GLYCOBIOLOGIEET

MYOGENESE :

UTILISATION DES SOURIS GDF8 -/-

Véronique BLANQUETFabrice DUPUYLionel FORESTIERLaëtitia MAGNOLEmilie PINAULTKarine VUILLIER

Séminaire du 13 juin 2008

Unité de Génétique Moléculaire AnimaleUMR 1061

Quels sont les acteurs, associés à la glycobiologie, qui interviennent dans le développement musculaire ?

PROBLÉMATIQUE :

« La glycobiologie est une nouvelle discipline scientifique qui allie les fondements de la biochimie et de la biologie moléculaire des glucides, pour étudier et comprendre la structure , la biosynthèse et la biologie des glycanes ».

DÉFINITION :

Comparaison entre : souris « sauvage » et souris GDF8 -/-

Echantillons biologiques : 20 souris sauvages (Orléans) et 20 souris GDF8 -/- (Limoges) :

(Fond génétique Fvb)

- 5 individus ♂ âgés de 3 sem - 5 individus ♂ âgés de 12 sem- 5 individus ♀ âgés de 3 sem - 5 individus ♀ âgés de 12 sem

muscle squelettique – foie – cœur – cerveau

APPROCHE SCIENTIFIQUE :

Etude Transcriptomique (Glyco-TLDA)

Etude Protéomique (2D-DIGE)

Droit fémoral

DÉMARCHE EXPÉRIMENTALE :

Broyat musculaire

Broyage dans l’azote liquide

ARN totaux

ADNc

Données PCR-q

20 mgRNA easy kit

AgilentcDNA Archive Kit

TLDA

Transcriptomique Protéomique

Protéines totales

Protéines microsomales

Données protéomiques

Electrophorèse 2DDIGE

Approche Transcriptomique

RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE

Marqueurs myogéniques

Pax3 Pax7 Tropomyosine

GDF8+/+ 3 sem

GDF8+/+ 12 sem

GDF8-/- 3 sem

GDF8-/- 12 sem

RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE

Analyse de l’expression du Glycogénome par TLDA

Gene function Number of known genes1

Number of analyzed genes2

Glycosyltransferase 192 148 (77%)

Glycosidase 74 53 (72%)

Sugar carrier 33 26 (79%)

Translocase 2 2 (100%)

Sugar metabolism 26 23 (88%)

Lectin 165 101 (61%)

Sulfotransferase 50 22 (44%)

Total 542 375 (69%)

RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE

Expression du Glycogénome :Nombre de gènes exprimés différentiellement

EchantillonsGDF8 +/+

12 semainesGDF8 -/-

3 semaines

GDF8 +/+

3 semaines79 51

GDF8 -/-

12 semaines8 42

- Individus ♂- T-test ≤ 5 %- RQ ≥ ± 1,5

RÉSULTATS PCR QUANTITATIVEExpression du Glycogénome :

In Vivo vs. In Vitro

79 gènes chez la souris GDF8+/+ 54 gènes dans les C2C12

20 gènes communs (12 gènes varient différemment)

RÉSULTATS PCR QUANTITATIVE

Expression du Glycogénome :

Gènes d’intérêt

Gene symbolGDF+/+

3sem/12semGDF-/-

3sem/12sem

3 sem GDF+/+/GDF-

/-

12 sem GDF+/+/GDF-/-

4732435N03Rik x (↘)Amy1 x (↗) x (↗)Art1 x (↗) x (↘)Art4 x (↘)Athl1 x (↘) x (↘)B3galnt1 x (↘)B3galt1 x (↘)B3gat1 x (↘) x (↘) x (↗)B3gnt2 x (↘)B4galnt1 x (↗)B4galt2 x (↘)B4galt4 x (↘)B4galt6 x (↘) x (↘)…

64 gènes d’intérêt

RÉSULTATS PCR QUANTITATIVEFonctions Biologiques des 64 gènes

(http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html)

9 gènes

12 gènes

5 gènes

Approche protéomique

���� Etude des protéines microsomales

���� Matériel biologique : muscle squelettique � Laëtitia54 mâles âgés de 3 semaines

18 GDF8-/- et 36 FVB = 4 pools �4 portées différentes

(autres tissus prélevés : foie et cœur)

���� Technologie 2D-DIGE/SM

���� Extraction : “fractionnement ” appliqué à une analyse protéomique

Selon Maribel E. Bruno et al. Archives of Biochemis try and Biophysics. Sept. 2002

Comparaison différentielle d’enzymes de la glycosylation dans le muscle de souris :

lignées GDF8-/- et FVB

microsomes

• Broyage du muscle dans un mortier avec azote• Reprise de la poudre dans Tampon (8 vol muscle/ poids poudre)

� 50mM Hepes, 1 mM EDTA, 0.25M Sucrose, 1mM DTT, inhibiteurs de protéases• Homogénéisation par sonication

• Centrifugation n°1 10 000 g 20 min à 4°Cculot = débris, membranes, noyaux et mitochondries

• Centrifugation n°2 10 000 g 20 min à 4°Cculot = reste mitochondries

• Centrifugation n°3 100 000 g 60 min à 4°C (X 2)culot = fraction microsomale surnageant : fraction soluble cytosolique

• Purification et concentration de l’échantillon

• Fraction « microsomale » tampon adapté pour gel 2D

• Dosage protéique

���� Rendement : 150 mg de tissu musculaire pour ~ 150 µg de fraction microsomale extraite

microsomesFractionnement simple

Glucose regulated protein : GRP78 ���� Marqueur spécifique des microsomesFamille des HSP 70 - Localisation dans RE

Western Blot sur marqueur biochimique

microsomes

Quantification de la protéine GRP78 après révélation par Western Blot

1

0,5

0 00

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Microsomemuscle

Soluble muscle TS3 TS12µ: microsomes

FS : fraction soluble

M : marqueurs

TS3 : fraction totale muscle 3 semaines

TS12 : fraction totale muscle 12 semaines

Enrichissement en protéines

« microsomales»

10% SDS-PAGE, 20µg/puits NC - HRP

Logiciel Image Quant TL

Suivi du fractionnement

µ FS M TS3 TS12

72 kDa

SDS-PAGE 10% 0.75 mm 10*10.5 cm 20 µg de protéines/puitscoloration bleu colloïdal

(1) Microsomes Foie (2) Microsomes Muscle(3) Fraction soluble Foie(4) Fraction soluble Muscle(5) Fraction totale Muscle

1 2 3 4 5

Fraction microsomale du muscle (2) 9 bandes = 115 protéines

Fraction soluble du muscle (4) 5 bandes = 40 protéines

Suivi du fractionnementIdentification de protéines pertinentes en SM

microsomes

Fraction microsomale du muscle (2)

� Plus grande proportion de protéines microsomales dans la fraction microsomale par rapport à la fraction solubl e

� Présence de protéines cytoplasmiques et mitochondrial es dans la fraction microsomale

Suivi du fractionnementIdentification de protéines pertinentes en SM

Fraction soluble du muscle (4)

microsomes

Suivi du fractionnementDéveloppement de la technologie MRM

Objectif : détecter de façon spécifique la GRP78 dans la fraction microsomale (mélange complexe de protéines)

Principe :

Séquence protéique

Peptides trypsiques + masse

DTHKSEIAHRFKDLGEEHFKLVNELTEFAKQEPERNECFLSHK ...

597.3625.3582.3539.6...

Fragment le plus probable ���� masse

496.3859.4708.4734.4...

Couple de masses pour chaque peptide trypsique

Analyse par MS/MS uniquement de ces peptides là

microsomes

8 pools d’animaux 3 semaines : 4 « Sauvages » et 4 « Hy permusclés »4 gels marqués : IEF pH4 - 7 18 cm/SDS-PAGE 10% (150 µ g/gel)

Gels Cy3 Cy5 Cy2 Decyder

N°1 S1 H1 SIN°2 H2 S2 SIN°3 S3 H3 SIN°4 H4 S4 SI

2 gels préparatifs : comparaison cartes protéiques fluorescentesN°5: 450 µg � pool HypermuscléN°6 : 450 µg � pool Sauvage

� Piquage des spots variants et analyse par SM (Emilie)

Approche 2D-DIGE

12 images analysées

Normalisation : référens

Analyse statistique

microsomes

Mise en évidence des protéines différentiellement exprimées dans le muscle de souris hypermusclépar rapport au sauvage ( lignées GDF8 -/- et FVB)

���� Etude du protéome total

���� Matériel biologique : muscle squelettique � Laëtitia

16 mâles âgés de 3 et 12 semaines8 animaux GDF8-/- et 8 animaux FVB

(autres tissus prélevés : foie, cœur et cerveau)

���� Technologie 2D-DIGE/SM

protéome total

• Analyses des 12 semaines :� 47 spots variants , 34 spots piqués

� 24 protéines identifiées en SM

� 50% ~ des protéines contractiles

Résultats préliminairesprotéome total

Gel fluorescent Cy2 Gel coloré au bleu colloïdal - sa uvage

Résultats préliminaires

• Analyses des 3 semaines :

� en cours

• Comparaison 12 et 3 semaines

protéome total

Merci…