MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m é thodes analytiques - spectrophotom é triques...

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES

méthodes analytiques - spectrophotométriques

SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIREPrincipeUtilise la capacité d’absorption de lumière d’une longueur d’onde fine et définie dessubstances dissoutes dans l’eau.

Loi de Beer-Lambert (en expression logarithmique) : Log I0 /I = e . C .L = densité optique ou DO (directement proportionnelle à C)I = énergie lumière transmiseI0 = énergie lumière incidenteC = concentration substance en mole/l dans le solvantL = longueur du trajet optique (largeur de la cuve)e = coefficient caractéristique de la longueur d’onde (coef. d’absorption moléculaire)Si I=I0 -> le milieu est transparent, la transmission est de 100% et la DO = 0Si I tend vers 0 , milieu opaque, la DO tend vers l’infini

Spectre d’absorption lumineuse :représentation graphique des variations de densité optique de la lumière transmiselors de modification de la longueur d’onde de la lumière incidente.Spectres des substances : ultraviolet et visible.Conditions définies : solvant, pH, O sinon variation de l’emplacement des longueursd’onde et de coefficient d’absorption



SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIREAppareillage Nature spectrophotomètres : toutes les longueurs d’ondes sont disponiblesPhotomètres : certaines longueurs d’ondesCaractéristiquesSources lumineuses

solides chauffés (tungstène , visible-infrarouge) (halogène, visible-UV)

décharges des gaz raréfiés (hydrogène ou deutérium( UV, continu) (vapeur de mercure (UV, discontinu)

Fente d’entrée forme rectangulaireMono chromateur filtres colorés (verre ou gélatine)

Filtres interférentiels (verre + métal)Prismes (dispersion de la lumière)Réseaux (idem)

Fentes de sortie



SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIREAppareillage CaractéristiquesCuves verre -> visible

Quartz -> U.V.polystyrènePrécautions d’utilisation (bulles, rayures,nettoyage)

Cellules photoélectriques -> transformation énergie lumineuse en énergie électriqueTubes photomultiplicateursLentilles, miroirs, fibres optiquesAmplificateursGalvanomètres (mesure le courant fourni par l’amplificateur)EnregistreurAppareilsphotomètres : à filtres, peu coûteuxspectrophotomètres : à réseaux ou à prismes (intéressants pour les spectres)



SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION MOLECULAIRE

ApplicationsDétermination du spectre caractérisation substanceMesure de concentration directe (Hb. Protéines)

Indirecte (urée diacetylmonoxime)RéflectométrieMesure de l’absorption lumineuse au cours du passage d’une lumièremonochromatique à travers une phase solide sur support réfléchissant.Applications Lecture de plaques de chromatographie, de

bandelettes réactivesAnalyse automatique

LuminométrieMesure de la lumière émise par réaction chimique (Chimioluminescence)Applications réactions impliquant la luciférase (ATP ou O2)



PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLESOpacimétrie mesure de la lumière émise dans le même sens que la lumière incidenteNéphélémétriemesure de la lumière à 90° par rapport à la direction de la lumière incidenteTurbidimétrieconcentration ou épaisseur d’un milieu troublant la visibilité nette d’un test optique placé

derrière ce milieuFLUORIMETRIEPrincipe : une molécule à l’état stable recevant une énergie sous forme de rayonnement

passe à l’état excité. Le retour à l’état fondamental se traduit par l’émission de lumière mesurable.

CHEMILUMINESCENCEDans ce cas, l’énergie est d’origine chimique ou enzymatiqueSpectresd’émission comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est

maximumd’excitation comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est

maximum



SPECTROMETRIE D’ABSORPTION ATOMIQUEPrincipeMesure de l’absorption de radiations photoniques spécifiques par des atomes enphase vapeurLoi de Kirchhoff : un élément métallique peut absorber les radiations qu’il est lui-mêmesusceptible d’émettreAtome métallique + énergie lumineuse état excitéRetour à l’état fondamental radiations caractéristiques (raie de résonance)InversementVapeur atomique (atomes état fondamental) + radiation absorption de la radiationAppareillageSources de radiation : lampe à cathode creuse ou lampes à excitation HFProduction de la vapeur atomique : source d’atomisation à flamme ou électrothermieSystèmes de correction d’absorption non spécifiqueSystème de lecture : monochromateur puis photomultiplicateurApplicationsDosage des métaux et alcalinoterreux (biologie clinique, toxicologie, pharmacologie)



PHOTOMETRIE D’EMISSION ATOMIQUE

Principe

Mesure de l’intensité d’énergie lumineuse spécifique émise par un élément chauffé dans

une flamme (raie de résonance)

Appareillage

Nébuliseur – brûleur (solution à doser nébulisée dans une flamme (air-propane,acétylène)

Système de lecture : filtre interférentiel à bande étroite + dispositif photosensible

Applications

Dosage des alcalins Na, K, Li (biologie clinique)

Inconvénient

Manipulation des gaz

Avantages

Fiabilité, spécificité, linéarité, simplicité

SpectrophotomètresSchéma


méthodes analytiques

METHODES ELECTROCHIMIQUESPrincipeEchange d’électrons entre électrode et substance électroactive(électrode = cathode ou anode)MéthodesMéthodes en pleine expansion, souvent automatisables (biochimie analytique du GR ou

analyses de biologie délocalisée)Les méthodes sont de 2 types selon l’importance de l’électrolyse : ampérométrique : ampérométrie : microélectrolyse avec concentration relativement constante del’analyte. Potentiel constant, intensité courant proportionnelle à concentrationAnalyte - Application : détermination de la PO2 ou étude post-chromatographiquehaute pression.potentiométrie : les électrodes sont spécifiques à membrane. Intensité courantconstante,analyse des variations de potentiel en fonction de la concentration analyte coulométrique : coulométriemesure la consommation complète du produit à analyser. Intensité ou potentielimposé. - Application : dosage du fer sérique par coulométrie à potentiel imposé. voltamétrie et polarographie. Application peu usuelle



RADIOANALYSEPrincipeLa plupart des éléments naturels existent à l’état de mélange d’isotopesMasse noyau et Nombre électron =propriétés chimiques identiquesLes radioisotopes sont instables. Leur désintégration libération e- ou rayon Il est possible de créer des réactifs marqués par radioisotopes pour l’usage biologique.

MéthodesLes radioisotopes peuvent être détectés de diverses manières : - compteur Geiger (ionisation d’un gaz)- compteur à scintillation (éclair lumineux)- autoradiographie (impression d’une plaque photographique)

Applications- toute technique d’analyse biochimique (cf : reste du cours !)- étude métaboliques : traçage des processus cellulaires :précurseur radioactif , étape métabolique, mesure biochimique , autoradiographique,..


méthodes analytiques - enzymologie

EnzymeDéfinition catalyseur biologique de réaction biochimiquesSpécificité vis à vis de la molécule sur laquelle il agit = substrat

Variable (notion d’affinité)StructurePréparation et purificationProtéines Parfois fragilisées par les séparation des constituants cellulairesSite actif = sites privilégiés de fixation du substratProenzyme = forme inactive à transformer pour activationIsoenzymes = différentes protéines à même spécificité enzymatique correspondent

souvent à des protéines formées de plusieurs chaînes polypeptidiques à combinaisons variables entre elles (LDH)

Il existe des protéines à plusieurs fonctions enzymatiquesEnzyme et structure cellulaire- enzymes impliquées dans une chaîne métabolique ont souvent la même localisation

cellulaireparfois regroupements en complexes poly-enzymatiques difficilement dissociables



EnzymeRégulation de l’activité enzymatiqueFormes allostériques différences de forme spacialeCertaines substances - ligands- modifient ces formesCe sont des effecteurs allostériques (parfois substrat ;dans ce cas la courbe de lavitesse de réaction en fonction de la concentration prend la forme d’une sigmoîde)Certaines substances de bas PM ont également des effets effecteurs ou inhibiteurs

modification de l’affinité pour le substrat régulation métaboliqueCas de la régulation par le produit terminal de la chaîne métabolique = rétro inhibition ou inhibition par feed-backEnzyme à concentration faible par rapport aux autres enzymes de la chaîne métabolique, enzyme régulateur de la chaîne effet limitant

Classification internationale des enzymes => numérotation1 = oxydoréductases : réactions d’oxyoréduction2 = transférases : transfert de groupements fonctionnels3 = hydrolases : réactions d’hydrolyse4 = lyases : suppression ou fixation d’un groupement=>double liaison5 = isomérases : réactions d’isomérisation6 = ligases : liaison (c-o, c-n, c-c, c-s) avec coupure d’une molécule d’ATP



Dosage des enzymesMoyens :méthodes immunochimiques (comme autres protéines, cf suite du cours)

méthodes de mesure de l’activité catalytique

Mesure quantitative (activité catalytique)Mesurer la vitesse de réaction apprécier la quantité d’enzymev = k{Enz]v = molécules de substrat tranformées par minute[Enz] concentration en enzyme k = constante dépendant de la nature de l’enzymeParamètresconcentration en substrat mesure, pour chaque concentration, de la vitesse initiale (tous paramètres stables)aspect de la courbe dû au fait que, à concentration faible, toutes les molécules d’enzyme ne sontpas saturéespour une concentration en substrat la vitesse est donnée par : équation de Michaelis-Menton : v = Vmax {S] / {S] + {KM]KM : caractéristique de l’enzyme, exprimée en molécules.l-1Souvent transformation pour obtenir une représentation graphique linéaire (équations deLineweaver-Burk, Eadie-Hoftee)

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - enzymologie



Dosage des enzymesParamètresTempérature et pH résultante entre effets activateurs et inhibiteursCoenzymes partie non protéique – souvent transformé lui-même

souvent transporteur de groupements fonctionnelsATP, coenzymeA, biotine, pyrophosphate de thiamine

Activateurs autres : ions métalliques (Zn, Mg..), protéines inertes (albumine)protecteurs des thiols

Inhibition compétitive : analogue structural du substratmodification par ajout de substratmodification de la KMnon compétitive complexants, inhibiteurs d’une fonction chimiqueaucun effet d’ajout de substratpas de modification de la KM

nécessité de standardisation, de contrôles interne, externes

MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES méthodes analytiques - enzymologie



Dosage des enzymes

conditions classiqueslarge excès de substrattempérature = 37° ou 30°pH = pH optimalprotecteurs enzymatiques dilutions ( !)

Expression des résultatsv de la réaction / ml ou mg de protéinesv = moles de substrat / mn à 30° UIKatal = 1 mole/seconde1 UI = 16 nkatal



Dosage des enzymesTechniques de mesure2 possibilités : disparition du substrat ou apparition du produitméthodologies de mesurephotométrie coloration du produit , différence d’absorptionfluorimétrie technique plus sensible,

soit fluorescence spontanée, soit transformation parmodification pH, ajout réactif, transformation structurecauses d’erreurs (fluorescence propre , impuretés

témoin « blanc réaction »)radioisotopie substrat radioactif séparation

sensible, peu d’interférencesimpossibilité d’automatisationprix élevé, difficultés de fabrication

Immunochimie Anticorps-anti-enzyme pour séparer différentes activités

Spécificité pour une isoformeEtude des modifications génétiques



Dosage des substrats

Dosages en point finalExcès d’enzymePossibilité d’utiliser une deuxième réaction de révélationMesure en fin de réaction par photométrie ou radioenzymologie

Dosages par méthode cinétiqueEnzyme à Km élevée (éventuellement inhibiteur compétitif)

Mesure de la vitesse de réaction à 2 temps rapprochés et comparaison avec la courbe établie à partir de quantités connues de substrat

La plupart du temps ; méthodes des analyseurs multiparamétriques


méthodes analytiques - immunochimie

Principe utilise la spécificité remarquable de la liaison antigène – anticorps due à lacomplémentation stéréochimique qui la caractérise

Nature des réactifsAnticorps protéine particulière synthétisée par les lymphocytes B

Architecture de base à 2 chaînes lourdes et légèresPolymorphisme très élevéSite Ac toujours situé en extrémité N terminaleLiaison Ag-Ac par site antigénique et site anticorpsChaque anticorps possède une afffinité particulière à l’égard de l’épitope qui lui correspond

Antigène Nombre d’épitopes variable de 1 pour les moléculeshapténiques à plusieurs centaines pour certains virus



Préparation des réactifs immunochimiquesImmunisation expérimentale d’animaux la plupart du tempsPréparation des antigènesGrosses molécules spontanément immunogènes injection directeHaptènes = molécules PM <5000 couplage avec grosses molécules (albumine,

adjuvant de Freund)Préparation des anticorpsAnticorps polyclonauxMélange d’anticorps issus de nombreuses cellules lymphoïdes Ac reconnaissantdes épitopes différents ou des aspects variés du même épitope ou un même épitopeavec une affinité variable = immunsérums, excellents réactifsNécessité de purifier l’immunsérum

de le concentrer en anticorps (précipitation Ig)Anticorps monoclonauxProviennent de l’hybridation d’une cellule lymphocytaire avec une cellule tumorale(plasmocytome) =>cellule hybride immortelle=>clone à fabrication indéfinie et stabilisée d’1 anticorps avantages : production industrielle

préparation à partir d’antigènes inconnus



EtalonnageRéaction Ag-Ac sensible à l’environnement étalonnage et dosage mêmes conditions (y compris nature du prélèvement)En général, il est en fait techniquement impossible de connaître la quantité exacted’antigène dans le milieu d’étalonnage=> expertises et définitions d’unités internationalesdistribution de solutions d’étalonnage sous les auspices de l’OMS

MéthodesNombre et variété impressionnantsClassification possible selon le phénomène observé et mesuré

Observation directe du complexe Ag-Ac : précipitation, agglutinationObservation indirecte par l’intermédiaire d’une marque attachée soit à l’antigène, soit à l’anticorps. Marque = molécule détectable par un appareil ou les sens.Observation par intermédiaire d’un phénomène biologique

Applicables à la quantification des antigènes et des anticorpsmais

dosage possible des antigènes (cf : remarques)Seulement estimation des anticorps (variabilité)Appréciation de la quantité des immuncomplexes



Standardisation et contrôles de qualité en immunochimieValeurs des méthodes inégales : Reproductibilitéseuil de détectionSpécificitésensibilité aux interférencesCommoditécapacité à être automatiséecoûtDonc : évaluations, comparaisonsgénéralement du mélange : « principe méthodologique, appareillage, réactifs »standardisation en fait impossible définition de valeurs de consensus mise au point de matériel réactif de référence


méthodes analytiques – observation microscopique

PrincipeUtilisation d’amplification du signal par lentilles optiques pour détecter des objets detaille inférieure à celle décelable à l’observation à l’œil nu.

MéthodesOn distingue : la microscopie photonique qui, comme son nom l’indique, utilise des lampes àémission de photons (longueurs d’ondes UV visibles).Préparation spéciale :coloration sélective (entraîne la nécessité d’augmenter lasensibilité par activité enzymatique ou par fluorescence) le microscope à fluorescence permet la détection de protéines ou d’autres substances.Il est possible d’utiliser des anticorps marqués (fluorescents ou révélés par activité

enzymatique). Ces anticorps se lient à la surface des molécules de la cellule vivante ou à l’intérieur de la cellule fixée perméabilisée. Il y a possibilité de détection de variation de concentration et localisation de molécules à l’intérieur de la cellule.

la microscopie par diffraction des rayons X : révèle un arrangement tridimensionnel moléculaire.



Méthodes

la microscopie électronique qui utilise un faisceau d’électrons.Contraintes spécifiques : - la fixation est nécessaire (elle utilise en général des produits identiques à ceuxdécrits pour la déprotéinisation)- coupe en tranches fines (souvent inclusion dans résine ou cire)- les mêmes préparations avec révélation (enzyme, peroxydase ou or colloïdal) utilisées

pour la microscopie optique peuvent être utilisées en microscopie électroniqueLa microscopie électronique par cryofracture (cassure des structures internes de lacellule par le froid intense) localise la distribution de proteines intra-cellulaires.La technique de coloration négative : entraîne la révélation d’agrégatsmacromoléculaires ou l’agencement des sous-unités protéiniques.


valeurs

Mesure d’un paramètre biologique chez un individu

Valeur

à situer par rapport aux valeurs possiblesdonc nécessite que soient connues :

Les valeurs représentatives de la population générale

Les valeurs de référence Individus en bonne santé Conditions définies (exclusion des facteurs de variation)

Les valeurs usuelles Population hétérogène (existent des facteurs incontrôlés) Population pathologique à risque (obèses…)

Valeurs usuelles deviennent valeurs de référence si définition de la population et contrôle des facteurs d’interférence


valeurs – listes des facteurs de variations biologiques

Le choix des individus de la population de référence impose de connaîtreles facteurs de variations biologiques

Etablissement de la liste = constitution de banques de données

Répertorier

Littérature Facteurs physiologiques Facteurs pharmacologiques

Quantifier Centres d’examens de santé Variations tissulaires physiologiques Variations pharmacologiques et pathologiques


valeurs – listes des facteurs de variations biologiques

Types de facteurs de variations biologiquesPlusieurs propositions de classifications

• Variations génétiques ou acquises

• Variations dues à l’environnement

• Variations dues à des facteurs exogènes ou endogènes

• Variations dues à des facteurs physiologiques• Facteurs de masse (graisse, muscle, foie enzymes)• Facteurs métaboliques

• Très régulés• Produits de catabolisme• Produits impliqués dans les mécanismes de synthèse à partir du plasma (glucose,

cholestérol…)


valeurs - sélection de la population de référence

La sélection de la population de référence utilise 2 types de critères

Les critères de stratification ou facteurs de variation maîtrisables

création de sous ensembles homogènes

personnalité des groupesenvironnementhistoireEn général : âge, sexe, masse corporelle, origine ethnique

Les critères d’exclusion ou facteurs de variation non maîtrisablespathologiesprise de médicamentsétat physiologiquesujets à risque


valeurs – le concept de valeur de référence

Filiation entre les différents termesIndividus de référence

Population de référence

Échantillon de référence

Valeur de référence

Distribution de référence

Limite de référence

Intervalle de référence

Valeur observée

chez un individu

Pouvant être comparée aux

Constituent la

À partir de laquelle est sélectionné un

Sur lequel on détermine des

Sur lesquelles on observe une

À partir de laquelle est déterminée une

Qui sert à définir l’


valeurs – le concept de valeur de référence

Études bibliographiques

et expérimentales

Liste des facteurs de variations biologiques et pathologiques

Sélection des sujetsà posteriori à priori

= population de référencePréparation des sujets

questionnaire

PrélèvementTraitement du spécimen

analyse

Sélection de l’échantillon de référenceCritères de stratification, d’exclusion

Traitement statistiqueVérification de la représentativité

Valeurs de référence

Critères de stratification, d’exclusion

Préparation des sujets

PrélèvementTraitement du spécimen

analyse

Traitements statistiques


méthodes analytiques - publication

ELEMENTS D'UN ARTICLE SCIENTIFIQUEjournalDate de parutiontitreAuteurs + adressesMots clefsrésuméintroduction

Exposé du problème à résoudreEtat des connaissancesPlan du travail

Matériels (techniques et biologiques) et méthodesRésultats + commentaires (Tableaux – Figures)Discussion (Tableaux – Figures)conclusionremerciementsbibliographie


méthodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis)

MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE

biopsie cutanée fibroblastes cultivés

sang leucocytes isolés

METHODES UTILISEES

culture cellulaire

sédimentation en polyvinylpyrolidone

centrifugation

lyse cellulaire (ultrasons)

mesure activité enzymatique :

radiochimie

blanc réactif + blanc réaction

double essai

mesure par fluorimétrie en substrat artificiel (méthylumbelliférone)


méthodes analytiques - publication (X linked recessive icthyosis)

RESULTATSblanc réactif (conditions d'incubation)conditions de réaction

STS comparaison de tampon Tris et phosphate sensibilité dans les leucocytes temps

incubation

activité spécifique substrat

concentration en protéines

de l'échantillonARS-C

tampon phosphate à pH 8,5détermination des valeurs de référence

des valeurs des patientsdes valeurs des porteurs

CONCLUSIONintérêt du dosage de la STSintérêt de la mesure dans plusieurs types cellulaires pour le dépistage

des porteurs


méthodes analytiques – publication (purification microfibrilles

MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISELigaments de la nuque de fœtus de boeuf

METHODES UTILISEESPréparation de microfibrilles natives intactes ( )Centrifugation en gradient de densité

directement ou après traitement avec hyaluronidase toute la nuit en gradient de C3CL (densité initiale 1,35 g/ml)

soit 72 H, 36 000 rpm 15 fractions de 0,8 mlsoit congélation4 H à -80°C, 18 H centrifugation, 36 000 rmp 15 fractions de 0,8 mlAnalyse biochimique

dialyse contre tampon 50 mM Tris/HCL, pH 7,4, contenant 0,2 M NaCl mesure densité optique à 280 nm par analyse spectrophotométrique

SDS PAGE dialyse contre eau distillée (aliquot 0,5 ml) congélation SDS PAGE à 6 % de SDS en condition réductrice (dithiothreitol) coloration des protéines ou bleu de Coomassie

Immunobuvardage (ou "blotting") sur membrane de cellulose (aliquot 50 µl) anticorps : anticollagène VI, antifibrilline, anti MAGP-1, anti LTBP-1,

anti LTBP-2, antifibronectine révélation par chemiluminescence

Microscopie électronique à ombrage rotatif observation du mélange initial riche en microfibrilles et des fractions de

centrifugation en gradient


méthodes analytiques – publication (purification microfibrilles)

RESULTATSCentrifugation en gradient de densité

gradients de 1,28 à 1,43 g/ml (72H ou 18H après congélation) mesure de la densité optique à 280 nm protéines à densité 1,30,

1,33 et 1,41 g/ml après traitement par hyaluronidase, pic protéines 1,33 et 1,37 g/l

SDS PAGE et Immunobuvardage fractions 6 et 7 collagène VI chaîne 1 et 2 et chaîne 3 fractions11 et 12 protéine de 330 kDa fibrilline avec

colocalisation MAGP-1 sommet du gradient fractions 1 et 2 LTBP-1 et LTBP-2

Microscopie à ombrage rotatif- préparation non traitée à la hyaluronidase fractions 6 et 7 collagène VI en aggregats+ quelques fibres de fibrilline fractions 11 µfibrilles de fibrilline- préparation traitée à la hyaluronidase fractions 6 et 7 µfibrilles de collagène VI fractions 11 µfibrilles de fibrilline

DISCUSSION (CONCLUSION)La méthode proposée permet une analyse structurale fine et précise des µfibrilles.

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