uk/staff/profiles/biosciences/alderwick-luke.aspx

0.30 mg/mL 90 µg/mL

Inhibition de la croissance de M. smegmatis

MIC : 0.78 mg/mL 0.80 mg/mL 0.40 - 0.55 mg/mL2.7 mM 2.0 mM 1.2 - 1.5 mM 1. 0 mM 0.3 mM


� Les thioimidates ne provoquent pas d’inhibition

� Longueur minimale de la chaîne alkyle requise

� Furanosides meilleurs que les pyranosides

� Groupements polaires en C-6 plus efficaces : liaisons hydrogène ?

� MIC ethambutol : 3 µg/mL

0.40 - 0.55 mg/mL

Takayama, K. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1989, 33 (9), 1493-1499.

2.7 mM 2.0 mM 1.2 - 1.5 mM 1. 0 mM 0.3 mM

Spectre de résonance « off »

RMN « STD » : Saturation Transfer Difference


D2O[S] 2 µM

Cellule : 20 mg Masse humide


Spectre de résonance « on »

Différence des deux spectres

Applicable aux cellules entières de M. smegmatis

OO

OH

HO

HO

HO

100%

70%

48%

10%

0%

9%

16%

11%

MIC 1.0 mM



H-1

H-2H-3

OCH2

OCH2

H-4H-5, H-6a, H-6b

CH3OCH2CH2 (CH2)5

-D-galactofuranoside de n-octyle

MIC 2.7 mM

O

HO

HO

OH

O

OH

100%

72%

48%

9%

0%

9%

14%

14%



H-1

H-2H-3

OCH2

H-6aH-6b

CH3OCH2CH2 (CH2)5

-D-galactopyranoside de n-octyle

H-4H-5

Pas d’inhibition



Chaîne octyle responsable de l’effet STD, mais n-octanol non inhibiteur :un cycle furanose/pyranose semble nécessaire

OMeO

OH

HO

HO

HO

-D-galactofuranoside de méthyle

Pas d'effets STD

Pas d’inhibition



Cycle furanique sans effets STD, ni activité inhibitrice : nécessité d’une chaîne octyle

Paroi mycobactérienne :

� Interaction de type lipophilemodulée par la tête polaire

� Glycoside d’alkyle requis



http://www.birmingham.ac.uk/staff/profiles/biosciences/alderwick-luke.aspx

� Mode d’action : perturbation de la couche d’acide mycolique, ou dégradation et reconnaissance d’entités sucres modifiées ?

� Reconnaissance spécifiquenon exclue

� Molécules marquées nécessaires

Lipophosphoglycane LPG :

Major cytoplasmic glycolipidVirulence factorAnchor at the gut’s wall of the phlebotome

Cell membrane of Leishmania:

Galactofuranose in Leishmania


Fragment of LPG core

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=glyco2&part=ch40

PG

GalfOct and 6-NH2-GalfOct significantly decrease parasite growth in vitro…

OC8H17O

OH

HO

HO

H2N

IC50 = 8.96 ± 2.5 µM IC50 = 41.6 ± 8.3 µM


Antimicrob. Agent and Chemother., 2014, 58, 2156-2166

But not the octyl galactopyranoside


A polar moiety at C-6 position is essential for activity

Specificity of the furanose ring

No surfactant effect (IC50 < CMC )


Applicable aux cellules entières de L. Donovani

RMN « STDD » : Saturation Transfer Double Difference

Inhibition de la croissance de Leishmania

Deuterated PBS (pH 7,5)[S] 2 µM

Cellule : 2.108 cellules par tube

Interaction avec la membrane du parasite pour tous les ligands


pour tous les ligands testés

Effet STD légèrement plus élevé pour les

furanosides d’alkyle

Spécificité

furanose

Spécificité pour le

furanose


Prochaine étape : RMN STD

couplé à l’HR-MAS


Interaction du co-transporteur SGLT1 avec son ligand

Pré-requis pour une bonne STD sur cellule entière :

Cellule en suspensionAgrégation faible

Non applicable aux cellules issues de tissu, aux cellules végétales, … qui s’aggrègent et

retombent rapidement au fond du tube

European Young Investigator Workshop Mai 2011Chem. Eur. J, 2011, 17, 13395-13399

Solution : RMN Haute Résolution à l’angle Magique

Force centrifuge empêche toute sédimentation

Interaction du co-transporteur SGLT1 avec son ligand

Modèle cellulaire : transporteur SGLT1 du glucose à travers la membrane apicale

Inhibiteur compétitif :

European Young Investigator Workshop Mai 2011Chem. Eur. J, 2011, 17, 13395-13399

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